CN109313200B - 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法 - Google Patents

Abstract

快速且精确检测，表征，测量，和量化临床前动物生物学样品，或人生物学样品(包括血浆/血清和组织样品)中可能存在的位点特异性抗体药物缀合物的方法。

Description

用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法

对相关申请的交叉援引

依照37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请要求2016年5月27日提交的流水号62/342,825的美国临时申请的依照35USC§119(e)的权益，通过援引将其完整收录。

发明领域

本公开涉及通过层析术和/或质谱术在非生物学或生物学基质中捕捉，检测，分析，表征，和量化抗体-药物缀合物，和它们的片段和代谢物的方法。

发明背景

随着brentuximab vedotin(

Seattle Genetics)和ado-trastuzumab emtansine(

Genentech)的获批，提供药学活性药物或毒素分子对特定作用部位的靶向投递的抗体药物缀合物(ADC)的治疗性潜力得到确认，并导致进一步研究和开发。ADC一般由抗体，药学活性小分子药物或毒素(常常称作“药物模块”或“有效负荷”)，和任选的连接二者的接头构成。这种蛋白质构建物如此连接小分子，高度有力的药物与大分子抗体，其选择或改造成靶向特定细胞类型(典型地是癌细胞)上的抗原。ADC如此采用单克隆抗体的强大靶向能力将高度有力的缀合的小分子治疗剂特异性投递至癌细胞。小分子治疗性有效负荷常常是高度有力的细胞毒性分子，它们对于在常规化疗中使用会是毒性太高。

随着成功的ADC候选物自正在进行的研究和开发程序浮现并行进至临床评估和市场销售，需要能有效评估通过组合大蛋白质复合物(抗体或抗体片段)和典型地小得多但高度有力的药物分子创建的复杂化学制品组合物的安全性和功效测定法。首先必须建立药物-抗体连接，抗体和药物浓度，以及药物-对-抗体比，和这些ADC组合物的稳定性的表征，然后监测一致性，因为ADC的这些特性会影响这些治疗性实体的生物活性，药动学，分布，免疫原性，安全性，和稳定性概况。在应用于ADC分子的异质组合物(它们代表许多当前可得的可具有零至八个药物分子每个抗体的ADC)时，ADC表征中的这些挑战甚至更加困难。这种异质性是导致这些治疗性构建物的药动学参数和体内性能的不一致测量的一个因素。

液相层析串联质谱术(LC-MS/MS)是用于非常复杂的基质(像血浆/血清/组织样品)中的蛋白质分析和定量的一种强大工具。由于源自消化感兴趣蛋白质和其它内源蛋白质的肽可能具有相同或相似的名义质量，MS片段化的第二维度常常提供感兴趣肽的独特片段。可使用特定亲本肽和独特片段离子的组合来选择性监测要量化的分子。此类办法称作“多重反应监测”(MRM)，也称作选择反应监测(SRM)，它是用于蛋白质量化的一种常用模式。但是这种有力工具可能受到完整ADC，抗体片段，和肽连接的药物以及游离药物分子的复杂混合物的分析危害。

最近下一代ADC的开发聚焦于探索生成具有改善的稳定性，药动学(PK)和治疗指数的均质ADC的技术。还在探索新类型的接头和具有多种细胞毒性机制的毒素。由于新的有效负荷的结构复杂性和相关的复杂的体内生物转化，这些下一代ADC可能造成另外的生物分析性挑战。例如，亲和捕捉LC-MS已经用于完整ADC的药物-对-抗体比(DAR)和分解代谢物表征。完整ADC亲和捕捉LC-MS测定法采用PNGaseF来去除Fc区中的N-聚糖并如此降低ADC质谱中的复杂性和异质性。然而，新ADC的完整质谱更加复杂且该方法的灵敏度和分辨率可能不足以阐明一些结构修饰及精确表征DAR分布。

亲和捕捉液体层析术-质谱术(LC-MS)广泛用于抗体-药物缀合物(ADC)的直接药物-对-抗体比(DAR)和分解代谢物表征。然而，新ADC(它并入新类型的接头和除了美登素和奥瑞司他汀以外的有效负荷)的完整质谱比先前检查的那些更加复杂。当前方法在阐明某些结构修饰方面已经显示一些限制。

发明概述

本发明的一个方面是一种用于抗体药物缀合物(ADC)，诸如THIOMAB抗体-药物缀合物(TDC)的分析性办法，其中接头药物在Fab区中位点特异性缀合。亲和捕捉LC-MS F(ab′)2测定法合并经由对Fab区的结合的ADC的亲和捕捉，继以珠上IdeS消化以特异性且一致性去除Fc域。所得F(ab′)2(～100kDa)片段含有关键ADC结构信息，诸如药物-对-抗体比和药物代谢且比完整ADC(～150kDa)更加容易通过电喷射离子化LCMS来分析。分析物缩小的尺寸导致改善的质谱灵敏度和分辨率。另外，缩短的且经优化的样品制备时间(例如通过IdeS消化快速去除Fc片段)最小化可能源自延长的温育时间(例如用于Fc去糖基化的过夜酶处理)的偏斜DAR概况和药物代谢的可能测定法伪像。亲和捕捉LC-MS F(ab′)2测定法提供更加详细且精确的关于ADC体内生物转化的信息，从而能够分析低剂量，不稳定，且复杂的具有Fab区中缀合的接头-药物的位点特异性ADC。

本发明的一个实施方案是一种采用具有Fc区中位点特异性缀合的药物模块的ADC的抗Fc捕捉和IgdE蛋白酶消化的方法。

提供强健有力的方法来检测和量化抗体蛋白质浓度和抗体缀合的药物数量和结构表征，其通过消化该抗体并分出ADC的药物构件，继以对所得组合物层析术和/或质谱术分析组合的自该经消化抗体释放的药物和肽。本发明的方法利用含有该药物模块的ADC片段作为完整ADC的替代并因此提供升高的测定法灵敏度和分辨率。新方法还最小化药物代谢的伪像并降低对某些药物-对-抗体比(DAR)种类的潜在偏移响应。先前使用通过试图控制内切蛋白酶Lys-C或蛋白酶PNGase的活性的有限蛋白水解消化，继以反相HPLC和质谱术，进行抗体和ADC分析。由于灵敏度，分辨率，和对某些DAR种类的偏移响应中的限制，发现这些方法不能胜任一些含有重组工程化，特异性药物缀合位点的下一代ADC的分析。ADC特别是这样，它们不稳定，要求高得多的MS分辨率，而且具有对典型地以低剂量施用且因此在样品中处于低浓度的高度有力的DNA破坏剂的位点特异性缀合，要求用于表征该ADC组合物和表征在将该ADC施用于人或其它测试受试者之后收集的生物学样品中可能存在的代谢物的结构的分析性技术中高得多的灵敏度。

如此，本发明提供在开发位点特异性ADC期间在生成，配制，贮藏，和施用期间一致，可靠，有效，高分辨率且高灵敏度的评估稳定性，翻译后和化学修饰的方法，其通过组合与均质且位点特异性ADC的分析匹配的位点特异性且受控蛋白水解消化以降低ADC分析物的尺寸。

分析物缩小的尺寸导致改善的质谱灵敏度，和分辨率，而且对一些完整DAR观察到的响应差异降低。另外，特异性蛋白水解消化消除对Fc碳水化合物的过夜去糖基化的需求。另外，快速蛋白水解消化最小化可能源自过夜酶处理的测定法伪像。对于使用先前的方法可能不可行的低剂量，不稳定，且复杂的具有Fab区中缀合的接头-药物的位点特异性ADC的分析，本公开的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法提供关于ADC体内生物转化的一些详细且精确信息。

本发明提供评估ADC的方法，其通过将含有至少一个在重组工程化位点处连接至抗体的药物模块的ADC用切割该ADC的蛋白酶消化以形成包括至少一种没有连接该药物模块的肽片段和至少一种连接该药物模块的肽片段的经消化ADC组合物。然后通过高效液体层析术(HPLC)和/或质谱术(MS)分析该经消化ADC组合物以检测至少一种连接该至少一个药物模块的肽片段。该药物模块附着至该ADC的该重组工程化特异性位点可以是选自半胱氨酸氨基酸残基，硒代半胱氨酸氨基酸残基，谷氨酰胺氨基酸残基，非天然发生氨基酸残基，和糖修饰聚糖残基的位点。该ADC可以是IgG抗体。该ADC的抗体部分可以是抗体片段。该ADC的抗体部分可以是人或人源化抗体。该ADC可以是糖基化的或磷酸化的。该ADC的抗体部分可特异性结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体。

该药物模块可包含至少一个芳香环。例示性药物模块包括肽，聚酰胺，美登木生物碱(maytansinoid)，多拉司他汀(dolastatin)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)，PNU-159682，蒽环(anthracycline)，倍癌霉素(duocarmycin)，长春花生物碱(vinca alkaloid)，紫杉烷(taxane)，单端孢菌素(trichothecene)，CC1065，倍癌霉素(duocarmycin)，喜树碱(camptothecin)，依利奈法德(elinafide)，抗生素，荧光团，放射性同位素，以及这些化合物的立体异构体，电子等排体，代谢物，类似物或衍生物。该药物模块也可以经由接头连接至该ADC的抗体部分。

这些方法中利用的蛋白酶可选自IdeS蛋白酶，IdeZ蛋白酶，IgdE蛋白酶，SpeB蛋白酶，牙龈菌蛋白酶(gingipain)，内切糖苷酶，和其组合。该消化规程可包含将该ADC与该蛋白酶一起于介于约20℃和约45℃之间的温度温育，而且典型地包括将该ADC与该蛋白酶一起于约37℃的温度温育。该消化还可包含将该ADC与该蛋白酶一起于介于约pH 5和约pH 9之间的pH温育，而且典型地包括将该ADC与该蛋白酶一起于约pH 7的pH温育。该消化还可包含将该ADC与该蛋白酶一起温育介于约0.1小时和约48小时之间的时间段，而且典型地包括将该ADC与该蛋白酶一起温育约1小时的时间段。

该分析可包括RP-LC，RP-LC/MS，和LC-MS/MS分析中的至少一种。

在这些方法中，在该消化步骤前，可以在选自缓冲液，全血，血清，血浆，脑脊液，唾液，尿液，淋巴，胆汁，粪，汗液，玻璃体液，泪液，和组织的基质中悬浮该ADC。在例示性实施方案中，在选自人，食蟹猴，大鼠，和小鼠的哺乳动物的全血，血清，血浆，或组织中悬浮该ADC。因此，可以在该消化步骤前通过选自大小排阻层析术，透析，选择性沉淀，差速离心，过滤，凝胶电泳，液体层析术，反相层析术，免疫沉淀，包括蛋白A和蛋白G，NHS和链霉亲合素铁或磷或固定化抗体或凝集素的SpinTrap柱，顺磁性珠，免疫消减，分级，固相萃取，磷酸肽富集，聚丙烯酰胺凝胶电泳，和脱盐的技术富集该ADC。如此，在这些方法中，可以使该ADC结合至亲和捕捉介质。该亲和捕捉介质可包括珠或树脂支持的蛋白A/G，靶抗原-顺磁性珠捕捉介质，抗独特型抗体，抗Hu抗体，和抗药物抗体中的至少一种。这些分析性方法可包括清洗结合至该亲和捕捉介质的ADC以减少与该ADC接触的非抗体蛋白质。这些方法还可包括使结合至该亲和捕捉介质的ADC去磷酸化或去糖基化。该消化步骤还可以在使ADC结合至该亲和捕捉介质同时进行。或者/另外，可以在消化该ADC的步骤前自该亲和捕捉介质洗脱该ADC。

这些方法在自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的总抗体浓度中特别有用。或者/另外，自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的抗体缀合的药物浓度。或者/另外，自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的平均DAR。或者/另外，可以自该经消化ADC组合物的分析确定代谢物或分解代谢物结构。或者/另外，可以自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的蛋白质浓度。或者/另外，关联该蛋白质浓度与来自该经消化ADC的至少一种Fc片段的RP-LC和/或MS分析的峰面积。或者/另外，自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的消光系数。或者/另外，自来自该经消化ADC的至少一种Fc片段的RP-LC和/或MS分析获得该ADC，代谢物或分解代谢物结构的平均DAR，和该ADC的蛋白质浓度。

此概述既非意图又非应当解读为代表本公开的全部广度和范围。而且，在本文中提到“本公开”或其方面应当理解为表示本公开的某些实施方案且不应必然解读为将所有实施方案限制至特定描述。本公开在此概述中以及在附图和实施方案的描述中以多种水平的细节列出，而且并非意图通过纳入或不纳入此概述中的要素，构件，等来限制本公开的范围。本公开的另外的方面会根据实施方案的描述而变得更加显而易见，特别是在与图一起时。

附图简述

图1A描绘用IdeS蛋白酶切割THIOMAB^TM药物缀合物(TDC)生成的抗体片段，其中接头-药物位点特异性缀合至F(ab)。消化生成F(ab’)2片段和Fc片段。接头-药物可位点特异性缀合F(ab)或Fc任一。

图1B提供IdeS消化，第2代亲和捕捉LC-MS的示意性图示。

图1C显示PNGaseF(第1代)和IdeS(第2代)消化的示意性图示和本公开的第2代亲和捕捉LC-MS测定法的优点。

图1D显示TDC标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)的直接LC-MS(1D-1)，第2代(1D-2)和第1代(1D-3)亲和捕捉LC-MS分析之间的比较。用*标记的MS峰代表具有聚糖的DAR。

图1E显示接头-药物解缀合(-LD)和来自大鼠血浆的不稳定TDC，TDC-L1的PNGaseF消化，第1代(1E-1)和IdeS消化，第2代(1E-2)分析之间的比较。第2代亲和捕捉LC-MS测定法将人为部分药物分解(-PD)最小化(B)。部分药物分解并不影响TDC-L1的效力，导致DAR没有变化。

图1F显示表征体内小鼠血浆中的复杂TDC分解代谢物期间获得的MS峰。由于自药物分子损失42Da，TDC-L2分解代谢物的MS峰在PNGaseF消化(第1代)亲和捕捉LC-MS测定法中分辨不了(1F-1)，但是它们使用IdeS消化(第2代测定法)得到近基线分辨(1F-2)。部分药物分解(-PD，43Da)显著影响例示性TDC-L2的效力，导致DAR相应减小。

图2A-1显示用IdeS蛋白水解酶消化的位点特异性ADC的RP-LCMS分析。Fc/2片段首先洗脱并与含有F(ab’)2的药物基线分辨开。然后使用并不含有接头-药物的抗体片段的峰面积来计算蛋白质浓度。

图2A-2显示来自图2A-1的Fc/2的解卷积质谱。

图2B显示使用用IdeS蛋白酶消化的曲妥珠单抗生成的0.5-20mg/ml范围上的标准曲线(Fc/2峰面积对浓度；顶部)(F(ab’)2峰面积对浓度；底部)。可使用TDC的Fc/2的峰面积(顶部曲线)和线性回归确定在F(ab)上位点特异性缀合的TDC的蛋白质浓度。在链间二硫化物上缀合的传统ADC也能使用这种方法来表征，因为这些缀合物中的Fc/2片段也没有药物。可使用TDC的F(ab’)2的峰面积(底部曲线)和线性回归确定在Fc上位点特异性缀合的TDC的蛋白质浓度。

图2C显示在工程化改造的半胱氨酸K149C处位点特异性缀合的曲妥珠单抗的浓度确定，其中接头-药物在F(ab)上在工程化改造的半胱氨酸K149C处。自标准曲线使用Fc/2峰面积(3份复制品)和线性回归确定浓度。

图2D显示在工程化改造的半胱氨酸S400C处位点特异性缀合的曲妥珠单抗的浓度确定，其中接头-药物在Fc上在工程化改造的半胱氨酸S400C处。自标准曲线使用F(ab’)2峰面积(3份复制品)和线性回归确定浓度。

图2E显示接头-药物在链间二硫化物上缀合的曲妥珠单抗的浓度确定。自标准曲线使用Fc/2峰面积(3份复制品)和线性回归确定浓度。因为Fc/2片段并不含有铰链二硫化物，所以它并不含有接头-药物。

图2F显示通过本公开的IdeS蛋白酶消化方法或二辛可宁酸测定法(BCA)蛋白质测定法获得的81个THIOMAB^TM药物缀合物浓度值的相关性。

图3A显示TDC(PBD二聚体药物，二硫化物接头)标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS测定法，IdeS消化，亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和PNGaseF，亲和捕捉LC-MS完整抗体测定法的DAR(药物-抗体比)概况分析，3份复制品的标准品偏差分别为0.13，0.09，和0.14。

图3B显示TDC标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS，IdeS消化1小时的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和PNGaseF消化过夜的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法的DAR概况分析。

发明详述

本公开涉及检测和量化抗体药物缀合物(ADC)的抗体和药物构件的单一测量方法，它们强健有力地自单一样品制剂测量总抗体和抗体缀合的药物数量，由此提供药物对抗体比(DAR)计算和显著的时间和资源节约。

除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的普遍理解相同的含义，而且与下述一致：Singleton等(1994)“Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology”,第2版,J.Wiley&Sons,New York,N.Y.；和Janeway等(2001)“Immunobiology”,第5版,Garland Publishing,New York。当本文中使用商品名时，还包括商品名产品配制剂，通用名药物，和商品名产品的活性药学组分。

定义

术语“生物学样品”指任何自动物衍生或分离的成分，而且包括血液，血浆，血清，细胞，尿液，脑脊液(CSF)，乳液，支气管灌洗液，骨髓，羊水，唾液，胆汁，玻璃体液，泪液，或组织。

术语“消化酶”指能够以特异性或通用随机方式将肽或蛋白质切割或水解成片段的酶。消化酶能自抗体形成经过消化的抗体样品，其中抗体是生物学样品的成分。消化酶包括蛋白酶，诸如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，内切蛋白酶LysC，内切蛋白酶ArgC，金黄色葡萄球菌V8，胰凝乳蛋白酶，Asp-N，Asn-C，PNGaseF，内切蛋白酶GluC，和LysN。

术语“抗体”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，及抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fc，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂，Fv，和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论(US 5,869,046)。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134；及Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(US 6,248,516)。

可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的恒定域残基。一般地，恒定域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

人源化抗体及其生成方法已经广泛综述于例如Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633，并且记载于例如Riechmann等(1988)Nature332:323-329；Queen等(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利No.5,821,337；美国专利No.7,527,791；美国专利No.6,982,321；美国专利No.7,087,409；Kashmiri等(2005)Methods 36:25-34(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等(2005)Methods 36:43-60(描述了“FR改组”)；及Osbourn等(2005)Methods 36:61-68；Klimka等(2000)Br.J.Cancer 83:252-260(描述了FR改组的“引导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”(best-fit)方法选择的框架区(见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296)；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285；及Presta等(1993)J.Immunol.151:2623)；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684及Rosok等(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。

一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel(2001)Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74；Lonberg(2008)Curr.Opin.Immunol.20:450-459。

可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg(2005)Nat.Biotech.23:1117-1125。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了

技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M

技术，和US 2007/0061900，其描述了

技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor(1984)J.Immunol.133:3001；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等(1991)J.Immunol.147:86)。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562。其它方法包括那些记载于：美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)；Ni(2006)Xiandai Mianyixue 26(4):265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein(2005)Histology andHistopathology 20(3):927-937及Vollmers和Brandlein(2005)Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91。

也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

“人共有框架”指如下的抗体框架区，其代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，见上文中的亚组。在一个例示性实施方案中，对于VL，亚组是亚组κI。在另一个例示性实施方案中，对于VH，亚组是亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。一种例示性“嵌合”抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区(美国专利No.4,816,567；Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。另一种例示性嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本公开的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等,于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,N.J.,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等(1990)Nature 348:552-554；Clackson等(1991)Nature 352:624-628；Marks等(1992)J.Mol.Biol.222:581-597；Marks和Bradbury,Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等(2004)J.Mol.Biol.338(2):299-310；Lee等(2004)J.Mol.Biol.340(5):1073-1093；Fellouse(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472；及Lee等(2004)J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunol.12:433-455的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等(1993)EMBO J 12:725-734描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.227:381-388所描述的。人抗体噬菌体文库记载于US 5,750,373；US7,985,840；US 7,785,903；US 8,679,490；US 8,054,268；和US 2005/0079574；US 2007/0117126；US 2007/0237764；US 2007/0292936。认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是用于本公开的目的的人抗体或人抗体片段。

抗体可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。结合特异性之一可以针对一种抗原，而另一种针对第二种抗原。或者，双特异性抗体可以结合同一抗原的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达抗原的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备(见例如Ortiz-Sanchez等(2008)Expert Opin.Biol.Ther.8(5):609-632)。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello(1983)Nature305:537；WO 1993/08829；及Traunecker等(1991)EMBO J.10:3655)，和“突起-入-空穴”工程化(US 5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如US 4,676,980；及Brennan等(1985)Science 229:81)；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(例如Kostelny等(1992)J.Immunol.148(5):1547-1553)；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)；及使用单链Fv(sFv)二聚体(Gruber等(1994)J.Immunol.152:5368)；及制备三特异性抗体(Tutt等(1991)J.Immunol.147:60)来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造的抗体，包括“章鱼抗体”(例如US 2006/0025576)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合抗原及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(例如US 2008/0069820)。

抗体变体

还涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或***和/或替代。可以进行删除，***，和替代的任何组合以得到最终的构建物，只要最终的构建物拥有期望的特征，例如抗原结合。

抗体包括包含抗体和蛋白质，药物模块，标记物，或一些其它基团的融合蛋白。可以通过重组技术，缀合，或肽合成来生成融合蛋白，以优化诸如药动学等特性。人或人源化抗体也可以是包含清蛋白结合肽(ABP)序列的融合蛋白(见Dennis等(2002)JBiol.Chem.277:35035-35043，第35038页表III和IV；美国专利公开文本No.2004/0001827，第[0076]段；和WO 01/45746，第12-13页，通过述及将它们都收入本文)。

替代，***，和删除变体

提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体供本公开的方法中使用和分析。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。实质的变化在下表中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或CDC。

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury(2008)Methods Mol.Biol.207:179-196)，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等,于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,N.J.,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，***，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg，asp，his，lys，和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297(Wright等(1997)TIBTECH 15:26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％，或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的(见例如WO 2008/077546)。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(美国专利公开文本No.2003/0157108；US 2004/0093621)。描述“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的专利出版物包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等(2004)J.Mol.Biol.336:1239-1249；Yamane-Ohnuki等(2004)Biotech.Bioeng.87:614。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等(1986)Arch.Biochem.Biophys.249:533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等(2004)Biotech.Bioeng.87:614；Kanda等(2006)Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688；WO2003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。描述具有两分型寡糖的此类抗体变体的出版物包括WO 2003/011878；美国专利No.6,602,684；及美国专利公开文本2005/0123546。在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体也有提供，而且可以具有改善的CDC功能。描述此类半乳糖残基抗体变体的出版物包括WO 1997/30087；WO 1998/58964；WO 1999/22764。

位点特异性抗体药物缀合物

如上所述，ADC设计中的主要挑战之一是当前可得的可具有零至八个连接至每个抗体或抗体片段的药物分子的ADC的均质性。ADC种类中的这种异质性不利地影响评估和监测ADC组合物的稳定性，一致性，药动学，和体内性能的分析性方法。出于这个原因，已经鉴定了允许在预定位点处将药物化学安装到抗体上的缀合策略，以确保在生成后和同时在体内循环时缀合物的稳定性。这些位点特异性ADC，也称作免疫缀合物，依赖于正在出现的位点特异性缀合策略，包括利用工程化改造的半胱氨酸(例如THIOMABTM)，非天然氨基酸，硒代半胱氨酸残基，经由葡糖转移酶和转谷氨酰胺酶s1的酶促缀合，和其它技术。特别地，可控制THIOMAB-药物缀合物(TDC)来生成均质DAR2。

1)半胱氨酸工程化改造的抗体药物缀合物

半胱氨酸工程化改造的抗体(例如“THIOMAbTM”)包含用半胱氨酸替代的一个或多个抗体残基。替代的残基可存在于抗体的可接近位点，使得反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建位点特异性ADC。此类THIOMAB的例子包括其中可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个的半胱氨酸工程化改造的抗体：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)，和轻链的S121，和K149。生成半胱氨酸工程化改造的抗体的方法包括但不限于US 7,521,541；US9,000,130中描述的方法。

如此，可将本公开的方法应用于抗体-药物缀合物，其包含半胱氨酸工程化改造的抗体，其中野生型或亲本抗体的一个或多个氨基酸用半胱氨酸氨基酸替换(THIOMAB^TM)。可以这样改造任何形式的抗体。例如，可以改造亲本Fab抗体片段以形成半胱氨酸工程化改造的Fab，而且可以改造亲本单克隆抗体以形成半胱氨酸工程化改造的单克隆抗体。应当注意，单位点突变在Fab抗体片段中产生一个工程化改造的半胱氨酸残基，而单位点突变在全长抗体中产生两个工程化改造的半胱氨酸残基，这是IgG抗体的二聚体本质所致。对具有替换的(“工程化改造的”)半胱氨酸(Cys)残基的突变体评估新引入的工程化改造的半胱氨酸硫醇基团的反应性。硫醇反应性值为0至1.0的范围中的一个相对数值术语，而且可以为任何半胱氨酸工程化改造的抗体进行测量。本发明的半胱氨酸工程化改造的抗体的硫醇反应性值在0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0的范围中。

可以在抗体的重链(HC)或轻链(LC)中的反应性位点处改造半胱氨酸氨基酸，它们不形成链内或分子间二硫化物连接(Junutula等(2008)Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US7,521,541；US 7,723,485；WO 2009/052249；Shen等(2012)Nature Biotech.,30(2):184-191；Junutula等(2008)J.Immuno.Methods 332:41-52)。工程化改造的半胱氨酸硫醇可以与本发明的具有硫醇反应性亲电子吡啶基二硫化物基团的接头试剂或接头-药物中间体反应以形成具有半胱氨酸工程化改造的抗体和药物模块的ADC。这些工程化改造的ADC中药物模块的具体定位(即位点)可以如此设计，控制，和知晓。因此可以控制药物载荷，因为工程化改造的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或接头-药物中间体反应。工程化改造的抗体，通过替代重链或轻链上的一个位点来引入半胱氨酸氨基酸在对称的抗体上给出两个新的半胱氨酸。在这些位点特异性缀合的ADC中能以接近完全均质实现接近2的药物载荷(DAR)。

2)非天然氨基酸工程化改造的抗体药物缀合物

与半胱氨酸工程化改造的抗体相似，将非天然氨基酸(UAA)并入蛋白质提供位点特异性工程化改造生物正交(biorthogonal)功能性的灵活方法(参见例如Agarwal andBertozzi,Bioconjugate Chem.2015,26:176-92；Sochaj et al.,Biotech.Advances(2015)33:775-84)。为了设计和将非天然氨基酸特异性引入蛋白质诸如抗体或抗体片段，可以连同相应的能够在琥珀终止密码子位点处安装UAA的正交tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶(aaRS)对一起在细胞中表达由在期望UAA的位点处具有琥珀终止密码子(TAG)的基因编码的突变蛋白(参见例如Liu and Schultz(2010)Annu.Rev.Biochem.79:413-44)。在大肠杆菌UAA表达***中掺入的一种非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸，因其酮的生物正交反应性而选择(Wang et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:56-61)。将这种非天然氨基酸缀合至氨基氧基-奥瑞司他汀F，而且所得曲妥珠单抗抗体在小鼠中展示卓越的药动学特性(Tian et al.(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111:1766-1771)。这种位点特异性工程化方法学能扩充至在蛋白质中包括超过一个生物正交官能团。基于将一个或多个非天然氨基酸引入蛋白质的这种办法可提供如下抗体-药物缀合物，其具有特定数目的已知非天然氨基酸替代，容易且一致地缀合治疗性模块，诸如抗癌药物，生成非常均质的ADC组合物，药物缀合限于蛋白质中精确设计和鉴定的位点。

3)硒代半胱氨酸工程化改造的抗体药物缀合物

硒代半胱氨酸是一种天然但罕见的氨基酸，作为硒代蛋白质(其中当前哺乳动物中只知道25种)的构件存在于生命的所有界中。硒代半胱氨酸含有硒代替硫，这使得它在酸性条件中比半胱氨酸对亲电体更具反应性。利用这种化学特性将含有马来酰亚胺和碘乙酰胺的药剂选择性偶联至含有遗传工程化硒代半胱氨酸残基的抗体(Hofer et al.(2009)Biochemistry 48:12047-57；Li et al.(2014)Methods 65:133-38)。利用硒代半胱氨酸将荧光探针，生物素和生物素聚乙二醇(生物素-PEG)缀合至抗体，产生具有药剂附着的特异性限定位点和化学计量的完全功能性缀合物，证明基于硒代半胱氨酸残基工程化的均质ADC的生成(参见例如Agarwal and Bertozzi(2015)Bioconjugate Chem.26:176-92；Sochaj et al.(2015)Biotech.Advances 33:775-84)。

4)聚糖修饰的抗体药物缀合物

人IgG分子在CH2域中的每个N297残基处具有保守的糖基化位点，使得这些悬垂N-聚糖成为位点特异性缀合的方便靶。这个糖基化位点足够远离可变区，使得药物模块对所附着的聚糖的缀合不应影响抗原结合。一种将治疗性模块连接这些聚糖的方法包括用高碘酸盐氧化性切割这些聚糖中含有的邻近二醇模块以生成能还原性胺化并缀合酰肼和氨基氧基化合物的醛(O’Shannessy et al.(1984)Immunol.Lett.8:273-77)。另一种方法包括提高这些聚糖中的N-乙酰基葡萄糖胺残基的岩藻糖基化。这些岩藻糖残基的氧化生成能用于将药物和荧光团连接至抗体上的这些特异性位点的羧酸和醛模块(Zuberbuhler et al.(2012)Chem.Commun.48:7100-02)。另一种方法包括修饰这些聚糖中的唾液酸(以及提高这些聚糖中的唾液酸含量)，继以氧化唾液酸并缀合氨基氧基-药物以生成肟连接的缀合物(Zhou et al.(2014)Bioconjugate Chem.25:510-20)。或者，可以使用唾液酸转移酶将含有生物正交官能团的经修饰唾液酸残基并入这些聚糖。然后可以修饰生物正交官能团以将治疗性模块附着至聚糖的位点(Li et al.(2014)Angew.Chem.Int.53:7179-82)。另一种修饰这些聚糖位点的办法是使用糖基转移酶来将半乳糖或含有酮或叠氮化物的半乳糖类似物连接至这些聚糖中的N-乙酰基葡萄糖胺，并将药物或放射核苷酸连接至半乳糖分子(Khidekel et al.(2003)J.Am.Chem.Soc.125:16162-63；Clark et al.(2008)J.Am.Chem.Soc.130:11576-77；Boeggeman et al.(2007)Bioconjugate Chem.18:806-14)。另一种办法依赖于在通过代谢寡糖工程表达抗体时将经修饰糖引入这些聚糖(Campbell et al.(2007)Mol.BioSyst.3:187-94；Agard et al.(2009)Acc.Chem.Res.42:788-97)。已经与引入岩藻糖类似物，继以岩藻糖基化位点处的药物连接/修饰一起利用这种办法(Okeley et al.(2013)Bioconjugate Chem.24:1650-1655；Okeley et al.(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110:5404-09)。

5)前抗体(Probody)药物缀合物

前抗体(PROBODY^TM，Cytomx Therapeutics LLC，South San Francisco，CA)是重组，蛋白水解活化的抗体前药，由抗体轻链的氨基末端以蛋白酶可切割接头和设计用于阻断抗体结合抗原的掩蔽肽延伸的单克隆抗体构成(美国专利No.8,563,269；Desnoyers etal.,Sci Transl Med.2013,16；5(207):207ra144；Polu and Lowman,Expert Opin BiolTher.2014,14(8):1049-53；Wong et al.,Biochimie.2016,122:62-7)。特异性肿瘤相关蛋白酶对接头的切割导致掩蔽物解离和胜任结合肿瘤中的抗原的抗体释放。前抗体设计成利用相对于健康组织而言肿瘤微环境内存在的细胞外蛋白酶活性的基本失调，由此仅仅最小限度结合其中所存在的活性蛋白酶不足以去除掩蔽物的健康组织中的抗原。在肿瘤内，在足够失调蛋白酶活性存在下，掩蔽物通过对接头的切割而去除，并发生抗原结合。已经工程化改造前抗体药物缀合物(PDC)以使前抗体结合微管抑制剂MMAE(Weidle et al.,CanGen&Proteom,2014,11:67-80；Sagert et al.,Abstract 2665,AACR AnnualMeeting2014)。

6)聚合物或肽缀合物

还使用连接自身能附着至治疗性肽，蛋白质或治疗性小分子的亲水性聚合物或由天然氨基酸构成的肽的抗体或抗体片段形成抗体药物缀合物。如此，该聚合物或肽本质上充当抗体和治疗性模块(药物)之间的接头，但是这种接头提供将附着多个治疗性模块，由此显著提高每个ADC分子的DAR的手段。使用这些构建物，在维持位点特异性ADC的位点特异性缀合属性的同时14-18或甚至更高的DAR是可能的。包括此类肽/聚合物缀合物的例示性ADC包括在抗体，诸如上文描述的半胱氨酸工程化改造的抗体的轻链中的特定，工程化改造的氨基酸残基处连接XTENTM肽缀合物(Amunix，Mountain View，CA)的ADC。这些肽是实质性均质的多肽，作为缀合配偶是有用的，经由交联剂反应物连接一个或多个有效负荷，产生XTEN-有效负荷ADC缀合物。这些肽接头是由在生理条件下具有低度或无二级或三级结构的非天然发生，实质性非重复序列构成的多肽，而且典型地具有约36至约3000个氨基酸，其中大多数或整个是亲水性小氨基酸，有限定数目的正交悬垂反应性基团缀合一个或多个分子的充当细胞表面受体的配体的靶模块和一个或多个分子的效应器药物(美国专利公开文本2015/0037359)。

7)Fc融合蛋白

有极其多种已经作为生物药物产品开发并得到FDA批准在美国作为药物使用的抗体-细胞因子融合蛋白。这些融合蛋白中的大多数以不同细胞因子与全长抗体或其衍生物融合的蛋白质构建物靶向肿瘤抗原(参见例如Ortiz-Sanchez et al.(2008)ExpertOpin.Biol.Ther.8(5):609-32；Sochaj et al.(2015)Biotechnology Advances 33:775-84)。每个细胞因子可融合在抗体的氨基或羧基末端，取决于细胞因子和抗体的结构，从而保留这两种构件的生物学活性。在数目越来越多的抗体衍生物和能与它们组合的不同细胞因子之间，不同抗体-细胞因子融合蛋白的数量很大。另外，正在开发用于非癌症临床适应症诸如自身免疫疾患的Fc融合构建物。这些蛋白质可直接与靶向自身蛋白质的抗体竞争。一般地，这些Fc融合蛋白构建物基于配体特异性(结合配体分子上的一种或多种表位)和价(结合配体分子的化学计量)归入四组：二价及单一配体特异性；单价及多重配体特异性；多价及单一配体特异性；和单价及单一配体特异性。

与Fc融合蛋白构建物不同，这些位点特异性，工程化改造的免疫缀合物可保留其野生型亲本抗体对应物的抗原结合能力。如此，位点特异性抗体缀合物能够结合(优选特异性地)抗原。此类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白，和其它细胞表面分子，跨膜蛋白，信号传导蛋白，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，已知或怀疑在功能上对组织发育或分化有贡献的分子，淋巴因子，细胞因子，牵涉细胞周期调节的分子，牵涉维管发生(vasculogenesis)的分子，和已知或怀疑在功能上对血管发生(angiogenesis)有贡献的分子。肿瘤相关抗原可以为簇分化因子(即CD蛋白)。半胱氨酸工程化改造的抗体能够结合的抗原可以为上文所述范畴之一的一个子集的成员，其中所述范畴的其它子集包含具有不同特征(就感兴趣抗原而言)的其它分子/抗原。

本公开的方法中使用的位点特异性抗体缀合物包括在癌症治疗中有用的免疫缀合物，包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。肿瘤相关抗原是本领域已知的，而且可以制备它们以用于使用本领域公知的方法和信息生成抗体。在发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌性细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜多肽或另外的肿瘤相关多肽。通常，与非癌性细胞的表面上相比，此类肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上更加丰富地表达。对此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经引起经由基于抗体的疗法特异性靶向癌细胞进行破坏的能力。

肿瘤相关抗原TAA的例子包括但不限于下文所列TAA(1)-(53)。为本领域公知的有关这些抗原的信息如下所列，并且按照National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定规定，包括名称，可选择的名称，Genbank登记号和主要参考文献。相当于TAA(1)-(53)的核酸和蛋白质序列可以在公共数据库，诸如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同种型，它们相对于引述的参考文献中鉴定的序列具有至少约70％，80％，85％，90％或95％序列同一性，或表现出基本上与具有引述参考文献中发现的序列的TAA相同的生物特性或特征。例如，具有变体序列的TAA一般能够特异性结合所列相应序列TAA特异性结合的抗体。通过援引明确收录本文中特别引用的参考文献中的序列和公开内容。

肿瘤相关抗原

(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)；ten Dijke,P.,et al Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997)；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)；NP_001194骨形态发生蛋白受体，IB型/pid＝NP_001194.1；交叉援引：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994；

(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)；Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,et al(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第127-129页)；WO200286443(权利要求27；第222，393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白，y+***)，成员5/pid＝NP_003477.3-Homo sapiens；交叉援引：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1；

(3)STEAP1(***的六次跨膜上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)；CancerRes.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,et al(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)；NP_036581***的六次跨膜上皮抗原。交叉援引：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1；

(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号AF361486)；J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001)；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；US 798959；交叉援引：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1；

(5)MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞强化因子，间皮素，Genbank登录号NM_005823)；Yamaguchi,N.,et al Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995)；WO2003101283(权利要求14)；(WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉援引：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1；

(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b，Genbank登录号NM_006424)；J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),Feild,J.A.,et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉援引：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1；

(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema域，七次血小板反应蛋白重复(1型和1型样)，跨膜域(TM)和短胞质域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)；Nagase T.,et al(2000)DNA Res.7(2):143-150；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43，48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；登录号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA2700050C12，RIKENcDNA 2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；Ross et al(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；交叉援引：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1；

(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体，Genbank登录号AY275463)；Nakamuta M.,et alBiochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.,et alBiochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.,et al Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.,et al J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,YanagisawaM.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.,et alJ.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.,et al J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.,et al Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.,et alProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.,et alJ.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.,et al Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.,et al Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；HofstraR.M.W.,et al Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.,et al Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.,et al,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.,etal Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.,et al Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.,et al Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.,et alHum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.,et al Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.,et al(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；Col 31-34)；WO2004001004；

(10)MSG783(RNF124，假设的蛋白质FLJ20315，Genbank登录号NM_017763)；WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；交叉援引：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1；

(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六次跨膜上皮抗原2，六次跨膜***蛋白，Genbank登录号AF455138)；Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002)；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉援引：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1；

(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体潜在阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)；Xu,X.Z.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell 109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003)；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；交叉援引：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1；

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎瘤衍生的生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola,A.,et al EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991)；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95，105页)；WO200222808(权利要求2；图1)；US 5,854,399(实施例2；第17-18栏)；US 5,792,616(图2)；交叉援引：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1；

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴二氏病毒受体)或Hs.73792Genbank登录号M26004)；Fujisaku et al(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.,etal J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.,et al Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.,et alProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.,et al(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；登录号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1；

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29，Genbank登录号NM_000626或11038674)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller et al(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625；WO2004016225(权利要求2，图140)；WO2003087768，US2004101874(权利要求1，第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1，第306和309页)；WO 99/558658，US 6,534,482(权利要求13，图17A/B)；WO200055351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉援引：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1；

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(含SH2域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C，Genbank登录号NM_030764，AY358130)；Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics 54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.,et al(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；交叉援引：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1；

(17)HER2(ErbB2，Genbank登录号M11730)；Coussens L.,et al Science(1985)230(4730):1132-1139；Yamamoto T.,et al Nature 319,230-234,1986；Semba K.,et alProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.,et al J.CellBiol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.,et al J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；ChoH.-S.,et al Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.,et al(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5,869,445(权利要求3；第31-38栏)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；登录号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1。EMBL；M11761；AAA35808.1；

(18)NCA(CEACAM6，Genbank登录号M18728)；Barnett T.,et al Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1。EMBL；M18728；

(19)MDP(DPEP1，Genbank登录号BC017023)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002)；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；交叉援引：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1；

(20)IL20Rα(IL20Ra，ZCYTOR7，Genbank登录号AF184971)；Clark H.F.,et alGenome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.,et al Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.,et al Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.,et al J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.,et al J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.,et al(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.,et al(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1；

(21)短小蛋白聚糖(BCAN，BEHAB，Genbank登录号AF229053)；Gary S.C.,et alGene 256,139-147,2000；Clark H.F.,et al Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)；

(22)EphB2R(DRT，ERK，Hek5，EPHT3，Tyro5，Genbank登录号NM_004442)；Chan,J.and Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉援引：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1；

(23)ASLG659(B7h，Genbank登录号AX092328)；US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234，452-453页)；WO 0116318；

(24)PSCA(***干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)；Reiter R.E.,etal Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.,et al Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO9851805(权利要求17；第97页)；WO9851824(权利要求10；第94页)；WO9840403(权利要求2；图1B)；登录号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1；

(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合配偶样蛋白/pid＝AAP14954.1-Homo sapien物种：Homo sapiens(人)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3，权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；交叉援引：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1；

(26)BAFF-R(B细胞活化性因子受体，BLyS受体3，BR3，Genbank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-Homo sapiens；Thompson,J.S.,et al Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(第136-137栏)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；交叉援引：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600；

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同等型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814，Genbank登录号AK026467)；Wilson et al(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉援引：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1；

(28)CD79a(CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α，与Igβ(CD79B)共价相互作用并与IgM分子在表面上形成复合物，转导牵涉B细胞分化的信号的B细胞特异性蛋白)；pI：4.84；MW：25028；TM：2[P]基因染色体：19q13.2，Genbank登录号NP_001774.10)；WO2003088808，US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4，第13-14页)；WO9958658(权利要求13，图16)；WO9207574(图1)；US 5,644,033；Ha et al(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller et al(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto et al(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme et al(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu et al(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi et al(1988)EMBO J.7(11):3457-3464；

(29)CXCR5(伯基特氏淋巴瘤受体1，由CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染和可能AIDS，淋巴瘤，骨髓瘤，和白血病发生中发挥作用的G蛋白偶联受体)；372aa；pI：8.54；MW：41959；TM：7[P]基因染色体：11q23.3，Genbank登录号NP_001707.1)；WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US 6,555,339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20，第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO9928468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2，第49-52栏)；WO9428931(第56-58页)；WO9217497(权利要求7，图5)；Dobner et al(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella et al(1995)Biochem.J.309:773-779；

(30)HLA-DOB(结合肽并将它们呈递给CD4+T淋巴细胞的MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；273aa；pI：6.56；MW：30820；TM：1[P]基因染色体：6p21.3，Genbank登录号NP_002111.1)；Tonnelle et al(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson et al(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck et al(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius et al(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck et al(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse etal(2002)Tissue Antigens59:512-519；WO9958658(权利要求13，图15)；US 6,153,408(第35-38栏)；US 5,976,551(第168-170栏)；US6011146(第145-146栏)；Kasahara et al(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar et al(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119；

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由细胞外ATP门控的离子通道，可能牵涉突触传递和神经发生，缺陷可促成特发性逼尿肌不稳定的病理生理情况)；422aa；pI：7.63；MW：47206；TM：1[P]基因染色体：17p13.3，Genbank登录号NP_002552.2；Le et al(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman et al(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)；

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)，pI：8.66；MW：40225；TM：1[P]基因染色体：9p13.3，Genbank登录号NP_001773.1；WO2004042346(权利要求65)；WO2003026493(第51-52，57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen et al(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和凋亡，功能丧失与具有***性红斑狼疮的患者中的疾病活性升高有关)；661aa；pI：6.20；MW：74147；TM：1[P]基因染色体：5q12，Genbank登录号NP_005573.1；US2002193567；WO9707198(权利要求11，第39-42页)；Miura et al(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura et al(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8，第57-61页)；WO200012130(第24-26页)；

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，含有C2型Ig样和ITAM域的推定的免疫球蛋白Fc域的受体，可能在B淋巴细胞分化中具有作用)；429aa；pI：5.28；MW：46925；TM：1[P]基因染色体：1q21-1q22，Genbank登录号NP_443170.1；WO2003077836；WO200138490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davis et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)；

(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2，可能在B细胞发育和淋巴瘤发生中有作用的推定的免疫受体；基因通过易位的失调在一些B细胞恶性中发生)；977aa；pI：6.88；MW：106468；TM：1[P]基因染色体：1q21，Genbank登录号人：AF343662，AF343663，AF343664，AF343665，AF369794，AF397453，AK090423，AK090475，AL834187，AY358085；小鼠：AK089756，AY158090，AY506558；NP_112571；WO2003024392(权利要求2，图97)；Nakayama etal(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3，图18B-1-18B-2)；

(36)TENB2(TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，推定的跨膜蛋白聚糖，涉及EGF/调蛋白家族的生长因子和促卵泡素抑制素)；374aa；NCBI登录号：AAD55776，AAF91397，AAG49451，NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI Gene：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登录号AF179274；AY358907，CAF85723，CQ782436；WO2004074320；JP2004113151；WO2003042661；WO2003009814；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie et al(2000)Genomics 67:146-152；Uchida et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang et al(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones et al(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2):178-84；

(37)PMEL17(silver同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.et al(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.et al(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306；

(38)TMEFF1(具有EGF样和两个促卵泡素抑制素样域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)Genes Dev.17(21),2624-2629；Gery,S.et al(2003)Oncogene 22(18):2723-2727；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim,M.H.et al(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.et al(1996)Nature 382(6586):80-83；

(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.et al(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.et al(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；

(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蟾Xenopus laevis)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.et al(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.et al(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；

(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.et al(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.et al(1999)J.Immunol.163(1):278-287；

(43)LGR5(含富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.et al(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.et al(2003)Hepatology 37(3):528-533；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.et al(2009)Cancer Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.et al(2009)Oncogene 28(34):3058-3068；

(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.et al(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.et al(2003)Int.J.Cancer 103(6):768-774；

(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.and Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O'Dowd,B.F.et al(1996)FEBSLett.394(3):325-329；

(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.et al(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.et al(2009)Anticancer Res.29(2):617-623；

(48)ASPHD1(含天冬氨酸β羟化酶域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.et al(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.et al(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.et al(2009)Int.J.Cancer125(4):909-917；

(50)TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.et al(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.etal(2006)Nature 440(7082):346-351；

(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.et al(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.et al(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101；

(52)CD33，唾液酸结合性，免疫球蛋白样凝集素家族的一个成员，是一种67kDa糖基化跨膜蛋白。在定型的骨髓单核细胞和类红细胞祖细胞以外，CD33在大多数髓样和单核细胞性白血病细胞上表达。在最早的多能干细胞，成熟粒细胞，淋巴样细胞，或非造血细胞上没有看到它(Sabbath et al.,(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews et al.,(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在它的胞质尾上含有两个酪氨酸残基，其中每一个继以疏水性残基，与在许多抑制性受体中看到的免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)相似。

(53)CLL-1(CLEC12A，MICL，和DCAL2)，编码C型凝集素/C型凝集素样域(CTL/CTLD)超家族的一个成员。此家族的成员分享共同的蛋白质折叠且具有多样的功能，诸如细胞粘附，细胞-细胞信号传导，糖蛋白周转，和炎症和免疫应答中的作用。由此基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节物。此基因的数种可变剪接转录变体已有描述，但是这些变体中一些的全长性质尚未确定。此基因与染色体12p13上的天然杀伤基因复合物区中的其它CTL/CTLD超家族成员有紧密连锁(Drickamer K.(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585-90；van Rhenen A.et al.(2007)Blood 110(7):2659-66；Chen CH.et al.(2006)Blood 107(4):1459-67；Marshall AS.et al.(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159-69；Bakker AB.et al.(2005)Cancer Res.64(22):8443-50；Marshall AS.et al.(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792-802)。已经显示CLL-1是一种II型跨膜受体，其包含单一C型凝集素样域(预测其不结合钙或糖)，茎区，和跨膜域和含有ITIM基序的短胞质尾。

抗体衍生物

可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

抗体和非蛋白质性质模块的缀合物可以通过暴露于辐射选择性加热来形成。此类缀合物的非蛋白质性质模块可以是碳纳米管(Kam等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605)。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。一般地，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。例示性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生于L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102氨基酸残基(Kabat编号方式)。除了VH中的CDR1之外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的CDR或a-CDR的CDR区域中。例示性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生于L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102氨基酸残基(Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)。除非另外指明，在本文中依照Kabat等，见上文对可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)编号。

“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等(2007)J.Chromatogr.B 848:79-87。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物内的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。

“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物或荧光团缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

多特异性抗体

本文中提供的抗体可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。如本文中使用的，术语“多特异性抗体”指包含具有多表位特异性(即能够结合一种分子上的两种或更多种不同表位或能够结合两种或更多种不同分子上的表位)的抗原结合域的抗体。

在例示性实施方案中，多特异性抗体是对至少两个不同抗原结合位点具有结合特异性的单克隆抗体(诸如双特异性抗体)。多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合一种和相同分子内的两种表位(分子内结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合相同分子上的两种不同表位。在某些实施方案中，多特异性抗体结合的两种不同表位是正常情况下不受一个单特异性抗体，诸如例如常规抗体或一个免疫球蛋白单一可变域同一时间结合的表位。多特异性抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合位于两种截然不同分子内的表位(分子间结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合域可结合一种分子上的一种表位，而多特异性抗体的第二抗原结合域可结合一种不同分子上的另一种表位，由此交联该两种分子。

多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合域可包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元结合第一表位而第二VH/VL单元结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或更多个VL和VH域的抗体，和抗体片段(诸如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体，已经共价或非共价连接的抗体片段)。进一步包含至少部分重链可变区和/或至少部分轻链可变区的VH/VL单元也可称作“臂”或“半体”或“半抗体”。半体可包含部分重链可变区，其足以容许与第二半体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半体包含节突变或穴突变，例如为了容许与包含互补穴突变或节突变的第二半体或半抗体异二聚化。下文讨论节突变和穴突变。

本文中提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。如本文中使用的，术语“双特异性抗体”指包含能够结合一种分子上的两种不同表位或能够结合两种不同分子上的表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。例示性的双特异性抗体可结合该分子和任何其它抗原二者。结合特异性之一可针对HER2且另一针对CD3。参见例如美国专利No.5,821,337。双特异性抗体可结合相同分子的两种不同表位。双特异性抗体可结合两种不同分子上的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达癌症相关抗原的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)，WO 93/08829，和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))，和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168，WO2009/089004，US2009/0182127，US2011/0287009，Marvin和Zhu，ActaPharmacol.Sin.(2005)26(6)：649-658，和Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.，26：1-9)。如本文中使用的，术语“节-入-穴”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将***(节)引入一条多肽并将空腔(穴)引入另一条多肽中，在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面，CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(见例如US 2011/0287009，US2007/0178552，WO 96/027011，WO 98/050431，Zhu等(1997)Protein Science6：781-788，和WO2012/106587)。在一些实施方案中，KnH在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起。例如，在它们的Fc区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单一可变域，或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外域或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列(例如包括亲和抗体(affibody)，肽体(peptibody)和其它Fc融合物)配对在一起。

如本文中使用的，术语“节突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入***(节)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有穴突变。

如本文中使用的，术语“穴突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入空腔(穴)的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有节突变。

“***”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿空腔中，从而稳定异多聚体，并由此例如有利于异多聚体形成，超过同多聚体形成。***可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码***。为了实现这一点，将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。可以有超过一个初始和对应输入残基。各种氨基酸残基的侧链体积显示于例如US2011/0287009的表1。引入“***”的突变可称作“节突变”。

用于形成***的输入残基可以是选自精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的天然发生氨基酸残基。例示性输入残基是色氨酸或酪氨酸。用于形成***的初始残基可具有较小侧链体积，诸如丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸或缬氨酸。

“空腔”指至少一个氨基酸侧链自第二多肽的界面凹进并因此容纳第一多肽的邻近界面上的对应***。空腔可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要小的“输入”氨基酸残基的DNA替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。用于形成空腔的输入残基可以是选自丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的天然发生氨基酸残基。输入残基可以是丝氨酸，丙氨酸或苏氨酸。用于形成空腔的初始残基具有较大的侧链体积，诸如酪氨酸，精氨酸，苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可称作“穴突变”。

***“可放置”在空腔中，这意味着***和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置及***和空腔的大小使得***能定位在空腔中，而对第一和第二多肽在界面处的正常联合没有显著扰乱。因为***诸如Tyr，Phe和Trp通常不与界面的轴垂直延伸且具有优选构象，所以***与对应空腔的排列在一些情况中可能依赖于***/空腔对基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的)的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。

IgG1恒定区中的一种例示性节突变为T366W(EU编号方式)。IgG1恒定区中的例示性穴突变可包含一处或多处选自T366S，L368A和Y407V(EU编号方式)的突变。IgG1恒定区中的一种例示性穴突变可包含T366S，L368A和Y407V(EU编号方式)。

IgG4恒定区中的一种例示性节突变为T366W(EU编号方式)。IgG4恒定区中的一种例示性穴突变可包含一处或多处选自T366S，L368A，和Y407V(EU编号方式)的突变。IgG4恒定区中的一种例示性穴突变包含T366S，L368A，和Y407V(EU编号方式)。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本公开的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007)。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体(Portolano等(1993)J.Immunol.150:880-887；Clarkson等(1991)Nature352:624-628)。

“肿瘤相关抗原”(TAA)是本领域已知的，如上文提供的例示性TAA列表中提供的，而且可以制备它们以用于使用本领域公知的方法和信息生成人或人源化抗体。在发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的尝试中，研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌性细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜多肽或另外的肿瘤相关多肽。通常，与非癌性细胞的表面上相比，此类肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上更加丰富地表达。对此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经引起经由基于抗体的疗法特异性靶向癌细胞进行破坏的能力。TAA的例子包括但不限于美国专利No.8,679,767和8,541,178中描述的那些，明确将它们收入本文。

可以使用重组方法和组合物来生成在本公开的方法中有用的ADC的抗体构件，例如，如记载于US 4,816,567的。提供了编码本文中所描述的此类抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。还提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。还提供了包含此类核酸的宿主细胞。宿主细胞可包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。宿主细胞可以是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。如此，提供了生成抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。

对于抗体的重组生成，可将编码抗体的核酸分离，并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。

适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如US 5,648,237；US 5,789,199；US5,840,523(还可见Charlton,Methodsin Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。

在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株(Gerngross(2004)Nat.Biotech.22:1409-1414；Li等(2006)Nat.Biotech.24:210-215)。

适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主(美国专利No.5,959,177；美国专利No.6,040,498；美国专利No.6,420,548；美国专利No.7,125,978；美国专利No.6,417,429，描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等(1977)J.Gen Virol.36:59的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather(1980)Biol.Reprod.23:243-251的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠***肿瘤(MMT 060562)；TR1细胞，如记载于例如Mather等(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216)；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述提供于例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。

可以通过本领域中已知的多种测定法对ADC的抗体构件鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。可以对抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA或Western印迹等来进行。还可使用竞争测定法来鉴定与另一种已知抗体竞争对抗原的结合的抗体。竞争性抗体可结合与已知抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope MappingProtocols”,Methods in Molecular Biology Vol.66(Humana Press,Totowa,N.J.)。

形成位点特异性ADC的例示性抗体可包括但不限于曲妥珠单抗(trastuzumab)，奥瑞珠单抗(ocrelizumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，抗PD1，抗PD-L1，抗神经毡蛋白(neuropilin)-1，抗MUC16，利妥昔单抗(rituximab)，抗间皮素，抗LY6E，抗STEAP1，抗FcRH5，抗CD22，抗B7H4，抗LGR5，抗CD79b，和抗Napi2b。

可以经由接头单元将形成ADC的药物构件的药物模块共价附着至抗体以形成抗体-药物缀合物，以实现靶向治疗效应。ADC化合物的一个例示性实施方案包含靶向例如肿瘤细胞的抗体(Ab)，细胞毒性或细胞抑制性药物模块(D)，和将Ab附着至D的接头模块(L)。通过接头模块(L)经由一个或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸和半胱氨酸)将抗体附着至D；组成具有式：Ab-(L-D)_p，其中p为1至约20，或约2至约5。可经由反应性接头模块缀合至抗体分子的药物模块的数目可受到半胱氨酸残基的数目限制，包括抗体中存在的或可通过本文所述方法引入的游离半胱氨酸残基，或形成抗体的链间二硫键的天然半胱氨酸。

ADC的药物模块(D)可包括任何治疗性化合物，模块或基团，尤其是具有细胞毒性或细胞抑制性效应的基团。例示性药物模块可通过包括但不限于微管蛋白结合，DNA结合或插层，和抑制RNA聚合酶，蛋白质合成，和拓扑异构酶的机制来发挥此类细胞毒性和细胞抑制性效应。一些细胞毒性药物在缀合至大型抗体或蛋白质受体配体时趋于没有活性或不太有活性。例示性药物模块包括但不限于肽(包括包含一个或多个非天然氨基酸的治疗性肽，诸如环肽，β肽，稳定肽，和半胱氨酸节肽)，聚酰胺，美登木生物碱，多拉司他汀，奥瑞司他汀，加利车霉素，吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)，PNU-159682，蒽环，倍癌霉素，长春花生物碱，紫杉烷，单端孢菌素，CC1065，倍癌霉素，喜树碱，依利奈法德，包括利福霉素或利福霉素类似物的抗生素，荧光团，放射性同位素，及其立体异构体，电子等排体，类似物或衍生物，而且包括这些药物具有细胞毒性活性的衍生物。

Fc区变体

可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的形成位点特异性ADC的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。

本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，这使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox

非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova，S.B.等，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

可以在抗体的Fc部分中引入一处或多处氨基酸修饰以提高对新生儿Fc受体的IgG结合。抗体可包含下述三处依照EU编号方式的突变：M252Y，S254T，和T256E(“YTE突变”)(美国专利No.8,697,650；还见Dall’Acqua等，Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。YTE突变不影响抗体结合其关联抗原的能力。YTE突变与天然(即非YTE突变体)抗体相比可延长抗体的血清半衰期。YTE突变与天然(即非YTE突变体)抗体相比可将抗体的血清半衰期延长2至10倍。见例如美国专利No.8,697,650；还见Dall’Acqua等，Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。

YTE突变体可提供调控抗体的ADCC活性的一种手段。YTEO突变体可提供调控针对人抗原的人源化IgG抗体的ADCC活性的一种手段。见例如美国专利No.8,697,650；还见Dall’Acqua等，Journal of Biological Chemistry281(33):23514-23524(2006)。

YTE突变体可容许同时调控血清半衰期，组织分布，和抗体活性(例如IgG抗体的ADCC)。见例如美国专利No.8,697,650；还见Dall’Acqua等，Journal of BiologicalChemistry 281(33):23514-23524(2006)。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有依照EU编号方式的Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在依照EU编号方式的氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括依照EU编号方式的残基265和297替代成丙氨酸(即依照EU编号方式的D265A和N297A)的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。在某些实施方案中，Fc突变体包含下述两处氨基酸替代：D265A和N297A。在某些实施方案中，Fc突变体由下述两处氨基酸替代组成：D265A和N297A。

野生型人Fc区的位置329(EU编号方式)处的脯氨酸(P329)可以是用甘氨酸或精氨酸或大得足以破坏Fc/Fcγ受体界面内Fc的P329和FcgRIII的色氨酸残基W87和W110之间形成的脯氨酸三明治的氨基酸残基(Sondermann等：Nature 406，267-273(20July 2000))替代的。在又一个实施方案中，Fc变体中的至少一处进一步的氨基酸替代为S228P，E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D，或P331S，而且在仍有另一个实施方案中，所述至少一处进一步的氨基酸替代为人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E，均依照EU编号方式(US 8,969,526，通过援引将其完整收录)。

多肽可包括野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中该多肽所具有的人IgG Fc区的P329是用甘氨酸替代的，且其中该Fc变体包含至少两处进一步的氨基酸替代，人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E，且其中残基是依照该EU编号方式编号的(US8,969,526，通过援引将其收录)。包含P329G，L234A和L235A(EU编号方式)替代的多肽展现降低对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力，用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于下调ADCP(美国专利No.8,969,526，通过援引将其收录)。

包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽可包括三重突变：依照EU编号方式的位置Pro329处的氨基酸替代，L234A和L235A突变(P329/LALA)(US8,969,526，通过援引将其收录)。在例示性实施方案中，该多肽包含下述氨基酸替代：依照EU编号方式的P329G，L234A，和L235A。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如US6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

抗体变体可包括具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(EU编号方式)的替代的Fc区。

可以对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于US 6,194,551，WO99/51642，及Idusogie等(2000)J.Immunol.164：4178-4184的。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在依照EU编号方式的Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(US7,371,826)。还可见Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

半胱氨酸工程化改造的抗体变体

可能想要创建半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“THIOMAB^TM抗体”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定的实施方案中，替代残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点且可用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物中间体，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，下述残基中任一个或多个可以用半胱氨酸替代：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A140(EU编号方式)；重链的L174(EU编号方式)；重链的Y373(EU编号方式)；轻链的K149(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。在具体实施方案中，本文中描述的抗体包含HC-A140C(EU编号方式)半胱氨酸替代。在具体实施方案中，本文中描述的抗体包含LC-K149C(Kabat编号方式)半胱氨酸替代。在具体实施方案中，本文中描述的抗体包含HC-A118C(EU编号方式)半胱氨酸替代。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如美国专利No.7,521,541；9,000,130中所述生成。

抗体可包含下述重链半胱氨酸替代之一：

链(HC/LC)	残基	EU突变位点#	Kabat突变位点#
				HC	A	118	114
HC	T	114	110
				HC	A	140	136
HC	L	174	170
				HC	L	179	175
HC	T	187	183
				HC	T	209	205
HC	V	262	258
				HC	G	371	367
HC	Y	373	369
				HC	E	382	378
HC	S	424	420
				HC	N	434	430
HC	Q	438	434

抗体可包含下述轻链半胱氨酸替代之一：

链(HC/LC)	残基	EU突变位点#	Kabat突变位点#
				LC	I	106	106
LC	R	108	108
				LC	R	142	142
LC	K	149	149
				LC	C	205	205

接头

“接头”(L)为可用于连接一个或多个药物模块(D)与抗体(Ab)以形成式I的ADC的双官能或多官能模块。在一些实施方案中，可以使用具有用于共价附着至药物和抗体的反应性官能度的接头制备ADC。例如，在一些实施方案中，半胱氨酸工程化改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能基形成键以生成ADC。

接头可具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价二硫键的官能度(参见例如Klussman et al.(2004),Bioconjugate Chemistry15(4):765-773第766页处的缀合方法，和本文中的实施例)。

例示性间隔物构件包括缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，和对氨基苄基氧基羰基(“PAB”)。本领域知道多种接头构件。

接头可具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。非限制性例示性此类反应性官能度包括马来酰亚胺，卤代乙酰胺，α-卤代乙酰基，活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯，酸酐，氯化酸，磺酰氯，异氰酸酯，和异硫氰酸酯。参见例如Klussman et al.(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773第766页上的缀合方法及本文中的实施例。

接头可具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能度。例示性此类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。接头的反应性官能度的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。此类反应性官能度的非限制性例子包括但不限于酰肼(hydrazide)，肟(oxime)，氨基(amino)，肼(hydrazine)，硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)，肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)，和芳酰肼(arylhydrazide)。

接头可包含一种或多种接头构件。例示性接头构件包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)，马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)，缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，对氨基苄氧羰基(“PAB”)，N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)，和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。本领域已知多种接头构件，下文描述了其中一些。

接头可以是便于释放药物的“可切割接头”。非限制性例示性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)，蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头，光不稳定接头，或含二硫化物接头(Chari et al.(1992)Cancer Research52:127-131；US 5,208,020)。

接头可包含二硫化物基团和药物模块之间的一个或多个间隔物单元。一个例子包括具有下式的接头：

-A_a-W_w-Y_y-，

其中A为“延伸物单元”(stretcher unit)，而a为0至1的整数；W为“氨基酸单元”，而w为0至12的整数；Y为“间隔物单元”(spacer unit)，而y是0，1，或2；且Ab，D，和p如上文关于式I定义的。此类接头的例示性实施方案记载于美国专利No.7,498,298，通过述及明确将其收入本文。

接头构件可包括将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”。例示性延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体，药物，或别的接头构件的位点)：

接头可以是肽模拟物接头，诸如WO2015/095227，WO2015/095124或WO2015/095223中记载的那些，据此通过援引收录这些文件。

药物模块

本发明的位点特异性ADC化合物包含缀合一个或多个药物模块的抗体，药物模块包括下述：

美登素和美登木素生物碱

在一些实施方案中，ADC包含缀合一个或多个美登木素生物碱分子的抗体。美登木素生物碱是美登素的衍生物，而且是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝***抑制剂。美登素最初自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(US 3896111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(US 4151042)。合成的美登木素生物碱披露于例如US 4137230；US 4248870；US 4256746；US 4260608；US 4265814；US4294757；US 4307016；US 4308268；US 4308269；US 4309428；US 4313946；US 4315929；US 4317821；US 4322348；US 4331598；US 4361650；US4364866；US 4424219；US 4450254；US 4362663；和US 4371533。

美登木素生物碱药物模块为抗体-药物缀合物中有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于接近以便通过发酵或化学修饰或衍生发酵产物来制备；(ii)易于使用适合于通过非二硫化物接头与抗体缀合的官能基衍生；(iii)在血浆中稳定；和(iv)对多种肿瘤细胞系有效。

适合于用作美登木素生物碱药物模块的某些美登素化合物为本领域已知并且可以按照公知方法分离自天然来源或使用遗传工程技术生产(参见例如Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:7968-7973)。还可以按照已知方法通过合成制备美登木素生物碱。

例示性美登木素生物碱药物模块包括但不限于那些具有修饰的芳族环的，诸如：C-19-去氯(美国专利No.4,256,746)(例如通过ansamytocin P2的氢化铝锂还原制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(例如通过使用链霉菌属(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)脱甲基化或使用LAH脱氯制备)；和C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(OCOR)，+/-去氯(美国专利No.4,294,757)(例如通过使用酰基氯酰化制备)和那些在芳香环的其它位置上具有修饰的。

例示性美登木素生物碱药物模块还包括那些具有诸如如下修饰的：C-9-SH(US 4,424,219)(例如通过使美登醇与H₂S或P₂S₅反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH₂OR)(US 4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(US 4450254)(例如由Nocardia制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(例如通过由链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(US4,313,946和US 4,315,929)(例如分离自Trewia nudlflora)；C-18-N-去甲基(US4,362,663和US 4,322,348)(例如通过用链霉菌属使美登醇脱甲基化制备)；和4,5-脱氧(US 4,371,533)(例如通过美登醇的三氯化酞/LAH还原制备)。

美登木素生物碱化合物上的许多位置作为连接位置是有用的。例如，可以通过使用常规偶联技术与羟基反应形成酯连接。该反应可以在具有羟基的C-3位置，使用羟甲基修饰的C-14位置，使用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置上进行。所述连接在美登醇或美登醇类似物的C-3位置上形成。

美登木素生物碱药物模块包括那些具有下列结构的：

其中波形线指示美登木素生物碱药物模块的硫原子对ADC的接头的共价附着。每个R可独立是H或C₁-C₆烷基。将酰胺基团附着至硫原子的亚烷基链可以是甲烷基，乙烷基，或丙基，即m为1，2，或3(US 633410；US 5208020；Chari et al(1992)Cancer Res.52:127-131；Liu et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93:8618-8623)。

对本发明的ADC而言，关注美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即在手性碳上的R和S构型的任意组合(US 7276497；US 6913748；US6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison et al(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，通过援引将其完整收录)。在一些实施方案中，美登木素生物碱药物模块具有下列立体化学：

美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括但不限于DM1；DM3；和DM4，它们具有如下结构：

其中波形线指示药物的硫原子对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着。

含有美登木素生物碱的免疫缀合物，生成它们的方法，及其治疗性用途披露于例如US 5208020和US 5416064；US 2005/0276812A1；和欧洲专利EP0 425 235B1，据此通过援引明确收录其公开内容。还可参见Liu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)；及Chari et al.Cancer Research52:127-131(1992)。

抗体-美登木素生物碱缀合物可以通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子任一的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020(据此通过援引明确收录其公开内容)。每个抗体分子平均缀合3-4个美登木素生物碱分子的ADC在增强针对靶细胞的细胞毒性方面显示功效且对抗体的功能或溶解度没有负面影响。在一些情况中，甚至一个分子的毒素/抗体预期较之裸抗体的使用增强细胞毒性。

用于生成抗体-美登木素生物碱缀合物的例示性连接基团包括例如本文中描述的那些和美国专利No.5208020；欧洲专利0425235；Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)；US 2005/0276812；和US 2005/016993中披露的那些，据此通过援引明确收录其公开内容。

奥瑞司他汀和多拉司他汀

药物模块可包括多拉司他汀，奥瑞司他汀，及其类似物和衍生物(US5635483；US5780588；US 5767237；US 6124431)。奥瑞司他汀是海洋软体动物化合物多拉司他汀-10的衍生物。虽然并非意图受理论束缚，已经显示多拉司他汀和奥瑞司他汀干扰微管动力学，GTP水解以及核和细胞***(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀/奥瑞司他汀药物模块可以通过肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 02/088172；Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784；Francisco等(2003)Blood102(4):1458-1465)。

例示性奥瑞司他汀实施方案包括N端连接的单甲基奥瑞司他汀药物模块，其披露于US 7498298和US 7659241，通过援引明确将其公开内容完整收入本文。

式D_E的一个例示性奥瑞司他汀实施方案是MMAE，其中波形线指示对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着：

式D_F的一个例示性奥瑞司他汀实施方案是MMAF，其中波形线指示对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着：

其它例示性实施方案包括在五肽奥瑞司他汀药物模块的C端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽奥瑞司他汀药物模块的C端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。

典型地，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如液相合成法来制备(参见例如E.

和K.Lübke,“ThePeptides”,volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)。奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277；Pettit,G.R.,et al.Synthesis,1996,719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。

式D_E(诸如MMAE)和D_F(诸如MMAF)的奥瑞司他汀/多拉司他汀药物模块，及其药物-接头中间体和衍生物，诸如MC-MMAF，MC-MMAE，MC-vc-PAB-MMAF，和MC-vc-PAB-MMAE可使用US 7498298；Doronina et al.(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124；及Doronina etal.(2003)Nat.Biotech.21:778-784中描述的方法来制备，然后缀合至感兴趣抗体。

加利车霉素

抗生素的加利车霉素家族及其类似物能够以亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂(Hinman et al.，(1993)Cancer Research 53:3336-3342；Lode et al.，(1998)CancerResearch 58:2925-2928)。加利车霉素具有细胞内作用位点，但是在某些情况中，不容易穿过质膜。因此，在一些实施方案中，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取可能大大增强它们的细胞毒效应。制备具有加利车霉素药物模块的抗体-药物缀合物的非限制性例示性方法记载于例如US 5,712,374；US 5,714,586；US 5,739,116；US 5,767,285；和WO2017/068511。

缀合至抗体的药物模块为具有下式的加利车霉素化合物：

其中X为Br或I；L为接头；R为氢，C_1-6烷基，或-C(＝O)C_1-6烷基；且R^a为氢或C_1-6烷基。

吡咯并苯并二氮杂卓

ADC可包含吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)药物模块。PDB二聚体可识别并结合特定DNA序列。天然产物安曲霉素(anthramycin)(一种PBD)首次报告于1965年(Leimgruber et al.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5793-5795；Leimgruber et al.(1965)J.Am.Chem.Soc.87:5791-5793)。自此以后，报告了一些PBD(天然发生的和类似物二者)(Thurston et al.(1994)Chem.Rev.1994，433-465)，包括三环PBD支架的二聚体(US 6,884,799；US 7,049,311；US 7,067,511；US 7,265,105；US 7,511,032；US 7,528,126；US 7,557,099)。并非意图受理论束缚，认为二聚体结构赋予适宜的三维形状以实现与B型DNA的小沟的同螺旋度(isohelicity)，导致在结合位点处的紧密贴合(Kohn，in Antibiotics III.Springer-Verlag，New York，pp.3-11(1975)；Hurley and Needham-VanDevanter(1986)Acc.Chem.Res.19:230-237)。携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物已经显示出作为细胞毒剂是有用的(Hartley et al.(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard et al.(2009)Bioorganic andMed.Chem.Letters19(22):6463-6466)。

可采用PBD化合物作为药物前体，这通过用在体内可移除的氮保护基团在N10位置处保护它们来实现(WO 00/12507；WO 2005/023814)。

已经将PBD二聚体缀合至抗体，而且所得ADC显示出具有抗癌特性(US2010/0203007)。PBD二聚体上的非限制性例示性连接位点包括五元吡咯环，PBD单元之间的系链，和N10-C11亚胺基团(WO 2009/016516；US2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO2011/130598)。

接头可附着于PBD二聚体药物模块的多个位点之一，包括B环的N10亚胺，C环的C-2内/外位，或连接A环的系链单元(见下文结构C(I)和C(II))。

在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-1的结构：

其中n为0或1。

在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-2的结构：

其中n为0或1。

在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-3的结构：

其中R^E和R^E”各自独立选自H或R^D，其中R^D如上文定义的；且

其中n为0或1。

在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，R^E和/或R^E”为H。在一些实施方案中，R^E和R^E”为H。在一些实施方案中，R^E和/或R^E”为R^D，其中R^D为任选取代的C_1-12烃基。在一些实施方案中，R^E和/或R^E”为R^D，其中R^D为甲基。

在一些实施方案中，ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-4的结构：

其中Ar¹和Ar²各自独立为任选取代的C_5-20芳基；其中Ar¹和Ar²可以是相同的或不同的；且

其中n为0或1。

ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-5的结构：

其中Ar¹和Ar²各自独立为任选取代的C_5-20芳基；其中Ar¹和Ar²可以是相同的或不同的；且

其中n为0或1。

Ar¹和Ar²可各自独立选自任选取代的苯基，呋喃基，硫苯基和吡啶基。在一些实施方案中，Ar¹和Ar²各自独立为任选取代的苯基。在一些实施方案中，Ar¹和Ar²各自独立为任选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar¹和Ar²各自独立为任选取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基基团可以经由任何可利用环位置结合至PBD核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基，喹啉-3-基，喹啉-4-基，喹啉-5-基，喹啉-6-基，喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基，异喹啉-3-基，异喹啉-4-基，异喹啉-5-基，异喹啉-6-基，异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。

ADC的一种例示性PBD二聚体构件具有式A-6的结构：

ADC的别的非限制性例示性PBD二聚体构件具有式B：

及其盐和溶剂合物，其中：

波形线表示共价附着至接头的位点；

连接至OH的波形线表示S或R构型；

R^V1和R^V2独立选自H，甲基，乙基和苯基(苯基可以是任选用氟取代的，特别是在4位)和C_5-6杂环基；其中R^V1和R^V2可以是相同的或不同的；且

n为0或1。

R^V1和R^V2可独立选自H，苯基，和4-氟苯基。

ADC的非限制性例示性PBD二聚体构件包括系链连接的式C(I)和C(II)：

式C(I)和C(II)以它们的N10-C11亚胺形式显示。例示性PBD药物模块还包括甲醇胺以及受到保护的甲醇胺形式，如下文表中显示的：

其中：

X为CH₂(n＝1至5)，N，或O；

Z和Z’独立选自OR和NR₂，其中R为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；R₁，R’₁，R₂和R’₂各自独立选自H，C₁-C₈烷基，C₂-C₈烯基，C₂-C₈炔基，C_5-20芳基(包括取代的芳基)，C_5-20杂芳基基团，-NH₂，-NHMe，-OH，和-SH，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；

R₃和R’₃独立选自H，OR，NHR，和NR₂，其中R为含有1至5个碳原子的伯，仲或叔烃基链；

R₄和R’₄独立选自H，Me，和OMe；

R₅选自C₁-C₈烷基，C₂-C₈烯基，C₂-C₈炔基，C_5-20芳基(包括用卤素，硝基，氰基，烃氧基，烃基，杂环基取代的芳基)和C_5-20杂芳基基团，其中，在一些实施方案中，烷基，烯基和炔基链包含多至5个碳原子；

R₁₁为H，C₁-C₈烃基，或保护基团(诸如乙酰基，三氟乙酰基，叔丁氧羰基(BOC)，苄氧羰基(CBZ)，9-芴基甲基烯酰基羰基(Fmoc)，或包含自我牺牲单元的模块诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；

R₁₂为H，C₁-C₈烃基，或保护基团；

其中R₁，R’₁，R₂，R’₂，R₅，或R₁₂之一的一个氢或A环之间的-OCH₂CH₂(X)_nCH₂CH₂O-间隔物的一个氢用连接至ADC的接头的键替换。

本文所述包含PBD二聚体的ADC可以通过将包括吡啶离去基团的接头-药物中间体经由硫原子与抗体的半胱氨酸硫醇缀合以形成二硫化物连接来生成。进一步地，在一些实施方案中，本文所述包含PBD二聚体的ADC可以通过缀合包括硫代吡啶基离去基团的接头-药物中间体来生成，其中吡啶环是用一个或多个硝基基团取代的。在一些实施方案中，吡啶环是用-NO₂单取代的。在一些实施方案中，-NO₂单取代相对于二硫化物是对位的。在一些实施方案中，PBD二聚体是经由N10位置连接的。例如，非限制性的例示性的包含PBD二聚体的ADC可以通过将单甲基乙基吡啶基二硫化物，N10连接的PBD接头中间体(下文所示)缀合至抗体来生成：

PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可依照本领域已知方法来制备。参见例如WO2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO2011/130598；WO 2013/055987。

蒽环

本公开的位点特异性ADC可包含蒽环。蒽环是展现细胞毒性活性的抗生化合物。并非意图受理论束缚，蒽环可通过多种不同机制运作来杀伤细胞，包括：1)将药物分子***细胞的DNA中，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)由药物生成自由基，然后自由基与细胞高分子反应以引起对细胞的损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson etal.，“Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And HumanLeukemia”in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur，“FreeRadical Damage”id.at pp.97-102)。由于它们的细胞毒性潜力，蒽环已经用于治疗众多癌症，诸如白血病，乳腺癌，肺癌，卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik，inAnthracycline：Current Status and New Developments p 11)。

例示性蒽环包括多柔比星，表柔比星，伊达比星，道诺霉素，奈莫柔比星，及其衍生物。已经制备并研究柔红霉素和多柔比星的免疫缀合物和药物前体(Kratz et al.(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey et al.(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362；Torgov et al.(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834；Dubowchik et al.(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King et al.(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP 0328 147；US 6,630,579)。抗体-药物缀合物BR96-多柔比星与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性反应，而且已经在I和II期研究中进行评估(Saleh et al.(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani et al.(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher et al.(1999)J.Clin.Oncology17:478-484)。

PNU-159682是一种有力的奈莫柔比星代谢物(或衍生物)(Quintieri et al.(2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的一种半合成类似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基团，而且已经处于临床评估(Grandi et al.(1990)Cancer Treat.Rev.17:133；Ripamonti et al.(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，包括针对肝细胞癌瘤的II/III期试验(Sun et al.(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22，Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research 44:1st Ed，Abs 4649；Pacciarini et al.(2006)Jour.Clin.Oncology24:14116)。

在一些实施方案中，含奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星构件为PNU-159682：

其中波形线表示附着至接头(L)。

可以经由数个连接位点和多种接头(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)(包括本文所述接头)将蒽环(包括PNU-159682)缀合至抗体。

例示性ADC可以如下生成，其通过将吡啶基二硫化物PNU酰胺(下文所示)缀合至抗体：

以生成二硫化物连接的PNU-159682抗体-药物缀合物：

PNU-159682，马来酰亚胺乙缩醛-Ab的接头是酸不稳定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab，PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物-Ab，和PNU-159682-val-cit-PAB-间隔物(R¹R²)-Ab的接头是蛋白酶可切割的。

1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体药物模块

在一些实施方案中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(氨基CBI)类的DNA小沟烷化剂是有力的细胞毒素(Atwell et al.(1999)J.Med.Chem.,42:3400)，而且已经作为效应器单元用于为癌症疗法设计的多类前体药物。这些包括抗体缀合物(Jeffrey et al.(2005)J.Med.Chem.,48:1344)，基于氨基甲酸硝基苄酯的用于基因疗法的前体药物(Hay et al.(2003)J.Med.Chem.46:2456)和作为缺氧活化的前体药物的相应硝基CBI衍生物(Tercel et al.(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50:2606-2609)。已经通过烷基链将CBI和吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓(PBD)药效团连接到一起(Tercel et al.(2003)J.Med.Chem46:2132-2151)。

位点特异性ADC可包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体(WO2015/023355)。该二聚体可以为异二聚体，其中该二聚体的一半为CBI模块且该二聚体的另一半为PBD模块。

一种例示性CBI二聚体包含式：

其中

R¹选自H，P(O)₃H₂，C(O)NR^aR^b，或与接头(L)的键；R²选自H，P(O)₃H₂，C(O)NR^aR^b，或与接头(L)的键；

R^a和R^b独立选自H和任选用一个或多个F取代的C₁-C₆烷基，或者R^a和R^b形成五或六元杂环基基团；

T为选自C₃-C₁₂亚烷基，Y，(C₁-C₆亚烷基)-Y-(C₁-C₆亚烷基)，(C₁-C₆亚烷基)-Y-(C₁-C₆亚烷基)-Y-(C₁-C₆亚烷基)，(C₂-C₆亚烯基)-Y-(C₂-C₆亚烯基)，和(C₂-C₆亚炔基)-Y-(C₂-C₆亚炔基)的拴系基团；

其中Y独立选自O，S，NR¹，芳基，和杂芳基；

其中亚烷基，亚烯基，芳基，和杂芳基是独立且任选用F，OH，O(C₁-C₆烷基)，NH₂，NHCH₃，N(CH₃)₂，OP(O)₃H₂，和C₁-C₆烷基取代的，其中烷基是任选用一个或多个F取代的；

或者亚烷基，亚烯基，芳基，和杂芳基是独立且任选用与L的键取代的；

D'为药物模块，其选自：

其中波状线表示附着至T的位点；X¹和X²独立选自O和NR³，其中R³选自H和任选用一个或多个F取代的C₁-C₆烷基；R⁴为H，CO₂R，或与接头(L)的键，其中R为C₁-C₆烷基或苄基；且R⁵为H或C₁-C₆烷基。

鹅膏蕈毒素和鹅膏蕈碱

位点特异性ADC可包含一个或多个鹅膏蕈毒素分子。鹅膏蕈毒素是由8个氨基酸构成的环肽。它们可以自蘑菇鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)分离或合成制备。鹅膏蕈毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II，并由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白质生物合成。细胞中对转录的抑制引起生长和增殖停止。见例如Moldenhauer etal.JNCI 104:1-13(2012)，WO2010115629，WO2012041504，WO2012119787，WO2014043403，WO2014135282，和WO2012119787，在此通过援引将它们完整收录。一个或多个鹅膏蕈毒素分子可以是α-鹅膏蕈碱分子。

其它药物模块

药物模块还可包括格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler et al(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler et al(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)；和酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白A链(ricin Achain)，相思豆毒蛋白A链(abrin A chain)，蒴莲根毒蛋白A链(modeccin A chain)，α-帚曲霉素(alpha-sarcin)，油桐(Aleurites fordii)毒蛋白，香石竹毒蛋白(dianthinproteins)，美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。见例如WO 93/21232。药物模块还可包括具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶)。

要理解，在多于一个亲核基团与药物-接头中间体或与接头试剂反应的情况中，所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。

接头-药物中间体可以通过依照WO 2013/055987；WO 2015/023355；WO2010/009124；WO 2015/095227的规程偶联药物模块与接头试剂，并与本文所述蛋白质，包括半胱氨酸工程化改造的抗体缀合来制备。

分析和量化位点特异性ADC中的抗体和药物模块的方法

ADC是设计用于相对于常规小分子和抗体癌症化疗降低非特异性毒性并提高功效的靶向抗癌治疗剂。它们采用单克隆抗体有力的靶向能力来将高度有力的，缀合的小分子治疗剂特异性投递至癌细胞。为了评估这些ADC诸如功效，稳定性，同源性，药动学和毒性等特性，经由样品分析性分析自溶液，血浆，尿液，和其它生物学样品精确表征和量化抗体构件和药物模块是有用的。

本公开提供用于量化和分析位点特异性ADC治疗性构建物的抗体和药物构件的特征的可再现的，精确的，且有效的分析性方法。图1b显示本公开的一种ADC样品测定法的工作流的卡通图，其包括任选的自样品亲和捕捉ADC，位点特异性酶促消化(其可包括自ADC切割并释放药物)，和随后通过层析术和/或质谱术方法分析药物和肽片段。

在这些方法中，将位点特异性ADC构建物用一种或多种特异性酶消化以形成经消化ADC组合物，其含有至少一种没有连接药物模块的肽片段和至少一种连接药物模块的肽片段。然后通过层析术/质谱术分析药物和经消化抗体构件/片段之一或二者以测定ADC的特征，可包括但不限于ADC组合物的蛋白质浓度，ADC的总抗体浓度，ADC的药物浓度和/或平均DAR，ADC代谢物或分解代谢物结构，和ADC的消光系数。

可以用蛋白水解酶诸如IdeS蛋白酶，IdeZ蛋白酶，IgdE蛋白酶，SpeB蛋白酶，牙龈菌蛋白酶，内切糖苷酶，和这些酶的组合消化ADC样品的蛋白质构件。

IdeS是一种由酿脓链球菌(S.pyogenes)生成且可自Promega(Madison，WI)和Genovis AB(Cambridge，MA)商购的细胞外半胱氨酸蛋白酶。因酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶而命名为IdeS的这种酶以高度特异性在铰链区以下切割人IgG，产生F(ab′)2和Fc片段的均质池。如此，其它人蛋白质(包括免疫球蛋白M，A，D和E)不受IdeS消化。该酶高效切割结合至链球菌表面结构的IgG抗体，由此抑制吞噬细胞对酿脓链球菌的杀伤，导致这种酶鉴定为细菌毒力的一个决定因子和潜在治疗靶(von Pawel-Rammingen et al.,EMBO J.(2002)21(7):1607-15)。IdeS酶的蛋白水解切割位点显示于下表：

IgG类和亚类	IdeS切割位点	SEQ ID No.
			人IgG1	..CPAPELLG/GPSVF..	1
人IgG2	..CPAPPVA/GPSVF..	2
			人IgG3	..CPAPPVA/GPSVF..	2
人IgG4	..CPAPPVA/GPSVF..	2
			小鼠IgG1	不切割
小鼠IgG2a	..CPAPPVA/GPSVF..	2
			小鼠IgG2b	不切割
小鼠IgG3	..CPAPPVA/GPSVF..	2
			大鼠IgG2b	..CPAPPVA/GPSVF..	2
猕猴	..CPAPPVA/GPSVF..	2
			家兔	..CPAPPVA/GPSVF..	2

HTCPPCPAPELLGGPSVF SEQ ID NO.：1

HTCPPCPAPPVAGPSVF SEQ ID NO.：2

IdeZ蛋白酶(IgG特异性)是一种自马链球菌(Streptococcus equi)兽疫(zooepidemicus)亚种克隆的抗体特异性蛋白酶，识别所有人，绵羊，猴，和家兔IgG亚类，特异性切割铰链区以下的单一识别位点，产生F(ab′)2和Fc片段的均质池，且可自NewEngland Biolabs(Ipswich，MA)，Promega(Madison，WI)，和Genovis AB(Cambridge，MA)商购。IdeZ蛋白酶具有与IdeS蛋白酶相比显著改善的针对小鼠IgG2a和IgG3亚类的活性。

IgdE是猪链球菌(Streptococcus suis)中唯独靶向猪IgG的一种蛋白酶。因猪链球菌的免疫球蛋白G降解酶而命名为IgdE的这种酶是一种与IdeS家族的链球菌免疫球蛋白降解蛋白酶不同的半胱氨酸蛋白酶且以高度特异性切割猪IgG的铰链区(Spoerry et al.,J Biol Chem.(2016)291(15):7915-25)。

SpeB是一种自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)分离的半胱氨酸蛋白酶，其降解IgA，IgM，IgE，和IgD，并在还原后在铰链区中切割IgG抗体，即切割处于还原状态的IgG分子，例如在二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇，或L-半胱氨酸存在下(Persson et al.,Infect.Immun.(2013)81(6):2236-41)。

牙龈菌蛋白酶Kgp(也称作Lys-牙龈菌蛋白酶)是一种由牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)分泌的半胱氨酸蛋白酶，其在温和还原条件下在上部铰链区(在K223和T224之间)片段中切割人IgG1，生成Fab和Fc的均质池。一种重组形式的牙龈菌蛋白酶Kgp可商购自Genovis AB(Cambridge，MA)。

内切糖苷酶代表由酿脓链球菌表达的一个酶家族，能够自糖蛋白诸如免疫球蛋白释放末端唾液酸残基，和特别是IgG的Asp279。EndoS是一种用于抗体去糖基化的特异性内切糖苷酶。在本公开的方法中可能有用的另外的内切糖苷酶包括EndoS2，EndoH，EndoA，EndoM，EndoF，EndoF1，EndoF2，和EndoF3中的一种或多种。内切糖苷酶可以与上文在用于层析术/光谱术分析的经消化位点特异性ADC的制备中描述的一种或多种蛋白酶组合在本公开的测定法中使用。

用于消化位点特异性ADC构建物的蛋白水解酶可以选择成生成独特肽片段进行检测和量化。检测并量化对于ADC的抗体独特的一种或多种肽片段，由此消除背景或应用于层析术或光谱术的分析样品中可能存在的不形成ADC的部分的非特异性蛋白质或其它污染物。

在例示性实施方案中，没有用胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，内切蛋白酶LysC，内切蛋白酶ArgC，金黄色葡萄球菌V8，糜蛋白酶，Asp-N，Asn-C，PNGaseF，内切蛋白酶GluC，LysN，或这些酶的任意组合消化ADC样品。如此，在例示性实施方案中，在消化或分析规程中的，ADC样品并不含有可检测量的胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，内切蛋白酶LysC，内切蛋白酶ArgC，金黄色葡萄球菌V8，糜蛋白酶，Asp-N，Asn-C，PNGaseF，内切蛋白酶GluC，或LysN。

取决于ADC的接头构件的身份和为了还原，变性，和/或消化样品的蛋白质构件应用的化学制品处理，可以自ADC的抗体/肽构件切割ADC的药物模块，而且因此可以在LC-MS/MS分析中作为未缀合的药物构件检测和量化。

或者/另外，ADC的药物模块构件可以在还原和变性ADC之后保持连接至ADC的抗体/肽构件，而且因此可以在分析中作为肽结合的药物模块检测和量化。

用于分析/量化的含有ADC的样品可以在没有任何初步样品清洁或富集的情况中提交消化(和任选的还原和/或变性)(即“直接消化”样品)。或者/另外，可以在消化前富集或浓缩含有ADC的样品用于进一步分析。低丰度肽或药物的此类浓缩可以包括诸如大小排阻层析，透析，选择性沉淀，差速离心，过滤，凝胶电泳，液相层析，反相层析，免疫沉淀，包括蛋白A和蛋白G，NHS和链霉亲合素铁或磷或固定化抗体或凝集素的SpinTrap柱，顺磁性珠，免疫消减，分级，固相萃取，磷酸肽富集，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脱盐，等等富集技术。

可以通过与包括至少一种还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)，2-巯基乙醇，或三(2-羧基乙基)膦(TCEP))的组合物接触使ADC还原。还可以通过与包括至少一种变性剂，例如甲酰胺，二甲基甲酰胺，乙腈，SDS，脲，胍，3-((1-(呋喃-2-基)十一烷基氧基)羰基氨基)丙烷-1-磺酸钠(ProteaseMax^TM)，和/或酸不稳定性表面活性剂，诸如那些含有二氧杂环戊烷(dioxolane)或二噁烷(dioxane)官能团的，诸如RapiGest^TM-SF表面活性剂(如US 7,229,539和US 8,580,533中所述；通过援引将其收入本文)的组合物接触使ADC变性。可以通过与包括至少一种还原剂和至少一种变性剂的组合物接触使ADC同时还原和变性。此类组合物可以包括另外的溶剂，缓冲剂和/或pH变调剂，诸如乙腈，甲醇，乙醇，HCl，碳酸氢铵，乙酸铵，和/或甲酸，去磷酸化剂，包括磷酸酶，诸如小牛肠碱性磷酸酶，牛肠碱性磷酸酶，或λ蛋白质磷酸酶。

为分析呈现的ADC也可以存在于溶液或悬浮液中，诸如为施用于动物或人配制的药物组合物，或ADC的生产步骤中可能存在的细胞培养物或上清液中，或自动物或人获得的生物学样品中。如此，ADC可能存在于选自缓冲液，全血，血清，血浆，脑脊液，唾液，尿液，淋巴，胆汁，粪，汗液，玻璃状液，泪液，和组织的基质中。为ADC的各种安全性，功效和药动学/生物分布参数的分析频繁呈现的生物学样品包括人，食蟹猴，大鼠，和小鼠血浆和组织样品，以及来自其它非人物种的生物学样品。

当作为此类生物学样品的一部分呈现时，可以使ADC与亲和捕捉介质接触。亲和捕捉是一种用于富集/分离完整蛋白质，鉴定结合配偶和蛋白质复合物，或调查翻译后修饰的广泛使用的方法。可以通过非特异性手段(例如凝胶电泳，蛋白A或G介质，1型抗神经元核自身抗体(ANNA-1，也称作“抗Hu”)，或特异性手段(例如胞外域(ECD)抗体，或抗独特性抗体)分出蛋白质或蛋白质复合物。然后可以自亲和捕捉介质洗脱ADC，作为样品清洁的手段，之后是消化(任选包括还原和/或变性)，和后续对消化物的层析术/质谱术分析。

或者/另外，通过珠或树脂支持的蛋白A/G用亲和捕捉分析ADC样品，继以珠上消化(其可以包括蛋白水解，去糖基化，去磷酸化，还原，和/或变性)，之后是自亲和捕捉介质洗脱富集的消化抗体样品，和后续层析术/质谱术分析。通过免疫亲和膜(IAM)捕捉和质谱术，检测和筛选抗体-药物缀合物的方法已经公开(US 7,662,936)，包括基于珠的亲和捕捉方法(US 8,541,178)。

然后将包含位点特异性ADC的药物(或肽-接头-药物)和消化抗体构件之一或二者的分析样品(或其至少一部分)应用于可包括高效液体层析(HPLC)，反相液体层析术(RP-LC)，质谱术(MS)或串联质谱术(MS/MS)，RP-LC/MS和LC-MS/MS的检测方法学以检测和量化ADC的药物和抗体构件二者。

可以使用质谱术来建立消化抗体的至少一种肽片段的质量对电荷比，和/或ADC的药物(或肽-接头-药物)模块的质量对电荷比。

摩尔消光系数(或质量衰减系数)等于摩尔衰减系数乘以摩尔质量。蛋白质在280nm处的摩尔消光系数大多广泛取决于芳香族残基，特别是色氨酸的数目，而且能自氨基酸序列预测。如此，如果摩尔消光系数已知，那么可利用它来确定溶液中蛋白质的浓度。

通过援引将本文中引用的每一篇出版物或专利完整收入本文。

现在一般性描述的公开通过参考下面的实施例(仅仅为了例示本公开的实施方案的某些方面的目的而包括它们)会变得更加容易理解。实施例并非意图限制公开，因为本领域技术人员会根据上文的教导和下面的实施例认识到其它技术和方法能满足权利要求且能在不偏离请求保护的公开的范围的情况中采用。

实施例

材料。人肝素锂血浆购自BioreclamationIVT(New York，U.S.A.)。链霉亲合素包被Dyna珠M-280购自Invitrogen(CA，U.S.A.)。IdeS，即FabRICATOR，购自Genovis公司(Cambridge，MA)。其它试剂包括含有0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(GE Healthcare；Little Chalfont，U.K.)和肽N-糖苷酶F(PNGaseF；ProZyme；CA，U.S.A.)的HBS-EP缓冲液。所有TDC和特异性ADC捕捉试剂，例如ECD，在Genentech(SouthSan Francisco，CA，U.S.A.)处生成。ECD用对ECD而言10摩尔当量的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce/Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，U.S.A.)在10mM磷酸钠/150mM NaCl，pH 7.8中于室温生物素化60分钟。使用Zeba旋转脱盐柱(Pierce/Thermo FisherScientific)遵照制造商的方案去除过量未结合生物素。通过使用GeneQuant 1300(GEHealthcare)于280nm测量吸光度，以分光光度法测定生物素化ECD浓度。

动物血浆样品。所有动物研究依照国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)实验动物护理和使用指南(guidelines for the care and use of laboratoryanimals)进行并得到Genentech公司的科研动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准。对于PK研究，对雌性C.B-17SCID小鼠(CharlesRiver Laboratories)施用单剂ADC静脉内推注注射，并经由末梢心脏穿刺自动物采集全血。将血液样品收集入含有肝素锂的管并容许在湿冰上放置直至离心(在收集15分钟内)。将收集的血浆样品保存于-70℃直至分析。以相似方式获得来自Sprague-Dawley大鼠的血浆样品。

仪器。使用2mL方顶96深孔板(Analytical Sales and Service，Pompton Plains，NJ，U.S.A.)在KingFisher 96磁性粒子处理器(Thermo Electron)上进行亲和捕捉。将洗出液转移至VWR Dynablock 96孔0.5mL板(VWR Scientific Products)。在偶联Sciex

5600质谱仪(Redwood City，CA，USA)的Waters nanoACQUITY UPLC***(Cambridge，MA，U.S.A.)上进行毛细管RPLC-MS。

实施例1：IdeS(第2代)亲和捕捉LC-MS测定法设计和验证

对位点特异性ADC，包括具有Fab区中的缀合位点的TDC进行亲和捕捉LC-MS测定法(Su,D.et al.(2016)Anal.Chem.,88(23):11340-11346；Xu,K.et al.(2013)Bioanalysis,5:1057-1071；US 8541178；Xu,K.et al.(2011)Anal.Biochem.412:56-66)。为了测试和验证本公开的多路测定法，IdeS蛋白酶(图1A)在特定位点处去除含有聚糖的Fc区，由此缩小分析物的尺寸和ADC分解代谢物的异质性。使用IdeS的珠上消化预期快速生成F(ab')2(约100kDa)用于最终的LC-MS分析，代替完整ADC(约150kDa)。与用于测试TDC的体内稳定性和PK评估的第1代亲和捕捉LC-MS相比，由IdeS提供的缩小的分析物尺寸和快速消化导致改善的灵敏度和分辨率，和最小限度的人为药物修饰或分解和富集过程期间个体DAR种类的同等回收。当对具有不同抗体，接头-药物，和缀合位点的多种TDC测试时，这种第2代亲和捕捉LC-MS对于分析位点特异性ADC的DAR和分解代谢物表征显示令人惊讶的改善。

图1B提供在这个实施例中测试的第2代LC-MS测定法的卡通图示，而图1C显示比较在这个实施例中测试和比较的第1代和第2代测定法的实施方案的卡通图示。

自已经静脉内施用TDC的小鼠，大鼠和食蟹猴模型收集体内血浆样品。所有动物研究依照NIH实验动物护理和使用指南实施。血浆购自BioreclamationIVT(New York，USA)。所有TDC和特异性ADC捕捉试剂，例如胞外域(ECD)和抗人(Fab区)抗体，在Genentech(SouthSan Francisco，CA，USA)处生成。ECD和抗人(Fab区)抗体用对ECD或抗人(Fab区)抗体而言10摩尔当量的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce/Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)在10mM磷酸钠/150mM NaCl，pH 7.8中于室温生物素化60分钟。使用ZEBA^TM旋转脱盐柱(Pierce/Thermo Fisher Scientific)遵照制造商的方案去除过量未结合生物素。通过使用GENEQUANT^TM1300(GE Healthcare)于280nm测量吸光度，以分光光度法测定生物素化ECD或抗人(Fab区)抗体浓度。

第1代亲和捕捉LC-MS的测定法试验详情先前已有描述(Kaur等人的US8541178；Xuet al.,Anal.Biochem.2011,412(1):56-66)。对于第2代测定法的比较测试，将100μL链霉亲合素顺磁性珠(链霉亲合素包被Dyna珠M-280；Invitrogen(CA，USA))添加至装有HBS-EP缓冲液(300μL；0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％P20(GE Healthcare；Little Chalfont，UK))中的过量生物素化特异性捕捉试剂，例如ECD的96深孔板，并在摇动中于室温(RT)温育1小时。然后将含有TDC的血浆样品添加(最大量2μg或250μL，以较少者为准)至ECD固定化珠至总体积300-500μL，并在摇动中于RT温育1.5小时。

用通用捕捉试剂，生物素化抗人IgG F(ab’)2抗体的亲和捕捉对于捕捉所有不同人源化治疗性抗体ADC是有用的且在具有不同治疗分支的研究中或在没有特异性ECD可得的情况中是适宜的。来自第2代LC-MS测定法的结果显示通用抗人IgG F(ab’)2与ADC分析物的特异性ECD捕捉相似。

使用2-mL方顶96深孔板(Analytical Sales and Service，Pompton Plains，NJ，USA)在KingFisher 96磁性粒子处理器(Thermo Electron)上进行亲和捕捉。将洗出液转移至VWR Dynablock 96孔0.5mL板(VWR Scientific Products)。在偶联AB Sciex 5600三联飞行时间(TOF)质谱仪(Redwood City，USA)的Waters nanoACQUITY UPLC***(Cambridge，MA，USA)上进行毛细管RPLC-MS。

与关于第1代方法描述的PNGaseF(PROZYME^TM；CA)消化过夜形成对比，将亲和捕捉的TDC用HBS-EP缓冲液(300μL)中的IdeS蛋白酶(FABRICATOR^TM，Genovis AB)(40个单位)于37℃消化1小时。小心进行所有摇动，确保贯穿消化规程珠在溶液中较好悬浮。将新生成的F(ab')2片段在珠上用HBS-EP缓冲液，水和10％ACN顺序清洗，然后通过在50μL含1％甲酸的30％乙腈中于RT温育10分钟来洗脱。将后续F(ab')2洗脱在Bruker离心机中以4000rpm于RT旋转10分钟，然后转移至96孔板以用磁铁去除残余珠。在LC-MS前将最终的洗脱以4000rpm于RT旋转10分钟以避免注射任何残余珠。将F(ab')2洗脱的5μL等分试样提交LC-MS分析。

在偶联Waters NanoAcquity的TripleTOF 5600质谱仪上实施毛细管LC-MS。以流速15μL/min以流动相A，0.1％甲酸(FA)和B，含0.1％FA的乙腈(ACN)使用梯度条件在PS-DVB单根柱(500-μm i.d.×5cm，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上于65℃进行在先脱盐和预浓缩。LC梯度是0％B(0-4分)，0-40％B(4-8分)，40％B(8-11分)，40-100％B(11-12.5分)，100％B(12.5-13.5分)，100-0％B(13.5-14.2分)，0％B(14.2-15分)。头6分钟将LC流转向废液。以下述关键设置与DuoSpray离子源一起运转三联TOF 5600：离子源温度，425.0℃；离子源气体(GS)1，40；GS2，35；幕气体，30；离子喷射电压浮动，5000V；去簇电压，250；碰撞能，20。使用ANALYST^TMTF 1.6以完整蛋白质模式获取质谱。用BIOANALYST^TM1.5.1实施解卷积。基于解卷积质谱中的峰面积获得个体TDC DAR种类的相对比。认为±15％内的计算结果没有显著差异：平均DAR＝∑(％峰面积×缀合的药物的数目)/100。

对于方法开发，测试直接LC-MS并与第1代和第2代亲和捕捉LC-MS二者比较。以总浓度100μg/mL作为DAR0:DAR2≈1:1混合裸抗体(DAR0)和TDC标准品(DAR2)。对于第1代和第2代亲和捕捉LC-MS，分别将TDC混合物的20μL等分试样掺入100μL人血浆至20μg/mL的终浓度。将TDC混合物的另一份10μL等分试样掺入50μL含1％FA的30％ACN并直接提交LC-MS分析。已知比的TDC混合物通过直接LC-MS的DAR概况分析容许确定所有个体DAR是否具有相似LC-MS响应。例如，如果通过直接LC-MS的相对DAR比与理论值一致，那么在LC回收和离子化效率方面针对任何个体DAR种类没有显著偏移。通过亲和捕捉LC-MS和直接LC-MS的DAR概况分析中的一致性会提示亲和富集过程期间个体DAR种类的无偏移回收。

通过注射相同量的起始TDC标准品混合物，图1D显示直接LC-MS(1D-1)，第1代(1D-3)和第2代(1D-2)亲和捕捉LC-MS之间的比较。例示性TDC含有吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(PBD)作为细胞毒性药物有效负荷。相似的保留时间和电荷包膜(charge envelope)提示在不同TDC DAR种类的离子化效率方面没有显著差异，容许利用个体DAR种类的相对比(基于它们在解卷积质谱中的峰面积)的半量化。ADC分解代谢物含有糖化和/或其它修饰。在直接LC-MS和第2代亲和捕捉LC-MS之间在DAR0和DAR2的相对比方面没有显著差异，指示个体DAR种类(DAR0和DAR2)的无偏移捕捉。用具有不同抗体，Fab区中的缀合位点，接头(马来酰亚胺和二硫化物)，和毒素(DNA破坏剂，包括蒽环，CBI二聚体和PBD二聚体，和微管蛋白结合物)的极其多种TDC标准品(DAR0和DAR2)进一步测试第2代亲和捕捉方法。通过直接LC-MS办法观察到相似的离子化效率和DAR0和DAR2的相对比，确认第2代亲和捕捉LC-MS适用于极其多种Fab位点特异性抗体-药物缀合物。

PNGaseF消化，第1代，亲和捕捉LC-MS测定法方法使用TDC(

抗体药物缀合物)标准品混合物，其包括经由马来酰亚胺基-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基氧基羰基(MC-vc-PAB)接头的缀合细胞毒性药物单甲基奥瑞司他汀E(MMAE)的半胱氨酸工程化，抗MUC16抗体。稍后发现这种方法取决于接头-药物和抗体对个体DAR显示不同响应。将测量DAR0:DAR2与理论值1比较，与计算结果没有显著差异，在±15％内。第1代和/或IdeS蛋白酶过夜消化亲和捕捉LC-MS的测量DAR0:DAR2与理论值的差异是显著的，指示长时间(例如过夜)珠上消化引起亲和富集步骤期间个体DAR的潜在有偏移回收。第2代亲和捕捉LC-MS中关于ECD固定化，ADC和ECD结合，和珠上消化步骤的缩短且优化的温育时间最小化不同DAR的潜在有偏移捕捉并因此提供更加精确的关于DAR概况分析的信息。如此，第2代亲和捕捉LC-MS的优点包括：

第2代LC-MS的MS强度(最大230cps)比第1代分析(最大48cps)要高。

第2代亲和捕捉LC-MS容许检测低至大约20ng(0.2μg/mL×100μL)的TDC。

第2代测定法更好地分辨邻近MS峰。

对第2代捕捉LC-MS观察到更加完全的聚糖去除。

与通过PNGaseF过夜消化的去糖基化相比，通过IdeS蛋白酶的Fc去除在约1小时内完成，大大改进测定法效率(第2代LC-MS的1天对第1代LC-MS的2天)。

专门设计亲和捕捉LC-MS来鉴定ADC分解代谢物，表征DAR概况，及由此了解循环中的ADC的命运和PK行为。因此重要的是贯穿样品制备过程保留ADC完整性，从而精确反映体内生物转化。然而，使用PNGaseF消化，第1代亲和捕捉LC-MS测定法，观察到含有不稳定细胞毒性药物的ADC在长时间温育后经历非故意的变化，诸如离体有效负荷代谢(图1F-1)。不稳定TDC，TDC-L2在体内大鼠血浆中通过亲和捕捉LC-MS完整抗体测定法(左)和F(ab')2测定法的分析(图1F-2)。源自离体有效负荷代谢的人为部分药物损失(-PD)通过于37℃ IdeS消化一小时和亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法最小化。TDC-L2具有CBI二聚体药物模块和马来酰亚胺接头。此类人为ADC分解代谢物的生成在第2代亲和捕捉LC-MS中最小化(图1F-2)，其中IdeS消化在1小时内完成。缩短的消化时间能够实现ADC完整性方面最小限度的非故意变化，并且如此提供更加精确的关于体内ADC生物转化和PK行为的信息。

图3A显示TDC(PBD二聚体药物，二硫化物接头)标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS测定法，亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和亲和捕捉LC-MS完整抗体测定法的DAR概况分析，3份复制品的标准偏差分别为0.13，0.09，和0.14。使用含有掺入的TDC标准品混合物的人血浆(100μL)进行亲和捕捉并注射5μL洗出液进行LC-MS分析。图3B显示具有以二硫化物接头共价附着至半胱氨酸工程化改造的抗体的PBD二聚体(TDC1和TDC4)，蒽环(TDC2)和CBI二聚体(TDC5)药物模块的TDC的TDC标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS，具有IdeS消化1小时的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和具有IdeS消化过夜的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法的DAR(药物-抗体比)概况分析。使用含有掺入的TDC标准品混合物的人血浆(100μL)进行亲和捕捉并注射5μL洗出液进行LC-MS分析。通过IdeS过夜消化亲和捕捉LC-MS，TDC2的测量DAR0:DAR2误差是显著的，指示延长的珠上温育(例如过夜消化)导致样品制备期间不同药物加载TDC2种类的潜在有偏移回收。例如，在亲和捕捉LC-MS F(ab′)2测定法中，显著缩短的珠上消化时间最小化不同ADC种类的潜在有偏移回收并由此提供更加精确的关于DAR评估的信息。

在复杂ADC分解代谢物的分析中，邻近解卷积MS峰需要近基线分开以容许精确指派ADC分解代谢物结构。图1E显示通过切割硫醇-马来酰亚胺键的接头-药物解缀合(-LD)。由于自药物分子损失42Da，在体内在小鼠血浆中生成多种TDC分解代谢物。它们的MS峰通过PNGaseF消化分辨不了，第1代亲和捕捉LC-MS(图1E-1)，但是通过IdeS消化，第2代亲和捕捉LC-MS得到近基线分辨(图1E-2)，这能够实现可信的分解代谢物鉴定和更加精确的DAR计算。这种精确信息有助于了解ADC功效和毒性概况以及ADC药物代谢，这继而帮助优化新细胞毒性ADC设计，这聚焦于新类型的抗体平台，缀合化学，接头，和药物。ADC的药物开发期间必须验证的多个药物和代谢参数和复杂的体内分解代谢物对生物分析性分析造成挑战。例如，由于其有限的灵敏度，分辨率，效率和对某些DAR种类的潜在有偏移响应，发现第1代亲和捕捉LC-MS(一种对于DAR和分解代谢物表征有用的探索性测定法)一般并非适用于下一代ADC。这种PNGaseF消化，第2代测定法容纳低剂量和不稳定位点特异性ADC，在药物开发中变成占优势。图1E显示在体内在小鼠血浆中复杂TDC分解代谢物通过亲和捕捉LC-MS完整抗体测定法(1E-1)较之亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法(1E-2)的表征。通过接头-药物解缀合(-PD)的部分药物损失显著影响TDC-L1的效力，导致DAR相应缩小。

这个比较性实施例中采用的第2代亲和捕捉方法利用IdeS蛋白酶通过去除聚糖中大多数所定位的Fc片段进行去糖基化。通过LC-MS分析保留接头-药物的所得F(ab')2片段(约100kDa)，代替传统的完整ADC(约150kDa)。与通过用PNGaseF过夜消化的去糖基化比较，通过珠上IdeS消化快速去除Fc和缩小的F(ab')2分析物尺寸导致具有更高灵敏度，分辨率，和效率的改良测定法，以及最小限度的样品加工期间ADC概况和完整性的非故意变化，如下表中汇总的：

表：对第1代测定法的变化和改进

延伸亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法以分析常规ADC，其中药物经由链间二硫化物结合。没有IdeS蛋白酶消化，在通过PNGaseF过夜去糖基化之后，需要LC分开以洗脱轻链(25kD)和重链(50kD)片段，因为轻链片段(较小尺寸)遏制重链片段(较大尺寸)的离子化/MS信号。有IdeS蛋白酶消化，轻链和重链具有相似尺寸(约23-29kDa)且能同时洗脱和分析，具有最小限度的针对重链MS偏移。当利用通用捕捉试剂，诸如生物素化抗人F(ab’)2抗体时，亲和捕捉LC-MSF(ab')2测定法容许在具有缀合至不同抗体的相同药物的ADC间平行比较ADC生物转化。对于更加精确和详细的生物转化和PK信息，这个比较性实施例证明IdeS蛋白酶消化，第2代测定法容纳低剂量，不稳定，和复杂位点特异性ADC，例如TDC的潜力。此类信息有助于优化细胞毒性药物设计，推动开发适宜的PK生物分析性策略，及导致发现新的ADC分解代谢物。该方法适用于具有Fab区中的缀合位点的多种位点特异性ADC，及分析经由链间二硫化物缀合的常规ADC。

实施例2：蛋白质浓度测定

精确蛋白质浓度测定对于评估蛋白质-药物缀合物的体外和体内功效，以及毒性是至关紧要的。发明人开发了一种方法来为包含例如由于芳香环的存在而对蛋白质在280nm处的吸光度有贡献的小分子有效负荷(特别是当该小分子在280nm处的消光系数和/或其最大吸光度未知时)的ADC测定蛋白质浓度。在这个实施例中，通过用酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)的蛋白水解消化和后续LC-MS分析，独立于缀合的有效负荷来测定蛋白质浓度。

IdeS在铰链区以下的位点处以高特异性切割人IgG1，生成F(ab’)2和Fc片段(图1A)。这些种类能在反相上以层析术分开(图2A-1)。Fc的两个臂之间的非共价相互作用受到流动相的酸性和有机溶剂浓度破坏，产生大小为大约25kD的Fc/2峰。在药物有效负荷缀合至链间二硫化物或位点特异性缀合至F(ab’)2或Fc区的ADC中，可使用所得不含药物的抗体片段(Fc/2或F(ab’)2片段峰任一)来量化样品的蛋白质浓度。这种方法对于表征经由链间二硫化物缀合的传统ADC以及具有位于Fab或Fc区任一中的用于位点特异性缀合的两个工程化改造的半胱氨酸残基每个抗体的THIOMABTM抗体药物缀合物(TDC)二者是有用的。将抗体-药物缀合物用IdeS消化，然后注射到反相LC-MS上，以280nm吸光度检测。在Fab上缀合的TDC和传统ADC的情况中，含有药物的抗体片段以层析术与Fc/2片段分开，容许使用Fc/2片段峰面积进行蛋白质浓度量化。使用用IdeS消化的抗体标准品的标准曲线的线性回归内插这个值，其中将起始浓度针对Fc/2峰面积绘图(图2A)。在经由Fc上的工程化改造的半胱氨酸缀合的TDC的情况中，含有药物的Fc/2片段以层析术与F(ab’)2片段分开，容许使用F(ab’)2片段峰面积进行蛋白质浓度量化。使用用IdeS消化的抗体标准品的标准曲线的线性回归内插这个值，其中将起始浓度针对F(ab’)2峰面积绘图(图2A)。

使用用IdeS蛋白酶消化的曲妥珠单抗生成0.5-20mg/ml范围上的标准曲线(Fc/2峰面积对浓度；图2B，顶部)(F(ab’)2峰面积对浓度；图2B，底部)。可使用TDC的Fc/2的峰面积(顶部曲线)和线性回归确定在F(ab)上位点特异性缀合的TDC的蛋白质浓度。还可使用这种方法表征在链间二硫化物上缀合的传统ADC，因为这些缀合物中的Fc/2片段也没有药物。可使用TDC的F(ab’)2的峰面积(底部曲线)和线性回归确定在Fc上位点特异性缀合的TDC的蛋白质浓度。

方法

将具有2个工程化改造的半胱氨酸残基每个抗体的THIOMAB^TM与3倍摩尔过量的硫醇反应性接头-药物一起于pH 7.5温育2小时。通过阳离子交换纯化掉过量的接头-药物并在pH 5.5缓冲液中配制缀合物。使用有药物和无药物种类的解卷积质量的丰度通过LC-MS分析确定TDC的药物对抗体比(DAR)(图2A-2)。检查的所有缀合物具有≥1.7的DAR。接头-药物有效负荷的大小范围为700-1500Da。

将30个单位(30U/μl)的IdeS(FABRICATOR^TM，Genovis AB)添加至10μl浓度范围为0.52-20mg/ml的抗体或抗体-药物缀合物。将反应混合物用PBS调至终体积50μl，最终反应pH约pH 6.5。在LC-MS分析之前将样品于37℃温育1小时。使用偶联电喷射离子化飞行时间质谱仪(Agilent 6224TOF-LC)的HPLC***(Agilent 1260infinity)以反相高效液体层析术(HPLC)分析样品。在加热至80℃的PLRP-S 1000A°，8μm 50x 2.1mm柱(Agilent)上注射10μl体积的样品。以流速0.5ml/min使用0.05％三氟乙酸(流动相A)和含0.05％三氟乙酸的乙腈(流动相B)生成梯度。将柱保持5％B达0.7分钟，接着是4.3分钟30％B至40％B梯度。在5分钟时，浓度升高至90％B，保持1分钟。然后将柱在5％B中再平衡2分钟。使用AgilentMassHunter软件获取并分析数据。

使用解卷积质谱数据来确认所有抗体和抗体药物缀合物已经消化完全且不含完整抗体。

使用用已知浓度的IdeS消化的曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM；抗Her2人IgG1抗体)生成标准曲线。制备具有下述各项的位点特异性曲妥珠单抗构建物：

1)在F(ab)上在工程化改造的半胱氨酸K149C处位点特异性缀合的接头-药物(缀合物A；图2C)；

2)在Fc上在工程化改造的半胱氨酸S400C处位点特异性缀合的接头-药物(缀合物B；图2D)；或

3)在链间二硫化物上缀合的接头-药物(缀合物C；图2E)。

将曲妥珠单抗在20mM组氨酸乙酸酯pH 5.5，240mM蔗糖中以1.5的因素系列稀释为20mg/ml至0.52mg/ml。选择这种缓冲液进行稀释是因为它是用于许多ADC的最终配制的缓冲液且模拟测定法中实验样品的条件。将样品一式三份稀释总共十个浓度。

将10μl体积的每个稀释度添加至39μl磷酸盐缓冲盐水pH 7.2，并添加1μl IdeS(30U/μl)至总体积50μl。这些样品的最终pH在IdeS活性的最佳活性范围中。将样品于37℃温育1小时。然后依次或以递增浓度在LC-MS上运行样品。将10μl体积的抗体消化物注射到反相柱上并梯度洗脱以分开Fc/2和F(ab’)2峰。导致注射>5μg抗体的样品继以不注射的相同LC-MS方法的空白运行以确保没有样品遗留至下一次运行。

通过用IdeS的蛋白水解消化和后续LC-MS分析来确定抗体-药物缀合物的蛋白质浓度。使用用范围为0.52mg/ml至20mg/ml的已知浓度的IdeS消化的曲妥珠单抗生成标准曲线(图2C，2D，2E)。消化标准品并以最小限度误差一式三份运行。将起始浓度针对峰面积绘图，产生该组标准品的线性回归(R²＝0.9999)(图2F)。依照下表使用这个线性回归方程来确定未知样品的蛋白质浓度：

1)对于在F(ab)上位点特异性缀合的接头-药物(图2C)：

2)对于在Fc上位点特异性缀合的接头-药物(图2D)

3)对于在链间二硫化物上缀合的接头-药物(图2E)

使用这种方法以及通过BCA(它是一种公认的用于蛋白质浓度测定的比色测定法)测定81种TDC的蛋白质浓度。将通过每一种方法测定的浓度值针对彼此绘图，显示强相关性，验证IdeS消化方法的精确性和可再现性(图2F)。然后可使用Beer-Lambert定律使用通过这种方法测定的浓度值来计算TDC或ADC在A280吸光度处的消光系数。

图3A显示TDC(PBD二聚体药物，二硫化物接头)标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS测定法，IdeS消化，亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和PNGaseF，亲和捕捉LC-MS完整抗体测定法的DAR概况分析，3份复制品的标准偏差分别为0.13，0.09，和0.14。使用含有掺入的TDC标准品混合物的人血浆(100μL)进行亲和捕捉并注射5μL洗出液进行LC-MS分析。

图3B显示具有以二硫化物接头共价附着至半胱氨酸工程化改造的抗体的PBD二聚体(TDC1和TDC4)，蒽环(TDC2)和CBI二聚体(TDC5)药物模块的TDC的TDC标准品混合物(DAR0:DAR2＝1:1)通过直接LC-MS，IdeS消化1小时的IdeS消化亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法，和PNGaseF消化过夜的亲和捕捉LC-MS F(ab')2测定法(绿色)的DAR(药物-抗体比)概况分析。使用含有掺入的TDC标准品混合物的人血浆(100μL)进行亲和捕捉并注射5μL洗出液进行LC-MS分析。通过IdeS过夜消化亲和捕捉LC-MS的TDC2的测量DAR0:DAR2的误差是显著的，指示延长的珠上温育(例如过夜消化)导致样品制备期间不同药物加载的TDC2种类的潜在有偏移回收。

这些方法为ADC的蛋白质浓度测定提供快速，强健有力，且可再现的测定法，不管它们缀合的有效负荷的光谱特性。缀合其它实验性有效负荷诸如荧光团的抗体也能使用这种方法分析来测定它们的蛋白质浓度，独立于荧光团或吸光度。常规ADC的蛋白质浓度也可通过这种方法来测定，特别是对于有效负荷缀合至链间二硫化物的ADC，因为Fc/2区没有这些缀合位点。

本发明的测定法包括相对较快的消化步骤，而且持续至完成，没有过度消化。如此，这种方法学具有胜过使用常规蛋白酶诸如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，和内切肽酶赖氨酸C的显著优点。例如，IgG1的胃蛋白酶消化较慢且最好在pH 5以下发生。木瓜蛋白酶消化在中性pH实施且蛋白质切割的位点不是特异性的，而且常常引起多重蛋白质切割事件。有限LysC消化可能过度消化Fc区。IdeS没有过度消化的风险，因为它在重链上铰链区以下的一个特异性位点处切割IgG1抗体。在溶液中，IdeS于4℃稳定高至一个月。这些特征对本文展现的强健有力的蛋白质浓度测定法有贡献。

对于例行浓度测量，可以在没有联线质谱仪的HPLC上进行该方法。例如，连同用于质量控制的测试样品一起消化并分析曲妥珠单抗标准品。能在这种测定法中确认完全消化，因为完整抗体具有已知的保留时间且能在没有质谱分析的情况下检测。然后直接关联280nm处的吸光度的峰面积与蛋白质浓度，不需要MS分析。

虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地描述前述发明，描述和例子不应解读为限制发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

序列表

<110> 基因泰克公司（Genentech, Inc.）

豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法

<130> P33200-WO

<141> 2017-05-26

<150> US 62/342,825

<151> 2016-05-27

<160> 2

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列是合成的

<400> 1

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列是合成的

<400> 2

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe

Claims (18)

1.一种评估抗体药物缀合物(ADC)的方法，其中在选自人，食蟹猴，大鼠，和小鼠的哺乳动物的全血，血清，血浆，或组织中悬浮该ADC，其中该方法包含：

(a) 将结合至亲和捕捉介质的，包含至少一个在选自半胱氨酸氨基酸残基，硒代半胱氨酸氨基酸残基，谷氨酰胺氨基酸残基，非天然发生氨基酸残基，和糖修饰聚糖残基的重组工程化位点处连接至抗体的药物模块的ADC用切割该ADC的IdeS蛋白酶消化以形成包含至少一种没有连接该至少一个药物模块的肽片段和至少一种连接该至少一个药物模块的肽片段的经消化ADC组合物；并

(b) 通过RP-LC，RP-LC/MS和LC-MS/MS中的至少一种分析该经消化ADC组合物以检测至少一种没有连接该至少一个药物模块的肽片段。

2.权利要求1的方法，其中该抗体选自IgG抗体，抗体片段，人或人源化抗体，糖基化或磷酸化抗体，和半胱氨酸工程化改造的抗体。

3.权利要求1或2的方法，其中该ADC的抗体部分是结合一种或多种选自(1)-(53)的肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体：

(1) BMPR1B (骨形态发生蛋白受体-IB型)；

(2) E16 (LAT1，SLC7A5)；

(3) STEAP1 (***的六次跨膜上皮抗原)；

(4) MUC16 (0772P，CA125)；

(5) MPF (MPF，MSLN，SMR，巨核细胞强化因子，间皮素)；

(6) Napi2b (NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34 (磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；

(7) Sema 5b (FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5b Hlog，sema域，七次血小板反应蛋白重复(1型和1型样)，跨膜域(TM)和短胞质域，(脑信号蛋白)5B)；

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA 2700050C12，RIKENcDNA 2700050C12基因)；

(9) ETBR (内皮缩血管肽B型受体)；

(10)MSG783 (RNF124，假设的蛋白质FLJ20315)；

(11)STEAP2 (HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***癌相关基因1，***癌相关蛋白1，***的六次跨膜上皮抗原2，六次跨膜***蛋白)；

(12)TrpM4 (BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体潜在阳离子通道，亚家族M，成员4)；

(13)CRIPTO (CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎瘤衍生的生长因子)；

(14)CD21 (CR2 (补体受体2)或C3DR (C3d/埃巴二氏病毒受体)或Hs 73792)；

(15)CD79b (CD79B，CD79β，IGb (免疫球蛋白相关β)，B29)；

(16)FcRH2 (IFGP4，IRTA4，SPAP1A (含SH2域的磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20Rα；

(21)短小蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R (B细胞活化性因子受体，BLyS受体3，BR3)；

(27)CD22 (B细胞受体CD22-B同等型)；

(28)CD79a (CD79A，CD79α，免疫球蛋白相关α)；

(29)CXCR5 (伯基特氏淋巴瘤受体1)；

(30)HLA-DOB (MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；

(31)P2X5 (嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；

(32)CD72 (B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；

(33)LY64 (淋巴细胞抗原64 (RP105)，富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白)；

(34)FcRH1 (Fc受体样蛋白1)；

(35)FcRH5 (IRTA2，免疫球蛋白超家族受体易位相关的2)；

(36)TENB2 (推定的跨膜蛋白聚糖)；

(37)PMEL17 (silver同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；

(38)TMEFF1 (具有EGF样和两个促卵泡素抑制素样域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；

(39)GDNF-Ra1 (GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；

(40)Ly6E (淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67，RIG-E，SCA-2，TSA-1)；

(41)TMEM46 (shisa同系物2 (非洲爪蟾(Xenopus laevis))；SHISA2)；

(42)Ly6G6D (淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D，MEGT1)；

(43)LGR5 (含富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5；GPR49，GPR67)；

(44)RET (ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；

(45)LY6K (淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；

(46)GPR19 (G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；

(47)GPR54 (KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；

(48)ASPHD1 (含天冬氨酸β-羟化酶域的1；LOC253982)；

(49)酪氨酸酶 (TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；

(50)TMEM118 (环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；

(51)GPR172A (G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；

(52)CD33；和

(53)CLL-1。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中该药物模块经由接头连接至该ADC的抗体部分且选自肽，聚酰胺，美登木生物碱(maytansinoid)，多拉司他汀(dolastatin)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine) (PBD)，PNU-159682，蒽环(anthracycline)，倍癌霉素(duocarmycins)，长春花生物碱(vinca alkaloid)，紫杉烷(taxane)，单端孢菌素(trichothecene)，CC1065，倍癌霉素(duocarmycin)，喜树碱(camptothecin)，依利奈法德(elinafide)，抗生素，荧光团，放射性同位素，和其立体异构体，电子等排体或代谢物。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中该消化包含将该ADC与该蛋白酶一起于介于20°C和45°C之间的温度于介于pH 5和pH 9之间的pH温育介于0.1小时和48小时之间的时间段。

6.权利要求5的方法，其中该消化包含将该ADC与该蛋白酶一起于约37°C的温度于约7的pH温育约1小时的时间段。

7.权利要求1至6任一项的方法，其中在该消化步骤前，通过选自大小排阻层析术，透析，选择性沉淀，差速离心，过滤，凝胶电泳，液体层析术，反相层析术，免疫沉淀，包括蛋白A和蛋白G，NHS和链霉亲合素铁或磷或固定化抗体或凝集素的SpinTrap柱，顺磁性珠，免疫消减，分级，固相萃取，磷酸肽富集，聚丙烯酰胺凝胶电泳，和脱盐的技术富集该ADC。

8.权利要求1至7任一项的方法，其中该亲和捕捉介质包含珠或树脂支持的蛋白A/G，靶抗原-顺磁性珠捕捉介质，抗独特型抗体，抗Hu抗体，和抗药物抗体中至少一种。

9.权利要求8的方法，其进一步包含清洗结合至该亲和捕捉介质的ADC以减少与该ADC接触的非抗体蛋白质。

10.权利要求8的方法，其进一步包含使结合至该亲和捕捉介质的ADC去磷酸化。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的总抗体浓度。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的抗体缀合的药物浓度。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的平均药物-对-抗体比(DAR)。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析确定代谢物(metabolite)或分解代谢物(catabolite)结构。

15.权利要求1至14任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的蛋白质浓度。

16.权利要求15的方法，其中关联该ADC的蛋白质浓度与来自经消化ADC的至少一种Fc片段的RP-LC和/或MS分析的峰面积。

17.权利要求1至16任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的消光系数。

18.权利要求1至17任一项的方法，其中自该经消化ADC组合物的分析计算该ADC的平均药物-对-抗体比(DAR)，自该经消化ADC的分析确定代谢物或分解代谢物结构，并关联该ADC的蛋白质浓度与来自经消化ADC的至少一种Fc片段的RP-LC和/或MS分析的峰面积。

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