CH645890A5 - Monacolin k, seine herstellung und dieses enthaltendes antihypercholesterinaemisches mittel. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verbindung mit antihypercholesterinämischer Wirkung, welche Monacolin K genannt wird. Monacolin K lässt sich durch Züchtung verschiedener Mikroorganismen der Gattung Monascus herstellen.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verbindung Monacolin K der folgenden Formel:
HO
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung von Monacolin K, welches darin besteht, dass man einen Monacolin K erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Monascus in einem geeigneten Kulturmedium züchtet.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein antihypercholesterinämisches pharmazeutisches Präparat, welches Monacolin K und ein pharmazeutisch zulässiges Trägermittel oder Verdünnungsmittel enthält.
Hohe Blutcholesterinspiegel sind bekanntlich eine der Hauptursachen der ICardiopathie, wie z.B. des Herzinfarktes oder der Arteriosklerose. Daher wurde ein beträchtlicher Forschungsaufwand zur Ermittlung von physiologisch annehmbaren Substanzen, welche die Cholesterinbiosynthese zu hemmen und demzufolge den Blutcholesterinspiegel zu senken vermögen, geleistet. Eine derartige Verbindung ist ML-236, welches Gegenstand der britischen Patentschrift Nr. 1463 425 ist. ML-236 erhält man durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Pénicillium.
Bei Versuchen mit Pilzen der Gattung Monascus wurde festgestellt, dass diese Pilze und insbesondere Monascus ruber Stamm 1005 (FERM 4822) ein antihypercholesterinämisches Mittel erzeugen, welches wesentlich bessere Wirksamkeiten aufweist als ML-236. Dieses Mittel wird Monacolin K benannt.
Sämtliche Mikroorganismen der Gattung Monascus, welche Monacolin K zu erzeugen vermögen, lassen sich für das erfindungsgemässe Verfahren verwenden. Besonders wertvoll sind die Stämme von Monascus ruber, insbesondere Monascus ruber Stamm 1005 (FERM 4822).
Monascus ruber Stamm 1005 (FERM 4822) ist ein neuer isolierter Mikroorganismus, dem die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften zukommen. Er wurde aus in Thailand erzeugten Nahrungsmitteln isoliert und am 16. Februar 1979 unter Nr. FERM 4822 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, und unter Nr. NRRL 12073 beim Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, USA, hinterlegt.
1. Wachstum
Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agarmedium bei 25°C ist rasch und der Durchmesser der Kolonien erreicht 10 Tage nach der Impfung 6 bis 6,5 cm. Die Kolonie ist flach und es entwickelt sich eine relativ dünne Grundschicht von Hyphen. Die Entwicklung der Lufthyphen ist mager. Die Lufthyphen sind weiss und die meisten Lufthyphen wollartig. Manche geschlossene Fruchtkörper bilden sich auf der Grundschicht der Hyphen und gehen bei der Reifung in rötlichbraun über. Sowohl die Oberfläche als auch die Rückseite der Kolonie sind braun bis rötlichbraun.
Das Wachstum auf einem Sabouraud-Agarmedium bei 25°C ist sehr rasch und der Durchmesser der Kolonie erreicht 10 Tage nach der Impfung 6 bis 6,5 cm. Die Oberfläche der Kolonie ist äusserst flach, und die Hyphen der Grundschicht und die Lufthyphen entwickeln sich besser als auf einem ICar-toffel-Glucose-Agarmedium. Es bilden sich äusserst wenig geschlossene Fruchtkörper. Die Oberfläche der Kolonie ist rötlichgelb bis rötlichbraun und die Rückseite rötlichbraun bis dunkelbraun.
Das Wachstum der Weizenmehlagar bei 25°C erfolgt langsam und der Durchmesser der Kolonie erreicht 1,5 bis 2 cm nach Ablauf von 10 Tagen nach der Impfung. Die Kolonie ist flach. Die Entwicklung der Lufthyphen und die Bildung von geschlossenen Fruchtkörpern ist äusserst schwach. Sowohl die Oberfläche als auch die Rückseite der Kolonie sind dunkelrot bis rötlichbraun.
Das Wachstum auf Czapek-Agarmedium bei 25°C erfolgt sehr langsam und der Durchmesser der Kolonie erreicht 1,6 bis 1,8 cm nach 10 Tagen nach erfolgter Impfung.
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Der Wachstumsverlauf auf jedem der oben genannten Medien bei 37°C ist praktisch derselbe wie bei 25°C.
2. Morphologische Eigenschaften
Die geschlossenen Fruchtkörper sind sphärisch und besitzen einen Durchmesser von 30 bis 60 Mikron. Deren Wandungen sind dünn und membranenhaft. Die Stiele derselben besitzen Scheidewände und bestehen aus Hyphen mit einem Durchmesser von 3,5 bis 4,5 Mikron und einer Länge von 15 bis 80 Mikron. Der Askus besteht aus 8 Sporen und ist nahezu sphärisch und zart bzw. durchsichtig. Die Askus-sporen sind farblos und eiförmig oder ellipsoid. Sie haben eine Dimension von 4 bis 5x4 bis 7 Mikron. Deren Oberflächen sind glatt. Die Konidien sind farblos und sphärisch oder birnenförmig. Deren Grösse liegt bei 6 bis 9x6 bis 11 Mikron. Deren unteren Teile sind abgestumpft, während die Wandungen relativ dick und glatt sind. Die Konidien sind zu teilungsfähigen Arthrosporen basipetal verbunden. Die Konidiophore ähnelt einer vegetativen Hyphe und ist verzweigt oder unverzweigt, wobei am oberen Ende Konidien gebildet sind. Die Mycelien sind farblos und verzweigt und besitzen Scheidewände, von denen die meisten einen Durchmesser von 3 bis 5 Mikron aufweisen.
Aufgrund der so beobachteten, oben erwähnten Eigenschaften wurde dieser Mikroorganismus als ein Stamm von Monascus ruber van Tieghem identifiziert.
Die mikrobiologischen Eigenschaften von Monascus ruber wurden in der folgenden Literatur geoffenbart: vergi.
Takada, Transactions of the Micological Society of Japan, 9, 125-130 (1969) [Materials for the Fungus Flora of Japan (7)]; und van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31,277 (1884). Die Erzeugung von Ascosporen durch den Stamm wurde von Cole et aüm Canadian Journal of Botany 46,987 (1968), «Conidium Ontogeny in hyphomycetes, The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthrospores» beschrieben.
Im folgenden wird die Verwendung von Monascus ruber Stamm 1005 besonders ausführlich beschrieben. Es sei aber speziell bemerkt, dass beliebige Stämme der Gattung Monascus, sowie die Varietäten und Mutanten davon,
welche Monacolin K zu erzeugen vermögen, ebensogut für das erfindungsgemässe Verfahren zur Anwendung gelangen können.
Monacolin K lässt sich durch Züchtung des ausgewählten Mikroorganismus in einer Kulturbrühe unter aeroben Bedingungen unter Anwendung der gleichen Arbeitsweisen, wie dies für die Züchtung von Fungi und anderen Mikroorganismen aus dem Stande der Technik bestens bekannt ist, herstellen. So kann man beispielsweise den Monacolin K erzeugenden Mikroorganismus zuerst auf einem geeigneten Mediun züchten und hierauf die erzeugten Mikroorganismen sammeln und in einem anderen Kulturmedium impfen oder in einem anderen Kulturmedium züchten, um auf diese Weise das gewünschte Monacolin K zu erhalten. Die für die Vermehrung des Mikroorganismus und für die Erzeugung von Monacolin K verwendeten Züchtungsmedien können die gleichen oder verschiedene Medien sein.
Beliebige, für die Züchtung von Fungi bekannte Kulturmedien lassen sich verwende^vorausgesetzt, dass sie, wie dies ebenfalls bestens bekannt ist, die erforderlichen Nährmaterialien, insbesondere eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, enthalten. Beispiele geeigneter assimilierbarer Kohlenstoffquellen sind Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke, Lactose, Saccharose und Glycerin. Für die Erzeugung von Monacolin K wird man von den soeben genannten Kohlenstoffquellen insbesondere der Glucose, dem Glycerin und der Stärke den Vorzug geben. Beispiele geeigneter assimilierbarer Stickstoffquellen sind
Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Maisquellflüssigkeit, Kleie sowie anorganische Stickstoffquellen. Als Stickstoffquelle wird man vorzugsweise Pepton verwenden. Bei der Herstellung von Monacolin K kann man nötigenfalls ein anorganisches Salz und/ oder ein Metallsalz dem Kulturmedium zugeben. Ferner kann man nötigenfalls eine kleine Menge eines Schwerme-talles hinzugeben.
Der Mikroorganismus wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen unter Anwendung von Züchtungsmethoden bekannter Art, beispielsweise mit einer festen Kultur, einer Schüttelkultur oder einer unter Belüftung und unter Schütteln gehaltenen Kultur, gezüchtet. Der Mikroorganismus wächst innerhalb eines breiten Temperaturbereiches von beispielsweise 7-40°C. Für die Herstellung von Monacolin K liegt aber die bevorzugte Züchtungstemperatur im Bereiche von 20 bis35°C.
Während der Züchtung des Mikroorganismus kann das Ausmass der Erzeugung von Monacolin K durch Entnahme von Proben aus dem Kulturmedium und durch Messen der physiologischen Aktivität des im Kulturmedium vorhandenen Monacolin K mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Testes festgehalten werden. Die Züchtung kann hierauf solange weitergeführt werden, bis eine wesentliche Anreicherung von Monacolin K im Kulturmedium stattgefunden hat. In diesem Zeitpunkt kann man das Monacolin K durch beliebige Kombination von Isolationsmethoden, die je nach den physikalischen und chemischen Eigenschaften ausgewählt werden, aus der Kulturbrühe gewinnen. So kann man sich einer oder mehrerer der nachfolgenden Isoliertechniken bedienen, nämlich der Extraktion der Flüssigkeit aus der Kulturbrühe mit einem hydrophilen Lösungsmittel, z.B. Diäthyläther, Äthylacetat, Chloroform und Benzol, Extraktion des Organismus mit einem hydrophilen Lösungsmittel, wie z.B. Aceton oder einem Alkohol, Konzentration, Auflösen in einem polareren Lösungsmittel, wie z.B. Aceton oder einem Alkohol, Entfernung der Verunreinigungen mit Hilfe eines weniger polaren Lösungsmittels, wie z.B. Petroläther oder Hexan, Gelfiltrierung durch eine Säule, welche mit einem Material, wie z.B. Sephadex (Warenzeichen eines bei der Firma Pharmacia Co., Ltd., USA, erhältlichen Materials) beschickt ist, absorptive Chromatographie mit Aktivkohle oder Kieselgel usw. Bei Anwendung einer geeigneten Kombination dieser Arbeitsmethoden kann man das Monacolin K als reine Substanz aus der Kulturbrühe isolieren.
Monacolin K besitzt, wie dies festgestellt wurde, die folgenden Eigenschaften:
1. Farbe und Form: Farblose Kristalle.
2. Schmelzpunkt: 157-159°C (unter Zersetzung).
3. Elementaranalyse: C= 71,56%; H= 8,85%; 0= 19,59%.
4. Molekulargewicht: 404 (mittels Massenspektrometrie).
5. Molekularformel: C24H36O5.
6. Ultraviolettabsorptionsspektrum (Methanol): Wie aus Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich ist, liegen die Maximalwerte bei 232,238 und 246 mil.
7. Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): Gemäss Angaben der Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen.
8. Protonenresonanzspektrum (60 MHz Proton): Gemäss Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen, in deuterisiertem Chloroform unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard.
9. Magnetisches Kohlenstoff-13-Resonanzspektrum(13C): Gemäss Fig. 4 der beiliegenden Zeichnungen, in deuterisiertem Methanol.
10. Löslichkeit: In niederen Alkoholen, wie z.B. Methanol, Äthanol und Propanol, Aceton, Chloroform, Äthylacetat und Benzol löslich; in Petroläther und Hexan unlöslich.
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11. Spezifische Drehung: [<x]d = +307,6 (c= 1, Methanol).
12. Dünnschichtchromatographie: Rf= 0,47 [Nr. 5715 Kieselgel 6OF254 Silikagel (Merck & Co., Ltd), entwickelt in einem Gemisch von 4 Vol.-Teilen Methylenchlorid und 1 Vol.-Teil Aceton, wahrnehmbar als Ultraviolettstrahlen absorbierender Fleck, 50 VoI.-% Schwefelsäure (es entwickelt sich beim Erhitzen eine blassrote bis rötlichbraune Färbung) oder mit Jod].
Die Verbindung ist neutral und in neutralen und sauren wässrigen Medien unlöslich. Sie geht bei der Behandlung mit einem Alkali in eine saure Substanz über und lässt sich in Wasser lösen. Diese saure Substanz kann mit Äthylacetat oder Chloroform bei einem sauren pH-Wert extrahiert werden. Sie geht beim Verdampfen des Lösungsmittels wiederum in das Monacolin K über.
Die physiologische Aktivität von Monacolin K lässt sich nach dem folgenden in vivo-Test quantitativ bestimmen.
In vivo-Test an Kaninchen
Bei diesem Test wurde das Senkungsvermögen der Cholesterinspiegel durch Monacolin K im Kaninchenblut gemessen. Die verwendeten Tiere wogen 2,5 bis 3,0 kg. Unmittelbar nach Beginn des Testes wurde das Blut aus der in einem Ohr eines Kaninchens vorhandenen Vene gesammelt und der Cholesterinspiegel im Blutserum in bekannter Weise gemessen. Eine zuvor bestimmte Menge an Monacolin K wurde hierauf kontinuierlich während 1 bis 5 Tagen oral verabreicht und nach erfolgter Verabreichung wurde der Cholesterinspiegel im Blutserum gemessen. Die Potenz des Monacolin K oder eines Monacolin K enthaltenden Kulturmediums Hess sich quantitativ aus den Cholesterinwerten bestimmen, welche vor und nach der Verabreichung von Monacolin K erziehlt worden sind.
Dass Monacolin K die Blut- und Lebercholesterinspiegel zu senken vermag, wurde durch verschiedene in vivo-Tests bestätigt.
Senkung der Blutcholesterinspiegel bei Ratten
Die verwendeten Raten waren solche vom Wistar-Ima-michi-Stamm mit jeweils einem Körpergewicht von ungefähr 300 g. Die Teste erfolgten auf verschiedenen Rattengruppen, wobei jede Gruppe aus 5 Tieren bestand. Jedem Tier wurden intravenös 400 mg/kg Triton WR-1339 (ein Markenartikel für ein bekanntes Mittel zur Erhöhung des Blutcholesterin-spiegels) injiziert, wobei man gleichzeitig intraperitoneal 10 mg/kg Monacolin K verabreichte. 14 Stunden nach erfolgter intraperitonealer Verabreichung wurden die Ratten durch Ausblutenlassen getötet und das Blut gesammelt und dessen Cholesterinspiegel in an sich bekannter Weise bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Blutcholesterinspiegel um 23,9% gesenkt worden waren, verglichen mit einer Vergleichsgruppe von Tieren, denen man nur Triton WR-1339 verabreicht hatte.
Senkung der Blutcholesterinspiegel bei Kaninchen
Die verwendeten Testtiere waren Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,7 bis 2,9 kg. Jedem Kaninchen wurde oral zweimal täglich und zwar morgens und abends kontinu- ' ierlich während 5 Tagen 1 mg/kg Monacolin K verabreicht.
Vor der Verabreichung und 3 bzw. 5 Tagen nach der Verabreichung wurde Blut aus einer Vene des Ohrs entnommen und die Cholesterinspiegel im Blutserum bestimmt. Dabei ergab sich, dass die Cholesterinspiegel bei Verabreichung von Monacolin K während 3 bzw. 5 Tagen um 15% bzw. 29% niedriger waren als der vor der Verabreichung von Monacolin K gemessene Blutspiegelwert.
Ausser seiner Hemmwirkung auf die Biosynthese von Cholesterin ist Monacolin K überdies äusserst gering toxisch. Die akute orale Toxizität liegt bei einer Maus von 1 g/kg Körpergewicht oder mehr bei (LD50) von Monacolin K.
Das Monacolin K lässt sich oral oder parenteral in Form von Kapseln, Tabletten, injizierbaren Präparaten oder in irgendeiner anderen beliebigen, bekannten Form verabreichen, doch wird man es normalerweise auf oralen Wege zugeben. Die Dosismenge schwankt je nach dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten und je nach dem Schweregrad der Erkrankung. Die tägliche Dosis für einen Erwachsenen liegt aber im allgemeinen bei 0,5 bis 50 mg, wobei das Mittel entweder in einer einzelnen Dosis aufgeteilt in zwei oder drei Dosierungen verabreicht wird. Wegen der niedrigen Toxität der Verbindung kann man nötigenfalls aber auch höhere Dosierungsmengen anwenden.
Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.
Beispiel
Monascus ruber Stamm 1005 wurde in einem flüssigen Kulturmedium, welches 6 Gew.-Teile/100 Vol.-Teile Glucose, 2,5 Gew.-Teile/100 Vol.-Teile Pepton, 0,5 Gew.-Teile/100 Vol.-Teile Maisquellflüssigkeit und 0,5 Gew.-Teile/100 Vol.-Teile Ammoniumchlorid enthielt, geimpft. Die Züchtung erfolgte unter aeroben Bedingungen während 10 Tagen bei einer Temperatur von 28°C. Das so erhaltene Filtrat (5 Liter) der Kulturbrühe wurde durch Zugabe einer 6n-Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und hierauf mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter vermidertem Druck aus dem Extrakt verdampft und der entstandene Rückstand in 100 ml Benzol gelöst. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert.
Das Filtrat wurde zweimal jeweils 100 ml einer 5 Gew.-Teile/100 Vol.-Teile wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Dann wurden 100 ml einer wässrigen 0,2n-Natri-umhydroxydlösung dem gewaschenen Filtrat hinzugegeben und das Gemisch bei Zimmertemperatur gerührt. Nachdem man durch Dünnschichtchromatographie das Verschwinden von Monacolin K aus der Benzolschicht festgestellt hatte, wurde die wässrige Schicht abgetrennt. Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde hierauf durch Zugabe von 6n-Salz-säure auf den Wert 3 eingestellt und die so erhaltene Lösung zweimal mit jeweils 100 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 260 mg eines Öls zurückblieben. Dieses Öl wurde in Benzol gelöst und auskristallisieren gelassen. Hierauf wurden die Kristalle aus einer wässrigen Acetonlö-sung umkristallisiert, wobei man 87 mg farblose Nadeln von Monacolin K erhielt, welches die vorerwähnten Eigenschaften aufwies.
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Claims (7)
- 645 890PATENTANSPRÜCHE 1. Antihypercholesterinämisch wirksames Monacolin K der Formel:HO
- 2. Verfahren zur Herstellung von Monacolin K, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Monacolin K erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Monascus in einem geeigneten Kulturmedium züchtet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen Stamm von Monascus ruber einsetzt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stamm Monascus ruber Stamm 1005 einsetzt.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Temperatur im Bereiche von 7 bis 40°C durchführt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bei einer Temperatur von 20 bis 35°C erfolgt.
- 7. Antihypercholesterinämisches Präparat, enthaltend Monacolin K der Formel I und ein pharmazeutisch annehmbares Träger- oder Verdünnungsmittel.
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