DE3051206C2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Monacolin K - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Monacolin K.

In der DE-PA P 30 06 216.9 ist die Verbindung Monacolin K und ihre Herstellung mit Mikroorganismen des Genus Monascus, insbesondere Monascus ruber Stamm 1005 (FERM 4822) beschrieben. Auch die wertvolle und unerwartete Aktivität der Verbindung Monacolin K als antihypercholesterinämisches Mittel ist offenbart. In der DE-PS P 30 06 215.8 ist die Herstellung von Monacolin K durch Züchtung verschiedener anderer Mikroorganismen des Genus Monascus beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß weitere Mikroorganismen sich in vorteilhafter Weise zur Herstellung von Monacolin K eignen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Monacolin K, bei dem man einen Monacolin K-salze bildenden Mikroorganismus des Genus Monascus züchtet und das Monacolin K aus dem Kulturmedium gewinnt, das dadurch ge­ kennzeichnet ist, daß man einen der folgenden Mikroorganismen einsetzt:

Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203),
Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832,70),
Monascus ruber SANK 17175 (CBS 503.70),
Monascus ruber SANK 17275 (ATCC 18199).

Über die mikrobiologischen Eigenschaften von Monascus ruber wird in den nachstehenden Veröffentlichungen berichtet: Takada, Transactions of the Micological Society of Japan, Bd. 9, S. 125-130 (1969) (Materials for the Fungus Flora of Japan (7)), und von Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, Bd. 31 S. 227 (1884). Über die Ascosporenbildung des Stammes berichten Cole et al. in Canadian Journal of Botany, Bd. 46, S. 987 (1968). "Conidium ontogeny in hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthrospores".

Monacolin K kann durch Züchtung des gewählten Mikroorganismus in einer Kulturbrühe unter aeroben Bedingungen hergestellt werden, wobei die für die Züchtung von Fungi und anderen Mikroorganismen üblichen Techniken angewandt werden. So kann z. B. der gewählte Stamm von Monascus zunächst auf einem geeigneten Medium gezüchtet werden, worauf man den gebildeten Mikroorganismus gewinnt, in ein anderes Kulturmedium einimpft und in diesem züchtet, um das gewünschte Monacolin K zu erhalten. Hierbei können das für die Vermehrung des Mikroorganismus verwendete Kulturmedium und das für die Bildung von Monacolin K verwendete Medium gleich oder verschieden sein. Jedes für die Züchtung von Fungi bekannte Kulturmedium kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß es die erforderlichen Nährstoffe enthält, insbesondere eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle. Beispiele für ge­ eignete assimilierbare Kohlenstoffquellen sind Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke, Lactose, Saccharose und Glycerin. Hiervon sind Glucose und Glycerin für die Bildung von Monacolin K-salzen besonders bevorzugt. Beispiele für geeignete assimilierbare Stickstoffquellen sind Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Sojamehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Reiskleie und anorganische Stickstoffquellen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Mikroorganismus zunächst auf einem Kartoffel-Dextrose-Agarmedium subkultiviert und dann in ein anderes Kulturmedium eingeimpft und dort gezüchtet, um das gewünschte Monacolin K-salz herzustellen.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen unter Anwendung üblicher Methoden gezüchtet, z. B. in Festkultur, Schüttelkultur oder belüfteter und gerührter Kultur. Der Mikroorganismus wächst innerhalb eines breiten Temperaturbereiches, z. B. 7 bis 35°C; insbesondere zur Bildung von Monacolin K ist jedoch eine Züchtungstemperatur von 20 bis 30°C besonders bevorzugt.

Während der Züchtung des Mikroorganismus kann die Bildung des Monacolin K überwacht werden, indem man Proben aus dem Kulturmedium entnimmt und die physiologische Aktivität des Monacolin K in dem Kulturmedium mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Tests mißt. Die Züchtung kann dann fortgesetzt werden, bis in dem Kulturmedium eine wesentliche Anreicherung von Monacolin K erreicht ist. Das Monacolin K kann dann aus dem Kulturmedium und den Geweben des Mikroorganismus mit Hilfe jeder geeigneten Kombination von Isoliermethoden isoliert und gewonnen werden, die im Hinblick auf seine physikalischen und chemischen Eigenschaften ausgewählt werden. So können z. B. beliebige oder alle der nachstehenden Isoliermethoden angewandt werden: Extraktion der Flüssigkeit aus der Kulturbrühe mit einem hydrophilen Lösungsmittel, wie Diäthyläther, Äthylacetat oder Chloroform; Extraktion des Organismus mit einem hydrophilen Lösungsmittel, wie Aceton oder einem Alkohol; Konzentrieren, z. B. durch Abdampfen eines Teils oder des gesamten Lösungsmittels unter vermindertem Druck; Lösen in einem stärker polaren Lösungsmittel, wie Aceton oder einem Alkohol; Entfernen von Verunreinigungen mit einem weniger polaren Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan; Gelfiltration durch eine z. B. mit Sephadex gefüllte Säule; Absorptionschromatographie an Aktivkohle oder Silicagel, Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie. Durch Anwendung einer geeigneten Kombination dieser Verfahren kann das gewünschte Monacolin K aus der Kulturbrühe als Reinsubstanz isoliert werden.

Die physiologische Aktivität des Monacolin K kann mit Hilfe der nachstehenden Tests nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden.

1. Inhibierung der Cholesterinbiosynthese

Monacolin K inhibiert spezifisch die Aktivität der 3-Hydroxy-3-methyl- glutaryl-CoA-Reduktase, die das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Biosynthese von Cholesterin ist. In der folgenden Tabelle I sind die Konzentrationen (ng/ml) der Verbindungen angegeben, die die Aktivität von 3-Hydroxy- 3-methylglutaryl (HMG)-CoA-Reduktase zu 50% inhibieren (gemessen nach der in Analytical Biochemistry, Bd. 31, S. 383 [1969], beschriebenen Methode). Ferner sind die Konzentrationen (ng/ml) der Verbindungen angegeben, die die Cholesterinbiosynthese zu 50% inhibieren (gemessen nach der in Journal of Biological Chemistry, Bd. 247, S. 4914 [1972], beschriebenen Methode). Zum Vergleich sind die ent­ sprechenden Ergebnisse für die bekannte Verbindung ML-236B genannt, die ein ähnliches Aktivitätsmuster zeigt und durch Züchten von Mikroorganismen des Genus Penicillium zugänglich ist; vgl. GB-PS 14 53 425. Ferner ist die Konzentration an Monacolin K angegeben, die die Cholesterin-Biosynthese zu 50% inhibiert. Die Ergebnisse zeigen, daß die für eine 50prozentige Inhibierung der Cholesterin-Biosynthese erforderliche Konzentration an ML-236B 10,0 ng/ml beträgt, während die ent­ sprechende Konzentration für die Monacolin K-ester nur etwa 1 ng/ml (d. h. etwa 10mal besser) und für das Natriumsalz von Monacolin K etwa 0,14 ng/ml (d. h. etwa 70mal besser) beträgt. Die Aktivitäten der Salze und Ester von Monacolin K sind mit der von Monacolin K vergleichbar oder sogar besser.

Tabelle I

2. Verringerung des Blut-Cholesterinspiegels

Die verwendeten Versuchstiere sind Ratten von Stamm Wistar Imamichi mit einem Körpergewicht von etwa 300 g. Die Tests werden an Gruppen von je 5 Ratten durchgeführt. Jedem Tier werden 400 mg/kg Triton WR-1339 ein Produkt, das den Blut-Cholesterinspiegel erhöht) intravenös injiziert, während gleichzeitig eine der in der folgenden Tabelle II genannten Verbindungen in der ebenfalls angegebenen Menge oral verabreicht wird. 20 Stunden nach der oralen Verabreichung werden die Ratten durch Verbluten getötet, das Blut und die Leber werden isoliert, und die Cholesterinspiegel werden auf übliche Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II genannt, wobei die Verringerung der Blut- und Leber-Choleste­ rinspiegel mit einer Kontrollgruppe von Ratten verglichen werden, denen allein Triton WR 1339 verabreicht wurde.

Zum Vergleich sind auch die entsprechenden Ergebnisse für Monacolin K und ML-236B angegeben, die in wesentlich größeren Dosen als die Verbindungen verabreicht werden müssen, um eine vergleichbare Verringerung der Cholesterinspiegel zu erzielen.

Tabelle II

Die Senkung des Blut- bzw. Leber-Cholesterinspiegels errechnet sich nach der Formel:

Hierbei bedeuten

A = Spiegel, der nur mit Triton WR-1339 behandelten Gruppe;
B = Spiegel der unbehandelten Kontrollgruppe;
C = Spiegel der Testgruppe.

3. Akute Toxizität

Getestet werden die Methyl-, Äthyl-, Butyl- und Benzylester sowie die Natrium- und Kaliumsalze voin Monacolin K. Die LD₅₀ jeder dieser Verbindungen beträgt bei oraler Verabreichung mindestens 2000 mg/kg und bei intraperitonealer Verabfolgung mindestens 500 mg/kg. Die Verbindungen besitzen somit sehr niedrige Toxizität.

Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Verbindungen die Biosynthese von Cholesterin inhibieren und somit den Blut-Cholesterinspiegel senken. Sie sind daher wertvolle Arzneistoffe zur Behandlung der Hyperlipämie und der Arteriosklerose.

Die Verbindungen können oral oder parenteral in Form von Kapseln, Tabletten, Injektionspräparaten oder anderen bekannten Formulierungen verabreicht werden, obwohl normalerweise die orale Verabreichung bevorzugt ist. Die Dosis richtet sich nach dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten und dem Schweregrad seines Zustands. Im allgemeinen beträgt jedoch die Tagesdosis für Erwachsene vorzugsweise 0,1 bis 100 mg, insbesondere 0,1 bis 10 mg, im Falle von Monacolin K-salzen und 0,5 bis 100 mg, insbesondere 0,5 bis 10 mg, im Falle von Monacolin K-estern.

Die Herstellung von Monacolin K ist in dem nachstehenden Beispiel erläutert.

Beispiel

300 Liter eines Kulturmediums, das vor der Sterilisation einen pH von 7,4 aufweist und 1,5% G/V lösliche Stärke, 1,5% G/V Glycerin, 2,0% G/V Fischmehl und 0,2 G/V Calciumcarbonat enthält, wird in einen 600-Liter-Fermenter eingebracht und mit Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832.70) beimpft. Die Züchtung des Organismus erfolgt 120 Stunden bei 26°C mit einer Be­ lüftungsrate von 300 Liter/min und unter Rühren mit 190 U/min.

Die Kulturbrühe wird dann mit einer Filterpresse filtriert, wobei 35 kg (Feuchtgewicht) des Organismus erhalten werden. Dieser wird mit 100 Liter Wasser versetzt und der pH des Gemisches wird durch Zugabe von Natriumhydroxid unter Rühren auf 12 eingestellt. Das Gemisch wird dann 1 Stunde bei Raum­ temperatur stehengelassen, anschließend mit 2 kg Hyflo Super Cel versetzt und mit einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wird dann durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH von 10 gebracht, worauf man das erhaltene Gemisch auf einer Säule adsorbiert, die 5 Liter HP-20-Harz enthält, das mit je 15 Liter Wasser und einer 10prozentigen V/V wäßrigen Me­ thanollösung gewaschen wurde. Die Säule wird dann mit 90pro­ zentigem V/V wäßrigem Methanol eluiert, worauf man das Eluat auf ein Volumen von etwa 10 Liter konzentriert, seinen pH durch Zugabe von Salzsäure auf einen Wert von 2 einstellt und das Gemisch mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, wobei 50 g einer öligen Substanz erhalten werden, die Monacolin K-säure enthält. Die ölige Substanz wird mit Methanol auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. 20 ml der erhaltenen Lösung werden der präparativen Schnellflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Prepac-C₁₈-Kolonne (Umkehrphasenkolonne) unterworfen und mit einer 20prozentigen V/V-wäßrigen Methanollösung, die 2% Essigsäure enthält, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/min eluiert. Die Fraktion, die in dem Differentialrefraktometer den Hauptpeak zeigt, wird abgetrennt (7 bis 10 Minuten). Die restlichen 80 ml der Methanollösung werden dann auf dieselbe Weise behandelt. Die erhaltenen Hauptpeak-Fraktionen werden gesammelt, konzentriert und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird nach Zugabe von Heptan zur Trockene eingeengt und ergibt 1,2 g einer öligen Substanz.

Diese ölige Substanz wird in 20 ml Methanol gelöst und dann der vorstehenden Schnellflüssigkeitschromatographie unterworfen, wobei 150 mg Monacolin K-säure erhalten werden.

Claims (1)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Monacolin K der Formel bei dem man einen Monacolin K-salze bildenden Mikroorganismus des Genus Monascus züchtet und das Monacolin K aus dem Kulturmedium gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der folgenden Mikroorganismen einsetzt:
   Monascus ruber SANK 11272 (IFO 9203),
   Monascus ruber SANK 17075 (CBS 832,70),
   Monascus ruber SANK 17175 (CBS 503.70),
   Monascus ruber SANK 17275 (ATCC 18199).