BR112012012494A2 - detecção de evento de soja aad-12 416 - Google Patents

Abstract

DETECÇÃO DE EVENTO DE SOJA AAD-12 416. A presente invenção refere-se, em parte, a método de detectar um evento de soja AAD-12. A invenção proporciona ensaios para detectar a presença do evento objeto em uma amostra (de sojas, por exemplo). Kits e condições úteis na condução dos ensaios são também providos. Mais especificamente, a presente invenção se refere, em parte, a um ensaio de Taq-Man PCR de ponto final para o evento de soja AAD-12. Algumas concretizações são direcionadas a ensaios que são capazes de análise de zigosidade de alta produção. A invenção se refere adicionalmente, em parte, a descoberta de um gene de referencia preferido para uso na determinação de zigosidade. Esta invenção também se refere, em parte, a geração de planta usando quaisquer dos métodos objetos. Em algumas concretizações, referida sequência de evento/polinucleotídeo pode ser "empilhada" com outros traços. Os procedimentos objetos podem ser usados para identificar unicamente linhas de soja compreendendo o evento da invenção.

Description

. 1/32 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃO DE EVENTO DE SOJA AAD-12 416".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O gene aad-12 (originalmente de Delftia acidovorans) codifica a proteína ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-12). O traço confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por exemplo, e a herbicidas piridiloxiacetato. O gene aad-12, em si, para tolerância à herbicida nas plantas, foi primeiro revelado em WO 2007/053482.

A expressão de genes heterólogos ou estranhos em plantas é in- 1 10 fluenciada, onde o gene estranho é inserido no cromossomo. Isto pode ser à devido à estrutura cromática (por exemplo, heterocromatina) ou a proximida- de de elementos de regulação transcricional (por exemplo, intensificador) próximos ao local de integração (Weising et al. Ann. Rev. Genet 22:421-477', 1988), por exemplo. O mesmo gene no mesmo tipo de planta transgênica (ou outro organismo) pode exibir uma ampla variação de nível de expressão contra eventos diferentes. Aqui pode também existir diferenças nos padrões espacial ou temporal de expressão. Por exemplo, as diferenças na expres- são relativa de um transgene em vários tecidos de planta não podem corres- ponder aos padrões esperados de elementos regulatórios transcricionais presentes no construto de gene introduzido.

Desse modo, grandes números de eventos são frequentemente criados e classificados de modo a identificar um evento que expressa um gene introduzido de interesse a um nível satisfatório para uma dada propos- ta. Para proposta comercial, é comum produzir centenas a milhares de even- tosdiferentes, e classificar aqueles eventos para um evento simples que tem níveis e padrões de expressão de transgene desejados. Um evento que tem níveis e/ou padrões desejados de expressão de transgene é útil para a intro- gressão do transgene em outros antecedentes genéticos por cruzamento sexual usando métodos de geração convencionais. A progênie de tais cru- zamentos mantém as características de expressão de transgene do trans- formante original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de ge- ne segura em um número de variedades que são bem adaptadas às condi-

R 2/32 ções de crescimento locais.

Vários métodos anteriores podem ser usados para detectar a presença de um evento em uma amostra de tecido de planta. Um exemplo é a técnica de Pirosequenciamento, conforme descrita por Winge (Innov.

Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é desig- nado que se sobrepõe ao DNA genômico e junção de DNA de inserto. O oli- gonucleotídeo é hibridizado a produto de PCR de trançado simples a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequên- cia genômica de flanqueamento), e incubado na presença de um DNA poli- . 10 merase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfossulfato e . luciferin. DNTPs são adicionados individualmente, e a incorporação resulta em um leve sinal que é medido. Um leve sinal indica a presença de inserto de transgene/sequência de flanqueamento devido à amplificação bem suce- dida, hibridização, e extensão de base múltipla ou simples. (Esta técnica é usualmente usada para sequenciamento inicial, não para detecção de um gene específico quando ele é conhecido).

Polarização de Fluorescência é outro método que pode ser usa- do para detectar um amplicon. Em seguida a este método, um oligonucleotí- deo é designado para sobrepor o flanqueamento genômico e junção de DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado ao produto de PCR de trançado simples da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na se- quência de DNA genômico de flanqueamento), e incubado na presença de um DNA polimerase e um ddNTP fluorescente-etiquetado. A extensão de base simples resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença do inserto de transge- ne/sequência de flanqueamento devido à amplificação bem sucedida, hibri- dização, e extensão de base simples.

Sinais moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõe o genômico de flanqueamento e junção de DNA de inserto. À estrutura única da sonda FRET resulta na mesma contendo estrutura secun-

R 3/32 dária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em proximidade. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dnTPs. Em seguida a amplifi- caçãodePCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET para a sequên- cia resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espa- cial das porções fluorescente e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença do genômico de flanqueamento/sequência de inserto transgene devido à amplificação bem sucedida e hibridização. á 10 Ensaio de sonda de hidrólise, de outro modo conhecido como J TAQMAN (Life Technologies, Foster City, Calif), é um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, uma sonda FRET de oligonucleotídeo é designada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flanqueamento para detecção específica de evento. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) são cicliza- dos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da porção fluorescente a partir da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença do flanqueamento/sequência de inserto transgene devido à ampli- ficação bem sucedida e hibridização.

Outro desafio, entre muitos, é descobrir um gene de referência adequado para um dado teste. Por exemplo, conforme citado no resumo de Czechowski et al, "Um conjunto excepcionalmente grande de dados de es- tudos GeneChip de genoma total Affymetrix ATH1 providos os meios para identificar uma nova geração de genes de referência com níveis de expres- são muito estáveis na espécie de modelo de planta Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Centenas de genes Arabidopsis foram encontrados que realizam genes de referência tradicionais em termos de estabilidade de expressão através de todo desenvolvimento, e sob uma faixa de condições ambientais". (Czechowski et al. (2005) Identificação ampla de genoma e teste de genes de referência superiores para normalização transcrita em Arabidopsis. Plant

. 4/32 Physiol. 139, 5-17).

Brodmann et al. (2002) se refere a uma detecção de PCR quan- titativa de tempo real de teor de milho transgênico em alimento para quatro variedades de milho diferentes aprovadas na União Europeia. Brodmann, PD,,P.D.,IMgEC., Berthoud H., e Herrmann, A. Métodos de Reação de Ca- deia Polimerase Quantitativa de Tempo Real para Quatro Variedades de Milho Geneticamente Modificadas e Teor de DNA de Milho em Alimento. J. of AOAC international 2002 85 (3) Hernandez et al. (2004) mencionam quar- to genes possíveis para uso com PCR de tempo real. ' 10 Hernandez et al. (2004) menciona quatro genes possíveis para ' uso com PCR de tempo real. Hernandez, M., Duplan, M--N., Berthier, G., Vaitiingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., e Bertheau, Y. Desenvolvi- mento e comparação de sistemas de reação de cadeia polimerase de tempo real para detecção específica e quantificação de Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004,52,4632-4637.

Costa et al. (2007) alcançaram esses quatro genes (também no contexto de PCR de tempo real) e concluíram que o álcool dehidrogenase e genes zein foram os melhores genes de referência para detectar um "even- to" de amostra (um gene lectin) para fontes de inter-mistura de alimento transgênico. Costa, L. D., e Martinelli L. Desenvolvimento de um Método de PCR de Tempo Real Baseado em plasmídeos de Alvo Duplo para Determi- nação de uma Intermistura de Soja Geneticamente Modificada Inesperada com Componentes de Alimento. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.

Huang et al. (2004) usaram plasmídeo pMulM2 como moléculas dereferência para detecção de MON810 e NK603 transgenes em milho. Hu- ang e Pan, "Detecção de Milho MON810 Geneticamente Modificado e NK603 por Métodos de Reação de Cadeia Polimerase Multiplex e de Tempo Real", J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268.

Gasparic et al. (2008) sugerem tecnologia de LNA, de uma com- paração a ciclização de tecnologia de sonda TaqMan, e várias químicas de PCR de tempo real, para analisar quantitativamente eventos de milho (tal como MONB810). Gasparic, Cankar, Zel, e Gruden, "Comparação de quími-

: 5/32 cas de PCR de tempo real diferentes e qualquer adequabilidade para detec- ção e quantificação de organismos geneticamente modificados", BMC Biote- chnol. 2008; 8: 26. U.S. 20070148646 se refere a um método de extensão de inicia- dorpara quantificação que requer dispensa controlada de nucleotídeos indi- viduais que podem ser detectados e quantificados pela quantidade de nucle- otídeos incorporados. Isto é diferente do método de PCR TaqMan método usando um gene de referência interno. Para distinguir entre genótipos homozigotos e hemizigotos de 1 10 TCI 507, um ensaio Invasor foi usado bem sucedidamente para este evento. ' Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. e Thompson, S. Um Ensaio Inder à base de não PCR-Quantitativamente Detecta Genes de Cópia Simples em Genomas de Planta Complexos. Mol. Breeding 2008,21, 173-181.

Huabang (2009) se refere a teste de zigosidade à base de PCR de milho transgênico. Contudo, nenhum gene de referência parece ser usa- do. Huabang, "Um Método de Teste de Zigosidade à Base de PCR Preciso e Rápido para Milho Geneticamente Modificado", Molecular Geração de plan- ta, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é relacionada, em parte, a métodos de de- tectar o evento de soja AAD-12 (Glicina máx) designado DAS-68416-4 tendo semente depositada com American Type Culture Collection (ATCC) com Nº de Acesso. PTA-10442.

Mais especificamente, a presente invenção se refere, em parte, a ensaio de TagMan PCR de pontos finais para o evento de soja ADD-12. Algumas concretizações são direcionadas a ensaios que são capazes de análise de zigosidade de alta produção. A invenção se relaciona adicional- mente, em parte, a descoberta de um gene de referência lectin preferido pa- rauso na determinação de zigosidade. Estes e outros procedimentos rela- cionados podem ser usados para identificar unicamente linhas de sojas compreendendo o evento da invenção.

' 6/32 Esta invenção também se relaciona, em parte, a geração de planta usando quaisquer dos métodos objetos. Em algumas concretizações, referida sequência de evento/polinucleotídeo pode ser "empilhada" com ou- tros traços, incluindo, por exemplo, outras(s) tolerâncias à gene(s) herbicida elouproteínas inibitórias de inseto. Contudo, a invenção inclui plantas tendo o evento simples, conforme aqui descrito.

Adicionalmente, a invenção proporciona ensaios para detecção da presença do evento objeto em uma amostra (de sojas, por exemplo). Kits e condições úteis na condução dos ensaios são também providos.

í 10 BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS : Figura 1. DNA genômico do evento de soja DAS-68416-4 foi di- gerido com EcoRV, ou Pvu Il, e usado para gerar bibliotecas GENOME- WALKER" correspondentes, que foram usadas como gabaritos para ampli- ficar as sequências de DNA alvos.

Figura 2. O diagrama esquemático representa as localizações de iniciador e estratégia de clonagem para sequenciamento de comprimento total do evento de soja DAS-68416-4 dos limites 5' a 3'.

Figura 3. O diagrama esquemático representa as localizações de iniciador para confirmar a sequencia de comprimento total do evento de soja DAS-68416-4 do limites 5'a3.

Figura 4. O diagrama esquemático representa as localizações de iniciador para confirmar a sequencia de local de inserção do evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 proporciona uma sequência de 5' e 3' sequências genômicas de flanqueamento em qualquer lado do inserto AAD-12, incluindo o inserto. As sequências de flanqueamento são sublinhadas.

SEQ ID NOs :2-7 proporciona sequências para iniciadores e sondas para uso de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Evento de soja transgênica AAD-12 (proporcionando tolerância à herbicida) pDAB4468-416 foi gerado por transformação de Agrobacterium.

- 7/32 Ambas sequências de flanqueamento terminais 5' e 3' deste inserto transge- ne AAD-12 foram clonadas, sequenciadas e caracterizadas conforme deta- lhado em USSN 61/263,950 (depositado em 24 de novembro de 2009). Em algumas concretizações específicas, o AAD-12 está presente em sojas con- forme o evento designado DAS-68416-4 tendo semente depositada com American Type Culture Collection (ATCC) com Nº de Acesso. PTA-10442, e progênie derivada deste. 2500 sementes foram depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste em 22 de outubro de 2009. O depósito foi testado em 2 de novembro de 2009, e naquela data, as sementes eram viáveis. Í 10 Iniciadores específicos TAQMAN e sonda foram designadas, : conforme aqui detalhado, em parte, de acordo com as sequências de DNA localizadas na região de junção entre o transgene e o DNA genômico hos- pedeiro. A especificidade de evento dos iniciadores e sonda foi bem sucedi- damente testada em formato duplex com a soja Lectin como um gene de referência em PCR de tempo real contra eventos de soja AAD-12 diferentes e variedade de soja não transgênica Maverick. Os procedimentos para en- saíios TAQMAN específicos de evento de ponto terminal para o evento de soja AAD-12 foram desenvolvidos, conforme aqui detalhado.

A extensão de sequência da região da junção de integração en- tre DNA de planta hospedeira e o construto de gene integrado neste evento de soja AAD-12 é uma sequência única. Ela foi usada para desenvolver en- saios de evento específico (PCR convencional ou PCR de tempo real) para detectar presença de evento de soja AAD-12 pDAB4468-416 para teste de GMO, e para determinar estado de zigosidade de plantas em populações de geração. O ensaio TAQMAN de evento específico aqui reportado pode ser empregado para ambas as aplicações.

A invenção proporciona ensaios para detectar a presença de e- vento de soja DAS-68416-4 transgênico em uma amostra. Aspectos da in- venção incluem métodos de designar e/ou produzir quaisquer moléculas de ácido nucleico diagnósticas exemplificadas ou sugeridas aqui. Linhas de planta compreendendo este evento podem ser detectadas usando sequên- cias reveladas e sugeridas aqui.

: 8/32 Desse modo, em algumas concretizações, esta invenção se re- fere a identificação de linhas de soja tolerantes à herbicida. A invenção se relaciona a, em parte, detectar a presença do evento objeto de modo a de- terminar se progênie de um cruzamento sexual contém o evento de interes- se. Em adição, um método para detectar o evento é incluído, e é proveitoso, por exemplo, para cumprir com regulações requerendo a aprovação pré- comercializada e etiquetação de alimentos derivados de plantas de colheita recombinantes, por exemplo.

Mais especificamente, o evento é um evento AAD-12 também 7 10 denominado pDAB4468-0416. Esta invenção pode ser usada para sua sele- : ção e caracterização para estabilidade e expressão na planta total e níveis moleculares de geração a geração.

O gene sintético objeto (aad-12) usado de acordo com a inven- ção foi derivado de Delftia acidovorans e codifica uma enzima capaz de de- sativar vários herbicidas com uma porção de ariloxialcanoato, incluindo fe- nóxi auxin (por exemplo, 2,4-D, MCPA), bem como piridilóxi auxins (por e- xemplo, fluroxipir, triciopir). Thegene aad-12, acionados por promotores atU- bilO, foi introduzido na linha de soja Maverick, via técnicas de Agrobacterium tumefaciens.

A invençãose relaciona, em parte, a um PCR de ponto final de ensaio de TaqMan à base de fluorescência utilizando um gene endógeno como um controle de referência (número de cópia) para análise de zigosida- de de alta produção do evento de soja AAD-12. A invenção se relaciona adi- cionalmente a, em parte, descoberta de um gene de referência preferido, invertase. Vários genes de referência foram identificados como opções pos- síveis.

A invençãotambém se relaciona, em parte, ao desenvolvimento de um PCT TaqMan de ponto final biplex para análise de zigosidade especí- fica de soja AAD-12. Adicionalmente, a invenção se relaciona, em parte, ao desenvolvimento de kits de teste de geração de AAD-12.

Os ensaios de TaqgMan de ponto final são baseados em uma es- tratégia mais/menos, pela qual "mais" significa a que amostra é positiva para

: 9/32 o gene ensaiado e "menos" significa que a amostra é negativa para o gene ensaiado. Estes ensaios tipicamente utilizam dois conjuntos de oligonucleo- tídeos para identificação da sequência transgene AAD-12 e a sequência de gene tipo selvagem respectivamente, bem como sondas etiquetadas duplas paramediro teor de transgene e sequência tipo selvagem.

Embora o ensaio Invasor tenha sido uma técnica robusta para eventos de caracterização, ele é muito sensível para qualidade do DNA. Em adição, o ensaio requer uma alta quantidade de DNA. Invasor também re- quer uma etapa adicional de desnaturação que, se não manuseada correta- : 10 mente, pode tornar o ensaio Invasor não bem sucedido. Adicionalmente, o : tempo de ensaio mais longo do ensaio Invasor é limitado em sua flexibilida- de a números de manuseio eficientemente grandes de 416 amostras de e- vento de AAD-12 para análise em um ajuste comercial. Uma vantagem prin- cipal da invenção é a economia de tempo e eliminação da etapa de desnatu- ração.

A análise de TagMan de Ponto Final objeto para detecção de 416 eventos de AAD-12 oferece vantagens surpreendentes sobre Invasor, particularmente na análise de número maior de amostras.

Definições e exemplos são providos aqui para auxiliar a descre- vera presente invenção e a guiar aqueles técnicos no assunto a praticar a invenção. A menos que de outro modo notado, os termos são para serem compreendidos de acordo co m uso convencional por aqueles técnicos no assunto. A nomenclatura para bases de DNA conforme colocada em 37 CFR 8 1.822 é usada.

Conforme aqui usado, o termo "progênie" denota a descendên- cia de qualquer geração de uma planta de origem que compreende evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.

Um "evento" transgênico é produzido por transformação de célu- las de planta com DNA heterólogo, isto é, um construto de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção de uma localização de

: 10/32 genoma particular. O termo "evento" se refere ao transformante original e progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere a progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/de transgene. Mesmo após cruzamento posterior repetido a uma origem recorrente, o DNA transgene inserido e DNA de flanqueamento genômico (DNA genômico/de transgene DNA) a partir da origem transformada estão presentes na progê- nie do cruzamento na mesma localização cromossomial. O termo "evento" também se refere a DNA a partir do transformante original e progênie deste í 10 compreendendo o DNA inserido e sequência genômica de flanqueamento ' imediatamente adjacente ao DNA inserido que seria esperado ser transferido a uma progênie que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linha de origem que in- clui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resul- tante de individualidade) e uma linha de origem que não contém o DNA inse- rido.

Uma "sequência de junção" alcança o ponto em que o DNA inse- rido no genoma é articulado ao DNA a partir do genoma nativo de soja que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou a ou- tras sequências de junção no material genético de planta sendo suficiente para ser diagnóstico para o evento. Incluídas estão as sequências de DNA que alcançam as inserções nos eventos de soja aqui descritos e comprimen- tos similares de DNA de flanqueamento. Exemplos específicos de tais se- quências diagnósticas são providos aqui; contudo, outras sequências que sobrepõem as junções das inserções, ou as junções das inserções e a se- quência genômica, são também diagnósticas e podem ser usadas de acordo com a invenção.

A invenção se refere à identificação de tal flanqueamento, jun- ção, e sequências de inserto. Iniciadores de PCR relacionados e amplicons são incluídos na invenção. De acordo com a invenção, métodos de análise de PCR usando amplicons que alcançam através do DNA inserido e seis limites podem ser usados para detectar ou identificar variedades de soja

. 11/32 transgênica comercializadas ou linhas derivadas das linhas de soja transgê- nica proprietárias objetos.

As sequências totais de cada um destes insertos, juntas com porções das respectivas sequências de flanqueamento, são providas aqui comoSEQIDNO:1.As coordenadas do inserto e sequências de flanquea- mento para este evento com relação a SEQ ID NO: 1 (10,212 pares bases total) são indicadas abaixo.

[| Tranqueamento 5 Tinserto — [fianqueamento 3 | | : LH Ng O O IO Os componentes do inserto e sequências de flanqueamento são adicionalmente ilustrados nas figuras 1 a 4.

Técnicas de detecção da invenção são especialmente úteis na conjunção com geração de planta, para determinar se plantas de progênie compreendem um dado evento, após uma planta de origem compreendendo um evento de interesse ser cruzada com outra linha de planta em um esfor- ço para conceder um ou mais traços adicionais de interesse na progênie.

Estes métodos de análise beneficiam os programas de geração de soja, bem como controle de qualidade, especialmente para sementes de soja transgê- nica comercializadas. Kits de detecção para estas linhas de soja transgêni- cas podem também agora serem produzidos e usados. Isto pode também beneficiar registro de produto e dispensa de produto. Estes podem ser usa- dos para estratégias de geração aceleradas e para estabelecer dados de articulação.

As sequências aqui proporcionadas podem ser usadas para es- tudar e caracterizar processos de integração de transgene, características de local de integração genômica, classificação de evento, estabilidade de transgenes e duas sequências de flanqueamento, e expressão de gene (es- pecialmente relacionada ao silenciamento de gene, padrões de metilação de transgene, efeitos de posição, e elementos potenciais relacionados a ex- pressão tais como MARS [regiões de fixação de matriz], e similares).

. 12/32 Ainda adicionalmente, a invenção inclui seleção de progênie descendente e/ou de planta, preferivelmente uma planta de soja resistente à herbicida em que referida planta tem um genoma compreendendo um inser- to de DNA detectável conforme descrito aqui.

Conforme aqui usado, o termo "soja" significa Glícina max e inclui todas as variedades desta que podem ser gerados com uma planta de soja.

Esta invenção inclui adicionalmente processos de produção de cruzamentos usando uma planta da invençãocomo no mínimo uma origem.

Esta invenção inclui um método para produção de uma semente híbrida Fi ' 10 por cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por : exemplo, origem em geração) e coletando a semente híbrida resultante.

As características das plantas resultantes (ou uma fêmea) podem ser aperfei- çoadas por consideração cuidadosa das plantas de origem.

Uma planta de soja tolerante à herbicida pode ser gerada pelo primeiro cruzamento sexualmente de uma primeira planta de soja de origem consistindo em uma planta de soja crescida de semente de qualquer uma das linhas referidas aqui, e uma segunda planta de soja de origem, produzi- do, desse modo, de uma pluralidade de primeiras plantas de progênie; e, em seguida, seleção de uma primeira planta de progênie que é resistente a um herbicida (ou que possui pelo menos um dos eventos da invenção); e indivi- dualidade da primeira planta de progênie, produzindo, desse modo, uma plu- ralidade de segundas plantas de progênie; e, em seguida, selecionar a partir das segundas plantas de progênie uma planta que seja resistente a um her- bicida (ou que possua pelo menos um dos eventos da invenção). Estas eta- pas podem adicionalmente incluir o cruzamento posterior à primeira planta de progênie, ou da segunda planta de progênie à segunda planta de soja de origem, ou uma terceira planta de soja de origem.

Uma colheita de soja compreendendo sementes de soja da invenção, ou progênie destas, pode, em seguida, ser plantada.

É também para ser compreendido que duas plantas transgêni- cas diferentes podem também ser conjugadas para produzir descendência que contém duas segregações independentemente adicionadas de genes

: 13/32 exógenos. A individualidade de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigóticas para ambos genes exógenos adicionados. O cruza- mento posterior para uma planta de origem e cruzamento com uma planta não transgênica são também contemplados, conforme é propagação vegeta- tiva Outros métodos de geração comumente usados para traços diferentes e colheitas são conhecidos na técnica. A geração de cruzamento posterior foi usada para transferir genes para um traço altamente hereditário simples- mente herdado em um cultivar homozigoto desejável, ou linha de geração, que é a origem recorrente. A fonte do traço a ser transferida é denominada a " 10 origem doadora. A planta resultante é esperada ter os atributos da origem : recorrente (por exemplo, cultivar), e o traço desejável transferido a partir da origem doadora. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (posteriormente cruzado) à origem recorrente. A origem resultante é espera- dateros atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço de- sejável transferido a partir da origem doadora.

A presente invenção pode ser usada com marcadores molecula- res em um método de geração por marcador (MAB). As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas com outros métodos (tais como, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNP's, e SSRs) que identificam traços agronomicamente úteis geneticamente articu- lados, conforme é conhecido na técnica. O traço resistente à progênie pode ser rastreado na progênie de um cruzamento com uma planta de soja da invenção (ou progênie desta, e qualquer cultivar de soja ou variedade) usan- doos métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadores para este traço, e métodos de MAB que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para rastrear o traço(s) resistente(s) à herbicida em plantas de soja onde pelo menos uma linha de soja da invenção, ou progênie desta, foi uma origem ou antecessor. Os métodos da presente invenção podem ser usados para identificar qualquer variedade de soja tendo o evento objeto.

Os métodos da invenção incluem um método de produção de uma planta de soja tolerante à herbicida em que referido método compreen-

: 14/32 de geração com uma planta da invenção. Mais especificamente, referidos métodos podem compreender cruzamento de duas plantas da invenção, ou uma planta da invenção e qualquer outra planta. Os métodos preferidos adi- cionalmente compreendem selecionar progênie de referido cruzamento pela análisede referida progênie para um evento detectável de acordo com a in- venção. Por exemplo, a invenção pode ser usada para rastrear o evento ob- jeto através de ciclos de geração com plantas compreendendo outros traços desejáveis, tais como traços agronômicos, tais como aqueles aqui testados em vários Exemplos. As plantas compreendendo o evento objeto e o traço 1 10 desejado podem ser detectadas, identificadas, selecionadas e rapidamente , usadas em etapas adicionais de geração, por exemplo. O evento objeto/ tra- ço pode também ser combinado através de geração, e rastreado de acordo com a invenção, com um traço resistente a inseto(s) e/ou com traços adicio- nais de tolerância à herbicida. Uma concretização preferida da última é uma planta compreendendo o evento objeto combinado com um gene que codifi- ca resistência ao herbicida dicamba.

O evento objeto pode ser combinado com, por exemplo, traços que codificam resistência à glifosato (por exemplo, planta resistente ou EPSPS bacterial, GOX, GAT), resistência à glifosato (por exemplo, Pat, bar), acetolatato sintase, resistência à herbicida de inibição de (ALS) (por exem- plo, imidazolinonas [tal como imazetapir], sulfonilureias, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidmiltiobenzoatos, e outros químicos [Csrl, SurA, et al. ]), resistência à bromoxinil (por exemplo, Bxn), resistência a inibidores de HPPD (4-hidroxilfenil-piruvato-dioxigenase) enzima, resistência à inibidores de fitoeno desaturase (PDS), resistência à herbicidas de inibição de fotosis- tema |l (por exemplo, psbA), resistência à herbicidas de inibição de fotossis- tema |, resistência à protoporfirinogen oxidase IX herbicidas de inibição de (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistência à herbicidas de fenilureia (por e- xemplo, CYP76B1), enzimas de degradação de dicamba (ver, por exemplo, US 20030135879), e outros podem ser empilhados sozinhos ou em combi- nações múltiplas para proporcionar a capacidade de controlar efetivamente ou impedir alterações de ervas-daninhas e/ou resistência à qualquer herbici-

: 15/32 da das classes antes mencionadas.

Com relação a herbicidas adicionais, alguns inibidores ALS adi- cionais preferidos (também conhecidos como AHAS) incluem as triazolopiri- midina sulfonanilidas (tais como cloransulam-metil, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam, e penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (tais como bispiribac e piritiobac), e flucarbazona. Alguns inibidores de HPPD preferidos incluem mesotriona, isoxaflutole, e sulcotriona. Alguns inibidores de PPO preferidos incluem flumiclorac, flumioxazin, flufenpir, piraflufen, flutiacet, bu- tafenacil, carfentrazona, sulfentrazona, e os difeniléteres (tais como acifluor- ' 10 fen,fomesafen, lactofen, e oxifluorfen). Adicionalmente, AAD-12 sozinho ou empilhado com um ou mais traços de HTC adicionais pode ser empilhado com uma ou mais admissão adicional (por exemplo, resistência à inseto, resistência fúngica, ou tolerân- cia à estresse, et al.) ou descarga (por exemplo, rendimento aumentado, perfil de óleo aperfeiçoado, qualidade de fibra aperfeiçoada, et al.) traços. Desse modo, a invenção pode ser usada para proporcionar um acondicio- namento agronômico completo de qualidade de colheita aperfeiçoada com a capacidade de flexivelmente controlar efetivamente o custo de qualquer nú- mero de pestes agronômicas.

A enzima objeto de AAD-12 capacita a expressão transgênica resultando na tolerância a combinações de herbicidas que controlariam qua- se todas as ervas daninhas de folha ampla e grama. AAD-12 pode servir como um excelente traço de colheita tolerante à herbicida (HTC) para empi- lhar com outros traços (por exemplo, resistência à glifosato, resistência à glifosinato, resistência à imidazolinona, resistência à bromoxinil, et al), e tra- ços de resistência à inseto (CryIF, CrylAb, Cry 34/45, et al.) por exemplo. Adicionalmente, AAD-12 pode servir como um marcador selecionável para auxiliar na seleção de transformantes primários de plantas geneticamente projetadas com um segundo gene, ou grupo de genes.

Os traços de HTC da invenção podem ser usados em novas combinações com outros traços de HTC (incluindo, mas não limitados a, to- lerância á glifosato). Estas combinações de traços ocorrem em novos méto-

' 16/32 dos de controle de espécies de ervas-daninhas (e similares), devido à resis- tência recentemente adquirida, ou tolerância inerente à herbicidas (por e- xemplo, glifosato). Desse modo, em adição aos traços de HTC, novos méto- dos para controle de ervas-daninhas usando herbicidas, para qual tolerância à herbicida foi criada por referida enzima em colheitas transgênicas, estão dentro do escopo da invenção.

Adicionalmente, colheitas tolerantes à glifosato crescidas ao re- dor do mundo são prevalecentes. Muitas vezes em rotação com outras co- Iheitas tolerantes à glifosato, o controle de voluntários resistentes à glifosato ' 10 pode ser difícil em colheitas rotacionais. Desse modo, o uso dos traços : transgênicos objetos, empilhados ou transformados individualmente nas co- lheitas, proporciona uma ferramenta para controlar outras colheitas de volun- tário de HTC.

A menos que de outro modo indicado, referência à sequências de flanqueamento se refere àquelas identificadas com relação a SEQ ID NO: | (ver a Tabela acima). Novamente, SEQ ID NO!:!| inclui o DNA heterólogo inserido no transformante original e sequências genômicas de flanqueamen- to ilustrativa imediatamente adjacentes ao DNA inserido. Toda ou parte des- tas sequências de flanqueamento podem ser esperadas serem transferidas para progênie que recebe o DNA inserido como um resultado de um cruza- mento sexual de uma linha de origem que inclui o evento.

Conforme aqui usado, uma "linha" é um grupo de plantas que revela pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos por pelo menos um traço. Tais linhas podem ser criadas por várias gerações de autopolini- zaçãoe seleção, ou propagação vegetativa de uma origem simples usando tecido ou técnicas de cultura de célula.

Conforme aqui usado, os termos "cultivar" e "variedade" são si- nônimos e se referem a uma linha que é usada para produção comercial.

"Estabilidade" ou "estável" significa que com relação ao dado componente, o componente é mantido de geração a geração e, preferivel- mente, pelo menos três gerações em substancialmente o mesmo nível, por exemplo, preferivelmente +15%, mais preferivelmente +10%>, mais preferi-

: 17/32 velmente +5%. A estabilidade pode ser afetada pela temperatura, localiza- ção, estresse e o tempo de plantio. A comparação de gerações subsequen- tes sob condições de campo deve produzir o componente em uma maneira similar.

"Utilidade Comercial" é definida como tendo bom vigor da planta e alta fertilidade, tal que a colheita pode ser produzida pelos fazendeiros u- sando equipamento de fazenda convencional, e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído a partir da semente usando trituração conven- cional e equipamento de extração. Para ser comercialmente útil, o rendimen- " 10 to, conforme medido pelo peso da semente, teor de óleo, e óleo total produ- : zido por acre, está dentro de 15% do rendimento médio de uma variedade de soja comercial de outro modo comparável sem os traços de valor especial crescidos na mesma região. "Elite agronômica" significa que uma linha tem características agronômicas desejáveis, tais como rendimento, maturidade, resistência à doença, e similares, em adição à resistência a inseto devido ao(s) evento(s) objeto(s). Os traços agronômicos, tomados individualmente em ou em qual- quer combinação, conforme colocados nos Exemplos abaixo, em uma planta compreendendo um evento da invenção, estão dentro do escopo da inven- ção. Qualquer e todas as características e pontos de dados podem ser usa- dos para identificar tais plantas, ou como um ponto ou em qualquer extremi- dade ou ambas as extremidades de uma faixa de características usadas pa- ra definir tais plantas. Conforme um versado na técnica reconhecerá à luz desta reve- lação, concretizações preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores, incluindo sondas de polinucleotídeo, e/ou amplicons. Iniciador(es) "que tocam abaixo" na sequência de flanqueamento não são tipicamente designado(s) para hibridizar além de cerca de 200 ba- ses ou além da junção. Desse modo, iniciadores de flanqueamento típicos seriam designados para compreenderem pelo menos 15 resíduos de qual- quer trançado dentro de 200 bases nas sequências de flanqueamento a par-

' 18/32 tir do começo do inserto. Isto é, iniciadores compreendendo uma sequência de um tamanho apropriado de (ou hibridizando a) 2530-2730 resíduos e/ou 9122-9322 de SEQ ID NO: 1 estão dentro do escopo da invenção. Iniciado- res de inserto podem, do mesmo modo, serem designados em qualquer lu- garnoinserto, mas 2731-2931 e 8921-9121 resíduos podem ser usados, por exemplo, não exclusivamente para tal desenho de iniciador.

Um versado na técnica também reconhecerá que iniciadores e sondas podem ser designados para hibridizar, sob uma faixa de hibridização padrão e/ou condições de PCR, a um segmento de SEQ ID NO: 1 (ou o 1 10 complemento), e complementos deste, em que o iniciador ou sonda não é ' perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Isto é, algum grau de desequiparação pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamen- te 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou, desse modo, nucleotídeos, não necessitam serem ligados com o trançado oposto se a base desequiparada é interna, ou na extremidade do iniciador que é oposta ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são providas a- baixo. Análogos de nucleotídeo sintéticos, tal como inosina, podem também serem usados em sondas. Sondas de ácido nucleico de peptídeo (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, podem também serem usadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores são diagnósticos para (capazes de identificarem unicamente e distinguirem) a presença de um evento da invenção.

Os componentes do "inserto" são ilustrados nas figuras. As se- quências de polinucleotíideo de DNA destes componentes, ou fragmentos destes, podem ser usados como iniciadores de DNA ou sondas nos métodos da presente invenção.

Em algumas concretizações da invenção, composições e méto- dos são providos para detecção da presença da região de transgene/de in- serção genômica, em plantas e sementes e similares, de uma planta de soja.

Sequências de DNA são providas, bem como segmentos destas, e comple- mentos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos destas.

Estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados

: 19/32 para identificar unicamente estas linhas de soja.

Em algumas concretizações, sequências de DNA que compre- endem um fragmento contíguo da nova região de transgene/inserção genô- mica são um aspecto desta invenção. Incluídas estão sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos de se- quência de inserto de transgene e um comprimento suficiente de polinucleo- tídeos de sequência genômica de soja de uma ou mais das três plantas de soja antes mencionadas e/ou sequências que são úteis como sequências de iniciador para a produção de um diagnóstico de produto de amplicon para 1 10 umaou mais destas plantas de sojas. : Concretizações relacionadas pertencem às sequências de DNA que compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais nucleotídeos contíguos de uma porção transgene de uma sequência de DNA aqui identificada (tão co- mo SEQ ID NO:l e segmentos desta), ou complementos desta, e um com- primento similar de flanqueamento de sequência de DNA de soja destas se- quências, ou complementos destas. Tais sequências são úteis como inicia- dores de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzi- dos usando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer dos eventos de soja aqui referidos. Portanto, a invenção também inclui os amplicons produ- zidos por tais iniciadores de DNA e iniciadores homólogos.

Esta invenção também inclui métodos de detecção da presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de soja aqui referido. Tais métodos podem compreender: (a) contatar a amostra compreendendo —DNA com um conjunto de iniciador que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA de pelo menos um destes eventos de soja, produz um amplicon que é diagnóstico para referido(s) evento(s); (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, os amplicon; e (c) detectar o amplicon.

Métodos de detecção adicionais da invenção incluem um méto- do de detectar a presença de um DNA, em uma amostra, correspondente a pelo menos um de referidos eventos, em que referido método compreende:

: 20/32 (a) contatar a amostra compreendendo DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA de pelo menos um de referidos eventos de soja, e que não hibridiza sob as condições de hibridiza- ção estringentes com uma planta de soja de controle (DNA de evento de não interesse); (b) sujeição da amostra e sonda à condições de hibridização es- tringentes; e (c) detecção da hibridização da sonda ao DNA.

Em concretizações ainda adicionais, a invenção inclui métodos de produção de uma planta de soja compreendendo o evento aad-12 da in- venção, em que referido método compreende as etapas de: (a) cruzar sexu- : 10 almente uma primeira linha de soja de origem (compreendendo cassetes de . expressão da presente invenção, que conferem referido traço de resistência à herbicida a plantas de referida linha) e uma segunda linha de soja de ori- gem (que carece deste traço de tolerância à herbicida) produzindo, desse modo, uma pluralidade de plantas de progênie; e (b) seleção de uma planta de progênie pelo uso da invenção. Tais métodos podem opcionalmente compreender a etapa adicional de cruzamento posterior da planta de progê- nie para a segunda linha de soja de origem para produção de uma planta de soja de geração verdadeira que compreende referido traço de tolerância à herbicida.

De acordo com algumas concretizações da invenção, métodos de determinar a zigosidade de progênie de um cruzamento são providos. Referidos métodos podem compreender contatar uma amostra, compreen- dendo DNA de soja, com um conjunto de iniciador da invenção. Referidos iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nuclei- cocom bDNA genômico de pelo menos um de referidos eventos de soja, pro- duz um primeiro amplicon que é diagnóstico para pelo menos um de referi- dos evento de soja. Tais métodos compreendem adicionalmente realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o primeiro amplicon; detecção do primeiro amplicon; e contatar a amostra compreendendo DNA de soja com referido conjunto de iniciador, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômi- co de plantas de soja, produz um segundo amplicon compreendendo o DNA genômico nativo de soja homólogo à região genômica de soja, e realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o segundo amplicon.

Os métodos compreendem adicionalmente detectar o segundo amplicon, e comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica para a inserção transgene.

Kits de detecção de DNA usando as composições aqui revela- das e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA.

Os kits são úteis para identificação do evento objeto de DNA de soja em uma amostra, e podem ser aplicados a métodos para geração de plantas de soja contendo este DNA.

Os kits contêm sequências homólogas de DNA ou complementa- i res aos amplicons, por exemplo, aqui revelados, ou as sequências homólo- gas de DNA ou complementares a DNA contido nos elementos genéticos transgenes dos eventos objetos.

Estas sequências de DNA podem ser usa- das em reações de amplificação de DNA, ou como sondas em um método de hibridização de DNA.

Os kits podem também conter os reagentes e mate- riais necessários para o desempenho do método de detecção.

Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico isolada que é fi- xada a uma etiqueta detectável convencional, ou molécula repórter (tais co- mo um :isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente, ou enzima). Tal uma sonda é complementar a um trançado de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a um trançado de DNA genômico de um de refe- ridos eventos de soja, se de uma planta de soja ou de uma amostra que in- clui DNA a partir do evento.

As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos deoxiribonucleico ou ribonucleico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e pode ser usada para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo. "Iniciadores" são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são reforçados a uma trança de DNA alvo complementar pela hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o trançado de DNA alvo, em seguida prolongados ao longo do trançado de DNA alvo por uma

: 22/32 polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Os pares de iniciadores da presente invenção se referem a seu uso para amplificação de uma se- quência de ácido nucleico alvo, por exemplo, pela reação de cadeia polime- rase (PCR), ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico. Sondas e iniciadores são geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, n 10 94,95,96,97,98,99,100,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, , 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

15. 172,173, 174, 175, 176, 177, 178. 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,238,239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305m 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312,313,314,315,316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387,388,389,390,391,392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431,

432, 433, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500 po- linucleotídeos ou mais em comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridi- zam especificamente a uma sequência alvo sob condições de hibridização de estringências altas. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de sequência completa com a sequên- cia alvo, embora estas sondas difiram da sequência alvo e que retenham a f 10 capacidade de hibridizar às sequências alvos podem ser designadas por D métodos convencionais.

Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores são descri- tos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et ah, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989. Pares de iniciador de PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, pelo uso de programas de computador pretendidos para esta proposta.

Iniciadores e sondas baseados no DNA de flanqueamento e se- quências de inserto aqui revelados podem ser usados para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências reveladas por métodos convencio- nais, por exemplo, por reclonagem e sequenciamento de tais sequências.

As sondas de ácido nucleico e iniciadores da presente invenção hibridizam sob condições estringentes a uma sequência de DNA alvo. Qual- quer hibridização de ácido nucleico convencional, ou método de amplifica- ção, podem ser usados para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácido nucleico, ou fragmen- tos destas, são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Conforme aqui usado, duas molé- culas de ácido nucleico são referidas para serem capazes de hibridizar es- pecificamente a uma outra se as dias moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de trançado duplo antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é referida para ser o "complemento" de outra molécula de

. 24/32 ácido nucleico se elas exibem complementaridade completa.

Conforme aqui usado, moléculas são referidas para exibir "complementaridade completa" quando muitos nucleotídeos de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra.

Duas moléculas são referidas para serem "minima- mente complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam reforçadas entre si sob condições de "baixa estringência" pelo menos convencionais.

Similarmente, as moléculas são referidas para serem "complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas f 10 permaneçam reforçadas entre si sob condições de "alta estringência" con- V vencionais.

As condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989. Desvios de complementaridade complete são, por- tanto, permissíveis, considerando-se que tais desvios não impedem comple- tamente a capacidade das moléculas para formar uma estrutura de trançado duplo.

De modo que uma molécula de ácido nucleico sirva como um inicia- dor ou sonda, ela necessita ser suficientemente complementar em sequên- cia para ser capaz de formar um a estrutura de trançado duplo estável sob as concentrações de solvente e sal particulares empregadas.

Conforme aqui usado, uma sequência substancialmente homó- logaé uma sequência de ácido nucleico que hibridizará especificamente ao complemento da sequência de ácido nucleico a qual ela está sendo compa- rada sob altas condições estringentes.

O termo "condições estringentes" é funcionalmente definido com relação a hibridização de uma sonda de ácido nucleico a um ácido nucleico alvo(isto é, a uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) pelo procedimento de hibridização específica discuti- do em Sambrook et a/l., 1989, at 9.52-9.55. Ver também, Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 e 9.56-9.58. Consequentemente, as sequências de ácido nucleico da invenção podem ser usadas por sua capacidade de formar sele- tivamente moléculas duplex com estiramentos complementares de fragmen- tosde DNA.

Dependendo da aplicação considerada, pode-se usar condições variadas de hibridização para alcançar graus variados de seletividade de

: 25/32 sonda para sequência alvo. Para aplicações requerendo alta seletividade, tipicamente se empregará condições relativamente estringentes para formar híbridos, por exemplo, se selecionará sal relativamente baixo e/ou condições de alta temperatura, tal como provido por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M NaClem temperaturas de cerca de 50º C a cerca de 70º C. Condições es- tringentes, por exemplo, podem envolver lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,2X SSC, 0,1% de SDS, 65º C). As condições de estringência apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0X cloreto de sódio/citrato í 10 de sódio (SSC)a cerca de 45º C, seguido por uma lavagem de 2,0X SSC a . 50º C são conhecidos àqueles técnicos no assinto. Por exemplo, a concen- tração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a baixa estringên- cia de cerca de 2,0X SSC a 50º C a uma alta estringência de cerca de 0,2X SSC a 50º C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser au- mentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22º C, a condições de alta estringência a cerca de 65º C. Ambos tempe- ratura e sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constante, enquanto que outra variável é mudada. Tais condições seletivas pouco toleradas, se houverem, se desequiparam entre a sondae o gabarito ou trançado alvo. A detecção de sequências de DNA, via hibridização, é bem conhecida àqueles técnicos no assunto, e os ensina- mentos das Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.965.188 e 5.176.995 são exemplares dos métodos de análise de hibridização. Em uma concretização particularmente preferida, um ácido nu- cleicoda presente invenção hibridizará especificamente a um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou aqui su- geridos, incluindo complementos e fragmentos destes, sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção tem a sequência de ácido nucleico conforme aqui colocada em uma das sequências exemplificadas, ou com- plementos e/ou fragmentos destas.

Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção se divide entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácido nu- cleico. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção se divide entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser usadas como marcadores em métodos de geração de planta para identificar a progênie de cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conheci- dos àqueles técnicos no assunto, estes podem incluir, mas não são limitados ' 10 a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas à base de anticor- . po, e etiquetas quimiluminescentes.

Com relação a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciador de amplificação particular, "condições estringentes" são condições que permitem que o par de iniciador hibridize somente para a sequência alvo de ácido nucleico a qual um iniciador tendo a sequência tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e, preferivelmente, produziria um produto de ampli- ficação único, o amplicon.

O termo "específico para (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização estringentes so- mente para a sequência alvo em uma amostra compreendendo a sequência alvo.

Conforme aqui usado, "DNA amplificado" ou "amplicon" se refere ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido —nucleico alvo que é parte de um gabarito de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de soja resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico a partir da planta de soja da presente invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico usan- doum par de iniciador que inclui um iniciador derivado de sequência de flan- queamento no genoma da planta adjacente ao local de inserção de DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo

: 27/32 inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do evento DNA.

O amplicon é de um comprimento e tem uma sequência que é também diagnóstica para o evento.

O amplicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combinado dos mares de iniciador, mais um par de basede nucleotídeo, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciador, mais cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, E 10 81,82,83,84,85, 86,87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, Ú 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162,163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178. 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227,228,229,230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302,303,304,305m 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377,378,379,380,381,382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,

i 28/32 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, ou mais pares bases de nucleotídeo (mais ou menos qualquer dos incrementos listados acima). Alternativamente, a par de iniciador pode ser derivado de sequência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a sequência de nucleotí- , 10 deo de inserto total. Un membro de um par de iniciador derivado da se- ) quência genômica de planta pode estar localizado uma distância a partir da sequência de DNA inserido. Esta distância pode variar de um par base de nucleotídeo até cerca de vinte mil pares bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" especificamente exclui iniciadores dímeros que podem ser formados na reação de amplificação termal de DNA.

A amplificação de ácido nucleico pode ser alcançada por qual- quer dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e são descritos, entre ou- tros, na Patente dos Estados Unidos No. 4.683.195 e Patente dos Estados Unidos No. 4.683.202. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvol- vidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos, bem co- mo outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência do inserto de DNA transgene heteróloga, ou sequência genômica de flanqueamento de um e- vento objeto de soja, pode ser verificada (e corrigida se necessário) por am- plificação de tais sequências a partir do evento usando iniciadores derivados das sequências aqui providas, seguido por sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR do DNA clonado.

O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Eletroforese de gel de agarose e manchamento com etidium brometo é um método bem conhecido comum de detecção de amplicons de DNA.

Outro tal método é Genetic Bit Analysis onde um oligo- nucleotíideo de DNA é designado, que sobrepõe ambas a sequência adja- cente de DNA de flanqueamento genômico e a sequência de DNA inserido.

O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de micro cavi- dade.

Em seguida ao PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e uma sequência genômica de flanqueamento adjacen- te), um produto de PCR de trançado simples pode ser hibridizado ao oligo- nucleotídeo imobilizado e serve como um gabarito para uma reação de ex- tensão de base simples usando uma polimerase de DNA e ddNTPs etique- " 10 tados específicos para a próxima base esperada.

A leitura pode ser fluores- ' cente ou à base de ELISA.

Um sinal indica a presença do inserto/sequência de flanqueamento devido à amplificação bem sucedida, hibridização, e ex- tensão de base simples.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidas a, ou citadas aqui, são incorporados por referência em sua totalidade à extensão que eles não são inconsistentes com os ensina- mentos explícitos deste relatório descritivo.

Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar procedimentos para praticar a invenção e para demonstrar certas concretizações preferidas da invenção.

Estes exemplos não devem ser construídos como limitantes.

Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas revela- das nos seguintes exemplos representam abordagens específicas usadas para ilustrar modelos preferidos para sua prática.

Contudo, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente revelação, apreciar que quaisquer mu- danças podem ser feitas nestas concretizações específicas, enquanto que ainda obtém-se resultados similares sem fugir do espírito e escopo da inven- ção.

A menos que de outro modo indicado, todas as percentagens são por peso, e todas as proporções de mistura de solvente são por volume, a me- nos que de outro modo notado.

As seguintes abreviações são usadas, a menos que de outro modo indicado.

: 30/32 AAD-12 ariloxialcanoato dioxigenase-1 bp par base ºC graus Celsius DNA ácido deoxiribonucleico DIG digoxigenin EDTA ácido etilenodioaminatetra-acético Kb kilobase ug micrograma . upL microlitro À 10 mL mililitro ã M massa molar OLP sonda de sobreposição PCR reação de cadeia polimerase PTU unidade de transcrição de planta SDS sódio dodecil sulfato SOP procedimento de operação padrão SSC uma solução tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 8,3 V volts

EXEMPLOS Exemplo 1. Ensaio Tagman Específico de Evento Um ENSAIOS TAQMAN específico foi desenvolvido para detec- tar a presença de evento de soja DAS-68416-44 e para determinar estado de Zigosidade de plantas na geração de populações. Para desenvolver um en- saio específico de evento, iniciadores Tagman específicos e sondas foram designadas de acordo com as sequências de DNA localizadas na junção 5' inserto-para-planta. Para detecção específica de evento de soja DAS-68416- 4, um fragmento de DNA de 128-bp que reforça esta junção de integração 5' foi amplificada usando dois iniciadores específicos. A amplificação deste produto de PCR foi medida por uma sonda de MGB alvo específica sinteti- zada por Applied Biosystems contendo o FAM repórter em seu terminal 5º. À especificidade deste método de detecção Taqgman para evento de soja DAS-

. 31/32 68416-4 foi testada contra 15 eventos de soja diferentes aad-12 e variedade de soja não transgênica (Maverick) em formato duplex com o gene de refe- rência endógeno específico de soja, lectin.

Exemplo 1.1. Isolamento de gDNA Amostras de gDNA de 15 eventos de soja diferentes AAD-12 e variedades de sojas não transgênicas foram testadas neste estudo.

DNA genômico foi extraído usando o Kit de Planta Qiagen DNeasy 96. Discos de folha de soja fresca, oito por amostra, foram usados para extração de gDNA usando um protocolo de Kit de Planta modificado Qiagen DNeasy 96. O gD- í 10 NA foi quantificado com o método Pico Green de acordo com as instruções . do vendedor (Molecular probes, Eugene, OU). As amostras foram diluídas com água livre de DNase resultando em uma concentração de 10 ng/yuE pa- ra a proposta deste estudo.

Example 1.2. Ensaio Tagman e Resultados Iniciadores Tagman específicos e sondas foram designados para um ensaio de Tagman específico de evento de soja DAS-68416-4. Estes reagentes podem ser usados com as condições listadas abaixo para detec- tar aad-12 dentro do evento de soja DAS-68416-4. A Tabela 1 lista o inicia- dor e sequências se sonda que foram desenvolvidos especificamente para a detecção de evento DAS-68416-4. Tabela 1. Iniciadores de PCR e Sondas Avanço o EEE emo Reverse ACT O AA AATAAATI Avanço

. 32/32 | 002 TTCTCTGCTGCCACGGGACTCGA-BHQ1 As condições de PCR multiplex para amplificação são conforme segue: IX PCR tampão, 0,5 — 2,5 de MM MgCl7, 0,2 mM de dNTP, 0,2 uM de Iniciador Soja16-F, 0,2 uM de Iniciador Soja 16-R, 0,2 uM de Iniciador ZNOO7, 0,2 UM de Iniciador ZNOO8, 0,08 uM de Soja416-Sonda, 0,08 uM de ZNLTOO2, 40 U/mL de HotStart Tag, 30 ng de gONA em uma reação total de 25 ul.

O coquetel foi amplificado usando as seguintes condições: i) 95ºC por . 15 min,, ii) 95ºC por 20 seg, iii) 60ºC por 60 seg, iv) repetir a etapa ii-lii por - 35 ciclos, v) 4ºC manter.

A PCR de tempo real foi efetuada em termocicliza- ' dores BIO-RAD ICYCLER'Y e ABI Gene Amp PCR System 9700. A análise dedados foibaseada na medição do limite de ciclo (CT), que é o número de ciclo de PCR quando a medição de fluorescência alcança um valor ajustado.

O valor de CT foi calculado automaticamente por software iCycler.

O método de detecção Tagman para evento de soja DAS-68416-4 foi testado contra 16 eventos de soja diferentes aad-12 e variedades de soja não transgênicas em formato duplex com endógeno específico de soja lectin como um gene de referência.

Este ensaio especificamente detecta o evento de soja DAS- 68416-4 e não produz ou amplifica quaisquer resultados falsos-positivos dos controles (isto é, os 15 eventos de soja diferentes aad-12 e variedades de soja não transgênica). Os iniciadores específicos de evento e sondas podem ser usados para a detecção do evento de soja DAS-68416-4 e estas condi- ções e reagentes são aplicáveis para ensaios de zigosidade.

Claims (22)

' 18 REIVINDICAÇÕES

1. “Método para determinar evento de zigosidade de uma plan- ta de soja compreendendo um evento de soja AAD-12 pDAB4468-0416, re- ferido evento compreendendo um construto transgene compreendendo um gene AAD-12, referido construto transgene sendo flanqueado por um 5' flan- queamento de DNA genômico de soja e um 3' flanqueamento de DNA ge- nômico de soja, referido método compreendendo: obter uma amostra de DNA de DNA genômico de referida planta de soja; produzir uma amostra contatada que contata referida amostra de DNA com q 10 a. um primeiro evento de iniciador e um segundo evento de inici- S ador, em que referido primeiro evento de iniciador liga especificamente refe- rido construto transgene, referido segundo evento de iniciador liga especifi- camente referido 5' DNA de flanqueamento genômico de soja ou referido 3' DNA de flanqueamento genômico de soja, e em que referido primeiro evento de iniciador e referido segundo evento de iniciador produzem um evento de amplicon quando submetidos a condições de TAQMAN PCR b. um iniciador de avanço de referência e um iniciador reverso de referência que produzem um amplicon de referência de um gene de refe- rência de soja endógena quando submetido a condições de TAQMAN c. uma sonda de evento florescente que hibridiza com referido evento de amplicon d. uma sonda de referência florescente que hibridiza com referi- do amplicon de referência; submeter referida amostra contatada a condições de TAQMAN PCR de ponto final à base de florescência; quantificar referida sonda de e- vento florescente que hibridiza para referido evento de amplicon; quantificar referida sonda de referência florescente que hibridiza para referido amplicon de referência; comparar quantidades de sonda de evento florescente hibridiza- daasonda de referência florescente hibridizada; e determinar zigosidade de pDAB4468-0416 por comparação de proporções florescentes de sonda de evento florescente hibridizada e sonda

. 2/3 de referência florescente hibridizada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que referi- dos amplicons consistem de 50-150 resíduos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que referido 5 DNA de flanqueamento compreende resíduos 1-2730 de SEQ ID NO:l, e referido 3' DNA de flanqueamento compreende 9122-10,212 de SEQ ID NO:L.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- rido construto transgene consiste em resíduos 2731-9121 de SEQ ID NO:1.

f 10 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- : rido gene de referência é um gene lectin de soja endógena.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- rido segundo evento de iniciador liga resíduos 2530-2730 de SEQ ID NO: 1, ou o complementos destes.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- rido segundo evento de iniciador liga resíduos 9122-9322 de SEQ ID NO:|.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- rido método é usado para geração de introgressão do evento em outra linha de soja.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que a refe- rida outra linha de soja carece de referido evento.

10. — Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os refe- ridos amplicons consistem em 100-200 pares bases.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o refe- rido gene de referência compreende ou hibridiza a uma sequência selecio- nada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, e SEQ ID NO:7.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os referi- dos iniciadores de referência compreendem SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO:6, e areferida sonda de referência compreende SEQ ID NO:7.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as referi- das sondas são etiquetadas com um corante fluorescente e um extintor.

' 33

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o referido evento de sonda compreende FAM como o referido corante fluorescente na extremidade 5' de referido evento de sonda e um extintor de MGB na extre- midade 3' de referido evento de sonda.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a referida sonda de referência é etiquetada com HEX na extremidade 5' da referida sonda de referência e um Black Hole Quencher 1 (BHQ!) na extremidade 3' da referida sonda de referência .

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido f 10 evento de sonda compreende SEQ ID NO:4. Í

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os referi- dos eventos iniciadores são selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os resul- tadosdo referido método são lidos diretamente em uma leitora de placa.

19. Método, de acordo a reivindicação 1, em que a referida a- mostra de DNA é obtida de uma planta de soja em um campo.

20. Kit para realização do método como definido na reivindica- ção 1, o referido kit compreendendo referido primeiro evento de iniciador, o referido segundo evento de iniciador, referido iniciador de avanço de refe- rência, o referido iniciador reverso de referência, referido evento de sonda, e a referida sonda de referência .

21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, em que os referidos eventos iniciadores consistem de SEQ ID NO :2 e SEQ ID NO:3, os referidos iniciadores de referência consistem de SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, o refe- rido evento de sonda consiste em SEQ ID NO:4, e referida sonda de refe- rência consiste em SEQ ID NO:7.

22. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência se- lecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQIDNO4,SEQID NO:5, SEQ ID NO:6, e SEQ ID NO:7.

Pvull 2 CSVMV — ORF1 | | MARÇS AUDIO ORF23 PAT EEN SSEsSass Y Genoma Genoma de Soja | de Soja DNA Digerido com Pvull e IcoRV | EcoRV v Pvull CSVNV EcoR) Abro AUTO pan17 ORI R AAD12 iM AIR oR PAT MAR ARO 2s sc — [SS | | Ligar a Adaptador Walker de Genoma +y Du p—D SDS QuE ES) EE caea: ESSES É o — —> e = + >= ++ AP ES LENdo3 AP1 ES LENdO3 ES PATENdO3 API PCR Primário PCR Primário PCR Primário PCR Secundário PCR Secundário PCR Secundário AP2 ES LEnd04 AP2 ES LENdO4 ES PATENdo04 AP2 > << > + >= << mea | A o PA —— fo A Limite terminal 5º Limite terminal 5º Limite terminal 3º EcoRV DNA genômico do evento de soja DAS-68416-4 foi digerido com EcoRV, ou Pvu II, e usado para gerar bibliotecas GENOMEWALKERTY correspondentes, que foram usadas como gabaritos para amplificar as sequências de DNA alvos.

- 2/4 AAD-12 - ORF 23 - Promotor AtUbi1O E CsVMV Promoter RB7 MAR ORF1 Região de Flanqueamento 5' PAT Região de Flanqueamento 3' | Prímer| Prímer Primer Primer — Prímer | Prímer Prímer 416-5-1] / 4468-1R [4488-1 4450-2R | 4468-2 — 4468-3R | 4468-9 416-3-1R Amplicon 1 i Í Í Amplicon 4 Amplicon 2 Amplicon 3 O diagrama esquemático representa as localizações de prímer e estratégia de clonagem para sequenciamento de comprimento total do evento de soja DAS-68416-4 dos limites 5' a 3' FIG. 2

. 3/4 y AAD-12 ORF 23 q Promotor AtUbi1O Promotor CSVMV

PAT RB7 MAR ORF 1 Soja 416F Soja 416R Região de Flanqueamento 3' Região de Flanqueamento 5 N | 16PATGO3 16LENdGO04 16PATGO4 16LENdGO3 ANLENdOS PATENdO6S 16LENdGO1 ANIILENdO6 ISPATOO2 16PATGO1 16LENdG02 O diagrama esquemático representa as localizações de prímer para confirmar a sequencia de comprimento total do evento de soja DAS-68416-4 do limites 5' a 3. FIG. 3

. . 4/4 - . Região de Flanqueamento 5' Local de Inserção de T-DNA Região de Flanqueamento 3' 192: | Inserção BP 9 463HR EEE SEE a no ESSA AAA A CASAS T — AAD-12 ariloxialcanoato dioxigenase-1 O diagrama esquemático representa as localizações de prímer para confirmar a sequencia de local de inserção do evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.