BR102013001764A2 - Método de detecção do evento de algodão pdab4468.19.10.3 - Google Patents

Método de detecção do evento de algodão pdab4468.19.10.3 Download PDF

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Abstract

Método de detecção do evento de algodão pdab4468.1 9.10.3. O evento de algodão pdab4468.19.1o.3 compreende cassetes de expressão gênica que contêm genes que codificam aad-12 e pat, fornecendo tolerância a herbicidas a plantas de cultivo de algodão que contêm o evento e possibilitando métodos para proteção das plantas de cultivo. As modalidades da presente invenção fornecem métodos de detecção de eventos relacionados a polinucleotídeos

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE DETECÇÃO DO EVENTO DE ALGODÃO pDAB4468.19.10.3".
REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA
Este pedido de patente reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos da América Número de Série 61/589.594, depositado em 23 de janeiro de 2012, para “HERBICI-DE TOLERANT COTTON EVENT pDAB4468.19.10.3 (EVENTO DE ALGODÃO pDAB4468.19.10.3 TOLERANTE A HERBICIDAS)”.
ANTECEDENTES O gene que codifica AAD-12 (ariloxialcanoato dioxigenase-12) é capaz de conferir níveis comerciais de tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético, 2,4-D e MCPA e os herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclo-pir e fluroxipir, quando expresso em plantas transgênicas. O gene que codifica PAT (fosfinotricina acetiltransferase) é capaz de conferir tolerância ao herbicida fosfinotricina (glufosinato) quando expresso em plantas transgênicas. PAT foi expresso de forma bem sucedida no algodão para uso tanto como um marcador selecionável quanto para conferir níveis comerciais de tolerância ao herbicida glufosinato em plantas transgênicas. É sabido que a expressão de transgenes em plantas é influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez por causa da estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos reguladores da transcrição (por exemplo, intensificadores) próximos ao sítio de integração (Weising e outros, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). A presença do transgene em localizações diferentes no genoma influenciará o fenótipo geral da planta de maneiras diferentes. Por exemplo, foi observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre os eventos. Pode também haver diferenças nos padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de plantas, que podem não corresponder aos padrões esperados partindo de elementos reguladores da transcrição presentes no constructo gênico introduzido. Por esta razão, é comum produzir centenas até milhares de eventos diferentes e verificar tais eventos para um único evento que possui os níveis de expressão do transgene desejados e os padrões para finalidades comerciais. Como tais, é frequentemente necessároi verificar um grande número de eventos com a finalidade de identificar um evento caracterizado pela expressão ótima de um gene introduzido de interesse. Um e-vento que possui níveis ou padrões desejados de expressão do transgene é útil para a introgressão do transgene dentro de outros fundos genéticos através de cruzamento sexual utilizando métodos de cruzamento convencionais. A progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é utilizada para garantir a expressão gênica confiável em um número de variedades que são bem adaptadas às condições de crescimento locais. É desejável ser capaz de detectar a presença de um evento particular com a finalidade de determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene ou um grupo de transgenes de interesse. Em adição, um método para a detecção de um evento particular seria uma ajuda para cumprir com as regulamentações que requerem a aprovação pré-mercado e a rotulação do alimento e da fibra derivados de plantas de cultivo recombinantes, por exemplo, ou para uso no monitoramento ambiental, monitoramento de características nas plantas de cultivo no campo ou monitoramento de produtos derivados de uma colheita de planta de cultivo, bem como para uso em garantir conformidade das partes sujeitas a termos regu-latórios ou contratuais. É possível detectar a presença de um evento transgênico através de qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido na técnica incluindo, mas não limitado à reação em cadeia da polimerase (PCR) ou à hibridização de DNA utilizando sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção geralmente se concentram nos elementos genéticos frequentemente utilizados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores etc., porque para muitas constructos de DNA, a região codifícadora é inter-cambiável. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para a discriminação entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos utilizando O mesmo constructo de DNA ou constructos muito similares a não ser que a sequência de DNA do DNA flanqueador adjacente ao DNA heteró-logo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR específico a um evento é descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos da América 2006/0070139 para o evento de milho DAS-59122-7. Seria desejável ter um método simples e discriminador para a identificação do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
As modalidades da presente invenção referem-se a um método para a detecção de um novo evento de transformação de algodão transgêni-co resistente a insetos e tolerante a herbicidas, denominado como o evento de algodão pDAB4468.19.10.3, que compreende aad-12 e pat que são descritos aqui, inseridos dentro de um sítio específico dentro do genoma de uma célula de algodão. A semente de algodão representativa foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Ma-nassas, VA, 20110. O depósito, denominado como o Depósito na ATCC No. PTA-12457, foi feito em nome da Dow AgroSciences LLC em 23 de janeiro de 2012. Este depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste em relação aos depósitos de sementes para as finalidades de procedimento de patente. O DNA de plantas de algodão contendo este evento inclui as sequências de junção/fianqueamento descritas aqui que caracterizam a localização do DNA inserido dentro do genoma do algodão. A SEQ ID NO:1 e a SEQ ID NO:2 são diagnosticas para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Mais particularmente, as sequências que circundam as junções nos pb 1354/1355 da SEQ ID NO:1 e pb 168/169 da SEQ ID NO:2 são diagnosticas para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os parágrafos a seguir descrevem exemplos de sequências que compreendem estas junções que são características do DNA de plantas de algodão que contêm o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.
Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 em uma amostra que compre- ende o DNA do algodão, o dito método compreendendo: (a) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro de pb 1-1354 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos pb 1355-1672 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma; e (b) a avaliação em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores; ou, (c) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos pb 1-168 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro de pb 169-2898 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma; e (d) a avaliação em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
Em outra modalidade, a invenção fornece um método de detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 que compreende: (a) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora selecionada do grupo que consiste em pb 1-1354 da SEQ ID NO:1 e pb 169-2898 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas; e um segundo iniciador que se liga seletivamente a SEQ ID NO:14 ou o complemento da mesma; (b) submeter a dita amostra à reação em cadeia da polimerase; e (c) a avaliação em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma molécula de DNA isolada que é diagnosticada para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Tais moléculas incluem, em adição às SEQ ID NOS: 1 e 2, moléculas de pelo menos 50 pb de comprimento que compreendem uma sequência de poli-nucleotídeo que abrange a junção dos pb 1354/1355 da SEQ ID NO:1 e mo- léculas de pelo menos 50 pb de comprimento que compreendem uma sequência de polinucleotídeo que abrange a junção dos pb 168/169 da SEQ ID NO:2. Os exemplos são pb 1329-1380 da SEQ ID NO:1; pb 1304-1405 da SEQ ID NO:1; pb 1254-1455 da SEQ ID NO:1; pb 1154-1555 da SEQ ID NO:1; pb 1054-1655 da SEQ ID NO:1; pb 143-194 da SEQ ID NO:2; pb 118-219 da SEQ ID NO:2; pb 68-269 da SEQ ID NO:2; e pb 1-369 da SEQ ID NO:2 e complementos das mesmas.
Adicionalmente, as modalidades da invenção fornecem ensaios para a detecção da presença do evento de objetivo em uma amostra (de algodão, por exemplo). Os ensaios podem ser baseados na sequência de DNA do constructo recombinante, inserida dentro do genoma de algodão e nas sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. São também fornecidos kits e condições úteis na condução dos ensaios.
As modalidades da invenção referem-se em parte à clonagem e à análise das sequências de DNA das regiões de borda resultantes da inserção do T-DNA de pDAB4468 em linhagens de algodão transgênicas. Estas sequências são únicas. Com base nas sequências de inserto e de junção, os iniciadores específicos ao evento podem ser e foram gerados. A análise de PCR demonstrou que estes eventos podem ser identificados através da análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Assim, estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar exclusivamente linhagens de algodão que compreendem o evento da presente divulgação.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS A SEQ ID NO:1 é a sequência de borda flanqueadora do DNA a 5’ para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os nucleotídeos 1-1354 são a sequência genômica. Os nucleotídeos 1355-1672 são a sequência de inserto. A SEQ ID NO:2 é a sequência de borda flanqueadora do DNA a 3’ para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Os nucleotídeos 1-168 são a sequência de inserto. Os nucleotídeos 169-2898 são a sequência genômica A SEQ ID NO:3 é um fragmento de DNA de 77 pb que é diagnóstico da junção de integração a 5’ do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A SEQ ID NO:4 é um fragmento de DNA de 90 pb que é diagnóstico da junção de integração a 3' do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A SEQ ID NO:5 é um iniciador de oligonucleotideo, ES_1910_5_F, que foi utilizado para o ensaio TaqMan® para detectar a borda a 5’ do evento de algodão 9582.814.19.1. A SEQ ID NO:6 é um iniciador de oligonucleotideo, ES_1910_5_R, que foi utilizado para o ensaio TaqMan® para detectar a borda a 5’ do evento de algodão 9582.814.19.1. A SEQ ID NO:7 é uma sonda de oligonucleotideo, ES_1910_5Pr, que foi utilizada para o ensaio TaqMan® para detectar a borda a 5’ do evento de algodão 9582.814.19.1. Esta sonda tinha uma porção fluorescente VIC adicionada na extremidade a 5’ e um agente de extinção MGB adicionado na extremidade a 3’. A SEQ ID NO:8 é um iniciador de oligonucleotideo, ES1910 3 F, que foi utilizado para o ensaio TaqMan ® para detectar a borda a 3’ do evento de algodão 9582.814.19.1. A SEQ ID NO:9 é um iniciador de oligonucleotideo, ES_1910 3_R, que foi utilizado para o ensaio TaqMan® para detectar a borda a 3’ do evento de algodão 9582.814.19.1. A SEQ ID NO:10 é uma sonda de oligonucleotideo, ES_1910_3Pr, que foi utilizada para o ensaio TaqMan® para detectar a borda a 5’ do evento de algodão 9582.814.19.1. Esta sonda tinha uma porção fluorescente VIC adicionada na extremidade a 5’ e um agente de extinção MGB adicionado na extremidade a 3’. A SEQ ID NO: 11 é um iniciador de oligonucleotideo, !C_Sah7F, que foi utilizado para o ensaio TaqMan® para detectar o gene de referência endógeno, Sah7 (GenBank: AY117065.1).
A SEQ ID NO: 12 é um iniciador de oligonucleotideo, IC_Sah7R ,que foi utilizado para o ensaio TaqMan® para detectar o gene de referência endógeno, Sah7 (GenBank: AY117065.1). A SEQ ID NO:13 é uma sonda de oligonucleotídeo, IC_Sah7_Pr, que foi utilizada para o ensaio TaqMan® para detectar o gene de referência endógeno, Sah7 (GenBank: AY117065.1). Esta sonda tinha uma porção fluorescente Cy5 adicionada na extremidade a 5’ e um agente de extinção BHQ2 adicionado na extremidade a 3’. A SEQ ID NO:14 é a sequência de DNA do filamento T de pDAB4468.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um mapa plasmideal de pDAB4468 que contém o cassete de expressão de aad-12 e pat. A FIG. 2 representa as localizações do iniciador e da sonda para o ensaio TaqMan® do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.
MODO(S) PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
Ambas as extremidades do inserto do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foram sequenciadas e caracterizadas. Foram desenvolvidos ensaios específicos ao evento. O evento também foi mapeado sobre o genoma do algodão (cromossomo 3 do subgenoma A). O evento pode sofrer introgressão em linhagens de elite adicionais.
Como insinuado anteriormente na seção de Fundamentos, a introdução e a integração de um transgene dentro do genoma de uma planta envolvem alguns eventos aleatórios (assim, o nome “evento” para certa inserção que é expressa). Ou seja, com muitas técnicas de transformação tais como a transformação com Agrobacterium, a transformação biolistica (isto é, pistola gênica) e a transformação mediada por carbureto de silício (isto é, WHISKERS), é imprevisível onde no genoma um transgene ficará inserido. Assim, a identificação do DNA genômico de planta flanqueador em ambos os lados do inserto pode ser importante para a identificação de uma planta que possui certo evento de inserção. Por exemplo, podem ser planejados iniciadores da PCR que geram um amplicon de PCR ao longo da região de junção do inserto e o genoma do hospedeiro. Este amplicon de PCR pode ser utilizado para identificar um tipo único ou distinto de evento de inserção. São fornecidos aqui definições e exemplos para ajudar a descrever as modalidades da presente invenção e para guiar os versados co muns na técnica na prática de tais modalidades. A não ser que seja observado de outra maneira, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados comuns na técnica relevante. É utilizada a nomenclatura para as bases de DNA que é apresentada em 37 CFR §1.822.
Como utilizado aqui, o termo “progênie” significa a prole de qualquer geração de uma planta parental que compreende o evento de algodão pDAB4468.19.10.3.
Um “evento” transgênico é produzido através da transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, umo constructo de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene dentro do genoma da planta e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção dentro de uma localização de genoma particular. O termo “evento” refere-se ao transformante original e à progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo “evento” refere-se ainda à progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que incluí o DNA genômico/do transgene. Mesmo após retrocruzamento repetido com um parental recorrente, o DNA do transgene inserido e o DNA genômico flanquea-dor (DNA genômico/do transgene) do parental transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo “evento” refere-se ainda ao DNA do transformante original e da progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e a sequência genômíca flanquea-dora imediatamente adjacente ao DNA inserido, que seriam esperados como sendo transferidos para uma progênie que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progênie resultante de autocruzamento) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.
Uma “sequência de junção” ou “sequência de borda” abrange o ponto em que o DNA inserido dentro do genoma está ligado ao DNA do ge-noma nativo do algodão que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou a detecção de urna ou das outras sequências de junção no material genético de uma planta sendo suficiente para ser diagnóstico do evento. São incluídas as sequências de DNA que abrangem as inserções nos eventos de algodão descritos aqui e comprimentos similares do DNA flanqueador. Os exemplos específicos de tais sequências de diagnóstico são fornecidos aqui; entretanto, outras sequências que se sobrepõem às junções das inserções ou às junções das inserções e a sequência genômica, também são diagnosticas e poderíam ser utilizadas de acordo com as modalidades da invenção da presente divulgação.
As modalidades da invenção referem-se em parte à identificação de eventos utilizando tais sequências flanqueadoras, de junção e de inserto. Os iniciadores e os amplicons da PCR relacionados são incluídos nas modalidades da invenção. De acordo com as modalidades da presente invenção, métodos de análise da PCR utilizando amplicons que se dispõem ao longo do DNA inserido e suas bordas podem ser utilizados para detectar ou para identificar variedades ou linhagens de algodão transgênicas comercializadas derivadas das linhagens de algodão transgênicas de objetivo de propriedade.
As sequências flanqueadoras/de junção são diagnosticas em relação ao evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Com base nestas sequências, foram gerados iniciadores específicos ao evento. A análise de PCR demonstrou que estas linhagens de algodão podem ser identificadas em ge-nótipos de algodão diferentes através da análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Assim, estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar de forma única estas linhagens de algodão. As sequências identificadas aqui são únicas.
As técnicas de detecção das modalidades da presente invenção são especialmente úteis em associação com o cruzamento de plantas, para determinar quais plantas da progênie compreendem certo evento, após uma planta parental que compreende um evento de interesse ser cruzada com outra linhagem de planta em um esforço de conferir uma ou mais características adicionais de interesse na progênie. Estes métodos de análise de PCR beneficiam os programas de cruzamento de algodão bem como o controle de qualidade, especialmente para sementes de algodão transgênicas comercializadas. Os kits de detecção pela PCR para estas linhagens de algodão transgênicas podem também ser agora produzidos e utilizados. Isto também é benéfico para o registro do produto e para gestão do produto.
Além disso, sequências flanqueadoras do algodão/genómicas podem ser utilizadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserto. Esta informação também pode ser utilizada para produzir sistemas de marcação molecular específicos para cada evento. Estas podem ser utilizadas para estratégias de cruzamento aceleradas e para estabelecer dados de ligação.
Ainda adicionalmente, a informação da sequência flanqueadora pode ser utilizada para estudar e caracterizar métodos de integração do transgene, características de sítio de integração genômica, classificação do evento, estabilidade dos transgenes e suas sequências flanqueadoras e expressão gênica (especialmente relacionados com o silenciamento gênico, padrões de metilação do transgene, efeitos de posição e elementos relacionados com a expressão potenciais tais como MARS [regiões de ligação à matriz] e similares).
Em relação à toda a presente divulgação, deve ser evidente que as modalidades da presente invenção incluem sementes disponíveis sob o No. de Depósito da ATCC identificado no parágrafo [0005]. As modalidades da invenção incluem ainda uma planta de algodão tolerante a herbicidas crescida partindo de uma semente depositada com o No. de Depósito da ATCC identificado no parágrafo [0005]. As modalidades da invenção incluem ainda partes da dita planta, tais como folhas, amostras de tecido, sementes produzidas pela dita planta, pólen e similares (em que estas partes da planta compreendem aad-12 e pat e SEQ ID NOS: 1 e 2).
Como utilizado aqui, o termo “algodão” significa Gossypium hir- sutum e inclui todas as variedades do mesmo que podem ser cruzadas com uma planta de algodão. a. As moléculas de DNA das modalidades da invenção podem ser utilizadas como marcadores moleculares em um método de cruzamento auxiliado por marcador (MAB). As moléculas de DNA das modalidades da invenção podem ser utilizadas nos métodos (tais como, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs e SSRs) que identificam características agronomicamente úteis ligadas geneticamente, como é conhecido na técnica. As características de tolerância a herbicidas podem ser rastrea-das na progênie de um cruzamento com uma planta de algodão das modalidades da presente invenção (ou progênie da mesma e qualquer outro cultivar ou variedade de algodão) utilizando os métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadores para esta característica e os métodos de MAB que são conhecidos na técnica podem ser utilizados para rastrear a(s) característica^) de tolerância a herbicida(s) em plantas de algodão em que pelo menos uma linhagem de algodão das modalidades da presente invenção ou progênie da mesma, era um parental ou um ancestral. Os métodos das modalidades da invenção podem ser utilizados para identificar qualquer variedade de algodão que possui o evento de objetivo.
Como utilizado aqui, uma “linhagem” é um grupo de plantas que exibe pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos em relação a pelo menos uma característica. Tais linhagens podem ser criadas através de várias gerações de autopolinização e seleção ou propagação vegetativa partindo de um único parental utilizando técnicas de cultura de tecidos ou de células.
Como utilizado aqui, os termos “cultivar” e “variedade” são sinônimos e referem-se a uma linhagem que é utilizada para produção comercial. “Estabilidade” ou “estável” significa que em relação a certo componente, o componente é mantido de geração para geração e, preferencialmente, pelo menos três gerações. “Utilidade comercial” é definida como possuindo bom vigor da planta e alta fertilidade, de forma que a planta de cultivo possa ser produzida por fazendeiros utilizando equipamento agrícola convencional e o óleo com os componentes descritos possa ser extraído da semente utilizando tritura-ção e equipamento de extração convencionais. “Elite agronômica” significa que uma linhagem possui características agronômicas desejáveis tais como rendimento, maturidade, resistência a doenças e similares, em adição à tolerância a herbicidas devido ao(s) e-vento(s) de objetivo. Qualquer uma ou todas estas características agronômicas e pontos de dados podem ser utilizados para identificar tais plantas, na forma de um ponto ou em qualquer uma das extremidades ou em ambas as extremidades de uma faixa de características utilizadas para definir tais plantas.
Como um versado na técnica irá reconhecer em consideração desta divulgação, modalidades preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados para e/ou que compreendem “sequências de junção” ou “sequências de transição” (onde a sequência flanqueadora genômica do algodão encontra a sequência de inser-to). Por exemplo, isto inclui sondas de polinucleotídeo, iniciadores e/ou am-plicons planejados para identificar uma ou ambas as sequências de junção (onde o inserto encontra a sequência flanqueadora). Um planejamento comum é ter um iniciador que se hibridiza na região flanqueadora e um inicia-dor que se hibridiza no inserto. Tais iniciadores possuem frequentemente cada um aproximadamente pelo menos ~15 resíduos de comprimento. Com esta disposição, os iniciadores podem ser utilizados para gerar/amplificar um amplicon detectável que indica a presença de um evento de uma modalidade da presente invenção. Estes iniciadores podem ser utilizados para gerar um amplicon que abrange (e inclui) uma sequência de junção como indicado anteriormente. O “touching down” do(s) iniciador(es) na sequência flanqueadora é tipicamente não planejado para se hibridizar além de aproximadamente 1200 bases ou isso além da junção. Assim, os iniciadores flanqueadores típicos seriam planejados para compreender pelo menos 15 resíduos de ca- da filamento dentro de 1200 bases dentro das sequências flanqueadoras desde o início do inserto. Isto é, iniciadores que compreendem uma sequência de um tamanho apropriado desde (ou que se hibridizam com) os pares de bases 154-1672 da SEQ ID NO:1 e/ou pares de bases 1-1369 da SEQ ID NO:2 estão dentro do âmbito das modalidades da presente invenção. Os iniciadores do inserto podem similarmente ser planejados em qualquer local do inserto, mas os pares de bases 1-6387 da SEQ ID NO:14, podem ser utilizados, por exemplo, de forma não exclusiva para o planejamento do ini-ciador.
Um versado na técnica também irá reconhecer que iniciadores e sondas podem ser planejados para se hibridizar, sob uma faixa de condições padronizadas de hibridização e/ou de PCR em que o iniciador ou a sonda não é perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Ou seja, algum grau de pareamento errado ou degeneração pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois ou mais nucleotídeos não precisam se ligar com o filamento o-posto se a base com pareamento errado for interna ou na extremidade do iniciador que é oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Análogos de nucleotídeos sintéticos, tal como inosina, também podem ser utilizados em sondas. Sondas de ácido nucleico peptídico (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, também podem ser utilizadas. O importante é que tais sondas e iniciadores sejam diagnósticos em relação (capazes de identificar e distinguir de forma única) à presença de um evento de uma modalidade da presente invenção.
Deve ser notado que podem ocorrer erros na amplificação pela PCR que poderíam resultar em erros menores no sequenciamento, por e-xemplo. Isto é, a não ser que seja indicado de outra maneira, as sequências listadas aqui foram determinadas através da produção de ampíicons longos partindo dos DNAs genômicos do algodão e então da clonagem e do sequenciamento dos ampíicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e discrepâncias sem valor nas sequências geradas e determinadas desta maneira, dado que muitas rodadas de amplificação que são necessárias para gerar amplicon suficiente para o sequenciamento partindo dos DNAs genô-micos. Um versado na técnica deve reconhecer e ser avisado que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros de sequenciamento ou discrepâncias comuns estão dentro do âmbito das modalidades da presente invenção.
Deve ser também observado que não é incomum que alguma sequência genômica seja deletada, por exemplo, quando uma sequência é inserida durante a criação de um evento. Assim, algumas diferenças também podem aparecer entre as sequências flanqueadoras e sequências genômi-cas de objetivo listadas no GENBANK, por exemplo.
Os componentes da sequência de “inserto” de DNA são ilustrados nas Figuras e são discutidos em maiores detalhes a seguir nos Exemplos. As sequências de DNA de polinucleotídeo destes componentes ou fragmentos das mesmas, podem ser utilizadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos das modalidades da invenção.
Em algumas modalidades da invenção, composições e métodos são fornecidos para a detecção da presença da região de inserção de trans-gene/genômica, em plantas e sementes e similares, de uma planta de algodão. São fornecidas sequências de DNA que compreendem a sequência de junção da região de inserção de transgene/genômica a 5’ de objetivo fornecida aqui (entre os pares de bases 1354/1355 da SEQ ID NO:1), segmentos das mesmas e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos das mesmas. São fornecidas sequências de DNA que compreendem are provided that comprise a sequência de junção da região de inserção de transgene/genômica a 3’ de objetivo fornecida aqui (entre os pares de bases 168/169 da SEQ ID NO:2), segmentos das mesmas e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos das mesmas. A sequêcia de junção da região de inserção abrange a junção entre o DNA heterólogo inserido dentro do genoma e o DNA da célula de algodão que flanqueia o sítio de inserção. Tais sequências podem ser diagnosticas para certo evento.
Com base nas sequências de inserto e de borda, podem ser ge- rados iniciadores específicos ao evento. A análise de PCR demonstrou que as linhagens de algodão das modalidades da presente invenção podem ser identificadas em genótipos diferentes do algodão através da análise dos am-plicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos ao evento. Estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para identificar exclusivamente estas linhagens de algodão. Assim, amplicons de PCR derivados de tais pares de iniciadores são únicos e podem ser utilizados para identificar estas linhagens de algodão.
Em algumas modalidades, as sequências de DNA que compreendem um fragmento contíguo da nova região de inserção do transgê-ne/genômica são um aspecto das modalidades desta invenção. São incluídas sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência de inserto do transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência genômica de algodão de uma ou mais das três plantas de algodão e/ou sequências mencionadas anteriormente que são úteis como sequências iniciadoras para a produção de um produto de amplicon diagnóstico para uma ou mais destas plantas de algodão.
Modalidades relacionadas referem-se a sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos contíguos de uma porção de transgene de uma sequência de DNA identificada aqui (tal como a SEQ ID NO:1 e segmentos da mesma) ou complementos da mesma e um comprimento similar da sequência de DNA flanqueadora do algodão destas sequências ou complementos das mesmas. Tais sequências são úteis como iniciadores de DNA nos métodos de amplificação do DNA. Os amplicons produzidos utilizando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer um dos eventos de algodão referidos aqui. Portanto, as modalidades da invenção incluem ainda os amplicons produzidos portais iniciadores de DNA.
As modalidades desta invenção incluem ainda métodos de detecção da presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de algodão referido aqui. Tais métodos podem compreender: (a) o contato da amostra que compreende DNA com um conjunto de iniciadores que, quando utilizado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com o DNA de pelo menos um destes eventos de algodão, produz um amplicon que é diagnóstico para o(s) dito(s) evento(s); (b) a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo assim o amplicon; e (c) a detecção do amplicon.
Os métodos de detecção adicionais das modalidades da presente invenção incluem um método de detecção da presença de um DNA, em uma amostra, correspondendo ao dito evento, em que o dito método compreende: (a) o contato da amostra que compreende DNA com uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização estringentes com o DNA do dito evento de algodão e que não se hibridiza sob as condições de hibridização estringentes com uma planta de algodão de controle (DNA sem ser do evento de interesse); (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização estringentes; e (c) a detecção da hibridização da sonda com o DNA.
Os kits de detecção do DNA podem ser desenvolvidos utilizando as composições divulgadas aqui e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para identificação do DNA evento de algodão de objetivo em uma amostra e podem ser aplicados aos métodos para cruzamento de plantas de algodão que contêm este DNA. Os kits contêm sequências de DNA complementares aos amplicons, por exemplo, divulgados aqui ou às sequências de DNA complementares ao DNA contido nos elementos genéticos do transgene dos eventos de objetivo. Estas sequências de DNA podem ser utilizadas nas reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits também podem conter reagentes e materiais necessários para realizar o método de detecção.
Uma “sonda” é uma molécula de ácido nucleico isolada à qual é ligada uma marcação detectável convencional ou uma molécula repórter (tal como um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimioluminescente ou uma enzima). Tal sonda pode se hibridizar com um filamento de um ácido nucleico alvo, no caso das modalidades da invenção, com um filamento de DNA genômico de um dos ditos eventos de algodão, seja de uma planta de algodão ou de uma amostra que inclui DNA do evente. As sondas de acordo com as modalidades da invenção incluem não somente ácidos desoxirribo-nucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser utilizadas para detectar a presença de tal sequência de DNA alvo. “Iniciadores” são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são anelados a um filamento de DNA alvo complementar através da hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, então estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma po-limerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Pares de iniciadores das modalidades da presente invenção referem-se ao uso para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, através da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.
As sondas e os iniciadores possuem geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 ou 1000 ou 2000 ou 5000 polinucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores se hibridizam especificamente com uma sequência alvo sob condições de hibridização estringentes. Preferencialmente, as sondas e os iniciadores de acordo com as modalidades da presente invenção possuem similaridade completa de sequência com a sequência alvo, embora sondas que diferem da sequência alvo e que mantêm a capacidade de se hibridizar com as sequências alvos possam ser planejadas a-través de métodos convencionais.
Os métodos para a preparação e para a utilização de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Os pares de iniciadores da PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, através da utilização de programas de computador pretendidos para tal finalidade.
Os iniciadores e as sondas baseados no DNA flanqueador e nas sequências de inserto divulgadas aqui podem ser utilizados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências divulgadas através de métodos convencionais, por exemplo, através da reclonagem e do sequenciamento de tais sequências.
As sondas e os iniciadores de ácido nucleico das modalidades da presente invenção se hibridizam sob condições estringentes com uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico convencional pode ser utilizado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Como utilizado aqui, é dito que duas moléculas de ácido nucleico são capazes de se hibridizar especificamente uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de filamento duplo antiparalela. É dito que uma molécula de ácido nucleico é o “complemento” de outra molécula de ácido nucleico se estas exibirem complementaridade completa. Como utilizado aqui, é dito que as moléculas exibem “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. As moléculas que exibem complementaridade completa irão geralmente se hibridizar com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas com a outra sob condições de “alta estringência” convencionais. As condições de alta estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989. É dito que duas moléculas exibem “complementaridade mínima” se estas puderem se hibridizar com a outra com estabilidade suficiente para permitir que estas permaneçam aneladas com a outra sob pelo menos condições de “baixa estringência” convencionais. As condições de baixa estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989. Com a finalidade de uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou uma sonda esta precisa exibir apenas complementaridade mínima na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações de solvente e de sais particulares empregadas. O termo “condição estringente” ou “condições de estringência” é funcionalmente definido em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico com um ácido nucleico alvo (isto é, com uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento de hibridização específica discutido em Sambrook e outros, 1989, em 9.52-9.55. Ver também, Sambrook e outros, 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-9.58.
Dependendo da aplicação imaginada, podem ser utilizadas condições variáveis de condições estringentes ou degeneração de sequência de polinucleotídeo de uma sonda ou um inicíador para atingir graus variáveis de seletividade de hibridização em direção à sequência alvo. Para aplicações que requerem alta seletividade, poderão ser tipicamente empregadas condições relativamente estringentes para a hibridização de uma sequência de polinucleotídeo with uma segunda sequência de polinucleotídeo, por exemplo, poderão ser selecionadas condições de sais relativamente baixas e/ou de alta temperatura, tais como as fornecidas por aproximadamente 0,02 M até aproximadamente 0,15 M de NaCI a temperaturas de aproximadamente 50°C até aproximadamente 70°C. As condições estringentes, por exemplo, poderíam envolver a lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,2X SSC, 0,1% de SDS, 65°C). As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização do DNA, por exemplo, 6,0X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas por uma lavagem de 2,0X SSC a 50°C são conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de aproximadamente 2,0X SSC a 50°C até uma alta estringência de aproximadamente 0,2X SSC a 50°C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, até condições de alta estringência a a-proximadamente 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada. Tais condições seletivas toleram pouco, se algum, pareamento errado entre a sonda e o molde ou o filamento alvo. A detecção de sequências de DNA através da hibridização é bem conhecida pelos versados na técnica e os ensinamentos das Patentes U.S. N— 4.965.188 e 5.176.995 são exemplos dos métodos de análises de hibridização.
Um ácido nucleico de uma modalidade da presente invenção se hibridizará especificamente com um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou sugeridos aqui, incluindo complementos e fragmentos dos mesmos, sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marca-dora de uma modalidade da presente invenção possui a sequência de ácido nucleico que é apresentada aqui em uma das sequências exemplificadas ou complementos e/ou fragmentos das mesmas.
Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula marca-dora de ácido nucleico de uma modalidade da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácido nucleico. Em um aspecto adicional de uma modalidade da presente invenção, uma molécula marcadora de ácido nucleico da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser utilizadas como marcadores em métodos de cruzamento de plantas para identificar a progênie de cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda com a molécula de DNA alvo pode ser detectada através de qualquer número de métodos conhecidos pelos versados na técnica, estes podem incluir, mas não estão limitados a marcações fluorescentes, marcações radioativas, marcações à base de anticorpos e marcações quimioluminescentes.
Em relação à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, através de PCR) utilizando um par de iniciadores de amplificação particular, "condições estringentes” são condições que permitem que o par de iniciadores se hibridize apenas com a sequência de ácido nucleico alvo à qual um iniciador que possui a sequência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e preferencialmente produziría um único produto de amplificação, o amplicon. O termo “específico para (uma sequência alvo)” indica que uma sonda ou um iniciador se hibridiza sob condições de hibridização estringen-tes apenas à sequência alvo em uma amostra que compreende a sequência alvo.
Como utilizado aqui, “DNA amplificado” ou “amplicon” refere-se ao produto da amplificação de ácido nucleico de uma sequência alvo de ácido nucleico que faz parte de um molde de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém o DNA genômico do evento transgênico da planta de algodão de uma modalidade da presente invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido da planta de algodão pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico utilizando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da sequência flanqueadora no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido e um segundo iniciador derived do DNA he-terólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico em relação à presença do DNA do evento. O amplicon tem um comprimento e possui uma sequência que é também diagnostica para o evento. O amplicon pode variar de comprimento desde o comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeo e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciadores mais aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109. 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 ou mais pares de bases de nucleo-tídeos (mais ou menos qualquer um dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência flanque-adora em ambos os lados do DNA inserido de forma a produzir um amplicon que inclui a sequência de nucíeotideos do inserto inteiro. Um membro de um par de iniciadores derivado da sequência genômica da planta pode estar localizado uma distância da sequência de DNA inserida. Esta distância pode variar de um par de bases de nucíeotideos até aproximadamente vinte mil pares de bases de nucíeotideos. O uso do termo “amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA. A amplificação de ácidos nucleicos pode ser realizada através de qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico co- nhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, inter alia, na Patente U.S. Ne 4.683.195 e na Patente U.S. N-4.683.202. Os métodos de amplificação pela PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser utilizados na prática de modalidades da presente invenção. A sequência do inserto de DNA de transgene heterólogo ou a sequência flanqueadora genõmica de um evento de algodão de objetivo pode ser verificada (e corrigida, se necessário) através da amplificação de tais sequências do evento utilizando iniciado-res derivados das sequências fornecidas aqui seguida pelo sequencíamento de DNA padronizado do amplicon da PCR ou do DNA clonado. O amplicon produzido através destes métodos pode ser detectado através de um grande número de técnicas. A eletroforese em gel de aga-rose e a coloração com brometo de etídeo é um método bem conhecido comum de detecção de amplicons de DNA. Outro tal método é Genetic Bit A-nalysis em que é planejado um oligonucleotídeo de DNA que se sobrepõe tanto à sequência flanqueadora genõmica de DNA adjacente quanto à sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de micropoços. Após a PCR da região de interesse (utilizando um iniciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora genõmica adjacente), um produto de PCR de filamento simples pode ser hibridizado com o oligonucleotídeo imobilizado e servir como um molde para a reação de extensão de uma única base utilizando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a base seguinte esperada. A análise de um produto ligado pode ser completada através da quantificação da quantidade de sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto/flanqueadora devido à amplificação, à hibridização e à extensão de uma única base bem sucedidas.
Outro método é a técnica de Pirossequenciamento que é descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método é plan-jeado um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e à junção de DNA do inserto. O oligonucleotídeo é planejado para se hibridizar com o produto de PCR de filamento simples da região de interesse (um ini-ciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora genômica) e incubado na presença de um DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfossulfato e luciferina. Os DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência do inserto do trans-gene/flanqueadora devido à amplificação, à hibridização ou à extensão de um ou de várias bases bem sucedida. A Polarização por Fluorescência é outro método que pode ser u-tilizado para detectar um amplicon de uma modalidade da presente invenção. Após este método, é planejado um oligonucleotídeo que se sobrepõe à junção de DNA flanqueadora genômica e inserida. O oligonucleotídeo é hi-brídizado com o produto de PCR de filamento simples da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência flanqueadora genômica de DNA) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de uma única base resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação do ddNTP marcado de forma fluorescente pode ser medida como uma alteração na polarização utilizando um fluorôme-tro. Uma alteração na polarização indica a presença da sequência do inserto do transgene/flanqueadora devido à amplificação, à hibridização e à extensão de uma única base bem sucedidas.
TaqMan® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método de detecção e de quantificação da presença de uma sequência de DNA. Sucintamente, é planejada uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe ao DNA genômico que flanqueia e à junção do DNA de inserto. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência flanqueadora genômica) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Durante a amplificação específica, o mecanismo de correção da Taq DNA polimerase libera a porção fluorescente da porção de extinção sobre a sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência flanqueadora/do transge- ne de inserto devido à amplificação e à hibridização bem sucedidas.
Beacons Moleculares foram descritos para uso na detecção de sequências de polinucleotídeos. Sucintamente, é planejada uma sonda de oligonucleotídeo de FRET que se sobrepõe ao DNA genômico flanqueador e à junção do DNA de inserto. A estrutura única da sonda FRET resulta nesta contendo uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em grande proximidade; A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência flanquea-dora genômica) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação de PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET com a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Isto resulta em um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica flanqueadora/de inserto do trans-gene devido à amplificação e à hibridização bem sucedidas.
Tendo divulgado uma localização no genoma do algodão que é excelente para uma inserção, as modalidades da presente invenção compreendem ainda uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão que compreende pelo menos um inserto sem ser do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 na vizinhança geral desta localização genômica. Uma opção é substituir um inserto diferente no lugar de um do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 exemplificado aqui. Em geral, a recombianção homóloga direcionada, por exemplo, é empregada em modalidades particulares. Este tipo de tecnologia é o objetivo, por exemplo, da WO 03/080809 A2 e do pedido de patente U.S. publicado correspondente (US 20030232410). Assim, as modalidades da presente invenção incluem plantas e células vegetais que compreendem um inserto heterólogo (no lugar de ou com várias cópias dos genes aad-12 ou pat), flanqueado por todas ou uma parte que pode ser reconhecida das sequências flanqueadoras identificadas aqui (pb 1-1354 da SEQ ID NO:1 e pb 169-2898 da SEQ ID NO:2). Uma cópia adicional (ou cópias adicionais) de um gene aad-12 ou pat poderíam também ser direcionadas para inserção nesta(s) maneira(s).
Os exemplos a seguir são incluídos para ilustrar procedimentos para a prática das modalidades da invenção e para demonstar certas modalidades preferidas da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes. Deve ser considerado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam abordagens específicas utilizadas para ilustar modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados na técnica devem, em consideração à presente divulgação, considerar que muitas alterações podem ser feitas nestas modalidades específicas enquanto ainda são obtidos resultados iguais ou similares sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. A não ser que seja indicado de outra maneira, todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são em volume a não ser que seja observado de outra maneira.
As abreviações a seguir são utilizadas a não ser que seja indicado de outra maneira, pb par de bases °C graus Celsius DNA ácido desoxirribonucleico EDTA ácido etilenodiaminotetraacético kb quilobase pg micrograma pL microlitro mL mililitro M massa molar PCR reação em cadeia da polimerase PTU unidade de transcrição da planta ou cassete de expressão SDS dodecil sulfato de sódio SSC uma solução tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7,0 TBE uma solução tampão contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA, pH 8,3 EXEMPLOS
Exemplo 1: Ensaio de TaqMan ® Específico ao Evento Os ensaios de TaqMan ® foram desenvolvidos para detectar a presença de plantas com o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 nas populações de cruzamento. O evento de algodão pDAB4468.19.10.3 contém o filamento T do vetor binário pDAB4468 (FIG. 1). Para a detecção específica do evento de algodão pDAB4468.19.10.3, dois conjuntos de iniciadores e sondas de TaqMan® foram planejados de acordo com as sequências de DNA localizadas na junção de inserto com a planta a 5’ (SEQ ID NO:1) ou a 3’ (SEQ ID NO:2) (FIG. 2). Um dos ensaios específicos ao evento para o e-vento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi planejado para detectar especifica-mente um fragmento de DNA de 77 pb (SEQ ID NO:3) que abrange a junção de integração a 5’ utilizando dois iniciadores e uma sonda MGB específica ao alvo sintetizadas pela Applied Biosystems (ABI) contendo o repórter VIC em sua extremidade a 5’. Um ensaio específico para um segundo evento para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi planejado para se direcionar especificamente a um fragmento de DNA de 90 pb (SEQ ID NO:4) que abrange a junção de integração a 3’ utilizando dois iniciadores específicos e uma sonda MGB específica ao alvo sintetizada pela ABI contendo o repórter VIC em sua extremidade a 5'. A especificidade deste método de detecção com TaqMan® em relação ao evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi testada contra outros eventos de algodão AAD12 e PAT e a variedade de algodão não transgênica (Coker310). Todos os ensaios foram corridos no formato de duplex com um ensaio de TaqMan® planejado para detectar o gene de referência endógeno específico para o algodão de cópia única conhecido, Sah7 (GenBank: AY117065.1).
Exemplo 1.1: Isolamento de gDNA O DNA genômico foi extraído utilizando o Qiagen Dneasy 96 plant DNA kit™ modificado (Qiagen, Valencia, CA). Discos de cotilédones foliares do algodão fresco, 6 por amostra, foram utilizados para a extração de gDNA. O gDNA foi quantificado com o método Pico Green™ de acordo com as instruções do fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). As amostras foram diluídas em uma diluição de 1/5 com água isenta de DNase.
Exemplo 1.2: Ensaio de TaqMan ® e Resultados Os iniciadores e as sondas específicos para TaqMan® foram planejados para o ensaio de TaqMan® específico para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3. Estes reagentes foram utilizados com as condições listadas a seguir para detectar o inserto do transgene dentro do evento de algodão pDAB4468.19.10.3. A Tabela 1 lista as sequências de iniciadores e sondas que foram desenvolvidas especificamente para a detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3.
Tabela 1. Iniciadores da PCR e Sondas As condições de PCR multiplex PCR para a amplificação são como a seguir: 1X Roche PCR Buffer, 0,4 μΜ de iniciador para frente específico para o evento, 0,4 μΜ de iniciador inverso específico para o evento, 0,4 μΜ de Iniciador IC_Sah7F, 0,4 μΜ de Iniciador IC_Sah7R, 0,2 μΜ de sonda específica para o evento, 0,2 μΜ de Sonda IC_Sah7Pr, 0,1% de PVP, 2 μΙ_ de gDNA diluído 1:5 em uma reação total de 10 μΙ_. O coquetel foi amplificado utilizando as condições a seguir: i) 95°C durante 10 min., ii) 95°C durante 10 s, iii) 55°C durante 30 s, iv) repetir as etapas ii-iii durante 40 ciclos, v) espera a 40°C. A PCR em tempo real foi realizada no Roche LightCycler® 480. A análise dos dados se baseava na medida do ponto de cruzamento (valor de Cp) determinado pelo software LightCycler 480, que é o número de ciclos de PCR quando a taxa de alteração na fluorescência atinge seu máximo. O método de detecção de TaqMan® para o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 foi testado contra um evento de algodão diferente que contém as PTUs de aad12 e pat e a variedade de algodão não transgênica no formato de duplex com o gene de referência endógeno específico do algodão, IC Sah7 (GenBank: AY117065.1). Os ensaios detectavam especificamente o evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e não produziam ou amplificavam quaisquer resultados falso positivos partindo dos controles (isto é, o evento de algodão diferente e a variedade de algodão não transgênica Co-ker 310). Os iniciadores e sondas específicos para o evento podem ser utilizados para a detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 e estas condições e reagentes são aplicáveis para ensaios de zigosidade.
Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhes sem se afastar de tais princípios. Os presentes inventores reivindicam todas as modificações que estão dentro do espírito e do âmbito das reivindicações em anexo.

Claims (3)

1. Método de detecção do evento de algodão pDAB4468.19.10.3 em uma amostra que compreende DNA de algodão, o dito método compreendendo: (a) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro dos pb 1 - 1354 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos pb 1355 - 1672 da SEQ ID NO:1 ou o complemento da mesma; e a avaliação em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores; ou (b) o contato da dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro dos pb 1 - 168 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma e um segundo iniciador de pelo menos 10 pb de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro dos pb 169 — 2898 da SEQ ID NO:2 ou o complemento da mesma; e a avaliação em relação a um amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
2.
Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita amostra que compreende o DNA do algodão é obtida partindo de plantas de algodão que compreendem o evento pDAB4468.19.10.3 que foram depositadas sob o número de acesso da ATCC PTA-12457.
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