BR102012019434B1 - Métodos de controle de pestes, de insetos, molécula e sequência de dna diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1 - Google Patents
Métodos de controle de pestes, de insetos, molécula e sequência de dna diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1 Download PDFInfo
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Abstract
evento de soja resistente a inseto e tolerante a herbicida. evento de soja 9582.814.19.1 que compreende genes que codificam cry1f, cry1ac (synpro), e pat, proporcionando resistência a inseto e tolerância a herbicida para colheitas de soja contendo o evento, e capacitando métodos para proteção da colheita e proteção de produtos armazenados.
Description
[001] Os genes que codificam Cry1F e Cry1Ac synpro (Cry1Ac) são capazes de conceder resistência a inseto, por exemplo, resistência a insetos lepidopteran, para plantas transgênicas; e o gene que codifica PAT (fosfinotricin acetiltranferase) é capaz de conceder tolerância a herbicida fosfinotricin (glufosinato) à plantas transgênicas. PAT foi bem sucessivamente expressa em feijão-soja para uso, ambos como um marcador selecionável na produção de culturas transgênicas resistentes a inseto, e para conceder níveis comerciais de tolerância a herbicida glufosinato em culturas transgênicas.
[002] A expressão de genes estranhos em plantas é conhecida por ser influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez devido a estrutura de cromatina (por exemplo, heterocromatina), ou à proximidade de elementos regulatórios transcricionais (por exemplo, intensificadores) perto do local de integração (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Ao mesmo tempo, a presença do transgene em localizações diferentes no genoma influenciará o fenótipo total da planta em modos diferentes. Por esta razão, é frequentemente necessário classificar um grande número de eventos de modo a identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, foi observado em plantas, e em outros organismos, que pode existir uma ampla variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre eventos. Podem existir também diferenças nos padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de planta, que não podem corresponder aos padrões esperados de elementos regulatórios transcricionais presentes no construto de gene introduzido. Por esta razão, é comum produzir centenas a milhares de eventos diferentes, e classificar estes eventos como um evento simples que tem níveis de expressão de transgene desejados e padrões para proposta comercial. Um evento que tem níveis ou padrões desejados de expressão transgene é útil para introgressão do transgene em outros antecedentes genéticos por cruzamento externo sexual usando métodos de reprodução convencionais. A progenia de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de gene segura em um número de variedades que são bem adaptadas às condições de crescimento locais.
[003] É desejável ser capaz de detectar a presença de um evento particular de modo a determinar se progenia de um cruzamento sexual contém um transgene ou grupo de transgenes de interesse. Em adição, um método para detectar um vento particular seria proveitoso cumprir com os regulamentos que requerem a aprovação do pré-mercado e etiquetação de alimentos derivados de plantas de cultura recombinante, por exemplo, ou para uso em monitoramento ambiental, traços de monitoramento em culturas no campo, ou monitoramento de produtos derivados de uma coleta de planta, bem como para uso em assegurar cumprimento de partes objetos em termos regulatórios ou contratuais.
[004] É possível detectar a presença de um evento transgênico por qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, a reação de cadeia polimerase (PCR), ou hibridização de DNA usando sondas de ácido nucleico. Estes métodos de detecção geralmente se focalizam nos elementos genéticos frequentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., porque para muitos construtos de DNA, a região de codificação é permutável. Como um resultado, tais métodos podem não ser úteis para descriminação entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando o mesmo construto de DNA ou construtos muitos similares, a menos que a sequência de DNA do DNA de flanqueamento adjacente ao DNA heterólogo inserido seja conhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR específico de evento é descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos 2006/0070139 para evento de maize DAS-59122-7. Seria desejável ter um método simples e discriminativo para a identificação de evento de soja 9582.814.19.1.
[005] A presente invenção se refere a um novo evento de transformação de feijão-soja transgênico resistente a inseto, e com tolerância a herbicida, designado evento de soja 9582.814.19.1, compreendendo cry1F, cry1Ac e pat, conforme aqui descrito, inserido em um local específico dentro do genoma de uma célula de feijão-soja. Semente de feijão-soja representativa foi depositada com American Type Culture Collection (ATCC) com o Accession No. Identificado no parágrafo [0021]. O DNA de plantas de soja contendo este evento inclui a sequência de junção/flanqueamento, conforme aqui descrita, que caracteriza a localização do DNA inserido dentro do genoma de feijão- soja. SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 são diagnósticos para evento de soja 9582.814.19.1. Mais particularmente, as sequências que circundam as junções em 1400/1401 bp, e 1536/1537 bp de SEQ ID NO:1, e 152/153 bp de SEQ ID NO:2 são diagnósticos para evento de soja 9582.814.19.1. O parágrafo [00012] abaixo descreve exemplos de sequências compreendendo estas junções que são características de DNA de feijões-sojas contendo evento de soja 9582.814.19.1.
[006] Em uma concretização, a invenção proporciona uma planta de soja, ou parte desta, que é resistente a Pseudoplusia includens (looper de soja) e que tem um genoma compreendendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3-303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas. Em outra concretização, a invenção proporciona semente de tais plantas.
[007] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de controle de insetos que compreende expor insetos a plantas de soja resistentes a inseto, em que as plantas de soja têm um genoma que contém uma ou mais sequências selecionada a partir do grupo consistindo em 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas; que são características da presença de evento de soja 9582.814.19.1, para, desse modo, controlar os insetos . A presença dos genes cry1F v3 (cry1F) e cry1Ac synpro (cry1Ac) no evento de soja 9582.814.19.1 concede resistência à, por exemplo, Pseudoplusia includens (looper de soja), Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica e Elasmopalpus lignosellus.
[008] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de controle de ervas - daninhas em uma cultura de soja que compreende aplicar herbicida de glufosinato à cultura de soja, referida cultura de soja compreendendo plantas de soja que têm um genoma contendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas, que são diagnóstico para a presença de evento de soja 9582.814.19.1. A presença do gene pat v6 (pat) no evento de soja 9582.814.19.1 concede tolerância a herbicida de glufosinato.
[009] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de detectar evento de soja 9582.814.19.1 em uma amostra compreendendo DNA de feijão-soja DNA, referido método compreendendo:
[0010] (a) contatar referida amostra com
[0011] um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de flanqueamento dentro de 1-1400 bp de SEQ ID NO:1, ou o complemento desta, e um segundo iniciador pelo menos de 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro de 1401-1836 bp de SEQ ID NO:1, ou o complemento desta; e amplicon gerado entre referidos iniciadores; ou
[0012] (b) contatar referidas amostra com um primeiro iniciador pelo menos de 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserto dentro de 1-152 bp de SEQ ID NO:2, ou o complemento desta, e um segundo iniciador pelo menos de 10 bp de comprimento que se liga seletivamente à sequência de flanqueamento dentro de 153-1550 bp de SEQ ID NO:2 ou o complemento desta; e
[0013] (c) ensaio de um amplicon gerado entre referidos iniciadores.
[0014] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de detecção de evento de soja 9582.814.19.1 compreendendo: (a) contatar referida amostra com um primeiro iniciador que se liga seletivamente a uma sequência de flanqueamento selecionada a partir do grupo consistindo em 1-1400 bp de SEQ ID NO:1 e 153-1550 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas; e um segundo iniciador que se liga seletivamente à SEQ ID NO:3, ou o complemento desta;
[0015] (b) submeter referida amostra a reação de cadeia polimerase; e
[0016] (c) ensaiar um amplicon gerado entre referidos iniciadores.
[0017] Em outra concretização a invenção proporciona um método de gerar uma planta de soja compreendendo: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de soja para produzir uma terceira planta de soja, referida primeira planta compreendendo DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3-303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas; e ensaio de referida terceira planta de soja para presença de DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em 13851415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3-303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas.
[0018] Em outra concretização, a invenção proporciona uma molécula de DNA isolado que é diagnóstica para evento de soja 9582.814.19.1. Tais moléculas incluem, em adição a SEQ ID NOS: 1 e 2, moléculas pelo menos de 25 bp de comprimento compreendendo 1400-1401 bp de SEQ ID NO:1 e pelo menos 10 bp de SEQ ID NO:1 em cada direção a partir da junção de 1400/1401 bp ; amplicons pelo menos de 25 bp de comprimento compreendendo 152 - 153 de SEQ ID NO:2 e pelo menos 10 bp de SEQ ID NO:2 em cada direção a partir da junção de 152/153 bp. Exemplos são 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 12001600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3-303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas.
[0019] Em outra concretização, a invenção proporciona um método de controlar pestes em grão de soja, semente, ou farinha de semente que compreende incluir evento de soja 9582.814.19.1 nos referidos grãos, semente, ou farinha de semente, conforme demonstrado por referidos grão, semente, ou farinha de semente compreendendo DNA compreendendo uma ou mais sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em 1385-1415 bp de SEQ ID NO:1; 1350-1450 bp de SEQ ID NO:1; 1300-1500 bp de SEQ ID NO:1; 1200-1600 bp de SEQ ID NO:1; 137-168 bp de SEQ ID NO:2; 103-203 bp de SEQ ID NO:2; e 3-303 bp de SEQ ID NO:2, e complementos destas.
[0020] A invenção também inclui células de planta de soja e partes de planta incluindo, mas não são limitadas a, pólen, óvulo, flores, brotos, raízes e folhas, e núcleo de células vegetativas, células de pólen, semente e farinha de semente, e células de ovo, que contêm evento de soja 9582.814.19.1.
[0021] Em algumas concretizações, o evento de soja 9582.814.19.1 pode ser combinado com outros traços, incluindo, por exemplo, outro(s) gene(s) de tolerância a herbicida e/ou proteínas inibitórias de inseto e sequências regulatórias transcricionais (isto é, interferência de RNA, dsRNA, fatores de transcrição, etc). Os traços adicionais podem ser empilhados no genoma da planta, via reprodução de planta, re- transformação da planta transgênica contendo evento de soja 9582.814.19.1, ou adição de novos traços através de integração alvo, via recombinação homóloga.
[0022] Outras concretizações incluem a excisão de polisequências de nucleotídeo que compreendem evento de soja 9582.814.19.1, incluindo, por exemplo, o cassete de expressão de gene pat. Após excisão de uma polisequência de nucleotídeo, o evento modificado pode ser re-alvejado a um local cromossomal específico em que polisequências de nucleotídeo adicionais são empilhadas com evento de soja 9582.814.19.1.
[0023] Em uma concretização, a presente invenção envolve um local alvo cromossomal de feijão-soja localizado no cromossomo 02 entre as sequências de flanqueamento colocadas em SEQ ID NOS:1 e 2.
[0024] Em uma concretização, a presente invenção envolve um método de produção de uma planta transgênica de soja compreendendo inserção de um ácido nucleico heterólogo em uma posição no cromossomo 02 entre sequências genômicas colocadas em SEQ ID NOS:1 e 2, isto é, entre 1-1400 bp de SEQ ID NO:1 e 153-1550 bp de SEQ ID NO:2.
[0025] Adicionalmente, a invenção objeto proporciona ensaios para detecção da presença do evento objeto em uma amostra (de feijões- soja, por exemplo). Os ensaios podem ser baseados na sequência de DNA do construto recombinante, inseridos no genoma de feijão-soja, e nas sequências genômicas que flanqueiam o local de inserção. Kits e condições úteis na condução dos ensaios são também proporcionados.
[0026] A invenção objeto se refere, em parte, à clonagem e análise das sequências de DNA das regiões de borda resultantes da inserção de T-DNA de pDAB9582 em linhas transgênicas de feijão-soja. Estas sequências são únicas. Baseado nas junções de inserto e de sequência, iniciadores específicos de evento podem ser e foram gerados. A análise de PCR demonstrou que estes eventos podem ser identificados pela análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciador específicos de evento. Desse modo, estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar unicamente linhas de feijão-soja compreendendo o evento da invenção objeto.
[0027] Como parte desta revelação, pelo menos 2500 sementes de uma linha de feijão-soja compreendendo evento de soja 9582.814.19.1 foram depositadas com o American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. O depósito, Designação de Depósito de Patente ATCC, PTA-12006, foi recebido pelo ATCC em 21 de julho de 2011. Este depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste com relação a depósitos de semente para a proposta de procedimento de patente. Este depósito foi feito e será mantido de acordo com e sob os termos do Tratado de Budapeste com relação a depósitos de semente para a proposta de procedimento de patente.
[0028] SEQ ID NO:1 é a sequência de borda de flanqueamento de DNA 5’ para evento de soja 9582.814.19.1. Os nucleotídeos 1-1400 são sequência genômica. Os nucleotídeos 1401-1535 são uma sequência re-arranjada de pDAB9582. Os nucleotídeos 1536-1836 são sequência de inserto.
[0029] SEQ ID NO:2 é a sequência de borda de flanqueamento de DNA 3’ para evento de soja 9582.814.19.1. Os nucleotídeos 1-152 são sequência de inserto. Os nucleotídeos 153-1550 são sequência genômica.
[0030] SEQ ID NO:3 é a sequência de DNA de pDAB9582, que é anotada abaixo na Tabela 1.
[0031] SEQ ID NO:4 é iniciador de oligonucleotídeo 81419_FW3 para confirmação de DNA genômico de borda 5’.
[0032] SEQ ID NO:5 é iniciador de oligonucleotídeo 81419_RV1 para confirmação de DNA genômico de borda 3’.
[0033] SEQ ID NO:6 é iniciador de oligonucleotídeo 81419_RV2 para confirmação de DNA genômico de borda 3’.
[0034] SEQ ID NO:7 é iniciador de oligonucleotídeo 81419_RV3 para confirmação de DNA genômico de borda 3’.
[0035] SEQ ID NO:8 é iniciador de oligonucleotídeo 5’IREnd-01 para confirmação de DNA genômico de borda 5’.
[0036] SEQ ID NO:9 é iniciador de oligonucleotídeo 5’IREnd-02 para confirmação de DNA genômico de borda 5’.
[0037] SEQ ID NO:10 é iniciador de oligonucleotídeo AtUbi10RV1 para confirmação de DNA genômico de borda 5’.
[0038] SEQ ID NO:11 é iniciador de oligonucleotídeo AtUbi10RV2 para confirmação de DNA genômico de borda 5’.
[0039] SEQ ID NO:12 é iniciador de oligonucleotídeo 3’PATEnd05 para confirmação de DNA genômico de borda 3’.
[0040] SEQ ID NO:13 é iniciador de oligonucleotídeo 3’PATEnd06 para confirmação de DNA genômico de borda 3’.
[0041] SEQ ID NO:14 é a sequência confirmada de evento de soja 9582.814.19.1. Incluindo a sequência genômica de flanqueamento 5’, pDAB9582 inserto de trançado-T, e sequência genômica de flanqueamento 3’.
[0042] Figura 1 é um Mapa de plasmídeo de pDAB9582 contendo os cassetes de expressão de cry1F, cry1Ac e pat.
[0043] Figura 2 representa as localizações de iniciador para confirmação da sequência de borda 5’ e 3’ do evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[0044] Figura 3 representa o arranjo de sequência genômica no evento de soja pDAB9582.814.19.1
[0045] Ambos terminais do evento de inserção de soja 9582.814.19.1 foram sequenciados e caracterizadps. Ensaios específicos de evento foram desenvolvidos. Eles foram também mapeados no genoma de feijão-soja (cromossomo de feijão-soja 02). O evento pode ser introgredido em linhas de elite adicionais.
[0046] Conforme aludido acima na seção Antecedentes, a introdução e integração de um transgene em um genoma de planta envolvem alguns eventos aleatórios (consequentemente o nome “evento” para uma dada inserção que é expressa). Isto é, com muitas técnicas de transformação, tal como transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, canhão de gene), e transformação mediada por carbeto de silício (isto é, WHISKERS), é imprevisível onde no genoma um transgene tornar-se-á inserido. Desse modo, a identificação do flanqueamento de DNA genômico de planta em ambos os lados do inserto pode ser importante para identificação de uma planta que tem um dado evento de inserção. Por exemplo, iniciadores de PCR podem ser designados que geral um amplicon de PCR através da região de junção do inserto e o genoma de hospedeiro. Este amplicon de PCR pode ser usado para identificar um tipo único ou distinto de evento de inserção.
[0047] Definições e exemplos são proporcionados aqui para ajudar a descrever a presente invenção e para guiar aqueles técnicos no assunto a praticar a invenção. A menos que de outro modo notado, os termos são para serem compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles técnicos no assunto. A nomenclatura para bases de DNA, conforme colocada em 37 CFR §1.822, é usada.
[0048] Conforme aqui usado, o termo "progenia" denota a descendência de qualquer geração de uma planta de origem que compreende evento de soja 9582.814.19.1.
[0049] Um “evento” transgênico é produzido por transformação de células de planta com DNA heterólogo, isto é, um construto de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante a partir da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em uma localização de genoma particular. O termo “evento” se refere ao transformante original e progenia do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo “evento” também se refere à progenia produzida por um cruzamento externo sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/de transgene. Mesmo após cruzamento posterior repetido a uma origem recorrente, o DNA de transgene inserido e DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/de transgene) a partir da origem transformada está presente na progenia do cruzamento na mesma localização cromossomal. O termo “evento” também se refere ao DNA a partir do transformante original e progenia deste compreendendo o DNA inserido e sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que seria esperado ser transferido a uma progenia que recebe DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linha de origem que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progenia resultante de si própria) e uma linha de origem que não contém o DNA inserido.
[0050] Uma “sequência de junção” ou “sequência de borda” se estende do ponto em que o DNA inserido no genoma é articulado ao DNA a partir do genoma nativo de feijão-soja que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou as outras sequências de junção em um material genético de planta sendo suficiente para ser diagnóstico para o evento. Incluídas estão as sequência de DNA que se estendem das inserções em eventos de soja aqui descritos e comprimentos similares de DNA de flanqueamento. Exemplos específicos de tais sequências diagnósticas são aqui proporcionados; contudo, outras sequências que sobrepõem as junções das inserções, ou as junções das inserções e a sequência genômica, são também diagnósticas, e podem ser usadas de acordo com a invenção objeto.
[0051] A invenção objeto se refere, em parte, a identificação de evento usando tal flanqueamento, junção e sequências de inserto. Iniciadores de PCR relacionados e amplicons são incluídos na invenção. De acordo com a invenção objeto, métodos de análise de PCR usando amplicons que se estendem através do DNA inserido e suas bordas podem ser usados para detectar ou identificar variedades de feijão-soja transgênicas comercializadas ou linhas derivadas das linhas de feijão- soja transgênicas proprietárias objeto.
[0052] As sequências de flanqueamento/de junção são diagnósticas para evento de soja 9582.814.19.1. Baseado nestas sequências, iniciadores específicos de evento foram gerados. A análise de PCR demonstrou que estas linhas de feijão-soja podem ser identificadas em genótipos diferentes de feijão-soja por análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciador específicos de evento. Desse modo, estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar unicamente estas linhas de feijão-soja. As sequências aqui identificadas são únicas.
[0053] Técnicas de detecção da invenção objeto são especialmente úteis em conjunto com reprodução de planta, para determinar que plantas de progenia compreendem um dado evento, após uma planta de origem compreendendo um evento de interesse ser cruzada com outra linha de planta em um esforço de conceder um ou mais traços adicionais de interesse na progenia. Estes métodos de análise de PCR beneficiam os programas de reprodução de feijão-soja, bem como controle de qualidade, especialmente para sementes de feijão-soja trangênicas comercializadas. Kits de detecção de PCR para estas linhas transgênicas de feijão-soja podem também agora serem produzidos e usados. Isto pode também beneficiar o registro do produto e intendência do produto.
[0054] Além disso, as sequências de flanqueamento/genômica de feijão-soja podem ser usadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserto. Esta informação pode ser usada para produzir sistemas de marcador molecular específicos para cada evento. Estes podem ser usados para estratégias de reprodução acelerada e estabelecer dados de ligação.
[0055] Ainda adicionalmente, a informação da sequência de flanqueamento pode ser usada para estudar e caracterizar processos de integração de transgene, características de local de integração genômica, classificação de evento, estabilidade de transgenes e suas sequências de flanqueamento, e expressão de gene (especialmente relacionados a silenciamento de gene, padrões de metilação de transgene, efeitos de posição, e elementos relacionados a expressão potencial, tal como MARS [regiões de fixação de matriz], e similares).
[0056] À luz de todas as revelações objetos, deve ser claro que a invenção objeto inclui sementes disponíveis sob o Depósito ATCC No. Identificado no parágrafo [0021]. A invenção objeto também inclui uma planta de soja tolerante a herbicida crescida de uma semente depositada com o Depósito ATCC Deposit No. identificado no parágrafo [0021]. A invenção objeto adicionalmente inclui partes de referida planta, tais como folhas, amostras de tecido, sementes produzidas por referida planta, pólen, e similares (em que elas compreendem cry1F, cry1Ac, pat, e SEQ ID NOS: 1 e 2).
[0057] Ainda adicionalmente, a invenção objeto inclui descendente e/ou plantas de progenia de plantas crescidas a partir da semente depositada, preferivelmente uma planta de soja resistente a herbicida em que referida planta tem um genoma compreendendo a sequência de junção tipo selvagem detectável conforme aqui descrita. Conforme aqui usado, o termo “feijão-soja” significa Glycine Max, e inclui todas as variedades deste que podem ser geradas com uma planta de soja.
[0058] Esta invenção adicionalmente inclui processos de produção de cruzamentos usando uma planta da invenção objeto como pelo menos uma origem. Por exemplo, a invenção objeto inclui uma planta híbrida F1 tendo como uma ou ambas origens de qualquer das plantas aqui exemplificadas. Também dentro da invenção objeto está semente produzida por tais híbridos F1 da invenção objeto. Esta invenção inclui um método para produção de uma semente híbrida F1 por cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, origem em reprodução) e coleta da semente híbrida resultante. A invenção objeto inclui uma planta exemplificada que é, ou uma origem fêmea, ou uma origem macho. As características das plantas resultantes podem ser aperfeiçoadas por consideração cuidadosa das plantas de origem.
[0059] Uma planta de soja resistente a inseto/tolerante a glufosinato da invenção objeto pode ser gerada por primeiro cruzamento sexualmente de uma primeira planta de soja de origem consistindo em uma planta de soja crescida de semente de qualquer uma das linhas aqui referidas, e uma segunda planta de soja de origem, produzindo, desse modo, uma pluralidade de primeiras plantas de progenia; em seguida, seleção de uma primeira planta de progenia que é resistente a glufosinato; aceitação da primeira planta de progenia, produzindo, desse modo, uma pluralidade de segundas plantas de progenia; e, em seguida, seleção a partir das segundas plantas de progenia a planta que é resistente a glufosinato. Estas etapas podem adicionalmente incluir o cruzamento posterior da primeira planta de progenia ou da segunda planta de progenia à segunda planta de soja de origem, ou uma terceira planta de soja de origem. Uma cultura de soja compreendendo sementes de feijão-soja da invenção objeto, ou progenia destas, pode, em seguida, ser plantada.
[0060] É também para ser compreendido que duas plantas transgênicas diferentes podem também serem unidas para produzir descendência que contém dois genes independentemente segregados exógenos, adicionados. A aceitação de progenia apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos genes exógenos adicionados. O cruzamento posterior a uma planta de origem e cruzamento externo com uma planta não-transgênica são também contemplados, conforme é propagação vegetativa. Outros métodos de reprodução comumente usados para traços diferentes e culturas são conhecidos na técnica. Reprodução de cruzamentos posteriores foi usada para transferir genes para um traço altamente hereditário simplesmente herdado em um cultivar homozigoto desejável, ou linhagem de reprodução, que é a origem recorrente. A fonte do traço a ser transferida é denominada a origem doadora. A planta resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido a partir da origem doadora. Após cruzamento inicial, os indivíduos que processam o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (cruzado posterior) a origem recorrente. A origem resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar), e o traço desejável transferido a partir da origem doadora.
[0061] Do mesmo modo uma planta de soja resistente a inseto/tolerante a glufosinato da invenção objeto pode ser transformada com transgenes adicionais usando métodos conhecidos na técnica. As técnicas de transformação, tais como transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (isto é, canhão de gene), e transformação mediada por carbeto de silício (isto é WHISKERS), podem ser usadas para transgene(s) adicional (is) introduzido(s) no genoma de evento de soja 9582.814.19.1. A seleção e caracterização de plantas transgênicas contendo os transgenes recentemente inseridos podem ser completadas para identificar plantas que contém um integrante estável do novo transgene em adição a genes cry1F, cry1Ac, pat da invenção objeto.
[0062] As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas como marcadores moleculares em um método de reprodução auxiliado por marcador (MAB). As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas nos métodos (tais como marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNPs, e SSRs) que identificam traços geneticamente ligados agronomicamente úteis, conforme é conhecido na técnica. Os traços de resistência a inseto e de tolerância a herbicida podem ser rastreados na progenia de um cruzamento com uma planta de soja da invenção objeto (ou progenia desta, e qualquer outro cultivar de feijão-soja ou variedade) usando os métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadoras para este traço, e métodos de MAB que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para rastrear o(s) traço(s) resistente(s) a herbicida em plantas de soja, onde pelo menos uma linha de feijão-soja da invenção objeto, ou progenia desta, foi uma origem ou ancestral. Os métodos da presente invenção podem ser usados para identificar qualquer variedade de feijão-soja tendo o evento objeto.
[0063] Os métodos da invenção objeto incluem um método de produzir uma planta de soja resistente a inseto/ tolerante a herbicida, em que referidos método compreendem reprodução com uma planta da invenção objeto. Mais especificamente, referidos métodos podem compreender cruzamento de duas plantas da invenção objeto, ou uma planta da invenção objeto, e qualquer outra planta. Métodos preferidos adicionalmente compreendem selecionar progenia de referido cruzamento por análise de referida progenia para um evento detectável de acordo com a invenção objeto, e desempenho varietal favorável (por exemplo, produção). Por exemplo, a invenção objeto pode ser usada para rastrear o evento objeto através de ciclos de reprodução com plantas compreendendo outros traços desejáveis, tais como traços genômicos, tolerância ou resistência à doença, tolerância ou resistência à nematódio, e maturidade. As plantas compreendendo o evento objeto e o traço desejado podem ser detectadas, identificadas, selecionadas, e rapidamente usadas em etapas adicionais de reprodução, por exemplo. O evento objeto/traço pode também ser combinado através de reprodução, e rastreado de acordo com a invenção objeto, com traço(s) adicionais resistente(s) a inseto e/ou com traços adicionais de tolerância a herbicida. As concretizações das últimas são plantas compreendendo o evento objeto combinado com o gene aad-12, que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético e herbicidas de piridiloxiacetato, ou com um gene que codifica resistência ao herbicida dicamba.
[0064] Desse modo, a invenção objeto pode ser combinada com, por exemplo, traços que codificam resistência à glifosato (por exemplo, planta resistente ou bacterial EPSPS, GOX, GAT), resistência á glufosinato (por exemplo, pat, bar), resistência a herbicida de inibição de etolactato sintase (ALS) (por exemplo, imidazolinonas [tal como imazetapir], sulfoniluréias, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, e outros químicos [Csr1, SurA, et al.]), resistência á bromoxinil (por exemplo, Bxn), resistência à inibidores de HPPD enzima de (4-hidroxlfenil-piruvato-dioxigenase), resistência á inibidores de fitoeno desaturase (PDS), resistência a herbicidas de inibição de fotosistema II (por exemplo, psbA), resistência a herbicidas de inibição de fotosistema I, resistência a herbicidas de inibição de protoporfirinogênio oxidase IX (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistência a herbicidas de feniluréia (por exemplo, CYP76B1), enzimas de degradação de dicamba (ver, por exemplo, US 20030135879), e outros, podem ser empilhados sozinhos ou em combinações múltiplas para proporcionar a capacidade de controlar efetivamente ou impedir alterações de erva - daninha e/ou resistência à qualquer herbicida das classes antes mencionadas.
[0065] Adicionalmente, o evento de soja 9582.814.19.1 pode ser combinado com uma ou mais entradas adicionais (por exemplo, resistência a inseto, resistência à patogenia, ou tolerância à tensão, et al.) ou traços de saída (por exemplo, rendimento aumentado, perfil de óleo aperfeiçoado, qualidade de fibra aperfeiçoada, et al.). Desse modo, a invenção objeto pode ser usada para proporcionar um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aperfeiçoada com a capacidade de controlar flexivelmente e com custo efetivo qualquer número de pestes agronômicas.
[0066] Métodos de integrar uma sequência de polinucleotídeo dentro de um local cromossomal específico de uma célula de planta, via recombinação homóloga, foi descrito dentro da técnica. Por exemplo, a integração específica de local, conforme descrita no Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2009/0111188 A1, aqui incorporado por referência, descreve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um alvo cromossomal. Em adição, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207, aqui incorporado por referência, descreve recombinação homóloga mediada por garra de zinco para integrar uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de localizações específicas do genoma. O uso de recombinases, tal como FLP/FRT, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6720475, aqui incorporada por referência, ou CRE/LOX, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5658772, aqui incorporada por referência, pode ser utilizado para integrar uma sequência de polinucleotídeo em um local cromossomal específico. (Finalmente, o uso de meganucleases para alvejar polinucleotídeos doadores em uma localização cromossomal específica foi descrito em Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).
[0067] Outros métodos para integração específica de local dentro de células de planta são geralmente conhecidos e aplicáveis (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). Além disso, sistemas de recombinação específica de local que foram identificados em vários organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para usar nas plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas não são limitas a, também; o sistema R/RS recombinase a partir do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), e o sistema Gin/gix de fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
[0068] Em algumas concretizações da presente invenção, pode ser desejável integrar ou empilhar um novo transgene(s) em proximidade a um evento transgênico existente. O evento transgênico pode ser considerado um local genômico preferido que foi selecionado baseado nas características únicas, tais como local de inserção simples, segregação Mendelian normal e expressão estável, e uma combinação superior de eficácia, incluindo tolerância a herbicida e desempenho agronômico em e através de localizações ambientais múltiplas. Os transgenes recentemente integrados devem manter as características de expressão de transgene dos transformantes existentes. Além disso, o desenvolvimento de ensaios para a detecção e confirmação de do evento recentemente integrado seria superado como a sequência genômica de flanqueamentos e localização cromossomal do evento recentemente integrado que já são identificados. Finalmente, a integração de um novo transgene em uma localização cromossomal específica que é ligada a um transgene existente expediria a introgressão dos transgenes em outros antecedentes genéticos por cruzamento externo sexual usando-se métodos de reprodução convencionais.
[0069] Em algumas concretizações da presente invenção, pode ser desejável cortar sequências de polinucleotídeo de um evento transgênico. Por exemplo, excisão de transgene, conforme descrito no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/297.628, aqui incorporado por referência, descreve o uso de nucleases de garra de zinco para remover uma sequência de polinucleotídeo, consistindo em um cassete de expressão de gene, de um evento transgênico cromossomalmente integrado. A sequência de polinucleotídeo que é removida pode ser um marcador selecionável. Após excisão e remoção de uma sequência de polinucleotídeo, o evento transgênico modificado pode ser re-alvejado pela inserção de uma sequência de polinucleotídeo. A excisão de uma sequência de polinucleotídeo e subsequente re-alvejamento do evento transgênico modificado, proporciona vantagens tais como re-uso de um marcador selecionável, ou a capacidade de superar mudanças não-pretendidas ao transcriptoma da planta que resulta da expressão dos genes específicos.
[0070] A invenção objeto aqui revela um local específico no cromossomo 02 no genoma de feijão-soja que é excelente para inserção de heterólogos de ácido nucleico. Desse modo, a invenção objeto proporciona métodos para introduzir heterólogos de ácido nucleico de interesse neste local alvo pré-estabelecido, ou na vizinhança deste local alvo. A invenção objeto também envolve uma semente de feijão-soja e/ou uma planta de soja, compreendendo qualquer sequência de nucleotídeo heteróloga inserida no local alvo revelado, ou na vizinhança geral de tal local. Uma opção para efetuar tal integração alvo é cortar e/ou substituir um inserto diferente no lugar do cassete de expressão pat aqui exemplificado. Neste particular, recombinação homóloga alvo, por exemplo, e sem limitação, pode ser usada de acordo com a invenção objeto.
[0071] Conforme aqui usado, “rastreamento” de evento ou traço é a combinação de traços desejados em uma linha transgênica. Os geradores de planta empilham traços transgênicos por produção de cruzamentos entre origens que cada um tem um traço desejado e, em seguida, identificando a descendência que tem ambos destes traços desejados. Outro modo de empilhar genes é por transferência de dois ou mais genes no núcleo da célula de uma planta ao mesmo tempo durante transformação. Outro modo de empilhar genes é por re- transformação de uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, empilhamento de gene pode ser usado para combinar dois ou mais traços diferentes, incluindo, por exemplo, dois ou mais traços de inseto diferentes, traços(s) de resistência a inseto e traço(s) de resistência á doença, dois ou mais traços de resistência a herbicida, e/ou traço(s) de resistência a inseto e traço(s) de resistência á herbicida. O uso de um marcador selecionável, em adição a um gene de interesse, pode ser também considerado empilhamento de gene.
[0072] “Recombinação homóloga” se refere a uma reação entre qualquer par de sequências de nucleotídeo tendo locais correspondentes contendo uma sequência de nucleotídeo similar através da qual as duas sequências de nucleotídeo podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os locais de sequência de nucleotídeo similares são cada referidos aqui como uma “sequência de homologia”. Geralmente, a frequência de recombinação homóloga aumenta conforme o comprimento da sequência de homologia aumenta. Desse modo, enquanto que a recombinação homóloga pode ocorrer entre duas sequências de nucleotídeo que são menos do que idênticas, a frequência de recombinação (ou eficiência) declina conforme a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser acompanhada usando-se uma sequência de homologia em cada uma das moléculas doadoras e alvos, gerando, desse modo, um produto de recombinação de “cruzamento simples”. Alternativamente, duas sequências de homologia podem ser colocadas em cada uma das sequências de nucleotídeo alvo e doadoras. A recombinação entre duas sequência de homologia no doador com duas sequências de homologia no alvo gera um produto de recombinação de “cruzamento duplo”. Se as sequências de homologia na molécula doadora flanqueiam uma sequência que é para ser manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação de cruzamento duplo com a molécula alvo resultará em um produto de recombinação em que a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências de homologia na molécula alvo. A troca de sequência de DNA entre o alvo e doador através de um evento de recombinação de cruzamento duplo é denominada “substituição de sequência”.
[0073] Uma planta referida, ou uma semente, da invenção objeto, compreende em seu genoma operativo sequências de nucleotídeo cry1F v3, cry1Ac synpro e pat v6, conforme aqui identificadas, junto com pelo menos 20-500 ou mais nucleotídeos de flanqueamento contíguos em ambos os lados do inserto, conforme aqui identificado. A menos de outro modo indicado, referência á sequências de flanqueamento se refere àquelas identificadas com relação a SEQ ID NOS: 1 e 2. Toda ou parte destas sequências de flanqueamento podem ser esperadas serem transferidas para progenia que recebem o DNA inserido como um resultado de um cruzamento sexual de uma linha de origem que inclui o evento.
[0074] A invenção objeto inclui culturas de tecido de células regeneráveis de uma planta da invenção objeto. Também incluída está uma planta regenerada de tal cultura de tecido, particularmente onde referida planta é capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. Plantas preferidas da invenção objeto têm todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta crescida da semente depositada. Esta invenção adicionalmente compreende progenia de tal semente e processamento de semente de traços de qualidade de interesse
[0075] Conforme aqui usado, uma “linha” é um grupo de plantas que mostra pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos para pelo menos um traço. Tais linhas podem ser criadas por várias gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetativa de um tecido de origem simples, ou técnicas de cultura de célula.
[0076] Conforme aqui usado, os termos “cultivar” e “variedade” são sinônimos e se referem a uma linha que é usada para produção comercial.
[0077] “Estabilidade” ou “estável” significam que com relação ao dado componente, o componente é mantido de geração a geração e, preferivelmente, pelo menos três gerações.
[0078] “Utilidade comercial” é definida como tendo bom vigor de planta e alta fertilidade, tal que a cultura pode ser produzida por fazendeiros usando equipamento convencional de fazenda, e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído da semente por triturador convencional e equipamento de extração.
[0079] “Agronomicamente de elite” significa que uma linha tem características agronômicas desejáveis, tais como rendimento, maturidade, resistência á doença, e similares, em adição à resistência a inseto e tolerância a herbicida devido ao(s) evento(s) objeto(s). Qualquer e todas destas características agronômicas e pontos de dados podem ser usados para identificar tais plantas, ou como um ponto ou em qualquer extremidade ou ambas extremidades de uma faixa de características usada para definir tais plantas.
[0080] Conforme um técnico no assunto reconhecerá à luz desta revelação, concretizações preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados a e/ou compreendendo “sequências de junção” ou “sequências de transição” (onde a sequência genômica de flanqueamento de feijão-soja encontra a sequência de inserto). Por exemplo, isto inclui sondas de polinucleotídeo, iniciadores, e/ou amplicons projetados para identificar uma ou ambas sequências de junção (onde o inserto encontra a sequência de flanqueamento), conforme indicado na Tabela acima. Um projeto comum é ter um iniciador que hibridiza na região de flanqueamento, e um iniciador que hibridiza no inserto. Tais iniciadores são frequentemente cada cerca de pelo menos ~15 resíduos de comprimento. Com este arranjo, os iniciadores podem ser usados para gerar/amplificar um amplicon detectável que indica a presença de um evento da invenção objeto. Estes iniciadores podem ser usados para gerar um amplicon que se estende (e inclui) uma sequência de junção conforme indicado acima.
[0081] O(s) iniciador(s) "que tocam abaixo" na sequência de flanqueamento é/são tipicamente não designado(s) para hibridizar além de cerca de 1200 bases, ou mesmo além da junção. Desse modo, iniciadores de flanqueamento típicos seriam projetados para compreender pelo menos 15 resíduos de qualquer trançado dentro de 1200 bases nas sequências de flanqueamento a partir do começo do inserto. Isto é, iniciadores compreendendo uma sequência de um tamanho apropriado de (ou hibridizando para) 800 a 1400 pares bases de SEQ ID NO:14, e/ou 13.897 a 14.497 pares bases de SEQ ID NO:14, estão dentro do escopo da invenção objeto. Iniciadores de inserto podem, do mesmo modo, serem projetados em qualquer lugar, mas 1400 a 2000 pares bases de SEQ ID NO:14 e/ou 13.297 a 13.896 pares bases de SEQ ID NO:14, e podem ser usados, por exemplo, não - exclusivamente, para tal projeto de iniciador.
[0082] Um técnico no assunto também reconhecerá que iniciadores e sondas podem ser projetados para hibridizar, sob uma faixa de hibridização padrão e/ou condições de PCR em que o iniciador ou sonda não é perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Isto é, algum grau de desequiparação pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois, ou ainda nucleotídeos não necessitam se ligarem com o trançado oposto se a base desequiparada é interna ou no final do iniciador que é oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são proporcionadas abaixo. Análogos de nucleotídeo sintéticos, tais como inosina, podem também serem usados em sondas. Sondas de ácido nucleico de peptídeo (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, podem também serem usadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores são diagnóticos para (capaz de identificar únicamente e distinguir) a presença de um evento da invenção objeto.
[0083] Deve ser notado que erros na amplificação de PCR podem ocorrer, que podem resultar em erros de sequenciamento menores, por exemplo. Isto é, a menos que de outro modo indicado, as sequências aqui listadas foram determinadas pela geração de longos amplicons de DNAs genômicos de feijão-soja, e, em seguida, clonagem e sequenciamento dos amplicons. Não é não-usual encontrar leves diferenças e discrepâncias menores em sequências geradas e determinadas dessa maneira, dadas as muitas etapas de amplificação que são necessárias para gerar bastante amplicon para sequenciamento de DNAs genômicos. Um técnico no assunto deve reconhecer e ser posto a noticiar que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros de sequenciamento e discrepâncias comuns estão dentro do escopo da invenção objeto.
[0084] Deve também ser notado que não é incomum para alguma sequência genômica ser anulada, por exemplo, quando uma sequência é inserida durante a criação de um evento. Desse modo, algumas diferenças podem também aparecerem entre as sequências de flanqueamento objetos e sequências genômicas listadas no BANCO DE GENES, por exemplo.
[0085] Os componentes do “inserto” de sequência de DNA são ilustrados nas Figuras, e são discutidos em maiores detalhes abaixo nos Exemplos. As sequências de polinucleotídeo de DNA destes componentes, ou fragmentos destas, podem ser usadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos da presente invenção.
[0086] Em algumas concretizações da invenção, as composições e métodos são proporcionados para detectar a presença da região de inserção de transgene/genômica, em plantas e sementes, e similares, de uma planta de soja. As sequências de DNA são proporcionadas, que compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica objeto 5’ aqui proporcionada (entre pares bases 800 a 1400 de SEQ ID NO:14), segmentos destas, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer segmentos destas. As sequências de DNA são proporcionadas, que compreendem a sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica objeto 3’ aqui proporcionada (entre pares bases 13.897 a 14.497 de SEQ ID NO:14), segmentos destas, e complementos das sequências exemplificadas, e quaisquer segmentos destas. A sequência de junção da região de inserção se estende na junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de feijão-soja que flanqueia o local de inserção. Tais sequências podem ser diagnósticas para dado evento.
[0087] Baseados nestas sequências de inserto e de borda, iniciadores específicos de evento podem ser gerados. A análise de PCR demonstrou que linhas de feijão-soja da invenção objeto podem ser identificadas em genótipos diferentes de feijão-soja por análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciador específico de evento. Estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar únicamente estas linhas de feijão-soja. Desse modo, amplicons de PCR derivados de tais pares de iniciadores são únicos, e podem ser usados para identificar estas linhas de feijão-soja.
[0088] Em algumas concretizações, as sequências de DNA que compreendem um fragmento contínuo da nova região de transgene/genômica são um aspecto desta invenção. Incluídas estão sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência de inserto de trangene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência genômica de feijão-soja de uma ou mais das três plantas antes mencionadas de soja, e/ou sequências que são úteis como sequências iniciadores para a produção de um produto de amplicon diagnóstico para uma ou mais destas plantas de soja.
[0089] Concretizações relacionadas pertencem a sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou nucleotídeos mais contíguos de uma porção transgene de uma sequência de DNA aqui identificada (tal como SEQ ID NO:1 e segmentos destas), ou complementos destas, e um comprimento similar de sequência de DNA de flanqueamento de feijão- soja destas sequências, ou complementos destas. Tais sequências são úteis como iniciadores de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos usando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer dos eventos de soja aqui referidos. Portanto, a invenção também inclui os amplicons produzidos por tais iniciadores de DNA e iniciadores homólogos.
[0090] Esta invenção também inclui métodos de detecção da presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de soja aqui referido. Tais métodos podem compreender: (a) contatar a amostra compreendendo DNA com um conjunto de iniciador que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA de pelo menos um destes eventos de soja, produz um amplicon que é diagnóstico para referido(s) evento(s); (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o amplicon; e (c) detecção do amplicon.
[0091] Métodos de detecção adicionais da invenção objeto incluem um método de detectar a presença de um DNA, em uma amostra, correspondente a referido evento, em que referido método compreende: (a) contatar a amostra compreendendo DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com DNA de pelo menos um de referidos eventos de soja, e que não hibridizam sob as condições de hibridização estringentes com uma planta de soja de controle (DNA de evento de não-interesse); (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização estringentes; e (c) detectar hibridização da sonda ao DNA.
[0092] Em ainda outras concretizações, a invenção objeto inclui métodos de produção de uma planta de soja compreendendo evento de soja 9582.814.19.1 da invenção objeto, em que referido método compreende as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linha de feijão-soja de origem (compreendendo cassetes de expressão da presente invenção, que conferem tolerância a glufosinato a plantas de referida linha) e uma segunda linha de feijão-soja de origem (que rastreia este traço de tolerância a herbicida) produzindo, desse modo, uma pluralidade de plantas de progenia; e (b) selecionar uma planta de progenia pelo uso de marcadores moleculares. Tais métodos podem, opcionalmente, compreender a etapa adicional de cruzamento posterior da planta de progenia à segunda linha de origem de feijão-soja para produção de uma planta de soja de geração verdadeira que compreende o traço de resistente a inseto e tolerante a glufosinato.
[0093] De acordo com outro aspecto da invenção, métodos de determinar a zigosidade de progenia de um cruzamento com referido evento é proporcionado. Referidos métodos podem compreender contatar a amostra, compreendendo DNA de feijão-soja, com um conjunto de iniciadores da invenção objeto. Referidos iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de pelo menos um de referidos eventos de soja, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para pelo menos um de referidos eventos de soja. Tais métodos compreendem adicionalmente realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o primeiro amplicon; detecção do primeiro amplicon; e contato da amostra compreendendo DNA de feijão-soja com um segundo conjunto de iniciadores (referido segundo conjunto de iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico de plantas de soja, produz um segundo amplicon compreendendo o homólogo de DNA genômico de feijão-soja nativo para a região genômica de feijão-soja); e realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, desse modo, o segundo amplicon. Os métodos adicionalmente compreendem detectar o segundo amplicon, e comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica para a inserção de transgene.
[0094] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições aqui reveladas e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para identificação do evento objeto de DNA de soja em uma amostra, e podem ser aplicados a métodos para reprodução de plantas de soja contendo este DNA. Os kits contêm homólogos de sequências de DNA ou complementares aos amplicons, por exemplo, aqui revelados, ou um homólogo de sequências de DNA ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgenes dos eventos objetos. Estas sequências de DNA podem ser usadas nas reações de amplificação de DNA, ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits podem também conter os reagentes e materiais necessários para o desempenho do método de detecção.
[0095] Uma “sonda” é uma molécula de ácido nucleico isolada a qual é fixada uma etiqueta detectável convencional ou molécula repórter (tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimiluminescente, ou enzima). Tal sonda é complementar a um trançado de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a um trançado de DNA genômico de referidos eventos de soja, se uma planta de soja ou de uma amostra que inclui DNA a partir do evento. As sondas de acordo com a presente invenção não incluem somente ácidos deoxiribonucleico ou ribonucleico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA-alvo, e podem ser usadas para detectar a presença daquela sequência de DNA-alvo.
[0096] Os “iniciadores” são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são reforçados a um trançado de DNA-alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o trançado de DNA-alvo, em seguida estendido ao longo do trançado de DNA-alvo por uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Pares de iniciadores da presente invenção se referem a seu uso para amplificação de uma sequência-alvo de ácido nucleico, por exemplo, pela reação de cadeia polimerase (PCR), ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.
[0097] Sondas e iniciadores são geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, ou 1000, ou 2000, ou 5000 polinucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente a uma sequência-alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade completa de sequência com a sequência- alvo, embora as sondas difiram da sequência-alvo e que retêm a capacidade de hibridizar à sequências alvos possam ser projetadas por métodos convencionais.
[0098] Métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Pares de PCR-iniciador podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, pelo uso de programas de computador pretendidos para esta proposta.
[0099] Iniciadores e sondas baseadas no DNA de flanqueamento e sequências de inserto aqui revelados podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências reveladas por métodos convencionais, por exemplo, por re-clonagem e sequenciamento de tais sequências.
[00100] As sondas e iniciadores de ácido nucleico da presente invenção hibridizam sob condições estringentes a uma sequência de DNA-alvo. Qualquer método convencional de hibridização de ácido nucleico ou de amplificação pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos destas são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são referidas para serem capazes de hibridizar especificamente entre si se as moléculas são capazes de formarem uma estrutura de ácido nucleico de trançado duplo, antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é referida para ser o “complemento” de outra molécula de ácido nucleico se elas exibem completa complementaridade. Conforme aqui usado, as moléculas são referidas para exibirem “completa complementaridade” quando todo nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são referidas para serem “minimamente complementares” se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam entre si sob pelo menos condições convencionais de “baixa estringência”. Similarmente, as moléculas são referidas para serem “complementares” se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam reforçadas entre si sob condições convencionais de “alta estringência”. As condições convencionais de estringência são descritas por Sambrook et al., 1989. As partidas de complementaridade completas são, portanto, permissíveis, considerando-se que tais partidas não evitam completamente a capacidade das moléculas formarem uma estrutura de trançado duplo. De modo a que a molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela necessita de somente ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de trançado duplo estável sob as concentrações de solvente particular e sal empregadas.
[00101] Conforme aqui usado, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que especificamente hibridizará ao complemento da sequência de ácido nucleico a qual ela está sendo comparada sob condições de alta estringência. O termo “condições estringentes” é funcionalmente definido com relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico a um ácido nucleico alvo (isto é, a uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) pelo procedimento de hibridização específica discutido em Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55. Ver também,Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 e 9.56-9.58. Consequentemente, as sequências de nucleotídeo da invenção podem ser usadas por sua capacidade de formar seletivamente moléculas duplex com estiramentos complementares de fragmentos de DNA.
[00102] Dependendo da aplicação considerada, pode-se usar condições variadas de hibridização para alcançar graus variados de seletividade de sonda em direção á sequência-alvo. Para aplicações que requerem alta seletividade, pode-se empregar tipicamente condições relativamente estringentes para formar os híbridos, por exemplo, se selecionará sal relativamente baixo e/ou condições de alta temperatura, tais como proporcionado por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCl à temperaturas de cerca de 50°C a cerca de 70°C. Condições estringentes, por exemplo, podem envolver lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,2X de SSC, 0,1% de SDS, 65°C). Condições de estringência apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0X de SSC a 50°C, são conhecidas àqueles técnicos no assunto. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0X de SSC a 50°C a uma alta estringência de cerca de 0,2X de SSC a 50°C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22°C, à condições de alta estringência a cerca de 65°C. Ambos a temperatura e sal podem ser variados, ou qualquer da temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto que a outra variável é mudada. Tais condições seletivas toleram pouca, se houver, desequiparação entre a sonda e o gabarito ou trançado alvo. A detecção das sequências de DNA, via hibridização, é conhecida àqueles técnicos no assunto, e os ensinamentos das Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.965.188 e 5.176.995 são exemplares dos métodos de análise de hibridização.
[00103] Em uma concretização particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente a um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados, ou aqui sugeridos, incluindo complementos e fragmentos destes, sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção tem a sequência de ácido nucleico conforme colocada em uma das sequências exemplificadas, ou complementos e/ou fragmentos destas.
[00104] Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácido nucleico. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser usadas como marcadores em métodos de reprodução de planta para identificar a progenia de cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda para a molécula de DNA-alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidas àqueles técnicos no assunto, estes podem incluir, mas não são limitados a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas baseadas em anticorpo, e etiquetas quimiluminescentes.
[00105] Com relação a amplificação de uma sequência-alvo de ácido nucleico (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciador de amplificação particular, “condições estringentes” são condições que permitem que o par de iniciador hibridize somente à sequência de ácido nucleico-alvo a qual um iniciador tendo a sequência tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e, preferivelmente, produziria um produto de amplificação único, o amplicon.
[00106] O termo “específico para (uma -sequência-alvo)” indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização estringentes somente para a -sequência-alvo em uma amostra compreendendo a -sequência-alvo.
[00107] Conforme aqui usado, “DNA amplificado” ou “amplicon” se refere ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma -sequência- alvo de ácido nucleico que é parte de um gabarito de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de soja resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico da planta de soja da presente invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido a método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado de sequência de flanqueamento no genoma da planta adjacente ao local de inserção de DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA de evento. O amplicon é de um comprimento, e tem uma sequência que é também diagnóstica para o evento. O amplicon pode variar de comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciadores, mais um par de base de nucleotídeo, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciadores, mais cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, ou mais pares bases de nucleotídeo (mais ou menos quaisquer dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado de sequência de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a sequência de inserto de nucleotídeo total. Um membro de um par de iniciadores derivado da sequência genômica da planta pode estar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida. Esta distância pode variar de um par base de nucleotídeo até cerca de vinte mil pares bases de nucleotídeo. O uso do termo “amplicon” especificamente exclui dímeros de iniciador que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[00108] A amplificação de ácido nucleico pode ser acompanhada por qualquer dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, inter alia, na Patente dos Estados Unidos No. 4.683.195 e Patente dos Estados Unidos No. 4.683.202. Métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência do inserto de DNA transgênico heterólogo ou sequência genômica de flanqueamento de um evento objeto de soja podem ser verificadas (e corrigidas se necessário) pela amplificação de tais sequências a partir do evento usando iniciadores derivados das sequências aqui proporcionadas, seguido por sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR, ou do DNA clonado.
[00109] O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Eletroforese de gel de agarose e manchamento com brometo de etídio é um método comum bem conhecido de detectar amplicons de DNA. Outro tal método é Genetic Bit Analysis, onde um oligonucleotídeo de DNA é projetado que sobrepõe ambas a sequência genômica de DNA de flanqueamento adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado nas cavidades de uma placa de micro cavidade. Em seguida ao PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e uma sequência genômica de flanqueamento adjacente), um produto de PCR de trançado simples pode ser hibridizado para o oligonucleotídeo imobilizado, e serve como um gabarito para uma reação de extensão base simples usando um DNA polimerase e ddNTPs etiquetados específicos para a próxima base esperada. A leitura pode ser fluorescente ou à base de ELISA. Um sinal indica a presença do inserto/sequência de flanqueamento devido a amplificação, hibridização, e extensão de base simples bem sucedidas.
[00110] Outro método é a técnica de Pirosequenciamento conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é projetado que sobrepõe o DNA genômico adjacente e junção de DNA de inserto. O oligonucleotídeo é hibridizado a produto de PCR de trançado simples da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de um DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfosulfato e luciferin. DNTPs são adicionadas individualmente e a incorporação resulta em um leve sinal que é medido. Tm leve sinal indica a presença do inserto transgene/sequência de flanqueamento devido a amplificação, hibridização, e extensão simples ou de base múltipla bem sucedidas.
[00111] Polarização de Fluorescência é outro método que pode ser usado para detectar um amplicon da presente invenção. Em seguida a este método, um oligonucleotídeo é projetado que sobrepõe o flanqueamento genômico e junção de DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado a produto PCR de trançado simples a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência genômica de DNA de flanqueamento), e incubado na presença de um DNA polimerase e um ddNTP fluorescente etiquetado. A extensão de base simples resulta na incorporação da ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença do inserto de transgene/sequência de flanqueamento devido a amplificação, hibridização e extensão de base simples bem sucedidas.
[00112] TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada, que sobrepõe o flanqueamento genômico e junção de inserto de DNA. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Durante amplificação específica, Taq DNA polimerase limpa e libera a porção fluorescente para fora da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença do flanqueamento/sequência de inserto transgene devido a amplificação e hibridização bem sucedidas.
[00113] Molecular Beacons foi descrito para uso na detecção de sequência. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada, que sobrepõe o genômico de flanqueamento e junção de DNA de inserto. A estrutura única da sonda FRET resulta na mesma conter estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em proximidade. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de inserto de DNA e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Em seguida a amplificação de PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET à -sequência-alvo resulta na remoção da estrutura de sonda secundária e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Um sinal fluorescente resulta. Um sinal fluorescente indica a presença do genômico de flanqueamento/sequência de inserto de transgene devido a amplificação e hibridização bem sucedidas.
[00114] Tendo revelado uma localização no genoma de feijão-soja que é excelente para uma inserção, a invenção objeto também compreende uma semente de feijão-soja e/ou uma planta de soja compreendendo pelo menos um inserto de evento de não-soja 9582.814.19.1 na vizinhança geral desta localização genômica. Uma opção é substituir um inserto diferente no lugar do evento de soja pDAB9582.814.19.1 exemplificado aqui. Nestes particulares gerais, recombinação homóloga-alvo, por exemplo, pode ser usada de acordo com a invenção objeto. Este tipo de tecnologia é o objeto de, por exemplo, WO 03/080809 A2 e o pedido correspondente publicado dos Estados Unidos (US 20030232410). Desse modo, a invenção objeto inclui plantas e células de planta compreendendo um inserto heterólogo (no lugar de, ou com multi-cópias dos genes cry1F, cry1Ac, ou pat), flanqueadas por toda ou uma parte reconhecível das sequências de flanqueamento aqui identificadas (1-1400 bp de SEQ ID NO:1 e 1531550 bp de SEQ ID NO:2). Uma cópia adicional (ou cópias adicionais) de um cry1F, cry1Ac, ou pat pode também ser alvejada para inserção nessa/nestas maneira(s).
[00115] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidas a ou aqui citadas, são incorporados por referência em sua totalidade à extensão que eles não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.
[00116] Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar os procedimentos para praticar a invenção e para demonstrar certas concretizações preferidas da invenção. Estes exemplos não devem ser construídos como limitantes. Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas reveladas nos seguintes exemplos representam abordagens específicas usadas para ilustrar modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nestas concretizações específicas, enquanto que ainda obtendo-se resultados correspondentes ou similares sem fugir do espírito e escopo da invenção. A menos que de outro modo indicado, todas as percentagens são por peso, e todas as proporções de mistura de solvente são por volume, a menos que de outro modo, notado.
[00117] As seguintes abreviações são usadas, a menos que de outro modo indicado. bp par base °C graus Celsius DNA ácido deoxiribonucleico EDTA ácido etilenodiaminatetraacético kb kilobase g micrograma L microlitre mL mililitto M massa molar PCR reação de cadeia polimerase PTU unidade de transcrição de planta SDS sódio dodecil sulfato SSC uma solução tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7,0 TBE uma solução tampão contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA, pH 8,3
[00118] As concretizações da presente invenção são adicionalmente definidas nos seguintes Exemplos. Deve ser compreendido que estes Exemplos são dados por meio de ilustração somente. A partir da discussão acima e estes Exemplos, um técnico no assunto pode determinar as características essenciais desta invenção, e sem fugir do espírito e escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações das concretizações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Desse modo, varias modificações das concretizações da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes àqueles técnicos no assunto a partir da descrição precedente. Tais modificações são também pretendidas caírem dentro do escopo das reivindicações em anexo.
[00119] A revelação de cada referência aqui colocada é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[00120] Feijão-soja transgênico (Glycine max) contendo o evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi gerado através de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de núcleo cotiledonário de feijão-soja. A cepa Agrobacterium EHA101 (Hood et al., 1993), conduzindo o vetor binário pDAB9582 (Figura 1) contendo o marcador selecionável, pat v6, e os genes de interesse, cry1F v3 e cry1Ac synpro, dentro da região de DNA de trançado-T, foi usada para iniciar a transformação. A sequência de DNA para pDAB9582 é dada em SEQ ID NO:3, que é anotada abaixo na Tabela 1. Tabela 1. Elementos de gene localizados em pDAB9582.
[00121] A transformação mediada por Agrobacterium foi efetuada usando um procedimento modificado de Zeng et al. (2004). Brevemente, sementes de feijão-soja (cv Maverick) foram germinadas em meio basal e nódulos cotilenodários foram isolados e infectados com Agrobacterium.Iniciação de broto, alongamento de broto e meio de enraizamento foram suplementados com cefotaxima, timentin e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção de glufosinato foi empregada para inibir o crescimento de brotos não-transformados. Brotos selecionados foram transferidos para o meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e, em seguida, transferidos para mistura de solo para aclimatação de plantinhas.
[00122] Folhinhas terminais de plantinhas selecionadas foram pintadas em folha com glufosinato para classificar transformantes putativos. As plantinhas classificadas foram transferidas para a estufa, permitidas se aclimatarem e, em seguida, pintadas em folha com glufosinato para re-confirmar tolerância e, de fato, serem transformantes putativos. As plantas classificadas foram amostradas e análises moleculares para a confirmação do gene marcador selecionável e/ou o gene de interesse foram efetuadas. As plantas T0 foram permitidas auto- fertilizarem na estufa para dar ocorrência a semente T1.
[00123] Este evento, evento de soja pDAB9582.814.19.1, foi gerado de um isolado transformado independente. As plantas T1 foram cruzadas e introgredidas em variedades de elite sobre gerações subsequentes. O evento foi selecionado baseado em suas características únicas, tais como local de inserção simples, segregação normal de Mendelian, expressão estável, e uma combinação superior de eficácia, incluindo tolerância a herbicida e desempenho agronômico. Os seguintes exemplos contêm os dados que foram usados para caracterizar evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00124] As propriedades bioquímicas do recombinante Cry1F, Cry1Ac, e proteínas PAT expressos no evento de soja 9582.814.19.1 foram caracterizadas. Ensaio imunosorvente ligado á enzima quantitativo (ELISA) é um ensaio bioquímico conhecido dentro da técnica, que pode ser usado para caracterizar as propriedades bioquímicas das proteínas e confirmar expressão destas proteínas no evento de soja 9582.814.19.1.
[00125] Amostras de tecidos de feijão-soja foram isoladas das plantas testes e preparadas para análise de expressão. A proteína PAT foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA). O tecido de planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando um kit PAT ELISA em um formato intercalado. O kit foi usado em seguida ao protocolo sugerido pelo fabricante (Envirologix, Portland, ME). Este ensaio mediu a proteína PAT expressa.
[00126] A proteína Cry1F foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST). O tecido de planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando um kit Cry1F ELISA em um formato intercalado. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Este ensaio mede a proteína Cry1F expressa.
[00127] A proteína Cry1Ac foi extraída de tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA). O tecido de planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando um kit Cry1Ac ELISA em um formato intercalado. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Este ensaio mede a proteína Cry1Ac.
[00128] Análise de detecção foi realizada para investigar a estabilidade de expressão e hereditariedade ambos verticalmente (entre gerações) e horizontalmente (entre linhagens dentro de uma reprodução) no evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00129] Níveis de proteínas Cry1F, Cry1Ac e PAT foram determinados no Evento de soja 9582.814.19.1. As proteínas extraíveis solúveis foram medidas usando um método de ensaio imunosorvente ligado à enzima quantitativo (ELISA) de tecido de folha de feijão-soja. De gerações T2 a T6 de Eventos de soja 9582.814.19.1, a expressão foi estável (não segregando), e consistente através de todas as linhagens. Tabela 2 lista o nível de expressão médio das proteínas transgênicas no evento de soja 9582.814.19.1. Tabela 2. Nível de expressão médio de proteínas transgênicas diferentes em evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00130] Para caracterizar e descrever local de inserção genômico, a sequência das regiões de borda de genômico de flanqueamento de DNA-T de evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi determinada. A sequência genômica de evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi confirmada, compreendendo 1400 bp de 5’ sequência de borda de flanqueamento (SEQ ID NO:1) e 1398 bp de 3’ sequência de borda de flanqueamento (SEQ ID NO:2). A amplificação de PCR baseada no evento de soja pDAB9582.814.19.1, sequências de borda validadas que as regiões de borda foram de origem de feijão-soja, e que as regiões de junção são sequências únicas para evento de soja pDAB9582.814.19.1. As regiões de junção podem ser usadas para identificação específica de evento de evento de soja pDAB9582.814.19.1. Em adição, o local de inserção de trançado-T foi caracterizado pela amplificação de um fragmento genômico correspondente à região da sequência de borda de flanqueamentos identificada do genoma de feijão-soja não- transformado. A comparação de evento de soja pDAB9582.814.19.1 com a sequência genômica não-transformada revelou que uma anulação de cerca de 57 bp do local original resultou durante a integração de trançado-T. No todo, a caracterização do inserto e sequência de borda de evento de soja pDAB9582.814.19.1 indicou que uma cópia intacta do trançado-T de pDAB9582 estava presente no genoma de feijão-soja. Tabela 3. Lista de iniciadores e suas sequências usadas na confirmação de DNA genômico de feijão-soja no evento de soja pDAB9582.814.19.1
Tabela 4. Condições para amplificação de PCR padrão das regiões de borda e sequências específicas de evento no evento de soja pDAB9582.814.19.1. 
Tabela 5. Mistura de PCR para amplificação de PCR padrão das regiões de borda e sequências específicas de evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00131] As bordas de flanqueamento 5’ e 3’ alinhadas a uma sequência shotgun de genoma total de Glicina máx do cromossomo 02, indicando que o transgene de evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi inserido no cromossomo de genoma 02 de feijão-soja. Para confirmar o local de inserção de evento de soja pDAB9582.814.19.1 a partir do genoma de feijão-soja, PCR foi efetuada com pares de iniciadores diferentes (Figura 2, Tabela 3, Tabela 4, e Tabela 5). O DNA genômico de evento de soja pDAB9582.814.19.1 e outras linhas transgênicas ou não-transgênicas de feijão-soja foi usado como um gabarito. Para confirmar que as 5’ sequências de borda são corretas, um iniciador designado para se ligar ao elemento de gene de promotor Ubi10, por exemplo, AtUbi10RV1, e um iniciador designado para se ligar à borda terminal 5’ clonada no cromossomo de genoma de feijão-soja 02, o iniciador designado 81419_FW3, foram usados para amplificar o segmento de DNA que se estende ao elemento de gene de promotor Ubi10 à 5’ sequência de borda terminal. Similarmente, para confirmação da 3’ sequência de borda clonada de um iniciador específico de pat, por exemplo, 3’PATEnd05, e três iniciadores designados de acordo com a 3’ sequência de borda terminal clonada, designada 81419_RV1, 81419_RV2 e 81419_RV3, foram usados para amplificação de segmentos de DNA que se estendem ao gene pat para 3’ sequência de borda. Os fragmentos de DNA com tamanhos esperados foram amplificados somente a partir do DNA genômico de evento de soja pDAB9582.814.19.1 com cada par de iniciadores, mas não de amostras de DNA de outras linhas transgênicas de feijão-soja, ou o controle não- transgênico. Os resultados indicam que as 5’ e 3’ sequências de borda clonadas são as sequências de borda de flanqueamento do inserto de trançado-T para evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00132] Para confirmar adicionalmente a inserção de DNA no genoma de feijão-soja, uma amplificação de PCR que se estende nas sequências de borda de feijão-soja foi completada no DNA genômico que não contém o inserto de trançado-T para evento de soja pDAB9582.814.19.1. O iniciador 81419_FW3, projetado de acordo com a 5’ sequência de borda terminal, e um iniciador 81419-RV3, projetado para a 3’ sequência de borda terminal, foram usados para amplificar segmentos de DNA que contêm o local onde a trançado-T pDAB9582 se integra. Conforme esperado, a amplificação de PCR completada com o par de iniciadores de 81419_FW3 e 81419_RV3 produziu aproximadamente 1,5 kb de fragmento de DNA de todas as outras linhas de controle de feijão-soja, mas não pDAB9582.814.19.1. O alinhamento das 5’ e 3’ sequências de borda identificadas de evento de soja pDAB9582.814.19.1 com uma sequência shotgun de genoma total de Glicina máxdo cromossomo 02 revelou cerca de 57 bp de anulação a partir do local de original. (Figura 3). Estes resultados demonstraram que o transgene de evento de soja pDAB8294 foi inserido no local de cromossomo de genoma 02 de feijão-soja.
[00133] A análise de Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração de evento de soja pDAB9582.814.19.1. Estes experimentos geram dados que demonstram a integração e integridade dos transgenes de cry1Ac e cry1F dentro do genoma de feijão-soja. Evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi caracterizado como um evento de integração simples de comprimento total contendo uma cópia simples da unidade de transcrição de planta de cry1Ac e cry1F (PTU) de plasmídeo pDAB9582.
[00134] Os dados de Southern blot sugerem um fragmento de trançado T inserido no genoma de evento de soja pDAB9582.814.19.1. A análise de Southern blot detalhada foi conduzida usando-se sondas específicas ao gene cry1Ac e cry1F, contido na região de integração de trançado-T de pDAB9582.814.19.1, e enzimas descritivas de restrição que têm locais de clivagem localizados dentro do plasmídeo, e produzem fragmentos de hibridização interno ao plasmídeo ou fragmentos que se estendem na junção do plasmídeo com DNA genômico de feijão-soja (fragmentos de borda). Os pesos moleculares indicados a partir da hibridização de Southern para a combinação da enzima de restrição e a sonda foram únicos para o evento, e estabelece seus padrões de identificação. Estas análises também mostram que o fragmento de plasmídeo foram inseridos no DNA genômico de feijão- soja sem re-arranjos da PTU de cry1Ac e cry1F PTU.
[00135] DNA genômico foi extraído de tecido de folha coletado de plantas individuais de soja contendo evento de soja pDAB9582.814.19.1. Em adição, gDNA foi isolado de uma planta de soja convencional, Maverick, que contém o antecedente genético que é representativo da linha de substância, ausente dos genes cry1Ac e cry1F. O DNA genômico individual foi extraído de tecido de folha liofilizado em seguida ao método padrão de CTAB (Sambrook et al (1989)). Em seguida à extração, o DNA foi quantificado espectrofluorometricamente usando reagente de PICO GREEN (Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA foi então visualizado em um gel de agarose para confirmar valores de análise de PICO GREEN, e para determinar a qualidade do DNA.
[00136] Para caracterização molecular de Southern blot de evento de soja pDAB9582.814.19.1, dez microgramas (10 μg) de DNA genômico foram digeridos. O DNA genômico do evento de soja pDAB9582.814.19.1 e linha de feijão-soja não-transgênica Maverick foram digeridos pela adição de aproximadamente cindo unidades de enzima de restrição selecionada por μg de DNA e o tampão de reação correspondente para cada amostra de DNA. Cada amostra foi incubada a aproximadamente 37°C durante a noite. As enzimas de restrição AseI, HindIII, NsiI, e NdeI foram usadas individualmente para as digestões simples (New England Biolabs, Ipswich, MA). As enzimas de restrição NotI e ApaLI foram usadas juntas para uma digestão dupla (New England Biolabs, Ipswich, MA). Em adição, uma amostra de controle de hibridização positiva foi preparada por combinação de DNA de plasmídeo, pDAB9582 com DNA genômico a partir da variedade de feijão-soja não-transgênico, Maverick. O coquetel de DNA de plasmídeo/DNA genômico foi digerido usando-se os mesmos procedimentos e enzima de restrição, conforme as amostras testes.
[00137] Após as digestões serem incubadas durante a noite, 25μL de DEDE QUICK-PRECIP PLUS SOLUTION (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) foi adicionado, e as amostras de DNA digeridas foram precipitadas com isopropanol. A pelota de DNA precipitado foi re- suspenda em 15 μL de 1X de tampão de carregamento (0,01% de bromofenol azul, 10,0 mM de EDTA, 10,0% de glicerol, 1,0 mM de Tris pH 7,5). As amostras de DNA e marcadores de tamanho molecular foram então eletroforesados através de 0,85% de géis de agarose com 0,4X de tampão de TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 35 volts por aproximadamente 18-22 horas para alcançar separação de fragmento. Os géis foram manchados com brometo de etídio (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV).
[00138] Análise de Southern blot foi realizada essencialmente conforme descrito por Memelink, et al. (1994). Brevemente, em seguida à separação eletroforética e visualização dos fragmentos de DNA, os géis foram depurados com 0,25M de HCl por aproximadamente 20 minutos, e, em seguida, expostos a uma solução de desnaturação (0,4 M de NaOH, 1,5 M de NaC1) por aproximadamente 30 minutos, seguido por solução de neutralização (1,5 M de NaCl, 0,5 M Tris pH 7,5) por pelo menos 30 minutos. A transferência de Southern foi realizada durante a noite em membranas de náilon usando uma sistema de mecha com 10X SSC. Após transferência, o DNA foi ligado à membrana por reticulação de UV em seguida por lavagem brevemente da membrana com uma solução de 2X SSC. Este processo produziu membranas de Southern blot prontas para hibridização.
[00139] Os fragmentos de DNA ligados à membrana de náilon foram detectados usando uma sonda etiquetada (Tabela 6). As sondas foram geradas por incorporação á base de PCR de um nucleotídeo etiquetado com digoxigenin (DIG), [DIG-11]-dUTP, no fragmento de DNA amplificado de plasmídeo pDAB9582 usando iniciadores específicos para elementos de gene. A geração de sondas de DNA por síntese de PCR foi efetuada usando um Kit de Síntese de Sonda de PCR DIG (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante.
[00140] Sondas etiquetadas foram analisadas por eletroforese de gel de agarose para determinar sua qualidade e quantidade. Uma quantidade desejada de sonda etiquetada foi, em seguida, usada para hibridização ao -alvoDNA-alvo nas membranas de náilon para detecção dos fragmentos específicos usando os procedimentos essencialmente conforme descritos para DIG EASY HYB SOLUTION (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Brevemente, manchas da membrana de náilon contendo DNA fixado foram brevemente lavadas com 2X SSC e pré-hibridizadas com 20-25 mL de DIG EASY HYB SOLUTION pré- aquecida em garrafas de hibridização a aproximadamente 45-55°C por cerca de 2 horas em um forno de hibridização. A solução de pré- hibridização foi então decantada e substituída com ~15 mL de DIG EASY HYB SOLUTION pré-aquecida contendo uma quantidade desejada de sondas específicas desnaturadas por ebulição em um banho de água por aproximadamente cindo minutos. A etapa de hibridização foi então conduzida a aproximadamente 45-55°C durante a noite no forno de hibridização.
[00141] No final da hibridização da sonda, DIG EASY HYB SOLUTIONS contendo as sondas foram decantadas em tubos limpos e armazenadas a aproximadamente -20°C. Estas sondas podem ser reutilizadas até duas vezes de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. As manchas da membrana foram enxaguadas brevemente e lavadas duas vezes em recipientes plásticos limpos com tampão de lavagem, de baixa estringência (2X SSC, 0,1% de SDS) por aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por lavagem duas vezes com tampão de lavagem de alta estringência (0,1X SSC, 0,1% SDS) por 15 minutos cada a aproximadamente 65°C. As manchas da membrana brevemente lavadas com 1X de tampão de ácido maleico a partir do DIG WASH AND BLOCK BUFFER SET (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) por aproximadamente 5 minutos. Isto foi seguido por bloqueio em 1X de tampão de bloqueio por 2 horas e uma incubação com anticorpo anti-DIG-AP (fosfatase alcalina) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em 1X de tampão de bloqueio também por um mínimo de 30 minutos. Após 2-3 lavagens com 1X de tampão de lavagem, as sondas de DNA específicas permanecem ligadas às manchas de membrana e padrões de DNA etiquetados com DIG foram visualizados usando CDP-STAR CHEMILUMINESCENT NUCLEIC ACID DETECTION SYSTEM (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) seguido a recomendação do fabricante. As manchas foram expostas a película quiluminescente por um ou mais pontos de tempo para detectar hibridização de fragmentos e visualizar padrões de tamanho molecular. As películas foram desenvolvidas com um desenvolvedor de película ALL-PRO 100 PLUS (Konica Minolta, Osaka, jápan) e imagens foram escaneadas. O número e tamanhos de faixas detectadas foram documentados para dada sonda. DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER II (DIG MWM II) e DIG-LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER VII (DIG MWM VII), visíveis após detecção de DIG conforme descrito, foram usados para determinar hibridização de tamanho de fragmento nas manchas de Southern. Tabela 6. Localização e comprimento de sondas usadas em análise de Southern.
[00142] Os tamanhos de fragmento esperados e observados com uma digestão e sondas particulares, baseado nos locais de enzima de restrição conhecidos da PTU de cry1Ac e cry1F, são dados na Tabela 7. Dois tipos de fragmentos foram identificados destas digestões e hibridizações: fragmentos internos onde locais de enzima conhecidos flanqueiam a região de sonda e estão completamente contidos dentro da região de inserção da PTU cry1Ac e cry1F, e fragmentos de borda onde um local de enzima conhecido é localizado na extremidade da região de sonda, e um segundo local é esperado no genoma de feijão- soja. Os tamanhos do fragmento de borda variam pelo evento porque, em muitos casos, os locais de integração de fragmento de DNA são únicos para cada evento. Os fragmentos de borda proporcionam um meio para localizar um local de enzima de restrição relativo ao DNA integrado, e para avaliar o número de inserções de DNA. As análises de Southern blot completadas nas gerações múltiplas de feijão-soja contendo evento de soja pDAB9582.814.19.1 produzem dados que sugerem que uma cópia baixa, PTU intacta de cry1Ac e cry1F de plasmídeo pDAB9582, foi inserida no genoma de feijão-soja de evento de soja pDAB9582.814.19.1. Tabela 7. Fragmentos de hibridização prognosticados e observados em análise de Southern blot. 1. Tamanhos de fragmento esperados são baseados no mapa de plasmídeo de pDAB9582. 2. Tamanhos de fragmento observados são considerados aproximadamente destas análises e são baseados nos tamanhos indicados dos fragmentos DIG- LABELED DNA MOLECULAR WEIGHT MARKER II e MARK VII.
[00143] As enzimas de restrição AseI e NsiI ligam e clivam locais de restrição únicos em plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, estas enzimas foram selecionadas para caracterizarem o inserto de gene cry1Ac no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Fragmentos mais amplos de >7286 bp ou >9479 bp foram prognosticados para hibridizarem com a sonda em seguida às digestões de AseI e NsiI, respectivamente (Tabela 7). Faixas de hibridização de cry1Ac simples de cerca de 7400 e >10000 bp foram observadas quando digestões de AseI e NsiI foram usadas, respectivamente. A hibridização da sonda a faixas deste tamanho sugere a presença de um local simples de inserção para o gene de cry1Ac no genoma de feijão-soja de evento de soja pDAB9582.814.19.1. As enzimas de restrição NotI e ApaLI foram selecionadas para realizar uma digestão dupla e liberar um fragmento que contém a unidade de transcrição de planta de cry1Ac (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). Os 4550bp fragmentos prognosticados foram observados com a sonda em seguida à digestão dupla de NotI e ApaLIle. Os resultados obtidos com a digestão de enzima das amostras pDAB9582.814.19.1, seguidos pela hibridização de sonda, indicaram que uma PTU intacta de cry1Ac deplasmídeo pDAB9582 foi inserida no genoma de feijão-soja de evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00144] As enzimas de restrição NdeI e NsiI ligam e clivam locais de restrição em plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, estas enzimas foram selecionadas para caracterizar o inseto de gene cry1F no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Fragmentos de borda de > 5569 bp e > 9479 foram prognosticados para hibridizarem com a sonda em seguida ás digestões de NdeI e NsiI, respectivamente (Tabela 7). Faixas de hibridização de cry1F simples de ~7500 bp e >10000 bp foram observadas quando NdeI e NsiI foram usadas, respectivamente. A hibridização da sonda para faixas deste tamanho sugere a presença de um local simples de inserção para o gene cry1F no genoma de feijão- soja de evento de soja pDAB9582.814.19.1. Enzima de restrição, HindIII, foi selecionada pata liberar um fragmento que contém a unidade de transcrição de planta cry1F (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). O fragmento de 7732 bp prognosticado foi observado com a sonda em seguida às digestões de HindIII. Os resultados obtidos com a digestão da enzima das amostras pDAB9582.814.19.1 seguidos pela sonda hibridização, indicaram que um PTU de cry1F intacto de plasmídeo pDAB9582 foi inserido no genoma de feijão-soja de evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00145] Análise de Southern blot foi também conduzida para verificar a ausência do gene de resistência a espectinomicin (specR), elemento Ori Rep e proteína de iniciação de replicação trfA (trf elemento A) no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Nenhuma resistência específica a resistência a espectinomicin, elemento Ori Rep ou trf elemento A é esperada quando controles positivos apropriados (pDAB9582 adicionado a DNA genômico Maverick) e controles negativos (DNA genômico Maverick) são incluídos para análise de Southern. Em seguida á digestão de NsiI e hibridização com a sonda específica specR, uma faixa de tamanho esperada de 15320 bp foi observada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionado a DNA genômico Maverick). A sonda specR não hibridizou para amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.814.19.1. Similarmente, uma faixa de tamanho esperada de 15320 bp foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB9582 mais maverick), mas ausente das amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.814.19.1 após digestão de NsiI e hibridização com sonda trfA. Outra faixa de tamanho esperada de 5329 bp foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionado a DNA genômico Maverick), mas ausente das amostras do controle negativo e evento de soja pDAB9582.814.19.1 após digestão de NdeI e hibridização com sonda específica OriRep. Estes dados indicam a ausência de gene de resistência a espectinomicin, elemento Ori Rep e proteína de iniciação de replicação trfA no evento de soja pDAB9582.814.19.1.
[00146] Para testar as características agronômicas e eficácia de evento de soja pDAB9582.814.19.1, o evento foi plantado em um ensaio de eficácia em Santa Isabel, Porto Rico, em Outubro de 2010 e Fevereiro de 2011. O cultivar Maverick, que foi originalmente transformado para produzir evento pDAB9582.814.19.1, foi plantado em cada sementeira e incluído como um controle nos experimentos. A semente para a sementeira T3 foi derivada de seleções de planta simples no estágio T2, e semente para a sementeira T4 foi derivada de seleções de planta simples no estágio T3. Quatro linhagens do evento foram testadas em cada geração. Cada linhagem foi plantada em um lote que tem 4 séries amplas e 228,6 cm de comprimento (7,5 pés de comprimento). O espaçamento entre séries foi 30 polegadas. Os lotes foram crescidos sob luzes por aproximadamente 2,5 semanas para compensar o comprimento de dia curto em Porto Rico. Cada sementeira foi pulverizada com glufosinato a uma taxa de 411 g ae/ha. Um lote das plantas de controle, Maverick, foi pulverizado com a mesma taxa de glufosinato e um segundo lote foi não-pulverizado e usado como comparação de controle para o evento.
[00147] O dado foi coletado em emergência, aparência geral, vigor, altura, alojamento, e maturidade. A tolerância a herbicida foi avaliada por apreciação visualmente para clorose, necrose da folha e morte da planta (Tabela 8).
[00148] Para comparações de evento de soja pDAB9582.814.19.1 com Maverick, somente dados do bloco não-pulverizado de Maverick foram usados. Para comparação dos tratamentos pulverizado e não- pulverizado, os dados do evento de soja pDAB9582.814.19.1 do bloco pulverizado com um dado tratamento foram comparados com dados do bloco não-pulverizado de controle Maverick. O evento de soja pDAB9582.814.19.1 mostrou tolerância à aplicação de herbicida de glufosinato. Em contraste, nenhuma das plantas Maverick foi tolerante aos tratamentos com herbicida. Tabela 8. Comparação de evento de soja pDAB9582.814.19.1 a Maverick. Valores são classificados de sementeiras T3 e T4. Cada sementeira de evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi pulverizada com glufosinato no estágio V3 a uma taxa de 411 g ae/ha.
[00149] Avaliações de campo e de estufa foram conduzidas para caracterizar a atividade de Cry1Ac e Cry1F no evento de soja pDAB9582.814.19.1 contra pestes de feijão-soja de lab incluindo Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar), Pseudoplusia includens (looper de soja) e Spodoptera frugiperda (lagarta dos cereais). O evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi comparado contra variedade não- transformadas de feijão-soja Maverick, para determinar o nível de proteção de planta proporcionado pelas proteínas Cry1F e Cry1 Ac.
[00150] Ensaios de estufa foram conduzidos em plantas de aproximadamente quatro semanas de idade. Quinze plantas foram usadas para avaliar o evento de soja pDAB9582.814.19.1 e o controle Maverick. Para cada espécie de inseto testada (Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includes, e Spodoptera frugiperda), 3 punções de folha foram feitas de cada planta para um total de 45 discos de folha/planta/espécie de inseto. As punções de folha de 1,4 cm de diâmetro (ou 1,54 cm2) foram colocadas em uma arena de teste no topo de 2% de água agar, infestada com uma larva neonata e vedada com uma tampa plástica perfurada. A mortalidade e consumo de folha foram classificados 4 dias após infestação. As larvas que não foram responsivas a sondagem branda foram consideradas mortas. O dano da folha foi avaliado por classificação visualmente da percentagem de punção de folha consumida pelo inseto.
[00151] Avaliações de campo foram conduzidas por coleta de amostras de folha de lotes de sementeira de aumento de semente em Santa Isabel, Porto Rico, e enviando estas folhas para Indianapolis, IN, para teste. O lote de sementeira para evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi plantado em Fevereiro de 2011 e consistia de aproximadamente 180 plantas dispostas em quatro séries. Cada série tinha 2,3 m de comprimento e espaçada 76,2 cm; as plantas individuais foram espaçadas 5,1 cm dentro de cada série. Em março de 2011, uma folha trifoleada de haste principal totalmente expandida, localizada aproximadamente quatro nódulos abaixo do meristema, foi retirada de 10 plantas de evento de soja pDAB9582.814.19.1 e 10 plantas ‘Maverick’. As folhas foram colocadas em sacos plásticos etiquetados, (uma por saco) e vedadas. As folhas ensacadas foram acondicionadas e transferidas para o laboratório. No laboratório, um ou dois discos de folha de diâmetro de 3,33 cm (1,31 polegadas) foram puncionados de cada folha trifoliada para proporcionar um total de 16 discos de folha. Cada disco de folha foi colocado em uma arena de teste no topo de 2% agar, infestado com uma larva S. frugiperda neonata, e vedado com uma tampa plástica perfurada. Os discos de folha foram mantidos em um câmara de ambiente controlado por 7 dias, em cujo tempo a mortalidade e consumo de folha foram classificados. As larvas não responsivas a sondagem branda foram consideradas mortas. O dano da folha foi avaliado por classificação visualmente da percentagem de punção de folha consumido pelo inseto.
[00152] Os resultados obtidos destes experimentos replicados indicam que o evento de soja pDAB9582.814.19.1 sustenta significantemente dano mais baixo do que as plantas de controle Maverick para todos os insetos testados. Desse modo, o evento de soja pDAB9582.814.19.1 tem atividade inseticida sobre esta ampla faixa de hospedeiro.
[00153] SEQ ID NO:14 proporciona a sequência de evento de soja pDAB9582.814.19.1. Esta sequência contém a 5' sequência genômica de flanqueamento, o inserto de trançado-T de pDAB9582 e 3' sequências genômica de flanqueamento. Com relação a SEQ ID NO:14, resíduos 1-1400 são 5' sequência genômica de flanqueamento, resíduos 1401 - 1536 são resíduos de um re-arranjo a partir do plasmídeo pDAB9582 e 1537 - 13896 são resíduos do inserto de trançado-T pDAB9582, e resíduos 13897 - 15294 são 3' sequência de flanqueamento. A sequência de junção ou transição com relação a extremidade 5' do inserto, desse modo, ocorre nos resíduos 1400-1401 de SEQ ID NO:14. A sequência de junção ou transição com relação à extremidade 3' do inserto, desse modo, ocorre nos resíduos 13896 - 13897 de SEQ ID NO:14.
[00154] Deve ser notado que a progenia de evento de soja pDAB9582.814.19.1 pode ter sequências que se desviam levemente de SEQ ID NO:14. Durante o processo de introgressão e reprodução de introdução de evento de soja pDAB9582.814.19.1 no genoma de células de planta, não é incomum para algumas anulações ou outras alterações do inserto ocorrer. Além disso, erros na amplificação de PCR podem ocorrer, que podem resultar em erros menores de sequenciamento. Por exemplo, sequências de flanqueamento aqui listadas foram determinadas por geração de amplicons de DNAs genômicos de feijão- soja, e, em seguida, clonando e sequenciando os amplicons. Não é não- usual encontrar leves diferenças e menores discrepâncias em sequências geradas e determinadas dessa maneira, dadas as muitas etapas de amplificação que são necessárias para gerar bastante amplicon para sequenciamento de DNAs genômicos. Um técnico no assunto deve reconhecer e ser posto a noticiar que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros de sequenciamento comuns ou discrepâncias estão dentro do escopo da invenção objeto. Desse modo, o segmento relevante da sequência de plasmídeo aqui proporcionada pode compreender algumas variações menores. Desse modo, uma planta compreendendo um polinucleotídeo tendo alguma faixa de identidade com a sequência de inserto objeto está dentro do escopo da invenção objeto. A identidade para a sequência de SEQ ID NO:14 pode ser uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência exemplificada ou descrita aqui. Desse modo, algumas diferenças entre SEQ ID NO:14 e plantas de progenia de evento de soja pDAB9582.814.19.1 podem ser classificadas, e estão dentro do escopo da presente invenção.
[00155] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser aparente aos técnicos no assunto que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhe sem fugir de tais princípios. Nós reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações em anexo.
[00156] Todas as publicações e documentos de patente publicados citados neste relatório descritivo são incorporados aqui por referência à mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicados para serem incorporados por referência.
Claims (8)
1. Método de controle de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende expor os insetos a plantas de soja resistentes a inseto do evento 9582.814.19.1, conforme representado nas sementes depositadas no ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, as referidas plantas de soja compreendendo uma sequência de DNA consistindo em SEQ ID NO: 14.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referidos insetos são Pseudoplusia includens (looper de soja).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referidos insetos são Anticarsia gemmatalis (lagarta de soja aveludada).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referidos insetos são Spodoptera frugiperda (lagarta dos cereais).
5. Sequência de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que é diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1, conforme representado nas sementes depositadas no ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, em que a referida sequência de DNA consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em pb 1385-1415 de SEQ ID NO:1; pb 1350-1450 de SEQ ID NO:1; pb 1300-1500 de SEQ ID NO:1; pb 1200-1600 de SEQ ID NO:1; pb 137-168 de SEQ ID NO:2; pb 103-203 de SEQ ID NO:2; e pb 3-303 de SEQ ID NO:2.
6. Molécula de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que é diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1, conforme representado nas sementes depositadas no ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, em que a referida sequência de DNA consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 14.
7. DNA isolado, caracterizado pelo fato de que é diagnóstico para o evento de soja 9582.814.19.1, conforme representado nas sementes depositadas no ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, o referido DNA consistindo em uma sequência de SEQ ID NO: 14.
8. Método, caracterizado pelo fato de que é para o controle de pestes em grãos ou sementes de soja do evento 9582.814.19.1 conforme representado nas sementes depositadas no ATCC com o N° de Acesso PTA-12006, em que os referidos grãos ou sementes de soja compreendem uma sequência de DNA consistindo em SEQ ID NO: 14.
Applications Claiming Priority (4)
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