KR102031625B1 - 스태킹된 제초제 내성 이벤트 ８２６４.４４.０６.１, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부분적으로 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 관한 것이고, 글리포세이트, 아릴옥시알카노에이트, 및 글루포시네이트 제초제에 내성을 부여하는 다형 형질을 포함하는 신규 발현 카세트 및 트랜스제닉 삽입물을 포함한다. 또한, 본 발명은 부분적으로 내성 잡초, 식물 육종, 및 제초제 내성 식물의 방제 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이벤트 서열은 예를 들어 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-방지 단백질을 포함하는 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 또한, 본 발명은 부분적으로 대두에서 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 관련된 식물 재료의 검출을 위한 종말점 TaqMan PCR 분석에 관한 것이다. 일부 실시양태는 식물 재료의 고 출력 접합성 분석을 수행할 수 있고, 다른 실시양태는 본 발명의 이벤트를 포함하는 대두 계통의 접합성을 특이적으로 인식하고 육종하는 데 사용될 수 있다. 이러한 분석을 수행하는 데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.

Description

스태킹된 제초제 내성 이벤트 ８２６４.４４.０６.１, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 검출{STACKED HERBICIDE TOLERANCE EVENT 8264.44.06.1, RELATED TRANSGENIC SOYBEAN LINES, AND DETECTION THEREOF}
광범위 제초제인 글리포세이트(N-포스포노메틸글리신)는 식물 세포에서 필수 방향족 아미노산을 생성하는 시키메이트(shikimate) 생합성 경로 중의 효소인 5-엔올피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제(EPSPS)를 억제한다. EPSPS의 억제는 단백질 합성을 효과적으로 방해함으로써 병든 식물 세포를 사멸한다. 글리포세이트는 비선택성이므로, 잡초 및 농작물 둘 다를 사멸한다. 따라서, 농작물에 대해서는 당업자가 농작물을 글리포세이트 내성으로 개질하여 목적 식물이 글리포세이트 노출에도 생존하도록 하는 것이 유용하다.
재조합 DNA 기술은 글리포세이트-내성인 돌연변이 EPSP 신타아제를 단리하는 데에 사용되고 있다. 그러한 글리포세이트-내성 돌연변이 EPSP 신타아제는 식물 내로 형질전환되어 형질전환된 식물에 글리포세이트-내성을 부여한다. 예를 들어, 글리포세이트 내성 유전자는 미국 특허 제5,633,435호에 기재된 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 CP4로부터 단리하였다. 상기 문헌 및 본 명세서에 기재된 모든 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
기타 글리포세이트 내성 유전자는 돌연변이의 도입을 통해 생성되고 있다. 여기에는 Comai에 의해 단리되고 미국 특허 제5,094,945호, 제4,769,061호 및 제4,535,060호에 기재된 AroA 유전자가 포함된다. 미국 특허 제5,310,667호에 기재된 바와 같이 아미노산 위치 80과 120 사이의 글리신 잔기를 알라닌 잔기로 치환함으로써 단일 돌연변이가 이용되고 있다. 이중 돌연변이는 미국 특허 6,225,114 및 5,866,775에 기재되었으며, 여기에서는 상기 돌연변이에 더하여, 제2 돌연변이(위치 170과 210 사이의 알라닌 잔기 대신에 트레오닌 잔기)를 야생형 EPSPS 유전자에 도입하였다.
기타 작업은 진뱅크(GenBank) 기탁 번호 X63374에 의해 코딩된 아미노산 서열의 잔기 102(트레오닌을 이소류신으로 변경) 및 잔기 106(프롤린을 세린으로 변경)에 돌연변이를 갖는 변형 옥수수 EPSPS 유전자의 도입을 통해 글리포세이트 내성 옥수수의 생산을 가져왔다. 미국 특허 제6,566,587호 및 제6,040,497호 참조.
대두에서 글리포세이트에 내성을 제공하는 이벤트의 예로는 대두 계통 GTS 40-3-2 (Padgette et al. 1995), 대두 이벤트 MON89788 (미국 특허 제7,608,761호)을 들 수 있고, 미국 특허 제7,608,761호는 대두 이벤트 MON89788에 관한 것이며, 이들 각각은 대두에 cp4 epsps 유전자를 삽입함으로써 생성되었다.
글리포세이트 내성 수확(cropping) 시스템의 광범위한 채택 및 글리포세이트의 증가된 사용은 최근에 글리포세이트-내성 및 방제 곤란 잡초의 유행에 기여하였다. 재배자들이 글리포세이트 내성 잡초 또는 보다 방제 곤란 잡초 종으로의 전이에 직면하고 있는 지역에서, 재배자들은 놓친 잡초를 방제할 다른 제초제와 탱크 혼합하거나 교대 사용함으로써 글리포세이트의 약점을 보완할 수 있다.
많은 경우 활엽 식물의 방제를 위한 한 가지 인기 있고 효과적인 탱크믹스 조합은 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)이었다. 2,4-D는 60년 이상 제초제로서 사용되었으며, 옥수수, 대두 및 면의 몇몇 주요 잡초를 포함한 다수의 일년생, 이년생 및 다년생 활엽 잡초의 광범위 발아후 방제를 제공한다. 줄뿌림 작물에서 2,4-D에 의해 방제되는 주요 잡초(560 내지 1120 g ae/ha 비율)에는 암브로시아 아르테미시시폴리아(Ambrosia artemisiifolia), 암브로시아 트리피다(Ambrosia trifida), 크산티움 스트루마리움(Xanthium strumarium), 체노포디움 알붐(Chenopodium album), 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus), 이포모에아 종(Ipomoea sp.), 아부틸론 테오프라스티(Abutilon theophrasti), 코니자 카나덴시스(Conyza Canadensis), 및 세나 옵투시폴리아(Senna obtusifolia)를 들 수 있다. 2,4-D는 폴리고눔 펜실바나쿰(Polygonum pensylvanicum), 폴리고눔 페르시카리아(Polygonum persicaria), 시르시움 아르벤세(Cirsium arvense), 타락사쿰 오피시날레(Taraxacum officinale), 및 아마란투스 루디스(Amaranthus rudis) 및 아마란투스 팔메리(Amaranthus palmeri)를 비롯한 아마란투스 종(Amaranthus sp.)을 포함하는 몇몇 주요 잡초의 부분 방제를 제공한다.
2,4-D의 추가 사용에 대한 제한은 대두 또는 면 같은 쌍떡잎식물에서 그의 선택성이 매우 불량하다는 것이며, 이에 따라 2,4-D는 민감한 쌍떡잎식물에(및 일반적으로 그의 근방에) 사용하지 않는 것이 전형적이다. 또한, 목초에서 2,4-D의 사용은 발생할 수 있는 농작물 손상의 속성에 의해 다소 제한된다. 글리포세이트와 조합된 2,4-D는 무경운 대두 및 면의 재식 전에 보다 확실한 고사(burndown) 처리를 제공하기 위해 사용되고 있으나, 이들 쌍떡잎식물의 2,4-D에 대한 민감성으로 인해 이들 고사 처리는 적어도 재식 14 내지 30일 전에 실시하여야 한다(Agriliance, 2005).
2,4-D를 분해하는 능력에 대해 광범위하게 연구된 한 가지 유기체는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)이며, 이는 무기화작용(mineralization) 경로의 제1 단계를 촉매화하는 효소인 tfdA (Streber et al., 1987)를 코딩하는 유전자를 함유한다. (미국 특허 제6,153,401호 및 진뱅크 기탁 번호 M16730 참조). tfdA는 2,4-D를 분해하는 것으로 보고되었다(Smejkal et al., 2001). 분해로부터 얻어지는 생성물은 2,4-D에 비해 거의 또는 전혀 제초 활성을 갖지 않는다. tfdA는 트랜스제닉(transgenic) 식물에 사용되어, 보통 2,4-D에 대해 민감한 쌍떡잎식물(예를 들어, 면 및 담배)에 2,4-D 내성을 부여한다(Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993), 및 U.S. Pat. No. 5,608,147).
2,4-D를 분해할 수 있는 단백질을 코딩하는 다수의 tfdA-형 유전자가 환경으로부터 식별되었고 진뱅크 데이터베이스에 기탁되었다. 다수의 상동체가 tfdA와 유사하다(>85％ 아미노산 동일성). 그러나 tfdA에 대해 현저히 낮은 동일성(25 내지 50％)을 가지면서도 α-케토글루타레이트 디옥시게나아제 Fe (II) 디옥시게나아제와 관련된 특징적 잔기를 가지는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열이 있다.
tfdA에 대해 낮은 서열 동일성(<35％)을 갖는 2,4-D-분해 유전자의 예는 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans)로부터의 aad-12 유전자이다(미국 특허 출원 2011/0203017). aad-12 유전자는 2,4-D 및 MCPA와 같은 페녹시아세트산 제초제; 및 페녹시부탄산 제초제, 예를 들어 2,4-DB 및 MCPB 및 피리딜옥시알칸산 제초제(예를 들어, 트리클로피르 및 플루록시피르와 같은 피리딜옥시아세트산 제초제) 및 활성 성분(들)의 산, 염, 에스테르 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 페녹시 옥신 제초제에 대해 내성을 부여하기 위해 식물에 사용되고 있는 S-거울상체-특이적 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게아나제를 코딩한다. (예를 들어 WO 2007/053482 참조).
글루포시네이트-암모늄("글루포시네이트")은 포스피노트리신 계열 제초제 중의 비침투성(non-systemic), 비선택성 제초제이다. 광범위한 활엽 및 화본과 잡초(grassy weed)의 발아후 방제에 주로 사용되는, 글루포시네이트 중의 활성 성분인 L-포스피노트리신은 식물에서 암모니아 해독에 필요한 효소인 글루타민-신타아제의 비가역적 억제를 통해 잡초를 방제한다. 글루포시네이트 제초제는 예를 들어 Ignite®, BASTA 및 Liberty®라는 상표명으로 시판된다.
토양 박테리아 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 단리된 효소 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스퍼라아제(PAT)는 L-포스피노트리신의 아세틸화에 의한 그의 비활성 형태로의 전환을 촉매화한다. PAT를 발현하는 유전자의 식물-최적화 형태는 글루포시네이트 제초제에 대한 내성을 부여하기 위해 대두에 사용되고 있다. 그러한 글루포시네이트 내성 대두의 한 예는 이벤트 A5547-127이다. 가장 최근에는, 글루포시네이트-내성 형질과 조합된 글루포시네이트 제초제의 사용이 ALS- 및 글리포세이트 내성 잡초의 효과적 관리를 위한 비선택적 수단으로서 제안되었다.
식물에서의 이종성 또는 외래 유전자의 발현은 염색체에서 외래 유전자가 삽입되는 장소의 영향을 받는다. 이는, 예를 들어, 크로마틴 구조 (예를 들어, 헤테로크로마틴), 또는 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 근접성에 기인할 수 있다 (문헌 [Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988]). 동일한 유형의 트랜스제닉 식물 (또는 기타 유기체) 내의 동일한 유전자는 상이한 이벤트들 간에 발현 수준에서의 광범위한 변동을 나타낼 수 있다. 발현의 공간적 또는 시기적 패턴에서의 차이가 또한 있을 수 있다. 예를 들어, 다양한 식물 조직에서의 트랜스진(transgene)의 상대적인 발현에서의 차이가 도입된 유전자 구축물 내에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다.
따라서, 도입된 관심 유전자를 소정의 목적을 위해 만족스러운 수준으로 발현하는 이벤트를 확인하기 위하여 다수의 이벤트가 종종 생성되고 스크리닝된다. 상업적인 목적을 위해, 수백 개 내지 수천 개의 상이한 이벤트를 생성하고, 이러한 이벤트들을 원하는 트랜스진 발현 수준 및 패턴이 있는 단일 이벤트에 대해 스크리닝하는 것이 통상적이다. 원하는 수준 및/또는 패턴의 트랜스진 발현이 있는 이벤트는 통상적인 육종법을 사용하여 유성 이종교배(outcross)에 의해 트랜스진을 다른 유전학적 배경 내로 유전자이입(introgressing)시키는데 유용하다. 이같은 교배의 자손은 원래의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 지역적인 성장 조건에 대해 잘 적응한 다수의 품종에서의 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확실하게 하는데 사용된다.
본 발명은 부분적으로, 제초제-내성 기술의 유용성 보전을 돕는 잡초 내성의 효과적인 관리 수단을 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 잡촉 방제 옵션에서 높은 유연성 및 편리성을 재배자에게 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 부분적으로, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁 번호 PTA-11336로 기탁된 종자를 가지는 pDAB8264.44.06.1로 지정된 대두 (글리신 맥스(Glycine max)) 이벤트("이벤트 pDAB8264.44.06.1") 및 이로부터 유래된 자손에 관한 것이다. 본 발명은 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 대두 식물을 포함한다(또한 서열 1 및 서열 2를 포함하는 유전자 절편 중의 트랜스제닉 삽입물을 포함하는 대두 식물을 포함한다).
본 이벤트 및 기탁된 종자에 존재하는 트랜스제닉 삽입물은 3개의 제초제 내성 유전자, 즉, aad-12, 2mepsps 및 pat 유전자를 포함한다. 델프티아 아시도보란스로부터 유도된 aad-12 유전자는 예를 들어 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 피리딜옥시아세테이트 제조체에 내성을 부여하는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나아제(AAD-12) 단백질을 코딩한다. 옥수수에서 단리된 변형된 EPSPS 서열인 2mepsps 유전자는 글리포세이트 제초제에 내성을 부여하는 단백질을 생성한다. 토양 박테리아 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스로부터의 pat 유전자는 제초제 글루포시네이트에 내성을 부여한다.
본 발명의 다른 측면은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1를 포함하는 자손 식물, 대두, 종자, 및/또는 식물 및 종자 및 자손의 재생가능한 부분 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것으로부터 제조된 식품 또는 사료 제품을 포함한다. 본 발명은 또한 꽃가루, 배주, 꽃, 출아물(shoot), 뿌리, 잎, 및 식물 세포, 꽃가루 세포 및 기타 식물 세포의 핵을 포함하지만 이에 한정되지 않는 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 식물 부분 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 다른 식물 세포를 또한 포함한다. 본 발명은 또한 페녹시아세트산 제초제, 페녹시부탄산 제초제, 피리딜옥시알칸산 제초제, 글리포세이트, 및/또는 글루포시네이트를 포함하는 다수의 제초제에 대해 내성을 갖는 대두 식물에 관한 것이다. 그러한 대두 식물은 또한 디캄바, 이미다졸리논 및 HPPD 제초제를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 다른 비선택성 및 선택성 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자와 스태킹될 수 있다. 본 발명은 또한 신규 유전자 조성물 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 대두 식물의 작물학적 성능의 측면을 포함한다.
본 발명은, 부분적으로, 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 대두 세포 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대두 식물에서의 신규 형질전환 이벤트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드는 예를 들어 작물학적 형질 및/또는 곤충-억제 단백질을 포함하는 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 단일 이벤트가 있는 식물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 제초제 내성 이벤트는 곤충 내성 이벤트와 함께 육종 스택에 조합될 수 있다. 이들 실시양태의 일부에서, 곤충 내성 이벤트는 cry1F 유전자 및 cry1Ac 유전자를 포함한다. 대두 이벤트 9582.812.9.1("812 이벤트") 및 대두 이벤트 9582.814.19.1("814 이벤트")을 포함한, 일부 그러한 이벤트 및 스택은 구체적으로 본 명세서에 예시된다. 예를 들어 본 이벤트들의 임의의 조합을 포함하는 식물, 식물 세포, 및 종자가 본 발명에 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 아래에 보다 상세히 논의되는 바와 같이 대두 이벤트 9582.812.9.1('812 이벤트)를 단독으로 포함한다.
추가의 형질이, 예를 들어 식물 육종, 이벤트 DAS-8264.44.06.1을 함유하는 트랜스제닉 식물의 재형질전환 또는 상동 재조합을 통해 표적화 통합을 통한 새로운 형질의 추가를 통해, 식물 게놈에, 또는 pDAB8264.44.06.1과 동일 유전자좌(locus)에 스태킹될 수 있다.
다른 실시양태는 트랜스제닉 삽입물 및/또는 이벤트 DAS-8264.44.06.1의 플랭킹 서열의 일부 또는 전부의 절제를 포함한다. 절제 후, 또다른 및/또는 추가의 삽입물을 이벤트 DAS-8264.44.06.1의 특이적 염색체 부위에 표적화할 수 있다. 예시된 삽입물은 교체되거나, 또는 추가의 삽입물(들)이 이러한 방식으로 예시된 본 대두 이벤트의 예시된 삽입물과 스태킹될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염색체 6에 위치하는 대두 염색체 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 부위는 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대두 염색체 표적 부위는 서열 1 및 서열 2에 제시된 게놈 플랭킹 서열들 사이 또는 내부에 위치한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 염색체 6의 위치에 이종 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물의 제조 방법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이종 핵산은 본 명세서에 기재된 다양한 예시된 폴리뉴클레오티드 절편의 근방 또는 사이의 염색체 6에 삽입된다.
추가적으로, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 대두) 내의 당해 이벤트의 존재를 검출하기 위한 검정법을 제공한다. 이러한 검정법은 대두 게놈 내로 삽입된 재조합 구축물의 DNA 서열, 및 삽입 부위에 플랭킹(flanking)된 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 이러한 검정법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.
따라서, 본 발명은, 부분적으로, 전체 예시된 삽입물, 및 이의 경계 영역 (트랜스제닉 대두 계통 내)의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이러한 서열들은 독특하다. 이러한 삽입물 및 경계 (및 접합) 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머들이 존재할 수 있고 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘(amplicon)의 분석에 의해 이러한 이벤트를 확인할 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 본 발명의 이벤트를 포함하는 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 부분적으로, 이벤트 8264.44.06.1의 검출을 위한 실시간 또는 종점 TaqMan PCR 검정에 관한 것이다. 일부 실시양태는 고처리량 접합성(zygosity) 분석이 가능한 분석에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부분적으로, 접합성 측정에 사용하기 위한 GMFL01-25-J19 (진뱅크: AK286292.1) 기준 유전자의 용도에 관한 것이다. 이들 및 다른 관련된 절차는 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 접합성 및 이 이벤트를 포함하는 육종 대두 계통을 독특하게 식별하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 pDAB8264의 플라스미드 지도이다.
도 2는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 프라이머 위치를 도시하는 개략도이다.
도 3은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 프라이머 위치 및 게놈 DNA 결실을 도시하는 개략도이다.
도 4는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 TaqMan 검정 검출을 위한 프라이머 위치를 도시하는 개략도이다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 본 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 5'-플랭킹 경계 서열을 제공한다.
서열 2는 본 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 3'-플랭킹 경계 서열을 제공한다.
서열 3은 프라이머 4406_WF1을 제공한다.
서열 4는 프라이머 4406_WF2를 제공한다.
서열 5는 프라이머 4406_WF3을 제공한다.
서열 6은 프라이머 4406_WF4를 제공한다.
서열 7은 프라이머 4406_WR5를 제공한다.
서열 8은 프라이머 4406_WR6을 제공한다.
서열 9는 프라이머 4406_WR7을 제공한다.
서열 10은 프라이머 4406_WR8을 제공한다.
서열 11은 프라이머 ED_v1_C1을 제공한다.
서열 12는 프라이머 PAT_12를 제공한다.
서열 13은 플라스미드pDAB8264에 대한 서열을 제공한다.
서열 14는 부분적인 5' 대두 게놈 플랭킹 및 부분적인 5' 삽입 서열을 제공한다.
서열 15는 부분적인 3' 대두 게놈 플랭킹 및 부분적인 3' 삽입 서열을 제공한다.
서열 16은 5' 통합 접합부에 걸쳐 있는 98개의 염기쌍 서열을 제공한다.
서열 17은 3' 통합 접합부에 걸쳐 있는 131개의 염기쌍 서열을 제공한다.
서열 18은 프라이머 4406_5'F를 제공한다.
서열 19는 프라이머 4406_5'R을 제공한다.
서열 20은 프로브 4406_5'P를 제공한다.
서열 21은 프라이머 4406_3'F를 제공한다.
서열 22는 프라이머 4406_3'R을 제공한다.
서열 23은 프로브 4406_3'P를 제공한다.
서열 24는 프라이머 GMS116F를 제공한다.
서열 25는 프라이머 GMS116R을 제공한다.
서열 26은 프로브 GMS116 프로브를 제공한다.
서열 27은 5' 게놈 플랭킹 서열, 삽입물, 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함하는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 서열을 제공한다.
서열 28은 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582 T-스트랜드 삽입물, 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함한 대두 이벤트 9582.812.9.1의 예상 서열을 제공한다.
서열 29는 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582 T-스트랜드 삽입물, 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함한 대두 이벤트 9582.814.19.1의 예상 서열을 제공한다.
본원에 기재된 본 발명은, 대두 세포 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된 다중 제초제 내성 유전자의 발현용 카세트를 포함하는 대두 식물(대두)의 신규 형질전환 이벤트를 포함한다.
이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 예시된 트랜스제닉 삽입물은 하기 3종의 상이한 제초제 내성 유전자의 발현을 위한 유전적 요소를 포함한다: (1) 합성 aad-12 유전자; (2) 야생형 EPSPS 폴리펩티드와 비교해 아미노산 잔기 102 (트레오닌에서 이소루신으로) 및 106 (프롤린에서 세린으로)에 돌연변이를 포함하고 글리포세이트 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 단백질을 코딩하는 옥수수로부터의 EPSPS 서열; 및 (3) 글루포시네이트 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 pat 유전자. aad-12 유전자는 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans)로부터 유래되고, 활성 성분들의 산, 염 또는 에스테르 형태를 포함하는 페녹시알카노에이트 제초제(예, 페녹시아세트산 제초제, 예 2,4-D 및 MCPA; 페녹시프로피온산 제초제, 예 디클로르프롭, 메코프롭 및 그의 거울상이성질체; 및 페녹시부탄산 제초제, 예 2,4-DB 및 MCPB) 및 피리딜옥시알칸산 제초제(예, 피리딜옥시아세트산 제초제, 예 트리클로피르 및 플루옥시피르)를 비롯한, α-케토글루타레이트 잔기를 갖는 제초제를 갖는 제초제를 불활성화할 수 있는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제(AAD-12) 단백질 효소를 코딩한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은, 부분적으로, 트랜스제닉 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1, 이러한 이벤트를 포함하는 식물 계통, 및 이러한 삽입물 및/또는 이의 경계 영역의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 본원에서 개시 및 제안된 서열들을 사용하여 본 발명의 식물 계통을 검출할 수 있다.
본 발명은, 부분적으로, 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 다른 형질(예컨대 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 코딩하는 유전자(들) 또는 억제 RNA 서열)과 "스태킹"될 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 단일 이벤트를 갖는 식물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제초제 내성 이벤트는 곤충 저항성 이벤트와의 육종 스태킹하여 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 곤충 저항성 이벤트는 각각 cry1F 유전자 및 cry1Ac 유전자를 포함하는 812 이벤트 및 814 이벤트(하기에 더 상세히 정의됨)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예컨대, 상기 이벤트의 임의의 조합을 포함하는 식물, 식물 세포 및 종자도 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 특정 실시양태에서 신규 812 이벤트를 단독으로, 또한 예를 들어 식물, 식물 세포 및 종자를 포함한다.
2011년 4월 5일 출원된 미국 가출원 제61/471,845호는, 부분적으로 대두 이벤트 9582.812.9.1(812 이벤트)을 포함하는 대두 계통에 관한 것이다. 상기 이벤트를 포함하는 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었고, 일반인이 제한 없이 (그러나 특허권에 따라) 이를 입수할 수 있다. ATCC 기탁 번호 PTA-11602로 지정되고 2011년 1월 20일에 기탁되었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다.
미국 가출원 제61/511,664호(2011년 7월 26일 출원) 및 제61/521,798호(2011년 8월 10일 출원)은 부분적으로 대두 이벤트 9582.814.19.1(814 이벤트)을 포함하는 대두 계통에 관한 것이다. 상기 이벤트를 포함하는 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었다. 이 기탁물 ATCC 기탁 번호 PTA-12006은 ATCC에 2011년 7월 21에 접수되었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다.
또한, 본 발명은 서열 27(이벤트 pDAB8264.44.06.1; 4406 이벤트), 서열 28 (812 이벤트), 및/또는 서열 29(814 이벤트), 및 상기 서열과의 동일성이 예를 들어 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 상기 서열의 변이체를 포함하는 식물, 종자 및 식물 세포를 포함한다. 식물 게놈 내에 삽입 서열이 통합된 후 일부의 변이(예, 일부 절편의 결실)의 발생은 일반적이다. 이는 예컨대, 실시예 7에 보다 상세히 논의되어 있다.
또한, 본 발명은 샘플 내의 당해 이벤트의 존재를 검출하기 위한 검정법을 제공한다. 본 발명의 측면은 본원에서 예시 또는 제안된 임의의 진단적 핵산 분자, 특히 당해 플랭킹 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 기초로 하는 것들을 디자인 및/또는 생산하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 예시 또는 설명된 폴리뉴클레오티드 절편(예, 서열 1, 서열 2 및/또는, 예컨대 도 2에 도시된 그 사이의 삽입물)을 분할하여 추후에 추가의 폴리뉴클레오티드 서열과 재표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제초제-내성 대두 계통, 및 이의 확인에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로, 유성 교배의 자손이 관심 이벤트를 함유하는지 여부를 결정하기 위해 당해 이벤트의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 또한, 예를 들어, 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들어, 재조합 농작물로부터 유래된 식품의 시판전 승인 및 표지를 필요로 하는 규정을 따르기 위해 포함되고 이에 유용하다. 임의의 주지된 핵산 검출 방법, 예컨대 핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 당해 이벤트의 존재를 검출할 수 있다. 이벤트-특이적 PCR 검정법이 여기서 논의된다. (예를 들어, 또 다른 예로 문헌 [Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999] 참조). 이들 예의 일부는 삽입물과 플랭킹 DNA 사이의 접합부에 스패닝(spanning)하는 프라이머 세트를 사용하는 것에 관한 것이었다. 더욱 구체적으로, 1개의 프라이머는 삽입물로부터의 서열을 포함하였고, 제2 프라이머는 플랭킹 DNA로부터의 서열을 포함하였다.
본원에서는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1, 세대 간에 대두 식물에서의 안정성 및 발현에 관련한 그의 선택 및 특성화가 예시된다. 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 양측 플랭킹 서열이 본원에서 서열 1 및 서열 2로 서열분석되고 기술되었다. 이벤트 특이적 검정법이 개발되었다. 또한, 대두 게놈(대두 염색체 6) 상에 맵핑되었다. 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 육종 및 혼성 대두 계통에서 페녹시 옥신, 글리포세이트 및 글루시네이트에 대한 내성을 부여하는 우량 품종에 도입할 수 있다.
당해 EPSPS 유전자는 돌연변이체 5-에놀피루빌-3-포스포쉬키믹 산 합성효소 (EPSPS)를 코딩한다. 야생형 EPSPS 유전자는 지아 메이즈(Zea mays)로부터 원래 단리되었고 그 서열은 GenBank 기탁 번호 X63374로 기탁되었다. 또한, 미국 특허 제6,566,587호 (특히, 문헌 중 서열 3) 참조.
식물체에서 이종 유전자의 높은 발현율을 달성하기 위해서는, 유전자가 식물 세포에서 보다 효율적으로 발현되도록 상기 유전자를 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 야생형 식물 EPSPS 뉴클레오티드 서열을 변형하면 식물 세포에서 발현될 때 그러한 저항성을 제공할 수 있다. 상기 특허 '587호에 기재된 바와 같이, EPSPS 폴리펩티드를 야생형 폴리펩티드와 비교할 때, 이 단백질의 잔기 102에서 트레오닌을 이소루신으로 위치 106에서 프롤린을 세린으로 치환하도록 변형하면 결과는 당해 삽입물에 사용된 이중 돌연변이체 EPSPS 폴리펩티드(2mEPSPS)이다. 이는 식물 세포에서 발현될 때 글리포세이트에 대한 내성을 제공한다. "2mepsps 유전자" 또는 DMMG로도 지칭되는 당해 EPSPS 유전자는 쌍떡잎 식물 및 홑떡잎 식물 둘 다에서 발현이 개선되고 특히 대두에서 발현이 개선되도록 최적화될 수 있다. 홑떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 용법 둘 다에 대한 바이어스를 갖는 코돈에 의해 단백질이 코딩되도록 바람직한 헤미코트 코돈 용법에 기반하여 코돈 용법을 선택, 즉 재설계할 수 있다. 불량 서열 및 우량 제한 부위를 제거하여 2mepsps 코딩 서열의 전사/번역의 효율을 증가시키고 DNA 조작 단계를 용이하게 할 수 있다. 당해 모노코트 유전자의 헤미코트-최적화 버젼은 제목 "OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS"의 미국 출원 제13/303,502호 (2011년 11월 23일 출원, 2010년 12월 3일 우선권 주장)에 더 상세히 개시되어 있다.
본원에서 앞서 언급된 바와 같이, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 도입 및 통합은 일부 무작위 이벤트를 수반한다 (따라서 발현되는 소정의 삽입에 대한 명칭 "이벤트"). 즉, 다수의 형질전환 기술 예컨대 아그로박테리움 형질전환, "유전자 총", 및 위스커스(WHISKERS)로는, 게놈 내의 어느 곳에 트랜스진이 사입될지가 예측불가능하다. 따라서, 삽입물의 양쪽 측면 상의 플랭킹된 식물 게놈 DNA를 확인하는 것이 소정의 삽입 이벤트가 있는 식물을 확인하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 삽입물과 숙주 게놈의 접합부 영역에 걸쳐 PCR 앰플리콘을 생성시키는 PCR 프라이머들을 디자인할 수 있다. 이러한 PCR 앰플리콘을 독특하거나 명료한 유형의 삽입 이벤트를 확인하는데 사용할 수 있다.
삽입물을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 과정 동안, 삽입물 및/또는 게놈의 플랭킹 서열의 일부 결실 또는 기타 변경이 일어나는 것이 드물지 않다. 따라서, 본원에서 제공되는 플라스미드 서열의 관련 절편은 약간의 미미한 변이를 변동을 포함할 수 있다. 이는 본원에서 제공되는 플랭킹 서열에 대해서도 그러하다. 따라서, 당해 플랭킹 및/또는 삽입물 서열과의 일부 범위의 동일성이 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물은 본 발명의 범주 내에 속한다. 본 발명의 서열에 대한 동일성은 본원에 예시 또는 기술된 서열과의 서열 동일성이 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상인 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같은 혼성화 및 혼성화 조건은 본 발명의 이같은 식물 및 폴리뉴클레오티드 서열을 정의하는데 또한 사용될 수 있다. 기탁된 종자와 관련하여 플랭킹 서열들 + 전체 삽입물 서열을 포함하는 서열을 확인할 수 있다.
"이벤트"가 본래 무작위 이벤트이기 때문에, 본 개시내용의 일부로서, 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 대두 계통의 2500개 이상의 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었고, 일반인이 제한 없이 (그러나 특허권에 따라) 이를 입수할 수 있다. 기탁물은 ATCC 기탁 번호 PTA-11336으로 지정되었다. 2010년 9월 14일에 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC) 및 M.S. Technologies, Inc에 의해 글리신 맥스 종자 ("대두 종자 글리신 맥스 엘.: 이벤트 pDAB8264.44.06.1")의 패킷 100개 (패킷 당 종자 25개)가 기탁되었다. 기탁물을 2010년 10월 4일에 테스트하였고, 테스트한 날에 종자들이 생육성이었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다. 기탁물은 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 30년, 또는 가장 최근의 요청 후 5년의 기간 동안, 또는 특허 유효 기간 동안 (어느 쪽이든 더 긴 것), 제한 없이 유지될 것이고, 이러한 기간 동안 생육성이지 않게 되면 교체될 것이다.
본 개시내용의 일부로서, 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1(당해 제초제 내성 이벤트 및 812 곤충 저항성 이벤트)을 포함하는 대두 계통의 2500개 이상의 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었고, 일반인이 제한 없이 (그러나 특허권에 따라) 이를 입수할 수 있다. 기탁물은 ATCC에 의해 "지정명: pDAB9582.812.9.1:: 이벤트 pDAB8264.44.06.1"로 식별되었다. 2011년 11월 18일에 글리신 맥스 종자 ("대두 종자 글리신 맥스 엘.: 이벤트 pDAB8264.44.06.1")의 패킷 100개 (패킷 당 종자 25개)가 기탁되었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다. 기탁물은 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 30년, 또는 가장 최근의 요청 후 5년의 기간 동안, 또는 특허 유효 기간 동안 (어느 쪽이든 더 긴 것), 제한 없이 유지될 것이고, 이러한 기간 동안 생육성이지 않게 되면 교체될 것이다.
기탁된 종자는 본 발명의 일부분이다. 명백하게, 대두 식물이 이러한 종자로부터 성장될 수 있고, 이같은 식물은 본 발명의 일부분이다. 또한 본 발명은 이러한 식물 및 이의 자손을 검출하는데 유용한 이러한 대두 식물 내에 함유된 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 검출 방법 및 키트는, 테스트의 궁극적인 목적에 따라, 이러한 이벤트들 중 임의의 하나, 2개, 또는 심지어 3개 모두를 확인하는 것에 지시될 수 있다.
본 발명을 기술하는 것을 돕고 본 발명을 실행하도록 당업자에게 지침이 되기 위해 정의 및 예가 본원에서 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 당업자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 기재된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명명법이 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "자손"은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 어버이 식물의 임의 세대의 후손을 의미한다.
트랜스제닉 "이벤트"는 이종성 DNA, 즉 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물로의 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 삽입으로부터 초래되는 식물 집단의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선별에 의해 생산된다. 용어 "이벤트"는 이러한 이종성 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 이러한 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 품종과 형질전환체 간의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친(recurrent parent)으로의 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 어버이로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 동일한 염색체 위치에서 교배 자손 내에 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA를 포함하는 한 어버이 계통 (예를 들어, 본래의 형질전환체 및 자가생식(selfing)으로부터 초래된 자손)과 삽입된 DNA를 함유하지 않는 어버이 계통의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA에 바로 인접하는 플랭킹 게놈 서열 및 삽입된 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 이의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭한다.
"접합부 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점에 플랭킹된 대두 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 스패닝되고, 식물의 유전 물질 내의 한 접합부 또는 다른 접합부 서열의 확인 또는 검출은 이벤트에 대해 진단적이기에 충분하다. 본원에 기술된 대두 이벤트에서의 삽입물 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA에 스패닝되는 DNA 서열이 포함된다. 이같은 진단적 서열의 구체적인 예가 본원에서 제공된다; 그러나, 삽입물의 접합부, 또는 게놈 서열 및 삽입물의 접합부에 중첩되는 기타 서열이 또한 진단적이고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 부분적으로 이같은 플랭킹 서열, 접합부 서열 및 삽입물 서열의 확인에 관한 것이다. 관련된 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따라, 삽입된 DNA 및 이의 경계에 걸쳐 스패닝되는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석 방법이 당해 독점 트랜스제닉 대두 계통으로부터 유래된 상업화된 트랜스제닉 대두 품종 또는 계통을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있다.
2원 플라스미드 pDAB8264(서열 13)는 도 1에 기재된 유전적 요소를 포함한다. 하기의 유전적 요소((T-가닥 경계 서열은 포함되지 않음)는 pDAB8264의 T-가닥 영역에 포함된다. 표 1에, 본원에 개시된 서열 13에 관련하여 유전자 요소의 잔기 번호가 제공되어 있다.
Figure 112013059698409-pct00001
서열 14 및 서열 15는 각각, 하기에 보다 상세히 개시되는 삽입 서열의 5' 및 3' 부분과 함께 5' 및 3' 플랭킹 서열이며, 따라서 삽입물 및 게놈 DNA의 5' 및 3' "접합부" 또는 "전이부" 서열을 포함한다. 서열 14에 관련하여, 잔기 1 내지 570은 5' 게놈 플랭킹 서열이고, 잔기 571 내지 859는 삽입물의 5' 말단의 잔기이다. 서열 15에 관련하여, 잔기 1 내지 220은 삽입물의 3' 말단의 잔기이고 잔기 221 내지 1719는 3' 게놈 플랭킹 서열이다. 따라서, 삽입물의 5' 말단에 대한 접합부 서열 또는 전이부는 서열 14의 잔기 570 내지 571에 존재한다. 따라서, 삽입물의 3' 말단에 대한 접합부 서열 또는 전이부는 서열 15의 잔기 220 내지 221에 존재한다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들여 5, 10, 20, 50, 100, 150, 또는 200개, 또는 그 이상 및 그 사이의 증가분을 접합부 서열의 양측에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 접합부 서열을 스패닝하는 프라이머는 예를 들어 플랭킹 서열과 혼성화할 수 있는 5 내지 10개 염기 및 삽입물 서열과 혼성화할 수 있는 5 내지 10개 염기를 포함할 수 있다. 프로브 및 앰플리콘도 흔히 프라이머보다는 길지만 유사하게 설계할 수 있다.
이러한 서열 (특히, 플랭킹 서열)은 독특하다. 이러한 삽입물 및 플랭킹 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이러한 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들로 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 본원에서 확인된 서열들은 독특하다.
본 발명의 검출 기술은, 식물 육종과 관련하여, 관심 이벤트를 포함하는 어버이 식물이 하나 이상의 추가적인 관심 형질을 자손 내에 부여하기 위한 시도로 또 다른 식물 계통과 교배된 후에 어떤 자손 식물이 소정의 이벤트를 포함하는지 여부를 결정하는데 특히 유용하다. 이러한 PCR 분석 방법은, 특히 상업화된 트랜스제닉 대두 종자에 대해, 대두 육종 프로그램, 뿐만 아니라 품질 제어에 이롭다. 이러한 트랜스제닉 대두 계통에 대한 PCR 검출 키트가 또한 이제 제조 및 사용될 수 있다. 이는 제품 등록 및 제품 책임관리에 또한 이로울 수 있다.
추가로, 플랭킹 대두/게놈 서열을 각각의 삽입물의 게놈 위치를 구체적으로 확인하는데 사용할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 각각의 이벤트에 대해 특이적인 분자 마커 시스템을 제조할 수 있다. 이는 가속 육종 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는데 사용될 수 있다.
추가로, 플랭킹 서열 정보를 트랜스진 통합 프로세스, 게놈 통합 부위 특성, 이벤트 분류, 트랜스진 및 이의 플랭킹 서열의 안정성, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵, 트랜스진 메틸화 패턴, 위치 효과, 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등과 관련됨)을 연구 및 특성화하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 개시내용의 견지에서, 본 발명이 ATCC 기탁 번호 PTA-11336 하에 입수가능한 종자를 포함한다는 것이 명백하여야 한다. 본 발명은 접속 번호 PTA-11336 하에 ATCC에 기탁된 종자로부터 성장된 제초제-내성 대두 식물을 또한 포함한다. 본 발명은 상기 식물의 일부분, 예컨대, 잎, 조직 샘플, 상기 식물에 의해 생산된 종자, 꽃가루 등(서열 1 및 서열 2에 의해 플랭킹된 트랜스제닉 삽입물을 포함함)을 추가로 포함한다.
추가로, 본 발명은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 후손 및/또는 자손 식물, 바람직하게는 제초제-저항성 대두 식물을 포함하고, 이때 상기 식물에는 본원에 기술된 바와 같은 검출가능한 야생형 게놈 DNA/삽입물 DNA 접합부 서열을 포함하는 게놈이 있다. 본원에서 사용된 용어 "대두"는 글리신 맥스를 의미하고, 대두 식물과 육종될 수 있는 이의 모든 품종을 포함한다.
추가로 본 발명은 본 발명의 식물을 하나 이상의 어버이로 사용하여 교배물을 제조하는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 예시된 식물들 중 임의의 것이 어버이 중 하나 또는 양쪽 어버이인 F1 잡종 식물을 포함한다. 이같은 본 발명의 F1 잡종에 의해 생산된 종자가 본 발명에 또한 속한다. 본 발명은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근교배(in-bred) 어버이) 식물과 교배시키고, 생성된 잡종 종자를 수확함으로써 F1 잡종 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 모친 또는 부친인 예시된 식물을 포함한다. 생성된 식물의 특성이 어버이 식물들의 신중한 고려에 의해 개선될 수 있다.
먼저 본원에서 언급된 계통들 중 임의의 하나의 종자로부터 성장된 대두 식물로 구성되는 제1 어버이 대두 식물과 제2 어버이 대두 식물을 유성 교배시킴으로써 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제초제에 대해 저항성인 (또는 본 발명의 이벤트 중 하나 이상을 보유하는) 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 제1 자손 식물을 자가생식시킴으로써 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제2 자손 식물로부터 제초제에 대해 저항성인 (또는 본 발명의 이벤트들 중 하나 이상을 보유하는) 식물을 선별하는 단계에 의해 본 발명의 제초제-내성 대두 식물이 육종될 수 있다. 이러한 단계들은 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물의 제2 어버이 대두 식물 또는 제3 어버이 대두 식물로의 역-교배를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 본 발명의 대두 종자를 포함하는 대두 작물, 또는 이의 자손을 재식할 수 있다.
독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 후손을 생산하도록 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 또한 짝짓기될 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 적합한 자손의 자가생식으로 첨가된 양쪽 외인성 유전자에 대해 동종접합성인 식물이 생산될 수 있다. 어버이 식물로의 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배가 또한 구상되고, 무성 번식이 또한 구상된다. 상이한 형질 및 작물에 통상적으로 사용되는 기타 육종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 단순하게 유전되는 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동종 접합성 재배종 또는 근교배 계통 내로 전달하는데 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 도너(donor) 어버이로 칭해진다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 도너 어버이의 표현형을 보유하는 개체를 선별하고, 반복적으로 반복친에 교배 (역교배)시킨다. 생성된 어버이는 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다.
마커 보조 육종 (MAB) 방법에서 본 발명의 DNA 분자가 분자 마커로서 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은, 유전적으로 연관된 농학적으로 유용한 형질들을 확인하는 방법 (예컨대, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)에서 본 발명의 DNA 분자가 사용될 수 있다. MAB 방법을 사용하여 본 발명의 대두 식물과의 교배의 자손 (또는 이의 자손 및 임의의 기타 대두 재배종 또는 품종)에서 제초제-저항성 형질을 추적할 수 있다. DNA 분자가 이러한 형질에 대한 마커이고, 당업계에 주지되어 있는 MAB 방법을 사용하여 하나 이상의 본 발명의 대두 계통, 또는 이의 자손이 어버이 또는 선조인 대두 식물에서 제초제-저항성 형질(들)을 추적할 수 있다. 당해 이벤트가 있는 임의의 대두 품종을 확인하는데 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 대두 재배종에 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 유전자이입하는 것을 포함하는 제초제-내성 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 방법은 2개의 본 발명의 식물, 또는 1개의 본 발명의 식물과 임의의 다른 식물을 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트에 대해 자손을 분석함으로써 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 다른 바람직한 형질, 예컨대 본원에서 다양한 실시예에서 테스트된 것들과 같은 작물학적 형질을 포함하는 식물과의 육종 사이클 동안 당해 이벤트를 추적하는데 본 발명이 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 이벤트 및 원하는 형질을 포함하는 식물을 검출하고, 확인하고, 선별하여, 추가적인 육종 라운드에서 신속하게 사용할 수 있다. 당해 이벤트/형질이 또한 육종 동안 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가적인 제초제 내성 형질과 조합될 수 있고, 이와 함께 본 발명에 따라 추적될 수 있다. 후자의 바람직한 실시양태는 제초제 디캄바에 대한 저항성을 코딩하는 유전자와 조합된 당해 이벤트를 포함하는 식물이다.
따라서, 본 발명이, 예를 들어, 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 박테리아 글리포세이트 옥시다제(GOX)), 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제(GAT)를 코딩하는 추가의 형질, 글루포시네이트 저항성에 대한 추가의 형질(예를 들어, 비알라포스 저항성(bar)), 아세토락테이트 신테이스(synthase) (ALS)-억제 제초제 저항성(예를 들어, 이미다졸리논 [예컨대 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 기타 화학물질 [Csr1, SurA 등])을 부여하는 형질, 브로목시닐 저항성 형질(예를 들어, Bxn), 디캄바 제초제 저항성에 대한 형질(예, 미국 제2003/0135879호 참조), HPPD(4-히드록시페닐-피루베이트-다이옥시저네이스(dioxygenase)) 효소의 억제제에 대한 저항성에 대한 형질, 파이토엔 디새튜레이스(desaturase) (PDS)의 억제제에 대한 저항성에 대한 형질, 광화학계 II 억제 제초제에 대한 저항성에 대한 형질(예를 들어, psbA), 광화학계 I 억제 제초제에 대한 저항성에 대한 형질, 프로토포르피리노겐 옥시데이스(oxidase) IX (PPO)-억제 제초제에 대한 저항성에 대한 형질(예를 들어, PPO-1), 페닐우레아 제초제에 대한 저항성에 대한 형질(예를 들어, CYP76B1)과 조합될 수 있다. 상기 형질중 하나 이상을 본 발명과 조합하여 잡초 전환을 효과적으로 제어 또는 방지하는 능력 및/또는 상기 언급된 클래스의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 aad-12 유전자는 페녹시아세테이트 옥신 제초제로 전환되는 화합물 (예를 들어, 2,4-DB, MCPB 등)에 대한 저항성을 또한 제공한다. 2,4-DB 제초제 내에 존재하는 부티르산 모이어티가 β-산화를 통해 식물독성 2,4-디클로로페녹시아세트산으로 전환된다. 유사하게, MCPB가 β-산화를 통해 식물독성 MCPA로 전환된다. 부탄산 제초제 자체는 제초제가 아니다. 이는 감수성 식물 내에서 β-산화에 의해 각각의 산 형태로 전환되고, 아세트산 형태의 제초제가 식물독성이다. 신속한 β-산화가 불가능한 식물은 부탄산 제초제에 의해 손상되지 않는다. 그러나, 신속한 β-산화가 가능하고 부탄산 제초제를 아세트산 형태로 전환시킬 수 있는 식물이 이에 따라 AAD-12에 의해 보호된다.
제초제를 적용하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 이같은 적용은 1가지를 초과하는 제초제의 탱크 믹스(tank mix)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 일부 바람직한 제초제에는 글리포세이트, 글루포시네이트, 및 페녹시 옥신 제초제(예컨대 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; MCPB) 가 포함된다. 다른 바람직한 조합은 글리포세이트 + 2,4-D 또는 글루포시네이트 + 2,4-D 혼합물을 포함한다. 이들 3개 유형의 제초제가 본 발명의 개시내용이 이로운 분야의 당업자에게 명백할 유리한 조합으로 사용될 수 있다. 당해 제초제들 중 하나 이상이 본 발명의 종자를 재식하기 전에 필드/구역에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이같은 적용은 재식 14일 이내일 수 있다. 또한 당해 제초제들 중 하나 이상을 재식할 때 및/또는 재식 후, 발아 전에 적용할 수 있다. 또한 당해 제초제들 중 하나 이상을 땅에 (잡초를 방제하기 위해) 또는 잡초 및/또는 본 발명의 트랜스제닉 식물의 위에 적용할 수 있다. 당해 3종의 제초제들은, 예를 들어, 하나의 제초제에 대해 내성이지만 또 다른 제초제에 대해서는 그렇지 않을 수 있는 잡초를 방제 또는 방지하기 위해, 조합되어 사용될 수 있거나 순환될 수 있다. 3가지 유형의 당해 제초제에 대한 다양한 적용 시간이 당업계에 공지된 바와 같아 다양한 방식으로 사용될 수 있다.
추가로, 당해 이벤트는 트랜스제닉 및 논트랜스제닉의 하나 이상의 추가의 제초제 내성 형질, 하나 이상의 추가의 입력물(예, 곤충 저항성(예, 812 이벤트 또는 814 이벤트), 곰팡이 저항성, 또는 스트레스 내성 등) 또는 출력물(예, 수율 증가, 오일 프로파일 개선, 섬유질 개선 등) 형질과 스태킹할 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 작물 해충을 유연하게 비용 효율적으로 방제하는 능력과 함께 개선된 작물 품질의 완전한 작물학적 패키지를 제공할 수 있다.
상동 재조합을 통해 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 특정 염색체 부위 내로 통합시키는 방법들이 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2009/0111188 A1호에 기술된 바와 같은 부위 특이적 통합은 염색체 표적 내로의 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 매개하기 위한 재조합효소(recombinase) 또는 통합효소(integrase)의 사용을 기술한다. 또한, 국제 특허 출원 WO 2008/021207에는 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 게놈의 특정 위치 내로 통합시키기 위한 아연 손가락 매개-상동 재조합이 기술되어 있다. 재조합효소 예컨대 미국 특허 제6,720,475호에 기술된 바와 같은 FLP/FRT 또는 미국 특허 제5,658,772호에 기술된 바와 같은 CRE/LOX의 사용이 폴리뉴클레오티드 서열을 특정 염색체 부위 내로 통합시키는데 이용될 수 있다. 마지막으로, 도너 폴리뉴클레오티드를 특정 염색체 위치 내로 표적화하기 위한 메가뉴클리에이스(meganuclease)의 용도가 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에서 기술되었다.
식물 세포 내에서의 부위 특이적 통합을 위한 기타 다양한 방법들이 일반적으로 공지되어 있고 이용가능하다 (문헌 [Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159]). 또한, 여러 원핵생물 및 저급 진핵생물에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템이 식물에서의 사용에 적용될 수 있다. 이같은 시스템의 예로는 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (문헌 [Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203]), 및 파지 뮤(Mu)의 Gin/gix 시스템 (문헌 [Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176])이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 신규 트랜스진(들)을 기존의 트랜스제닉 이벤트에 근접하게 통합시키거나 스태킹하는 것이 바람직할 수 있다. 독특한 특성 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정적인 발현, 및 여러 환경학적 위치에 걸친 작물학적 성능 및 제초제 내성이 포함되는 효능의 우수한 조합을 기초로 선택된 트랜스제닉 이벤트가 바람직한 게놈 유전자좌로 고려될 수 있다. 새롭게 통합된 트랜스진은 기존의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지하여야 한다. 또한, 새롭게 통합된 이벤트의 게놈 플랭킹 서열 및 염색체 위치가 이미 확인되어 있기 때문에 새롭게 통합된 이벤트의 검출 및 확인을 위한 검정법의 개발이 극복될 것이다. 마지막으로, 기존의 트랜스진에 연결된 특정 염색체 위치 내로의 새로운 트랜스진의 통합은 통상적인 육종 방법을 사용하는 유성 이종교배에 의한 다른 유전학적 배경 내로의 트랜스진들의 유전자이입을 촉진할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 트랜스제닉 이벤트로부터 절제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제13/011,666호에 기술된 바와 같은 트랜스진 절제는 염색체에 통합된 트랜스제닉 이벤트로부터 유전자 발현 카세트로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하기 위한 아연 핑거 뉴클리에이스(nuclease)의 사용을 기술한다. 제거되는 폴리뉴클레오티드 서열은 선별성 마커일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 제거 시, 변형된 트랜스제닉 이벤트가 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 재표적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 변형된 트랜스제닉 이벤트의 이어지는 재표적화는 선별성 마커의 재사용 또는 특정 유전자의 발현으로부터 초래되는 식물 트랜스크립톰(transcriptome)에 대한 의도하지 않은 변화를 극복하는 능력과 같은 장점을 제공한다.
본 발명은 이종성 핵산의 삽입용으로 우수한 대두 게놈 내의 염색체 6 상의 특정 부위를 본원에서 개시한다. 염색체 6 상의 삽입/표적 부위의 위치를 확인 및/또는 표적화하는데 유용한 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열이 또한 개시된다. 따라서, 본 발명은 관심이 있는 이종성 핵산을 이러한 미리 확립된 표적 부위 내로 또는 이러한 표적 부위에 근접하게 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개시된 표적 부위에 또는 이같은 부위에 일반적으로 근접하게 삽입된 임의의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포함한다. 이같은 표적화된 통합을 달성하기 위한 한 선택권은 본원에 예시된 pat 발현 카세트를 절제하고/하거나 이러한 카세트 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자, 이벤트 또는 형질 "스태킹"은 원하는 형질을 하나의 트랜스제닉 계통 내로 조합하는 것이다. 식물 육종자들은 원하는 형질을 각각 지니는 어버이들을 교배시킨 후 이러한 원하는 형질들 양쪽 모두를 지니는 후손을 확인함으로써 트랜스제닉 형질들을 스태킹시킨다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 2개 이상의 유전자를 형질전환 동안 동시에 식물의 세포핵 내로 전달하는 것에 의한 것이다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 트랜스제닉 식물을 또 다른 관심 유전자로 재-형질전환시키는 것에 의한 것이다. 예를 들어, 2개 이상의 상이한 곤충 형질, 곤충 저항성 형질(들) 및 질병 저항성 형질(들), 2개 이상의 제초제 저항성 형질, 및/또는 곤충 저항성 형질(들) 및 제초제 저항성 형질(들)이 예를 들어 포함되는 2개 이상의 상이한 형질을 조합하는데 유전자 스태킹이 사용될 수 있다. 관심 유전자에 더하여 선별성 마커를 사용하는 것이 또한 유전자 스태킹으로 간주될 수 있다.
"상동 재조합"은 새로운 재조합 DNA 서열을 형성하도록 2개의 뉴클레오티드 서열이 이를 통하여 상호작용할 수 있는 (재조합될 수 있는), 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 상응하는 부위들이 있는 임의의 뉴클레오티드 서열 쌍 간의 반응을 지칭한다. 유사한 뉴클레오티드 서열의 부위들은 각각 본원에서 "상동성 서열"로 지칭된다. 일반적으로, 상동성 서열의 길이가 증가함에 따라 상동 재조합의 빈도가 증가한다. 따라서, 동일하다고는 할 수 없는 2개의 뉴클레오티드 서열 간에 상동 재조합이 발생할 수 있지만, 2개의 서열 간의 차이가 증가함에 따라 재조합 빈도 (또는 효율)가 감소한다. 도너 및 표적 분자 각각 상의 1개의 상동성 서열을 사용하여 재조합이 달성될 수 있고, 이에 의해 "단일 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 별법적으로, 2개의 상동성 서열이 표적 및 도너 뉴클레오티드 서열 각각 상에 놓일 수 있다. 도너 상의 2개의 상동성 서열과 표적 상의 2개의 상동성 서열 간의 재조합으로 "이중 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 도너 분자 상의 상동성 서열들이 조작하려는 서열 (예를 들어, 관심 서열)에 플랭킹되면, 표적 분자와의 이중 교차 재조합은 표적 분자 상의 상동성 서열들 사이에 원래 있었던 DNA 서열을 관심 서열이 교체한 재조합 생성물을 초래할 것이다. 이중 교차 재조합 이벤트를 통한 표적과 도너 간의 DNA 서열 교환은 "서열 교체"로 명명된다.
당해 이벤트는 3종 이상의 제초제 내성 단백질의 트랜스제닉 발현을 가능케 하여 거의 모든 활엽 및 잡초를 방제하는 제초제의 조합에 대해 내성을 제공한다. 이 다중 제초제 내성 형질 발현 카세트/트랜스제닉 삽입물은 예컨대, 다른 제초제 내성 형질(예, 글리포세이트 저항성, 글루포시네이트 저항성, 이미다졸리논 저항성, 디캄바 저항성, HPPD 저항성, 브로목시닐 저항성 등), 및 곤충 저항성 형질(예, Cry1F, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry 34/45, Cry1Be, Cry1Ca, Cry1Da, Cry1Ea, Cry1Fa, 채소 살충성 단백질("VIPS" - VIP3A 등 포함)과 스태킹될 수 있다. 또한, 본 발명의 발현 카세트/트랜스제닉 삽입물 내의 제초제 내성 단백질은 제2의 유전자 또는 유전자군으로 유전자 조작된 식물의 1차 형질전환체의 선별에 도움을 주는 하나 이상의 선별 마커로서 작용할 수 있다.
상기 형질의 조합은 제초제(예, 글리포세이트)에 대한 새로이 획득된 저항성 또는 고유 내성으로 인한 잡초종 등을 방제하는 신규한 방법을 제공한다. 따라서, 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 이용한 신규한 잡초 방제 방법은 본 발명의 범위 내이다.
스태킹되거나 개별적으로 작물에 형질전환된 당해 트랜스제닉 형질의 이용은 페녹시, 피리딜옥시, 글리포세이트 및/또는 글루포시네이트 제초제에 내성을 부여하는 유전자를 함유하지 않는 다른 제초제 내성 자생 작물을 방제하는 수단을 제공한다.
본 발명의 바람직한 식물 또는 종자는 본원에서 확인된 삽입물 서열과, 본원에 기재된 삽입물 양측의 적어도 20 내지 500개 이상의 연속 플랭킹 뉴클레오티드를 게놈에 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 플랭킹 서열에 대한 언급은 서열 1 및 서열 2에 관련해 확인된 서열을 지칭한다. 또한, 당해 이벤트는 삽입된 DNA에 바로 인접한 당해 플랭킹 서열들 사이에 삽입된 이종 DNA를 포함한다. 상기 플랭킹 서열의 전부 또는 일부는 이벤트를 포함하는 어버이 계통의 삽입물의 유성 교배의 결과로 삽입된 DNA를 수용하는 자손에게로 전달된다고 예상할 수있다.
본 발명은 본 발명의 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 이같은 조직 배양물로부터 재생된 식물이, 특히 상기 식물이 예시된 품종의 모든 형태학적 및 생리학적 성질을 나타낼 수 있는 경우에, 또한 포함된다. 바람직한 본 발명의 식물은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특성을 지닌다. 본 발명은 관심 대상인 품질 형질을 보유하는 이같은 종자 및 종자의 자손을 추가로 포함한다.
식물 또는 종자, 또는 이의 일부분의 조작 (예컨대 돌연변이, 추가적인 형질감염, 및 추가적인 육종)은 "본질적으로 유래된" 품종으로 칭해질 수 있는 것의 생성에 이를 수 있다. 국제 식물 신품종 보호 연맹 (UPOV: International Union for the Protection of New Varieties of Plants)은 품종이 보호 품종으로부터 본질적으로 유래되었는지를 결정하기 위한 하기의 지침을 제공하였다:
[A] 하기의 경우에, 품종이 다른 품종 ("원품종")으로부터 본질적으로 유래된 것으로 간주한다:
(i) 원품종의 유전자형 또는 유전자형 조합으로부터 초래되는 본질적인 특성의 발현을 유지하면서, 원품종으로부터, 또는 자체가 원품종으로부터 주로 유래된 품종으로부터 주로 유래되고;
(ii) 원품종과 명확하게 구별될 수 있으며;
(iii) 유도 작용으로부터 초래되는 차이를 제외하고는, 원품종의 유전자형 또는 유전자형 조합으로부터 초래되는 본질적인 특성의 발현에서 원품종과 일치함.
(1992년 10월 30일에 제네바에서 열린 UPOV의 6차 국제기구 회의; 사무국에 의해 제조된 문서).
본원에서 사용된 "계통"은 하나 이상의 형질에 대해 개체들 간에 유전적 변이를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는 일군의 식물이다. 이같은 계통은 여러 세대의 자가-수분 및 선별, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 편친(single parent)으로부터의 무성 번식에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "재배종" 및 "품종"은 동의어이고, 상업적인 생산에 사용되는 계통을 지칭한다.
"안정성" 또는 "안정적"은 소정의 성분과 관련하여, 이러한 성분이 세대에서 세대로, 바람직하게는 3대 이상 동안, 실질적으로 동일한 수준, 예를 들어, 바람직하게는 ±15％, 더욱 바람직하게는 ±10％, 가장 바람직하게는 ±5％에서 유지되는 것을 의미한다. 안정성은 온도, 장소, 스트레스 및 재식 시기에 영향을 받을 수 있다. 필드 조건 하에서의 후속 세대들의 비교가 유사한 방식으로 이러한 성분을 생산하여야 한다.
"상업적 유용성"은 양호한 식물 활력 및 높은 번식력이 있어서, 통상적인 농업 설비를 사용하여 농부가 작물을 생산할 수 있고, 기술된 성분들이 있는 오일이 통상적인 분쇄 및 추출 설비를 사용하여 종자로부터 추출될 수 있는 것으로 정의된다. 상업적으로 유용하기 위해, 종자 중량, 오일 함량 및 에이커 당 생산된 총 오일에 의해 측정되는 바와 같은 수율은 동일한 영역에서 성장된, 다른 면에서는 유사하지만 프리미엄 가치의 형질이 없는 시판되는 캐놀라 품종의 평균 수율의 15％ 이내이다.
"작물학적으로 우량한(elite)"은 계통이, 당해 이벤트(들)에 기인하는 제초제 내성에 더하여, 바람직한 작물학적 특성 예컨대 수율, 숙성도, 질병 저항성 등을 지니는 것을 의미한다. 본 발명의 이벤트를 포함하는 식물에서 하기 실시예에 기재된 바와 같이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 취해진 작물학적 형질이 본 발명의 범주 내에 속한다. 임의의 모든 이러한 작물학적 특성 및 데이터 포인트가 포인트로서, 또는 이같은 식물을 정의하는데 사용되는 광범위한 특성들의 한쪽 끝부분 또는 양쪽 끝부분에서, 이같은 식물을 확인하는데 사용될 수 있다.
당업자가 본 개시내용의 견지에서 인지할 바와 같이, 검출 키트의 바람직한 실시양태는, 예를 들어, "접합부 서열" 또는 "전이 서열" (대두 게놈 플랭킹 서열이 삽입물 서열과 만나는 곳)에 대해 지시되고/되거나 이를 포함하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 표 1에서 지시된 바와 같은 접합부 서열 (삽입물이 플랭킹 서열을 만나는 곳) 중 하나 또는 양쪽을 확인하도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머 및/또는 앰플리콘을 포함한다. 한 통상적인 디자인은 플랭킹 영역에서 혼성화하는 1개의 프라이머, 및 삽입물에서 혼성화하는 1개의 프라이머가 있는 것이다. 종종 이같은 프라이머들은 각각 잔기 약 15개 이상의 길이이다. 이러한 배열 내에서, 프라이머들이 본 발명의 이벤트의 존재를 지시하는 검출가능한 앰플리콘을 생성/증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 지시된 바와 같은 접합부 서열에 스패닝되는 (그리고 이를 포함하는) 앰플리콘을 생성시키는데 이러한 프라이머들이 사용될 수 있다.
플랭킹 서열에 "터치다운"한 프라이머(들)은, 전형적으로, 염기 약 200개를 넘어서 또는 접합부를 넘어서 혼성화하도록 디자인되지 않는다. 따라서, 전형적인 플랭킹 프라이머는 삽입물 시작부로부터 플랭킹 서열 내로의 염기 200개 이내의 어느 한 쪽 가닥의 15개 이상의 잔기를 포함하도록 디자인될 것이다. 즉, 상기 확인된 일측 또는 양측 접합부 서열로부터의 서열 100 내지 200-500 정도의 염기 내의 잔기로부터의 (또는 이러한 잔기에 혼성화하는) 적합한 크기의 서열을 포함하는 프라이머가 본 발명의 범주 내에 속한다. 삽입물 프라이머가 삽입물 상의 임의의 장소에서 유사하게 디자인될 수 있지만, 상기 확인된 접합부 서열(들)로부터의 서열 100 내지 200-500 정도의 염기 내의 (상보물을 포함하는) 삽입물 상의 잔기가, 예를 들어, 이같은 프라이머 디자인에 비-배타적으로 사용될 수 있다.
당업자는 프라이머 및 프로브가 광범위한 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건 하에 본원에 예시된 서열 (또는 이의 상보물)의 절편, 및 이의 상보물에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 이때 프라이머 또는 프로브가 예시된 서열에 대해 완벽하게 상보적이지 않다는 것을 또한 인지할 것이다. 즉, 어느 정도의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 약 20개의 프라이머에 대해, 앰플리콘을 마주 보는 프라이머의 내부 또는 끝부분에 미스매치 염기가 있는 경우 전형적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드가 반대 가닥과 결합할 필요가 없다. 다양한 적합한 혼성화 조건이 하기에서 제공된다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브뿐만 아니라, 펩티드 핵산 (PNA) 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 것은 이같은 프로브 및 프라이머가 본 발명의 이벤트의 존재에 대해 진단적이다 (이를 독특하게 확인 및 구별할 수 있다)는 것이다.
PCR 증폭에서의 오류가 발생할 수 있고, 이는 예를 들어 미미한 시퀀싱 오류를 초래할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 즉, 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 열거된 서열은 대두 게놈 DNA로부터 긴 앰플리콘을 생성시킨 후 이러한 앰플리콘을 클로닝하고 시퀀싱함으로써 결정되었다. 게놈 DNA로부터 시퀀싱을 위한 충분한 앰플리콘을 생성시키기 위해 필요한 다수의 증폭 라운드를 고려하여, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 당업자는 이러한 유형의 통상적인 시퀀싱 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 보정이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인지하여야 하고 이를 주의하여야 한다.
일부 게놈 서열이, 예를 들어, 서열이 이벤트 생성 동안 삽입될 때, 결실되는 것이 드물지 않다는 것을 또한 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 진뱅크(GENBANK)에 열거된 게놈 서열과 당해 플랭킹 서열 간에 약간의 차이가 또한 나타날 수 있다.
"삽입물"의 성분들이 도면에서 도해되고, 하기 실시예에서 더욱 상세하게 논의된다. 이러한 성분들의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편이 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대두 식물로부터, 식물 및 종자 등 내의 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 당해 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열을 포함하는 DNA 서열, 본원에서 확인된 접합부 서열을 포함하는 절편, 및 임의 이러한 예시된 서열 및 이의 임의의 절편의 상보물이 제공된다. 삽입 영역 접합부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA와 삽입 부위에 플랭킹된 대두 세포로부터의 DNA 사이의 접합부에 스패닝된다. 이같은 서열은 소정의 이벤트에 대해 진단적일 수 있다.
삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성될 수 있다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 본 발명의 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들에서 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 따라서, 이같은 프라이머 쌍으로부터 유래된 PCR 앰플리콘이 독특하고, 이러한 대두 계통을 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신규 트랜스진/게놈 삽입 영역의 연속적인 단편을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 측면이다. 트랜스진 삽입물 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및 상기 언급된 대두 식물들 중 하나 이상으로부터의 대두 게놈 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 및/또는 이러한 대두 식물들 중 하나 이상에 대해 진단적인 앰플리콘 생성물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열이 포함된다.
관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열의 트랜스진 부분의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열 또는 이의 상보물 및 이들 서열들로부터의 유사한 길이의 플랭킹 대두 DNA 서열 (예컨대 서열 1 및 서열 2 및 이의 절편) 또는 이의 상보물에 관한 것이다. DNA 증폭 방법에서 이러한 서열은 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급된 임의의 대두 이벤트에 대해 진단적이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 DNA 프라이머 및 상동성 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘을 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 내의 본원에서 언급된 대두 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 이들 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우 상기 이벤트(들)에 진단적인 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이로써 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 검출 방법은, (a) DNA를 포함하는 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 DNA와 혼성화하고, 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 대두 식물 (비-관심 이벤트 DNA)과 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 상기 이벤트에 상응하는 DNA의 존재의 검출 방법을 포함한다.
또한 추가의 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제1 부모 대두 계통 (상기 제초제 내성 형질을 상기 계통의 식물에 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함) 및 제2 부모 대두 계통 (상기 제초제 내성 형질이 없음)을 유성 교배시켜, 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 분자 마커를 사용하여 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 포함하는 대두 식물의 생산 방법을 포함한다. 이러한 방법은 자손 식물을 제2 부모 대두 계통에 역-교배시켜 상기 제초제 내성 형질을 포함하는 순계(true-breeding) 대두 식물을 생산하는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 이벤트와의 교배의 자손의 접합성을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대두 DNA를 포함하는 샘플을 본 발명의 프라이머 세트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는, 상기 대두 이벤트 중 하나 이상으로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우, 상기 대두 이벤트 중 하나 이상에 대해 진단적인 제1 앰플리콘을 생산한다. 이러한 방법은, 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 대두 DNA를 포함하는 샘플을, 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 대두 게놈 영역에 상동성인 천연 대두 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생산하는 상기 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; 및 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제2 앰플리콘을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 제2 앰플리콘을 검출하는 단계 및 샘플 내의 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하고, 이때 양쪽 앰플리콘의 존재는 샘플이 트랜스진 삽입에 대해 이종접합성이라는 것을 가리키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 주지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 키트는 샘플 내의 당해 대두 이벤트 DNA의 확인에 유용하고, 이러한 DNA를 함유하는 대두 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 키트는 예컨대 본원에 개시된 앰플리콘에 상동적이거나 상보적인 DNA 서열 또는 당해 이벤트의 트랜스진 유전 요소 내에 함유된 DNA에 상동성이거나 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이들 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 키트는 또한 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 함유할 수 있다.
"프로브"는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소)에 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이러한 프로브는 표적 핵산 스트랜드에 상보적이고, 본 발명의 경우에는, 대두 식물로부터 유래되거나 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래되는 상기 대두 이벤트 중 하나로부터의 게놈 DNA 스트랜드에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 디옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 그 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 포함한다. "단리된" 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드가 비-천연, 예를 들어, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 상태에 있음을 의미한다. "정제된" 단백질은 마찬가지로, 단백질이 비-천연 상태에 있음을 의미한다.
"프라이머"는 상보적인 표적 DNA 스트랜드에 핵산 혼성화에 의해 어닐링하여 프라이머와 표적 DNA 스트랜드 간에 하이브리드를 형성하고, 이어서 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소에 의해 표적 DNA 스트랜드를 따라 연장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은, 표적 핵산 서열의 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 대한 그들의 사용을 지칭한다.
프로브 및 프라이머는 일반적으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 개 또는 이를 초과하는 개수의 폴리뉴클레오티드의 길이이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 고-엄격성 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과의 완전한 서열 유사성을 가지지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 유지하는 프로브가 통상적 방법에 의해 설계될 수도 있다.
프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법이, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. PCR-프라이머 쌍이, 예를 들어 그러한 목적으로 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.
본원에서 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입 서열에 기초한 프라이머 및 프로브가 통상적인 방법, 예를 들어 이러한 서열의 재-클로닝 및 시퀀싱에 의해 개시된 서열을 확인하는데 (그리고, 필요하다면 수정하는데) 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 내의 트랜스진 이벤트로부터 DNA의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 이의 절편은 특정 환경 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 두 개의 핵산 분자가 역-평행, 이중 스트랜드 핵산 구조를 형성할 수 있으면, 두 개의 핵산 분자는 서로간에 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다. 핵산 분자는, 그들이 완전한 상보성을 나타낸다면, 또 다른 핵산 분자의 "상보물"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자들 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 분자들은 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 두 개의 분자는, 그들이 적어도 통상적인 "저-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 서로 간에 혼성화할 수 있다면, "최소로 상보적"인 것으로 언급된다. 유사하게, 분자들은, 그들이 통상적인 "고-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 서로 간에 혼성화할 수 있다면, "상보적"인 것으로 언급된다. 통상적인 엄격성 조건은 문헌[Sambrook et al., 1989]에 기술되어 있다. 따라서 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것은 이러한 벗어남이 분자가 이중 스트랜드 구조를 형성하는 능력을 완전히 방해하지 않는 한 허용된다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서의 역할을 하기 위해, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중 스트랜드 구조를 형성할 수 있도록 서열 면에서 충분하게 상보적인 것만이 필요하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동성인 서열은, 고-엄격성 조건 하에서 비교되는, 핵산 서열의 상보물에 특이적으로 혼성화할 핵산 서열이다. 용어 "엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.52-9.55에 논의된 특이적 혼성화 절차에 의해 표적 핵산 (즉, 관심이 있는 특정 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.47-9.52 및 9.56-9.58을 또한 참조한다. 따라서, DNA 절편의 상보적인 신장물과 선택적으로 이중 분자를 형성하는 능력에 대해 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
구상되는 용도에 따라, 표적 서열을 향한 프로브의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 용도에 대해, 예를 들어 종점 TaqMan 및 실시간 PCR 용도에 대해, 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건이 통상 선택될 것이고, 약 60 ℃ 내지 약 75 ℃의 온도에서 1.5 mM 내지 약 4.0mM MgCl2를 선택할 것이고, 본원에서 기술된 바와 같이 증가되는 엄격성에 대해 유지 시간을 변경할 수 있다. 다른 혼성화 기술에 대해, 통상 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl이 사용될 것이다. 엄격한 조건은, 예를 들어 혼성화 필터를 고-엄격성 세정 완충제 (0.2X SSC, 0.1％ SDS, 65 ℃)로 2 회 이상 세정하는 것을 수반할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적합한 엄격성 조건, 예를 들어 약 45 ℃에서 6.0X 염화 나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)에 이어서 50 ℃에서 2.0X SSC로의 세정이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세정 단계에서의 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0X SSC의 저-엄격성 내지 50 ℃에서 약 0.2X SSC의 고-엄격성으로 선택될 수 있다. 또한, 세정 단계에서의 온도가 실온, 약 22 ℃의 저-엄격성 조건에서 약 65 ℃의 고-엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 농도 모두가 변할 수 있거나, 다른 변수는 변화시키면서 온도 또는 염 농도 중 하나가 일정하게 유지될 수 있다. 이러한 선택적 조건은 프로브와 주형 또는 표적 스트랜드 사이의 불일치 (존재하는 경우)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 당업자에게 주지되어 있고, 미국 특허 제 4,965,188호 및 제 5,176,995호의 교시는 혼성화 분석 방법을 예시한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 고-엄격성 조건 하에서, 본원에서 예시되거나 제안된 프라이머 (또는 앰플리콘 또는 기타 서열), 이의 상보물 및 절편 중 하나 이상에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 예시된 서열 중 하나에서 본원에서 제시된 핵산 서열 또는 이의 상보물 및/또는 절편을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이러한 핵산 서열과 80％ 내지 100％ 또는 90％ 내지 100％ 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이러한 서열과 95％ 내지 100％ 서열 동일성을 공유한다. 이러한 서열은 유전 교차의 자손을 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법에 의해 검출될 수 있고, 이들은 비제한적으로, 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그 및 화학발광 태그를 포함할 수 있다.
특정 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 표적 핵산 서열의 (예를 들어, PCR에 의한) 증폭에 관련하여, "엄격한 조건"은 프라이머 쌍이, 상응하는 야생형 서열 (또는 이의 상보물)을 가진 프라이머가 결합할 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 하여, 바람직하게는 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생산하게 하는 조건이다.
용어 "(표적 서열)에 대해 특이적인"은 엄격한 혼성화 조건 하에서 프로브 또는 프라이머가 표적 서열을 포함하는 샘플 내의 표적 서열에만 오직 혼성화하는 것을 가리킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 대두 식물이 본 발명의 대두 식물로부터의 트랜스진 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지를 결정하기 위해, 이벤트 DNA의 존재에 대해 진단적인 앰플리콘을 생산하도록, 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를, 삽입된 이종성 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 및 삽입된 이종성 DNA로부터 유래한 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용할 수 있다. 앰플리콘은 또한 이벤트에 진단적인 길이 및 서열을 가진다. 앰플리콘은 프라이머 쌍 + 1 개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 결합 길이 및/또는 프라이머 쌍 + 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 개 또는 이를 초과하는 개수의 뉴클레오티드 염기 쌍 (±임의의 상기 열거된 증분)의 결합 길이의 범위에 있을 수 있다. 다르게는, 프라이머 쌍은 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 플랭킹 서열로부터 유래되어, 전체 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘이 생산될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입 DNA 서열로부터 거리를 두고 위치할 수 있다. 이러한 거리는 1 개의 뉴클레오티드 염기 쌍 내지 약 20000 개의 뉴클레오티드 염기 쌍 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 명확하게 배제한다.
핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함하여, 당업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법의 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업계에 공지되어 있고, 특히, 미국 특허 제 4,683,195호 및 제 4,683,202호에 기술되어 있다. 최대 22 kb의 게놈 DNA를 증폭하도록 PCR 증폭 방법이 개발되어 왔다. 이들 방법 뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 기타 방법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 당해 대두 이벤트로부터의 이종성 트랜스진 DNA 삽입물의 서열 또는 플랭킹 게놈 서열은, 본원에서 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터 이러한 서열을 증폭시키고 이어서 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 시퀀싱하여 확인될 수 있다 (그리고 필요하다면 수정될 수 있다).
이들 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 다수의 기술에 의해 검출할 수 있다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드로에 의한 염색은 통상적인 주지된 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 이러한 방법은, DNA 올리고뉴클레오티드가 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 모두에 중첩되도록 디자인되는 제네틱 비트 분석(Genetic Bit Analysis)이다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR 후 (삽입된 서열에서 1 개의 프라이머 및 인접한 플랭킹 게놈 서열에서 1 개를 사용하여), 단일 스트랜드 PCR 생성물이 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 표지된 ddNTP를 사용한 단일 염기 연장 반응에 대한 주형으로서 역할을 할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장에 의한 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
또 다른 방법은 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 기술된 바와 같은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서 올리고뉴클레오티드가 인접한 게놈 DNA와 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역의 단일 스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 서열에서의 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서의 1 개)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라아제, 루시페라아제, 아피라아제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 중에 인큐베이션된다. DNTP는 개별적으로 첨가되고, 그 혼입은 측정되는 광 신호를 초래한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중-염기 연장에 의한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
형광 편광은 본 발명의 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 상기 방법을 따라서, 올리고뉴클레오티드는 게놈 플랭킹 및 삽입된 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일 스트랜드 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서 1 개)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지 ddNTP의 존재 중에 혼입된다. 단일 염기 연장은 ddNTP의 혼입을 초래한다. 혼입은 형광계를 사용하여 편광에서의 변화로서 측정될 수 있다. 편광에서의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장에 의한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
TAQMAN (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems), 포스터 시티, 캘리포니아)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간략하면, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 게놈 플랭킹 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로프와 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 1 개)는 열안정적인 중합효소 및 dNTP의 존재 중에 사이클링된다. 특이적인 증폭 동안, Taq DNA 중합효소는 FRET 프로브 상의 켄칭 잔기로부터 형광 잔기를 제거하고 방출시킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
서열 검출에서 사용하는 분자 비콘(Molecular Beacon)이 기술되었다. 간략하면, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 플랭킹 게놈 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 형광 잔기와 켄칭 잔기를 근접하게 유지시키는 2차 구조를 함유하는 것을 초래한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열 내에 1 개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 1 개)가 열안정적 중합효소 및 dNTP의 존재 중에 사이클링된다. 성공적인 PCR 중폭에 이어서, 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 잔기와 켄칭 잔기의 공간적 분리를 초래한다. 형광 신호가 초래된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
삽입에 우수한 대두 게놈 내의 위치가 개시되었고, 본 발명은 또한 상기 게놈 위치에 일반적으로 근접 내의 또는 주변의 하나 이상의 비-aad12/pat/2mepsps 코딩 서열을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 포함한다. 하나의 선택은 본원에서 예시된 삽입물 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 유형의 기술은 예를 들어, WO 03/080809 A2 및 상응하는 미국 출원 공보 (미국 2003/0232410)의 주제이다. 따라서, 본 발명은 본원에서 서열 1 및 서열 2로 확인되는 플랭킹 서열의 모든 부분 또는 인식가능한 부분에 의해 플랭킹된 이종성 삽입물 (예시된 삽입물의 다중-카피(multi-copy) 대신 또는 다중-카피와 함께)을 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다. 예시된 삽입물의 추가의 카피 (또는 추가의 카피들) 또는 그의 임의의 구성 요소가 또한 이러한 방식(들)으로 삽입에 표적화될 수 있다.
본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은, 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않을 정도로 전문이 참조로서 도입된다.
본 발명의 실시를 위한 절차를 예시하고, 본 발명의 특정 바람직한 실시양태를 설명하기 위해 하기의 실시예가 포함된다. 이들 실시예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 하기의 실시예에서 개시된 기술은 이의 실시를 위해 바람직한 방식을 예시하기 위해 사용된 특정한 접근법을 나타낸다는 것이 통상의 기술자에게 이해되어야 한다. 그러나 통상의 기술자는 본 개시물의 견지에서, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고, 많은 변화가 이들 특정한 실시양태에서 가능하며 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 달리 언급되지 않는 한 부피 기준이다.
달리 지시되지 않는 한 하기의 약어가 사용된다.
bp 염기 쌍
℃ 섭씨 온도
DNA 디옥시리보핵산
DIG 디곡시제닌
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
kb 킬로베이스
㎍ 마이크로그램
㎕ 마이크로리터
㎖ 밀리리터
M 몰 질량
OLP 중첩 프로브
PCR 중합효소 연쇄 반응
PTU 식물 전사 유닛
SDS 소듐 도데실 술페이트
SOP 표준 공정 절차
SSC 염화 나트륨 및 시트르산 나트륨의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 7.0)
TBE 트리스 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 8.3)
V 볼트
실시예
실시예 1: 2mEPSPS 및 AAD-12 대두 이벤트 8264.44.06.1의 형질전환 및 선별
대두 이벤트 8264.44.06.1을 함유하는 트랜스진 대두 (글리신 맥스)를 대두 자엽절 외식편의 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환을 통해 생성하였다. T-스트랜드 DNA 영역 내에 선별성 마커, pat 및 관심 유전자, aad-12 및 2mepsps v1를 함유한 이원성 벡터 pDAB8264 (도 1)를 보유하는, 무장해제(disarmed) 아그로박테리움 균주 EHA101 (문헌 [Hood et al., 2006])을 사용하여 형질전환을 개시하였다.
아그로박테리움-매개 형질전환을 변형된 문헌 [Zeng et al. (2004)]의 절차를 사용하여 수행하였다. 간략하면, 대두 종자 (cv 매버릭(Maverick))를 기본 배지 상에서 발아시키고, 자엽절을 단리하고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 출아 개시, 출아물 신장 및 발근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 글루포시네이트 선별을 사용하여 형질전환되지 않은 출아물의 성장을 억제하였다. 선별된 출아물을 뿌리 발달을 위해 발근 배지로 옮기고, 이어서 묘목의 순응을 위해 토양 혼합물로 옮겼다.
추정 형질전환체를 스크리닝하기 위해 선별된 묘목의 말단 소엽에 글루포시네이트를 칠하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 순응시킨 후, 글루포시네이트를 잎에 칠하여 내성을 재확인하고, 추정 형질전환체로 간주하였다. 스크리닝된 식물의 샘플을 취하고, 선별성 마커 유전자 및/또는 관심 유전자의 확인을 위해 분자 분석을 수행하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정시켜 T1 종자를 생성시켰다.
상기 이벤트인 대두 이벤트 8264.44.06.1가 개별적 형질전환된 단리체로부터 생성되었다. T1 식물을 다음 세대의 우량 변종 내로 역교배 및 유전자이입시켰다. 이벤트를 그의 독특한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적 멘델 분리 및 안정적 발현 및 제초제 내성 및 작물학적 성능을 포함하는 효능의 우수한 조합을 기초로 선별하였다. 하기의 실시예는 대두 이벤트 8264.44.06.1를 분석하는데 사용된 데이터를 포함한다.
실시예 2: 대두 이벤트 8264.44.06.1에서 AAD-12, 2mEPSPS 및 PAT 단백질의 분석
트랜스진 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1로부터 유래한 재조합 AAD-12, 2mEPSPS 및 PAT 단백질의 생화학적 성질을 분석하였다. 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 단백질의 생화학적 성질을 분석하고, AAD-12, PAT 및 2mEPSPS 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 2.1: 식물 조직에서 AAD-12 단백질의 발현
대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 AAD-12 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성, 추출 가능한 AAD-12 단백질을 대두 잎 조직으로부터 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 측정하였다.
대두 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 AAD-12 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 AAD-12 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 발현 안정성 및 수직 (세대 간의) 및 수평 (동일한 세대의 혈통 간의) 모두의 유전력을 조사하였다. T4 세대 대두 이벤트 8264.44.06.1에서 발현은 안정하였고 (분리되지 않고) 모든 혈통에 걸쳐 일정하였다. 현장 발현 수준 연구를 대두 이벤트에 대해 수행하였고, 모든 혈통에 걸친 평균 발현은 대략 200-400 ng/cm2이었다.
실시예 2.2: 식물 조직에서 2mEPSPS 단백질의 발현
대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 2mEPSPS 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성, 추출 가능한 2mEPSPS 단백질을 대두 잎 조직으로부터 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 측정하였다.
대두 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 2mEPSPS 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 2mEPSPS ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 발현 안정성 및 수직 (세대 간의) 및 수평 (동일한 세대의 혈통 간의) 모두의 유전력을 조사하였다. T4 세대 대두 이벤트 8264.44.06.1에서 발현은 안정하였고 (분리되지 않고) 모든 혈통에 걸쳐 일정하였다. 현장 발현 수준 연구를 대두 이벤트 8264.44.06.1에 대해 수행하였다. 모든 혈통에 걸친 평균 발현은 대략 5,000 - 17,500 ng/cm2이었다. 상기 발현 수준은 2mEPSPS 단백질을 발현한 양성 대조군보다 더 높았다.
실시예 2.3: 식물 조직에서 PAT 단백질의 발현
대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 PAT 단백질의 수준을 측정하였다. 가용성, 추출 가능한 PAT 단백질을 대두 잎 조직으로부터 정량적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 측정하였다.
대두 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA)을 함유한 계면활성제 트윈-20 (PBST)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 PAT ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 8264.44.06.1 내의 발현 안정성 및 수직 (세대 간의) 및 수평 (동일한 세대의 혈통 간의) 모두의 유전력을 조사하였다. T4 세대 대두 이벤트 8264.44.06.1에서 발현은 안정하였고 (분리되지 않고) 모든 혈통에 걸쳐 일정하였다. 현장 발현 수준 연구를 대두 이벤트 8264.44.06.1에 대해 수행하였다. 모든 혈통에 걸친 평균 발현은 대략 15 - 25 ng/cm2이었다.
실시예 3: 클로닝 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 삽입 및 플랭킹 경계 영역에서 DNA 서열의 분석
게놈 삽입 부위를 분석하고 기술하기 위해, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 플랭킹 게놈 T-DNA 경계 영역의 서열을 결정하였다. 총 2,578 bp의 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 게놈 서열을 확인하였고, 이는 5' 플랭킹 경계 서열 (서열 1) 570 bp, 3' 플랭킹 경계 서열 (서열 2) 1,499 bp를 포함한다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 경계 서열에 기초한 PCR 증폭은, 경계 영역이 대두 기원의 것이고 접합부 영역이 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대해 독특한 서열임을 입증하였다. 접합부 영역은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 이벤트-특이적 확인을 위해 사용될 수 있었다. 또한, T-스트랜드 삽입 부위는, 야생형 대두의 게놈으로부터 확인된 플랭킹 경계 서열의 영역에 상응하는 게놈 절편을 증폭하여 분석되었다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 야생형 게놈 서열과의 비교는 원래의 위치로부터 약 4,357 bp 결실을 나타내었다. 전체적으로, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 삽입 및 경계 서열의 분석은 T-스트랜드의 무손상 카피가 대두 게놈 내에 존재함을 나타내었다.
Figure 112013059698409-pct00002
Figure 112013059698409-pct00003
Figure 112013059698409-pct00004
실시예 3.1: 대두 게놈 서열의 확인
5' 및 3' 플랭킹 경계는 염색체 6으로부터 글리신 맥스 전체 게놈 숏건 서열과 정렬되었고, 이는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 6에 삽입되었음을 나타내었다. 대두 게놈으로부터 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 트랜스진의 삽입 부위를 확인하기 위해, PCR을 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다 (도 2 및 표 3). 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 기타 트랜스진 또는 비-트랜스진 대두 계통으로부터의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 따라서, 5' 경계 서열이 맞는지 확인하기 위해, 2mepsps 특이적 프라이머, 예를 들어 ED_v1_C1 (서열 11) 및 클로닝된 5' 말단 경계 서열 및/또는 대두 게놈 염색체 6 상의 그것의 정렬 서열에 따라 설계된 2 개의 프라이머, 4406-WF1 (서열 3) 및 4406-WF3 (서열 5)로 지명된 것을, 2mepsps 유전자로부터 5' 말단 경계 서열에 걸쳐있는 DNA 절편을 증폭하는데 사용하였다. 유사하게, 클로닝된 3' 말단 경계 서열의 확인을 위해, pat 특이적 프라이머, 예를 들어 PAT-12 (서열 12) 및 클로닝된 3' 말단 경계 서열에 따라 설계된 3 개의 프라이머, 4406-WR5 (서열 7), 4406-WR7 (서열 9) 및 4406-WR8 (서열 10)로 지명된 것을, pat 유전자로부터 3' 말단 경계 서열에 걸쳐있는 DNA 절편을 증폭하는데 사용하였다. 예측된 크기를 가진 DNA 절편을, 다른 트랜스진 대두 계통 또는 비-트랜스진 대조군으로부터의 DNA 샘플로부터는 아닌 오직 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 게놈 DNA로부터, 하나의 프라이머는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 플랭킹 경계 상에 위치하고, 하나는 트랜스진 특이적 프라이머인 각각의 프라이머 쌍을 가지고 증폭하였다. 그 결과는 클로닝된 5' 및 3' 경계 서열이 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 T-스트랜드 삽입물의 플랭킹 경계 서열임을 나타낸다.
대두 게놈 내의 DNA 삽입을 추가로 확인하기 위해, 2 개의 대두 서열에 걸쳐 PCR 증폭을 완료하였다. 5' 말단 경계 서열에 따라 설계된 2 개의 프라이머, 4406-WF1 (서열 3) 및 4406-WF3 (서열 5) 및 3' 말단 경계 서열을 위한 2 개의 프라이머, 4406-WR5 (서열 7) 및 4406-WR7 (서열 9)을 사용하여 전체 트랜스진, 5' 말단 경계 서열 및 3' 경계 서열을 포함하는 DNA 절편을 증폭하였다. 예상된 바와 같이, 4406-WF1 (서열 3) 및 4406-WR5 (서열 7)의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 게놈 DNA로부터 대략 12 kb DNA 절편을 증폭하였고, 비-트랜스진 대두 대조군 및 기타 대두 트랜스진 계통으로부터 6 kb DNA 절편을 증폭하였다. 유사하게, 이에 대응하여 4406-WF3 (서열 5) 및 4406-WR7 (서열 9)의 프라이머 쌍으로 완료된 PCR 반응은, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 샘플로부터 대략 12 kb DNA 절편을 증폭하였고, 모든 기타 대두 대조군 계통으로부터 6 kb DNA 절편을 증폭하였다. 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 6의 부위 내에 삽입되었음을 증명하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 확인된 5' 및 3' 경계 서열을 염색체 6으로부터의 글리신 맥스 전체 게놈 숏건 서열과 정렬하는 것은 원래의 위치로부터 약 4.4 kb 결실을 나타내었다 (도 3).
실시예 4: 서던 블롯을 통한 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 분석
서던 블롯 분석을 사용하여 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 통합 패턴을 확립하였다. 이들 실험은 대두 게놈 내에 aad-12, pat 및 2mepsps v1 트랜스진의 통합 및 완전성을 증명하는 데이터를 생성하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1는 플라스미드 pDAB8264로부터 aad-12, pat 및 2mepsps v1 PTU의 단일 카피를 포함하는 전장 단일 통합 이벤트로서 분석되었다.
서던 블롯 데이터는 T-스트랜드 절편이 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 게놈 내에 삽입되었음을 시사하였다. 자세한 서던 블롯 분석을 aad-12, pat 및 2mepsps v1 삽입물에 특이적인, pDAB8264의 T-스트랜드 통합 영역 내에 포함된 프로브 및 플라스미드 내에 위치한 절단 부위를 가지고, 플라스미드 또는 플라스미드와 대두 게놈 DNA의 접합부에 걸쳐 있는 절편 (경계 절편)에 대해 내부인 혼성화 절편을 생산하는 서술적 제한 효소를 사용하여 수행하였다. 제한 효소와 플라스미드의 조합에 대해 서던 혼성화로부터 나타난 분자량은 이벤트에 대해 독특하였고, 그것의 확인 패턴을 확립하였다. 이들 분석은 또한 플라스미드 절편이 aad-12, pat 및 2mepsps v1 PTU의 재배열 없이 대두 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.1: 대두 잎 샘플 수집 및 게놈 DNA (gDNA) 단리
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1를 함유한 각 대두 식물로부터 수확된 잎 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, aad-12 및 2mepsps v1 유전자가 없는 물질 계통을 나타내는 유전적 배경을 포함하는, 통상적인 대두 식물, 매버릭으로부터 gDNA를 단리하였다. 동결건조된 입 조직으로부터 표준 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 CTAB 방법에 따라 개별적인 게놈 DNA를 추출하였다. 추출 후에, 피코 그린 (Pico Green) 시약 (인비트로젠(Invitrogen), 칼스배드(Carlsbad), 캘리포니아)을 사용하여 형광분석법으로 DNA를 정량하였다. 이어서 DNA를 아가로스 겔 상에서 가시화하여, 피코 그린 분석으로부터의 값을 확인하고 DNA 품질을 결정하였다.
실시예 4.2: DNA 소화 및 분리
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 서던 블롯 분자 분석을 위해, 게놈 DNA 10 마이크로그램 (10 ㎍)을 소화시켰다. 대두 pDAB8264.44.06.1 및 비-트랜스진 대두 계통 매버릭으로부터의 게놈 DNA를 DNA ㎍ 당 대략 5 유닛의 선택된 제한 효소 및 상응하는 반응 완충제를 각 DNA 샘플에 첨가하여 소화시켰다. 각 샘플을 약 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제한 효소 BstZ17I, HinDIII, NcoI, NsiI 및 PacI를 개별적으로 소화에 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 입스위치(Ipswich), 매사추세츠). 또한, 플라스미드 DNA, pDAB8264를 비-트랜스진 대두 품종, 매버릭으로부터의 게놈 DNA와 결합함으로써 양성 혼성화 대조군 샘플을 제조하였다. 플라스미드 DNA / 게놈 DNA 칵테일을 시험 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 사용하여 소화시켰다. 소화물을 밤새 인큐베이션한 후, NaCl을 0.1 M의 최종 농도로 첨가하고, 소화된 DNA 샘플을 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 DNA 펠릿을 20 ㎕의 1X 로딩 완충제 (0.01％ 브로모페놀 블루, 10.0 mM EDTA, 5.0％ 글리세롤, 1.0 mM 트리스 pH 7.5)에 재현탁시켰다. 이어서 DNA 샘플과 분자 크기 마커를 35 볼트에서 대략 18-22 시간 동안 0.4X TAE 완충제 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 피츠버그, 펜실베니아)를 사용하여 0.85％ 아가로스 겔을 통해 전기영동하여, 절편 분리를 수행하였다. 겔을 에티듐 브로마이드 (인비트로젠, 칼스배드, 캘리포니아)로 염색하고, 자외선 (UV) 하에서 DNA를 가시화하였다.
실시예 4.3: 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석을 실질적으로 문헌 [Memelink, J.; Swords, K.; Harry J.; Hoge, C.; (1994) Southern, Northern, and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1-23]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하면, DNA 절편의 전기영동 분리 및 시각화에 이어, 겔을 0.25 M HCl로 대략 20 분 동안 퓨린제거하고(depurinate), 이어서 대략 30 분 동안 변성 용액 (0.4 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 노출시키고, 이어서 30 분 이상 동안 중화 용액 (1.5 M NaCl, 0.5 M 트리스 pH 7.5)에 노출시켰다. 서던 전달을 10×SSC와 함께 위킹(wicking) 시스템을 사용하여 나일론 막 상으로 밤새 수행하였다. 전달 후, UV 가교에 이어서 짧게 2×SSC 용액으로 막을 세정하여, DNA를 막에 결합시켰다. 상기 과정은 혼성화에 대해 준비된 서던 블롯 막을 생산하였다.
실시예 4.4: DNA 브로브 표지 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 절편을 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다. 프로브는 디곡시제닌 (DIG) 표지된 뉴클레오티드, [DIG-11]-dUTP를, 유전자 요소에 특이적인 프라이머를 사용하여 플라스미드 pDAB8264로부터 증폭된 DNA 절편 내에 PCR 기반 혼입을 통해 생성되었다. PCR 합성에 의한 DNA 프로브의 생성은 PCR DIG 프로브 신세시스 키트(Probe Synthesis Kit) (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나폴리스, 인디애나)를 사용하여 제조자가 추천한 절차를 따라서 수행하였다.
표지된 프로브를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 그들의 품질을 결정하고 정량하였다. 이어서 원하는 양의 표지된 프로브를 특정 절편의 검출을 위해 DIG 이지 히브 솔루션(Easy Hyb Solution) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)에 대해 기술된 바와 실질적으로 같은 절차를 사용하여 나일론 막 상의 표적 DNA에 대한 혼성화를 위해 사용하였다. 간략하면, 고정된 DNA를 함유한 나일론 막 블롯을 짧게 2× SSC로 세척하고 혼성화 용기 내 예열된 DIG 이지 히브 용액 20-25 ㎖로 대략 45-55 ℃로 약 2 시간 동안 혼성화 오븐에서 예비-혼성화시켰다. 이어서 예비-혼성화 용액을 기울여 따라내고, 수조에서 대략 5 분 간 끓여서 변성시킨, 원하는 양의 특이적 프로브를 함유한 예열된 DIG 이지 히브 용액 대략 15 ㎖로 교체하였다. 이어서 혼성화 단계를 혼성화 오븐에서 밤새 대략 45-55 ℃에서 수행하였다.
프로브 혼성화의 마지막에, 프로브를 함유한 DIG 이지 히브 용액을 깨끗한 튜브 내로 기울여서 따라내고, 대략 -20 ℃에서 보관하였다. 이들 프로브는 제조사가 제안한 절차에 따라서 2 번 재사용할 수 있었다. 막 블롯을 짧게 세정하고, 실온에서 대략 5 분 동안 저-엄격성 세척 완충액 (2×SSC, 0.1％ SDS)로 깨끗한 플라스틱 용기 내에서 2 회 세척하였고, 이어서 대략 65 ℃에서 각각 15 분 동안 고-엄격성 세척 완충액 (0.1×SSC, 0.1％ SDS)로 2 회 세척하였다. 막 블롯을 짧게 대략 5 분 동안 DIG 워시 및 블록 버퍼 세트(Wash and Block Buffer Set) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)로부터의 1×말레산 완충액으로 세척하였다. 이어서 2 시간 동안 1×블로킹 완충액 내에서 블로킹하고, 또한 최소 30 분 동안 1×블로킹 완충액 내에서 안티-DIG-AP (알칼리성 포스파타아제) 항체 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)와 함께 인큐베이션하였다. 1×세척 완충제로 2-3 회 세척한 후, 특이적 DNA 프로브는 막 블롯에 결합된 채로 남고, CDP-스타 화학발광 핵산 검출 시스템(CDP-Star Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System) (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나폴리스, 인디애나)를 사용하여 제조자의 권고에 따라 DIG-표지된 DNA 표준을 시각화하였다. 블롯을 하나 이상의 시점 동안 화학발광 필름에 노출시켜서 혼성화 절편을 검출하고 분자 크기 표준을 시각화하였다. 필름을 올-프로 100 플러스(All-Pro 100 Plus) 필름 현상기 (코니카 미놀타(Konica Minolta), 오사카, 일본)으로 현상하고, 영상을 스캔하였다. 검출된 밴드의 수 및 크기를 각 프로브에 대해 기록하였다 (표 5). 기술된 바와 같은 DIG 검출 후에 보이는, DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II (DIG MWM II) 및 DIG-표지된 DNA 분자량 마커 VII (DIG MWM VII)를 사용하여 서던 블롯 상의 혼성화 절편 크기를 측정하였다.
Figure 112013059698409-pct00005
실시예 4.5: 서던 블롯 결과
aad-12 및 2mepsps PTU의 공지된 제한 효소 부위를 기초로 하는, 특정 소화물 및 프로브의 예상 절편 크기 및 관찰된 절편 크기가 표 6에 제공된다. 예상 절편 크기는 pDAB8264의 플라스미드 지도에 기초하고, 관찰된 절편 크기는 이들 분석의 대략적 결과이고, DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II 및 마크 VII 절편의 지시된 크기에 기초한다.
2 가지 유형의 절편이 이들 소화물 및 혼성화로부터 확인되었다: 공지된 효소 부위가 프로브 영역을 플랭킹하고 aad-12 및 2mepsps PTU의 삽입 영역 내에 완전히 함유되는 내부 절편 및 공지된 효소 부위가 프로브 영역의 한 말단에 위치하고, 제2 부위가 대두 게놈 내에 예상되는 경계 절편. 대부분의 경우, DNA 절편 통합 부위가 각 이벤트에 대해 독특하기 때문에, 경계 절편 크기는 이벤트에 따라 다르다. 경계 절편은, 제한 효소 부위를 통합된 DNA에 대해서 위치시키고 DNA 삽입물의 개수를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 이벤트 pDAB8264.44.06.1를 함유하는 대두의 복수의 세대에 대해 완성된 서던 블롯 분석은, 플라스미드 pDAB8264로부터의 낮은 카피, 무손상 aad-12 및 2mepsps PTU가 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 시사하는 데이터를 생성하였다.
Figure 112013059698409-pct00006
제한 효소 NcoI 및 HinD III는 플라스미드 pDAB8264 내에 독특한 제한 부위에 결합하고 절단한다. 따라서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 내의 aad-12 유전자 삽입물의 분석에 선택되었다. 4,078 bp보다 크거나 3,690 bp보다 큰 경계 절편이 각각 HinD III 및 NcoI 소화 후 프로브와 혼성화할 것으로 예상되었다 (표 6). HinDIII 및 NcoI이 각각 사용될 때, 대략 7,400 bp 및 대략 3,800 bp의 단일 aad-12 혼성화 밴드가 관찰되었다. 상기 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 대두 게놈 내에 aad-12 유전자에 대한 단일의 삽입 부위의 존재를 시사한다. aad-12 식물 전사 유닛 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)을 함유한 절편을 방출하기 위해 제한 효소 BstZ17I, NsiI 및 PacI를 선택하였다 (표 6). 예상된 대략 5,000, 대략 5,000 및 대략 6,800 bp 절편이 각각 BstZ17I, NsiI 및 PacI 소화 후 프로브로 관찰되었다. pDAB8264.44.06.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화를 통해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB8264로부터의 무손상 aad-12 PTU가 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다. 또한, HinDIII, NcoI, NsiI 및 BstZ17I 제한 절편에 대해 생산된 혼성화 밴드의 분자량 크기는, aad-12 PTU가 또한 연결된 pat PTU를 함유함을 나타낸다.
제한 효소 BstZ17I, NcoI 및 NsiI는 플라스미드 pDAB8264 내에 제한 부위에 결합하고 절단한다. 따라서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 내의 2mepsps 유전자 삽입물의 분석에 선택되었다. 4,858 bp보다 크거나 3,756 bp보다 크거나 5,199 bp보다 큰 경계 절편이 각각 BstZ17I, NcoI 및 NsiI 소화 후 프로브와 혼성화할 것으로 예상되었다 (표 6). BstZ17I, NcoI 및 NsiI이 각각 사용될 때, 대략 16,000 bp, 대략 6,100 bp 및 대략 5,300 bp의 단일 2mepsps 혼성화 밴드가 관찰되었다. 상기 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 대두 게놈 내에 2mepsps 유전자에 대한 단일의 삽입 부위의 존재를 시사한다. 2mepsps 식물 전사 유닛 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)을 함유한 절편을 방출하기 위해 제한 효소 PacI를 선택하였다 (표 6). 예상된 대략 6,800 bp 절편이 PacI 소화 후 프로브로 관찰되었다. pDAB8264.44.06.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화를 통해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB8264로부터의 무손상 2mepsps PTU가 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.6: 골격 서열의 부재
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 내에 스펙티노마이신 내성 유전자 (specR), Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA (trf A 요소)의 부재를 검증하기 위해 서던 블롯 분석을 또한 수행하였다. 적합한 양성 (pDAB8264 플러스 매버릭) 및 음성 (매버릭) 대조군이 서던 분석을 위해 포함될 경우, 스펙티노마이신 내성, Ori Rep 요소 또는 trf A 요소에 특이적인 혼성화는 예상되지 않는다. Hind III 소화 및 specR 특이적 프로브와의 혼성화에 이어, 하나의 예상되는 대략 9,300 bp 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (pDAB8264 플러스 매버릭)에서는 발견되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 샘플로부터는 부재이었다. 유사하게, Pac I 소화 및 OriRep 특이적 프로브 및 trfA 특이적 프로브의 혼합물과의 혼성화 후, 하나의 예상되는 대략 9,200 bp의 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (pDAB8264 플러스 매버릭)에서는 검출되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 샘플로부터는 부재이었다. 이들 데이터는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 내의 스펙티노마이신 내성 유전자, Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA의 부재를 나타낸다.
실시예 5: 작물학적 수율 및 제초제 내성 평가
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 작물학적 특성 및 제초제 내성을 단일의 재배 시즌 동안 복수의 지리적 장소에서 수율 실험으로 연구하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1와 매버릭 대조군 식물 간에 작물학적으로 의미있는 의도되지 않은 차이점이 관찰되지 않았다. 연구 결과는, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1가 작물학적으로 매버릭 대조군 식물과 동등함을 입증하였다. 또한, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1는 글리포세이트 및 2,4-D의 탱크혼합물이 분무될 경우 강한 제초제 내성을 제공하였다.
하기의 작물학적 특성을 각 장소에서 모든 시험군에 대해 측정하고 기록하였다.
1.) 발아: 1 미터 구획에 심은 종자의 수로 스탠드(Stand) 수를 나누고, 100을 곱하여 계산.
2.) V1에서의 묘목 활력(Seedling Vigor): 활력은 토지(plot)의 건강에 대한 전체적 추정이다. 결과는 0-100％의 등급으로 평가하고, 이때 0％는 식물이 모두 사멸한 토지를 나타내고, 100％는 매우 건강해 보이는 토지를 나타낸다.
3.) V3 약품 적용 후 1일, 7일 및 14일에 전체적인 시각적 작물 손상, 황백화 및 괴사를 평가하였다. 전형적인 2,4-D 손상인 상편생장의 조짐에 대해 관찰을 하였다. 상편생장은 잎 및 줄기의 비틀림 또는 처짐으로 나타난다. 모든 작물 손상은 0 내지 100％ 등급을 사용하였고, 이때 0％는 손상 없음을 나타내고, 100％는 완전한 식물 사멸을 나타낸다.
4.) 개화일: 토지에서 식물의 50％가 개화하기 시작하는 날짜를 기록하여 이를 측정하였다. 식재로부터 각 토지의 식물의 50％의 개화까지의 일수를 기록하였다.
5.) R2 또는 R1에서 스탠드 수: 각 토지에서 식물의 평균 활력의 시각적 추정이고, 토지 당 하나의 열 내의 대표적인 1 미터 구획의 식물의 수를 세고, R2 또는 R1 생장 단계에서 기록한다.
6.) R2 약품 적용 후 1일, 7일 및 14일에 전체적인 시각적 작물 손상, 황백화 및 괴사를 평가하였다. 전형적인 2,4-D 손상인 상편생장의 조짐에 대해 관찰을 하였다. 상편생장은 잎 및 줄기의 비틀림 또는 처짐으로 나타난다. 모든 작물 손상은 0 내지 100％ 등급을 사용하였고, 이때 0％는 손상 없음을 나타내고, 100％는 완전한 식물 사멸을 나타낸다.
7.) R6 생장 단계에서 질병 발생: 토지의 질병의 중증도를 기록하는데 사용되는 질병 발생의 시각적 평가이다. 0-100％ 등급으로 평가하였다. 이때 0％는 존재하는 질병이 없음을 나타내고, 100％는 토지의 모든 식물이 질병을 가짐을 나타낸다.
8.) R6 생장 단계에서 곤충 피해: 토지의 곤충 피해의 중증도를 기록하기 위해 사용되는 곤충 피해의 시각적 평가이다. 곤충에 의해 피해를 입은 토지의 식물 조직의 백분율을 0-100％ 등급을 사용하여 기록하였다. 이때 0％는 곤충 피해가 없음을 나타내고, 100％는 토지의 모든 식물이 곤충 피해를 입음을 나타낸다.
9.) 노화기의 식물 높이: 각 토지의 식물의 평균 높이를 기록하였다. 잎이 떨어진 후 식물을 토양 표면으로부터 끝 부분까지 측정하였다. 측정치는 센티미터로 기록하였다. 토지가 도복(lodged)되어 있으면, 대표적인 군의 식물을 세워서 측정치를 얻었다.
10.) 성숙기까지의 날. 토지 내의 95％의 깍지가 생리학적 성숙기에 도달하고, 식물이 드라이 다운(dry down) 색상일 때 날짜를 기록하였다. 식재로부터 지난 날의 수를 계산하였다.
11.) 도복(lodging): 수확 시기에 도복 중증도의 시각적 추정치를 기록하였다. 0 내지 100％ 등급으로 기록하였고, 이때 0％는 도복이 없음을 나타내고, 100％는 토지 내의 모든 식물이 지면에 있음을 나타낸다.
12.) 탈립(shattering): 수확 시기에 깍지 탈립의 시각적 추정치를 기록하였다. 토지 당 탈립된 깍지의 백분율의 추정치로 기록하였다. 0-100％ 등급으로 기록하였고, 0％는 탈립이 없음을 나타내고, 100％는 모든 깍지가 탈립됨을 나타낸다.
13.) 수율: 각 토지로부터 수확된 낟알의 중량을 기록하였다. 2 개의 열 토지 전체를 수확하고 종자 중량 및 수분을 기록하였다. 13％ 수분으로 조절하여 bu/acre를 계산하였다.
14.) 100 개의 종자 중량: 각 토지에 대해 100 개의 종자를 세고, 그 중량을 그램으로 기록하였다.
2 중량％ 황산 암모늄 (AMS)과 혼합된 2,4-D 및 글리포세이트의 탱크혼합물을 2,185 g ae/ha로 적용한 후, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 제초제 내성을 평가하였다. 제초제를 V3/R2 순차적 제초제 처리로 분무하였다. 상기 제초제 처리는 V3 생장 단계의 대두 식물에 분무하고, R2 발달 생장 단계에서 두 번째 순차적 적용함으로서 완료되었다. V3 생장 단계는 단소엽 및 처음 세 개의 작은 잎이 완전히 발달하였을 때를 특징으로 한다. R2 생장 단계는 충분히 발달한 잎과 주 줄기 상의 2 개의 가장 위의 마디 중의 하나에 하나의 꽃이 개화하는 것을 특징으로 한다.
각 처리에 대해 4 번의 반복 실험으로 무작위의 완전한 블록 설계를 사용하여 이들 실험을 준비하였다. 각 토지는 2 개의 열의 폭이었고, 열들은 30 인치 떨어져서 있었다. 토지 간에 2.5 내지 3.0 피트 통로를 두고 총 길이 12.5 피트의 토지에 식재하였다. 매버릭 대조군 식물은 제초제 적용으로부터 사멸할 것으로 예상되어, 트랜스진 대두 식물 열로부터 멀리 별도의 토지에서 재배되었다.
분무되지 않은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 비교한, 2,4-D 및 글리포세이트 제초제 탱크 혼합물로 분무된 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 결과가 요약되어 있다. 표 7은 2,4-D 및 글리포세이트 탱크혼합물이 분무된 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1를 분무되지 않은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1과 비교하여 결과의 평균을 제시한다. 제초제 적용은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 해를 입히지 않았고, 이들 식물은 표 7에 열거된 기록된 작물학적 특성에 대해 분무되지 않은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 식물과 동등하였다. V3 발달 단계에서 일부 이른 일시적 손상 1 및 7 daa (적용 후 일수) 및 R2 발달 단계의 1, 7 및 14 daa에서 예외는 있지만, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1는 2,4-D 및 글리포세이트 탱크 혼합물에 대해 강한 내성을 보였다. 반면에, 매버릭 식물은 제초제 분무한 후에는 모두 생존하지 못했다.
Figure 112013059698409-pct00007
대조군 계통 매버릭과 비교된 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 작물학적 특성을 평가하였다. 이들 실험은 2 번의 반복실험으로 블록 설계를 사용하여 준비하였다. 각 토지는 2 개의 열의 폭이었고, 열들은 30 인치 떨어져 있었다. 토지 간에 2.5 내지 3.0 피트 통로를 두고 총 길이 12.5 피트의 토지에 식재하였다.
표 8은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 작물학적 특성을 대조군 계통 매버릭과 비교하여 결과의 평균을 제시한다. 작물학적 데이터는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1가 매버릭 식물과 특성이 동등하고, 작물학적으로 의미있는 의도하지 않은 차이를 초래하지 않음을 나타낸다.
Figure 112013059698409-pct00008
실시예 6: 이벤트 특이적 TaqMan 검정
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 존재를 검출하고, 육종 집단에서 식물의 접합성 상태를 결정하기 위해 2 회의 이벤트 특이적 TAQMAN 검정을 개발하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1는 이원성 벡터 pDAB8264의 T-스트랜드를 함유한다 (도 1). 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 특이적 검출을 위해, 특이적 Taqman 프라이머와 프로브를, 5' (서열 14) 또는 3' (서열 15) 삽입물-대-식물 접합부에 위치한 DNA 서열에 따라서 설계하였다 (도 4). 5' 통합 접합부에 걸쳐 있는 98 bp DNA 절편 (서열 16)을 2 개의 프라이머와 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems, ABI)에 의해 합성된, 5' 말단에 FAM 리포터를 함유한 표적-특이적 MGB 프로브를 사용하여 특이적으로 검출하게 위해, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 하나의 이벤트 특이적 검정을 설계하였다. 3' 통합 접합부에 걸쳐 있는 131 bp DNA 절편 (서열 17)을 2 개의 특이적 프라이머와 ABI에 의해 합성된, 5' 말단에 FAM 리포터를 함유한 표적-특이적 MGB 프로브를 사용하여 특이적으로 검출하게 위해, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 또 다른 이벤트 특이적 검정을 설계하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 상기 Taqman 검출 방법의 특이성을 2mEPSPS 및 aad-12 PTU를 함유한 11 종의 상이한 이벤트 및 대조군 비-트랜스진 대두 품종 (매버릭)에 대해 이중 형식으로 대두 특이적 내인성 기준 유전자 GMFL01-25-J19 (글리신 맥스 cDNA, 진뱅크: AK286292.1)를 사용하여 시험하였다.
실시예 6.1: gDNA 단리
11 종의 상이한 대두 이벤트 및 비-트랜스진 대두 품종의 gDNA 샘플을 이번 연구에서 시험하였다. 변형된 퀴아젠 맥어트랙트(Qiagen MagAttract) 식물 DNA 키트 (퀴아젠, 발렌시아, 캘리포니아)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 신선한 대두 잎 디스크, 샘플 당 8 개를 gDNA 추출을 위해 사용하였다. gDNA를 피코 그린 방법을 사용하여 공급자의 설명에 따라 정량하였다 (몰라큘라 프로브스(Molecular Probes), 유진(Eugene),오리건). 샘플을 DNA아제가 없는 물로 희석하여, 이번 연구의 목적을 위한 10 ng/㎕의 농도를 얻었다.
실시예 6.2: Taqman 검정과 결과
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 Taqman 검정을 위해 특이적 Taqman 프라이머와 프로브를 설계하였다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 내에 트랜스진을 검출하기 위해 하기 열거된 조건으로 이들 시약이 사용될 수 있다. 표 9는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 검출을 위해 특이적으로 개발된 프라이머 및 프로브 서열을 열거한다.
Figure 112013059698409-pct00009
증폭을 위한 다중 PCR 조건은 다음과 같다: 총 반응물 10 ㎕ 중의 1×로슈 PCR 완충액, 0.4 μM 이벤트 특이적 전방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 특이적 역방향 프라이머, 0.4 μM 프라이머 GMS116 F, 0.4 μM GMS116 R, 0.2 μM 이벤트 특이적 프로브, 0.2 μM GMS116 프로브, 0.1％ PVP, 20 ng gDNA. 그 칵테일을 다음의 조건을 사용하여 증폭하였다: i) 10 분 동안 95 ℃, ii) 10 초 동안 95 ℃, iii) 30 초 동안 60 ℃, iv) 1 초 동안 72 ℃, v) ii-iv 단계를 35 사이클 반복, v) 40 ℃ 유지. 실시간 PCR을 로슈 라이트사이클러(LightCycler) 480 상에서 수행하였다. 데이터 분석은 라이트사이클러 480 소프트웨어로 측정된, 형광의 변화율이 그것의 최대에 도달할 때의 PCR 사이클 수인 교차점(crossing point, Cp 값)의 측정에 기초하였다.
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1에 대한 Taqman 검출 방법을 2mEPSPS 및 aad-12 PTU를 함유한 11 종의 상이한 이벤트 및 비-트랜스진 대두 품종에 대해 이중 형식으로 대두 특이적 내인성 기준 유전자 GMFL01-25-J19 (진뱅크: AK286292.1)를 사용하여 시험하였다. 검정은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1를 특이적으로 검출하였고, 대조군 (즉, 2mEPSPS 및 aad-12 PTU를 함유한 11 종의 상이한 이벤트 및 비-트랜스진 대두 품종)으로부터 거짓-양성 결과를 생성하거나 증폭하지 않았다. 이벤트 특이적 프라이머와 프로브는 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 검출을 위해 사용될 수 있고, 이들 조건 및 시약은 접합성 검정에 적용가능하다.
실시예 7: 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 전장 서열
서열 27은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 전장 서열을 제공한다. 상기 서열은 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB8264으로부터의 통합된 T-스트랜드 삽입물 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 함유한다. 서열 27에 관하여, 잔기 1-1494는 5' 게놈 플랭킹 서열이고, 잔기 1495-1497은 3 쌍의 염기 쌍 삽입물이고, 잔기 1498 - 11,774는 pDAB8264 T-스트랜드 삽입물이고 잔기 11,775 - 13,659는 3' 플랭킹 서열이다. 따라서 접합부 서열 또는 삽입물의 5' 말단에 대한 전이부는 서열 27의 잔기 1494 - 1495에서 발생한다. 따라서 접합부 서열 또는 삽입물의 3' 말단에 대한 전이부는 서열 27의 잔기 11,774 -11,775에서 일어난다. 서열 27은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 폴리뉴클레오티드 서열이고, PCR 증폭 반응을 통해 생산되고, ABI 빅 다이® 종결인자(Big Dye Terminator) 시퀀싱 반응 키트 (어플라이드 바이오시스템스, 포스터 시티, 캘리포니아)를 사용하여 시퀀싱된 복수의 PCR 콘틱의 정렬으로부터 조립되었다.
실시예 8: 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 대두 곤충 내성 이벤트 pDAB9582.812.9.1의 육종 스택(stack)
실시예 8.1: 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 대두 곤충 내성 이벤트 pDAB9582.812.9.1의 유성 교배
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1와 유성 교배시켰다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 화분을 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1의 암술머리에 걸쳐 손으로 문지름으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1을 수정시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 모두로부터 통합 이벤트를 합유한 생성된 F1 자손을 2,4-D 및 글리포세이트 제초제에 대한 내성에 대해 스크리닝하여 통합 이벤트 둘 다를 함유한 자손 식물을 확인하였다. 다음으로, F1 자손 식물을 자가-수정시켜, 양 이벤트 모두에 대해 독립적으로 차별되는 것으로 확인된 F2 자손을 생산하였다. F2 식물에 2,4-D (1120 g ae/ha) 및 글리포세이트 (1120 g ae/ha)를 모두 함유한 단일의 제초제를 분무하였다. 생성된 F2 식물을 Taqman 접합성 기초 검정을 사용하여 스크리닝하여 양 이벤트 모두에 대해 동형인 식물을 확인하였다. 이들 F2 동형 식물의 자가 수정은 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 모두에 대해 동형인 F3 자손을 생산하였다. 생성된 이벤트는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1로 표지되었다.
실시예 8.2: 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 접합성 상태의 결정
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1의 육종 교배로부터 생산된 식물의 접합성 상태를 결정하기 위해, pDAB9582.812.9.1 또는 pDAB8264.44.06.1 중의 하나 통합 이벤트의 존재를 검출하기 위한 별도의 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 개발하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1과 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 교배의 자가 수정으로부터 생산된 분리된 F2 식물을 이들 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 사용하여 시험하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 모두 함유하고, 양 이벤트 모두에 대해 동형접합성인 개별적 식물을 확인하였다.
gDNA 단리
대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 분리된 F2 식물로부터의 gDNA 샘플을 이번 연구에서 시험하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 3,187 종의 분리된 F2 식물로부터 신선한 대두 잎 디스크, 식물 당 4 개를 수집하였다. 변형된 퀴아젠 맥어트랙트 식물 DNA 키트 (퀴아젠, 발렌시아, 캘리포니아)를 사용하여 이들 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
TAQMAN® 검정 및 결과
대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 (미국 가출원 제61/471845호) 및 pDAB8264.44.06.1 (상술됨)에 대해 개별적인 이벤트 특이적 검정의 사용을 위해 TAQMAN® 프라이머와 프로브를 상술한 바와 같이 설계하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택 내에 함유된 각 통합 이벤트의 접합성을 결정하기 위해 하기 열거된 조건으로 이들 시약이 사용되었다.
증폭을 위한 다중 PCR 조건은 다음과 같다: 총 반응물 10 ㎕ 중의 1×로슈 PCR 완충액, 0.4 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 전방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 역방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB9582.812.9.1 특이적 전방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB9582.812.9.1 특이적 역방향 프라이머, 0.4 μM 프라이머 GMS116 F, 0.4 μM 프라이머 GMS116 R, 0.2 μM 이벤트 pDAB9582.812.9.1 특이적 프로브, 0.2 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 프로브, 0.2 μM GMS116 프로브, 0.1％ PVP, 20 ng gDNA. 그 칵테일을 다음의 조건을 사용하여 증폭하였다: i) 10 분 동안 95 ℃, ii) 10 초 동안 95 ℃, iii) 30 초 동안 60 ℃, iv) 1 초 동안 72 ℃, v) ii-iv 단계를 35 사이클 반복, v) 40 ℃ 유지. 실시간 PCR을 로슈 라이트사이클러® 480 상에서 수행하였다. 데이터 분석은 라이트사이클러® 480 소프트웨어로 측정된, 형광의 변화율이 그것의 최대에 도달할 때의 PCR 사이클 수인 교차점(Cp 값)의 측정에 기초하였다.
대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 교배로부터 생산된 총 3,187 개의 분리된 F2 식물을 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 사용하여 시험하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 모두에 대한 개별적 식물의 접합성을 결정하였다. 이들 검정으로부터의 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1가 2,360 종의 식물에서 모두 존재하고 검출됨을 나타내었다. 각 통합 이벤트의 접합성 상태 (또한 배수성 수준으로 기술됨)가 표 9b에 나타나 있다. 2,360 종의 확인된 식물 중 237 종은 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 2 개의 카피를 함유하는 것으로 결정되었다.
[표 9b]
Figure 112013059698409-pct00010
실시예 8.3: 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서의 단백질 발현의 분석
대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 발현된 재조합 Cry1F, Cry1Ac, AAD12, 2mEPSPS 및 PAT 단백질의 생화학적 특성을 분석하였다. 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 PAT 발현을 정량하였다. 비교해 보면, Cry1Ac/Cry1F 및 AAD12/2mEPSPS 단백질은 메소-스케일 디스커버리(Meso-Scale Discovery) (MSD, 게이더스버그(Gaithersburg), 메릴랜드)로부터의 전기화학발광 기술을 이용한 다중 면역검정법으로 정량하였다. 총괄하여, 이들 검정은 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택 내의 이들 단백질의 생화학적 특성을 분석하고, 강한 발현을 확인하기 위해 사용되었다.
식물 조직에서 PAT 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 PAT 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 PAT 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1와 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 PAT 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 정량 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다 (APS 014, 엔비롤로직스(Envirologix), 포틀랜드, ME). 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®(GenoGrinder)를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 PAT ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (엔비롤로직스, 포틀랜드, ME).
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 육종 스택, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 F3 세대는 부모 이벤트인 pDAB9582.812.9.1 및 pDAB8264.44.06.1보다도 높은 농도로 PAT를 발현하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 육종 스택에서의 증가된 PAT 농도가 예상되었다. 더 높은 농도의 PAT는, 부모 이벤트와 비교할 때 2 배 많은 pat 코딩 서열의 카피를 함유한 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 결과이다 (표 10).
Figure 112013059698409-pct00011
식물 조직에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1과 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 다중 전기화학발광 MSD 검정을 사용하여 측정하였다. 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 메소-스케일 디스커버리로부터의 Cry1F/Cry1Ac 다중 MSD 검정을 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F3 세대는 부모 대두 이벤트인 pDAB9582.812.9.1보다 높은 농도로 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 발현하였다 (표 11). 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 식물이, 부모 계통인 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1로부터 유전된 cry1F 및 cry1Ac 코딩 서열의 기능적으로 발현된 카피를 함유하였음을 나타낸다.
Figure 112013059698409-pct00012
식물 조직에서 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1과 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 다중 전기화학발광 MSD 검정을 사용하여 측정하였다. 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 메소-스케일 디스커버리로부터의 AAD12 및 2mEPSPS 다중 MSD 검정을 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F3 세대는 부모 대두 이벤트인 pDAB8264.44.06.1보다 높은 농도로 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 발현하였다 (표 12). 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 식물이, 부모 계통인 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1로부터 유전된 aad-12 및 2mEPSPS 코딩 서열의 기능적으로 발현된 카피를 함유하였음을 나타낸다.
Figure 112013059698409-pct00013
실시예 8.4: 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 제초제 내성
육종 스택인 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 제초제 내성을 2 회의 재배기 동안 검정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 종자를 식재하였고, 성숙기까지 재배하였다. 성숙 식물에 2,4-D 및 글리포세이트의 조합으로 구성된 단일의 제초제를 분무하였다. 생존한 식물의 수를 세어서 이들 제초제에 대한 결과적 내성을 측정하였다. 비교해 보면, aad-12 및 2mEPSPS 유전자를 함유하지 않았고, 2,4-D 및 글리포세이트의 적용에 민감할 것으로 예상되었던 대조군 식물도 연구에 포함되었다.
첫 번째 시즌 동안, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F2 분리된 혈통의 120 개의 현장 재배지에서 제초제 내성을 평가하였다. 각 토지는 1 개의 열의 폭이었고, 열들은 30 인치 떨어져 있었다. 토지 간에 4.5 피트 통로를 두고 12 피트 센터의 (총 식재 길이 7.5 피트)에 토지에 식재하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F2 분리된 혈통으로부터 총 4,364 종의 식물에 2,4-D 및 글리포세이트의 혼합물을 분무하였다 (1120 g ae/ha). V3와 V4 생장 단계 사이에 글리포세이트/2,4-D 제초제를 단일 분무하였다. V3 생장 단계는 단소엽 및 처음의 세 개의 작은 잎이 충분히 발달한 것을 특징으로 하고, V4 생장 단계는 단소엽 및 처음의 네 개의 작은 잎이 충분히 발달한 것을 특징으로 한다. 제초제 처리를 완료한 후에, 토지를 관찰하였고 3,234 종의 식물이 제초제의 적용에 대해 내성이 있는 것으로 확인되었다. 제초제 적용에 대해 민감하였던 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 식물은 pDAB8264.44.06.1 통합 이벤트의 멘델 분리의 결과로 aad-12 및 2mEPSPS의 카피를 함유하지 않았다.
두 번째 시즌 동안, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 온실 재배된 F3 동형접합성 식물에서 제초제 내성을 평가하였다. 화분 당 하나의 식물을 함유한 4 인치 화분에서 대두 식물을 재배하였다. 총 15 종의 F3 동형접합성 식물에 2,4-D 및 글리포세이트를 단일 분무하였다 (840 ae/ha). 제초제를 분무한 후 모든 15 종의 식물이 생존하였고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 식물이 제초제인 글리포세이트 및 2,4-D의 적용에 내성이 있음을 나타낸다.
요약하면, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 부모 계통 내에 존재하였던 aad-12 및 2mEPSPS 유전자는 2,4-D 및 글리포세이트 제초제에 내성을 부여하였다. 이들 형질은 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 내로 건네지고 유전됨으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1에 제조체 내성을 제공하였다. 비교해 보면, aad-12 및 2mEPSPS 유전자를 함유하지 않았던 대조군 식물은 2,4-D 및 글리포세이트 제초제의 인가에 민감하였다.
실시예 8.5: 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 살충 활성의 분석
cry1Ac 및 cry1F 트랜스진의 발현으로부터 초래되는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 살충 내성을 분석하기 위해 온실 평가를 수행하였다. 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) (벨벳빈(velvetbean) 애벌레) 및 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens) (대두 자벌레)를 포함하는, 실험실에서 배양된 대두 곤충에 대해 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1을 시험하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택을 부모 대두 이벤트 (대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1) 및 또한 형질전환되지 않은 대두 품종 매버릭과 비교하였다. Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공된 식물 보호의 수준이, 추가의 트랜스진을 대두 식물의 게놈 내로 도입한 육종 스택 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 비교를 하였다. 또한, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에, 곤충 생물검정 전에 2,4-D 및 글리포세이트 (840 g ae/ha)를 함유하는 단일 제초제를 분무하여, 제초제의 분무가 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공되는, 곤충으로부터의 식물 보호에 어떤 효과를 주는지 측정하였다.
온실 시험을 대략 3 주령 식물 상에서 수행하였다. 10 종의 식물 각각을 사용하여, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1 및 음성 대조군; 제초제 분무된 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 매버릭의 육종 스택을 평가하였다. 각 시험된 곤충 균주 (안티카르시아 겜마탈리스 및 크리소데익시스(Chrysodeixis) (이전에 슈도플루시아) 인클루덴스)에 대해서, 각 식물로부터 총 30 종의 잎 디스크/식물/곤충 균주로 3 종의 잎 펀치(punch)를 제조하였다. 1.4 cm 직경 (또는 1.54 cm2) 잎 펀치를 1 종의 신생 유충이 들끓는 2％ 물 아가의 상부의 시험장 내에 두었고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 침입 후 4 일에 치사성 및 잎 소비를 평가하였다. 약한 탐지에 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 곤충에 의해 소비된 잎 펀치의 백분율을 시각적으로 등급을 매겨 잎 피해를 평가하였다. JMP® 프로 9.0.1 (2010 SAS 인스티튜트 인크., 캐리, 노스캐롤라이나)를 사용하여 통계적 분석을 데이터에 대해 수행하였다.
이들 반복된 실험으로부터 얻은 결과 (표 13)는 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공된 곤충 보호 및 치사성의 수준이 부모 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1와 일치함을 나타내었다. 예상된 바와 같이, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 (58-76％) 및 매버릭 (79-91％) 대조군 식물보다 모든 시험한 곤충에 대해 상당히 더 낮은 곤충 피해(0.10-0.15％)를 당하였다. 추가로, 음성 대조군인 매버릭 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1은 <10％ 곤충 치사성이 나타난 반면에, cry1F 및 cry1Ac 코딩 서열을 함유한 모든 대두 이벤트에 대해 높은 곤충 치사성 (100％)이 기록되었다. 따라서, 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1은 부모 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1에 상응하는 수준으로 살충 활성으로부터 보호를 제공하였다.
Figure 112013059698409-pct00014
실시예 9: 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 스택 및 대두 곤충 내성 이벤트 pDAB9582.814.19.1
실시예 9.1: 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1과 대두 곤충 내성 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 유성 교배
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1와 유성 교배시켰다. 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 화분을 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 암술머리에 손으로 문지름으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1을 수정시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 모두로부터 통합 이벤트를 함유한 생성된 F1 자손을 2,4-D 및 글리포세이트 제초제에 대한 내성에 대해 스크리닝하여 통합 이벤트 모두를 함유한 자손 식물을 확인하였다. 다음으로, F1 자손 식물을 자가-수정시켜, 양 이벤트 모두에 대해 독립적으로 분리되는 것으로 확인된 F2 자손을 생산하였다. F2 식물에 2,4-D (840 g ae/ha) 및 글리포세이트 (840 g ae/ha)를 모두 함유한 단일의 제초제를 분무하였다. 생성된 F2 식물을 Taqman 접합성 기초한 검정을 사용하여 스크리닝하여 양 이벤트 모두에 대해 동형접합성인 식물을 확인하였다. 이들 F2 동형접합성 식물의 자가 수정은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 모두에 대해 동형접합성인 F3 자손을 생산하였다. 생성된 이벤트는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1로 표지되었다.
실시예 9.2: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 접합성 상태의 결정
대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1의 육종 교배로부터 생산된 식물의 접합성 상태를 결정하기 위해, pDAB9582.814.19.1 또는 pDAB8264.44.06.1 중의 하나 통합 이벤트의 존재를 검출하기 위한 별도의 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 개발하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1과 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 교배의 자가 수정으로부터 생산된 분리된 F2 식물을 이들 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 사용하여 시험하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1을 모두 함유하고, 양 이벤트 모두에 대해 동형접합성인 개별적 식물을 확인하였다.
gDNA 단리
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 분리된 F2 식물로부터의 gDNA 샘플을 이번 연구에서 시험하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 37 종의 분리된 F2 식물로부터 신선한 대두 잎 디스크, 식물 당 4 개를 수집하였다. 변형된 퀴아젠 맥어트랙트 식물 DNA 키트® (퀴아젠, 발렌시아, 캘리포니아)를 사용하여 이들 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
TAQMAN® 검정 및 결과
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 (미국 가출원 제61/471845호) 및 pDAB8264.44.06.1 (상술됨)에 대해 개별적인 이벤트 특이적 검정의 사용을 위해 TAQMAN® 프라이머와 프로브를 상술한 바와 같이 설계하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택 내에 함유된 각 통합 이벤트의 접합성을 결정하기 위해 하기 열거된 조건으로 이들 시약이 사용되었다.
증폭을 위한 다중 PCR 조건은 다음과 같다: 총 반응물 10 ㎕ 중의 1×로슈 PCR 완충액, 0.4 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 전방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 역방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB9582.814.19.1 특이적 전방향 프라이머, 0.4 μM 이벤트 pDAB9582.814.19.1 특이적 역방향 프라이머, 0.4 μM 프라이머 GMS116 F, 0.4 μM 프라이머 GMS116 R, 0.2 μM 이벤트 pDAB9582.814.19.1 특이적 프로브, 0.2 μM 이벤트 pDAB8264.44.06.1 특이적 프로브, 0.2 μM GMS116 프로브, 0.1％ PVP, 20 ng gDNA. 그 칵테일을 다음의 조건을 사용하여 증폭하였다: i) 10 분 동안 95 ℃, ii) 10 초 동안 95 ℃, iii) 30 초 동안 60 ℃, iv) 1 초 동안 72 ℃, v) ii-iv 단계를 35 사이클 반복, v) 40 ℃ 유지. 실시간 PCR을 로슈 라이트사이클러® 480 상에서 수행하였다. 데이터 분석은 라이트사이클러® 480 소프트웨어로 측정된, 형광의 변화율이 그것의 최대에 도달할 때의 PCR 사이클 수인 교차점(Cp 값)의 측정에 기초하였다.
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 교배로부터 생산된 총 37 개의 분리된 F2 식물을 이벤트 특이적 TAQMAN® 검정을 사용하여 시험하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 모두에 대한 개별적 식물의 접합성을 결정하였다. 이들 검정으로부터의 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1가 23 종의 식물에서 모두 존재하고 검출됨을 나타내었다. 각 통합 이벤트의 접합성 상태 (또한 배수성 수준으로 기술됨)가 표 14에 나타나 있다. 23 종의 확인된 식물 중 1 종은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 2 개의 카피를 함유하는 것으로 확인되었다.
Figure 112013059698409-pct00015
실시예 9.3: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서의 단백질 발현의 분석
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 발현된 재조합 Cry1F, Cry1Ac, AAD12, 2mEPSPS 및 PAT 단백질의 생화학적 특성을 분석하였다. 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 PAT 발현을 정량하였다. 비교해 보면, Cry1Ac/Cry1F 및 AAD12/2mEPSPS 단백질은 메소-스케일 디스커버리 (MSD, 게이더스버그, 메릴랜드)로부터의 전기화학발광 기술을 이용한 다중 면역검정법으로 정량하였다. 총괄하여, 이들 검정은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택 내의 이들 단백질의 생화학적 특성을 분석하고, 강한 발현을 확인하기 위해 사용되었다.
식물 조직에서 PAT 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 PAT 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 PAT 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1와 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 PAT 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 정량 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다 (APS 014, 엔비롤로직스, 포틀랜드, ME). 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 샌드위치 형식으로 PAT ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다 (엔비롤로직스, 포틀랜드, ME).
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 육종 스택, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 F3 세대는 부모 이벤트인 pDAB9582.814.19.1 및 pDAB8264.44.06.1보다도 높은 농도로 PAT를 발현하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 육종 스택에서의 증가된 PAT 농도가 예상되었다. 더 높은 농도의 PAT는, 부모 이벤트와 비교할 때 2 배 많은 pat 코딩 서열의 카피를 함유한 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 결과이다 (표 15).
Figure 112013059698409-pct00016
식물 조직에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1과 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 다중 전기화학발광 MSD 검정을 사용하여 측정하였다. 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 메소-스케일 디스커버리로부터의 Cry1F/Cry1Ac 다중 MSD 검정을 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F3 세대는 부모 대두 이벤트인 pDAB9582.814.19.1보다 높은 농도로 Cry1Ac 단백질을 발현하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F3 세대는 부모 대두 이벤트인 pDAB9582.814.19.1보다 높은 농도로 Cry1F 단백질을 발현하였다 (표 16). 발현 수준에서의 가변성에도 불구하고, 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 식물이, 부모 계통인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1로부터 유전된 cry1F 및 cry1Ac 코딩 서열의 기능적으로 발현된 카피를 함유하였음을 나타낸다.
Figure 112013059698409-pct00017
식물 조직에서 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 발현
이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 이벤트 pDAB8264.44.06.1 통합 모두에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 F3 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에서 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 수준을 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1로부터 발현된 AAD12 및 2mEPSPS 단백질의 수준을 부모 이벤트인 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1과 비교하였다.
가용성, 추출 가능한 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 대두 잎 조직으로부터 수득하였고, 다중 전기화학발광 MSD 검정을 사용하여 측정하였다. 대두 잎 조직의 샘플을 온실에서 재배한 V1 단계의 단엽의 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 처리하였다. 계면활성제 트윈-20 (PBST) 및 1％ 폴리비닐피롤리돈 40 (PVP-40)을 함유한 인산염 완충된 염수 용액을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 추출하였다. 이어서 제노그라인더®를 5 분 동안 1500 rpm에서 사용하여 샘플을 추출하였다. 식물 추출물을 원심분리하였고, 수성 상층액을 수집하고, 필요한 경우 적합한 완충액으로 희석하고, 메소-스케일 디스커버리로부터의 AAD12 및 2mEPSPS 다중 MSD 검정을 사용하여 분석하였다. 키트를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 사용하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 발현 및 유전력을 조사하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 F3 세대는 부모 대두 이벤트인 pDAB8264.44.06.1보다 높은 농도로 AAD12 및 2mEPSPS 단백질을 발현하였다 (표 17). 발현 수준에서의 가변성에도 불구하고, 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 식물이, 부모 계통인 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1로부터 유전된 aad-12 및 2mEPSPS 코딩 서열의 기능적으로 발현된 카피를 함유하였음을 나타낸다.
Figure 112013059698409-pct00018
실시예 9.4: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 제초제 내성
육종 스택인 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 제초제 내성을 검정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 종자를 온실에서 식재하였고, 성숙 식물에 2,4-D 및 글리포세이트의 조합으로 구성된 단일의 제초제를 분무하였다. 생존한 식물의 수를 세어서 이들 제초제에 대한 결과적 내성을 측정하였다. 비교해 보면, aad-12 및 2mEPSPS 유전자를 함유하지 않았고, 2,4-D 및 글리포세이트의 적용에 민감할 것으로 예상되었던 대조군 식물도 연구에 포함되었다.
대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 온실 재배된 F2 식물에서 제초제 내성을 평가하였다. 화분 당 하나의 식물을 함유한 4 인치 화분에서 대두 식물을 재배하였다. 단일엽 생장 단계에서 총 37 종의 F3 동형접합성 식물에 2,4-D 및 글리포세이트를 단일 분무하였다 (840 ae/ha). 제초제를 분무한 후 모든 25 종의 식물이 생존하였고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 식물이 제초제인 글리포세이트 및 2,4-D의 적용에 내성이 있음을 나타낸다.
요약하면, 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 부모 계통 내에 존재하였던 aad-12 및 2mEPSPS 유전자는 2,4-D 및 글리포세이트 제초제에 내성을 부여하였다. 이들 형질은 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 내로 건네지고 유전됨으로써, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1에 제조체 내성을 제공하였다. 제초제 적용에 대해 민감하였던 대두 이벤트 pDAB9582.812.9.1::pDAB8264.44.06.1 식물은 pDAB8264.44.06.1 통합 이벤트의 멘델 분리의 결과로 aad-12 및 2mEPSPS의 카피를 함유하지 않았다. 추가로, aad-12 및 2mEPSPS 유전자를 함유하지 않았던 대조군 식물은 2,4-D 및 글리포세이트 제초제의 적용에 민감하였다.
실시예 9.5: 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 살충 활성의 분석
Cry1Ac 및 Cry1F 트랜스진의 발현으로부터 초래되는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 살충 내성을 분석하기 위해 온실 평가를 수행하였다. 안티카르시아 겜마탈리스 (벨벳빈 애벌레) 및 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)를 포함하는, 실험실에서 배양된 대두 곤충에 대해 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1을 시험하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택을 부모 대두 이벤트 (대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1) 및 또한 형질전환되지 않은 대두 품종 매버릭과 비교하였다. Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공된 식물 보호의 수준이, 추가의 트랜스진을 대두 식물의 게놈 내로 도입한 육종 스택 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 비교를 하였다. 또한, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1의 육종 스택에, 곤충 생물검정 전에 2,4-D 및 글리포세이트 (840 g ae/ha)를 함유하는 단일 제초제를 분무하여, 제초제의 분무가 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공되는, 곤충으로부터의 식물 보호에 어떤 효과를 주는지 측정하였다.
온실 시험을 대략 3 주령 식물 상에서 수행하였다. 10 종의 식물 각각을 사용하여, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1 및 음성 대조군; 제초제 분무된 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 및 매버릭의 육종 스택을 평가하였다. 각 시험된 곤충 균주 (안티카르시아 겜마탈리스 및 슈도플루시아 인클루덴스)에 대해서, 각 식물로부터 총 30 종의 잎 디스크/식물/곤충 균주로 3 종의 잎 펀치를 제조하였다. 1.4 cm 직경 (또는 1.54 cm2) 잎 펀치를 1 종의 신생 유충이 들끓는 2％ 물 아가의 상부의 시험장 내에 두었고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 침입 후 4 일에 치사성 및 잎 소비를 평가하였다. 약한 탐지에 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 곤충에 의해 소비된 잎 펀치의 백분율을 시각적으로 등급을 매겨 잎 피해를 평가하였다. JMP® 프로 9.0.1 (2010 SAS 인스티튜트 인크., 캐리, 노스캐롤라이나)를 사용하여 통계적 분석을 데이터에 대해 수행하였다.
이들 반복된 실험으로부터 얻은 결과 (표 18)는 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1의 육종 스택의 Cry1F 및 Cry1Ac 단백질에 의해 제공된 곤충 보호 및 치사성의 수준이 부모 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1와 일치함을 나타내었다. 예상된 바와 같이, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1은 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1 (58-76％) 및 매버릭 (79-91％) 대조군 식물보다 모든 시험한 곤충에 대해 상당히 더 낮은 곤충 피해 (0.10-0.12％)를 당하였다. 추가로, 음성 대조군인 매버릭 및 대두 이벤트 pDAB8264.44.06.1은 <10％ 곤충 치사성이 나타난 반면에, cry1F 및 cry1Ac 코딩 서열을 함유한 모든 대두 이벤트에 대해 높은 곤충 치사성 (100％)이 기록되었다. 따라서, 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1은 부모 대두 이벤트 pDAB9582.814.19.1에 상응하는 수준으로 살충 활성으로부터 보호를 제공하였다.
Figure 112013059698409-pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC; M.S. Technologis, Inc. <120> STACKED HERBICIDE TOLERANCE EVENT 8264.44.06.1, RELATED TRANSGENIC SOYBEAN LINES, AND DETECTION THEREOF <130> DAS-P0189-01 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' flanking border sequence for the subject soybean Event pDAB8264.44.06.1 <400> 1 agcttaacat acaagtaatg taatccacag tacgaaaaat gtgcaggttc ttatttgtgc 60 tccataattg tttcttgatt ccgatcaaag caagagcatc cagtctcaaa attttgtctt 120 ctcaattcac tcattcatca aaatcagcag ttttatgcat caacaagcat ggaatgttga 180 accacccatg attaagcccc atatcgttgt gttgagataa ctatcacctg aagttgtctt 240 ataaaaaaca catctgaata cttttataat catacctttc tcggcctttt ggctaagatc 300 aagtgtagta tctgttctta tcagtttaat atctgatatg tgggtcattg gcccacatga 360 tattaaattt attttttgaa gggtggggcc tgacatagta gcttgctact gggggttctt 420 aagcgtagcc tgtgtcttgc actactgcat gggcctggcg caccctacga ttcagtgtat 480 atttatgtgt gataatgtca tgggttttta ttgttcttgt tgtttcctct ttaggaactt 540 acatgtaaac ggtaaggtca tcatggaggt 570 <210> 2 <211> 1499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' flanking border sequence for the subject soybean Event pDAB8264.44.06.1 <400> 2 acagagaacg aatgtcgtgt gatatgtgga acaaggcaac gacaacaaca tacatgaatc 60 tcacaataga gtcggggtcg ccgagttgtg atgtaatcca tggcatggac atggtggccg 120 atcgaaaaag aaaaaagaaa tgcatgtata tgtgtgaaaa tgagagtttt ttttatccaa 180 ataataaaaa aaaattaatt atttacccaa aaaattattt acatgaccga tacgtacact 240 tttttcctta gttaagaaac accgatttct taattacatt tttttataca tttagaaatt 300 ggtttccttg gaaccgattt caaaatgttc attttttttt tcaaaaccaa gttaagaaat 360 cggttccttg gaaaacgact tcttaattgc tttttttttt gttttgtttt aaaattgttt 420 gtatttttat tttttttgtt attaattgtc tatatttgtg ttctgtttaa attgaaaaca 480 atattatttt tcatatgttg ttaattctta atttcttatg catattttat gttttatcat 540 tttttaagag ttgaaatcct ttgtattttt attttatttg attattataa tacataatta 600 aacaacaact taattgaaat taaaaaatat atatttaact gacaagttga cttgaactaa 660 aatatttaaa ttacaaaata gatatgaaat tacaaacaat agaacaaaat atttaaattt 720 gaaataatac aacaaaaatt ttaaaataca aacaatatgg cataaaatta atgttgttgg 780 cctgagccta cacaatgggg ggaatgcgac acatggaaca tcattttggt ttacctgatt 840 cttggatatc cattttggtg tgtatacgag aggagacatg acaaccttta gaatttcttt 900 tcatttttgg gttggggcaa attcttggct tgtgacatgg tgaccaacat gcttcattgc 960 acaatttccc aagtaatcat ttgtacatgt tatagatact tttcagcgta tacacaagat 1020 gtatgtagtt cctatactca tggtgagcat gcttataaac aacaacatga gaacaaaaca 1080 tgtgcatttt ttgaaatttg tcacagtcac actacctttc atctagcttg accatgaaat 1140 ttctcactag ttgaatctct ctctccagtt aattgtctcc tagactaaga attgtatgtc 1200 gcattaatcg aactcaagaa caatgtgaga gtttgccttt ttctgtatgt ctttcatagc 1260 cttgtttaat acttttgtat aaacttcacc aaatgtaatc actcttgcga cttctctccc 1320 cctttggttg aacaatgcat tacacctagt ataggttgat tttaccaacr cacattgcca 1380 gattttgtgt tttcttgagt accaaattaa ttaactcagt gtccccatcg ccagccacca 1440 tcccatgcga gagtccactt ttcttgtgga atcttcctaa gctaattaat tgttagtta 1499 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WF1 <400> 3 aggttgtcat tccgctgaag aagat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WF2 <400> 4 cacagtggac aattctgatt tctgg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WF3 <400> 5 ggattgcatc tgaaacggat catat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WF4 <400> 6 ggaatgttga accacccatg attaa 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WR5 <400> 7 catgtatgtt gttgtcgttg ccttg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WR6 <400> 8 aacattttga aatcggttcc aagga 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WR7 <400> 9 aggctcaggc caacaacatt aattt 25 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4406_WR8 <400> 10 ggagagaagt cgcaacagtg attacat 27 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ED_v1_C1 <400> 11 gagtaaagga gaccgagagg atggtt 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PAT_12 <400> 12 gaacgcttac gattggacag ttga 24 <210> 13 <211> 10256 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pDAB8264 <400> 13 agtcagcatc atcacaccaa aagttaggcc cgaatagttt gaaattagaa agctcgcaat 60 tgaggtctac aggccaaatt cgctcttagc cgtacaatat tactcaccgg atcctaaccg 120 gtgtgatcat gggccgcgat taaaaatctc aattatattt ggtctaattt agtttggtat 180 tgagtaaaac aaattcgaac caaaccaaaa tataaatata tagtttttat atatatgcct 240 ttaagacttt ttatagaatt ttctttaaaa aatatctaga aatatttgcg actcttctgg 300 catgtaatat ttcgttaaat atgaagtgct ccatttttat taactttaaa taattggttg 360 tacgatcact ttcttatcaa gtgttactaa aatgcgtcaa tctctttgtt cttccatatt 420 catatgtcaa aacctatcaa aattcttata tatctttttc gaatttgaag tgaaatttcg 480 ataatttaaa attaaataga acatatcatt atttaggtat catattgatt tttatactta 540 attactaaat ttggttaact ttgaaagtgt acatcaacga aaaattagtc aaacgactaa 600 aataaataaa tatcatgtgt tattaagaaa attctcctat aagaatattt taatagatca 660 tatgtttgta aaaaaaatta atttttacta acacatatat ttacttatca aaaatttgac 720 aaagtaagat taaaataata ttcatctaac aaaaaaaaaa ccagaaaatg ctgaaaaccc 780 ggcaaaaccg aaccaatcca aaccgatata gttggtttgg tttgattttg atataaaccg 840 aaccaactcg gtccatttgc acccctaatc ataatagctt taatatttca agatattatt 900 aagttaacgt tgtcaatatc ctggaaattt tgcaaaatga atcaagccta tatggctgta 960 atatgaattt aaaagcagct cgatgtggtg gtaatatgta atttacttga ttctaaaaaa 1020 atatcccaag tattaataat ttctgctagg aagaaggtta gctacgattt acagcaaagc 1080 cagaatacaa tgaaccataa agtgattgaa gctcgaaata tacgaaggaa caaatatttt 1140 taaaaaaata cgcaatgact tggaacaaaa gaaagtgata tattttttgt tcttaaacaa 1200 gcatcccctc taaagaatgg cagttttcct ttgcatgtaa ctattatgct cccttcgtta 1260 caaaaatttt ggactactat tgggaacttc ttctgaaaat agtggccacc gcttaattaa 1320 ggcgcgccga cgaatgtccc cgatcaaatc tgagggacgt taaagcgatg ataaattgga 1380 accagaatat agaatctttg ttctgctcta gcttttcttc tgtacatttt ttacgattag 1440 actatgattt tcattcaata accaaaattc tgaagtttgt catcaagttg ctcaatcaaa 1500 cttgtaccgg tttgtttcgg ttttatatca gctcactgtt acactttaac caaaatcggt 1560 ttatgtctta ataaaggaat tgagtcggtt taactcatat ccgtaccaat gcgacgtcgt 1620 gtccgcgttt cagtagcttt gctcattgtc ttctacggga actttcccgg acataggaac 1680 cgccctttcg ttatcctcat ccatcgtgaa atcaggaaat aaatgttcga agatttgagg 1740 tcaaaagtcg aatttcatgt tgtctcttct atttagatac aaaattgaag caattttcac 1800 caatttaatg ccaaaattta aaacaacgct gataaagtga aacttgattc gatttatatt 1860 tcaaccgaaa ctgctgaagc aagaagaaaa agcgtaatta cacataacaa gaacgctacc 1920 gcaaactact aaacgccaaa cccaatacaa aagtaaaacg cagacgctta agtgagaaac 1980 ccagaaaaca caaacgcgga tcgggggatc cactagttct agagcttaat tcttgacgaa 2040 agtgctcagc acatcgaagt agtcggggaa ggtcttccgg gtgcacccag ggtcccggat 2100 ggtgacgggg acctcggcac aggcggcaag ggagaaagcc atcgccatcc tgtggtcgtc 2160 gtacgtgtcg atcgccgtca cgttcagctt ctccggcggc gtgatgatgc agtagtccgg 2220 cccttcctca acagatgctc ccagcttggt tagctccgtc cggatcgcaa ccatcctctc 2280 ggtctccttt actctccagg aagccacgtc tctgatggct gtcgggccat cggcaaagag 2340 ggcaaccaca gcaagagtca tggcgacatc aggcatcttg ttcatgttga catcaatcgc 2400 cttgaggtgt ttcctcccaa atggctcccg cggtgggcca gtaacagtta cgctagtctc 2460 ggtccatgta accttcgctc ccatcatctc cagtacctca gcaaacttca catcaccctg 2520 caaactggtg gtgccacaac cttccacagt cacagtccct ccagtaattg cagcaccagc 2580 caagaaatag cttgcgcttg aggcatcacc ttcaacatag gcatttttag gggacttgta 2640 tttttgacct cccttaatgt agaatctgtc ccagctatca gaatgctctg ctttcacacc 2700 aaaacgctcc atcaatctca atgtcatttc gacgtacgga atggagatta atttatcaat 2760 gatttcaatc tccacatccc caagagccaa aggagcagcc atcagcaagg cactcaagta 2820 ctgactgctg atggagccag acagcttgac cttgccacca ggtagccctc cgattccatt 2880 gacacgaaca ggtgggcagt cagtgccaag gaaacaatca acatctgcac caagctgctt 2940 caatccgaca accaagtcgc caatgggtct ctccctcatt cttggtactc catcaagcac 3000 gtaagttgca tttccaccag cagcagtaac agctgctgtc aaggaccgca ttgcgattcc 3060 agcattcccc aagaagagct gcacttcctc tttagcatcc tcaactggga actttccacc 3120 acagccaaca actacagctc ttttggcagc tttgtccgct tcgacagaga gaccaagagt 3180 cctcaaggcc ccgagcatgt agtggacatc ctcactgttc agcaggttat caaccactgt 3240 tgtcccctcg gacagggcgg cgagtaggag gatccggttg gaaagcgact tggaccccgg 3300 cagcttgacg gtgccggaga tctccttgat gggctgcagc acgatctcct cggcgccggc 3360 catgcaccgg atccttccgc cgttgctgac gttgccgagg cttctggagg agcggcgggc 3420 gacggggagg ctggcggtgg acttgagccc ctggaacgga gcgacggcgg tggccgacga 3480 ggccatcatc acggtgggcg ccatagacag cggcggcagg tacgacagcg tctcgaactt 3540 cttgttgccg taggccggcc acacctgcat acattgaact cttccaccgt tgctgggaag 3600 ggtggagaag tcgttagcct tcttggtggt ggggaaggcg gcgttggact taaggccggt 3660 gaacggagcc accatgttgg cctgagcagg ggcggtccgg ctaacggtcg cgactgagga 3720 ggagatcgaa gccatgggga tctgcgcatt taacaagaaa ttgaacagtc aattggggat 3780 tttcattatc cataactaaa ttttgaagaa attggaatac taaacgtcac cacttaaaac 3840 cctaatccag atgaatcgtt atcgaaccag atataaccaa aaggggcaaa attgactcga 3900 aaaccctagt tctcgataca cggctaggta atgacaatcg cacacagaca aatctggtta 3960 tacagaactt cgaagcaaga aaaaaacgat gaagaatgga tcatccaata aatcgactag 4020 actcaatctt cacaggttta 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cattagataa 7200 atggcaaaaa aaaacaaaaa ggaaaagaaa taaagcacga agaattctag aaaatacgaa 7260 atacgcttca atgcagtggg acccacggtt caattattgc caattttcag ctccaccgta 7320 tatttaaaaa ataaaacgat aatgctaaaa aaatataaat cgtaacgatc gttaaatctc 7380 aacggctgga tcttatgacg accgttagaa attgtggttg tcgacgagtc agtaataaac 7440 ggcgtcaaag tggttgcagc cggcacacac gagtcgtgtt tatcaactca aagcacaaat 7500 acttttcctc aacctaaaaa taaggcaatt agccaaaaac aactttgcgt gtaaacaacg 7560 ctcaatacac gtgtcatttt attattagct attgcttcac cgccttagct ttctcgtgac 7620 ctagtcgtcc tcgtcttttc ttcttcttct tctataaaac aatacccaaa gcttcttctt 7680 cacaattcag atttcaattt ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt 7740 gatcaaggta aatttctgtg ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg 7800 atcccaattt cgtatatgtt ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt 7860 ttctgggttt gatcgttaga tatcatctta attctcgatt agggtttcat aaatatcatc 7920 cgatttgttc aaataatttg agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat 7980 ctagatctgg tgttagtttc tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt 8040 ctgattaaca gagatctcca tggctcagac cactctccaa atcacaccca ctggtgccac 8100 cttgggtgcc acagtcactg gtgttcacct tgccacactt gacgatgctg gtttcgctgc 8160 cctccatgca gcctggcttc aacatgcact cttgatcttc cctgggcaac acctcagcaa 8220 tgaccaacag attacctttg ctaaacgctt tggagcaatt gagaggattg gcggaggtga 8280 cattgttgcc atatccaatg tcaaggcaga tggcacagtg cgccagcact ctcctgctga 8340 gtgggatgac atgatgaagg tcattgtggg caacatggcc tggcacgccg actcaaccta 8400 catgccagtc atggctcaag gagctgtgtt cagcgcagaa gttgtcccag cagttggggg 8460 cagaacctgc tttgctgaca tgagggcagc ctacgatgcc cttgatgagg caacccgtgc 8520 tcttgttcac caaaggtctg ctcgtcactc ccttgtgtat tctcagagca agttgggaca 8580 tgtccaacag gccgggtcag cctacatagg ttatggcatg gacaccactg caactcctct 8640 cagaccattg gtcaaggtgc atcctgagac tggaaggccc agcctcttga tcggccgcca 8700 tgcccatgcc atccctggca tggatgcagc tgaatcagag cgcttccttg aaggacttgt 8760 tgactgggcc tgccaggctc ccagagtcca tgctcaccaa tgggctgctg gagatgtggt 8820 tgtgtgggac aaccgctgtt tgctccaccg tgctgagccc tgggatttca 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atgcggcaca 9720 tatgcaacct atgttcaaaa atgaagaatg tacagataca agatcctata ctgccagaat 9780 acgaagaaga atacgtagaa attgaaaaag aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaag 9840 acgtaagcac tgacgacaac aatgaaaaga agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga 9900 catagaggac acatgtaagg tggaaaatgt aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga 9960 atcttatccc ccactactta tccttttata tttttccgtg tcatttttgc ccttgagttt 10020 tcctatataa ggaaccaagt tcggcatttg tgaaaacaag aaaaaatttg gtgtaagcta 10080 ttttctttga agtactgagg atacaacttc agagaaattt gtaagtttgt agatctccat 10140 gtctccggag aggagaccag ttgagattag gccagctaca gcagctgata tggccgcggt 10200 ttgtgatatc gttaaccatt acattgagac gtctacagtg aactttagga cagagccaca 10260 aacaccacaa gagtggattg atgatctaga gaggttgcaa gatagatacc cttggttggt 10320 tgctgaggtt gagggtgttg tggctggtat tgcttacgct gggccctgga aggctaggaa 10380 cgcttacgat tggacagttg agagtactgt ttacgtgtca cataggcatc aaaggttggg 10440 cctaggatcc acattgtaca cacatttgct taagtctatg gaggcgcaag gttttaagtc 10500 tgtggttgct gttataggcc ttccaaacga tccatctgtt 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ttttttttgt tattaattgt ctatatttgt gttctgttta 12240 aattgaaaac aatattattt ttcatatgtt gttaattctt aatttcttat gcatatttta 12300 tgttttatca ttttttaaga gttgaaatcc tttgtatttt tattttattt gattattata 12360 atacataatt aaacaacaac ttaattgaaa ttaaaaaata tatatttaac tgacaagttg 12420 acttgaacta aaatatttaa attacaaaat agatatgaaa ttacaaacaa tagaacaaaa 12480 tatttaaatt tgaaataata caacaaaaat tttaaaatac aaacaatatg gcataaaatt 12540 aatgttgttg gcctgagcct acacaatggg gggaatgcga cacatggaac atcattttgg 12600 tttacctgat tcttggatat ccattttggt gtgtatacga gaggagacat gacaaccttt 12660 agaatttctt ttcatttttg ggttggggca aattcttggc ttgtgacatg gtgaccaaca 12720 tgcttcattg cacaatttcc caagtaatca tttgtacatg ttatagatac ttttcagcgt 12780 atacacaaga tgtatgtagt tcctatactc atggtgagca tgcttataaa caacaacatg 12840 agaacaaaac atgtgcattt tttgaaattt gtcacagtca cactaccttt catctagctt 12900 gaccatgaaa tttctcacta gttgaatctc tctctccagt taattgtctc ctagactaag 12960 aattgtatgt cgcattaatc gaactcaaga acaatgtgag agtttgcctt tttctgtatg 13020 tctttcatag ccttgtttaa tacttttgta taaacttcac caaatgtaat cactcttgcg 13080 acttctctcc ccctttggtt gaacaatgca ttacacctag tataggttga ttttaccaac 13140 acacattgcc agattttgtg ttttcttgag taccaaatta attaactcag tgtccccatc 13200 gccagccacc atcccatgcg agagtccact tttcttgtgg aatcttccta agctaattaa 13260 ttgttagttc agcttggcct taaaacacac atgacaaata tttttattat aaaacaaaca 13320 cccagtgata caacaatgaa caacacacat gacaactaca aatcattaaa taatacaatt 13380 acaatcaaat aatttgggga gggggtcttc aaaacttgat tcaaggttca ttgtatcatc 13440 gaggtattca cccaaaccct ccaaattcaa agagcttgca gaaactggtg gtggttgtgc 13500 atatgtttat gtgggtgtgt ctacggtgat aacataaaac tcaaggcatg tgaagttgaa 13560 gagtttccca aatatagaaa acatagtaat tatttcctca tcatcttgca gcatacatgc 13620 cctgtactga aaacaatcac caacaaatga tacgggaca 13659 <210> 28 <211> 14619 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hypothetical sequence of Event 9582.812.9.1 containing 5' genomic flank, 9582 T-strand insert, 3' genomic flank <400> 28 ttaattataa tgactttatt ataaaatgaa caatttcaaa atcttcacac tccaatttta 60 gattcctttt atatcatttt ctattgagta aaccaccatt tccattctta aaaatgtgag 120 gcctcgcata aaagcatgaa aatggcaaaa acatccccaa aattacattt tatcagtcca 180 gttaatcaat cgtaaggatc ttagtgtctc tattaacata tgatgaggtg acgtgttaag 240 tgttatgcca tgtacttgtt gatctgtcat gttgcgatca cgtcagcata aatcaaaata 300 aaacttttaa agtacaaaat gataataata ttttatttat ttatttcctc tcgcatccca 360 agatgacagt gaagaaaata attttttgag accgataatt ctaacataca ctattgactt 420 cagattataa agtactgttc aaatatgaaa tttaaatgct attctagacc aaaatctgaa 480 aattaccaaa atttccctca tgcatcaaac tatattgaat ctcattttaa gacaaaatac 540 aattggaaaa attataaaag ctttatttta aacttagaaa attactataa tatttgaatt 600 tttttctaca actatctaga tttttgttta aaattatcaa aataccctga gccttttgat 660 caagagtatt attgtcttta gttattgtcg aaaatattat caattgacag tataagttta 720 gtcactattt tgattaaata ttatactttt tttaaggatt aattattata cttttataac 780 ttaatccttt ttattataaa atgaacaatt ttaaaatctt ctcactccaa ttttatactc 840 actttatatt cttaataata tgttgtatga gcagaactaa actgaaattc cttaaaaaga 900 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tcatacaaaa atatccaata acactaaaaa attaaaagaa atggataatt tcacaatatg 1800 ttatacgata aagaagttac ttttccaaga aattcactga ttttataagc ccacttgcat 1860 tagataaatg gcaaaaaaaa acaaaaagga aaagaaataa agcacgaaga attctagaaa 1920 atacgaaata cgcttcaatg cagtgggacc cacggttcaa ttattgccaa ttttcagctc 1980 caccgtatat ttaaaaaata aaacgataat gctaaaaaaa tataaatcgt aacgatcgtt 2040 aaatctcaac ggctggatct tatgacgacc gttagaaatt gtggttgtcg acgagtcagt 2100 aataaacggc gtcaaagtgg ttgcagccgg cacacacgag tcgtgtttat caactcaaag 2160 cacaaatact tttcctcaac ctaaaaataa ggcaattagc caaaaacaac tttgcgtgta 2220 aacaacgctc aatacacgtg tcattttatt attagctatt gcttcaccgc cttagctttc 2280 tcgtgaccta gtcgtcctcg tcttttcttc ttcttcttct ataaaacaat acccaaagct 2340 tcttcttcac aattcagatt tcaatttctc aaaatcttaa aaactttctc tcaattctct 2400 ctaccgtgat caaggtaaat ttctgtgttc cttattctct caaaatcttc gattttgttt 2460 tcgttcgatc ccaatttcgt atatgttctt tggtttagat tctgttaatc ttagatcgaa 2520 gacgattttc tgggtttgat cgttagatat catcttaatt ctcgattagg gtttcataaa 2580 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cagcactcta tataggagac ctttcaacat cggcatcaac aatcaacaat tgtctgtgct 8880 tgacgggaca gaatttgcct atggaacctc ctcaaatctg ccatccgctg tctacagaaa 8940 gagcggaaca gttgatagct tggatgagat ccctccacag aacaacaacg ttccacctag 9000 gcaagggttt agccatcgcc ttagccatgt gtccatgttc cgttcaggct ttagtaatag 9060 cagcgttagt atcatcagag ctccgatgtt ctcttggata catcgtagtg ctgagtttaa 9120 caacataatt gcatccgata gcattactca gatcccagct gtcaagggga actttctctt 9180 taatggttct gtcatttcag gaccaggatt cactggaggc gacttggtta ggctgaattc 9240 ttccggcaac aacatccaga atagagggta tattgaagtg cccattcact tcccatcgac 9300 atctaccaga tatcgtgttc gtgtaaggta tgcctctgtt acccctattc acctcaacgt 9360 caattggggt aattcctcca tcttttccaa tacagtacca gcgacagcta catccttgga 9420 taatctccaa tctagcgatt tcggttactt cgaaagtgcc aatgccttca cctcttccct 9480 aggtaacata gtaggtgtta gaaatttctc cggaaccgcc ggagtgataa tcgaccgctt 9540 cgaattcatt cccgttactg caacgctcga ggcagagtct gacttggaaa gagcacagaa 9600 ggcggtgaat gctctgttca cttcgtccaa tcagattggg ctcaagacag atgtgactga 9660 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cgaaatcagc caattttaga caagtatcaa acggatgtga 13860 cttcagtaca ttaaaaacgt ccgcaatatg atattcatta attttatatt atctaaaaga 13920 gttaaaagag aaaaaagaaa tatgacaatt tttttctttc acatcttcta acctaaaagt 13980 atgactctat ggaggctaag tttagaaaaa gatacggatc tagggtgtgg aaacatcaat 14040 ggtcaactcc ttttatattt caatcaattg ggttttgctt tatctttaca ttttctcctt 14100 ttattttcca cgtctattca aatctacttg ttagcgggtg attactcttt tttcttttat 14160 agatgccaat tatttctctc ctatgtatta aattagagta tattgtcttg aaagtgactt 14220 agtattttag tttatagtct cttaaagaac gacacctttt attcttaact ctctttatca 14280 agttttaatt taaaattatt ttaaattaag tatgcataca tatcttaata tttttcttaa 14340 ttatttttaa attccctaaa tttaatgttt tcatacaatg taagagatat acatattaat 14400 tatatttaaa gataaaactt actttcctgc aataaaataa agaaaaggac agtcatacaa 14460 ttatataatt aatccagaat atttatagct tttaaacatt tattttctat caattaagta 14520 ataactttaa ataaaattaa gagtactttt ttatactcca aagaatttat ttattttcaa 14580 caaaatcgtc tgactgtttc aattgatcat tatcagccta gcataaccta aatttcattt 14640 tcaaacataa 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Claims (69)

  1. 서열 27을 포함하는 게놈을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 대두 식물 세포.
  2. 서열 27을 포함하는 게놈을 포함하는 대두 종자.
  3. 제1항의 세포를 포함하는 대두 종자.
  4. 제2항의 종자를 성장시킴으로써 생산된 대두 식물로서, 상기 서열 27을 포함하는 대두 식물.
  5. 제4항의 대두 식물의 자손 식물로서, 상기 서열 27을 포함하는 자손 식물.
  6. 제1항의 세포를 다수 포함하는 트랜스제닉 대두 식물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포가 서열 28 또는 서열 29를 더 포함하는 식물.
  8. 제6항에 있어서, 페녹시아세트산 제초제, 페녹시부탄산 제초제, 피리딜옥시알칸산 제초제, 글리포세이트, 및 글루포시네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 제초제에 내성이고, 서열 13의 잔기 2026 내지 9222를 포함하는 트랜스제닉 게놈 삽입물을 포함하는 식물.
  9. 화분, 밑씨, 꽃, 줄기, 뿌리 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 14 및 서열 15를 포함하는, 제4항의 식물의 일부분.
  10. 기탁 번호 PTA-11336 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁된 대표 종자에 존재하는 서열 27을 포함하는 게놈을 포함하는 식물 세포.
  11. 서열 4, 10, 13-17, 20, 27 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 서열 27을 포함하는 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시켜 게놈을 포함하는 제3 대두 식물을 생산하고, 상기 제3 대두 식물을 상기 게놈 중 서열 27의 존재에 대해 평가하는 것을 포함하는 대두 식물의 육종법.
  13. 제12항에 있어서, 제초제 내성 형질을 대두 식물에 유전자이입하기 위해 사용되는 방법.
  14. 제6항의 식물로서 서열 13의 잔기 2026-9222를 포함하는 트랜스제닉 게놈 삽입물을 포함하는 식물을 포함하는 필드(field)에 페녹시아세트산 제초제, 페녹시부탄산 제초제, 피리딜옥시알칸산 제초제, 글리포세이트, 비알라포스, 포스피노트리신 또는 글루포시네이트 중 1종 이상을 시용하는 것을 포함하는 잡초의 방제 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제초제 중 2종 이상을 동시에 시용하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제초제 중 2종 이상을 순차적으로 시용하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 제초제는 2,4-D, 2,4-DB, MCPA, MCPB, 트리클로피르 및 플루록시피르로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 1종 이상의 추가 제초제를 상기 필드에 시용하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가 제초제가 디캄바인 방법.
  20. 페녹시아세트산 제초제, 페녹시부탄산 제초제, 피리딜옥시알칸산 제초제, 글리포세이트 및 글루포시네이트 중 하나 이상을 필드에 시용하고, 상기 제초제(들)을 시용한 후 14일 이내에 제3항의 종자로서 상기 서열 27이 서열 13의 잔기 2026 내지 9222를 포함하는 종자를 필드에 재식하는 것을 포함하는, 필드에서 잡초를 방제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시용 단계는 상기 재식 단계 전에 수행하는 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 1종 이상의 제초제가 상기 식물의 위에 시용되는 방법.
  23. 삭제
  24. 제6항에 있어서, 글리신 맥스(Glycine max)로부터 유래된 식물.
  25. 제6항의 식물을 성장시킴으로써 생산된 밀(meal) 제품.
  26. 서열 27을 포함하는 게놈을 생성하도록 식물 세포의 게놈의 단일 염색체좌에 유전자 도입에 의해(transgenically) 삽입된 발현 카세트를 포함하고,
    상기 서열 27은
    a. 글리포세이트 제초제 내성 유전자를 발현하는 제1 식물 전사 단위;
    b. 페녹시아세트산 제초제 내성 및 피리딜옥시알칸산 내성을 제공하는 유전자를 발현하는 제2 식물 전사 단위; 및
    c. 글루포시네이트 제초제 내성 유전자를 발현하는 제3 식물 전사 단위
    를 포함하는 것인,
    식물 세포.
  27. ATCC 기탁 번호 PTA-11336 하에 기탁된 종자에 존재하는 바와 같은, 서열 14의 잔기 570-571, 또는 서열 15의 잔기 220-221을 포함하는 서열 27의 접합부 서열을, 상기 접합부 서열과 특이적으로 결합하거나 그를 증폭시키는 프로브 또는 하나 이상의 프라이머를 사용하여 검출하는 것을 포함하는, 샘플 중 서열 27을 식별하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 2종 이상의 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 상기 샘플에 존재하는 핵산으로부터 DNA 절편을 증폭시키는 것을 더 포함하며,
    상기 제1 프라이머는 서열 13 내의 삽입 서열 또는 이들의 상보물과 특이적으로 결합하고, 제2 프라이머는 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택된 플랭킹 서열 내의 서열에 특이적으로 결합하는 방법.
  29. ATCC 기탁 번호 PTA-11336 하에 기탁된 종자에 존재하는 서열 27을 포함하고, 상기 서열 27은 트랜스진(transgene) 구축물을 포함하고, 상기 트랜스진 구축물은 5' 플랭킹 대두 게놈 DNA 및 3' 플랭킹 대두 게놈 DNA에 의해 플랭킹되는, 대두 식물의 이벤트 접합성(zygosity) 측정 방법으로서,
    상기 대두 식물로부터 게놈 DNA의 DNA 샘플을 수득하고;
    a. 서열 19 또는 서열 21을 갖는 제1 이벤트 프라이머 및 서열 18 또는 서열 22를 갖는 제2 이벤트 프라이머 - 여기서 상기 제1 이벤트 프라이머는 상기 트랜스진 구축물에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 이벤트 프라이머는 상기 5' 플랭킹 대두 게놈 DNA 또는 상기 3' 플랭킹 대두 게놈 DNA에 특이적으로 결합하고, 상기 서열 19 또는 서열 21을 갖는 제1 이벤트 프라이머 및 상기 서열 18 또는 서열 22를 갖는 제2 이벤트 프라이머는 TaqMan PCR 조건에 가할 경우 서열 27을 갖는 이벤트 앰플리콘(amplicon)을 생성함 -
    b. TaqMan PCR 조건에 가할 경우 내생 대두 기준 유전자로부터 기준 앰플리콘을 생성하는, 서열 24를 갖는 기준 순방향 프라이머 및 서열 25를 갖는 기준 역방향 프라이머
    c. 상기 서열 27을 갖는 이벤트 앰플리콘과 혼성화하는 서열 20을 갖는 형광 이벤트 프로브
    d. 상기 기준 앰플리콘과 혼성화하는 서열 26을 갖는 형광 기준 프로브
    와 상기 DNA 샘플을 접촉시킴으로써 접촉된 샘플을 생성하고;
    상기 접촉된 샘플에 형광 기반 말단점 TaqMan PCR 조건을 가하고;
    상기 서열 27을 갖는 이벤트 앰플리콘에 혼성화된 상기 서열 20을 갖는 형광 이벤트 프로브를 정량하고;
    상기 기준 앰플리콘에 혼성화된 상기 서열 26을 갖는 형광 기준 프로브를 정량하고;
    혼성화된 서열 26을 갖는 형광 기준 프로브에 대해, 혼성화된 서열 20을 갖는 형광 이벤트 프로브의 양을 비교하고;
    혼성화된 서열 20을 갖는 형광 이벤트 프로브와 혼성화된 서열 26을 갖는 형광 기준 프로브의 형광 비율을 비교함으로써 서열 27의 접합성을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 앰플리콘은 50 내지 150개의 잔기로 이루어진 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 5' 플랭킹 대두 게놈 DNA는 서열 1을 포함하고, 상기 3' 플랭킹 대두 게놈 DNA는 서열 2를 포함하는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 기준 유전자는 진뱅크 기탁번호 AK286292.1를 갖는 내생 대두 GMFL01-25-J19 유전자인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 제1 이벤트 프라이머는 서열 13에 결합하고, 상기 제2 이벤트 프라이머는 서열 1 또는 서열 2, 또는 이들의 상보물에 결합하는 방법.
  34. 제29항에 있어서, 다른 대두 계통으로의 서열 27의 육종 유전자이입에 사용되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 다른 대두 계통은 상기 서열 27이 결핍된 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 기준 유전자는 서열 24, 서열 25 및 서열 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 상기 서열에 혼성화하는 방법.
  37. 삭제
  38. 제29항에 있어서, 상기 프로브는 형광 염료 및 소광제(quencher)로 표지되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이벤트 프로브는 상기 이벤트 프로브의 5' 말단에 상기 형광 염료로서 FAM을 포함하고 상기 이벤트 프로브의 3' 말단에 MGB 소광제를 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 기준 프로브는 상기 기준 프로브의 5' 말단에서 HEX로 표지되고 상기 기준 프로브의 3' 말단에서 블랙 홀 켄처 1(Black Hole Quencher 1; BHQ1)로 표지되는 방법.
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 제29항에 있어서, 상기 방법의 결과는 플레이트 판독기(plate reader)에서 직접 판독되는 방법.
  44. 제29항에 있어서, 상기 DNA 샘플은 필드에서 대두 식물로부터 수득되는 방법.
  45. 제29항의 방법을 수행하기 위한 키트이며, 상기 제1 이벤트 프라이머, 상기 제2 이벤트 프라이머, 상기 기준 순방향 프라이머, 상기 기준 역방향 프라이머, 상기 이벤트 프로브 및 상기 기준 프로브를 포함하는 키트.
  46. 삭제
  47. 제27항의 방법을 수행하기 위한 키트이며, 상기 프로브 또는 상기 하나 이상의 프라이머를 포함하는 키트.
  48. 제28항에 있어서, 상기 증폭 DNA 절편은 7196개의 염기를 포함하는 방법.
  49. 서열 14 또는 서열 15 및 이들의 상보물로 이루어진 프로브.
  50. 삭제
  51. 서열 1을 포함하는 5' 말단 및 서열 2를 포함하는 3' 말단을 포함하는 서열 27을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물.
  52. 서열 1을 포함하는 5' 말단 및 서열 2를 포함하는 3' 말단을 포함하는 서열 27을 생성하도록 대두 게놈의 DNA 절편에 트랜스제닉 삽입물을 삽입하는 방법.
  53. 서열 1을 포함하는 5' 말단 및 뉴클레오티드 잔기 서열 2를 포함하는 3' 말단을 포함하는 서열 27을 생성하도록 트랜스제닉 삽입물을 게놈의 DNA 절편에 삽입하는 것을 포함하는, 게놈을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물의 제조 방법.
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 제2항에 있어서, PTA-11602 및 PTA-12006으로 이루어진 군으로부터 선택된 기탁 번호 하에 ATCC에 기탁된 종자에 존재하는 서열 28 또는 서열 29를 포함하는 곤충 저항성 이벤트를 더 포함하는 종자.
  57. 제3항에 있어서, 서열 28 또는 서열 29를 더 포함하는 종자.
  58. 제56항의 종자로부터 성장되고, 상기 서열 27, 및 상기 서열 28 또는 서열 29를 포함하는 식물.
  59. 제6항에 있어서, 서열 28 또는 서열 29인 곤충 저항성 폴리뉴클레오티드 절편을 더 포함하는 식물.
  60. 제10항에 있어서, PTA-11602 및 PTA-12006으로 이루어진 군으로부터 선택된 기탁 번호 하에 ATCC에 기탁된 종자에 존재하는 서열 28 또는 서열 29를 더 포함하는 식물 세포.
  61. 삭제
  62. 제1항에 있어서, 서열 28 또는 서열 29를 더 포함하는 식물 세포.
  63. 삭제
  64. 제3항에 있어서, 서열 28 및 서열 29를 더 포함하는 종자.
  65. 제6항의 식물을 성장시킴으로써 생산된 오일 제품.
  66. 제6항에 있어서, 서열 28 및 서열 29인 곤충 저항성 폴리뉴클레오티드 절편들을 더 포함하는 식물.
  67. 서열 27을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  68. 삭제
  69. 삭제
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