BR102012018662A2 - acumulação dos eventos pdab9582.814.19.1 e pdab4468.04.16.1 para a produção de soja tolerante a herbicida e resistente a insetos - Google Patents

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Abstract

acumulação dos eventos pdab9582.814.19.1 e pdab4468.04.16.1 para a produção de soja tolerante a herbicida e resistente a insetos .uma pirâmide de evento de soja 9582.814.19.1 e evento de soja pdab4468.04.16.1 resultou no novo evento de soja pdab9582.814.19.1:: pdab4468.04.16.1. o evento de soja pdab9582.814.19.1::pdab4468.04. 16.1 compreende genes que codificam aad-12, crylf, crylac (synpro), e pai, conferindo resistência a insetos e tolerância a herbicidas às colheitas de soja contendo o evento, e possibilitando métodos para proteção das colheitas e proteção dos produtos rmazenados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ACUMULAÇÃO DOS EVENTOS PDAB9582.814.19.1 E PDAB4468.04.16.1 PARA A PRODUÇÃO DE SOJA TOLERANTE A HERBICIDA E RESISTENTE A INSETOS".
Antecedentes da Invenção Os genes que codificam Cry1F e CrylAc synpro (CrylAc) são capazes de conferir resistência a insetos, por exemplo, insetos lepidópteros, a plantas transgênicas, e o gene que codifica PAT (fosfinotricina acetiltrans-ferase) é capaz de conferir tolerância ao herbicida de fosfinotricina (glufosi-nato) às plantas transgênicas. PAT tem sido expressa com sucesso em soja para uso tanto como marcador selecionável na produção de colheitas transgênicas resistentes a insetos, como para conferir níveis comerciais de tolerância ao herbicida de glufosinato em colheitas transgênicas. O gene que codifica AAD-12 (ariloxialcanoato dioxigenase-12) é capaz de conferir níveis comerciais de tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético, 2,4-D e MCPA, e os herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopyr e fluroxypyr, quando expressos em plantas transgênicas. A expressão de genes estranhos em plantas é conhecida como sendo influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez na estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou na proximidade dos elementos reguladores transcricionais (por exemplo, intensificadores) próximos ao sítio de integração (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Ao mesmo tempo, a presença de transgenes em locais diferentes no genoma influenciará o fenótipo total da planta de diferentes modos. Por esse motivo, é frequentemente necessário selecionar um número grande de eventos para identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, foi observando nos vegetais e em outros organismos que existe uma variedade ampla dos níveis de expressão de um gene introduzido, dentre os eventos. Existem também diferenças nos padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais, que podem corresponder aos padrões esperados dos elementos reguladores transcri- cionais presentes na construto de gene introduzida. Por esse motivo, é comum produzir centenas a milhares de eventos diferentes e selecionar aqueles eventos para um único evento que tem os níveis de expressão transgêni-ca, desejados, e padrões comerciais para estes propósitos. Um evento que tem os níveis ou padrões de expressão transgênica desejados para introgre-dir o transgene no patrimônio genético por cruzamento sexual usando-se métodos de reprodução convencionais. Progênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica do transformante original. Essa estratégia é utilizada para assegura a expressão gênica confiável em numerosas variedades que estão bem adaptadas às condições locais de crescimento. É desejável a capacidade de detectar a presença de um evento particular ou eventos múltiplos para determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene ou grupo de transgenes de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular ou eventos múltiplos ser de ajuda para satisfazer as regulamentações que requerem a aprovação pré-comercial e rotulação de alimentos derivados de plantas de colheita, ou para uso em monitoramento ambiental, monitoramento das características da colheitas no campo, ou monitorar os produtos derivados de uma colheita de cultura, bem como para uso em assegurar o comprimento das partes envolvidas nos termos reguladores ou contratuais. É possível detectar a presença de um ou mais eventos transgê-nicos por qualquer método de detecção de ácido nucleico conhecido da técnica, que inclui, mas sem limitação, a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou hibridização de NDA usando-se sondas de ácido nucleico. Esses métodos de detecção geralmente focam em elementos genéticos usados frequentemente, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., já que para muitos construtos de DNA, a região de codificação é intercambiável. Como resultado, tais métodos não podem ser úteis para descriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando-se o mesmo construto de DNA ou construtos bastante similares a menos que a sequência de DNA do DNA flanqueador adjacente ao DNA heterólogo inserido seja co- nhecida. Por exemplo, um ensaio de PCR específico para evento está descrito no Pedido de Patente US 2006/0070139 para evento de milho DAS-59122-7. Seria desejável ter um método simples e descriminativo para a i-dentificação de evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16. de soja de pirâmide de reprodução.
Breve Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um novo evento de pirâmide de reprodução de soja transgênica resistente a insetos e tolerante a herbicidas, designado evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16. Essa pirâmide de reprodução cry1F, crylAc e pat, conforme descrita aqui e no Pedido de Patente Internacional WO/2012/075428 inserida em sítios específicos dentro do genoma de célula de soja. Semente de soja foi depositada no American Type Culture Collection (ATCC) com N° de Acesso identificado em parágrafo mais abaixo. O DNA de plantas de soja contendo esse evento inclui as sequências de junção/flanqueadoras descritas aqui que caracterizam o local do DNA inserido dentro do genoma de soja. SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 15 são específicas para evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04. 16.1. Mais particularmente, as sequências que circundam as junções em 1400/1401, bp 1536/1537 da SEQ ID NO:1, bp 152/153 da SEQ ID NO:2, bp 2730/2731 da SEQ ID NO:15, e bp 9121/9122 da SEQ ID NO:15 são diagnósticos para evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Em um parágrafo mais abaixo, são descritos exemplos dessas sequências compreendendo essas junções que são características de DNA de sojas contendo o evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1.
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de soja, ou parte desta, que é resistente a Pseudoplusia includens (verme de folha de soja), cujo genoma compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e seus complementos. Em outra modalidade, a invenção proporciona semente de tais plantas.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para controlar insetos que compreende expor insetos às plantas de soja resistentes a insetos, em que as plantas de soja têm um genoma que contém uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO:15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e seus complementos; que são características da presença do evento de soja pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1., para assim controlar os insetos. A presença dos genes cry1F v3 (cry1F) e crylAc synpro (crylAc) no evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468. 04.16.1 confere resistência a, por exemplo, Pseudoplusia includens (verme das folhas de soja), Anticarsia gemmatalis (lagarta da mucuna preta), Epinotia apo-rema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodopte-ra cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica and Elasmopalpus lignosellus.
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de soja, ou parte desta, que é tolerante aos herbicidas de ácido fenoxiacético tais como 2,4-D e MCPA. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma planta de soja, ou parte desta, que é tolerante aos herbicidas de ácido piridi-loxiacético tais como triclopyr e fluroxypyr. Nessas modalidades, a planta de soja tem um genoma que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e seus complementos. Em outra modalidade, a invenção proporciona semente de tais plantas.
Em outra modalidade, a invenção proporcionar um método para controlar ervas daninhas em uma colheita de soja que aplica herbicidas de ácido fenoxiacético tais como 2,4-D e MCPA. Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para controlar ervas daninhas em uma colheita de soja, que compreende aplicar herbicidas de ácido fenoxiacético, tais como triclopyr e fluroxypyr, à colheita de soja, em que a colheita de soja compreende plantas de soja que têm um genoma contendo uma ou mais das sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e seus complementos. A presença do gene aad-12 no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 confere tolerância aos herbicidas de ácido fenoxiacético e herbicidas de ácido piridiloxiacético.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para controlar ervas daninhas em uma colheita de soja que compreende aplicar o herbicida de glufosinato à colheita de soja, em que a dita colheita de soja compreende plantas de soja que têm genoma contendo uma ou mais das sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO: 15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15 e seus complementos, que são diagnósticos quando à presença do evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. A presença do gene pat v6 (Pat) no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814 confere tolerância ao herbicida de glufosinato.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para detectar o evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. em uma amostra que compreende DNA da soja, em que o dito método compreende: (a) contatar a dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro de bp 1-1400 da SEQ ID NO:1 ou seu complemento, e um segundo iniciador de pelo menos 10 de comprimento que se liga seletivamente a um sequência de inserções dentro de bp 1401-1836 da SEQ ID NO:1 ou seu complemento; e ensaiar quanto ao amplicon gerado entre os ditos iniciadores; ou (b) contatar a dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserções dentro de bp 1-152 da SEQ ID NO:2 ou seu complemento, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente à sequência flanqueadora dentro de bp 153-1550 da SEQ ID NO:2 ou seu complemento; ou (c) contatar a dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserções dentro de bp 2731-9121 da SEQ ID NO: 15 ou seu complemento, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente à sequência flanqueadora dentro de bp 1-2730 da SEQ ID NO: 15 ou seu complemento; ou (d) contatar a dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência de inserções dentro de bp 2731-9121 da SEQ ID NO:15 ou seu complemento, e um segundo iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga sele- tivamente à sequência flanqueadora dentro de bp 9122-10.198 da SEQ ID NO: 15 ou seu complemento; (e) ensaiar quanto ao amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para detectar o evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1, que compreende: (a) contatar a dita amostra com um primeiro iniciador de pelo menos 10 bp de comprimento que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora dentro de bp 1-1400 da SEQ ID NO:1 ou seu complemento; e um segundo iniciador que se liga seletivamente à SEQ ID NO:3, ou seu complemento; e um terceiro iniciador que se liga seletivamente a uma sequência flanqueadora de PB 1 -2730 da SED ID NO: 15ebp 9122-10.198 da SEQ ID NO: 15, e seus complementos; e um quarto iniciador que se liga seletivamente a uma sequência de inserções de 2731 - 9121 da SEQ ID NO: 15, e seus complementos; (b) submeter a dita reação em cadeia de polimerase; e (c) ensaiar quanto ao amplicon gerado entre os ditos iniciadores.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para reproduzir uma planta de soja, que compreende: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de soja para produzir uma terceira planta de soja, em que a primeira planta de soja compreende DNA que contém uma ou mais sequências do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO: 15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15 e seus complementos; e ensaiar a dita terceira planta de soja quanto à presença de DNA que compreende uma ou mais das sequências que compreende 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e seus complementos.
Em outra modalidade, a invenção proporciona uma molécula de DNA isolada para diagnosticar o evento de soja pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1.Tais moléculas incluem, além das SED ID NOS:1, 2, e 15, pelo menos 25 bp de comprimento compreendendo bp 1400-1401 da SEQ ID NO:1 e pelo menos 10 bp da SEQ ID NO:1 em cada direção a partir da junção de bp 1400/1401; amplicons de pelo menos 25 bp de comprimento compreendendo 152 - 153 da SEQ ID NO:2 e pelo menos 10 bp da SEQ ID NO:2 em cada direção a partir da junção bp 152/153; amplicons de pelo menos 25 p de comprimento compreendendo bp 2730 — 2731 da SEQ ID NO:15 e pelo menos 10 bp da SEQ ID NO: 15 em cada direção a partir da junção de bp 2730/2731; amplicons de pelo menos 25 bp de comprimento compreendendo bp 9121 - 9122 da SEQ ID NO: 15 e pelo menos 10 bp da SEQ ID NO:15 em cada direção da junção de bp 9121/9122. Exemplos são bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; bp 2680-2780 da SEQ ID NO:15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO;15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9211 da SEQ ID NO:15; e bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15, e seus complementos.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para controlar pragas em grão de soja, semente ou farinha de semente, que compreende incluir o evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 no dito grão, semente, ou farinha de semente conforme demonstrados pelo fito grão, semente ou farinha de semente, que compreende DNA contendo uma ou mais das sequências do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências sele- cionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO: 15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15 e seus complementos. A invenção inclui também células de planta de soja e partes da planta, mas sem limitação ao pólen, óvulo, flores, brotos, raízes, e folhas, e núcleos de células vegetativas, células de pólen, semente e farinha de semente, e células de ovo, que contêm o evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução.
Em algumas modalidades, o evento pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução pode ser combinado com outras características, incluindo, por exemplo, outro(a) gene(s) de tolerância a herbicidas e/ou proteínas inibidoras de insetos e sequências reguladoras de transcrição (i.e. DNA interferência, dsRNA, fatores de transcrição, etc.). As características adicionais podem ser piramidadas no genoma da planta via reprodução da planta, re-transformação da planta transgênica contendo o evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução, ou adição de novas características através de integração marcada.
Outras modalidades incluem a excisão de sequências de polinu-cleotídeos, que compreendem o evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468. 04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução, incluindo por exemplo, o cassete de expressão do gene pat. Mediante excisão de uma sequência de polinu-cleotídeos, o evento modificado por ser re-marcado em um sítio cromossô-mico específico, em que as sequências de polinucleotídeos adicionais são piramidadas com o evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução.
Em uma modalidade, a presente invenção engloba um sítio-alvo cromossômico de soja localizado no cromossomo 2 entre as sequências flanqueadoras mostras nas SEQ ID NOS: 1 e 2. ___________________ Em uma modalidade, a presente invenção engloba um sítio-alvo cromossômico de soja localizado no cromossomo 04 entre as sequências flanqueadoras mostradas na SEQ ID NO: 15.
Em uma modalidade, a presente invenção engloba um método para produzir uma planta de soja transgênica, que compreende inserir um ácido nucleico heterólogo em uma posição no cromossomo 04 entre as sequências genômicas mostradas na SEQ ID NO: 15 i.e. entre bp 1-2730 da SEQ ID NO:15 e bp 9122-10.198 da SEQ ID NO:15.
Adicionalmente, a presente invenção proporciona ensaios para detectar a presença do evento em questão em uma amostra (de sojas, por exemplo). Os ensaios podem ser baseados na sequência de DNA da cons-truto recombinante inserida no genoma da soja, e nas sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. Kits e condições úteis para realizar os ensaios são proporcionados também. A presente invenção refere-se, em parte, à clonagem e à análise das sequências de DNA das regiões de extremidades resultantes da inserção de T-DNA de pDAB9582 e pDAB4468 em linhas de soja transgênicas. Essas sequências são únicas. Com base nas sequências de inserção e de junção, iniciadores específicos para eventos podem ser e foram gerados. A análise de PCT demonstrou que esses eventos podem ser identificados por análise dos amplicons de PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos para eventos. Assim, esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar unicamente linhagens de soja que compreendem o evento da presente invenção.
Depósito de Sementes Como parte desta exposição, pelo menos 2.500 sementes de uma linhagem de soja compreendendo o evento de soja pDAB9582.814.19 e 2500 sementes da linha de soja que contém o evento de soja pDAB4468.04.16.1 foram depositadas e disponibilizadas ao público sem restrição (mas submetidas aos direitos patentários) no American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Os depósitos, designados como Número de Depósito ATCC PTA- 10442 (pDAB4468.04.16.1) Número de Depósito ATCC ._______(pDAB9582.814.19.1 foram feitos a favor da Dow AgroSciences LLC, em 22 de outubro de 2009 e________, respectiva- mente. Esses depósitos foram feitos e serão mantidos de acordo e sob os termos do Tratado de Budapeste com respeito a depósitos de sementes para fins de procedimento de patente.
Breve Descrição das Sequências SEQ ID NO:1 é a sequência de extremidade flanqueadora de DNA 5’ para o evento de soja pDAB9582.814.19.1. Os nucleotídeos 1-1400 são sequência genômica. Os nucleotídeos 1401-1535 são uma sequência rearranjada de pDAB9582. Os nucleotídeos 1536-1836 são uma sequência de inserções. SEQ ID NO:2 é a sequência de extremidade flanqueadora de DNA 3’ para o evento de soja pDAB9582.814.19.1. Os nucleotídeos 1-152 são a sequência de inserções. Os nucleotídeos 153-1550 são sequência genômica. SEQ ID NO:3 é a sequência de DNA de pDAB9582, que é citada abaixo na Tabela 1. SEQ ID NO:4 é o iniciador de oligonucleotídeos 81419_FW3 para confirmação do DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:5 é um iniciador de oligonucleotídeos 81419_RV1 para confirmação de DNA genômico de extremidade 3’. SEQ ID NO:6 é um iniciador de oligonucleotídeos 81419 RV2 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:7 é um iniciador de oligonucleotídeos 81419_RV3 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:8 é um iniciador de oligonucleotídeos 51IREnd-02 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:9 é um iniciador de oligonucleotídeos 5’IREnd-02 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:1Q é um iniciador de oligonucleotídeos AtUbi10RV1 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NQ:11 é um iniciador de oligonucleotídeos AtUbi10RV2 para confirmação de DNA genômico de extremidade 5’. SEQ ID NO:12 é um iniciador de oligonucleotídeos 3’PATEnd05 para confirmação de DNA genômico de extremidade. 3’ SEQ ID NO:13 é um iniciador de oligonucleotídeos 3’PATEnd06 para confirmação de DNA genômico de extremidade. 3’ SEQ ID NO:14 é a sequência confirmada do evento de soja pDAB9582.814.19.1. Incluindo a sequência flanqueadora genômica 5’ de inserção de fita T de pDAB9582, e a sequência flanqueadora genômica 3’. SEQ ID NO:15 é a sequência confirmada do evento de soja pDAB4468.04.16.1. Incluindo a sequência flanqueadora genômica 5’, inserção de fita T de pDAB4468, e a sequência flanqueadora 5\ Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um plasmídeo Map de pDAB9582 que contêm os cassetes de expressão de crylf, crylAc e pat. A Figura 2 ilustra os locais de iniciadores para confirmar o arranjo de sequência genômica em evento de soja pDAB9582.814.19.1. A Figura 3 ilustra o arranjo de sequência genômica em evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Descrição Detalhada da Invenção As sequências flanqueadoras de inserção de evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 foram sequenciadas e caracterizadas. Ensaios específicos de evento foram desenvolvidos. Tem sido também mapeado sobre o genoma de soja (cromossomos 02 e 04 de soja). Os eventos podem ser introgredidos juntos nas subsequentes linhagens de elite.
Conforme mencionado acima na seção de Antecedentes, a introdução e a integração de um transgene em um genoma de planta envolvem alguns eventos aleatorizados (logo, o nome "evento" para uma inserção dada que é expressa). Ou seja, com muitas técnicas de transformação tais como a transformação de Agrobacterium, a transformação biolística (i.e. pistola de genes), e transformação mediada por carbureto de silício (i.e. WHIS-KERS™), é imprevisível onde no genoma um transgene tornar-se-á inserido. Assim, a identificação do DNA genômico de planta flanqueador em ambos os lados da inserção pode ser importante para identificar uma planta que tem um dado evento de inserção. Por exemplo, os iniciadores de PCT po- dem ser desenhados para gerar um amplicon de PCR através da região de junção da inserção e do genoma hospedeiro. Esse amplicon de PCR pode ser usado para identificar um tipo único ou distinto do evento de inserção.
Definições e exemplos são proporcionados aqui para auxiliar a descrever a presente invenção e orientar aqueles com conhecimento ordinário da técnica a realizar a invenção. A menos que de outro modo indicado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles com conhecimento ordinário da técnica relevante. A nomenclatura para as bases de DNA conforme estabelecida em 37 CFR §1.822 é usada.
Como usado aqui, o termo "progênie" refere-se a uma descendência de qualquer geração de uma planta parente que compreende o evento pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução.
Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com DNA heterólogo, i.e. construto de ácido nucleico que inclui os transgenes de interesse, regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de um planta particular caracterizada pela inserção em um local de genoma particular. O termo "evento" se refere ao transformante original e progênie do trans-formante que incluem o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à ascendência produzida por uma hibridação natural entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgênico. Mesmo depois do retrocruzamento para um parente recorrente, o DNA transgênico inserido e o DNA genômico flanqueador (DNA genômico/flanqueador) do parente transformado está presente na progênie do cruzamento no mesmo local cromos-sômico. O termo "evento" também se refere ao DNA proveniente do transformante original e sua progênie compreendendo DNA inserido e sequência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que era esperado ser transferido para uma progênie que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como resultado de cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante de autocruzamento) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.
Uma "sequência de junção" ou "sequência de extremidade" a-brange o ponto no qual o DNA inserido no genoma é ligado ao DNA proveniente do genoma nativo de soja que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou das outras sequências de junção em um material genético da planta que é suficiente para ser diagnóstico para o evento. Incluídas estão as sequências de DNA que abrangem as inserções dos e-ventos de soja descritos aqui e comprimentos similares do DNA ffanqueador. Exemplos específicos de tais sequências de diagnóstico são proporcionadas aqui; contido, outras sequências que se sobrepõem às junções das inserções, ou as junções das inserções e a sequência genômica, são também diagnósticos e podem ser usadas de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se, em parte, à identificação de e-ventos usando tais sequências flanqueadoras, de junção e de inserções. Iniciadores de PCR e amplicons relacionados são contemplados pela invenção. De acordo com a presente invenção, métodos de análise de PCR usando amplicons que atravessam o DNA inserido e suas extremidades podem ser usados para detectar ou identificar variedades de soja transgênica comercializada ou linhas derivadas das linhagens de soja transgênica proprietárias.
As sequências flanqueadoras/junção são diagnosticas para o evento pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução. Com base nessas sequências, foram gerados iniciadores específicos de sequência. Análise de PCR demonstrou que essas linhagens de soja podem ser identificadas em genótipos de soja diferentes por análise de amplicons de PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos para eventos. Assim, esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados unicamente para identificar essas linhagens de soja. As sequências identificadas aqui são únicas. Técnicas de detecção da presente invenção são especialmente úteis em conjunto com a reprodução da planta para determinar quais plantas de progênie compreendem um dado evento, depois que uma planta parente, compreendendo um evento de interesse, é cruzada com outra linhagem da planta em um esforço para conferir uma ou mais características de interesse na progênie. Esses métodos de análise de PCR beneficiam os programas de reprodução de soja bem como controle de qualidade, especialmente para sementes de soja transgênicas comercializadas. Kits de detecção de PCR para essas linhagens de soja transgênicas podem agora ser feitas e usada. Isso pode também beneficiar o registro de produtos e a administração dos produtos.
Além disso, sequências flanqueadoras de soja/genômicas podem ser usadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserção. Essa informação pode ser usada para fazer sistemas de marcadores moleculares específicos para cada evento. Esses podem ser usados para estratégias de reprodução acelerada e para estabelecer os dados de ligação.
Ainda, a informação sobre sequências flanqueadoras pode ser usada para estudar e caracterizar os processos de integração transgênica, característicos de sítios de integração genômica, classificação de eventos, estabilidade de transgenes e suas sequências flanqueadoras, e expressão gênica (especialmente relacionada ao silenciamento de genes, padrões de metilação de transgenes, efeitos das posições, e elementos relacionados à expressão potencial tais como MARS [regiões de ligação de matriz], e similares). À luz dessa presente exposição, é para ficar claro que a presente invenção inclui sementes disponíveis sob o Número de Depósito ATCC identificado acima. A presente invenção inclui também uma planta de soja tolerante à herbicida crescida de uma semente depositada sob o Número de Acesso ATCC identificado acima. A presente invenção inclui ainda partes da dita planta, tais como folhas, amostras de tecidos, sementes produzidas pela dita planta, pólen e similares (em que esses compreendem cry1F, crylAc, pat, e as SEQ ID NOS: 1 e 2 além de aad-12, pate SEQ ID NO:15).
Ainda, a presente invenção inclui plantas descendentes e/ou plantas de progênie de plantas crescidas a partir da semente depositada, preferivelmente uma planta de soja resistente a herbicidas, em que a dita planta tem um genoma que compreende uma sequência de junção do tipo selvagem detectável conforme descrita aqui. Como usado aqui, o termo "soja" significa Glycine Max e inclui todas as variedades destas que podem ser reproduzidas com uma planta de soja.
Essa invenção inclui ainda processos para fazer cruzamentos usando uma planta da presente invenção tal como pelo menos uma parente. Por exemplo, a presente invenção inclui uma planta híbrida Fi tendo como uma ou ambas as parentes quaisquer das plantas exemplificadas aqui, incluindo, mas sem limitação, ter uma parente que compreende o evento de soja pDAB9582.814.19.1 e a outra parente compreendendo pDAB4468.04.16.1. Também dentro da presente invenção está a semente produzida por tais híbridos Fi da presente invenção. Essa invenção inclui um método para produzir uma semente de híbrido Fi por cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, parente cruzada) e colher a semente híbrida resultante. A presente invenção inclui uma planta exemplificada que é ou parente fêmea ou parente macho. As características das plantas resultantes podem ser aperfeiçoadas por cuidadosa consideração das plantas parentes.
Uma planta de soja resistente a insetos / tolerante a 2,4 d- / tolerante a glufosinato da presente invenção pode ser produzido primeiramente por cruzamento sexual de uma primeira planta de soja parental que consiste em uma planta de soja crescida da semente de qualquer uma das linhagens referidas aqui, e uma segunda planta de soja parental, produzindo, assim, uma pluralidade de plantas de primeiras plantas da progênie; então selecionando uma planta da primeira progênie que é resistente ao glufosinato e/ou ao 2,4-D; efetuando o autocruzamento da planta da primeira progênie, produzindo, assim, uma pluralidade de plantas da segunda progênie, e então selecionando das plantas de segunda progênie uma planta que é resistente ao glufosinato e/ou ao 2,4-D. Essas etapas podem incluir ainda o retrocru-zamento da planta da primeira progênie ou da planta da segunda progênie com a segunda planta de soja parental ou uma terceira planta de soja parental. Uma colheita de soja que compreende sementes de soja da presente invenção, ou sua progênie, pode ser então plantada. É também para ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes podem ser também acasaladas para produzir uma descendência que contêm dois genes exógenos independentemente segregadores, adicionados. O autocruzamento da progênie apropriado pode produzir plantas que são homózigos para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruza-mento para uma planta parental ou cruzamento exogâmico com uma planta não transgênica são também contemplados, tal como a propagação vegeta-tiva. Outros métodos de reprodução comumente usados para diferentes características e colheitas são conhecidos da técnica. Reprodução por retro-cruzamento tem sido usada para transferir genes para uma característica simplesmente herdada, altamente herdável, em uma cultivar homozigótica desejável ou linha reproduzida, que é o parente recorrente. A fonte da característica a ser transferidas é chamada de parente doador. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do parente recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do parente doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do parente doador são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) para o parente recorrente.Espera-se que o parente resultante tenha os atributos do parente recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do parente doador.
Igualmente uma planta de soja resistente a insetos / tolerante a 2,4 D/ tolerante a glufosinato da presente invenção pode ser transformada com transgenes adicionais usando-se métodos conhecidos da técnica. As técnicas de transformação, tal como a transformação das agrobactérias, transformação biolística (ie.e pistola de genes), e transformação mediada por carbeto de silício (i.e. WHISKERS), podem ser usadas para introduzir trangene(s) adicio-nal(adicionais) no genoma do evento pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04. 16.1 de soja de pirâmide de reprodução. Seleção e caracterização das plantas transgênicas contendo os transgenes recentemente introduzidos podem ser completados para identificar quais contêm um integrante estável do transgene novo além de adicionar o genes aad-12, cry1F, crylac, pat da presente invenção.
As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas como marcadores moleculares em um método de reprodução assistida por marcador (MAB). Moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas nos métodos (tais como, marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs, e SSRs) que identificam geneticamente características agronomicamente úteis, como é conhecido da técnica. As características de resistência a insetos e de tolerância a herbicidas podem ser rastreadas na progênie de um cruzamento com uma planta de soja da presente invenção (ou sua progênie e qualquer outra cultiva ou variedade de soja) usando os métodos MAB. As moléculas de DNA são marcadores para essa característica, e os métodos MAB que são bem conhecidos da técnica podem ser usados para rastrear a(s) característica(s) nas plantas de soja, onde pelo menos uma linhagem de soja da presente invenção, ou sua progênie, are um parente ou ancestral. Os métodos da presente invenção podem ser usados para identificar qualquer variedade de soja tendo o presente evento.
Os métodos da presente invenção incluem um método para produzir uma planta de soja resistente a insetos / tolerante a herbicidas, em que o dito método compreende a reprodução com uma planta da presente invenção. Mais especificamente, os ditos métodos podem compreender cruzar duas plantas da presente invenção, ou uma planta da presente invenção e qualquer outra planta. Os métodos preferidos compreendem ainda selecionar a progênie do dito cruzamento por análise da dita progênie quanto a um evento detectável de acordo com a presente invenção e performance de variedade favorável (por exemplo, rendimento). Por exemplo, a presente invenção pode ser usada para rastrear o evento em questão através de ciclos de reprodução com plantas compreendendo outras características desejáveis tais como características agronômicas, tolerância ou resistência às doenças, tolerância ou resistência a nematódeos e data de maturidade. Plantas que compreendem evento em questão e a característica desejada podem ser detectadas, identificadas, selecionadas e rapidamente usadas em outros ciclos de reprodução, por exemplo. O evento em questão / característica po- de ser combinado através de reprodução, e rastreado de acordo com a presente invenção, com outra(s) característica(s) de resistência a insetos e/ou com outras características de tolerância a herbicidas. As modalidades dos últimos são plantas que compreendem o evento em questão combinado com um gene de tolerância ao glifosato, que confere tolerância ao herbicida de glifosato.
Assim, a presente invenção pode ser combinada com, por e-xemplo, características que codificam a resistência ao glifosato (por exemplo, planta resistente ou EPSPS, GOX, GATbacterianos), resistência ao glu-fosinato (por exemplo, pat, bar), sintase resistência a herbicidas inibidores de acetolactato sintase (ALS) (por exemplo, imidazolinas [tal como imaze-thapyr], sulfonilureias, triazolpirimidina sulfonalida, tiobenzoatos de pirimidini-la, e outros produtos químicos [Csr1, SurA, et al.]), resistência à bromoxinila (por exemplo, Bxn), resistências aos inibidores da enzima HPPD (piruvato de 4-hidroxifenila dioxigenase), resistência a inibidores de fitoeno dessaturase (PDS), resistência aos herbicidas inibidores do fotossistema II (por exemplo, psbA), resistência aos herbicidas inibidores do fotossistema I, resistência aos inibidores de protoporfirinogeno oxidas IX (PPO) (por exemplo, PPO-1), resistências aos herbicidas de fenilureia (por exemplo, CYP76B1), enzimas de degradação de dicamba (vide por exemplo, US 20030135879), e outros poderíam ser piramidados sozinhos ou em combinações múltiplas para proporcionar a capacidade de controlar e prevenir eficazmente os deslocamentos de ervas daninhas e/ou a resistência a qualquer herbicida das classes mencionadas acima.
Adicionalmente, o evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 de soja de pirâmide de reprodução pode ser combinado com uma ou mais características de entradas (por exemplo, resistência a insetos, resistência a patógenos ou tolerâncias ao estresse, et al.) ou saídas (por exemplo, rendimento aumentado, perfil de óleo aumentado, qualidade de fibras aumentada, et al.) adicionais. Assim, a presente invenção pode ser usada para proporcionar um pacote agronômico completo de qualidade de colheita aumentada com capacidade de controle de custo flexível e eficaz de qualquer número de pragas agronômicas. Métodos para integrar uma sequência de poiinucleotídeos dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula vegetal via recombina-ção homóloga estão descritos na técnica. Por exemplo, a integração sítio-específica conforme descrita na Publicação de Pedido de Patente US 2009/0111188 A1, aqui incorporada a título de referência, descreve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de poiinucleotídeos doadores em um-alvo cromossômico. Além disso, o Pedido de Patente Internacional WO 2008/021207, aqui incorporado a título de referência, descreve a recombinação homóloga mediada por zinc finger para integrar uma ou mais sequências de poiinucleotídeos doadores dentro de localizações específicas do genoma. O uso de recombinases tal como FLP/FRT conforme descrição na Patente US 6.720.474, aqui incorporada a título de referência, pode ser empregado para integrar uma sequências de poiinucleotídeos em um sítio cromossômico específico. Finalmente, o uso de meganucleases para alvejar poiinucleotídeos doadores em um local cromossômico específico foi descrito por Puchta et ai, PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).
Outros métodos para integração sítio-específica dentro de células vegetais são, em geral, conhecidas e aplicáveis (Kumar et ai, Trends in Plant Sei. 6(4) (2001) pp. 155-159). Além disso, sistemas de recombinação sítio-específica, que foram identificados em vários organismos procarióticos e eucarióticos podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas sem limitação: o sistema de R/RS recombinase do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), e o sistema Gin/gix do fago Mu (Maeser e Kahl-mann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
Em algumas modalidades da presente invenção, pode ser desejável integrar ou piramidar um novo transgene em proximidade a um evento transgênico. O evento transgênico pode ser considerado um local genômico preferido que foi selecionado com base em características única, tais como sítio de inserção simples, segregação Mendeliana normal e expressão está- vel, e uma combinação superior de eficácia, incluindo tolerância a herbicidas e desempenho agronômico em e através de locais ambientais múltiplos. Os transgenes recentemente integrados devem manter as características de expressão transgênica dos transformantes existentes. Além disso, o desenvolvimento de ensaios para a detecção e confirmação do evento recentemente integrado seria superado, pois as sequências flanqueadoras genômi-cas e local cromossômico do evento recentemente integrado já estão identificados. Finalmente, a integração de um transgene novo em um local cromossômico específico que é ligado a um transgene existente acelerar a in-trogressão dos transgenes em outros campos genéticos por cruzamento e-xogâmico usando-se métodos de reprodução convencionais.
Em algumas das modalidades da presente invenção, pode ser desejável efetuar a excisão das sequências de polinucleotídeos de um evento transgênico. Por exemplo, excisão transgênica conforme descrita no Pedido de Patente Provisório US 61/297.628, incorporado aqui a título de referência, descreve o uso de zinc finger nucleases para remover uma sequência de polinucleotídeos consistindo em um cassete de expressão gênica, de um evento transgênico integrado cromossomicamente. A sequência de polinucleotídeos pode ser um marcador selecionável. Mediante excisão e remoção de uma sequência de polinucleotídeos, o evento transgênico modificado pode ser re-alvejado pela inserção de uma sequência de polinucleotídeos. A excisão de uma sequência de polinucleotídeos e subsequente re-alveja-mento do evento transgênico modificado proporciona vantagens tal como o re-uso de um marcador selecionável o a capacidade de superar as mudanças para o transcriptoma da planta que resulta da expressão de genes específicos. A presente invenção descreve aqui um sítio específico no cromossomo 02 no genoma de soja que é excelente para inserção de ácidos nucleicos heterólogos. Assim, a presente invenção proporciona métodos para introduzir ácidos nucleicos heterólogos de interesse neste sítio-alvo pré-estabelecido ou na vizinhança deste sítio-alvo. A presente invenção engloba também uma semente de soja e/ou uma planta de soja compreendendo qualquer sequência de nucleotídeo heteróloga inserida no sítio-alvo descrito ou na vizinhança geral de tal sítio. Uma opção para conseguir a integração alvejada é efetuar a excisão e/ou substituir uma inserção diferente no lugar do cassete de expressão pat exemplificado aqui. Em geral, a este respeito, a recombinação homóloga alvejada, por exemplo, e sem limitação, pode ser usada de acordo com a presente invenção.
Como usado aqui, a "piramidação" de gene, evento ou característica é combinar características desejadas em uma linhagem de transgene. Reprodutores de plantas piramidam características transgênicas fazendo cruzamento entre parentes que têm, cada um, uma características desejada e então identificam a descendência desejada que tem ambas destas características desejadas. Outro modo de piramidar genes é transferindo dois ou mais genes para o núcleo da célula de uma planta no mesmo momento, durante a transformação. Outro modo de piramidar genes e re-transformando uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, piramidação gênica pode ser usada para combinar duas ou mais características diferentes, incluindo, por exemplo, duas ou mais características de inseto diferentes, característica(s) de resistência a insetos e característica(s) de resistência a doenças, duas ou mais características de resistência a herbicidas, e/ou característica(s) de resistência a insetos e característica(s) de resistência a herbicidas. O uso de um marcador selecionável além de um gene de interesse pode ser também considerado piramidação gênica. "Recombinação homóloga" se refere a uma reação entre qualquer par de sequências de nucleotídeos tendo sítios correspondentes contendo uma sequência de nucleotídeos similar através dos quais as duas sequências de nucleotídeos podem interagir (recombinar) para formar uma nova sequência de DNA recombinante. Os sítios de sequência de nucleotídeos similares são, cada um, referidos aqui como uma "sequência de homologia". Geralmente, a frequência da recombinação homóloga aumenta conforme o tamanho da sequência de homologia aumenta. Assim, enquanto a recombinação homóloga pode ocorrer entre duas sequências de nucleotídeos que são menos que idênticas, a frequência (ou eficácia) de recombinação declina conforme a divergência entre as duas sequências aumenta. A recombinação pode ser obtida usando-se uma sequência de homologia em cada uma de as moléculas doadora ou alvo, gerando, assim, um produto de recombinação de "cruzamento simples". Alternativamente, duas sequências de homologia podem ser colocadas sobre cada uma de as sequências de nucleotídeos-alvo e doadores. A recombinação entre as duas sequências de homologia sobre o doador com duas sequências de homologia no alvo gera um produto de recombinação de "cruzamento duplo". Se as sequências de homologia sobre a molécula doadora flanqueiam uma sequência que é para ser manipulada (por exemplo, uma sequência de interesse), a recombinação do cruzamento duplo com a molécula-alvo resultará em um produto de recombinação em que a sequência de interesse substitui uma sequência de DNA que estava originalmente entre as sequências de homologia sobre a molécula-alvo. A troca da sequência de DNA entre o alvo e o doador através de um evento de recombinação de cruzamento duplo é denominada "substituição de sequência".
Uma planta preferida, ou uma semente, da presente invenção compreende em seu genoma sequências de nucleotídeos operativos aad-12, cry1F v3, crylAc synpro e pat v6, conforme identificadas aqui juntamente com pelo menos 20-500 ou mais nucleotídeos flanqueadores contíguos em ambos os lados da inserção, como identificado aqui. A menos que indicado de outro modo, referência a sequências flanqueadoras diz respeito àquelas identificadas em relação às SEQ ID NOS:1, 2, e 15. Pode se esperara que toda ou parte dessas sequências flanqueadoras seja transferida para a pro-gênie que recebe o DNA inserido como resultado de cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o evento. A presente invenção inclui culturas de tecidos de células regene-ráveis de uma planta da presente invenção. Também incluída está uma planta regenerada de tal tecido de cultura, particularmente em que a dita planta é capaz de expressar todas as propriedades morfológicas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. As plantas preferidas da presente invenção têm todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta cres- cida a partir da semente depositada. Esta invenção compreende ainda a progênie da tal semente e a semente possui as características de qualidade de interesse.
Como usada aqui, "linhagem" é um grupo de plantas que exibe pouca ou nenhuma variação genética entre os indivíduos em pelo menos uma característica. Tais linhagens podem ser criadas por várias gerações por autopolinação ou seleção, ou propagação vegetativa a partir de um único parente usando técnicas de cultura de tecidos ou de células.
Como usados aqui, os termo "cultiva" e "variedade" são sinônimos e se referem a uma linhagem que é usada para produção comercial. "Estabilidade" ou "estável" significa que com respeito ao dado componente, o componente é mantido de geração para geração e, preferivelmente, pelo menos três gerações. "Utilidade Comercial" é definida como tendo um vigor de planta bom e fertilidade alta, de modo que a colheita pode ser produzida por fazendeiros usando equipamento rurais convencionais, e o óleo com os componentes descritos podem ser extraídos da semente usando-se equipamento para esmagamento e extração convencional. "Agronomicamente elite" significa que a linhagem tem características agronômicas desejáveis tais como rendimento, maturidade, resistência a doenças, e similares, além da resistência a insetos e da tolerância a herbicidas devido ao(s) presente(s) evento(s). Qualquer uma e todas essas características agronômicas e pontos de dados podem ser usados para identificar tais plantas, ou como um ponto e em uma das extremidades ou em ambas as extremidades de uma gama de características usadas para definir tais plantas.
Como aquele versado na técnica reconhecerá à luz desta descrição, modalidades preferidas de detecção de kits, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados a e/ou compreendendo "sequências de junção" ou "sequências de transição" (em que a sequência flanquea-dora genômica de soja satisfaz a sequência de inserções). Por exemplo, isto inclui sondas de polinucleotídeos, iniciadores, e/ou amplicons desenhados para identificar uma ou mais sequências de junção (em que a inserção satisfaz a sequência fianqueadora), conforme indicador na Tabela acima. Um desenho comum é para ter um iniciador que hibridiza na região fianqueadora, e um iniciador que hibridiza na inserção. Tais iniciadores apresentam, frequentemente, cada um, cerca de pelo menos ~15 resíduos de comprimento. Com tal arranjo, os iniciadores podem ser usados para gerar/amplificar um ampli-con detectável que indica a presença de um evento da presente invenção. Esses iniciadores podem ser usados para gerar amplicon que abrange (e inclui) uma sequência de junção conforme indicado acima. O "touching down" do(s) iniciador(es) na sequência fianqueadora não é desenhada tipicamente para hibridizar além de cerca de 1200 bases e assim além da junção. Assim, iniciadores flanqueadores típicos seriam desenhados para compreender pelo menos 15 resíduos de cada fita dentro de 1200 bases nas sequências flanqueadoras a partir do início da inserção. Ou seja, os iniciadores que compreendem sequência de tamanho apropriado a partir (ou hibridizando para) os pares de base 800 a 1440 da SEQ ID NO:1 e/ou para os pares de base 153 a 753 da SEQ ID NO:2 e/ou para os pares de base 2130 a 2730 da SEQ ID NO: e/ou para os pares de base 9122 a 9722 da SEQ ID NO: 15 estão dentro do escopo da presente invenção. Iniciadores de inserção podem, igualmente, ser desenhados em qualquer lugar na inserção da SEQ ID NO:3 ou em qualquer lugar entre os pares de base 2731 e 9121 da SEQ ID No:15, e podem ser usados, por exemplo, não exclusivamente para tal desenho de iniciador.
Aquele versado na técnica reconhecerá que iniciadores e sondas podem ser desenhados para hibridizar, sob uma gama de condições padrão de hibridização e/ PCR, em que o iniciador ou a sonda não é perfei-tamente complementar à sequência exemplificada. Ou seja, algum grau de despareamento pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente ou mais ou dois ou mais nucleotí- deos não precisam se ligar à fita oposta se a base despareada é interna ou__ está na extremidade do iniciador que está oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização são proporcionadas abaixo. Análogos de nucleotídeos sintéticos, tal como inosina, podem ser usados também nas sondas. Sondas de ácido nucleico peptídico (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, podem ser usadas também. O importante é que tais sondas e iniciadores sejam diagnósticos (capazes de identificar unicamente e distinguir) a presença de um evento da presente invenção.
Deve ser observado que erros na amplificação de PCR podem ocorrer o que pode resultar em erros de sequenciamento menores, por e-xemplo. Ou seja, a menos que indicado de outro modo, as sequências listadas aqui foram determinadas por geração de amplicons longos de DNAs genômicos de soja, e então clonagem e sequenciamento dos amplicons. Não é incomum encontrar pequenas diferenças e leves discrepâncias em sequências geradas e determinadas deste modo, devido aos muitos ciclos de amplificação necessários para gerar bastante amplicon para sequenciar a partir de DNAs genômicos. Aquele versado na técnica deverá reconhecer e estar informado que quaisquer ajustes necessários devido a estes tipos de erros no sequenciamento ou discrepâncias estão dentro do escopo da presente invenção.
Deve ser observado que não é incomum para alguma sequência genômica ser deletada, por exemplo, quando uma sequência é inserida durante a criação de um evento. Assim, algumas diferenças podem também aparecer entre as sequências flanqueadoras presentes e sequências genô-micas lista no GenBank, por exemplo.
Os componentes da "inserção" da sequência de DNA estão ilustrados nas Figuras e são mais detalhadamente discutidos abaixo, nos E-xemplos. As sequências de polinucleotídeos de DNA destes componentes, ou seus fragmentos, podem ser usados como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos da presente invenção.
Em algumas modalidades da invenção, composições e métodos são proporcionados para detectar a presença da região de inserção de transgene/genômica, em plantas e sementes e similares, de uma planta de soja. As sequências de DNA são proporcionadas, as quais compreendem a presente sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 5’ proporcionada aqui (entre os pares de base 800 e 1400 da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:3), seus segmentos, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer de seus segmentos. As sequências de DNA que são proporcionadas compreendem a presente sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 3’ proporcionada aqui (entre os pares de base 153 e 753 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:3), seus segmentos, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer de seus segmentos. As sequências de DNA que são proporcionadas compreendem a presente sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 3’ proporcionada aqui (entre os pares de base 1 e 2730 da SEQ ID NO: 15 e 2731 e 9121 da SEQ ID NO: 15), seus segmentos, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer de seus segmentos. As sequências de DNA que são proporcionadas compreendem a presente sequência de junção de região de inserção de transgene/genômica 3’ proporcionada aqui (entre os pares de base 9122 e 10.198 da SEQ ID NO:15 e 2731 e 9121 da SEQ ID NO: 15), seus segmentos, e complementos das sequências exemplificadas e quaisquer de seus segmentos. A sequência de junção da região de inserção abrange a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula da soja que flanqueia o sítio de inserção. Tais sequências podem ser diagnósticos para o dado evento.
Com base nessas sequências de inserção e de extremidade, ini-ciadores específicos para evento podem ser gerados. Analise de PCR demonstrou que as linhagens de soja da presente invenção podem ser identificadas em diferentes genótipos de soja por análise dos amplicon por PCR gerados com esses conjuntos de íniciadores específicos para eventos. Esses e outros procedimentos relacionados podem ser usados para identificar unicamente essas linhagens de soja. Assim, amplicon de PCR derivados de tais pares de Íniciadores são únicos e podem ser usados para identificar essas linhagens de soja.
Em algumas modalidades, as sequências de DNA que compreendem um fragmento contíguo da nova região de inserção de transgene/genômica são um aspecto desta invenção. Incluídas estão as sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência de inserção de transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos de sequência genômica de soja de uma ou mais das três plantas de soja mencionadas acima e/ou sequências que são úteis como sequência de iniciadores para a produção de um produto de amplicon diagnóstico para uma ou mais destas plantas de soja.
Modalidades relacionadas pertencem às sequências de DNA que compreendem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos contíguos de uma porção de transgene de uma sequência de DNA identificada aqui (tal como a SEQ ID NO:1 e seus segmento) ou complementos desta, e um comprimento similar de uma sequência de DNA de soja flanqueadora destas sequências, ou seus complementos. Tais sequências são úteis como iniciadores de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos usando-se esses iniciadores são diagnósticos para qualquer evento de soja referido aqui. Portanto, a invenção inclui ainda os amplicons produzidos por tais iniciadores de DNA e iniciadores heterólogos.
Essa invenção inclui métodos para detectar a presença de DNA, em uma amostra, que corresponde ao evento de soja referido aqui. Tais métodos podem compreender: (a) contatar a amostra que compreende DNA com um conjunto de iniciadores que, quando usado na reação de amplificação de ácido nucleico com DNA de pelo menos um desses eventos de soja, produz um amplicon que é diagnóstico para o(s) dito(s) evento(s); (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico, produzindo, assim, o amplicon; e (c) detectar o amplicon.
Outros métodos detecção da presente invenção incluem um método para detectar a presença de DNA, em uma amostra, correspondente ao dito evento, em que o dito método compreende: (a) contatar a amostra que compreende DNA com uma sonda que hibridiza sob condições severas de hibridização com DNA de pelo menos um dos ditos eventos de soja e que não hibridiza sobre as condições severas de hibridização com uma planta de soja de controle (DNA de não evento de interesse); (b) submeter a amostra e a sonda às condições severas de hibridização; e (c) detectar a hibridização da sonda para o DNA.
Em ainda outras modalidades, a presente invenção incluir métodos para produzir uma planta de soja que compreende o evento de soja pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 da presente invenção, em que o dito método compreende as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linhagem de soja parental (compreendendo um cassete de expressão da presente invenção, que confere tolerância ao glufosinato às plantas da dita linhagem) e uma segunda linhagem de soja parental (que carece dessa característica de tolerância a herbicidas), produzindo, assim, uma pluralidade de plantas da progênie; e (b) selecionar uma planta da progênie através do uso de marcadores moleculares. Tais métodos podem compreender opcío-nalmente outra etapa de retrocruzamento da planta da progênie para a segunda linhada de soja parental para produzir uma planta de soja para reprodução verdadeira que compreende a característica de resistência a insetos e de tolerância aos herbicidas 2,4-D e glufosinato.
De acordo com outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos para determinar a zigosidade da progênie de um cruzamento com o dito evento. Esses métodos podem compreender contatar uma amostra, compreendendo o DNA da soja, com um conjunto de iniciadores da presente invenção. Os ditos iniciadores, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico a partir de pelo menos um dos ditos eventos de soja, produzem um primeiro amplicon que é diagnóstico para pelo menos um dos ditos eventos de soja. Tais métodos compreendem ainda realizar a reação de amplificação do ácido nucleico, produzindo, assim, o primeiro amplicon; detectar a primeiro amplicon; e contatar a amostra que compreende do DNA de soja com um segundo conjunto de iniciadores (o dito segundo conjunto de iniciadores, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucleico com DNA genômico proveniente das plantas de soja, produz um segundo amplicon que compreende o DNA genômico de soja nativo homólogo à região genômica de soja); e realizar uma reação de amplificação do ácido nucleico, produzindo, assim, o segundo amplicon. Os métodos compreendem ainda detectar o segundo amplicon, e comparar o primeiro e o segundo amplicons em uma amostra, em que a presença de ambos os amplicons indica que a amostra a heterozigótica para a inserção de transgene.
Os kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando-se as composições descritas aqui e métodos bem conhecidos da técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do DNA no evento de soja em questão em uma amostra e podem ser aplicados em métodos para reproduzir plantas de soja contendo este DNA. Os kits contêm sequências de DNA homólogas e complementares aos amplicons, por exemplo, descritos aqui, ou as sequências de DNA homólogas ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgênicos dos eventos em questão. Essas sequências DNA podem ser usadas em reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits podem conter também os reagentes e materiais necessários para a realização do método de detecção.
Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucleico, isolada, na qual é anexado um marcador detectável convencional ou molécula repórter (tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima). Tal sonda é complementar a uma fit5a de um ácido nucleico-alvo, no caso da presente invenção, a uma fita de DNA genômico de um dos ditos eventos de soja, se a partir de uma planta de soja ou a partir de uma amostra que inclui DNA do evento. As sondas, de acordo com a invenção incluem não somente ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliami-das e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a um DNA-alvo e podem ser usadas para alvejar uma sequência de DNA para detectar a presença daquela sequência de DNA-alvo.
Os "iniciadores" são ácidos nucleicos isolados/sintetizados que são anelados para uma fita de DNA-alvo complementar por hibridização do ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA-alvo, então estendidos ao longo da fita de DNA-alvo por uma polimerase, por e-xemplo, uma DNA polimerase. Pares de iniciadores da presente invenção se referem a seu uso para amplificação de uma sequência de ácidos nucleicos,-alvo, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico, convencionais.
As sondas e os iniciadores são geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, ou 1000, ou 2000, ou 5000 polinucleotídeos ou mais de compri- mento. Tais sonda e iniciadores hibridizam especificamente para uma se-quência-alvo sob condições severas de hibridização. Preferivelmente, as sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de sequência completa com a sequência-alvo, embora as sondas que difiram da sequência-alvo e que retêm a capacidade de hibridizar para as sequên-cias-alvo podem ser desenhados por métodos convencionais. Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, vol. 1-3, ed. Sambrook et at., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Pares de iniciadores para PCR podem ser derivados de sequência conhecida, por exemplo, usando-se programas de computados destinados para esta finalidade.
Os iniciadores e as sondas com base no DNA flanqueador e as sequências de inserção descritos aqui podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências descritas por métodos convencionais, por exemplo, por re-clonagem e sequenciamento de tais sequências.
As sondas e iniciadores de ácido nucleico da presente invenção hibridizam sob condições severas para uma sequência de DNA-alvo. Qualquer método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA proveniente de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos são capazes de hibridizarem especificamente para outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Como usadas aqui, as duas moléculas de ácido nucleico são capazes de formarem uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla anti-paralela. Diz-se que uma molécula de ácido nucleico é o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se elas exibem complementaridade completa. Como usadas aqui, diz-se que a moléculas exibem "complementaridade" complementa quando cada núcleo- tídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo do outro. Duas moléculas são ditas serem "minimamente complementares" se elas podem hibridizar para a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam anelas uma com a outra sobe pelo menos condições convencionais de "baixa severidade". Similarmente, diz-se que as moléculas são "complementares" se elas hibridizam uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições convencionais de "alta severidade". Condições de severidade convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989. Divergências da complementaridade completa são, assim, permitidas, desde que tais divergências não impeçam completamente a capacidade das moléculas de formarem estrutura de fita dupla. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como inicíador ou sonda, ela precisa ser somente sufícíentemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as concentrações particulares de solvente e sal empregadas.
Como usada aqui, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácidos nucleicos que hibridizaram especificamente para o complemento da sequência de ácidos nucleicos com a qual ela está sendo comparada sob condições severas altas. A expressão "condições severas" é funcionalmente definida com respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucleico para um ácido nucleico-alvo (i.e. para uma sequência de ácidos nucleicos de interesse, particular) pelo procedimento de hibridização específica discutido por Sambrook et al., 1989, em 9.52-9.55. Vide também, Sambrook et al., 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-9.58. Por conseguinte, as sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas por sua capacidade de formar seletivamente moléculas duplex com esticamentos de fragmentos de DNA.
Dependendo da aplicação pretendida, podem ser usadas condições variáveis de hibridização para obtenção de graus variáveis de seletividade da sonda com relação à sequência-alvo. Para aplicações que requerem seletividade alta, serão empregadas tipicamente condições relativamen- te severas para formar os híbridos, por exemplo, serão selecionadas condições de baixo teor de sal e/ou de alta temperatura, tais como proporcionadas por cerca de 0,02M a cerca de 0,15M de NaCI em temperaturas de cerca de 50°C a cerca de 70°C. As condições severas, por exemplo, podem envolver lavagem do filtro de híbridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem para alta severidade (0,2X de SSC, 0,1% de SDS, 65°C). Condições de severidade adequadas, que promovem a híbridização de DNA, por exemplo, 6,0X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0X de SSC a 50°C, são conhecidas daqueles versados na técnica. Por exemplo, concentrações de sal na etapa de lavagem podem ser selecionadas de baixa severidade de cerca de 2,0X de SSC a 50°C para uma de alta severidade de cerca de 0,2X de SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa severidade à temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de alta severidade a cerca de 65°C. Tanto a temperatura como o sal podem variar, ou quer a temperatura quer a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é alterada. Tais condições seletivas toleram pouco, se algum, divergência entre a sonda e o modelo ou a fita-alvo. A detecção de sequências de DNA via híbridização é bem conhecida daqueles versados na técnica, e dos ensinamentos das Patentes US 4.965.188 e US 5.176.995 exemplificam os métodos de análises de híbridização.
Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nuclei-co da presente invenção hibridizará especificamente para um ou mais inicia-dores (ou amplicons ou outras sequências) exemplificados ou sugeridos a-qui, incluindo complementos de fragmentos destes, sob condições de alta severidade. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção tem a sequência de ácidos nuclei-cos conforme estabelecida aqui em uma ou mais das sequências exemplificadas, ou seus complementos e/ou fragmentos.
Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção compartilha entre 80% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácidos nucleicos. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser usadas como marcadores em métodos de reprodução de planta para identificar a progênie dos cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda para a molécula de DNA-alvo pode ser detectada por quaisquer dos métodos conhecidos daqueles versados na técnica, e estes podem incluir, mas sem limitação, marcadores de gás fluorescente, marcadores radioativos, marcadoras baseados em anticorpos, e marcadores quimioluminescentes.
Com respeito à amplificação de uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, por PCR) usando-se um par particular de iniciadores de amplificação, a "condições severas" são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize somente para a sequência de ácidos nucleicos-alvo para a qual um iniciador tendo sequência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligue e produza preferivelmente um produto de amplificação única, o amplicon. A expressão "específico para (uma sequência-alvo)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições severas de hibridização somente para a sequência-alvo em uma amostra compreendendo a sequência-alvo.
Como usado aqui, "DNA amplificado" ou "amplicon" se refere ao produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácidos nucleicos-alvo que é parte de um modelo de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de soja resultante de cruzamento sexual contém DNA genômico de evento transgênico da planta de soja da presente invenção, DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da sequência flanqueadora no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo de interesse, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA de evento. O amplicon é de um comprimento e tem uma sequência que é também diagnóstico para o evento. O amplicon pode variar de comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeos, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciadores mais cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481,482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, ou mais pares de bases (mais ou menos qualquer um dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência flanqueadora em ambos os lados da DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui uma sequência de nucleotídeos de inserção, inteira. Um membro de um par de iniciadores da sequência genômica da planta pode ser localizado em uma distância da sequência de DNA inserida. Essa distância pode variar de um par de bases de nucleotídeos até cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formado em uma reação de amplificação térmica de DNA. A amplificação de ácido nucleico pode ser obtida por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos da técnica, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida da técnica e está descrita, entre outros, nas Patentes US 4.683.195 e US 4.683.203. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb do DNA genô-mico. Esses métodos bem como os outros métodos conhecidos da técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática de presente invenção. A sequência da inserção de DNA transgênico heterólogo ou a sequência genômica flanqueadora do evento de soja em questão pode ser verificada (e corrigida, se necessário) por amplificação do evento usando-se iniciadores derivados das sequências proporcionadas aqui, seguido por sequenciamen-to de DNA padrão do amplicon de PCT ou do DNA clonado. O amplicon produzido por esses métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio é um método bem conhecido para detectar amplicons de DNA. Outro de tal método é Genetic Bit Analysis em que um oligonucleo-tídeo de DNA desenhado o qual se sobrepõe tanto à sequência de DNA ge- nômico flanqueadora adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonu-cleotídeo é imobilizado nos poços de uma placa de micropoços. Seguinte à PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto de PCR de fita simples pode ser hibridizado para o oligonucleotídeo imobilizado e serve como modelo para um ração de extensão de base simples usando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a próxima base esperada. A leitura pode ser com base em fluorescência ou ELISA. Um sinal indica a presença da sequência de inserção/flanqueadora devido à amplificação, hi-bridização e extensão de base simples, bem sucedidas.
Outro método na técnica de Pirossequenciamento conforme descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Nesse método, um oligonucleotídeo é desenhado o qual se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e a junção de DNA de inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto de PCR de fita simples da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanquadora) e incubado em presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossultato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal de luz que é medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência flanqueadora/de inserção transgênica devido à amplificação, hibridização e extensão simples ou de multibase, bem sucedidas.
Polarização de Fluorescência em outro método pode ser usada para detectar uma amplicon da presente invenção. Seguinte a esse método, um oligonucleotídeo é desenhado, o qual se sobrepõe à junção flanqueadora genômica e DNA inserida. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto de PCT de fita simples da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico flanqueador) e incubado na presença de uma DNA polimerase e ddNTP marcado fluorescentemente. A extensão de base simples resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida com alteração na polarização usando um fluorímetro. Uma alteração em polimerização indica a presença da sequência de inserção/flanqueadora transgênica devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples, bem sucedidas. TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Em resumo, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é desenhada tal que se sobrepõe à junção flanqueadora genômica e DNA inserida. A Sonda FRET e os iniciadores PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e uma sequência genômica flanqueadora) are girados na presença de uma polime-rase termoestável e dNTPs. Durante a amplificação específica, a Taq DNA polimerase libera a fração fluorescente para longe da fração finalizadora na sonda Fret. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência flanquea-dora/de inserção transgênica devido à amplificação e à hibridização bem sucedidas.
Beacons moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Em resumo, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é desenhada, a qual se sobrepõe à junção flanqueadora genômica e DNA de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta em que ela contém uma estrutura secundária que mantém as frações fluorescentes e finalizadoras em proximidade. A sonda GRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica flanqueadoras) are girados na polimerase termoestável e dNTPs. Seguinte à amplificação de PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET à sequência-alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das frações fluorescentes e finalizadoras. Resulta um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica flanqueadora/de inserção transgênica devido à amplificação e hibridização bem sucedidas.
Depois de ter sido descrita a localização no genoma de soja que é excelente para inserção, a presente invenção compreende também uma semente de soja e/ou uma planta de soja que compreende uma inserção de evento de não soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 na vizinhança gela desta localização genômica. Uma opção é substituir uma inserção diferente no local daquelas do evento de soja pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 exemplificado aqui. Em geral, a recombinação homóloga marcada, por e-xemplo, pode ser usada de acordo com a presente invenção. Esse tipo de tecnologia é o assunto, por exemplo, de WO 03/080809 A2 e o pedido norte-americano publicado, correspondente, US 20030232410. Assim, a presente invenção inclui plantas e células vegetais que compreendem uma inserção heteróloga (no lugar de ou com multi-cópias dos genes aad-12, cry1F, crylAc, ou paf), flanqueada por todos ou um par reconhecível das sequências flanqueadoras identificadas aqui (bp 1-1400 da SEQ ID NO:1 e bp 153-1550 da SEQ ID NO:2 e bp 1-2730 of SEQ ID NO: 15 e bp 9122-10,198 da SEQ ID NO:15).
Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidos ou citados aqui são incorporados a título de referência, na íntegra, até onde não estejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.
Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar procedimentos para praticar e invenção e para demonstrar certas modalidades preferidas da invenção. Esses exemplos não devem ser entendidos como limitativos. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos a seguir representam abordagens específicas usadas para ilustrar os modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente exposição, apreciar que muitas alterações podem ser efetuadas nessas modalidades específicas embora sejam obtidos parecidos ou similares sem se afastar do espírito e escopo da invenção. A menos que de outro indicado, todas as percentagens estão em peso e todas as proporções das misturas de solventes estão em volume a menos que de outro modo indicado.
As abreviaturas a seguir são usadas a menos que indicado de outro modo. bp par de bases °C graus Celsius DNA ácido desoxirribonucleico EDTA ácido etilenodiaminotetraacético kb quilobase mg micrograma mL microlitro mL mililitros M massa molar PCR reação em cadeia de polimerase PTU unidade de transcrição vegetal SDS dodecil sulfato de sódio SSC solução tampão contendo uma mistura de cloreto de sódio e citrato de sódio, pH 7.0 TBE solução tampão contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA, pH 8.3 As modalidades da presente invenção são ainda definidas nos exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses Exemplos são dados tão-somente a tipo de ilustração. Da discussão acima e dos Exemplos, aquele versado na técnica pode verificar as características essenciais da invenção, e sem se desviar do espírito e escopo da invenção, pode efetuar várias alterações e modificações das modalidades da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Assim, as várias modificações das modalidades da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica da descrição antecedente. Tais modificações são bem entendidas como estando também englobadas pelo escopo das reivindicações apensas. A descrição de cada referência determinada aqui é incorporada aqui a título de referência na íntegra.
EXEMPLOS
Exemplo t: Transformação e Seleção do Evento de Soía Crv1F e CrvIAc PDAB9582.814.19.1 A soja transgênica (Glycine Max) contendo o evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi gerado através da transformação de agrobactéria gerada de explantes de nódulo de cotilédones da soja. A cepa de agrobactéria desarmada EHA101 (Hood et al., 1993), carregando o vetor binário pDAB9582 (Figura 1) contendo o marcador selecionável, pat v6, e os genes de interesse, cry1Fv3 e crylAc synpro, dentro da região de DNA de fita T, foi usada para iniciar a transformação. A sequência de DNA para pDAB9582 é dada na SEQ ID NO:3, que está citada abaixo na Tabela 1.
Tabela 1. Elementos gênicos localizados em pDAB9582. A transformação mediada por agrobactéria foi efetuada usando-se um procedimento modificado de Zeng et al (2004). Em resumo, sementes de soja (cv Maverick) foram germinadas em meios basais e nódulos de coti-lédones foram isolados e infectados com Agrobactéria. Início dos brotos, alongamento dos brotos, meios de enraizamento forma suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção da agrobactéria. Seleção com glufosinato foi empregada para inibir o crescimento dos brotos não transformados. Os brotos selecionados foram transferidos para o meio de enraizamento para o desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatização das mudas.
Folhas pequenas terminais de mudas selecionadas tiveram as folhas cobertas com glufosinato quanto a transformantes putativos. Essas mudas selecionadas foram transferidas para a estufa, deixas se aclimatiza-rem e então as folhas foram cobertas com glufosinato e consideradas como sendo transformantes putativos. As plantas selecionadas foram amostradas e foram efetuadas análises moleculares para a confirmação do gene marcador selecionável e/ou do gene de interesse. Plantas T0 foram deixadas se auto-fertilizarem na estufa para produzir semente T-t.
Esse evento, evento de soja pDAB9582.814.19.1, foi gerado de um isolado transformado independente. As plantas T-ι foram retrocruzadas e introgredidas em variedades de elite. O evento foi selecionado com base nestas características únicas tais como sítio de inserção simples, segregação Mendeliana normal, expressão estável, e combinação superior de eficácia, incluindo tolerância a herbicidas e desempenho agronômico. Os exemplos seguintes contêm os dados que foram usados para caracterizar o evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Exemplo 2: Caracterização de Expressão de Proteína no Evento de Soia As propriedades bioquímicas das proteínas recombinantes CRY 1F, CrylAc, e PAT expressas no evento de soja pDAB9582.814.19.1 foram caracterizadas. Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, quantitativo (ELISA) é um ensaio bioquímico ligado dentro da técnica que pode ser usado para caracterizar as propriedades bioquímicas das proteínas e confirmar a expressão dessas proteínas no evento de soja pDAB582.814.19.1.
Exemplo 2.1: Expressão de Proteína PAT, Crv1F e CRYIAc em Tecidos Vegetais Amostras de tecidos de soja foram isoladas das plantas de teste e preparadas para análise de expressão. A proteína PAT foi extraída dos tecidos da planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina Sérica Bovina (BSA). O tecido da planta centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando-se o kit ELISA PAT em formato sanduíche. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Envirologix, Portland, ME). Esse ensaio mediu a proteína PAT expressa. A proteína Cry1 F foi extraída de tecidos de planta de soja com solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST). O tecido da planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado u-sando-se o kit Cry1F ELISA em formato sanduíche. O kit foi usando seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Esse ensaio mediu a proteína Cry1F expressa. A proteína CrylAc foi extraída de tecidos da planta de soja com solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) contendo 0,5% de Albumina Sérica Bovina (BSA). O tecido da planta foi centrifugado; o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando-se o kit CrylAc ELISA em formato sanduíche. O kit foi usando seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE). Esse ensaio mediu a proteína CrylAc expressa. A análise de detecção foi realizada para investigar a estabilidade da expressão e da hereditariedade tanto vertical (entre as gerações) e horizontais (entre as linhagens com uma geração) no evento de soja pDAB9582.814.19.1 Exemplo 2.2: Expressão da Proteína PAT, Cry1F, e CrylAc em Tecidos Vegetais Os níveis das proteínas Cry1F, CrylAc e PAT foram determinados no evento de soja pDAB9582.814.19.1. As proteínas extraíveis solúveis foram medidas usando-se um método de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, quantitativo (ELISA) do tecido da folha de soja. Das gerações T2 a T6, Eventos de Soja pDAB9582.814.19.1, a expressão foi estável (sem segregação) e consistente em todas as linhagens. A Tabela 2 lista o nível de expressão médio das proteínas transgênicas em evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Tabela 2. Nível de expressão média de diferentes proteínas transgênicas no evento de soja pDAB9582.814.19.1 Exemplo 3: Clonagem de Caracterização de Sequência de DNA nas Regiões de Extremidade de Inserção e de Flanqueamento do Evento de Soja PDAB9582.814.19.1 Para caracterizar e descrever o sítio de inserção genômica, a sequência das regiões de extremidade de DNA genômico T, flanqueadoras do evento se soja pDAB9582.814.19.1 foi determinada. A sequência genômica do evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi confirmada, compreendendo 1400 b da sequência de extremidade flanqueadora 5’ (SEQ ID NO:1) e 1398 bp da sequência de extremidade flanqueadora 3’ (SEQ ID NO:2). A amplificação por PCR com base no evento de soja pDAB9582.814.19.1 validou que as regiões de extremidade eram da soja de origem e que as regiões de junção são sequências únicas para o evento de soja pDAB9582.814.19.1. As regiões de junção poderíam ser usadas para identificação específica para evento do evento de soja pDAB9582.814.19.1. Além disso, o sítio de inserção de fita T foi caracterizado por amplificação de um fragmento genômico correspondente à região das sequências de extremidade flanqueadoras i-dentificadas a partir do genoma de soja não transformada. A comparação do evento de soja pDAB9582.814.19.1 com o sequência genômica não transformada revelou que uma deleção de cerca de 57 bp do local original resultou durante a integração da fita T. No total, a caracterização da sequência de inserção e extremidade do evento de soja pDAB9582.814.19.1 indicou que uma cópia intacta da fita T proveniente de pDAB9582.814.19.1 estava presente no genoma de soja.
Tabela 3. Lista dos iniciadores e suas sequências usados na confirmação do DNA genômico de soja no evento de soja PDAB9582.814.19.1 Tabela 3. -continuação- Tabelai Condições para a amplificação por PCR padrão das regiões de extremidade e sequências específicas para evento no evento de soja pDAB9582.814.19.1 Tabela 4. -continuação- Tabela 5. Mistura para PCT para amplificação por PCT padrão das regiões de extremidade e sequências específicas para evento em evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Exemplo 3.1: Confirmação das Sequências Genômicas de Soia As extremidades flanqueadoras 5’ e 3’ alinhadas com a sequência shotgun integral de Glycine Max do cromossomo 02, indicando que o transgene do evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi inserido no cromossomo 02 do genoma da soja. Para confirmar o sítio de inserção do evento de soja pDAB9582.814.19.1 do genoma da soja, PCR foi efetuada com diferentes pares de iniciadores (Figura 2, Tabela 4, e Tabela 5). O DNA genômico do evento de soja pDAB9582.814.19.1 e outras linhagens transgênicas ou não transgênicas foi usado como um modelo. Para confirmar se as sequências de extremidade 5’ estão corretar um iniciador desenhado para se ligar ao elemento gênico do promotor At Ubi10, por exemplo, AtUbi1-RV1, e um iniciador desenhado para se ligar à extremidade termina 5’ clonada nono cromossomo 02 do genoma da soja, iniciador designado81419_FW3, foram usados para amplificar o segmento de DNA que abrange o elemento gênico do promotor At Ubi10 para a sequência de extremidade 5’ terminal. Similarmente, para confirmação da sequência de extremidade 3’ clonada um iniciador específico para pat, por exemplo, 3’ PATEndOS, e três iniciadores desenhados de acordo com a sequência de extremidade terminal 3’ clonada, designados 81419_RV1, 81419JRV2 e 81419JRV3, foram usados para amplificar segmentos de DNA que abrange o gene pat até a sequência de extremidade 3’. Fragmentos de DNA com tamanhos esperados foram amplificados a partir do DNA genômico do evento de soja pDAB9582.814.19.1, com cada par de iniciadores, mas não a partir de amostras de DNA provenientes de outras linhagens de soja transgênicas ou do controle não transgênico. Os resultados indicam que as sequências de extremidades 5’ e 3’ clonadas são as sequências de extremidade flanqueadoras de inserção da fita T para o evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Para confirmar, subsequentemente, a inserção de DNA no genoma da soja, uma amplificação por PCR abrangendo as sequências de extremidade da soja foi completada no DNA genômico que não continha a inserção de fita T para o evento de soja pDAB9582.814.19.1. O iniciador 81419 FW3, desenhado de acordo com a sequência de extremidade terminal 5’, e um iniciador 81419-RV3, desenhado para a sequência de extremidade terminal 3’, foram usados para amplificar segmentos de DNA, que continham o local onde a fita T do pDAB9582 se integrou. Como esperado, a amplificação de PCT completada com o par de iniciadores 81419 FW3 e 81419 RV3 produziram uma fragmento de DNA de aproximadamente 1,5 kb a partir de todas as outras linhagens de controle de soja, mas não de pDAB9582.814.19.1. Alinhamento das sequências de extremidades 5’ e 3’ identificadas do evento de soja pDAB9582.814.19.1 com uma sequência shotgun do genoma integral de Glycine Max a partir do cromossomo 02 revelou deleção de cerca de 57 bp do local original. (Figura 3). Esses resultados demonstraram que o transgene do evento de soja pDAB8294 foi inserido no sítio do cromossomo 02 do genoma da soja.
Exemplo 4: Caracterização do Evento de Soja pDAB9582.814.19.1 via Southern Blot Foi usada a análise Southern blot para estabelecer o padrão de integração do evento de soja pDAB9582.814.19.1. Esses experimentos geraram dados que demonstraram a integração e a integridade dos transgenes cr-yAc e cry1F dentro do genoma de soja. O evento de soja pDAB9582.814. 19.1 foi caracterizado como um evento de comprimento natural, integração simples, contendo a unidade de transcrição de planta (PTU) crylAc e cry1F do plasmídeo pDAB 9582.
Dados de Southern blot sugeriram que um fragmento de fita T inseriu-se no genoma do evento de soja pDAB9582.814.19.1. Análise de Southern blot foi conduzida usando-se sondas específicas para o gene crylAc e cry1F, contidas na região de integração da fita T do pDAB9582. 814.19.1, e enzimas de restrição descritivas que têm sítios de divagem localizados dentro do plasmídeo e produzem fragmentos de hibridização internos ao plasmídeo ou fragmentos que abrangem a junção do plasmídeo com DNA genômico da soja (fragmentos de extremidade). Os pesos moleculares indicados a partir da hibridização Southern para a combinação da enzima de restrição e a sonda foram únicos para o evento, e estabelecidos seus padrões de identificação. Essas análises mostraram também que o fragmento de plasmídeo havia sido inserido no DNA genômico da soja sem rearranjos do crylAc e cry1F PTU
Exemplo 4.1: Coleção de Amostras de Folha de Soía e Isolamento DNA (qDNA) Genômico O DNA genômico foi extraído do tecido de folha colhido das plantas de soja individuais contendo o evento de soja pDAB9582.814.19.1. Além disso, gDNA foi isolada de uma planta de soja contendo o evento de soja pDAB9582.814.19.1. Além disso, gDNA foi isolado de uma planta de soja convencional, Maverick, que contém o patrimônio genético que é representativo da linha de substância, ausente, os genes crylAc e cry1F. DNA genômico individual foi extraído do tecido des folha liofilizado seguinte ao método CTAB padrão (Sambrook et al. (1989)). Seguinte à extração, o DNA ou quantificado espectrofluormetricamente usando o reagente PICO GREEN (Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA foi então visualizado em gel de agarose para confirmar os valores a partir da análise com PICO GREEN e para determinar a quantidade de DNA.
Exemplo 4.2: Digestão e Separação de DNA
Para caracterização molecular Southern blot do evento de soja pDAB9582.814.19.1, dez microgramas (10 pg) de DNA genômico foram digeridos. O DNA genômico do evento de soja pDAB9582.814.19.1 e de linhagem de soja não transgênica Maverick foi digerido por adição de aproximadamente cinco unidades de enzima de restrição selecionada por pg de DNA e o tampão de reação correspondente para cada amostra de DNA. Cada amostra foi incubada, a aproximadamente 37°C, durante a noite. As enzimas de restrição Asei, Hindlll, Nsil, e Ndel foram usadas individualmente para digestores simples (New England Biolabs, Ipswich, MA). As enzimas de restrição Notl e ApaLI foram usadas juntas para digestão dupla (New England Biolabs, Ipswich, MA). Além disso, uma amostra de controle de hibridização positiva foi preparada combinando-se o DNA de plasmídeo, pDAB9582 com DNA genômico da variedade de soja não transgênica, Maverick. O coquetel de DNA de plasmídeo / DNA genômico foi digerido usando-se os mesmos procedimentos e enzima de restrição que as amostras de teste.
Depois das digestões terem sido incubadas durante a noite, 25 pL de SOLUÇÃO QUICK-PRECIP PLUS (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) foram adicionados e as amostras de DNA digerido foram precipitadas com isopropanol. O pélete precipitado de DNA ressuspenso em 15 pL de tampão de carga 1X (bromofenoi azul a 0,01%, EDTA 10,0mM, glicerol a 10,0%, Tris 10,mM pH 7,5). As amostras de DNA e marcadores de pesos moleculares foram então eletroforados através de gel de agarose a 0,85% com 0,4X de tampão TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 35 volts por aproximadamente 18-22 horas para obter a separação de fragmentos. Os géis foram coloridos com brometo de etídio (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV).
Exemplo 4,3: Transferência Southern e Tratamento com Membrana Análise Southern blot foi realizada essencialmente conforme descrita por Memelink et al. (1994), Em resumo, seguinte à separação ele-troforética e visualização dos fragmentos de DNA, os géis foram depurina-dos com HCI 0,25M por aproximadamente 20 minutos, e então expostos a uma solução desnaturante (NaOH 0,4M, NaCI 1,5M) por aproximadamente 30 minutos seguido por solução neutralizante (NaCI 1,5M, Tris 0,5M pH 7,5) por pelo menos 30 minutos. Transferência Southern foi realizada durante a noite sobre membranas de náilon usando-se um sistema de absorção com pavio (wicking) com 10X de SSC. Depois da transferência, o DNA foi ligado à membrana por reticulação com UV seguindo rápida lavagem da membrana com 2X uma solução de SSC. Esse processo produziu membranas para Southern blot prontas para hibridização.
Exemplo 4.4: Marcação e Hibridizacão das Sondas de DNA
Os fragmentos de DNA ligados à membrana de náilon foram detectados usando-se uma sonda marcada (Tabela 6). As sondas foram geradas por incorporação à base de PCR de uma nucleotídeo marcado do digo-xigenina (DIG), [DIG-11]-dTUP, no fragmento de DNA amplificado a partir dos plasmídeo pDAB9582 usando-se iniciadores específicos para os elementos gênicos. A geração de sonda de DNA por sonda de síntese de PCR foi efetuada usando-se um Kit de Síntese de Sondas DIG por PCR (Roche Diagnostics, Indianopolis, IN) seguindo os procedimentos do fabricante.
As sondas marcadas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose para determinar sua qualidade e quantidade. Uma quantidade desejada de sonda marcada foi então usada para a hibridização para o DNA-alvo sobre as membranas de náilon para detecção dos fragmentos específicos usando-se os procedimentos conforme essencialmente descritos para SOLUÇÃO DIG EASY HYB (Roche Diagnostics, Indianopolis, IN). Em resumo, os bfots de membrana de náilon contendo DNA fixado foram lavados rapidamentes com 2X de SSC e pré-hibridizados com 20-25 mL da SOLUÇÃO DIG EASY HYB pré-aquecida em garrafas a aproximadamente 45-55°C, por cerca de 2 horas, em um forno de hibridização. A solução de pré-hibridização foi então decantada e reposta com ~15 mL da SOLUÇÃO DIG EASY HYB pré-aquecida contendo uma quantidade desejada de sondas específicas desnaturadas por ebulição em banho de água por aproximadamente cinco minutos. A etapa de hibridização foi então conduzida a aproximadamente 45-55°C, durante a noite, no forno de hibridização.
No final da hibridação das sondas, as SOLUÇÕES DIG EASY HYB contendo as sondas foram decantadas em tubos limpos e armazenadas a aproximadamente -20°C. Essas sondas poderíam ser reusadas até duas vezes de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. Os blots de membranas foram enxaguados e lavados duas vezes em recipientes de plástico limpos com tampão de lavagem de baixa severidade (2X de SSC, SDS a 0,1%) por aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por lavagem duas vezes com tampão de lavagem de alta severidade (0,1X de SSC, SDS a 0,1%), por 15 minutos cada, a aproximadamente 65°C. Os blots de membranas foram lavados rapidamente com 1X de tampão de Ácido maleico do CONJUNTO DE TAMPÃO DIG AND BLOCK (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), por aproximadamente 5 minutos. Isso foi seguido por bloqueio em um 1X de tampão de bloqueio por 2 horas e uma incubação com um anticorpo anti-DÍG-AP (fosfatase alcalina) (Roche Diagnostics, Indianaopolis, IN) em um tampão de bloqueio também, por no mínimo 30 minutos. Depois de 2 a 3 lavagens com 1X de tampão de lavagem, sondas de DNA específicas permanecem ligadas aos blots de membranas e padrões de DNA marcado com DIG foram visualizados usando-se SISTENA DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO QUIMIOLUMINESCENTE CDP-STAR (Roche Diagnostics, Indianopolis, IN) seguindo as recomendações do fabricante. Os blots foram expostos a filmes quimioluminescentes por um ou mais pontos de tempo para detectar fragmentos de hibridização e para visualizar padrões de dimensões moleculares. Os filmes foram revelados com revelador de filme ALL-PRO 100 PLUS (Konica Minolta, Osaka, Japão) e as imagens foram escaneadas. O número e os tamanhos das bandas detectadas foram documentados para cada sonda. MARCADOR II DE PESO MOLECULAR DE DNA MARCADO COM DIG (DIG MWM II) e MARCADOR VII DE PESO MOLECULAR DE DNA MARCADO COM DIG (DIG MWM VII), detecção de DIG conforme descrito, foram usados para determinar o tamanho dos fragmentos de nos Southern blots.
Tabela 6. Localização e comprimento das sondas usadas em análise Southern.
Exemplo 4.5: Resultados de Southern Blots Os tamanhos de fragmentos esperados e observados com um digestor e sonda particulares, com base nos sítios de enzimas de restrição conhecidos dos crylAc e c/yfFPTU, são dados na Tabela 7. Dois tipos de fragmentos foram identificados a partir desses digestores e hibridizações: fragmentos internos onde os sítios de enzima conhecidos flanqueiam a região de sonda e estão completamente contidos dentro dos crylAc e crylFPJU, e fragmentos de extremidades onde um sítio de enzima conhecido está localizado em um terminal da região da sonda e um segundo sítio é esperado no genoma de soja. Tamanhos de fragmentos de extremidade variam com o evento porque, na maioria dos casos, os sítios de integração de DNA são únicos para cada evento. Os fragmentos de extremidade proporcionam um meio para localizar um sítio de enzima de restrição relativo ao DNA integrado e para avaliar o número de inserções de NDA. Análises de Southern blots completadas em múltiplas gerações de soja contendo o evento soja pDAB9582.814.19.1 produziram dados que sugeriram que uma baixa cópia, crylAc e crylFPTU intactos, do plasmídeo pDAB9582, foi inserida no geno-ma da soja do evento de soja pDAB9582.814.19.1.
Tabela 7. Fragmentos de hibridização previstos e observados na análise de Southern blot. 1. Tamanhos de fragmentos esperados são baseados no mapa de plasmídeo do pDAB9582.2. Tamanhos de fragmentos observados são considerados aproximadamente dessas análises e são baseados nos tamanhos indicados dos fragmentos de MARCADOR II e MARCADOR II DE PESO MOLECULAR DE DNA MARCADO COM DIG.
Tabela 7. -continuação- As enzimas de restrição Asei e Nsil se ligam e clivam sítios de restrição no plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, essas enzimas foram selecionadas para caracterizar a inserção do gene crylAc no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Os fragmentos de borda de >7286 bp ou >9479 bp foram previstos hibridizarem com a sonda seguindo os digestores Asei e Nsil, respectivamente (Tabela 7). As bandas de hibridização crylAc de cerca de 7400 e >10000 bp foram observadas quando os digestores de Asei e Nsil foram usados, respectivamente. A hibridização da sonda para bandas deste tamanho sugere a presença de um sítio único de inserção para o gene crylAc no genoma da soja do evento pDAB9582.814.19.1. Enzimas de restrição Notl e ApaLI foram selecionados para realizar uma digestão dupla e liberar um fragmento que contém a unidade de transcrição planta crylAc (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). Os fragmentos de 4550 bp previstos foram observador com a sonda seguinte as digestão dupla de Notl e ApaLI. Os resultados obtidos com a digestão de enzima das amostras de pDAB9582.814.19.1 seguida por hibridização das sondas indicaram que um crylAcPIU intacto do plasmídeo pDAB9582 foi inserido no genoma de soja do evento de soja pDAB9582.814.19.1.
As enzimas de restrição Nde\ e Nsil se ligaram e clivaram sítios de restrição no plasmídeo pDAB9582. Subsequentemente, essas enzimas foram selecionadas para caracterizar a inserção do gene cry1F no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Os fragmentos de extremidade de >5569 bp e >9479 bp foram previstos hibridizarem com a sonda seguintes às digestões de Ndel e Nsil, respectivamente (Tabela 7). Bandas de hibridização de cry1F simples de ~7500 bp e > 10000 bp foram observadas quando Ndel e Nsil foram usados, respectivamente. A hibridização da sonda para bandas deste tamanho sugere que a presença de um sítio simples de inserção para o gene cry1F no genoma da soja do evento de soja pDAB9582.814.19.1. A enzima de restrição, Hindlll, foi selecionado para liberar o fragmento que contém a unidade de transcrição de planta cry1F (PTU; promotor/gene/terminador) (Tabela 7). O fragmento de 7732 bp previsto foi observado com seguinte as digestões de Hindlll. Os resultados obtidos com a digestão de enzima das amostras de pDAB9582.814.19.1 seguido pela hibridização de sonda indicou que um crylFPTU intacto de plasmídeo pDAB9582 foi inserido no geno-ma da soja do evento pDAB9582.814.19.1.
Exemplo 4.6: Ausência de Sequências de Cadeia Principal Análise Southern blot foi também conduzida para verificar a ausência do gene de resistência à espectinomicina (specR), o elmento Ori Rep e a proteína de iniciação de replicação trfA (elemento trf A) no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Nenhuma hibridização específica do elemento Ori Rep ou elemento TRF A, de resistência à espectinomicina, é esperada quando controles apropriados positivos (pDAB9582 adicionado ao DNA ge-nômico Maverick) e negativos (DNA genômico Maverick) são incluídos para a análise SoutherN. Seguinte à digestão de Nsil e hibridização com a sonda específica specR, uma banda de tamanho esperado de 15320 bp foi observada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionado ao DNA genômico Maverick). A sonda specR não hibridizou para amostras do controle negativo e o evento de soja pDAB9582.814.19.1. Similarmente, uma banda de tamanho esperado de 15320 bp foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB9582 plus maverick), mas ausente das amostras do controle negativo e do evento de soja pDAB9582.814.19.1 após digestão de Nsil e hibridização com a sonda trfA. Outra banda de tamanho esperado de 5329 bp foi detectada na amostra de controle positivo (pDAB9582 adicionada ao DNA genômico Maverick), mas ausente das amostras do controle negativo e do evento de soja pDAB9582.814.19.1 após a digestão de Ndel e hibridização com sonda específica para OriRep. Esses dados indicam que a ausência de gene de resistência à espectinomicina, o elemento Ori Rep e a proteína trfA de iniciação à replicação no evento de soja pDAB9582.814.19.1. Exemplo 5: Experiência Agronômica e em Campo e Tolerância a Herbicidas Para testas as características agronômicas e eficácia do evento de soja pDAB9582.814.19.1, o evento foi planto em um experimento de eficácia em Santa Isabel, Porto Rico, em outubro de 2010 e em fevereiro de 2011. A cultivar Maverick, que foi originalmente transformada para produzir o evento pDAB9582.814.19.1, foi plantada em cada sementeira e incluída co- mo controle nos experimentos. Semente para a sementeira T3 foi derivada de seleções de plantas simples no estágio T2 e a semente para a sementeira T4 foi derivada de seleções de plantas simples no estágio T3. Quatro linhagens do evento foram testadas para cada geração. Cada linhagem foi plantada em um lote que era de 4 fileiras de largura e 2,29 metros (7,5 pés) de comprimento. O espaçamento entre as fileiras era de 76, 2 cm (30 polegadas). Os lotes foram deixados crescer sob luz por aproximadamente 2,5 semanas para compensar pelos dias curtos de Porto Rico. Cada sementeira foi pulverizada com glufosinato em uma taxa de 411 g ae/ha. Um lote das plantas de controle, Maverick, foi pulverizado com a mesma taxa de glufosinato e um segundo lote não foi pulverizado e usado como comparação de controle para o evento.
Os dados foram coletados sobre emergência, aparência geral, vigor, altura, acomodação e maturidade. A tolerância a herbicidas foi avaliada procurando-se visualmente clorose, necrose foliar e morte da planta (Tabela 8).
Para comparações do evento de soja pDAB9582.814.19.1 com Maverick, somente os dados do bloco não pulverizado de Maverick foram usados. Para comparação dos tratamentos pulverizados e não pulverizados, dados do bloco de evento de soja pDAB9582.814.19.1 pulverizado com um dado tratamento foram comparados ao dados do bloco não pulverizado de controle Maverick. O evento de soja pDAB9582.814.19.1 mostrou tolerância à aplicação do herbicida de glufosinato. Em contraste, nenhuma das plantas Maverick eram tolerantes aos tratamentos com herbicidas.
Tabela 8. Comparação do evento de soja pDAB9582.814.19.1 para Maverick. Os valores são dados médios das sementeiras T3 e T4. Cada sementeira do evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi pulverizada com glufosinato no estágio V3 em uma taxa de 411 ae/ha.
Exemplo 6: Caracterização da Atividade Inseticida para o Evento de Soia PDAB9582.814.19.1 Avaliações em campo e em estufa foram conduzidas para caracterizar a atividade de CrylAc e Cry1F no evento de soja pDAB9582.814.19.1 contra pragas de soja cultivada em laboratório incluindo Anticarsia gemmatalis (mucuna preta), Pseudoplusia includens (verme da soja) and Spodoptera frugi-perda (lagarta do cartucho do milho). O evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi comparado com uma variedade de soja não transformada Maverick, para determinar o nível de proteção à planta pelas proteínas Cry1F e Cry1 Ac.
Experimentos em estufa foram conduzidos em plantas com a-proximadamente quatro semanas. Quinze plantas foram usadas para avaliar o evento de soja pDAB9582.814.19.1 e o controle Maverick. Para cada espécie de inseto testada (Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includes, e Spodoptera frugiperda), foram feitos 3 furos nas folhas de cada planta para um total de 45 discos de folhas/planta/espécie de inseto. Os furos na folha com diâmetro de 1,4 cm (ou 1,54 cm2) foram colocados em uma arena de teste no topo de 2% de água ágar, com infestação de larvas de neonato e vedada com uma tampa de plástico perfurada. A mortalidade e o consumo da folha foram classificados 4 dias após a infestação. As larvas que não responderam à sondagem branca foram consideradas mortas. O dano na folha foi avaliado visualmente classificando a percentagem de furo na folha consumido por inseto.
As avaliações em campos foram conduzidas coletando-se amostras de folhas de lotes de sementeira com aumento em Santa Isabel, Porto Rico e enviando estas folhas para Indianapolis, IN, para teste. O lote com sementeira para o evento de soja pDAB9582.814.19.1 foi plantado em feve- reiro de 2011 e consistia em aproximadamente 180 plantas dispostas em quatro fileiras. Cada fileira tinha 2,3 m de comprimento e espaçada de 7,2 cm; plantas individuais foram espaçadas de 5,1 cm dentro de cada fileira. Em março de 2011, uma folha em trifoliada de haste principal, inteiramente expandida, localizada aproximadamente quatro nódulos abaixo do meriste-ma, foi excisada de 10 plantas de evento de soja pDAB9582.814.19.1 e 10 plantas "Maverick". As folhas foram colocadas em sacos plásticos rotulados, (uma por saco), e vedados. As folhas ensacadas forma acondicionadas e transferidas para o laboratório. No laboratório, um ou dois discos de folha de 3,33 cm (1,31 polegada) de diâmetro foram cortados em cada folha trifoliada para proporcionar um total de 16 discos de folha. Cada disco de folha foi colocado em arena de teste no topo de ágar a 2%, infestada com uma larva de neonato S. frugiperda, e veda com uma tampa de plástico perfurada. As folhas de disco foram mantidas em uma câmara de meio ambiente controlada por 7 dias, e nesse tempo a mortalidade e o consumo de folhas foram classificados. Larvas não responsivas à sondagem branda foram consideradas mortas. O dano nas folhas foi avaliado por classificação visual do furo na folha consumido pelo inseto.
Os resultados obtidos desses experimentos indicaram que o e-vento de soja pDAB9582.814.19.1 susteve significantemente dano menor que as plantas de controle Maverick para todos os insetos testados. Assim, o evento de soja pDAB9582.814.19.1 mostrou atividade inseticida sobre esta ampla faixa hospedeira.
Exemplo 7: Sequência do Evento de soja pDAB9582.814.19.1 A SEQ ID NO:14 proporciona a sequência do evento de soja pDAB9582.814.19.1. Essa sequência contém a sequência flanqueadora ge-nômica 5’, o inserção de fita T do pDAB9582 e as sequências flanqueadoras genômicas 3’. Com respeito à SED ID NO: 14, resíduos 1-1400 são sequência flanqueadora genômica 5’, resíduos 1537-13896 são resíduos de um re-arranjo do plasmídeo pDAB9582 e 1537-13896 são resíduos da inserção de fita T do pDAB9582, e os resíduos 13897-15294 são sequência flanqueadora 3’. Assim, a sequência de junção ou de transição com respeito à extremi- dade 5’ da inserção ocorre nos resíduos 1400-1401 da SEQ ID NO:14. A sequência de junção ou transição com respeito à extremidade 3’ da inserção ocorre assim nos resíduos 13896-13897 da SEQ ID NO:14.
Deve ser observado que a progênie do evento de soja pDAB9582.814.19.1 pode ter sequências que divergem levemente da SEQ ID NO:14. Durante a introgressão e o processo de reprodução de introduzir o evento de soja pDAB9582.814.19.1 no genoma das células vegetais, não é incomum que ocorram algumas deleções ou outras alterações da inserção. Além disso, erros na amplificação de PCR podem ocorrer, o que pode resultar em menores erros de sequenciamento. Por exemplo, as sequências flan-queadoras listadas aqui foram determinadas ao serem gerados amplicons a partir de DNAs genômicos, e então clonagem e sequenciamento dos amplicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e pequenas discrepân-cias em sequências geradas e determinadas desta maneira, dado os muitos ciclos de amplificação que são necessários para gerar bastante amplicon para sequenciamento a partir de DNAs genômicos. Aquele versado na técnica deve reconhecer e observar que quaisquer ajustes necessários devidos a estes tipos de erros comuns e discrepâncias estão dentro do escopo da presente invenção. Assim, o segmento relevante da sequência de plasmídeo proporcionada aqui pode compreender algumas pequenas variações. Assim, uma planta que compreende um polinucleotídeo tendo alguma faixa de identidade com a sequência de inserção em questão está dentro do escopo da presente invenção. Identidade para a sequência da SEQ ID NO: 14 pode ser uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% com uma sequência exemplificada ou descrita aqui. Assim, algumas diferenças entre a SEQ ID NO: 14 e as plantas de progênie do evento de soja pDAB9582.814.19.1 podem ser identificadas e estão dentro do escopo da presente invenção.
Exemplo 8: Evento de Soja pDAB4468.04.16.1 e Evento de Soja PDAB9582.814.19.1 para Pirâmide de Reprodução Exemplo 8.1: Cruzamento Sexual do Evento de Soja pDAB4468.04.16.1 e Evento de Soja pDAB9582.814.19.1 O evento de soja pDAB4468.04.16.1, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional WO/2012/075426, foi cruzado sexualmente com o evento de soja pDAB9582.814.19.1 As anteras do evento de soja pDAB4468.04.16.1 foram manualmente esfregadas através do estigma do evento de soja pDAB9582.814.19.1, fertilizando, assim, o evento de soja pDAB9582.814.19.1. A progênie Fi resultante que continha eventos de integração de ambos o evento de soja pDAB9582.814.19.1 e o evento de soja pDAB4468.04.16.1 foi selecionada para tolerância aos herbicidas 2,4-D e glufosinato para identificas a plantas de progênie, que continham ambos os eventos de integração.
Exemplo 8.2; Caracterização da Expressão de Proteína no Evento de Soia pDAB9582-814.19.1::pDAB4468.04.16.1 para Pirâmide de Reprodução As propriedades bioquímica das proteínas recombinantes Cry1F, Cry lAc, AAD12 e PAT expressas no evento de soja pDAB9582.814.19.1:: pDAB8264.44.06.1 para pirâmide de reprodução foram caracterizadas. Um total de 51 plantas F! foram confirmadas como contendo ambos os eventos de soja pDAB9582.814.19.1 e pDAB4468.04.16.1 por ensaios TAQMAN® específicos para eventos, usando-se ensaios baseados naqueles descritos no Pedido de Patente Provisório US 61/511658 e no Pedido de Patente Internacional WO/2011/066360, respectivamente. A seguir, um ensaio imuno-absorvente ligado à enzima (ELISA) foi usado para quantificar a expressão das proteínas PAT e AAD12 ao passo que as proteínas CrylAc e Cry1F foram quantificadas por imunoensaios multiplexados usando-se tecnologia eletroquimioluminescente da Meso-Scale Discovery (MSD). Coletivamente, esses ensaios foram usados para caracterizar as propriedades bioquímicas das proteínas e confirmar a expressão dessas proteínas no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB44686.04.16.1.
Expressão da Proteína PAT em Tecidos Vegetais Os níveis da proteína PAT foram determinados usando-se o e-vento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468. 04.16.1. A proteína PAT, solúvel, extraível foi medida usando-se um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, quantitativo (Envirologix Portland, ME) para testar o tecido da folha de soja.
Um total de 51 plantas Fi foi confirmado como contendo ambos os eventos de soja pDAB9582.814.19.1 e pDAB4468.04.16.1 por ensaios TAQMAN® específicos para eventos. As amostras de tecido de folha de soja foram isoladas dessas plantas de teste crescidas em estufa no estágio de crescimento V3-V4 e preparadas para análise de expressão. A proteína PAT foi extraída de tecidos da planta de soja com uma solução salina contendo o detergente Tween-20 (PBST) e 1% de polivinilpirrolidona 40 (PVP-40). As amostras foram então extraídas usando-se um GENOBRINDER™, a 1500 rpm, por 5 minutos. O extrato da planta foi centrifugado; o sobrenadante a-quoso foi coletado, diluído com tampão apropriado se necessário, e analisado usando-se o kit ELISA para PAT em formato sanduíche. O kit foi usado seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Esse ensaio mediu a proteína PAT expressa no tecido da folha. A análise de detecção foi realizada para investigar a hereditariedade de expressão no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1. Na geração Fi, as plantas do e-vento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1 expressaram PAT (Tabela 9).
Expressão das Proteínas CcrylF e Cry1 Ac em Tecidos Vegetais Os níveis das proteínas Cry1F e CrylAc foram determinados no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1. As proteínas Cry1F e CrylAc, solúveis, extraíveis, foram medidos usando-se um ensaio MDS multiplexado (Meso-Scale Discovery, Gaithersbrug, MD) para tecido de folha de soja.
Um total de 51 plantas Fi foram confirmadas como contendo ambos os eventos de soja pDAB9582.814.19.1 e pDAB4468.04.16.1 por ensaios TAQMAN®. As amostras de tecido de folha de soja foram isoladas dessas plantas de teste crescidas em estufa no estágio de crescimento V3-V4 e preparadas para análise de expressão. As proteínas Cry1F e CrylAc foram extraídas dos tecidos de planta de soja com PBST e 1% de PVP40. As amostras foram então extraídas usando-se um GENOGRINDER™ a 1500 rpm, por 5 minutos. O extrato da planta foi centrifugado; sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado usando um ensaio de MSD multiplex para Cry1;Cry1Ac da Meso-Scale Discovery. Esse ensaio mediu as proteínas Cry1F e CrylAc no tecido da folha. A análise de detecção foi realizada para investigar a hereditariedade de expressão no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Na geração Fi, as plantas do e-vento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468. 04.16.1 expressaram Cry1F e CrylAc (Tabela 10).
Expressão das Proteínas AAD12 em Tecidos Vegetais Os níveis da proteína AAD12 foram determinados no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. A proteína AAD12, solúvel, extraível, foi medida usando-se um ensaio imuno-absorvente ligado à enzima, quantitativo (Acadia Bioscience, Portland, ME) para teste de tecido de folha de soja. Um total de 51 plantas Fi foram confirmadas como contendo ambos os eventos de soja pDAB9582.814.19.1 e pDAB4468.04.16.1 por ensaios TAQMAN® específicos para eventos. Amos- tras de tecido de folha de soja foram isoladas dessas plantas de teste crescidas em estufa no estágio de crescimento V3-V4 e preparadas para análise de expressão. A proteína AAD12 foi extraída dos tecidos de planta de soja com uma solução salina tamponada com fosfato contendo o detergente Tween-20 (PBST) e 0,5% de albumina sérica bovina (BSA). As amostras foram então extraídas usando-se GENOGRINDER™, a 1500 rpm, por 5 minutos. O extrato da planta foi centrifugado, o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído com tampão apropriado conforme necessário, e analisado u-sando-se kit ELISA para AAD12 em formato de sanduíche. O kit foi usado seguindo-se as instruções do fabricante (Acadia, Portland, ME). Esse ensaio mediu a proteína AAD12 expressa no tecido de folha. A análise de detecção foi realizada para investigar a hereditariedade de expressão no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1. Na geração F1, as plantas do e-vento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468. 04.16.1 expressaram AAD12 (Tabela 11).
Tabela 11. Expressão Média de AAD12 no evento de soja de pirâmide de produção pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1______________________ Evento_______________________________Expressão Média de AAD12 (ng/cm2) pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 110,2________________________ Exemplo 8.3: Tolerâncias a Herbicidas do Evento de Soia de Pirâmide de Reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB468.04.16.1 Tolerância a herbicidas a pirâmide de reprodução, o evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 ensaiado em um estudo em estufa. Sementes do evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 foram plantadas em potes e crescidas até a maturidade. Cinquenta e três (53) plantas foram pulverizadas com aplicação única de herbicida, que consistiu em 840 g ar/há de 2,40D no estágio de crescimento V3-V4 (caracterizado por unifoliato e primeiras três até quatro folhas de trifoliato sendo inteiramente desenvolvidas. Foi constatado que todas as cinquenta e três plantas eram resistentes à aplicação de herbicida. Comparativamente, as plantas de controle que não continham o gene aad-12 e eram esperados serem suscetíveis à aplicação dos herbicidas 2,4-D foram incluídas no estudo.
Em resumo, o gene aad-12, que estava presente na linhagem parental do evento de soja DAB4468.04.16.1 conferiu tolerância ao herbicida 2,4-D. Essa característica foi passa e herdada na soja pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1, proporcionando assim tolerância a herbicidas ao evento de soja pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1. Comparativamente, as plantas de controle, que não continham o gene aad-12 eram suscetíveis à aplicação do herbicida 2,4-D.
Exemplo 8.4: Caracterização da Atividade Inseticida do Evento de Soía PDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 Avaliações em estufa foram conduzidas para caracterizar a atividade de CrylAc e Cry1F no evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 contra pragas de soja cultivada em laboratório, incluindo Anticarsia gemmatalis (mucuna preta) e Pseudopiusia includens (verme de soja) foi comparado versus o evento de soja pDAB9582.814.19.1, evento de soja pDAB4468.04.16.1 e variedade de soja Maverick não transformada para determinar se o nível de proteção de planta proporcionado pelas proteínas Cry1F e CrylAc se altera quando da pirami-dação. Além disso, o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582. 814.19.1::pDAB4468.04.16.1 e o evento de soja pDAB4468.04.16.1 eram pulverizados com uma composição herbicida simples contendo 840 g ae/ha de 2,4-D antes dos bioensaios para confirmar a presença de impacto biológico negativo dos herbicidas contra insetos.
Experimentos em estufas foram conduzidos em plantas com cerca de três semanas de vida. Foram usadas cada uma de cinco a dez plantas para avaliar o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582. 814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1, evento de soja pDAB9582.814.19.1, e os controles negativos: o evento de soja pulverizado pDAB4468.04.16.1 e Maverick. Para cada espécie de inseto testada (Anticarsia gemmatalis e Pseudo-plusia includes), foram feitos 3 furos na folhas de cada planta por espécie de inseto. Os furos na folha com diâmetro de 1,4 cm (ou 1,54 cm2) foram colocados em uma arena de teste no topo de 2% de água ágar, com infestação de uma larva de neonato e vedada com uma tampa de plástico perfurada. A mortalidade e o consumo da folha foram classificados 4 dias após a infestação. As larvas que não responderam à sondagem branca foram consideradas mortas. O dano na folha foi avaliado visualmente classificando a percentagem de furo na folha consumido por inseto.
Os resultados obtidos desses experimentos replicados (Tabela 12) indicaram que o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582. 814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1 era consistente com o evento de soja pDAB9582.814.19.1 e susteve dano significantemente menor no tecido da folha (0,6-0,8%) que o evento de soja pDAB4468.04.16.1 (94-99%) e controles de Maverick (96-97%) contra o verme de soja e mucuna preta. Alta mortalidade (100%) foi registrada para ambos o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 e o evento de soja pDAB9582.814.19.1 enquanto o pDAB4468.04.16.1 e as plantas Maverick resultaram em mortalidade baixa (0%) e todos os insetos colocados nesta plantas controle sobreviveram. Assim, o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 tem atividade inseticida comparável com o evento de soja pDAB9582.814.19.1. * DAI = dias após infestação Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, tornar-se-á aparente para aqueles versados na técnica que a invenção pode ser modificada em disposição e detalhes sem se desviar de tais princípios. São reivindicadas aqui todas as modificações que estão dentro do espírito e do escopo das reivindicações apensas.
Todas as publicações e documentos de patentes publicados citados neste relatório descritivo são aqui incorporados a título de referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Método para controlar insetos, que compreende expor insetos às plantas de soja resistentes a insetos, em que as plantas de soja compreendem DNA que compreende uma primeira sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma segunda sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID ΝΟ.Ί5; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15, em que as ditas primeira e segunda sequências são diagnósticos para a presença do evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16, para, assim, controlar os insetos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os ditos insetos são Pseudoplusia includens (verme de soja).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que os ditos insetos são Anticarsia gemmatalis (mucuna preta)
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os ditos insetos são Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho do milho).
5. Método para controlar ervas daninhas em uma colheita de soja, que compreende aplicar um herbicida de glufosinato, um herbicida de ácido fenoxiacético, um herbicida de ácido piridiloxiacético, ou combinações destes, a uma área que compreende a colheita de soja, em que a colheita de soja compreende plantas de soja compreendendo DNA que tem uma primeira sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e tem uma segunda sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15, em que as ditas sequências são diagnósticos para a pre- sença do evento pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1.
6. Sequência de DNA isolado, que compreende uma ou mais sequências do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15.
7. Método para reproduzir uma planta de soja, que compreende: cruzar uma primeira planta com uma segunda planta de soja para produzir uma terceira planta de soja, em que a dita primeira planta compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionada do grupo que consiste em 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 e complementos destas; e que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO:15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15 e complementos destas; e ensaiar a dita terceira planta de soja para verificar a presença de DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 complementos destas; e uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO: 15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e complementos destas.
8. Molécula de DNA isolada, que compreende uma sequência de junção que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 e complementos destas; e que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO: 15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO: 15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e complementos destas.
9. Planta de soja, ou parte desta, que é resistente ao Pseudo-plusia includens (verme de soja) e compreende DNA que tem pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 e complementos destas; e que tem pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO:15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO: 15 e complementos destas.
10. Semente da planta conforme definida na reivindicação 9.
11. Composição derivada da planta de soja, ou partes desta, de acordo com a reivindicação 5, em que a dita composição é um produto de commodity selecionado do grupo que consiste em ração de soja, farinha de soja, concentrado de proteína de soja, e óleo de soja.
12. Método para controlar pragas em grão, semente, ração ou farinha de soja, que compreende incluir o evento de soja de pirâmide de reprodução pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 no dito grão, semente, ração, ou farinha conforme demonstrado pelo dito grão, semente, ração, ou farinha que compreende DNA que compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1: bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO:2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 e complementos destas; e que compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO:15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e complementos destas.
13. Semente de soja, que compreende em seu genoma uma primeira sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em bp 1385-1415 da SEQ ID NO:1; bp 1350-1450 da SEQ ID NO:1; bp 1300-1500 da SEQ ID NO:1; bp 1200-1600 da SEQ ID NO:1; bp 137-168 da SEQ ID NO:2; bp 103-203 da SEQ ID NO.2; e bp 3-303 da SEQ ID NO:2 e uma segunda sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em bp 2680-2780 da SEQ ID NO: 15; bp 2630-2830 da SEQ ID NO:15; bp 2530-2930 da SEQ ID NO:15; bp 9071-9171 da SEQ ID NO:15; bp 9021-9221 da SEQ ID NO:15; e, bp 8921-9321 da SEQ ID NO:15 e complementos destas.
14. Planta de soja crescida a partir da semente de soja conforme definida na reivindicação 13.
15. Parte da planta de soja conforme definida na reivindicação 14, em que a dita parte é selecionada do grupo que consiste em pólen, óvulo, flores, brotos, raízes e folhas, e a dita parte compreende o dito evento de soja pDAB9582.814.19.1 ::pDAB4468.04.16.1.
16. Composição derivada da planta de soja ou uma parte desta conforme definida na reivindicação 14, em que a dita composição é um produto de commodity selecionado do grupo que consiste em ração de soja, farinha de soja, e óleo de soja.
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