TW201636354A - 甲苯磺酸鹽 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。

Description

甲苯磺酸鹽
本發明係關於N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸(甲苯磺酸鹽)鹽、包括該甲苯磺酸鹽之醫藥組合物、使用該甲苯磺酸鹽來治療生理病症之方法、及用於其合成之中間產物與方法。
本發明係在治療阿茲海默氏(Alzheimer’s)病及涉及澱粉樣β(Aβ)肽之其他疾病與病症之領域，Aβ肽係澱粉樣前體蛋白質(APP)之神經毒性及高度聚集肽片段。阿茲海默氏病係影響全世界數百萬患者之可怕神經退化性病症。鑒於目前市場上核准之藥劑僅提供患者短暫、症狀效益，在治療阿茲海默氏病方面存在顯著未滿足之需求。
阿茲海默氏病之特徵係在大腦中產生、聚集並沉積Aβ。完全或部分抑制β-分泌酶(β-位澱粉樣前體蛋白質-裂解酶；BACE)已顯示在小鼠模型中對斑塊有關及斑塊依賴性病理學具有顯著效應，其表明甚至少量降低Aβ肽水平可導致長期顯著降低斑塊負擔及突觸短缺，由此特定言之在治療阿茲海默氏病方面提供顯著治療效益。
美國專利案第8,841,293號揭示用於治療Aβ肽-介導之病症(諸如阿茲海默氏病)之特定BACE抑制劑，及特定言之，揭示例如BACE抑制劑N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺及相應鹽酸鹽。
期望N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之新穎形式，其提供改良固態穩定性及化學穩定性以增強在製備及製造醫藥調配物方面之應用。由此，本發明提供一種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。此外，本發明提供N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，其為晶型。本發明進一步提供N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，其以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處結合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度。
本發明亦提供一種治療患者之阿茲海默氏病之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。本發明進一步提供一種治療患者之輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。本發明亦提供一種抑制患者之BACE之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。本發明亦提供一種抑制BACE介導之澱粉樣前體蛋白質裂解之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)- 4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。本發明進一步提供一種抑制Aβ肽產生之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。
此外，本發明提供N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，其用於治療，特定言之用於治療阿茲海默氏病或用於治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病。甚至此外，本發明提供一種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽之用途，其用於製造用於治療阿茲海默氏病或用於治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病之藥劑。
此外，本發明提供一種治療患者之阿茲海默氏病之方法，其包括向有此治療需要之患者投與有效量之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，該甲苯磺酸鹽以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處結合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度。本發明亦提供一種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，該甲苯磺酸鹽以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處結合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度，其用於治療，特定言之用於治療阿茲海默氏病或用於治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病。此外，本發明提供一種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)- 4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，該甲苯磺酸鹽以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處結合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度，其用於製造用於治療阿茲海默氏病或用於治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病之藥劑。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦包括用於合成N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽的新穎中間產物及方法。
輕度認知障礙已定義為與阿茲海默氏病相關聯之癡呆症之潛在前期，基於臨床表徵及隨時間患者顯示輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病。(Morris等人，Arch.Neurol.，58，397-405(2001)；Petersen等人，Arch.Neurol.，56,303-308(1999))。術語「治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病」包括減緩、抑制、或逆轉患者之輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病。
如文中所用，術語「治療」或「用於治療」包含約束、減緩、停止、或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重程度。
如文中所使用，術語「患者」係指人類。
術語「抑制Aβ肽之產生」意指降低患者中活體內Aβ肽水平。
如本文中所使用，術語「有效量」係指本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽當呈單劑量或多劑量投與給患者時，可在處於診斷或治療下患者中提供所需效應之用量或劑量。
由主治診斷醫生，如熟習本項技術者，透過使用已知技術及透過在類似環境下觀察所獲得的結果即可容易確定其有效量。在確定針對患者之有效量時，主治診斷醫生要考慮多個因素，包括但不限於：患者物種；其尺寸、年齡、以及健康情況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之進展或嚴重程度；個體患者之反應；所投與之特定化合物；投藥模式；所投與製劑之生物可利用率特徵；所選擇之給藥方案；使用之合併用藥；以及其他相關環境。
本發明化合物在廣泛劑量範圍內普遍有效。例如，日劑量一般在約0.01至約20mg/kg體重之範圍內。在一些情形中，低於上述範圍下限之劑量水平可能會足夠多，而在其他情形中，仍可採用更大劑量且具有可接受之副作用，及因此，以上劑量範圍無意以任何方式限制本發明之範圍。
較佳係將本發明化合物調配成可藉由使該化合物為生物可利用之任何途徑(包括口服、經皮、及非經腸途徑)投與之醫藥組合物。更佳地，此等組合物用於口服或經皮，其中口服係特佳。此等醫藥組合物及製備其等之方法係在此項技術中熟知。(參見，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy編輯，第21版，Lippincott,Williams & Wilkins,2006)。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽係特別適用於本發明之治療方法，但某些形式係較佳。以下段落描述此等形式。應瞭解此等較佳形式係可應用於該醫藥組合物、該治療方法、及本發明新穎化合物。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之結晶甲苯磺酸鹽(以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處結合選自由 19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度)係特佳。
一般技術者應瞭解N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺可如在反應圖A中描述以互變異構體形式存在。當在此說明書中提及任何N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之具體互變異構體之一時，應瞭解其包括兩種互變異構形式及全部其混合物。
此外，在以下反應圖中描述之特定中間產物可含有一或多個氮保護基。該可變保護基在每次出現時可係相同或不同，取決於特定反應條件及待進行之特定轉變。該保護及脫保護條件為一般技術者熟知及在文獻(參見例如「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene，John Wiley and Sons,Inc.2007)中描述。
特定立體化學中心留下未指定及出於明確考慮特定取代基在以下反應圖中排除且並不意味著以任何方式限制該反應圖之教示。此外，個別異構體、對映體及非對映體可藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析法之方法於在合成本發明化合物時任何方便點由一般技術者分離或解析(參見例如，J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」，John Wiley and Sons,Inc.,1981及E.L.Eliel與S.H. Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」，Wiley-Interscience,1994)。名稱「異構體1」及「異構體2」指分別從對掌性層析法中首先及其次洗脫之化合物，且若在合成早期開始對掌性層析法，則相同名稱應用於後續中間產物及實例。
特定略語係如下定義：「乙腈」指ACN；「APP」指澱粉樣前驅蛋白質；「CSF」指腦脊髓液；「DCM」指二氯甲烷；「DIPEA」指二異丙基乙胺、N-乙基-N-異丙基-丙-2-胺、或N,N-二異丙基乙胺；「DMEM」指杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)；「DMF」指二甲基甲醯胺；「DMSO」指二甲基亞碸；「EDCI」指1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；「ee」指對映異構體過量；「EtOAc」指乙酸乙酯‘「Ex」指實例；「F12」指漢姆氏(Ham’s)F12培養基；「FBS」指胎牛血清；「FRET」指螢光共振能量轉移；「HEK」指人類胎腎；「HOAc」指乙酸；「HOBt」指1-羥基苯并***水合物；「HPLC」指高效液相層析法；「IC50」指試劑產生50%針對該試劑之最大抑制反應之濃度；「min」指分鐘；「MTBE」指甲基第三丁醚；「PDAPP」指血小板衍生之澱粉樣前驅蛋白質；「Prep」指製備型；「RFU」指相對螢光單位；「SCX」指強陽離子交換；「Rt」指滯留時間；及「THF」指四氫呋喃。
一般技術者應瞭解術語「甲苯磺酸鹽」、「甲苯磺酸」、「對甲苯磺酸」及「4-甲基苯磺酸」指以下結構化合物：
因而，一般技術者應瞭解本文提及係指以下名稱中之任一者：「N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并 [3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽」；「N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸」；「N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；對甲苯磺酸」；及「N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；4-甲基苯磺酸」；指以下結構之鹽：
可藉由各種在此項技術中熟知之程序製備N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽，其中數者在下文製法及實例中闡明。此外，N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺游離鹼及對應HCl鹽可由一般技術者如在美國專利第8,841,293號中所描述製備。所述途徑各者之特定合成步驟可以不同方式組合，或與不同製法之步驟結合來製備本發明化合物。各個步驟之產物可藉由在此項技術中熟知之習知方法(包括萃取、蒸發、沉澱、層析、過濾、濕磨、或結晶)回收。一般技術者很容易獲得試劑及起 始材料。
製法1 2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮
於35℃下，將N-溴代丁二醯亞胺(984g，5.53mol)分多次添加至含1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(1000g，4.6mol)及對甲苯磺酸(1315g，7.64mol)之DCM(7L)溶液中。攪拌該混合物並加熱至40℃持續4小時。將該混合物冷卻至24℃並添加7% NaHCO3(5L)。進行層分離並使用10% Na2SO3(5L)與水(5L)洗滌有機層。將有機層濃縮至2至3體積以獲得無需進一步純化即可使用之標題化合物。
替代製法1
將1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(80g，0.37mol)溶於DCM(800mL)中並冷卻至10℃。歷時5小時緩慢添加溴(63g，0.39mol)。在30分鐘後，添加額外溴(3.5g，0.06mol)。在30分鐘後，將該混合物加熱至室溫並使用NaCl水溶液(500mL)與NaHCO3水溶液(400mL)之混合物洗滌該有機層。依次使用NaHCO3水溶液(400mL)、NaHSO3水溶液(2×400mL)、及NaCl水溶液洗滌該有機層。乾燥(Na2SO4)該有機層並濃縮為殘餘物。將該殘餘物溶於DCM(100mL)與石油醚(500mL)之混合物中。將該溶液冷卻至-50℃持續0.5小時並藉由過濾收集固體以獲得標題化合物(84g，77%)。1H NMR(CDCl3)δ 4.46(d,2H),7.07(dd,1H),7.66(m,1H),8.02(dd,1H)。
製法2 2-[烯丙基(苄基)胺基]-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮
於室溫下，將2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(25.1g，84.8mmol)添加至含N-苄基丙-2-烯-1-胺(15.0g，102mmol)之甲苯(200mL)與(DIPEA)(59mL，338mmol)溶液中。藉由於室溫攪拌10分鐘同時表面下吹入氮氣通過該混合物來使該混合物去氧化。將該反應加熱至40℃，攪拌2.5小時，隨後添加額外N-苄基丙-2-烯-1-胺(2.0g，13.6mmol)。於40℃攪拌該反應4.5小時並隨後冷卻至室溫。不進行進一步純化即可使用該物質。針對標題化合物，藉由使用以下參數之HPLC分析該溶液：LC管柱：Waters Acquity超高效液相層析(UPLC®)C 8 2.1×100mm 1.7μm；流動相A：含0.1%(vol/vol)TFA之水+0.2% ACN(vol/vol)，藉由將TFA(4mL)及ACN(10mL)添加至水中(4L)製備，流動相B：含0.1% TFA之ACN，藉由將TFA(4mL)添加至ACN(4L)中製備。梯度：%A=95%至53.1%，歷時10分鐘，流速0.85mL/分鐘，管柱溫度：45℃。Rt=6.43分鐘(UV)。
製法3 5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑
在含2-溴-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮(1363g，4.61mol)之甲苯(10L)溶液中添加二烯丙胺(537g，5.53mol)及DIPEA(2381g，18.42mol)。 於40℃攪拌該混合物4小時以獲得未單離之1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(二烯丙胺基)乙酮。將N-(4-甲氧基苄基)羥胺(847g，5.53mmol)及異丙醇鈦(IV)(1965g，6.91mol)添加至含有粗製1-(5-溴-2-氟-苯基)-2-(二烯丙胺)乙酮之混合物中。於90℃攪拌該混合物2小時。將該混合物冷卻至20℃，並添加50%檸檬酸一水合物(4L)及飽和Na2CO3(4L)。進行層分離並使用MTBE(5L)萃取水層。使用水(5L)洗滌有機萃取物，並通過矽藻土過濾隨後濃縮至乾燥。將EtOAc(10L)及草酸(580g)添加至該殘餘物中及過濾固體並添加至1N NaCl(13L)中。添加MTBE(5L)並透過矽藻土過濾該混合物。進行層分離並將該有機層濃縮至2體積。添加庚烷(3L)並將該溶液冷卻至10℃。過濾所得固體以獲得標題化合物(1330g，64%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 2.51-2.49(m,3H),3.09-3.04(m,3H),3.78-3.41(m,6H),4.01(m,1H),5.24-5.01(m,2H),5.89-5.85(m,1H),6.82-6.80(m,2H),7.51-7.13(m,3H),7.63-7.62(m,1H),7.65-7.64(m,1H)。
製法4 相對-(3Ar,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑，草酸
於40℃下，將N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羥胺(15.5g，101mmol)添加至2-[烯丙基(苄基)胺基]-1-(5-溴-2-氟-苯基)乙酮之溶液中，接著添加異丙醇鈦(IV)(50.3mL，169mmol)。藉由通過該系統吹入氮氣5分鐘來使該混合物去氧化。將該混合物加熱至90℃並攪拌2小時。使用 含檸檬酸(36g，186mmol)之水(36g)溶液洗滌該反應混合物並於室溫攪拌30分鐘。添加作為在水中之飽和溶液之碳酸鈉(100g，939mmol)並將pH調整至約9。按需要使用水及甲苯稀釋該混合物以分離該等層。使用以水(200mL)接著水(200mL)稀釋的HCl水溶液(5.1mL 5N HCl)溶液洗滌甲苯層。將甲苯層濃縮至稠油。將該油溶於EtOAc(375mL)及於室溫攪拌下逐滴添加溶於EtOAc(375mL)之草酸(15.4g，169mmol)溶液。於室溫攪拌該混合物2天，過濾，及使用EtOAc(250mL)洗滌產物濾餅。在真空中於40℃乾燥該固體過以獲得呈順式外消旋混合物之標題化合物(41.7g，84%)。ES/MS(m/z)：498(M+H)。
製法5 相對N-[3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]-2,2,2-三氟-乙醯胺
將相對-(3aR,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑，草酸(23.6g，40.2mmol)添加至DCM(400mL)與5N NaOH水溶液(200mL)之混合物中。攪拌該混合物10分鐘並隨後進行層分離。濃縮有機層以獲得相對-(3aR,6aS)-5-苄基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑(20.0g，40.2mmol)。將此物質添加至二甲基亞碸(360mL)、2,2,2-三氟乙醯胺(7.8g，68mmol)、碘化鈉(10.3g，68.6mmol)、碳酸鉀(9.54g，68.3mmol)、(1R,2R)-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(4.7g，32mmol)、及碘化銅(I)(1.53g，8.03mmol)中。藉由吹 入氮氣通過該系統10分鐘來使該混合物去氧化。將該混合物加熱至115℃，攪拌5.5小時，並冷卻至室溫。添加EtOAc(250mL)及水(200mL)並攪拌所得混合物10至15分鐘。進行層分離並使用EtOAc(200mL)後萃取水層。使用20重量%氯化銨水溶液(100mL)接著20重量%氯化鋰水溶液(100mL)及水(100mL)洗滌已合併之有機層。經硫酸鎂乾燥該有機層、過濾、並濃縮至乾燥以獲得呈外消旋順式混合物之粗製標題混合物(23.6g，111%)。ES/MS(m/z)：530(M+H)。
製法6 相對-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯胺
將相對N-[3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]-2,2,2-三氟-乙醯胺(21.0g，39.7mmol)添加至甲醇(250mL)、5N NaOH水溶液(105mL)、及乙醇(105mL)並將所得混合物加熱至50℃持續2小時。在減壓下於35至40℃下濃縮該反應混合物以移除甲醇及乙醇。將該物質溶於MTBE(320mL)及水(300mL)之混合物中。進行層分離及使用水(100mL)，接著水(400mL)與12N HCl水溶液(3.5mL)之混合物洗滌。將水層添加至MTBE(400mL)、水(100mL)、及5N NaOH水溶液(25mL)之混合物中並進行層分離。使用MTBE(100mL)洗滌水層。合併有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾，並在真空中濃縮以獲得呈外消旋順式混合物之標題化合物(9.8g，57%)。ES/MS(m/z)：435(M+H)。
製法7 相對-N-3-[(3Ar,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]乙醯胺
將對-3-[(3Ar,6aS)-5-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯胺(9.4g，22mmol)添加至DCM(110mL)、4-二甲胺基吡啶(0.08g，0.65mmol)、及三乙胺(6.1mL，43mmol)並將該反應冷卻至0℃。將乙酸酐(3.4g，33mmol)逐滴添加至該溶液。將該反應加熱至室溫並攪拌2小時。將水(140mL)添加至該反應並於室溫攪拌該混合物10分鐘。進行層分離並使用DCM(100mL)洗滌水層。已合併之有機層經硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮以獲得呈外消旋順式混合物之標題化合物(10.1g，100%)。ES/MS(m/z)：477(M+H)。
製法8 5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽
將TFA(4L，52.9mol)以維持溫度低於35℃之速率逐滴添加至含5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑(1990g，4.45mol)]之DCM(12L)溶液中。在完成添加後，將該混合物加熱至33至43℃並攪拌6小時。以維持溫度低於35℃之速率添加NaOH(20%，10L)。進行層分離並使用水(6L)洗滌有 機層。濃縮該溶液，添加乙醇(16L)，並通過矽藻土過濾該混合物。濃縮濾液並添加EtOAc(10L)。添加4M HCl之EtOAc溶液(8L)並過濾所得固體及乾燥以獲得標題化合物(1385g，85.6%)。ES/MS(m/z)：327.1(M+H)
製法9 [1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將碳酸鈉飽和水溶液添加至含5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽(1400g，3.85mol)之DCM(7L)溶液中以達到pH>9。進行層分離並將有機萃取物濃縮至1.5體積。添加HOAc(1.38L)及將該溶液濃縮至2L。添加HOAc(7L)及鋅粉(2.5kg，38.5mol)及將將該混合物加熱至40至50℃並攪拌3小時。添加EtOAc(9.8L)及通過矽藻土過濾該混合物。使用EtOAc(4L)洗滌濾餅。分離濾液及將水(7L)添加至合併之有機物。添加氫氧化銨以達成PH9。進行層分離並將有機層濃縮至2L。添加乙醇(2.8L)及將該溶液濃縮至2L。添加乙醇(19L)及通過矽藻土過濾該混合物以獲得標題化合物之乙醇溶液，其無需進一步純化即可使用。
製法10 (2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]銨
將二-對-甲苯醯基-L-酒石酸一水合物(1.04kg，2.69mol)添加至含[1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(1264g，3.85mmol)之乙醇(21L)溶液中。將該混合物加熱至65至75℃並攪拌3小時。將該混合物冷卻至5至10℃，添加晶種(2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]銨(1.0g)，並攪拌該混合物3小時。過濾固體並使用冷乙醇(1.4L)洗滌該濾餅。乾燥該濾餅以獲得呈白色固體之標題化合物。第二洗脫異構體之對掌性分析：管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；洗脫劑：90%己烷(0.3%二乙胺)：10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速1.0mL/min於UV 270nm，證實是對映體性質上經過強化(99% ee)對映體，其中Rt=7.4分鐘，(1050g，38%)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 2.40(s,6H),3.05-3.04(m,1H),3.57-3.31(m,3H),3.66-3.58(m,4H),3.75-3.74(m,2H),5.38-5.36(m,1H),5.50-5.46(m,1H),5.88(s,2H),5.97-5.91(m,1H),7.10-7.05(m,1H),7.29(d,J=8.0Hz,4H),7.53-7.51(m,1H),7.80-7.78(m,1H),8.01(d,J=8.0Hz,4H)。
製法11 相對-1-[3-[(3S,4R)-3-胺基-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]-4-氟-苯基]丙- 2-酮，二-甲苯磺酸
將相對-N-3-[(3aR,6aS)-5-苄基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基]-4-氟-苯基]乙醯胺(5.0g，11.0mmol)添加至水(75mL)、10%碳載鈀(2.5g，23mmol)、對甲苯磺酸(5.0g，26mmol)、及乙醇(75mL)中並在50psi氫氣氛圍下於室溫下使該混合物氫化20小時。通過矽藻土過濾該混合物並使用乙醇(100mL)接著DCM(100mL)洗滌該墊。濃縮濾液以以定量粗產率獲得呈外消旋順式化合物之標題混合物(8.1g，>100%)。無需進一步純化即可直接使用該物質。ES/MS(m/z)：268(M+H)。
製法12 ((3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯啶-3-基)甲醇
將1N HCl(500mL，500mmol)添加至含(2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]銨(100g，139.4mmol)之EtOAc(500mL)0℃溶液中。攪拌該混合物1小時。分離水層並使用1N NaOH將pH調整至8。以EtOAc(350mL x 2)萃取水層。合併有機層，使用水(500mL)洗滌並濃縮以獲得標題化合物(40g，87%)。第二洗脫異構體 之對掌性分析：管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；洗脫劑：90%己烷(0.3%二乙胺)：10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速1.0mL/min於UV 270nm，證實是對映體性質上經過強化(99.7% ee)對映體，其中Rt=7.4分鐘。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 2.78-2.70(m,5H),3.16-3.00(m,3H),3.87-3.75(m,1H),3.90-3.84(m,1H),5.24-5.11(m,2H),5.91-5.87(m,1H),6.95-6.91(m,1H),7.35-7.32(m,1H),7.67-7.65(m,1H)。
製法13 相對-N-[3-[(3S,4R)-3-胺基-1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]-4-氟-苯基]乙醯胺
將相對-1-[3-[(3S,4R)-3-胺基-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]-4-氟-苯基]丙-2-酮二甲苯磺酸(7.5克，12.3mmol)添加至ACN(75mL)中。添加2-氯-5-氟嘧啶(2.44g，18.4mmol)及DIPEA(7.5mL，43mmol)並將該混合物加熱至70℃持續20小時。將該混合物冷卻至室溫並濃縮。添加水(50mL)並攪拌該混合物1小時為漿料形式。過濾該混合物並於室溫在真空下乾燥以獲得呈外消旋順式混合物之標題化合物(3.0g)。使用氯仿(3 x 20mL)萃取余留水溶液，經硫酸鈉乾燥，濃縮至乾燥並在真空下乾燥以獲得額外標題化合物(1.8g)，總粗產率(4.8g，110%)。ES/MS(m/z)：364(M+H)。
製法14 N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基) 硫甲醯)苯甲醯胺
將異硫氰酸苯甲醯基酯(15.0g，91.9mmol)添加至含((3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟-苯基)吡咯啶-3-基)甲醇(30g，91.1mmol)之THF(400mL)0℃溶液中。將該溶液加熱至25℃並攪拌1小時以獲得標題化合物之THF溶液，其無需進一步純化即可使用。
製法15 N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺二鹽酸鹽
將三苯基膦(36.8g，140.3mmol)添加至N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基)硫甲醯)苯甲醯胺(91.1mmol)之THF(400mL)溶液中。添加含偶氮二甲酸二-第三丁酯(31.6g，137.2mmol)之THF(100mL)。於20至30℃攪拌該混合物2小時。濃縮該混合物並添加MTBE(400mL)。通過矽藻土過濾該溶液並使用MTBE(130mL)洗滌該濾餅。合併濾液並添加1N HCl之EtOAc溶液(200mL)。攪拌該混合物2小時並隨後濃縮至500mL。添加MTBE(320mL)並過濾該溶液及使用庚烷洗滌(130mL)。使該固體在EtOAc(650mL)中成漿並於50至60℃攪拌2小時。過濾熱漿料並使用EtOAc(130mL)及庚烷(130mL)洗滌該固體。使該固體在EtOAc(650mL)中再次成 漿並於50至60℃攪拌2小時。過濾該熱漿料並使用EtOAc(130mL)及庚烷(130mL)洗滌。乾燥該混合物以獲得呈二-HCl鹽之標題化合物(40g，80%，99.5% ee)。第一洗脫異構體之對掌性分析：管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；洗脫劑：85%己烷(0.1%二乙胺)：15%異丙醇(0.1%二乙胺)；流速1.0mL/min於UV 282nm，證實是對映體性質上經過強化(99.5% ee)對映體，其中Rt=12.5分鐘。
製法16 N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-[2-氟-5-[(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]苯基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將15%碳酸鈉(440mL)添加至含N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3])噻嗪-2-基]苯甲醯胺二鹽酸鹽(495g，717.88mmol)之EtOAc(3L)及水(784mL)溶液中。攪拌該混合物1至2小時。進行層分離並通過矽膠(40g)過濾有機層及使用EtOAc(600mL)洗滌。濃縮濾液至乾燥以獲得N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺。將三氟乙醯胺(136.7g，1.21mol)、NaI(182.5g，1.22mol)、4A分子篩(342g)及K2CO3(170.9g，1.24mol)添加至含N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(341g，494.54mmol)之DMSO(525mL)及1,4-二噁烷(1.025L)溶液中。將含於DMSO(500mL)中之反-N,N'-二甲基環己烷(81.6g，573.66mmol)及碘化銅(27.3g，143.34mmol)添加至反應混合物中。 攪拌該混合物5分鐘。將該混合物加熱至100℃並攪拌8小時及冷卻至24℃。添加水(5.9L)及DCM(5.9 l)，過濾該混合物，並進行層分離。使用水(5.9L)洗滌有機層以獲得在DCM溶液中之標題化合物，其無需進一步純化即可使用。
製法17 相對-N-[(4aR,7aS)-7a-5-(乙醯胺基)2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將THF(30mL)添加至相對-N-[3-[(3S,4R)-3-胺基-1-(5-氟嘧啶-2-基)-4-(羥甲基)吡咯啶-3-基]-4-氟-苯基]乙醯胺(4.1g，11.0mmol)。將該混合物在冰浴中冷卻至0℃並添加異硫氰酸苯甲醯基酯(1.50mL，11.0mmol)。隨後容許該混合物歷時30分鐘加熱至室溫。添加1,1'-羰基二咪唑(1.9g，11.0mmol)並於室溫攪拌該混合物2小時。隨後將該混合物加熱至55℃並攪拌額外18小時。添加水(50mL)並使用EtOAc(50mL)萃取該混合物。使用額外EtOAc(25mL)萃取水層並濃縮至乾燥。藉由使用50%DCM之EtOAc溶液，接著100%EtOAc洗脫之矽膠急驟管柱層析法純化該粗製殘餘物。濃縮適當溶離份並在真空中乾燥以獲得呈外消旋順式混合物之標題化合物(1.33g，26%)。ES/MS(m/z)：509(M+H)。
製法18 N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺鹽酸鹽
將NaOH(28.7g)及水(2.7L)添加至N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-[2-氟-5-[(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]苯基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(250g，494.4mmol)之DCM溶液並於24℃攪拌該混合物68小時。添加1N HCl(3.5L)以獲得1至3之pH。進行層分離且以DCM(680mL)洗滌水層。將DCM(4L)添加至水層接著添加21%氫氧化銨以獲得8至10之pH。進行層分離並合併有機萃取物，通過矽膠(170g)過濾並使用DCM(1.4L)洗滌。濃縮該溶劑至乾燥並使用EtOAc(4L)稀釋。於低於25℃之溫度下添加1N HCl之EtOAc溶液(700mL)並攪拌該混合物1小時。濃縮該混合物至約7至8體積並添加EtOAc(2.8L)。過濾所得沉澱物並使用EtOAc(400mL)洗滌。乾燥該固體以獲得標題化合物(246g，52%)。
製法19 N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將乙酸酐(23.5g，0.23mol)添加至含N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺鹽酸鹽(100g，0.153mol)及三乙胺(54.3g，0.535mol)之DCM(800mL)溶液中。在於20至25℃攪拌1小時後，添加飽和NaHCO3(700mL) 及水(600mL)。進行層分離以獲得標題化合物，其無需進一步純化即可呈在DCM中之溶液使用。
製法20 N-((4aR，7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將三苯基膦(4.0g，0.015mol)及1,3-二甲基巴比妥酸(15.2g，0.097mol)添加至N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.153mol)之DCM溶液。添加乙酸鈀(1.7g，7.7mmol)並於20至30℃攪拌該混合物1小時。添加25%氫氧化銨並進行層分離。使用HOAc(3.0當量，含於500mL水中)洗滌有機層並使用25%氫氧化銨將pH調整至8至9。以DCM(2×500mL)萃取水層。合併有機萃取物並濃縮至3至4體積。添加MTBE(1L)並過濾該混合物。濃縮該混合物並添加庚烷(1L)。將所得固體過濾、收集、並乾燥以獲得標題化合物(48g，76%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 2.15(s,3H),2.87-2.83(m,1H),3.43-3.23(m,5H),3.70-3.67(m,1H),7.12-7.07(m,1H),7.28-7.27(m,1H),7.52-7.41(m,4H),7.79(m,1H),8.18-8.16(m,2H),ES/MS(m/z)：413.1(M+H)。
製法21 N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將2-氯-5-氟嘧啶(28.9g，218mmol)及碳酸鉀(33.46g，242.1mmol)添加至含N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(50g，121.22mmol)之DMF(100mL)溶液中。將該混合物加熱至80至85℃持續8小時。將該混合物冷卻至24℃，過濾，並使用DMF(100mL)洗滌。使該固體在水中(2L)成漿並過濾以獲得標題化合物(68.5g，98%)。LC-MS：m/z=509.2(M+H)+，1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ ppm 1.22(t,J=7.28Hz,2 H)1.92-2.07(m,6 H)2.89-3.20(m,2 H)3.36-3.44(m,1 H)3.67(t,J=9.54Hz,1 H)3.84(br.s.,1 H)4.16(br.s.,2 H)7.23(br.s.,2 H)7.35-7.61(m,8 H)7.77(br.s.,2 H)7.85-8.18(m,4 H)8.48(s,4 H)10.15(br.s.,1 H)10.46-10.59(m,1 H)。
製法22 (4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
將氫氧化鋰(8.6g，204.9mmol)添加至N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(80g,157.3mmol)之甲醇(400mL)溶液中。將該混合物加熱至60至70℃持續4小時。添加濃HCl(132g)並於55℃攪拌該混合 物18小時。將該混合物冷卻至30℃並濃縮以移除甲醇。添加水並使用DCM(3x)萃取水層以獲得920g呈水溶液之標題化合物，其中5.6%之總質量係無需進一步純化即可使用之標題化合物。
替代製法22
將硫酸(33.4mL，626.6mmol)添加至含(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8g，125.3mmol)之TFA(626mL)溶液中。將該混合物冷卻至0℃並攪拌20分鐘。添加發煙硝酸(6.2mL，144.4mmol)並將該反應混合物加熱至22℃並攪拌3小時。蒸發該反應混合物並添加MTBE(250mL)及蒸發兩次。在真空下將殘餘物乾燥至恆重並隨後溶於水(147mL)及乙醇(885mL)中及經由鼓入氮氣脫氣15分鐘。將該混合物轉移至壓力反應器並添加10% Pd/C膏型87L(6.6g，6.27mmol)。使用額外乙醇(700mL)稀釋該混合物並以氫氣於80psi加壓16小時。過濾該反應混合物及隨後添加第二觸媒進料10% Pd/C膏型87L(6.6g，6.27mmol)及將該混合物加壓至80psi並在壓力反應器中攪拌3天。使用氮氣淨化該反應混合物並經矽藻土過濾。蒸發濾液及將殘餘物分配在水(200mL)與EtOAc(200mL)間。分離水層，冷卻至5℃，並使用15%w/w氫氧化銨中和。以EtOAc(3×150mL)萃取水層。合併有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾，並在減壓下蒸發以獲得呈淺棕色固體之標題化合物(47.7g，99%，含有殘餘EtOAc)。ES/MS(m/z)：363(M+H)。
製法23 N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苄基酯
在氮氣下使用固體氫氧化鉀(51.6g，919.69mmol)處理含N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苄基酯(50g，208.9mmol)之甲苯(180mL)溶液。10分鐘後添加氯化苄基三乙銨(0.8g，3.1mmol)。在又10分鐘後，歷時10分鐘逐滴添加烯丙基溴(33g，272.8mmol)之甲苯(50mL)溶液。於50℃攪拌所得混合物48小時。將該混合物冷卻至室溫並使用水淬冷。分離有機層，使用鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥，及濃縮至乾燥以獲得標題化合物(44g，75%)。ES/MS(m/z)：280(M+H)。
製法24 N-烯丙基-N-(2-氧乙基)胺基甲酸苄基酯
於室溫攪拌含烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苄基酯(30g，107mmol)之甲酸(36.8mL，860mmol)及水(4.84mL)溶液過夜。濃縮該混合物並使用己烷/EtOAc(1：2)及水稀釋。分離有機層，使用鹽水溶液洗滌直至pH=6，並經硫酸鈉乾燥。蒸發該溶劑以獲得標題化合物(25g，99%)。ES/MS(m/z)：234(M+H)。
製法25 N-烯丙基-N-[2-羥亞胺基乙基]胺基甲酸苄基酯
使用鹽酸羥胺(9.68g，139mmol)及含三水合乙酸鈉(16g，117.9mmol)之水(75mL)溶液處理含N-烯丙基-N-(2-氧乙基)胺基甲酸苄基酯(25g，107mmol)之ACN(150mL)溶液。室溫下攪拌該混合物過夜。 蒸發ACN並使用EtOAc萃取水溶液。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，並在真空下濃縮以獲得標題化合物(24g，90%)。ES/MS(m/e)：249(M+H)。
製法26 3,3a,4,6-四氫抑咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯
歷時10分鐘使用5%w/w次氯酸鈉(106.08mmol，143.06mL)之水溶液逐滴處理含N-烯丙基-N-[2-羥亞胺基乙基]胺基甲酸苄基酯(24g，96.6mmol)之DCM(338mL)溶液。於室溫下攪拌所得混合物過夜。使用40%亞硫酸氫鈉(7g)水溶液淬冷該反應。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，並在真空下濃縮。經矽膠以5%EtOAc之己烷溶液洗脫來純化該粗產物以獲得標題化合物(18g，75%)。ES/MS(m/z)：247(M+H)。
製法27 6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯
將正丁基鋰(25.4mL，40.6mmol)之1.6M己烷溶液逐滴添加至含4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22g，40.6mmol)之THF(60mL)-78℃溶液以獲得黃色溶液，將其於-78℃攪拌15分鐘。將三氟化硼合***(5.14mL，40.6mmol)添加至含3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯 (5g，20.3mmol)之THF(60mL)之獨立-78℃溶液並於-78℃攪拌該混合物5分鐘。經由套管將該溶液添加至預先製備之-78℃有機鋰混合物。於-78℃攪拌合併之混合物30分鐘。使用飽和氯化銨水溶液淬冷該混合物並加熱至室溫。使用EtOAc(3x)萃取該混合物並合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除溶劑。經矽膠(35分鐘5%至100%EtOAc的己烷溶液梯度)純化該粗產物以獲得標題化合物(2.27g，27%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)421/423(M+H)。
製法28 1-(苯甲醯基硫甲醯基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯
將異硫氰酸苯甲醯基酯(2.87mL，21.28mmol)逐滴添加至含6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯(5.977g，14.2mmol)之THF(95mL)溶液中並在氮氣下攪拌過夜。在真空中移除該溶劑。經矽膠(30分鐘5%至100%EtOAc之己烷溶液梯度)純化該粗產物以獲得標題化合物(6.05g，73%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)584/586(M+H)。
製法29 3-(苯甲醯基硫代胺基甲酸基胺基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-甲酸苄基酯
於室溫在氮氣下在HOAc(52mL)中攪拌1-(苯甲醯基硫甲醯基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苄基酯(6.05g，10.4mmol)及鋅(粉，小於10微米)(6.77g，103.5mmol)之混合物過夜。使用EtOAc稀釋該反應並經矽藻土過濾。在真空中移除溶劑並使用EtOAc、水、及飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋該殘餘物。使用EtOAc(3x)萃取該混合物，合併已合併之有機層並經硫酸鈉乾燥、過濾、及在真空中移除該溶劑。經矽膠(30分鐘5%至100%EtOAc之己烷溶液梯度)純化該粗產物以獲得標題化合物(5.222g，86%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)586/588(M+H)。
製法30 2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯
將1,1'-羰基二咪唑(2.87g，17.7mmol)添加至含3-(苯甲醯基硫甲醯基胺基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-甲酸苄基酯(5.198g，8.86mmol)之THF(52mL)溶液中。於室溫攪拌該混合物1.5小時及隨後在氮氣下回流加熱該反應過夜。使反應冷卻，以水加以稀釋，並使用EtOAc(3x)進行萃取。合併有機層，經硫酸鈉乾燥、過濾、並在真空中移除溶劑。經矽膠(30分鐘5%至100%EtOAc之己烷溶液梯度)純化該粗產物以獲得標題化合物(2.93g，58%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br).568/570(M+H)。
製法31 N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將碘三甲基矽烷(2.21mL，15.46mmol)逐滴添加至含2-苯甲醯胺-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苄基酯(2.93g，5.15mmol)之ACN(44mL)室溫溶液中。於室溫攪拌該反應兩小時並在真空中移除該溶劑。經SCX管柱使用3：1 DCM：甲醇及隨後2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化該粗產物以獲得標題化合物(2.098g，94%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)434/436(M+H)。
製法32 2-苯甲醯胺-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯
將二碳酸二-第三丁基酯(1.16g，5.31mmol)及三乙胺(1.01mL，7.25mmol)添加至含N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2基]苯甲醯胺(2.098g，4.83mnmol)之DCM(48mL)溶液中。於室溫在氮氣下攪拌該反應1小時。在真空中移除溶劑並經矽膠(30分鐘5%至100%EtOAc之己烷溶液梯度)純化該粗產物以獲得標題化合物(2.556g，99%)。ES/MS(m/z)：(79Br/81Br)534/536(M+H)。
製法33 7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-2-苯甲醯胺-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯
使用疊氮化鈉(933mg，14.3mmol)處理含2-苯甲醯胺-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯(2.556g，4.8mmol)及反-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(150mg，1.1mmol)之乙醇(50mL)溶液。添加L-抗壞血酸鈉鹽(0.66M，3.2mL，2.1mmol)與水(1mL)之水溶液並使用氮氣淨化燒瓶頂部。用五水合硫酸銅(II)(0.33M，3.2mL，1.1mmol)之水溶液處理該混合物及立即在氮氣下在預熱熱板上於80℃加熱該混合物1.5小時。加熱後獲得均勻混合物。使反應冷卻，以冰水加以稀釋，並使用EtOAc(3x)萃取該混合物。合併有機萃取物並經硫酸鈉乾燥、過濾、及在真空中移除溶劑以獲得粗製疊氮產物。該粗製疊氮產物與10%碳載鈀(1g)在冷乙醇(150mL)中合併並使用真空/氮氣及隨後真空/氫氣淨化該混合物。於室溫在30psi氫氣下攪拌該混合物5小時。使該反應排氣，經矽藻土過濾，及使用DCM沖洗該濾餅。在真空中從該濾液移除該溶劑及經矽膠(50%EtOAc之DCM溶液)純化該粗產物以獲得標題化合物(2.014g，89%)。ES/MS(m/z)：471(M+H)。
製法34 N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將TFA(10mL)添加至含7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-2-苯甲醯胺- 4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯(2.013g，4.28mmol)之DCM(30mL)溶液中並於室溫在氮氣下攪拌該混合物4小時。在真空中移除該溶劑並經SCX管柱使用3：1 DCM：甲醇及隨後2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化該粗產物以獲得標題化合物(1.555g，98%)。ES/MS(m/z)：371(M+H)。
製法35 外消旋N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣下，在1,4-二噁烷(20mL)中加熱N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(705mg，1.90mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01g，7.61mmol)、及DIPEA(1.66mL，9.52mmol)之溶液至回流持續4小時。使反應冷卻，以水加以稀釋，並使用EtOAc(3x)進行萃取。合併有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除該溶劑以獲得粗產物。在矽膠(25分鐘5%至100%EtOAc之己烷溶液梯度)上純化該粗產物以獲得標題化合物(590mg，66%)。ES/MS(m/z)：467(M+H)。
製法36 N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(異構體1)
藉由對掌性HPLC(管柱：Chiralcel OJ，8 x 35cm；洗脫劑：90%甲醇(0.2%二甲乙胺)及10% ACN；流速400mL/min，於UV 280nm)純化外消旋N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(1.694g，3.63mmol)。首先洗脫之異構體分析(管柱：Chiralcel OJ-H 0.46 x 15cm；洗脫劑：10：90 ACN：甲醇(0.2%二甲乙胺)；流速：0.6mL/min，於UV 280nm)，證實是對映體性質上經過強化(99% ee)對映體，其中Rt=6.70分鐘，(723mg，43%)。ES/MS(m/z)：467(M+H)。
製法37 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺，異構體1
將N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺，異構體1(0.361g，0.77mmol)溶於DCM(4mL)與DMF(0.5mL)之混合物中。將5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240mg，1.55mmol)、HOBT(210mg，1.55mmol)及EDCI(300mg，1.55mmol)添加至混合物及於室溫攪拌該混合物過夜。將該反應溶液直接添加在12g矽膠負載管柱上並使用40g矽膠管柱純化及經0至100% EtOAc/己烷梯度洗脫。將該產物溶於EtOAc(200mL)，使用1N NaOH(2×50mL)並使用鹽水(1×50mL)洗滌。如上文描述重複矽膠純化以獲得標題化合物(350mg，74%)。ES/MS(m/z)： 603(M+H)。
製法38 5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑
流動化學反應步驟：將343ml無縫不鏽鋼管狀反應器(OD=1/8英吋)置於GC烘箱內部並以每分鐘20mL之甲苯沖洗20分鐘。施加反壓氮氣(720psig)並將GC之溫度設置至210℃。在溫度達到210℃之後，使用一對以連續模式運行之高壓注射泵將2-(二烯丙基胺基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51g，1.74mol)之甲苯(5.81L)溶液以22.866mL/min泵送通過反應器，以獲得15分鐘滯留時間。在消耗全部儲備溶液後，使用甲苯以22.866mL/min中洗該反應器30分鐘。將GC烘箱之溫度設置至25℃及收集最終溶液並在真空下濃縮。蒸發該溶劑並將殘餘物溶於DCM(2.5L)及水(5L)中。使用HCl將pH調整至1及分離水層並使用NaOH中和以將pH調整至10。以MTBE(3×2.5L)萃取水層。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾及蒸發至乾燥以獲得無需進一步純化即可使用之標題化合物(248g，47%)。ES/MS(m/z)：249(M+H)。
製法39 1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將鋅粉(590g，9mol)添加至5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四 氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(3559g，1.29mol)含於甲醇(2.85L)及氯化銨飽和水溶液(3.56L)之混合物中之溶液及將該混合物於70℃加熱16小時。將該反應冷卻至60℃，經THF(2.85L)稀釋，及在還熱的時候經矽藻土過濾。蒸發該濾液以移除有機溶劑，及使用10% w/w檸檬酸水溶液(4L)及EtOAc(3.5L)稀釋該水性混合物。分離有機層並使用EtOAc(2x2L)洗滌水層。使用50%w/w NaOH中和該水層以將pH調整至10，及隨後使用EtOAc(2x1.5L)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，及蒸發至乾燥以獲得粗製標題化合物(299g，92%)。ES/MS(m/z)：251(M+H)。
製法40 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸
將含二對甲苯醯基-L-酒石酸(348.6g，884mmol)之1-甲氧基-2-丙醇(1.13L)溶液添加至預先於40℃加熱之含[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(225.9g，902mmol)之1-甲氧基-2-丙醇(1.13L)溶液中。將該反應冷卻至22℃並攪拌18小時。藉由過濾收集白色固體並利用1-甲氧基-2-丙醇(600mL)洗滌。乾燥收集之固體以獲得標題化合物(183.01g，31.8%)。ES/MS(m/z)：251(M+H)。
製法41 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸(211g，331mmol)溶於水(2.1L)及EtOAc(2.3L)中。添加35%w/w HCl以將pH調整至1。分離水層並使用50% w/w NaOH將pH調整至10及使用EtOAc(2x)萃取。使用NaOH水溶液將水層之pH調整至10，及使用MTBE(3×)萃取同時亦維持水溶液pH於pH=10。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，及濃縮至乾燥以獲得粗製標題化合物(73g，88%，94.8%ee)。藉由對掌性層析法分析該產物：管柱AS-H，洗脫劑10%異丙醇，2%異丙胺；流速3mL/min，於UV 220；壓力100bar於35℃以獲得作為第二洗脫異構體的標題化合物，Rf=2.26分鐘。ES/MS(m/z)：251(M+H)。
製法42 N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
於0℃在氮氣氛圍下冷卻含[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(129.7g，414mmol)之THF(2.3L)溶液。添加異硫氰酸苯甲醯基酯(61.5mL，456mmol)並保持溫度低於5℃。歷時3小時將該反應加熱至室溫及添加1,1'-羰基二咪唑(87.4g，538.9mmol)及於22℃攪拌該反應1小時，接著於70℃加熱16小時。將該反應混合物冷卻至22℃並蒸發該溶劑。將混合物分配在EtOAc(1L)與水(1L) 間。分離有機層，並使用EtOAc(2×400mL)萃取水層。合併有機物，經硫酸鈉乾燥，過濾，並蒸發至乾燥以獲得粗製標題化合物。藉由矽膠層析法(經EtOAc/DCM從0至40% DCM梯度洗脫)純化該粗產物以獲得含有殘餘溶劑之呈淺黃色固體之標題化合物(170g，99%)。ES/MS(m/z)：396(M+H)。
製法43 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣氛圍下將2-巰基-苯甲酸(122g，793mmol)、雙(二亞苄基丙酮)鈀(4.15g，7.21mmol)及1,4-雙(二苯基膦)丁烷(3.14g，7.21mmol)添加至含N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(178.21g，360mmol)之無水2-甲基四氫呋喃(1.96L)溶液中。藉由真空/氮氣循環三次使該溶液脫氣，並隨後鼓入氮氣通過該反應15分鐘。將該反應混合物加熱至40℃同時鼓入氮氣通過該反應。當該反應達到40℃時，移除吹氣並在氮氣氛圍下於40℃攪拌該反應混合物3小時。將該反應冷卻至22℃並使用水(2L)稀釋。添加HCl(5M)溶液以調整pH至1。分離水層並使用額外EtOAc(2×800mL)洗滌。使用50%w/w NaOH將水層之pH調整至10並隨後使用EtOAc(10L)萃取。以額外EtOAc(2×750mL)洗滌水層。合併有機萃取物，使用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至乾燥以獲得粗製呈淺黃色固體之標題化合物(124.7g，97%)。ES/MS(m/z)：356(M+H)。
製法44 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將含N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(124.7g。256mmol)、DIPEA(67mL)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3ml，307mmol)之N-甲基吡咯酮(997mL)溶液加熱至100℃持續16小時。將該反應冷卻至22℃並倒入10℃冷水(10L)以保持溫度低於15℃。藉由過濾收集淺色膏狀固體並使用額外水洗滌。將濕固體溶於EtOAc(2L)並轉移至分液漏斗。添加5%w/w氯化鈉水溶液(1L)及分離有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾，並在減壓下蒸發該濾液。藉由矽膠層析法使用0至40% EtOAc/異己烷梯度純化該產物以獲得呈淺黃色固體之標題化合物(116g，70%)。ES/MS(m/z)：452(M+H)。
製法45 (4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
將氫氧化鋰(9.26g，386mmol)添加至含N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(158.6g，351.6mmol)之甲醇(1.6L)混合物中。於70℃加熱該混合物4小時並隨後冷卻至22℃。在真空下蒸發該反應混合物至黃色殘 餘物。將殘餘物分配在水(1L)與EtOAc(750mL)間。添加HCl(5M水溶液)以將pH調整至1。分離水層並使用EtOAc(2x200mL)洗滌有機層。使用50%w/w NaOH水溶液調整水層之pH至pH=10並使用EtOAc(3×1L)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，並在減壓下蒸發以獲得呈淺黃色固體之粗製標題化合物(133.3g，99%，含有12%殘餘EtOAc)。ES/MS(m/z)：348(M+H)。
製法46 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺鹽酸鹽
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-羧基醯胺，異構體1(0.350g，0.58mmol)溶於THF(2mL)及隨後添加甲醇(4mL)與乙醇(4mL)。將O-甲基羥胺鹽酸鹽(495mg，5.81mmol)及吡啶(470μL，5.81mmol)添加至該混合物並將該反應加熱至50℃及攪拌過夜。將矽膠(~10g)添加至該反應並濃縮該混合物。在矽膠上乾燥之樣品裝載入空濾筒並經0至10%梯度之7N氨甲醇含於DCM中洗脫純化。在SCX管柱上使用3：1 DCM：甲醇及隨後2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液再次純化該產物。最後一次經矽膠(以0至10%梯度之7N氨甲醇含於DCM中)純化該產物以獲得該標題化合物之游離鹼。將該物質溶於DCM(5mL)中並添加含1M HCl之***溶液(0.20mL，660μmol)。在真空中移除該溶劑以獲得標題化合物(71mg，23%)。ES/MS(m/z)： 498(M+H)。
X射線粉末繞射(XRD)
於在35kV及50mA下操作且配備CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器的Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRD圖案。樣本係在4至40°(2θ)之間掃描，其中步長0.009°(2θ)且掃描速率0.5秒/步，且發散狹縫0.6mm，固定防散射狹縫5.28mm，及偵測器狹縫9.5mm。乾燥粉末裝填在石英樣本架上，並使用載玻片獲得光滑表面。於環境溫度及相對濕度下收集晶型之繞射圖。結晶學技術中已熟知：對於任何既定晶型而言，繞射峰的相對強度可因諸如晶體形態及習性的因素所導致的較佳定向而變化。在存在較佳定向的效應中，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置未變化。參見，例如The United States Pharmacopeia #23，National Formulary #18，第1843-1844頁，1995。此外，結晶學技術中亦熟知：對於任何既定晶型而言，角峰位置可稍微變化。例如，峰位置可因分析樣品時所處的溫度或濕度的變化、樣品置換或內標準的存在與否而位移。在此情況下，2θ±0.2的峰位置變化將考慮此等潛在變化而不妨礙所指示晶型的明確辨識。可根據識別峰(單位為°2θ)(通常為更突出峰)之任何獨特組合確認晶型。基於在8.853及26.774°2θ下的NIST 675標準峰調整於周圍溫度及相對濕度下收集的晶型繞射圖案。
製法47 晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(水合物)
將草醯氯(888μL，10.2mmol)添加至含5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(1.6g，10.2mmol)之ACN(53mL)及DMF(848μL)溶液中。在15分鐘後，將新鮮製備之溶液添加至於50℃預先加熱之(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2- 氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(2.65g，7.3mmol)含於水(53mL)及乙醇(53mL)混合物中之溶液中。於50℃攪拌該反應混合物1小時，冷卻至22℃，隨後於此溫度攪拌過夜。在真空下蒸發有機溶劑及使用50% w/w NaOH水溶液處理該水溶液混合物以調整pH=10。單離淺色膏狀固體並使用額外水洗滌。使用異丙醇(2x)稀釋該固體並蒸發該溶劑。藉由矽膠層析法使用氨甲醇(2N)/DCM梯度純化該粗製物質。合併含有期望產物之溶離份並蒸發該溶劑以獲得呈灰白色固體之標題化合物(1.9g，52%)。ES/MS(m/z)：499(M+H)。
晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(水合物)之替代製法
將ACN(500mL)添加至DMF(19.2mL，248.9mmol)中。將草醯氯(39.3g，309.63mmol)接著5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4mmol)添加至DMF/ACN溶液中。在獨立燒瓶中，將(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8g，156.75mmol)之水溶液添加至ACN(500mL)並使用氫氧化銨(95mL)將pH調整至9。隨後將此混合物加熱至50至55℃。逐滴添加草醯氯溶液並攪拌該混合物3小時。藉由氫氧化銨將pH調整至8至9。過濾所得沉澱，使用水洗滌，並乾燥以獲得標題化合物(123g)。使該固體在丙酮(250mL)中成漿1.5小時並過濾。使用丙酮洗滌濕濾餅以獲得標題化合物(110g，藉由HPLC測得純度90.5%)。將THF(1L)及活性碳(9g)添加至該固體並將固體加熱至回流過夜。藉由矽藻土過濾混合物並利用THF(150mL)洗滌。濃縮有機溶液至10體積並加熱至60℃。添加水(430mL)及於60℃攪拌該混合物8小時。將該混合物冷卻至室溫並攪拌10小時。過濾所得固體，使用THF/水(7：6)洗滌並乾燥以獲得 標題化合物(69g，88%)LC-MS：(m/z)499(M+H)，純度：98.3%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.99-3.07(m,2 H)3.07-3.14(m,1 H)3.58-3.67(m,1 H)3.68-3.76(m,1 H)3.76-3.84(m,1 H)4.02(s,3 H)4.07(d,J=10.92Hz,1 H)6.08(s,2 H)7.19(dd,J=11.98,8.72Hz,1 H)7.78-7.89(m,2 H)8.41(s,1 H)8.44(s,2 H)8.88(s,1 H)10.60(s,1 H)。
製備晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(水合物)之一般程序
使N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺在THF中於約23℃以約71mg/mL溶劑之濃度成漿。加熱該漿料並攪拌至溶解，溶解出現於約60℃至約63℃。將水添加至該熱溶液以提供約95：5之THF：水溶劑比。添加晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺晶種(約3重量%負載)。所得薄漿料維持於約60℃至約63℃持續約20分鐘，接著歷時約2至約4小時添加約5.3至約5.5體積水，導致約69：31之THF：水溶劑比。隨後該漿料維持於約60℃至約63℃持續約30分鐘及隨後歷時約1小時冷卻至約23℃，並隨後攪拌約8至12小時。隨後過濾該漿料，使用THF：水(35：65)稍沖洗，及在低真空下於約40℃乾燥約8至12小時以提供期望晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺，其為水合物。
晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之製備樣品係藉由使用CuKa輻射之XRD圖案如具有如在下文表1中描述之 繞射峰(2-θ值)表徵。明確言之，該圖案包含在11.8°下的峰組合選自由18.6°、19.3°、及26.7°組成之群中之一或多個峰，且其中該等繞射角的公差為0.2度。
晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺於室溫及大於約15%之相對濕度下係穩定晶型。
製法48 晶型3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺
熱重分析盤裝載有N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺並加熱至約170℃及維持於170℃約5分鐘。將該混合物冷卻至室溫以獲得標題化合物。
晶型3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之替代製法
使N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(121mg)與ACN(5mL)在小瓶中合併，並在90℃攪拌板中加熱。在約30分鐘後，大部分固體溶解，獲得渾濁溶液。添加晶型3晶種及於約90℃攪拌該樣品約1小時。移除加熱並該攪拌混合物以獲得淺白色固體。藉由真空過濾單離該固體，在空氣流下乾燥約10分鐘，並隨後在低真空下於約80℃持續約8至12小時以獲得標題化合物。
晶型3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之製備樣品係藉由使用CuKa輻射之XRD圖案如具有如下文表2中描述之繞射峰(2-θ至)表徵。明確言之，該圖案包含15.7°下的峰組合選自由18.1°、27.0°、及19.7°組成之群中之一或多個峰，且其中該等繞射角的公差為0.2度。
實例1： N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸
將水合晶型2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(149.15mg)添加至乙酸乙酯(2mL)中。於80℃溫度下以1000rpm攪拌該樣品。將對甲苯磺酸(70mg溶於乙酸乙酯(1mL))添加至攪拌溶液，並於80℃將其攪拌過夜來製備白色固體漿料，該固體藉由真空過濾單離以獲得標題化合物。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸之替代製法A
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(9.5g，19mmol)及對甲苯磺酸(3.80g，19.8mmol)添加至四氫呋喃(31mL)、水(7.9mL)、及2-丙醇(8.6mL)中。將該溶液加熱至40℃。歷時約3小時向溫溶液中添加2-丙醇(200.0mL)。在2-丙醇中開始添加後不久以部分標題化合物(500mg，0.75mmol)對該混合物接晶種。在完成溶劑添加後，歷時1至3小時將該混合物冷卻至約20℃。歷時2小時目標時間將該混合物從約20℃加熱至約55℃。將溫度維持於55℃持續1小時並隨後歷時約4小時冷卻至約20℃。於約20℃下攪拌該漿料至少10小時。過濾該漿料並使用水(57mL)洗滌該濕濾餅。在真空中於45℃乾燥該產物至少10小時以獲得標題化合物(10.4g，81%)。ES/MS(m/z)：500(M+H)。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并 [3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸之替代製法B
在500mL 3頸圓底燒瓶(配有氮氣鼓泡器、附著在具有鐵氟龍橡膠葉片之玻璃軸的IKA®機械馬達/攪拌器，及連接至可程式化J-KEM®溫度控制器的熱電偶)中，於60：40 THF：H2O(85mL)中以170rpm使水合N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(20.7g)成漿。將對甲苯磺酸一水合物(7.6g，1.03eq)溶於60：40 THF：H2O之混合物(20mL)中並立即將該溶液全部添加至於23℃攪拌之N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺漿料，導致大多數立即變為透明紅棕色溶液。隨後歷時15分鐘將攪拌速度增加至200rpm，將水(22mL)添加至該溶液，隨後加入晶種N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺甲苯磺酸(750mg，3重量%晶種負載)並隨後於23℃攪拌又15分鐘。歷時6小時，添加水(226mL，總溶劑為353mL；或13.6體積，最終溶劑比為17.5：82.5 THF：H2O)至該漿料，隨後於23℃攪拌過夜(22小時)。經由真空過濾該漿料，使用15：85 THF：H2O(2×20mL)沖洗，隨後置於真空20分鐘同時人工壓緊在產物濕濾餅中形成之裂縫。於40℃在真空下乾燥該濕固體約72小時以獲得呈白色結晶固體之標題化合物(24.07g，90.0重量%)。
結晶N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；甲苯磺酸係藉由使用CuKa輻射之XRD圖案如具有如在下文表3中描述之繞射峰(2-θ值)表徵，及特定言之於5.0°之繞射角2-θ下組合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰；其中該等繞射 角的公差為0.2度。
已發現低於約15%相對濕度，存在N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺游離鹼之晶型1，而大於約15%相對濕度，以N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺晶型2主導。此物理不穩定性係非所需的，特定言之對於醫藥藥物或藥品而言，其二者均受到有關固態形式之規則控制。與游離鹼晶型相比，甲苯磺酸鹽提供在相對濕度大範圍(5至95%)內之物理穩定性。因此，N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽基本上避免與對應結晶游離鹼形式有關之濕度依賴性相轉移。此外，發現N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽具有約1.3%之實質上較低量在晶體中余留之溶劑(與對於N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之HCl鹽而言約7.7% 溶劑余留相比)。在長期存儲期間游離鹼經相轉移之增加之可能性可導致性質(諸如溶解性或溶解速度)變異，這可折損藥品性能。其亦添加晶體結構塌陷為非晶型或積累缺陷或疾病之額外風險，這些可導致化學不穩定性或降低藥品存放期。
活體外分析程序：
對於活體外酶及細胞分析而言，在DMSO中製備測試化合物以產生10mM儲備溶液。在進行活體外酶及全細胞分析之前，在96孔圓底板上將該儲備溶液連續稀釋於DMSO中以獲得十點稀釋曲線，其中最終化合物濃度從10mM至0.05nM變化。
活體外蛋白酶抑制分析： 人類BACE1之表現
人類BACE1(寄存編號：AF190725)係藉由RT-PCR選殖自全部大腦cDNA。將對應胺基酸序列#1至460之核苷酸序列***編碼人類IgG1(Fc)多肽之cDNA(Vasser等人，Science,286,735-741(1999))。此BACE1(1至460)及人類Fc之融合蛋白質(稱為huBACE1：Fc)構筑入pJB02載體。人類BACE1(1-460)：Fc(huBACE1：Fc)在HEK293細胞中短暫表現。250μg各個構築體之cDNA與Fugene 6混合並添加至1公升HEK293細胞。在轉染四天後，收穫用於純化之經調節培養基。
純化huBACE1：Fc
藉由蛋白質A層析法純化huBACE1：Fc。該酶以小等分試樣儲存於-80℃。
BACE1 FRET分析
如上文描述製備測試化合物之連續稀釋液。在KH2PO4緩衝液中進一步稀釋20×該化合物。將10μL各個稀釋液添加至對應含有該反應混合物(25μL 50mM KH2PO4，pH 4.6，1mM TRITON® X-100，1mg/mL小牛血清白蛋白，及15μM FRET底物)之低蛋白結合黑板之列 A至H的各個孔(參見Yang等人，J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。該內容物在板振盪器上充分混合10分鐘。將15μL含在KH2PO4緩衝液中之200pM人類BACE1(1-460)：Fc(參見Vasser等人，Science,286,735-741(1999))添加至含有底物及測試化合物之板以引發該反應。在板振盪器上快速混合後，於激發波長355nm及發射波長460nm下記錄於時間0時該混合物之RFU。使用鋁箔覆蓋反應板並保持於室溫在黑暗濕潤烘箱中16至24h。於時間0使用之相同激發及發射設置記錄培養末期RFU。於時間0及培養末期RFU之差異代表在化合物處理下BACE1之活性。相對抑制劑濃度繪製RFU差異曲線及使用四參數邏輯斯諦方程擬合該曲線以獲得EC50與IC50值。(參見Sinha等人，Nature,402,537-540(2000))
基本上如上文描述測試製法46之化合物及顯示0.615nM(±0.101，n=5)[平均值±SEM；SEM=平均值標準誤差]之BACE1 IC50。這些數據表明製法46之化合物抑制經純化重組BACE1酶活體外活性。
PDAPP原代神經元分析
亦在由PDAPP轉殖基因胚胎小鼠產生之原代神經元培養物中運行證實性全細胞分析。由胎齡16天PDAPP胚胎製備原代皮質神經元並在96孔板(15 x 104細胞/孔，含在DMEM/F12(1：1)加10% FBS中)上培養。在活體外兩天後，培養基由含有B27補充及2μM(最終)Ara-C(Sigma,C1768)之無血清DMEM/F12(1：1)替代。在活體外第5天時，在存在/不存在抑制劑(稀釋於DMSO)於期望濃度於37℃培養神經元24小時。在培養末期，分析經調節培養基之β-分泌酶活性的證據，例如，藉由分析Aβ肽。藉由夾層ELISA使用單株266作為捕獲抗體及生物素化3D6作為記錄抗體測量總Aβ肽(Aβ1-x)。或者，藉由夾層ELISA使用單株2G3作為Aβ1-40之捕獲抗體，及單株21F12作為Aβ1-42之捕獲抗體來測量Aβ1-40及Aβ1-42肽。Aβ1-40及Aβ1-42 ELISA均使用生 物素化3D6作為記錄抗體。在化合物處理後在經調節培養基中釋放之Aβ濃度對應在此條件下BACE1活性。繪製該10點抑制曲線及使用四參數邏輯斯諦方程擬合以獲得針對降低Aβ效應之EC50及IC50值。基本上如上文描述測試製法46之化合物及顯示以下降低Aβ效應活性：
平均值±SEM；「SEM」=平均值標準誤差
此等數據證實製法46抑制全細胞中Aβ產生。
活體內抑制β分泌酶
若干動物模型(包括小鼠、豚鼠、狗、及猴子)可用以篩選用於在化合物處理後活體內抑制β-分泌酶活性。用於本發明之動物可係野生型、轉殖基因、或基因剔除動物。例如，如在Games等人，Nature 373,523-527(1995)中描述製備之PDAPP小鼠模型及其他非轉殖基因、或基因剔除動物可用於分析在抑制劑化合物存在時活體內抑制Aβ及sAPPβ產生。一般而言，對2至12月齡PDAPP小鼠，基因剔除小鼠或非轉殖基因的動物投與在媒劑(諸如玉米油、環糊精、磷酸鹽緩衝液、PHARMASOLVE®、或其他適宜媒劑)中調配之化合物。投與化合物一至二十四小時後，殺死動物，移除大腦以及腦脊髓液及血漿用於分析Aβ、C99及sAPP片段。(參見May等人，Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011))。
對於標準活體內藥物學研究，對動物投與各種濃度化合物及與於相同時間給藥之經媒劑處理對照組對比。對於相同時程研究，腦組織、血漿、或腦脊隨液獲自經選擇動物，起始於時間0以建立基線。 將化合物或適當媒劑投與其他組及於給藥後各個時間殺死。腦組織、血漿、或腦脊隨液獲自經選擇動物及例如藉由特殊夾層ELISA分析來分析APP裂解產物(包括Aβ肽、sAPPβ及其他APP片段)之存在。於測試末期，殺死動物並酌情分析腦組織、血漿、或腦脊髓液之Aβ肽、C99、及sAPPβ之存在。亦可分析APP轉殖基因動物之腦組織在化合物處理後之β-澱粉樣斑含量。如本文使用之「Aβ-1-x肽」指起始於殘基1及終止大於殘基28之C-末端的Aβ種類之總數。此檢測大部分Aβ種類及通常稱為「總Aβ」。
與經媒劑處理對照或時間零點對照比較，投與抑制劑化合物之動物(PDAPP或其他APP轉殖基因或非轉殖基因小鼠)可證實在腦組織、血漿或腦脊髓液中Aβ或sAPPβ降低及在腦組織中β澱粉樣斑降低。對於製法46而言，在投與0.3、1或3mg/kg口服劑量之化合物三小時後，與經媒劑處理小鼠相比，Aβ1-x肽水平分別在腦海馬體中降低約31%、39%及61%，及在腦表皮層中降低約28%、42%及64%。
考慮製法46活體外對BACE酶之活性，此等降低Aβ效應與活體內BACE抑制一致，及進一步證實N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之CNS滲透。

Claims (9)

  1. 一種化合物，其係N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之甲苯磺酸鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其係晶體。
  3. 如請求項1或請求項2之化合物，其以在X-射線繞射光譜中於5.0°之繞射角2-θ處組合選自由19.6°、13.8°、及18.5°組成之群一或多個峰的實質峰表徵；其中該等繞射角的公差為0.2度。
  4. 一種如請求項1至3中任一項之化合物之用途，其用於製造用於治療患者之阿茲海默氏(Alzheimer’s)病之藥物。
  5. 一種如請求項1至3中任一項之化合物之用途，其用於製造用於治療患者之輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病之藥物。
  6. 如請求項1或請求項2之化合物，其用於治療。
  7. 如請求項1或請求項2之化合物，其用於治療阿茲海默氏病。
  8. 如請求項1或請求項2之化合物，其用於治療輕度認知障礙進展為阿茲海默氏病。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之化合物與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
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