JP6723250B2 - N−[3−[(4ar,7as)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのトシル酸塩 - Google Patents
N−[3−[(4ar,7as)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのトシル酸塩 Download PDFInfo
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Description
スキームA
「N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのトシル酸塩」、
「N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド;トルエンスルホン酸」、
「N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド;p−トルエンスルホン酸」、及び
「N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド;4−メチルベンゼンスルホン酸」。
2−ブロモ−1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン
N−ブロモスクシンイミド(984g、5.53モル)を、1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン(1000g、4.6モル)及びp−トルエンスルホン酸(1315g、7.64モル)のDCM溶液(7L)に35℃で分割して加える。混合物を攪拌し、4時間、40℃に加熱する。混合物を24℃まで冷却し、7%NaHCO3(5L)を添加する。層を分離させ、有機層を10%Na2SO3(5L)及び水(5L)を用いて洗浄する。有機層を2〜3体積まで濃縮し、表題化合物を得て、それをさらなる精製を行うことなく用いる。
1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン(80g、0.37モル)をDCM(800mL)に溶解し、10℃まで冷却する。臭素(63g、0.39モル)を、5時間かけてゆっくりと添加する。30分後、追加の臭素(3.5g、0.06モル)を添加する。30分後、混合物を室温まで加温し、有機層を、NaCl水溶液(500mL)とNaHCO3水溶液(400mL)の混合溶液を用いて洗浄する。有機層を、NaHCO3水溶液(400mL)、NaHSO3水溶液(2×400mL)、及びNaCl水溶液を用いて連続的に洗浄する。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、濃縮して残留物を得る。この残留物を、DCM(100mL)と石油エーテル(500mL)の混合溶液中に溶解する。この溶液を0.5時間、−50℃に冷却し、固形物をろ過により集め、表題化合物を得る(84g、77%)。1H NMR (CDCl3)δ4.46 (d, 2H), 7.07 (dd, 1H), 7.66 (m, 1H), 8.02 (dd, 1H)。
2−[アリル(ベンジル)アミノ]−1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン
2−ブロモ−1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン(25.1g、84.8ミリモル)を、N−ベンジルプロパ−2−エン−1−アミン(15.0g、102ミリモル)のトルエン(200mL)及びDIPEA(59mL、338ミリモル)の溶液に室温で添加する。この混合物の表面下に窒素をスパージングしながら、10分間、室温で攪拌することにより、この混合物を脱酸素化する。反応物を40℃まで加熱し、2.5時間攪拌し、次いで追加のN−ベンジルプロ−2−エン−1−アミン(2.0g、13.6ミリモル)を添加する。反応物を4.5時間、40℃で攪拌し、その後室温まで冷却する。この物質を、さらに精製を行うことなく使用する。この溶液を、以下のパラメータを使用するHPLCにより、表題化合物に関して解析する:LCカラム:Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC(登録商標))C82.1×100mm 1.7μm;移動相A:TFA(4mL)とACN(10mL)を水(4L)に添加することにより調製される0.1%(vol/vol)TFA水溶液+0.2%ACN(vol/vol)、移動相B:TFA(4mL)をACN(4L)に添加することにより調製される0.1%TFAのACN溶液。勾配:%A=10分間にわたり、95%〜53.1%、流速0.85mL/分、カラム温度:45℃。Rt=6.43分(UV)。
5−アリル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−1−[(4−メトキシフェニル)メチル−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール
2−ブロモ−1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノン(1363g、4.61モル)のトルエン溶液(10L)に、ジアリルアミン(537g、5.53モル)及びDIPEA(2381g、18.42モル)を添加する。この混合物を40℃で4時間攪拌し、単離されていない1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−2−(ジアリルアミノ)エタノンを得る。粗1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−2−(ジアリルアミノ)エタノンを含有するこの混合物に、N−(4−メトキシベンジル)ヒドロキシルアミン(847g、5.53モル)とチタン(IV)イソプロポキシド(1965g、6.91モル)を添加する。この混合物を90℃で2時間攪拌する。この混合物を20℃まで冷却し、50%クエン酸一水和物(4L)と飽和Na2CO3(4L)を加える。層を分離させ、MTBE(5L)を用いて水層を抽出する。有機抽出物を、水(5L)で洗浄し、珪藻土を通してろ過し、乾燥するまで濃縮する。この残留物にEtOAc(10L)及びシュウ酸(580g)を加え、固形物をろ過し、1N NaOH(13L)に加える。MTBE(5L)を加え、この混合物を、珪藻土を通してろ過する。層を分離させ、有機層を2体積まで濃縮する。ヘプタン(3L)を加え、溶液を10℃まで冷却する。得られた固形物をろ過し、表題化合物を得る(1330g、64%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H), 3.78-3.41(m, 6H), 4.01(m, 1H), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 1H), 6.82-6.80(m, 2H), 7.51-7.13(m, 3H), 7.63-7.62(m, 1H), 7.65-7.64(m, 1H)。
相対−(3aR,6aS)−5−ベンジル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール、シュウ酸
N−[(4−メトキシフェニル)メチル]ヒドロキシルアミン(15.5g、101ミリモル)を、2−[アリル(ベンジル)アミノ]−1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)エタノンの溶液に40℃で加え、次いでチタン(IV)イソプロポキシド(50.3mL、169ミリモル)を加えた。この混合物を5分間、システムを通して窒素をスパージングすることにより脱酸素化する。この混合物を攪拌しながら2時間、90℃まで加熱する。この反応混合物をクエン酸(36g、186ミリモル)の水溶液(36g)を用いて洗浄し、室温で30分間攪拌する。飽和水溶液として炭酸ナトリウム(100g、939ミリモル)を加え、pHをおよそ9に調節する。この混合物を必要に応じて水及びトルエンで希釈し、層を分離させる。トルエンの層を水(200mL)で希釈したHClの水溶液(5.1mLの5N HCl)、次いで水(200mL)を用いて洗浄する。トルエン層を粘性のある油状物にまで濃縮する。この油状物をEtOAc(375mL)に溶解し、EtOAc(375mL)に溶解させたシュウ酸(15.4g、169ミリモル)の溶液を室温で攪拌しながら滴下して加える。この混合物を2日間室温で攪拌し、ろ過し、生成物のケークをEtOAc(250mL)で洗浄する。固形物を40℃、真空内で一晩乾燥させ、シスラセミ混合物(41.7g、84%)として表題化合物を得る。ES/MS(m/z):498(M+H)。
相対N−[3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−2,2,2−トリフルオロ−アセトアミド
相対−(3aR,6aS)−5−ベンジル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール、シュウ酸(23.6g、40.2ミリモル)を、DCM(400mL)と5N NaOH水溶液(200mL)の混合溶液に加える。この混合物を10分間攪拌し、次いで層を分離させる。有機層を濃縮して、相対−(3aR,6aS)−5−ベンジル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール(20.0g、40.2ミリモル)を得る。この物質をジメチルスルホキシド(360mL)、2、2、2−トリフルオロアセトアミド(7.8g、68ミリモル)、ヨウ化ナトリウム(10.3g、68.6ミリモル)、炭酸カリウム(9.54g、68.3ミリモル)、(1R、2R)−N、N’−ジメチル−1、2−シクロヘキサンジアミン(4.7g、32ミリモル)、及びヨウ化銅(I)(1.53g、8.03ミリモル)へと加える。この混合物を10分間、システムを通して窒素をスパージングすることにより脱酸素化する。この混合物を115℃まで加熱し、5.5時間攪拌し、室温まで冷却する。EtOAc(250mL)及び水(200mL)を加え、得られた混合物を10〜15分間攪拌する。層を分離させ、EtOAc(200mL)を用いて水層を逆抽出する。混合有機層を、塩化アンモニウム20wt%水溶液(100mL)、次いで塩化リチウム20wt%水溶液(100mL)及び水(100mL)を用いて洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、乾固するまで濃縮し、シスラセミ混合物として粗表題化合物を得る(23.6g、111%)。ES/MS(m/z):530(M+H)。
相対−3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−アニリン
相対N−[3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−2,2,2−トリフルオロ−アセトアミド(21.0g、39.7ミリモル)をメタノール(250mL)、5N NaOH水溶液(105mL)、及びエタノール(105mL)に加え、得られた混合物を2時間、50℃に加熱する。反応混合物を減圧下、35〜40℃で濃縮し、メタノールとエタノールを除去する。この物質を、MTBE(320mL)と水(300mL)の混合溶液中に溶解する。層を分離させ、有機層を水(100mL)、次いで水(400mL)と12N HCl水溶液(3.5mL)の混合溶液で洗浄する。水層を、MTBE(400mL)、水(100mL)、及び5N NaOH水溶液(25mL)の混合溶液に加え、層を分離させる。水層をMTBE(100mL)で洗浄する。有機層を1つにまとめ、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、真空内で濃縮して、シスラセミ混合物として表題化合物を得る(9.8g、57%)。ES/MS(m/z):435(M+H)。
相対−N−3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−フェニル]アセトアミド
相対−3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−アニリン(9.4g、22ミリモル)をDCM(110mL)、4−ジメチルアミノピリジン(0.08g、0.65ミリモル)、及びトリエチルアミン(6.1mL、43ミリモル)に加え、反応物を0℃に冷却する。この溶液に無水酢酸(3.4g、33ミリモル)を滴下して加える。反応物を室温まで加温し、2時間攪拌する。反応物に水(140mL)を加え、混合物を室温で10分間、攪拌する。層を分離させ、水層をDCM(100mL)で洗浄する。混合有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、濃縮してシスラセミ混合物として表題化合物を得る(10.1g、100%)。ES/MS(m/z):477(M+H)。
5−アリル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール塩酸塩
TFA(4L、52.9モル)を、5−アリル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−1−[(4−メトキシフェニル)メチル−3、3a、4、6−テトラヒドロピロロ[3、4−c]イソキサゾール(1990g、4.45モル)のDCM溶液(12L)に、温度が35℃未満に維持される速度で滴下して加える。添加が完了した後、混合物を33〜43℃に加温し、6時間攪拌する。NaOH(20%、10L)を、温度が35℃未満に維持される速度で添加する。層を分離させ、有機層を水(6L)で洗浄する。溶液を濃縮し、エタノール(16L)を添加し、混合物を、珪藻土を通してろ過する。ろ液を濃縮し、EtOAc(10L)を加える。4M HClのEtOAc溶液(8L)を加え、得られた固形物をろ過し、乾燥させて表題化合物を得る(1385g、85.6%)。ES/MS(m/z):327.1(M+H)。
[1−アリル−4−アミノ−4−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール
5−アリル−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール塩酸塩(1400g、3.85モル)のDCM溶液(7L)に、pH>9となるよう炭酸ナトリウムの飽和水溶液を加える。層を分離させ、有機抽出物を1.5体積まで濃縮する。HOAc(1.38L)を加え、溶液を2Lまで濃縮する。HOAc(7L)及び亜鉛粉末(2.5kg、38.5モル)を加え、混合物を40〜50℃に加熱し、3時間攪拌する。EtOAc(9.8L)を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過する。ろ過ケークをEtOAc(4L)で洗浄する。ろ液を分離させ、水(7L)を混合有機物に加える。水酸化アンモニウムを、pH≧9になるように加える。層を分離させ、有機層を2Lまで濃縮する。エタノール(2.8L)を加え、溶液を2Lまで濃縮する。エタノール(19L)を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過し、表題化合物のエタノール溶液を得て、それをさらなる精製を行わずに使用する。
[(3S,4R)−1−アリル−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]アンモニウム;(2S,3S)−4−ヒドロキシ−2,3−ビス[(4−メチルベンゾイル)オキシ]−4−オキソ−ブタン酸塩
ジ−p−トルオイル−L−酒石酸一水和物(1.04kg、2.69モル)を、[1−アリル−4−アミノ−4−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール(1264g、3.85ミリモル)のエタノール溶液(21L)に加える。混合物を65〜75℃に加熱し、3時間攪拌する。混合物を5〜10℃に冷却し、[(3S,4R)−1−アリル−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]アンモニウム;(2S,3S)−4−ヒドロキシ−2,3−ビス[(4−メチルベンゾイル)オキシ]−4−オキソ−ブタン酸塩の種晶(1.0g)を加え、混合物を3時間攪拌する。固形物をろ過し、ろ過ケークを冷エタノール(1.4L)で洗浄する。ろ過ケークを乾燥し、白色固形物として表題化合物を得る。第二の溶出異性体のキラル解析:カラム:IC Chiralpak、4.6mm×250mm×5μm;溶離液:90%ヘキサン(0.3%ジエチルアミン):10%エタノール(0.3%ジエチルアミン);流速1.0mL/分、UV270nmによって、鏡像異性的に富化された(99%ee)、Rt=7.4分の鏡像異性体を確認する。1H NMR(400 MHz, CD3OD) δ 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, 1H), 5.50-5.46(m, 1H), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, 1H), 7.10-7.05(m, 1H), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, 1H), 7.80-7.78(m, 1H), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H)。
相対−1−[3−[(3S,4R)−3−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]−4−フルオロ−フェニル]プロパン−2−オン、ジ−トルエンスルホン酸
相対−N−3−[(3aR,6aS)−5−ベンジル−1−[(4−メトキシフェニル)メチル]−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−6a−イル]−4−フルオロ−フェニル]アセトアミド(5.0g、11.0ミリモル)を、水(75mL)、10%パラジウム炭素(2.5g、23ミリモル)、p−トルエンスルホン酸(5.0g、26ミリモル)、及びエタノール(75mL)に加え、混合物を、20時間、室温で50psiの水素雰囲気下、水素化する。混合物を、珪藻土を通してろ過し、パッドをエタノール(100mL)、次いでDCM(100mL)で洗浄する。ろ液を濃縮し、定量粗収率(8.1g、>100%)で、シスラセミ混合物として表題化合物を得る。この材料をさらなる精製を行うことなく直接使用する。ES/MS(m/z):268(M+H)。
((3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)ピロリジン−3−イル)メタノール
1N HCl(500mL、500ミリモル)を、[(3S,4R)−1−アリル−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]アンモニウム;(2S,3S)−4−ヒドロキシ−2,3−ビス[(4−メチルベンゾイル)オキシ]−4−オキソ−ブタン酸塩(100g、139.4ミリモル)の0℃のEtOAc溶液(500mL)に加える。この混合物を1時間攪拌する。水層を分離させ、pHを、1N NaOHを用いて8に調節する。水層を、EtOAc(350mL×2)を用いて抽出する。有機層を混合し、水(500mL)で洗浄し、濃縮して表題化合物を得る(40g、87%)。第二の溶出異性体のキラル解析:カラム:IC Chiralpak、4.6mm×250mm×5μm;溶離液:90%ヘキサン(0.3%ジエチルアミン):10%エタノール(0.3%ジエチルアミン);流速1.0mL/分、UV270nmによって、鏡像異性的に富化された(99.7%ee)、Rt=7.4分の鏡像異性体を確認する。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 2.78-2.70(m, 5H), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, 1H), 3.90-3.84(m, 1H), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H), 7.35-7.32(m, 1H), 7.67- 7.65 (m, 1H)。
相対−N−[3−[(3S,4R)−3−アミノ−1−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]−4−フルオロ−フェニル]アセトアミド
相対−1−[3−[(3S,4R)−3−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]−4−フルオロ−フェニル]プロパン−2−オン、ジ−トルエンスルホン酸(7.5グラム、12.3ミリモル)を、ACN(75mL)に加える。2−クロロ−5−フルオロピリミジン(2.44g、18.4ミリモル)及びDIPEA(7.5mL、43ミリモル)を加え、混合物を20時間、70℃に加熱する。混合物を室温まで冷却し、濃縮する。水(50mL)を加え、混合物を1時間、スラリー形態として攪拌する。混合物をろ過し、真空下、室温で乾燥させ、シスラセミ混合物として表題化合物を得る(3.0g)。残りの水溶液は、クロロホルム(3×20mL)を用いて抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまで濃縮し、真空内で乾燥させ、さらに表題化合物を得る(1.8g)。総粗収率(4.8g、110%)。ES/MS(m/z):364(M+H)。
N−(((3S,4R)−1−アリル−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル)カルバモチオイル)ベンズアミド
イソチオシアン酸ベンゾイル(15.0g、91.9ミリモル)を、((3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)ピロリジン−3−イル)メタノール(30g、91.1ミリモル)の0℃のTHF溶液(400mL)に加える。溶液を25℃まで加温し、1時間攪拌して、表題化合物のTHF溶液を得て、それをさらに精製することなく使用する。
N−((4aR,7aS)−6−アリル−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド、ジヒドロクロリド
トリフェニルホスフィン(36.8g、140.3ミリモル)を、N−(((3S,4R)−1−アリル−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル)カルバモチオイル)ベンズアミド(91.1ミリモル)のTHF溶液(400mL)に加える。アゾジカルボン酸ジ−t−ブチル(31.6g、137.2ミリモル)のTHF溶液(100mL)を加える。混合物を2時間、20〜30℃で攪拌する。混合物を濃縮し、MTBE(400mL)を加える。溶液を、珪藻土を通してろ過し、ケークをMTBE(130mL)で洗浄する。ろ液を1つにまとめ、1N HClのEtOAc溶液(200mL)を加える。混合物を2時間攪拌し、次いで500mLに濃縮する。MTBE(320mL)を加え、溶液をろ過し、ヘプタン(130mL)で洗浄する。固形物をEtOAc(650mL)中でスラリー化させ、2時間、50〜60℃で攪拌する。熱いスラリーをろ過し、固形物をEtOAc(130mL)及びヘプタン(130mL)で洗浄する。固形物をEtOAc(650mL)中で再スラリー化させ、2時間、50〜60℃で攪拌する。熱いスラリーをろ過し、EtOAc(130mL)及びヘプタン(130mL)で洗浄する。固形物を乾燥させ、二HCl塩として表題化合物を得る(40g、80%、99.5%ee)。第一の溶出異性体のキラル解析:カラム:IC Chiralpak、4.6mm×250mm×5μm;溶離液:85%ヘキサン(0.1%ジエチルアミン):15%イソプロピルアルコール(0.1%ジエチルアミン);流速1.0mL/分、UV282nmによって、鏡像異性的に富化された(99.5%ee)、Rt=12.5分の鏡像異性体を確認する。
N−[(4aR,7aS)−6−アリル−7a−[2−フルオロ−5−[(2,2,2−トリフルオロアセチル)アミノ]フェニル]−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
15%炭酸ナトリウム(440mL)を、N−((4aR,7aS)−6−アリル−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド、ジヒドロクロリド(495g、717.88ミリモル)のEtOAc(3L)及び水(784mL)の溶液に加える。混合物を1〜2時間攪拌する。層を分離させ、有機層を、シリカゲル(40g)を通してろ過し、EtOAc(600mL)で洗浄する。ろ液を乾燥するまで濃縮し、N−((4aR、7aS)−6−アリル−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4、4a、5、7−テトラヒドロピロロ[3、4−d][1、3]チアジン−2−イル)ベンズアミドを得る。トリフルオロアセトアミド(136.7g、1.21モル)、NaI(182.5g、1.22モル)、4A分子篩(342g)、及びK2CO3(170.9g、1.24モル)を、N−((4aR、7aS)−6−アリル−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4、4a、5、7−テトラヒドロピロロ[3、4−d][1、3]チアジン−2−イル)ベンズアミド(341g、494.54ミリモル)のDMSO(525mL)及び1、4−ジオキサン(1.025L)の溶液に加える。トランス−N、N’−ジメチルシクロヘキサン(81.6g、573.66ミリモル)及びヨウ化銅(27.3g、143.34ミリモル)のDMSO溶液(500mL)をこの反応混合物に加える。この混合物を5分間攪拌する。この混合物を100℃まで加温し、8時間攪拌し、24℃まで冷却する。水(5.9L)及びDCM(5.9l)を加え、混合物をろ過し、層を分離させる。有機層を水(5.9L)で洗浄し、DCM溶液で表題化合物を得て、それをさらなる精製を行うことなく使用する。
相対−N−[(4aR,7aS)−7a−5−(アセトアミド)−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
THF(30mL)を、相対−N−[3−[(3S、4R)−3−アミノ−1−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−3−イル]−4−フルオロ−フェニル]アセトアミド(4.1g、11.0ミリモル)に加える。この混合物を氷槽中で0℃まで冷却し、イソチオシアン酸ベンゾイル(1.50mL、11.0ミリモル)を加える。次いで、この混合物を30分以上室温に加温させる。1、1’−カルボニルジイミダゾール(1.9g、11.0ミリモル)を加え、混合物を2時間、室温で攪拌する。次いで、この混合物を55℃まで加熱し、さらに18時間攪拌する。水(50mL)を加え、混合物をEtOAc(50mL)で抽出する。水層を、追加のEtOAc(25mL)で抽出し、乾燥するまで濃縮する。粗残留物を、EtOAc中、50%DCM、次いで100%EtOAcで溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。適切な分画を濃縮し、真空下で乾燥させ、シスラセミ混合物として表題化合物を得る(1.33g、26%)。ES/MS(m/z):509(M+H)。
N−((4aR,7aS)−6−アリル−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド、塩酸塩
NaOH(28.7g)及び水(2.7L)を、N−[(4aR,7aS)−6−アリル−7a−[2−フルオロ−5−[(2,2,2−トリフルオロアセチル)アミノ]フェニル]−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(250g、494.4ミリモル)のDCM溶液に加え、この混合物を24℃で68時間攪拌する。1N HCl(3.5L)を加え、pHを1〜3とする。層を分離させ、水層をDCM(680mL)で洗浄する。DCM(4L)を水層に加え、次いで21%水酸化アンモニウムを加えて、pHを8〜10とする。層を分離させ、有機抽出物を1つにまとめ、シリカゲル(170g)を通してろ過し、DCM(1.4L)で洗浄する。溶媒を乾燥するまで濃縮し、EtOAc(4L)で希釈する。1N HClのEtOAc溶液(700mL)を25℃未満の温度で加え、この混合物を1時間攪拌する。この混合物を7〜8体積まで濃縮し、EtOAc(2.8L)を加える。得られた沈殿物をろ過し、EtOAc(400mL)で洗浄する。固形物を乾燥させ、表題化合物を得る(246g、52%)。
N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−6−アリル−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド
無水酢酸(23.5g、0.23モル)を、N−((4aR,7aS)−6−アリル−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド、塩酸塩(100g、0.153モル)及びトリエチルアミン(54.3g、0.535モル)のDCM溶液(800mL)に加える。20〜25℃で1時間攪拌した後、飽和NaHCO3(700mL)及び水(600mL)を加える。層を分離させ、表題化合物を得て、それをDCM溶液としてさらなる精製を行うことなく使用する。
N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド
トリフェニルホスフィン(4.0g、0.015モル)及び1、3−ジメチルバルビツール酸(15.2g、0.097モル)を、N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−6−アリル−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド(0.153モル)のDCM溶液に加える。酢酸パラジウム(1.7g、7.7ミリモル)を加え、この混合物を1時間、20〜30℃で攪拌する。25%水酸化アンモニウムを加え、層を分離させる。有機層をHOAc(500mLの水中、3.0当量)で洗浄し、25%水酸化アンモニウムを用いてpHを8〜9に調節する。水層をDCM(2×500mL)で抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、3〜4体積に濃縮する。MTBE(1L)を加え、この混合物をろ過する。この混合物を濃縮し、ヘプタン(1L)を加える。得られた固形物をろ過し、回収し、乾燥させて表題化合物を得る(48g、76%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.15 (s, 3H), 2.87-2.83(m, 1H), 3.43-3.23(m, 5H), 3.70-3.67(m, 1H), 7.12-7.07 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, 1H), 8.18-8.16(m, 2H), ES/MS (m/z): 413.1 (M+H)。
N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド
2−クロロ−5−フルオロピリミジン(28.9g、218ミリモル)及び炭酸カリウム(33.46g、242.1ミリモル)を、N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド(50g、121.22ミリモル)のDMF溶液(100mL)に加える。この混合物を8時間、80〜85℃に加熱する。この混合物を24℃まで冷却し、ろ過し、DMF(100mL)で洗浄する。固形物を水(2L)中でスラリー化させ、ろ過し、表題化合物を得る(68.5g、98%)。LC−MS:m/z=509.2(M+H)+、1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ ppm 1.22 (t, J = 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (m, 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (s, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - 10.59 (m, 1 H)。
(4aR,7aS)−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−アミン
水酸化リチウム(8.6g、204.9ミリモル)を、N−((4aR,7aS)−7a−(5−アセトアミド−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル)ベンズアミド(80g、157.3ミリモル)のメタノール溶液(400mL)に加える。この混合物を4時間、60〜70℃に加熱する。濃HCl(132g)を加え、この混合物を18時間、55℃で攪拌する。この混合物を30℃まで冷却し、濃縮してメタノールを除去する。水を加え、水層をDCM(3×)で抽出し、920gの水溶液として表題化合物を得て、その総量の5.6%が表題化合物であり、それをさらなる精製を行うことなく使用する。
硫酸(33.4ml、626.6ミリモル)を、(4aR、7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4、4a、5、7−テトラヒドロピロロ[3、4−d][1、3]チアジン−2−アミン(45.8g、125、3ミリモル)のTFA溶液(626mL)に加える。この混合物を0℃に冷却し、20分間攪拌する。発煙硝酸(6.2mL、144.1ミリモル)を加え、反応混合物を22℃に加温し、その温度で3時間攪拌する。反応混合物を蒸発させ、MTBEを加え(250mL)、2回蒸発させる。残留物を真空下で恒量まで乾燥させ、次いで水(147mL)及びエタノール(885mL)に溶解させ、15分間、窒素を泡立てながら脱気する。溶液を耐圧反応容器に移し、10%Pd/Cペーストタイプ87L(6.6g、6.27ミリモル)を加える。この混合物を追加のエタノール(700mL)で希釈し、16時間、80psiで水素を用いて加圧する。この反応混合物をろ過し、次いで10%Pd/Cペーストタイプ87L(6.6g、6.27ミリモル)の第二の触媒充填を加え、混合物を80psiまで加圧し、耐圧反応容器中で3日間攪拌する。反応混合物に窒素をパージし、珪藻土を通してろ過する。ろ液を蒸発させ、残留物を水(200ml)及びEtOAc(200ml)の間で分割させる。水層を分離させ、5℃まで冷却し、水酸化アンモニウム15%w/wで中和する。水層を、EtOAc(3×150mL)で抽出する。有機層を1つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させて、淡褐色の固形物として表題化合物を得る(47.7g、残留EtOAc含有99%)。ES/MS(m/z):363(M+H)。
N−アリル−N−(2,2−ジメトキシエチル)カルバミン酸ベンジル
N−(2、2−ジメトキシエチル)カルバミン酸ベンジル(50g、208.9ミリモル)のトルエン溶液(180mL)を、窒素雰囲気下で固形状水酸化カリウム(51.6g、919.69ミリモル)を用いて処置する。10分後、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム(0.8g、3.1ミリモル)を加える。さらに10分後、臭化アリル(33g、272.8ミリモル)のトルエン溶液(50mL)を10分にわたり滴下して加える。得られた混合物を48時間、50℃で攪拌する。混合物を室温まで冷却し、水でクエンチする。有機層を分離させ、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、乾固するまで濃縮し、表題化合物を得る(44g、75%)。ES/MS(m/z):280(M+H)。
N−アリル−N−(2−オキソエチル)カルバミン酸ベンジル
N−アリル−N−(2,2−ジメトキシエチル)カルバミン酸ベンジル(30g、107ミリモル)のギ酸(36.8mL、860ミリモル)及び水(4.84mL)の溶液を室温で一晩攪拌する。混合物を濃縮し、ヘキサン/EtOAc(1:2)及び水で希釈する。有機層を分離させ、pH=6までブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を蒸発させ、表題化合物を得る(25g、99%)。ES/MS(m/z):234(M+H)。
N−アリル−N−[2−ヒドロキシイミノエチル]カルバミン酸ベンジル
N−アリル−N−(2−オキソエチル)カルバミン酸ベンジル(25g、107ミリモル)のACN溶液(150mL)を、ヒドロキシルアミン塩酸塩(9.68g、139ミリモル)、及び酢酸ナトリウム三水和物(16g、117.9ミリモル)の水溶液(75mL)で処理する。混合物を室温で一晩攪拌する。ACNを蒸発させ、水溶液をEtOAcで抽出する。有機層を分離させ、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮して表題化合物を得る(24g、90%)。ES/MS(m/e):249(M+H)。
3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル
N−アリル−N−[2−ヒドロキシイミノエチル]カルバミン酸ベンジル(24g、96.6ミリモル)のDCM溶液(338mL)を、5%w/wの次亜塩素酸ナトリウム水溶液(106.08ミリモル、143.06mL)を用いて10分にわたり、滴下して処理する。得られた混合物を室温で一晩攪拌する。40%重亜硫酸ナトリウム(7g)の水溶液で反応をクエンチする。有機層を分離させ、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮する。粗生成物を、ヘキサン中、5%EtOAcで溶出するシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(18g、75%)。ES/MS(m/z):247(M+H)。
6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル
n−ブチルリチウム(25.4mL、40.6ミリモル)の1.6Mヘキサン溶液を、−78℃の4−ブロモ−1−フルオロ−2−ヨードベンゼン(12.22g、40.6ミリモル)のTHF溶液(60mL)に滴下して加え、黄色溶液を得て、それを15分間、−78℃で攪拌する。三フッ化ホウ素エーテラート(5.14mL、40.6ミリモル)を、別の−78℃の3、3a、4、6−テトラヒドロピロロ[3、4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル(5g、20.3ミリモル)のTHF溶液(60mL)に加え、この混合物を5分間、−78℃で攪拌する。この溶液を、前もって調製された−78℃の有機リチウム混合物にカニューレを介して加える。混合された混合物を30分間、−78℃で攪拌する。この混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、室温に加温する。この混合物をEtOAc(3×)で抽出し、有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、真空内で溶媒を除去する。粗生成物を、35分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAの勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(2.27g、27%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br)421/423(M+H)。
1−(ベンゾイルカルバモチオイル)−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル
イソチオシアン酸ベンゾイル(2.87mL、21.28ミリモル)を、6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル(5.977g、14.2ミリモル)のTHF溶液(95mL)に滴下して加え、窒素雰囲気下で一晩攪拌する。溶媒を真空内で除去する。粗生成物を、30分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAc勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(6.05g、73%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br)584/586(M+H)。
3−(ベンゾイルカルバモチオイルアミノ)−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボン酸ベンジル
1−(ベンゾイルカルバモチオイル)−6a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロピロロ[3,4−c]イソキサゾール−5−カルボン酸ベンジル(6.05g、10.4ミリモル)と亜鉛(亜鉛末、<10ミクロン)(6.77g、103.5ミリモル)の混合物を、窒素雰囲気下、一晩、室温で、HOAc(52mL)中で攪拌する。反応物をEtOAcで希釈し、珪藻土を通してろ過する。溶媒を真空内で除去し、残留物をEtOAc、水及び飽和重炭酸ナトリウム水溶液で希釈する。この混合物をEtOAc(3×)で抽出し、混合有機層を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を真空内で除去する。粗生成物を、30分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAc勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(5.222g、86%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br)586/588(M+H)。
2−ベンズアミド−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸ベンジル
1、1’−カルボニルジイミダゾール(2.87g、17.7ミリモル)を、3−(ベンゾイルカルバモチオイルアミノ)−3−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボン酸ベンジル(5.198g、8.86ミリモル)のTHF溶液(52mL)に加える。この混合物を室温で1.5時間攪拌し、次いで反応物を一晩、窒素雰囲気下で加熱還流する。反応物を冷却し、水で希釈し、EtOAc(3×)で抽出する。有機層を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を真空で除去する。粗生成物を、30分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAc勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(2.93g、58%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br).568/570(M+H)。
N−[7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
ヨードトリメチルシラン(2.21mL、15.46ミリモル)を、室温の2−ベンズアミド−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸ベンジル2.93g、5.15ミリモル)のACN溶液(44mL)に滴下して加える。反応物を2時間、室温で攪拌し、溶媒を真空で除去する。粗生成物を、3:1のDCM:メタノール、次いでメタノール中、2:1のDCM:7N アンモニアを用いたSCXカラムで精製し、表題化合物を得る(2.098g、94%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br)434/436(M+H)。
2−ベンズアミド−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸tert−ブチル
ジ−t−ブチルジカルボン酸(1.16g、5.31ミリモル)及びトリエチルアミン(1.01mL、7.25ミリモル)を、N−[7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(2.098g、4.83ミリモル)のDCM溶液(48mL)に加える。反応物を窒素雰囲気下で1時間、室温で攪拌する。溶媒を真空で除去し、粗生成物を、30分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAc勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(2.556g、99%)。ES/MS(m/z):(79Br/81Br)534/536(M+H)。
7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−2−ベンズアミド−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸tert−ブチル
2−ベンズアミド−7a−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸tert−ブチル(2.556g、4.8ミリモル)とトランス−N、N’−ジメチル−1、2−シクロヘキサンジアミン(150mg、1.1ミリモル)のエタノール溶液(50mL)を、アジ化ナトリウム(933mg、14.3ミリモル)で処理する。L−アスコルビン酸ナトリウム塩(0.66M、3.2mL、2.1ミリモル)及び水(1mL)の水溶液を加え、フラスコの上部を窒素でパージする。この混合物を硫酸銅(II)五水和物(0.33M、3.2mL、1.1ミリモル)の水溶液で処理し、この混合物を、前もって80℃に加熱されたホットプレート上で直ちに1.5時間、窒素雰囲気下で加熱する。均一な混合物は加熱を行うことで得られる。反応物を冷却し、氷水で希釈し、混合物をEtOAc(3×)で抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥さし、ろ過し、溶媒を真空で除去して粗アジ化生成物を得る。この粗アジ化生成物を、冷エタノール(150mL)中、10%パラジウム炭素と混合させ、真空/窒素、次いで真空/水素を用いて混合物をパージする。この混合物を5時間、30psiの水素下、室温で攪拌する。反応物をベントし、珪藻土を通してろ過し、ろ過ケークをDCMでリンスする。真空内でろ液から溶媒を除去し、粗生成物を、DCM中、50%EtOAcのシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(2.014g、89%)。ES/MS(m/z):471(M+H)。
N−[7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
TFA(10mL)を、7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−2−ベンズアミド−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−6−カルボン酸tert−ブチル(2.013g、4.28ミリモル)のDCM溶液(30mL)に加え、混合物を4時間、窒素雰囲気下、室温で攪拌する。溶媒を真空内で除去し、粗生成物を、3:1のDCM:メタノール、次いでメタノール中、2:1のDCM:7N アンモニアを用いたSCXカラムで精製し、表題化合物を得る(1.555g、98%)。ES/MS(m/z):371(M+H)。
ラセミ体N−[7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
N−[7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(705mg、1.90ミリモル)、5−フルオロ−2−クロロピリミジン(1.01g、7.61ミリモル)、及びDIPEA(1.66mL、9.52ミリモル)の溶液を、1、4−ジオキサン(20mL)中で4時間、窒素雰囲気下で加熱還流する。反応物を冷却し、水で希釈し、EtOAc(3×)で抽出する。有機層を1つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、真空で溶媒を除去し、粗生成物を得る。この粗生成物を、25分で、ヘキサン中、5%〜100%EtOAc勾配のシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る(590mg、66%)。ES/MS(m/z):467(M+H)。
N−[(4aR,7aS)−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド、(異性体1)
ラセミ体N−[7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(1.694g、3.63ミリモル)を、キラルHPLC(カラム:Chiralcel OJ、8x35cm;溶離液:90%メタノール(0.2%ジメチルエチルアミン)及び10%ACN;流速400mL/分、UV280nm)により精製する。最初に溶出された異性体の解析(カラム:Chiralcel OJ−H0.46x15cm;溶離液:10:90のACN:メタノール(0.2%ジメチルエチルアミン含有);流速:0.6mL/分、UV280nm)により、鏡像異性的に富化された(99%ee)、Rt=6.70分の鏡像異性体を確認する(723mg、43%)。ES/MS(m/z):467(M+H)。
N−[3−[(4aR,7aS)−2−ベンズアミド−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド、異性体1
N−[(4aR,7aS)−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド、(異性体1)(0.361g、0.77ミリモル)を、DCM(4mL)とDMF(0.5mL)の混合液中に溶解させる。5−メトキシピラジン−2−カルボン酸(240mg、1.55ミリモル)、HOBT(210mg、1.55ミリモル)及びEDCI(300mg、1.55ミリモル)をこの混合液に加え、この混合液を室温で一晩攪拌する。反応溶液を12gのシリカゲルローディングカラム上に直接加え、40gのシリカゲルカラムを用いて、0〜100%EtOAc/ヘキサン勾配で溶出して精製する。生成物をEtOAc(200mL)中に溶解させ、1N NaOH(2×50mL)とブライン(1×50mL)で洗浄する。シリカゲル精製を上述のように繰り返し、表題化合物を得る(350mg、74%)。ES/MS(m/z):603(M+H)。
5−アリル−6a−(2−フルオロフェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール
フローケミストリー反応工程:343mlのシームレスなステンレススチールの菅型反応装置(OD=1/8インチ)をGCオーブン内に配置し、20分間、20mL/分で、トルエンでフラッシュする。窒素背圧(720psig)を印加し、GCの温度を210℃に設定する。温度が210℃に達した後、2−(ジアリルアミノ)−1−(2−フルオロフェニル)エタノンオキシム(480.51g、1.74モル)のトルエン溶液(5.81L)を、連続モードで作動する高圧シリンジポンプのペアを用いて、22.866mL/分で、反応装置にポンプで送り出し、15分の滞留時間を得る。すべての原液が消費された後、反応装置を30分間、22.866mL/分でトルエンを用いてフラッシュする。GCオーブンの温度を25℃に設定し、完了溶液を集め、真空下で濃縮する。溶媒を蒸発させ、残留物をDCM(2.5L)及び水(5L)に溶解させる。HClを用いてpHを1に調節し、水層を分離させ、NaOHを用いて中和し、pHを10に調節する。水層を、MTBE(3×2.5L)を用いて抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾固するまで蒸発させ、粗表題化合物を得て(248g、47%)、それをさらなる精製を行うことなく使用する。ES/MS(m/z):249(M+H)。
1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール
亜鉛末(590g、9モル)を、5−アリル−6a−(2−フルオロフェニル)−3,3a,4,6−テトラヒドロ−1H−ピロロ[3,4−c]イソキサゾール(3559g、1.29モル)の、メタノール(2.85L)と飽和塩化アンモニウム水溶液(3.56L)の混合溶液に添加し、この混合溶液を16時間、70℃で加熱する。反応溶液を60℃に冷却し、THF(2.85L)で希釈し、熱いうちに珪藻土を通してろ過する。ろ液を蒸発して有機溶媒を取り除き、水性混合物をクエン酸10%w/w水溶液(4L)とEtOAc(3.5L)で希釈する。有機層を分離させ、水層をEtOAc(2×2L)で洗浄する。水層をNaOH 50%w/wtで中和し、pHを10に調節して、次いでEtOAc(2×1.5L)で抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾燥するまで蒸発させ、粗表題化合物を得る(299g、92%)。ES/MS(m/z):251(M+H)。
[(3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール;2,3−ビス[(4−メチルベンゾイル)オキシ]ブタン二酸
ジ−p−トルオイル−L−酒石酸(348.6g、884ミリモル)の1−メトキシ−2−プロパノール溶液(1.13L)を、前もって40℃に加熱されていた[(3R、4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール(225.9g、902ミリモル)の1−メトキシ−2−プロパノール溶液(1.13L)に加える。反応物を22℃に冷却し、18時間攪拌する。白色固形物をろ過により集め、1−メトキシ−2−プロパノール(600ml)で洗浄する。集めた固形物を乾燥させ、表題化合物を得る(183.01g、31.8%)。ES/MS(m/z):251(M+H)。
[(3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール
[(3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール;2,3−ビス[(4−メチルベンゾイル)オキシ]ブタン二酸(211g、331ミリモル)を水(2.1L)とEtOAc(2.3L)に溶解させる。HCl 35%w/wを加え、pHを1に調節する。水層を分離させ、NaOH 50%w/wを用いてpHを10に調節し、EtOAc(2×)を用いて抽出する。水層のpHを、NaOH水溶液を用いて10に調節し、水溶液のpHもpH=10に維持しながらMTBE(3×)を用いて抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾燥するまで濃縮し、粗表題化合物を得る(73g、88%、94.8%ee)。この生成物をキラルクロマトグラフィー:カラムAS−H、溶離液10%イソプロピルアルコール、2%イソプロピルアミン;流速3mL/分、UV220;圧力は100バール、35℃、により解析し、2番目に溶出する異性体として表題化合物を得る。Rf=2.26分。ES/MS(m/z):251(M+H)。
N−[(4aR,7aS)−6−アリル−7a−(2−フルオロフェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
[(3R,4S)−1−アリル−4−アミノ−4−(2−フルオロフェニル)ピロリジン−3−イル]メタノール(129.7g、414ミリモル)のTHF溶液(2、3L)を窒素雰囲気下で0℃に冷却する。イソチオシアン酸ベンゾイル(61.5mL、456ミリモル)を、5℃未満の温度を維持しながら加える。反応物を3時間にわたり室温に加温し、1、1’−カルボニルジイミダゾール(87.4g、538.9ミリモル)を加え、反応物を1時間、22℃で攪拌し、次いで16時間、70℃に加熱する。反応混合物を22℃に冷却し、溶媒を蒸発させる。残留物を、EtOAc(1L)及び水(1L)で分割させる。有機層を分離させ、水層をEtOAc(2×400mL)で抽出する。有機層を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾固するまで蒸発させ、粗表題化合物を得る。粗生成物を、0〜40%のDCMのEtOAc/DCM勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、残留溶媒を含有する淡黄色の固形物として表題化合物を得る(170g、99%)。ES/MS(m/z):396(M+H)。
N−[(4aR,7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
2−メルカプト−安息香酸(122g、793ミリモル)、ビス(ジベンジリデンアセトン)パラジウム(4.15g、7.21ミリモル)、及び1、4−ビス(ジフェニルホスフィノ)ブタン(3.14g、7.21ミリモル)を、窒素雰囲気下でN−[(4aR,7aS)−6−アリル−7a−(2−フルオロフェニル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(178.21g、360ミリモル)の無水2−メチルテトラヒドロフラン(1.96L)溶液に加える。この溶液を、真空/窒素サイクルを3回行うことにより脱気し、次いで、この反応物に15分間、窒素を泡立たせる。この反応物に窒素を泡立たせながら、反応混合物を40℃に加熱する。反応物が40℃に達した時点で、泡立てることを止め、反応混合物を窒素雰囲気下で3時間、40℃で攪拌する。反応物を22℃に冷却し、水(2L)で希釈する。HCl(5M)溶液を加えてpHを1に調節する。水層を分離させ、追加のEtOAc(2×800mL)で洗浄する。水層のpHを、NaOH50%w/wを用いて10に調節し、次いでEtOAc(10L)を用いて抽出する。水層を追加のEtOAc(2×750mL)で洗浄する。有機抽出物を1つにまとめ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾固するまで蒸発させ、淡黄色の固形物として粗表題化合物を得る(124.7g、97%)。ES/MS(m/z):356(M+H)。
N−[(4aR,7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド
N−[(4aR,7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−4a,5,6,7−テトラヒドロ−4H−ピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(124.7g、256ミリモル)、DIPEA(67mL)、5−フルオロ−2−クロロピリミジン(29.3ml、307ミリモル)のN−メチルピロリドン溶液(997mL)を16時間、100℃に加熱する。反応物を22℃に冷却し、15℃未満の温度を維持しながら、10℃に冷却された水(10L)へと注ぐ。淡いクリーム状の固形物をろ過により集め、追加の水で洗浄する。湿った固形物をEtOAc(2L)に溶解させ、分離漏斗に移す。塩化ナトリウム水溶液5%w/w(1L)を加え、有機層を分離させ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で蒸発させる。生成物を、0〜40%EtOAc/イソヘキサンの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色の固形物として表題化合物を得る(116g、70%)。ES/MS(m/z):452(M+H)。
(4aR,7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−アミン
水酸化リチウム(9.26g、386ミリモル)を、N−[(4aR,7aS)−7a−(2−フルオロフェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−2−イル]ベンズアミド(158.6g、351.6ミリモル)のメタノール混合物(1.6L)に加える。この混合物を4時間、70℃に加熱し、次いで22℃に冷却する。反応混合物を真空下で黄色残留物になるまで蒸発させる。この残留物を水(1L)及びEtOAc(750mL)で分割させる。HCl(5M水溶液)を加え、pHを1に調節する。水層を分離させ、有機層をEtOAc(2×200mL)で洗浄する。水層のpHをNaOH50%w/w水溶液を用いて、pH=10に調節し、EtOAc(3×1L)を用いて抽出する。有機抽出物を1つにまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発させ、淡黄色固形物として粗表題化合物を得る(133.3g、99%、12%の残留EtOAcを含有)。ES/MS(m/z):348(M+H)。
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド塩酸塩
N−[3−[(4aR,7aS)−2−ベンズアミド−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド、異性体1(0.350g、0.58ミリモル)をTHF(2mL)に溶解させ、次いでメタノール(4mL)及びエタノール(4mL)を加える。O−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩(495mg、5.81ミリモル)及びピリジン(470μL、5.81ミリモル)をこの混合物に加え、反応物を50℃に加温し、一晩攪拌する。シリカゲル(約10g)を反応物に加え、混合物を濃縮する。シリカゲル上で乾燥されたサンプルを空のカートリッジにロードし、DCM中、7N アンモニアメタノールの0〜10%勾配で溶出して精製する。生成物は、3:1のDCM:メタノール、次いでメタノール中、2:1のDCM:7Nアンモニアを用いたSCXカラムで二度目の精製を行う。生成物に、DCM中、7Nアンモニアメタノールの0%〜10%勾配を用いたシリカゲル上で最終的な精製を行い、表題化合物の遊離塩基を得る。この物質をDCM(5mL)に溶解させ、1M HClのジエチルエーテル溶液(0.20mL、660μモル)を加える。溶媒を真空内で除去して表題化合物を得る(71mg、23%)。ES/MS(m/z):498(M+H)。
結晶質固形物のXRDパターンは、35kV及び50mAで作動する、CuKa線λ=1.54060Åを備えたBruker D4 Endeavor粉末X線回析装置及びVantec検出器で得る。サンプルは、工程サイズが2θの0.009°、及びスキャン速度が0.5秒/工程で、2θで4〜40°の間で、ならびに0.6mmの発散(divergence)、5.28の固定アンチスキャッター(anti−scatter)、及び9.5mmの検出スリットで、スキャンされる。乾燥粉末は石英の試料容器上にパックされ、ガラススライドを用いて滑面を得る。結晶形の回析パターンはを周囲温度及び相対湿度で集める。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関し、回析ピークの相対強度は、たとえば結晶形態及び傾向などの因子に起因する優先される方向性によって変化しうることは周知である。優先される方向性の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。たとえば、The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995を参照のこと。さらに、結晶学分野において、任意の所与の結晶形に関し、角度のピーク位置は若干変化し得ることも周知である。たとえば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変動、試料の移動、または内部標準の有無によって変わり得る。本件の場合、2θで±0.2のピーク位置の変動性は、指定された結晶形の明確な特定を阻害することなく、これらの潜在的な変化を考慮している。結晶形の確認は、特徴的なピーク(°2θの単位)、典型的にはより突出したピークの任意の固有の組み合わせに基づき行われ得る。大気温度及び相対湿度で集められた結晶形回析パターンは、8.853及び26.774度2シータでのNIST675標準ピークに基づき調節される。
結晶形2 N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド(水和物)
塩化オキサリル(888μL、10.2ミリモル)を、5−メトキシピラジン−2−カルボン酸(1.6g、10.2ミリモル)のACN(53mL)及びDMF(848μL)の溶液に加える。15分後、新たに調製した溶液を、前もって50℃に加熱された(4aR、7aS)−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4、4a、5、7−テトラヒドロピロロ[3、4−d][1、3]チアジン−2−アミン(2.65g、7.3ミリモル)の水(53mL)及びエタノール(53mL)の混合溶液に加える。反応混合物を1時間、50℃で攪拌し、22℃に冷却し、次いでこの温度で一晩攪拌する。有機溶媒を真空下で蒸発させ、水性混合物をNaOH50%w/w水溶液で処理し、pH=10に調節する。淡いクリーム状の固形物を単離させ、追加の水で洗浄する。固形物をイソプロピルアルコール(2×)で希釈し、溶媒を蒸発させる。粗物質を、アンモニア処理メタノール(2N)/DCMの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。所望の生成物を含有する分画を1つにまとめ、溶媒を蒸発させて、オフホワイトの固形物として表題化合物を得る(1.9g、52%)。ES/MS(m/z):499(M+H)。
ACN(500mL)をDMF(19.2mL、248.9ミリモル)に加える。塩化オキサリル(39.3g、309.63ミリモル)、次いで5−メトキシピラジン−2−カルボン酸(46.0g、298.4ミリモル)をこのDMF/ACN溶液に加える。別のフラスコで、(4aR、7aS)−7a−(5−アミノ−2−フルオロ−フェニル)−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4、4a、5、7−テトラヒドロピロロ[3、4−d][1、3]チアジン−2−アミン(56.8g、156.75ミリモル)の水溶液をACN(500mL)に加え、水酸化アンモニウム(95mL)を用いてpHを9に調節する。この混合物を、次いで、50〜55℃に加熱する。塩化オキサリル溶液を滴下して加え、混合物を3時間攪拌する。水酸化アンモニウムを用いてpHを8〜9に調節する。得られた沈殿物をろ過し、水で洗浄し、乾燥させて表題化合物を得る(123g)。固形物をアセトン(250mL)中で1.5時間スラリー化させ、ろ過する。湿性ケークをアセトンで洗浄し、表題化合物を得る(110g、HPLCによる純度は90.5%)。THF(1L)及び活性炭(9g)をこの固形物に加え、混合物を一晩加熱還流する。混合物を、珪藻土を通してろ過し、THF(150mL)で洗浄する。有機溶液を10体積まで濃縮し、60℃に加熱する。水(430mL)を加え、混合物を8時間、60℃で攪拌する。混合物を室温まで冷却し、10時間攪拌する。得られた固形物をろ過し、THF/水(7:6)で洗浄し、乾燥させて表題化合物を得る(69g、88%)LC−MS:(m/z)499(M+H)、純度:98.3%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (s, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (s, 2 H) 7.19 (dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (s, 1 H) 8.44 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H) 10.60 (s, 1 H)。
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドを、約71mg/mL溶媒の濃度、約23℃で、THF中でスラリー化させる。約60℃〜約63℃で発生する溶解まで、このスラリーを攪拌しながら加熱する。約95:5のTHF:水の溶媒比率を得るよう、この熱い溶液に水を加える。N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドの結晶形2の種晶を加える(約3重量%の投入量)。得られた薄いスラリーを、約20分間、約60℃〜約63℃に維持し、次いで約2〜約4時間にわたり、約5.3〜約5.5体積の水を加え、約69:31のTHF:水の溶媒比率とする。次いでこのスラリーを約30分間、約60℃〜約63℃に維持し、その後、約1時間にわたり約23℃に冷却し、次いで、約8〜12時間、攪拌する。次いでこのスラリーをろ過し、THF:水(35:65)を用いて軽くリンスし、低真空下、約40℃で約8〜12時間乾燥させ、水和された所望の結晶形2のN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドを得る。
表1:結晶形2の粉末X線回析ピーク
結晶形3のN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドを熱重量分析のパンにロードし、約170℃に加熱して、約5分間、170℃で維持する。この混合物を室温に冷却し、表題化合物を得る。
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド(121mg)とACN(5mL)をバイアル中で混合し、90℃の攪拌プレート上で加熱する。約30分後、固形物のほとんどが溶解し、濁った溶液を得る。結晶形3の種晶を加え、試料を約90℃で約1時間、攪拌する。加熱器を取り除き、混合物を攪拌して、明白色の固形物を得る。固形物を真空ろ過により単離し、約10分間、エアースチーム下で乾燥させ、次いで約8〜12時間、約80℃、低真空下で乾燥させ、表題化合物を得る。
表2:結晶形3の粉末X線回析ピーク
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド:トルエンスルホン酸
水和された結晶形2のN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド(149.15mg)を酢酸エチル(2mL)に加える。試料を80℃の温度、1000rpmで攪拌する。p−トルエンスルホン酸(70mgを酢酸エチル(1mL)に溶解)を、この攪拌溶液に加え、それを一晩、80℃で攪拌して、白色固形物のスラリーを生成し、それを真空ろ過により単離して、表題化合物を得る。
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド(9.5g、19ミリモル)及びp−トルエンスルホン酸(3.80g、19.8ミリモル)をテトラヒドロフラン(31mL)、水(7.9mL)、及び2−プロパノール(8.6mL)に加える。この溶液を40℃に加熱する。加温された溶液に、およそ3時間かけて2−プロパノール(200.0mL)を加える。2−プロパノールの添加開始後すぐに、この混合物に表題化合物の一部(500mg、0.75ミリモル)を播種する。溶媒添加が完了した後、この混合物を1〜3時間かけておよそ20℃にまで冷却する。およそ20℃からおよそ55℃にまで、2時間の目標時間をかけてこの混合物を加熱する。1時間、55℃に温度を維持し、次いでおよそ4時間かけて約20℃まで冷却する。少なくとも10時間、およそ20℃でスラリーを攪拌する。このスラリーをろ過し、湿性ケークを水(57mL)で洗浄する。生成物を45℃、真空で少なくとも10時間乾燥させ、表題化合物を得る(10.4g、81%)。ES/MS(m/z):500(M+H)。
水和されたN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミド(20.7g)を、窒素バブラー、テフロン(登録商標)バナナ刃を有するガラスシャフトに付加されたIKA(登録商標)機械電動機/撹拌機、及びプログラム可能J−KEM(登録商標)温度制御装置に連結された熱電温度計を備えた500mLの三つ首丸底フラスコ中に、60:40のTHF:H2O(85mL)中、170rpmでスラリー化させる。p−トルエンスルホン酸一水和物(7.6g、1.03当量)を、60:40のTHF:H2O(20mL)の混合液中に溶解させ、この溶液を、攪拌中のN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのスラリーに23℃で、一度にすべて加え、ほぼ瞬時に澄んだ赤色調の褐色溶液とさせる。次いで攪拌速度を15分かけて200rpmに上げ、水(22mL)をこの溶液に加え、次いでN−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドトルエンスルホン酸(750mg、3wt%の種投入量)を用いてそれに播種し、次いでさらに15分間、23℃で攪拌する。6時間かけて、水(226mL、総溶媒量は353mL;または13.6体積。最終溶媒比率は17.5:82.5のTHF:H2O)をスラリーに加え、次いでそれを一晩(22時間)、23℃で攪拌する。スラリーを、バキュームを介してろ過し、15:85のTHF:H2O(2×20mL)を用いてリンスし、次いで20分間、生成物の湿性ケーク中に形成される亀裂を手でぴったりと押しながらバキューム上に置く。湿性固形物を約72時間、真空下、40℃で乾燥させ、白色結晶質固形物として表題化合物を得る(24.07g、90.0wt%)。
表3:実施例1の結晶の粉末X線回析ピーク
In vitroの酵素アッセイ及び細胞アッセイを行うために、被験化合物をDMSO中で調製し、10mMのストック溶液を作製する。このストック溶液を96ウェルの丸底プレート中、DMSOで連続希釈し、最終化合物濃度は10mM〜0.05nMの範囲で10点の希釈曲線を得て、その後にin vitro酵素アッセイ及び全細胞アッセイを行う。
ヒトBACE1の発現
ヒトBACE1(アクセッション番号:AF190725)は、全脳cDNAからRT−PCRによりクローニングされる。アミノ酸配列番号1〜460に対応するヌクレオチド配列を、ヒトIgG1(Fc)ポリペプチドをコードするcDNAへと挿入する(Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999))。このBACE1(1〜460)とヒトFcの融合タンパク質を、huBACE1:Fcと名付け、pJB02ベクター中に構築させる。ヒトBACE1(1〜460):Fc(huBACE1:Fc)を、HEK293細胞中で一過性発現させる。各構築物のcDNA250μgをFugene6と混合し、1リットルのHEK293細胞に添加する。トランスフェクションの4日後、精製のために馴化培地を回収する。
huBACE1:Fcは、プロテインAクロマトグラフィーにより精製される。酵素は、小分注物において、−80℃で保存される。
被験化合物の連続希釈は上述のように調製される。KH2PO4緩衝液中で化合物はさらに20倍に希釈される。各希釈の10μLを、反応混合液(25μLの50mMKH2PO4、pH4.6、1mM TRITON(登録商標)X−100、1mg/mL ウシ血清アルブミン、及び15μMのFRET基質)を含有する、対応するタンパク質低結合黒色プレートのA列〜H列の各ウェルに加える(Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)を参照のこと)。内容物を10分間、プレート振とう器上で良く混合する。KH2PO4緩衝液に溶解した200pM ヒトBACE(1〜460):Fc(Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)を参照のこと)の15μLを、基質と被験化合物を含有するプレートに加え、反応を開始させる。0時点での混合物のRFUを、プレート振とう器上で軽く混合した後、励起波長355nm、及び発光波長460nmで記録する。反応プレートをアルミホイルで覆い、16〜24時間、室温で、加湿された暗いオーブン内で維持する。インキュベーション終了時のRFUを、0時点で用いられたものと同じ励起及び発光の設定で記録する。0時点と、インキュベーション終了時のRFUの差は、化合物処置下でのBACE1活性を表す。RFUの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、4パラメーターロジスティック方程式に適合され、EC50値及びIC50値を得る(Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)を参照のこと)。
また、確証的全細胞分析を、PDAPPトランスジェニック胎児マウスから作製された初代神経細胞培養中で行う。初代皮質神経細胞は、胎児16日目のPDAPPの胚から調製され、96ウェルプレート中で培養される(10%FBSを添加したDMEM/F12(1:1)中、15x104細胞/ウェル)。in vitroで2日後、培養培地を、B27サプリメント及び2μM(最終)のAra−C(Sigma社、C1768)を含有する無血清DMEM/F12(1:1)と置き換える。in vitroで5日目、神経細胞を37℃で24時間、所望される濃度の阻害剤(DMSO希釈されている)の存在下/非存在下でインキュベートする。インキュベーション終了時、馴化培地を、たとえばAベータペプチドの分析により、ベータ−セクレターゼ活性の兆候に関して分析する。総Aベータペプチド(Aベータ 1−x)を、捕捉抗体としてモノクローナル抗体266を、及び報告抗体としてビオチニル化3D6を用いたサンドイッチELISAにより計測する。あるいは、Aベータ1〜40ペプチド及びAベータ1〜42ペプチドを、Aベータ1〜40に対する捕捉抗体としてモノクローナル抗体2G3を、Aベータ1〜42に対する捕捉抗体としてモノクローナル抗体21F12を用いたサンドイッチELISAにより計測する。Aベータ1〜40及びAベータ1〜42の両方のELISAとも、報告抗体としてビオチニル化3D6を使用する。化合物処置後の馴化培地中に放出されたAベータの濃度は、かかる条件下でのBACE1活性に相当する。10点阻害曲線をプロットし、及び4パラメーターロジスティック方程式に適合させることにより、Aベータ低減効果に対するEC50値及びIC50値が得られる。製造46の化合物は原則的に上述のように検証され、Aベータ低減効果に関し以下の活性を示した。
表4
平均±SEM;SEM=平均の標準誤差。
マウス、モルモット、イヌ、及びサルをはじめとする数種類の動物モデルを用いて、化合物処置後のベータ−セクレターゼ活性のin vivoでの阻害に関しスクリーニングを行ってもよい。本発明に用いられる動物は、野生型動物であっても、トランスジェニック動物であっても、または遺伝子ノックアウト動物であってもよい。たとえば、Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)に記載されるように作製されるPDAPPマウスモデル、ならびに他の非トランスジェニック動物または遺伝子ノックアウト動物が、阻害化合物の存在下での、Aベータ及びsAPPベータ産生のin vivo阻害の解析に有用である。一般的に、2〜12か月齢のPDAPPマウス、遺伝子ノックアウトマウス、または非トランスジェニック動物に、たとえばトウモロコシ油、シクロデキストラン、リン酸緩衝液、PHARMASOLVE(登録商標)、または他の適切なビヒクルなどのビヒクル内に製剤化された化合物が投与される。化合物投与の1〜24時間後、動物は殺処分され、脳ならびに脳脊髄液及び血漿が、Aベータ、C99、及びsAPP断片の解析のために回収される(May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)参照)。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのトシル酸塩である化合物。
[2]
結晶質である[1]に記載のトシル酸塩。
[3]
0.2度の回析角に対する許容誤差で、19.6°、13.8°、及び18.5°からなる群から選択されるピークのうち1つ以上と組み合わせて、5.0°の回析角2シータでのX線回析スペクトラムにおける実質的なピークにより特徴づけられる、[1]または[2]のいずれかに記載のトシル酸塩。
[4]
[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物の有効量を、かかる治療を必要としている患者に投与することを含む、患者のアルツハイマー病を治療する方法。
[5]
[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物の有効量を、かかる治療を必要としている患者に投与することを含む、患者の軽度認知機能障害からアルツハイマー病への進行を治療する方法。
[6]
治療における使用のための、[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物。
[7]
アルツハイマー病の治療における使用のための、[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物。
[8]
軽度認知機能障害からアルツハイマー病への進行の治療における使用のための、[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物。
[9]
1つ以上の薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、[1]〜[3]のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
Claims (7)
- N−[3−[(4aR,7aS)−2−アミノ−6−(5−フルオロピリミジン−2−イル)−4,4a,5,7−テトラヒドロピロロ[3,4−d][1,3]チアジン−7a−イル]−4−フルオロ−フェニル]−5−メトキシ−ピラジン−2−カルボキサミドのトシル酸塩の結晶であって、
0.2度の回折角に対する許容誤差で、5.0°、19.6°、13.8°および18.5°の回折角2シータでのX線回折スペクトラムにおけるピークにより特徴づけられる、結晶。 - アルツハイマー病を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載の結晶を含む、組成物。
- 軽度認知機能障害からアルツハイマー病への進行を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載の結晶を含む、組成物。
- 治療における使用のための、請求項1に記載の結晶。
- アルツハイマー病の治療における使用のための、請求項1に記載の結晶。
- 軽度認知機能障害からアルツハイマー病への進行の治療における使用のための、請求項1に記載の結晶。
- 1つ以上の薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、請求項1に記載の結晶を含む、医薬組成物。
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