TWI599358B - 組合療法 - Google Patents

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Description

組合療法
本發明係關於一種BACE抑制劑與抗N3pGlu Aβ單株抗體之組合及使用其治療某些神經病症(諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease))之方法。
本發明屬於治療阿茲海默氏病及涉及澱粉樣蛋白β(Aβ)肽、澱粉樣蛋白前驅蛋白(APP)之神經毒性及高度凝集肽區段的其他疾病及病症的領域。阿茲海默氏病為影響全世界數百萬患者之破壞性神經退化性病症。鑒於市場上當前批准之藥劑僅向患者提供短暫症狀性利益，治療阿茲海默氏病中存在顯著未滿足之需要。
阿茲海默氏病之特徵為腦中Aβ之產生、凝集及沈積。完全或部分抑制β分泌酶(β位點澱粉樣蛋白前驅蛋白裂解酶；BACE)已展示對小鼠模型中之斑塊相關及斑塊依賴性病變具有重大影響。此表明即使Aβ肽含量少量降低亦可引起斑塊負荷及突觸缺陷之長期顯著降低，因此提供顯著治療利益，尤其在治療阿茲海默氏病中。
此外，特異性靶向N3pGlu Aβ之抗體已展示降低活體內之斑塊水準(US 2013/0142806)。N3pGlu Aβ，亦稱為N3pE或Aβp3-42，為僅在斑塊中發現之Aβ肽的截短形式。儘管N3pGlu Aβ肽為腦中所沈積之Aβ的次要組分，但研究展現N3pGlu Aβ肽具有侵襲性凝集特性且早期積聚於沈積級聯中。
需要BACE抑制劑以及結合N3pGlu Aβ肽之抗體以提供針對Aβ肽 介導之病症(諸如阿茲海默氏病)的治療，其可比單獨使用之任一藥物更有效。舉例而言，用此類組合治療可使得可使用比單獨使用之各藥物低的劑量的任一或兩種藥物，從而可能使副作用降低，同時維持功效。相信用N3pG抗體及BACE抑制劑靶向移除Aβ之沈積形式將便於吞噬細胞移除預先存在之斑塊沈積物，而同時藉由抑制Aβ產生減少或阻止Aβ之進一步沈積。
US 2009/0209755揭示稠合之胺基二氫噻嗪衍生物，其具有BACE抑制活性且進一步揭示為由Aβ肽引起之神經退化性疾病(諸如阿爾茨海默型癡呆)的適用治療劑。另外，J.Neuroscience,31(46)，第16507-16516頁(2011)揭示(S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基-苯基)-4-甲基-5,6-二氫-4H-[1,3]噻嗪-2-基胺，一種經口投與之CNS活性BACE抑制劑。美國專利第8,278,334號揭示一種治療認知或神經退化性疾病之方法，其包含投與經取代之環胺BACE-1抑制劑以及抗澱粉樣蛋白抗體。此外，J.Neuroscience,34(35)，第11621-11630頁(2014)揭示用BACE抑制劑及抗Aβ抗體金特魯單抗(Gentenerumab)組合治療提高了APPLondon小鼠中之澱粉樣蛋白減少。
因此，本發明提供一種治療認知或神經退化性疾病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之BACE抑制劑以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
更特定言之，本發明提供一種治療認知或神經退化性疾病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物：
其中R為H或F；且A為： 或其醫藥學上可接受之鹽；以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明亦提供一種治療特徵為Aβ形成及沈積之疾病的方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明進一步提供一種治療阿茲海默氏病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明亦提供一種治療輕度阿茲海默氏病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明進一步提供一種治療輕度認知障礙之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明進一步提供一種治療前驅性阿茲海默氏病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
另外，本發明提供一種預防輕度認知障礙發展為阿茲海默氏病之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
本發明進一步提供一種治療大腦澱粉樣血管病(CAA)之方法，其包含為需要此類治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體。
此外，本發明提供一種式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及 有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體，其用於療法，尤其用於治療阿茲海默氏病、輕度阿茲海默氏病、前驅性阿茲海默氏病或用於預防輕度認知障礙發展為阿茲海默氏病。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑；以及具有抗N3pGlu Aβ單株抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
另外，本發明提供一種套組，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及抗N3pGlu Aβ單株抗體。本發明進一步提供一種套組，其包含如下醫藥組合物，該組合物包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑；及包含抗N3pGlu Aβ單株抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。如本文所用，「套組」在單一包裝中包括各組分之各別容器，其中一種組分為式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且另一組分為抗N3pGlu Aβ單株抗體。「套組」亦可在各別包裝中包括各組分之各別容器，其中一種組分為式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，且另一組分為抗N3pGlu Aβ單株抗體，該等包裝具有以組合形式投與各組分之說明。
本發明進一步提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與有效量之抗N3pGlu Aβ單株抗體之組合的用途，其用於製造供治療阿茲海默氏病、輕度阿茲海默氏病、前驅性阿茲海默氏病或供預防輕度認知障礙發展為阿茲海默氏病的藥物。
一般技術者應瞭解且認識到「抗N3pGlu Aβ單株抗體」及特異性抗體「B12L」及「R17L」以及製備及使用該等抗體之方法由一般技術者鑑別且揭示於2014年3月25日頒佈之標題為「Anti-N3pGlu Amyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof」的美國專利第 8,679,498 B2號(USSN 13/810,895)中。參見例如美國專利第8,679,498 B2號之表1。
另外，本發明所用之某些抗體的胺基酸序列提供於下表A中：
認知或神經退化性疾病包括阿茲海默氏病、輕度阿茲海默氏病、輕度認知障礙、前驅性阿茲海默氏病、大腦澱粉樣血管病(CAA)、唐氏症候群(Down's syndrome)及其類似物。
如本文所用，術語「治療(treating/to treat/treatment)」包括抑制、減緩、阻止、減輕或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重性。
如本文所用，術語「患者」係指人類。
術語「抑制Aβ肽之產生」意謂減少患者之Aβ肽的活體內含量。
如本文所用，術語「有效量」係指如下式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之量或劑量及抗N3pGlu Aβ單株抗體之量或劑量，其在以單次劑量或多次劑量投與診斷或治療下之患者後在患者中提供所要作用。應瞭解本發明之組合療法藉由以任何方式投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以及抗N3pGlu Aβ單株抗體進行，該方式在體內提供式I化合物及抗N3pGlu Aβ單株抗體之有效含量。
有效量可由主治診斷醫師(如熟習此項技術者)藉由使用已知技術且藉由觀察在類似情況下所獲得之結果容易地確定。在確定患者之有效量時，主治診斷醫師考慮多個因素，包括(但不限於)：患者之物種；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之程度或涉及或嚴重性；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之給藥方 案；伴隨藥療之使用；及其他相關情況。
式I化合物及其醫藥學上可接受之鹽在本發明之組合中在寬廣劑量範圍內一般為有效的。舉例而言，每日劑量通常處於約0.1毫克/天至約1000毫克/天、較佳約0.1毫克/天至約500毫克/天且最佳約0.1毫克/天至約100毫克/天範圍內。另外，抗N3pGlu Aβ單株抗體在本發明之組合中在寬廣劑量範圍內一般為有效的。舉例而言，每週劑量通常處於約0.1至約10毫克/公斤/週、較佳約0.3至約6毫克/公斤/週且最佳約0.3至約3毫克/公斤/週範圍內。在一些情況下，低於前述範圍之下限之劑量可已完全足夠，而在其他情況下，在可接受副作用之情況下可採用更大之劑量，因此以上劑量範圍不欲以任何方式限制本發明之範疇。
本發明之BACE抑制劑及抗體較佳調配成醫藥組合物，其藉由使該化合物生物可用之任何途徑投與。投藥途徑可以任何方式變化，其受藥物之物理特性及患者及照護者之便利性限制。較佳地，抗N3pGlu Aβ單株抗體組合物用於非經腸投與，諸如靜脈內或皮下投與。另外，BACE抑制劑(諸如式I化合物)或其醫藥學上可接受之鹽用於經口、非經腸或經皮投與，包括靜脈內或皮下投與。此類醫藥組合物及其製備方法為此項技術中熟知。(參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(編輯D.B.Troy，第21版，Lippincott,Williams & Wilkins,2006)。
如本文所用，短語「組合」係指同時或以任何次序依序投與或以其任何組合形式投與BACE抑制劑(諸如式I化合物)或其醫藥學上可接受之鹽以及抗N3pGlu Aβ單株抗體(諸如抗N3pGlu Aβ單株抗體)。兩種分子可以同一醫藥組合物之一部分的形式或在各別醫藥組合物中投與。BACE抑制劑可在投與抗N3pGlu Aβ單株抗體之前、同時或之後投與或以其某種組合形式投與。在抗N3pGlu Aβ單株抗體以重複間隔 投與時(例如在標準治療過程期間)，BACE抑制劑可在每次投與抗N3pGlu Aβ單株抗體之前、同時或之後投與或以其某種組合形式投與，或以相對於使用抗N3pGlu Aβ單株抗體之療法不同之間隔投與，或以單個或一系列劑量在用抗N3pGlu Aβ單株抗體治療之過程之前、期間之任何時間或之後投與。
以下段落描述本發明之較佳基團、取代基及構型。
較佳化合物為：N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺；及N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺；及其醫藥學上可接受之鹽。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽為尤其較佳。
N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺為最佳。
此外，結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺為較佳化合物；且如下結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺為尤其較佳，其特徵為X射線繞射光譜之繞射角2-θ 11.8°處具有大峰，其中一或多個峰選自由18.6°、19.3°及26.7°組成之群；其中繞射角公差為0.2度。
較佳抗N3pGlu Aβ單株抗體為美國專利第8,679,498 B2號中所鑑別之B12L及R17L(參見例如其中之表1)，其中B12L為尤其較佳。
一般技術者應瞭解式I化合物可以互變異構形式存在，如流程A中所描繪。當本申請案中任意提及式I化合物之特定互變異構體中之一者時，應瞭解涵蓋其互變異構形式與所有混合物。
為清楚起見，在以下流程中，未指定某些立體化學中心且已去除某些取代基，且並不意欲以任何方式限制流程之教示。此外，個別異構體、對映異構體及非對映異構體可在合成式I化合物之任何便利點由一般技術者藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法分離或解析(參見例如J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」,John Wiley and Sons,Inc.,1981及E.L.Eliel及S.H.Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」,Wiley-Interscience,1994)。名稱「異構體1」及「異構體2」係指分別自對掌性層析第一個及第二個溶離之化合物，且若對掌性層析在合成早期開始，則相同名稱施用於後續中間物及實例。
一般技術者應瞭解本發明化合物包含含有至少兩個對掌性中心之核心：
儘管本發明涵蓋所有個別對映異構體以及該等化合物之對映異構體的混合物，包括外消旋物，但在標記為1及2之碳原子處具有流程 B中所說明之絕對構型的化合物為較佳本發明化合物。
另外，以下流程中所述之某些中間物可含有一或多個氮保護基。不同保護基在每次出現時視特定反應條件及欲進行的特定轉化而定可相同或不同。保護及去保護條件為熟習此項技術者所熟知且描述於文獻中(參見例如「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene,John Wiley and Sons,Inc.2007)。
式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中已知之多種程序製備，該等程序其中一些在以下製備及實例中說明。各所述途徑之特定合成步驟可以不同方式組合或與不同程序之步驟結合以製備式I化合物或其鹽。各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、濕磨及結晶。另外，除非另外指明，否則所有取代基如先前所定義。試劑及起始物質為一般技術者容易獲得的。
如本文所用，「APP」係指澱粉樣蛋白前驅蛋白；「BOC」係指第三丁氧基羰基；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CSF」係指腦脊髓液；「DCC」係指1,3-二環己基碳化二亞胺；「DIC」係指二異丙基碳化二亞胺；「DCM」係指二氯甲烷；「DIPEA」係指二異丙基乙胺；「DMAP」係指二甲基胺基吡啶；「DMEM」係指杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)；「DMSO」係指二甲亞碸；「EDCI」係指1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ee」係指對映異構體過量；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「Ex」係指實例；「F12」係指漢姆氏F12培養基(Ham's F12 medium)；「FBS」係指胎牛血清；「FRET」係指螢光共振能量轉移；「HATU」係指六氟磷酸(二甲基胺基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲亞銨；「HEK」係指人胚腎； 「hr」係指小時；「HOAc」係指乙酸；「HOAt」係指1-羥基-7-偶氮苯并***；「HOBt」係指1-羥基苯并***水合物；「HBTU」係指六氟磷酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基；「HRP」係指辣根過氧化酶；「IC50」係指產生藥劑之最大可能抑制反應之50%的藥劑濃度；「iPr」係指異丙基；「min」係指分鐘；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「PBS」係指磷酸鹽緩衝生理食鹽水；「PDAPP」係指血小板衍生之澱粉樣蛋白前驅蛋白；「Prep」係指製備；「psi」係指磅/平方吋；「PyBOP」係指六氟磷酸苯并***-1-基氧基三吡咯啶基-鏻；「PyBrop」係指六氟磷酸溴-參-吡咯啶基鏻；「RFU」係指相對螢光單位；「Rt」係指滯留時間；「SCX」係指強陽離子交換層析；「SFC」係指超臨界流體層析；「SEM」係指平均值之標準誤差；「THF」係指四氫呋喃；且「TMB」係指3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。
以下製備及實例進一步說明本發明。
在以下流程中，除非另外指明，否則所有取代基均為如先前所定義。試劑及起始物質一般為一般技術者容易獲得的。其他試劑可藉由有機及雜環化學品之標準技術使用下述製備及實例中所述之程序(包括任何新穎程序)製備。
流程1
流程1描繪肟(步驟2之產物)及(步驟5之產物)之形成。肟可各用於形成雙環異噁唑(步驟3或7之產物)。經取代之芳族基可在流程1步驟1及步驟7中所示之合成的不同點***。「PG」係為胺基開發之保護基，諸如胺基甲酸酯及烯丙基。此類基團為此項技術中所熟知及瞭解。
在2步反應中，可使用無機鹼(諸如碳酸鉀)用經保護之烯丙胺烷基化(步驟1)具有β鹵素之酮，隨後在極性質子溶劑(諸如乙醇)中用羥基胺鹽酸鹽及有機鹼(諸如吡啶)處理，得到肟(步驟2)。步驟2之肟產物可隨後在3+2環化中藉由數種方法轉化為雙環異噁唑，諸如在非極性溶劑(諸如甲苯或二甲苯)中加熱步驟2之肟，形成雙環異噁唑(步驟3)。或者，肟可以二甲縮醛為起始物質形成，用酸(諸如甲酸)處理二甲縮醛，形成醛(步驟4之產物)。在步驟5中，步驟4之醛可隨後用羥基胺鹽酸鹽及鹼(諸如三水合乙酸鈉)轉化為步驟5之肟產物。步驟6之雙環異噁唑產物可由步驟6中所示之肟一種次氯酸鈉水溶液形成。在步驟7中，隨後經保護之雙環異噁唑與芳族有機鋰試劑或格林納試劑(Grignard reagent)反應，得到步驟7之經保護雙環異噁唑產物。
流程2
流程2說明獲得步驟10或步驟12之經保護之吡咯并噻嗪產物的不同途徑。可在壓力氫化條件下在乙酸中用粉末狀Zn或在極性溶劑(諸如乙醇)中藉由阮尼鎳(Raney Nickel)處理經保護雙環異噁唑，得到胺基吡咯啶甲醇(步驟11之產物)。隨後，使步驟11之胺基吡咯啶甲醇產物與異硫氰酸苯甲醯酯在極性溶劑(諸如THF)中反應，繼而添加1,1-羰基二咪唑(CDI)，得到稠合之經保護吡咯啶噻嗪(步驟12之產物)。或者，可使雙環異噁唑之胺與異硫氰酸苯甲醯酯反應，得到硫脲(步驟8之產物)，隨後在步驟9中，可在乙酸中用粉末狀鋅打開異噁唑環，得到步驟9之羥基化合物產物。可隨後在極性非質子性溶劑(諸如THF或1-氯-N,N,2-三甲基丙烯基胺於DCM中之溶液)中用CDI處理羥基化合物，形成稠合之經保護吡咯啶噻嗪(步驟10之產物)。稠合之吡咯啶噻嗪亦可由光延反應(Mitsunobu reaction)諸如使用三苯基膦及偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)形成。
流程3
流程3描繪吡咯并噻嗪向苯胺(步驟13之產物)之轉化，苯胺可隨後醯基化，繼而去除保護基且雜芳基化吡咯啶。醯化苯胺氮且去除噻嗪胺之保護基，得到式I化合物。
在疊氮基來源(諸如疊氮化鈉)存在下對適當吡咯并噻嗪執行疊氮基去鹵素。此類疊氮基-去鹵素反應為此項技術中所熟知及瞭解。所得疊氮基中間物還原為苯胺(步驟13之產物)可藉由此項技術中熟知及描述的氫化條件或藉由此項技術中熟知之還原劑(諸如LiAlH4、NaBH4及PPh3)實現。
可在此項技術中熟知之酸性條件下去除經BOC保護之吡咯啶的保護基(步驟14之步驟1)。可隨後在親核性芳族取代基(SNAr)中用經取代之芳族嘧啶使用有機鹼(諸如dipea、三乙胺或N,N,N,N'-四甲基胍)雜 芳基化去除保護基之吡咯啶，得到步驟14中步驟2之產物。可使步驟14之苯胺產物與雜芳族羧酸在偶合條件下偶合(步驟15中步驟1之產物)。熟習此項技術者應認識到有大量方法及試劑由羧酸與胺反應形成醯胺。舉例而言，適當苯胺與適當酸在偶合劑及胺鹼(諸如DIPEA或三乙胺)存在下反應，在去除噻嗪胺之保護基後得到式I化合物。偶合試劑包括碳二醯亞胺，諸如DCC、DIC、EDCI，及芳族肟，諸如HOBt及HOAt。另外，非親核性陰離子之或鏻鹽(諸如HBTU、HATU、PyBOP及PyBrOP)可用於替代更傳統偶合試劑。可以使用諸如DMAP之添加劑促進反應。或者，可在鹼(諸如三乙胺或吡啶)存在下使用經取代之苯甲醯氯醯基化經保護之苯胺。可隨後在極性非質子性溶劑(諸如乙醇)或無機鹼(諸如氫氧化鋰之甲醇溶液)中用有機鹼(諸如吡啶及甲基羥基胺鹽酸鹽)去除經保護之噻嗪胺的保護基，得到式I化合物。
在視情況存在之步驟中，式I化合物之醫藥學上可接受之鹽可藉由使式I之適當游離鹼與醫藥學上可接受之適當酸在標準條件下在適合溶劑中反應形成。另外，此類鹽之形成可在去除氮保護基後同時發生。此類鹽之形成為此項技術中所熟知及瞭解。參見例如Gould,P.L.,「Salt selection for basic drugs」,International Journal of Pharmaceutics,33：201-217(1986)；Bastin,R.J.等人，「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」,Organic Process Research and Development,4：427-435 (2000)；and Berge,S.M.等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences,66：1-19,(1977)。一般技術者應瞭解，式I化合物容易轉化為且可分離成醫藥學上可接受之鹽，諸如鹽酸鹽。
製備及實例
以下製備及實例進一步說明本發明。
製備1 1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮
將碳酸鉀(38.8g，281mmol)添加至3-溴苯甲醯甲基溴(60g，216mmol)於乙腈(430毫升)中之溶液中，且在氮氣下冷卻混合物至0℃。經1小時逐滴添加二烯丙胺(34.6mL，280.63mmol)且使反應物升溫至22℃隔夜。濃縮粗反應混合物且使殘餘物分配於水(300mL)與MTBE(300mL)中。丟棄水層且用水(100mL，2×)及鹽水(100mL)洗滌有機層。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾且蒸發溶劑至恆重，得到標題化合物(62g，98%)。ES/MS(m/e)：294(M+1)。
製備2 N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯
在0℃下用4.85M氫氧化鈉溶液(70.8mL，343.5mmol)處理胺基乙醛二甲縮醛(25mL，229mmol)於甲苯(120mL)中之溶液。在0℃下攪拌混合物10分鐘，且添加氯甲酸苯甲酯(33.8mL，229mmol)，在添加期間保持內部溫度低於20℃。將混合物經4小時升溫至室溫。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮至乾，得到標題化合物(54g，98%)。ES/MS(m/e)：240(M+H)。
製備3 N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯
在氮氣下用固體氫氧化鉀(51.6g，919.69mmol)處理N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯(50g，208.9mmol)於甲苯(180mL)中之溶液。10分鐘後，添加氯化苯甲基三乙銨(0.8g，3.1mmol)。再經10分鐘後，經10分鐘逐滴添加烯丙基溴(33g，272.8mmol)於甲苯(50mL)中之溶液。在50℃下攪拌所得混合物48小時。冷卻混合物至室溫且用水淬滅。分離有機層，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且濃縮至乾，得到標題化合物(44g，75%)。ES/MS(m/e)：280(M+H)。
製備4 N-烯丙基-N-(2-側氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯
在室溫下攪拌N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯(30g，107mmol)於甲酸(36.8mL，860mmol)及水(4.84mL)中之溶液隔夜。濃縮混合物且用己烷/EtOAc(1：2)及水稀釋。分離有機層，用鹽水溶液洗滌直至pH=6為止且經硫酸鈉乾燥。蒸發溶劑，得到標題化合物(25g，99%)。ES/MS(m/e)：234(M+H)。
製備5 1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮肟
在22℃下攪拌1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮(60g，204.7 mmol)於乙醇(720mL)及吡啶(24.8mL，307mmol)中之溶液15分鐘。將羥基胺鹽酸鹽(17g，246mmol)經1小時逐份添加至溶液中。使反應物升溫至50℃後維持2小時，隨後加熱至70℃後維持16小時。蒸發溶劑且使殘餘物分配於水(300mL)與MTBE(300mL)中。分離有機層且用水(100mL，2×及鹽水(100mL))洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾且蒸發至乾，得到標題化合物(75.5g，79%)。ES/MS(m/e)：309(M+1)。
製備6 2-(二烯丙基胺基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟
將二烯丙胺(1.56L，12.2mol)添加至2-溴-1-(2-氟苯基)乙酮(1291g，5.8mol)於乙醇(12.9L)中之溶液中，其中保持內部溫度低於30℃。在22℃下攪拌反應混合物4小時。將羥基胺鹽酸鹽(543g，7.58mol)逐份添加至溶液中，隨後在70℃下加熱16小時。冷卻反應物至室溫，蒸發溶劑且使殘餘物分配於水(5.1L)與MTBE(6.4L)中。添加碳酸鈉以調節水層至pH=5.5且再用MTBE(1.2L)萃取水層。組合有機層且用水及鹽水洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾且蒸發至乾，得到粗標題化合物(1.45kg，104%)，其不經進一步純化即使用。ES/MS(m/e)：249(M+1)。
製備7 N-烯丙基-N-[2-羥基亞胺基乙基]胺基甲酸苯甲酯
用羥基胺鹽酸鹽(9.68g，139mmol)及三水合乙酸鈉(16g，117.9mmol)於水(75mL)中之溶液處理N-烯丙基-N-(2-側氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯(25g，107mmol)於乙腈(150mL)中之溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜。蒸發乙腈且用EtOAc萃取水溶液。分離有機層，經硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮，得到標題化合物(24g，90%)。ES/MS(m/e)：249(M+H)。
製備8 2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮
在35℃下將N-溴丁二醯亞胺(984g，5.53mol)逐份添加至1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(1000g，4.6mol)及對甲苯磺酸(1315g，7.64mol)於DCM(7L)中之溶液中。攪拌混合物且加熱至40℃。冷卻混合物至24℃且添加7% NaHCO3(5L)。分離各層且用10% Na2SO3(5L)及水(5L)洗滌有機層。將有機層濃縮至2-3份體積，得到標題化合物，其不經進一步純化即使用。
製備9 5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧基苯甲基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑
向2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(1363g，4.61mol)於甲苯(10L)中之溶液中添加二烯丙胺(537g，5.53mol)及dipea(2381g，18.42mol)。在40℃下攪拌混合物4小時，得到1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙 基胺基)乙-1-酮，不對其進行分離。將N-(4-甲氧基苯甲基)羥基胺(847g，5,53mol)及Ti(OiPr)4(1965g，6.91mol)添加至含有粗1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基胺基)乙-1-酮之混合物中。在90℃下攪拌混合物2小時。將混合物冷卻至20℃且添加50%單水合檸檬酸(4L)及飽和Na2CO3(4L)。分離各層且用MTBE(5L)萃取水溶液。用水(5L)洗滌有機萃取物，經由矽藻土過濾且濃縮至乾。將EtOAc(10L)及乙二酸(580g)添加至殘餘物中，且過濾固體且添加至1N NaOH(13L)中。添加MTBE(5L)且經由矽藻土過濾混合物。分離各相且將有機層濃縮至2份體積。添加庚烷(3L)且冷卻溶液至10℃。過濾所得固體，得到標題化合物(1330g，64%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：2.51-2.49(m,3H),3.09-3.04(m,3H),3.78-3.41(m,6H),4.01(m,1H),5.24-5.01(m,2H),5.89-5.85(m,1H),6.82-6.80(m,2H),7.51-7.13(m,3H),7.63-7.62(m,1H),7.65-7.64(m,1H)。
製備10 5-烯丙基-6a-(3-溴苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑
將粗1-(3-溴苯基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮肟(75.5g，195.34mmol)溶解於甲苯(600mL)中且回流12小時。在真空中蒸發溶劑且將殘餘物溶解於水性1N HCl(1L)與MTBE(300mL)之混合物中。攪拌混合物15分鐘且添加矽藻土(10g)。再攪拌混合物20分鐘且經由矽藻土過濾。再用水性1N HCl(200mL)及MTBE(200mL)洗滌濾餅。分離有機層且用1N HCl(2×100mL)洗滌。組合水層且用NaOH 50% w/w調節pH值至9。用MTBE(3×250mL)萃取水性混合物。組合有機層，經硫酸鈉乾燥且過濾。蒸發濾液且在真空下乾燥，得到紅色固體(60 g)。用庚烷(600mL)稀釋紅色固體且加熱混合物至回流後維持20分鐘。添加炭(2g)且經由矽藻土過濾混合物。在大氣壓下濃縮濾液以調節最終體積至300mL。冷卻溶液至22℃且攪拌3小時。藉由過濾收集淡黃色固體且在真空下乾燥至恆重，得到標題化合物(40g，60%)。ES/MS(m/e)：309(M+1)。
製備11 5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑
流動化學反應步驟：將343-mL無縫不鏽鋼管狀反應器(O.D=1/8吋)置放在GC烘箱內且用甲苯以20mL/min沖洗20分鐘。施加氮氣背壓(720psig)且將GC之溫度設定為210℃。溫度達到210℃後，使用以連續模式工作之一對高壓注射泵以22.866mL/min將2-(二烯丙基胺基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51g，1.74mol)於甲苯(5.81L)中之溶液泵送通過反應器，得到15分鐘之滯留時間。所有儲備溶液耗盡後，用甲苯以22.866mL/min沖洗反應器30分鐘。將GC烘箱之溫度設定為25℃，收集所有溶液且在真空下濃縮。蒸發溶劑且將殘餘物溶解於二氯甲烷(2.5L)及水(5L)中。用鹽酸調節pH值至1，分離水層且用氫氧化鈉中和以調節pH值至10。用MTBE(3×2.5L)萃取水層。組合有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發至乾，得到粗標題化合物(248g，47%)，其不經進一步純化即使用。ES/MS(m/e)：249(M+1)。
製備12 5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽
將三氟乙酸(4L，52.9mol)以一定速率逐滴添加至5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧基苯甲基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(1990g，4.45mol)於DCM(12L)中之溶液中以維持溫度低於35℃。添加完成後，將混合物升溫至33-43℃且攪拌6小時。將NaOH(20%，10L)以一定速率添加以維持溫度低於35℃。分離各層且用水(6L)洗滌有機層。濃縮溶液，添加乙醇(16L)且經由矽藻土過濾混合物。濃縮濾液且添加EtOAc(10L)。添加4M HCl之EtOAc溶液(8L)，過濾所得固體且乾燥，得到標題化合物(1385g，85.6%)。ES m/z 327.1(M+1)
製備13 3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯
用5% w/w次氯酸鈉水溶液(106.08mmol，143.06mL)經10分鐘逐滴處理N-烯丙基-N-[2-羥基亞胺基乙基]胺基甲酸苯甲酯(24g，96.6mmol)於DCM(338mL)中之溶液。在室溫下攪拌所得混合物隔夜。用40%亞硫酸氫鈉水溶液(7g)淬滅反應物。分離有機層，經硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮。經矽膠用5% EtOAc之己烷溶液溶離純化粗產物，得到標題化合物(18g，75%)。ES/MS(m/e)：247(M+H)。
製備14 6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯
將1.6M正丁基鋰之己烷溶液(25.4mL，40.6mmol)逐滴添加至4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22g，40.6mmol)於THF(60mL)中之-78℃溶液，得到黃色溶液，在-78℃下攪拌15分鐘。
將三氟化硼醚化物(5.14mL，40.6mmol)添加至3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯(5g，20.3mmol)於THF(60mL)中之各別-78℃溶液中且在-78℃下攪拌混合物5分鐘。將此溶液經由導管添加至此前製備之-78℃有機鋰混合物中。在-78℃下攪拌經合併之混合物30分鐘。用飽和氯化銨水溶液淬滅混合物且升溫至室溫。用EtOAc(3×)萃取混合物且合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠以35分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.27g，27%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)421/423(M+H)。
製備15 1-(苯甲醯基硫代胺甲醯基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯
將異硫氰酸苯甲醯酯(2.87mL，21.28mmol)逐滴添加至6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯(5.977g，14.2mmol)於THF(95mL)中之溶液中且在氮氣下攪拌隔夜。在真空中移除溶劑。經矽膠以30分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(6.05g，73%)。ES/MS(m/e)： (79Br/81Br)584/586(M+H)。
製備16 3-(苯甲醯基硫代胺甲醯基胺基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯
在室溫下在氮氣下於乙酸(52mL)中攪拌1-(苯甲醯基硫代胺甲醯基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸苯甲酯(6.05g，10.4mmol)與鋅(粉末，<10微米)(6.77g，103.5mmol)之混合物隔夜。用EtOAc稀釋反應物且經由矽藻土過濾。在真空中移除溶劑且用EtOAc、水及飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋殘餘物。用EtOAc(3×)萃取混合物，合併經合併之有機層且經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠以30分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(5.222g，86%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)586/588(M+H)。
製備17 (1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯啶-3-基)甲醇
將飽和碳酸鈉水溶液添加至5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽(1400g，3.85mol)於DCM(7L)中之溶液中以達到pH>9。分離各層且將有機萃取物濃縮至1.5份體積。添加乙酸(1.38L)，將溶液濃縮至2L。添加乙酸(7L)及鋅粉(2.5kg，38.5 mol)且加熱混合物至40-50℃且攪拌3小時。添加EtOAc(9.8L)且經由矽藻土過濾混合物。用EtOAc(4L)洗滌濾餅。分離濾液且將水(7L)添加至經合併之有機相中。添加氫氧化銨以達到pH值>9。分離各層且將有機層濃縮至2L。添加乙醇(2.8L)且濃縮溶液至2L。添加乙醇(19L)且經由矽藻土過濾混合物，得到標題化合物之乙醇溶液，其不經進一步純化即使用。
製備18 [1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
用鋅粉(42.3g，646.8mmol)一次性處理5-烯丙基-6a-(3-溴苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(40g，129.4mmol)於乙酸(400mL)中之22℃溶液。在室溫下劇烈攪拌反應物1小時。添加EtOAc(400mL)且經由矽藻土過濾混合物。蒸發濾液且在真空下乾燥殘餘物。使殘餘物分配於水(300mL)與MTBE(300mL)中。用氫氧化鈉50% w/w調節pH值至8且分離有機層，經硫酸鈉乾燥且過濾。蒸發濾液且在真空下乾燥殘餘物，得到標題化合物(41g，97%)。ES/MS(m/e)：311(M+1)。
製備19 1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將鋅粉(590g，9mol)添加至5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四 氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(3559g，1.29mol)於甲醇(2.85L)與氯化銨飽和水溶液(3.56L)之混合物中之溶液中且在70℃下加熱混合物16小時。冷卻反應物至60℃，用THF(2.85L)稀釋且趁熱經矽藻土過濾。蒸發濾液以移除有機溶劑且用10% w/w檸檬酸水溶液(4L)及EtOAc(3.5L)稀釋水性混合物。分離有機層且用EtOAc(2×2L)洗滌水層。用氫氧化鈉50% w/w中和水層以調節pH值至10，隨後用EtOAc(2×1.5L)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發至乾，得到粗標題化合物(299g，92%)。ES/MS(m/e)：251(M+1)。
製備20 (2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-3-基]銨
將單水合二對甲苯甲醯基-L-酒石酸(1.04kg，2.69mol)添加至(1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯啶-3-基)甲醇(1264g，3.85mmol)於乙醇(21L)中之溶液中。將混合物加熱至65-75℃且攪拌3小時。冷卻混合物至5-10℃，添加(2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-3-基]銨之晶種(1.0g)且攪拌混合物3小時。過濾固體且用冷乙醇(1.4L)洗滌濾餅。乾燥濾餅，得到呈白色固體狀之標題化合物。第二溶離異構體之對掌性分析(管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；溶離劑：90%己烷(0.3%二乙胺)：10%乙醇(0.3%二乙胺)；UV 270nm下，流速1.0mL/min)確定對映異構性增濃(99% ee)對映異構體(1050g，38%)，其Rt=7.4分鐘。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ：2.40(s,6H),3.05-3.04(m,1H),3.57-3.31(m,3H),3.66-3.58(m,4H),3.75-3.74(m,2H),5.38-5.36(m,1H),5.50-5.46(m,1H),5.88(s,2H),5.97-5.91(m,1H),7.10-7.05(m,1H),7.29(d,J=8.0Hz,4H),7.53-7.51(m,1H),7.80-7.78(m,1H),8.01(d,J=8.0Hz,4H)。
製備21 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸
將二對甲苯甲醯基-L-酒石酸(348.6g，884mmol)於1-甲氧基-2-丙醇(1.13L)中之溶液添加至在40℃下預熱之[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(225.9g，902mmol)於1-甲氧基-2-丙醇(1.13L)中之溶液中。冷卻反應物至22℃且攪拌18小時。藉由過濾收集白色固體且用1-甲氧基-2-丙醇(600ml)洗滌。乾燥所收集之固體，得到標題化合物(183.01g，31.8%)。ES/MS(m/e)：251(M+1)。
製備22 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；(2R,3R)-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸
加熱[1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(77g，235mmol)於異丙醇(914mL)中之溶液至70℃。添加二對甲苯甲醯基-L-酒石酸(86.2g，223mmol)，冷卻混合物至22℃後維持2小時且攪拌隔夜。過濾漿液以收集淡黃色固體且用異丙醇洗滌。在真空下乾燥固體，得到標題化合物(63g，36%)。ES/MS(m/e)：311(M+1)。藉由逆相對掌性層析分析產物：分析第一溶離異構體(管柱：Chiralpak ID-3 4.6×50mm；溶離劑：70：30，水性20mM碳酸氫銨：乙腈；流速：1.5mL/min，在UV 215nm下)確定對映異構性增濃(96% ee)對映異構體，其Rt=1.26分鐘。
製備23 ((3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯啶-3-基)甲醇
將1N HCl(500mL，500mmol)添加至(2S,3S)-4-羥基-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]-4-側氧基-丁酸[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-3-基]銨(100g，139.4mmol)於EtOAc(500mL)中之0℃溶液中。將混合物攪拌1小時。分離水層且用1N NaOH調節pH值至8。用EtOAc(350mL×2)萃取水層。合併有機層，用水(500mL)洗滌且濃縮，得到標題化合物(40g，87%)。第二溶離異構體之對掌性分析(管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；溶離劑：90%己烷(0.3%二乙胺)：10%乙醇(0.3%二乙胺)；在UV 270nm下，流速1.0mL/min)確定對映異構性增濃(99.7% ee)對映異構體，其Rt=7.4分鐘。1H NMR(400MHz,CDCl3 δ：2.78-2.70(m,5H),3.16-3.00(m,3H),3.87-3.75(m,1H),3.90-3.84(m,1H),5.24-5.11(m,2H),5.91- 5.87(m,1H),6.95-6.91(m,1H),7.35-7.32(m,1H),7.67-7.65(m,1H)。
製備24 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸(211g，331mmol)溶解於水(2.1L)及EtOAc(2.3L)中。添加鹽酸35% w/w以調節pH值至1。分離水層且用氫氧化鈉50% w/w調節pH值至10且用EtOAc(2×)萃取。用NaOH水溶液調節水層之pH值至10且用MTBE(3×)萃取，同時亦維持水溶液之pH值在pH=10下。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮至乾，得到粗標題化合物(73g，88%，94.8% ee)。藉由對掌性層析(管柱AS-H，溶離劑10%異丙醇，2%異丙胺；在UV 220下，流速3mL/min；在35℃下，壓力100巴)分析產物，得到標題化合物作為第二溶離異構體，Rf=2.26分鐘。ES/MS(m/e)：251(M+1)。
製備25 N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-3-基)硫代胺甲醯基)苯甲醯胺
將異硫氰酸苯甲醯酯(15.0g，91.9mmol)添加至((3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯啶-3-基)甲醇(30g，91.1mmol)於THF(400mL)中之0℃溶液中。使溶液升溫至25℃且攪拌1小時，得到 標題化合物之THF溶液，其不經進一步純化即使用。
製備26 [(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇
將[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇；(2R,3R)-2,3-雙[(4-甲基苯甲醯基)氧基]丁二酸(63g，85.8mmol)與水性1N HCl(800mL)及EtOAc(400mL)組合且在22℃下攪拌混合物15分鐘。分離各層且用氫氧化鈉50% w/w調節水層之pH值至10。用MTBE(3×250mL)萃取水性混合物。經硫酸鎂乾燥經合併之有機層，過濾且蒸發至乾，得到標題化合物(27g，99%)。ES/MS(m/e)：311(M+1)。
製備27 N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣氛圍下冷卻[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(3-溴苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(27g；86.7mmol)於THF(270mL)中之溶液至-5℃。在保持溫度低於0℃下逐滴添加異硫氰酸苯甲醯酯(12.3mL，91mmol)。使反應物升溫至22℃後維持1小時。一次性添加1,1'-羰基二咪唑(28.1g，173.5mmol)且在22℃下攪拌反應物1小時，隨後加熱至回流後維持16小時。在真空中移除溶劑且在真空下乾燥殘餘物。使粗物質分配 於MTBE(500mL)與水(250mL)中。分離有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾且蒸發至乾。經90/10至60/40 DCM/EtOAc之矽膠梯度純化粗物質，得到標題化合物(27g，68%)。ES/MS(m/e)：456(M+1)。
製備28 N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺二鹽酸鹽
將三苯基膦(36.8g，140.3mmol)添加至N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-3-基)硫代胺甲醯基)苯甲醯胺(91.1mmol)之THF(400mL)溶液中。添加偶氮二甲酸二第三丁酯(31.6公克，137.2mmol)於THF(100mL)中之溶液。在20-30℃下攪拌混合物2小時。濃縮混合物且添加MTBE(400mL)。經由矽藻土過濾溶液且用MTBE(130mL)洗滌濾餅。合併濾液且添加1N HCl之EtOAc溶液(200mL)。攪拌混合物2小時，隨後濃縮至500mL。添加MTBE(320mL)，過濾溶液且用庚烷(130mL)洗滌。將固體於EtOAc(650mL)中製成漿液且在50-60℃下攪拌2小時。過濾熱漿液且用EtOAc(130mL)及庚烷(130mL)洗滌固體。將固體於EtOAc(650mL)中再製成漿液且在50-60℃下攪拌2小時。過濾熱漿液且用EtOAc(130mL)及庚烷(130mL)洗滌。乾燥固體，得到二鹽酸鹽形式之標題化合物(40g，80%，99.5% ee)。第一溶離異構體之對掌性分析(管柱：IC Chiralpak，4.6mm * 250mm * 5μm；溶離劑：85%己烷(0.1%二乙胺)：15%異丙醇(0.1%二乙胺)；在UV 282nm下，流速1.0mL/min)確定對映異構性增濃(99.5% ee)對映異構體，其Rt=12.5分鐘。
製備29 N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙醯胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺
將15%碳酸鈉(440mL)添加至N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺二鹽酸鹽(495g，717.88mmol)於EtOAc(3L)及水(784mL)中之溶液中。攪拌混合物1-2小時。分離各層，經由矽膠(40g)過濾有機層且用EtOAc(600mL)洗滌。濃縮濾液至乾，得到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺。將三氟乙醯胺(136.7g，1.21mol)、NaI(182.5g，1.22mol)、4 A分子篩(342g)及K2CO3(170.9g，1.24mol)添加至N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺(341g，494.54mmol)於DMSO(525mL)及1,4-二噁烷(1.025L)中之溶液中。將反-N,N'-二甲基環己烷(81.6g，573.66mmol)及碘化銅(27.3g，143.34mmol)於DMSO(500mL)中之溶液添加至反應混合物中。攪拌混合物5分鐘。使混合物升溫至100℃，攪拌8小時且冷卻至24℃。添加水(5.9L)及DCM(5.9l)，過濾混合物且分離各層。用水(5.9L)洗滌有機層，獲得含標題化合物之DCM溶液，其不經進一步純化即使用。
製備30 N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-胺基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺鹽酸鹽
將氫氧化鈉(28.7g)及水(2.7L)添加至N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙醯胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺(250g，494.4mmol)之DCM溶液中且在24℃下攪拌混合物68小時。添加1N HCl(3.5L)以獲得1-3之pH值。分離各層且用DCM(680mL)萃取水層。將DCM(4L)添加至水溶液中，繼而添加21%氫氧化銨，獲得8-10之pH值。分離各層且合併有機萃取物，經由矽膠(170g)過濾且用DCM(1.4L)洗滌。濃縮溶劑至乾且用EtOAc(4L)稀釋。在低於25℃之溫度下添加1N HCl之EtOAc溶液(700mL)且攪拌混合物1小時。濃縮混合物至約7-8份體積且添加EtOAc(2.8L)。過濾所得沈澱且用EtOAc(400mL)洗滌。乾燥固體，得到標題化合物(246g，52%)。
製備31 N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺
將乙酸酐(23.5g，0.23mol)添加至N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-胺基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺鹽酸鹽(100g，0.153mol)及三乙基胺(54.3g，0.535mol)於DCM(800mL)中之溶液中。在20-25℃下攪拌1小時後，添加飽和NaHCO3(700mL)及水(600mL)。分離各層，得到標題化合物，其不經進一步 純化即以DCM溶液形式使用。
製備32 N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在0℃下在氮氣氛圍下冷卻[(3R,4S)-1-烯丙基-4-胺基-4-(2-氟苯基)吡咯啶-3-基]甲醇(129.7g,414mmol)於THF(2.3L)中之溶液。在保持溫度低於5℃下添加異硫氰酸苯甲醯酯(61.5mL，456mmol)。使反應物經3小時升溫至室溫，添加1,1'-羰基二咪唑(87.4g，538.9mmol)且在22℃下攪拌反應物1小時，繼而在70℃下加熱16小時。冷卻反應混合物至22℃且蒸發溶劑。使殘餘物分配於EtOAc(1L)與水(1L)中。分離有機層且用EtOAc(2×400mL)萃取水層。合併有機相，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發至乾，得到粗標題化合物。藉由矽膠層析用0-40% DCM之EtOAc/DCM之梯度溶離純化粗產物，得到呈淡黃色固體狀之標題化合物(170g，99%)，其含有殘餘溶劑。ES/MS(m/e)：396(M+1)。
製備33 2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苯甲酯
將1,1'-羰基二咪唑(2.87g，17.7mmol)添加至3-(苯甲醯基硫代胺甲醯基胺基)-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸苯甲酯 (5.198g，8.86mmol)於THF(52mL)中之溶液中。在室溫下攪拌混合物1.5小時，隨後在回流下在氮氣下加熱反應物隔夜。冷卻反應物，用水稀釋且用EtOAc(3×)萃取。合併有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠以30分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.93g，58%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)。568/570(M+H)
製備34 N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺
將三苯基膦(4.0g，0.015mol)及1,3-二甲基巴比妥酸(15.2g，0.097mol)添加至N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺(0.153mol)之DCM溶液中。添加乙酸鈀(1.7g，7.7mmol)且在20至30℃下攪拌混合物1小時。添加25%氫氧化銨且分離各相。用HOAc(3.0當量，於500水中)洗滌有機層且用25%氫氧化銨調節pH值至8-9。用DCM(2×500mL)萃取水層。合併有機萃取物且濃縮至3-4份體積。添加MTBE(1L)，且過濾混合物。濃縮混合物且添加庚烷(1L)。過濾所得固體，收集且乾燥，得到標題化合物(48g，76%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：2.15(s,3H),2.87-2.83(m,1H),3.43-3.23(m,5H),3.70-3.67(m,1H),7.12-7.07(m,1H),7.28-7.27(m,1H),7.52-7.41(m,4H),7.79(m,1H),8.18-8.16(m,2H)。ES m/z 413.1(M+1)。
製備35 N-[(4aR,7aS)-7a-(3-溴苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
藉由在室溫下使氮氣鼓泡通過所得漿液5分鐘將N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(1g，2.19mmol)及N,N-二甲基巴比妥酸(0.868g，5.48mmol)於氯仿(22mL)中之室溫混合物脫氣。用肆(三苯基膦)鈀(0.261g,219μmol)處理混合物且在氮氣下攪拌1.5小時。在各別燒瓶中，將N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(22.2g，48.6mmol)及N,N-二甲基巴比妥酸(19.28g，121.6mmol)於氯仿(486mL)中之混合物藉由在室溫下使氮氣鼓泡穿過所得漿液5分鐘脫氣。用肆(三苯基膦)鈀(5.79g，4.86mmol)處理混合物且在氮氣下攪拌2小時。合併兩種反應物且在真空中移除溶劑以得到粗產物。經矽膠以30分鐘0.5%至10%甲醇之DCM梯度純化粗物質，得到標題化合物(22.4g，100%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)416/418(M+H)。
製備36 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣氛圍下將2-巰基-苯甲酸(122g，793mmol)、雙(二苯亞甲基)鈀(4.15g，7.21mmol)及1,4-雙(二苯基膦基)丁烷(3.14g，7.21 mmol)添加至N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(178.21g，360mmol)於無水2-甲基四氫呋喃(1.96L)中之溶液中。將溶液藉由真空/氮氣循環三次脫氣，隨後使氮氣鼓泡通過反應物15分鐘。加熱反應混合物至40℃，同時使氮氣鼓泡通過反應物。當反應物達到40℃時，移除鼓泡且在40℃下在氮氣氛圍下攪拌反應混合物3小時。將反應物22℃且用水(2L)稀釋。添加HCl(5M)以調節pH值至1。分離水層且再用EtOAc(2×800mL)洗滌。用氫氧化鈉50% w/w調節水層之pH值至10，隨後用EtOAc(10L)萃取。再用EtOAc(2×750mL)洗滌水層。合併有機萃取物，用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發至乾，得到呈淡黃色固體狀之粗標題化合物(124.7g，97%)。ES/MS(m/e)：356(M+1)。
製備37 N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將碘三甲基矽烷(2.21mL，15.46mmol)逐滴添加至2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸苯甲酯(2.93g，5.15mmol)於乙腈(44mL)中之室溫溶液中。在室溫下攪拌反應物2小時且在真空中移除溶劑。用SCX管柱使用3：1 DCM：甲醇隨後2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.098g，94%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)434/436(M+H)。
製備38 (4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯
依序用二碳酸二第三丁酯(8.81g，40.36mmol)及三乙胺(7.67mL，55.04mmol)處理N-[(4aR,7aS)-7a-(3-溴苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(22.4g，36.69mmol)於DCM(367mL)中之室溫溶液，且在室溫下在氮氣下攪拌反應物1小時。在真空中移除溶劑且經矽膠用25分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(20.22g，100%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)516/518(M+H)。
製備39 2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-二氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯
將二碳酸二第三丁酯(1.16g，5.31mmol)及三乙胺(1.01mL，7.25mmol)添加至N-[7a-(5-溴-2-二氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(2.098g，4.83mmol)於DCM(48mL)中之溶液中。在室溫下在氮氣下攪拌反應物1小時。在真空中移除溶劑且經矽膠用30分鐘5%至100% EtOAc之己烷溶液的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.556g，99%)。ES/MS(m/e)：(79Br/81Br)534/536(M+H)。
製備40 (4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯
用疊氮化鈉(1.30g，19.4mmol)處理(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-(3-溴苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(5g，9.7mmol)及反-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(220.3mg，1.5mmol)於乙醇(100mL)中之溶液。添加L抗壞血酸鈉鹽(0.66M，3.2mL，2.1mmol)及水(10mL)之水溶液且用氮氣吹掃燒瓶之頂部。用五水合硫酸銅(II)之水溶液(0.33M，3.2mL，1.1mmol)處理混合物且在80℃下在氮氣下於預熱加熱板上立即加熱混合物1.5小時。加熱後獲得均勻混合物。冷卻反應物且添加冰水。用EtOAc(3×)萃取混合物。合併有機層且經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗疊氮產物。將粗疊氮產物與10%鈀/碳(2g)於冷乙醇(150mL)中組合且依序使用真空/氮氣及真空/氫氣吹洗混合物。在室溫下在30psi氫氣下攪拌混合物2小時。將反應物排出且經由矽藻土過濾混合物，使用DCM沖洗濾餅。在真空中自濾液移除溶劑且經矽膠用50% EtOAc之DCM溶液純化粗產物，得到標題化合物(4g，91%)。ES/MS(m/e)：453(M+H)。
製備41 7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯
用疊氮化鈉(933mg，14.3mmol)處理2-苯甲醯胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(2.556g，4.8mmol)及反-N,N'-二甲基-1,2-環己烷二胺(150mg，1.1mmol)於 乙醇(50mL)中之溶液。添加L抗壞血酸鈉鹽(0.66M，3.2mL，2.1mmol)及水(1mL)之水溶液且用氮氣吹掃燒瓶之頂部。用五水合硫酸銅(II)之水溶液(0.33M，3.2mL，1.1mmol)處理混合物且在80℃下在氮氣下於預熱加熱板上立即加熱混合物1.5小時。加熱後獲得均勻混合物。冷卻反應物，用冰水稀釋且用EtOAc(3×)萃取混合物。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗疊氮產物。將粗疊氮產物與10%鈀/碳(1g)於冷乙醇(150mL)中組合且依序使用真空/氮氣及真空/氫氣吹洗混合物。在室溫下在30psi氫氣下攪拌混合物5小時。排出反應物，經由矽藻土過濾且用DCM沖洗濾餅。在真空中自濾液移除溶劑且經矽膠用50% EtOAc之DCM溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.014g，89%)。ES/MS(m/e)：471(M+H)。
製備42 (4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-[3-[(5-氟吡啶-2-羰基)胺基]苯基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯
用DIPEA(179.2μL，1.03mmol)處理(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(93mg，0.21mmol)、5-氟吡啶-2-甲酸(31.9mg，0.23mmol)、1-羥基苯并***水合物(56.7mg，0.41mmol)及EDCI(40mg，0.21mmol)於含有二甲基甲醯胺(1ml)之DCM(4mL)中之漿液且在室溫下攪拌所得混合物隔夜。用DCM(5mL)及飽和碳酸氫鈉水溶液(15mL)稀釋反應混合物。分離有機層且用氯化鈉飽和水溶液(10mL)洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗標題化合物(105mg， 89%)。ES/MS(m/e)：576(M+H)。
製備43 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；2,2,2-三氟乙酸
將(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-7a-[3-[(5-氟吡啶-2-羰基)胺基]苯基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(105mg，0.18mmol)溶解於DCM(2mL)中且用三氟乙酸(500μL，6.6mmol)處理。在室溫下攪拌所得黃色溶液4小時且在真空中移除溶劑，得到粗標題產物(190mg，100%)。ES/MS(m/e)：476(M+H)。
製備44 N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將三氟乙酸(25mL)添加至(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(4g，8.84mmol)於DCM(100mL)中之溶液中且在室溫下在氮氣下攪拌混合物4小時。在真空中移除溶劑且用SCX管柱依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.49g，80%)。 ES/MS(m/e)：353(M+H)。
製備45 N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
將三氟乙酸(10mL)添加至7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁酯(2.013g，4.28mmol)於DCM(30mL)中之溶液中且在室溫下在氮氣下攪拌混合物4小時。在真空中移除溶劑且用SCX管柱依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化粗產物，得到標題化合物(1.555g，98%)。ES/MS(m/e)：371(M+H)。
製備46 N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣下加熱N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(2.49g，7.06mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(3.74g，28.26mmol)及DIPEA(6.16mL，35.32mmol)於1,4-二噁烷(60mL)中之溶液至回流後維持4小時。冷卻反應物，用水稀釋且用EtOAc(3×)萃取。經硫酸鈉乾燥經合併之有機萃取物，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗產物。經矽膠以25分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(2.51g，79%)。ES/MS (m/e)：449(M+H)。
製備47 N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
加熱N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(124.7g，256mmol)、DIPEA(67mL)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3ml，307mmol)於N-甲基吡咯啶酮(997mL)中之溶液至100℃後維持16小時。冷卻反應物至22℃且在保持溫度低於15℃下倒入10℃冷卻水(10L)中。藉由過濾收集淺奶油色固體且再用水洗滌。將濕固體溶解於EtOAc(2L)中且轉移至分液漏斗。添加氯化鈉水溶液5% w/w(1L)且分離有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且將濾液在減壓下蒸發。藉由矽膠層析使用0-40% EtOAc/異己烷之梯度純化產物，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物(116g，70%)。ES/MS(m/e)：452(M+1)。
製備48 N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺
將2-氯-5-氟嘧啶(28.9g，218mmol)及碳酸鉀(33.46g，242.1mmol)添加至N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六 氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺(50g，121.22mmol)於DMF(100mL)中之溶液中。加熱混合物至80-85℃後維持8小時。冷卻混合物至24℃，過濾且用DMF(100mL)洗滌。將固體於水(2L)中製成漿液且過濾，獲得標題化合物(68.5g，98%)。LC-MS：m/z=509.2(M+1)+,1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ ppm 1.22(t,J=7.28Hz,2 H)1.92-2.07(m,6 H)2.89-3.20(m,2 H)3.36-3.44(m,1 H)3.67(t,J=9.54Hz,1 H)3.84(br.s.,1 H)4.16(br.s.,2 H)7.23(br.s.,2 H)7.35-7.61(m,8 H)7.77(br.s.,2 H)7.85-8.18(m,4 H)8.48(s,4 H)10.15(br.s.,1 H)10.46-10.59(m,1 H)。
製備49 (4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
將氫氧化鋰(8.6g，204.9mmol)添加至N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙醯胺基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲醯胺(80g，157.3mmol)於甲醇(400mL)中之溶液中。加熱混合物至60-70℃後維持4小時。添加濃HCl(132g)且在55℃下攪拌混合物18小時。冷卻混合物至30℃且濃縮以移除甲醇。添加水且用DCM(3×)萃取水層，獲得920g水溶液形式之標題化合物，其中總質量之5.6%為標題化合物，其不經進一步純化即使用。
製備50 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺
在40℃下於DMSO(5mL)中加熱N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；2,2,2-三氟乙酸(150mg，254μmol)、5-氟-2-氯嘧啶(68mg，51μmol)及DIPEA(98μL，56μmol)之溶液隔夜。再添加5-氟-2-氯嘧啶(68mg，51μmol)及DIPEA(98μL，56μmol)且在50℃下加熱混合物隔夜。再添加5-氟-2-氯嘧啶(68mg，51μmol)及DIPEA(98μL，56μmol)且在50℃下加熱混合物隔夜，持續三夜。冷卻反應物，用飽和碳酸鈉水溶液(50mL)稀釋，得到漿液，過濾且在50℃下在真空烘箱中乾燥4小時，得到標題化合物(60mg，41%)。ES/MS(m/e)：449(M+H)。
替代性製備50
將N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(282mg，628.73μmol)及5-氟吡啶-2-甲酸(106.46mg，754.47μmol)於DCM(3mL)及二甲基甲醯胺(0.5mL)中組合。依序添加HOBT(112.70mg，817.35μmol)及EDCI(159.07mg，817.35μmol)且在室溫下在氮氣下攪拌所得混合物5小時。用水稀釋反應混合物且用1N NaOH調節pH值至約12。用EtOAc(3×)萃取混合物。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗產物。經矽膠以20分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(327mg，91%)。ES/MS(m/e)：571(M+H)。
製備51 N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺
在氮氣下於1,4-二噁烷(20mL)中加熱N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(705mg，1.90mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01g，7.61mmol)及DIPEA(1.66mL,9.52mmol)之溶液至回流後維持4小時。冷卻反應物，用水稀釋且用EtOAc(3×)萃取。合併有機層且經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑，得到粗產物。經矽膠以25分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(590mg，66%)。ES/MS(m/e)：467(M+H)。
製備52 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺
將N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(400mg，891.81μmole)及5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(165mg，1.07mmol)於DCM(4mL)及二甲基甲醯胺(0.5mL)中組合。依序添加HOBt(160mg，1.16mmol)及EDCI(226mg，1.16mmol)且在室溫下在氮氣下攪拌所得混合物5小時。用水稀釋反應混合物且用1N NaOH調節pH值至約12。用EtOAc(3×)萃取混 合物。經硫酸鈉乾燥經合併之有機萃取物，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠以20分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化粗產物，得到標題化合物(482mg，92%)。ES/MS(m/e)：585(M+H)。
製備53 N-[3-[2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺
將N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(302mg，647μmol)及5-氟吡啶-2-甲酸(110mg，777μmol)於DCM(3mL)及二甲基甲醯胺(0.5mL)中組合。依序添加HOBT(116mg，842μmol)及EDCI(164mg，842μmol)且在室溫下在氮氣下攪拌混合物隔夜。用水稀釋反應混合物且用1N NaOH調節pH值至約12，隨後用EtOAc(3×)萃取。合併有機層且過濾，收集不溶性物質。用水及EtOAc洗滌固體且在真空下乾燥，得到標題化合物。將濾液之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠用20分鐘5%至100% EtOAc於己烷中的梯度溶液純化殘餘物，再得到標題化合物，其合併產量為(275mg，72%)。ES/MS(m/e)：590(M+H)。
製備54 N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(異構體1)
藉由對掌性HPLC(管柱：Chiralcel OJ，8×35cm；溶離劑：90%甲醇(0.2%二甲基乙胺)及10%乙腈；在UV 280nm下，流速400mL/min)純化外消旋N-[7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(1.694g，3.63mmol)。第一溶離異構體之分析(管柱：Chiralcel OJ-H 0.46×15cm；溶離劑：10：90乙腈：甲醇(含有0.2%二甲基乙胺)；在UV 280nm下，流速：0.6mL/min)確定對映異構性增濃(99% ee)對映異構體(723mg，43%)，其中Rt=6.70分鐘。ES/MS(m/e)：467(M+H)。
製備55 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(異構體1)
將N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.361g，0.77mmol，異構體1)溶解於DCM(4mL)與DMF(0.5mL)之混合物中。將5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240mg，1.55mmol)、HOBT(210mg，1.55mmol)及EDCI(300mg，1.55mmol)添加至混合物中且在室溫下攪拌混合物隔夜。將反應溶液直接添加於12g矽膠負載管柱上且使用40g矽膠管柱及用0-100% EtOAc/己烷梯度溶離純化。將產物溶解於 EtOAc(200mL)中，用1N NaOH(2×50mL)及鹽水(1×50mL)洗滌。如上所述重複矽膠純化，得到標題化合物(350mg，74%)。ES/MS(m/e)：603(M+H)。
製備56 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺
將N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.30g，0.67mmol)溶解於DCM(10mL)中且添加5-氰基吡啶-2-甲酸(129mg，0.87mmol)、HOBt(185mg，1.34mmol)及EDCI(169mg，0.87mmol)。添加DIPEA(0.35mL，2mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。用矽膠層析用0-100% EtOAc/己烷梯度溶離直接純化該物質，得到標題化合物(360mg，88%)。ES/MS(m/e)：579(M+H)。
製備57 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺
將N-[(4aR,7aS)-7a-(3-胺基苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.30g，0.67mmol)溶解於DCM(10mL)中且添加3,5-二氟吡啶-2-甲酸(138mg，0.87mmol)、HOBT(185mg，1.34mmol)及EDCI(169mg，0.87mmol)。添加Dipea(0.35mL，2mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。用矽膠層析用0-100% EtOAc/己烷梯度溶離直接純化反應物，得到標題化合物(330mg，84%)。ES/MS(m/e)：590(M+H)。
製備58 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(異構體1)
將N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.180g，0.39mmol，異構體1)溶解於DCM(2mL)與DMF(0.25mL)之混合物中。添加5-氰基吡啶-2-甲酸(114mg，0.77mmol)、HOBt(106mg，0.77mmol)及EDCI(150mg，0.77mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。用水(10mL)、EtOAc(10mL)稀釋混合物且添加至1N NaOH之溶液(100mL)中。用EtOAc(2×100mL)萃取混合物，合併有機層且用鹽水洗滌。經MgSO4乾燥有機層，過濾且濃縮。經矽膠層析使用0-100% EtOAc/己烷梯度純化殘餘物，得到標題化合物(133mg，57%)。ES/MS(m/e)：597(M+H)。
製備59 N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺(異構體1)
將N-[(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(0.180g，0.39mmol，異構體1)溶解於DCM(2mL)與DMF(0.25mL)之混合物中。添加5-氰基吡啶-2-甲酸(114mg，0.77mmol)、HOBt(106mg，0.77mmol)及EDCI(150mg，0.77mmol)且在室溫下攪拌反應物隔夜。用水(10mL)及EtOAc(10mL)稀釋混合物，隨後倒入1N NaOH之溶液(100mL)中。用EtOAc(2×100mL)萃取混合物，合併有機萃取物且用鹽水洗滌。經MgSO4乾燥有機層，過濾且濃縮。經由矽膠層析使用0-100% EtOAc/己烷梯度純化殘餘物，得到標題化合物(190mg，80%)。ES/MS(m/e)：608(M+H)。
製備60 (4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
將氫氧化鋰(9.26g，386mmol)添加至N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(158.6g，351.6mmol)於甲醇(1.6L)中之混合物中。在70℃下加 熱混合物4小時，隨後冷卻至22℃。在真空下蒸發反應混合物，得到黃色殘餘物。使殘餘物分配於水(1L)與EtOAc(750mL)中。添加HCl(5M水溶液)以調節pH值至1。分離水層且用EtOAc(2×200mL)萃取有機層。用氫氧化鈉50% w/w水溶液調節水層之pH值至pH=10且用EtOAc(3×1L)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下蒸發，得到呈淺黃色固體狀之粗標題化合物(133.3g，99%，含有12%殘餘EtOAc)。ES/MS(m/e)：348(M+1)。
製備61 (4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺
將硫酸(33.4ml，626.6mmol)添加至(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8g，125.3mmol)於三氟乙酸(626mL)中之溶液中。將混合物冷卻至0℃且攪拌20分鐘。添加發煙硝酸(6.2mL，144.1mmol)，使反應混合物升溫至22℃且攪拌3小時。蒸發反應混合物，添加MTBE(250mL)且蒸發兩次。在真空下乾燥殘餘物至恆重，隨後溶解於水(147mL)及乙醇(885mL)中且用鼓泡之氮氣脫氣15分鐘。將溶液轉移至壓力反應器且添加10% Pd/C漿料型87L(6.6g，6.27mmol)。再用乙醇(700mL)稀釋混合物且用氫氣在80psi下加壓16小時。過濾反應混合物，隨後添加10% Pd/C漿料型87L(6.6g，6.27mmol)之第二催化劑饋料，加壓混合物至80psi且在壓力反應器中攪拌3天。用氮氣吹掃反應混合物且經矽藻土過濾。蒸發濾液且使殘餘物分配於水(200ml)與EtOAc(200mL)之間。分離水層，冷卻至5℃且用氫氧化銨15% w/w中和。用EtOAc (3×150mL)萃取水層。合併有機相，經硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下蒸發，得到呈淡棕色固體狀之標題化合物(47.7g，99%，含有殘餘EtOAc)。ES/MS(m/e)：363(M+1)。
實例A N-[3-[2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺
在加蓋之燒瓶中在乙醇(13mL)中加熱N-[3-[2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺(293mg，497μmol)、O-甲基羥基胺鹽酸鹽(430mg，4.97mmol)及吡啶(402μL，4.97mmol)之混合物至70℃後維持2.5小時。添加DMSO(3mL)且在70℃下加熱混合物隔夜。再添加DMSO(10mL)且在70℃下繼續加熱4小時。再添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(208mg，2.48mmol)及吡啶(201μL，2.48mmol)，加熱混合物至60℃後維持3小時且在室溫下攪拌混合物3天。在各別燒瓶中，在70℃下在加蓋之燒瓶中在乙醇(15mL)及DMSO(4mL)中加熱N-[3-[2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺(276mg，468μmol)、O-甲基羥基胺鹽酸鹽(405mg，4.68mmol)及吡啶(478μL，4.68mmol)之混合物隔夜。再添加DMSO(10mL)且在70℃下繼續加熱4小時。再添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(195mg，2.34mmol)及吡啶(189μL，2.34mmol)且在70℃下繼續加熱3小時，繼而在室溫下攪拌混合物3天。合併兩種反應混合物且在真空中移除大多數溶劑。於SCX管柱上依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化粗產物。經矽膠用20分鐘含0.5%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液進一步純化粗產物，得到標題化合物(451mg，96%)。ES/MS(m/e)：486(M+H)。
實例1 N-{3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]苯基}-5-氟吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
在65℃下於加蓋之小瓶中加熱N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺(320mg，560μmol)、O-甲基羥基胺鹽酸鹽(485mg，5.60mmol)及吡啶(453μL，5.60mmol)於乙醇(15mL)中之混合物五小時。冷卻反應物且在真空中移除溶劑。經矽膠用30分鐘0.5%至10% 7N氨之甲醇溶液與DCM的梯度溶液純化粗產物，得到N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺(219mg，84%)。將此物質溶解於DCM(1mL)及甲醇(0.5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.47mL，470μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(228mg，81%)。ES/MS(m/e)：468(M+H)。
實例2 N-{3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]苯基}-5-甲氧基吡嗪-2-甲醯胺鹽酸鹽
在50℃下於加蓋之燒瓶中加熱N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(479mg，819μmol)、O-甲基羥基胺鹽酸鹽(709mg，8.19mmol)及吡啶(663μL，8.19mmol)於乙醇(20mL)中之混合物隔夜。添加DMSO(4mL)且加熱混合物至70℃後維持4小時，獲得溶液。冷卻反應物且在真空中移除大多數溶劑。添加水且用1N氫氧化鈉將pH值調節至約12。用EtOAc(5×)萃取混合物。經硫酸鈉乾燥經合併之有機萃取物，過濾且在真空中移除溶劑。經矽膠用30分鐘含0.5%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液純化粗產物。再次於SCX管柱上依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化混合物以移除殘餘DMSO。經矽膠用20分鐘含0.5%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液純化混合物，得到N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。將此物質溶解於DCM(1mL)及甲醇(0.5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.66mL，660μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(329mg，78%)。ES/MS(m/e)：481(M+H)。
實例3 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
藉由SFC(管柱：Chiralcel OD-H(5μm)，2.1×25cm；溶離劑：含40%甲醇(0.2%異丙胺)之CO2；在UV 225nm下，流速70mL/min)對掌性純化外消旋N-[3-[2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺(451mg，929μmol)。第一溶離異構體之對掌性分析(管柱：Chiralcel OD-H(5μm)，4.6×150mm；溶離劑：含40%甲醇(0.2%異丙胺)之CO2；在UV 225nm下，流速5mL/min)確定對映異構性增濃(>99% ee)對映異構體(175mg，360μmole)，其Rt=1.01分鐘。將此物質(游離鹼，異構體1)溶解於DCM(1mL)及甲醇(0.5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.36mL，360μmole)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(183mg，38%)。ES/MS(m/e)：486(M+H)。
實例4 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺鹽酸鹽.
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(0.350g，0.58mmol，異構體1)溶解於THF(2mL)中，隨後添加甲醇(4mL)及乙醇(4mL)。將O-甲基羥基胺鹽酸鹽(495mg，5.81mmol)及 吡啶(470μL，5.81mmol)添加至混合物中且使反應物升溫至50℃且攪拌隔夜。將矽膠(約10g)添加至反應物中且濃縮混合物。將於矽膠上乾燥之樣品裝載於空管柱上且用含0-10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液溶離純化。於SCX管柱上依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液第二次純化產物。最後一次用含0%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液，經矽膠純化產物，得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於DCM(5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.20mL，660μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(71mg，23%)。ES/MS(m/e)：498(M+H)。
實例5 結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(水合).
將乙腈(500mL)添加至二甲基甲醯胺(19.2mL，248.9mmol)中。依序將乙二醯氯(39.3g，309.63mmol)及5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4mmol)添加至二甲基甲醯胺溶液中。於另一個分開燒瓶中，將(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8g，156.75mmol)之水溶液添加至乙腈(500mL)中且用氫氧化銨(95mL)調節pH值至9。隨後將此混合物加熱至50-55℃。逐滴添加該酸氯化物溶液且攪拌混合物3小時。用氫氧化銨調節pH至8-9。過濾所得沈澱物，用水洗滌且乾燥，獲得標題化合物(123g)。將固體於丙酮(250mL)中製成漿液歷時1.5小時且過濾。用丙酮洗滌濕濾餅，獲得標題化合物(110g，藉由HPLC發現純度為90.5%)。將THF(1L)及活性碳(9g)添加至固體中且加熱混合物至回流隔夜。經由矽藻土過濾混合物且用THF(150mL)洗滌。濃縮有機溶液至10份體積且加熱至60℃。添加水(430mL)且在60 ℃下攪拌混合物8小時。冷卻混合物至室溫且攪拌10小時。過濾所得固體，用THF/水(7：6)洗滌且乾燥，得到標題化合物(69g，88%)，LC-MS：m/z=499(M+1)，純度：98.3%。1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ ppm 2.99-3.07(m,2 H)3.07-3.14(m,1 H)3.58-3.67(m,1 H)3.68-3.76(m,1 H)3.76-3.84(m,1 H)4.02(s,3 H)4.07(d,J=10.92Hz,1 H)6.08(s,2 H)7.19(dd,J=11.98,8.72Hz,1 H)7.78-7.89(m,2 H)8.41(s,1 H)8.44(s,2 H)8.88(s,1 H)10.60(s,1 H)。
X射線粉末繞射(XRD)
在配備有CuKα源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器且在35kV及50mA下操作的Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRD圖。樣品以2θ在4°與40°之間掃描，其中2θ之步長為0.009°且掃描速率為0.5秒/步，且發散度為為0.6mm，固定抗散射性為5.28，且偵測器狹縫為9.5mm。將乾燥粉末裝填於石英樣品固持器中且使用玻璃載片獲得光滑表面。在環境溫度及相對濕度下收集結晶形式繞射圖。結晶學技術中已熟知，對於任何既定結晶形式，由於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之較佳取向，繞射峰之相對強度可能變化。在存在較佳取向之影響的情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如The United States Pharmacopeia #23,National Formulary #18，第1843-1844頁，1995。此外，結晶學技術中亦熟知，對於任何既定結晶形式，角峰位置可略微變化。舉例而言，峰位置可能由於分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品移位或內標存在或不存在而偏移。在本發明之情況下，2θ之±0.2之峰位置變化將考慮此等潛在變化而不妨礙明確鑑別指定結晶形式。結晶形式之確認可基於區別性峰，通常為更顯著之峰(以°2θ為單位)之任何獨特組合來進行。在環境溫度及相對濕度下收集之結晶形式繞射圖基於8.853及26.774° 2θ之NIST 675標準峰調節。
結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之製備樣品藉由XRD圖使用CuKa輻射表徵為具有如下表2中所述之繞射峰(2-θ值)。特定言之，圖案在11.8°處含有峰，其中一或多個峰選自由18.6°、19.3°及26.7°組成之群；其中繞射角之公差為0.2度。
實例6 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(360mg，0.59mmol)溶解於乙醇(10mL)及DCM(2mL)中。添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(504mg，5.91mmol)及吡啶(478μL，5.91mmol)且在室溫下攪拌反應物度過週末(70小時)。使反應物升溫至60℃且攪拌24小時。濃縮反應物，得到粗產物，且經由矽膠層析使用含0-10% 7N氨之甲醇 溶液之DCM的梯度溶液純化，得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於DCM(5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.54mL，540μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(240mg，75%)。ES/MS(m/e)：475(M+H)。
實例7 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]苯基]-3,5-氟-吡啶-2-甲醯胺(330mg，0.53mmol)溶解於THF(10mL)中且用乙醇(10mL)稀釋。添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(453mg，5.32mmol)及吡啶(430μL，5.91mmol)且在室溫下攪拌反應物度過週末(70小時)。使反應物升溫至60℃且攪拌24小時。於矽膠(約10g)上濃縮混合物且經由矽膠層析使用含0-10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液純化，得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於DCM(5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.49mL，490μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(159mg，54%)。ES/MS(m/e)：486(M+H)。
實例8 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-氰基-吡啶-2-甲醯胺(133mg，0.22mmol，異構體1)溶解於THF(1mL)中且用甲醇(3mL)及乙醇(3mL)稀釋。添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(190mg，2.2mmol)及吡啶(180μL，2.2mmol)。使反應物升溫至50℃且攪拌隔夜。於矽膠(約10g)上濃縮混合物且經由矽膠層析用含0-10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液溶離純化。於SCX管柱上依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液第二次純化該物質。最後一次經矽膠用含0%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液純化混合物，得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於DCM(5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.27mL，270μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(114mg，97%)。ES/MS(m/e)：493(M+H)。
實例9 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺鹽酸鹽
將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲醯胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺(190mg，0.31mmol，異構體1)溶解於THF(1mL)中且用甲醇(3mL) 及乙醇(3mL)稀釋。添加O-甲基羥基胺鹽酸鹽(267mg，3.1mmol)及吡啶(253μL，3.1mmol)，使反應物升溫至50℃且攪拌隔夜。於SCX管柱上依序使用3：1 DCM：甲醇及2：1 DCM：7N氨之甲醇溶液純化反應物。最後一次經矽膠用含0%至10% 7N氨之甲醇溶液之DCM的梯度溶液純化該物質，得到標題化合物之游離鹼。將此物質溶解於DCM(5mL)中且添加1M鹽酸之***溶液(0.20mL，200μmol)。在真空中移除溶劑，得到標題化合物(101mg，60%)。ES/MS(m/e)：504(M+H)。
實例10 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-3,5-二氟-吡啶-2-甲醯胺
將乙二醯氯(10.5ml，136.4mmol)添加至3,5-二氟吡啶甲酸(19.9g，125mmol)於乙腈(617mL)及二甲基甲醯胺(10.5mL)中之溶液中。攪拌30分鐘後，將溶液添加至(4aR,7aS)-7a-(5-胺基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(41.1g，113mmol)於乙醇(823mL)/水(823mL)之預熱至50℃之混合物中的新鮮製備溶液中。在50℃下維持反應1小時。冷卻反應混合物至22℃且蒸發溶劑。用DCM(1L)稀釋水溶液且用2M氫氧化鈉調節pH值至pH=11。分離有機層，且再用DCM(2×400mL)洗滌水層。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發至乾。藉由矽膠層析使用0-10% DCM之胺化甲醇2N/DCM之梯度純化粗物質，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(45g，78%)。ES/MS(m/e)：504(M+1)。
活體外分析程序：
為進行活體外酶學及細胞分析，於DMSO中製備測試化合物以製成10mM儲備溶液。在進行活體外酶學及全細胞分析前，用DMSO連續稀釋儲備溶液，獲得十點稀釋曲線，其中在96孔圓底盤中最終化合物濃度在10mM至0.05nM範圍內。
活體外蛋白酶抑制分析： 人類BACE1之表現
藉由RT-PCR自總腦cDNA選殖人類BACE1(寄存編號：AF190725)。將對應於胺基酸序列#1至460之核苷酸序列***編碼人類IgG1(Fc)多肽之cDNA中(參見Vasser等人，Science,286,735-741(1999))。將BACE1(1-460)及人類Fc之此融合蛋白(稱為huBACE1：Fc)建構於pJB02載體中。將人類BACE1(1-460)：Fc(huBACE1：Fc)短暫表現於HEK293細胞中。將各構築體之250μg cDNA與Fugene 6混合且添加至1公升HEK293細胞中。轉染後四天，收集條件培養基進行純化。
huBACE1：Fc之純化
藉由蛋白A層析純化huBACE1：Fc。以小等分試樣在-80℃下儲存酶。
BACE1 FRET分析
如上所述製備測試化合物之連續稀釋液。進一步用KH2PO4緩衝液20倍稀釋化合物。將10μL各稀釋液添加至含有反應混合物(25μL 50mM KH2PO4，pH 4.6，1mM TRITON® X-100，1mg/mL牛血清白蛋白及15μM FRET受質)之相應低蛋白質結合黑色盤之A至H列上的各孔中(參見Yang等人，J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。將內含物在盤震盪器上充分混合10分鐘。將15μL 200pM人類BACE1(1-460)：Fc(參見Vasser等人，Science,286,735-741(1999))於KH2PO4緩衝液中之溶液添加至含有受質及測試化合物之盤中以引發反應。在於盤震盪器上短暫混合後，在激發波長355nm及發射波長460nm下記錄時 間0時混合物之RFU。用鋁箔覆蓋反應盤且在室溫下保持於黑暗潮濕烘箱中16至24小時。在培育結束時記錄RFU，其中激發及發射設定與時間0時所用相同。時間0時與培育結束時之差值表示在化合物處理下BACE1之活性。相對於抑制劑濃度繪製RFU差值，且將曲線擬合四參數對數方程式，獲得EC50及IC50值。(參見Sinha等人，Nature,402,537-540(2000))。
以下例示性化合物基本上如上所述進行測試且對BACE1展現以下活性：
平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差
此等資料展示表3之化合物在活體外抑制經純化重組BACE1酶活性。
量測β-分泌酶活性之抑制的全細胞分析 HEK293Swe全細胞分析
量測β-分泌酶活性之抑制的常規全細胞分析使用穩定表現人類APP751 cDNA之人胚腎細胞株HEK293p(ATCC寄存編號CRL-1573)，其含有天然存在之Lys651Met652至Asn651Leu652之雙突變(通常稱為瑞典突變(標註為HEK293Swe))且展示過度產生Aβ(Citron等人，Nature, 360,672-674(1992))。活體外Aβ減少分析已描述於文獻(參見Dovey等人，Journal of Neurochemistry,76,173-181(2001)；Seubert等人，Nature,361,260(1993)；及Johnson-Wood等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA,94,1550-1555(1997))中。
在37℃下在所要濃度之抑制劑(用DMSO稀釋)存在/不存在下培育細胞(HEK293Swe，每孔3.5×104個細胞，該孔含有200μL培養基，即含有10% FBS之DMEM)4至24小時。在培育結束時，分析條件培養基以證明β-分泌酶活性，例如藉由分析Aβ肽來證明。藉由夾心ELISA使用單株266作為捕捉抗體且使用經生物素標記之3D6作為報導抗體量測總Aβ肽(Aβ 1-x)。或者，藉由夾心ELISA使用單株2G3作為Aβ 1-40之捕捉抗體且使用單株21F12作為Aβ 1-42之捕捉抗體量測Aβ 1-40及Aβ 1-42肽。Aβ 1-40與Aβ 1-42 ELISA均使用經生物素標記之3D6作為報導抗體。化合物處理後條件培養基中所釋放之Aβ之濃度對應於此類條件下BACE1之活性。繪製10點抑制曲線且擬合四參數對數方程式，獲得針對Aβ降低作用之EC50及IC50值。以下例示性化合物基本上如上所述測試且對Aβ降低作用展現以下活性：
此等資料展示表4之化合物抑制全細胞中之天然Aβ產生。
PDAPP原代神經元分析
亦在自PDAPP轉殖基因胚胎小鼠產生的原代神經元培養物中進行確認性全細胞分析。自第16天胚胎之PDAPP胚胎製備原代皮層神經元且於96孔盤(15×104個細胞/孔，於DMEM/F12(1：1)加上10% FBS中)中培養。活體外2天後，將培養基用不含血清且含有B27補充劑及2μM(最終)Ara-C(Sigma，C1768)之DMEM/F12(1：1)替換。在活體外第 5天，在37℃下在所要濃度之抑制劑(用DMSO稀釋)存在/不存在下培育神經元24小時。在培育結束時，分析條件培養基以證明β-分泌酶活性，例如藉由分析Aβ肽來證明。藉由夾心ELISA使用單株266作為捕捉抗體且使用經生物素標記之3D6作為報導抗體量測總Aβ肽(Aβ 1-x)。或者，藉由夾心ELISA使用單株2G3作為Aβ 1-40之捕捉抗體且使用單株21F12作為Aβ 1-42之捕捉抗體量測Aβ 1-40及Aβ 1-42肽。Aβ 1-40與Aβ 1-42 ELISA均使用經生物素標記之3D6作為報導抗體。化合物處理後條件培養基中所釋放之Aβ之濃度對應於此類條件下BACE1之活性。繪製10點抑制曲線且擬合四參數對數方程式，獲得針對Aβ降低作用之EC50及IC50值。以下例示性化合物基本上如上所述測試且對Aβ降低作用展現以下活性：
平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差
此等資料展示表5之化合物抑制全細胞中之Aβ產生。
活體內抑制β分泌酶
可使用數種動物模型(包括小鼠、天竺鼠、狗及猴)篩檢化合物處理後活體內對β分泌酶活性之抑制。本發明中所用動物可為野生型、轉殖基因或基因剔除動物。舉例而言，如Games等人，Nature 373,523-527(1995)中所述製備之PDAPP小鼠模型及其他非轉殖基因或基因剔除動物適用於分析在抑制化合物存在下對Aβ及sAPPβ產生之活體 內抑制。一般而言，向2至12個月齡之PDAPP小鼠、基因剔除小鼠或非轉殖基因動物投與在媒劑中調配之化合物，該等媒劑諸如玉米油、環葡聚糖、磷酸鹽緩衝液、PHARMASOLVE®或其他適合媒劑。投與化合物後一至二十四小時，處死動物且移出腦以及腦脊髓液及血漿以供Aβ、C99及sAPP片段分析。(參見May等人，Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011))。
為進行標準活體內藥理學研究，給與動物各種濃度之化合物，且與經媒劑處理之同時給與之對照組比較。為進行某段時程研究，自所選動物獲得腦組織、血漿或腦脊髓液，該等研究在時間0時開始以建立基線。投與其他組化合物或適當媒劑且在給藥後之各種時間處死。自所選動物獲得腦組織、血漿或腦脊髓液且例如藉由特定夾心ELISA分析來分析APP裂解產物(包括Aβ肽、sAPPβ及其他APP片段)之存在。在測試階段結束時，處死動物且按需要分析腦組織、血漿或腦脊髓液中Aβ肽、C99及sAPPβ之存在。亦可分析化合物處理後APP轉殖基因動物之腦組織中β澱粉樣斑塊之量。如本文所用之「Aβ 1-x肽」係指以殘基1開始且以大於殘基28之C端封端的Aβ物質之總和。此偵測大部分Aβ物質且通常稱為「總Aβ」。
相較於媒劑處理之對照或時間零時對照，投與抑制性化合物之動物(PDAPP或其他APP轉殖基因或非轉殖基因小鼠)可展示腦組織、血漿或腦脊髓液中Aβ或sAPPβ減少及腦組織中β澱粉樣斑塊減少。投與幼齡雌性PDAPP小鼠1、3或10mg/kg經口劑量之實例1化合物後三小時，相較於媒劑處理小鼠，分別地，Aβ 1-x肽含量在腦海馬區中降低約34%、48%及53%，且在腦皮質中降低約43%、59%及66%。
投與1或3mg/kg經口劑量之實例3化合物後三小時，相較於媒劑處理小鼠，分別地，Aβ 1-x肽含量在腦海馬區中降低約38%及50%，且在腦皮質中降低約34%及53%。
對於實例4，投與0.3、1或3mg/kg經口劑量之化合物後3小時，相較於媒劑處理小鼠，分別地，Aβ 1-x肽含量在腦海馬區中降低約31%、39%及61%，且在腦皮質中降低約28%、42%及64%。
給定活體外實例1、3及4對BACE酶之活性的情況下，此等Aβ降低作用與活體內BACE抑制一致，且進一步展示實例1、3及4之CNS滲透。
此等研究展示實例1至9之化合物抑制BACE，因此適用於降低Aβ含量。
組合研究 BACE抑制劑餵養初步研究
在用含有BACE抑制劑(諸如式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽)之飲食餵養的PDAPP小鼠中執行初步藥物動力學及藥效動力學研究以確定僅藉由BACE抑制提供最少至顯著血漿及腦Aβ降低的劑量。以3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg之「準一日兩次」相等劑量用含有含BACE抑制劑之飲食的膳食餵養幼齡PDAPP小鼠14天。將每公克經鑑定之嚙齒動物膳食#8728CM(Harlan labs)約0.05、0.15、0.5或1.5mg BACE抑制劑於Sorvall混合器中混合10分鐘，隨後用Hobart混合器混合15分鐘，隨後粒化。將三十二隻幼齡雌性PDAPP小鼠根據親本品系隨機分成由媒劑處理組及三個BACE抑制劑劑量組所組成之4組，一組8隻。使小鼠隨意獲取食物持續14天，隨後處死。用CO2麻醉小鼠且藉由心臟穿刺將血液收集於塗佈EDTA之微型離心管中且儲存於冰上。隨後，藉由在室溫下在14,000rpm下離心血液樣品4分鐘收集血漿，轉移至未處理之微型離心管，隨後冷凍於乾冰上且在-80℃下儲存直至分析為止。藉由斷頭術處死小鼠，將腦快速微切成一半，快速冷凍於乾冰上且儲存在-80℃下直至分析為止(一半用於Aβ分析且另一半用於化合物暴露量測)。為分析實質性Aβ，將腦樣品在5.5M胍 -HCl緩衝液(每一半腦0.5mL)中用組織破碎機(985-370型)以速度5均質化約1分鐘。在室溫下將均質化腦樣品下垂隔夜。
為進行Aβ ELISA分析，收集萃取物且用酪蛋白緩衝液(1×PBS，其具有0.25%酪蛋白、0.05% Tween 20、0.1%硫柳汞，pH 7.4；以及蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P9340，在0.01mg/mL下))至少1：10稀釋且在14000rpm下離心10分鐘。為分析血漿Aβ，用試樣緩衝液(PBS；0.05% TritonX-405；0.04%硫柳汞、0.6% BSA)1：2稀釋樣品，隨後藉由ELISA分析。藉由夾心ELISA分別使用m266.2(抗Aβ13-28)及經生物素標記之3D6(抗Aβ1-5)作為捕捉及報導抗體測定血漿人類Aβ1-x。一式兩份分析未知樣品且藉由內插(Soft Max Pro v.5.0.1，Molecular Dynamics，使用參照曲線之4參數擬合)自8點標準曲線測定pg/mL，隨後調節稀釋度。如上所述藉由夾心ELISA測定實質性Aβ且將值標準化為蛋白含量(藉由布拉福考馬斯普拉斯蛋白法(Bradford Coomassie Plus Protein method)一式兩份地測定)且表示為皮克/毫克蛋白質。
為測定BACE抑制劑之組織及血漿含量，採用以下方法：用甲醇/水(1：1，v/v)連續稀釋BACE抑制劑之0.1mg/mL儲備溶液以製備工作溶液，隨後用於強化對照血漿及腦勻漿以得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000ng/mL之分析物濃度。分析前，將腦樣品在3份體積甲醇/水(1：4，v/v)中用超音波破碎機均質化。將各研究樣品之等分試樣、適當校準標準物及對照基質樣品轉移至96孔盤，隨後與含有內標之乙腈混合。混合後，將樣品離心以粒化所沈澱之蛋白質。隨後將所得上清液之等分試樣轉移至潔淨96孔盤，用甲醇/水(1：1，v/v)稀釋且藉由LC-MS/MS分析10微升等分試樣。使用藉由校準曲線樣品之多次回歸測定的反應與濃度關係式計算分析物濃度。
活體內組合研究
為評估抗N3pGlu Aβ單株抗體(諸如抗N3pGlu-Aβ單株抗體VII(參見表1，mE8c-IgG2a；如美國專利第8,679,498 B2號；USSN 13/810,895中所述))與BACE抑制劑(諸如式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽)之組合斑塊降低療法，首先將一大群PDAPP小鼠老化至16至18個月齡。將經老化PDAPP小鼠基於性別、親本品系及年齡隨機分成五個處理組。每個處理組存在20至30隻經老化PDAPP小鼠。第1組在研究開始之時間零時處死以測定在治療處理之前病變之基線水準(下述屍檢)。隨後如下處理四個剩餘組：第2組，對照動物接受安慰劑飲食且每週注射12.5mg/kg對照同型IgG2a抗體；第3組，動物每週接受12.5mg/kg抗N3pGlu-Aβ單株抗體注射；第4組，動物以初步餵養研究中預先規定之劑量(但通常為約3至30毫克/公斤/天)接受BACE抑制劑飲食；第5組，動物接受BACE抑制劑飲食(約3至30毫克/公斤/天)且每週注射12.5mg/kg抗N3pGlu-Aβ單株抗體。自由抗體於PBS緩衝液中之溶液組成之無菌儲備溶液稀釋抗N3pGlu-Aβ單株抗體且藉由腹膜內注射投與動物。將BACE抑制劑與鬆軟飲食(視所要劑量而定，每公克餵料約0.15至1.5mg化合物)混合且壓製成餵料丸粒。在研究開始時記錄動物重量，隨後對於第一個月處理每週記錄，隨後對於研究持續時間每月記錄。亦在研究過程期間以規則時間間隔監測食物攝入。動物接受研究處理總共4個月。動物保持其各別飲食直至為屍檢止，此在最終抗體注射後一週進行。在屍檢之時，將動物麻醉且藉由使用EDTA預沖洗1ml注射器心臟穿刺獲得血液。於冰上收集血液樣品且藉由標準離心分離血漿。隨後，用冷肝素化生理食鹽水灌注動物，移出腦且切成左半球與右半球。將一個腦半球快速冷凍且保存以供組織學分析。將剩餘腦半球切成由海馬區、皮質、小腦及中腦組成之組織區段，隨後於乾冰上冷凍。將血漿及組織樣品儲存在-80℃下直至分析時為止。
藥物動力學評估
對屍檢時獲得之血漿樣品測定血漿藥物動力學。在抗原結合ELISA分析中測定血漿抗體含量，其中用抗原(Aβp3-42)塗佈培養盤，隨後與經稀釋血漿樣品或由抗N3pGlu單株抗體於分析緩衝液(PBS+對照鼠類血漿)中之連續稀釋液組成的參考標準物一起培育。洗滌培養盤後，用抗鼠類HRP結合抗體偵測結合之鼠類抗體，繼而用TMB顯色。為測定BACE抑制劑之組織(中腦)及血漿含量，採用以下方法：用甲醇/水(1：1，v/v)連續稀釋BACE抑制劑之0.1mg/mL儲備溶液以製備工作溶液，隨後用於強化對照血漿及腦勻漿以得到1、5、10、20、50、100、500、1000、2000、4000及5000ng/mL之分析物濃度。分析前，將腦樣品在3份體積甲醇/水(1：4，v/v)中用超音波破碎機均質化。將各研究樣品之等分試樣、適當校準標準物及對照基質樣品轉移至96孔盤，隨後與含有內標之乙腈混合。混合後，將樣品離心以粒化所沈澱之蛋白質。隨後將所得上清液之等分試樣轉移至潔淨96孔盤，用甲醇/水(1：1，v/v)稀釋且藉由LC-MS/MS分析10微升等分試樣。使用藉由校準曲線樣品之多次回歸測定的反應與濃度關係式計算分析物濃度。
藥效動力學評估
藉由夾心ELISA測定胍溶解之組織勻漿中的實質性Aβ濃度。用珠粒打漿機技術進行組織提取，其中在pH 8.0下在1ml 5.5M胍/50mM Tris/0.5×蛋白酶抑制劑混合物中於含有1ml矽化玻璃珠之2ml深孔盤中提取冷凍組織(將密封盤震盪兩個時間間隔，各3分鐘)。藉由夾心ELISA分析所得組織溶解物的Aβ1-40及Aβ1-42：用2% BSA/PBS-T 1：10稀釋珠粒打漿機樣品且經由樣品過濾盤(Millipore)過濾。進一步用0.55M胍/5mM Tris於2% BSA/PBST中稀釋樣品、空白、標準物、品質對照樣品，隨後裝載樣品盤。用樣品稀釋劑稀釋參考標準物。將塗 佈有15μg/ml捕捉抗體21F12(抗Aβ42)或2G3(抗Aβ40)之培養盤與樣品一起培育，且依序用以2%BSA/PBS-T稀釋之經生物素標記之3D6(抗Aβ1-x)及用2% BSA/PBS-T 1：20 K稀釋之中性抗生物素蛋白-HRP(Pierce)實現偵測，且用TMB(Pierce)顯色。將Aβ含量自標準曲線內插且以每毫克組織濕重Aβ之奈克數計算最終組織濃度。組織學上測定海馬區及皮質中由沈積之Aβ佔據的面積百分比。將連續冠狀面(7至10μm厚)與10μg/ml經生物素標記之3D6(抗Aβ1-x)或陰性對照鼠類IgG(經生物素標記)一起在低溫恆溫器中培育。採用特異於生物素之二次HRP試劑，且用DAB-Plus(DAKO)觀測沈積之Aβ。在海馬區或皮質內之相關規定區域中藉由分析用Image Pro plus軟體(Media Cybernetics)捕獲之影像定量免疫反應性Aβ沈積物。
此等研究可展示抗N3pGlu-Aβ單株抗體與BACE抑制劑(諸如式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽)之組合療法可引起相對於個別單一療法增加之Aβ降低。
序列清單
<SEQ ID NO：1；PRT1；人工>(LCDR1-B12L/R17L)KSSQSLLYSRGKTYLN
<SEQ ID NO：2；PRT1；人工>(LCDR2-B12L/R17L)AVSKLDS
<SEQ ID NO：3；PRT1；人工>(LCDR3-B12L/R17L)VQGTHYPFT
<SEQ ID NO：4；PRT1；人工>(HCDR1-B12L)GYDFTRYYIN
<SEQ ID NO：5；PRT1；人工>(HCDR1-R17L)GYTFTRYYIN
<SEQ ID NO：6；PRT1；人工>(HCDR2-B12L/R17L) WINPGSGNTKYNEKFKG
<SEQ ID NO：7；PRT1；人工>(HCDR3-B12L)EGITVY
<SEQ ID NO：8；PRT1；人工>(HCDR3-R17L)EGTTVY
<SEQ ID NO：9；PRT1；人工>(LCVR-B12L/R17L)
<SEQ ID NO：10；PRT1；人工>(HCVR-B12L)
<SEQ ID NO：11；PRT1；人工>(HCVR-R17L)
<SEQ ID NO：12；PRT1；人工>(LC-B12L/R17L)
<SEQ ID NO：13；PRT1；人工>(HC-B12L)
<SEQ ID NO：14；PRT1；人工>(HC-R17L)
<110> 美國禮來大藥廠派翠克 梅 達斯汀 莫高
<120> 組合療法
<130> P20348
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 8
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 11
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13
<210> 14
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14

Claims (12)

  1. 一種醫藥組合物，其包含下式之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，與具有抗N3pGlu Aβ單株抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物之組合。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該抗N3pGlu Aβ單株抗體為B12L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：10之重鏈可變區；或R17L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：11之重鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該抗N3pGlu Aβ單株抗體為B12L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：10之重鏈可變區。
  4. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該化合物為N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。
  5. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該化合物為結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2- 胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之特徵為在X射線繞射光譜之繞射角2-θ 11.8°處具有大峰，其中一或多個峰選自由18.6°、19.3°及26.7°組成之群；其中繞射角公差為0.2度。
  7. 一種下式化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途， 其用於製造供與抗N3pGlu Aβ單株抗體組合用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之藥物。
  8. 如請求項7之用途，其中該抗N3pGlu Aβ單株抗體為B12L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：10之重鏈可變區；或R17L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：11之重鏈可變區。
  9. 如請求項7或8之用途，其中該抗N3pGlu Aβ單株抗體為B12L，其包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變區及SEQ ID NO：10之重鏈可變區。
  10. 如請求項7或8之用途，其中該化合物為N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。
  11. 如請求項7或8之用途，其中該化合物為結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。
  12. 如請求項11之用途，其中該結晶形式2 N-[3-[(4aR,7aS)-2-胺基-6- (5-氟嘧啶-2-基)-4a,5,6,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a(4H)-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之特徵為在X射線繞射光譜之繞射角2-θ 11.8°處具有大峰，其中一或多個峰選自由18.6°、19.3°及26.7°組成之群；其中繞射角公差為0.2度。
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