TW201209063A - Anti-tenascin-C A2 antibodies and methods of use - Google Patents

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TW201209063A
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tnc
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Anne Freimoser-Grundschober
Ralf Hosse
Christian Klein
Ekkehard Moessner
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
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Roche Glycart Ag
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201209063 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於對健生蛋白-C(tenasciii-C)之A2结構域 (TNC A2)具有特異性之抗體。另外，本發明係關於編碼此 等抗體之多核苷酸、及包含此等多核苷酸之載體及宿主細 胞。本發明進一步係關於產生該等抗體之方法及其在治療 疾病中之使用方法》 【先前技術】 腱生蛋白C及抗腱生蛋白C抗艘 腱生蛋白係在脊椎動物中發現之大的多聚體細胞外基質 (ECM)糖蛋白之高度保守家族。已在哺乳動物中鑑別出4 種腱生蛋白旁系同源物（paral〇gue)，其稱為腱生蛋白_c、 腱生蛋白-R、腱生蛋白_χ及腱生蛋白-W。腱生蛋白家族 蛋白具有共同一級結構，包含Ν末端七重複（hepud repeat)、表皮生長因子（Egf)樣重複、m型纖連蛋白 (fibr〇nectin)結構域重複及c末端纖維蛋白原樣球形結構 域。個別亞單位經由N末端寡聚結構域組裝成三聚體或（在 腱生蛋白-C之情形下）甚至六聚體。 哺乳動物腱生蛋白-C單體通常具有所有腱生蛋白_c亞型 共有之14.5個EGF樣重複及8個111型纖連蛋白結構域重複。 然而，可藉由選擇性剪接（aUernatively splicing)獨立地包 括或排除多至9個其他m型纖連蛋白結構域重複（結構域^ 至D)，從而產生大量腱生蛋白< 亞型（例如，參見Hsia及 Schwarzbauer, J Biol Chem 280, 26641-26644 (2005)) 〇 157262.doc 201209063 腱生蛋白-c在發育胚胎中瞬時表現，但幾乎不存在於成 人組織中。然而，其會在經受重構過程（包括諸如傷口癒 合、發炎及癌症等某些病理狀況）之組織中再次出現（綜述 於 Chiquet-Ehrismann 及 Chiquet，J Pathol 200，488-499 (2003)中）。 重要的是，腱生蛋白-C在大多數惡性實體瘤（包括腦 瘤、乳瘤、結腸瘤、肺瘤、皮膚瘤及其他器官之腫瘤）中 高度表現（綜述於 Orend 及 Chiquet-Ehrismann，Cancer Letters 244, 143-163 (2006)中），其中其可由經轉化上皮細 胞以及間質細胞在腫瘤微環境中表現（Y〇shida等人，j
Pathol 182，421-428 (1997) ; Hanamura等人，Int j Cancer 73，10-15 (1997)中特定而言，含有選擇性剪接結構域 Α1至D之腱生蛋白_c之「大亞型」在侵潤性癌瘤中表現， 而在健康成人組織中幾乎不可檢測（B〇rsi等人，int j
Cancer 52，688-692 (1992) ; Camemolla 等人，Eur j Biochem 205, 561-567 (1992)) 〇 其表現模式使腱生蛋白-C、尤其其選擇性剪接結構域成 為腫瘤把向應用之有前景之抗原，且因此已研發出多種抗 該蛋白之若干結構域之抗體（例如，參見Brack等人，Clin
Cancer Res 12, 3200-3208 (2006)或 EP 1 817 345，其闡述 抗腱生蛋白-C之A1結構域之抗體；Silacci等人，prot Eng Des Sel 19, 471-478 (2006)或 EP 1 173 766，其闡述抗腱生 蛋白-C之C結構域之抗體；\Vang等人，Hybridoma 29，13_ 16 (2010)，其闡述抗腱生蛋白c之D結構域之抗體；或 157262.doc 201209063
Balza等人，FEBS 332, 39-43 (1993)，其闡述若干抗人類 腱生蛋白之不同結構域之抗體）。 最近，亦已闡述識別人類腱生蛋白-C之A2結構域中特異 性表位之抗體（WO 2009/089998)。 抗體糖基化 寡糖組份可顯著影響與治療性糖蛋白之功效有關之性 質，包括物理穩定性、對蛋白酶攻擊之抗性、與免疫系統 之相互作用、藥物代謝動力學及特定生物活性。該等特性 不僅可取決於存在或不存在寡糖，且亦取決於寡糖之特定 結構。在寡糖結構與糖蛋白功能之間可得到一些概論。舉 例而言，某些寡糖結構經由與特定碳水化合物結合蛋白相 互作用來調介快速清除血流中之糖蛋白，而另一些則可與 抗體結合並觸發不期望之免疫反應（Jenkins等人，Nature Biotechnol 14, 975-81 (1996))。
IgGl型抗體係癌症免疫療法中最常用之抗體，其係在每 一 CH2結構域中之Asn297處具有保守N-連接糖基化位點之 糖蛋白。兩種附接至Asn297之複雜雙觸角寡糖隱藏在CH2 結構域之間，與多肽骨架形成廣泛接觸，且其存在對抗體 介導諸如抗體依賴性細胞介導細胞毒性（ADCC)等效應子 功能而言至關重要（Lifely等人，Glycobiology 5，. 813-822 (1995) ; Jefferis等人，Immunol Rev 163，59-76 (1998); Wright及 Morrison，Trends Biotechnol 15，26-32 (1997)) 〇 蛋白質改造研究已顯示，FcYR與IgG CH2結構域之較低鉸 鏈區相互作用。Lund 等人，J. Immunol. 157:4963-69 157262.doc 201209063 (1996)。然而，FcyR結合亦需要在CH2區中存在寡糖。 Lund 等人，J. Immunol. 157:4963-69 (1996) ; Wright 及 Morrison，Trends Biotech. 15:26-31 (1997)，從而表明， 寡糖與多肽二者皆直接決定相互作用位點，或需要寡糖來 維持活性CH2多肽構象。因此，對寡糖結構之修飾可作為 增強IgGl與FcyR之間之相互作用之親和力及增強IgGl之 ADCC活性之手段來探究。 一種顯著提高單株抗體效能之方式係藉由改造其寡糖組 份來增強其細胞介導之天然效應子功能，如Umaiia等人， Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)及美國專利第 6,602,684 號（WO 99/54342)中所述，該等文獻之内容以全文引用方 式併入本文。Umafia等人顯示，β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基 轉移酶III (GnTIII)(催化形成二等分型（bisected)寡糖之糖 基轉移酶）在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中之過表現顯著增強 彼等細胞中所產生抗體之活體外ADCC活性。GnTIII在產 生細胞系中之過表現產生富含二等分型寡糠之抗體，該等 寡糖通常亦係非岩藻糖基化且為雜合型。若除GnTIII外， 在產生細胞系中亦過表現甘露糖苷酶II (Manll)，則獲得 富含複雜類型之二等分型非岩藻糖基化寡糖之抗體 (Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006))。與具 有未經修飾聚糖之抗體相比，兩種類型之抗體皆顯示大大 增強之ADCC，但僅多數N-聚糖屬於複雜類型之抗體能夠 誘導顯著的補體依賴性細胞毒性（Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006))。對 Asn 297 碳水化合物之組成 157262.doc 201209063 之改變或其消除亦影響抗體Fc-結構域與FcYR及補體Clq蛋 白之結合，此分別對於ADCC及CDC而言至關重要（Umafia 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999); Davies等人， Biotechnol Bioeng 74，288-294 (2001) ; Mimura等人，J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001) ; Radaev等人，J Biol Chem 276，16478-16483 (2001) ; Shields 等人，J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001) ; Shields等人，J Biol Chem 277，26733-26740 (2002) ; Simmons等人，J Immunol 方法 263, 133-147 (2002))。 【發明内容】 本發明提供特異性結合腱生蛋白-C之抗體，該等抗體具 有高親和力及/或增強之效應子功能。 在一個態樣中，本發明係關於特異性結合TNC A2之抗 體，其包含至少一個（即1個、2個、3個、4個、5個或6個） 以下中所述互補決定區（CDR) : SEQ ID NO 3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、 35、37、39、41、43、45及47 »在一個實施例中，該抗體 包含選自以下之3個重鏈CDR(即HCDR1、HCDR2及 HCDR3)及/或 3個輕鏈CDR(即 LCDR1、LCDR2及LCDR3): SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25 、 27 、 29 、 31 、 33 、 35 、 37 、 39 、 41 、 43 、 45及47 ° 在 一更特定實施例中，該抗體包含選自以下中所述重鏈及輕 鏈可變區序列之抗體重鏈可變區及/或抗體輕鏈可變區、 尤其同時具有重鏈及輕鏈之可變區：SEQ ID NO 55、57、 157262.doc 201209063 59、61、63、65、67、69 ' 71、73、75、77、79 83、85、87、89及9i。在一個實施例中，該抗體包含& 區、尤其IgG Fc區。在又一實施例中，抗體係全長抗體、 尤其IgG類抗體。在另一實施例中’抗體包含人類抗體值 定區。在一個實施例中’抗體係人類。在一個實施例中， 抗體經糖改造以在Fc區中具有經修飾寡糖。在—個實施例 中，與非糖改造抗體相比，該抗體在Fc區中具有提言比例 之非岩藻糖基化及/或二等分型寡糖。在又一實施S中， 該抗體具有增強之效應子功能及/或增強之^受體結合親 和力。在-特定實施例中’增強之效應子功能係增強：抗 體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)。在另一實施例 中，抗體以低於約1 μΜ、較佳低於約1〇〇 nM、最佳低於 約1 nM2KD值結合人類TNC Α2β在―個實施例中，㈣ 係親和力成熟的。在一個實施例中，抗體結合人類組織中 之 TNC Α2。 用-玄抗體尤其用於治療特徵在於表現tnc Α2之疾病（例如 癌症）之方法。 在其他態樣中，本發明亦係 核苷酸、宿主細胞及表現载體 關於製備該抗體之方法。在又 關於與抗體有關之多肽、多 。在又一態樣中，本發明係 一態樣中，本發明係關於使 【實施方式】 I·定義 出於本文目的， 球蛋白框架或人類 觉體人類框架」係包含源自人類免疫 #有框架之輕鏈可變結構域（VL)框架或 157262.doc 201209063 重鍵可變結構域（VH)框架之胺基酸序列的_，如下文所 疋義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受 =人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸 列變化。在-些實施例中，胺基酸變化之數量為1〇或更 小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4 或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，％受體 人類框架t序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共 有框架序列相同。 親和力」係指分子（例如，抗體）之單一結合位點與其 結合配偶體（例如，抗原）間之非共價相互作用之總強度。 =非另有說明，否則本文㈣「結合親和力」係指反映結 合對成員（例如，抗體及抗原）間之1:1相互作用的固有結合 親和力。分子X對其配偶體γ之親和力通常可由解離常數 (KD)表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數（分別 為k解*及k締合）之比率。因此，等效親和力可包含不同速率 常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由業内已 头之吊用方法來量測親和力’包括彼等本文所述者。用於 里測結合親和力之具體闡釋性及實例性實施例闡述於下文 中。 親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比 在—或多個高變區域（HVR)(例如CDR)中具有一或多個改 變（例如胺基酸突變）的抗體，此等改變使得可改良抗體對 於抗原之親和力❶通常，親和力成熟抗體結合與親代抗體 相同之表位。 157262.doc 201209063 術語「抗TNC A2抗體」及「結合腱生蛋白_C之A2結構 域之抗體」係指能夠以足夠親和力結合TNC A2從而使該 抗體可用作靶向TNC A2中之診斷劑及/或治療劑的抗體。 在一個實施例中，抗TNC A2抗體與不相關非TNC A2蛋白 之結合程度小於該抗體與TNC A2之結合的約1〇%，如藉由 (例如）放射免疫分析（RIA)所量測。在某些實施例中，結合 TNC A2之抗體具有 $1 μΜ、幻00 nM、$10 nM、nM、 £0·1 nM、S0.01 nM或 $0.001 nM(例如 10·8 Μ或更小，例如 10·8 Μ至 ΙΟ·13 Μ，例如 ΙΟ·9 Μ至 ΙΟ·13 Μ)之解離常數（KD)。 在某些實施例中，抗TNC A2抗體結合在來自不同物種之 TNC A2中保守之TNC A2表位。 術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種 抗體結構’包括（但不限於）單株抗體、多株抗體、多特異 性抗體（例如’雙特異性抗體）及抗體片段，只要其展現期 望抗原結合活性即可。本發明亦包括具有F c區之抗體片段 及包3專效於免疫球蛋白之F c區之區域的融合蛋白。 「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗 體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實 例包括（但不限於）Fv、Fab、Fab，、Fab'-SH、F(ab，）2、單鍵 抗體分子（例如scFv)、雙特異性抗體及自抗體片段形成之 多特異性抗體。 「結合相同表位之抗體」（作為參考抗體）係指在競爭分 析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷5〇%或更高的抗體， 且反之’參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合 157262.doc •10· 201209063 阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。 術sf「抗原結合結構域」係指抗原結合分子中包含特異 性結合抗原之一部分或全部且與其互補之區域的一部分。 倘若抗原較大，則抗原結合分子可僅結合抗原之特定部 分，該部分稱為表位。抗原結合結構域可由（例如）一或多 個抗體可變結構域（亦稱為抗體可變區）提供。較佳地，抗 原結合結構域包含抗體輕鏈可變區（V L)及抗體重鏈可變區 (VH)。 術語「嵌合」抗體係指重鍵及/或輕鍵之一部分源自特 疋來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之剩餘部分源自不同來 源或物種的抗體。對於嵌合抗體而言，舉例而言，非抗原 結合組分可源自多種物種’包括靈長類動物，例如黑猩獲 及人類。人類化抗體係嵌合抗體之尤佳形式。 抗體之「類別」係指其重鏈所擁有之恆定結構域或恆定 區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及 IgM，且該等類別中之若干可進一步分成亞類（同種型）， 例如，IgG〗、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi 及 IgA2。對應於不 同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、 ε、γ及 μ 〇 本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能 及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括（但不 限於）放射性同位素（例如，At21丨、1丨3丨、I125、γ9〇、Re186、
Re 、Sm 、Bi212、P32、Pb212及 Lu之放射性同位素）； 化學治療劑或藥物（例如胺甲蝶呤、阿黴素（adriamicin)、 157262.doc 201209063 長春花生物驗類（vinca alkal〇ids)(長春新鹼、長春鹼、依 託/白苦（etop〇side))、多柔比星（doxorubicin)、美法命 (melphalan)、絲裂黴素 C、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、柔 紅黴素（daimombicin )或其他嵌入劑）；生長抑制劑；酶及 其片段’例如溶核酶；抗生素；毒素’例如細菌、真菌、 植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片 段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。 「效應子功能」係指彼等歸因於抗體之Fc區之生物活 性’其可隨抗體同種型而有所變化。抗體效應子功能之實 例包括.C1 q結合及補體依賴性細胞軎性（cdc) ; Fe受體 結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC);吞噬作 用；細胞因子分泌；免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗 原攝取；細胞表面受體（例如B細胞受體）之下調；及b細胞 活化。 藥劑（例如，醫藥調配物）之「有效量」係指在所需時間 段内以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。 術語「Fc區」在本文中用於界定免疫球蛋白重鏈中含有 怪定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列 Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類][gG重鏈Fc區自 Cys226、或自pr〇230延伸至重鏈之羧基末端。然而，可存 在或可不存在Fc區之C末端離胺酸（Lys447)。除非在本文 中另外指出’否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根 據亦稱為EU指數之EU編號系統，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public 157262.doc . j2- ⑧ 201209063
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。 「與免疫球蛋白Fc區等效之區域」意欲包括免疫球蛋白 Fc區之天然等位基因變體，以及具有可產生取代、添加或 缺失但不會顯著降低免疫球蛋白介導效應子功能（例如抗 體依賴性細胞介導之細胞毒性）之能力之改變之變體《舉 例而言，免疫球蛋白Fc區之N末端或C末端可缺失一或多 個胺基酸且不顯著損失生物功能。此等變體可根據業内已 知通用規則來選擇以對活性造成最小效應（例如，參見
Bowie，J. U.等人，Science 247:1306-10 (1990))。 「框架」或「FR」係指除高變區域（HVR)(或CDR)殘基 外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構 域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR^FR序列通 常出現於VH(或VL)中之下列序列中：fR1-H1(L1)_FR2_ H2(L2)-FR3-H3(L3：)_FR4。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中 可互換使用，其係指具有實質上與天然抗體結構相似之結 構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。 術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養 物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括 該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化細 胞」，其包括原代經轉化細胞及源自其之子代（與傳代次數 無關广子代與親代細胞之核酸含量可能並不完全相同， 但可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉化細 157262.doc -13- 201209063 胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。在一個實 施例中，宿主細胞經改造使得可產生具有經修飾寡糖之抗 體。在某些實施例中，宿主細胞已經進一步操作以表現提 南3量之一或多種具有β(ι，4)_n_乙醢基葡糖胺基轉移酶 (GnTIII)活性之多肽。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳 動物培養細胞，例如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、 SP2/0細胞、Y0骨髓瘤細胞、ρ3χ63小鼠骨髓瘤細胞、 PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細 胞及植物細胞，僅舉幾個例子，且亦包括轉基因動物、轉 基因植物或培養植物或動物組織中所含細胞。 「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺 基酸序列者.其由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗 體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗 體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗 體。 「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或 VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常， 人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變結構域序 列亞組。通常’序列亞組係如Kabat等人，Sequences of
Proteins of Immunological Interest，第 5版，>^111出版物91- 3242，Bethesda MD (1991)’第1-3卷中之亞組。在一個實 施例中，對於VL而言’亞組係如Kabat等人所述之亞組κ 1(參見上文）。在一個實施例中，對於VH而言，該亞組係 如Kabat等人（參見上文）所述之m亞組。 157262.doc -14- 201209063 「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基 及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例 中’人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩 個可變結構域’其中全部或實質上全部之HvR(例如， CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之 FR對應於人類抗體之彼等fr。人類化抗體視情況可包含 源自人類抗體之抗體怪定區的至少一部分。「人類化形 式」之抗體（例如，非人類抗體）係指已經受人類化之抗 體。 如本文所用術語「高變區域」或「HVR」係指抗體可變 結構域區域中序列具有高變性及/或形成結構上經界定之 環（「高變環」）中的每一者。通常，天然四鏈抗體包括6個 HVR ; 3個位於VH中（HI、H2、H3)，且3個位於VL中 (1^1、！^2、1^3)。1^11通常包括來自高變環及/或來自「互 補決定區域」（CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可 變性及/或參與抗原識別。除VH中之CDR1外，CDR通常包 含形成高變環之胺基酸殘基。高變區（HVR)亦稱作互補決 定區（CDR) ’且該等術語在本文中可參照可變區中形成抗 原結合區之部分互換使用。此特定區域已闡述於以下文獻 中：Kabat等人，美國衛生及人類服務部（u s Dept. 〇f
Health and Human Services)」，Sequences of Proteins of Immunological Interest」（1983)及 Chothia等人，J. Mol.
Biol. 196:901-917 (1987)，其中該等定義在彼此進行比較 時包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，本文所定義及使 157262.doc -15· 201209063 用之術語之範圍意欲涵蓋使用任一定義意指抗體或其變體 之CDR。涵蓋上文所引用參考文獻中之每一者定義之CDR 之合適胺基酸殘基展示於下表1中進行比較。涵蓋特定 CDR之確切殘基數量可隨CDR之序列及尺寸而變。給定抗 體之可變區胺基酸序列，彼等熟習此項技術者可以常規方 式確定包含特定CDR之殘基。 表1. CDR定義1 CDR Kabat Chothia AbM2 VH CDR1 31-35 26-32 26-35 VhCDR2 50-65 52-58 50-58 Vh CDR3 95-102 95-102 95-102 VL CDR1 24-34 26-32 24-34 VLCDR2 50-56 50-52 50-56 VL CDR3 89-97 91-96 89-97 157262.doc -16- ⑧ 1 表1中之所有CDR定義皆係根據Kabat等人所述之編號規定 來編號（參見下文）。 2 表1中所用具有小寫字母「b」之「AbM」係指由Oxford Molecular之「AbM」抗體建模軟體定義之CDR。
Kabat等人亦定義用於可變區序列且適用於任一抗體之 編號系統。熟習此項技術者不依賴除序列本身以外之任何 實驗數據即可明確地將此「Kabat編號」系統指定給任一 可變區序列。本文所用「Kabat編號」係指Kabat等人，國 衛生及人類服務部，「Sequence of Proteins of Immunological Interest」（1983)闡述之編號系統。除非另有說明，否則提 及在抗體可變區中對具體胺基酸殘基位置進行編號時係根 201209063 據Kabat編號系統。 CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸 抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR (abbreviated_ CDR)或a-CDR之區域内。一般而言，給定中僅i/5至 1/3殘基參與抗原結合。可藉由（例如）根據等人， FASEB J· 9(1):133_139 (1995)中所述方法自三維建模計算 原子間接觸並確定給定殘基位置處之序列可變性來鑑別特 疋CDR中之特異性決定殘基。實例性a CDR(a CDR Li、 CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR_H2Aa_CDR_H3) 出現於胺基酸殘基LI之31-34、L2之50-55、L3之89-96、 H1 之 31-35B、H2 之 50-58 及 H3 之 95-102 處（參見 Almagro 及
Fransson，Front· Bi〇sci 13:16191633 (2〇〇8))。除非另有 說明，否則在本文中根據Kabat等人（參見上文）來編號可變 結構域中之HVR殘基及其他殘基（例如，FR殘基）。 抗體偶聯物」係偶聯至細胞毒性劑之抗體。 「個體（individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包 括（但不限於）家養動物（例如，牛、綿羊、貓、狗及馬）、 靈長類動物（例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴 子）、兔及齧齒類動物（例如，小鼠及大鼠）。在某些實施例 中，個體係人類。 「經分離」抗體係自其天然環境組份分離者。在一些實 施例中’將抗體純化至具有大於95%或之純度，如藉 由（例如）電永（例如，SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細管 電冰）或層析（例如，離子交換或反相HPLC)方法所測定。 157262.doc -17· 201209063 關於評價抗體純度之方法之綜述，例如，參見^以爪⑽等
經为離」多核苷酸係指自天然環境組份分離之多核苷 酸分子。經分離多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子之細 胞中所$的多核苷酸分子.，但該多核苷酸分子存在於染色 體外或存在於與其天然染色體位\不同之染色體位置。 「編碼抗TNC A2抗體之經分離多核苷酸」係指編碼抗 體重鏈及輕鏈（或其片段）之一或多個多核苷酸分子，包括 單一載體或單獨載體中之此（等）多核苷酸分子 '及存在於 宿主細胞中一或多個位置處之此（等）多核苷酸分子。 本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群獲 得之抗體，亦即，包含該群之個別抗體相同及/或結合相 同表位，可旎之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在 產生單株抗體製劑期間產生，此等變體通常以較小量存 在。與通常編號針對不同決定簇（表位）之不同抗體的多株
一單株抗體針對抗原上 之單個決定簇。因此，修御語 抗體群獲得之抗體性質，且不 方法產生抗體。舉例而言，用 單株」表示自實質上同源
裸抗體」係^不與異源部分（例如，細胞毒性部分）或 157262.doc ⑧ 201209063 放射性標記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。 「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分 子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓（dalton)之 異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條 相同重鏈組成。自N-至C末端，每一重鏈依次具有可變區 (VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鍵可變結構域）及三個怔 定結.構域（CHI、CH2、及CH3)(亦稱為重鏈恆定區）。同 樣，自N端至c末端，每一輕鏈依次具有可變區域（V]L)(亦 稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域）及恆定輕鏈（cl) 結構域（亦稱為輕鏈恆定區）。基於抗體恆定結構域之胺基 酸序列’可將該抗體之輕鏈分為兩種類型中之一者，稱為 稱為κ型及λ型。 無貫質父又反應性」意指分子（例如，抗體）尤其在與 &抗原比較時不識別或特異性結合與自身不同之實際靶抗 原之抗原（例如與該靶抗原密切相關之抗原）。舉例而言， 抗體可結合小於約1〇%至小於約5%與實際靶抗原不同之抗 原，或可以選自由以下組成之群之量結合該與實際靶抗原 不同之抗原.小於約10%、9%、8%、7% ' 6%、5。/。、 ’4〇/〇、3%、2%、1%、〇.5%、〇·2% 或 〇 1%，較佳小於約 2%、1%或〇.5%，且最佳小於約〇2%或〇1%與實際乾抗原 抗原不同之抗原。 術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品商業包裝 内之說明t，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組 合療法、禁忌症及/或涉及該等治療產品使用之警告的資 157262.doc 201209063 訊0 術語「親代」抗體係指用作變體製備之起始點或基礎之 抗體。 就參考肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比（％)」定 義為在比對序列並引入空位（若需要）以達到最大序列一致 性百分比後候選序列中與參考肽序列中之胺基酸殘基一致 之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一 致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目 的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成， 例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技 術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較序列 之全長範圍内達成最大比對所需要之任何算法。然而，出 於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來產生胺基 酸序列一致性％之值。ALIGN-2序列對比電腦程式係由 Genentech公司設計，且原始碼與使用者文件已一起編入 美國版權局，Washington D.C.，20559中，其中其以美國版 權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公 司，South San Francisco, California公開獲得，或可自源 代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系 統（包括數位UNIX V4.0D)中》所有序列比較參數皆由 ALIGN-2程式設定且並不改變。 在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺 基酸序列A相對於（to)、與（with)或對（against)給定胺基酸 157262.doc -20· 201209063 序列B之胺基酸序列一致性％(或者可表達為相對於與或 對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性％ 之給定胺基酸序列A)計算如下： 10〇χ 分數 χ/γ 其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式AUGN_ 2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其十^係B中胺 基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等 於胺基酸序列B之長度，則a相對於B之胺基酸序列一 致性°/。將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性％。除非 另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性％ 的值皆係根據前面緊接段落中所述使用ALIGN_2電腦程 式獲得。 同樣，具有與本發明參考核苷酸序列至少（例如）95% 「一致」之核苷酸序列的核酸或多核苷酸意欲指多核苷酸 之核苷酸序列與參考序列一致，只是按參考核苷酸序列的 每100個核苷酸計，該多核苷酸序列可包括最多5個點突 變。換&之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95% 一致 之核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中最多5%核苷酸可 缺失或經另一核普酸取代’或可將佔參考序列中總核苷酸 最多5%之大量核苷酸***參考序列中。該等參考序列之 改變可發生在參考核苦酸序列之5,或3,末端位置或在彼等 末端位置之間之任何位置，其係、個別地散佈在參考序列殘 基中之各殘基之間或在參考序列内呈一或多4固鄰接基團形 式。實際上’可使用已知電腦程式（例如上文所歹,J示者）按 157262.doc •21· 201209063 償例確疋多核芽酸或多肽與本發明核普酸序列或 多肽序列是否為至少80%、85%、9〇%、95%、96%、 97%、98% 或 99%—致。 術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其呈現形式允許其 中所含活性成份之生物活性有效，且不含對投與調配物之 個體具有不可接受毒性的其他組份。 馐藥上可接爻之載劑」係指醫藥調配物中活性成份以 外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括（但不限 於）緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 除非另有說明，否則本文所用術語「腱生蛋白/之入之結 構域（TNC A2)」係指任一脊椎動物來源之任一天然TNC A2，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物（例 如人類）及齧齒類動物（例如小鼠及大鼠）^該術語涵蓋「全 長」未處理之TNC A2以及在細胞中處理產生之任一形式 的TNC A2。§玄術g吾亦涵蓋TNC A2之天然變體，例如剪接 變體或等位基因變體《實例性人類TNC A2(具有C端avi-標 籤及6x His-標籤）之胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 97中。 在人類腱生蛋白-C分子中，A2結構域係多至9個選擇性剪 接之ΠΙ型纖連蛋白結構域中之第二個結構域（自n端計 數）’其可***恆定III型纖連蛋白結構域之第5個結構域與 第6個結構域之間（關於腱生蛋白-C之結構域結構之示意 圖’參見例如 Orend 及 Chiquet-Ehrismann，Cancer Letters 244，143-163 (2006))。相似地，在小鼠腱生蛋白-C分子 中，A2係多至6個選擇性剪接之III型纖連蛋白結構域中之 157262.doc -22- ⑧ 201209063 第二結構域（闡述於 J〇estner 及 Faissner，J Bi〇1 Chem 274 17144-17151 (1999)中）。 本文所用「治療」（及其文法變化，例如「treat」或 「treating」）係、指意圖改變所治療個體之自然疾病過程的 L床介入’且可為預防目的或在臨床病理學過程期間實 施/σ療之期望效應包括（但不限於）防止疾病發生或復 發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、防 止轉移¥低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩 解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲 疾病發生或減緩疾病進展。 術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈 中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鍵及輕鏈 之可變結構域（分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中 各結構域包含4個保守框架區（FR)及三個高變區（hvR)。 (參見例如 Kindt 等人 Kuby Immunology，第 6 版，W.H.
Freeman and Co.，第 91 頁（2007)。）單一 VH 或 VL· 結構域可 足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可 使用結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選 互補VL或結構域之庫。參見例如Portolano等人，J.
Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson等人，Nature 352: 624-628 (1991)。 本文所用術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核 酸的核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以 及納入引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠 157262.doc •23- 201209063 引導與其可操作連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱 作「表現載體」。 本文所用術語「具有GnTIII活性之多肽」係指能催化將 N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)殘基以β-1-4鍵添加至N-連接寡 糖中三甘露糖基核心之β-連接甘露糖苷上之多狀。此多肽 包括表現類似於但不一定等同於β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基 轉移酶 111(根據 Nomenclature Committee of the International
Union of Biochemistry and Molecular Biology(NC-IUBMB) 亦稱作β-1,4-甘露糖基·糖蛋白4-β-Ν-乙醢葡糖胺基轉移酶 (EC 2.4.1.144))之酶活性之融合多肽，該活性係如特定生 物學分析中所量測且具有或不具有劑量依賴性。倘若確實 存在劑量依賴性，則其無需等同於GnTIII之活性，而係與 GnTIII相比實質上類似於給定活性之劑量依賴性（即，候選 多肽相對於GnTIII可展現較高活性，或其活性不小於 GnTIII的約二十五分之一、且較佳活性不小於約十分之 一，且最佳活性不小於約三分之一）。 本文所用術語「高爾基體定位結構域」係指高爾基體駐 留多肽之胺基酸序列，其負責將多肽錨定至高爾基複合體 内之位置。一般而言，定位結構域包含酶之胺基末端 「尾」。 認為尤其具有前綴「糖-」之本文所用術語「改造 (engineer，engineered，engineering」以及術語「糖基化改 造」包括對天然或重組多肽或其片段之糖基化模式之任一 操作。糖基化改造包括細胞糖基化機制之代謝改造（例如 157262.doc -24· 201209063 寡糖合成途徑之遺傳操作），以達成細胞中表現之糖蛋白 糖基化的改變。此外，糖基化改造包括突變及細胞環境對 糠基化之效應。在一個實施例中，糖基化改造係糖基轉移 酶活性之改變。在一特定實施例中，改造導致葡糖胺基轉 移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性改變。 本文所用術語「Fc介導細胞毒性」包括抗體依賴性細胞 介導之細胞毒性（ADCC)及含有人類Fc區之可溶Fc融合蛋 白介導之細胞毒性。其係引起「人類免疫效應細胞」溶解 「靶向細胞」之免疫機制。 本文所用術語「人類免疫效應細胞」係指在表面上展示 Fc受體之白細胞群’其經由該等以受體結合抗體或！^融合 蛋白之Fc區並實施效應子功能。此白細胞群可包括（但不 限於）外周血單核細胞（PBMC)及/或自然殺傷（NK)細胞。 本文所用術語「乾向細胞」係指結合包含F c區之抗原結 合分子（例如，包含Fc區之抗體或其片段）或Fc融合蛋白特 異性之細胞。抗原結合分子或Fc融合蛋白經由蛋白質部分 中Fc區之N末端結合靶細胞。 本文所用術語「增強之Fc介導細胞毒性」定義為在給定 時間内、在給定抗體或F c融合蛋白濃度下、在靶細胞周圍 培養基中藉由上文所定義之FC介導細胞毒性機制溶解之 「粗向細胞」數量的增加’及/或靶細胞周圍培養基中在 給定時間内藉由Fc介導細胞毒性機制使給定數量之「靶向 細胞」溶解所需之抗體或FC融合蛋白濃度之降低。Fc介導 細胞毒性之増強係相對於由相同抗原結合分子或Fc融合蛋 157262.doc' -25- 201209063 白介導之細胞毒性而言，該相同抗體或Fc融合蛋白係由相 同類型之宿主細胞使用相同標準製備、純化、調配及儲存 方法（其為彼等熟習此項技術者已知）來產生，但尚未藉由 經本文所述方法進行改造而具有經改變糖基化模式（例如 表現糖基轉移酶GnTIII或其他糖基轉移酶）之宿主細胞來產 生。 「具有增強的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC) 之抗體」意指藉由彼等熟習此項技術者已知之任一適宜方 法測得具有增強的ADCC之抗體（該術語如本文中所定 義）。一種普遍接受之活體外ADCC分析係如下： 1) 該分析使用已知可表現抗體之抗原結合區識別之靶抗 原之乾細胞； 2) 該分析使用自隨機選擇之健康供體血液中分離之人類 外周血單核細胞（PBMC)作為效應細胞； 3) 該分析根據以下方案來實施； i) 使用標準密度離心程序來分離PBMC且以5χ106個細胞 /ml將其懸浮於RPMI細胞培養基中； ii) 藉由標準組織培養方法來培養乾細胞，在生存力高於 900/。之指數生長期收穫細胞，在rpmI細胞培養基中洗條， 用100微居裏（micro-Curie)51Cr標記’用細胞培養基洗滌兩 次，並以105個細胞/ml之密度使其再次懸浮於細胞培養基 中； iii) 將100微升上述最終靶標細胞懸浮液轉移至96孔微量 滴定板的各孔中； 157262.doc -26· 201209063 iv) 在細胞培養基中將抗體自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml並將50微升所得抗體溶液添加至96孔微量滴定板中 之靶細胞甲，以一式三份測試覆蓋上述整個濃度範圍之各 種抗體濃度； v) 對於最大釋放（MR)對照’在板中3個含有經標記靶細 胞之其他孔中添加50微升2% (V/V非離子型去污劑水溶液 (Nonidet，Sigma，St. Louis)來代替抗體溶液（上述第…點）； vi) 對於自發釋放（SR)對照’在板中3個含有經標記靶細 胞之其他孔中添加5 0微升RPMI細胞培養基來代替抗體溶 液（上述第iv點）； vii) 然後將96孔微量滴定板在5〇xg下離心1分鐘並在4。〇 下培育1小時； viii) 將50微升PBMC懸浮液（上述第i點）添加至各孔中以 產生25:1之效應細胞：靶標細胞比並將各滴定板在培育箱中 於5% (：02氣氛下在37°C下放置4小時； ix) 自各孔收穫無細胞上清液並使用γ計數器對實驗釋放 之放射性（ER)進行定量； X)根據式（ER-MR)/(MR-SR)x 1〇〇計算每一抗體濃度下之 特異性溶解百分比，其中ER係在該抗體濃度下（見上述第 ix點）定量之平均放射性，MR係對MR對照（見上述第v點） 定量之平均放射性（見上述第ix點），且SR係對SR對照（見 上述第vi點）定量之平均放射性（見上述第ix點）； 4)「增強之ADCC」定義為在上文所測試抗體濃度範圍 内所觀察到特異性溶解之最大百分比增加，及/或達成在 157262.doc -27· 201209063 上文所測試抗體濃度範圍内所觀察到特異性溶解之最大百 分比的一半所需抗體濃度之降低^ ADCC之增強係相對於 使用上述分析來量測且由相同抗體介導之ADCC而言，該 相同抗體係由相同類型宿主細胞使用彼等熟習此項技術者 已知之相同標準製備、純化、調配及儲存方法來產生，但 尚未藉由經改造可過表現GnTIII之宿主細胞產生。 Π.組合物及方法 由於腱生蛋白-C、尤其腱生蛋白-c之A2結構域及其他選 擇性剪接結構域在某些病理狀況中特異性表現，但基本不 存在於健康成人組織中，因此靶向此抗原之抗體具有極大 治療潛力。本發明提供結合腱生蛋白_C之A2結構域之抗 體、尤其具有高親和力及強效應子功能之抗體。本發明抗 體可用於（例如）診斷或治療特徵在於表現TNC A2之疾病， 例如癌症。 A·實例性抗TNC A2抗體 本發明提供特異性結合腱生蛋白C之A2結構域（TNC A2) 之抗體。特定而言，本發明提供特異性結合TNC A2之抗 體’其中該等抗體經糖改造以具有增強之效應子功能。 在一個實施例中，本發明之抗TNC A2抗體包含至少一 個（例如1個、2個、3個、4個、5個或6個）選自以下之群之 重鍵或輕鏈互補決定區（CDR) : SEQ m NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: Η、 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO： 19 ' SEQ ID NO:21 ' SEQ ID NO: 23 ' SEQ ID N〇： 】57262.doc -28 - ⑧ 201209063 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 47，或其至少含有該CDR之特異性 決定殘基（SDR)之變體或截短形式。在一個實施例中，本 發明之抗TNC A2抗體包含至少一個（例如1個、2個、3個、 4個、5個或6個）選自以下之群之重鏈或輕鏈互補決定區 (CDR) : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45及 SEQ ID NO: 47，其中該抗體不包含以下之組合：選自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 之群之重鏈 CDR1 (HCDR1)、選自 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15及 SEQ ID NO: 21 之群之重鏈 CDR2 (HCDR2)、重鏈 CDR3 (HCDR3) SEQ ID NO: 27、輕鏈CDR1 (LCDR1) SEQ ID NO: 29、輕 鏈 CDR2 (LCDR2) SEQ ID NO: 35及輕鏈 CDR3 (LCDR3) SEQ ID NO:47。 在一個實施例中，該至少一個CDR係重鏈CDR、尤其重 鏈CDR3 SEQ ID NO: 27。在另一實施例中，該抗體包含至 少一個重鏈CDR及至少一個輕鏈CDR、尤其重鏈CDR3 157262.doc -29· 201209063 SEQ ID NO:27 及輕鏈 CDR3 SEQ ID NO: 47 » 在一個實施例中，本發明抗體包含至少1個、至少2個、 或全部3個選自以下之重鏈CDR (HCDR)序列：（a) HCDR1，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及 SEQ ID NO: 7 ; (b)HCDR2，其包 含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11 ' SEQ ID NO: 13 ' SEQ ID NO: 15 ' SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23及 SEQ ID NO: 25 ;及（c)HCDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27。在又一實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈 可變區包含（a)選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7 ; (b)選自以下之群之重 鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23及 SEQ ID NO: 25 ;及（c)重 鏈CDR3 SEQ ID NO: 27 ;或其至少含有該等CDR之SDR之 變體或截短形式。 在一個實施例中，本發明抗體包含至少1個、至少2個或 全部3個選自以下之輕鏈CDR (LCDR)序列：（a) LCDR1， 其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31 及SEQ ID NO: 33 ; (b)LCDR2，其包含選自以下 之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO·· 37、 SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及 SEQ ID NO: 45 ;及（c)LCDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 157262.doc -30· _ ⑧ 201209063 47。在又一實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變 區包含（a)選自以下之群之輕鏈CDR1 : SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33 ; (b)選自以下之群之輕鏈 CDR2 ： SEQ ID NO: 35 > SEQ ID NO: 37 ' SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及 SEQ ID NO: 45 ; 及（c)輕鏈CDR3 SEQ ID N0..47 ;或其至少含有該等CDR之 SDR之變體或截短形式。
在一個實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，其包含 選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7 ;選自以下之群之重鏈CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO: 23 及 SEQ ID NO: 25 ;及重鏈 CDR3 SEQ ID NO: 27;及輕鏈可變區，其包含選自以下之群之輕鏈 CDR1 : SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31 及 SEQ ID NO: 33 ;選自以下之群之輕鏈CDR2 : SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及 SEQ ID NO: 45 ;及輕鏈CDR3 SEQ ID NO:47 ;或其 至少含有該等CDR之SDR之變體或截短形式。
在另一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重鏈 可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7;選自以下之群之重鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ •31- 157262.doc 201209063 ID NO:21、SEQ ID NO·· 23 及 SEQ ID NO: 25 ;及重鏈 CDR3 SEQ ID NO: 27;及輕鏈可變區，其包含選自以下之 群之輕鏈CDR1 : SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31 及 SEQ ID NO: 33 ;選自以下之群之輕鏈CDR2 : SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43 及 SEQ ID NO: 45 ;及輕鏈 CDR3 SEQ ID NO:47，其中該抗體不包含以下之組合：選自SEQ ID NO: 3 ' SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 之群之重鏈 CDR1 (HCDR1)、選自 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15及 SEQ ID NO: 21 之群之重鏈CDR2 (HCDR2)、重鏈CDR3 (HCDR3) SEQ ID NO: 27、輕鏈 CDR1 (LCDR1) SEQ ID NO: 29、輕 鏈 CDR2 (LCDR2) SEQ ID NO: 35及輕鏈 CDR3 (LCDR3) SEQ ID NO:47。 在一具體實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區，該重 鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7;選自以下之群之重鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 23及 SEQ ID NO: 25 ; 及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 27 ;及輕鏈可變區，其包含輕鏈 CDR1 SEQ ID NO: 29、輕鏈 CDR2 SEQ ID NO: 35 及輕鏈 CDR3 SEQ ID NO:47。在另一具體實施例中，本發明抗體 包含重鏈可變區，該重鍵可變區包含選自以下之群之重鍵 CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及 SEQ ID NO: 7 ;選 自以下之群之重鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15 157262.doc -32- ⑧ 201209063 及 SEQ ID NO: 21 ;及重鏈 CDR3 SEQ ID NO: 27 ;及輕鏈 可變區，其包含選自以下之群之輕鏈CDR1 : SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 33 ;選自以下之群之輕 鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43及 SEQ ID NO: 45 ;及輕鏈CDR3 SEQ ID NO:47。在再一實施例中，本發明抗體包含重鏈可變 區，該重鏈可變區包含選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及 SEQ ID NO: 7 ;選自以下之群 之重鏈 CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO·. 15 及 SEQ ID NO: 21 ;及重鏈CDR3 SEQ ID NO: 27 ;及輕鏈可變區，其 包含輕鏈 SEQ ID NO: 29、輕鏈 CDR2 SEQ ID NO: 35 ;及 輕鍵CDR3 SEQ ID NO:47。 在一個實施例中，本發明抗體包含重鏈可變區（VH)，該 重鏈可變區包含與選自以下之群之序列具有至少約90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 990/〇 — 致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63。在一個實施例中，該抗體包含重鏈可變 區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63。 在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96°/。、97%、98%或 99%— 致性之 VH序列相對 於參考序列含有取代（例如，保守取代）、***或缺失，但 包含該序列之抗TNC A2抗體保持結合TNC A2之能力。在 某些實施例中，在SEQ ID NO 59、63或67中，總共有1至 157262.doc •33· 201209063 ίο個胺基酸已經取代、***及/或缺失。在某些實施例 中，取代、***或缺失在HVR或CDR外部區域（即’在FR 中）發生。視情況，本發明之抗TNC A2抗體包含SEQ ID NO 59、63或67中之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。 在一特定實施例中，VH包含1個、2個或3個選自以下中所 述序列之重鍵CDR用於HCDR1、HCDR2及HCDR3 : SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25及 27 〇 在另一實施例中，本發明抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈 可變區包含與選自以下之群之序列具有至少約90°/〇、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% — 致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85 及 SEQ ID NO: 89。在再一實施 例中，抗體包含輕键可變區，該輕键可變區包含選自以下 之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89。 在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或 99%— 致性之 VL序列相對 於參考序列含有取代（例如，保守取代）、***或缺失，但 包含該序列之抗TNC A2抗體保持結合TNC A2之能力。在 某些實施例中，在SEQ ID NO 55、57、69、73、77、81、 85或89中，總共有1至10個胺基酸已經取代、***及/或缺 157262.doc -34- 201209063 失。在某些實施例中，取代、***或缺失在HVR或CDR中 (即，在FR中）發生。視情況，本發明之抗TNCA2抗體包含 SEQ ID NO 55、57、69、73、77、81、85 或 89 中之 VL序 列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下中所述序列之輕鏈CDR用於 LCDR1、LCDR2及 LCDR3 : SEQ ID NO 29、31、33、35、 37、39、41、43、45及47 ° 在另一態樣中，提供抗TNC A2抗體’其中該抗體包括 如上文所提供任一實施例中之VH、及如上文所提供任一 實施例中之VL。在一個實施例中，抗體包含重鏈可變 區，該重鏈可變區包含與選自以下之群之序列至少約 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94% ' 95% ' 96% ' 97% ' 98% ' 99%或 100%—致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO·· 67及SEQ ID NO: 63;及輕鏈可變區，其包含與選自 以下之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98°/。、99%或 100%—致之胺基酸序列： SEQ ID NO: 55 ' SEQ ID NO: 57 ' SEQ ID NO: 69 ' SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及SEQ ID NO: 89。在一個實施例中，抗體包含分 別在以下中之VH及VL序列：SEQ ID NO 59、63或67及 SEQ ID NO 55、57、69、73、77、81、85 或 89，包括彼等 序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區 包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ 157262.doc ·35· 201209063 ID NO: 67及SEQ ID NO: 63 ;及輕鏈可變區，其包含選自 以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、 SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89，其中 該抗體不包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 59之重鏈可變 區與含有胺基酸序列SEQ ID NO: 55或SEQ ID NO: 57之輕 鏈可變區之組合。 在一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列 SEQ ID NO: 59之重鏈可變區及含有選自以下之群之胺基 酸序列之輕鏈可變區：SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、 SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89。在另一具體實施例中，本發明抗體包含含有 胺基酸序列SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:67之重鏈可變區 及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 57之輕鏈可變區。在再一 實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:59 之重鏈可變區及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 55或SEQ ID NO: 5 7之輕鏈可變區。在一特定實施例中，上述實施例中 任一者之抗體另外包含免疫球蛋白之Fc區或等效於該Fc區 之區域。 在一個實施例中，本發明抗體包含Fc區、尤其IgG Fc 區、最特定而言IgGl Fc區。 在一特定實施例中，本發明抗體係全長抗體、尤其IgG 類抗體、最特定而言IgGl同種型抗體。在另一實施例中， 本發明抗體係選自以下之群之抗體片段：scFv片段、Fv片 157262.doc -36- ⑧ 201209063 段、Fab片段及F(ab’）2片段。在又一實施例中，本發明抗 體係具有Fc區之抗體片段或包含等效於免疫球蛋白之Fc區 之區域之融合蛋白。在一個實施例中，本發明抗體係單株 抗體。 在一個實施例中，本發明抗體係嵌合抗體、更具體而言 人類化抗體。在一特定實施例中，本發明抗體係人類抗 體。在另一實施例中，本發明抗體包含人類恆定區。在一 個實施例中，本發明抗體包含人類Fc區、較佳人類IgG Fc 區、最特定而言人類IgGl Fc區。 在一個實施例中，本發明抗體包含重鏈恆定區，其中該 重鏈恆定區係人類IgG恆定區、尤其人類IgGl恆定區，包 含Fc區。在一具體實施例中，抗體包含含有胺基酸序列 SEQ ID NO: 93之重鏈恆定區。在另一具體實施例中，本 發明抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO: 95之輕鏈恆定 區。在再一具體實施例中，本發明抗體包含含有胺基酸序 列SEQ ID NO: 93之重鏈恆定區及含有胺基酸序列SEQ ID Ν 0: 9 5之輕鏈‘)·亙定區。 在一特定實施例中，本發明提供特異性結合TNC A2之 抗體，其中該抗體包含a)重鏈可變區，其包含與選自以下 之群之序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%—致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63 ;或輕鏈可變 區，其包含與選自以下之群之序列至少約90%、91%、 92% ' 93% ' 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 157262.doc -37- 201209063 一致之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 69 > SEQ ID NO: 73 ' SEQ ID NO: 77 ' SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85 及 SEQ ID NO: 89 ;或其組合； 及b)免疫球蛋白之Fc區或等效於該Fc區之區域。 在一個實施例中，本發明抗體包含Fc區，其中該Fc區係 經糖改造F c區。在又一實施例中，本發明抗體經糖改造以 在Fc區中具有經修飾寡糖。在一具體實施例中，該抗體與 非糖改造抗體相比在Fc區中具有提高比例之二等分型寡 糖。在一更具體實施例中，抗體之Fc區中N-連接寡糖之至 少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95% 或約 1 00%、較佳至少約50°/。、更佳至少約70%係二等分型寡 糖。二等分型寡糖可為雜合型或複雜型。 在另一具體實施例中，本發明抗體與非糖改造抗體相比 在Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖。在一更具體 實施例中，抗體之Fc區中N-連接寡糖之至少約20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約90°/。、約95%或約100%、較佳至少約50%、更佳 至少約70%未經岩藻糖基化。非岩藻糖基化寡糖可為雜合 型或複雜型。 在一特定實施例中，本發明抗體與非糖改造抗體相比在 Fc區中具有提高比例之二等分型非岩藻糖基化寡糖。具體 157262.doc • 38· 201209063 而言’抗體包含㈣’其中N連接寡糖之至少約·。、約 ⑽、約鳩、約25%、約观、約⑽、約娜、約 約 50/〇、約 55%、約 6〇%、約 65%、約 7〇%、約 75%、約8、約85%、約9Q%、約娜或約謂％、較佳至 八句15 /。、更佳至少約25%、至少約35%或至少約$⑽係二 等分型非岩藻糖基化寡糖。二等分型非岩藻糖基化寡糖可 為雜合型或複雜型。 在一個實施例中，本發明抗體具有增強之效應子功能 及/或增強之Fc受體結合親和力。增強之效應子功能及/或 增強之Fc受體結合可源自（例如）對抗體之糖改造及/或親和 力成熟。在-個實施例中，冑強之效應子功能及/或增強 之Fc又體結合源自對抗體之Fe區之糖改造。在另一實施例 中，增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合源自增強 之親和力與糖改造之組合。增強之效應子功能可包括（但 不限於）以下中之一或多者：增強之Fc介導細胞毒性（包括 增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADcc))、增強之 抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCp)、增強之細胞因子分 泌，增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、 增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合、增 強之與單核細胞之結合、增強之與多形核細胞之結合、增 強之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、增強之靶結合抗體之 交聯、增強之樹突細胞成熟或增強之丁細胞啟動。在一特 疋實施例中，增強之效應子功能係增強之ADCC。增強之 Fc受體結合較佳係與活化^受體、最佳FcYRma之增強之 157262.doc •39· 201209063 結合。 在一個實施例中，本發明抗體在以治療有效量投與個體 時不會引起臨床顯著程度之毒性。 在一個實施例中，本發明抗體係親和力成熟的。在又一 實施例中，本發明抗體以低於約1 μΜ至約0·001 nM之解離 常數（KD)值、尤其低於約100 nM、低於約20 nM、低於約 10 nM或低於約1 nM之KD值結合腱生蛋白C之A2結構域 (TNC A2)。在一個實施例中，本發明抗體結合人類、小鼠 及食蟹猴TNC A2之A2結構域。在一個實施例中，本發明 抗體結合人類及食蟹猴TNC A2之A2結構域。在一更具體 實施例中，本發明抗體以低於約20 nM、低於約1 0 nM或低 於約1 nM之KD值結合人類及食蟹猴TNC A2之A2結構域。 KD值係藉由表面電漿共振使用呈Fab或IgG形式、尤其呈 IgG形式之抗體來測定。 在一個實施例中，本發明之抗TNC A2抗體結合人類組 織中之TNC A2。 在一特定實施例中，本發明提供特異性結合腱生蛋白C 之A2結構域（TNC A2)之抗體，其中該抗體包含重鏈可變 區，該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67 及 SEQ ID NO: 63 ;輕鏈可變 區，其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、 SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89 ;及人類IgG Fc區，且其中視情況該抗體經糖改 157262.doc -40- ⑧ 201209063 造以具有增強之效應子功能及/或Fc受體結合親和力。在 另一特定實施例中，本發明提供特異性結合腱生蛋白C之 A2結構域（TNCA2)之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區， 該重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 63 ;輕鏈可變區， 其包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89 ;及人類IgG Fc區，且其中該抗體在該Fc區中具有提高 比例之非岩藻糖基化寡糖及/或提高比例之二等分型寡 糖。 在一個態樣中，本發明提供特異性結合腱生蛋白C之A2 結構域（TNC A2)之抗體，其中該抗體源自親代抗體，該親 代抗體包含重鏈CDR1 SEQ ID NO: 3、重鏈CDR2 SEQ ID NO: 9、重鏈CDR3 SEQ ID NO: 27、輕鏈CDR1 SEQ ID NO: 29、輕鏈 CDR2 SEQ ID NO: 35 及輕鏈 CDR3 SEQ ID NO: 47，且其中該抗體包含至少一個在親代抗體之至少一 個重鏈或輕鏈CDR中之胺基酸取代。舉例而言，抗體可包 含在親代抗體之一或多個高變區或CDR(即，1個、2個、3 個、4個、5個或6個高變區或CDR)内之至少一個（例如約1 至約10個，即，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7 個、8個、9個或10個）且尤其約2至約5個取代。在某些實 施例中，上文所提供親代抗體之任一或多個胺基酸在以下 CDR位置處經取代： 157262.doc -41 · 201209063 -重鍵 CDR2 (SEQ ID NCh 9):位置 1、6及 8 -輕鏈 CDR1 (SEQ ID NO: 29):位置 5及 9 -輕鏈 CDR1 (SEQ ID NO: 3 5):位置 1、2及 3 在某些實施例中，本文所提供之取代係保守取代。在某 些實施例中，以下取代中之任一或多者可以任一組合作 出： -重鏈 CDR2 (SEQ ID NO: 9) : G1A或 V、F6L、T8I -輕鏈 CDR1 (SEQ ID NO: 29) : G5S、D9V -輕鏈 CDR1 (SEQ ID NO: 35) : AID、A2S或 V、S3Y 或 T 另外，該抗體與親代抗體相比亦可包含在重鏈或輕鏈之 一或多個框架區内之一或多個添加、缺失及/或取代。在 一個實施例中，該在至少一個CDR中之至少一個胺基酸取 代導致該抗體與其親代抗體相比增強之之結合親和力。在 另一實施例中，該抗體對TNC A2之親和力為親代抗體之 至少約2倍至約1 0倍（在比較本發明抗體與呈相同形式（例如 Fab形式）之親代抗體時）。此外，源自親代抗體之抗體可單 獨或組合納入與本發明抗體有關之先前段落中所述特徵中 之任一者。 本發明亦提供編碼特異性結合腱生蛋白-C之A2結構域之 抗體的多核苷酸。在一個態樣中，本發明係關於經分離多 核苷酸，其編碼形成上文所述本發明之抗TNC A2抗體之 一部分的多肽。在一個實施例中，經分離多核苷酸編碼形 成上文所述本發明之抗TNC A2抗體之一部分的抗體重鏈 及/或抗體輕鏈。 157262.doc -42- 201209063
在一個實施例中，本發明係關於經分離多核苷酸，其包 含序列編碼一或多個（例如1個、2個、3個、4個、5個或6 個）以下中所述重鏈或輕鏈互補決定區（CDR)之序列：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45 及 47，或其至 少含有該CDR之特異性決定殘基（SDR)之變體或截短形 式。在另一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之3個 重鏈CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)或3個輕鏈 CDR(存·!如 LCDR1、LCDR2 及 LCDR3)的序列：SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45及 47，或其至少含 有該3個互補決定區中每一者之SDR之變體或截短形式。 在再一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之3個重鏈 CDR(例如，HCDR1、HCDR2及 HCDR3)及 3個輕鏈 CDR(例 如 LCDR1、LCDR2 及 LCDR3)的序列：SEQ ID NO 3、5、 7 、 9 、 11 、 13 、 15 、 17 、 19 、 21 、 23 、 25 、 27 、 29 、 31 、 33、35、37、39、41、43、45及 47。在一特定實施例中， 編碼一或多個CDR之多核苷酸包含與以下CDR核苷酸序列 中之一或多者至少約90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%—致的序列：SEQ ID NO 4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40 、 42 、 44 、 46 、 48 、 49 、 50 、 51 、 52 、 53及54 °
在又一實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之群之重 鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及SEQ -43· 157262.doc 201209063 ID NO: 63 ;及/或編碼選自以下之群之輕鏈可變區之序 列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、 SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及SEQ ID NO: 89。在一特定實施例中，編碼重 鏈及/或輕鏈可變區之多核苷酸包含選自由以下組成之可 變區核苷酸序列之群之序列：SEQ ID NO 56、58、60、 62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、88、90及92、或其組合。 在一具體實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之群之 重鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63 ;及編碼重鏈恆定區、尤其人類重鏈恆定 區之序列。在一特定實施例中，該重鏈恆定區係人類IgG 重鍵恆定區、特定而言人類IgGl重鏈怪定區，包含Fc區。 在一具體實施例中，該重鏈恆定區包含序列SEQ ID NO: 93。在另一具體實施例中，多核苷酸包含編碼選自以下之 群之輕鏈可變區之序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、 SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89 ;及編 碼輕鏈恆定區、尤其人類輕鏈恆定區之序列。在一具體實 施例中，該輕鏈恆定區包含序列SEQ ID NO: 95。 在一個實施例中，本發明係關於組合物，其包含第一經 分離多核苷酸，該第一經分離多核苷酸編碼包含與選自由 以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%—致胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: •44- 157262.doc ⑧ 201209063 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63 ;及第二經分離多核 苷酸，其編碼包含與選自由以下組成之群之序列至少約 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%—致之胺基酸 序列的多肽：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89。 在一個實施例中，本發明係關於組合物，其包含第一經 分離多核苷酸，該第一經分離多核苷酸包含與選自由以下 組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、98%、 99%或 100%—致的序列：SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 68 及SEQ ID NO: 64;及第二經分離多核苷酸，其包含與選 自由以下組成之群之序列至少約90%、95%、96%、97%、 98%、99%或 100%—致的序列：SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO-· 78、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 86及 SEQ ID NO: 90。 在又一態樣中，本發明亦係關於由上文所述本發明多核 苷酸中任一者編碼之經分離多肽。 在又一態樣中，上文實施例中任一者之抗TNC A2抗體 可單獨或組合納入如下文在部分1-6中所述特徵中之任一 者： 1.抗體親和力 在某些實施例中，本文所提供抗體具有S1 μΜ、$1 00 ηΜ、<10 ηΜ、<1 ηΜ、<0.1 ηΜ、<0.01 ηΜ 或 $0.001 ηΜ(例如ΙΟ·8 Μ或更小，例如ΙΟ·8 Μ至10·13 Μ，例如1(Τ9 Μ 157262.doc -45- 201209063 至10_13 Μ)之解離常數（KD) ^較佳地，本文所提供抗體以 如藉由表面電漿共振（SPR)所測定低於1 ηΜ之KD值結合腱 生蛋白（TNC A2)、尤其人類TNC A2。 根據一個實施例，使用表面電漿共振來量測KD。可使用 (例如）BIACORE®-T100機器（GE Healthcare)在 25°C 下來實 施此一分析，其中在抗生蛋白鍵菌素（streptavidin)晶片上 以80個反應單位（RU)固定生物素化抗原。簡言之，對於固 定而定，用 10 mM HEPES、150 mM NaC卜 3 mM EDTA、 0.05%表面活性劑P20 (pH 7.4)將抗原稀釋至0_1 pg/ml，然 後以10 μΐ/分鐘之流速注射以達成約80反應單位（RU)之偶 合蛋白。適宜抗原構建體之蛋白質及DNA序列展示於SEQ ID NO 99-104中。對於動力學量測而言，在25°C下以約50 μΐ/min 之流速將 Fab(1.56 ηΜ 至 100 ηΜ)或 IgG(0.39 ηΜ 至 25 ηΜ)之2倍系列稀釋液注射於1〇 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑 P20 ( pH 7.4)中。 締合時間及解離時間係180 sec且在各循環之間用10 mM甘 胺酸（pH 1.5)再生60 sec。使用簡單一對一 Langmuir結合 模型（BIACORE ® T100評估軟體1.1.1版）藉由同時擬合締 合感測圖與解離感測圖來計算締合速率（k*合）及解離速率 (k解離)〇 以比 解離/kd$ < < tj·# f ^ 〇 例如，參見Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。. 2.抗體片段 在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片 段包括（但不限於）Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv 157262.doc -46- ⑧ 201209063 片段、及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之综 述，參見Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003);或 Carter, Nat. Rev. Immunol· 6:343-357 (2006)。 單鏈Fv或scFv片段包含VH結構域及VL結構域作為單一 多肽鏈。通常，VH及VL結構域由連接體序列接合。關於 scFv片段之綜述，例如，參見Pliickthun，The Pharmacology of Monoclonal抗體，第 113 卷，Rosenburg及 Moore 編輯 (Springer-Verlag，New York)，第 269-3 15 頁（1994);亦參見 WO 93/16185、及美國專利第 5,571，894號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體内 半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第 5,869,046號。 雙特異性抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙 特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097 ; WO 1993/01161 ; Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人， Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。 微抗體係二價同源二聚體scFv衍生物，其含有免疫球蛋 白、較佳IgG、更佳IgGl之怪定區、通常CH3區作為二聚 體化區。通常，恆定區經由鉸鏈區及/或連接體區連結至 scFv。微抗體蛋白之實例可參見Hu等人，Cancer Res. 56: 3055-61 (1996)。 單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或 157262.doc -47· 201209063 一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在 某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體 (Domantis公司，Waltham, MA ;例如，參見美國專利第 6,248,516 B1號）。 可藉由各種技術來製備抗體片段，包括（但不限於）蛋白 水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞（例如大腸桿菌 (E. coli)或嗤菌體）來產生，如本文所述。 3·嵌合及人類化抗體 在某些實施例中’本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌 合抗體闡述於（例如）美國專利第4,816,567號、及Morrison 等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6851-6855 (1984)) 中。在一實例中，嵌合抗體包括非人類可變區域（例如， 源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人類靈長類動物（例如 猴子）之可變區域）及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗 體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗 體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。 在某些實施例中’嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非 人類抗體人類化以減小對人類之免疫原性’同時保留親代 非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一 或多個可變結構域’其中HVR(例如，CDR)(或其部分）源 自非人類抗體，且FR(或其部分）源自人類抗體序列。人類 化抗體視情況亦包含人類怪定區之至少一部分。在一些實 施例中’人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體 (例如’產生HVR殘基之抗體）之相應殘基取代以（例如）恢 I57262d〇c -48- ⑧ 201209063 復或改良抗體特異性或親和力。人類化可藉由各種方法來 達成，包括（但不限於）（a)將整個非人類可變結構域移植至 人類恆定區上以產生嵌合抗體，（b)僅將非人類（例如，供 體抗體）CDR移植至人類（例如，接受者抗體）框架區及恆定 區上，且保留或不保留關鍵框架殘基（例如彼等對保留良 好抗原結合親和力或抗體功能至關重要之殘基）；（c)僅將 非人類特異性決定區（SDR或a-CDR ;抗體-抗原相互作用 之關鍵殘基）移植至人類框架區及恆定區上；或（d)移植整 個非人類可變結構域，但藉由替代表面殘基來用類人部分 將其「覆蓋」。人類化抗體及其製備方法综述於（例 如）Almagro及 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，且進一步闡述於（例如）以下文獻中：Riechmann等 人，Nature 332:323-329 (1988) ; Queen等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);美國專利第 5, 821，337號、第 7,527,791 號、第 6,982,321 號及第 7,087,409 號；Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986) ; Morrison 等 人，Proc. Natl· Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984) ; Morrison 及 Oi，Adv. Immunol. 44:65-92 (1988) ; Verhoeyen 等人 > Science 239:1534-1536 (1988) ； Padlan, Molec. Immun. 3 1(3):169-217 (1994) ; Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005)(闡述 SDR (a-CDR)移植）；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(闡述「表面重修」）；Dall'Acqua等人， Methods 36:43-60 (2005)(闡述「FR改組」）；及Osbourn等 人，Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer 157262.doc •49- 201209063 83:252-260 (2000)(闡述FR改組之「導向選擇」方法）。 可用於人類化之人類框架區包括（但不限於）：使用「最 佳擬合」方法選擇之框架區（例如，參見，Sims等人，J. Immunol. 151:2296 (1993));源自輕鏈或重鏈可變區之特 定亞組之人類抗體之共有序列的框架區（例如，參見， Carter等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992);及 Presta等人，J· Immunol·，151:2623 (1993));人類成熟（經 體突變）框架區或人類種系框架區（例如，參見，Almagro 及 Fransson，Front. Biosci· 13:1619-1633 (2008));及自篩 選FR文庫獲得之框架區（例如，參見，Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)) ° 4.人類抗體 在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用 業内已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於 van DijkAvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) 〇 可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉 基因動物已經改良以產生具有響應抗原性激發之人類可變 區域的完整人類抗體或完整抗體。此等動物通常含有人類 免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座可替代内 源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動 物染色體中。在此等轉基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因 •50· 157262.doc ⑧ 201209063 座通常不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的 综述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:11 17-1125 (2005)。 例如，亦可參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號， 其闡述XENOMOUSEtm技術；美國專利第5,770,429號，其 闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041，870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/ 0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術》可進一步（例 如）藉由與不同人類恆定區進行組合來修飾來自由該等動 物產生之完整抗體的人類可變區域。 人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法製得。已闡述用於 產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤 細胞系。（例如，參見 Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur等人，單株抗體 Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker 公司，New York， 1987);及 Boerner 等人，J. Immunol·，147: 86 (1991)。）經 由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)中。 其他方法包括彼等闡述於（例如）美國專利第7，189,826號（闡 述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體）及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006)(闡述人類-人類雜交瘤）中 者。人類雜交瘤技術（三源雜交瘤（Trioma)技術）亦闡述於 以下文獻中：Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005);及 Vollmers 及 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 157262.doc -51- 201209063 27(3):185-91 (2005)。 亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變 結構域序列來產生人類抗體。然後，此等可變結構域序列 可與期望人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體 之技術闡述於下文中。 S.源自文庫之抗艘 可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來 分離本發明抗體。舉例而言，業内已知用於產生噬菌體展 示文庫及自此等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種 方法。此等方法可例如，參見Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien 等人，編輯， Human Press, Totowa，NJ，2001)，且進一步闡述於（例如） 以下文獻中：McCafferty 等人，Nature 348:552-554 ; Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991) ; Marks等人， J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992) ； Marks及 Bradbury， Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo 編輯， Human Press, Totowa，NJ, 2003) ; Sidhu 等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004) ; Lee等人，】.]^〇1.61〇1· 340(5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及Lee等人，J. Immunol· Methods 284(1-2): 119-132(2004)。 在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應（PCR)來 單獨選殖VH及VL譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，然 後可筛選結合抗原之嗤菌體，如Winter等人，Ann. Rev. 157262.doc -52- __ ⑧ 201209063
Immunol.，12: 433-455 (1 994)中所述。噬菌體通常展示抗 體片段，該抗體片段呈單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段。來 自免疫化來源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需 構建雜交瘤。另一選擇為，可選殖天然譜（例如，自人類） 以向各種無任何免疫之非自體抗原以及自體抗原提供單一 來源之抗體，如由Griffiths等人，EMBO J, 12: 725-734 (1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得天 然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，且使用含 有隨機序列之PCR引物編碼高度可變CDR3區域並在活體 外進行重排，如由 Hoogenboom 及 Winter，J. Mol. Biol.， 227: 381-388 (1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專 利公開案包括（例如）：美國專利第5,750,373號、及美國專 利公開案第2005/0079574號、第2005/01 19455號、第 2005/0266000號、第 2007/0117126號、第 2007/0160598 號、第 2007/0237764 號、第 2007/0292936 號、及第 2009/ 0002360號。 自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段可視為本文中之 人類抗體或人類抗體片段。 6.多特異性抗體 在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體， 例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點 具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異 性中之一者係關於TNC A2且另一者係關於任一其他抗 原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合TNC A2之兩 157262.doc -53- 201209063 種不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑局域化 至表現TNC A2之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗 體片段形式製得。 製備多特異性抗體之技術包括（但不限於）重組共表現兩 個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（參見Milstein 及 Cuello，Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829、及 Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))、及「隆凸與 孔洞（knob-in-hole)」改造（例如，參見美國專利第 5,731，168號）。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體： 改造用於製備抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牵引效應 (WO 2009/089004A1);使兩個或兩個以上抗體或片段交聯 (例如，參見美國專利第4,676,980號、及Brennan等人， Science 229: 81 (1985));使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗 體（例如，參見，Kostelny等人，】.11111111111〇1.,148(5):1547-1553 (1992));使用用於製備雙特異性抗體片段之」雙鏈 抗體」技術（例如，參見，Hollinger 等人，Proc.Natl· Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993));及使用單鏈Fv (sFv)二聚體（例如，參見 Gruber 等人，J. Immunol. 152:5368 (1994));及製備三特異性抗體，如（例如）Tutt等 人，J. Immunol_147: 60 (1991)中所述。 本文亦包括經構建以具有三個或更多個功能抗原結合位 點之抗體（包含「章魚抗體」）（例如，參見US 2006/ 0025576A1)。 本文之抗體或片段亦包括含有結合TNC A2以及另一不 157262.doc • 54· 201209063 同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之FAb」或「DAF」 (例如，參見US 2008/0069820)。 7.抗體變體 在某些實施例中，本發明涵蓋本文提供抗體之胺基酸序 列變體。舉例而言，可能期望改良抗體之結合親和力及/ 或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體係藉由向編碼 抗體之核苦酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。 此等修飾包括（例如）抗體胺基酸序列内殘基之缺失、及/或 ***及/或取代。可實施缺失、***及取代之任一組合以 達成最終構建體，前提為最終構建體應具有期望特性，例 如抗原結合性。 a)取代、***及缺失變體 在某些實施例中’提供具有一或多個胺基酸取代之抗體 變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。 胺基酸取代可產生用具有相似結構及/或化學性質之另 一胺基酸替代一種胺基酸，例如保守胺基酸替代。「保 守」胺基酸取代可基於所涉及殘基在以下方面中之相似性 來進行：極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩 親性特性。舉例而言’非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺 酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、***酸、色胺酸及甲 硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、 半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；帶正電荷（鹼 性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電荷（酸 性）胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。保守取代展示於表2中 157262.doc -55- 201209063 之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表2中之 「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈類別進 一步所述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經筛選具有 期望活性之產物中，該期望活性係（例如）保持/改良抗原結 合、降低免疫原性或改良ADCC或CDC。 表2. 初始殘基 實例性取代 較佳取代 Ala (A) Val ; Leu ; lie Val Arg(R) Lys ; Gin ; Asn Lys Asn (N) Gin ； His ； Asp, Lys ； Arg Gin Asp (D) Glu ; Asn Glu Cys(C) Ser ； Ala Ser Gin (〇) Asn ； Glu Asn Glu (E) Asp ； Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn ； Gin ； Lys ； Arg Arg He (I) Leu ; Val ; Met ; Ala ; Phe ;正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸；lie ; Val ; Met ; Ala ; Phe lie Lys(K) Arg ； Gin ； Asn Arg Met (M) Leu ; Phe ; lie Leu Phe(F) Trp ； Leu ； Val ； lie ； Ala ； Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ； Ser Ser Trp(W) Tyr ； Phe Tyr Tyr(Y) Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val(V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ;正白胺酸 Leu 可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組： (1)疏水性殘基：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、 157262.doc -56- ⑧ 201209063 lie ; (2) _ 性親水性殘基：〇73、861'、1'1^、八311、〇111; (3) 酸性殘基：Asp、Glu ; (4) 鹼性殘基：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro ; (6) 芳族殘基：Trp、Tyr、Phe。 非保守取代需要將該等類別之一的成員調換成另一類 別。舉例而言，胺基酸取代亦可產生用具有不同結構及^ 或化學性質之另一胺基酸代替一種胺基酸，例如用來自不/ 同基團（例如，鹼性基團）之另一胺基酸代替來自一種基團 (例如，極性基團）之胺基酸。可藉由使用重組DNA技術在 多肽分子中系統性進行胺基酸***、缺失或取代並分析所 得重組變體之活性以實驗方式來確定允許之變化。 一種取代變體類型涉及取代親代抗體（例如人類化或人 類抗體）之一或多個高變區域殘基。通常，所得選擇用於 進一步研究之變體相對於親代抗體在某些生物性質（例 如，增強之親和力、經減小免疫原性）中具有修飾（例如， 改良）及/或實質上保持親代抗體之某些生物性質。實例性 取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地使用（例如）基於 嘆菌體展示之親和力成熟技術（例如彼等本文所述者）產 生。簡s之’一或多個HVR殘基發生突變且變體抗體展示 於嗤菌體上並篩選特定生物活性（例如結合親和力）。 可對HVR作出改變（例如，取代）以（例如）改良抗體親和 力。此等改變可在HVR「熱點」（亦即，由在體細胞成熟 157262.doc •57· 201209063 過程期間發生高頻突變之密碼子編碼的殘基）（例如，參 見 5 Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) ' 及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之 結合親和力。藉由自二級文庫構建及重新選擇來達成親和 力成熟已闡述於（例如）Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(0丨Brien 等人編輯，Human Press, Totowa，NJ，（2001))中。在親和力成熟之一些實施例 中，藉由各種方法（例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引 導之誘變）中之任一者將多樣性引入選擇用於成熟之可變 基因中。然後建立二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期 望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及 HVR引導方法，其中將若干HVR殘基（例如，一次4-6個殘 基）隨機化。可特定鑑別（例如，使用丙胺酸掃描誘變或建 模）參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3 及 CDR-L3。 在某些實施例中，取代、***或缺失可發生於一或多個 HVR内，只要此等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能 力即可。舉例而言，不實質上降低結合親和力之保守改變 (例如，本文所提供之保守取代）可發生於HVR中》此等改 變可位於HVR「熱點」或SDR外側。在上文所提供變體VH 及VL序列之某些實施例中，每一 HVR未經改變，或含有 不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。 用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區域的有用方 法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells (1989) 157262.doc -58 - ⑧ 201209063
Science’ 244:1081-1085中所述。在此方法中，已锻別殘基 或目彳示殘基組（例如，帶電殘基，例如Arg、Asp、His、 Lys及Glu)，並由中性或帶負電胺基酸（例如’丙胺酸或多 丙胺酸）代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可. 在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取 代。另一選擇為或另外，分析抗原-抗體複合體之晶體結 構以鏗別抗體與抗原之間之接觸點可能有益。可靶向該等 接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選殘基或將其排除。可篩 選變體以確定其是否含有期望性質。 胺基酸序列***包含胺基·及/或羧基末端融合（長度介於 一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽之間）、以及單個 或多個胺基酸殘基之序列内***。末端***之實例包括具 有N-末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他***變體 包含酶（例如用於ADEPT者）或可延長抗體血清半衰期之多 肽與抗體N-末端或c末端之融合體。 b)糖基化變體 在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具 有某些改良性質之抗體變體。 在一個態樣中，本發明提供具有增強之效應子功能（包 括抗體依賴性細胞毒性）之抗TNC A2抗體之糖型。抗體之 糖基化改造先前已有闡述。例如，參見美國專利第 6,602,684號’其以全文引用方式併入本文中。自具有參與 糖基化之基因之經改變活性之宿主細胞產生抗Tnc A2抗 體的方法亦詳細闡述於本文中（例如，參見下文標題為 157262.doc •59· 201209063 「重組方法及組合物」之部分）。
IgG分子在其Fc區中载有兩個N-連接寡糖，其中每一重 鍵上有一個。就任一糖基化而言，抗體以共用相同多肽骨 架但具有附接至糖基化位點之不同寡糖之一群糖型形式產 生。通常見於血清IgG之Fc區中之寡糖屬於複合雙觸角類 型（Wormald等人，Biochemistry 36:130-38 (1997))，其具 有低含量之末端唾液酸及二等分型N_乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)以及可變程度之末端半乳糖基化及核心岩藻糖基 化（附接至「主幹」雙觸角寡糖結構中之GicNAc殘基之岩 藻糖）。一些研究表明，FcyR結合所需之最少碳水化合物 結構位於募糖核心内。Lund等人，J. Immunol. 157:4963-69 (1996)。 產生抗體之工業及學術研究中使用之小鼠或倉鼠源細胞 係通常將所需寡糖決定子附接至Fc位點上《然而，該等細 胞系中表現之IgG缺乏少量見於血清IgG中之二等分型
GlcNAc。Lifely等人 ’ Glycobiology 318:813-22 (1995)。 在N-連接糖基化途徑中，藉由GnTIII添加二等分型 GlcNAc。Schachter，Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986)。
Umafia等人使用單個產生抗體之ch〇細胞系，其先前經 改造而以外部調節方式表現不同程度之選殖GnTIII酶基因 (Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999))。 此方法首次確認了糖基轉移酶（例如，GnTIII)之表現與經 修飾抗體之ADCC活性之間的嚴格相關性。因此，本發明 •60· 157262.doc ⑧ 201209063 涵蓋抗TNC A2抗體，其包含具有經改變糖基化之Fc區或 等效於該Fc區的區域’經改變糖基化源自改變糖基轉移酶 基因在產生抗體之宿主細胞中之表現程度。在一具體實施 例中’基因表現程度變化係GnTIII活性提高。增強之 GnTIII活性使抗體之FC區中二等分型寡糖之百分比提高以 及岩藻糖基化寡糖之百分比降低。此抗體或其片段具有增 強之Fc受體結合親和力及增強之效應子功能。 提供具有二等分型寡糖之抗體’例如其中附接至抗體Fc 區之雙觸角寡糖由GlcNAc二等分。此等抗體變體可具有 減小岩藻糖基化及/或經改良ADCC功能。此等抗體變體之 實例闡述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人）、美國 專利第 6,602,684 號（Umafia 等人）及 US 2005/0123546 (Umafta等人）中。 在一個實施例中，本發明之抗TNC A2抗體因本發明方 法對其寡糖之修飾而在Fc區中具有提高比例之二等分型寡 糖。在一個實施例中，二等分型N—連接寡糖在本發明之抗 TNC A2抗體之區中之百分比係總寡糖的至少約1〇%至約 100°/。、特別是至少約5〇%、更特別是至少約6〇%、至少約 70%、至少約8〇%或至少約9〇95%。二等分型寡糖可為雜 合型或複雜型。 在另一實施例中，本發明之抗TNC A2抗體因本發明方 法對其寡糖之修飾而在Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基 化募糖。在一個實施例中，非岩藻糖基化寡糠之百分比係 至少約20%至約1〇〇%，特別是至少約5〇%、至少約6〇%至 157262.doc -61 - 201209063 約70%，且更特別是至少約75%。非岩藻糠基化寡糖可屬 於雜合型或複雜型。 岩藻糖之量係藉由計算在Asn297糖鏈内之岩藻糖相對於 所有附接至Asn 297之糖基結構（例如複雜結構、雜合結構 及高甘露糖結構）之總和之平均量來確定，如藉由MALDI-TOF質譜測量，例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指 位於Fc區中約297位（Fc區殘基之EU編號）之天冬醯胺酸殘 基；然而，Asn297亦可因抗體中之微小序列變化而位於 297位約土3個胺基酸上游或下游，即介於294位與300位之 間。岩藻糖之相對量係藉由MALDI-TOF MS鑑別在N-糖苷 酶F處理試樣中含岩藻糖結構相對於所有糖基結構（例如複 雜結構、雜合結構及高甘露糖結構）之百分比。此等岩藻 糖基化變體可具有改良ADCC功能。
可用於本發明之抗TNC A2抗體之糖改造方法已更詳細 地闡述於以下專利中：美國專利第6,602,684號、美國專利 申請公開案第2004/0241817八1鐃、美國專利申請公開案 第2003/0175884 A1號、美國臨時專利申請案第60/441,3〇7 號及WO 2004/065 540，該等專利中每一者之全部内容皆係 全文以引用方式併入本文中。或者，本發明之抗TNC A2 抗體可根據以下文獻中所揭示之技術進行糠改造以在Fc區 具有減少之岩藻糖殘基：美國專利申請公開案第 2003/0157108 號（Genentech)或 EP 1 176 195 Al、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第 2003/0115614號、第 2004/093621號、第 2004/110282號、 -62- 157262.doc ⑧ 201209063 第 2004/110704 號、第 2004/132140 號；Niwa 等人，J Immunol Methods 306，151/160 (2006);美國專利第 6,946,292號（Kyowa)。本發明之經糖改造抗TNC A2抗體亦 可在產生經修飾糖蛋白之表現系統中產生，例如彼等以下 專利中所教示者：美國專利申請公開案第60/344,169號及 WO 03/056914(GlycoFi 公司）或 WO 2004/057002 及 WO 2004/024927 (Greenovation)。 與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺陷」抗體變體有關之 出版物的其他實施例包括：WO 2000/61739 ; WO 2001/29246 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0109865 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； W02005/053742 ； WO 2002/031140 ； Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包含 缺少蛋白質岩藻糖基化之Lecl3 CHO細胞（Ripka等人， Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);美國專利申 請案第 US 2003/0157108 A1 號，Presta，L;及 WO 2004/ 056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中）、及基因剔除細 胞系（例如α-1，6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除 CHO 細胞）（例如，參見 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) ; Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng” 94(4):680-688 (2006);及 WO 2003/085107)。 在一特定實施例中，本發明之抗TNC A2抗體在Fc區中 具有提高比例之二等分型非岩藻糖基化募糖。二等分型非 157262.doc • 63- 201209063 岩藻糖基化寡糖可為雜合型或複雜型。具體而言，本發明 方法可用於產生抗TNC A2抗體，其中抗原結合分子之以 區中寡糖之至少約1 〇%至約【〇〇%、具體而言至少約丨5%、 更具體而言至少約20%至約25%且更具體而言至少約30% 至約35%係二等分型非岩藻糖基化寡糖。本發明之抗TNC A2抗體亦可包含以區，其中抗體之Fc區中募糖之至少約 10%至約100%、具體而言至少約丨5%、更具體而言至少約 20 /〇至約25 %且更具體而言至少約3 〇%至約3 5%係二等分雜 合體非岩蒸糖基化募糖。 在某些實施例中，改變本文所提供抗體以增加或降低抗 體發生糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以產生或去 除一或多個糖基化位點來便利地達成抗體糖基化位點的添 加或缺失。 亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基 的抗體變體。此等抗體變體可具有經改良CDC功能《此等 抗體變體闡述於（例如）WO 1997/30087(Patel等人）、WO 1998/58964 (Raju，S.)及 WO 1999/22764 (Raju，S.)中。 亦可藉由（例如）以下方式增強抗原結合分子對TNC A2之 親和力來提高本發明抗TNC A2抗體之ADCC或其他效應子 功能：親和力成熟或改良親和力之其他方法（參見Tang等 人，J. Immunol. 2007，179:2815-2823)或如下文所述在 Fc 區中進行胺基酸修飾。本發明亦涵蓋該等方法之組合。 c) Fc區變體 在某些實施例中’可將一或多個胺基酸修飾引入本文所 •64· 157262.doc ⑧ 201209063 提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含 在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾（例如取代）之人類 Fc區序列（例如人類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區）。 在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些（但非全部）效應 子功能之抗體變體，此情況使其成為許多應用之合意的候 選物，在該等應用中抗體之活體内半衰期較為重要，但某 些效應子功能（例如補體及ADCC)體係不必要或有害的。 可實施活體外及/或活體内細胞毒性分析來證實CDC及/或 ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體（FcR) 結合分析以確保抗體缺乏FcYR結合能力（因此可能缺乏 ADCC活性），但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原 代細胞（NK細胞）僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、 FcyRII及FcyRIII。在Ravetch&Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492 (1991)之第464頁表3中對FcR於造血細胞中之表現進行 了總結。用於評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析 的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號（例如，參 見 Hellstrom, I.等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及 Hellstrom，I 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第 5,821，337 號（參見
Bruggemann，Μ·等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) 中。另一選擇為，可使用非放射性方法（例如，參見用於 流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析（CellTechnology 公司 ’ Mountain View, CA)、及 CytoTox 96®非放射性細胞 毒性分析（Promega，Madison，WI))。用於此等分析之有用 157262.doc -65- 201209063 效應子細胞包括外周血單核細胞（PBMC)及天然殺傷（ΝΚ) 細胞。另一選擇為或另外，可在活體内（例如，在諸如 Clynes等人，Proc· Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) 中所揭示之動物模型中）對所關注分子之ADCC活性進行評 價《亦可實施Clq結合分析來證實抗體不能與Clq結合且 因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為評價補體活 化，可實施CDC分析（例如，參見Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996) ; Cragg, M.S.等人， Blood 101:1045-1052 (2003);及Cragg，M.S.及M.J. Glennie， Blood 103:2738-2743 (2004)) »亦可使用業内已知方法來 實施FcRn結合及活體内清除/半衰期測定（例如，參見 Petkova，S.B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)) 〇 具有降低效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基 23 8、265、269、270、297、327 及 329 中之一或多者的取 代者（美國專利第6,737,056號）。此等Fc突變體包括在胺基 酸位置265、269、270、297及327中之兩個或更多個處經 取代之Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂 的「DANA」Fc突變體（美國專利第7,332,581號）。 闡述與FcR具有改良或減小之結合的某些抗體變體。（例 如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312、及 Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。 在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良 157262.doc -66 - ⑧ 201209063 ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、 333及/或334處之取代（殘基之EU編號）。 在一些實施例中，Fc區有所改變，從而改變（亦即，改 良或減小）Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)，例 如，如美國專利第6，194,551號、WO 99/51642、及 Idusogie 等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所 述。 具有經延長半衰期及與新生Fc受體（FcRn)(其負責將母 體 IgG 轉移至胎中）（Guyer 等人，J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249 (1994))之改良結合 的抗體闡述於US2005/0014934Al(Hinton等人）中。彼等抗 體包含具有一或多個改良Fc區與F cRn之結合之取代的Fc 區。此等Fc變體包括彼等在下列Fc區殘基之一或多者處具 有取代者：23 8、256、265、272、286、3 03、3 05、3 07、 311 、 312 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378 、 380 、 3 82、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利 第 7,371，826號）。
關於Fc區變體之其他實例亦可參見美國專利申請案第 60/439,498 號、第 60/456,041 號、第 60/514,549 號或 WO 2004/063351(結合親和力因胺基酸修飾而增強之變體Fc 區）；或美國專利申請案第1〇/672,280號或WO 2004/099249(與FcyR之結合因胺基酸修飾而改變之Fc變 體）；Duncan 及 Winter，Nature 322:738-40 (1988);美國專 利第5,648,260號、美國專利第5,624,821號及WO 157262.doc •67· 201209063 94/29351 。 d)半胱胺酸改造之抗體變體 在某些實施例中，可能期望產生半胱胺酸改造之抗體， 例如「硫代MAb」’其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸 殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基出現於抗體之可 及位點處。藉由使用半胱胺酸取代該等殘基，反應性硫醇 基團由此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其 他部分（例如藥物部分或連接體-藥物部分）以產生抗體偶聯 物，如本文進一步所述。在某些實施例中，下列殘基中之 任一個或多個可經半胱胺酸取代：輕鍵之V205(Kabat編 號）、重鏈之A118(EU編號）及重鏈Fc區之S400(EU編號）。 半胱胺酸改造之抗體可如（例如）美國專利第7,521,541號中 所述來產生。 e)抗體衍生物 在某些實施例中’可進一步修飾本文所提供抗體以含有 業内已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適於衍生抗 體之部分包括（但不限於）水溶性聚合物。水溶性聚合物之 非限制性實例包括（但不限於）聚乙二醇（PEG)、乙二酵/丙 二醇之共聚物、羧曱基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙 烯基吡咯啶酮、聚4,3-二氧戊環、聚•三噁烷、乙烯/ 馬來酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）、及葡 聚糖或聚（n-乙烯基吡咯啶酮）聚乙二醇、聚丙二醇均聚 物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇 (例如’甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙路可因 157262.doc ⑧ -68 - 201209063 水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何 分子量’且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物 的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可 為相同或不同分子。一般而言，衍生化所用聚合物之數量 及/或類型可根據包括（但不限於）以下在内之考慮因素來確 定：擬改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用 於界定條件下之療法等。 在另一實施例t，提供抗體及非蛋白質性部分之偶聯 物其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例 中，非蛋白質性部分係碳奈米管（Kam等人，pr〇c Natl Acad· Sci· USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任 一波長，且包括（但不限於）如下波長之輻射：其不危害正 常細胞’但將非蛋白質性部分加熱至將毗鄰抗體_非蛋白 質性部分之細胞殺滅的溫度。 B.重組方法及組合物 可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專 利第4,816,567號中所述。在一個實施例中，提供本文所述 之編碼抗TNC A2抗體之經分離多核苷酸。此多核苷酸可 編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之vh之胺 基fee序列（例如，抗體之輕鍵及/或重鍵）β在又—實施例 中’提供一或多個包含此多核苷酸之載體（例如，選殖載 體或表現載體）。在又一實施例中，提供包含此多核苷酸 或此载體之宿主細胞。在一個此實施例中’宿主細胞包含 以下物質（例如，已經該等物質轉化）：（1)包含如下多核普 157262.doc •69· 201209063 酸之載體：其編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗 體之VH之胺基酸序列（例如，多順反子載體），或（2)包含 編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之多核苷酸的第一載 體、及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之多核苷酸 的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞、尤 其哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、幼倉鼠 腎（BHK)細胞或淋巴樣細胞（例如，Y0、NS0、Sp2〇細 胞）。在一個實施例中，提供製備抗TNC A2抗體之方法， 其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包含編碼如 上文所提供抗體之多核苷酸的宿主細胞，及視情況自宿主 細胞（或宿主細胞培養基）回收抗體。
對於抗TNC A2抗體之重組產生而言，將一或多個編碼 抗體之多核苷酸（例如，如上文所述）分離並***一或多個 載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。為彼等 熟習此項技術者熟知之方法可用於構建含有抗TNC A2抗 體之編碼序列以及合適轉錄/轉譯控制信號之表現載體。 該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體内重 組/遺傳重組。例如，參見闡述於以下文獻中之技術： Maniatis等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Ν·Υ· (1989)及 Ausubel 等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y (1989)中。 在一個實施例中，一個或若干編碼抗TNC A2抗體之多 157262.doc •70- 201209063 核苷酸可在組成型啟動子或另一選擇為調節表現系統控制 下表現。適宜調節表現系統包括（但不限於）四環素調節表 現系統、蛻皮激素誘導型表現系統、乳糖切換表現系統 (lac-switch expression system)、糖皮質激素誘導型表現系 統、溫度誘導型啟動子系統及金屬硫蛋白金屬誘導型表現 系統。若在宿主細胞系統内包含若干不同的編碼本發明抗 體之多核苷酸，則其中一些可在組成型啟動子控制下表 現，而其他在調節啟動子控制下表現。 用於選殖或表現編碼抗體之載體的適宜宿主細胞包括本 文所述的原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產 生，尤其在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段 及多肽在細菌中之表現，例如，參見美國專利第5,648,237 號、第 5,789，199 號及第 5,840,523 號（亦參見 Charlt〇n, Methods in Molecular Biology，第 248卷（B.K.C· Lo編輯， Humana Press, Totowa，NJ，2003)，第 245-254頁，其闡述 抗體片段在大腸桿菌中之表現）。表現後，抗體可自細菌 細胞漿液以可溶部分形式分離且可經進一步純化。 除原核生物外，真核微生物（例如絲狀真菌或酵母）亦適 於用於編碼抗體之載體之選殖或表現宿主，包括糖基化途 徑已「人類化」從而產生部分或完全人類糖基化模式之抗 體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross，Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及 Li 等人，Nat. Biotech. 24··210-215 (2006)。此等表現系統亦教示於美國專利申請案第 60/344，169號及WO 03/056914(用於在非人類真核宿主細胞 157262.doc •71 201209063 中產生人類樣糖蛋白之方法）中。 用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機 體（無脊椎動物及脊椎動物）。無脊椎動物細胞之實例包括 植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用之許多 杆狀病毒菌株，尤其用於轉染草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)細胞。 亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專 利第 5,959，177 號、第 6,040,498 號、第 6,420,548 號、第 7，125,978號及第6,417,429號（闡述產生轉基因植物中之抗 體之PLANIBODIESTM技術）。 亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適 於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。可用哺乳動物宿主 細胞系之其他實例係由SV40轉化之猴腎CV1系（C0S-7); 人類胚腎系（293或293T細胞，如（例如）Graham等人，J. Gen Virol· 36:59 (1977)中所述）；幼倉鼠腎細胞（BHK);小 鼠支持細胞（TM4細胞，如（例如）Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述）；猴腎細胞（CV1);非洲綠猴腎 細胞（VERO-76);人類宮頸癌細胞（HELA);犬腎細胞 (MDCK);布法羅大鼠（buffalo rat)肝細胞（BRL 3A);人類 肺細胞（W138);人類肝細胞（Hep G2);小鼠***腫瘤 (MMT 060562) ; TRI細胞，如（例如）Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5 細胞；及 FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵 巢（CHO)細胞，包括DHFR· CHO細胞（Urlaub等人，Pr〇c. 157262.doc -72- ⑧ 201209063
Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));及骨髓瘤細胞系， 例如Y0、NSO及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動 物宿主細胞系之綜述，例如，參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第 248卷（B.K.C. Lo編輯，Humana Press，Totowa，NJ)，第 255-268 頁（2003)。 穩定表現一般優於瞬時表現，此乃因其通常可達成重現 性更高之結果且亦更適於大規模生產；然而，確定瞬時表 現是否更適於特定情形係在熟習此項技術者之技術範圍 内。 本發明進一步係關於修飾由宿主細胞產生之本發明抗 TNC A2抗體之糖基化特徵的方法，其包含在該宿主細胞 中表現一或多個編碼抗TNC A2抗體之多核苷酸及一或多 個編碼具有糖基轉移酶活性之多肽的多核苷酸、或包含此 等多核苷酸之載體。通常，任一類型之培養細胞系（包括 上述細胞系）皆可用於生成用以產生具有經改變糖基化模 式之抗TNC A2抗體細胞系。較佳細胞系包括CHO細胞、 BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞及 其他哺乳動物細胞。具有糖基轉移酶活性之多肽包括 β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基轉移酶III (GnTIII)、α-甘露糖苷 酶 II (Manll)、β(1，4)-半乳糖基轉移酶（GalT)、β(1，2)-Ν-乙 醯基葡糖胺基轉移酶I (GnTI)及β(1，2)-Ν-乙醯基葡糖胺基 轉移酶II (GnTII)。在一個實施例中，在宿主細胞中表現 編碼具有糖基轉移酶活性之多核苷酸之多核苷酸之組合 157262.doc -73- 201209063 (例如，GnTIII及Man II)。同樣，該方法亦涵蓋在已斷裂 或以其他方式不活化糖基轉移酶基因之宿主細胞（例如， 已剔除編碼αΐ，6核心岩藻糖基轉移酶之基因之活性的宿主 細胞）中表現一或多個編碼抗TNC Α2抗體之多核苷酸。在 一特定實施例中，本發明之抗TNC Α2抗體可在進一步表 現編碼具有GnTIII活性之多肽的多核苷酸的宿主細胞中產 生以修飾該等抗體之糖基化模式。在一具體實施例中，具 有GnTIII活性之多肽係包含高爾基體駐留多肽之高爾基體 定位結構域的融合多肽。在另一特定實施例中，本發明抗 TNC A2抗體在表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸 的宿主細胞中之表現產生具有增強之Fc受體結合親和力 及/或增強之效應子功能之抗TNC A2抗體。因此，在一個 實施例中，本發明係關於宿主細胞，其包含（a)—或多個包 含編碼具有GnTIII活性之多肽之序列的經分離多核苷酸； 及（b)—或多個編碼本發明抗TNC A2抗體之經分離多核苷 酸。在一特定實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含 GnTIII之催化結構域及異源性高爾基體駐留多肽之高爾基 體定位結構域的融合多肽。特定而言，該高爾基體定位 結構域係甘露糖苷酶II之高爾基體定位結構域。用於產生 此等融合多肽及使用其產生效應子功能增強之抗體的方 法揭示於W02004/065540、美國臨時專利公開案第 60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241 8 17號中， 該等案件之全部内容皆明確地以引用方式併入本文中。在另 一實施例中，宿主細胞另外包含經分離多核苷酸，該經分離 157262.doc • 74· 201209063 多核苦酸包含編碼具有甘露糖㈣n (m)活性之多狀 之序列。編碼多狀之多核苦g曼（如編碼抗tnc A]抗體之多 核普酸）可在組成型啟動子或者調節型表現系統之控制下 表現。此等系統為業内所熟知，且包括上文所述系統。 宿主細胞含有抗TNC A2抗體之編碼序列及/或具有糖基 轉移酶活性之多肽之編碼序列，且表現生物活性基因產 物，忒等佰主細胞可藉由（例如）以下方式來鑑別：DNA_ DNA或DNA-RNA雜交；存在或不存在「標記物」基因功 能，評價轉錄程度，如藉由相應mRNA轉錄物在宿主細胞 中之表現所量測；或檢測基因產物，如藉由免疫分析或藉 由其為業内所熟知之生物活性方法所量測。GnTm或Man II活性可藉由（例如）採用分別結合GnTIII或ManII2生物合 成產物的凝集素來檢測。此一凝集素之實例係優先結合含 有二等分型GlcNAc之寡糖的E4_PHA凝集素。具有GnTm 或Manll活性之多肽之生物合成產物（即特定寡糖結構）亦可 藉由對自表現該等多肽之細胞所產生糖蛋白釋放的寡糖實 施質譜分析來檢測《另一選擇為，可使用量測由細胞所產 生抗體介導之增強之Fc受體結合或增強之效應子功能的功 月匕刀析，該專細胞經改造具有編碼具有GnTIII活性之多狀 之多核苷酸。 本發明亦係關於產生具有經修飾寡糖之抗TNC A2抗體 之方法’其包含（a)在允許產生本發明抗TNC A2抗體之條 件下培養宿主細胞，該等宿主細胞經改造以表現至少一個 編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之多核苷酸，其中該具有 157262.doc -75· 201209063 糖基轉移酶活性之多肽以足以修飾由該宿主細胞產生之該 抗TNC A2抗體之Fc區中之募糖的量表現；及（b)分離該抗 TNC A2抗體。在一個實施例中，具有糖基轉移酶活性之 多肽係GnTIII。在另一實施例中，存在兩種具有糖基轉移 酶活性之多肽。在一特定實施例中，該兩種具有糖基轉移 酶活性之肽係GnTIII及Manll。在另一實施例中，具有糖 基轉移酶活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域之融合多 肽。在一更具體實施例中，融合多肽進一步包含高爾基體 駐留多肽之高爾基體定位結構域。特定而言，高爾基體定 位結構域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位結構域、最特定而 &甘露糖之疋位結構域。另一選擇為，高爾基體定 位結構域選自由以下組成之群：甘露糖苷酶〗之定位結構 域、GnTII之定位結構域及α 1，6核心岩藻糖基轉移酶之定 位結構域。 在一特定實施例中，由上述宿主細胞或方法產生之經修 飾抗TNC Α2抗體具有IgG恆定區或其包含卜區之片段。在 另一特定實施例中，抗TNC A2抗體係人類化或人類抗體 或其包含Fc區之片段。 由上述宿主細胞或方法所產生具有經改變糖基化之抗 TNC A2抗體因對伯主細胞之修飾（例如，藉由表現糖基轉 移酶基因）而通常展示增強之Fc受體結合親和力及/或增強 之效應子功能。較佳地，增強之Fc受體結合親和力係增強 之與活化Fq受體、最佳FqRina受體之結合。增強之效應 子功能較佳係以下中一或多者之增強：增強之抗體依賴性 •76- 157262.doc ⑧ 201209063 細胞毒性、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP)、增 強之細胞因子分泌、增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細 胞之抗原攝取、增強之Fc介導之細胞毒性、增強之與NK 細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合，增強之與多形核 細胞（PMNC)之結合、增強之與單核細胞之結合、增強之 靶結合抗體之交聯、增強之誘導細胞凋亡之直接信號傳 導、增強之樹突細胞成熟及增強之T細胞啟動。 C·分析 可藉由業内已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗TNC A2抗體、篩選、或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。 結合分析及其他分析 在一個態樣中，舉例而言，藉由已知方法（例如ELISA、 西方墨點（Western blot)等）測試本發明抗體之抗原結合活 性。 在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與另一具體抗 TNC A2抗體競爭與TNC A2結合之抗體。在某些實施例 中，此一競爭性抗體與由該另一具體抗TNC A2抗體結合 之相同表位（例如，線性或構形表位）結合。對抗體所結合 表位作圖之詳細實例性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第 66卷（Humana Press, Totowa，NJ)中。 在實例性競爭分析中，在包含結合TNC A2之第一標記 抗體（例如實例中所述2B 1 0抗體）及第二未標記抗體之溶液 中培育固定TNC A2，其中測試該第二未標記抗體與該第 157262.doc -77- 201209063 一抗體競爭結合TNC A2之能力。第二抗體可存在於雜交 瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第 二未標記抗體之溶液中培育固定TNC A2。在允許第一抗 體與TNC A2結合之條件下培育後，去除過量未結合抗 體，並量測與固定TNC A2締合之標記的量。若與固定TNC A2締合之標記之量在測試試樣中相對於對照試樣實質上有 所減小，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合TNC A2。參見 Harlow及 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 2.活性分析 在一個態樣中，提供分析以鑑別其具有生物活性之抗 TNC A2抗體》生物活性可包括（例如）靶向細胞之溶解、抗 體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)、補體依賴性細胞 毒性（CDC)或細胞凋亡之誘導。亦提供在活體内及/或活體 外具有此生物活性之抗體。 在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。測試 ADCC之實例性分析闡述於上文（參見「定義」：「具有增強 之ADCC之抗體」）及實例11中。用於檢測細胞溶解（例如 藉由量測LDH釋放）或細胞凋亡（例如使用TUNEL分析）之分 析為業内所熟知。量測ADCC或CDC之分析亦闡述於WO 2004/065540(參見其中之實例1)中，其全部内部以引用方 式併入本文中。 D.抗體偶聯物 157262.doc -78- 201209063 本發明亦提供包含偶聯至一或多種細胞毒性劑之本發明 抗TNC A2抗體的偶聯物，該等細胞毒性劑係（例如）化學治 療劑或藥物、生長抑制劑、毒素（例如，蛋白質毒素、細 菌之酶促活性毒素、真菌、植物、或動物來源或其片段） 或放射性同位素。 在個一實施例中，在抗體-藥物偶聯物（ADC)中，抗體偶 聯至一或多種藥物，包括（但不限於）類美坦素（maytansinoid) (參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利 EP 0 425 235 B1);奥裏斯他汀（auristatin)，例如單曱基奥 裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專 利第5,635,483號及第5,780,588號、及第7,498,298號）；多 拉司他汀（dolastatin);卡奇黴.素（calicheamicin)或其衍生 物（參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第 5,739,116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710號、第 5,773,001 號及第 5,877,296號；出1111^11等 人，Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及 Lode 等人， Cancer Res. 58:2925-2928 (1998));蒽環抗生素，例如道 諾黴素（daunomycin)或多柔比星（doxorubicin)(參見Kratz等 人，Current Med. Chem. 13:477-523 (2006) ; Jeffrey 等 人，Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov等人，Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005) ; Nagy等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik等人，Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002) ; King等人，J. Med. Chem. 45:4336-4343 157262.doc -79- 201209063 (2〇〇2);及美國專利第6,630,579號）；胺甲蝶呤；長春地 辛；紫杉烷’例如多西他賽（docetaxel)、紫杉醇、拉羅他 塞（larotaxel)、特西他塞（tesetaxel)及歐他紫和尸 (ortataxel);單端抱黴烯（trichothecene);及 CC1065。 在另一實施例中，抗體偶聯物包含與酶促活性毒素或其 片段偶聯之本文所述抗體，該酶促活性毒素或其片段包括 (但不限於）白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒 素A鍵（來自綠膿桿菌（pseud〇in〇nas aeruginosa))、萬麻毒 素A鏈、相思豆毒蛋白a鏈、蒴蓮根毒素a鏈、α_八疊球 菌、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸 (Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜 (momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草 (sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素 (mitogellin)、侷限麴菌素（restriet〇cin)、酚黴素 (phenomycin)、依諾黴素（enomycin)及單端孢黴烯族毒素 (tricothecene)。 在另一實施例中，抗體偶聯物包含偶聯至放射性原子以 形成放射性偶聯物的本文所述抗體。多種放射性同位素可 用於產生放射性偶聯物。實例包括At2n、I131、、 Y90、Re186、、Sm⑴、Bi212、p32、pb21jLu之放射 性同位素。當偶聯物用於檢測時，其可包含用於閃爍法研 究之放射性原子，例如tc99m或II23;或用於核磁共振 (NMR)成像（亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如 峨-123(再次）、碘_ι31、銦-ηι、氟_19、碳_13、氮七、 157262.doc •80- 201209063 氧-17、釓、錳或鐵。 抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶 合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代）丙酸N-琥珀醯亞胺酯 (SPDP)、4-(N_馬來醯亞胺曱基）環己烧_1_甲酸玻珀醯亞胺 酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、亞胺酸酯之雙功能衍 生物（例如己二醯亞胺二甲酯HC1)、活性酯（例如辛二酸二 琥珀醯亞胺酯）、醛（例如戊二醛）、雙-疊氮基化合物（例如 雙（對-疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙-重氮衍生物（例如雙-(對-重氮苯甲醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（例如甲苯2,6-二 異氰酸酯）及雙-活性氟化合物（例如1，5-二氟-2,4-二硝基 苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人， Science, 238: 1098 (1987)中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸（MX-DTPA)係用 於偶聯放射性核苷酸與抗體的實例性螯合劑。參見 W094/11026。連接體可為促進細胞毒性藥物在細胞内釋 放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連 接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連 接體或含二硫化物連接體（Chari等人，Cancer Res. 52:127- ) 131 (1992);美國專利第 5,208,020號）。 本文之抗體偶聯物明確地涵蓋（但不限於）使用包括（但不 限於）以下交聯體試劑製備之此等偶聯物：BMPS、 EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、 SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代- 157262.doc -81 - 201209063 SIAB、硫代_SMCC及硫代-SMPB、以及SVSB((4-乙稀基 礙）苯曱酸琥珀醯亞胺酯），以上試劑可自市面購得（例如， 可購自 Pierce Biotechnology公司，Rockf〇rd，IL.，U.S.A)。 Ε·診斷及檢測用方法及組合物 在某些實施例中’本文所提供抗TNC Α2抗體中之任一. 者皆可用於檢測生物試樣中TNC Α2之存在。本文所用之 術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生 物試樣包含細胞或組織’例如來自以下器官之細胞或組 織.腦、乳腺、結腸、腎、肝、肺、卵巢、騰腺、前列 腺、骨路肌、皮膚、小腸、胃或子宮，亦包括該等器官之 細胞或組織腫瘤。 在一個實施例中，k供用於診斷或檢測方法中之抗TNc A2抗體》在又一態樣中’提供檢測生物試樣中tnc A2之 存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物試樣視 情況與對照試樣、與本文所述抗TNC A2抗體在允許抗TNC A2抗體與TNC A2結合之條件下接觸，及檢測在抗TNe A2 抗體與TNC A2之間;I：否形成複纟冑。此方法可為活體外 或活體内方法。在一個實施例中，使用A2抗體來 選擇適用於使用抗TNC A2抗體之療法的個體，舉例而 言’，其中TNCA2係用於選擇患者之生物標記物。 可使用本發明抗體診斷之實例性病症包括與tnc a2表 現相關之病症，例如癌症及發炎性病況。 在-個態樣中’提供診斷個體之疾病之方法，該方法包 含向該個體投與有效量之診斷劑，其中該診斷劑包含本文 157262.doc ⑧ •82- 201209063 所述抗TNC A2抗體及標記（通常為成像劑），該標記允許檢 測該診斷劑與TNC A2之複合體。 在某些實施例中’提供經標記之抗TNC A2抗體。標記 包括（但不限於）直接檢測之標記或部分（例如螢光標記、發 色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記）以 及經由（例如）酶反應或分子相互作用間接檢測之部分（例如 酶或配體）。實例性標記包括（但不限於）放射性同位素 32p、14(：、1251、士及⑴1、螢光團（例如稀土螯合物或螢光 育及其衍生物）、若丹明（rhodamine)及其衍生物、丹醯、 傘形酮、螢光素酶（例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素 酶）（美國專利第4,737,456號）、螢光素、2,3·二氫酞嗪二 酮、辣根過氧化物酶（HRP)、鹼性構酸酶、β_半乳糖苦 酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如，葡萄糖氧 化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）、雜環氧化 酶（例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化 物酶、或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之 酶偶聯）、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標 記、穩定自由基、及諸如此類。 F.醫藥調配物 本文所述抗TNC Α2抗體之醫藥調配物係藉由混合具有 期望純度之此抗體與一或多種醫藥上可接受之可選载劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16版，〇soj 八 編輯（1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可 接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包 157262.doc -83- 201209063 括（但不限於）緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及 其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐 劑（例如十八烷基二曱基苄基氣化銨；氣化六曱雙銨丨苯 1 氣銨（benzalkonium chloride)、苄索氣銨（benzeth〇nium chloride);苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯， 例如對羥基苯曱酸甲酯或對羥基苯曱酸丙酯；兒茶酚；間 苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚）；低分子量（小於約 10個殘基）多肽，蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫 球蛋白，親水聚合物，例如聚乙稀基η比略咬_ ;胺基酸， 例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離 胺酸，單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露 糖或糊精；螯合劑’例如EDTA ;糖，例如蔗糖、甘露 醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合 物（例如Ζη-蛋白錯合物）；及/或非離子表面活性劑，例如 聚乙二醇（PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一 步包括間質性藥物分散劑’例如可溶性中性活性透明質酸 酶糖蛋白（sHASEGP)，例如，人類可溶性ρΗ·2〇透明質酸 酶糖蛋白’例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter Internati〇nal 公司）。某些實例性sHASEGP及使用方法（包括rHupH20)闡 述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968 號中。在一個態樣中’將sHASEGP與一或多種其他釀胺多 醣酶（例如軟骨素酶）組合。 實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號 中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6，171，586 157262.doc _g4- ⑧ 201209063 號及W02006/044908中者，後一些調配物包含組胺酸乙酸 鹽緩衝液。 本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定 適應症之活性成份，較佳為彼等具有相互間不會產生不利 影響之補充活性者。舉例而言，若擬治療疾病係癌症，則 可能期望進一步提供一或多種抗癌劑，例如化學治療劑、 腫瘤細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞凋亡活化劑。此等活性成 份適宜以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。 活性成份亦可分別裝入藉由（例如）凝聚技術或介面聚合 製備之微膠囊（例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚曱 基丙烯酸甲酯）微膠囊）中、膠質藥物遞送系統（例如，脂質 體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）或粗 滴乳液中。此等技術揭示於Remingt〇n,s pharmaceuticai
Sciences，第 16 版，〇s〇l，a.編輯（1980)中。 可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之 固態疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件形 式，例如，膜或微膠囊。 擬用於活體内投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉 由（例如）使用無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。 本文所述分子可呈多種劑型，其包括（但不限於）液體溶 液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合物微膠囊或 微泡、脂質體及可注射或可輸注溶液，較佳形式取決於投 與模式及治療應用，但通常可為可注射或可輸注溶液。 G·治療方法及組合物 157262.doc -85- 201209063 在治療方法中可使用本文所提供抗TNC A2抗體或包含 本文所提供抗TNC A2抗體之醫藥調配物中之任一者。 本文所提供抗TNC A2抗體可用於治療與相同細胞類型 之正常組織相比特徵在於以下之疾病：TNC A2表現、尤 其異常TNC A2表現（例如細胞中之過表現或以不同模式之 表現）。與相同細胞類型之非腫瘤組織相比，TNC A2在許 多人類腫瘤異常表現（例如過表現）。因此，本文所提供抗 TNC A2抗體尤其可用於預防腫瘤形成、根除腫瘤及抑制 腫瘤生長或轉移。本文所提供抗TNC A2抗體可用於治療 任一表現TNC A2之腫瘤。可藉由本文所提供抗TNC A2抗 體治療之特定惡性腫瘤包括（例如）肺癌、結腸癌、胃癌、 乳癌、頭頸癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、***癌、胰腺 癌、腦癌、骨路肌癌。 本文所揭示抗TNC A2抗體可用於抑制腫瘤生長或殺滅 腫瘤細胞。舉例而言，抗TNC A2抗體可結合癌性細胞（腫 瘤細胞或腫瘤基質細胞）之膜或細胞表面上之TNC A2並誘 發（例如）對癌性細胞之ADCC或其他效應子介導之殺滅。 另一選擇為，可使用抗TNC A2抗體以尤其藉由物理干 擾TNC A2與另一化合物之結合來阻斷其功能。舉例而 言，抗原結合分子可用於阻斷TNC A2介導之細胞黏附、 擴散或遷移。 在一個態樣中，提供用作藥劑之抗TNC A2抗體。在其 他態樣中，提供用於治療特徵在於表現TNC A2之疾病之 抗TNC A2抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中 157262.doc -86 · ⑧ 201209063 之抗TNC A2抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治 療患有特徵在於表現TNC Α2之疾病之個體之方法中的抗 TNC Α2抗體’該方法包含向該個體投與有效量之抗tnc Α2抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體 投與有效量之至少一種其他治療劑，例如，如下文所述。 在其他實施例中，本發明提供用於誘導細胞溶解之抗TNC Α2抗體。在某些實施例中，本發明提供用於在個體中誘導 細胞溶解之方法中的抗TNC Α2抗體，該方法包含向該個 體投與有效量之抗TNC Α2抗體以誘導細胞溶解^任一上 述實施例之「個體」較佳為人類。任一上述實施例之「特 徵在於表現TNC Α2之疾病」較佳為癌症，最佳為選自以 下之群之癌症：肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、頭頸癌、皮 膚癌、肝癌、腎癌、***癌、胰腺癌、腦癌、骨骼肌 癌。任一上述實施例之「細胞」較佳為存在於腫瘤中之細 胞（例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞），最佳為腫瘤細胞。與 相同細胞類型之正常組織相比，任一上述實施例之「TNc A2表現」較佳係異常表現，例如細胞中之過表現或以不模 式之表現。 在另一態樣中’本發明提供抗TNC A2抗體在製造或製 備藥劑中之用途。在一個實施例中，該藥劑用於治療特徵 在於表現TNC A2之疾病。在又一實施例中，該藥劑用於 治療特徵在於表現TNC A2之疾病之方法中，該方法包含 向患有特徵在於表現TNC A2之疾病之個體投與有效量該 藥劑。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體投 157262.doc •87· 201209063 與有效量之至少-種其他治療劑，例如，如下文所述。在 又-實施财’該㈣詩料細胞溶解4又—實施例 中，該藥劑用於在個體中誘導細胞溶解之方法中，該方法 包含向該個體投與有效量之該藥劑以誘導細胞溶解。任_ 上述實施例之「個體」較佳為人類。任一上述實施例之 「特徵在於表現TNC Α2之疾病」較佳為癌症，最佳為選 自以下之群之癌症：肺癌、結腸癌、胃癌、乳癌、皮膚 癌、肝癌、腎癌、***癌、騰腺癌、腦癌、骨路肌癌。 任一上述實施例之「細胞」較佳為存在於腫瘤中之細胞 (例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞），最佳為腫瘤細胞。與相 同細胞類型之正常組織相比，任一上述實施例之「TNc A2表現」較佳係異常表現，例如細胞中之過表現或以不模 式之表現。 在又一態樣中，本發明提供治療特徵在於表現TNc A2 之疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有特徵 在於表現TNC A2之此疾病之個體投與有效量之抗TNC A2 抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向該個體投 與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。在又一實 施例中，本發明提供在個體中誘導細胞溶解之方法。在一 個實施例中’該方法包含向該個體投與有效量之抗TNC A2抗體以誘導細胞溶解。任一上述實施例之「個體」可為 人類。任一上述實施例之「特徵在於表現Tnc A2之疾 病」較佳為癌症，最佳為選自以下之群之癌症：肺癌、結 腸癌、胃癌、乳癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、***癌、胰 157262.doc -88- 201209063 腺癌、腦癌、骨路肌癌。任一上述實施例之「細胞」較佳 為存在於腫瘤中之細胞（例如腫瘤細胞或腫瘤基質細胞）， 最佳為腫瘤細胞。與相同細胞類型之正常組織相比，任一 上述實施例之「TNC A2表現」較佳係異常表現，例如細 胞中之過表現或以不模式之表現。 在又一態樣中’本發明提供醫藥調配物，其包含本文所 提供抗TNC A2抗體中之任一者以供（例如）用於上述治療方 法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文 所提供抗TNC A2抗體中之任一者及一或多種醫藥上可接 党之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供 抗TNC A2抗體中之任一者及至少一種其他治療劑，例 如’如下文所述。 本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例 而3，可共投與本發明抗體與至少一種其他治療劑。在某 些實施例中，其他治療劑係抗癌劑。適宜抗癌劑係(例如) 化學治療劑、腫瘤細胞增殖抑制劑或腫瘤細胞凋亡活化 劑。 此等上文所述組合療法涵蓋組合投與（其中兩種或更多 種治療齊j包括於相單獨調配物中）及單獨投與（在此情 /下可在彳又與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之 支心與本發明抗體）。本發明抗體亦可與辕射療法組合使 用。 鱼本發明抗體(及任一其他治療劑)可藉由任何適宜手段投 與，包括非經腸、肺内及鼻内、以及(若期望用於局部治 157262.doc •的· 201209063 療）病灶内投與。非經腸投與包括肌内、靜脈内、動脈 内 '腹膜内或皮下投與。靜脈内投與通常較佳。然而，預 計腹膜内途徑尤其可用於(例如)治療結腸直腸腫瘤。可藉 由任-適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈内或皮下 注射，此部分地端視投與時間長短而定。本文涵蓋各種投 藥方案’包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、 濃注投與及脈衝輸注。 本發明抗體之調配、給藥及投與應以符合良好醫療實踐 之方式實施。在此情況下，考慮因素包括所治療之特定病 症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症 起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從 業者已知之其他因素。抗體不必（但視情況）與一或多種當 前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此等其他 藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療 之類型以及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常以 相同劑量且以本文所述之投與途徑、或本文所述約1%至 99°/。之劑量 '或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一 途徑使用。 對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之合適劑量（當 單獨使用或與一或多種其他其他治療劑組合使用時）應端 視擬治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病 程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、 患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而 定。該抗體適於一次性地或經一系列治療投與患者。端視 157262.doc -90- 201209063 疾病之類型及嚴重程度而定，約！ 0§/0至15 mg/kg(例如 (M mg/kg至10 mg/kg)抗體可為投與患者之初始候選劑 量，不論（例如）藉由一或多次單獨投與、抑或藉由連續輸 注。端視上述因素而定，一種典型日劑量可介於約i 至100 mg/kg之間或更高。對經若干天或更長時間重複投 與而言，端視病況而定，治療通常將持續至對疾病症狀之 期望阻抑出現為止。抗體之一個實例性劑量將在約Ο.” mg/kg至約10 mg/kg之範圍内。因此，可向患者投與約 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或10 mg/kg2一或多個劑量 (其任一組合）。此等劑量可間歇性投與，例如每週一次或 每三週一次（例如，以使患者接受約兩個至約2〇個、或例 如約6個劑量之抗體）。可在開始時投與較高負荷劑量，隨 後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。 此療法之進展可藉由習用技術及分析來容易地監測。 應理解，可使用本發明之抗體偶聯物代替抗Tnc A2抗 體或與抗TNC A2抗體一起來實施任一上述調配物或治療 方法。 H.製品 在本發明另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或 診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容 器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括 (例如）瓶子、小瓶、注射器、1¥溶液袋等。該等容器可由 諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一 、’且&物組0時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合 I57262.doc •91· 201209063 ’且可具有無菌存取通道（例如，該容器可為靜脈内溶 或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合 物中至少-種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示 該組合物用於治療選定病況。此外，該製品可包含⑷其中 含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體； 及(b)其中含有組合物之第二容器’其中該組合物包含又一 細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步 包含指示組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。另一選 :為或另外’該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該 容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水 (B WFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液s。丨 及右旋糖溶液。其可進一步包含自商業及用戶角度考慮所 期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針 及注射器。 應理解’上述製品中之任-者皆可包括本發明抗體偶聯 物來代替抗TNC A2抗體或與抗TNC A2抗體一起使用。 ΠΙ.實例 以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，可根據上 文所提供一般說明來實踐各種其他實施例。 實例1 重組DNA技術 如以下文獻中所述使用標準方法來操作DNA :
Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual ； Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 157262.doc •92· 201209063
Harbor，New York，1989。根據廠商說明書使用分子生物學 試劑。藉由雙鏈測序測定DNA序列。在一些情形下，期望 基因片段係由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡 核苷酸及PCR產物藉由自動基因合成來製備。將兩側有單 一限制内切酶裂解位點之基因片段選殖至pGA 18 (ampR)質 粒中。自轉化細菌純化質粒DNA並藉由UV譜確定濃度。 藉由DNA測序證實來亞選殖基因片段之DNA序列。基因片 段經設計具有適宜限制位點以允許亞選殖至相應表現載體 中〇 有關人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資 訊參見：Kab at, E.A.等人，（1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版物第 91-3242 號。對於表現而言，所有構建體皆含有編碼前導肽之5’-端 DNA序列，該前導肽引導蛋白質在真核細胞中分泌。SEQ ID NO 107至115中給出實例性前導肽及編碼其之多核苷酸 序列。 (糖改造）抗體之製備 已藉由亞選殖與預先***相應接受者哺乳動物表現載體 中之恆定重鏈或恆定輕鏈在框架内之可變區來獲得全抗體 重鏈及輕鏈DNA序列。抗體表現由MPSV啟動子驅使且載 體在CDS之3'端處載有合成聚A信號序列。另外，每一載 體含有EBV OriP序列。 藉由使用磷酸鈣轉染共轉染HEK293-EBNA細胞與哺乳 動物抗體表現載體來產生抗體。藉由磷酸鈣方法轉染指數 157262.doc -93- 201209063 生長之HEK293-EBNA細胞。另一選擇為，藉由聚乙烯亞 胺轉染懸浮生長之HEK293細胞。對於未經修飾非糖改造 抗體之產生而言，僅用比率為I:1之抗體重鏈及輕鏈表現 載體轉染細胞。
對於糖改造抗體之產生而言，用兩個其他質粒共轉染細 胞’分別為：一個用於融合GnTIII多狀表現（GnT-III表現 載體）且另一個用於甘露糖苷酶11表現（高爾基體甘露糖苷 酶II表現載體），比率為4:4:1:1。使用補充有10% FCS之 DMEM培養基在T燒瓶以帖壁單層培養物形式生長細胞， 且當該等細胞在介於50%與80°/。鋪滿之間時實施轉染。對 於T15 0燒瓶之轉染而言，在轉染前24小時將1千5百萬個細 胞接種於補充有FCS(最終濃度為10% V/V)之25 ml DMEM 培養基中，並將細胞置於具有5% C02氣氛之37°C培育箱中 過夜。對於每一待轉染之T150燒瓶而言’藉由將94 pg總 質粒載體DNA(在輕鏈與重鏈表現載體之間均分）、水（最終 體積為469 μΐ)及469 μΐ 1 M CaCl2溶液混合來製備DNA、 CaCl2及水之溶液。向此溶液加添加938 μΐ 50 mM HEPES、280 mM NaC卜 1·5 mM Na2HP04溶液（pH 7.05)， 立即混合10 sec並在室溫下靜置20 sec。用l〇 m補充有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液，並添加至T150中代替現有培養 基。隨後再添加13 ml轉染培養基。在37°C、5% C02下將 細胞培育約17至20小時，隨後用25 ml DMEM (10% FCS) 替代培養基。在培養基交換後約7天藉由以21〇xg離心15 min來收獲條件培養基’無菌過濾、（0.22 μιη過濾器）溶液並 157262.doc -94- 201209063 添加最終濃度為0.01% w/v之疊氮化鈉，且保持在4°c下。 藉由親和層析使用蛋白質A (HiTrap ProtA，GE Healthcare)親和層析自細胞培養物上清液純化分泌野生塑 或糖改造非岩藻糖基化（afucosylated)抗體。簡言之，用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉（pH 7.5)平衡管枉，加載細胞 上清液，隨後用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉（pH 7.5)進 行第一次洗滌，且用13.3 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉、 500 mM氣化鈉（pH 5.45)進行第二次洗滌。用20 mM檸檬酸 鈉、100 mM氣化鈉、100 mM甘胺酸（pH 3)溶析抗體。在 隨後尺寸排除層析步驟中在HiLoad Superdex 200管柱（GE Healthcare)上將緩衝劑交換為25 mM麟酸钟、125 mM氣化 納、100 mM甘胺酸·溶液（pH 6.7)或另一選擇為140 mM氣化 鈉、20 mM組胺酸（pH 6.0)並收集純單體IgGl抗體。若需 要，在兩種標準純化步驟之間包括其他陽離子交換層析步 驟。 藉由在280 nm下量測光學密度（OD)使用基於胺基酸序列 計算之莫耳消光係數來確定純化蛋白質試樣之蛋白質濃 度。在還原劑（5 mM 1,4-二硫蘇糖醇）存在與不存在時藉由 SDS-PAGL·分析抗體之純度及分子量並用考馬斯 (Coomassie)(購自 Invitrogen 之 SimpleBlue™ SafeStain)染 色。根據廠商說明書使用NuPAGE®預澆注凝膠系統 (Invitrogen, USA)(4-20% Tris-甘胺酸凝膠或 3-12°/。Bis-
Tris)。在25°C下使用Superdex 200 10/300GL分析型尺寸排 除管柱（GE Healthcare, Sweden)在 2 mM MOPS、150 rnM 157262.doc -95- 201209063
NaCl、0.02%NaN3(pH7.3)運行緩衝劑中分析抗體試樣之 聚集體含量。在藉由用肽-N糖苷酶F (Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理去除N-聚糖後，藉由 NanoElectrospray Q-TOF質譜驗證經還原抗體輕鍵及重鍵 之胺基酸骨架之完整性。 野生型及糖改造2B10人類IgG抗體之純化及分析結果展 示於圖6及7中。 藉由下文所述MALDI TOF-MS來分析附接至抗體Fc區之 寡糖》藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放寡糖。所得含有 經釋放寡糖之消化溶液經直接製備用於MALDI TOF-MS分 析或用内Η糖苷酶進一步消化，隨後製備試樣用於MALDI TOF-MS分析》 對（糖改造）抗體之糖結構之分析 為測定含有岩藻糖之寡糖結構與含有非岩藻糖（去岩藻 糖）之寡糖結構之相對比率，藉由MALDI-Tof-質譜儀分析 經純化抗體材料之經釋放聚糖。在37°C下將抗體試樣（約 50 μβ)與存於 2 mM Tris (pH 7.0)中之5 mU N-糖苷酶F (QAbio ; PNGaseF: E-PNG01)—起培育過夜，以自蛋白質 骨架釋放寡糖。為將聚糖去胺基，添加乙酸以達成150 mM之最終濃度並在37°C下培育lh。為藉由MALDI TOF質 譜進行分析，將2 pL試樣於MALDI靶上與2 pL DHB基質 溶液（2，5-二經基苯甲酸[Bruker Daltonics編號201346] ’以 4 mg/ml溶解於50%乙醇/5 mM NaCl中）混合並用MALDI TOF質譜儀 Autoflex II 儀器[Bruker Daltonics]分析。按常 157262.doc 96· ⑧ 201209063 規’記錄50-300次照射並將其合計至單次實驗中。藉由 flex分析軟體（Bruker Dalt〇nics)評估所獲光譜並測定每— 所檢測峰之質量。隨後，藉由比較相應結構（例如分別為 複雜結構、雜合結構及寡-或高甘露糖結構，且含有且不 含有岩藻糖）之計算質量與理論預計質量將各峰指派給含 有岩藻糖或去岩藻糖（非岩藻糖）之碳水化合物結構。 為測定雜合結構之比率，同時用Ν·糖苷酶F及内糖苷酶 H [QAbio ; EndoH: E-EH〇2]消化抗體試樣。N_糖苷酶以 蛋白質骨架釋放全部N-連接聚糖結構（複雜結構、雜合結 構及寡-及高甘露糖結構）且内糖苷酶H另外在聚糖之還原 端處兩個Ν-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)殘基之間裂解全部雜合 型聚糖。隨後處理此消化物且藉由MALDI T〇F質譜以與上 文針對N_糖㈣精化試樣所述相同之方式分析。藉由比 較N-糖普酶_化物與组合型N省芽酶f/㈣❶h消化物之 模式’使用特定碳水化合物結構之信號之減弱程度來估計 雜合結構之相對含量。自個體結構之峰高度比率計算每一 ，水化合物結構之相對量並檢測全部寡糖之峰高度總和。 ▲藩糖之量係3石漢糖結構相對於所有在糖普酶F處理 袠中鑑別之碳水化合物結構(例如分別為複雜結構、雜 ^结構及寡.及高甘露糖結構）之百分比。非岩藻糖基化之 罝係無岩藻糖結構相對於所有在N_糖苷酶F處理試樣中鑑 之：水化合物(例如分別為複雜結構、雜合結構及寡-及 呵甘露糖結構）之百分比。 如藉由MALDI-Tm?… S所測定2B10人類igG抗體之非岩 157262.doc -97- 201209063 藻糖基化程度係8.1 %(對於野生型形式而言）及83%(對於糖 改造形式而言）。 實例2 一般Fab-文庫之構建 基於人類種系基因使用以下V-結構域配對構建呈Fab形 式之一般抗體文庫：Vk3_20 κ輕鏈與VH3_23重鏈（對於 DP47-3文庫）及Vkl_17K輕鏈與VH1_69重鏈（對於DP88-3文 庫）。參見SEQ ID NO 1及2。 在輕鏈之CDR3 (L3)及重鏈之CDR3 (H3)方面將兩個文 庫隨機化並藉由剪接藉由重疊延伸（SOE) PCR自3個片段組 裝每一文庫。片段1包含抗體基因中包括隨機化L3之5’ 端，片段2係自L3跨越至H3之中心恆定片段，而片段3包 含隨機化H3及抗體基因之3’部分。 使用以下引物組合來產生DP47-3文庫之文庫片段：片段 l(LMB3-LibLlb_ 新）、片段 2 (MS63-MS64)、片段 3 (Lib2H-fdseqlong)。參見表3.使用以下引物組合來產生 DP88-3文庫之文庫片段：片段1 (LMB3-RJHJLIB3)、片段 2 (RJH3 1-RJH32)及片段3 (LIB88_2-fdseqlong)。參見表 4_ 表3. 用於DP47·3文辱中之^丨綸 SEOIDNO LMB3 CAGGAAACAUCIATGACCATGATTAC 116 LibLlbJ^ CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGTMNNGGGMNNMNNMNNA CCCTGCTGACAGTAATACACTGC 117 MS63 TTTCOCACAGTAATATACGGCCGTGTCC 118 MS64 ACGTTCGGCCAGGGGACCAAAGTGG 119 Lib2H GGCCGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKTTTG ACTACTGGGGCCAAGGAAC 120 fdseqlong GACGTTAGTAAATGAATITTCTGTATGAGG 121 157262.doc -98- ⑧ 201209063 表4· 用於DP88-3文庫中之引物 SEOIDNO LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 116 RJHJJB3 GACTTTGGTGCCCTGGCCAAACGT MNN GGG MNN MNN ACC MNN CTGCAAGCAGTAATAGGTGGCAAAATC 122 RJH31 ACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG 123 RJH32 TCTCGCACAGTAATACACGGCGGTGTCC 124 LIB88 一2 GGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGA -[(33% GAC Asp; 26% GGT Gly; 10% GAA Glu; 9% CGT Arg; 7% Lys; 6% GTT Val; 5% TCT Ser, 4% CTG Uu)l - (23% GGT Gly, 17% TAC Tyr; 16% TCT Ser, 11% GOT Ala; 9% CGT Arg; 7% AAC Asn; 6% ACT Thr, 6% GTT Val; 5% CCG Pro)8]- TTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC 125 fdseqlong GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG 121 產生文庫片段之PCR方案包括：在94°C下初始變性5分 鐘；在94°C下1分鐘、在58°C下1分鐘及在72°C下1分鐘持續 25個循環；及在72°C下末端延長1〇分鐘。對於組裝PCR而 言，使用等莫耳比率之3個片段作為模板。組裝PCR方案 包括：在94°C下初始變性3分鐘；及在94°C下30秒、在58°C 下1分鐘及在72°C下2分鐘持續5個循環。在此階段，添加 與片段1-3外側序列互補之引物並再實施20個循環’隨後 在72°C下末端延長10 min。 在組裝足量全長隨機化Fab構建體後，用Ncol/Notl(對於 DP47-3文庫而言）及Ncol/Nhel(對於DP88-3文庫而言）消化 Fab構建體，該等文庫與經相似處理之受體噬菌粒載體相 連。對於DP47-3文庫而言，將22·8 pg Fab文庫與16.2 pg噬 菌粒載體連接在一起。對於DP88_3文庫而言，將30.6 pg Fab文庫與30.6 pg噬菌粒載體連接在一起。 使用純化連接物分別進行68次轉化（對於DP47-3文庫而 言）及64次轉化（對於DP88-3文庫而言），以獲得4.2><101()(對 -99- 157262.doc 201209063 於DP47-3而言）及3·3χ109(對於DP88-3而言）之最終文庫尺 寸。復蘇展示Fab文庫之噬菌粒顆粒並藉由PEG/NaCi純化 來純化以用於選擇。 實例3 抗TNC A2純系2B10之選擇（初步選擇） 針對大腸桿菌表現之人類TNC-A2實施選擇，該人類 TNC-A2係在avi-標籤及6xhis-標籤之5'端處亞選殖。參見 SEQ ID NO: 97。 表現後，將抗原於活體内生物素化。已根據以下方案在 溶液中實施選擇：⑴將文庫DP88-3之約l〇u個噬菌粒顆粒 與100 nM生物素化人類TNC A2結合0.5小時，總體積為！ ml ; (ii)藉由添加5.4 X 1〇7個抗生蛋白鏈菌素塗覆之磁性珠 粒來捕獲生物素化人類TNC-A2及所附接噬菌體且保持1〇 分鐘，（iii)使用 5x lml PBS/Tween20及 5x 1 ml PBS來洗務 珠粒；（iv)藉由添加1 mL 100 mM TEA(三乙胺）將噬菌體顆 粒溶析10分鐘並藉由添加500 pL 1M Tris/HCl pH 7.4來中 和；及（v)再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用辅助噬菌體 VCSM13感染且隨後PEG/NaCl沉澱喧菌粒顆粒以用於隨後 選擇輪次中。 使用100 nM之恆定抗原濃度實施3輪選擇。在第2輪中， 在中性鍵親和素板（neutravidin plate)而非抗生蛋白鏈菌素 珠粒上實施抗原：噬菌體複合體之捕獲。利用以下方式藉 由ELISA來鑑別特定黏合劑：將100 μΐ 1〇〇 nM生物素化人 類TNC-A2塗覆於中性鏈親和素板之每一孔中。 157262.doc -100· 201209063 添加含Fab細菌上清液且結合Fab係經由其Flag-標籤藉由 使用抗Flag/HRP二級抗體來檢測《在鑑別後，以0.5升培 養物體積用細菌表現純系2B10，對其實施親和力純化並藉 由SPR-分析使用BIACORE T100來進一步表徵。參見SEQ ID NO: 56及 60。 實例4 基於純系2B10之抗TNC A2親和力成熟文庫之構建 基於來自初步TNC A2選擇之預選擇抗體構建親和力成 熟文庫。更精確而言，其基於親代純系2B10且由兩個亞文 庫組成：1)在輕鏈之CDR1及CDR2 (L1/L2)方面隨機化之 VL亞文庫，及2)在重鏈之CDR1及CDR2 (H1/H2)方面隨機 化之VH亞文庫。在轉化後彙集該等亞文庫。藉由4個擴增 及組裝之隨後步驟來構建該等亞文庫中之每一者。對於 L1/L2文庫而言：1)擴增片段1 (LMB3-AM_VklA30—Ll_ba) 及片段 2 (RJH50 (VklA30_Ll/L2_fo)-RJH51 (VklA30_ BsiWI_ba))，2)使用外部引物 LMB3 及 RJH51 (VklA30_ BsiWI_ba)組裝片段1及2以產生片段3之模板，3)擴增片段 3 (LMB3-AM_VklA30_L2_ba)及片段4 (RJH52 (VklA30_ L2/L3)-RJH51 (VklA30_BsiWI一ba))，及 4)最終使用與上文 相同之外部引物來組裝片段3及4 »對於H1/H2文庫而言： 1)擴增片段 1 (RJH53-AM_DP88_Hl_ba一opt)及片段 2 (RJH54(DP88一H1/H2一fo)-MS52)，2)使用外部引物 RJH53 及MS52組裝片段1及2以產生片段3之模板，3)擴增片段3 (RJH53-AM_DP88_H2_ba)及片段4 (RJH55 (DP88_H2H3一 157262.doc • 101 - 201209063 fo)-MS52)，及4)最終使用與上文相同之外部引物來組裝片 段3及4。已用NcoI/BsiWI(對於VL亞文庫而言）及Muni及 Nhel(對於VH亞文庫而言）消化最終組裝產物並將其選殖於 以相似方式消化之受體載體中。文庫尺寸產生1.16xl01Q個 獨立純系。 表5. L1/L2親和力成熟文庫中用於抗TNC A2黏合劑2B10之引物 SEO ID NO LMB3 CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 116 AM_VklA30_L CCTGGCTTCTGCTGGTACCAGCCTAAATCATTA 126 1 ba CGAATGCCCTGACTTGCCCGGCAGGTGATG RJH50(VklA30 GCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAG 127 L1/L2 fo) RJH51(VklA30 GGTGCAGCCACCGTACGCTTGATCTC 128 BsiWI ba) AM_VklA30_L CTTGATGGGACGCCACTCTGCAAACTGGACG 129 2 ba CAGCATAGATCAGGCGCTTAGGGGCTTTCC RJH52(VklA30 TTGCAGAGTGGCGTCCCATCAAGGTTC 130 L2/L3)
下劃線：60%係原始鹼基且40%隨機化為V 黑體：60°/。係原始鹼基且40%隨機化為N 表6· H1/H2親和力成熟文庫中用於抗TNC A2黏合劑2B10之引物 SEQIDNO RJH53 CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC 131 AM一DP88_HlJ)a opt GTCCAGGGGCCTGTCGCACCCAGCTTATAGCGTAGC TGCTGAATGTGCCTCCGGAGGCCTTG 132 RJH54(DP88 HI/ H2 fo) ATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGAC 133 MS52 GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG 134 AM_DP88_H2_ba GACCCTGCCCTGGAACTTCTGTGCGTAGTTTGCGGTA CCAAAQATAGGGATGATeCCTCCCATCCACTCGAGC CCTTGTCCAG 135 RJH55 CDP88 H2H3 fo) TACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC 136 -102- 157262.doc ⑧ 201209063
下劃線：60%係原始鹼基且40%隨機化為V 黑體：60%係原始鹼基且40%隨機化為N 實例5 親和力成熟抗TNC A2純系之選擇 針對大腸桿菌表現之人類TNC A2實施選擇，該人類 TNC A2係在avi-標籤及6xhis-標籤（參見SEQ ID NO: 97)之 上游處選殖。表現後，將抗原於活體内生物素化。已如針 對初步TNC A2選擇所述在溶液中使用濃度降低之人類TNC A2(介於100 nM至2 nM範圍内）實施選擇。在藉由ELIS A鑑 別親和力成熟純系後，使用ProteOn XPR36生物感測器 (Biorad)實施二次篩選，並在相同儀器上分析親和力純化 Fab製劑以確定動力學速率常數及親和力。在25°C下藉由 表面電漿使用ProteOn XPR36機器（Biorad)來量測KD，其中 在NLC感測器晶片（Biorad)固定抗原。簡言之，將重組抗 原於？88/0.005%丁\\^611-20(卩117.4)中稀釋至1〇 pg/ml並以 30 gg/min注射100至300 s以達成約200-800個反應單位 (RU)之偶合抗原。對於單擊（one-shot)動力學量測而言， 以100 μΐ/min之流速注射純化Fab之2倍稀釋系列（濃度範圍 介於約0.01 nM與25 nM之間）。締合時間係210 s，解離時 間係600 s。藉由以100 μΐ/min之流速將50 mM NaOH注射 18 s使感測器晶片再生。使用簡單一對一 Langmuir結合模 型（ProteOn管理軟體2.1版）藉由同時擬合締合感測圖與解 離感測圖來計算締合速率（k*合）及解離速率（k*»)。以比率 k解離/k〇之形式來計算平衡解離常數（kd)。 157262.doc -103- 201209063 鑑別以下親和力成熟純系：2B10_〇1F7(參見SEQ ID NO: 85 及 87)、2B10—6H10(參見 SEQ ID NO: 89 及 91)、 2B10_C3A6(參見 SEQ ID NO: 69 及 71)、2B10_D1A2(參見 SEQ ID NO: 73 及 75)及 2B10—〇7D8(參見 SEQ ID NO: 81 及 83)(所有該等純系皆源自\^亞文庫）、以及2丑10_〇386(參 見 SEQ ID NO: 61 及 63)及 2B10_6A12(參見 SEQ ID NO: 65 及67)(該兩個純系源自VH亞文庫）。此外，對於純系 2B10—D1A2而言，產生V32D突變體（參見SEQ ID NO: 77及 79)(根據Kabat編號）。 圖1展示所選結合固定TNC A2之親和力成熟Fab之表面 電漿共振感測圖，且表7給出所得相應親和力。所選Fab跨 越在pM範圍内之高親和力範圍。 表7. 呈Fab片段形式（單價結合）之親和力成熟抗TNC A2抗體 之動力學平衡常數（KD)之匯總 抗體 與huTNCA2之親和力 (Κη) ΓρΜ| 2B10 C3B6 191 2B10 6A12 29〇 2B10 C3A6 497 2B10 07D8 147 2B10 01F7 . 56 2B10 6H10 8l〇 實例6 結合TNC A2之2B10 Fab之IgG轉化 已將親代2B10 Fab及親和力成熟2B 1〇 Fab衍生物轉化為 157262.doc -104· ⑧ 201209063 人類IgGl模式、小鼠IgG2a模式及人類IgG1模式，其中Avi 標籤融合至重键之C末端。將親和力成熟2B1〇 Fab轉化為 小鼠IgG以允許免疫組織化學分析（參見實例8)。 藉由亞選殖與預先***不同接受者哺乳動物表現載體中 之相應恒定重鍵及怪定輕鏈區在框内之可變區來獲得全抗 體重鏈及輕鏈DNA序列或藉由融合與接受者載體***位點 同源之短序列伸長來簟組該等序列。根據來自Invitr0gen 之「In-Fusion選殖***」實施重組。 在所有載體中’抗體表現由MPSV啟動子驅使且所有載 體在CDS之3'端處載有合成聚a信號序列。另外’每一載 體含有EBV OriP序列。 實例7 對2B10 Fab及IgG對TNC A2之親和力之測定 隨後在25°C下藉由表面電漿共振使用biacORE® T100機 器（GE Healthcare)來測定並證實tnC A2 2B10 Fab片段以 及人類IgGl轉化之TNC A2 2B10抗體對人類、鼠類及食蟹 猴TNC A2結構域之親和力。出於此目的，將生物素化抗 原（在大腸桿菌中表現，菌髓中之抗原，但未糖基化）固定 於抗生蛋白鏈菌素晶片上且使用該等構建體作為分析物。 對於固定而言，用HBS-EP+(GE Healthcare，10 mM HEPES、 150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性劑 P20 (pH 7.4))將抗原稀釋至0.1μg/ml’隨後以10μl/分鐘流速注射 以達成約80個反應單位（RU)之偶合蛋白。來自人、小鼠及 食蟹猴之TNC A2結構域以結構域A1及A3之情形表現。包 157262.doc •105- 201209063 含人類TNC之第5 III型纖連蛋白結構域（Fn5)、人類、鼠類 或食蟹猴TNC之A1及A2結構域及人類TNC之A3結構域 (丁>^?115-八1-1111111311/111111^116/〇>^110入2-八3)之抗原構建體展 示於 SEQ ID NO 99-104 中。 對於動力學量測而言，在25°C下以50 μΐ/min之流速將 Fab片段之2倍系列稀釋液（範圍介於1.56 nM至100 nM之 間）或IgG(範圍介於0.39 nM至25 nM之間）注射於HBS-EP+ 中。締合及解離時間係1 80 s且在各循環之間用10 mM甘胺 酸（pH 1.5)再生60 s。使用簡單一對一 Langmuir結合模型 (BIACORE ® T100評估軟體1.1.1版）藉由同時擬合締合感測 圖與解離感測圖來計算締合速率（k#合）及解離速率（kw *〇。 以kw /k_合比率之形式來計算平衡解離常數（KD)。例如， 參見 Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。 HEK中產生之TNC結構域1至8用作陰性對照（參見SEQ ID 105及 106)。 表8中給出結合之KD值。圖2A-B展示基於SPR之對應動 力學分析。 表8. 呈Fab片段及IgG形式之2B10抗TNC A2抗體之動力學平 衡常數（KD)之匯總
構建體 人類TNC 鼠類TNC Cyno TNC IgG 2B10 Immob大腸桿菌Ag 親合力：〇·29 nM 親合力：1.9 nM 親合力：0.21 nM Fab 片段 2B10 Immob大腸桿菌Ag 親和力：1.8 nM 親和力：180 nM 親和力：17 nM 157262.doc -106- ⑧ /Ον 201209063 實例8 抗TNC A2抗體在相對於正常組織之人類腫瘤組織切片 上之結合 實施免疫組織化學分析以檢查所選2B10 Fab對人類腱生 蛋白之A2結構域（TNC-A2)之特異性並評估其相對於正常 組織選擇性結合腫瘤組織之能力。簡言之，Fab片段中之 2B10可變區融合至FLAG片段（SHD2B10-FLAG)。製備健 康及癌性人類子宮組織試樣以供免疫組織化學染色。隨 後，將該等試樣與SHD2B10-FLAG Fab片段一起培育。然 後洗滌該等試樣並將其與對FLAG表位具有特異性之螢光 抗體一起培育。與健康組織試樣相比，癌性組織試樣展現 TNC A2之更高表現程度（圖3A)。將來自健康個體及癌症患 者之不同人類組織試樣與所述SHD2B10-FLAG Fab片段一 起培育。圖3B給出不同人類組織試樣中以免疫螢光表面積 %表示之TNC A2之量化表現程度。在另一組實驗中，2B10 可變區係以小鼠IgG模式使用。製備來自不同器官之健康 及癌性人類組織試樣以供免疫組織化學染色。隨後，將該 等試樣與SHD2B 10-小鼠IgG—起培育。然後，洗滌該等試 樣並將其與過氧化物酶顯影系統一起培育。圖4A-N展示， 與健康組織試樣相比，癌性組織試樣展現TNC A2之更高 表現程度。 實例9 抗TNC A2抗體與U87 MG膠質母細胞瘤細胞上之腱生蛋 白-C之結合 157262.doc -107- 201209063 將2B10 Fab轉化為人類IgGl抗體並藉由FACS測試其與 U87MG膠質母細胞瘤腫瘤細胞上表現之TNC A2之結合。 簡言之，將200.000個細胞/孔與指示濃度之抗TNC A2抗體 2B10在圓底96孔板中一起培育，在4°C下培育30 min，並 用PBS/0.1% BSA洗滌一次。在4°C下培育30 min後使用 FACS CantoII(軟體 FACS Diva)利用偶聯FITC 之 AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fey特異性抗體（Jackson Immuno Research Lab編號 109-096-098，工作溶液：以 1:20 稀釋於新鮮製備之PBS/0.1% BSA中）檢測結合抗體。圖5展 示與未處理細胞及僅用二級抗體染色之細胞相比，以劑量 依賴性方式結合之平均螢光強度。 使用相同實驗程序，測試糖改造2B10人類IgG抗體與野 生型2B10人類IgG抗體相比與U87MG細胞上之TNC A2之結 合。圖8展示野生型2B10抗體與糖改造2B10抗體二者結合 U87MG細胞上之TNC A2。 實例10
親和力成熟抗TNC A2抗體與腫瘤細胞上之腱生蛋白-C 之結合 藉由FACS來量測源自親和力成熟2B10 Fab之人類IgGl 抗體與U87MG膠質母細胞瘤細胞或SK-Mel5黑素瘤細胞上 之人類TNC A2之結合。簡言之，將200.000個細胞/孔與指 示濃度之2B10源抗TNC A2抗體在圓底96孔板中一起培 育，在4。(：下培育30 min，並用PBS/0.1% BSA洗滌一次。 在 4°C 下培育 30 min後使用 FACS CantoII(軟體 FACS Diva) 157262.doc -108- 201209063 利用偶聯FITC之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fey 特異性抗體（Jackson Immuno Research Lab編號 109-096-098，工作溶液：以1:20稀釋於新鮮製備之PBS/0_1°/。BSA 中）檢測結合抗體。 實例11 由糖改造抗TNC A2 IgGl抗體介導之抗體依賴性細胞介 導之細胞毒性 源自2B10之抗TNC A2人類IgGl抗體係藉由經編碼 GnTIII及Manll之質粒共轉染來糖改造，如實例1中所述。 隨後，在ADCC分析中比較糖改造親代2B10及源自2B10之 親和力成熟人類IgGl抗體介導優於其非糖改造野生型形式 之抗體介導細胞毒性的潛力。簡言之，收集U87MG膠質母 細胞瘤細胞或SK-Mel5黑素瘤細胞作為把細胞，將其洗滌 並再懸浮於培養基中，且在37°C下用新鮮製備之鈣黃綠素 AM (Molecular Probes)染色30 min，洗務3次，計數並稀釋 至300.000個細胞/ml。將此懸浮液轉移至圓底96孔板 (30.000個細胞/孔）中，添加相應抗體稀釋液並培育10 min 以促進測試抗體與細胞之結合，之後與效應細胞接觸。 PBMC之效應子：靶標比率係30 : 1 ;另一選擇為，可應用 NK92細胞。實施4小時共培育。使用在受攻擊細胞崩解後 乳酸脫氫酶（LDH)至上清液中之釋放作為讀出值。自共培 養物上清液收集LDH並用LDH檢測套組（Roche Applied Science)分析。用ELISA吸收讀取器（SoftMaxPro軟件，參 考波長·· 490 nm對650 nm)量測LDH酶之受質轉化。 157262.doc •109· 201209063 儘管出於清晰理解之目的藉助闡釋及實例在某些細節上 闡述了上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發 明範圍。本文所引用所有專利及科學文獻之揭示内容皆全 文以引用方式明確併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1展示對親和力成熟抗TNC A2 Fab片段與人類（hu) TNC A2之結合的基於表面電漿共振（SPR)之動力學分析。 圖中呈現純系2B10—C3B6 (A)、純系2B10—6A12 (B)、純系 2B10_C3A6 (C)、純系 2B10_O7D8 (D)、純系 2B10_01F7 (E)及純系2B10_6H10 (F)之經處理動力學數據集。平滑線 代表將該等數據整體擬合至1:1相互作用模型中； 圖2(A)展示對2B10抗TNC A2 Fab片段與人類、鼠類及食 蟹猴TNC A2之結合的基於SPR之動力學分析。圖（B)展示 對2B10抗TNC A2人類IgG與人類、鼠類及食蟹猴TNC A2 之結合的基於SPR之動力學分析，如實例7中所述； 圖3(A)展示正常（上圖）及腫瘤（下圖）人類子宮組織在 100X(左圖）及400X(中圖）放大率下之免疫組織化學影像， 該組織經融合至FLAG片段（SHD2B10-FLAG)之Fab片段中 之2B10可變區所染色。右圖：對照，100X放大率。（B)展 示不同人類組織試樣中以免疫螢光表面積％表示之TNC A2 之表現程度，該等試樣經融合至FLAG片段（SHD2B10-FLAG)之Fab片段中之2B10可變區所染色。用811〇2810-FLAG Fab片段對來自健康個體及癌症患者之不同人類組 織試樣進行染色，如實例8中所述； 157262.doc •110· ⑧ 201209063 圖4(a)至（n)展示人類組織在1 〇〇χ(左圖）及4〇〇x(中圖）放 大率下之免疫組織化學影像，該組織經SHD2B10-小鼠IgG 染色，如實例8中所述。在放大率下展示用同種型對 照抗體進行之染色（右圖）。上圖：正常組織，下圖：腫瘤 組織。（A)腦、（B)乳腺、（C)結腸、（D)腎、（E)肝、（F)肺、 (G)卵巢、（H)胰腺、⑴***、⑺骨骼肌、（K)皮膚、（L) 小腸、（Μ)胃、（N)子宮； 圖5展示2Β10源人類IgG與U87MG膠質母細胞瘤腫瘤細 胞上表現之TNC A2之結合，如藉由流式細胞術所測定（參 見實例9) »圖中展示經不同濃度之2B10 IgG處理之細胞與 未處理細胞及僅用二級抗體染色之細胞（陰性對照）相比的 平均螢光強度； 圖6展示對野生型2B10人類IgG之純化及分析。A)蛋白 質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C) 分析型SDS PAGE。實驗程序闡述於實例1中； 圖7展示對糖改造2B10人類IgG之純化及分析。A)蛋白 質A親和層析純化步驟。B)尺寸排除層析純化步驟。C) 分析型SDS PAGE。D)分析型尺寸排除層析。實驗程序闡 述於實例1中； 圖8展示呈野生型（wt)及糖改造（ge)形式之抗TNC A2抗 體2B10與U87MG細胞上之TNCA2之結合； 157262.doc -111. 201209063 序列表 <110>瑞士商羅齊克雷雅公司 <120>抗腱生蛋白-C (ANTI-TENASCIN-C)抗逋及使用方法 <130> EP 10172841.8 <140> 100128586 <141> 2011-08-10 <150> EP 10172841.8 <151> 2010-08-13 <160> 136 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1611 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> DP47-3文庫之文庫模板 <400> 1 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggccgaaa tcgtgttaac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 120 gccaccctct cttgcagggc cagtcagagt gttagcagca gctacttagc ctggtaccag 180 cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggag catccagcag ggccaciggc 240 atcccagaca ggttcagtgg cagtggatcc gggacagact tcactctcac catcagcaga 300 ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc accgctgacg 360 ttcggccagg ggaccaaagt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag ccicagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tggagccgca 720 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatotg aatggagccg cagactacaa ggacgacg&c 780 gacaagggtg ccgcataata aggcgcgcca attctatttc aaggagacag tcatatgaaa 840 tacctgctgc cgaccgctgc tgctggtclg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc 900 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 960 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 1020 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attastggta gtggtggtag cacatactac 1080 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 1140 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 1200 ccgtattttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcsagtgc tagcaccaaa 1260 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggs cacagcggcc 1320 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 1380 gccctgacca gcggcgtsca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 〗440 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 1500 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaagtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 1560 157262·序列表.doc 201209063 1611 £〇ggccgcaa gcactagtgc ccatcaccat caccatcacg ccgcggcata g 列 7 ^2SDNAAX 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> DP88-3文庫之文庫棋板 <400> 2 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc atggccgata tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt cggagaccgg gtcaccatca cctgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtaccagcag aagccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcaC ccagtttgca gagtggcgtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatccggg acagagttca ctctcaccat cagcagcttg cagcctgaag attttgccac ctattactgc ttgcagcata atagttaccc cacgtttggc cagggcacca aagtcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagt^ tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggagc cgcagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatgga gccgcagact acaaggacga cgacgacaag ggtgccgcat aataaggcgc gccaattcta tttcaaggag acagtcatat gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggcccaggtg caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc aaggcctccg gaggcacatt cagcagctac gctataagct g££tgcgaca ggcccctgga caagggctcg agtggatggg agggatcatc cctatctttg gtacagcaaa ctacgcacag aafittccagg gcagggtcac cattactgca gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagact atccccaggc ggttactatg ttatggatgc ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc accaaaggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacgcgg ccgcaagcac tagtgcccat caccatcacc atcacgccgc ggcatag <210> 3 <211> 5 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223> HCDR1 Rabat 157262·序列表.doc -2 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1617 201209063 <400> 3 Ser Tyr Ala lie Ser <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR1 Kabat (DNA 1) <400> 4 agctacgcta taagc 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR1 Chothia <400> 5 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 >>>> o 1 cSi 3 <21<21<21<21 621 DNA 人工序列 <220> <223> HCDR1 Chothia (DNA1) <400> 6 ggaggcacat tcagcagcta c 21 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR1 AbM <400> 7 Gly Gly Thr Phe Sex Ser Tyr Ala lie Ser1.5 10 <210〉8 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR1 AbM (DNA1) <400> 8 ggaggcacat tcagcagcta cgctataagc <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 157262-序列表.doc 201209063 <220> <223> HCDR2 Kabat (1) <400> 9
Gly lie He Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Kabat (1) (DNA) <400> 10 gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac tacgcacaga agttccag 48 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Kabat (2) <400> 11
Ala lie lie Pro lie Leu Gly I】e Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15 列 序 A工 1248DNAJ 0>1>2>3> 1A ΙΑ 1J <2<2<2<2 <220> <223> HCDR2 Kabat (2) (DNA) <400> 12 gctatcatcc cgatccttgg tatcgcaaac tacgcacaga agttccag 48 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223> HCDR2 Kabat (3) <400> ]3
Val lie lie Pro lie Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15
<210> 14 <211> 48 <212> DNA <2〗3>人工序列 <220> <223> HCDR2 Kabat (3) (DNA) <400> 14 gtgatcatcc ctatccttgg taccgcaaac tacgcacaga agttccag 48 <210> 15 .4- 157262-序列表.doc 201209063 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (1) <400> 15 I]e Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (1) (DNA) <400> 16 atccctatct ttggtacagc a <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (2) <400> 17 lie Pro He Leu Gly lie A]a Asn <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (2) (DNA) <400> 18
atcccgatcc ttggtatcgc a <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (3) <400> 19 lie Pro lie Leu Gly Thr Ala Asn <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 Chothia (3) (DNA) <400> 20 atccctatcc ttggtaccgc a 157262-序列表.doc 201209063 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223> HCDR2AbM(l) <400> 21
Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn 1 5 10 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 AbM (1) (DNA) <400> 22 gggatcatcc ctatctttgg tacagca <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 AbM (2) <400> 23
Ala lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn 1 5 10
<210> 24 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 AbM (2) (DNA) <400> 24 gctatcatcc cgatccttgg tatcfica <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 AbM (3) <400> 25
Val lie lie Pro lie Leu Gly Thr Ala Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 27 <212> WA <213>人工序列 <220> <223> HCDR2 AbM (3) (DNA) 157262-序列表.doc 201209063 <400> 26 gtgatcatcc ctatccttgg taccgca <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> HCDR3 <400> 27
Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> HCDR3 (DNA) <400> 28 tactgtgcga gactgtacgg ttac <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR1 (1) <400> 29
Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR1 (1) (OsiA 1) <400> 30 cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR1 (2) <400> 31
Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Val Leu Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 157262-序列表.doc 201209063 <220> <223> LCDR1 (2) (DNA 1) <400> 32 cgggcaagtc agggcattcg taatgtttta ggc
<210> 33 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR1 (3) <400> 33
Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Asn Val Leu Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> ' <223> LCDR1 (3) (DNA) <400> 34 cgggcaagtc agagcattcg taatgtttta ggc <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (1) <40Q> 35
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (1) (DNA) <400> 36 gctgcatcca gtttgcagag t <210〉 37 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> UCDR2 (2) <400> 37
Asp Ser Ser Ser Leu Gin Ser <210> 38 157262-序列表.doc 201209063 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (2) (DNA) <400> 38 gattcgtcca gtttgcagag t 21 <210〉 39 <211> 7 <212> <213> PRT <220> <223> LCDR2 (3) <400> 39 Asp Ala Tyr Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (3) (DNA) <400> 40 gatgcttaca gcttgcagag t 21 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (4) <400> 41
Asp Val Ser Ser Leu Gin Ser
<210> 42 <211> 21 <212> DNA <^13>人工序列 <220> <223> LCDR2 (4) (DNA) <400> 42 gatgtgtcca gtttgcagag t 21 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (5) <400〉 43
Asp Ala Ser Ser Leu Gin Ser -9- 157262-序列表.doc 201209063 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (5) (DNA) <400> 44 gatgcgtcca gtttgcagag t 21 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (6) <400> 45
Ala A]a Thr Ser Leu Gin Ser <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR2 (6) (DNA) <400> 46 gctgctacca gtttgcagag t 21 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> LCDR3 <400> 47
Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala Thr <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> LCDR3 (DNA 1) <400> 48 ttgcagaatg gtctgcagcc cgcgacg 27 <210> 49 <2]】> 15 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> HCDR1 Kabat (DNA 2) <400> 49 -10- 157262-序列表.doc 201209063 agctatgcta taagc 15 <210> 50 <211> <212> <213> 21 DNA 人工序列 <220> <223> HCDR1 Chothia (DNA 2) <400> 50 ggaggcacat tcagcagcta t 21 <210> 51 , <211> <212> <213> 30 DNA 人工序列 <220> <223> HCDR1 AbM (DNA 2) <400> 51 ggaggcacat tcagcagcta tgctataagc 30 <210> 52 <211> <212> <213> 33 DNA .人工序列 <220> <223> LCDR1 (1) (DNA 2) <400> 52 cgggcaagtc aggggattcg taatgattta ggc 33 <210> 53 <211> <212> <213> 33 DNA 人工序列 <220> <223> LCDR1 (2) (DNA 2) <400> 53 cgggcaagtc aggggattcg taatgtttta ggc 33 <210> 54 <211> <212> <213> 27 DNA 人工序列 <220> <223> LCDR3 (DNA 2) . <400> 54 ctgcagaatg gtctgcagcc cgcgacg 27 . <210> <211> <212> <213> 55 107 PRT 人工序列 <220> <223> 2B10; VL <400> 55
Asp He Gin Met Thr Gin Set Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 •11· 157262-序列表.doc 201209063
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10; VL <400> 56 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> 2B10(GS)； VL <400> 57
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 12 157262-序列表.doc 201209063 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Lea Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223> 2B10(GS); VL <400> 58 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60 atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240 gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300 ggcaccaaag tcgagatcaa g 321 <210> 59 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10; VH <400> 59
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly SeT 1 5 10 15
Ser Val Lys Val- Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Va] Ser Ser 115 120 13- 157262·序列表.d〇c 201209063 <210> 60 <2Π> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10; VH <400> 60 60 120 180 240 300 360 363 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggcac agcaaactac gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac ggttacsctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc tea <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_C3B6; VL <400> 61
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie TTu Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pra Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 62 <211> 321 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223> 2B10_C3B6; VL <400> 62 60 120 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca gggeattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 157262·序列表.doc •14· ⑧ 201209063 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240 gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300 ggcaccaaag tcgagatcaa g 321 <210> 63 <211> 121 <212> m <213>人工序列 <220> <223> 2B10_GB6; VH <400> 63
Gin Val Gin Leu Val Gin Scr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser.Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phc Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Atg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ala lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Scr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 305 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_C3B6； VH <400> 64 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggagct atcatcccga tccttggtat cgcaaactac )80 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360 tea 363 -15- 157262·序列表.doc 201209063 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10.6A12; VL <400> 65
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val G]y 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr G)n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr A]a Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Pbe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pio 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 66 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> 60 120 180 240 300 321 <223> 2B10.6A12; VL <400> 66 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagatttig ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g <210> 67 <211> 121 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10.6A12; VH <40Q> 67
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 】 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 157262·序列表.doc 16- ⑧ 201209063 A]a lie Ser Trp Va】Arg Gin Ala 35 40
Gly Val lie lie Pro He Leu Gly 50 55
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala 65 70
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr 100
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 25 Pro Gly Thr Ala Asp Lys Glu Asp 90 Tyr Gly 105 Ser
Gin Gly Leu 45
Asn Tyr Ala 60
Ser Thr Ser 75
Thr Ala Val
Ala Phe Asp 30 Glu Trp Met Gin Lys Phe Thr Ala Tyr 80 Tyr Tyr Cys 95 Tyr Trp Gly 110 ^ > > > 012 3 <21<21<21<21 68 363
DNA 人工序列 <220> <223> 2B10.6A12; VH <400> 68 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctatgcta taagctgggt gcgacaggcc ]20 cctggacaag ggctcgagtg gatgggagtg atcatcccta tccttggtac cgcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360 tea 363 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10.C3A6; VL <400> 69
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Val 20 25 30
Leu Gly Ττρ Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Sei Gly 50 55 60 17- 157262-序列表.doc 201209063
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 70 <211> 321 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223> 2B10,C3A6; VL <400> 70 gacatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca sggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat tcgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatg&tctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g <210> 71 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10,C3A6； VH <400> 71
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Va] Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly He He Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp TTir Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser -I8 60 120 ISO 240 300 321 157262-序列表 _d〇c 201209063 Π5 120 <210> 72 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_C3A6; VH <400> 72 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360 tea 363 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_DlA2.wt; VL <400> 73
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Val 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr· Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 74 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_DlA2jvt; VL <400〉 74 gatatccaga tgacccagtc tccaccctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60 •19- 157262·序列表.doc 201209063 atcacctgcc gggcaagtca ggggattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_DlA2_wt; VH <400> 75
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Str Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 G]n Gly Tlr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_DlA2_wt; VH <400> 76 caggtgcaat tg^tgcagtc tggsgctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc -20- 157262-序列表.doc 363 201209063 tea <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10^D1A2_VD； VL <400> 77
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Tyr Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 78 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2BI0__D1A2_VD; VL <400> 78 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60 atcacctgcc gggcaagtca ggggattcgt aatgatttag gctggtacca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatetatgat gcttacagct tgcagagtgg cgtcccatca 180 aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240 gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300 ggcaccaaag tcgagatcaa g 321
<210> 79 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_D1A2_VD; VH <400> 79
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15 •2卜 157262·序列表.doc 201209063
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Scr Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Scr Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly TVr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <21]> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10.D1A2.VD; VH <400> 80 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggctcgagts gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc tea <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223> 2B10.07D8; VL <400> SI
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Asn Val 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45 -22- 60 120 180 240 300 360 363 157262-序列表.doc 201209063
TyrAspValSerSerLeuGlnSerGlyVa, Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Gly Gly Ser Gly Hu Glu Phe TTir Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu G!n Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 82 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_07D8; VL <400> 82 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60 atcacctgcc gggcaagtca gagcattcgt aatgttttag gctggtacca* gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gtgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca 180 aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240 gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag 300 ggcaccaaag tcgagatcaa g 321 <210> 83 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_07D8; VH <400> 83
Gin Va】Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser. 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly He lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 -23- 157262·序列表.doc 201209063
Gin Gly Thr TT)r Va丨 Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10.07D8; VH <400> 84 60 120 180 240 300 360 363 caggtgcaat tggigcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctsa gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc tea <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_01F7; VL <400> 85
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va】Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Val 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr l]e Ser Set Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Pbe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 86 <211> 321 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> 2B10_01F7; VL 157262·序列表.doc 24· ⑧ 201209063 <400> 86 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca gggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgat gcgtccagtt tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagattttg ccacctatta ctgcctgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g <210> 87 <211> 121 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223> 2B10.01F7; VH <400> 87
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 363 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 2B10,01F7; VH <400> 88 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctga £cagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactgtac •25- 157262-序列表.doc 201209063 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc tea 360 363 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10_6H10; VL <40Q> 89 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Scr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Val 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45 Gin Ala Ala Thr Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asn Gly Leu Gin Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 90 <211> 321 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223> 2B10.6H10; VL <400> 90 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc atcacctgcc gggcaagtca gggcattcgt aatgttttag gctggtacca gcagaagcca gggaaagccc ctaagcgcct gatccaggct gctaccagtt tgcagagtgg cgtcccatca aggttcagcg gcggtggatc cgggacagag ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag aatggtctgc agcccgcgac gtttggccag ggcaccaaag tcgagatcaa g 60 120 180 240 300 321 <210> 91 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 2B10.6H10; VH <400> 91 157262-序列表.doc 26 201209063
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Tlir Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Va】Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 92 <211> 363 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 2B10_6H10; VH <400> 92 caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaage ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agetaegeta taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atetgaggae accgccgtgt attactgtgc gagactgtac 300 ggttacgctt actacggtgc ttttgactac tggggccaag ggaccaccgt gaccgtctcc 360 tea 363 <210> 93 <211> 330 <212> PRT <213>智人 <400> 93
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 •27· 157262-序列表.doc 201209063 GJy Va】His Thr Phe Pro A】a Val Leu G】n Ser Ser Gly JLeu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 305 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Clu Gin tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Set Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Tlir lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 94 <211> 990 -28 - 157262-序列表.doc 201209063 <212> DNA <213>智人 <400> 94 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacsaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 95 <211> 107 <212> PRT <213> %人 <40〇> 95
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 TTir Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 . 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Lea Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 96 -29· 157262-序列表.doc 201209063 <211> 321 <212> DNA <213>智人 <400> 96 cgtacggtgg ctscaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct giaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcggg丨 aactcccagg agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t <210> 97 <211> 319 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 人類 TNC-A2avi-標簽 his6·標簽 <400> 97
Ala Ser Thr Gly Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu 】 5 】0 15
Val Gly Trp Asp Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala 20 25 30
Tyr Glu Tyr Phe Phe lie Gin Val Gin Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala 35 40 45
Ala Gin Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro 50 55 60
Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr lie ΊΤιι He Arg Gly Val Thr 65 70 75 80
Gin Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Ala Ser 85 90 95
Gly Leu Asn Asp lie Phe Glu Ala Gin Lys lie Glu Tip His Glu Gly 100 105 110
Thr His His His His His His 115 <210> 98 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 人類 TNC-A2 avi·楳簽 his6-標簽 <400> 98 gcgtccaccg gggaaacccc gaacctgggc gaagtggtg^ tggcggaagt gggttgggai gcgctgaaac tgaactggac cgcgccggaa ggcgcgtatg aatatttttt catccaggtg caggaagcgg ataccgttga agcggcgcag aacctgaccg ttccgggcgg tetgegtage -30- 157262·序列表.doc 201209063 accgatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cattatacca ttaccatccg tggggtgacc caggatttta gcaccacccc gctgtctgtg gaagtgctga ccgctagcgg cctgaacgac atcttcgagg ctcagaaaat cgaatggcac gaaggtaccc atcaccatca ccaccac <210> 99 <211> 670 <212> PRT <213>人工序列 <223> 來自大腸桿菌之 TNC Fn5 huAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7477 <400> 99
Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro 15 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60
Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu He Ser Met Leu Glu 85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser 100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr 180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser 210 215 220 G3y Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg 225 230 235 240 •31· 240 300 357 157262·序列表.doc 201209063
Gly Ser Thr Ala lie Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu 245 250 255
Arg Gin His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270
He Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr 275 280 285
Pro Lys Asp Leu Gin Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu 290 295 300
Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr 305 310 315 320
Ser Leu Pro Thr Gly Gin Trp Val Gly Val Gin Leu Pro Arg Asn Thr 325 330 335
Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Val 340 345 350
Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Va】 355 360 365
Lys Ala Ser Thr Glu Gin Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr 370 375 380
Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gin 385 390 395 400
Ala Tyr Glu His Phe lie lie Gin Val Gin Glu Ala Asn Lys Val Glu 405 410 415
Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp lie 420 425 430
Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser lie Tyr Gly Val 435 440 445 lie Gin Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly 450 455 460
Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp 465 470 475 480
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Fhe 485 490 495
Phe lie Gin Val Gin Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gin Asn Leu 500 505 510
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys A)a 515 520 525
Ala Thr His Tyr Thr lie Thr lie Arg Gly Val Thr Gin Asp Phe Ser •32· 15 7262-序列表.doc 201209063 530 535 540
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr G!u Glu Val Pro Asp Met 545 550 555 560
Gly Asn Leu TTir Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn 565 570 575
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Glu Ala Asp Gin Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser 595 600 605
Leu Arg Ser Met Glu lie Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr 610 615 620
Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala 625 630 635 640
Val Glu Val Val Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp lie Phe Glu Ala Gin 645 650 655
Lys lie Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His 660 665 670
<210> 100 <211> 2013 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 來自大腸桿菌之 TNC Fn5 huAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7477 (DNA) <400> 100 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720 ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780 gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840 tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900 agcctgaccc tgctgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960 •33- 157262·序列表.doc 201209063 agcctgccca ctggacagt£ ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020 ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggccgg 1080 cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagc aggcccccga gctggaaaac 1140 ctgaccgtga ccgaagtggg ctgggacggc ctgcggctga actggaccgc ggctgaccag 】200 gcctatgagc actttatcat tcaggtgcag gaggccaaca aggtggaggc agctcggaac 】260 ctcaccgtgc ctggcagcct tcgggctgtg gacataccgg gcctcaaggc tgctacgcct 1320 tatacagtct ccatctatgg ggtgatccag ggctatagaa caccagtgct ctctgctgag 1380 gcctccacag gcgaaacacc gaacctgggc gaagtggtgg tggcggaagt gggttgggat 】440 gcgctgaaac tgaactggac cgcgccggaa ggcgcgtatg aatatttttt catccaggtg 1500 caggaagcgg ataccgttga agcggcgcag aacctgaccg ttccgggcgg tctgcgtagc 1560 accgatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cattatacca ttaccatccg tggggtgacc 1620 caggacttct ctaccacccc tctgagcgtg gaggtgctga ccgaggaggt acccgacatg 1680 ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740 gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt cgaagaggcc 1800 cacaatctga cagtgccagg cagcctgcgg agcatggaaa tccccggcct gagagccggc 1860 accccctaca ccgtgaccct gcacggcgaa gtgcggggcc acagcaccag acccctggcc 1920 gtggaagtgg tcacagctag cggcctgaac gacatcttcg aggctcagaa aatcgaatgg 1980 cacgaaggta cccatcacca tcaccaccac taa 2013
<210> 101 <211> 670 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> 來自大腸桿菌之 TNC Fn5cyAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7478 <400> 101
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Gly Ser Thr Ala lie Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu 245 250 255
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Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val 355 360 365
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Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Met Val Ser Glu Val Gly Trp Asp 465 470 475 480
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Val Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe 485 490 495
Phe lie Gin Va】Gin Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gin Asn His 500 505 510
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys A1a 515 520 525
Ala Thr His Tyr Thr lie Thr lie Arg Gly Val Thr Gin Asp Phe Ser 530 535 540
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met 545 550 555 560
Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn 565 570 575
Trp Thr Thr Pro Asp Gly TT^r Tyr Asp Gin Phe Thr lie Gin Val Gin 580 585 590
Glu Ala Asp Gin Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser 595 600 605
Leu Arg Ser Met Glu lie Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr 610 615 620
Val Thr Leu His Gly Glu Va】Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala 625 630 635 640
Val Glu Val Val Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp He Phe Glu Ala Gin 645 650 655
Lys Me Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His 660 665 670 <210> 102 <211> 2013 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉來自大腸桿菌之 TNC Fn5 cyAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7478 (DNA) <400> 102 -36- 157262·序列表.doc 201209063 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atata£〇tga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta scaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacstattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 SSttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720 ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780 gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840 tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900 agcctgaccc tgctgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960 agcctgccca ctggacagtg ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020 ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggcaga 1080 cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagc aggcccccga gctggaaaac 1140 ctgaccgtga ccgaagtggg ctgggacggc ctgagactga actggacagc cgccgaccag 1200 gcttatgagc acttcgtgat ccaggtgcag gaagccaaca aggtcgaggc cgcccagaat 1260 ctgaccgtgc ccggcaacct gagagccgtg gacatccctg gcctgaaggc tgccaccccc 1320 tacaccgtgt ccatctacgg cgtgattcag ggctaccgga cccctgtgct gtctgccgag 1380 gccagcacag gcgagacacc caacctgggc gaagtgatgg tgtctgaagt gggatgggat 1440 gccctgaagc tcaattggac cgtgcctgag ggcgcctacg agtacttctt tattcaggtc 1500 caggaagctg acaccgtcga agccgctcag aaccacacag tgcctggcgg cctgagaagc 1560 accgatctgc ccggcctgaa agccgctaca cactacacaa tcaccatcag aggcgtgacc 1620 caggacitca gcaccacccc cctgagcgtg gaggtgctga ccgaagaggt acccgacatg 1680 ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740 gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt cgaagaggcc 1800 cacaatctga cagtgccagg cagcctgcgg agcatggaaa tccccggcct gagagccggc 1860 accccctaca ccgtgaccct gcacggcgaa gtgcggggcc acagcaccag acccctggcc 1920 gtggaagtgg tcacagctag cggcctgaac gacatcttcg aggctcagaa aatcgaatgg 1980 cacgaaggta cccatcacca tcaccaccac taa 2013 <210> 103 <211> 670 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> 37- 157262·序列表.doc 201209063 <223> 來自大腸桿菌之 TNC Fn5 huAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7479 <400> 103
Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro 15 10 15
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Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45
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Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu He Ser Met Leu Glu 85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser 】00 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160
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Val Cys Phe Lys Lys Arg lie G)u Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr 】80 ]85 190
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Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg 225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala lie Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu 245 250 255
Arg Gin His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 lie Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr 275 280 285 157262-序列表.doc -38- 201209063
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Ala Tyi Glu Tyr Phe Val He Gin Val Gin Glu Ala Asd Ash Val Glu 405 410 415
Thr Ala His Asn Phe Thr Val Pro Gly Asn Leu Arg Ala Ala Asp lie 420 425 430
Pro Gly Leu Lys Val Ala Thr Ser Tyr Arg Val Ser lie Tyr Gly Val 435 440 445
Ala Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Tlir Ser Thr Gly 450 455 460
Thr Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Thr Val Ala Glu Val Gly Trp Asp 465 470 475 480
Ala Leu Thr Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Lys Asn Phe 485 490 495
Phe He Gin Val Leu Glu Ala Asp Thr Thr Gin Ήιγ Val Gin Asn Leu 500 505 510
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Val Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala 515 520 525
Ala Thr Arg Tyr Tyr lie Thr Leu Arg Gly Val Thr Gin Asp Phe Gly 530 535 540
Thr Ala Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met 545 550 555 560
Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn 565 570 575
Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gin Phe Thr He Gin Val Gin 580 585 590 •39- 157262·序列表.doc 201209063
Glu Ala Asp Gin Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser 595 600 605
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Val Glu Val Val Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp lie Phe Glu Ala Gin 645 650 655
Lys lie Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His 660 665 670 <210> 104 <211> 2013 <212> m <213>人工序列 <220> <223> 來自大腸桿酋之 TNC Fn5 muAlA2 huA3 avi his 生物素=pETR7479 (DNA) <400> 104 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 g£ttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720 ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780 gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840 tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900 agcctgaccc tactgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960 agcctgccca ctggacagtg ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020 ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggccgg 1080 cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagg aagtgcccag cctggaaaac Π40 ctgaccgtga ccgaggccgg ctgggacggc ctgcggctga actggaccgc cgacgacctg 1200 gcctacgagt acttcgtgat ccaggtgcag gaagccaaca acgtcgagac agcccacaac 1260 ttcaccgtgc ccggcaacct gagagccgcc gacatccccg gcctgaaggt ggccacatcc 1320 157262·序列表.doc -40- ⑧ 1380 201209063 taccgggtgt ccatctacgg cgtggccagg ggctaccgga cccccgtgct gtccgccgag acaagcaccg gcaccacgcc gaacctgggc gaagtgaccg tggcggaagt gggttgggat gcgctgaccc tgaattggac cgcaccggaa ggcgcgtata aaaacttttt catccaggt£ ctggaagcgg ataccaccca gaccgtgcag aacctgaccg tgccgggtgg tctgcgtagc gtggatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cgttattaca ttaccctgcg tggcgtgacc caggattttg gcaccgcgcc gctgtctgtg gaagtgctga ccgaggaggt acccgacatg ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt cgaagaggcc cacaatctga cagtgccagg cagcctgcgg agcatggaaa tccccggcct gagagccggc accccctaca ccgtgaccct gcacggcgaa gtgcggggcc acagcaccag acccctggcc gtggaagtgg tcacagctag cggcctgaac gacatcttcg aggctcagaa aatcgaatgg cacgaaggta cccatcacca tcaccaccac taa <210> 105 <211> 773 <2J2> PRT <213>人工序列 <220> <223> HEK 人類 TNC1-8 <400> 105
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
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Thr Glu Glu Thr Val Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr 35 40 45
Glu Tyr Leu Val Val Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met 50 55 60
Gin Phe Arg Val Pro Gly Asp Gin Thr Ser Thr lie He Arg Glu Leu 65 70 75 80
Glu Pro Gly Val Glu Tyr Phe lie Arg Val Phe Ala lie Leu Glu Asn 85 90 95
Lys Lys Ser lie Pro Val Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala 100 105 HO
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Leu Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gin lie Glu 195 200 205
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Leu Ala Glu He Asp Gly lie Glu Leu Thr Tyr Gly lie Lys Asp Val 225 230 235 240
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Ser lie Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu lie 260 265 270
Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr 275 280 285
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Tyr Arg lie Lys Tyr Ala Pro lie Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val 325 330 335
Asp Val Pro Lys Ser Gin Gin Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly 340 345 350
Leu Arg Pro Gly Thr Glu Tyr Gly lie Gly Val Ser Ala Val Lys Glu 355 360 365
Asp Lys Glu Ser Asn Pro Ala Thr lie Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp 370 375 380
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Ser Glu Ala Leu Ala Arg Trp Gin Pro Ala lie Ala Thr Val Asp Ser 580 585 590
Tyr Val lie Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu lie Thr Arg Thr 595 600 605
Val Ser Gly Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala 610 615 620
Thr Glu Tyr Thr Leu Arg lie Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gin Lys Ser 625 630 635 640
Ser Thr lie Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp 645 650 655
Leu Thr Ala Thi Glu Val Gin Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg 660 665 670
Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser Val 675 680 685
Asp Gly Thr Val Lys Glu Val He Val Gly Pro Asp Thr Thr Ser Tyr 690 695 700
Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Set Thr His Tyr Thr Ala Lys He Gin 705 710 715 720
Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met He Gin Thr lie Phe Thr 725 730 735
Thr Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn 740 745 750
Asp lie Phe Glu Ala Gin Lys lie Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His 755 760 765 •43· 157262-序列表.doc 201209063
His His His His His 770 <210> 106 <211> 2322 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223〉HEK 人類 TNC1-8(DNA) <400> 106 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60 gtgtctcctc ccaaagacct cgttgtgaca gaagtgacgg aagagacggt caacctggcc 120 tgggacaatg agatgcgggc cacagagtac cttgtcgtgt acacgcccac ccacgagggt 180 ggtctggaaa tgcagttccg tgtgcctggg gaccagacgt ccaccatcat ccgggagctg 240 gagcctggtg tggagtactt tatccgtgta tttgccatcc tggagaacaa gaagagcatt 300 cctgtcagcg ccagggtggc cacgtactta cctgcacctg aaggcctgaa attcaagtcc 360 atcaaggaga catctgtgga agtggagtgg gatcctctag acattgcttt tgaaacctgg 420 gagatcatct tccggaatat gaataaagaa gatgagggag agatcaccaa aagcctgagg 480 aggccagaga cctcttaccg gcaaactggt ctagctcctg ggcaagagta tgagatatct 540 ctgcacatag tgaaaaacaa tacccggggc cctggcctga agagggtgac caccacacgc 600 ttggatgccc ccagccagat cgaggtgaaa gatgtcacag acaccactgc cttgatcacc 660 tggttcaagc ccctggctga gatcgatggc attgagctga cctacggcat caaagacgtg 720 ccaggagacc gtaccaccat cgatctcaca gaggacgaga accagtactc catcgggaac 780 ctgaagcctg acactgagta cgaggtgtcc ctcatctccc gcagaggtga catgtcaagc 840 aacccagcoa aagagacctt cacaacaggc ctcgatgctc ccaggaatct tcgacgtgtt 900 tcccagacag ataacagcat caccctggaa tggaggaatg gcaaggcagc tattgacagt 960 tacagaatta agtatgcccc catctctgga ggggaccacg ctgaggttga tgttccaaag 1020 agccaacaag ccacaaccaa aaccacactc acaggtctga ggccgggaac tgaatatggg 1080 attggagttt ctgctgtgaa ggaagacaag gagagcaatc cagcgaccat caacgcagcc 1140 acagagttgg acacgcccaa ggaccttcag gtttctgaaa ctgcagagac cagcctgacc 1200 ctgctctgga agacaccgtt ggccaaattt gaccgctacc gcctcaatta cagtctcccc 1260 acaggccagt gggtgggagt gcagcttcca agaaacacca cttcctatgt cctgagaggc 1320 ctggaaccag gacaggagta caatgtcctc ctgacagccg agaaaggcag acacaagagc 1380 aagcccgcac gtgtgaaggc atccactgaa caagccgcca tgggctcccc aaaggaagtc 1440 attttctcag acatcactga aaattc£gct actgtcagct ggagggcacc cacagcccaa 1500 gtggagagct tccggattac ctatgtgccc attacaggag gtacaccctc catggtaact 1560 gtggacggaa ccaagactca gaccaggctg gtgaaactca tacctggcgt ggagtacctt 1620 gtcagcatca tcgccatgaa gggctttgag gaaagtgaac ctgtctcagg gtcattcacc 1680 acagctctgg atggcccatc tggcctggtg acagccaaca tcactgactc agaagccttg 1740 gccaggtggc agccagccat tgccactgtg gacagttatg tcatctccta cacaggcgag 1800 157262·序列表.doc -44- 201209063 aaagtgccag aaattacacg cacggtgtcc gggaacacag tggagtatgc tctgaccgac 1860 ctcgagcctg ccacggaata cacactgaga atctttgcag agaaagggcc ccagaagagc 1920 tcaaccatca ctgccaagtt cacaacagac ctcgattctc caagagactt gactgctact 1980 gaggttcagt cggaaactgc cctccttacc tggcgacccc cccgggcatc agtcaccggt 2040 tacctgctgg tctatgaatc agtggatggc acagtcaagg aagtcattgt gggtccagat 2100 accacctcct acagcctggc agacctgagc ccatccaccc actacacagc caagatccag 2160 • gcactcaatg ggcccctgag gagcaatatg atccagacca tcttcaccac agtcgacctg 2220 gaagttctgt tccaggggcc cggctcaggc ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatc 2280 . gagtggcacg aggctcgagc tcaccaccat caccatcact ga 2322 ^ > > > Q123 11 lx 11 <2<2<2<2 107 19
PRT 人工序列 <220> <223>前導序列1 <400> 107
Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15
Ala His Ser <210> 108 <211> 57 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>前導序列1(DNA1) <400> 108 atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 109 <211> 57 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>前導序列1(DNA2) <400> 109 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 110 <211> 22 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>前導序列2 <400> 110
Met Asp Met Arg Val Pto Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15 • 45· 157262·序列表.doc 201209063
Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20 <210> 111 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 前導序列2 (DNA) <400> 111 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgt 66 <210〉 112 <211> 19 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 前導序列3 <400> 112
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Val His Ser
<210> 113 <211> 57 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223>前導序列3(DNA1) <400> 113 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcc 57 <210> 114 <211> 57 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>前導序列3(DNA1) <400> 114 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc 57 <210> 115 ·
<211> 57 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>前導序列3(DNA3) <400> 115 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct 57
<210> 116 <211> 26 <212> DNA 157262-序列表.doc -46· ⑧ 26201209063 <213>人工序列 <220> <223> LMB3 <400> 116 caggaaacag ctatgaccat gattac <210> 117 <2Π> 63 <212> m <213>人工序列 <220> <223〉UbLlb一新 <220> <221> misc feature <222> (26)..(27) <223> η 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (32)..(33) <223> η 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> η 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> η 係 a、c、g 或 t <400> 117 cactttggtc ccctggccga acgtnmnggg tgc nrnnnrnnmnna ccctgctgac agtaatacac 60 63 0>1>2>3> 1Λ 1Λ <2<2<2<2 118 28 DNA 人工序列 <220> <223> MS63 <400> 118 tttcgcacag taatatacgg ccgtgtcc 28 <210> 119 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> MS64 <400> 319 acgttcggcc aggggaccaa agtgg
<210> 120 <211> 60 <212> 諷 <213>人工序列 <220> <223> LiblH 157262·序列表.doc -47- 25 201209063 <220> <221> misc feature <222> (23)7.(24) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (26):.(27) <223> n 係 a ' c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (29)..(30) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (32):.(33) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (35):.(36) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 120 ggccgtatat tactgtgcga aannknnknn knnknnkttt gactactggg gccaaggaac 60 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> 30 <223> fdseqlong <400> 121 gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg <210> 122 <211> 69 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> RJH.LIB3 <220> <221> misc feature <222> (26)..(27) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <^23> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (41)..(42) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 122 gactttggtg ccctggccaa acgtrannggg mnnnmnaccni nnctgcaagc agtaataggt 60 157262·序列表.doc • 48 · ⑧ 201209063 ggcaaaatc 69 <210> 123 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> RJH31 <400〉 123 acgtttggcc agggcaccaa agtcgag 27 <210> 124 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> RJH32 <400> 124 tctcgcacag taatacacgg cggtgtcc 28 <210> 125 <211> 94 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> L1B88_2 <220> <221> misc difference <222> (29)..(55) <223> (33% GAC Asp; 26% C3GT Gly; 10% GAA Glu; 9% OGT Arg; 7% Lys; 6% (ΠΤ Val; 5% TCT Ser; 4% CFG Leu)l - (23% GGT Gly; 17% TAC Tyr; 16¾ TCT Ser; 11¾ GCT Ala; 9% OGT Arg; 7% AAC Asn; 6% ACT Thr; 6% GTT Val; 5% CCX5 Pro)8 <220> <221> misc_feature <222> (30)..(33) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (35)..(36) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <22]> misc feature <222> (38)7.(39) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (41)..(42) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc feature <222> (44)..(45) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> -49- 157262-序列表.doc 201209063 <221> misc」eature <222> (50)7.(51) <223> n 係 a、c、g 或 t 0>]>2>3> 2 2 2 2 <2<2<2<2 misc一feature (53)7.(54) n 係 a、c、g 或 t <400> 125 ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagabn nnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbtttga 60 ctactggggc caagggacca ccgtgaccgt ctcc 94 <210> 126 <211> 63 <212> DNA <3l3>人工序列 <220> <223> AM_VklA30JLlJ)a <400> 126 cctggcttct gctggtacca gcctaaatca ttacgaatgc cctgacttgc ccggcaggtg 60 atg 63 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <2]3>人工序列 <220> <223> RJH50(VklA30_Ll/L2_fo) <400> 127 gctggtacca gcagaagcca gggaaag 27 <210> 】28 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> RJH51(VklA30.BsiWLba) <>128 ggtgcagcca ccgtacgctt gatctc 26 0>1>2>3> <21<2I<21<21 129 61 DNA 人工序列 <220> <223> AM_VklA30_L2_ba <400> 129 cttgatggga cgccactctg caaactggac gcagcataga tcaggcgctt aggggctttc 60 <2】0> 130 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> RJH52(VklA30-L2/L3) 157262-序列表.doc -50- 201209063 <400〉 130 ttgcagagtg gcgtcccatc aaggttc 27 <210> 131 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> RJH53 <400> 131 catcagggcc tgagctcgcc cgtcac 26 <210> 132 <211> 62 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> AM_DP88.Hl_ba_opt <400> 132 gtccaggggc ctgtcgcacc cagcttatag cgtagctgct gaatgtgcct ccggaggcct 60 tg 62 <210> 133 <211> 28 <212> TO <213>人工序列 <220> <223> RJH54(DP88_Hl/H2„fo) <400> 133 ataagctggg tgcgacaggc ccctggac 28
<210> 134 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> MS52 <400> 134 gaagaccgat gggcctttgg tgctag 26 <210> 135 <211> 83 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> AM_DP88_H2_ba <400> 135 gaccctgccc tggaacttct gtgcgtagtt tgcggtacca aagataggga tgatccctcc 60 catccactcg agcccttgtc cag 83 <210> 136 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> RJH55 (DP88.H2H3.fo) -51- 157262·序列表.doc 201209063 <400〉 136 tacgcacaga agttccaggg cagggtcac 157262-序列表.doc -52- ⑧

Claims (1)

  1. 201209063 七、申請專利範圍： 1. 一種特異性結合腱生蛋白（tenascin) C之A2結構域（TNC A2)之抗體，其中該抗體經糖改造以具有增強之效應子 功能。 • 2_ —種特異性結合腱生蛋白C之A2結構域（TNC A2)之抗 . 體，其中該抗體包含至少一個選自以下之群之重鏈或輕 鏈互補決定區（CDR) : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33 ' SEQ ID NO: 35 ' SEQ ID NO: 37 ' SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45及SEQ ID NO: 47或其組合。 3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該 重鏈可變區包含 (a) 選自以下之群之重鏈CDR1 : SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5及 SEQ ID NO: 7 ; (b) 選自以下之群之重鏈CDR2 : SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23及 SEQ ID NO: 25 ;及 (c) SEQ ID NO: 27之重鏈 CDR3。 4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，該 157262.doc 201209063 輕鏈可變區包含 (a) 選自以下之群之輕鏈CDRl : SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31 及 SEQ ID NO: 33 ; (b) 選自以下之群之輕鏈CDR2 : SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: · 43及 SEQ ID NO: 45 ;及 . (c) SEQ ID NO:47 之輕鏈 CDR3。 5. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體不包含以下之組合： 選自 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7之群 之重鏈CDRl、選自 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 15及 SEQ ID NO: 21之群之重鏈CDR2、SEQ ID NO: 27之重鏈 CDR3、SEQ ID NO: 29 之輕鏈 CDRl、SEQ ID NO: 35 之 輕鏈 CDR2 及 SEQ ID NO:47 之輕鏈 CDR3。 6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該 重鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及 SEQ ID NO: 63。 7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，該 輕鏈可變區包含選自以下之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: · 73、SEQ ID NO: 77 ' SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89。 8. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體不包含以下之組合： 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5 9之重鏈可變區與包含胺基 酸序列SEQ ID NO: 55或SEQ ID NO: 57之輕鏈可變區。 157262.doc 201209063 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含免疫球蛋白之Fc 區或等致於該Fc區之區域。 如請求項9之抗體，其中該Fc區係IgGFc區。 &請求項1或2之抗體，其中該抗體係全長IgG類抗體。 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含人類恆定區。 如請求項1或2之抗體，其中該抗體係人類抗體。 士口讀'求項1或2之抗體，其中該抗體包含糖改造之Fc區》 士〇請求項14之抗體，其中該抗體與非糖改造之抗體相比 在該Fc區中具有提高比例之非岩藻糖基化寡糖。 如請求項14之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約1〇〇〇/0 之N-連接寡糖係非岩藻糖基化寡糖。 如請求項14之抗體，其中該抗體與非糖改造之抗體相比 在該以區中具有提高比例之二等分型（bisected)寡糖。 如請求項14之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約1〇〇% 之N-連接寡糖係二等分型寡糖。 如請求項14之抗體，其中該Fc區中至少約20%至約50% 之N-連接寡糖係二等分型非岩藻糖基化募糖。 如請求項1或2之抗體，其中該抗體具有增強之效應子功 能及/或增強之^受體結合親和力。 如請求項20之抗體，其中該增強之效應子功能係增強之 ADCC。 如請求項1或2之抗體，其中該抗體係親和力成熟的。 如請求項1或2之抗體，其中該抗體以低於約1 μΜ之KD值 結合人類TNC A2。 157262.doc 201209063 24. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體結合人類組織中之 TNC A2。 25. —種經分離之多核苷酸，其編碼形成如請求項1至24中 任一項之抗體之一部分的多肽。 26. —種經分離之多肽，其由如請求項25之多核苷酸編碼。 2 7 · —種組合物，其包含第一經分離之多核苦酸，編碼包含 選自以下之群之序列之多肽：SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 63 ;及第二經分離之多核苷酸，編 碼包含選自以下之群之序列之多肽：SEQ ID NO: 55、 SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85及 SEQ ID NO: 89。 28. —種載體，其包含如請求項25之多核苷酸。 29. —種宿主細胞，其包含如請求項25之多核苷酸、如請求 項27之組合物或如請求項28之載體。 30. 如請求項29之宿主細胞，其中該宿主細胞已經操作以表 現提高量之一或多種具有GnTIII活性之多肽。 31. 如請求項30之宿主細胞，其中該具有GnTIII活性之多肽 係包含GnTIII之催化結構域及Manll之高爾基體定位結構 域的融合多肽。 32. 如請求項30或31之宿主細胞，其中該宿主細胞已經進一 步操作以表現提高量之一或多種具有Manll活性之多 肽。 33. —種產生特異性結合腱生蛋白C之A2結構域之抗體之方 157262.doc ⑧ 201209063 法’該方法包含 a) 如請求項29之宿主細胞在培養基中在允許表現該抗體 之條件下培養，及 b) 回收該抗體。 34. —種產生特異性結合腱生蛋白c之A2結構域之抗體之方 法，該方法包含 a) 如請求項30至32中任一項之宿主細胞在培養基中在允 許表現該抗體及該抗體之Fc區上存在之寡糖由該具有 GnTIII活性之多肽修飾的條件下培養，及 b) 回收該抗體。 35. —種特異性結合腱生蛋白c之A2結構域之抗體，其中該 抗體係由如請求項3 3或3 4之方法產生。 3 6. —種抗體偶聯物（conjugate)，其包含如請求項1至24中任 一項之抗體及細胞毒性劑。 37. —種醫藥調配物，其包含如請求項1至24中任一項之抗 體及醫藥上可接受之載劑。 38. 如請求項37之醫藥調配物，其進一步包含其他治療劑。 39. 如請求項1或2之抗體，其用作藥劑。 40. 如請求項1或2之抗體，其用於治療特徵在於表現丁]^(： A2 之疾病。 41. 如請求項40之抗體，其中該疾病係癌症。 42. 如請求項1或2之抗體，其用於誘導腫瘤細胞或腫瘤基質 細胞之細胞溶解。 43. —種如凊求項1至24中任一項之抗體之用途，其用於製 157262.doc 201209063 造藥劑。 44. 一種如請求項1至24中任一項之抗體或如請求項37或π 之醫藥調配物之用途，其用於製造用以治療患有特徵在 於TNC Α2表現之疾病之個體的藥劑。 45. 如請求項44之用途，其中該藥劑進一步包含其他治療劑 或與該其他治療劑組合使用。 46. 如請求項44或45之用途，其中該疾病係癌症。 47. —種如請求項1至24中任一項之抗體或如請求項37或“ 之醫藥調配物之用途，其用於製造用以誘導腫瘤細胞或 腫瘤基質細胞之細胞溶解的藥劑。 48. 如請求項47之用途，其中該細胞溶解係由該抗體之抗體 依賴性細胞毒性誘導。 49. 一種如請求項1至24中任一項之抗體之用途，其用於製 造用以診斷特徵在於表現TNC Α2之疾病之診斷劑，其中 該診斷劑進一步包含允許檢測該抗體與TnC Α2之複合體 之標記。 50. —種診斷劑，其包含如請求項1至24中任一項之抗體及 允許檢測該抗體與TNC Α2之複合體之標記。 157262.doc
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