TW201326212A - 抗－ｍｃｓｐ抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供抗-MCSP抗體及其使用方法。

Description

抗-MCSP抗體

本發明係關於抗-MCSP抗體及使用該等抗體治療及診斷疾病之方法。

本申請案主張優先於2011年8月23日申請之歐洲專利申請案第EP 11178393.2號，其揭示內容係全文以引用方式併入本文中。

MCSP

黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)係在大多數黑素瘤癌症中表現之大型跨膜蛋白聚糖。MCSP亦在其他癌症中表現，包括神經膠胚細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、一些類型之ALL及AML及基底細胞癌。其用作早期細胞表面黑素瘤進展標記且參與刺激腫瘤細胞增殖、轉移、遷移、侵犯及血管發生。Staube,E.等人，FEBS Letters,527：114-118(2002)；Campoli,M.等人，Crit.Rev.Immun.24：267-296(2004)；Vergilis,I.J.,J Invest Dermatol,125：526-531(2005)；Yang,J.,JCB,165：881-891(2004)；Luo,W.,J.Immuno.,176：6046-6054(2006)。

抗體糖基化

寡糖組份可顯著影響與治療性糖蛋白之效能相關之性質，包括物理穩定性、對蛋白酶侵襲之抗性、與免疫系統之相互作用、藥物動力學及特定生物活性。該等性質可能不僅取決於寡糖之存在或不存在，且亦取決於寡糖之具體 結構。可在寡糖結構與糖蛋白功能之間進行一些歸納。舉例而言，某些寡糖結構經由與特定碳水化合物結合蛋白之相互作用介導自血流快速清除糖蛋白，而其他寡糖結構可與抗體結合並觸發不期望免疫反應(Jenkins等人，Nat Biotechnol 14,975-81(1996))。

IgG1型抗體(癌症免疫療法中最常用之抗體)係糖蛋白，其在每一CH2結構域之Asn 297處具有保守N-連接糖基化位點。兩個附接至Asn 297之複雜雙觸角寡糖隱藏在CH2結構域之間，從而與多肽骨架形成廣泛接觸，且其存在對抗體介導效應子功能(例如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))至關重要(Lifely等人，Glycobiology 5,813-822(1995)；Jefferis等人，Immunol Rev 163,59-76(1998)；Wright及Morrison,Trends Biotechnol 15,26-32(1997))。

單株抗體之細胞介導之效應子功能可藉由改造其寡糖組份來增強，如Umana等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)及美國專利第6,602,684號(WO 99/54342)所述。Umana等人顯示，β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化形成二等分型寡糖之糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過表現顯著提高彼等細胞中所產生抗體之活體外ADCC活性。組合物中Asn 297碳水化合物之改變或其消除亦影響抗體Fc-結構域與Fc.γ.R及C1q蛋白之結合(Umana等人，Nat Biotechol 17,176-180(1999)；Davies等人，Biotechnol Bioeng 74,288-294(2001)；Mimura等人，J Biol Chem 276,45539-45547(2001)； Radaev等人，J Biol Chem 276,16478-16483(2001)；Shields等人，J Biol Chem 276,6591-6604(2001)；Shields等人，J Biol Chem 277,26733-26740(2002)；Simmons等人，J Immunol Methods 263,133-147(2002))。

本發明提供抗-MCSP抗體及其使用方法。本發明之一態樣提供結合人類MCSP之膜近端表位之分離抗體，其中該抗體已經過糖基化改造以修飾Fc區中之寡糖，且其中該抗體具有與未經過糖基化改造之抗體相比增強之ADCC效應子功能。在一實施例中，人類MCSP之膜近端表位包含含有CSPG重複序列之結構域。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列14(SEQ ID NO：3)。在一實施例中，抗體之Fc區具有與未經過糖基化改造之抗體相比數目減少之岩藻糖殘基。在一實施例中，抗體之Fc區中具有與未經過糖基化改造之抗體相比增加之GlcNAc殘基與岩藻糖殘基之比率。在一實施例中，抗體之Fc區具有與未經過糖基化改造之抗體相比增加之二等分型寡糖之比例。在某些實施例中，抗體係單株抗體。在某些實施例中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在某些實施例中，抗體係全長IgG類抗體。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之HVR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：15之HVR-H2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：16之HVR-H3。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含HVR-L1，其包含胺基酸 序列SEQ ID NO：10；HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：17之HVR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO：18之HVR-H2及包含胺基酸序列SEQ ID NO：16之HVR-H3。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：29具有至少95%序列一致性之VH序列；與胺基酸序列SEQ ID NO：28具有至少95%序列一致性之VL序列；或與胺基酸序列SEQ ID NO：29具有至少95%序列一致性之VH 序列及與胺基酸序列SEQ ID NO：28具有至少95%序列一致性之VL序列。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：29之VH序列；SEQ ID NO：28之VL序列。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：29之VH序列及SEQ ID NO：28之VL序列。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之VH序列；與胺基酸序列SEQ ID NO：31具有至少95%序列一致性之VL序列；或與胺基酸序列SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之VH序列及與胺基酸序列SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之VL序列。

在一實施例中，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：29之VH序列；SEQ ID NO：28之VL序列。在一實施例中，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：29之VH序列及SEQ ID NO：28之VL序列。

本發明之另一態樣提供編碼上述抗-MCSP抗體之分離核酸。本發明之另一態樣提供包含此一核酸之宿主細胞。本發明之另一態樣提供產生抗體之方法，其包含培養此一宿主細胞以產生該抗體。

本發明之另一態樣提供包含上述抗-MCSP抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物。本發明之另一態樣提供包含上述抗-MCSP抗體及醫藥上可接受之載劑之免疫偶聯物。

本發明之另一態樣提供包含上述抗-MCSP抗體之免疫偶 聯物，其用作藥劑。本發明之另一態樣提供上述抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物，其用於治療癌症，尤其彼等表現MCSP之癌症，包括皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠質瘤(包括神經膠胚細胞瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)及白血病(包括ALL及AML)。

本發明之另一態樣提供上述抗-MCSP抗體之用途，其用於誘導細胞裂解。本發明之另一態樣提供上述抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物之用途，其用於製造藥劑(例如用於治療癌症之藥劑)或用於誘導細胞裂解。

本發明之另一態樣提供治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之上述抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物。癌症係(例如)表現MCSP之癌症，例如皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠質瘤(包括神經膠胚細胞瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)及白血病(包括ALL及AML)。

本發明之另一態樣提供誘導個體之細胞裂解之方法，其包含向該個體投與有效量之上述抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物以誘導細胞裂解。

I.定義

出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸 序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。

「親和性」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和性」係指固有結合親和性，其反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)之間之1：1相互作用。分子X對其配偶體Y之親和性通常可藉由解離常數(Kd)表示。親和性可藉由業內已知之常用方法(包括本文所述之彼等)來量測。量測結合親和性之具體說明性及實例性實施例闡述於下文中。

「親和性成熟」抗體係指與不具有一或多個超變區(HVR)中之一或多個改變之親代抗體相比具有該等改變之抗體，該等改變改良抗體對抗原之親和性。

「血管生成性病症」係指任何血管發生失調，包括非贅瘤性及贅瘤性病況。贅瘤性病況包括(但不限於)下文所述之彼等。非贅瘤性病症包括(但不限於)不期望或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、斑狀牛皮癬、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病及其他增殖性視網膜病變(包括早產兒視網膜病變、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、老年性黃斑病變、糖尿病性黃斑水腫、角膜新生血管、角膜移植物新生 血管、角膜移植物排斥、視網膜/脈絡膜新生血管、隅角新生血管(neovascularization of the angle，發紅)、眼新生血管疾病)、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦脊髓膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷弗氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性發炎、肺炎、急性肺損傷/ARDS、膿毒病、原發性肺動脈高血壓、惡性肺積液、腦水腫(例如，與急性中風/封閉性頭部損傷/創傷相關)、滑囊發炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、多囊性卵巢疾病、子宮內膜異位、體液失調之第三間隙(胰腺炎、腔室症候群、燒傷、腸病)、子宮肌瘤、早產、慢性發炎(例如IBD(克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎))、腎同種異體移植物排斥、發炎性腸病、腎病症候群、不期望或異常組織腫塊生長(非癌症)、出血性關節、肥厚性瘢痕、頭髮生長受抑制、奧韋症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫、晶狀體後纖維增生症、硬皮症、沙眼、血管黏附、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水症、心包膜積液(例如與心包炎相關者)及胸腔積液。

術語「抗-MCSP抗體」及「結合MCSP之抗體」係指能以足夠親和性結合MCSP從而使得該抗體可用作靶向MCSP之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一實施例中，抗-MCSP抗體與無關非MCSP蛋白結合之程度低於該抗體與MCSP結合之約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合MCSP之抗體之解離常數(Kd)係1 μM、 100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10^-8 M或更低，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)。在某些實施例中，抗-MCSP抗體結合MCSP中在來自不同物種之MCSP之間保守之表位。

術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現期望抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、雙鏈抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。

與參考抗體「結合相同表位之抗體」係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多之抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更多。本文中提供實例性競爭分析。

術語「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長/增殖失調之生理病況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤(例如，何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、骨癌(例如骨肉瘤、軟骨肉瘤、依汶氏肉瘤(Ewing's sarcoma))、胃腸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、***癌、皮膚癌(例如黑素瘤及基底細胞癌)、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴增生性病症及各種類型之頭頸癌。

術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與一定程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增殖性病症係癌症。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。抗體有五大類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。

本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春鹼、滅必治(etoposide))、 多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如具有細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

「效應子功能」係指彼等歸因於抗體Fc區之生物活性，其隨抗體同種型而變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需劑量下及在所需時間段內可有效達成期望治療或預防結果之量。

術語「Fc區」在本文中係用於界定免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號符合EU編號系統(亦稱為EU索引)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈之抗體。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及源自其之子代(不考慮傳代次數)。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，且可含有突變。本文包括經篩選或選擇與原始轉化細胞具有相同功能或生物活性之突變體子代。

「人類抗體」係具有如下胺基酸序列之抗體：其對應於人類或人類細胞產生之抗體或利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列自非人類來源獲得之抗體。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

「人類共有框架」係代表在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案91-3242, Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一實施例中，對於VL而言，亞組係如上述Kabat等人之亞組κI。在一實施例中，對於VH而言，亞組係如上述Kabat等人之亞組III。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之彼等。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經受人類化之抗體。

本文所用術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域區中序列高度可變及/或形成結構上界定之環(「超變環」)之區域中的每一者。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自超變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。)實例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2 之50-65及H3之95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)除VH中之CDR1外，CDR一般包含形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據上述Kabat等人來編號。

「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之抗體。

「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體係人類。

「經分離」抗體係已與其天然環境之組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至純度大於95%或99%，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電 泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述，參見(例如)Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

「經分離」核酸係指已與其天然環境之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之該核酸分子，但該核酸分子存於染色體外或存於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。

「編碼抗-MCSP抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括單一載體或多個單獨載體中之該(等)核酸分子及存於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。

本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，即構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，但可能之變體抗體除外，例如含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變體，該等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑中之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵在於得自實質上同源之抗體群體，且不應視為需要藉由任一特定方法產生該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體顯示法及利用含有所有或部分之人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。

「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記偶聯之抗體。裸抗體可存於醫藥調配物中。

「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道耳頓(dalton)之異源四聚體糖蛋白，其由雙硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈組成。自N末端至C末端，每一重鏈依次具有可變區(VH，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)及三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈依次具有可變區(VL，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ)。

所用術語「包裝插頁」係指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌症及/或該等治療產品之使用警告之資訊。

相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入間隔(若需要)以達到最大序列一致性百分比後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比，且任何保守取代皆不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成比對，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟 習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，胺基酸序列一致性%之值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司設計，且原始碼已與用戶文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其係以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆係藉由ALIGN-2程式設定且不改變。

在採用ALIGN-2比較胺基酸序列之情形中，給定胺基酸序列A相對於(to、with或against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者其可表述為具有或包含相對於給定胺基酸序列B之一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下來計算：100乘以分數X/Y其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2在該程式對A與B之比對中評定為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%之 值皆係如前一段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。

術語「醫藥調配物」係指呈容許所含活性成份之生物活性有效之形式且不含對投與該調配物之個體具有不可接受之毒性之其他組份之製劑。

「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份以外之對個體無毒性之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

除非另有指示，否則本文所用術語「MCSP」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠))之任何天然MCSP(黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖)。該術語涵蓋「全長」未經處理之MCSP以及自細胞中之處理產生之任一形式之MCSP。該術語亦涵蓋MCSP之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。MCSP亦稱作硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、硫酸軟骨素蛋白聚糖NG2、高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)及黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖。實例性人類MCSP之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：1中。亦參見Pluschke G.,等人，Molecular cloning of a human melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：9710-9715(1996)；Staub E.等人，A novel repeat in the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan defines a new protein family,FEBS Lett.527：114-118(2002)；Genbank AccessionNo：NP_001888。

本文所用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如 「treat」或「treating」)係指試圖改變正治療個體之自然病程之臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之合意效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態以及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。

術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，且每一結構域包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合特定抗原之抗體之VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域文庫來分離結合該抗原之抗體。例如，參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

本文所用術語「載體」係指能傳送與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入已引入該載體之宿主細胞之基因組中之載體。某些載體能引導與其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。

II.組合物及方法

本發明提供可用於治療及/或診斷細胞增殖性疾病(例如癌症)之抗-MCSP抗體。在某些實施例中，提供結合MCSP之膜近端表位之抗體。在某些實施例中，提供結合MCSP之具有增強之效應子功能之抗體。

A.實例性抗-MCSP抗體

在一態樣中，本發明提供結合MCSP之經分離抗體。具體而言，本發明所提供抗-MCSP抗體結合人類MCSP之膜近端表位。如Staub E.,等人，FEBS Lett.527：114-118(2002)中所論述，MCSP之膜近端區域包括多個新穎重複序列結構域(稱作CSPG重複序列結構域)。圖3。本發明抗-MCSP抗體結合存於人類MCSP之膜近端結構域中之表位，該膜近端結構域包含含有CSPG重複序列之結構域。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列14，其對應於人類MCSP之胺基酸1937-2043。在一實施例中，CSPG重複序列14結構域具有SEQ ID NO：3中所示之胺基酸序列。在另一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列14及CSPG重複序列15之至少一部分。CSPG重複序列15結構域對應於人類MCSP之胺基酸2044-2246。在一實施例中，CSPG重複序列-15結構域具有胺基酸序列SEQ ID NO：4。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：5。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：5且不含天然跨膜結構域。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列13-15。在一實 施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：6。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：6且不含天然跨膜結構域。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列12-15。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：7。在一實施例中，含有CSPG重複序列之結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：7且不含天然跨膜結構域。在某些實施例中，天然跨膜結構域係VIIPMC LVLLLLALIL PLLFY(UniProt登記號Q6UVK1)(SEQ ID NO：44)。

在一實施例中，抗-MCSP抗體誘導表現MCSP之細胞裂解。可藉由任一機制來誘導裂解，例如藉由介導效應子功能(例如C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化)來誘導，或藉由直接誘導細胞之細胞凋亡來誘導。

在一實施例中，抗-MCSP抗體經過糖基化改造以與未經過糖基化改造之親代抗-MCSP抗體相比增強至少一種效應子功能。效應子功能之增強係增強之與Fc受體之結合親和性；增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)；增強之與NK細胞之結合；增強之與巨噬細胞之結合；增強之與多形核細胞之結合；增強之與單核球之結合；誘導細胞凋亡之直接信號轉導；增強之樹突細胞成熟；或增強之T細胞初免。經過糖基化改造之抗-MCSP抗體在患有表現MCSP之癌症 之個體中與針對相同MCSP表位之未經過糖基化改造之抗體相比提供存活益處。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。在另一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在一實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR- L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明抗-MCSP抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR：(i)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14，(ii)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10，(ii)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺 基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。在另一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。

在一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。在一實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明抗-MCSP抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR：(i)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17，(ii)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列； 及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13，(ii)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序 列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體，其包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：27具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：27中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：27之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO： 16。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 26中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：26之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：26之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：32具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：32中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：32之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：31具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VL序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：31中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗- MCSP抗體包含SEQ ID NO：31之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之VL，包括該等序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：29具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：29中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：29之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：28具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VL序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：28中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：28之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：29之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之VL，包括該等序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：35具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之重鏈序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體仍保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：35中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：35之重鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：34具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之輕鏈序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體仍保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 34中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：34之輕鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之重鏈及如上文所提供任一實施 例中之輕鏈。在一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：35之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：34之輕鏈序列，包括該等序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，抗-MCSP抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：37具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈序列。 在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之重鏈序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：37中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：37之重鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：36具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之輕鏈序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合MCSP之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 36中已有總計1至10個胺基酸經取代、***及/或缺失。在某些實施例 中，取代、***或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗-MCSP抗體包含SEQ ID NO：36之輕鏈序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗-MCSP抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之重鏈及如上文所提供任一實施例中之輕鏈。在一實施例中，抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之輕鏈序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在另一態樣中，本發明提供與本文所提供抗-MCSP抗體結合相同表位之抗體。

在一實施例中，提供與具有包含胺基酸序列SEQ ID NO：27之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：26之VL之抗-MCSP抗體結合相同表位之抗體。在另一實施例中，提供與具有包含胺基酸序列SEQ ID NO：32之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：31之VL之抗-MCSP抗體結合相同表位之抗體。

在其他實施例中，提供與本文所述抗-MCSP抗體競爭結合相同表位之抗體。

在一實施例中，與抗-MCSP抗體結合相同表位及/或競爭結合相同表位之抗體呈現效應子功能活性，例如Fc介導之細胞毒性(包括ADCC活性)。

在一實施例中，抗-MCSP抗體結合人類MCSP之膜近端表位。在一實施例中，抗-MCSP抗體結合人類MCSP之包含含有CSPG重複序列之結構域之膜近端表位。在一實施 例中，抗-MCSP抗體結合人類MCSP之膜近端表位，該膜近端表位來自胺基酸序列SEQ ID NO：5，位於該序列內或與該序列重疊。在一實施例中，抗-MCSP抗體結合人類MCSP之膜近端表位，該膜近端表位來自胺基酸序列SEQ ID NO：4，位於該序列內或與該序列重疊。在一實施例中，抗-MCSP抗體結合人類MCSP之膜近端表位，該膜近端表位來自胺基酸序列SEQ ID NO：3，位於該序列內或與該序列重疊。

在本發明之另一態樣中，上文任一實施例之抗-MCSP抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一實施例中，抗-MCSP抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙鏈抗體或F(ab')₂片段。在另一實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型。

在一實施例中，抗-MCSP抗體係小鼠單株抗體LC007。此抗體之重鏈及輕鏈之核酸序列分別存於SEQ ID NO：37及36中。在一實施例中，抗-MSCP抗體係源自小鼠單株抗體LC007之嵌合抗體。在一實施例中，抗-MSCP抗體係源自小鼠單株抗體LC007之人類化抗體。在一實施例中，抗-MSCP抗體係源自小鼠單株抗體LC007之人類抗體。

在另一態樣中，上文任一實施例之抗-MCSP抗體可單獨或組合納入下文章節1-7中所述特徵中之任一者：

1.抗體親和性

在某些實施例中，本文所提供抗體之解離常數(Kd)1 μM、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM(例如10^-8 M或更低，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)。

在一實施例中，Kd係如以下分析所述藉由利用所關注抗體之Fab形式及其抗原實施之放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測。Fab對抗原之溶液結合親和性係藉由以下來量測：在滴定系列之未標記抗原之存在下，用最低濃度之(¹²⁵I)標記抗原平衡Fab，然後用抗Fab抗體塗佈之板捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立用於分析之條件，將MICROTITER^®多孔板(Thermo Scientific)用存於50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml之捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈過夜，且隨後在室溫(約23℃)下用存於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白封阻2至5小時。在非吸附性板(Nunc 269620號)中，將100 pM或26 pM[¹²⁵I]抗原與所關注Fab之連續稀釋物混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體(Fab-12)之評價一致)。然後將所關注Fab培育過夜；然而，可繼續培育更長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。之後，將混合物轉移至捕獲板以在室溫下培育(例如，1小時)。然後移除溶液，並用存於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^®)將板洗滌8次。在已乾燥板時，添加150 μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20^TM；Packard)，且將板在TOPCOUNT^TM γ計數器上(Packard)計數10分鐘。選擇每一Fab所獲得之最大結合低於或等於 20%之濃度用於競爭性結合分析。

根據另一實施例，在25℃下，使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE^®-2000或BIACORE^®-3000(BIAcore公司，Piscataway，NJ)以約10個反應單位(RU)之固定化抗原CM5晶片來量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，之後以5 μl/分鐘之流速注射以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。在抗原注射後，注射1 M乙醇胺以封阻未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以約25 μl/min之流速注射Fab存於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋物(0.78 nM至500 nM)。締合速率(k_on)及解離速率(k_off)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE^®評估軟體3.2版)藉由同時擬合結合及解離感測圖來計算。以比率k_off/k_on來計算平衡解離常數(Kd)。例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上文表面電漿子共振分析獲得之締合速率(on-rate)超過10⁶ M^-1 s^-1，則該締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術在25℃下在濃度遞增之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)之升高或降低，如在使用攪拌比色管之光譜儀(例如配備有停流設備之光譜儀(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。

2.抗體片段

在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見(例如)Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且活體內半衰期延長之Fab及F(ab')₂片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。

雙鏈抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分之抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第 6,248,516 B1號)。

抗體片段可藉由多種技術來製備，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)來產生，如本文所述。

3.嵌合及人類化抗體

在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係「類別轉換」之抗體，其中類別或亞類已相對於親代抗體發生變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保持親代非人類抗體之特異性及親和性。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR，或其部分)源自非人類抗體，且FR(或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和性。

人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一 步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(闡述FR改組之「導向選擇」方法)。

可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列之框架區(例如，參見Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(經體突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及自篩選FR文庫獲得之框架區(例如，參見Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

4.人類抗體

在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於 van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。

可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以因應抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其替代內源免疫球蛋白基因座或存於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已經鈍化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSE^TM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可藉由(例如)與不同人類恆定區組合來進一步修飾來自藉由該等動物產生之完整抗體之人類可變區。

人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類種間骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147： 86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類融合瘤)中者。人類融合瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。

亦可藉由分離選自人類源噬菌體顯示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。然後，可將該等可變結構域序列與期望人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。

5.源自文庫之抗體

可藉由在組合文庫中篩選具有期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知多種產生噬菌體顯示文庫及在該等文庫中篩選具有期望結合特徵之抗體之方法。該等方法綜述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人，編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。

在某些噬菌體顯示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜且在噬菌體文庫中將其隨機重組，然後可在該等文庫中篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常顯示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和性抗體且無需構築融合瘤。或者，可不經任何免疫即選殖天然譜(例如，來自人類)以提供針對眾多種非自體抗原亦及自體抗原之單一抗體源，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：自幹細胞選殖未重排V-基因片段，且使用含有隨機序列之PCR引物以編碼高可變CDR3區並在活體外達成重排，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。

自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視作人類抗體或人類抗體片段。

6.多特異性抗體

在某些實施例中，本文所提供抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對MCSP且另一種係針對任何另一抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合MCSP之兩個不同表位。亦可使用雙特異性抗體將細胞毒性劑集中至表現MCSP之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。

製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(例 如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體(例如，如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述)。

本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(例如，參見US 2006/0025576A1)。

本文之抗體或片段亦包括「雙重作用性FAb」或「DAF」，其包含結合MCSP以及另一不同抗原之抗原結合位點(例如，參見US 2008/0069820)。

7.抗體變體

在某些實施例中，涵蓋本文所提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可期望改良抗體之結合親和性及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由在編碼該抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或***及/或取代。可實施缺失、***及取代之任一組合以達成最終構築體，前提係該最終構築體具有期望特徵(例如抗原結合)。

a)取代、***及缺失變體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。取代誘變之目標位點包括HVR及FR。保守取代顯示於表1中之「保守取代」標題下。其他實質性變化顯示於表1中之「實例性取代」標題下，且參照胺基酸側鏈類別進一步闡述於下文中。可將胺基酸取代引入所關注抗體及 針對期望活性(例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)篩選之產物中。

可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代必須將該等類別中之一者之成員交換為另一類別。

一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，所選擇用於進一步研究之所得變體將相對於親代抗體改變(例如改良)某些生物學性質(例如，親和性增強、免疫原性降低)及/或將實質上保持親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和性成熟抗體，其可使用(例如)基於噬菌體顯示之親和性成熟技術(例如彼等本文所述者)便捷地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上顯示變體抗體並針對特定生物學活性(例如結合親和性)進行篩選。

可對HVR進行改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和性。可在HVR「熱點」(即，由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變之密碼子編碼之殘基，例如，參見Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行該等改變，且測試所得變體VH或VL之結合親和性。藉由構築二級文庫及自該等文庫重新選擇來達成親和性成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和性成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入所選擇 用於成熟之可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選文庫以鑑別任何具有期望親和性之抗體變體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR引導之方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可使用(例如)丙胺酸掃描誘變或建模特異性地鑑別參與抗原結合之HVR殘基。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些實施例中，取代、***或缺失可發生在一或多個HVR內，只要該等改變不顯著降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR進行不顯著降低結合親和性之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。該等改變可位於HVR「熱點」或SDR以外。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

可用於鑑別抗體中可靶向以供誘變之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所述。在此方法中，鑑別靶殘基中之一個殘基或殘基群(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並藉由中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，以抗原-抗體複合體之晶體結構鑑別抗體與抗原之間之接觸點。可將該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選者來靶向或排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。

胺基酸序列***包括胺基-及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽之範圍內)以及單一或多個胺基酸殘基之序列內***。末端***之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變體包括抗體與延長該抗體之血清半衰期之酶(例如用於ADEPT)或多肽之N末端或C末端融合物。

b)糖基化變體

在某些實施例中，改變本文所提供抗體以提高或降低抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列從而產生或移除一或多個糖基化位點來便捷地達成抗體中糖基化位點之增加或缺失。

倘若抗體包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可有所改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈雙觸角寡糖，其通常藉由N-連接附接至Fc區中CH2結構域之Asn297。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至雙觸角寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。

在一實施例中，提供碳水化合物結構中缺少附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之抗體變體。舉例而言，該抗體中之岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由相對於附接至Asn297之所 有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和計算岩藻糖在Asn297處之糖鏈內之平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中大約297位(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於297位上游或下游之約±3個胺基酸處，即介於294位與300位之間。該等岩藻糖基化變體可具有改良ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo公司)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺陷」抗體變體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞系(例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除之CHO細胞，例 如，參見Yamane-Ohnuki的，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)。

另外提供具有二等分寡糖之抗體變體，其中(例如)附接至抗體Fc區之雙觸角寡糖係藉由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。該等抗體變體可具有經改良CDC功能。該等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

因此，本發明另外係關於改良藉由宿主細胞產生之本發明抗-MCSP抗體之糖基化概況之方法，其包含在該宿主細胞中表現編碼本發明抗-MCSP抗體之核酸及編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之核酸或包含該等核酸之載體。具有糖基轉移酶活性之基因包括β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III(GnTII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、β(1,4)-半乳糖基轉移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶I(GnTI)及β(1,2)-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶II(GnTII)。在一實施例中，在宿主細胞中表現具有糖基轉移酶活性之基因之組合(例如，GnTIII及Man II)。同樣，該方法亦涵蓋在宿主細胞中表現一或多個編碼抗-MCSP抗體之多核苷酸，在該宿 主細胞中，糖基轉移酶基因已被破壞或以其他方式失活(例如，在宿主細胞中，編碼α1-6核心岩藻糖基轉移酶之基因之活性已被剔除)。在另一實施例中，本發明抗-MCSP抗體可在宿主細胞中產生，該宿主細胞另外表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸以改良糖基化模式。在一具體實施例中，具有GnTIII活性之多肽係融合多肽，其包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域。術語高爾基體定位結構域係指高爾基體駐留多肽中負責將該多肽錨定在高爾基複合體內之位置之胺基酸序列。通常，定位結構域包含酶之胺基末端「尾」。在另一較佳實施例中，本發明抗-MCSP抗體在表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸之宿主細胞中的表現產生Fc受體結合親和性增強且效應子功能增強之抗-MCSP抗體。因此，在一實施例中，本發明係關於宿主細胞，其包含(a)分離核酸，其包含編碼具有GnTIII活性之多肽之序列；及(b)分離之多核苷酸，其編碼本發明抗-MCSP抗體，例如結合人類MCSP之嵌合、靈長類化或人類化抗體。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域之融合多肽且高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II之定位結構域。生成該等融合多肽且使用其產生效應子功能增強之抗體之方法揭示於美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號中，其全部內容係以引用方式明確併入本文中。在一特定實施例中，由宿主細胞產生之經修飾抗-MCSP抗體具有IgG恆定區或其包含Fc區之 片段。在另一特定實施例中，抗-MCSP抗體係人類化抗體或其包含Fc區之片段。

藉由本發明宿主細胞產生之具有經改變糖基化之抗-MCSP抗體通常由於改良宿主細胞(例如，因表現糖基轉移酶基因)而呈現增強之Fc受體結合親和性及/或增強之效應子功能。較佳地，增強之Fc受體結合親和性係增強之與Fcγ活化受體(例如FcγRIIIa受體)之結合。增強之效應子功能較佳係以下中之一或多者之增強：增強之抗體依賴性細胞毒性、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞介素分泌、增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝入、增強之Fc介導之細胞毒性、增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合、增強之與多形核細胞(PMN)之結合、增強之與單核球之結合、增強之靶-結合抗體之交聯、增強之誘導細胞凋亡之直接信號轉導、增強之樹突細胞成熟及增強之T細胞初免。

在一態樣中，本發明提供與未經過糖基化改造之抗-MCSP抗體相比具有增強之效應子功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之抗-MCSP抗體(例如，變體抗體)之糖基型式(glycoform)。先前已闡述抗體之糖基化改造。例如，參見美國專利第6,602,684號，其係全文以引用方式併入本文中。自參與糖基化之基因活性經改變之宿主細胞產生抗-MCSP抗體之方法亦詳細闡述於本文中(例如，參見標題為「表現載體及宿主細胞」之先前章節)。本發明抗-MCSP抗體之ADCC之增強亦係藉由增強抗體對MCSP之親和性 (例如藉由親和性成熟或其他改良親和性之方法(參見Tang等人，J.Immunol.2007,179：2815-2823))來達成。本發明亦涵蓋該等方法之組合。

最近，對用於治療一些類型之癌症的未偶聯單株抗體(mAb)之臨床試驗獲得令人鼓舞之結果。Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997)；Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。已批准嵌合未偶聯IgG1用於低級或濾泡性B細胞性非何傑金氏淋巴瘤，Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997)；而另一未偶聯mAb(靶向實體***腫瘤之人類化IgG1)亦已在III期臨床試驗中顯示有前景之結果，Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。該兩種mAb之抗原分別在其腫瘤細胞中大量表現，且該等抗體在活體外及活體內藉由效應子細胞介導潛在的腫瘤破壞。與之相比，許多其他具有良好腫瘤特異性之未偶聯mAb不能觸發具有足以在臨床上有用之潛能之效應子功能。Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996)。對於該等較弱mAb中之一些mAb，目前正在測試輔助性細胞介素療法。添加細胞介素可藉由提高循環淋巴球之活性及數目來刺激抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996)。在白血球受體與抗體之恆定區(Fc)結合後觸發ADCC(對靶向細胞之裂解性攻擊)。Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。

不同但互補之提高未偶聯IgG1之ADCC活性之方法係改造抗體之Fc區。蛋白質改造研究已顯示，FcγR與IgG CH2結構域之鉸鏈下游區(lower hinge region)相互作用。Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)。然而，FcγR結合亦需要共價附接在CH2區中之保守Asn 297處之寡糖之存在，Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)；Wright及Morrison,Trends Biotech.15：26-31(1997)，從而表明寡糖及多肽二者皆直接促進相互作用位點，或需要寡糖來維持活性CH2多肽構象。因此，可探究對寡糖結構之修飾作為提高相互作用之親和性之方式。

IgG分子在其Fc區中載有兩個N-連接寡糖，每一重鏈上載有一個。作為任何糖蛋白，以糖基型式群體形式產生抗體，其共享相同多肽骨架但具有附接至糖基化位點之不同寡糖。通常發現於血清IgG之Fc區中之寡糖係複雜雙觸角類型(Wormald等人，Biochemistry 36：130-38(1997))，其具有低含量之末端唾液酸及二等分型N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)，以及不同程度之末端半乳糖基化及核心岩藻糖基化。一些研究表明，FcγR結合所需之極小碳水化合物結構位於寡糖核心內。Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)。

在工業及學術界用於產生未偶聯治療性mAb之小鼠源或倉鼠源細胞系通常將所需寡糖決定簇附接至Fc位點。然而，該等細胞系中表現之IgG缺少在血清IgG中少量發現之二等分型GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22 (1995)。與之相比，最近觀察到，大鼠骨髓瘤產生之人類化IgG1(CAMPATH-1H)在其一些糖基型式中載有二等分型GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995)。大鼠細胞源抗體達到與標準細胞系中產生之CAMPATH-1H抗體類似之最大活體外ADCC活性，但抗體濃度顯著較低。

CAMPATH抗原通常在淋巴瘤細胞上大量存在，且此嵌合mAb在不存在二等分型GlcNAc時具有高ADCC活性。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995)。在N-連接糖基化路徑中，藉由GnTIII添加二等分型GlcNAc。Schachter,Biochem.Cell Biol.64：163-81(1986)。

先前研究使用產生抗體之單一CHO細胞系，該細胞系預先經改造以按外部調節方式表現不同程度之GnTIII酶基因(Umaña,P.,等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999))。此方法首次確立糖基轉移酶(例如，GnTIII)之表現與經修飾抗體之ADCC活性之間之嚴格關聯。因此，本發明涵蓋抗-MCSP抗體，其包含Fc區或等效於Fc區之區域，該區域因改變糖基轉移酶基因在產生該抗體之宿主細胞中之表現程度而具有經改變糖基化。在一具體實施例中，基因表現程度之改變係GnTIII活性之提高。在抗體之Fc區中，提高之GnTIII活性提高二等分型寡糖之百分比，且降低岩藻糖殘基之百分比。此抗體或其片段具有增強之Fc受體結合親和性及增強之效應子功能。

本發明亦係關於產生本發明具有經修飾寡糖之抗-MCSP 抗體之方法，其包含(a)在容許產生本發明抗-MCSP抗體之條件下培養經改造以表現至少一種編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之核酸之宿主細胞，其中該具有糖基轉移酶活性之多肽係以足以修飾該宿主細胞產生之該抗-MCSP抗體之Fc區中之寡糖之量表現；及(b)分離該抗-MCSP抗體。在一實施例中，具有糖基轉移酶活性之多肽係GnTIII。在另一實施例中，存在兩種具有糖基轉移酶活性之多肽。在一特定實施例中，兩種具有糖基轉移酶活性之肽係GnTIII及ManII。在另一實施例中，具有糖基轉移酶活性之多肽係包含GnTIII之催化結構域之融合多肽。在另一具體實施例中，融合多肽另外包含高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域。較佳地，高爾基體定位結構域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位結構域。或者，高爾基體定位結構域選自由以下組成之群：甘露糖苷酶I之定位結構域、GnTII之定位結構域及α 1-6核心岩藻糖基轉移酶之定位結構域。藉由本發明方法產生之抗-MCSP抗體具有增強之Fc受體結合親和性及/或增強之效應子功能。通常，增強之效應子功能係以下中之一或多者：增強之Fc介導之細胞毒性(包括增強之抗體依賴性細胞毒性)、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞介素分泌、增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝入、增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合、增強之與單核球之結合、增強之與多形核細胞之結合、增強之誘導細胞凋亡之直接信號轉導、增強之靶-結合抗體之交聯、增強之樹突細胞 成熟或增強之T細胞初免。增強之Fc受體結合親和性較佳係增強之與Fc活化受體(例如FcγRIIIa)之結合。在一尤佳實施例中，ABM係人類化抗體或其片段。

在一實施例中，二等分型N-連接寡糖在抗-MCSP抗體之Fc區中之百分比佔總寡糖至少約10%至約100%，具體而言至少約50%，更具體而言至少約60%，至少約70%，至少約80%，或至少約90-95%。在另一實施例中，藉由本發明方法產生之抗體在Fc區中由於本發明方法對其寡糖進行修飾而具有升高比例之非岩藻糖基化寡糖。在一實施例中，非岩藻糖基化寡糖之百分比係至少約20%至約100%，具體而言至少約50%，至少約60%至約70%，且更具體而言至少約75%。非岩藻糖基化寡糖可係雜合或複雜類型。在另一實施例中，藉由本發明方法產生之抗體在Fc區中由於本發明方法對其寡糖進行修飾而具有升高比例之二等分型寡糖。在一實施例中，二等分型寡糖之百分比係至少約20%至約100%，具體而言至少約50%，至少約60%至約70%，且更具體而言至少約75%。在一尤佳實施例中，藉由宿主細胞及本發明方法產生之抗-MCSP抗體在Fc區中具有升高比例之二等分型非岩藻糖基化寡糖。二等分型非岩藻糖基化寡糖可係雜合或複雜類型。具體而言，可使用本發明方法來產生抗體，其中在抗體之Fc區中，至少約10%至約100%，具體而言至少約15%，更具體而言至少約20%至約50%，更具體而言至少約20%至約25%，且更具體而言至少約30%至約35%之寡糖係二等分型非岩藻糖基化寡糖。 本發明抗-MCSP抗體亦可包含Fc區，其中在該抗-MCSP抗體之Fc區中，至少約10%至約100%，具體而言至少約15%，更具體而言至少約20%至約25%，且更具體而言至少約30%至約35%之寡糖係二等分型雜合非岩藻糖基化寡糖。

在另一實施例中，本發明係關於藉由本發明方法產生之抗-MCSP抗體，其經改造以具有增強之效應子功能及/或增強之Fc受體結合親和性。增強之效應子功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：增強之Fc介導之細胞毒性(包括增強之抗體依賴性細胞毒性)、增強之抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、增強之細胞介素分泌、增強之免疫複合體介導之抗原呈遞細胞之抗原攝入、增強之與NK細胞之結合、增強之與巨噬細胞之結合、增強之與單核球之結合、增強之與多形核細胞之結合、增強之誘導細胞凋亡之直接信號轉導、增強之靶-結合抗體之交聯、增強之樹突細胞成熟或增強之T細胞初免。在一較佳實施例中，增強之Fc受體結合親和性係增強之與Fc活化受體(最佳FcγRIIIa)之結合。在一實施例中，抗體係完整抗體。在一實施例中，抗體係含有Fc區之抗體片段，或包括等效於免疫球蛋白之Fc區之區域之融合蛋白。

本發明另外提供產生及使用宿主細胞系統來產生本發明抗體之糖基型式之方法，該等糖基型式具有增強之Fc受體結合親和性(較佳增強之與Fc活化受體之結合)及/或具有增強之效應子功能(包括抗體依賴性細胞毒性)。可用於本發 明抗體之糖改造方法已更詳細地闡述於以下文獻中：美國專利第6,602,684號、美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號、美國專利申請公開案第2003/0175884 A1號、臨時美國專利申請案第60/441,307號及WO 2004/065540，每一專利之全部內容係全文以引用方式併入本文中。或者，本發明抗體可根據以下文獻中揭示之技術經過糖基化改造以在Fc區中具有減少之岩藻糖殘基：美國專利申請公開案第2003/0157108號(Genentech)或EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號(Kyowa)。該等文件中每一者之內容係全文以引用方式併入本文中。本發明經過糖基化改造之抗體亦可在產生經修飾糖蛋白之表現系統中產生，例如彼等教示於以下文獻中者：美國專利申請公開案第60/344,169號及WO 03/056914(GlycoFi公司)或WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)，其每一者之內容係全文以引用方式併入本文中。

在另一態樣中，本發明提供用於產生具有經修飾糖基化模式之本發明抗體之宿主細胞表現系統。具體而言，本發明提供用於產生本發明抗體之具有經改良治療價值之糖基型式之宿主細胞系統。因此，本發明提供宿主細胞表現系統，其經選擇或改造以表現具有糖基轉移酶活性之多肽。在一具體實施例中，糖基轉移酶活性係GnTIII活性。在一實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含異源高爾基體駐 留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽。具體而言，該等宿主細胞表現系統可經改造以包含編碼具有GnTIII之多肽之重組核酸分子，其與組成型或調節型啟動子系統可操作連接。

在一具體實施例中，本發明提供宿主細胞已經改造以表現至少一種編碼具有GnTIII活性且包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽之核酸。在一態樣中，宿主細胞經核酸分子改造，該核酸分子包含至少一種編碼具有GnTIII活性且包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽之基因。

通常，可使用任一類型之培養細胞系(包括上文所論述之細胞系)作為改造本發明宿主細胞系之背景。在一較佳實施例中，使用CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞作為產生本發明經改造宿主細胞之背景細胞系。

欲使本發明涵蓋任何經改造宿主細胞，其表現具有糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)之多肽，包括如本文所定義包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽。

一種或若干種編碼具有糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)之多肽之核酸可在組成型啟動子或者調節型表現系統控制下表現。該等系統為業內所熟知，且包括上文所論述 之系統。若在宿主細胞系統內包含若干種編碼具有糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)且包含異源高爾基體駐留多肽之高爾基體定位結構域之融合多肽之不同核酸，則該等核酸中之一些核酸可在組成型啟動子控制下表現，而其他核酸係在調節型啟動子控制下表現。具有糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)之融合多肽之表現程度係藉由相關技藝習知之方法來測定，包括西方墨點分析(Western blot analysis)、北方墨點分析(Northern blot analysis)、報導子基因表現分析或糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)之量測。或者，可採用結合GnTIII之生物合成產物之凝集素，例如E4-PHA凝集素。或者，可使用功能分析法，其量測由經編碼具有糖基轉移酶活性(例如GnTIII活性)之多肽之核酸改造之細胞產生之抗體所介導增強之Fc受體結合或增強之效應子功能。

含有本發明抗體之編碼序列且表現生物活性基因產物之宿主細胞可藉由以下至少四種通用方法來鑑別：(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)「標記物」基因功能之存在或不存在；(c)如藉由各別mRNA轉錄物在宿主細胞中之表現所量測來評估轉錄程度；及(d)如藉由免疫分析或藉由基因產物之生物活性所量測來檢測該等基因產物。

在第一種方法中，可藉由DNA-DNA或DNA-RNA雜交法，使用包含分別與各別編碼序列同源之核苷酸序列或其部分或衍生物之探針來檢測抗-MCSP抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶(例如GnTIII)活性之多肽之編碼序列之存 在。

在第二種方法中，可基於某些「標記物」基因功能(例如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、胺甲喋呤抗性、轉化表型、桿狀病毒中之包涵體形成，等)之存在或不存在來鑑別及選擇重組表現載體/宿主系統。舉例而言，若將本發明抗體之編碼序列或其片段及/或具有糖基轉移酶(例如GnTIII)活性之多肽之編碼序列***載體之標記物基因序列內，則可藉由標記物基因功能之不存在來鑑別含有各別編碼序列之重組體。或者，可將標記物基因與編碼序列串聯置於用於控制編碼序列之表現之相同或不同啟動子之控制下。標記物因應誘導或選擇之表現來指示本發明抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶(例如GnTIII)活性之多肽之編碼序列之表現。

在第三種方法中，可藉由雜交分析法評估本發明抗體之編碼區或其片段及/或具有糖基轉移酶(例如GnTIII)活性之多肽之編碼序列之轉錄活性。舉例而言，可藉由北方墨點法，使用與本發明抗體之編碼序列或其片段及/或具有糖基轉移酶(例如GnTIII)活性之多肽或其特定部分之編碼序列同源之探針來分離RNA且分析。或者，可提取宿主細胞之總核酸並分析其與該等探針之雜交。

在第四種方法中，蛋白產物之表現可以免疫學方式來評價，例如藉由西方墨點法、免疫分析(例如放射免疫沈澱、酶連接免疫分析及諸如此類)來評價。然而，表現系統成功之最終測試涉及檢測生物活性基因產物。

c)Fc區變體

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區)。

在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非全部效應子功能之抗體變體，此使其成為抗體之活體內半衰期較為重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害之應用之期望候選者。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺少FcγR結合能力(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現Fc(RIII，而單核球表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。FcR於造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)中第464頁之表3中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)及CytoTox 96^® 非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之有用效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如，在動物模型中，例如在Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者)評價所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析以確認抗體不能與C1q結合且因此缺少CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

一種公認之活體外ADCC分析如下所述：1)該分析使用已知可表現抗體之抗原結合區識別之靶抗原之靶細胞；2)該分析使用自隨機選擇之健康供體之血液分離之人類外周血單核細胞(PBMC)作為效應子細胞；3)該分析係根據以下方案來實施：i)使用標準密度離心程序分離該等PBMC，且將其以5×106細胞/ml懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)使該等靶細胞藉由標準組織培養方法生長，自活 力高於90%之指數生長期收穫，在RPMI細胞培養基中洗滌，用100微居裏之51Cr標記，用細胞培養基洗滌兩次，且以105細胞/ml之密度再懸浮於細胞培養基中；iii)將100微升之上述最終靶細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定板之每一孔中；iv)將抗體在細胞培養基中自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml且將50微升之所得抗體溶液添加至96孔微量滴定板中之靶細胞，從而以一式三份測試覆蓋上述全部濃度範圍之各個抗體濃度；v)對於最大釋放(MR)對照，使板中另外3個含有經標記靶細胞之孔接收50微升之2%(V/V)非離子型清潔劑水溶液(Nonidet,Sigma,St.Louis)來代替抗體溶液(上文第iv點)；vi)對於自發釋放(SR)對照，使板中另外3個含有經標記靶細胞之孔接收50微升之RPMI細胞培養基來代替抗體溶液(上文第iv點)；vii)然後將96孔微量滴定板以50×g離心1分鐘且在4℃下培育1小時；viii)將50微升之PBMC懸浮液(上文第i點)添加至每孔中以獲得25：1之效應子：靶細胞比率，且將板置於培育器中並於5% CO₂氣氛及37℃下保持4小時；ix)自每孔收穫無細胞上清液且使用γ計數器量化實驗釋放之放射性(ER)；x)根據公式(ER-MR)/(MR-SR)×100計算每一抗體 濃度下特異性裂解之百分比，其中ER係在該抗體濃度下所量化之平均放射性(見上文第ix點)，MR係MR對照(見上文第v點)之所量化之平均放射性(見上文第ix點)，且SR係SR對照(見上文第vi點)之所量化之平均放射性(見上文第ix點)；4)「增強之ADCC」定義為在上文所測試抗體濃度範圍內觀察到之最大特異性裂解百分比之增加，及/或達成在上文所測試抗體濃度範圍內觀察到之最大特異性裂解百分比之一半所需抗體濃度之降低。ADCC之增強係相對於使用上述分析量測之藉由相同抗體介導之ADCC而言，該相同抗體係使用熟習此項技術者已知之相同標準產生、純化、調配及儲存方法藉由相同類型之宿主細胞產生，但並非由經改造以過表現GnTIII之宿主細胞產生。

具有降低之效應子功能之抗體包括彼等在Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者處具有取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

闡述具有改良或降低之與FcR之結合之某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良 ADCC之胺基酸取代(例如，在Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代)之Fc區。

在一些實施例中，在Fc區中之改變改變(即，改良或降低)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

具有延長之半衰期及增強之與新生兒Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中，Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合之抗體闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。

亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及涉及Fc區變體之其他實例之WO 94/29351。

d)半胱胺酸改造之抗體變體

在某些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，由此將反應性硫 醇基團定位於抗體之可及位點處且其可用於將抗體與其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)偶聯，從而產生免疫偶聯物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。

e)抗體衍生物

在某些實施例中，本文所提供抗體可經進一步修飾以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三氧雜環己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物之數目可變，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：抗體欲改良之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定 條件下之治療等。

在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長：不會危害正常細胞，但可將非蛋白質性部分加熱至可殺滅抗體-非蛋白質性部分附近之細胞之溫度。

B.重組方法及組合物

抗體可使用重組方法及組合物來產生，如(例如)美國專利第4,816,567號中所闡述。在一實施例中，提供編碼本文所述抗-MCSP抗體之經分離核酸。該核酸可編碼抗體中包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多個包含該核酸之載體(例如，表現載體)。在另一實施例中，提供包含該核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)載體，其包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸之第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸之第二載體。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供製備抗-MCSP抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下 培養如上文所提供包含編碼該抗體之核酸之宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

對於抗-MCSP抗體之重組產生，分離(例如)如上文所述之編碼抗體之核酸並將其***一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。該核酸可易於使用習用程序分離及測序(例如，藉由使用能特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。

適用於選殖或表現編碼抗體之載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，尤其在不需要糖基化及Fc效應子功能時，抗體可在細菌中產生。對於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見(例如)美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana a Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現後，可自存於可溶部分中之細菌細胞糊狀物分離抗體且可進一步純化。

除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦係編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體之真菌及酵母株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括 植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。

亦可使用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。

亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。可用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40(COS-7)轉化之猴腎CV1系；人類胚腎系(293或293細胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利氏細胞(sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見(例如)Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。

C.分析

可藉由業內已知之多種分析來鑑別本文所提供之抗-MCSP抗體，針對其物理/化學性質及/或生物活性進行篩選或表徵。

1.結合分析及其他分析

在一態樣中，藉由已知方法(例如ELISA、西方墨點法等)測試本發明抗體之抗原結合活性。

在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本文所述抗-MCSP抗體競爭結合MCSP之抗體。在某些實施例中，此一競爭性抗體結合本文所述抗-MCSP抗體結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。

在實例性競爭分析中，在溶液中培育固定化MCSP，該溶液包含結合MCSP之第一經標記抗體及正在測試與第一抗體競爭結合MCSP之能力之第二未標記抗體。第二抗體可存於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定化MCSP。在容許第一抗體結合MCSP之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化MCSP結合之標記之量。若在測試樣品中與固定化MCSP結合之標記之量相對於對照樣 品顯著降低，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合MCSP。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

2.活性分析

在一態樣中，提供用於鑑別其具有生物活性之抗-MCSP抗體之分析。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。

在某些實施例中，測試本發明抗體之該生物活性。

D.免疫偶聯物

本發明亦提供免疫偶聯物，其包含與一或多種細胞毒性劑(化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素)偶聯之本文之抗-MCSP抗體。

在一實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體與一或多種藥物偶聯，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid，參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF，參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第 5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲喋呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他塞(larotaxel)、替司他塞(tesetaxel)及奧他塞(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。

在另一實施例中，免疫偶聯物包含與酶促活性毒素或其片段偶聯之本文所述抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石鹼草(Sapaonaria officinalis)抑制劑、 白樹毒素(gelonin)、線菌毒素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及新月毒素。

在另一實施例中，免疫偶聯物包含與放射性原子偶聯以形成放射性偶聯物之本文所述抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素。在使用放射性偶聯物來檢測時，其可包含用於閃爍法研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(同上)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳-14標記之1-異硫氰酸苯甲醯基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA) 係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接體可係促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫鍵之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。

本文之免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)使用包括(但不限於)以下之交聯劑試劑製備之該等偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。

E.用於診斷及檢測之方法及組合物

在某些實施例中，本文所提供抗-MCSP抗體中之任一者可用於在生物樣品中檢測MCSP之存在。本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。

在一實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-MCSP抗體。在另一態樣中，提供在生物樣品中檢測MCSP之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在容許抗-MCSP抗體結合MCSP之條件下使生物樣品與本文所述抗-MCSP抗體接觸，及檢測在抗-MCSP抗體與MCSP之間是否形成複合體。該方法可係活體外或活體內方法。在一實施例 中，使用抗-MCSP抗體來選擇使用抗-MCSP抗體之療法之合格個體，例如，其中MCSP係用於選擇患者之生物標記。

可使用本發明抗體診斷之實例性病症包括特徵在於表現MCSP之病症，包括細胞增殖性病症或血管生成性病症。在一實施例中，病症係癌症，例如皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠質瘤(包括神經膠胚細胞瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)及白血病(包括ALL及AML)。

在某些實施例中，提供經標記抗-MCSP抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃(fluorescein)及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶，美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶合)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。

F.醫藥調配物

本文所述抗-MCSP抗體之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；氯化苄烷銨；氯化苄甲乙氧銨；酚類、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX^®，Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡 述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。

實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO 2006/044908中者，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳係彼等具有不會相互不良影響之互補活性者。該等活性成份適宜地以有效用於預期目的之量以組合形式存在。

可將活性成份裝入藉由(例如)凝聚技術或介面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或***液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如膜或微膠囊。

欲用於活體內投與之調配物通常無菌。無菌性可藉由(例如)經由無菌濾膜過濾來容易地實現。

G.治療方法及組合物

本文所提供任一抗-MCSP抗體可用於治療方法。

在一態樣中，提供用作醫藥之抗-MCSP抗體。在其他態樣中，提供用於治療癌症之抗-MCSP抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法之抗-MCSP抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體之方法之抗-MCSP抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗-MCSP抗體。在一此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。在其他實施例中，本發明提供用於治療黑素瘤之抗-MCSP抗體。上文任一實施例之「個體」較佳係人類。

在另一態樣中，本發明提供抗-MCSP抗體在製造或製備醫藥中之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療癌症。在另一實施例中，該醫藥係用於治療癌症之方法，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之該醫藥。在一此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。上文任一實施例之「個體」可係人類。

在另一態樣中，本發明提供用於治療癌症之方法。在一實施例中，該方法包含向患有該癌症之個體投與有效量之抗-MCSP抗體。在一此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。上文任一實施例之「個體」可係人類。

在一實施例中，上文態樣中之癌症在其組成細胞之表面上表現MCSP。在一實施例中，上文態樣中之癌症選自皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠質瘤(包括神經膠 胚細胞瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)及白血病(包括ALL及AML)。在一實施例中，上文態樣中之癌症係黑素瘤。

在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供用於(例如)上文任一治療方法之任一抗-MCSP抗體之醫藥調配物。在一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供任一抗-MCSP抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供任一抗-MCSP抗體及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。

本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，本發明抗體可與至少一種其他治療劑共投與。

上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或分開調配物中)及分開投與(在此情形中，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體)。本發明抗體亦可與放射療法組合使用。

本發明抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑(例如藉由注射、例如靜脈內或皮下注射)給藥，此部分端視於投與時間長短而定。本文涵蓋多種投藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。

本發明抗體可以符合良好醫療實踐之方式進行調配、給藥及投與。在此背景下，考慮因素包括所治療之特定病 症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從業者已知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於抗體存於調配物中之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑，或本文所述劑量之約1%至99%，或以經驗/臨床上確定為適宜之任一劑量及任一途徑使用。

對於疾病之預防或治療，本發明抗體之適宜劑量(在單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。該抗體適於一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重性，不論(例如)係藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)抗體可係投與患者之初始候選劑量。端視上述因素，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之範圍內。對於經若干天或更長時間反覆投與，端視病況，治療通常會持續至出現對疾病症狀之期望抑制。抗體之一實例性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任一組合)中之一或多個劑量。該等劑量可 間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約2個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。此療法之進展可藉由習用技術及分析容易地監測。

應理解，代替抗-MCSP抗體或除抗-MCSP抗體以外，可使用本發明免疫偶聯物來實施上文任一調配或治療方法。

H.製品

在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器容納組合物自身或該組合物與另一有效治療、預防及/或診斷病況之組合物之組合，且可具有無菌存取埠(例如，容器可為靜脈內溶液袋或小瓶，其具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子)。組合物中之至少一種活性劑係本發明抗體。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療所選病況。此外，製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例之製品可另外包含包裝插頁，其指示組合物可用於治療特定病況。或者或另外，製品可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受之緩衝液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另 外包括自商業及用戶角度考慮需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

應理解，代替抗-MCSP抗體或除抗-MCSP抗體以外，上文任一製品可包括本發明免疫偶聯物。

實例

以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，慮及上文所提供之一般說明，可實踐多個其他實施例。

實例1-抗-MCSP抗體之產生 免疫及融合瘤產生

每4週一次用對應於與KLH偶合之人類MCSP序列中aa 2177-2221(SVPE AARTEAGKPE SSTPTGEPGPMASSPEPAVA KGGFLSFLEAN(SEQ ID NO：2))之合成肽對Balb/c小鼠進行4次腹腔內免疫，之後用表現MCSP之Colo38細胞(Giacomini P,Natali P,Ferrone S J Immunol.1985年7月；135(1)：696-702)進行兩次免疫。初始免疫係在CFA中進行，隨後所有加強係在IFA中進行。

進行血清測試采血且使用與生物素偶合且塗佈至抗生蛋白鏈菌素ELISA微量滴定板上之MCSP肽aa2177-2221測定半最大血清效價。選擇半最大效價為1：50,000之小鼠進行靜脈內加強。在融合前第4天使用20 μg之MCSP肽及Colo38細胞進行靜脈內加強。在靜脈內加強後三天，收穫脾細胞且將其與Ag8骨髓瘤細胞融合。

篩選及融合瘤表徵

針對MCSP特異性抗體進行篩選始於鑑別結合塗佈至抗 生蛋白鏈菌素微量滴定板之MCSP-生物素肽aa 2177-2221(SEQ ID NO：2)之抗體。然後在無血清培養基(Hyclone ADCF-Mab-Thermo Scientific，目錄號SH30349.02)中擴增結合固定化MCSP肽之陽性純系。

藉由FACS分析對天然過表現大量人類MCSP之Colo38細胞實施與MCSP之天然形式之結合。使用不表現可檢測含量之MCSP之***癌系PC3作為陰性對照。為進一步表徵主要抗體之特異性，對Colo38細胞實施雙重免疫細胞化學分析，其中使用已為人所接受之市售抗-MCSP抗體(Invitrogen 公司，目錄號41-2000，純系LHM2)與嵌合主要抗體(表現人類Fc)之組合進行雙重染色。如免疫螢光標記所顯示，一個抗體LC007在Colo38細胞中強烈染色表面MCSP，但在PC3細胞上呈陰性。

實例2：嵌合

使用市售套組自表現抗體純系LC007之融合瘤細胞系分離mRNA且將其轉化為cDNA。對cDNA分離物之重鏈(SEQ ID NO：39)及輕鏈(SEQ ID NO：38)進行測序且將每一片段融合至人類IgG1及κ之恆定區。

在HEK-EBNA細胞中使用來自人類免疫球蛋白之信號肽表現序列，且使用習用蛋白A及尺寸排阻層析(SEC)來純化。

藉由以下方法來測定結合活性。用細胞解離緩衝液使靶細胞脫離培養燒瓶，且對其計數並檢查活力。使細胞再懸浮於PBS-0.1% BSA中且調節至1.111×10⁶(活)細胞/ml。 將180 μl之此懸浮液轉移至圓底96孔板之每個孔(200,000細胞/孔)中，以400 g離心4 min，且使其再懸浮。將20 μl存於PBS-0.1% BSA中之抗體稀釋液(自10 μg/ml至0.002 μg/ml)添加至每孔中。將樣品以400 g離心4 min，且使其再懸浮。添加二級抗體FITC-偶聯之AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG Fcg特異性片段(Jackson Immuno Research Lab，編號109-096-098)且將樣品以400 g離心4 min，且使其再懸浮。在流式細胞儀(例如FACS Canto II)中量測螢光。滴定結果顯示於圖1及2中。使用Morgan AC Jr、Galloway DR、Reisfeld RA.Hybridoma.1981；1(1)：27-36中所述之抗體9.2.27(輕鏈及重鏈之基因庫登錄號分別為：GI：20797193及GI：20797189)作為參照(圖2)。使用人類黑素瘤細胞系Colo38、A2058及A375。Giacomini等人1985(對於Colo38)。Marquardt H、Todaro GJ.J Biol Chem.1982年5月10日；257(9)：5220-5(對於A2058)。Geiser M、Schultz D、Le Cardinal A、Voshol H、García-Echeverría C.Cancer Res.1999年2月15日；59(4)：905-10(對於A375)。

實例3：LC007抗體在MCSP抗原上之結合表位之測定

LC007抗體在黑素瘤細胞上顯示良好結合，但在原始免疫原上僅弱結合。因此，對抗體LC007進行表位定位以測定在抗原上之確切結合位點。為此，產生MCSP抗原之若干個截短形式，其各自含有不同數目之人類MCSP之膜近端重複區(稱作CSPG重複序列)。Staub E.,等人，FEBS Lett.527：114-118(2002)。

構築體1含有CSPG重複序列15(SEQ ID NO：4)，構築體2含有CSPG重複序列14-15(SEQ ID NO：5)，構築體3含有CSPG重複序列13-15(SEQ ID NO：6)，且構築體4含有CSPG重複序列12-15(SEQ ID NO：7)。圖3提供MCSP之含有CSPG重複序列之結構之示意圖。該等構築體含有原始跨膜區域且使其在HEK-EBNA細胞上表現以供藉由FACS檢測LC007結合。圖4顯示此實驗之結果。僅包括MCSP重複序列15及天然跨膜結構域之構築體不顯示任何顯著結合。與之相比，所有包括結構域14及15之構築體皆顯示顯著結合。此表明，結合表位位於重複序列14內，或僅在存在重複序列14且可能亦包括重複序列15之部分或介於CSPG重複序列與跨膜結構域之間之未結構化區域時重構。

實例4：對與人類及食蟹猴抗原之交叉反應性之測定

產生表現構築體，其包括食蟹猴MCSP蛋白之C末端部分、用於分泌之信號肽及N末端FLAG-標籤(SEQ ID NO：8)以測試對食蟹猴抗原之交叉反應性。此結構域稱作D3結構域，Tillet,F.等人，J.Biol.Chem.272：10769-10776(1997)。針對人類對應體(SEQ ID NO：9)產生類似構築體。將編碼該兩個構築體之表現質粒電穿孔至HEK-EBNA細胞中，且用抗-FLAG抗體確認表現。然後藉由流式細胞術測試LC007抗體之結合。圖5顯示，抗體LC007結合食蟹猴構築體之親和性類似於與相應人類表現構築體之親和 性。

實例5：經過糖基化改造之LC007抗體

藉由抗體表現載體與GnT-III糖基轉移酶表現載體一起或與GnT-III表現載體加高爾基體甘露糖苷酶II表現載體一起共轉染來產生LC007抗體之經過糖基化改造變體。

實例6 經過糖基化改造之LC007抗體之ADCC ADCC分析

在不同濃度之經過糖基化改造之LC007抗體及對照抗體樣品存在下，在37℃下之16 h培育期間，經由螢光染料之滯留來量測在1：19之靶：效應子比率下人類淋巴球(效應子)對Colo38人類惡性黑素瘤細胞(靶)之裂解。Kolber等人，1988,J.Immunol.Methods 108：255-264。用螢光染料鈣黃綠素(Calcein)AM將IMR-32細胞標記20 min(最終濃度3.3 μM)。將經標記細胞(80,000細胞/孔)與不同濃度之經過糖基化改造之LC007抗體及對照抗體樣品一起培育1 h。然後，添加去單核球之單核細胞(monocyte depleted mononuclear cell)(1,500,000細胞/孔)且將細胞混合物在37℃及5% CO₂氣氛下培育16 h。棄去上清液且將細胞用HBSS洗滌一次，且在Triton X-100(0.1%)中裂解。用螢光計(Perkin Elmer，發光光譜儀LS 50B,Foster City,Calif.)量測螢光染料在Colo38細胞中之滯留，且計算相對於總裂解對照(得自靶暴露於清潔劑而非暴露於抗體)之特異性裂解。將不存在抗體時之信號設定為0%細胞毒性。一式三份分析每一抗體濃度，且將分析分開重複三次。如圖6中 所示，未經過糖基化改造之LC007抗體(LC007 wt)呈現ADCC效應。經過糖基化改造之LC007抗體(LC007 g2)顯示與未經過糖基化改造之LC007相比增強之ADCC。因此，未經過糖基化改造之LC007抗體自身顯示一定ADCC活性，其可藉由糖改造進一步增強。與之相比，抗-MCSP抗體MHLG KV9 G2(其係抗體225.28S之人類化形式，如Buraggi G等人，Int J Biol Markers.1986年1月至4月；1(1)：47-54中所述)在此分析中不顯示任何顯著ADCC誘導。測定225.28抗體之結合表位位於MCSP抗原之N末端部分或膜遠端部分內。包括結合EGF受體(其在Colo38細胞上不存在)之經過糖基化改造之GA201抗體作為對照。此抗體不存在ADCC顯示，NK細胞之活化必須經由存於腫瘤細胞上之靶來進行。

圖7顯示，對於人類U86MG神經膠胚細胞瘤細胞系亦觀察到經過糖基化改造之LC007抗體之ADCC。

實例7 經過糖基化改造之LC007抗體之人類化

人類化程序係遵循經典環接枝程序(Jones PT、Dear PH、Foote J、Neuberger MS、Winter G.Nature.1986年5月29日-6月4日；321(6069)：522-5.P.Carter等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；第89卷，第4285-4289頁，1992年5月)來實施。簡言之，將鼠類抗體之CDR(SEQ ID NO.10、11、12、14、15及16)接枝至人類框架序列(輕鏈之IMGT登錄號為IGKV1D-39*01及IGKJ1且重鏈之IMGT登錄號為IGHV4-31*02及IGHJ4)上，從而獲得具有包含胺基酸 序列SEQ ID NO：29之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：28之輕鏈之抗體。

優化抗體構築體以保留對靶MCSP抗原之結合親和性。圖8顯示不同人類化變體之結合性質。將人類殘基Val71及Arg94替代為其對應之鼠類對應體(分別係精胺酸及天冬胺酸)，此乃因據測定，具有該等人類殘基之抗體構築體呈現降低之與抗體之結合。如圖8中所示，在重鏈之94位(Kabat編號)具有Arg之構築體M4-2 ML1(SEQ ID NO：30(對應於此序列中之D98R))及在重鏈之74位(Kabat編號)具有Val之M4-6 ML1(SEQ ID NO：33(對應於此序列中之R72V))顯示降低之與MCSP抗原之結合，表明該等殘基與抗體之結合特異性相關。在彼等位置分別具有對應之鼠類對應體(精胺酸及天冬胺酸)之彼等構築體保留結合活性，例如彼等具有M4-1(SEQ ID NO：29)及M4-3(SEQ ID NO：32)之重鏈構築體之抗體。

將CDR-H1殘基Asn35取代為相應之人類種系絲胺酸殘基。如圖8中所示，含有此取代之構築體M4-7 ML1(SEQ ID NO：25)顯示與靶MCSP抗原之結合降低，從而表明此殘基亦參與保留抗原結合強度。

其他構築體指示其他殘基在抗-MCSP抗體之結合性質中之相關性。在HVR-L1(SEQ ID NO：21)之7位用絲胺酸替代精胺酸殘基使對MCSP抗原之結合活性降低。在HVR-L2SEQ ID NO：22之1位用天冬胺酸替代天冬胺酸酪胺酸及在2位用蘇胺酸替代丙胺酸亦降低對MCSP抗原之結合活性。

實例8 經過糖基化改造之LC007抗體之人類化變體之ADCC

藉由乳酸去氫酶使用Colo38細胞作為靶細胞來量測經過糖基化改造之LC007抗體之人類化變體之ADCC活性。使用人類外周血單核細胞(PBMC)作為效應子細胞且其係使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics公司，St.Louis,Mo.63178 USA)基本上遵循製造商說明書來製備。

簡言之，用加肝素注射器自健康志願者取靜脈血。用PBS(不含Ca⁺⁺或Mg⁺⁺)將血液稀釋1：0.75-1.3且在Histopaque-1077上分層。在室溫(RT)下將梯度以400×g不間斷地離心30 min。收集含有PBMC之中間相且用PBS洗滌(來自兩個梯度之每種細胞50 ml PBS)，且藉由在RT下以300×g離心10分鐘來收穫。在用PBS使沈澱再懸浮後，對PBMC進行計數且藉由在RT下以200×g離心10分鐘再次洗滌。然後將細胞再懸浮於適當培養基中以用於後續程序。

對於PBMC及NK細胞，用於ADCC分析之效應子：靶比率分別為25：1及10：1。在AIM-V培養基中以適宜濃度製備效應子細胞以在圓底96孔板中以50 μl/孔添加。靶細胞係Colo30細胞。在PBS中洗滌靶細胞，對其進行計數且以0.3×10⁶/ml再懸浮於AIM-V中以添加30,000細胞/100 μl/微孔。在AIM-V中稀釋抗體，以50 μl添加至預先鋪平板之靶細胞且在RT下使其與靶結合10分鐘。然後添加效應子細胞且在37℃下於含有5% CO₂之加濕氣氛中將板培育4小時。使用細胞毒性檢測套組(Roche Diagnostics,Rotkreuz, Switzerland)藉由量測自受損細胞釋放之乳酸去氫酶(LDH)來評價靶細胞之殺滅。在培育4小時後，將板以800×g離心。自每孔將100 μl上清液轉移至新透明平底96孔板中。自套組向每孔添加100 μl呈色基質緩衝液。在ELISA讀取器中在490 nm下經至少10 min使用SOFTmax PRO軟體(Molecular Devices,Sunnyvale,Calif.94089,USA)來測定呈色反應之Vmax值。自僅含有靶及效應子細胞但不含抗體之孔量測自發LDH釋放。自僅含靶細胞及1% Triton X-100之孔測定最大釋放。如下計算抗體介導之特異性殺滅之百分比：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x係在特定抗體濃度下Vmax之平均值，SR係自發釋放之Vmax之平均值且MR係最大釋放之Vmax之平均值。

圖9顯示此分析之結果且確認，人類化變體保留經過糖基化改造之親代LC007抗體之ADCC活性。

在使用5 mM含有0.1% Triton X-100之硼酸鹽緩衝液洗滌及細胞裂解後，使用如實例6中所述之分析藉由鈣黃綠素量測(Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter)進一步量化存活靶細胞。此分析之結果顯示於圖10中。

實例9 小鼠異種移植分析 9.1 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MV3細胞

根據約定導則(GV-Solas；Felasa；TierschG)將20隻FcgR3A tg SCID小鼠(購自Charles River,Lyon,France)維持在具有12 h光/12 h暗之每日循環之IVC(分離換氣籠架)條件下。由地方政府審閱並批准實驗研究方案(P 2005086)。在到達後將動物維持一週以適應新環境且進行觀察。繼續定期進行健康監測。

在37℃下及5% CO₂之水飽和氣氛中，將MV3腫瘤細胞系(van Muijen GN等人，Int J Cancer.48(1)：85-91(1991))以常規方式培養於補充有10%胎牛血清(Invitrogen,Switzerland)之DMEM培養基(GIBCO,Switzerland)中。用胰蛋白酶/EDTA 1×(GIBCO,Switzerland)實施培養傳代，每三天分離一次。在注射當天，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco,Switzerland)自培養燒瓶(Greiner Bio-One)收穫腫瘤細胞，且將其轉移至50 ml培養基中，在AIM V(Gibco,Switzerland)中洗滌一次且使其再懸浮。在用AIM V再次洗滌後，使用細胞計數器測定細胞濃度。將存於200 μl Aim V培養基中之0.2×10⁶細胞注射至每只FcgR3A tg SCID小鼠之尾靜脈中。

治療

將異種移植小鼠分配至治療組或媒劑對照組中，每組由九隻小鼠組成。向治療組靜脈內投與25 mg/kg經過糖基化改造之人類化抗-MCSP mAb M4-3 ML2。僅向媒劑對照組靜脈內投與媒劑。兩個組皆在第7天、第14天及第21天接受三次劑量。

使用對數等級(Mantel-Cox)測試(p=0.0033)及Gehan-Breslow-Wilcoxon測試(p=0.0039)對自治療獲得之數據實施統計學分析。

結果

如圖11中所示，在此模型中，經過糖基化改造之人類化抗-MCSP抗體與媒劑對照相比顯著延長存活時間。

9.2 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MDA-MB-435細胞

MDA-MB435細胞最初得自ATCC，且在擴增後寄存於Glycart內部細胞庫中。在37℃下於5% CO₂之水飽和氣氛中將MDA-MB435腫瘤細胞系以常規方式培養於補充有10%胎牛血清(Invitrogen,Switzerland)及1% Glutamax之RPMI培養基(GIBCO,Switzerland)中。用胰蛋白酶/EDTA 1×(GIBCO,Switzerland)實施培養傳代，每三天分離一次。

根據約定導則(GV-Solas；Felasa；TierschG)將FcgR3A tg SCID小鼠(購自Charles River,Lyon,France)維持在具有12 h光/12 h暗之每日循環之IVC(分離換氣籠架)條件下。由地方政府審閱並批准實驗研究方案(P 2005086)。在到達後將動物維持一週以適應新環境且進行觀察。繼續定期進行健康監測。

在注射當天，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco,Switzerland)自培養燒瓶(Greiner Bio-One)收穫腫瘤細胞，且將其轉移至50 ml培養基中，在AIM V(Gibco,Switzerland)中洗滌一次且使其再懸浮。在用AIM V再次洗滌後，使用細胞計數器測定細胞濃度。將存於200 μl Aim V培養基中之0.2×10⁶細胞注射至每只FcgR3A tg SCID小鼠之尾靜脈中。

治療

將異種移植小鼠分配至治療組或媒劑對照組中。向治療 組靜脈內投與25 mg/kg之經過糖基化改造之嵌合抗-MCSP mAb。僅向媒劑對照組靜脈內投與媒劑。兩個組皆在第7天、第14天及第21天接受三次劑量。

結果

如圖12中所示，在此模型中，經過糖基化改造之嵌合抗-MCSP抗體與媒劑對照相比顯著延長存活時間。

9.3 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MDA-MB-435細胞

遵循如實例9.2中之相同方案，但將人類化抗體M4-3 ML2(包含SEQ ID NO：32之VH及SEQ ID NO：31之VL)與其親代嵌合抗體LC007相比。該兩種抗體皆經過糖基化改造。

結果

如圖13中所示，在此模型中，親代嵌合抗體LC007及其經過糖基化改造之人類化變體二者與媒劑對照相比皆顯著延長存活時間。

儘管上文出於清晰理解之目的已經由說明及實例在一定程度上詳細地闡述了本發明，但該等說明及實例不應視為限制本發明之範圍。本文所引用所有專利及科學文獻之揭示內容皆係全文以引用方式明確併入本文中。

圖1係繪示FACs分析結果之圖，其顯示在Colo38細胞中嵌合抗體LC007對表面MCSP之結合親和性。

圖2係繪示FACs分析結果之圖，其顯示在A2058及A375癌細胞中嵌合抗體LC007對表面MCSP之結合親和性。

圖3係MCSP之含有CSPG重複序列之結構之示意圖。

圖4係顯示LC007對MCSP CSPG重複序列構築體之結合特異性之圖。

圖5係繪示FACs分析結果之圖，其顯示，抗體LC007結合食蟹猴構築體之親和性類似於結合相應人類表現構築體之親和性。

圖6係顯示未經過糖基化改造及經過糖基化改造之 LC007抗體二者之ADCC效應之圖。

圖7係顯示在人類U86MG神經膠胚細胞瘤細胞系中觀察到經過糖基化改造之LC007抗體之ADCC效應之圖。

圖8係顯示LC007抗體之若干種人類化變體之結合性質之圖。

圖9係顯示LC007之人類化變體保留經過糖基化改造之親代LC007抗體之ADCC活性之圖。

圖10係顯示LC007之人類化變體保留經過糖基化改造之親代LC007抗體之ADCC活性之圖。

圖11繪示存活曲線，其顯示，經過糖基化改造之人類化抗-MCSP抗體在具有MV3腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中與媒劑對照相比顯著延長存活時間。

圖12繪示存活曲線，其顯示，經過糖基化改造之嵌合抗-MCSP抗體在具有MDA-MB-435腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中與媒劑對照相比顯著延長存活時間。

圖13繪示存活曲線，其顯示，經過糖基化改造之嵌合抗-MCSP抗體及其人類化變體M4-3 ML2二者在具有MDA-MB-435腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中與媒劑對照相比皆顯著延長存活時間。

<110> 瑞士商羅齊克雷雅公司

<120> 抗-MCSP抗體

<130> 30603

<140> 101130535

<141> 2012/08/22

<150> EP 11178393.2

<151> 2011-08-23

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2322

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 203

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> DOMAIN

<222> (182)..(203)

<223> 跨膜結構域

<400> 4

<210> 5

<211> 310

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Domain

<222> (289)..(310)

<223> 跨膜結構域

<400> 5

<210> 6

<211> 419

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Domain

<222> (398)..(419)

<223> 跨膜結構域

<400> 6

<210> 7

<211> 545

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Domain

<222> (524)..(545)

<223> 跨膜結構域

<400> 7

<210> 8

<211> 643

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 8

<210> 9

<211> 643

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L3

<400> 12

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H1

<400> 14

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H2

<400> 15

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H3

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H1

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H2

<400> 18

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L1

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-L2

<400> 24

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVR-H1

<400> 25

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體VL

<400> 26

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體VH

<400> 27

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體ML1 VL

<400> 28

<210> 29

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-1 VH

<400> 29

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-2 VH

<400> 30

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體ML2 VL

<400> 31

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-3 VH

<400> 32

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-6 VH

<400> 33

<210> 34

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體輕鏈

<400> 34

<210> 35

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體重鏈

<400> 35

<210> 36

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體ML2輕鏈

<400> 36

<210> 37

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-3重鏈

<400> 37

<210> 38

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007鼠類抗體輕鏈

<400> 38

<210> 39

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007鼠類抗體重鏈

<400> 39

<210> 40

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體輕鏈

<400> 40

<210> 41

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007嵌合抗體重鏈

<400> 41

<210> 42

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體ML2輕鏈

<400> 42

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LC007人類化抗體M4-3重鏈

<400> 43

<210> 44

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Claims (32)

1. 一種分離抗體，其結合包含含有CSPG重複序列之結構域之人類MCSP之膜近端表位，其中該抗體已經過糖基化改造以修飾Fc區中之寡糖，且其中該抗體具有比未經過糖基化改造之抗體增強之ADCC效應子功能。
2. 如請求項1之抗體，其中該含有CSPG重複序列之結構域包含CSPG重複序列14(SEQ ID NO：3)。
3. 如請求項1或2之抗體，其中該Fc區具有比該未經過糖基化改造之抗體減少之岩藻糖殘基數目。
4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體在Fc區中具有比該未經過糖基化改造之抗體增加之GlcNAc殘基與岩藻糖殘基之比率。
5. 如請求項1或2之抗體，其中該Fc區具有比該未經過糖基化改造之抗體增加之二等分型寡糖之比例。
6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體係單株抗體。
7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
8. 如請求項7之抗體，其中該抗體係全長IgG類抗體。
9. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：14；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：15；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。
10. 如請求項9之抗體，其進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序 列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
11. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-L1，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：10；(b)HVR-L2，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：12。
12. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：18；及(c)HVR-H3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：16。
13. 如請求項12之抗體，其進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：12。
14. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-L1，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：13；(b)HVR-L2，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：11；及(c)HVR-L3，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO：12。
15. 如請求項1或2之抗體，其包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：27具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：26具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
16. 如請求項15之抗體，其包含SEQ ID NO：27之VH序列。
17. 如請求項15之抗體，其包含SEQ ID NO：26之VL序列。
18. 如請求項15之抗體，其包含SEQ ID NO：27之VH序列及SEQ ID NO：26之VL序列。
19. 如請求項1或2之抗體，其包含(a)與胺基酸序列SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與胺基酸序列SEQ ID NO：31具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
20. 如請求項19之抗體，其包含SEQ ID NO：32之VH序列。
21. 如請求項19之抗體，其包含SEQ ID NO：31之VL序列。
22. 如請求項19之抗體，其包含SEQ ID NO：32之VH序列及SEQ ID NO：31之VL序列。
23. 一種分離核酸，其編碼如請求項1至22中任一項之抗體。
24. 一種宿主細胞，其包含如請求項23之核酸。
25. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項24之宿主細胞，以產生該抗體。
26. 一種免疫偶聯物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體及細胞毒性劑。
27. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至22中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
28. 如請求項1或2之抗體或如請求項26之免疫偶聯物，其用作醫藥。
29. 一種如請求項1至22中任一項之抗體或如請求項26之免疫偶聯物之用途，其用於製造治療癌症之醫藥。
30. 如請求項29之用途，其中該癌症係表現MCSP之癌症。
31. 如請求項30之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠質瘤(包括神經膠胚細胞瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)及白血病(包括ALL及AML)。
32. 一種如請求項1至22中任一項之抗體之用途，其用於製造誘導細胞裂解之醫藥。