MX2013001336A - Anticuerpos ani-tenascina c a2 y metodos de utilizacion. - Google Patents

Anticuerpos ani-tenascina c a2 y metodos de utilizacion.

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Ekkehard Moessner
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Abstract

La invención proporciona anticuerpos contra el dominio A2 de la tenascina-C y métodos de utilización de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TENASCINA C A2 Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos específicos del dominio A2 de la tenascina C (TNC A2). Además, la invención se refiere a polinucleótidos codificantes de dichos anticuerpos, y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para producir los anticuerpos y a métodos de utilización de los mismos en el tratamiento de enfermedades.
ANTECEDENTES Tenascina C y anticuerpos anti-tenascina C Las tenascinas son una familia altamente conservada de glucoproteínas de matriz extracelular (ECM) multiméricas de gran tamaño, que se encuentra en los vertebrados. Se han identificado cuatro paralogos de la tenascina en los mamíferos, denominados tenascina-C, tenascina-R, tenascina-X y tenascina-W. Las proteínas de la familia de la tenascina presentan una estructura primaria común, que comprende repeticiones N-terminales de héptadas, repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF), repeticiones de dominio de fibronectina de tipo III y dominio globular C-terminal de tipo fibrinógeno. Mediante un dominio de oligomerización N-terminal, las subunidades individuales se ensamblan formando trímeros o, en el caso de la tenascina-C, incluso hexámeros.
Los monómeros de tenascina-C de mamífero típicamente presentan 14,5 repeticiones de tipo EGF y 8 repeticiones de dominio de fibronectina de tipo III que se encuentran compartidos en todas las isoformas de la tenascina C. Sin embargo, hasta 9 repeticiones adicionales de fibronectina de tipo III (dominios Al a D) pueden incluirse o excluirse independientemente mediante procesamiento alternativo, dando lugar a un gran número de isoformas de la tenascina-C (ver, por ejemplo, Hsia y Schwarzbauer, J. Biol. Chem. 280:26641-26644, 2005).
La tenascina C se expresa transitoriamente en el embrión en desarrollo, pero se encuentra prácticamente ausente de los tejidos adultos. Sin embargo, reaparece en los tejidos que experimentan procesos de remodelado, incluyendo determinadas condiciones patológicas tales como la cicatrización de heridas, la inflamación y el cáncer (revisadas en Chiquet-Ehrismann y Chiquet, J. Pathol. 200:488-499, 2003).
Resulta importante que la tenascina-C presenta un nivel elevado de expresión en la mayoría de tumores sólidos malignos, incluyendo los tumores cerebral, mamario, de colon, pulmonar, de piel y de otros órganos (revisados en Orend y Chiquet-Ehrismann, Cáncer Letters 244: 143-163, 2006), en donde puede ser expresado por células epiteliales transformadas, así como por células estromales en el microambiente tumoral (Yoshida et al, J. Pathol. 182:421-428, 1997; Hanamura et al, Int. J. Cáncer 73: 10-15, 1997). En particular, la "isoforma grande" de la tenascina-C, que contiene los dominios procesados alternativamente, Al a D, se expresa en carcinomas invasivos, mientras que es prácticamente indetectable en tejidos adultos sanos (Borsi et al, Int. J. Cáncer 52:688-692, 1992; Carnemolla et al, Eur. J. Biochem. 205:561-567, 1992).
Su patrón de expresión convierte a la tenascina-C, en particular sus dominios procesados alternativamente, en un antígeno prometedor para aplicaciones de dianización tumoral, y por consiguiente se ha desarrollado un gran número de anticuerpos contra varios dominios de la proteína (ver, por ejemplo, Brack et al, Clin. Cáncer Res. 12:3200-3208, 2006, o la patente EP n° 1.817.345, que describe anticuerpos contra el dominio Al de la tenascina-C; Silacci et al, Prot. Eng. Des. Sel. 19:471-478, 2006, o la patente EP n° 1.173.766, que describe anticuerpos contra el dominio C de la tenascina-C; Wang et al, Hybridoma 29:13-16, 2010, que describe un anticuerpo contra el dominio D de la tenascina-C; o Balza et al, FEBS 332:39-43, 1993, que describe varios anticuerpos contra diferentes dominios de la tenascina humana).
Recientemente también se ha descrito un anticuerpo que reconoce un epítopo específico en el dominio A2 de la tenascina-C humana (patente WO n° 2009/089998).
Glucosilación de anticuerpos El componente oligosacárido puede afectar significativamente a propiedades relevantes a la eficacia de una glucoproteína terapéutica, incluyendo la estabilidad física, la resistencia al ataque de proteasas, las interacciones con el sistema inmunológico, la farmacocinética y la actividad biológica específica. Dichas propiedades pueden depender no sólo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos Pueden alcanzarse algunas generalizaciones sobre la relación entre estructura del oligosacárido y función de la glucoproteína. Por ejemplo, determinadas estructuras oligosacáridas median en la eliminación rápida de la glucoproteína del flujo sanguíneo mediante interacciones con proteínas de unión a carbohidrato específicas, mientras que otras pueden unirse a anticuerpos y desencadenar reacciones inmunológicas no deseadas (Jenkins et al, Nat. Biotechnol. 14:975-81, 1996).
Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos utilizados más comúnmente en la inmunoterapia del cáncer, son glucoproteínas que presentan un sitio de glucosilación religada conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely et al, Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et al, Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y Morrison, Trends Biotechnol. 15:26-32, 1997). Algunos estudios de manipulación de proteínas han demostrado que los FcyRs interactúan con la región bisagra inferior del dominio CH2 de IgG (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996). Sin embargo, la unión de FcyR también requiere la presencia de los oligosacáridos en la región CH2 (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996; Wright y Morrison, Trends Biotech. 15:26-31, 1997), sugiriendo que tanto el oligosacárido como el polipéptido contribuyen directamente al sitio de interacción o que el oligosacárido resulta necesario para mantener una conformación polipeptídica de CH2 activo. Por lo tanto, la modificación de la estructura oligosacárida puede explorarse como medio para incrementar la afinidad de la interacción entre IgGl y FcyR, y para incrementar la actividad ADCC de las IgGl s.
Una manera de obtener grandes incrementos de la potencia de los anticuerpos monoclonales es mejorar sus funciones efectoras naturales mediadas por células mediante la manipulación de su componente oligosacárido, tal como se describe en Umaña et al, Nat. Biotechnol. 17: 176-180, 1999, y patente US n° 6.602.684 (patente WO n° 99/54342), ' el contenido de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. Umaña et al. han demostrado que la sobreexpresión de la ß(1,4)-?-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biantenanos en células de ovario de hámster chino (CHO) incrementa significativamente la actividad ADCC in vitro de los anticuerpos producidos en dichas células. La sobreexpresión de GnTIII en líneas celulares de producción conduce a la generación de anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos biantenarios, los cuales generalmente también son no fucosilados y del tipo híbrido. En el caso de que, además de GnTIII, se sobreexprese la manosidasa II (Manll) en líneas celulares de producción, se obtienen anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos no fucosilados biantenarios del tipo complejo (Ferrara et al, Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006). Ambos tipos de anticuerpos muestran una ADCC fuertemente incrementada, en comparación con anticuerpos con glicanos no modificados, pero únicamente los anticuerpos en los que la mayoría de los N-glicanós son del tipo complejo son capaces de inducir citotoxicidad dependiente del complemento significativa (Ferrara et al, Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006). Las alteraciones de la composición del carbohidrato Asn 297 o su eliminación también afectan a la unión del dominio Fe del anticuerpo al receptor de Fcy (FcyR) y a la proteína del complemento Clq, lo que resulta importante para ADCC y CDC, respectivamente (Umana et al, Nat. Biotechnol. 17:176-180, 1999; Davies et al, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001; Mimura et al, J. Biol. Chem. 276:45539-45547, 2001; Radaev et al, J. Biol. Chem. 276:16478-16483, 2001; Shields et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001; Shields et al, J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Simmons et al, J. Immunol. Methods 263: 133-147, 2002).
BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente al dominio A2 de la tenascina-C, que presentan una afinidad elevada y/o una función efectora incrementada.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a TNC A2, que comprende por lo menos una (es decir, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) indicadas en SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47. En una realización, el anticuerpo comprende tres CDRs de cadena pesada (es decir, HCDRl, HCDR2 y HCDR3) y/o tres CDRs de cadena ligera (es decir, LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47. En una realización más particular, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo y/o una región variable de cadena ligera de anticuerpo, particularmente una región variable de tanto cadena pesada como cadena ligera, seleccionada de entre las secuencias de región variable de cadena pesada y de cadena ligera indicadas en SEC ID n° 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89 y 91. En una realización, el anticuerpo comprende una región Fe, particularmente una región Fe de IgG. En una realización adicional, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, particularmente un anticuerpo de clase IgG. En otra realización, el anticuerpo comprende una región constante de anticuerpo humano. En una realización, el anticuerpo es humano. En una realización, el anticuerpo se manipula mediante glucosilación para que presente oligosacáridos modificados en la región Fe. En una realización, el anticuerpo presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados y/o biantenarios en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. En una realización adicional, el anticuerpo presenta una función efectora incrementada y/o una afinidad de unión al receptor de Fe incrementada. En una realización particular, la función efectora incrementada es citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células (ADCC). En otra realización, el anticuerpo se une a TNC A2 humana con un valor de KD inferior a aproximadamente 1 µ?, preferentemente inferior a aproximadamente 100 nM, más preferentemente inferior a aproximadamente 1 nM. En una realización, se ha madurado la afinidad del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se une a TNC A2 en tejidos humanos.
En otros aspectos, la invención también se refiere a polipéptidos, polinucleótidos, células huésped y vectores de expresión relacionados con los anticuerpos. En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos de preparación de los anticuerpos. En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos de utilización de los anticuerpos, particularmente para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la expresión de TNC A2, tales como cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra análisis cinéticos basados en resonancia de plasmón superficial (SPR) de fragmentos Fab anti-TNC A2 de afinidad madurada que se unen a TNC A2 humana (hu). Se presentan datos cinéticos procesados para los clones 2B10_C3B6 (A), 2B10_6A12 (B), 2B10_C3A6 (C), 2B10_O7D8 (D), 2B10_OlF7 (E) y 2B10_6H10 (F). Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1 : 1.
La FIGURA 2 (A) muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab de 2B10 anti-TNC A2 ligantes de TNC A2 humana, murina y de mono Cynomolgus. La FIGURA 2 (B) muestra análisis cinéticos basados en SPR de IgG 2B10 anti-TNC A2 humana ligante de TNC A2 humana, murina y de mono Cynomolgus, tal como se indica en el Ejemplo 7. La FIGURA 3 (A) muestra imágenes inmunohistoquímicas de tejido uterino humano normal (paneles superiores) y tumoral (paneles inferiores) a una magnificación de 100X (paneles izquierdos) y de 400X (paneles intermedios) teñido con región variable de 2B10 en un fragmento Fab fusionado con un fragmento FLAG (SHD2B10-FLAG). Paneles derechos: control, magnificación de 100X. La FIGURA 3 (B) muestra los niveles de expresión de TNC A2 en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente teñida con región variable de 2B 10 en un fragmento Fab fusionado con un fragmento FLAG (SHD2B10-FLAG). Se tiñeron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con fragmento Fab SHD2B10-FLAG tal como se indica en el Ejemplo 8.
La FIGURA 4 (A) a (N) muestra imágenes inmunohistoquímicas de tejido humano a una magnificación de 100X (paneles izquierdos) y de 400X (paneles intermedios) teñido con IgG de ratón SHD2B10 tal como se indica en el Ejemplo 8. La tinción con anticuerpo de isotipo de control se muestra a una magnificación de 100X (paneles derechos). Paneles superiores: tejido normal, paneles inferiores: tejido tumoral. (A) cerebro, (B) mama, (C) colon, (D) riñon, (E) hígado, (F) pulmón, (G) ovario, (H) páncreas, (I) próstata, (J) músculo esquelético, (K) piel, (L) intestino delgado, (M) estómago, (N) útero.
La FIGURA 5 muestra la unión de IgG humana derivada de 2B10 a TNC A2 expresada en células tumorales de glioblastoma U87MG determinada mediante citometría de flujo (ver el Ejemplo 9). Se muestra la intensidad de fluorescencia media de células tratadas con diferentes concentraciones de IgG 2B10 en comparación con células no tratadas y con células teñidas únicamente con el anticuerpo secundario (controles negativos).
La FIGURA 6 muestra la purificación y el análisis de la IgG humana 2B10 de tipo salvaje. A) Etapa de purificación mediante cromatografía de afinidad de proteína A. B) Etapa de purificación mediante cromatografía por exclusión de tamaños. C) SDS PAGE analítico. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 1.
La FIGURA 7 muestra la purificación y el análisis de la IgG humana 2B10 manipulada mediante glucosilación. A) Etapa de purificación mediante cromatografía de afinidad de proteína A. B) Etapa de purificación mediante cromatografía por exclusión de tamaños. C) SDS PAGE analítico. D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 1.
La FIGURA 8 muestra la unión del anticuerpo 2B10 anti-TNC A2 en forma de tipo salvaje (wt) y en versión manipulada mediante glucosilación (ge) a TNC A2 sobre células U87MG.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES Una "región marco humana aceptora" para los fines de la presente memoria se refiere a una región marco que comprende una región marco de secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena ligera (VL) o una región marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivada de una región marco de inmunoglobulina humana o de una región marco de consenso humana, tal como se define posteriormente. Un marco humano aceptor "derivado de" una región marco de inmunoglobulina humana o de una región marco de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es de 10 ó inferior, de 9 ó inferior, de 8 ó inferior, de 7 ó inferior, de 6 ó inferior, de 5 ó inferior, de 4 ó inferior, de 3 ó inferior o de 2 ó inferior. En algunas realizaciones, la región marco humana aceptora VL presenta una secuencia idéntica a la secuencia marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia marco de consenso humana.
El término "afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse de manera general a partir de la constante de disociación (KD), que es la proporción entre las constantes de tasa de disociación y de asociación (kofr y kon, respectivamente). De esta manera, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de tasa, con la condición de que la proporción entre las constantes de tasa no varíe. Puede medirse la afinidad mediante métodos comunes conocidos de la técnica, incluyendo los descritos en la presente memoria. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "de afinidad madurada" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones (por ejemplo mutaciones de aminoácidos) en una o más regiones hipervariables (HVRs) (por ejemplo CDRs), en comparación con un anticuerpo parental que no presenta dichas alteraciones, resultando dichas alteraciones en una mejora de la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Típicamente, el anticuerpo de afinidad madurada se une al mismo epítopo que el anticuerpo parental.
Las expresiones "anticuerpo anti-TNC A2" y "un anticuerpo que se une al dominio A2 de la tenascina C" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a TNC A2 con suficiente afinidad para que el anticuerpo resulte útil como agente diagnóstico y/o terapéutico con diana en TNC A2. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-TNC A2 a una proteína no TNC A2 no relacionada es inferior a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a TNC A2 medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a TNC A2 presenta una constante de disociación (KD) de < ?µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo 10" M o inferior, por ejemplo de entre 10" M y 10" M, por ejemplo de entre 10"9 M y 10"13 M). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-TNC A2 se une a un epítopo de TNC A2 que se encuentra conservado entre las TNC A2 de diferentes especies.
El término "anticuerpo" en la presente memoria se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos muí tiespecí fieos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad de unión a antígeno deseada. También se encuentran incluidos fragmentos de anticuerpo que presentan una región Fe, y proteínas de fusión que comprenden una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto, que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, Fv, Fab, Fab.', Fab'-SH, F(ab')2, moléculas de anticuerpo de una cadena (por ejemplo scFv), diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia á su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o niás, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más. En la presente memoria se proporciona ensayo de competición ejemplar.
La expresión "dominio de unión a antígéno" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente, y es complementaria, a parte o la totalidad de un antígeno. En el caso de que el antígeno sea grande, una molécula de unión a antígeno podría sólo unirse a una parte particular del antígeno, denominándose a esta parte, epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede proporcionarse como, por ejemplo, uno o más dominios variables de anticuerpo (también denominados regiones variables de anticuerpo). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).
El término "quimérico" referido a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente. Para los anticuerpos quiméricos, por ejemplo, los componentes de unión no antígenos pueden derivarse de una amplia diversidad de especies, incluyendo primates tales como chimpancés y seres humanos. Los anticuerpos humanizados son una forma particularmente preferente de anticuerpos quiméricos.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o de región constante que presente la cadena pesada del mismo. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de las mismas, pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAj e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.
La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o que provoca la muerte o destrucción celular. Entre los agentes citotóxicos se incluyen, aunque sin limitación, isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu), agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes), agentes inhibidores del crecimiento, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticos, antibióticos, toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o anticáncer dados a conocer posteriormente.
Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían según el isotipo del anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen: la unión de Clq y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión de receptor Fe, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la secreción de citoquinas, la incorporación de antígenos mediada por complejo inmunológico por parte de células presentadoras de antígeno, la regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo los receptores de células B) y la activación de las células B.
Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo de una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
La expresión "región Fe" en la presente memoria se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una parte de la región constante. La expresión incluye las regiones Fe de secuencia nativa y las regiones Fe variantes. En una realización, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede encontrarse presente o no. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, la numeración de los residuos aminoácidos en la región Fe o en la región constante sigue el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
La expresión "región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina" pretende incluir las variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina, así como variantes que presentan alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no reducen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina de mediar en funciones efectoras (tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células). Por ejemplo, puede delecionarse uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de la región Fe de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes pueden seleccionarse según las reglas generales conocidas de la técnica de manera que presenten un efecto mínimo sobre la actividad (ver, por ejemplo, Bowie J.U. et al., Science 247:1306-10, 1990).
El término "marco" o "FR" se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de región hipervariable (HVR) (o CDR). El FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias HVR y FR generalmente aparecen en la secuencia siguiente en el VH (o en el VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
La expresión "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan en la presente memoria intercambiablemente para referirse a un anticuerpo que presenta una estructura sustancialmente similar a una estructura nativa de anticuerpo o que presenta cadenas pesadas que contienen una región Fe tal como se define en la presente memoria.
Las expresiones "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se utilizan intercambiablemente y se refieren a células en las que se han introducido ácidos nucleicos exógenos, incluyendo la progenie de dichas células. Entre las células huésped se incluyen "transformantes" y "células transformadas", incluyendo las células transformadas primarias y la progenie derivada de las mismas, con independencia del número de pases de cultivo. La progenie puede no ser completamente idéntica en su contenido de ácidos nucleicos a una célula parental, sino que puede contener mutaciones. Se encuentra incluida en la presente memoria la progenie muíante que presenta la misma función o actividad biológica cribada o seleccionada en la célula originalmente transformada. En una realización, la célula huésped se manipula para permitir la producción de un anticuerpo con oligosacáridos modificados. En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de p(l,4)-N-actilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). Entre las células huésped se incluyen células en cultivo, por ejemplo células de mamífero en cultivo tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo.
Un "anticuerpo humano" es uno que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpo humano. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Una "región marco de consenso humana" es una región marco que representa los residuos aminoácidos más comunes en una selección de secuencias de región marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo tal como en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, publicación de NIH n° 91-3242, Bethesda MD, 1991, vols. n? 1 a 3. En una realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa 1, tal como en Kabat et al, supra. En una realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III, tal como en Kabat et al. , supra.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende los residuos aminoácidos de HVRs no humanas y residuos aminoácidos de FRs humanos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las HVRs (por ejemplo CDRs) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FRs corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sido sometido a humanización. La expresión "región hipervariable" o "HVR", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que presentan una secuencia hipervariable y/o que forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVRs, tres en el VH (Hl, H2, H3) y tres en el VL (Ll, L2, L3). Las HVRs generalmente comprende residuos aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDRS), siendo éstas últimas de la máxima variable de secuencia y/o encontrándose implicados en el reconocimiento de antígeno. Con la excepción de la CDR1 en la VH, las CDRs generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVRs) también se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y estas expresiones se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para hacer referencia a partes de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al. , U.S'. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983, y por Chothia et ai, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, en donde las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subconjuntos de residuos aminoácidos al compararlas entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma pretende encontrarse comprendida dentro del alcance de la expresión según se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados que comprenden las CDRs tal como se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se proporcionan a continuación, en la Tabla 1, a título comparativo. El número exacto de residuos que comprende una CDR particular varía dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. El experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones de CDR1 1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 sigue las convenciones de numeración proporcionadas por Kabat et al. (ver posteriormente).
"AbM" con una "b" minúscula, tal como se utiliza en la Tabla 1, se refiere a las CDRs según la definición del programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también han definido un sistema de numeración para las secuencias de región variable que resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia podrá asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de región variable sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración proporcionado por Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos aminoácidos en una región variable de anticuerpo siguen el sistema de numeración de Kabat.
Las CDRs también comprenden "residuos determinantes de especificidad", o "SDRs", que son residuos que entran en contacto con los antígenos. Las SDRs se encuentran contenidas dentro de regiones de las CDRs denominadas CDRs-abreviadas o CDRs-a. En general, únicamente un quinto a un tercio de los residuos en una CDR dada participan en la unión a antígenos. Los residuos determinantes de especificidad en una CDR particular pueden identificarse mediante, por ejemplo, el cálculo de los contactos interatómicos a partir del modelado tridimensional y la determinación de la variabilidad de las secuencias en una posición de residuo dada según los métodos descritos en Padlan et al, FASEB J. 9(1): 133-139, 1995. Se encuentran CDRs-a (CDR-a-Ll, CDR-a-L2, CDR-a-L3, CDR-a-Hl, CDR-a-H2 y CDR-a-H3) en los residuos aminoácidos 31 a 34 de Ll, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de Hl, 50 a 58 de H2 y 95 a 102 de H3 (ver Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo residuos de FR) se numeran en la presente memoria según Kabat et al. , supra.
Un "conjugado de anticuerpo" es un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, animales domesticados (por ejemplo vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su ambiente natural. En algunas realizaciones, se purifica un anticuerpo hasta una pureza superior a 95% ó 99%, determinada mediante, por ejemplo, métodos electroforéticos (por ejemplo SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo HPLC de intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Para una revisión de los métodos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos ver, por ejemplo, Flatman et al. , J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007.
Un polinucleótido "aislado" se refiere a una molécula polinucleótida que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleótida contenida en células que habitualmente contienen la molécula polinucleótida, aunque la molécula polinucleótida se encuentre presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica que sea diferente de su localización cromosómica natural.
La expresión "polinucleótido aislado codificante de un anticuerpo anti-TNC A2" se refiere a una o más moléculas polinucleótidas codificantes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha molécula o moléculas polinucleótidas en un único vector o en vectores separados, y encontrándose presentes dicha molécula o moléculas polinucleótidas en una o más localizaciones en una célula huésped.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo que contengan mutaciones naturales o que aparecen durante la producción de un anticuerpo monoclonal, encontrándose presentes generalmente dichas variantes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo es que ha sido obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse según la presente invención pueden prepararse mediante una diversidad de técnicas, incluyendo, aunque sin limitación, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de expresión fágica, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, estando descritos en la presente memoria dichos métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no se encuentra conjugado con un grupo heterólogo (por ejemplo un grupo citotóxico) o con un mareaje radioactivo. El anticuerpo desnudo puede encontrarse presente en una formulación farmacéutica.
Los "anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se encuentran unidas por disulfuros. De extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena pesada presenta una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también denominado región constante de cadena pesada. De manera similar, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena ligera presenta una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL), también denominado región constante de cadena ligera. La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
La expresión "reactividad cruzada sustancialmente nula" se refiere a que una molécula (por ejemplo un anticuerpo) no reconoce o no se une específicamente a un antígeno que sea diferente del antígeno diana real de la molécula (por ejemplo un antígeno estrechamente relacionado con el antígeno diana), particularmente en comparación con dicho antígeno diana. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse a menos de entre aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% a un antígeno diferente del antígeno diana real, o pueden unirse a dicho antígeno que es diferente del antígeno diana real en una cantidad seleccionada de entre el grupo que consiste de menos de aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ó 0,1%, preferentemente menos de aproximadamente 2%, 1% ó 0,5%, y más preferentemente menos de aproximadamente 0,2% ó 0,1% de antígeno diferente del antígeno diana real.
La expresión "prospecto en el paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes a la utilización de dichos productos terapéuticos.
El término "parental" referido a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que se utiliza como punto de partida o base para la preparación de una variante.
"La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata idénticos a los de la secuencia polipeptídica de referencia tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinación del porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando programas informáticos disponibles públicamente, tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El experto en la materia puede determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los fines de la presente memoria, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado conjuntamente con la documentación para usuario en el U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde se ha registrado bajo el n° de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.
En los casos en que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones entre secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente: 100 veces la fracción X/Y en la que X es él número de residuos aminoácidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, y en el que Y es el número total de residuos aminoácidos de B. Se apreciará que, en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente memoria se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
De manera similar, la referencia a un ácido nucleico o polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto en que la secuencia polinucleótida puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un grupo de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' ó 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En la práctica, puede determinarse si algún polinucleótido o polipéptido particular es idéntico por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a una secuencia de nucleótidos o a una secuencia polipeptídica de la presente invención convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos, tales como los indicados anteriormente.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma resulte efectivo, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto en el que se administre la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que resulta no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.
La expresión "dominio A2 de la tenascina-C (TNC A2)" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier TNC A2 nativa procedente de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo seres humanos) y roedores (por ejemplo ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. La expresión com rende "longitud completa", TNC A2 no procesada, así como cualquier forma de TNC A2 que resulte del procesamiento en la célula. La expresión también comprende variantes naturales de TNC A2, por ejemplo variantes de procesamiento , o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una TNC A2 humana ejemplar (con etiquetas avi y 6x His C-terminales) se muestra en SEC ID n° 97. En la molécula de tenascina-C humana, el dominio A2 es el segundo (desde el extremo N-terminal) de hasta nueve dominios de fibronectina de tipo III alternativamente procesados, que puede insertarse entre el quinto y el sexto dominios constantes de fibronectina de tipo III (para una representación esquemática de la estructura de dominios de la tenascina-C, ver, por ejemplo, Orend y Chiquet-Ehrismann, Cáncer Letters 244:143-163, 2006). De manera similar, en la molécula de tenascina-C de ratón, el dominio A2 es el segundo de hasta seis dominios de fibronectina de tipo III alternativamente procesados (descrito en, por ejemplo, Joestner y Faissner, J. Biol. Chem. 274:17144-17151, 1999).
Tal cómo se utiliza en la presente memoria, el término "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural de la enfermedad del individuo bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la prevención de la aparición o recurrencia de una enfermedad, el alivio de síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la reducción de la tasa de avance de la enfermedad, la mejora o la paliación del estado de la enfermedad y la remisión o la mejora de la prognosis. En algunas realizaciones, se utilizan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para enlentecer el avance de la misma.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que se encuentra implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente presentan estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco (FRs) conservadas y tres regiones hipervariables (HVRs) (ver, por ejemplo, Kindt e al. Kuby Immunology, 6a edición, W.H. Freeman and Co., página 91, 2007). Puede resultar suficiente un único dominio VH o VL para proporcionar especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio VH o VL a partir de un anticuerpo que se une al antígeno, con el fin de cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887, 1993; Clarkson et ai, Nature 352:624-628, 1991).
El término "vector" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de propagar otro ácido nucleico al que se encuentra unida. El término incluye el vector en forma de una estructura autoreplicante de ácidos nucleicos, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que ha sido introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se encuentran operablemente unidos. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión".
Tal como se utiliza en la presente memoria, "un polipéptido que presenta actividad de GnTIII" se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) en enlace ß-1-4 al manósido ß-ligado del núcleo trimanosilo de los oligosacáridos N-ligados. Lo anterior incluye los polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de P(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como ß-1,4-manosil-glucoproteína 4-3-N-acetilglucosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144), según el comité de nomenclatura del International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), medida en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de que exista dependencia de la dosis, ésta no es necesariamente idéntica a la de GnTIII, sino que, por el contrario, es sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con la GnTIII (es decir, el polipéptido candidato muestra una actividad mayor, o no superior a aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no superior a aproximadamente diez veces menos, y más preferentemente, no superior a aproximadamente tres veces menos actividad que GnTIII).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio de localización en Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el Golgi que es responsable del anclaje del polipéptido en una localización dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localización comprenden "colas" aminoterminales de un enzima.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "manipular, manipulado, manipulación", particularmente con el prefijo "gluco", así como la expresión "manipulación mediante glucosilación", se considera que incluyen cualquier manipulación del patrón de glucosilación de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La glucomanipulación incluye la manipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo manipulaciones genéticas de las rutas de síntesis de oligosacáridos para conseguir la glucosilación alterada de las glucoproteínas expresadas en estas células. Además, la manipulación mediante glucosilación incluye los efectos de mutaciones y del ambienté celular sobre la glucosilación. En una realización, la manipulación mediante glucosilación es una alteración de la actividad de glucosiltransferasa. En una realización particular, la manipulación resulta en una actividad glucosaminiltransferasa y/o actividad fucosiltransferasa alterada.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fe" incluye la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad celular mediada por una proteína de fusión de Fe soluble que contiene una región Fe humana. Es un mecanismo inmunológico que conduce a la lisis de "células diana" por parte de "células inmunológicas efectoras humanas", en el que: Las "células inmunológicas efectoras humanas" son una población de leucocitos que muestran receptores de Fe sobre su superficie a través de los cuales se unen a la región Fe de anticuerpos o de proteínas de fusión de Fe y llevan a cabo funciones efectoras. Dicha población puede incluir, aunque sin limitarse a ellas, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células asesinas naturales (NK).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "células diana" se refiere a células a las que se unen específicamente moléculas de unión a antígeno que comprenden una región de Fe (por ejemplo anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fe) o proteínas de fusión de Fe. Las moléculas de unión a antígeno o proteínas de fusión de Fe se unen a las células diana a través de la parte proteína que es N-terminal respecto a la región Fe.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada" se define como un incremento del número de "células diana" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo o de proteína de fusión de Fe, en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe definido anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo o de la proteína de fusión de Fe, en el medio circundante a las células diana, necesaria para conseguir la lisis de un número dado de "células diana", en un tiempo dado, por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe. El incremento de la citotoxicidad celular mediada por Fe es relativa a la citotoxicidad celular mediada por la misma molécula de unión a antígeno o proteína de fusión de Fe, producida por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento (que son conocidos por el experto en la materia), pero que no ha sido producido por células huésped que han sido manipuladas para que presenten un patrón alterado de glucosilación (por ejemplo para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII u otras glucosiltransferasas) mediante los métodos descritos en la presente memoria.
La expresión "anticuerpo que presenta una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada" se refiere a un anticuerpo, tal como se define este término en la presente memoria, que presenta una ADCC incrementada según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo in vitro de ADCC aceptado es el siguiente: 1) el ensayo utilizó células diana que es conocido que expresaban el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo, 2) el ensayo utilizó células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas, aisladas a partir de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, a modo de células efectoras, 3) el ensayo se llevó a cabo según el protocolo siguiente: i) se aislaron las PBMCs utilizando procedimientos estándares de centrifugación en gradiente de densidad y se suspendieron a una densidad de 5x106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI, ii) se cultivaron las células diana mediante métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90%, se lavaron en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 µCuries de 51Cr, se lavaron dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspendiero en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml, iii) se transfirieron 100 microlitros de la suspensión final de células diana anteriormente indicada a cada pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios, iv) el anticuerpo se diluyó en serie entre 4.000 ng/ml y 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añadieron 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocilios, realizando un ensayo por triplicado de diversas concentraciones de anticuerpo que cubrían el intei"valo completo de concentraciones anteriormente indicado, v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas recibieron 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vii) la placa de microtitulación de 96 pocilios seguidamente se centrifugó a 50xg durante 1 minuto y se incubó durante 1 hora a 4°C, viii) se añadieron 50 microlitros de la suspensión de PBMCs (punto i, anteriormente) a cada pocilio, rindiendo una proporción de célula efectora:diana de 25:1, y las placas se introdujeron en un incubador bajo una atmósfera de 5% de C02 a 37°C durante 4 horas, ix) se recolecta el sobrenadante libre de células de cada pocilio y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifíca utilizando un contador gamma, x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantifícada (ver el punto ix, anteriormente) para la concentración de anticuerpos correspondiente, MR es la radioactividad media cuantifícada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles MR (ver el punto v, anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantifícada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi, anteriormente), 4) se define "ADCC incrementada" como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpos necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente. El incremento de ADCC es respecto a la ADCC, medida con el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo, producida por el mismo tipo de células huésped, utilizando los. mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por células huésped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS La tenasciria-C, en particular el dominio A2 y otros dominios alternativamente procesados de la tenascina C, se expresa específicamente en determinadas condiciones patológicos, pero se encuentra esencialmente ausente de los tejidos adultos sanos; de esta manera, los anticuerpos que presentan como diana este antígeno presentan un gran potencial terapéutico. La presente invención proporciona anticuerpos que se unen al dominio A2 de la tenascina C, en particular anticuerpos con elevada afinidad y funciones de efector fuerte. Los anticuerpos de la invención resultan útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades caracterizadas por la expresión de TNC A2, tales como el cáncer.
A. Anticuerpos anti-TNC A2 ejemplares La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2). Particularmente, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TNC A2, en el que dichos anticuerpos son manipulados mediante glucosilación para que presenten una función efectora incrementada. . En una realización, un anticuerpo anti-TNC A2 de la invención comprende por lo menos una (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada o ligera seleccionadas de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n0 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23, SEC ID n0 25, SEC ID n° 27, SEC ID n°. 29, SEC ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41 , SEC ID.n° 43, SEC ID n° 45 y SEC ID n° 47, o una variante o forma truncada de los mismos que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad (SDRs) de dicha CDR. En una realización, un anticuerpo anti-TNC A2 de la invención comprende por lo menos una (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada o ligera seleccionadas de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 29, SEC ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45 y SEC ID n° 47, en el que el anticuerpo no comprende la combinación de una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 15 y SEC ID n° 21, la CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEC ID n° 27, la CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEC ID n° 47.
En una realización, dicha por lo menos una CDR es una CDR de cadena pesada, particularmente una CDR3 de cadena pesada seleccionada de SEC ID n° 27. En otra realización, el anticuerpo comprende por lo menos una CDR de cadena pesada y por lo menos una CDR de cadena ligera, particularmente una CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27 y una CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende por lo menos una, por lo menos dos, o la totalidad de tres secuencias CDR de cadena pesada (HCDR) seleccionadas de entre (a) HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, (b) HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 1 1, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 25, y (c) HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 27. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende (a) una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, (b) una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 25, y (c) la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, o variantes o formas truncadas de las mismas que contiene por lo menos las SDRs de dichas CDRs.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende por lo menos una, por lo menos dos, o la totalidad de tres secuencias CDR de cadena ligera (LCDR) seleccionadas de entre (a) LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, (b) LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y (c) LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 47. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende (a) una CDRl de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, (b) una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y (c) la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47, o variantes o formas truncadas de las mismas, que contienen por lo menos las SDRs de dichas CDRs.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 25, y la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47, o variantes o formas truncadas de las mismas, que contienen por lo menos las SDRs de dichas CDRs.
En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 25, y la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRl de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47, en el que dicho anticuerpo no comprende la combinación de una CDRl de cadena pesada (HCDR1) seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 15 y SEC ID n° 21, la CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEC ID n° 27, la CDRl de cadena ligera (LCDR1) de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEC ID n° 47.
En una realización específica, el anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23 y SEC ID n° 25, y la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, y una región variable de cadena ligera que comprende la CDRl de cadena ligera de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47. En otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 15 y SEC ID n° 21, y la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47. En todavía otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 15 y SEC ID n° 21, y la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, y una región variable de cadena ligera que comprende la cadena ligera de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63. En una realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63.
En determinadas realizaciones, una secuencia de VH que presenta una identidad de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% contiene sustituciones (por ejemplo sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia, aunque un anticuerpo anti-TNC A2 que comprende dicha secuencia conserva la capacidad de unirse a TNC A2. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos ha sido sustituido, insertado y/o delecionado en la secuencia SEC ID n° 59, 63 ó 67. En determinadas realizaciones, se realizan sustituciones, inserciones o deleciones en regiones exteriores a las HVRs o CDRs (es decir, en las FRs). Opcionalmente, un anticuerpo anti-TNC A2 según la invención comprende la secuencia de VH en SEC ID n° 59, 63 ó 67, incluyendo modificaciones post-traduccionales de dicha secuencia. En una realización particular, la VH comprende una, dos o tres CDRs de cadena pesada seleccionadas de entre las secuencias indicadas en SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27 para la HCDR1, HCDR2 y HCDR3.
En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. En todavía otra realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89.
En determinadas realizaciones, una secuencia de VL que presenta una identidad de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% contiene sustituciones (por ejemplo sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones respecto a la secuencia de referencia, aunque un anticuerpo anti-TNC A2 que comprende dicha secuencia conserva la capacidad de unirse a TNC A2. En determinadas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos ha sido sustituido, insertado y/o delecionado en la secuencia SEC ID n° 55, 57, 69, 73, 77, 81, 85 ó 89. En determinadas realizaciones, se realizan sustituciones, inserciones o deleciones en regiones exteriores a las HVRs o CDRs (es decir, en las FRs). Opcionalmente, un anticuerpo anti-TNC A2 de la invención comprende la secuencia de VL en SEC ID n° 55, 57, 69, 73, 77, 81, 85 ó 89, incluyendo las modificaciones post-traduccionales de dicha secuencia. En una realización particular, la VL comprende una, dos o tres CDRs de cadena ligera seleccionadas de entre las secuencias indicadas en SEC ID n° 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47 para la LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TNC A2, en el que el anticuerpo comprende una VH tal como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y una VL tal como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y de VL en SEC ID n° 59, 63 ó 67 y en SEC ID n° 55, 57, 69, 73, 77, 81, 85 ó 89, respectivamente, incluyendo las modificaciones post-traduccionales de dichas secuencias.
En una realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre grupo de: SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89, en el que dicho anticuerpo no comprende una combinación de una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 59, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 55 ó a la secuencia SEC ID n° 57.
En una realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 59, una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre grupo de SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. En otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 63 ó de SEC ID n° 67, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 57. En todavía otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 59, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 55 ó SEC ID n° 57. En una realización particular, el anticuerpo según cualquiera de las realizaciones anteriores comprende además una región Fe o una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región Fe, particularmente una región Fe de IgG, más particularmente una región Fe de IgGl .
En una realización particular, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, particularmente un anticuerpo de clase IgG, más particularmente un anticuerpo de isotipo IgGl . En otra realización, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo, seleccionado de entre el grupo de: un fragmento scFv, un fragmento Fv, un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2. En una realización adicional, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo que presenta una región Fe, o una proteína de fusión que comprende una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina. En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.
En una realización, un anticuerpo de la invención es quimérico, más específicamente humanizado. En una realización particular, un anticuerpo de la invención es humano. En otra realización, un anticuerpo de la invención comprende una región constante humana. En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una región Fe humana, preferentemente una región Fe de IgG, más particularmente una región Fe de IgGl humana. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región constante de cadena pesada, en la que dicha región constante de cadena pesada es una región constante de IgG humana, particularmente una región constante de IgGl humana, que comprende una región Fe. En una realización específica, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 93. En otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 95. En todavía otra realización específica, un anticuerpo de la invención comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 93, y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 95. En una realización particular, la invención proporciona un anticuerpo que se un específicamente a TNC A2, en el que dicho anticuerpo comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, o una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89, o una combinación de las mismas, y b) una región Fe o una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina.
En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región Fe, en el que dicha región Fe es una región Fe glucomanipulada. En una realización adicional, un anticuerpo de la invención se manipula mediante glucosilación para que presente oligosacáridos modificados en la región Fe. En una realización específica, el anticuerpo presenta una proporción incrementada de oligosacáridos biantenarios en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. En una realización más específica, por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 70%, de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo son biantenarios. Los oligosacáridos biantenarios pueden ser de tipo híbrido o complejo.
En otra realización específica, un anticuerpo de la invención presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. En una realización más específica, por lo menos aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 70%, de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo son no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo.
En una realización particular, un anticuerpo de la invención presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados biantenarios en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. Específicamente, el anticuerpo comprende una región Fe en la que por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 15%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 35% o por lo menos aproximadamente 50% de los oligosacáridos N-ligados son biantenarios no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados biantenarios pueden ser de tipo híbrido o complejo.
En una realización, un anticuerpo de la invención presenta una función efectora incrementada y/o una afinidad de unión al receptor de Fe incrementada. La función efectora incrementada y/o unión a receptor de Fe incrementada puede resultar, por ejemplo, de la manipulación mediante glucosilación y/o la maduración de la afinidad de los anticuerpos. En una realización, la función efectora incrementada y/o la unión a receptor de Fe incrementada es el resultado de la manipulación mediante glucosilación de la región Fe del anticuerpo. En otra realización, la función efectora incrementada y/o la unión a receptor de Fe incrementada es el resultado de una combinación de afinidad incrementada y manipulación mediante glucosilación. La función efectóra incrementada puede incluir, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada (incluyendo la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, la secreción de citoquinas incrementada, la incorporación incrementada de antígeno por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, la unión a células NK incrementada, la unión a macrófagos incrementada, la unión a monocitos incrementada, la unión a células polimorfonucleares incrementada, la señalización directa inductora de apoptosis incrementada, el entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana incrementado, la maduración de células dendríticas incrementada o el cebado de células T incrementado. En una realización particular, la función efectora incrementada es ADCC incrementada. La unión a receptor de Fe incrementada preferentemente es la unión incrementada a un receptor de Fe activador, más preferentemente FcyRIIIa.
En una realización, un anticuerpo de la invención no provoca un nivel clínicamente significativo de toxicidad al administrarlo en un individuo en una cantidad terapéuticamente efectiva.
En una realización, se madura la afinidad de un anticuerpo de la invención. En una realización adicional, un anticuerpo de la invención se une al dominio A2 de la tenascina-C (TNC A2) con una constante de disociación (KD) con un valor entre uno inferior a aproximadamente 1 µ? y aproximadamente 0,001 nM, particularmente un valor de KD inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 1 nM. En una realización, un anticuerpo de la invención se une al dominio A2 de la TNC A2 humana, de ratón y de mono Cynomolgus. En una realización, un anticuerpo de la invención se une al dominio A2 de la TNC A2 humana y de mono Cynomolgus. En una realización más específica, un anticuerpo de la invención se une al dominio A2 de la TNC A2 humana y de mono Cynomolgus con un valor de KQ inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 1 nM. Los valores de KD se determinan mediante resonancia de plasmón superficial utilizando anticuerpos tales como Fab o IgG, particularmente IgG.
En una realización, un anticuerpo anti-TNC A2 de la invención se une a TNC A2 en tejidos humanos.
En una realización particular, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID nH 67 y SEC ID n° 63, una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89, y una región Fe de IgG humana, y en la que opcionalmente dicho anticuerpo se ha manipulado mediante glucosilación para que presente una función efectora y/o afinidad de unión a receptor de Fe incrementadas. En otra realización particular, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89, y una región Fe de IgG humana, y en la que dicho · anticuerpo presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados y/o una proporción incrementada de oligosacáridos biantenarios en dicha región Fe.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), en el que dicho anticuerpo se deriva a partir de un anticuerpo parental que comprende la CDR1 de cadena pesada de SEC ID n° 3, la CDR2 de cadena pesada de SEC ID n° 9, la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, la CDR1 de cadena ligera de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47, y en la que dicho anticuerpo comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos en por lo menos una CDR de cadena pesada o ligera respecto al anticuerpo parental. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender por lo menos una, por ejemplo entre aproximadamente una y aproximadamente diez (es decir, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10), y particularmente entre aproximadamente dos y aproximadamente cinco, sustituciones en una o más regiones hipervariables o CDRs (es decir, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 regiones hipervariables o CDRs) del anticuerpo parental. En determinadas realizaciones, uno o más aminoácidos cualesquiera del anticuerpo parental tal como se ha proporcionado anteriormente se sustituyen en las posiciones de CDR siguientes: - CDR2 de cadena pesada (SEC ID n° 9): posiciones 1, 6 y 8 - CDR1 de cadena ligera (SEC ID n° 29): posiciones 5 y 9 - CDR1 de cadena ligera (SEC ID n° 35): posiciones 1, 2 y 3 > En determinadas realizaciones, las sustituciones son sustituciones conservadoras, tal como se proporciona en la presente memoria. En determinadas realizaciones, puede realizarse cualquiera de las sustituciones siguientes en cualquier combinación: - CDR2 de cadena pesada (SEC ID n° 9): G1A o V, F6L, T8I - CDR1 de cadena ligera (SEC ID n° 29): G5S, D9V - CDR1 de cadena ligera (SEC ID n° 35): AID, A2S o V, S3Y o T Además, el anticuerpo también puede comprender una o más adiciones, deleciones y/o sustituciones en una o más regiones de marco de la cadena pesada o de la cadena ligera, en comparación con el anticuerpo parental. En una realización, dicha sustitución de aminoácidos en por lo menos una CDR contribuyen a una afinidad de unión incrementada del anticuerpo en comparación con su anticuerpo parental. En otra realización, dicho anticuerpo presenta una afinidad de entre por lo menos aproximadamente 2 y aproximadamente 10 veces mayor para TNC A2 que el anticuerpo parental (en comparación con el anticuerpo de la invención y el anticuerpo parental en el mismo formato, por ejemplo el formato Fab). Además, el anticuerpo derivado de un anticuerpo parental puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, descritas en los párrafos anteriores en relación a los anticuerpos de la invención.
La presente invención también proporciona polinucleótidos codificantes de anticuerpos que se unen específicamente al dominio A2 de la tenascina-C. En un aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que forma parte de un anticuerpo anti-TNC A2 según la invención tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
En una realización, el polinucleótido aislado codifica una cadena pesada de anticuerpo y/o una cadena ligera de anticuerpo que forma parte de un anticuerpo anti-TNC A2 según la invención tal como se descrito anteriormente en la presente memoria.
En una realización, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificante de una o más (por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de las regiones determinantes dé complementariedad (CDRs) de cadena pesada o ligera indicadas en SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47, o una variante o forma truncada de las mismas que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad (SDRs) de dichas CDRs. En otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica tres CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1, HCDR2 y HCDR3) o tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47, o variantes o formas truncadas de las mismas que contienen por lo menos las SDRs para cada una de dichas tres regiones, determinantes de complementariedad. En todavía otra realización, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de tres CDRs de cadena pesada (por ejemplo HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y tres CDRs de cadena ligera (por ejemplo LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas de entre SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47. En una realización particular, el polinucléotido codificante de una o más CDRs comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una o más de las secuencias de nucleótidos de CDR de SEC ID n° 4, 6 ,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53 y 54.
En una realización adicional, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de una región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y/o una secuencia codificante de una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. En una realización particular, el polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada y/o de cadena ligera comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias de nucleótidos de región variable que consiste de SEC ID n° 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 y 92, o una combinación de las mismas.
En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de una región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y una secuencia codificante de una región constante de cadena pesada, particularmente una región constante de cadena pesada humana. En una realización particular, dicha región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG humana, específicamente una región constante de cadena pesada de IgGl humana que comprende una región Fe. En una realización específica, dicha región constante de cadena pesada comprende la secuencia SEC ID n° 93. En otra realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia codificante de una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89, y una secuencia codificante de una región constante de cadena ligera, particularmente una región constante de cadena ligera humana. En una realización específica, dicha región constante de cadena ligera comprende la secuencia SEC ID n° 95.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende un primer polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica por lo menos aproximadamente al 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y un segundo polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 90%., 95%, 96%, 97%, 98%>, 99% ó 100%. idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81 , SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89.
En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende un primer polinucleótido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica por lo menos aproximadamente al 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%. respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 60, SEC ID n° 68 y SEC ID n° 64, y un segundo polinucleótido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 90%, 95%, 96%», 97%, 98%., 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° -78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86 y SEC ID n° 90.
En un aspecto adicional, la invención también se refiere a polipéptidos aislados, codificados por cualquier de los polinucleótidos según la invención tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti^TNC A2 según cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, tal como se describe en las secciones 1 a 6, posteriormente: 1. Afinidad de anticuerpos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria presenta una constante de disociación (KD) de < ?µ?, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo 10"8M o inferior, por ejemplo de entre 10"8 M y 10"13 M, por ejemplo de entre 10"9 M y 10"13 M). Preferentemente, los anticuerpos proporcionados en la presente memoria se unen al dominio A2 de la tenascina-C (TNC A2), en particular la TNC A2 humana, con un valor de KD inferior a 1 nM, determinado mediante resonancia de plasmón superficial (SPR).
Según una realización, la KD se mide utilizando resonancia de plasmón superficial. Dicho ensayo puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un aparato BIACORE®-T100 (GE Healthcare) a 25°C con antígeno biotinilado inmovilizado sobre chips con estreptavidina a -80 unidades de respuesta (RU). Brevemente, para la inmovilización, el antígeno se diluyó con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4, hasta 0,1 µ^p?? antes de la inyección a un caudal de 10 µ?/minuto hasta alcanzar aproximadamente 80 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Las secuencias de proteína y de ADN de los constructos de antígeno adecuados se muestran en SEC ID n° 99 a 104. Para las mediciones de cinética, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de Fab (1,56 nM a 100 nM) o de IgG (0,39 nM a 25 nM) en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4, a 25°C a un caudal de aproximadamente 50 µ?/minuto. Los tiempos de asociación y disociación eran de 180 segundos y se llevó a cabo una regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 60 segundos entre los ciclos. Las tasas de asociación (kon) y de disociación (kofr) se calcularon utilizando un modelo simple de Langmuir de unión uno a uno (BIACORE® TI 00 Evaluation Software, versión 1.1.1) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de equilibrio de disociación (KD) como la proporción koff k0n- Ver, por ejemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999. . 2. Fragmentos de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un fragmento de anticuerpo. Entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos indicados posteriormente. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo ver Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134, 2003, o Cárter, Nat. Rev. Immunol. 6:343-357, 2006. Los fragmentos Fv de una cadena o scFv comprenden un dominio de VH y un dominio de VL en forma de una sola cadena polipeptídica. Típicamente los dominios de VH y de VL se unen mediante una secuencia conectora. Para una revisión de los fragmentos scFv ver, por ejemplo, Plückthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg y Moore, editores (Springer-Verlag, New York), páginas 269 a 315, 1994, ver también la patente WO n° 93/16185, y las patentes US n° 5.571.894 y n° 5.587.458. Para un comentario de los f agmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate y que presentan una vida media in vivo incrementada, ver la patente US n° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, las patentes EP n° 404.097, WO n° 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134, 2003, y Hollinger et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al. , Nat. Med. 9:129-134, 2003.
Un minicuerpo es un derivado de scFv homodimérico bivalente que contiene una región constante, típicamente la región CH3 de una inmunoglobulina, preferentemente IgG, más preferentemente IgGl, como región de dimerización. Generalmente, la región constante se conecta al scFv a través de una región bisagra y/o una región conectora. Pueden encontrarse ejemplos de proteínas minicuerpo en Hu et ai, Cáncer Res. 56: 3055-61 (1996).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo humano de un solo dominio (Domantis Inc., Waltham M.A.; ver, por ejemplo, la patente US n° 6.248.516 Bl).
Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas técnicas, incluyendo, aunque sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por parte de células huésped recombinantes (por ejemplo E. coli o un fago), tal como se describe en la presente memoria. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente US n° 4.816.567, y en Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1984. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase intercambiada", en el que la clase o subclase ha sido modificada por la del anticuerpo parental. Entre los anticuerpos quiméricos se incluyen fragmentos ligantes de los mismos.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir su inmunogenicidad para el ser humano, conservando simultáneamente la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVRs, por ejemplo las CDRs (o partes de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y las FRs (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende por lo menos una parte de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por residuos correspondientes procedentes de un anticuerpo no humano (por ejemplo el anticuerpo a partir del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. La humanización puede conseguirse mediante diversos métodos, entre ellos: (a) injertar los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos, (b) injertar únicamente las CDRs no humanas (por ejemplo un anticuerpo donador) en un marco humano (por ejemplo un anticuerpo receptor) y regiones constantes con o sin conservación de los residuos de marco críticos (por ejemplo aquellos que resultan importantes para conservan una buena afinidad de unión de antígeno o funciones de anticuerpo), (c) injertar únicamente las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDRs o CDRs-a, los residuos críticos para la interacción de anticuerpo-antígeno) en regiones de marco y constantes humanas, o (d) trasplantar los dominios variables no humanos completos, aunque "recubriéndolos" con una sección de tipo humano mediante sustitución de los residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y los métodos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008, y se describen además en, por ejemplo, Riechmann et al, Nature 332:323-329, 1988; Queen et al, Proc. Nat'l Acad. Sel USA 86:10029-10033, 1989; patentes US n° 5.821.337, n° 7.527.791, n° 6.982.321 y n° 7.087.409; Jones et al, Nature 321 :522-525, 1986; Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 81 :6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol. 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217, 1994; Kashmiri et al, Methods 36:25-34, 2005 (que describe la injertación de SDR (CDR-a)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498, 1991 (que describe la "resuperficialización"); Dall'Acqua et al, Methods 36:43-60, 2005 (que describe la "reorganización de FR") y Osbourn et al, Methods 36:61-68, 2005, y Klimka et al, Br. J. Cáncer 83:252-260, 2000 (que describe el enfoque de "selección guiada" a la reorganización de FRs).
Entre las regiones de marco humanas que pueden utilizarse para la humanización se incluyen, aunque sin limitación: regiones de marco seleccionadas utilizando el método "de ajuste óptimo" (ver, por ejemplo, Sims et al, J. Immunol. 151 :2296, 1993), las regiones de marco derivádas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (ver, por ejemplo, Cárter et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992, y Presta et al, J. Immunol. 151 :2623, 1993), regiones de marco maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones de marco de línea germinal humana (ver, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008) y regiones de marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR (ver, por ejemplo, Baca et al, J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997, y Rosok et al , J. Biol. Chem. 271 :22611-22618, 1996). 4. Anticuerpos humanos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas de la técnica. Los anticuerpos humanos se describen de manera general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74, 2001, y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008.
Pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la administración de un inmunógeno en un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al reto antigénico. Dichos animales típicamente contiene la totalidad o una parte de los loci de inmunoglobulina humanos, que sustituyen los loci de inmunoglobulina endógenos, o que se encuentran presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógenos han sido generalmente inactivados. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23: 11 17-1125, 2005. Ver también, por ejemplo, las patentes US n° 6.075.181 y n° 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente US n° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente US n° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE®; y la solicitud de patente US n° de publicación US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo mediante combinación con una región constante humana diferente.
También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en el hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Ver, por ejemplo, Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984, y Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987), y Boemer et al, J. Immunol. 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de células B humanas también han sido descritos por Li et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103:3557-3562, 2006. Entre los métodos adicionales se incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la patente US n° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268, 2006 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridomas humanos (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology 20(3):927-937, 2005, y en Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3): 185-91, 2005.
También pueden generarse anticuerpos humanos mediante al aislamiento de secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de entre bibliotecas de expresión fágica derivadas de seres humanos. Dichas secuencias de dominio variable seguidamente pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos derivados de una biblioteca Los anticuerpos de la invención pueden aislarse mediante cribado de bibliotecas combinatoriales para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conoce una diversidad de métodos en la técnica para generar bibliotecas de expresión fágica y para cribar dichas bibliotecas para anticuerpos que presenten las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan en, por ejemplo, Hoogenboom et al, en: Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al, editor; Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente en, por ejemplo, McCafferty et al, Nature 348: 624- 628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1992; Marks y Bradbury, en: Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, editor, Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472, 2004; y Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En determinados métodos de expresión fágica, se clonan separadamente repertorios de genes de VH y de VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas fágicas, que seguidamente pueden cribarse para fagos de unión a antígeno tal como se describe en Winter et al, Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente expresan fragmentos de anticuerpo, en forma de fragmentos monocatenarios de Fv (scFv) o en forma de fragmentos Fab. Las bibliotecas procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad contra el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, puede clonarse el repertorio no expuesto (por ejemplo procedente de un ser humano), proporcionando una única fuente de anticuerpos contra un amplio abanico de no autoantígenos y también autoantígenos sin ninguna inmunización, tal como describen Griffiths et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Finalmente, también pueden prepararse sintéticamente bibliotecas no expuestas mediante la clonación de segmentos de gen V no reorganizados a partir de células madre, y utilizando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para conseguir la reorganización in vitro, tal como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992). Entre las publicaciones de patente que describen bibliotecas fágicas de anticuerpos humanos se incluyen, por ejemplo: la patente US n° 5.750.373 y las publicaciones de patente US n° 2005/0079574, n° 2005/01 19455, n° 2005/0266000, n° 2007/0117126, n° 2007/0160598, n° 2007/0237764, n° 2007/0292936 y n° 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en la presente memoria. 6. Anticuerpos multiespecíficos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que presentan especificidades de unión para por lo menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es para TNC A2 y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de TNC A2. También pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos de células que expresan TNC A2. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse en forma de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. Entre las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la coexpresión recombinante de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que presentan diferentes especificidades (ver Milstein y Cuello, Nature 305:537, 1983; patente WO n° 93/08829, y Traunecker et al, EMBO J. 10:3655, 1991, y la manipualción "botón en ojal" (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también pueden prepararse mediante la manipulación de efectos de "steering" electrostático para preparar moléculas heterodiméricas de Fe d anticuerpo (patente WO n° 2009/089004A1), el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.676.980, y Brennan et al, Science 229:81, 1985), la utilización de cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny et al, J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992), la utilización de tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos biespecíficos de anticuerpo (ver, por ejemplo, Hollinger et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993) y la utilización de dímeros monocatenarios de Fv (scFv) (ver, por ejemplo, Gruber et al, J. Immünol. 152:5368, 1994) y la preparación de anticuerpos triespecíficos tal como se describe en, por ejemplo, Tutt et al. , J. Immunol. 147: Los anticuerpos manipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos Octopus" también se encuentran incluidos en la presente memoria (ver, por ejemplo, la patente US n° 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento en la presente memoria también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a TNC A2, así como otro antígeno diferente (ver la patente US n° 2008/0069820, por ejemplo). 7. Variantes de anticuerpo En determinadas realizaciones, se encuentran contempladas las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, puede resultar deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos codificnate del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Entre dichas modificaciones se incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para alcanzar el constructo final, con la condición de que el constructo final presente las características deseadas, por ejemplo de unión a antígeno. a) Variantes por sustitución, por inserción y por deleción En determinadas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que presentan una o más sustituciones de aminoácidos. Entre los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución se incluyen las HVRs y las FRs.
Las sustituciones de aminoácidos pueden resultar en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas similares, por ejemplo sustituciones conservadoras de aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoácidos basándose en similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina; y entre los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Se muestran sustituciones conservadoras en la Tabla 2, bajo el titulo "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 2, bajo el, título "sustituciones ejemplares", y tal como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y cribarse los productos para una actividad deseada, por ejemplo unión conservada/mejorada de antígeno, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejorada.
TABLA 2.
Los aminoácidos pueden clasificarse de acuerdo a propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, GIn; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen sobre la orientación de las cadenas: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras implican el intercambio de un miembro de una de dichas clases por uno de otra clase. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos también puede resultar en la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas diferentes, por ejemplo la sustitución de un aminoácido de un grupo (por ejemplo polar) por otro aminoácido de un grupo diferente (por ejemplo básico). La variación permitida puede determinarse experimentalmente realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes que resultan para su actividad.
Un tipo de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para su estudio adicional presentan modificaciones (por ejemplo mejoras) de determinadas propiedades biológicas (por ejemplo afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) respecto al anticuerpo parental y/o determinadas propiedades biológicas sustancialmente conservadas del anticuerpo parental. Una variante por sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, utilizando técnicas de maduración de afinidad basadas en la expresión fénica, tales como las descritas en la presente memoria. Brevemente, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se expresan en un fago y se criban para una actividad biológica particular (por ejemplo la afinidad de unión).
Pueden realizarse alteraciones (por ejemplo sustituciones) en las HVRs, por ejemplo para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008) y/o SDRs (CDRs-a), sometiendo a ensayo la VH o VL variante resultante para la afinidad de unión. La maduración de la afinidad mediante la construcción y la reselección a partir de bibliotecas secundarios ha sido descrita en, por ejemplo, Hoogenboom et ai, en: Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al, editor, Humana Press, Totowa, NJ, 2001). En algunas realizaciones de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para la maduración mediante cualquiera de entre una diversidad de métodos (por ejemplo PCR propensa a errores, reorganización de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una biblioteca secundaria. Seguidamente, la biblioteca se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de la HVR (por ejemplo 4 a 6 residuos cada vez). Los residuos de la HVR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo utilizando la mutagénesis por escaneo de alaninas o el modelado. En particular, con frecuencia son dianas CDR-H3 y CDR-L3.
En determinadas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVRs, con la condición de que estas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse en las HVRs alteraciones conservadoras (por ejemplo sustituciones conservadoras tales como las proporcionadas en la presente memoria) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden encontrarse fuera de los "puntos calientes" de las HVRs o SDRs. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y de VL proporcionadas anteriormente, cada HVR no ha sido alterada, o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser dianas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por escaneo de alaninas", tal como describen Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989. En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo residuos con carga tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o de carga negativa (por ejemplo alanina o polialanina) con el fin de determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno resulta afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las localizaciones de aminoácidos, demostrando la sensibilidad funcional frente a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contracto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y los residuos contiguos pueden ser dianas o ser eliminados como candidatos para la sustitución. Pueden cribarse variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Entre las inserciones en la secuencia de aminoácidos se incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxilo-terminales de longitud comprendida entre un residuo polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos individuales o de múltiples residuos aminoácidos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Entre otras variantes por inserción de la molécula de anticuerpo se incluyen la fusión del extremo N-terminal o C-terminal del anticuerpo con un enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media sérica del anticuerpo, b) Variantes por glucosilación En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En un aspecto, la presente invención proporciona glucoformas de anticuerpos anti-TNC A2 que presentan una función efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La manipulación mediante glucosilación de los anticuerpos ha sido descrita anteriormente. Ver, por ejemplo, la patente US n° 6.602.684, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad. Los métodos para producir anticuerpos anti-TNC A2 a partir de células huésped que presentan una actividad alterada de genes implicados en la glucosilación también se describen en la presente memoria en detalle (ver, por ejemplo, la sección titulada "Métodos y composiciones recombinantes", posteriormente).
Una molécula de IgG porta dos oligosacáridos N-ligados en su región Fe, uno en cada cadena pesada. Al igual que cualquier glucoproteína, un anticuerpo es producido en forma de población de glucoformas que comparten el mismo esqueleto polipeptídico pero que presentan diferentes oligosacáridos unidos a los sitios de glucosilación. Los oligosacáridos normalmente presentes en la región Fe de la IgG sérica son de tipo biantenario complejo (Wormald et al, Biochemistry 36:130-38, 1997, con un nivel bajo de ácido siálico terminal y N-acetilglucosamina biantenaria (GlcNAc), y un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación nuclear (füeosa unida a un residuo de GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria). Algunos estudios sugieren que la estructura de carbohidrato mínima necesaria para la unión de FcyR se encuentra dentro del núcleo oligosacárido. (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996).
Las líneas celulares derivadas de ratón o de hámster utilizadas en la industria y en la Universidad para la producción de anticuerpos normalmente unen los determinantes oligosacáridos necesarios a los sitios Fe. Las IgGs expresadas en dichas líneas celulares, sin embargo, no presentan el GlcNAc biantenario presente en cantidades reducidas en las IgGs séricas. Lifely et al, Glycobiology 318:813-22, 1995. En la ruta de glucosilación N-ligada, GnTIII añade un GlcNAc biantenario. Schachter, Biochem. Ce7 Biol. 64: 163-81 (1986).
Umafia et al. utilizaron una única línea celular CHO productora de anticuerpos que había sido previamente manipulada para expresar, de un modo externamente regulado, diferentes niveles de un gen clonado del enzima GnTIII (Umaña P. et al, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1 99)). Este enfoque estableció por primera vez una correlación rigurosa entre la expresión de una glucosiltransferasa (por ejemplo GenTIII) y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado. De esta manera, la invención contempla anticuerpos anti-TNC A2 que comprenden una región Fe o una región equivalente a una región Fe que presenta una glucosilación alterada resultante de la modificación del nivel de expresión de un gen de glucosiltransferasa en la célula huésped productora de anticuerpos. En una realización específica, la modificación del nivel de expresión génica es un incremento de la actividad de GnTIII. La actividad incrementada de GnTIII resulta en un incremento del porcentaje de oligosacáridos biantenarios, así como una reducción del porcentaje de oligosacáridos fucosilados en la región Fe del anticuerpo. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, presenta una afinidad incrementada de' unión al receptor de Fe y una función efectora incrementada.
Se proporcionan anticuerpos con oligosacáridos biantenarios, por ejemplo en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo resulta dividida en dos por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden presentar una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen en, por ejemplo, la patente WO n° 2003/011878 (Jean-Mairet et al), patente US n° 6.602.684 (Umaña et al.) y la patente US n° 2005/0123546 (Umaña ét al).
En una realización, los anticuerpos anti-TNC A2 de la invención presentan una proporción incrementada de oligosacáridos biantenarios en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos N-ligados biantenarios en la región Fe de los anticuerpos anti-TNC A2 de la invención es de entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente de por lo menos aproximadamente 50%, más específicamente, de por lo menos aproximadamente 60%, de por lo menos aproximadamente 70%, de por lo menos aproximadamente 80%, o de por lo menos entre aproximadamente 90% a 95% del total de oligosacáridos. Los oligosacáridos biantenarios pueden ser de tipo híbrido o complejo.
En otra realización, los anticuerpos anti-TNC A2 de la invención presentan una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 100%, específicamente de por lo menos aproximadamente 50%, de entre por lo menos aproximadamente 60% y aproximadamente 70%, y más específicamente de por lo menos aproximadamente 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo.
La cantidad de fucosa se determina mediante el cálculo de la cantidad media de fucosa dentro de la cadena sacárida en Asn297, respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y ricas en mañosa) según mediciones mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en, por ejemplo, la patente WO n° 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo asparagina situado en la posición aproximada 297 en la región Fe (numeración EU de los residuos de la reigón Fe); sin embargo, Asn297 también puede encontrarse situada aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o abajo de la posición 297, es decir entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de la secuencia en los anticuerpos. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa respecto a todas las glucoestructuras identificadas en una muestra tratada con N-glücosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y ricas en mañosa) según la EM MALDI-TOF. Dichas variantes fucosiladas pueden presentar una función ADCC incrementada.
La metodología de manipulación mediante glucosilación que puede utilizarse con los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención ha sido descrita en mayor detalle en la patente US n° 6.602.684, en la solicitud publicada de patente US n° 2004/0241817 Al, en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0175884 Al, en la solicitud provisional de patente US n° 60/441.307, y en la patente WO n° 2004/065540, el contenido completo de las cuales se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. Los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención alternativamente pueden manipularse mediante glucosilación para que presenten una cantidad reducida de residuos fucosa en la región Fe según las técnicas dadas a conocer en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0157108 (Genentech), o en el documento EP n° 1.176.195 Al, en las patentes WO n° 03/084570 y n° 03/0851 19 y en las solicitudes publicadas de patente US n° 2003/01 15614, n° 2004/093621, n° 2004/110282, n° 2004/110704 y n° 2004/132140, en Niwa et al, J. Immunol. Methods 306: 151/160, 2006, y en la patente US n° 6.946.292 (Kyowa). Los anticuerpos anti-TNC A2 manipulados mediante glucosilación de la invención también pueden producirse en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las que se enseñan en la solicitud publicada de patente US n° 60/344.169 y en la patente WO n° 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en las patentes WO n° 2004/057002 y n° 2004/024927 (Greenovation).
Entre los ejemplos adicionales de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "deficientes en fucosa" se incluyen: las patentes n° WO 2000/61739, n° WO 2001/29246, n° US 2002/0164328, n° US 2004/0109865, n° WO 2005/035586, n° WO 2005/035778, n° WO2005/053742 y n° WO2002/031140; Yamane-Ohnuki et al Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Entre los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfticosilados se incluyen las células CHO Lee 13 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545, 1986; solicitud de patente US n° 2003/0157108 Al, Presta L.; y patente n° WO2004/056312 Al, Adams et al, especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares con genes desactivados, tales como el gen de la alfa-l,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes desactivados (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004; Kanda Y et al, Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688, 2006, y la patente n° WO2003/085107).
En una realización particular, los anticuerpos anti-TNC A2 de la invención presentan una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados biantenarios en la región Fe. Los oligosacáridos no fucosilados biantenarios pueden ser híbridos o complejos. Específicamente, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir anticuerpos anti-TNC A2 en los que entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente por lo menos aproximadamente 15%, más específicamente entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 25%, y más específicamente entre por lo menos aproximadamente 30% y aproximadamente 35% de los oligosacáridos en la región Fe de la molécula de unión a antígeno son no fucosilados biantenarios. Los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención también pueden comprender una región Fe en la que entre por lo menos aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, específicamente por lo menos aproximadamente 15%, más específicamente entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 25%, y más específicamente entre por lo menos aproximadamente 30% y aproximadamente 35% de los oligosacáridos en la región Fe del anticuerpo son no fucosilados híbridos biantenarios.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria se altera para incrementar o reducir el grado en el que se encuentra glucosilado el anticuerpo. La adición o deleción de sitios de glucosilación de un anticuerpo puede conseguirse convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que se cree o se elimine uno o más sitios de glucosilación.
También se proporcionan variantes de anticuerpo con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpo pueden presentar una función de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen en, por ejemplo, las patentes WO n° 1997/30087 (Patel et al.), n° 1998/58964 (Raju S.) y n° 1999/22764 (Raju S.).
El incremento de la ADCC o de otras funciones efectoras de los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención también puede conseguirse mediante el incremento de la afinidad de la molécula de unión a antígeno para TNC A2, por ejemplo mediante maduración de la afinidad u otros métodos de mejora de la afinidad (ver Tang et al, J. Immunol. 179:2815-2823, 2007) o mediante modificaciones de los aminoácidos en la región Fe tal como se describe posteriormente. Las combinaciones de diferentes enfoques también se encuentra comprendidas dentro de la presente invención, c) Variantes de la región Fe En determinadas realizaciones, puede introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria, generando de esta manera una variante de región Fe. La región Fe variante puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones aminoácidas.
En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que presenta algunas, aunque no todas, las funciones efectoras, que lo convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo resulta importante pero determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y la ADCC) resultan innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in v/vopara confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o de ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión de receptor de Fe (FcR) para garantizar que el anticuerpo no presenta unión de FcyR (por lo tanto, probablemente no presenta actividad de ADCC), pero que conserva la capacidad dé unión a FcRn. Las células primarias para mediar en las ADCC, las células NK, únicamente expresan FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Se describen ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente US n° 5.500.362 (ver, por ejemplo, Hellstrom I. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986) y en Hellstrom I. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985, patente US n° 5.821.337 (ver Bruggemann M. et al, J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). Alternativamente, pueden utilizarse métodos no radioactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology Inc., Mountain View, CA) y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Entre las células efectoras que resultan útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de una molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1 98. También pueden llevarse a cbo ensayo de unión de Clq para confirmar que el anticuerpo no es capaz de unirse a Clq y por lo tanto no presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, los ELISAs de unión a Clq y a C3c en las patentes WO n° 2006/029879 y n° 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163, 1996; Cragg M.S. et al, Blood 101 :1045-1052, 2003; y Cragg M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743, 2004). También pueden llevarse a cabo determinaciones de la unión de FcRn y de la eliminación/vida media in v/voutilizando métodos conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Petkova S.B. et al, Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769, 2006).
Entre los anticuerpos con función efectora reducida se incluyen aquellos con sustitución de uno o más residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fe (patente US n° 6.737.056). Entre dichos mutantes de Fe se incluyen los mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado muíante "DANA" de Fe con sustitución de los residuos 265 y 297 por alaninas (patente US n° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcRs (ver, por ejemplo, las patentes US n° 6.737.056, WO n° 2004/056312, y Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En determinadas realizaciones, una variante anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de los residuos).
En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fe que resultan en alteraciones (es decir, mejora o reducción) de la unión a Clq y/o de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo tal como se describe en las patentes US n° 6.194.551 y WO n° 99/51642, y en Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Los anticuerpos con vidas medias incrementadas y unión mejorada al receptor de Fe neonatal (FcRn), el cual es responsable de la transferencia de las IgGs maternas al feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587, 1976, y Kim et al, J. Immunol. 24:249, 1994) se describe en la patente US n° 2005/0014934A1 (Hinton et al). Dichos anticuerpos comprende una región Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Entre dichas variantes de Fe se incluyen aquéllas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ó 434, por ejemplo la sustitución del residuo 434 de la región Fe (patente US n° 7.371.826).
Para ejemplos adicionales referentes a variantes de la región Fe, ver también las solicitudes de patente US n° 60/439.498, n° 60/456.041 ó la patente WO n° 2004/063351 (regiones Fe variantes con una afinidad de unión incrementada debida a modificaciones de aminoácidos) o la solicitud de patente US n° 10/672.280 o la patente WO n° 2004/099249 (variantes de Fe con unión alterada a FcyR debido a modificaciones de aminoácidos), Duncan y Winter, Nature 322:738-40, 1988; patentes US n° 5.648.260, US n° 5.624.821 y WO n° 94/29351. d) Variantes de anticuerpos con manipulación de las cisteínas En determinadas realizaciones, puede resultar deseable crear anticuerpos con manipulación de cisteínas (por ejemplo "tioMAbs"), en los que se han sustituido uno o más residuos del anticuerpo por residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se encuentran en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de aquellos residuos con cisteína, de esta manera se posicionan grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo con otros grupos, tales como grupos farmacológicos o grupos de conector-fármaco, con el fin de crear un conjugado de anticuerpo, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria. En determinadas realizaciones, puede sustituirse uno o más cualesquiera de los residuos siguientes por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera, Al 18 (numeración EU) de la cadena pesada y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos con manipulación de las cisteínas tal como se describe en, por ejemplo, la patente US n° 7.521.541. e) Derivados de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria puede modificarse adicionalmente para que contenga grupos no proteicos adicionales que son conocidos de la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Entre los grupos adecuados para la derivatización del anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, polímeros solubles en agua. Entre los ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli-l,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede presentar ventajas de fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede presentar cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unido al anticuerpo puede variar, y en el caso de que se encuentre unido más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o el tipo de polímeros utilizados para la derivatización pueden determinarse basándose en consideraciones entre las que se incluyen, aunque sin limitación, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que debe mejorarse, el uso opcional del derivado de anticuerpo en una terapia bajo condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un grupo no proteico que puede calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. En una realización, el grupo no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et ai, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, aunque sin limitación, longitudes de onda que no perjudican las células ordinarias, pero que calientan el grupo no proteico hasta una temperatura a la que mueren las las células próximas al grupo no proteico del anticuerpo.
B. Métodos y composiciones recombinantes Pueden producirse anticuerpos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo tal como se describe en la patente US n° 4.816.567. En una realización, se proporciona un polinucleótido aislado codificante de un anticuerpo anti-TNC A2 descrito en la presente memoria. Dichos polinucleótidos pueden codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de VL y/o de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo vectores de clonación o de expresión) que comprenden dicho polinucleótido. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho polinucleótido o dicho vector. En una de dichas realizaciones, una célula huésped comprende (por ejemplo ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo un vector policistrónico), o (2) un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es una célula eucariótica, particularmente una célula de mamífero, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula renal de hámster neonato (BHK) o una célula linfoide (por ejemplo células YO, NSO ó Sp20). En una realización, se proporciona un método de preparación de un anticuerpo anti-TNC A2, en el que el método proporciona cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido codificante del anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o del medio de cultivo de la célula huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-TNC A2, se aisla uno o más polinucleótidos codificantes de un anticuerpo, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente, y se insertan en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por el experto en la materia para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo anti-TNC A2 conjuntamente con señales apropiadas de control transcripcional/traduccional. Entre dichos métodos se incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y la recombinación in vivo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) y en Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989.
En una realización, puede expresarse uno o varios polinucleótidos codificantes de un anticuerpo anti-TNC A2 bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulada. Entre los sistemas de expresión regulada adecuados se incluyen, aunque sin limitación, un sistema de expresión regulado por tetraciclina, un sistema de expresión inducible por ecdisona, un sistema de expresión de interruptor lac, un sistema de expresión inducible por glucocorticoides, un sistema promotor inducible térmicamente y un sistema de expresión inducible por metal de metalotioneína. En el caso de que se encuentren comprendidos varios polinucleótidos diferentes codificantes de un anticuerpo de la presente invención dentro del sistema de la célula huésped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se exprsan bajo el control de un promotor regulado.
Entre las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión de vectores codificantes de anticuerpos se incluyen las células procarióticas o eucarióticas indicadas en la presente memoria. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular en el caso de que no resulte necesaria la glucosilación ni la función efectora de Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.648.237, n° 5.789.199 y n° 5.840.523 (ver también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, editor, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245 a 254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. colí). Tras la expresión, el anticuerpo puede aislarse a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, algunos microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores codificantes de anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y de levaduras cuyas rutas de glucosilación hayan sido "humanizadas", resultando en la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, y Li et al, Nat. Biotech. 24:210-215, 2006. Dichos sistema de expresión también se enseñan en la solicitud de patente US n° 60/344.169 y en la patente WO n° 03/056914 (métodos para producir glucoproteína similar a la humana en una célula huésped eucariótica no humana).
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados también se derivan a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculpvíricas que pueden utilizarse conjuntamente con células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.959.177, n° 6.040.498, n° 6.420.548, n° 7.125.978 y n° 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para la producción de anticuerpos en plantas transgénicas).
También pueden utilizarse células de vetebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden resultar útiles líneas celulares de mamífero adaptadas para el crecimiento en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero que resultan útiles son la línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea renal embrionaria humana (células 293 ó células 293T tal como se describe en, por ejemplo, Graham et al, J. Gen. Virol. 36:59, 1977), células renales de hámster neonato (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe en, por ejemplo, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), células renales de mono (CVl), células renales de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células renales caninas (MDCK, células hepáticas de rata búfalo (BRL 3 A), células pulmonares humanas (W138), células hepáticas humanas (Hep G2), tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI, tales como las descritas en, por ejemplo, Mather et al, Armáis N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982, células MRC 5 y células FS4. Entre otras líneas celulares huésped de mamífero que resultan útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO DHFR* (Urlaub et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980) y las líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, editor, Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003).
La expresión estable resulta generalmente preferente a la expresión transitoria debido a que típicamente consigue resultados más reproducibles y que también permiten más fácilmente la producción a gran escala; sin embargo, se encuentra comprendido dentro de los conocimientos del experto en la materia la determinación de si la expresión transitoria resulta mejor para una situación particular.
La presente invención se refiere además a un método para modificar el perfil de glucosilación de los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención que son producidos por una célula huésped, que comprende expresar en dicha célula huésped uno o más polinucleótidos codificantes de un anticuerpo anti-TNC A2 y uno o más polinucleótidos codificantes de un polipéptido con una actividad de glucosiltransferasa, o un vector que comprende dichos polinucleótidos. Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de línea celular en cultivo, incluyendo las líneas celulares comentadas anteriormente, para generar líneas celulares para la producción de anticuerpos anti-TNC A2 con un patrón de glucosilación alterado. Entre las líneas celulares preferentes se incluyen las células CHO, las células BHK, las células NSO, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 o las células de hibridoma, y otras células de mamífero. Entre los polipéptidos con actividad glucosiltransferasa se incluyen la P(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), la o manosidasa II (Manll), la P(l,4)-galactosiltransferasa (GalT), la ß(1,2)-?-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI) y la (l,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII). En una realización, se expresa en la célula huésped una combinación de polinucleótidos codificantes de polipéptidos con actividad glucosiltransferasa (por ejemplo GnTIII y Manll). De manera similar, un método también comprende la expresión de uno o más polinucleótidos codificantes del anticuerpo anti-TNC A2 en una célula huésped en la que un gen de glucosiltransferasa ha sido interrumpido o de otro modo desactivado (por ejemplo una célula huésped en la que la actividad del gen codificante de la al, 6-fiicosiltransferasa nuclear ha sido desactivado). En una realización particular, los anticuerpos anti-TNC A2 de la presente invención pueden producirse en una célula huésped que expresa además un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII para modificar el patrón de glucosilación de dichos anticuerpos. En una realización específica, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en Golgi. En otra realización particular, la expresión del anticuerpo anti-TNC A2 de la presente invención en una célula huésped que expresa un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII resulta en anticuerpos anti-TNC A2 con afinidad de unión incrementada a receptor de Fe y/o una función efect ora incrementada. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una realización, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende: (a) uno o más polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII, y (b) uno o más polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo anti-TNC A2 de la presente invención. En una realización particular, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi. En particular, dicho dominio de localización en Golgi es el dominio de localización en Golgi de la manosidasa II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y para utilizarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se dan a conocer en la solicitud provisional de patente WO n° 2004/065540, la solicitud de patente provisional US n° 60/495.142 y la solicitud publicada de patente US n° 2004/0241817, el contenido completo de cada una de las cuales se incorpora expresamente como referencia en la presente memoria. En otra realización, la célula huésped comprende además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificante de un polipéptido que presenta actividad de manosidasa II (Manll). El polinucleótido o polinucleótidos codificante del polipéptido o polipéptidos, al igual que el polinucleótido o polinucleótidos codificantes del anticuerpo anti-TNC A2, pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulada. Dichos sistemas son bien conocidos de la técnica, e incluyen los sistemas comentados anteriormente.
Las células huésped que contienen la secuencia codificante del anticuerpo anti-TNC A2 y/o la secuencia codificante de polipéptidos que presentan, actividad glucosiltransferasa y que expresan los productos génicos biológicamente activos pueden identificarse, por ejemplo, mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", la evaluación del nivel de transcripción medido a partir de la expresión de los transcritos de ARNm respectivos en la célula huésped, o la detección del producto génico medida mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biológica, métodos que son bien conocidos de la técnica. La actividad de GnTIII o de Manll puede · detectarse, por ejemplo, mediante la utilización de lectina que se une a productos de biosíntesis de GnTIII o Manll, respectivamente. Un ejemplo de dicha lectina es la lectina E4-PHA, que se une preferentemente a los oligosacáridos que contienen GlcNAc divisor. Los productos de biosíntesis (es decir, estructuras oligosacáridas específicas) de polipéptidos que presentan actividad de GnTIII o de Manll también pueden detectarse mediante análisis de espectrometría de masas de oligosacáridos liberados de glucoproteínas producidas por células que expresan dichos polipéptidos. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la unión incrementada de receptor de Fe o una función efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos por las células manipuladas con el polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII.
La presente invención también se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-TNC A2 que presenta oligosacáridos modificados, que comprende: (a) cultivar una célula huésped manipulada para expresar por lo menos un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa bajo condiciones que permiten la producción de un anticuerpo anti-TNC A2 según la presente invención, en el que dicho polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de dicho anticuerpo anti-TNC A2 producido por dicha célula huésped, y (b) aislar dicho anticuerpo anti-TNC A2. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa es GnTIII. En otra realización, existen dos polipéptidos que presentan actividad de glucosiltransferasa. En una realización particular, los dos péptidos que presentan actividad de glucosiltransferasa son GnTIII y Manll. En otra realización, el polipéptido que presenta actividad de glucosiltransferasa es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII. En una realización más específica, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en el Golgi. En particular, el dominio de localización en Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o de GnTI, más particularmente el dominio de localización de la manosidasa II.
Altemativamente, el dominio de localización en el Golgi se selecciona de entre el grupo que consiste de: el dominio de localización de la manosidasa I, el dominio de localización de GnTÜ y el dominio de localización de la a?,?-fucosiltransferasa nuclear.
En una realización particular, el anticuerpo anti-TNC A2 modificado producido por la célula huésped o el método descrito anteriormente presenta una región constante de IgG o un fragmento de la misma que comprende la región Fe. En otra realización particular, el anticuerpo anti-TNC A2 es un anticuerpo humanizado o humano o un fragmento del mismo que comprende una región Fe.
El anticuerpo anti-TNC A2 con glucosilación alterada producido por la célula huésped o el método descrito anteriormente típicamente muestran una afinidad de unión incrementada al receptor de Fe y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación de la célula huésped (por ejemplo mediante expresión de un gen de glucosiltransferasa). Preferentemente, la afinidad de unión incrementada a receptor de Fe es la unión incrementada a un receptor de Fe activador, más preferentemente el receptor FcYRIIIa. La función efectora incrementada preferentemente es un incremento de uno o más de los siguientes: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción de citoquinas incrementada, incorporación incrementada de antígenos por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada, unión a células NK incrementada, unión a macrófagos incrementada, unión a células polimorfonucleares (PMNCs) incrementada, unión a monocitos incrementada, entrecruzamiento de anticuerpos unidos a diana incrementado, señalización directa inductora de apoptosis incrementada, maduración de células dendríticas incrementada o cebado de células T incrementado.
C. Ensayos Los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria pueden identificarse, cribarse o caracterizarse para sus propiedades fisicoquímicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos de la técnica. 1. Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, se somete a ensayo un anticuerpo de la invención para su actividad de unión a antígeno, por ejemplo mediante métodos conocidos tales como ELISA, transferencia western, etc.
En otro, aspecto, pueden utilizarse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compita con otro anticuerpo anti-TNC A2 específico para la unión a TNC A2. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo un epítopo lineal o conformacional) que se encuentra unido a dicho otro anticuerpo anti-TNC A2 específico. Se proporcionan métodos ejemplares detallados para la localización de un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris, "Epitope Mapping Protocols", en: Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), 1996. En un ensayo de competición ejemplar, se incuba TNC A2 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a TNC A2 (por ejemplo el anticuerpo 2B10 indicado en los Ejemplos) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a ensayo para su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión a TNC A2. El segundo anticuerpo puede encontrarse presente en un sobrenadante de hibridoma. A modo de control, se incuba una TNC A2 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras la incubación bajo condiciones permisivas de la unión del primer anticuerpo a TNC A2, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de mareaje asociado a TNC A2 inmovilizada. En el caso de que la cantidad de mareaje asociado a TNC A2 inmovilizada se encuentre sustancialmente reducida en la muestra de ensayo respecto a la muestra de control, se indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para la unión a TNC A2. Ver Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1988. 2. Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-TNC A2 que presentan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la lisis de células diana, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la inducción de apoptosis. También se proporcionan anticuerpos que presentan dicha actividad biológica in v/voy/o in vitro. En determinadas realizaciones, se somete a ensayo un anticuerpo de la invención para dicha actividad biológica. Se han descrito anteriormente en la presente memoria ensayos ejemplares para el ensayo de ADCC (ver en la sección "Definiciones": "anticuerpo que presenta una ADCC incrementada") y en el Ejemplo 11. Los ensayos para detectar la lisis celular (por ejemplo mediante la medición de la liberación de la LDH) o la apoptosis (por ejemplo utilizando el ensayo TUNEL) son bien conocidos de la técnica. Los ensayos para medir la ADCC o la CDC también se han descrito en la patente WO n° 2004/065540 (ver el Ejemplo 1 en la misma), el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria.
D. Conjugados de anticuerpos La invención también proporciona conjugados que comprenden un anticuerpo anti-TNC A2 en la presente memoria conjugados con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo proteínas toxinas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.
En una realización, en un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), se conjuga un anticuerpo con uno o más fármacos, incluyendo, aunque sin limitación, un maitansinoide (ver las patentes US n° 5.208.020, n° 5.416.064 y la patente europea EP n° 0 425 235 Bl), una auristatina tal como las fracciones DE y DF del fármaco monometil-lauristatina (MMAE y MMAF) (ver las patentes US n° 5.635.483 y n° 5.780.588 y n° 7.498.298), una dolastatina, una caliqueamicina o derivado de la misma (ver patentes US n° 5.712.374, n° 5.714.586, n° 5.739.116, n° 5.767.285, n° 5.770.701, n° 5.770.710, n° 5.773.001 y n° 5.877.296; Hinman et al, Cáncer Res. 53:3336-3342, 1993, y Lode et al, Cáncer Res. 58:2925-2928, 1998; una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (ver Kratz et al, Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey et al, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al, Bioconj. Chem. 16:717-721, 2005; Nagy et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King et al, J. Med. Chem. 45:4336-4343, 2002; y la patente US n° 6.630.579); metotrexato, vindesina, un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno, y CC1065.
En otra realización, un conjugado de anticuerpo comprende un anticuerpo tal como se indica en la presente memoria conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, aunque sin limitación, cadena A diftérica, fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, cadena A de exo toxina (de Pseudomonas aeruginosá), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra realización, un conjugado de anticuerpo comprende un anticuerpo tal como se ha indicado en la presente memoria conjugado con un átomo radioactivo para formar un conjugado radioactivo. Se encuentra disponible una diversidad de isótopos radioactivos para la producción de conjugados radioactivos. Entre los ejemplos se incluyen At , I , I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 y los isótopos radioactivos de Lu. En el caso de que el conjugado radioactivo se utilice para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o un mareaje de espín para la obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, RMI), tal como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio- 111, flúor- 19, carbono- 13, nitrógeno- 15, oxígeno- 17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico se preparan utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclohexán-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HC1 de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-flúor activo (tales como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al. , Science 238:1098, 1987. El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilén-triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Ver la patente WO n° 94/1 1026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un conector lábil a los ácidos, un conector sensible a la peptidasa, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contenga disulfuros (Chari et ai, Cáncer Res. 52: 127-131, 1992; patente US n° 5.208.020).
Los conjugados de anticuerpo en la presente memoria contemplan expresamente, aunque sin limitación, los conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato), que se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo de Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA).
E. Métodos y composiciones para el diagnóstico y la detección En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria resulta útil para detectar la presencia de TNC A2 en una muestra biológica. El término "detección" tal como se utiliza en la presente memoria comprende la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como células o tejidos de cerebro, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, músculo esquelético, piel, intestino delgado, estómago o útero, incluyendo también tumores de células o tejidos de estos órganos.
En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método de detección de la presencia de TNC A2 en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica, opcionalmente con una muestra de control, con un anticuerpo anti-TNC A2 tal como se indica en la presente memoria, bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-TNC A2 a TNC A2, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-TNC A2 y TNC A2. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-TNC A2 para la selección de los sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-TNC A2, por ejemplo en el que TNC A2 es un marcador biológico para la selección de los pacientes.
Entre los trastornos ejemplares que pueden diagnosticarse utilizando un anticuerpo de la invención se incluyen los trastornos asociados a la expresión de TNC A2, tales como cáncer y algunas condiciones inflamatorias.
En un aspecto, se proporciona un método de diagnóstico de enfermedades en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración en dicho sujeto de una cantidad efectiva de un agente diagnóstico, en el que dicho agente diagnóstico comprende un anticuerpo anti-TNC A2 tal como se indica en la presente memoria, y un mareaje, típicamente un agente de formación de imágenes, que permite la detección de un complejo con dicho agente diagnóstico y TNC A2.
En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-TNC A2 marcados. Entre los mareajes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, mareajes o grupos que se detectan directamente (tales como mareajes fluorescentes, cromofóricos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como grupos tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo mediante una reacción enzimática o una interacción molecular. Entre los mareajes ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los isótopos radioactivos 32P, 14C, 1251, 3H y 131I, fluoróforos tales como los quelatos de tierra rara o fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente US n° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, peróxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido, por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con un enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de pigmento tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, mareajes de espín, mareajes de bacteriófago, radicales libres estables, y similares.
F. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-TNC A2 tal como se describe en la presente memoria se preparan mediante la mezcla de dicho anticuerpo que presenta el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980) en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metiomna; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes tales como metilparabén o propilparabén, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Entre los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en la presente memoria se incluyen los agentes de dispersión intersticial de fármaco tales como las glucoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP), por ejemplo las glucoproteínas hialuronidasa PH-20 solubles humanas tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados sHASEGPs ejemplares y métodos de utilización, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente US n° 2005/0260186 y n° 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofílizadas ejemplares en la patente US n° 6.267.958. Entre las formulaciones acuosas de anticuerpos se incluyen las indicadas en la patente US n° 6.171.586 y en la patente WO n° 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.
La formulación en la presente memoria también puede contener más de un ingrediente activo según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no presenten efectos mutuos adversos. Por ejemplo, en el caso de que la enfermedad que debe tratarse sea cáncer, puede resultar deseable proporcionar además uno o más agentes anticáncer, por ejemplo un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la proliferación de células tumorales, o un activador de la apoptosis de las células tumorales. Dichas ingredientes activos convenientemente se encuentran presentes en combinación en cantidades que resultan eficaces para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también pueden encapsularse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración coloidales de administración farmacológica (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, encontrándose dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas.
Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo generalmente son estériles. La esterilidad puede conseguirse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril.
Las moléculas indicadas en la presente memoria pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo, aunque sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica, pero típicamente serán soluciones inyectables o infusionables.
G. Métodos y composiciones terapéuticos Puede utilizarse en los métodos terapéuticos cualquiera de los anticuerpos anti-TNC A2 o formulaciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria.
Los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria pueden utilizarse para tratar enfermedades caracterizadas por la expresión de TNC A2, particularmente por la expresión anormal (por ejemplo la sobreexpresión, o la expresión en un patrón diferente en la célula) de TNC A2 en comparación con el tejido normal del mismo tipo celular. TNC A2 se expresa anormalmente (por ejemplo se sobreexpresa) en muchos tumores humanos en comparación con la expresión en tejido no tumoral del mismo tipo celular. De esta manera, los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria resultan particularmente útiles en la prevención de la formación de tumores, en la erradicación de tumores y en la inhibición del crecimiento o metástasis tumorales. Los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria pueden utilizarse para tratar cualquier tumor que exprese TNC A2. Entre las malignidades particulares que pueden tratarse con los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria se incluyen, por ejemplo, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer mamario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cáncer del músculo esquelético.
Los anticuerpos anti-TNC A2 dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para inhibir el crecimiento tumoral o para eliminar células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-TNC A2 pueden unirse a TNC A2 que se encuentre sobre la membrana o la superficie celular de las células cancerosas (células tumorales o células del estroma tumoral) e inducir, por ejemplo, ADCC u otra eliminación de las células cancerosas mediada por efectores.
Los anticuerpos anti-TNC A2 alternativamente pueden utilizarse para bloquear la función de TNC A2, particularmente mediante la interferencia física con su unión a otro compuesto. Por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno pueden utilizarse para bloquear la adhesión, extensión o migración celulares mediadas por TNC A2.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización a modo de medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2. En determinadas realizaciones se proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que presenta una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2, que comprende administrar en el individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-TNC A2. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se indica posteriormente. En realizaciones adicionales, la invención proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en la inducción de la lisis de una célula. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-TNC A2 para la utilización en un método de inducción de la lisis de una célula en un individuo, que comprende administrar en el individuo una cantidad efectiva del anticuerpo anti-TNC A2 para inducir la lisis de una célula. Un "individuo" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es un ser humano. Una "enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es cáncer, más preferentemente un cáncer seleccionado de entre el grupo de cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer mamario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cáncer del músculo esquelético. Una "célula" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es una célula presente en un tumor, tal como una célula tumoral o una célula del estroma tumoral, más preferentemente una célula tumoral. La "expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es la expresión anormal, tal como la sobreexpresión o la expresión en un patión diferente en la célula, en comparación con la expresión en el tejido normal del mismo tipo celular.
En un aspecto adicional, la invención proporciona la utilización de un anticuerpo anti-TNC A2 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento está destinado al tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2, que comprende la administración en un individuo que presenta una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2 de una cantidad efectiva del medicamento. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se indica posteriormente. En una realización ádicional, el medicamento está destinado a la inducción de la lisis de una célula. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método para inducir la lisis de una célula en un individuo, que comprende la administración en el individuo de una cantidad efectiva del medicamento para inducir la lisis de una célula. Un "individuo" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es un ser . humano. Una "enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es cáncer, más preferentemente un cáncer seleccionado de entre el grupo de cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer mamario, cáncer de piel, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cáncer del músculo esquelético. Una "célula" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es una célula presente en un tumor, tal como una célula tumoral o una célula del estroma tumoral, más preferentemente una célula tumoral. La "expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es la expresión anormal, tal como la sobreexpresión o la expresión en un patrón diferente en la célula, en comparación con la expresión en el tejido normal del mismo tipo celular.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2. En una realización, el método comprende la administración en un individuo que presenta dicha enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2, de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TNC A2. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, tal como se indica posteriormente. En una realización adicional, la invención proporciona un método para inducir la lisis de una célula en un individuo. En una realización, el método comprende la administración en el individuo de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TNC A2 para inducir la lisis de una célula. Un "individuo" según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadás puede ser un ser humano. Una "enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es cáncer, más preferentemente un cáncer seleccionado de entre el grupo de cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer mamario, cáncer de piel, cáncer hepático, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer pancreático, cáncer cerebral y cáncer del músculo esquelético. Una "célula" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es una célula presente en un tumor, tal como una célula tumoral o una célula del estroma tumoral, más preferentemente una célula tumoral. La "expresión de TNC A2" según cualquiera de las realizaciones anteriores preferentemente es la expresión anormal, tal como la sobreexpresión o la expresión en un patrón diferente en la célula, en comparación con la expresión en el tejido normal del mismo tipo celular.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria, por ejemplo para la utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriormente indicados. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-TNC A2 proporcionados en la presente memoria y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se indica posteriormente.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, puede coadministrarse un anticuerpo de la invención con por lo menos un agente terapéutico adicional. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente anticáncer. Son agentes anticáncer adecuados, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la proliferación de células tumorales, o un activador de la apoptosis de las células tumorales.
Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente comprenden la administración combinada (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicionales. Los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse en combinación cón terapia de radiación.
Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. La administración parental incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intravenosa típicamente resulta preferente. Sin embargo, se contempla que la vía intraperitoneal resulte particularmente útil, por ejemplo en el tratamiento de los tumores colorrectales. La dosificación puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como las inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En la presente memoria se encuentran contemplados diversos programas de dosificación, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la administración individual o múltiple en diversos puntos temporales, la administración de bolo y la infusión de pulsos. Los anticuerpos de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de un modo consistente con las buenas prácticas médicas. Entre los factores para la consideración en el presente contexto se incluyen el trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. No resulta necesario, aunque es opcional, formular el anticuerpo con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad ' efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores comentados anteriormente. Estos se utilizan generalmente a las mismas dosis y por vías de administración indicadas en la presente memoria, o entre aproximadamente 1% y 99% de las dosis indicadas en la presente memoria, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que resulta apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (utilizado solo o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, del tipo de anticuerpo, de -l i lla severidad y curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y según el criterio del médico responsable. El anticuerpo convenientemente se administra en el paciente de una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para la administración en el paciente, en una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 µg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores indicados anteriormente. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se prolonga hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo se encontraría comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) en el paciente. Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera que el paciente reciba aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). También puede administrarse una dosis inicial de carga más elevada, seguido de una o más dosis más bajas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden resultar útiles. Se realiza fácilmente un seguimiento del progreso de dicha terapia mediante técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que puede llevarse a cabo cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriormente indicados utilizando un conjugado de anticuerpo de la invención en sustitución o adicionalmente a un anticuerpo anti-TNC A2.
H. Artículos fabricados En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el paquete sobre el recipiente o asociado al mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución I.V., etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación con otra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición, y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presente un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. Además, el artículo fabricado puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico adicional u otro agente de otro modo terapéutico. El artículo fabricado en la presente realización de la invención puede comprender además un prospecto en el paquete que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo fabricado puede p comprender adicionalmente un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y para el usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se entiende que cualquiera de los artículos fabricados anteriormente indicados puede incluir un conjugado de anticuerpo de la' invención en sustitución o adicionalmente a un anticuerpo anti-TNC A2.
III. EJEMPLOS A continuación se proporcionan ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1 Técnicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación de doble cadena. En algunos casos se prepararon los segmentos génicos deseados fueron preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. Los segmentos génico flanqueados por sitios únicos de corte por endonucleasa de restricción se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR). El plásmido.de ADN se purificó a partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en . los vectores de expresión respectivos.
Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina humana en: Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., NIH Publication n° 91-3242, 1991. Para la expresión, todos los constructos contenían una secuencia de ADN en el extremo 5' codificante de un péptido líder con diana en proteínas de secreción en células eucarióticas. Los péptidos líder ejemplares y secuencias polinucleótidas codificantes de los mismos se proporcionan en SEC ID n0 107 a 1 15.
Preparación de anticuerpos (manipulados mediante glucosilación) Las secuencias de ADN de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo completo se obtuvieron mediante subclonación de las regiones variables en el mismo marco que la cadena pesada constante o que la cadena ligera constante preinsertadas en el vector de expresión de mamífero receptor respectivo. La expresión del anticuerpo estaba controlada por un promotor de MPSV y el vector portaba una secuencia de señal poliA sintética en el extremo 3' del CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP del EBV.
Los anticuerpos se producen mediante cotransfección de células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de anticuerpos de mamífero utilizando una transfección con fosfato cálcico. Se transfectan células HEK293-EBNA en crecimiento exponencial mediante el método del fosfato cálcico. Alternativamente, se transfectan con polietilenimina células HEK293 en cultivo en suspensión. Para la producción de anticuerpos no manipulados mediante glucosilación no modificados, las células se transfectan únicamente con vectores de expresión de cadenas pesada y ligera de anticuerpo en una proporción 1 :1.
Para la producción del anticuerpo manipulado mediante glucosilación, las células se cotransfectan con dos plásmidos adicionales, uno para la expresión con polipéptido GnTIII de fusión (un vector de expresión de GnTIII) y uno para la expresión de manosidasa ? (un vector de expresión de manosidasa II de Golgi) en una proporción de 4:4: 1 :1, respectivamente. Las células se cultivan en cultivos monocapa adherentes en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectan al alcanzar una confluencia de entre 50% y 80%. Para la transfección de un matraz TI 50, se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% v/v final) y las células se introducen en un incubador a 37°C con una atmósfera con 5% de C02 durante la noche. Para la transfección de cada matraz TI 50, se prepara una solució nde ADN, CaCl2 y agua mediante la mezcla de 94 µg de ADN total de vector plásmido dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y cadena pesada, agua hasta un volumen final de 469 µ? y 469 µ? de una solución 1 M de CaCl2. A dicha solución, se añadieron 938 µ? de una solución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1,5 mM a pH 7,05, se mezcló inmediatamente durante 10 segundos y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 segundos. La suspensión se 'diluyó con 10 mi de DMEM suplementado con FCS al 2% y se añadió al matraz TI 50 en lugar del medio existente. A continuación, se añadieron 13 ml adicionales de medio de transfección. Las células se incubaron a 37°C, con 5% de C02, durante aproximadamente 17 a 20 horas, y después se sustituyó el medio por 25 ml de DMEM, FCS al 10%. El medio de cultivo condicionado se recolectó aproximadamente 7 días después del intercambio de medios mediante centrifugación durante 15 minutos a 210xg, se esterilizó la solución mediante filtración (filtro de 0,22 µ??) y se añadió azida sódica a una concentración final de 0,01 % p/v, y se mantuvo a 4°C .
Los anticuerpos afucosilados de tipo salvaje o manipulados mediante glucosilación que se habían secretado se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad utilizando cromatografía de afinidad de proteína A (HiTrap ProtA, GE Healthcare). Brevemente, se equilibró la columna con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante celular, seguido de un primer lavado con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, y un segundo lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Los anticuerpos se eluyeron con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, glicina 100 mM, pH 3. En una etapa cromatográfica posterior de exclusión por tamaño en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), se intercambió el tampón con fosfato potásico 25 mM, cloruro sódico 125 mM, solución de glicina 100 mM de pH 6,7 ó, alternativamente, cloruro sódico 140 mM, histidina 20 mM, pH 6,0, y se recogieron los anticuerpos IgGl monoméricos puros. En caso necesario, se incluye una etapa adicional de cromatografía de intercambio catiónico entre las dos etapas de purificación estándar.
La concentración de proteínas de las muestras de proteínas purificadas se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de aminoácidos. Se analizó mediante SDS-PAGE la pureza y el peso molecular de los anticuerpos en presencia y en ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y la tinción con Coomassie (tinción SimpleBlue™ SafeStain, de Invitrogen). Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGE® (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina al 4-20% o Bis-Tris al 3-12%). El contenido agregado de muestras de anticuerpo se analizó utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Suecia) en tampón de corrido MOPS 2 mM, NaCl 150 mM, NaN3 al 0,02%, pH 7,3, a 25°C. Se verificó la integridad del esqueleto de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo reducidas mediante espectrometría de masas Q-TOF de nanoelectropulverización tras la eliminación de los N-glicanos mediante tratamiento enzimático con péptido-N-glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals). Los resultados de la purificación y análisis de los anticuerpos IgG humanos 2B10 de tipo salvaje y manipulados mediante glucosilación se muestran en las figuras 6 y 7.
Los oligosacáridos unidos a la región Fe de los anticuerpos se analizaron mediante MS MALDI TOF tal como se indica posteriormente. Los oligosacáridos se liberaron enzimáticamente de los anticuerpos mediante digestión con PNGasaF. La solución digerida resultante que contenía los oligosacáridos liberados se preparó directamente para el análisis de MS MALDI TOF o se digirió adicionalmente con glucosidasa EndoH previamente a la preparación de las muestras para el análisis de MS MALDI TOF.
Análisis de la glucoestructura de los anticuerpos (manipulados mediante glucosilación) Para la determinación de las proporciones relativas de estructuras oligosacáridas que contienen fucosa y que no contienen fucosa (a-fucosa), se analizaron los glicanos liberados del material de anticuerpos purificados mediante espectrometría de masas MALTI-TOF. La muestra de anticuerpos (aproximadamente 50 µg) se incubó durante la noche a 37°C con N-glucosidasa F 5 mU (QAbio, PNGasaF: E-PNGOl) en Tris 2 mM, pH 7,0, con el fin de liberar el oligosacárido del esqueleto proteico. Para la desanimación de los glicanos se añadió ácido acético hasta una concentración final de 150 mM y se incubó durante 1 hora a 37°C. Para el análisis mediante espectrometría de masas MALDI TOF, se mezclaron 2 µ? de la muestra en la diana MALDI con 2 µ? de solución de matriz DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico [Bruker Daltonics n° 201346] disuelto en etanol al 50%/NaCl 5 mM a una concentración de 4 mg/ml) y se analizaron . con un instrumento Autoflex II de espectrometría de masas MALDI TOF [Bruker Daltonics]. Rutinariamente se registraron 50 a 300 instantáneas y se agruparon en un único experimento. Los espectros obtenidos se evaluaron con el programa informático de análisis flex (Bruker Daltonics) y se determinaron las masas para cada uno de los picos detectados. A continuación, se asignaron los picos a estructuras de carbohidrato con fucosa o a-fucosa (sin fucosa) mediante la comparación de las masas calculadas y las masas esperadas teóricamente para las estructuras respectivas (por ejemplo compleja, híbrida y de bajo o alto contenido de mañosa, respectivamente, con o sin fucosa).
Para la determinación de la proporción de estructuras híbridas, las muestras de anticuerpo se digirieron con N-glucosidasa F y endo-glucosidasa H [QAbio, EndoH: E-EH02] concomitantemente. La N-glucosidasa F libera todas las estructuras de glicano N-ligadas (estructuras complejas, híbridas y de bajo y alto contenido de en mañosa) del esqueleto proteico y la endoglucosidasa H corta todos los glicanos de tipo híbrido adicionalmente entre los dos residuos N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el extremo reductor del glicano. Este digerido se trató posteriormente y se analizó mediante espectrometría de masas MALDI TOF del mismo modo tal como se ha indicado anteriormente para la muestra digerida con N-glucosidasa F. Mediante la comparación del patrón del digerido con N-glucosidasa F y el digerido combinado de N-glucosidasa F/EndoH, se utilizó el grado de reducción de las señales de una estructura de carbohidrato específica para estimar el contenido relativo de estructuras híbridas. Se calculó la cantidad relativa de cada estructura de carbohidrato a partir de la proporción entre la altura del pico de una estructura individual y la suma de las alturas de los picos de todos los oligosacáridos detectados. La cantidad de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a la totalidad de las estructuras de carbohidrato identificadas en la muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y estructuras de bajo y alto contenido en mañosa, respectivamente). La cantidad de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación a la totalidad de las estructuras de carbohidrato identificadas en la muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y estructuras de bajo y alto contenido en mañosa, respectivamente).
El grado de no fucosilación determinado mediante MS MALDI-TOF para los anticuerpos IgG humanos 2B10 era de 8,1% para la versión de tipo salvaje y de 83% para la versión manipulada mediante glucosilación.
Ejemplo 2 Construcción de bibliotecas de Fab genérico Se construyeron bibliotecas de anticuerpos genéricos en el formato Fab basándose en genes de línea germinal humana con los apareamientos de dominio V siguientes: cadena ligera kappa de Vk3_20 con cadena pesada de VH3_23 para la biblioteca DP47-3 y cadena ligera kappa de Vkl_17 con cadena pesada de VH1_69 para la biblioteca DP88-3. Ver las secuencias SEC ID n° 1 y 2.
Se aleatorizaron ambas bibliotecas en CDR3 de la cadena ligera (L3) y CDR3 de la cadena pesada (H3) y se ensamblaron a partir de 3 fragmentos por biblioteca mediante procesamiento por PCR de extensión solapante (SOE). El fragmento 1 comprendía el extremo 5' del gen de anticuerpo, incluyendo L3 aleatorizado, el fragmento 2 era un fragmento constante central que comprendía L3 a H3, mientras que el fragmento .3 comprendía H3 aleatorizado y la parte 3' del gen de anticuerpo.
Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar los fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - LibLlb_new), fragmento 2 (MS63 - MS64), fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong). Ver la Tabla 3. Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3 - RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31 - RJH32) y fragmento 3 (LIB88_2 - fdseqlong). Ver la Tabla 4.
TABLA 3.
TABLA 4.
El protocolo de PCR para la producción de fragmentos de biblioteca incluía: 5 minutos de desnaturalización inicial a 94°C, 25 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C y 1 minuto a 72°C, y elongación terminal durante 10 minutos a 72°C. Para la PCR de ensamblaje, se utilizaron proporciones equimolares de los 3 fragmentos como molde. El protocolo de PCR de ensamblaje incluía: 3 minutos de desnaturalización inicial a 94°C, y 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 58°C y 2 minutos a 72°C. En esta etapa, se añadieron cebadores complementarios a la secuencia exterior a los fragmentos 1 a 3 y se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales previamente a la elongación terminal durante 10 minutos a 72°C. Tras el ensamblaje de cantidades suficientes de constructos de Fab aleatorizados de longitud completa, se digirieron los constructos de Fab con Ncol/Notl para la biblioteca DP47-3 y con Ncol/Nhel para la biblioteca DP88-3 conjuntamente con vector fagémido aceptor tratado de manera similar. Para la biblioteca DP47-3, se ligaron 22,8 µg de biblioteca de Fab con 16,2 µg de vector fagémido. Para la biblioteca DP88-3, se ligaron 30,6 de biblioteca de Fab con 30,6 µg de vector fagémido.
Se utilizaron ligaciones purificadas para 68 transformaciones para la biblioteca DP47-3 y 64 transformaciones para la biblioteca DP88-3, respectivamente, obteniendo tamaños de biblioteca finales de 4,2xl010 para DP47-3 y de 3,3xl09 para DP88-3. Las partículas fagémidas que expresaban las bibliotecas de Fab se rescataron y se purificaron mediante purificación con PEG/NaCl, para su utilización para las selecciones.
Ejemplo 3 Selección de clon 2B10 anti-TNC A2 (selecciones primarias) Las selecciones se llevaron a cabo contra TNC-A2 humana expresada en E. coli, que se subclonó en el lado 5' de una etiqueta avi y de una etiqueta óxhis. SEC ID n° 97.
El antígeno se biotiniló in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémidas de biblioteca DP88-3 y de TNC A2 humana biotinilada 100 nM durante 0,5 horas en un volumen total de 1 mi, (ii) captura de TNC-A2 humana biotinilada y fago unido mediante la adición de 5,4 x 107 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 minutos, (iii) lavado de las perlas utilizando 5x1 mi de PBS/Tween20 y 5x1 mi de PBS, (iv) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 µ? de Tris/HCl 1 M, pH 7,4, y (v) reinfección de las células E. coli TG1 en fase logarítmica con fago ayudante VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de las partículas fagémidas que debían utilizarse en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas utilizando una concentración constante de antígeno de 100 nM. En la ronda 2, se llevó a cabo la captura de los complejos de antígeno:fago en placas con neutravidina en lugar de perlas con estreptavidina. Se identificaron los ligantes específicos mediante ELISA del modo siguiente, utilizando: cada pocilio de las placas con neutravidina se recubrió con 100 µ? de TNC-A2 humana biotinilada 100 nM.
Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fabs ligantes a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Tras la identificación, el clon 2B10 se expresó en bacterias en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificó por afinidad y se caracterizó adicionalmente mediante análisis de SPR utilizando un aparato BIACORE TI 00. Ver las secuencias SEC ID n° 56 y n° 60).
Ejemplo 4 Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad anti-TNC A2 basadas en el clon 2B10 Se construyó una biblioteca de maduración de afinidad basándose en un anticuerpo preseleccionado en selecciones primarias de TNC A2. Más concretamente, se basó en el clon parental 2B10 y consistía de dos sub-bibliotecas: 1) sub-biblioteca de VL, aleatorizada en CDR1 y CDR2 de la cadena ligera (L1/L2), y 2) sub-biblioteca de VH, aleatorizada en CDR1 y CDR2 de la cadena pesada (H1/H2). Se agruparon estas sub-bibliotecas tras la transformación. Se construyó cada una de estas sub-bibliotecas en cuatro etapas posteriores de amplificación y ensamblaje. Para las bibliotecas de L1/L2: 1) amplificación del fragmento 1 (LMB3 - AM_VklA30_Ll_ba) y del fragmento 2 (RJH50 -(VklA30_Ll/L2_fo) - RJH51 (VklA30_ BsiWI_ba)), 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores externos LMB3 y RJH51 (VklA30_BsiWI_ba) para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (LBM3 - AM_VklA30_L2_ba) y del fragmento 4 (RJH52 (VklA30_L2/L3) - RJH51 (VklA30_BsiWI_ba)) y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores externos que anteriormente. Para las bibliotecas de H1 H2: 1) amplificación del fragmento 1 (RJH53 -AM_DP88_Hl_ba_opt) y del fragmento 2 (RJH54 (DP88_H1 H2_fo) - MS52, 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores externos RJH53 y MS52 para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (RJH53 - AMJDP88_H2_ba) y del fragmento 4 (RJH55 (DP88_H2H3_fo) y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores externos que anteriormente. Los productos de ensamblaje finales se digirieron con NcoI/BsiWI en el caso de las sub-bibliotecas de VL y con MunI y Nhel en el caso de las sub-bibliotecas de VH, y se clonaron en vectores aceptores digeridos de manera similar. El tamaño de biblioteca resultante fue de 1,16 x 1010 clones independientes.
TABLA 5.
Subrayado: 60% bases originales y 40% aleatorización como V Negrita: 60% bases originales y 40% aleatorización como N TABLA 6.
Subrayado: 60% bases originales y 40% aleatorización como V Negrita: 60% bases riginales y 40% aleatorización como N Ejemplo 5 Selección de clones anti-TNC A2 de afinidad madurada Las selecciones se llevaron a cabo respecto a TNC A2 humana expresada en E. coli, que se clonó cadena arriba de una etiqueta avi y de una etiqueta 6xhis (ver SEC ID n° 97). El antígeno se biotiniló in v/votras la expresión. Las selecciones se llevaron a cabo en solución tal como se ha descrito para las selecciones primarias de TNC A2, utilizando concentraciones decrecientes de TNC A2 humana comprendidas entre 100 y 2 nM. Se llevaron a cabo cribados secundarios tras la identificación de los clones de afinidad madurada mediante ELISA, utilizando un biosensor ProteOn XPR36 (Biorad) y las constantes de tasa cinética y afinidades se determinaron mediante el análisis de preparaciones de Fab purificadas por afinidad en el mismo instrumento. Se midió la KD mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato ProteOn XPR36 (Biorad) a 25°C con antígenos inmovilizados en chips sensores NLC (Biorad). Brevemente, se diluyó antígeno recombinante a 10 g/ml en PBS/Tween-20 al 0,005%, pH 7,4, y se inyectó a 30 µg/minuto durante 100 a 300 segundos hasta alcanzar aproximadamente 200 a 800 unidades de respuesta (RU) de antígeno acoplado. Para las mediciones cinéticas puntuales, se inyectó una serie de dilución de dos veces de Fabs purificadas (intervalo de concentraciones de entre -0,01 nM y 25 nM) a un caudal de 100 µ?/minuto. El tiempo de asociación era de 210 segundos, y el tiempo de disociación, de 600 segundos. Se regeneró el chip sensor mediante inyección de NaOH 50 mM durante 18 segundos a un caudal de 100 µ?/minuto. Se calcularon las tasas de asociación (ko„) y de disociación (kofr) utilizando un modelo simple de Langmuir de unión uno a uno (software de control ProteOn versión 2.1) mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de equilibrio de disociación (KD) como la proporción koff/kon.
Se identificaron los clones de afinidad madurada siguientes: 2B10_OlF7 (ver las secuencias SEC ID n° 85 y 87), 2B10_6H10 (ver las secuencias SEC ID n° 89 y 91), 2B10_C3A6 (ver las secuencias SEC ID n° 69 y 71), 2B10_D1A2 (ver las secuencias SEC ID n° 73 y 75) y 2B1.0_O7D8 (ver las secuencias SEC ID n° 81 y 83) (todas ellas derivadas de la sub-biblioteca de VL), así como 2B10_C3B6 (ver las secuencias SEC ID n° 61 y 63) y 2B10_6A12 (ver las secuencias SEC ID n° 65 y 67) (estos dos clones se derivaron de las sub-biblioteca de VH). Además, para el clon 2B10_D1A2, se generó un muíante V32D (ver las secuencias SEC ID n° 77 y 79) (numeración según Kabat).
La figura 1 muestra los sensogramas de resonancia de plasmón superficial de Fabs de afinidad madurada seleccionados que se unen a TNC A2 inmovilizada, y la Tabla 7 proporciona las afinidades respectivas que se derivan. Las Fabs seleccionadas presentaban afinidades dentro del rango de valores elevados, del orden de pM.
TABLA 7.
Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KQ) de anticuerpos anti-TNC A2 de afinidad madurada en forma de fragmentos Fab (unión monovalente).
Ejemplo 6 Conversión de IgG de Fabs 2B10 ligantes de TNC A2 El Fab 2B10 parental y los derivados de Fab 2B10 de afinidad madurada se convirtieron a un formato IgGl humano, IgG2a de ratón e IgGl humano con una etiqueta Avi fusionada con el extremo C-terminal de la cadena pesada. Las Fabs 2B10 de afinidad madurada se convirtieron en IgG de ratón para permitir el análisis inmunohistoquímico (ver el Ejemplo 8).
Las secuencias de ADN de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo completo se obtuvieron mediante subclonación de las regiones variables en el mismo marco de lectura de las regiones pesada constante y ligera constante respectivas preinsertadas en diferentes vectores de expresión receptores de mamífero, o se recombinaron mediante fusión de un segmento de secuencia corta homólogo respecto al sitio de inserción en el vector receptor.
Se llevó a cabo la recombinación según el sistema de clonación "In-Fusion" de Invitrogen.
En todos los vectores la expresión del anticuerpo estaba controlada por un promotor de MPSV y todos los vectores portaban una secuencia de señal poliA sintética en el extremo 3' del CDS. Además, cada vector contiene una secuencia OriP del EBV.
Ejemplo 7 Determinación de la afinidad de Fab 2B10 e IgG para TNC A2 A continuación, se determinó la afinidad del fragmento Fab 2B10 de TNC A2, así como el anticuerpo 2B10 de TNC A2 convertido en IgGl humana, y se confirmó para el dominio de TNC A2 humano, murino y de mono Cynomolgus mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato BIACORE® TI 00 (GE Healthcare) a 25°C. Con este fin, se inmovilizaron los antígenos biotinilados (expresados en E. coli, antígeno en el contexto pero no glucosilado) en un chip con estreptavidina y se utilizaron los constructos a modo de analitos. Para la inmovilización, los antígenos se diluyeron con HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4) hasta 0,1 µg/ml antes de la inyección a un caudal de 10 µ?/minuto hasta alcanzar aproximadamente 80 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. El dominio de TNC A2 humano, de ratón y de mono Cynomolgus se expresó en el contexto de los dominios Al y A3. Los constructos de antígeno que comprendían el quinto dominio de fibronectina de tipo III de la TNC humana (Fn5), los dominios Al y A2 de la TNC humana, murina o de mono Cynomolgus, y el dominio A3 de la TNC humana (TNC Fn5-Al-A2 humana/murina/Cyno-A3) se muestran en las secuencias SEC ID n° 99 a 104.
Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de dos veces de fragmentos Fab (intervalo entre 1,56 y 100 nM) o de IgG (intervalo de entre 0,39 y 25 nM) en HBS-EP+ a 25°C a un caudal de 50 µ?/minuto. Los tiempos de asociación y de disociación eran de 180 segundos y se llevó a cabo una regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 60 segundos entre ciclos. Las tasas de asociación (kon) y de disociación (k^) se calcularon utilizando un modelo simple de Langmuir de unión uno a uno (BI ACORE® TI 00 Evaluation Software, versión 1.1.1) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de equilibrio de disociación (KD) como la proporción 1?<??. Ver, por ejemplo, Chen et al, J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999.
Los dominios 1 a 8 de TNC producidos en HEK sirvieron de controles negativos (ver las secuencias SEC ID n° 105 y n° 106).
Los valores de KD de unión se proporcionan en la Tabla 8. La figura 2 A-b muestra los análisis cinéticos basados en SPR correspondientes.
TABLA 8.
Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KD) de anticuerpos 2B10 anti-TNC A2 como fragmentos Fab y como IgG Ejemplo 8 Unión de anticuerpos anti-TNC A2 en secciones de tejido tumoral humano frente a secciones de tejido normal Con el fin de comprobar la especificidad de la Fab 2B10 seleccionada para el dominio A2 de la tenascina humana (TNC-A2) y para evaluar su capacidad de unirse selectivamente a tejidos tumorales frente a tejidos normales, se llevaron a cabo análisis inmunohistoquímicos. Brevemente, la región variable de 2B 10 en un fragmento Fab se fusionó con un fragmento FLAG (SHD2B10-FLAG). Se prepararon muestras de tejido uterino humano sano y canceroso para la tinción inmunohistoquímica. A continuación, las muestras se incubaron con el fragmento Fab SHD2B10-FLAG. A continuación, las muestras se lavaron y se incubaron con un anticuerpo fluorescente específico para el epítopo FLAG. Las muestras de tejido canceroso mostraban niveles de expresión más altos de TNC-A2 que las muestras de tejido sano (figura 3 A). Se incubaron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con fragmento Fab SHD2B10-FLAG tal como se ha indicado anteriormente. La FIGURA 3B muestra los niveles de expresión cuantificados de TNC-A2 en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente. En otro conjunto de experimentos, se utilizó la región variable de 2B10 en un formato de IgG de ratón. Se prepararon muestras de tejido humano sano y canceroso procedentes de diferentes órganos para la tinción inmunohistoquímica. A continuación, las muestras se incubaron con la IgG de ratón SHD2B10. A continuación, se lavaron las muestras y se incubaron con un sistema de revelado de peroxidasa. La figura 4 A-N muestra que las muestras de tejido canceroso mostraban niveles de expresión más altos de TNC-A2 que las muestras de tejido sano. Ejemplo 9 Unión de los anticuerpos anti-TNC A2 a tenascina-C en células de glioblastoma U87 MG Se convirtió el Fab 2B10 en un anticuerpo IgGl humano y se sometió a ensayo para la unión a TNC A2 expresado en células tumorales de glioblastoma U87MG mediante FACS. Brevemente, se incubaron 200.000 células por pocilio con la concentración indicada del anticuerpo anti-TNC A2 2B10 en una placa de 96 pocilios de fondo redondo, se incubaron durante 30 minutos a 4°C y se lavaron una vez con PBS/BSA al 0,1%. Se detectó el anticuerpo unido utilizando fragmento F(ab')2 AffiniPure de cabra conjugado con FITC específicamente anti-IgG Fcy humano (Jackson ImmunoResearch Lab n° 109-096-098, solución de trabajo: 1 :20 diluido en PBS/BSA al 0,1%, recién preparado) tras la incubación durante 30 minutos a 4°C utilizando un FACS CantoII (Software FACS Diva). La figura 5 muestra la intensidad de fluorescencia media de unión de modo dependiente de la dosis en comparación con células no tratadas y células teñidas únicamente con el anticuerpo secundario.
Mediante la utilización del mismo procedimiento experimental, se sometió a ensayo el anticuerpo IgG humano 2B10 manipulado mediante glucosilación, para la unión a TNC A2 sobre células U87MG, en comparación con el anticuerpo IgG humano 2B10 de tipo salvaje. La figura 8 muestra que el anticuerpo 2B10 tanto de tipo salvaje como manipulado mediante glucosilación se une a TNC A2 sobre las células U87MG.
Ejemplo 10 Unión de anticuerpos anti-TNC A2 de afinidad madurada a tenascina-C sobre células tumorales La unión de anticuerpos IgGl humanos derivados de Fabs 2B10 de afinidad madurada a TNC A2 humana sobre células de glioblastoma U87MG o sobre células de melanoma SK- Mel5 se midió mediante FACS. Brevemente, se incubaron 200.000 células por pocilio con la concentración indicada del anticuerpo 2B10 anti-TNC A2 en una placa de 96 pocilios de fondo redondo, se incubaron durante 30 minutos a 4°C y se lavaron una vez con PBS/BSA al 0,1%. Se detectó el anticuerpo unido utilizando fragmento F(ab')2 AffíniPure de cabra conjugado con FITC específicamente anti-IgG Fcy humano (Jackson ImmunoResearch Lab n° 109-096-098, solución de trabajo: 1 :20 diluido en PBS/BSA al 0,1%, recién preparado) tras la incubación durante 30 minutos a 4°C utilizando un FACS CantoII (Software FACS Diva).
Ejemplo 11 Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos mediada por anticuerpos IgGl anti-TNC A2 manipulados mediante glucosilación Se manipularon mediante glucosilación anticuerpos IgGl humanos contra TNC A2 derivados de 2B10, mediante cotransfección con plásmidos codificantes de GnTIII y Manll tal como se indica en el Ejemplo 1. A continuación, los anticuerpos IgGl humanos 2B10 parentales manipulados mediante glucosilación y de afinidad madurada derivados de 2B10 se compararon en un ensayo de ADCC para su potencial de mediar en una mayor citotoxicidad celular mediada por anticuerpos en comparación con su versión de tipo salvaje no manipulada mediante glucosilación. Brevemente, se recogieron células de glioblastoma U87MG o de melanoma SK-Mel5 como células diana, se lavaron y se resuspendieron en medio, de cultivo, y se tiñeron con calceína AM recién preparada (Molecular Probes) a 37°C durante 30 minutos, se lavaron tres veces, se contaron y se diluyeron hasta 300.000 células/ml. Esta suspensión se transfirió a una placa de 96 pocilios de fondo redondo (=30.000 células/pocilio), se añadió la dilución de anticuerpos respectiva y se incubó durante 10 minutos para facilitar la unión del anticuerpo sometido a ensayo a las células previamente al contacto con las células efectoras. La proporción de efector a diana era de 30 a 1 para las PBMCs; alternativamente, pueden utilizarse células NK92. Se llevó a cabo la coincubación durante 4 horas. A modo de lectura, se determinó la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante tras la desintegración de las células atacadas. Se recogió la LDH del sobrenadante de cocultivo y se analizó con un kit de detección de LDH (Roche Applied Science). Se midió la conversión de sustrato por parte del enzima LDH con un lector de absorbancia de ELISA (software SoftMaxPro, longitudes de onda de referencia: 490 nm frente a 650 nm).
* * * Aunque la invención anteriormente expuesta ha sido descrito en cierto detalle a título ilustrativo y ejemplar para los fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citadas en la presente memoria se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.

Claims (53)

  1. REIVINDICACIONES Anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina A2 (TNC A2), en el que dicho anticuerpo se manipula mediante glucosilación para que presente una función efectora incrementada. Anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina C (TNC A2), en el que dicho anticuerpo comprende por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada o ligera, seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, SEC ID n° 9, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21 , SEC ID n° 23, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 29, SEC ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45 y SEC ID n° 47 ó una combinación de los mismos. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 7, (b) una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 1 1, SEC ID N° 13, SEC ID N° 15, SEC ID N° 17, SEC ID N° 19, SEQ ID NO:21, SEC ID N° 23 y SEC ID N° 25, y (c) la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27. Anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende: -m- (a) una CDRl de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 29, SEC ID n° 31 y SEC ID n° 33, (b) una CDR2 de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 45, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo no comprende la combinación de una CDRl de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 7, una CDR2 de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 9, SEC ID n° 15 y SEC ID n° 21, la CDR3 de cadena pesada de SEC ID n° 27, la CDRl de cadena ligera de SEC ID n° 29, la CDR2 de cadena ligera de SEC ID n° 35, y la CDR3 de cadena ligera de SEC ID n° 47. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de: SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. 8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo no comprende una combinación de una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 59, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 55 ó a la secuencia SEC ID n° 57. 9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fe o una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina. 10. Anticuerpo según la reivindicación 9, en el que dicha región Fe es una región Fe de IgG. 11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa. 12. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones l a 11, en el que dicho anticuerpo comprende una región constante humana. 13. Anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano. 14. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fe manipulada mediante glucosilación. 15. Anticuerpo según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fúcosilados en dicha región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. 16. Anticuerpo según la reivindicación 14 ó 15, en el que por lo menos entre aproximadamente 20% y aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en dicha región Fe no se encuentran fucosilados. 17. Anticuerpo según las reivindicaciones 14 a 16, en el que dicho anticuerpo presenta una proporción incrementada de oligosacáridos biantenarios en dicha región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucosilación. 18. Anticuerpo según las reivindicaciones 14 a 17, en el que entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 100% de los oligosacáridos N-ligados en dicha región Fe son biantenarios. 19. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que entre por lo menos aproximadamente 20% y aproximadamente 50% de los oligosacáridos N- ligados en dicha región Fe son biantenarios no fucosilados. 20. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dicho anticuerpo presenta una función efectora incrementada y/o una afinidad de unión a receptor de Fe incrementada. 21. Anticuerpo según la reivindicación 20, en el que dicha función efectora incrementada es ADCC incrementada. 22. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , en el que dicho anticuerpo es de afinidad madurada. 23. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho anticuerpo se une a TNC A2 con un valor de KD inferior a aproximadamente 1 µ?. 24. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que dicho anticuerpo se une a TNC A2 en tejido humano. 25. Polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que forma parte del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. 26. Polipéptido aislado codificado por el polinucleótido según la reivindicación 25. 27. Composición que comprende un primer polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 59, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 63, y un segundo polinucleótido aislado codificante de un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85 y SEC ID n° 89. 28. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 25. 29. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 25, la composición según la reivindicación 27 ó el vector según la reivindicación 28. 30. Célula huésped según la reivindicación 29, en la que dicha célula huésped ha sido manipulada para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de GnTIII. 31. Célula huésped según la reivindicación 30, en la que dicho polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización en Golgi de Manll. 32. Célula huésped según la reivindicación 30 ó 31, en la que dicha célula huésped ha sido manipulada adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de Manll. 33. Método para producir un anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina A2, comprendiendo dicho método: a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 29 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo, y b) recuperar el anticuerpo. 34. Método para producir un anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina A2, comprendiendo dicho método:a) cultivar la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 32 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo y la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe de dicho anticuerpo mediante dicho polipéptido que presenta actividad de GnTIII, yb) recuperar el anticuerpo. 35. Anticuerpo que se une específicamente al dominio A2 de la tenascina, en el que dicho anticuerpo es producido mediante el método según la reivindicación 33 ó 34. 36. Conjugado de anticuerpo que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y un agente citotóxico. 37. Formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y un portador farmacéuticamente aceptable. 38. Formulación farmacéutica según la reivindicación 37, que comprende además un agente terapéutico adicional. 39. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la utilización como medicamento. 40. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2. 41. Anticuerpo según la reivindicación 40, en el que dicha enfermedad es cáncer. 42. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para la utilización en la inducción de la lisis celular de una célula tumoral o de una célula estromal de un tumor. 43. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en la preparación de un medicamento. 44. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2. 45. Utilización según la reivindicación 44, en la que dicha enfermedad es cáncer. 46. Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para la preparación de un medicamento destinado a la inducción de la lisis de una célula tumoral o de una célula estromal de un tumor. 47. Método de tratamiento de un individuo que presenta una enfermedad caracterizada por la expresión de TNC A2, que comprende administrar en el individuo una cantidad efectiva del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o la formulación farmacéutica según la reivindicación 37 ó 38. 48. Método según la reivindicación 47, que comprende además la administración de un agente terapéutico adicional en el individuo. 49. Método según la reivindicación 47 ó 48, en la que dicha enfermedad es cáncer. 50. Método de inducción de lisis celular de unaf célula tumoral o de una célula estromal de un tumor, comprendiendo dicho método la puesta en contacto de dicha célula tumoral o célula estromal con el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. 51. Método según la reivindicación 50, en el que dicha lisis celular resulta inducida por la citotoxicidad dependiente de anticuerpos del anticuerpo. 52. Método de diagnóstico de una enfermedad en un individuo, comprendiendo dicho método la administración en el individuo de una cantidad efectiva de un agente diagnóstico, en el que dicho agente diagnóstico comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y un mareaje que permite la detección de un complejo de dicho agente diagnóstico y TNC A2. 53. Invención según se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
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