TW200835793A

TW200835793A - Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield

Info

Publication number: TW200835793A
Application number: TW096140667A
Authority: TW
Inventors: Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer Sa
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2008-09-01
Also published as: CA2665448A1; MX2009004659A; KR20090090319A; US20100137655A1; EP2084288A1; EP2400027A1; WO2008052595A1; JP2010508013A; AR065833A1; CN101528936A; BRPI0622099A2; US8236994B2

Description

200835793 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】領逸 5 之本發明係包括藉由代謝性工程之梭菌屬、生物轉化反應而製造高產率之丙二醇的方、去丁甘油【先前技術】

10 矣置背t 1，3-丙二醇為使用於聚酯纖維製造中之單码取胺基曱酸酯及環狀化合物之製造中具有潛在的用途於來 1，3-丙二醇可藉由不同的化學途徑從丨）U 氫ii)環氧乙烷一氧化碳與水於光氣存在之下及由及氫於一氧化碳存在之下製造。所有此等方法具有严二且產生含污染物質之廢氣的共通性。、 15

1，3-丙二醇可藉由不同的梭菌以甘油之發酵作用來製造醋酸酯/丁酸酯/乳酸酯/;1，3_丙二醇混合物。甘油進入梭囷中之一般代謝作用係出示於圖1中。 20 於一方面中，甘油係在二階段酵素反應順序中轉化成1，3-丙二醇。於第一步驟中，甘油脫水酶催化了甘油轉化成3-羥基丙醛（3-HPA)及水之反應。於第二步驟中，3-HPA係藉由NADH依賴1，3_丙二醇脫氫酶而還原成1，3-丙一醇。多種生成1，3-丙二醇之梭菌係採用經 dhaBlB2B3結構基因編碼之B12依賴甘油脫水酶，然而丁酸梭菌係使用經dhaBl結構基因編碼之B12獨立酵 5 200835793 素。於Bl2依賴甘油脫水酶時，orfX及oriZ編碼甘油脫水酶再活化因子，然而於僅知之B12獨立酵素時’ dhaB2編碼S-腺核苷-甲硫胺酸(SAM)依賴活化因子。編碼結構及活化因子之基因附近亦出現編碼1，3-丙二醇脫 5 氫酶(dhaT)之基因。由甘油製造l，3-丙二醇時係消耗 NADH 〇於另一方面中，當甘油未轉化成丙二醇時，其係被分別經glpk及gipA編碼之甘油激酶及甘油-3-磷酸醋脫水酶或被甘油脫氫酶，接著被分別經dhaD及 10 dhaK1K2編碼之DHA激酶氧化成二羥基丙酮-磷酸酯 (DHAP)且伴隨著產生nadh。然後DHAP將會進入具 • 有產生丙酮酸鹽及以乙醯基_CoA作為主要中間體之甘油途徑。丙酮酸鹽及乙醯基_c〇A可藉由經ldh基因編碼之乳酸酯脫氫酶及經adhE編碼之雙-官能性醛-醇脫氫酶 15 分別還原成乳酸酯及乙醇。乙醯基-CoA亦可轉化成丁醯基-CoA，其為中間體產物可被： i) 77別經Ptb及buk基因編碼之填-轉化丁醯酶及丁酸酯激酶轉化成丁酸或 n)級adhE編竭之雙-官能性醛_醇脫氫酶還原成丁 20 || 〇於/谷別產生的（s〇lvent〇genic)梭菌中，丙酮係由乙 I乙基-CoA (於製造丁醯基-C〇A時之中間體）分別藉 ^經ctfAB及adc基因編碼之c〇A_轉化酶及乙酸醋酸酉曰脫羧酶所製造。氫係藉由鐵來製造，惟僅氫酶係被 6 200835793 hydA基因編碼。天然的與重組體梭菌二者，由於經還原的化合物如丁酸（丁酸酯），乳酸（乳酸酯），乙醇或丁醇之共生產作用而以每克甘油生成0.55克1，3-丙二醇之最大產量。為 5 了增加1，3-丙二醇的製造量，必須避免製造所有經還原的共-產物及伴隨著製造1，3-丙二醇成經氧化的共產物。不能產生丁酸酯之丙酮丁醇梭菌菌株業已說明於論 ^ 文（葛林等，1996)中。丁酸酯之形成作用由於與非-自律 10 性質體單交叉所得到之bilk基因鈍化而戲劇性地降低。將該突變菌株用於試驗1,3-丙二醇之製造，如（康沙雷-帕株艾洛，2005，代謝性工程）所示。此重組體菌株有效地製造1，3-丙二醇為主要的發酵產物，但亦產生丁 • 醇，其降低了 1，3-丙二醇之產量。 15 甘油藉由梭菌之1,3-丙二醇發酵作用可以批次，進給批次或連續培育來進行。 ® 本發明所要解決的問題是由甘油生物製造高產率 1，3丙二醇而無經還原的化合物例如，丁酸酯，乳酸酯，或醇類伴隨產生。此製造法係用梭菌藉由厭氧性發 20 酵來進行。【發明内容】本發明之摘要申請者解決了所陳明的問題且本發明係提供用於厭 7 200835793 ，人衣& i，3 m的方法，其鱗著將㈣屬菌株於油作為碳源之適#培養介f巾培I，其中，該梭菌屬，株貝貝上不產生選自包括丁酸醋，乳酸醋，丁醇及乙醇之甘油代謝的其他產物，並回收i，3_丙二醇。 5 1,3-丙二醇可與甘油代謝之單一氧化產物共伴產生。於本發明之特別方面中，該梭菌屬菌株係經改質以限制來自甘油之代謝物生產，其生物合成途徑為消耗 » NADH或NADPH，但13·丙二醇除外。 10 於本發明之一方面中，係將可自然製造1，3〜丙二醇之梭菌屬菌株予以基因性改質以製造高產率之1，3-丙二醇，其係藉著·· i) 將編碼丁酸酯激酶(buk)或礙-轉化丁醯酶(ptb)之基因去除以避免產生丁酸酉旨 15 ϋ) 任意的將編碼乳酸酯脫氫酶(Idh)之所有的基因去除以避免產生乳酸酯 • 出）任意的將編碼雙-官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之基因去除以避免形成醇。於本發明另一方面中，係將可自然製造丁酸醋但不 20 能製造丨，3·丙二醇之梭菌屬予以基因性改質以製造高產率之1，3-丙二醇。該結果係藉著將編碼涉及丁酸酯途徑之醭素的ptb或buk基因用編碼涉及B12獨立1，3-丙二醇途征之酵素的丁酸梭菌操縱子替代，且： i) 任意的去除編碼乳酸酯脫氫酶(Idh)之所有的基因 8 200835793 以避免產生乳酸酯 π)任意的去除編碼雙_官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之基因以避免形成醇而達成。 &於本發明之其他方面中，係將可自然製造乙醇但不月匕製造丨，3·丙二醇之梭菌屬予以基因性改質以製造1，3-丙一醇。该結果係藉著將一種編碼涉及乙醇途徑之酵素的&舰基因用編碼涉及B12獨立1，3-丙二醇途徑之酵素的丁酸梭菌操縱子替代，且： 10 15

20 0任思的去除編碼乳酸酯脫氫酶（ldh)之所有的基因以避免產生乳酸酯 …任思的去除編碼雙-官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之所有剩餘的基因，免形成醇而達成。於本發明之另一方面中，將氫製造之通量降低且然 Ϊ降低之平衡通量藉著減弱編碼氫酶(hydA)之基因再指向1,3-丙二醇之製造。 …二月之另β曲中，U·丙二醇製造之通量係 1 者¥引來自丁酸梭菌（編碼涉及m2獨立u-丙二醇喊之酵素贿卜複本之U·丙二_縱子而增加。士 @之目的亦提供利於高產率之1,3_丙二醇製造方法中之重組财《屬菌株。本文中所使用及說明書。細說吸之下列名詞係用於詮釋申請專利範圍 9 200835793 梭菌屬π及’’梭菌"一詞係指屬於該族之所有種類的細菌。適當的培養介質係指最佳於特定使用之梭菌屬菌株生長及製造二醇的培養介質。石厌基質’’或π碳源π —詞係指任何能夠被微生物所代謝的碳源，其中，基質含有至少一個碳原子。於本發明中’甘油為唯一的碳源。

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20 "將微生物改質"一語係指菌株已被轉化，目的是轉化其基因特性。内因性基因可被減弱，去除，或過度-表現。外因性基因可被質體所導引，攜帶，或總合^ 株之染色體組，於細胞中表現。 ’’減弱”一詞係指降低的基因表現或蛋白質，基 ==:=方*技藝中之人士熟知許多得Ϊ -基因中，降低此基因之表現程經編碼之蛋白質的活性度。 4 1 =然促進子被強度低的促進子替代，導敢铰 :關訊息RNA或蛋白質不穩定的元素。如果不藏要表現，將基因去除。份被移去除除。:=一=指，基因之編碼序列的實質邹佳為至少8〇%Γ ’ 7 5〇%之編石馬序列被移除，且更本文中所用之”質體"或，，載體，，—詞係指外加的染色 200835793 且通常為體元素經常攜帶非細胞中心代謝部份之基因環形雙股DNA分子的型式。於本發明之㈣書中’酵素似彼料定之活性來 5

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20 確認。因此較義係包括所有亦存在於其他生物特別為於其他微生物中，具有經定義之特韻性的肽。具有類似活性之酵素經常可藉由其等歸屬於族如PFAM或COG所定義者而被確認。 PFAM(排比及隱藏的馬可夫模式之蛋白質家族資料庫；代表大量收集之蛋白質序列排比。各個PFAM儘可能地顯示多重排比，觀看蛋白質區域，評估於生物中之分佈，獲准進入其他資料庫，及顯示已知的蛋白質結構。 COGs (蛋白質之同源群組（orth〇i〇gOUS gr〇Up)叢集；iltm:_//_>y.w：^Jigbi.nlm.nih.g〇v/COGA 係從 43 個代表 30個主要種系發生系之完整定序的染色體組中藉著比較蛋白質序列而獲得。各個COG係從至少三個系中界定，其同意先前保存之區域的鑑定。鑑定同質性序列及其等百分比同質性的方法係精於此方面技藝之人士所熟知者，且特別包含BLAST程式，其可從http://www.ncbLnlmunih.gov/BLAST/ 網站使用該網站中所指明之預設參數來操作。然後將所得到的

序列（例如，組合），利用程式例如，CLUSTALW f http: //w w w. eb i. ac, uk/c lu s t al w/) 或 MULT ALIN (http：//prodes,toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin>pl) 11 200835793 使用那些網站上所指明之預設參數來操作。

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20 那些精於此方面技藝者使用基因庫（GenBank)中所給定之已知基因的參考時能夠測定在其他生物，細菌菌株，酵母，真菌，哺乳類，植物等中之相等基因。該例行工作可使用一致序列（consensus sequence)，其係藉由與其他微生物所衍生的基因來進行序列排比而有利地完成’且設計簡併探針(degenerate probe)而選瘦另一個生物中之相關基因。此等分子生物學的例行方法係精於此方面技藝者所熟知，且係說明於例如，山布魯克等 (1989分子選殖：實驗室手札第2版，冷春港實驗室，冷春港，紐約）中。本發明係提供用於厭氧性製造lv3_i二醇的方法，其係藉著將梭菌屬菌株於包含甘油作為碳源之適當培養介質中培育，其中，該梭菌屬菌株實質上不產生選自包括丁酸酯，乳酸酯，丁醇及乙醇之甘油代謝的1 物，並回收1，3-丙二醇。，、產 Y實質上’’係指於培養介質中發現至多有微量的產或甘油減低。微量宜指不干擾1，3-丙二醇回收作業量’更佳為低於10 mM。 ' ’’甘油代謝，，一語係指甘油於細菌中發生之所化轉化作用。此係包括有機分子之生物合成的, 及其等之㈣(降解代謝）。某減縣纏消耗 _PH ’而其他相健生。㈣制株巾之= 谢作用係_於圖式1中。得自於代謝反應中之中間^ 12 200835793 以及最終產物稱為代謝物。發二法之特徵在於甘油代謝係指向u 之製'，卜此代謝途徑沒有其他經還原的產物例如丁 5 10 15

20 酸醋’，乙醇係、藉由梭菌屬與丙二: 共伴生成。的確，此等_原的產物之製造知胞之ΝΓ_ΡΗ存量。限制此消耗將使得i原= 力再指向1，3-丙二醇之製造。、巧動代中’該u-丙二醇係與甘油代谢之早：乳化產物，例如醋酸酯，丙酮伴產生二氧化的產物，，-詞係指無需消耗細胞之二ς NADPH存量所產生的產物。有利地’製法中所使用的梭菌屬菌株僅產生υ 二醇及醋酸酯。 ’ 根據本發明，梭菌屬菌株可經改質以限制由甘油製以除了 1，3_丙二醇外的代謝物，其生物合成途徑為消耗 NADH 或 NADPH 〇有利地，該改質包括去除至少一個編碼涉及該代謝物製造之酵素的基因。特別的，此酵素涉及製造選自包括下列之代謝物：丁酸酯，乳酸酯，丁醇及乙醇。於本發明之特定具體例中，梭菌屬菌株係自然地製這1’3_丙一醇，因為其包括編碼涉及ι，3_丙二醇生物合成之酵素的官能性内因性基因。此等基因特別為：甘油脫水酶及1，3-丙二醇脫氫酶。 13 200835793 該菌株可經基因性改質以產生m 的產物’其係藉著將至少一個編碼填_轉

或丁酸驗酶(buk)之基因予以去除以轉化成丁酸酯。 I基-C〇A 5 於另-個狀的具體例中，該梭菌屬菌株亦將 :酸醋脫虱酶⑽)之所有的基因去除以阻斷乳酸酿產

10 雙官======= 產生將梭菌中之基因去除可使用最近於專利申情 PCT/ EP2006/066997中所說明的方法來完成，其容許& 將要去除的基因用紅黴素抗藥性基因替代及⑴藉由表現FLP重組酶移除紅黴素抗藥性基因。 15

20 有利地，梭菌屬菌株係選自包括丁酸梭菌及巴氏芽胞梭菌者。於本發明之特定具體例中，梭菌屬菌株必須予以改質以便能夠製造1，3-丙二醇。該改質包括導引至少一個編碼涉及B-12獨立1，3-丙二醇途徑之酵素的外源性基因。此等基因可為dhaBl，dhaB2，dhaT但不偈限於此0 有利地，該菌株係藉著導引編碼涉及B12-獨立1,3-丙二醇途徑之酵素的丁酸梭菌操縱子而改質。操縱子挿入染色體中可使用最近於專利申請案PCT/EP2006/ 14 200835793 066997中所說明的方法來完成。 f夺發明之特定具體例中，所使用的梭菌屬菌株於 :貝=係自然地產生丁酸醋，但*能產生1，3-丙二醇；該巧的梭菌屬係經基因性改質以產生1，3_丙三醇，其 5 1藉著將至少一個編碼涉及丁酸酯形成之酵素，特別是 η轉化丁鉍酶③化)或丁酸酯激酶作此)的基因，用一個、扁馬涉及B-12獨立13—丙二醇途徑之酵素的外源性基因來替代，其目的是： —阻斷丁醯基-c〇A轉化成丁酸酯且 10 -容許於此菌株中由甘油產生1，3-丙二醇。於染色體中挿入操縱子及去除基因可使用最近於專利申請案PCT/Ep2〇〇6/066997中所說明的方法來完成。於该梭菌屬菌株中優先地將編碼乳酸酯脫氫酶(1 d h) 之所有的基因去除以阻斷乳酸酯產生。 15 卜於該梭菌屬菌株中優先地將編碼雙-官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之所有的基因去除以阻斷醇產生。 •有利地’該梭菌屬菌株係選自包括丙酮丁醇梭菌，拜氏梭菌，糖過丁丙酮梭菌（c sacchar〇perbmyl_ acetonicmn) ’糖丁酸梭菌，丁酸梭菌或纖維梭菌（c. 20 cellulolyticum)者。於本發明之特定具體例中，梭菌屬於改質前可自然產生乙醇，但不能產生1，3-丙二醇；該菌株係經基因性改質而產生1，3_丙二醇，其係將至少_個編碼雙_官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之基因用至少一種編碼涉及B12獨立 15 200835793 1，3-丙一醇途徑之酵素的外源性基因來替代。此外源性基因優先為編瑪涉及B12獨立1，3-丙二醇途徑之酵素的丁酸梭菌操縱子。該替代導致： 5 —乙醯基_C〇A*化成乙醇之反應降低，且 -由甘油產生1，3_丙二醇。較佳者’於此梭菌屬菌株中，編碼乳酸酯脫氫酶 (Idh)之所有的基因被去除以抑制乳酸酯產生。較佳者’於此梭菌屬菌株中，編碼雙—官能性_醇脫 10 氳酶(adhE)之所有剩餘的基因被去除以阻斯醇產生。於梭菌屬染色體中挿入操縱子且去除前文所引用的基因可藉由使用最近於專利申請案pCT/Ep2〇〇6/〇66997 中所說明的方法來完成。 _ 有利地，該梭菌屬菌株係選自包括熱纖梭菌，解糖 15 板囷（現為糖熱厭氧細菌（Thermoanaerobacter saccharolyticum)) ’ 熱硫梭菌（c· thermo-sulfurogenes ) • (現為熱石爪熱厭氧細菌（Thermoanaer〇bacter thermosulfurigenes))或熱氫硫梭菌（C· thermohydrosulfuricum)(現為乙醇熱厭氧細菌（Therm〇_ 20 anaerobacter ethanolicus))者。於本發明之特定具體例中，梭菌屬菌株具有降低的虱製造通量且因而表現出將減低當量之通量再指向製造 1，3丙二醇。該結果可藉由各種方法來達成，且特別的可藉由削弱編碼氫酶(hydA)(其係一種以製造氫的形式對 200835793 降低的當量提供貯存區（sink))的基因來達成。削弱 HydA時，可藉著將天然的促進質子用強度較低的促進子來替代，或藉由使用元素使相關的訊息rNA或蛋白質不穩定來達成。如果需要，亦可藉著將相關DNa序列部份或完全去除而達到將基因完全削弱。

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20 於本發明之另一個具體例中，所使用的梭菌屬菌株呈現1，3_丙二醇製造的通量增加；該結果係藉導弓丨來自丁酸梭菌（編碼涉及B12獨立1，3-丙二醇途徑之酵素）之額外的1，3-丙二醇操縱子，藉由質體過度_表現或整合至重組體梭菌屬之染色體而達成。例如，pSPD5質體可用於1，3_丙二醇操縱子之過度_表現。於本發明之另一方面中，梭菌屬菌株係經改質而能夠將醋酸酯轉化成丙酮。此改質法可藉著將人造的，，丙酮操縱子，，（其含有分別編碼硫解酶，c〇A_轉化酶及乙酿-醋，旨脫_之tM，ctfAB及adc基因）導入微生物中而％•到’这二種酵素涉及丙嗣了冑梭菌及拜氏梭菌中 =丙酮之形成。此人造操縱子可藉由質體攜帶或可被整 &至經轉化之梭菌屬的染色體中。客於另-個具義巾’本發明係提仙於發酵製備高產率1，3-丙二醇的方法，其包括： ⑷將梭菌屬菌株與甘油接觸而用於發酵法因而產生 1，3-丙二醇， ⑻2顧法將m醇及任意的甘油代謝之單一氧化產物（主要為醋酸酯或丙酮）單離出來。 17 200835793 可以了料所辅·基質。此方面減Ϊ 批m及連續法進行。精於定根據本發明之微生物的培育二並界 2〇ΐ及6(TC間，造n始^件扣別的，梭菌係在

ίο 15 温的錢宜於45ΐ及6叱間之溫度發酵。c間且書本發明亦’如前文中所說明的微生物 m，列者:丁酸梭菌，巴氏芽ξ梭口 _δ丁醇杬囷，拜氏梭菌，糖過丁丙酮梭菌，糖丁酸梭菌，丁酸梭菌，纖維梭菌，熱纖梭菌，解糖梭菌 (現為糖熱厭氧細g)，熱硫㈣（現為熱硫熱厭氧細菌）或熱氫硫梭菌（現為乙醇熱厭氧細菌）。【實施方式】 • 實例1

產生1，3-丙二醇及不能產生丁睃酯及丁醇之重組體丙酮丁醇梭菌的構築：丙酮丁醇梭菌ApSOLlAcacl515 20 ΔιιρρΔ buk::PDO 為了得到可經基因複製且不能產生丁醇及丙酮的菌株，吾人首先由丙酮丁醇梭菌Acacl515Aupp菌株(說明於專利申請案PCT/EP2006/066997中）處理ps〇Ll巨質體(megaplasmid)，其係藉著i)於葡萄糖MS介質中進 18 200835793 行20次-培養且ii)藉著於瓊脂皿上（含有澱粉(2%)及葡萄糖(0·2%)，如沙巴席等（2003)所說明者）選出可產生殿粉水解小暈圈之菌落，以鑑定丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAcacl515 Aupp菌株。為了去除buk基因且由丁 5 酸梭菌導入丨，3-丙二醇操縱子，係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同貝性重組體方法。整合於pCons::upp載體中來自丁酸梭囷之1，3·丙二醇操縱子之buk去除1£係構築如下。圍繞 buk之二個DNA斷片係經具有來自丙酮丁醇梭菌之總 10 DNA的Pwo聚合酶作為模板及二個特定寡聚核苷酸對予以 PCR 放大。以 BUK 1-BUK 21 及 BUK 31_BUK 4 引子對，分別得到二個DNA斷片。引子BUK 1及BUK 4二者係導引BamHI位置，而引子BUK 21及BUK 31 具有互補區其導引pvull及Nrul位置。將DNA斷片 15 BUK 1_BUK 21 及 BUK 31-BUK 4 係在以引子 BUK 1 及 BUK 4之PCR融合實驗中連接，且將產生的斷片於 . pCR4-TOPO-Blunt 中選殖以產生 pTOPO:buk。於

pTOPO:buk獨特之nrul位置上，將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS基因從pUC18-FRT-MLS2之 20 1372 bp StuI斷片中導引出來。於所產生質體之hmHI 消化後將所得到之BUK去除匣選殖至pCons::upp中 BamHI位置上以產生pREPABUK二upp質體。於 pREPABUK::upp獨特之pvull位置上，將1，3-丙二醇操縱子作為pSPD5質體經4854bpBlunt端Klenow處理的 200835793

Sail斷片而導引。 pREPABUK::PDO::upp質體係藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌ApSOLlAcaclSAupp菌株而使用於轉化。於陪替氏培養皿上選出對抗紅黴素(40微克/亳升)之選殖後，；— 5 菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之甘油液態合成介質中達24小時且將100微升未稀釋之培養物平板塗抹至具有40微克/毫升紅黴素及400#M 5-FU之RCGA (經強化的梭菌屬介質，其中甘油取代澱粉及葡萄糖作 ® 為碳源)上。將對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接 10 種至具有40微克/毫升紅黴素之RCA上及具有5〇微克/ 毫升曱磺氯黴素之RCA上，以選出其中5Jpu抗藥性亦伴隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對甲磺氯徽素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析（具有弓丨子BUK 0及BUK 5位於buk去除匣外面）來檢查。 15 將已喪失 pREPAbuk“upp 之

ApS0LlAcacl5AuppAbuk:: PDO::mlsR 菌株單離出來。 • ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO::mlsR 菌株係用來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLFl.l載體予以轉化。於陪替氏培養孤上轉化且選出對抗甲石黃氯黴 20 素(50微克/毫升)之選殖後，將一菌落培育於具有50微克/毫升曱磺氯黴素之合成液體介質上且將適當的稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升甲磺氯黴素之RCA 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/ 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升曱磺氯黴素 20 200835793 之RCA上。具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性之菌落的基因型係藉由具有引子BXJK 〇及BUK 5之PCR 分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之Acacl5AuppAbuk菌株之二個連續24小時之培養物 5 以便去除 pCLFl.l 。將已去除 pCLFl.l 之

ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO菌株根據其對紅黴素及曱磺氯黴素二者之敏感性予以單離。

表1 10 名稱

Bukl Buk21 Buk31 Buk4 Buk 0 Buk 5

引子序列 aaaaggatcctagtaaaagggagtgtacgaccagtg ggggcagctggtcgcgaaaaaaggggggattattagtaatctatacatgttaacattcctccac cccccttttttcgcgaccagctgccccacttcttgcacttgcagaaggtggac aaaaggatcctctaaattctgcaatatatgccccccc_ ataacaggatatatgctctctgacgcgg gatcatcactcattttaaacatggggcc_ 實例2 不能產生丁酸酯，丙酮及乳酸酯之菌株的構築：丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAcacl515AuppAbuk::PDOAldh 15 為了去除ldh基因，係使用克勞斯及索凱爾（2006) 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入，同時去除 21 200835793 大部份有關的基因。將pCons::upp中之ldh去除匣構築如下。圍繞ldh (CAC267)之二個DNA斷片係經具有來自丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特 5 定寡聚核苷酸對予以PCR放大。以LDH 1-LDH 2及 LDH 3-LDH 4引子對，分別得到1135 bp及1177 bp DNA斷片。引子LDH 1及LDH 4二者係導引BamHl位置，而引子LDH 2及LDH 3具有互補區其導引stul位置。將 DNA 斷片 LDH 1-LDH 2 及 LDH 3-LDH 4 係在 10 以引子LDH 1及LDH 4之PCR融合實驗中連接，且將所產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選殖以產生 PTOPO.LDH。於pTOPO:LDH獨特之Stul位置上，將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS基因從 PUC18-FRT-MLS2之1372 bp Stul斷片中導引出來。於 !5 產生之質體BamHl消化後將所得到之UPP去除匣選殖至 pConszupp 中 BamHl 位置上以產生 pREPMJ)H::upp ® 質體。 pREPALDH: ••upp質體係藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO菌株而使用於轉化。於 20 陪替氏培養皿上(在RCGA上)選出對抗紅黴素(40微克/ 毫升)之選殖後，將一菌落培育於具有4〇微克/毫升紅黴素之液態甘油合成介質中達24小時且將1〇〇微升未稀釋之培養物平板塗抹至在具有40微克/毫升紅黴素及 400//M 5-FU之RCGA上。將對抗紅黴素及5_FU二者 22 200835793 之菌落以影印接種至具有4〇微克/毫升紅黴素之RGCA 上及具有50微克/毫升甲磺氯黴素之RGCA上，以選出其中5-FU抗藥性亦伴隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅Μ素抗藥及對曱石黃氯黴素敏感之菌落的基因型係藉 5 由PCR分析（具有引子LDH 0及LDH 5位於Idh去除匣外面）來檢查。將已喪失pREpALDH::upp之 △△pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh:: mlsR 菌株單離出來。 ’ Δρ8〇υΔοαο15ΑιιρρΔΙη±::ΡΟΟΔ1(11ι“ιηΐ8Κ 菌株係用 10 來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLFl.l 載體予以轉化。於陪替氏培養jBI上轉化且選出對抗甲石黃氯黴素（50微克/毫升）之選殖後，將一菌落培育於具有 50微克/毫升曱石黃氣黴素之合成夜體介質上且將適當的稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升曱續氣黴素之rcA 15 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/ 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲續氯黴素 _ 之RCA上。具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之菌落的基因型係藉由以引子LDH 0及LDH 5之PCR分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性 20 之ApSOLlAcacl5A uppAbuk::PDOAldh 菌株之二個連續 24小時之培養物以便去除pCLFl.l。將已去除pCLFl.l 之八卩801^1八〇&〇15厶叩卩八13111<:::?00八1(111菌株根據其對紅黴素及曱磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 23 200835793 表2

名稱引子序列 Ldh 1 AAAAGGATCCGCTTTAAAATTTGGAAAGAGGAAGTTGTG Ldh2 GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTTAGAAATCTTTAAAAATTT CTCTATAGAGCCCATC Ldh 3 CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGGTAAAAGACCTAAACTCCAAG GGTGGAGGCTAGGTC Ldh 4 AAAAGGATCCCCCATTGTGGAGAATATTCCAAAGAAGAAAATA ATTGC Ldh 0 CAGAAGGCAAGAATGTATTAAGCGGAAATGC Ldh 5 CTTCCCATTATAGCTCTTATTCACATTAAGC 實例3 具有較低氫產生之菌株的構築：丙嗣丁醇梭菌

ApSOLlAcac 1515AuppAbuk::PDOAldhAhydAA 為了去除hydA基因，係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入’同日守去除大部份有關的基因。pC〇ns::Upp中hydA 去除匣係構築如下。

圍繞hydA (CAC028)之二個DNA斷片係經具有來自丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特定券聚核苷酸對予以pCR放大。以HYd 1-HYD 2及HYD 3-HYD 4引子對，分別獲得1269 bp及1317 bp DNA斷片。引子hyd 1及HYD 4二者係導引 24 200835793

BamHI位置，而引子HYD 2及HYD 3具有互補區其導引StuI位置。將DNA斷片HYD 1-HYD 2及HYD 3-HYD 4係在以引子HYD 1及HYD 4之PCR融合實驗中連接，且將產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選 5 殖以產生PT0P0:HYD。於pTOPO.HYD獨特之StuI

位置上，將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS 基因從pUC18_FRT-MLS2之1372 bp StuI斷片中導引 _ 出來。於產生之質體BamHI消化後將所得到之UPP 去除匣選殖至pCons::upp中BamHI位置上以產生 10 pREPAHYD::upp 質體。將pREPAHYD::upp質體藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △PSOL1Acacl5AuppAbuk::PDOAldh 菌株而使用於轉化。於陪替氏培養皿上(RCGA)選出對抗紅黴素(40微克/¾升)之選殖後，將一菌落培育於具有4〇微克/毫升 15 紅被素之甘油液態合成介質中達24小時且將1 〇〇微升未稀釋之培養物平板塗抹至具有40微克/毫升紅黴素驗及400//M 5-FU之RCA上。將對抗紅黴素及5_FU二者之菌落以影印接種至具有40微克/毫升紅黴素之 RCGA上及具有50微克/毫升曱磺氯黴素之RCA上， 20 以選出其中5_FU抗藥性亦伴隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對曱磺氯黴素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析(具有引子HYD 0及HYD 5位於 hydA去除匣外面）來檢查。將已喪失之 △pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldhA hydA::mlsR 菌株 25 200835793 單離出來。

ApS0LlAcacl5AuppAbuk::PD0AldhAhydA::mlsR 菌株係用來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Fipl基因之 pCLFl.l載體予以轉化。於陪替氏培養皿上轉化且選 5 出對抗甲石黃氟撤素(5〇微克/毫升)之選殖後，將一菌落培育於具有50微克/¾升曱石黃氣黴素之合成液體介質上且將適當的稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升甲石買氣傕i:素之RCA上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/毫升紅黴素之RCA上及具有50微 10 克/毫升曱磺氯黴素之RCA上。具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性之菌落的基因型係藉由具有引子 HYD 〇及HYD 5之PCR分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及曱石黃氯黴素抗藥性之 ApS0LlAcacl5AuppMmk::PD0AldhAhydA 菌株之二個 15 連續24小時之培養物以便去除pCLFl.l。將已去除 pCLF 1 · 1 之 ApSOL 1 Acac 15AuppAbuk:·· PDOAldhAhydA B 菌株根據其對紅黴素及甲磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 26 200835793 表3 名稱引子序列 Hyd 1 Hyd 2 Hyd 3 AAAAGGATCCGCCTCTTCTGTATTATGCAAGGAAAGCAGCTGC GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTATATAAAATAAATGTGCCTTAA CATCTAAGTTGAGGCC CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGTTTATCCTCCCAAAATGTAAAAT A TAATTAAAATATATTAATAAACTTCGATTAATAAACTTCG AAAAGGATCCCCTTTTAGCGTATAAAGTTTTATATAGCTATTG Hyd 4 Hyd 0 Hyd 5 CATGTTCTATTGTTACTATGGAAGAGGTAGTAG GCAGTTATTATAAATGCTGCTACTAGAGC 實例4 具有增加1，3-丙二醇途徑通量之菌株的構築：丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAeacl515AuppAbuk::PDOAldh pSPD5 為了構梁將甘油以較南通量轉化成1，3-丙二醇及醋酸酯之菌株，吾人導引pSPD5質體（說明於於專利申請案W001/04324中）其表現為來自丁酸梭菌B12獨立1，3-丙二醇途徑之操縱子。將該pSpD5質體藉由電牙孔丙酮丁醇梭囷 ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh 菌株而使用於轉化。於陪替氏培養皿上(RCGA)選出對抗紅黴素(40微克/毫升)之選殖後，將一菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之甘油液態合成介質中達24小日t且用來萃取具有限制態樣特徵之質體。 27 200835793 實例5 產生1，3-丙二醇及丙酮之菌株的構築：丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAcacl515AuppAbuk::PDOAIdh pSOS95 till

10 15

20 為了構築將醋酸酯轉化成丙酮之菌株，將表現合成丙酮操縱子之pSOS 95 thl質體予以構築。為了此目的’將編碼硫解酶(來自丙酮丁醇梭菌）之基因導引於業已表現為ctfAB及adc基因合成操縱子之？3〇395 載體（基因庫登記號碼AY187686)的BamHI位置上。 5亥thl基因係經具有來自丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo 聚合酶作為模板及二個特定寡聚核苷酸對予以PCR放大。以THL 1-THL 2引子對’獲得L2 kbp DNA斷片且用BamHI及BglII消化，該二個限制位置係分別由引子THL 1及THL2所導引。連結至經BamhI消化之 PSOS95 後，獲得 pS〇S95_thl 質體。將此 pS〇s95 tw 質體藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △pS〇LUCacl5AupMbuk:: PD〇Aldh 菌株而使用於轉 H陪替氏培養皿(RCGA)上選出對抗紅黴素(40微之選輯，將―^落培育於具有4G微克/毫升 =素之甘油液態合成介質中達24切且·萃取具有限制態樣特徵之pSOS95-thl質體。、 28 200835793

表4 名稱引子序列 THL1 cgcggatcctttatctgttaccccgtatcaaaatttagg THL2 gaAGATCTTCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGC 實例6 產生1，3-丙二醇之菌株的批次發酵菌株首先係在添加有2·5克/升醋酸銨且用甘油替代葡萄糖之厭氧性燒瓶培養物中，於索尼等（索尼等， 1986，微生物生物技術應用32 : 120-128)所說明之合成介質中分析。於35°C將過夜培養物用於接種30毫升培養物至〇·〇5之OD600上。將培養物於35°C培育達3天後，藉由HPLC使用分離用之Biorad HPX 97H 管柱及偵測用之折射計來分析甘油，有機酸及1，3_丙二醇。隨即將具有正確表現型之菌株，於300毫升發酵器（DASGIP)中，於製造條件下使用厭氧批次實驗步驟進行試驗。為了此目的，於發酵器中填充250毫升合成介質，用氮噴撒達30分鐘且將25毫升預培養物接種至介於0·05及0·1間（OD600毫微米）之光密度。培養物之溫度於35°C維持恆定且使用ΝΗ4ΟΗ溶液將pH調整至永遠為6.5。於發酵中之振盪速率維持 29 200835793 在 300rpm 〇實例7 產生1,3-丙二醇及酷酸醋菌株之連續性發酵將產生1，3-丙二醇及醋暖酷最好的菌株於化學怪定培養中’於索尼等（索尼等’ 1987，微生物生物技術應用）所說明之合成介質中’除了以甘油替代葡萄糖外’進行分析。於3穴將_料物雜至使用厭氧性化學恆定實驗步驟之·毫升發酵。為了此目的，於發酵器中填充25〇毫升合成介質，用氮喷灑達30分鐘且將25毫升預培養物接種至川於0.05及0·1間（OD600晕微米）之光密度。於％ C ’ pH 6·5 (使用：ΝΗ4〇Η溶液予以調整)及3〇〇11)111振运速率下批次培養12小時後’將發酵器用不含氧之合成介質以0·05小時-1之稀釋速率予以連續填充，同時藉由依序將發酵的介質移除而使體積維持恆定。於使用如前文所說明之HPLC流程進行產物分析後接著測定培養物之穩定性。參考文獻洛Μ，梅尼爾-沙爾斯I二曼迪斯f ^ 康塞羅I，索凱爾ρ 丙_丁醇梭菌用於由甘油工業製造1，3-丙二醇之代謝性工程。代謝工程 2005，； 7 ·· 329-36。 30 200835793

FB 中藉由基因不活化之，波恩，哈里期 jj' 基斯 ΕΤ，斑 5 於丙酮丁醇梭菌ATCC 824 酸形成途徑的基因操作法處理。微生物學 1996，142 : 2079-86。童尼Β· K·，索凱爾p,，古焉〇. • 連續的丙嗣丁醇發酵作用：維生素於丙酮丁醇播菌代謝活性上之影響。 _ 10 微生物生物技術應用1987，27 : 1、5。 . 【圖式簡單說明】併入且構成本說明書之一部份的附帶圖式舉例說明了本發明且與說明書一起用於解释本發明之原理。W 15 圖1描述不同梭菌之中心代謝作用 1 :丙酮酸酯-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶；2 :硫解酶；3 : /5-經基丁酸基-CoA脫氳酶；4 :巴豆酶 (Crotonase) ; 5 : 丁醯基_CoA脫氫酶；6 :乳酸酯脫氫酶；7 :磷-轉化乙醯酶；8 :醋酸酯激酶；9 :乙縮醛 2〇乙醇脫氫酶；10 :氫酶；11 : CoA轉化酶（乙醯乙酸基-CoA :醋酸酯/丁酸酯·· CoA轉化酶）；12 ··乙酿酷酸酯脫羧酶；13 ··磷-轉化丁醯酶；14 ·· 丁酸醋激酶’ 15 ·· 丁醛-丁醇脫氫酶；16 ··甘油脫水酶；17 · I3丙二醇脫氫酶。 31 200835793 1，3丙二醇ST25序列清單序列表

<110> METABOLIC EXPLORER <12C)>用於由甘油生物製造高產率1，3-丙二醇之方法 <130> 350459 D24893 <160> 20 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> Buk 1 <400〉1 36 aaaaggatcc tagtaaaagg gagtgtacga ccaglg <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Buk 21 <400> 2 60 64 ggggcagctg gtcgcgaaaa aaggggggat tattagtaat ctatacatgt taacattcct ccac 3SAU 0>1>2>3> 1 1 u 1 <2<2<2<2 <220> <223> Buk 31 <400〉 3 cccccttttt tcgcgaccag ctgccccact tcttgcactt gcagaaggtg gac <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> 人工， <220> <223> Buk 4 <400〉 4 aaaaggatcc tctaaattct gcaatatatg ccccccc 53 37 A工528DN人 0>1>2>3> IX Tx lx 11 <2<2<2<2 <220> <223> Buk 0 <400> 5 ataacaggat atatgctctc tgacgcgg 28 第1頁 2008357931，3丙二醇ST25序列清單 <210> 6 <211〉 28 <212> DNA <2!3> 人工 <220> <223> Buk 5 <400〉 6 gatcatcact cattttaaac atggggcc 28 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213>人工- <220> <223> Ldh 1 <400〉 7 aaaaggatcc gctttaaaat ttggaaagag gaagttgtg 39 <210> δ •<211> 56 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Ldh 2 <400> 8 ggggaggcct aaaaaggggg ttagaaatct ttaaaaattt ctctatagag cccatc 56 A工 957DN人 0>1>2>3> Tx lx lx 11 <2<2<2<2 <220〉 * <223> Ldh 3 <400> 9 cccccttttt aggcctcccc ggtaaaagac ctaaactcca agggtggagg ctaggtc 57 1048DN人 0>1>2>3> 11 IX ΤΑ lx <2<2<2<2 <220> <223> Ldh 4 <400〉 10 aaaaggatcc cccattgtgg agaatattcc aaagaagaaa ataattgc 48 A工 1131DN人 0>1>2>3> 11 11 1 lx <2<2<2<2 <220〉 <223> Ldh 0 <400〉 11 cagaaggcaa gaatgtatta agcggaaatg c 31

<210> 12 <211〉31 <212> DNA 第2頁 31200835793 <213〉人工 <220> <223> Ldh 5 <400〉 12 cttcccatta tagctcttat tcacattaag c 1，3丙二醇ST25序列清單 <210> 13 <211〉 43 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Hyd 1 <400〉 13 aaaaggatcc gcctcttctg tattatgcaa ggaaagcagc tgc 43 <210〉 14 <211> 59 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Hyd 2 <4O0> 14 ggggaggcct aaaaaggggg tatataaaat aaatgtgcct taacatctaa gttgaggcc 59 <210> 15 <211> 85 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> Hyd 3 <400〉 15 cccccttttt aggcctcccc gtttatcctc ccaaaatgta aaatataatt aaaatatatt 60 aataaacttc gattaataaa cttcg 85 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> Hyd 4 <400> 16 aaaaggatcc ccttttagcg tataaagttt tatatagcta ttg 43 > > > > 0 12 3 ΙΑ IX 1 1 <2<2<2<2 1733DN人 <220> <223> Hyd 0 <400> 17 catgttctat tgttactatg gaagaggtag tag <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213>人工第3頁 33 200835793 1，3丙二醇ST25序列清單 <220> <223> Hyd 5 <400> 18 gcagttatta taaatgctgc tactagagc <210> 19 <21I> 39 <212> DNA <213>人工 <220> <223> THL 1 <400〉 19 cgcggatcct ttatctgtta ccccgtatca aaatttagg <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213>人工 • <220> <223> THL 2 <400> 20 gaagatcttc tagcactttt ctagcaatat igc

Claims

200835793 、申請專利範圍： 1. 一種用於厭氧性製造1，3-丙二醇的方法，其係藉著 5 將梭菌屬菌株於包含甘油作為碳源之適當培養介質中培育，其中，該梭菌屬菌株實質上不產生選自包括丁酸酯，乳酸酯，丁醇及乙醇之甘油代謝的其他產物，並回收1，3-丙二醇。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，1，3-丙二醇之製造中有甘油代謝之單一氧化產物。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，該甘油代謝 10 之單一氧化產物係選自包括醋酸1旨，丙酮或二氧化碳。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中，該梭菌屬菌株僅由甘油產生1,3-丙二醇及醋酸醋。 ’ 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 15 • 中，該梭菌屬菌株係經改質以限制由甘油之代謝物製造，其生物合成途徑係消耗NADH或NADPH，但1，3-丙二醇除外。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中，至少一個編碼涉及該代謝物製造之酵素的基因被去除。 20 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中，該基因編碼涉及製造選自包括丁酸酯，乳酸酯，丁醇及乙醇之代謝物的酵素。 8· 如申請專利範圍第1至7項之方法，其中，該梭菌屬菌株包含用於製造1，3-丙二醇之官能内因性基 32 2〇〇835793 因 9· 10 15 20 如申請專利範圍第8項之方法，其中，該梭菌屬存在至少一個選自下列涉及丁酸酯形成作用中予以去除之基因： *編碼鱗-轉化丁醯酶之ptb •編碼丁酸S旨激酶之buk。如申請專利範圍第8項之方法，其中，該編瑪乳酸酯脫氫酶之所有的ldh基因皆被去除。如申請專利範圍第9或10項之方法，其中，該編碼醛-醇脫氫酶之所有的adhE基因皆被去除。 12. 如申請專利範圍第8至u項中任一項之方法其中二該梭g屬菌株係選自包括丁酸梭g及巴氏芽胞梭菌。 13. 如申請專利範圍第i至7項中任一項之方法中’該梭菌屬_株係藉由導引編碼至少—種涉及B 12=立丙二醇途徑之酵素的外源性基二改質以製造1，3-丙二醇。、 14. 如申請專㈣13項之方法，其中，經導引編碼涉及B 12-獨立1 3 ^ 的丁酸梭菌操縱子而改^ ^二_徑之酵素 A 或14項中任-項之方法，- 屬囷株於改質前可產生二種外源性基因被導y以替主乂酯形成之酵素的基因。 Q、、扁碼涉及丁酸 10 11 33 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中，該編碼涉及丁酸酯形成之酵素的基因係選自下列者：鲁編碼磷-轉化丁醯酶之ptb 鲁編碼丁酸酯激酶之buk。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中，該編碼乳酸酯脫氫酶之所有的Idh基因皆被去除。 18. 如申請專利範圍第16或17項中之方法，其中，該編碼酸·醉脫氮酶之所有的adhE基因皆被去除。 19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項之方法，其中，該梭菌屬菌株係選自包括丙酮丁醇梭菌，拜氏梭菌，糖過丁丙酮梭菌，糖丁酸梭菌，丁酸梭菌或纖維梭菌。 20. 如申請專利範圍第13或14項之方法，其中，該梭菌屬菌株於改質前可產生乙醇且至少一種外源性基因被導引以替代至少一個編碼涉及乙醇形成之酵素的基因。 21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中，該編碼涉及乙醇形成之酵素的基因係選自編碼醛-醇脫氫酶之adhE基因。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該編碼乳酸酯脫氫酶之所有的Idh基因皆被去除。 23. 如申請專利範圍第21或22項之方法，其中，該編碼酸-醇脫氫酶之所有剩餘的adhE基因皆被去除。 24. 如申請專利範圍第20至23項中任一項之方法，其 34 200835793 中，該梭菌屬菌株係選自包括熱梭菌，解糖梭菌 (現為糖熱厭氧細囷）’熱硫梭囷（現為熱疏熱厭氧細菌）或熱氳硫梭菌（現為乙醇熱厭氧細菌）者。 25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項之方法，其 5 中，氫通量被降低且減低的動力再指向1，3丙二醇之製造。 26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中，該hydA基因被減弱。 27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項之方法，其 10 中，該微生物係經改質以將醋酸酯轉化成丙酮。 28·如申請專利範圍第27項之方法，其中，該編碼涉及丙酮形成之酵素的基因為外因性者且被導引至梭菌屬菌株中。 ’ 29. —種用於發酵製造如申請專利範圍第1至25項中 15 任一項之1，3丙二醇的方法，其包括下列步驟：籲微生物發酵產生.1，3丙二醇 *·藉蒸餾法將1，3丙二醇及甘油代謝之任意單一氧化產物單離出來。 30·如申請專利範圍第1至29項中任一項之方法，其 20 中，該培養係連續的。 31.如申請專利範圍第1至29項中任一項之方法，其中’該培養係以批次製得。 32· —種如申請專利範圍第1至28項中任一項所定義之微生物。 35