TW200835793A - Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield - Google Patents
Process for the biological production of 1,3-propanediol from glycerol with high yield Download PDFInfo
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200835793 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 領逸 5 之 本發明係包括藉由代謝性工程之梭菌屬、 生物轉化反應而製造高產率之丙二醇的方、去丁甘油 【先前技術】
10 矣置背t 1,3-丙二醇為使用於聚酯纖維製造中之單码 取 胺基曱酸酯及環狀化合物之製造中具有潛在的用途於來 1,3-丙二醇可藉由不同的化學途徑從丨)U 氫ii)環氧乙烷一氧化碳與水於光氣存在之下及由 及氫於一氧化碳存在之下製造。所有此等方法具有严二 且產生含污染物質之廢氣的共通性。 、 15
1,3-丙二醇可藉由不同的梭菌以甘油之發酵作用來 製造醋酸酯/丁酸酯/乳酸酯/;1,3_丙二醇混合物。甘油進 入梭囷中之一般代謝作用係出示於圖1中。 20 於一方面中,甘油係在二階段酵素反應順序中轉化 成1,3-丙二醇。於第一步驟中,甘油脫水酶催化了甘油 轉化成3-羥基丙醛(3-HPA)及水之反應。於第二步驟 中,3-HPA係藉由NADH依賴1,3_丙二醇脫氫酶而還 原成1,3-丙一醇。多種生成1,3-丙二醇之梭菌係採用經 dhaBlB2B3結構基因編碼之B12依賴甘油脫水酶,然 而丁酸梭菌係使用經dhaBl結構基因編碼之B12獨立酵 5 200835793 素。於Bl2依賴甘油脫水酶時,orfX及oriZ編碼甘油 脫水酶再活化因子,然而於僅知之B12獨立酵素時’ dhaB2編碼S-腺核苷-甲硫胺酸(SAM)依賴活化因子。編 碼結構及活化因子之基因附近亦出現編碼1,3-丙二醇脫 5 氫酶(dhaT)之基因。由甘油製造l,3-丙二醇時係消耗 NADH 〇 於另一方面中,當甘油未轉化成丙二醇時,其 係被分別經glpk及gipA編碼之甘油激酶及甘油-3-磷酸 醋脫水酶或被甘油脫氫酶,接著被分別經dhaD及 10 dhaK1K2編碼之DHA激酶氧化成二羥基丙酮-磷酸酯 (DHAP)且伴隨著產生nadh。然後DHAP將會進入具 • 有產生丙酮酸鹽及以乙醯基_CoA作為主要中間體之甘 油途徑。丙酮酸鹽及乙醯基_c〇A可藉由經ldh基因編碼 之乳酸酯脫氫酶及經adhE編碼之雙-官能性醛-醇脫氫酶 15 分別還原成乳酸酯及乙醇。乙醯基-CoA亦可轉化成丁 醯基-CoA,其為中間體產物可被: i) 77別經Ptb及buk基因編碼之填-轉化丁醯酶及丁 酸酯激酶轉化成丁酸或 n)級adhE編竭之雙-官能性醛_醇脫氫酶還原成丁 20 || 〇 於/谷別產生的(s〇lvent〇genic)梭菌中,丙酮係由乙 I乙基-CoA (於製造丁醯基-C〇A時之中間體)分別藉 ^經ctfAB及adc基因編碼之c〇A_轉化酶及乙酸醋酸 酉曰脫羧酶所製造。氫係藉由鐵來製造,惟僅氫酶係被 6 200835793 hydA基因編碼。 天然的與重組體梭菌二者,由於經還原的化合物如 丁酸(丁酸酯),乳酸(乳酸酯),乙醇或丁醇之共生產作 用而以每克甘油生成0.55克1,3-丙二醇之最大產量。為 5 了增加1,3-丙二醇的製造量,必須避免製造所有經還原 的共-產物及伴隨著製造1,3-丙二醇成經氧化的共產 物。 不能產生丁酸酯之丙酮丁醇梭菌菌株業已說明於論 ^ 文(葛林等,1996)中。丁酸酯之形成作用由於與非-自律 10 性質體單交叉所得到之bilk基因鈍化而戲劇性地降 低。將該突變菌株用於試驗1,3-丙二醇之製造,如(康沙 雷-帕株艾洛,2005,代謝性工程)所示。此重組體菌株 有效地製造1,3-丙二醇為主要的發酵產物,但亦產生丁 • 醇,其降低了 1,3-丙二醇之產量。 15 甘油藉由梭菌之1,3-丙二醇發酵作用可以批次,進 給批次或連續培育來進行。 ® 本發明所要解決的問題是由甘油生物製造高產率 1,3丙二醇而無經還原的化合物例如,丁酸酯,乳酸 酯,或醇類伴隨產生。此製造法係用梭菌藉由厭氧性發 20 酵來進行。 【發明内容】 本發明之摘要 申請者解決了所陳明的問題且本發明係提供用於厭 7 200835793 ,人衣& i,3 m的方法,其鱗著將㈣屬菌株於 油作為碳源之適#培養介f巾培I,其中,該梭 菌屬,株貝貝上不產生選自包括丁酸醋,乳酸醋,丁醇 及乙醇之甘油代謝的其他產物,並回收i,3_丙二醇。 5 1,3-丙二醇可與甘油代謝之單一氧化產物共伴產 生。 於本發明之特別方面中,該梭菌屬菌株係經改質以 限制來自甘油之代謝物生產,其生物合成途徑為消耗 » NADH或NADPH,但13·丙二醇除外。 10 於本發明之一方面中,係將可自然製造1,3〜丙二醇 之梭菌屬菌株予以基因性改質以製造高產率之1,3-丙二 醇,其係藉著·· i) 將編碼丁酸酯激酶(buk)或礙-轉化丁醯酶(ptb)之基 因去除以避免產生丁酸酉旨 15 ϋ) 任意的將編碼乳酸酯脫氫酶(Idh)之所有的基因去 除以避免產生乳酸酯 • 出)任意的將編碼雙-官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之基因 去除以避免形成醇。 於本發明另一方面中,係將可自然製造丁酸醋但不 20 能製造丨,3·丙二醇之梭菌屬予以基因性改質以製造高產 率之1,3-丙二醇。該結果係藉著將編碼涉及丁酸酯途徑 之醭素的ptb或buk基因用編碼涉及B12獨立1,3-丙二 醇途征之酵素的丁酸梭菌操縱子替代,且: i) 任意的去除編碼乳酸酯脫氫酶(Idh)之所有的基因 8 200835793 以避免產生乳酸酯 π)任意的去除編碼雙_官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之基 因以避免形成醇而達成。 &於本發明之其他方面中,係將可自然製造乙醇但不 月匕製造丨,3·丙二醇之梭菌屬予以基因性改質以製造1,3-丙一醇。该結果係藉著將一種編碼涉及乙醇途徑之酵素 的&舰基因用編碼涉及B12獨立1,3-丙二醇途徑之酵 素的丁酸梭菌操縱子替代,且: 10 15
20 0任思的去除編碼乳酸酯脫氫酶(ldh)之所有的基因 以避免產生乳酸酯 …任思的去除編碼雙-官能性醛-醇脫氫酶(adhE)之所 有剩餘的基因,免形成醇而達成。 於本發明之另一方面中,將氫製造之通量降低且然 Ϊ降低之平衡通量藉著減弱編碼氫酶(hydA)之基因再指 向1,3-丙二醇之製造。 …二月之另β曲中,U·丙二醇製造之通量係 1 者¥引來自丁酸梭菌(編碼涉及m2獨立u-丙二醇 喊之酵素贿卜複本之U·丙二_縱子而增加。 士 @之目的亦提供利於高產率之1,3_丙二醇製造 方法中之重組财《屬菌株。 本文中所使用 及說明書。 細說吸 之下列名詞係用於詮釋申請專利範圍 9 200835793 梭菌屬π及’’梭菌"一詞係指屬於該族之所有種類的 細菌。 適當的培養介質係指最佳於特定使用之梭菌屬菌株 生長及製造二醇的培養介質。 石厌基質’’或π碳源π —詞係指任何能夠被微生物所代 謝的碳源,其中,基質含有至少一個碳原子。於本發明 中’甘油為唯一的碳源。
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20 "將微生物改質"一語係指菌株已被轉化,目的是轉 化其基因特性。内因性基因可被減弱,去除,或過度-表現。外因性基因可被質體所導引,攜帶,或總合^ 株之染色體組,於細胞中表現。 ’’減弱”一詞係指降低的基因表現或蛋白質,基 ==:=方*技藝中之人士熟知許多得Ϊ -基因中,降低此基因之表現程 經編碼之蛋白質的活性度。 4 1 =然促進子被強度低的促進子替代,導敢铰 :關訊息RNA或蛋白質不穩定的元素。 如果不藏要表現,將基因去除。 份被移去除除。:=一=指,基因之編碼序列的實質邹 佳為至少8〇%Γ ’ 7 5〇%之編石馬序列被移除,且更 本文中所用之”質體"或,,載體,,—詞係指外加的染色 200835793 且通常為 體元素經常攜帶非細胞中心代謝部份之基因 環形雙股DNA分子的型式。 於本發明之㈣書中’酵素似彼料定之活性來 5
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20 確認。因此較義係包括所有亦存在於其他生物 特別為於其他微生物中,具有經定義之特韻性的 肽。具有類似活性之酵素經常可藉由其等歸屬於 族如PFAM或COG所定義者而被確認。 PFAM(排比及隱藏的馬可夫模式之蛋白質家族資料 庫;代表大量 收集之蛋白質序列排比。各個PFAM儘可能地顯示多重 排比,觀看蛋白質區域,評估於生物中之分佈,獲准進 入其他資料庫,及顯示已知的蛋白質結構。 COGs (蛋白質之同源群組(orth〇i〇gOUS gr〇Up)叢 集;iltm:_//_>y.w:^Jigbi.nlm.nih.g〇v/COGA 係從 43 個代表 30個主要種系發生系之完整定序的染色體組中藉著比較 蛋白質序列而獲得。各個COG係從至少三個系中界 定,其同意先前保存之區域的鑑定。 鑑定同質性序列及其等百分比同質性的方法係精於 此方面技藝之人士所熟知者,且特別包含BLAST程 式,其可從http://www.ncbLnlmunih.gov/BLAST/ 網站使 用該網站中所指明之預設參數來操作。然後將所得到的
序列(例如,組合),利用程式例如,CLUSTALW f http: //w w w. eb i. ac, uk/c lu s t al w/) 或 MULT ALIN (http://prodes,toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin>pl) 11 200835793 使用那些網站上所指明之預設參數來操作。
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20 那些精於此方面技藝者使用基因庫(GenBank)中所 給定之已知基因的參考時能夠測定在其他生物,細菌菌 株,酵母,真菌,哺乳類,植物等中之相等基因。該例 行工作可使用一致序列(consensus sequence),其係藉由 與其他微生物所衍生的基因來進行序列排比而有利地完 成’且設計簡併探針(degenerate probe)而選瘦另一個生 物中之相關基因。此等分子生物學的例行方法係精於此 方面技藝者所熟知,且係說明於例如,山布魯克等 (1989分子選殖:實驗室手札第2版,冷春港實驗室, 冷春港,紐約)中。 本發明係提供用於厭氧性製造lv3_i二醇的方法, 其係藉著將梭菌屬菌株於包含甘油作為碳源之適當培養 介質中培育,其中,該梭菌屬菌株實質上不產生選自包 括丁酸酯,乳酸酯,丁醇及乙醇之甘油代謝的1 物,並回收1,3-丙二醇。 ,、產 Y實質上’’係指於培養介質中發現至多有微量的產 或甘油減低。微量宜指不干擾1,3-丙二醇回收作業 量’更佳為低於10 mM。 ' ’’甘油代謝,,一語係指甘油於細菌中發生之所 化轉化作用。此係包括有機分子之生物合成 的, 及其等之㈣(降解代謝)。某減縣纏消耗 _PH ’而其他相健生。㈣制株巾之= 谢作用係_於圖式1中。得自於代謝反應中之中間^ 12 200835793 以及最終產物稱為代謝物。 發二法之特徵在於甘油代謝係指向u 之製',卜此代謝途徑沒有其他經還原的產物例如丁 5 10 15
20 酸醋’,乙醇係、藉由梭菌屬與丙二: 共伴生成。的確,此等_原的產物之製造 知 胞之ΝΓ_ΡΗ存量。限制此消耗將使得i原= 力再指向1,3-丙二醇之製造。 、巧動 代中’該u-丙二醇係與甘油 代谢之早:乳化產物,例如醋酸酯,丙酮 伴產生二氧化的產物,,-詞係指無需消耗細胞之二ς NADPH存量所產生的產物。 有利地’製法中所使用的梭菌屬菌株僅產生υ 二醇及醋酸酯。 ’ 根據本發明,梭菌屬菌株可經改質以限制由甘油製 以除了 1,3_丙二醇外的代謝物,其生物合成途徑為消耗 NADH 或 NADPH 〇 有利地,該改質包括去除至少一個編碼涉及該代謝 物製造之酵素的基因。 特別的,此酵素涉及製造選自包括下列之代謝物: 丁酸酯,乳酸酯,丁醇及乙醇。 於本發明之特定具體例中,梭菌屬菌株係自然地製 這1’3_丙一醇,因為其包括編碼涉及ι,3_丙二醇生物合 成之酵素的官能性内因性基因。此等基因特別為:甘油 脫水酶及1,3-丙二醇脫氫酶。 13 200835793 該菌株可經基因性改質以產生m 的產物’其係藉著將至少一個編碼填_轉
或丁酸驗酶(buk)之基因予以去除以 轉化成丁酸酯。 I基-C〇A 5 於另-個狀的具體例中,該梭菌屬菌株亦將 :酸醋脫虱酶⑽)之所有的基因去除以阻斷乳酸酿產
10 雙官======= 產生 將梭菌中之基因去除可使用最近於專利申情 PCT/ EP2006/066997中所說明的方法來完成,其容許& 將要去除的基因用紅黴素抗藥性基因替代及⑴藉由表 現FLP重組酶移除紅黴素抗藥性基因。 15
20 有利地,梭菌屬菌株係選自包括丁酸梭菌及巴氏芽 胞梭菌者。 於本發明之特定具體例中,梭菌屬菌株必須予以改 質以便能夠製造1,3-丙二醇。該改質包括導引至少一個 編碼涉及B-12獨立1,3-丙二醇途徑之酵素的外源性基 因。此等基因可為dhaBl,dhaB2,dhaT但不偈限於 此0 有利地,該菌株係藉著導引編碼涉及B12-獨立1,3-丙二醇途徑之酵素的丁酸梭菌操縱子而改質。操縱子挿 入染色體中可使用最近於專利申請案PCT/EP2006/ 14 200835793 066997中所說明的方法來完成。 f夺發明之特定具體例中,所使用的梭菌屬菌株於 :貝=係自然地產生丁酸醋,但*能產生1,3-丙二醇; 該巧的梭菌屬係經基因性改質以產生1,3_丙三醇,其 5 1藉著將至少一個編碼涉及丁酸酯形成之酵素,特別是 η轉化丁鉍酶③化)或丁酸酯激酶作此)的基因,用一個 、扁馬涉及B-12獨立13—丙二醇途徑之酵素的外源性基 因來替代,其目的是: —阻斷丁醯基-c〇A轉化成丁酸酯且 10 -容許於此菌株中由甘油產生1,3-丙二醇。 於染色體中挿入操縱子及去除基因可使用最近於專 利申請案PCT/Ep2〇〇6/066997中所說明的方法來完成。 於该梭菌屬菌株中優先地將編碼乳酸酯脫氫酶(1 d h) 之所有的基因去除以阻斷乳酸酯產生。 15 卜於該梭菌屬菌株中優先地將編碼雙-官能性醛-醇脫 氫酶(adhE)之所有的基因去除以阻斷醇產生。 •有利地’該梭菌屬菌株係選自包括丙酮丁醇梭菌, 拜氏梭菌,糖過丁丙酮梭菌(c sacchar〇perbmyl_ acetonicmn) ’糖丁酸梭菌,丁酸梭菌或纖維梭菌(c. 20 cellulolyticum)者。 於本發明之特定具體例中,梭菌屬於改質前可自然 產生乙醇,但不能產生1,3-丙二醇;該菌株係經基因性 改質而產生1,3_丙二醇,其係將至少_個編碼雙_官能性 醛-醇脫氫酶(adhE)之基因用至少一種編碼涉及B12獨立 15 200835793 1,3-丙一醇途徑之酵素的外源性基因來替代。此外源性 基因優先為編瑪涉及B12獨立1,3-丙二醇途徑之酵素的 丁酸梭菌操縱子。 該替代導致: 5 —乙醯基_C〇A*化成乙醇之反應降低,且 -由甘油產生1,3_丙二醇。 較佳者’於此梭菌屬菌株中,編碼乳酸酯脫氫酶 (Idh)之所有的基因被去除以抑制乳酸酯產生。 較佳者’於此梭菌屬菌株中,編碼雙—官能性_醇脫 10 氳酶(adhE)之所有剩餘的基因被去除以阻斯醇產生。 於梭菌屬染色體中挿入操縱子且去除前文所引用的 基因可藉由使用最近於專利申請案pCT/Ep2〇〇6/〇66997 中所說明的方法來完成。 _ 有利地,該梭菌屬菌株係選自包括熱纖梭菌,解糖 15 板囷(現為糖熱厭氧細菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)) ’ 熱硫梭菌(c· thermo-sulfurogenes ) • (現為熱石爪熱厭氧細菌(Thermoanaer〇bacter thermosulfurigenes))或熱氫硫梭菌(C· thermohydrosulfuricum)(現為乙醇熱厭氧細菌(Therm〇_ 20 anaerobacter ethanolicus))者。 於本發明之特定具體例中,梭菌屬菌株具有降低的 虱製造通量且因而表現出將減低當量之通量再指向製造 1,3丙二醇。該結果可藉由各種方法來達成,且特別的 可藉由削弱編碼氫酶(hydA)(其係一種以製造氫的形式對 200835793 降低的當量提供貯存區(sink))的基因來達成。削弱 HydA時,可藉著將天然的促進質子用強度較低的促進 子來替代,或藉由使用元素使相關的訊息rNA或蛋白 質不穩定來達成。如果需要,亦可藉著將相關DNa序 列部份或完全去除而達到將基因完全削弱。
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20 於本發明之另一個具體例中,所使用的梭菌屬菌株 呈現1,3_丙二醇製造的通量增加;該結果係藉導弓丨來自 丁酸梭菌(編碼涉及B12獨立1,3-丙二醇途徑之酵素)之 額外的1,3-丙二醇操縱子,藉由質體過度_表現或整合至 重組體梭菌屬之染色體而達成。例如,pSPD5質體可用 於1,3_丙二醇操縱子之過度_表現。 於本發明之另一方面中,梭菌屬菌株係經改質而能 夠將醋酸酯轉化成丙酮。此改質法可藉著將人造的,,丙 酮操縱子,,(其含有分別編碼硫解酶,c〇A_轉化酶及乙 酿-醋,旨脫_之tM,ctfAB及adc基因)導入微生物 中而%•到’这二種酵素涉及丙嗣了冑梭菌及拜氏梭菌中 =丙酮之形成。此人造操縱子可藉由質體攜帶或可被整 &至經轉化之梭菌屬的染色體中。 客於另-個具義巾’本發明係提仙於發酵製備高 產率1,3-丙二醇的方法,其包括: ⑷將梭菌屬菌株與甘油接觸而用於發酵法因而產生 1,3-丙二醇, ⑻2顧法將m醇及任意的甘油代謝之單一氧 化產物(主要為醋酸酯或丙酮)單離出來。 17 200835793 可以了料所辅·基質。 此方面減Ϊ 批m及連續法進行。精於 定根據本發明之微生物的培育二並界 2〇ΐ及6(TC間,造n始^件扣別的,梭菌係在
ίο 15 温的錢宜於45ΐ及6叱間之溫度發酵。c間且書 本發明亦’如前文中所說明的微生物 m,列者:丁酸梭菌,巴氏芽ξ梭 口 _δ丁醇杬囷,拜氏梭菌,糖過丁丙酮梭菌,糖丁 酸梭菌,丁酸梭菌,纖維梭菌,熱纖梭菌,解糖梭菌 (現為糖熱厭氧細g),熱硫㈣(現為熱硫熱厭氧細菌) 或熱氫硫梭菌(現為乙醇熱厭氧細菌)。 【實施方式】 • 實例1
產生1,3-丙二醇及不能產生丁睃酯及丁醇之重組體丙 酮丁醇梭菌的構築:丙酮丁醇梭菌ApSOLlAcacl515 20 ΔιιρρΔ buk::PDO 為了得到可經基因複製且不能產生丁醇及丙酮的菌 株,吾人首先由丙酮丁醇梭菌Acacl515Aupp菌株(說明 於專利申請案PCT/EP2006/066997中)處理ps〇Ll巨質 體(megaplasmid),其係藉著i)於葡萄糖MS介質中進 18 200835793 行20次-培養且ii)藉著於瓊脂皿上(含有澱粉(2%)及葡 萄糖(0·2%),如沙巴席等(2003)所說明者)選出可產生殿 粉水解小暈圈之菌落,以鑑定丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAcacl515 Aupp菌株。為了去除buk基因且由丁 5 酸梭菌導入丨,3-丙二醇操縱子,係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同 貝性重組體方法。整合於pCons::upp載體中來自丁酸梭 囷之1,3·丙二醇操縱子之buk去除1£係構築如下。圍繞 buk之二個DNA斷片係經具有來自丙酮丁醇梭菌之總 10 DNA的Pwo聚合酶作為模板及二個特定寡聚核苷酸對 予以 PCR 放大。以 BUK 1-BUK 21 及 BUK 31_BUK 4 引子對,分別得到二個DNA斷片。引子BUK 1及BUK 4二者係導引BamHI位置,而引子BUK 21及BUK 31 具有互補區其導引pvull及Nrul位置。將DNA斷片 15 BUK 1_BUK 21 及 BUK 31-BUK 4 係在以引子 BUK 1 及 BUK 4之PCR融合實驗中連接,且將產生的斷片於 . pCR4-TOPO-Blunt 中選殖以產生 pTOPO:buk。於
pTOPO:buk獨特之nrul位置上,將兩邊皆具有FRT序 列之抗生素抗藥性MLS基因從pUC18-FRT-MLS2之 20 1372 bp StuI斷片中導引出來。於所產生質體之hmHI 消化後將所得到之BUK去除匣選殖至pCons::upp中 BamHI位置上以產生pREPABUK二upp質體。於 pREPABUK::upp獨特之pvull位置上,將1,3-丙二醇操 縱子作為pSPD5質體經4854bpBlunt端Klenow處理的 200835793
Sail斷片而導引。 pREPABUK::PDO::upp質體係藉由電穿孔丙酮丁醇 梭菌ApSOLlAcaclSAupp菌株而使用於轉化。於陪替氏 培養皿上選出對抗紅黴素(40微克/亳升)之選殖後,;— 5 菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之甘油液態合成介 質中達24小時且將100微升未稀釋之培養物平板塗抹 至具有40微克/毫升紅黴素及400#M 5-FU之RCGA (經強化的梭菌屬介質,其中甘油取代澱粉及葡萄糖作 ® 為碳源)上。將對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接 10 種至具有40微克/毫升紅黴素之RCA上及具有5〇微克/ 毫升曱磺氯黴素之RCA上,以選出其中5Jpu抗藥性亦 伴隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對甲 磺氯徽素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析(具有弓丨 子BUK 0及BUK 5位於buk去除匣外面)來檢查。 15 將 已喪失 pREPAbuk“upp 之
ApS0LlAcacl5AuppAbuk:: PDO::mlsR 菌株單離出來。 • ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO::mlsR 菌株係用來自 啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLFl.l載體 予以轉化。於陪替氏培養孤上轉化且選出對抗甲石黃氯黴 20 素(50微克/毫升)之選殖後,將一菌落培育於具有50微 克/毫升曱磺氯黴素之合成液體介質上且將適當的稀釋 液平板塗抹至具有50微克/毫升甲磺氯黴素之RCA 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/ 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升曱磺氯黴素 20 200835793 之RCA上。具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性之 菌落的基因型係藉由具有引子BXJK 〇及BUK 5之PCR 分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥 性之Acacl5AuppAbuk菌株之二個連續24小時之培養物 5 以便去除 pCLFl.l 。將已去除 pCLFl.l 之
ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO菌株根據其對紅黴素及 曱磺氯黴素二者之敏感性予以單離。
表1 10 名稱
Bukl Buk21 Buk31 Buk4 Buk 0 Buk 5
引子序列 aaaaggatcctagtaaaagggagtgtacgaccagtg ggggcagctggtcgcgaaaaaaggggggattattagtaatctatacatgttaacattcctccac cccccttttttcgcgaccagctgccccacttcttgcacttgcagaaggtggac aaaaggatcctctaaattctgcaatatatgccccccc_ ataacaggatatatgctctctgacgcgg gatcatcactcattttaaacatggggcc_ 實例2 不能產生丁酸酯,丙酮及乳酸酯之菌株的構築:丙酮 丁 醇梭菌 ApSOLlAcacl515AuppAbuk::PDOAldh 15 為了去除ldh基因,係使用克勞斯及索凱爾(2006) 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重 組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入,同時去除 21 200835793 大部份有關的基因。將pCons::upp中之ldh去除匣構築 如下。 圍繞ldh (CAC267)之二個DNA斷片係經具有來自 丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特 5 定寡聚核苷酸對予以PCR放大。以LDH 1-LDH 2及 LDH 3-LDH 4引子對,分別得到1135 bp及1177 bp DNA斷片。引子LDH 1及LDH 4二者係導引BamHl位 置,而引子LDH 2及LDH 3具有互補區其導引stul位 置。將 DNA 斷片 LDH 1-LDH 2 及 LDH 3-LDH 4 係在 10 以引子LDH 1及LDH 4之PCR融合實驗中連接,且將 所產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選殖以產生 PTOPO.LDH。於pTOPO:LDH獨特之Stul位置上,將 兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS基因從 PUC18-FRT-MLS2之1372 bp Stul斷片中導引出來。於 !5 產生之質體BamHl消化後將所得到之UPP去除匣選殖 至 pConszupp 中 BamHl 位置上以產生 pREPMJ)H::upp ® 質體。 pREPALDH: ••upp質體係藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDO菌株而使用於轉化。於 20 陪替氏培養皿上(在RCGA上)選出對抗紅黴素(40微克/ 毫升)之選殖後,將一菌落培育於具有4〇微克/毫升紅黴 素之液態甘油合成介質中達24小時且將1〇〇微升未稀 釋之培養物平板塗抹至在具有40微克/毫升紅黴素及 400//M 5-FU之RCGA上。將對抗紅黴素及5_FU二者 22 200835793 之菌落以影印接種至具有4〇微克/毫升紅黴素之RGCA 上及具有50微克/毫升甲磺氯黴素之RGCA上,以選出 其中5-FU抗藥性亦伴隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。 對紅Μ素抗藥及對曱石黃氯黴素敏感之菌落的基因型係藉 5 由PCR分析(具有引子LDH 0及LDH 5位於Idh去除匣 外面)來檢查。將已喪失pREpALDH::upp之 △△pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh:: mlsR 菌株單離出 來。 ’ Δρ8〇υΔοαο15ΑιιρρΔΙη±::ΡΟΟΔ1(11ι“ιηΐ8Κ 菌株係用 10 來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLFl.l 載體予以轉化。於陪替氏培養jBI上轉化且選出對抗甲石黃 氯黴素(50微克/毫升)之選殖後,將一菌落培育於具有 50微克/毫升曱石黃氣黴素之合成夜體介質上且將適當的 稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升曱續氣黴素之rcA 15 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/ 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲續氯黴素 _ 之RCA上。具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之 菌落的基因型係藉由以引子LDH 0及LDH 5之PCR分 析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性 20 之ApSOLlAcacl5A uppAbuk::PDOAldh 菌株之二個連續 24小時之培養物以便去除pCLFl.l。將已去除pCLFl.l 之八卩801^1八〇&〇15厶叩卩八13111<:::?00八1(111菌株根據其對紅 黴素及曱磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 23 200835793 表2
名稱 引子序列 Ldh 1 AAAAGGATCCGCTTTAAAATTTGGAAAGAGGAAGTTGTG Ldh2 GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTTAGAAATCTTTAAAAATTT CTCTATAGAGCCCATC Ldh 3 CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGGTAAAAGACCTAAACTCCAAG GGTGGAGGCTAGGTC Ldh 4 AAAAGGATCCCCCATTGTGGAGAATATTCCAAAGAAGAAAATA ATTGC Ldh 0 CAGAAGGCAAGAATGTATTAAGCGGAAATGC Ldh 5 CTTCCCATTATAGCTCTTATTCACATTAAGC 實例3 具有較低氫產生之菌株的構築:丙嗣丁醇梭菌
ApSOLlAcac 1515AuppAbuk::PDOAldhAhydAA 為了去除hydA基因,係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之 同質性重組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿 入’同日守去除大部份有關的基因。pC〇ns::Upp中hydA 去除匣係構築如下。
圍繞hydA (CAC028)之二個DNA斷片係經具有來 自丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二 個特定券聚核苷酸對予以pCR放大。以HYd 1-HYD 2及HYD 3-HYD 4引子對,分別獲得1269 bp及1317 bp DNA斷片。引子hyd 1及HYD 4二者係導引 24 200835793
BamHI位置,而引子HYD 2及HYD 3具有互補區其 導引StuI位置。將DNA斷片HYD 1-HYD 2及HYD 3-HYD 4係在以引子HYD 1及HYD 4之PCR融合實 驗中連接,且將產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選 5 殖以產生PT0P0:HYD。於pTOPO.HYD獨特之StuI
位置上,將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS 基因從pUC18_FRT-MLS2之1372 bp StuI斷片中導引 _ 出來。於產生之質體BamHI消化後將所得到之UPP 去除匣選殖至pCons::upp中BamHI位置上以產生 10 pREPAHYD::upp 質體。 將pREPAHYD::upp質體藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △PSOL1Acacl5AuppAbuk::PDOAldh 菌株而使用於轉 化。於陪替氏培養皿上(RCGA)選出對抗紅黴素(40微 克/¾升)之選殖後,將一菌落培育於具有4〇微克/毫升 15 紅被素之甘油液態合成介質中達24小時且將1 〇〇微升 未稀釋之培養物平板塗抹至具有40微克/毫升紅黴素 驗及400//M 5-FU之RCA上。將對抗紅黴素及5_FU二 者之菌落以影印接種至具有40微克/毫升紅黴素之 RCGA上及具有50微克/毫升曱磺氯黴素之RCA上, 20 以選出其中5_FU抗藥性亦伴隨著曱磺氯黴素敏感性 之菌落。對紅黴素抗藥及對曱磺氯黴素敏感之菌落的 基因型係藉由PCR分析(具有引子HYD 0及HYD 5位於 hydA去除匣外面)來檢查。將已喪失之 △pSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldhA hydA::mlsR 菌株 25 200835793 單離出來。
ApS0LlAcacl5AuppAbuk::PD0AldhAhydA::mlsR 菌 株係用來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Fipl基因之 pCLFl.l載體予以轉化。於陪替氏培養皿上轉化且選 5 出對抗甲石黃氟撤素(5〇微克/毫升)之選殖後,將一菌落 培育於具有50微克/¾升曱石黃氣黴素之合成液體介質 上且將適當的稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升甲 石買氣傕i:素之RCA上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接 種至具有40微克/毫升紅黴素之RCA上及具有50微 10 克/毫升曱磺氯黴素之RCA上。具有紅黴素敏感性及 甲磺氯黴素抗藥性之菌落的基因型係藉由具有引子 HYD 〇及HYD 5之PCR分析來檢查。進行具有紅黴 素敏感性及曱石黃氯黴素抗藥性之 ApS0LlAcacl5AuppMmk::PD0AldhAhydA 菌株之二個 15 連續24小時之培養物以便去除pCLFl.l。將已去除 pCLF 1 · 1 之 ApSOL 1 Acac 15AuppAbuk:·· PDOAldhAhydA B 菌株根據其對紅黴素及甲磺氯黴素二者之敏感性予以 單離。 26 200835793 表3 名稱 引子序列 Hyd 1 Hyd 2 Hyd 3 AAAAGGATCCGCCTCTTCTGTATTATGCAAGGAAAGCAGCTGC GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTATATAAAATAAATGTGCCTTAA CATCTAAGTTGAGGCC CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGTTTATCCTCCCAAAATGTAAAAT A TAATTAAAATATATTAATAAACTTCGATTAATAAACTTCG AAAAGGATCCCCTTTTAGCGTATAAAGTTTTATATAGCTATTG Hyd 4 Hyd 0 Hyd 5 CATGTTCTATTGTTACTATGGAAGAGGTAGTAG GCAGTTATTATAAATGCTGCTACTAGAGC 實例4 具有增加1,3-丙二醇途徑通量之菌株的構築:丙酮丁 醇梭菌 ApSOLlAeacl515AuppAbuk::PDOAldh pSPD5 為了構梁將甘油以較南通量轉化成1,3-丙二醇及 醋酸酯之菌株,吾人導引pSPD5質體(說明於於專利 申請案W001/04324中)其表現為來自丁酸梭菌B12獨 立1,3-丙二醇途徑之操縱子。將該pSpD5質體藉由電 牙孔丙酮丁 醇梭囷 ApSOLlAcacl5AuppAbuk::PDOAldh 菌株而使用於轉化。於陪替氏培養皿上(RCGA)選出對 抗紅黴素(40微克/毫升)之選殖後,將一菌落培育於具 有40微克/毫升紅黴素之甘油液態合成介質中達24小 日t且用來萃取具有限制態樣特徵之質體。 27 200835793 實例5 產生1,3-丙二醇及丙酮之菌株的構築:丙酮丁醇梭菌 ApSOLlAcacl515AuppAbuk::PDOAIdh pSOS95 till
10 15
20 為了構築將醋酸酯轉化成丙酮之菌株,將表現合 成丙酮操縱子之pSOS 95 thl質體予以構築。為了此目 的’將編碼硫解酶(來自丙酮丁醇梭菌)之基因導引 於業已表現為ctfAB及adc基因合成操縱子之?3〇395 載體(基因庫登記號碼AY187686)的BamHI位置上。 5亥thl基因係經具有來自丙酮丁醇梭菌總DNA之Pwo 聚合酶作為模板及二個特定寡聚核苷酸對予以PCR放 大。以THL 1-THL 2引子對’獲得L2 kbp DNA斷片 且用BamHI及BglII消化,該二個限制位置係分別由 引子THL 1及THL2所導引。連結至經BamhI消化之 PSOS95 後,獲得 pS〇S95_thl 質體。將此 pS〇s95 tw 質體藉由電穿孔丙酮丁醇梭菌 △pS〇LUCacl5AupMbuk:: PD〇Aldh 菌株而使用於轉 H陪替氏培養皿(RCGA)上選出對抗紅黴素(40微 之選輯,將―^落培育於具有4G微克/毫升 =素之甘油液態合成介質中達24切且·萃取具 有限制態樣特徵之pSOS95-thl質體。 、 28 200835793
表4 名稱 引子序列 THL1 cgcggatcctttatctgttaccccgtatcaaaatttagg THL2 gaAGATCTTCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGC 實例6 產生1,3-丙二醇之菌株的批次發酵 菌株首先係在添加有2·5克/升醋酸銨且用甘油替 代葡萄糖之厭氧性燒瓶培養物中,於索尼等(索尼等, 1986,微生物生物技術應用32 : 120-128)所說明之合 成介質中分析。於35°C將過夜培養物用於接種30毫 升培養物至〇·〇5之OD600上。將培養物於35°C培育 達3天後,藉由HPLC使用分離用之Biorad HPX 97H 管柱及偵測用之折射計來分析甘油,有機酸及1,3_丙 二醇。 隨即將具有正確表現型之菌株,於300毫升發酵 器(DASGIP)中,於製造條件下使用厭氧批次實驗步驟 進行試驗。 為了此目的,於發酵器中填充250毫升合成介 質,用氮噴撒達30分鐘且將25毫升預培養物接種至 介於0·05及0·1間(OD600毫微米)之光密度。 培養物之溫度於35°C維持恆定且使用ΝΗ4ΟΗ溶 液將pH調整至永遠為6.5。於發酵中之振盪速率維持 29 200835793 在 300rpm 〇 實例7 產生1,3-丙二醇及酷酸醋菌株之連續性發酵 將產生1,3-丙二醇及醋暖酷最好的菌株於化學怪 定培養中’於索尼等(索尼等’ 1987,微生物生物技術 應用)所說明之合成介質中’除了以甘油替代葡萄糖 外’進行分析。於3穴將_料物雜至使用厭氧 性化學恆定實驗步驟之·毫升發酵。 為了此目的,於發酵器中填充25〇毫升合成介 質,用氮喷灑達30分鐘且將25毫升預培養物接種至 川於0.05及0·1間(OD600晕微米)之光密度。於% C ’ pH 6·5 (使用:ΝΗ4〇Η溶液予以調整)及3〇〇11)111振 运速率下批次培養12小時後’將發酵器用不含氧之合 成介質以0·05小時-1之稀釋速率予以連續填充,同時 藉由依序將發酵的介質移除而使體積維持恆定。於使 用如前文所說明之HPLC流程進行產物分析後接著測 定培養物之穩定性。 參考文獻 洛Μ,梅尼爾-沙爾斯I二曼迪斯f ^ 康塞羅I,索凱爾ρ 丙_丁醇梭菌用於由甘油工業製造1,3-丙二醇之 代謝性工程。 代謝工程 2005,; 7 ·· 329-36。 30 200835793
FB 中藉由基因不活化之 ,波恩,哈里期 jj' 基斯 ΕΤ,斑 5 於丙酮丁醇梭菌ATCC 824 酸形成途徑的基因操作法處理。 微生物學 1996,142 : 2079-86。 童尼Β· K·,索凱爾p,,古焉〇. • 連續的丙嗣丁醇發酵作用:維生素於丙酮丁醇播 菌代謝活性上之影響。 _ 10 微生物生物技術應用1987,27 : 1、5。 . 【圖式簡單說明】 併入且構成本說明書之一部份的附帶圖式舉例說 明了本發明且與說明書一起用於解释本發明之原理。W 15 圖1描述不同梭菌之中心代謝作用 1 :丙酮酸酯-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶;2 :硫 解酶;3 : /5-經基丁酸基-CoA脫氳酶;4 :巴豆酶 (Crotonase) ; 5 : 丁醯基_CoA脫氫酶;6 :乳酸酯脫氫 酶;7 :磷-轉化乙醯酶;8 :醋酸酯激酶;9 :乙縮醛 2〇 乙醇脫氫酶;10 :氫酶;11 : CoA轉化酶(乙醯乙酸 基-CoA :醋酸酯/丁酸酯·· CoA轉化酶);12 ··乙酿酷 酸酯脫羧酶;13 ··磷-轉化丁醯酶;14 ·· 丁酸醋激酶’ 15 ·· 丁醛-丁醇脫氫酶;16 ··甘油脫水酶;17 · I3丙 二醇脫氫酶。 31 200835793 1,3丙二醇ST25序列清單 序列表
<110> METABOLIC EXPLORER <12C)>用於由甘油生物製造高產率1,3-丙二醇之方法 <130> 350459 D24893 <160> 20 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> Buk 1 <400〉1 36 aaaaggatcc tagtaaaagg gagtgtacga ccaglg <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Buk 21 <400> 2 60 64 ggggcagctg gtcgcgaaaa aaggggggat tattagtaat ctatacatgt taacattcct ccac 3SAU 0>1>2>3> 1 1 u 1 <2<2<2<2 <220> <223> Buk 31 <400〉 3 cccccttttt tcgcgaccag ctgccccact tcttgcactt gcagaaggtg gac <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> 人工 , <220> <223> Buk 4 <400〉 4 aaaaggatcc tctaaattct gcaatatatg ccccccc 53 37 A工528DN人 0>1>2>3> IX Tx lx 11 <2<2<2<2 <220> <223> Buk 0 <400> 5 ataacaggat atatgctctc tgacgcgg 28 第1頁 2008357931,3丙二醇ST25序列清單 <210> 6 <211〉 28 <212> DNA <2!3> 人工 <220> <223> Buk 5 <400〉 6 gatcatcact cattttaaac atggggcc 28 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213>人工- <220> <223> Ldh 1 <400〉 7 aaaaggatcc gctttaaaat ttggaaagag gaagttgtg 39 <210> δ •<211> 56 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Ldh 2 <400> 8 ggggaggcct aaaaaggggg ttagaaatct ttaaaaattt ctctatagag cccatc 56 A工 957DN人 0>1>2>3> Tx lx lx 11 <2<2<2<2 <220〉 * <223> Ldh 3 <400> 9 cccccttttt aggcctcccc ggtaaaagac ctaaactcca agggtggagg ctaggtc 57 1048DN人 0>1>2>3> 11 IX ΤΑ lx <2<2<2<2 <220> <223> Ldh 4 <400〉 10 aaaaggatcc cccattgtgg agaatattcc aaagaagaaa ataattgc 48 A工 1131DN人 0>1>2>3> 11 11 1 lx <2<2<2<2 <220〉 <223> Ldh 0 <400〉 11 cagaaggcaa gaatgtatta agcggaaatg c 31
<210> 12 <211〉31 <212> DNA 第2頁 31200835793 <213〉人工 <220> <223> Ldh 5 <400〉 12 cttcccatta tagctcttat tcacattaag c 1,3丙二醇ST25序列清單 <210> 13 <211〉 43 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Hyd 1 <400〉 13 aaaaggatcc gcctcttctg tattatgcaa ggaaagcagc tgc 43 <210〉 14 <211> 59 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Hyd 2 <4O0> 14 ggggaggcct aaaaaggggg tatataaaat aaatgtgcct taacatctaa gttgaggcc 59 <210> 15 <211> 85 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> Hyd 3 <400〉 15 cccccttttt aggcctcccc gtttatcctc ccaaaatgta aaatataatt aaaatatatt 60 aataaacttc gattaataaa cttcg 85 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> Hyd 4 <400> 16 aaaaggatcc ccttttagcg tataaagttt tatatagcta ttg 43 > > > > 0 12 3 ΙΑ IX 1 1 <2<2<2<2 1733DN人 <220> <223> Hyd 0 <400> 17 catgttctat tgttactatg gaagaggtag tag <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213>人工 第3頁 33 200835793 1,3丙二醇ST25序列清單 <220> <223> Hyd 5 <400> 18 gcagttatta taaatgctgc tactagagc <210> 19 <21I> 39 <212> DNA <213>人工 <220> <223> THL 1 <400〉 19 cgcggatcct ttatctgtta ccccgtatca aaatttagg <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213>人工 • <220> <223> THL 2 <400> 20 gaagatcttc tagcactttt ctagcaatat igc
Claims (1)
- 200835793 、申請專利範圍: 1. 一種用於厭氧性製造1,3-丙二醇的方法,其係藉著 5 將梭菌屬菌株於包含甘油作為碳源之適當培養介質 中培育,其中,該梭菌屬菌株實質上不產生選自包 括丁酸酯,乳酸酯,丁醇及乙醇之甘油代謝的其他 產物,並回收1,3-丙二醇。 2. 如申請專利範圍第1項之方法,其中,1,3-丙二醇 之製造中有甘油代謝之單一氧化產物。 3. 如申請專利範圍第2項之方法,其中,該甘油代謝 10 之單一氧化產物係選自包括醋酸1旨,丙酮或二氧化 碳。 4. 如申請專利範圍第3項之方法,其中,該梭菌屬菌 株僅由甘油產生1,3-丙二醇及醋酸醋。 ’ 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法,其 15 • 中,該梭菌屬菌株係經改質以限制由甘油之代謝物 製造,其生物合成途徑係消耗NADH或NADPH, 但1,3-丙二醇除外。 6. 如申請專利範圍第5項之方法,其中,至少一個編 碼涉及該代謝物製造之酵素的基因被去除。 20 7. 如申請專利範圍第6項之方法,其中,該基因編碼 涉及製造選自包括丁酸酯,乳酸酯,丁醇及乙醇之 代謝物的酵素。 8· 如申請專利範圍第1至7項之方法,其中,該梭菌 屬菌株包含用於製造1,3-丙二醇之官能内因性基 32 2〇〇835793 因 9· 10 15 20 如申請專利範圍第8項之方法,其中,該梭菌屬存 在至少一個選自下列涉及丁酸酯形成作用中予以去 除之基因: *編碼鱗-轉化丁醯酶之ptb •編碼丁酸S旨激酶之buk。 如申請專利範圍第8項之方法,其中,該編瑪乳酸 酯脫氫酶之所有的ldh基因皆被去除。 如申請專利範圍第9或10項之方法,其中,該編 碼醛-醇脫氫酶之所有的adhE基因皆被去除。 12. 如申請專利範圍第8至u項中任一項之方法其 中二該梭g屬菌株係選自包括丁酸梭g及巴氏芽胞 梭菌。 13. 如申請專利範圍第i至7項中任一項之方法 中’該梭菌屬_株係藉由導引編碼至少—種涉及B 12=立丙二醇途徑之酵素的外源性基二改質 以製造1,3-丙二醇。 、 14. 如申請專㈣13項之方法,其中, 經導引編碼涉及B 12-獨立1 3 ^ 的丁酸梭菌操縱子而改^ ^二_徑之酵素 A 或14項中任-項之方法,- 屬囷株於改質前可產生 二 種外源性基因被導y以替 主乂 酯形成之酵素的基因。 Q、、扁碼涉及丁酸 10 11 33 16. 如申請專利範圍第15項之方法,其中,該編碼涉 及丁酸酯形成之酵素的基因係選自下列者: 鲁編碼磷-轉化丁醯酶之ptb 鲁編碼丁酸酯激酶之buk。 17. 如申請專利範圍第16項之方法,其中,該編碼乳 酸酯脫氫酶之所有的Idh基因皆被去除。 18. 如申請專利範圍第16或17項中之方法,其中,該 編碼酸·醉脫氮酶之所有的adhE基因皆被去除。 19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項之方法,其 中,該梭菌屬菌株係選自包括丙酮丁醇梭菌,拜氏 梭菌,糖過丁丙酮梭菌,糖丁酸梭菌,丁酸梭菌或 纖維梭菌。 20. 如申請專利範圍第13或14項之方法,其中,該梭 菌屬菌株於改質前可產生乙醇且至少一種外源性基 因被導引以替代至少一個編碼涉及乙醇形成之酵素 的基因。 21. 如申請專利範圍第20項之方法,其中,該編碼涉 及乙醇形成之酵素的基因係選自編碼醛-醇脫氫酶 之adhE基因。 22. 如申請專利範圍第21項之方法,其中,該編碼乳 酸酯脫氫酶之所有的Idh基因皆被去除。 23. 如申請專利範圍第21或22項之方法,其中,該編 碼酸-醇脫氫酶之所有剩餘的adhE基因皆被去除。 24. 如申請專利範圍第20至23項中任一項之方法,其 34 200835793 中,該梭菌屬菌株係選自包括熱梭菌,解糖梭菌 (現為糖熱厭氧細囷)’熱硫梭囷(現為熱疏熱厭氧細 菌)或熱氳硫梭菌(現為乙醇熱厭氧細菌)者。 25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項之方法,其 5 中,氫通量被降低且減低的動力再指向1,3丙二醇 之製造。 26. 如申請專利範圍第25項之方法,其中,該hydA基 因被減弱。 27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項之方法,其 10 中,該微生物係經改質以將醋酸酯轉化成丙酮。 28·如申請專利範圍第27項之方法,其中,該編碼涉 及丙酮形成之酵素的基因為外因性者且被導引至梭 菌屬菌株中。 ’ 29. —種用於發酵製造如申請專利範圍第1至25項中 15 任一項之1,3丙二醇的方法,其包括下列步驟: 籲微生物發酵產生.1,3丙二醇 *·藉蒸餾法將1,3丙二醇及甘油代謝之任意單一氧 化產物單離出來。 30·如申請專利範圍第1至29項中任一項之方法,其 20 中,該培養係連續的。 31.如申請專利範圍第1至29項中任一項之方法,其 中’該培養係以批次製得。 32· —種如申請專利範圍第1至28項中任一項所定義 之微生物。 35
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