CN105051179B

CN105051179B - 重组微生物和其用途

Info

Publication number: CN105051179B
Application number: CN201380045791.3A
Authority: CN
Inventors: A·P·米勒; M·科普克
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: US9284564B2; CA2882276C; CA2882276E; EP2890778B1; WO2014036152A1; JP6302471B2; JP2015526105A; EP2890778A1; KR20150045447A; CN105051179A; CA2882276A1; EP2890778A4; IN2015DN01365A; KR102121888B1; SG11201501254RA; US20140065698A1

Abstract

自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)中的一种立体特异性酶允许将外消旋丙二醇转化为丙酮和/或丙醛。对映异构起始物质产生不同产物。必要时，所述产物可以还原以形成醇。所述反应可以在各种宿主细胞中进行，以便各种物质可以用作碳和/或能量来源。

Description

重组微生物和其用途

技术领域

本发明涉及一种将丙-1,2-二醇转化为丙-2-酮和丙醛的酶促反应，和一种通过使底物微生物发酵来产生包括丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的产物的方法。

背景技术

迄今为止，大多数化学品，例如丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇、丙烯或异丁烯来源于石油化学来源。随着原油全球储备减少和来自发展中国家的需求增加，对石油供应与需求的压力将增长并且替代性生物基化学品正在开发中。使用粮食或非粮食作物产生基于糖或纤维素的原料的生物化学品的当前产生可能具有关于土地利用、粮食安全和供应源波动的缺陷以及环境问题。

丙-2-酮是一种重要溶剂，其在美国的年需求量是2百万公吨/年。丙-2-醇以3百万公吨/年的容量用作用于涂料或工业过程的溶剂。1-丙醇在药物和化妆品的生产中是重要的，并且被视为燃料替代品。异丁烯是一种用于众多化学品的化学结构单元和关键前体。估计全世界对异丁烯的需求已经超过1千万公吨/年并且其市值是250亿美元。

长期以来已经认为，催化过程可以用以将主要由CO和/或CO和氢气(H₂)组成的气体转化为多种燃料和化学品。然而，微生物也可以用以将这些气体转化为燃料和化学品。这些生物过程，尽管一般来说比化学反应更慢，但具有数种优于催化过程的优势，包括更高特异性、更高产率、更低能量成本和更大毒化抗性。

CO是例如煤或石油和石油来源的产物的有机材料不完全燃烧的主要自由能富集副产物。举例来说，澳大利亚的钢铁工业据报告每年产生并且向大气中释放超过500,000吨CO。

微生物生长于作为其唯一碳源的CO上的能力是使用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生物化学路径(也称为伍德-永达尔(Woods-Ljungdahl)路径)的生物体的性质。包括一氧化碳营养型、光合、产甲烷和产乙酸生物体的多种厌氧生物体已经显示使CO 代谢为各种最终产物，即CO₂、H₂、甲烷、正丁醇、乙酸酯和乙醇。当使用CO作为唯一碳源时，所有此类生物体都产生这些最终产物中的至少两者。

一些微生物，例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)已知在丁醇发酵(ABE或IBE发酵)期间产生丙-2-酮或丙-2-醇作为主要副产物(乔治(George)等人1983)，而丙-1-醇是酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵的副产物(黑泽尔伍德(Hazelwood)等人2008)。然而，所有这些生物体都依赖于基于糖或淀粉的底物。产乙酸生物体，例如紧密相关的微生物自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(C.ljungdahlii)和拉氏梭菌(C.ragsdalei)能够化学自养地生长于作为唯一能量和碳来源的含CO或CO₂/H₂的气体上并且合成产物，例如乙酸酯、乙醇、丁醇或2,3-丁二醇，但既不合成丙-2-酮也不合成丙-2-醇(穆纳辛格(Munasinghe)和哈那尔(Khanal)2010)。尽管丙-2-酮向丙-2-醇的还原已经显示于产乙酸物质中，但基本原理是未知的(拉马钱德里亚(Ramachandriya)等人2011)。

本发明的目标是提供一种产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇或其前体的方法。

发明内容

本发明尤其提供一种将丙-1,2-二醇转化为丙-2-酮和丙醛的酶促反应，和通过微生物发酵(特别是包含CO的底物的微生物发酵)来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的方法，和此类方法中所用的重组微生物。

在第一方面，本发明提供一种通过一类二醇脱水酶催化的将丙-1,2-二醇转化为丙-2- 酮和丙醛的酶促反应。

在一个具体实施例中，提供一种产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的方法，其包含使底物在微生物存在下发酵，其中底物含有丙-1,2-二醇。

在一个具体实施例中，微生物产生一或多种其它产物。在一个实施例中，一或多种其它产物是乙醇、丁醇和/或丁二醇。

在一个实施例中，微生物是一氧化碳营养型微生物。

在一个具体实施例中，一氧化碳营养型微生物是自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酰乙酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

在一个实施例中，微生物是如下文中定义的重组微生物。

在一个实施例中，微生物选自以下各属：埃希氏菌属(Escherichia)、酵母属(Saccharomyces)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、醋杆菌属 (Acetobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupravidor)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alkaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)。

在一个具体实施例中，微生物选自由以下组成的群组：大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharbutyricum)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、二醇梭菌(C.diolis)、克氏梭菌(C.kluyveri)、巴氏梭菌(C.pasterianium)、诺维氏梭菌(C.novyi)、艰难梭菌(C.difficile)、热纤梭菌(C.thermocellum)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)、嗜纤维梭菌(C.cellulovorans)、植物发酵梭菌(C.phytofermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)。

在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：

a.好氧或厌氧发酵，向含有包含一或多种微生物的培养物的底物的生物反应器提供包含糖、淀粉、纤维素、生物质水解物、合成气和/或甘油的底物；

b.向所述底物提供丙-1,2-二醇；和

c.使所述培养物在所述生物反应器中厌氧发酵以产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

在一个具体实施例中，所述方法包含以下步骤：

a.向含有包含一或多种一氧化碳营养型微生物的培养物的底物的生物反应器提供包含CO的底物；

b.向所述底物提供丙-1,2-二醇；和

在一个具体实施例中，所述方法包含以下步骤：

a.捕获由于工业工艺产生的含CO气体；

b.使所述含CO气体在包含一或多种一氧化碳营养型微生物和丙-1,2-二醇的底物中厌氧发酵以产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：

b.用一或多种微生物，产生丙-1,2-二醇；

c.和一或多种微生物使丙-1,2-二醇转化并且产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2- 醇。

在所述方法方面的具体实施例中，发酵在水性培养基中进行。

在一个实施例中，丙-1,2-二醇是(R)-丙-1,2-二醇，并且产物是丙-2-酮和/或丙-2-醇。

在一个实施例中，丙-1,2-二醇是(S)-丙-1,2-二醇，并且产物是丙醛和/或丙-1-醇。

优选地，底物包含CO。优选地，底物是包含CO的气态底物。在一个实施例中，底物包含工业废气。在某些实施例中，气体是钢厂废气或合成气。

在一个实施例中，底物典型地将含有较大比例的CO，例如至少约20体积％到约100体积％CO，20体积％到70体积％CO，30体积％到60体积％CO，和40体积％到55 体积％CO。在具体实施例中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％CO，或约55体积％CO，或约60体积％CO。

在一个实施例中，所述方法进一步包含从发酵液中回收丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/ 或丙-2-醇和任选地一或多种其它产物的步骤。

在一个实施例中，丙-1,2-二醇在将微生物引入到底物中之前、与其同时或在其之后添加到发酵底物中。

在一个实施例中，发酵液的CO和/或其它组分可以在引入丙-1,2-二醇之前、与其同时或在其之后添加到底物中。

在一个实施例中，底物中所存在的丙-1,2-二醇通过产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/ 或丙-2-醇的一氧化碳营养型微生物产生。在一个实施例中，丙-1,2-二醇可以在相同生物反应器或不同生物反应器中产生。

在另一个实施例中，丙-1,2-二醇通过不同微生物在相同生物反应器中或在不同生物反应器中产生。

重组微生物

在第二方面，本发明提供一种重组微生物，其经修饰以表达亲本微生物中不存在的一或多种外源性二醇脱水酶(在本文中可以称为外源性酶)。

在第三方面，本发明提供一种微生物，其经修饰以过度表达亲本微生物中存在的一或多种内源性二醇脱水酶(在本文中可以称为内源性酶)。

在第四方面，本发明提供一种微生物，其经修饰以表达亲本微生物中存在的一或多种内源性二醇脱水酶的变异体(在本文中可以称为内源性酶)。

在第二、第三或第四方面的一个实施例中，微生物被调适成能够实现比通过亲本微生物所产生更高的丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇产率。

在第二、第三或第四方面的一个实施例中，微生物被调适以按比通过亲本微生物所产生更快的速率产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

在第二方面的一个实施例中，二醇脱水酶。

在一个具体实施例中，二醇脱水酶具有来自自产乙醇梭菌或扬氏梭菌的二醇脱水酶 (EC 4.1.2.28)或其功能上等效的变异体的识别特征。

在一个具体实施例中，二醇脱水酶具有来自产酸克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌的丙二醇脱水酶(EC 4.1.2.30)或其功能上等效的变异体的识别特征。

在第二方面的一个实施例中，新颖二醇脱水酶和活化酶如SEQ ID NO:1和2(自产乙醇梭菌的酶)和YP_003779353和YP_003779354(扬氏梭菌的酶)定义或是其功能上等效的变异体。

在第二方面的一个实施例中，新颖二醇脱水酶和其活化酶由如SEQ ID NO:3和4(自产乙醇梭菌的基因)和CLJU_c11830；9444800和CLJU_c11831；9444801(扬氏梭菌的基因)定义的核酸序列或其功能上等效的变异体编码。

在第三方面的一个实施例中，包含克雷伯氏菌属的二醇脱水酶的三个亚单位如YP_002236780、YP_002236781、YP_002236782(肺炎克雷伯氏菌)和1DIO_A、1DIO_B、 1DIO_C(产酸克雷伯氏菌)定义或是其功能上等效的变异体。

在第三方面的一个实施例中，克雷伯氏菌属的三个二醇脱水酶亚单位由如 GI:206575748、GI:206575749、GI:206575750(肺炎克雷伯氏菌)和GI:868006、GI:868007、 GI:868008_(产酸克雷伯氏菌)定义的核酸或其功能上等效的变异体编码。

在第二或第三方面的一个具体实施例中，重组微生物经修饰以便内源性酶的表达相对于亲本微生物中的相同酶的表达减弱或敲除。

在一个实施例中，表达减弱或敲除的酶是乙醇脱氢酶。在具体实施例中，仲醇脱氢酶定义于SEQ ID NO:5(自产乙醇梭菌)和ADK15544.1(扬氏梭菌)中，或是其功能上等效的变异体。在其它实施例中，仲醇脱氢酶由如SEQ ID NO:6(自产乙醇梭菌)和 CLJU_c24860；GI:300435777(扬氏梭菌)定义的核酸编码。

在另一个实施例中，除了丙-1-醇和/或丙-2-醇之外或代替丙-1-醇和/或丙-2-醇，重组生物体还产生丙醛和/或丙-2-酮。

在一个实施例中，微生物包含被调适以增加一或多种内源性核酸的表达的一或多种外源性核酸，并且所述一或多种内源性核酸编码上文提及的二醇脱水酶。

在一个实施例中，被调适以增加表达的一或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施例中，调节元件是启动子。在一个实施例中，启动子是组成型启动子。在一个实施例中，启动子选自包含以下的群组：伍德-永达尔基因簇、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

在一个实施例中，重组微生物进一步被调适以表达一或多种外源性酶以产生丙-1,2- 二醇，所述外源性酶包括但不限于甲基乙二醛合成酶(mgsA)、甲基乙二醛还原酶(ydjG)、仲醇脱氢酶(gldA/budC)、乳醛还原酶/伯醇脱氢酶(fucO)。在另一个方面，微生物被调适以过度表达丙-1,2-二醇生物合成路径中的一或多种内源性酶。

在一个实施例中，一或多种外源性核酸是核酸构筑体或载体，在一个具体实施例中是质粒，编码上文提及的二醇脱水酶。

在一个实施例中，外源性核酸是表达质粒。

在一个具体实施例中，亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养型细菌的群组：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、甲酰乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusa silvacetica、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。

在一个实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实施例中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693，菌株DSM10061的衍生物。在另一个具体实施例中，微生物是扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在一个实施例中，亲本微生物是大肠杆菌或乳酸乳球菌。

经分离核酸(来自自产乙醇梭菌和扬氏梭菌)

在第四方面，本发明提供一种编码二醇脱水酶的核酸，其中核酸从一氧化碳营养型微生物中分离。

在第四方面的另一个实施例中，一氧化碳营养型微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实施例中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693，菌株DSM10061自产乙醇梭菌的衍生物。

在第四方面的另一个实施例中，当在微生物中表达时，编码二醇脱水酶的核酸有助于增加通过使包含CO和丙-1,2-二醇的底物发酵来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2- 醇的产率和/或速率。

在第四方面的一个实施例中，编码二醇脱水酶的核酸是SEQ ID NO:3或是其功能上等效的变异体。

在一个实施例中，核酸包含编码本文中之前定义的本发明酶中的一或多者的序列，其当在微生物中表达时允许微生物通过使包含CO和丙-1,2-二醇的底物发酵来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。在一个具体实施例中，本发明提供一种编码两种酶的核酸，其当在微生物中表达时允许微生物通过使包含CO的底物发酵来产生丙醛、丙 -2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

在一个实施例中，本发明的核酸进一步包含启动子。在一个实施例中，启动子允许基因在其控制下的组成型表达。在一个具体实施例中，使用伍德-永达尔簇启动子。在其它具体实施例中，使用丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、 ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体实施例中，启动子来自自产乙醇梭菌。

在第五方面，本发明提供一种核酸构筑体或载体，其包含一或多种第四方面的核酸。

在一个具体实施例中，核酸构筑体或载体是表达构筑体或载体。在一个具体实施例中，表达构筑体或载体是质粒。

在第六方面，本发明提供一种宿主生物体，其包含第四方面的核酸或第五方面的载体或构筑体中的任一或多者。

在第七方面，本发明提供一种组合物，其包含如本发明的第四方面中提及的表达构筑体或载体和甲基化构筑体或载体。

优选地，组合物能够产生根据本发明的第二方面的重组微生物。

在一个具体实施例中，表达构筑体/载体和/或甲基化构筑体/载体是质粒。

在第八方面，本发明提供当通过第一方面的方法产生时的丙-1-醇、丙-2-醇、丙醛和/或丙-2-酮。

在另一个方面，本发明提供一种产生本发明的第二或第三方面的微生物的方法，其包含通过引入一或多种核酸来使一氧化碳营养型产乙酸亲本微生物转化，以便微生物能够通过使包含CO和丙-1,2-二醇的底物发酵来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇，或产生与亲本微生物相比增加量的丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇，和任选地一或多种其它产物，其中亲本微生物通过使包含CO的底物发酵，不能够产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇，或以比重组微生物更低的水平产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙 -2-醇。

在一个具体实施例中，亲本微生物通过引入被调适以表达用于生物合成丙-1,2-二醇的一或多种酶的一或多种外源性核酸而转化，所述酶包括但不限于甲基乙二醛合成酶(mgsA)、甲基乙二醛还原酶(ydjG)、仲醇脱氢酶(gldA/budC)、乳醛还原酶/伯醇脱氢酶(fucO)。在另一个实施例中，亲本微生物进一步通过引入被调适以表达丙-1,2-二醇生物合成路径中的一或多种酶的一或多种外源性核酸而转化。在另一个实施例中，亲本微生物进一步通过表达或过表达被调适以表达丙-1,2-二醇生物合成路径中的一或多种酶的一或多种内源性核酸而转化。在一个实施例中，亲本微生物用被调适以过度表达丙 -1,2-二醇路径中的在亲本微生物中天然存在的一或多种内源性酶的一或多种核酸转化。

在某些实施例中，一或多种酶如本文之前所述。

广泛地说，本发明还可以在于单独地或共同地在本申请的说明书中提及或指示的部分、要素和特征，呈两个或更多个所述部分、要素或特征中的任何或所有组合形式，并且当具有本发明所涉及的领域中的已知等效物的特定整体在本文中被提到时，所述已知等效物被认为如单独地进行阐述一般并入本文中。

附图说明

本发明的这些和其它方面(应被视为在所有其方面中)将从以下仅借助于实例给出的描述参考附图而变得显而易见。

图1：反应路径，其展示由丙-1,2-二醇立体特异性产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

图2：HPLC色谱图，其展示由A.丙-1,2-二醇、B.(S)-丙-1,2-二醇和C.(R)-丙-1,2-二醇产生产物丙醛、丙-1-醇、丙-2-醇和乙醇。丙-2-酮是A和C中的副产物但由丙-2- 醇峰遮蔽。进一步分析已经使用不同气相色谱方法分别地洗脱丙-2-酮。

图3：自产乙醇梭菌的培养物上方的顶部空间的气相色谱图突显了丙-2-酮和丙-2-醇的滞留时间。不添加丙-1,2-二醇的培养物A；和添加有(R)-丙-2-醇的培养物B。

图4：扬氏梭菌的培养物的HPLC色谱图。不添加丙-1,2-二醇的培养物A展示无丙 -1-醇或丙-2-醇；并且添加有(R)-丙-2-醇的培养物B展示产生丙-1-醇和丙-2-醇。

图5：拉氏梭菌的培养物的HPLC色谱图。不添加丙-1,2-二醇的培养物A；和添加有(R)-丙-2-醇的培养物B未展示丙-1,2-二醇转化为丙-1-醇或丙-2-醇。

图6：食一氧化碳梭菌的培养物的HPLC色谱图。不添加丙-1,2-二醇的培养物A展示无丙-1-醇或丙-2-醇；并且添加有(R)-丙-2-醇的培养物B展示无剩余丙-1,2-二醇并且仅产生丙-1-醇并且不产生丙-2-醇。

图7：在携带pMTL83155-pddABC的自产乙醇梭菌中(具有实心轮廓的条柱)和在野生型自产乙醇梭菌中(具有间断轮廓的条柱)由丙-1,2-二醇进行的丙醇产生。误差条表示三次重复的标准偏差。

图8：自产乙醇梭菌的二醇脱水酶与来自BLAST检索的大多数相关酶的比对的概述。灰色条柱表示与自产乙醇梭菌参考序列的一致性，而黑色区域表示错配并且白色区域表示空隙。仅在自产乙醇梭菌和扬氏梭菌中所存在的结构域在方框中突显。

图9：丁酸梭菌的培养物的HPLC色谱图。接种时的培养物A展示甘油和丙-1,2-二醇。生长48小时之后的培养物B展示一些剩余丙-1,2-二醇和所产生的丙-1-醇。

图10：PCR证实基团II内含子使用引物Og84f和Og85r***在二醇脱水酶基因中。随机筛选克拉霉素(Clarithromycin)选择之后的8个无性系。

图11：具有灭活的二醇脱水酶的自产乙醇梭菌ClosTron突变体的培养物在生长1周之后的HPLC色谱图。不添加丙-1,2-二醇的培养物A；和添加有(R)-丙-2-醇的培养物 B未展示丙-1,2-二醇转化为丙-1-醇或丙-2-醇。

图12：携带pTrc-dhaB1B2(A)和pTrc99A(B)的大肠杆菌的培养物培养液在4g L-1丙-1,2-二醇存在下生长48小时之后的HPLC色谱图。

具体实施方式

丙-2-酮和丙-2-醇的所有已知生物合成途径都经由中间物乙酰乙酰CoA和乙酰乙酸酯从乙酰CoA开始。此处我们呈现一种从甘油醛-3-磷酸酯或丙酮酸酯经由乳醛和丙-1,2- 二醇(贝里奥斯-里韦拉(Berríos-Rivera),萨恩(San)和班尼特(Bennett)2003；杰恩(Jain)和颜(Yan)2011)到丙-2-酮和丙-2-醇的替代途径。此处我们描述一种酶，其可以将丙-1,2-二醇立体特异性转化为丙-2-酮和丙醛。这些产物然后可以进一步转化为丙-2-醇和丙-1-醇。丙-1,2-二醇向丙醛的转化已经由肺炎克雷伯氏菌的另一种酶描述(杰恩和颜2011)，然而所述酶不能够使其转化为丙醛以及丙-2-酮。此处我们描述一种如关于大肠杆菌或酿酒酵母所展示在可以天然含有这种酶的产乙酸细胞中或在任何天然丙-1,2-二醇产生宿主生物体中或在被修饰用于丙-1,2-二醇产生的经工程化细胞中，选择性产生丙-2-酮/丙-2-醇和/或丙醛/丙-1-醇的酶和方法(贝里奥斯-里韦拉,萨恩和班尼特 2003；杰恩和颜2011)。这个反应还允许由前体丙-2-酮、丙-2-醇、丙醛、丙-1-醇产生其它商品，例如异丁烯，其可以由丙-2-酮产生(范莱文(van Leeuwen)等人2012) (WO2011032934)。使用新颖二醇脱水酶的本发明的另一个优势在于酶机制的性质。二醇脱水酶催化不可逆反应，因此允许动力控制元件的高效产生，因为产物无法被再利用，这是当设计合成路径时的一个重要考虑因素(巴尔-埃文(Bar-Even)等人2012；邦德- 瓦特(Bond-Watts),贝勒罗斯(Bellerose)和常(Chang)2011)。

以下是本发明的描述，包括在一般意义上给出的其优选实施例。本发明由在以下本文中标题“实例”下给出的公开内容进一步阐明，其提供支持本发明的实验性数据、本发明的各种方面的特定实例以及执行本发明的方式。

定义

如本文中所提到的，“发酵液”是包含至少一种营养培养基和细菌细胞的培养基。

如本文中所提到的，“穿梭微生物”是其中甲基转移酶经表达并且不同于目标微生物的微生物。

如本文中所提到的，“目标微生物”是其中包括在表达构筑体/载体上的基因经表达并且不同于穿梭微生物的微生物。

术语“增加效率”、“增加的效率”等在相对于发酵工艺使用时包括但不限于增加以下中的一或多者：催化发酵的微生物的生长速率、在较高产物浓度下的生长和/或产物产生速率、每消耗的底物体积所产生的所需产物的体积、产生所需产物的产生速率或水平、以及与发酵的其它副产物相比产生的所需产物的相对比例。

短语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应理解为包括其中一氧化碳可例如用于一或多种细菌菌株以便生长和/或发酵的任何底物。

短语“包含一氧化碳的气态底物”和类似短语和术语包括含有一定水平一氧化碳的任何气体。在某些实施例中，底物含有至少约20体积％到约100体积％CO，20体积％到70体积％CO、30体积％到60体积％CO和40体积％到55体积％CO。在具体实施例中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约 45体积％、或约50体积％CO，或约55体积％CO，或约60体积％CO。

短语“经分离”和类似术语是指群体中的已经从群体的其它成员中移出的成员。典型地，群体是混合群体，并且经分离成员是单个的或同质群体的成员。所述术语可以用以描述微生物、蛋白质、核酸等。

短语“重组”和类似术语是指核酸、蛋白质或微生物含有不同个体、不同种或不同属的已经连接在一起的部分。典型地，这使用重组DNA技术进行，以便形成复合核酸。复合核酸可以用以例如制造复合蛋白。其可以用以制造融合蛋白。其可以用以使微生物转化，所述微生物维持并且复制复合核酸并且任选地表达蛋白质、任选地复合蛋白。

术语“立体特异性的”和类似术语是指酶区别地识别对映异构体并且催化对映异构体的不同反应。因此，仅一种对映异构体可以反应，或每种对映异构体可以产生不同产物。

虽然底物未必含有任何氢气，但H₂的存在不应对根据本发明的方法的产物形成是不利的。在具体实施例中，氢气的存在引起醇产生的总效率的改进。举例来说，在具体实施例中，底物可以包含约2:1或1:1或1:2比率的H₂:CO。在一个实施例中，底物包含约30体积％或更少H₂、20体积％或更少H₂、约15体积％或更少H₂或约10体积％或更少H₂。在其它实施例中，底物液流包含低浓度的H₂，例如少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％、或少于1％或实质上无氢气。底物还可以含有一些CO₂，例如约1体积％到约80体积％CO₂，或1体积％到约30体积％CO₂。在一个实施例中，底物包含少于或等于约20体积％CO₂。在具体实施例中，底物包含少于或等于约15体积％CO₂、少于或等于约10体积％CO₂、少于或等于约5体积％CO₂或实质上无CO₂。

在以下描述中，本发明的实施例在传递和发酵“含有CO的气态底物”方面进行描述。然而，应了解气态底物可以按替代形式提供。举例来说，含有CO的气态底物可以溶解于液体中而提供。基本上，液体经含有一氧化碳的气体饱和，并且然后将所述液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法实现。借助于实例，可以使用微泡分布发生器(亨西里萨克(Hensirisak)等人用于好氧发酵的微泡分布发生器的规模放大(Scale-up ofmicrobubble dispersion generator for aerobic fermentation)；应用生物化学与生物技术 (Applied Biochemistry and Biotechnology)第101卷，第3册/2002年10月)。借助于另一实例，含有CO的气态底物可以吸附到固体支撑物上。所述替代方法通过使用术语“含有CO的底物”等涵盖。

在本发明的具体实施例中，含CO的气态底物是工业尾气或废气。“工业废气或尾气”应广泛地被认为包括包含由工业工艺产生的CO的任何气体，并且包括由二价铁金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产以及焦炭制造所产生的气体。其它实例可以提供在本文其它地方。

除非上下文另有要求，否则如本文中所用的短语“发酵”、“发酵工艺”或“发酵反应”等打算涵盖所述工艺的生长期和产物生物合成期两者。如本文将进一步描述，在一些实施例中，生物反应器可以包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，将金属或组合物添加到发酵反应中应理解为包括添加到这些反应器中的任一或两者中。

术语“生物反应器”包括由一或多个容器和/或塔或管道排布组成的发酵装置，其包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可以包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，在提及将底物添加到生物反应器或发酵反应中时，适当时，应理解为包括添加到这些反应器中的任一或两者中。

“外源性核酸”是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源性核酸可以来源于任何适当来源，包括但不限于待引入其的微生物(例如在重组微生物所来源于的亲本微生物中)、与待引入其的生物体不同的微生物菌株或种，或者其可以按人工方式或按重组方式形成。如果核酸来自不同微生物种并且具有不同序列，那么其是异源的。在一个实施例中，外源性核酸代表天然存在于待引入其的微生物内的核酸序列，并且将其引入以增加具体基因的表达或过度表达(例如通过增加所述序列(例如基因)的拷贝数，或引入强的或组成型启动子以增加表达)。在另一个实施例中，外源性核酸代表非天然存在于待引入其的微生物内的核酸序列，并且允许表达非天然存在于所述微生物内的产物或增加微生物中天然基因的表达(例如在引入调节元件例如启动子的情况下)。外源性核酸可以被调适以整合到待引入其的微生物的基因组中，或者保持染色体外状态。

“外源性”也可以用以指蛋白质。这是指蛋白质不存在于重组微生物所来源于的亲本微生物中。

如本文中关于重组微生物和核酸或蛋白质所用的术语“内源性”是指任何核酸或蛋白质存在于重组微生物所来源于的亲本微生物中。

除非另外规定，否则如本文中所提到的，“丙-1,2-二醇”是指两种对映异构体(R)-丙-1,2-二醇和(S)-丙-1,2-二醇的外消旋混合物。除非另外规定，否则如本文中所提到的，“丙醇”是指两种异构体丙-1-醇和丙-2-醇的混合物。在本文中提及的反应产物包含丙 -1-醇或丙-2-醇时，本领域的技术人员应理解，可以另外或或者产生相应中间物丙醛和丙 -2-酮。在一些情形下可能需要以单独产物形式分离中间物醛或酮化合物，并且适当时此类醛和酮产物打算包括在本发明的范围内。

应了解，可以使用序列不同于本文具体例示的序列的核酸实施本发明，限制条件为其执行实质上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意味着所编码的蛋白质或肽具有实质上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列，所述变异序列将具有促进一或多种基因表达的能力。此类核酸在本文中可以称为“功能上等效的变异体”。举例来说，核酸的功能上等效的变异体包括等位基因变异体、基因片段、包括突变(缺失、***、核苷酸取代等)和/或多态性的基因等。来自其它微生物的同源基因也可以被视为是本文具体例示的序列的功能上等效的变异体的实例。这些基因包括在例如自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、诺维氏梭菌的种中的同源基因，其详情在网站例如Genbank或NCBI上可公开获得。短语“功能上等效的变异体”还应被认为包括其序列因为具体生物体密码子优化而改变的核酸。本文中，核酸的“功能上等效的变异体”优选地将与所鉴别的核酸具有至少约70％、优选约80％、更优选约85％、优选约90％、优选约95％或更高的核酸序列一致性。

还应了解，可以使用其序列不同于本文具体例示的氨基酸序列的多肽实施本发明。这些变异体在本文中可以称为“功能上等效的变异体”。蛋白质或肽的功能上等效的变异体包括与所鉴别的蛋白质或肽具有至少40％，优选50％、优选60％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、优选90％、优选95％或更高的氨基酸一致性，并且具有与所关注的肽或蛋白质实质上相同功能的那些蛋白质或肽。此类变异体在其范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包含截短形式的多肽，其中缺失可以是1到5个、到10 个、到15个、到20个、到25个氨基酸，并且可以在所述多肽的任一末端延伸1到25 个残基，并且其中缺失可以是所述区域内的任何长度；或可以位于内部位置或蛋白质的赋予特异催化功能和活性或者结合底物或辅因子的特异性结构域。本文中特定多肽的功能上等效的变异体还应被认为包括由其它细菌物种(例如前段中例示的)中的同源基因表达的多肽。

如本文中所用的“实质上相同功能”打算意指所述核酸或多肽的变异体能够执行所述核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变异体将能够催化与所述酶相同的反应。然而，不应认为所述多肽或核酸的变异体与所述多肽或核酸具有相同的活性水平。

可以使用本领域的技术人员已知的方法评估核酸或多肽的功能上等效的变异体是否具有与所述核酸或多肽实质上相同功能。然而，举例来说，用以测试二醇脱水酶活性的分析描述于实例章节中并且可以使用HPLC方法或通过用2,4-二硝基苯肼进行衍生化来评估(寅弥(Toraya)等人1977)。

“过度表达”、“过表达”和类似术语和短语在相对于本发明使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一或多种蛋白质(包括编码一或多种蛋白质的一或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。

如本文中所提到的，“减弱的表达”是指核酸或蛋白质的表达相对于亲本微生物中的表达的减少。减弱的表达还包括“零表达”，其是指核酸或蛋白质根本不表达。“零”表达可以通过本领域的技术人员已知的任何方法而实现，所述方法包括RNA沉默、修饰表达过程(例如破坏启动子功能)、或完全或部分去除(即“敲除”)编码来自基因组的酶的核酸。

“亲本微生物”是本发明的微生物所来源于的微生物。本发明的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择、突变或基因重组而产生。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前曾被修饰过但是不表达或不过度表达本发明的一或多种酶(主题)的微生物。因此，本发明的重组微生物可能已经被修饰以表达或过度表达在所述亲本微生物中不表达或不过度表达的一或多种酶。

术语核酸“构筑体”或“载体”和类似术语应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)。所述术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构筑体或载体可以包括一或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。在一个具体实施例中，构筑体或载体被调适以允许由所述构筑体或载体编码的一或多种基因表达。核酸构筑体或载体包括裸露核酸，以及用一或多种促进向细胞的传递的试剂调配的核酸(例如脂质体结合的核酸、其中含有所述核酸的生物体)。

公开内容

本发明人已经发现，丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇可以通过一氧化碳营养型微生物当在包含CO和丙-1,2-二醇的底物存在下时产生。丙-2-酮和/或丙-和/或丙-2-醇由丙-1,2-二醇的外消旋混合物的产生之前未曾通过微生物展示。在进一步实验之后，本发明人已经展示，使包含(R)-丙-1,2-二醇的底物发酵优先产生丙-2-酮和/或丙-2-醇，并且使包含(S)-丙-1,2-二醇的底物发酵优先产生丙醛和/或丙-1-醇。本发明人相信，反应如图1 中所示在一氧化碳营养型微生物中进行，其催化丙-1,2-二醇的立体特异性脱水以形成丙醛(来自(S)对映异构体)或丙-2-酮(来自(R)对映异构体)。催化这一反应的二醇脱水酶已经被鉴别出并且分离。本发明人相信，这些化合物然后通过内源性醇脱氢酶的作用转化为相应醇，丙-1-醇或丙-2-醇。仲醇脱氢酶已经被鉴别出并且证实可将丙-2-酮转化为丙-2-醇。所鉴别出的酶可以用于在产生丙-1,2-二醇作为产物或中间物或者已经被工程化以这样做的任何重组生物体中形成丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇(杰恩和颜2011)。这一反应还允许产生其它商品，例如异丁烯，其可以由前体丙-2-酮、丙-2-醇、丙醛、丙 -1-醇产生(范莱文等人2012)。

本发明提供一种产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇和任选地一或多种其它产物的方法，其通过微生物发酵来进行，包含使用如本文中所定义的一氧化碳营养型微生物使包含CO和丙-1,2-二醇的底物发酵。本发明的方法可以用以减少来自工业工艺的总大气碳排放。

本发明可以具有优于由基于糖的底物产生生物燃料(例如丙醇)的优势，并且提供一种利用来自工业工艺的废气(包括一氧化碳)来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和丙-2- 醇的替代性方式。

丙-1,2-二醇可以通过本领域的技术人员已知的任何方法添加到发酵底物中。举例来说，丙-1,2-二醇可以在将微生物引入到底物中之前、与其同时或在其之后添加到底物中。此外，发酵液的CO和/或其它组分可以在引入丙-1,2-二醇之前、与其同时或在其之后添加到底物中。

底物中所存在的丙-1,2-二醇可以通过产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的一氧化碳营养型微生物产生，并且丙-1,2-二醇的产生可以在相同生物反应器或不同生物反应器中。在另一个实施例中，丙-1,2-二醇通过不同微生物在相同生物反应器中或在不同生物反应器中产生。

在具体实施例中，微生物还产生一或多种其它产物，例如乙醇、丁醇和/或丁二醇。图2中可以看出，除了产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇之外，观察到乙醇共同产生。

优选地，发酵包含使用如本文中所定义的本发明的重组微生物、使底物在生物反应器中厌氧发酵以产生至少丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的步骤。

重组微生物

本发明人具有经工程化的重组生物体和其用于产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙 -2-醇的使用方法。重组一氧化碳营养型微生物表达外源性二醇脱水酶，并且能够实现比通过亲本微生物所产生更高的由丙-1,2-二醇产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的产率。由丙-1,2-二醇产生的丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的比率也可以按这种方式调节。微生物还以比通过亲本微生物所产生更快的速率产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

如图1可以看出，二醇脱水酶催化(R)和/或(S)丙-1,2-二醇向相应酮/醛(即分别向丙 -2-酮或丙醛)的反应。虽然本说明书中可以提及丙醇由丙-1,2-二醇产生，但本领域的技术人员应理解，所述产生可能经由相应醛/酮中间物而进行。通过进一步研究，本发明人已经证实，这些醛通过由微生物表达的一或多种内源性醇脱氢酶而还原为相应醇。据设想，一或多种醇脱氢酶可以经过度表达以增加丙醇产物的反应速率和/或反应产率。或者，一或多种醇脱氢酶的表达可以减弱，以便减少醇的产生并且增加相应醛的产生。

本发明的微生物中所使用的酶和功能变异体可以来源于任何适当来源，包括不同细菌属和种或者其它生物体。然而，在一个实施例中，二醇脱水酶是来源于肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌的二醇脱水酶(EC 4.1.2.30)或其功能上等效的变异体。在一个实施例中，二醇脱水酶(三个亚单位)如YP_002236780、YP_002236781、YP_002236782 定义或是其功能上等效的变异体。在一个具体实施例中，二醇脱水酶由二醇脱水酶基因 GI:206575748、GI:206575749、GI:206575750(肺炎克雷伯氏菌)和GI:868006、GI:868007、 GI:868008(产酸克雷伯氏菌)编码。

本发明人已经鉴别出一氧化碳营养型微生物中的先前尚未被描述的二醇脱水酶(SEQ ID NO:1)。在一个实施例中，本发明提供一种一氧化碳营养型微生物，其被调适以过度表达亲本微生物中存在的一或多种二醇脱水酶(例如SEQ ID NO:1或其功能上等效的变异体)。在一个具体实施例中，内源性二醇脱水酶由如SEQ ID NO:3定义的核酸或其功能上等效的变异体编码。

在一个实施例中，重组生物体包含展现减弱或敲除的表达的酶。在一个具体实施例中，酶是乙醇脱氢酶，并且重组生物体除了丙-1-醇和/或丙-2-醇之外或代替丙-1-醇和/或丙-2-醇还产生丙醛和/或丙-2-酮。在具体实施例中，乙醇脱氢酶定义于SEQ ID NO:5中，或是其功能上等效的变异体。在其它实施例中，乙醇脱氢酶由如SEQ ID NO:6定义的核酸编码。

在一个实施例中，微生物进一步被调适以表达丙-1,2-二醇的生物合成中所涉及的一或多种外源性酶，所述外源性酶包括但不限于甲基乙二醛合成酶(mgsA)、甲基乙二醛还原酶(ydjG)、仲醇脱氢酶(gldA/budC)、乳醛还原酶/伯醇脱氢酶(fucO)。在另一个方面，微生物被调适以过度表达丙-1,2-二醇生物合成路径中的一或多种内源性酶。

虽然本发明人已经在自产乙醇梭菌中证实了本发明的功效，但其预期本发明适用于如本文中进一步论述的更广泛群组的一氧化碳营养型产乙酸微生物。

微生物可以通过许多重组方法被调适以表达或过度表达一或多种酶，包括例如增加内源性基因的表达(例如通过引入较强的或组成型启动子以驱动基因的表达)，通过引入编码具体酶并且被调适以表达所述酶的外源性核酸来增加编码所述酶的基因的拷贝数，或引入编码非天然存在于亲本微生物内的酶并且被调适以表达所述酶的外源性核酸。

在一个实施例中，微生物包含被调适以增加亲本微生物的天然的一或多种核酸的表达，并且所述一或多种核酸编码之前本文中提及的一或多种酶。在一个实施例中，被调适以增加表达的一或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施例中，调节元件是启动子。在一个实施例中，启动子是组成型启动子，其在适当发酵条件下具优选地高度活性。还可以使用诱导型启动子。在优选实施例中，启动子选自包含以下的群组：伍德-永达尔基因簇、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。本领域的技术人员应了解，可以在适当发酵条件下直接表达、优选地高水平表达的其它启动子将有效作为例示实施例的替代方案。

微生物可以包含一或多种外源性核酸。当需要用两种或更多种遗传元件(例如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物时，其可以含有在一或多种外源性核酸上。

在一个实施例中，由微生物表达或过度表达的一或多种外源性核酸是核酸构筑体或载体，在一个具体实施例中是质粒，编码上文提及的呈任何组合的一或多种酶。

本发明的核酸可以在转化亲本微生物之后保持染色体外或可以整合到亲本微生物的基因组中。因此，其可以包括其它核苷酸序列，其被调适以辅助整合(例如允许同源重组并且靶向整合到宿主基因组中的区域)或表达和复制染色体外构筑体(例如复制起点、启动子和其它调节元件或序列)。

在一个实施例中，编码如之前本文中提及的一或多种酶的外源性核酸将进一步包含被调适以促进由外源性核酸编码的一或多种酶的表达的启动子。在一个实施例中，启动子是组成型启动子，其在适当发酵条件下具优选地高度活性。还可以使用诱导型启动子。在优选实施例中，启动子选自包含以下的群组：伍德-永达尔基因簇、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域的技术人员应了解，可以在适当发酵条件下直接表达、优选地高水平表达的其它启动子将有效作为例示实施例的替代方案。

在一个实施例中，外源性核酸是表达质粒。

在一个具体实施例中，亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养型产乙酸细菌的群组：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、甲酰乙酸梭菌、大梭菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautiaproducta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusasilvacetica、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。

在一个具体实施例中，亲本微生物选自产乙醇、产乙酸梭菌属的集群，其包含以下种：自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离株。这些微生物包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1^T(DSM10061)(阿布里尼(Abrini),纳沃(Naveau)和尼恩斯 (Nyns)1994)；自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)；自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)；扬氏梭菌PETC^T(DSM13528＝ATCC 55383)(泰纳(Tanner), 米勒(Miller)和杨(Yang)1993)；扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)；扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)；扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)；拉氏梭菌P11^T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)；相关分离株，例如“C.coskatii”(US20110229947)和“梭菌属”(秋林(Tyurin)和基留欣(Kiriukhin) 2012)；或突变菌株，例如扬氏梭菌OTA-1(蒂拉多-阿塞韦多O.(Tirado-Acevedo O.) 使用扬氏梭菌从合成气产生生物乙醇(Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii).北卡罗来纳州大学博士论文(PhD thesis,North Carolina State University),2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成子簇，并且其16S rRNA基因超过99％一致，具有约30％的类似低GC含量。然而，DNA-DNA重缔合和DNA指纹识别实验展示出，这些菌株属于不同种(WO2008/028055)。

这一簇的所有种具有类似形态和大小(对数增长细胞在0.5-0.7×3-5μm之间)，是嗜温性(最佳生长温度在30-37℃之间)并且严格地厌氧生物(阿布里尼,纳沃和尼恩斯1994；泰纳,米勒和杨1993)(WO 2008/028055)。此外，其都具有相同的主要***发生特性，例如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳初始pH是5.5-6)，具有类似生长速率的依靠含CO气体的强自养生长，以及具有乙醇和乙酸作为主要发酵最终产物以及在某些条件下形成的少量2,3-丁二醇和乳酸的类似代谢型态。(阿布里尼,纳沃和尼恩斯1994；科普克等人2011；泰纳,米勒和杨1993)(WO 2008/028055)。在所有三个种下也观察到吲哚产生。然而，种间区别在于各种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用。此外，发现一些种对某些维生素(例如硫胺、生物素)是营养缺陷型的，而其它的不是。已经发现引起气体吸收的伍德-永达尔路径基因的组织和数目在所有种中相同，尽管核酸和氨基酸序列有差异(科普克等人2011)。

在一个实施例中，亲本菌株使用CO作为其唯一的碳和能量来源。

在一个实施例中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实施例中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693，菌株DSM10061自产乙醇梭菌的衍生物。在另一个具体实施例中，微生物是扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

核酸

经分离核酸(由自产乙醇梭菌和扬氏梭菌鉴别的)

本发明人已经鉴别出两种一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌和扬氏梭菌中的编码二醇脱水酶的核酸。核酸编码二醇脱水酶，所述二醇脱水酶催化丙-1,2-二醇向丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇的转化。

在一个实施例中，编码二醇脱水酶的核酸定义于SEQ ID NO:3(自产乙醇梭菌)和CLJU_c11830；9444800和CLJU_c11831；9444801(扬氏梭菌)中，或是其功能上等效的变异体。

在一个实施例中，本发明的核酸进一步包含启动子。在一个实施例中，启动子允许基因在其控制下的组成型表达。本领域的技术人员将易于理解用于本发明中的启动子。优选地，启动子可以在适当发酵条件下引导高水平表达。在一个具体实施例中，使用伍德-永达尔簇启动子。在其它具体实施例中，使用丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、 Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体实施例中，启动子来自自产乙醇梭菌。

本发明还提供一或多种核酸或核酸构筑体，其包含一或多种用于产生本发明重组微生物的本发明核酸。

在一个实施例中，核酸包含编码本文中之前定义的本发明酶中的一或多者的序列，其当在微生物中表达时允许微生物通过使包含CO的底物发酵来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。在一个具体实施例中，本发明提供一种编码两种酶的核酸，其当在微生物中表达时允许微生物通过使包含CO的底物发酵来产生丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和 /或丙-2-醇。在一个具体实施例中，两种酶是如本文中所定义的二醇脱水酶和醇脱氢酶。

编码本文中所描述的酶的例示性氨基酸序列和核酸序列提供在本文中或可以获自上文所提及的GenBank。然而，技术人员将易于理解GenBank和其它数据库中与本文中含有的信息有关的编码所述酶或其功能上等效的变异体的替代核酸序列和遗传密码。

本发明还提供当通过第一方面的方法产生时的丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇。

在一个实施例中，核酸是核酸构筑体或载体。在一个具体实施例中，核酸构筑体或载体是表达构筑体或载体，然而其它构筑体和载体(例如用于克隆的构筑体和载体)由本发明涵盖。在一个具体实施例中，表达构筑体或载体是质粒。

应了解，本发明的表达构筑体/载体除了含有启动子以及必要时适于表达其它蛋白质的其它基因之外还可以含有任何数目的调节元件。在一个实施例中，表达构筑体/载体包括一个启动子。在另一个实施例中，表达构筑体/载体包括两个或更多个启动子。在一个具体实施例中，表达构筑体/载体针对每一待表达的基因包括一个启动子。在一个实施例中，表达构筑体/载体包括一或多个核糖体结合位点，优选地是针对每一待表达的基因的核糖体结合位点。

本领域的技术人员应了解，本文中所述的核酸序列和构筑体/载体序列可以含有标准连接子核苷酸，例如核糖体结合位点和/或限制位点所需的那些。此类连接子序列不应被解释为必需的并且不提供对所定义的序列的限制。

本发明的核酸和核酸构筑体(包括表达构筑体/载体)可以使用本领域中任何数目的标准技术构筑。举例来说，可以使用化学合成或重组技术。此类技术例如描述在萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A laboratory manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约州冷泉港(Cold SpringHarbor,NY),1989)中。其它例示性技术描述在本文之后的实例章节中。基本上，个别基因和调节元件将可操作地彼此连接，使得基因可以表达以形成所需蛋白质。本领域普通技术人员将了解适用于本发明的载体。然而，举例来说，以下载体可以是适合的： pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750和本文之后的实例章节中例示的质粒。

应了解，本发明的核酸可以呈任何适当形式，包括RNA、DNA或cDNA。

本发明还提供宿主生物体，尤其是微生物，并且包括病毒、细菌和酵母，其包含本文中所述的核酸中的任一或多者。

产生微生物的方法

一或多种外源性核酸可以按裸露核酸形式传递到亲本微生物中，或可以用一或多种促进转化过程的试剂(例如脂质体结合的核酸、其中含有所述核酸的生物体)调配。一或多种核酸适当时可以是DNA、RNA或其组合。限制抑制剂可以用于某些实施例；参见例如莫雷N.E.(Murray,N.E.)等人(2000)微生物与分子生物学综述(Microbial.Molec. Biol.Rev.)64,412。

本发明的微生物可以使用本领域中已知用于产生重组微生物的任何数目的技术由亲本微生物和一或多种外源性核酸制备。仅举例来说，转化(包括转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或结合来实现。适合的转化技术描述于例如萨姆布鲁克J,弗里奇EF(Fritsch EF),马尼亚迪斯T(Maniatis T):分子克隆实验指南,冷泉港实验室出版社,冷泉港, 1989中。

电穿孔已经针对数种一氧化碳营养型产乙酸菌描述，如扬氏梭菌(科普克等人2010)(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、乙酸梭菌(席尔-本格尔道夫(Schiel-Bengelsdorf)和彼得杜瑞(Peter Dürre)2012)或伍氏乙酸杆菌(施特拉茨等人1994)，并且是用于许多梭菌属的标准方法，例如丙酮丁醇梭菌(默梅尔斯坦(Mermelstein)等人,1992,生物技术 (Biotechnology),10,190-195)、解纤维素梭菌(詹内特(Jennert)等人,2000,微生物学(Microbiology),146:3071-3080)或热纤梭菌(秋林等人,2004,环境微生物学应用 (Appl.Environ.Microbiol.)70:883-890)。前噬菌体诱导已经证实用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及在粪味梭菌(普拉桑那·塔玛拉普·帕塔萨拉蒂(Prasanna Tamarapu Parthasarathy),2010,用于产生突变体的粪味梭菌ATCC 25775中的基因修饰***的发展(Development of a GeneticModification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation ofMutants),西肯塔基大学硕士项目(Masters Project Western Kentucky University))的情况下，而结合已经作为许多梭菌属的所选方法加以描述，包括艰难梭菌(赫伯特(Herbert)等人,2003,欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol. Lett.)229:103-110)或丙酮丁醇梭菌(威廉姆斯(Williams)等人,1990,普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)136:819-826)，并且可以按类似方式用于一氧化碳营养型产乙酸菌。

在某些实施例中，由于在待转化的微生物中活跃的限制***，有必要将待引入到微生物中的核酸甲基化。这可以使用各种技术进行，包括下文所描述并且在本文之后的实例章节中进一步例示的那些。

举例来说，在一个实施例中，本发明的重组微生物通过一种包含以下步骤的方法产生：

将穿梭微生物引入到(i)如本文中所述的表达构筑体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构筑体/载体中；

表达甲基转移酶基因；和

从穿梭微生物分离一或多种构筑体/载体；以及

将一或多种构筑体/载体引入到目标微生物中。

在一个实施例中，步骤B的甲基转移酶基因组成性地表达。在另一个实施例中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是被诱导的。

穿梭微生物是微生物，优选地是限制阴性微生物，其有助于构成表达构筑体/载体的核酸序列的甲基化。在一个具体实施例中，穿梭微生物是限制阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌。

甲基化构筑体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。

一旦表达构筑体/载体和甲基化构筑体/载体被引入到穿梭微生物中，存在于甲基化构筑体/载体上的甲基转移酶基因即被诱导。诱导可以通过任何适合的启动子***进行，但在本发明的一个具体实施例中，甲基化构筑体/载体包含诱导型lac启动子并且是通过添加乳糖或其类似物、更优选地是异丙基-β-D-硫基-半乳糖苷(IPTG)来诱导的。其它适合的启动子包括ara、tet或T7***。在本发明的另一个实施例中，甲基化构筑体/载体启动子是组成型启动子。

在一个具体实施例中，甲基化构筑体/载体具有对穿梭微生物的身份具有特异性的复制起点，使得存在于甲基化构筑体/载体上的任何基因都在穿梭微生物中表达。优选地，表达构筑体/载体具有对目标微生物的身份具有特异性的复制起点，使得存在于表达构筑体/载体上的任何基因都在目标微生物中表达。

甲基转移酶的表达引起存在于表达构筑体/载体上的基因的甲基化。表达构筑体/载体可以接着根据多种已知方法中的任一者从穿梭微生物中分离。仅举例来说，下文中描述的实例章节中描述的方法可以用以分离表达构筑体/载体。

在一个具体实施例中，构筑体/载体两者同时经分离。

表达构筑体/载体可以使用任何数目的已知方法引入到目标微生物中。然而，举例来说，可以使用下文实例章节中描述的方法。由于表达构筑体/载体被甲基化，故存在于表达构筑体/载体上的核酸序列能够并入到目标微生物中并且成功地表达。

据设想，甲基转移酶基因可以引入到穿梭微生物中并过度表达。因此，在一个实施例中，所得甲基转移酶可以使用已知方法收集并且体外用于甲基化表达质粒。表达构筑体/载体可以接着被引入到目标微生物中以便表达。在另一个实施例中，甲基转移酶基因被引入到穿梭微生物的基因组中，接着将表达构筑体/载体引入到穿梭微生物中，从穿梭微生物分离一或多种构筑体/载体，并且接着将表达构筑体/载体引入到目标微生物中。

据设想，如上所定义的表达构筑体/载体和甲基化构筑体/载体可以组合以提供物质的组合物。所述组合物在避开限制屏障机制中具有特别效用，从而产生本发明的重组微生物。

本领域的普通技术人员将了解用于产生本发明的微生物的多种适合的甲基转移酶。然而，举例来说，可以使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和本文之后的实例中描述的甲基转移酶。在一个实施例中，甲基转移酶具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或是其功能上等效的变异体。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，将容易了解编码适合的甲基转移酶的核酸。在一个实施例中，编码甲基转移酶的核酸如本文之后的实例中所描述(例如SEQ ID NO:8的核酸，或其是其功能上等效的变异体)。

任何数目的被调适以允许表达甲基转移酶基因的构筑体/载体可以用以产生甲基化构筑体/载体。然而，举例来说，可以使用下文实例章节中描述的质粒。

产生方法

在本发明的一个实施例中，通过微生物发酵的气态底物是含有CO的气态底物。气态底物可以是作为工业工艺的副产物获得的含CO废气，或来自一些其它来源，如来自汽车废气。在某些实施例中，工业工艺选自由以下组成的群组：二价铁金属产品制造(例如钢厂)、非铁产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施例中，含CO气体可以使用任何方便的方法在其排到大气中之前从工业工艺捕获。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢气的气体)的组分。由工业工艺产生的CO通常被燃烧掉以产生CO₂，并且因此本发明在减少CO₂温室气体排放以及产生生物燃料方面具有特别效用。取决于气态含CO底物的组成，也可能需要在将其引入到发酵之前对其进行处理以去除任何非所需杂质，例如尘粒。举例来说，气态底物可以使用已知方法过滤或洗涤。

应了解，为了细菌生长和产物产生得以进行，除了含CO底物气体之外，还将需要适合的液体营养物培养基进料到生物反应器中。

在所述方法方面的具体实施例中，发酵在水性培养基中进行。在所述方法方面的具体实施例中，底物的发酵在生物反应器中进行。

底物和培养基可以按连续、批式或批式进料方式进料到生物反应器中。营养物培养基将含有足以允许所用微生物生长的维生素和矿物质。适用于使用CO发酵的厌氧培养基是本领域中已知的。举例来说，比布尔(Biebel)(2001)描述了适合的培养基。在本发明的一个实施例中，培养基是如本文之后的实例章节中所描述。

发酵应合乎需要地在用于进行生物燃料生产的适当发酵条件下进行。应考虑到的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的CO不会变成限制性的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。

另外，通常需要增加底物液流中的CO浓度(或气态底物中的CO分压)并且由此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。在增加的压力下操作允许CO从气相向液相的转移速率显著增加，在液相中其可以被微生物作为碳源吸收以便产生发酵。这又意味着当在高压而非大气压下维持生物反应器时可以缩短滞留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分取决于所用的本发明的具体微生物。然而，一般来说，优选的是发酵在比环境压力高的压力下执行。此外，由于给定的CO 转化速率在某种程度上是底物滞留时间的函数，并且获得所需滞留时间又指示生物反应器的所需体积，故使用加压***可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此减少发酵设备的资金成本。根据美国专利第5,593,886号中给出的实例，反应器体积可以与反应器操作压力增加成线性比例减小，即，在10大气压的压力下操作的生物反应器仅需要在1大气压的压力下操作的生物反应器的体积的十分之一。

举例来说，已经描述了在较高压力下进行气体到乙醇发酵的益处。举例来说，WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下执行的气体到乙醇发酵，分别得到150克 /升/天和369克/升/天的乙醇产率。然而，发现使用类似培养基和输入气体组合物在大气压下执行的例示性发酵每天每升产生少10与20倍之间的乙醇。

还需要的是含CO的气态底物的引入速率使得确保液相中的CO浓度不会变得限制性。这是因为CO限制性条件的后果可能是一或多种产物被培养物所消耗。

用于进料发酵反应的气流的组成可以对所述反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说，O₂可能会降低厌氧发酵工艺的效率。在发酵之前或之后发酵工艺阶段中对非所需或不必要的气体的处理可能会增加所述阶段的负担(例如其中气流在进入生物反应器之前经压缩，不必要的能量可以用以压缩在发酵中非所需的气体)。因此，可能需要处理底物液流，尤其是来源于工业来源的底物液流，从而去除非所需组分并且增加所需组分的浓度。

在某些实施例中，本发明的细菌的培养物维持在水性培养基中。优选地，水性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。适合的培养基是本领域中已知的，并且描述在例如美国专利第5,173,429号和第5,593,886号和WO 02/08438中，并且如本文之后的实例章节中所描述。

丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇、或者含有丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2- 醇和/或一或多种其它产物的混合液流可以通过本领域中已知的方法从发酵液中回收，所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提和萃取发酵，包括例如液-液萃取。产物还可以扩散或分泌到培养基中，其可以通过相分离从所述培养基中萃取。

在本发明的某些优选实施例中，丙醛、丙-2-酮、丙-1-醇和/或丙-2-醇和一或多种产物通过以下方式从发酵液中回收：从生物反应器中连续去除一部分培养液，从培养液中分离微生物细胞(通过过滤方便地进行)，并且从培养液中回收一或多种产物。醇类可以例如通过蒸馏方便地回收。丙-2-酮可以例如通过蒸馏回收。任何产生的酸可以例如通过吸附于活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞送回到发酵生物反应器中。在已经去除任何醇和酸之后剩余的无细胞渗透物也优选地被送回到发酵生物反应器中。其它营养物(例如B维生素)可以添加到无细胞渗透物中以补给营养物培养基，随后将其送回到生物反应器中。

此外，如果培养液的pH如上文所述经调整以增强乙酸对活性炭的吸附，那么pH 应被再调整到与发酵生物反应器中的培养液的pH类似的pH，随后将其送回到生物反应器中。

实例

现将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。

微生物和生长条件

自产乙醇梭菌DSM23693、食一氧化碳梭菌DSM15243和扬氏梭菌DSM13528和丁酸梭菌DSM 10702来源于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures),德国不伦瑞克市因霍芬斯特拉斯7B 38124(Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany))。自产乙醇梭菌DSM23693 是自产乙醇梭菌DSM10061的衍生物。

将大肠杆菌在好氧和厌氧条件两者下培养，而将所有其它菌株严格厌氧地生长于血清瓶中的50ml体积的液体培养基中，所述血清瓶具有果糖(异养生长)或在顶部空间中具有30psi含CO的钢厂气体(从位于新西兰格伦布鲁(Glenbrook,NZ)的新西兰钢厂(NewZealand Steel)收集；组成：44％CO、32％N₂、22％CO₂、2％H₂)(自养生长)。

使用标准厌氧技术(亨盖特RE(Hungate RE):用于培养严格厌氧菌的旋转管方法(A roll tube method for cultivation of strict anaerobes),诺里斯JR(Norris JR)和里朋DW (Ribbons DW)(编),微生物学方法(Methods in Microbiology),第3B卷.纽约的学术出版社(Academic Press,New York),1969:117-132；沃尔夫RS(Wolfe RS):甲烷的微生物形成(Microbial formation of methane).微生物生理学进展(Adv MicrobPhysiol), 1971,6:107-146)根据表2-4中给出的配方制备培养基。对于固体培养基，添加1.2％细菌琼脂(BD，美国新泽西州法兰克顿湖07417(Frankton Lakes,NJ 07417,USA))。

所有菌株都在37℃下生长。

PETC培养基(自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌pH 5.6、丁酸梭菌pH 6.8)

加强的梭菌培养基RCM(食一氧化碳梭菌)

培养基组分	每1.0L培养基的浓度
		酪蛋白的胰腺消化物	5g
朊间质蛋白胨第3号	5g
		牛肉提取物	10g
酵母提取物	3g
		右旋糖	5g
NaCl	5g
		可溶淀粉	1g
半胱氨酸盐酸盐	0.5g
		乙酸钠	3g
果糖	5g

Luria Bertani培养基LB(大肠杆菌)

当规定时，在接种时添加丙-1,2-二醇到5g L-1的最终浓度，并且在培养物已经生长40小时之后进行最终代谢物分析。

代谢物的分析

为去除蛋白质和其它细胞残余物，将400μl样品与100μl的2％(w/v)5-磺基水杨酸混合，并且在14,000×g下离心3分钟以分离沉淀的残余物。然后将10μl上清液注射到 HPLC中用于分析。2,3-丁二醇、2-丁醇和其它代谢物的HPLC分析使用配备有在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在35℃下的Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm，粒度9μm)的Agilent1100系列HPLC***执行。将略微酸化的水(0.005M H₂SO₄)用作流速为0.6ml/min的流动相。为了区别2,3-丁二醇立体异构体，使用配备有在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在60℃下的Alltech IOA-2000有机酸柱(150×6.5mm，粒径8μm)的Agilent 1100系列HPLC***执行HPLC分析。将略微酸化的水(0.005M H₂SO₄)用作流速为0.25ml/min的流动相。

丙-2-酮、丙-2-醇和其它代谢物的GC分析使用配备有Supelco PDMS 100 1cm纤维、 Alltech EC-1000(30m×0.25mm×0.25μm)柱和火焰离子化检测器(FID)的Agilent6890N 顶空GC执行。将5ml样品转移到亨盖特管中，在水浴中加热到40℃，并且暴露于纤维恰好5分钟。将注射器保持在250℃下，并且将恒定流速为1ml/min的氦气用作载体气体。烘箱程序是40℃下5分钟，随后每分钟升高10℃直到200℃。然后将温度以每分钟 50℃的速率进一步升高到220℃，随后保持这一温度5分钟，随后将温度以每分钟50℃的速率降低到40℃，并且最终保持1分钟。将FID保持在250℃下，40ml/min氢气、 450ml/min空气和15ml/min氮气作为构成气体。

鉴别丙-1,2-二醇向丙-2-酮、丙-2-醇、丙醛、丙-1-醇的反应

在接种时添加丙-1,2-二醇(外消旋)到自产乙醇梭菌的培养物中。在生长两天之后，出人意料地发现丙-1,2-二醇如图2中所见转化为丙-1-醇和丙-2-醇。当(S)-丙-1,2-二醇添加到培养物中时，其转化为丙-1-醇，并且可以看到中间物丙醛(图2)。当(R)-丙-1,2-二醇添加到培养物中时，其转化为丙-2-醇(图2)。所用HPLC方法无法拆分丙-2-醇和丙 -2-酮，但通过GC可以看到中间物丙-2-酮的存在(图3)。

丙-1,2-二醇向丙醛的转化已经针对数种二醇脱水酶加以描述。存在两种类型的先前描述的二醇脱水酶，例如肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌的B12依赖性(丙烷)二醇脱水酶类型(EC 4.2.1.28)(寅弥T,白樫T(Shirakashi T),小菅T(Kosuga T)1976)，和例如乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)或丁酸梭菌的B-12非依赖性甘油/二醇脱水酶类型(EC 4.1.2.30)(布赖恩(Brien)等人2004；哈特马尼斯(Hartmanis)和斯塔特曼(Stadtman)1986)(表1)。

表1：

然而，未曾观察到丙-1,2-二醇向丙-2-酮和丙-2-醇的转化，并且催化这一反应的酶先前是未知的。此外未描述过丙-1,2-二醇的立体特异性转化。本发明人此处如图1中所描绘，鉴别出丙-1,2-二醇向丙-2-酮加丙-2-醇和/或丙醛和丙-1-醇的立体特异性反应。不束缚于这一理论，本发明人认为，自产乙醇梭菌的新颖二醇脱水酶将(R)-丙-1,2-二醇立体特异性转化为丙-2-酮并且将(S)-丙-1,2-二醇立体特异性转化为丙-2-醇。

然后如早先的美国专利申请第US 13/403,972号和第US 13/459,211号中所描述通过伯:仲醇脱氢酶(SEQ ID NO:5和6)催化丙-2-酮向丙-2-醇的转化。此类酶的主要功能还可以催化丙醛向丙-1-醇的还原(伊斯梅尔(Ismaiel)等人1993)，如同许多其它伯醇脱氢酶和特定乙醇脱氢酶一样。

鉴别二醇脱水酶基因

自产乙醇梭菌的基因组中的检索鉴别出在氨基酸水平上与丁酸梭菌的B12非依赖性甘油脱水酶(ABX65443和ABX65444)具有低同源性(一致性＝503/844(59％)，阳性＝626/844(74％)，空隙＝63/844(7％)，相应地一致性＝125/257(49％)，阳性＝181/257 (70％)，空隙＝0/257(0％))的基因(SEQ ID NO:3和4)。

这种酶已经使用ClosTron***在自产乙醇梭菌中敲除(西普(Heap)等人2007)，这导致菌株不能利用丙-1,2-二醇和形成任何丙-2-酮、丙-2-醇、丙醛或丙-1-醇，因此证实这种酶代表了引起丙-1,2-二醇立体特异性转化为丙-2-酮和丙醛的新颖二醇脱水酶。

将在ClosTron.com托管的佩鲁特卡算法(Perutka algorithm)用以鉴别在pMTL007C-E2载体中化学合成的基因的有义链上的碱基2052与2053之间的基团II内含子目标位点，并且设计内含子靶向区(SEQ ID NO:13)。最终载体 pMTL007C-E2-pfl-1136-2052!2053s含有逆转位活化的ermB标记物(RAM)，其在***到目标位点中之后赋予对抗生素克拉霉素(Clarithromycin)的抗性。

将pMTL007C-E2-pfl-1136-2052! 2053s质粒引入到如上文所述的自产乙醇梭菌中。单一菌落的划线依序在具有15μg/ml甲砜霉素(thiamphenicol)的PETC-MES琼脂上制得，并且使用引物Og84f(SEQ ID NO:14)和Of85r(SEQ ID NO:15)(侧接目标基因中的基团II内含子***位点)和Maxime PCR预混试剂盒通过PCR针对基团II内含子***来随机筛选8个菌落。16s rDNA也使用引物fD1(SEQ ID NO:16)和rP2(SEQ ID NO:17)以及Maxime PCR预混试剂盒进行PCR扩增。316bp的PCR产物指示未经修饰的野生型基因型，并且约2kb的PCR产物指示基团II内含子***在目标基因中。所有8个克隆对于基因破坏来说都是阳性的，如通过扩增约2kb PCR产物可见(图10)。此外，对克隆4(SEQ ID NO:18和19)和7(SEQ ID NO:20和21)的PCR产物的测序证实PCR产物是RAM盒情况下的基团II内含子靶向片段。克隆4(SEQID NO:22和 23)和7(SEQ ID NO:24和25)的16s rDNA PCR产物还经序列验证，其证实两个克隆是自产乙醇梭菌。这些结果证实了自产乙醇梭菌中推定二醇脱水酶基因的破坏。将克隆 4通过在丙-1,2-二醇存在下生长来进行测试，并且所述菌株不能利用丙-1,2-二醇和形成任何丙-2-酮、丙-2-醇或丙-1-醇(图11)，因此证实这种酶代表了引起丙-1,2-二醇立体特异性转化为丙-2-酮和丙醛的新颖二醇脱水酶。

类似基因(CLJU_c11830；9444800和CLJU_c11831；9444801)和酶(YP_003779353和YP_003779354)仅以分别99％(一个错配)和100％的一致性存在于扬氏梭菌中。相应的基因和酶标注为丙酮酸:甲酸裂解酶而非二醇脱水酶。二醇脱水酶(SEQ ID NO:1) 的BLAST结果展示于表2，图8中的概述中(黑色条柱是与参考自产乙醇梭菌二醇脱水酶的氨基酸序列的错配，白色区域代表空隙)。可以看出，仅存在于扬氏梭菌中而非任何其它酶(例如丁酸梭菌的已知酶)的酶(SEQ ID NO:9)的位置596与656之间存在特定结构域，而酶的其余部分具有良好同源性。不束缚于这一理论，本发明人相信，这一蛋白质结构域可以使得丙-1,2-二醇转化为丙-2-酮和丙醛。

为了测试是否仅自产乙醇梭菌和扬氏梭菌的二醇脱水酶可以催化丙-1,2-二醇向丙 -2-酮和丙醛的这一新颖反应，使与自产乙醇梭菌和扬氏梭菌共有数种特征的其它一氧化碳营养型生物体，如紧密相关的拉氏梭菌(科普克等人2011)(WO 2008/028055)；和具有相关二醇脱水酶的生物体，例如丁酸梭菌，在5g/L丙-1,2-二醇的外消旋混合物存在下生长(表3)。为确保表达甘油/二醇脱水酶基因，使丁酸梭菌在甘油存在下生长。

表3：一氧化碳营养型生物体和具有已知二醇脱水酶的生物体和大肠杆菌中丙-1,2- 二醇的转化：

扬氏梭菌细胞实际上能够将外消旋丙-1,2-二醇转化为丙-1-醇和丙-2-醇，因为存在相同酶以及仲醇脱氢酶(图4)。然而，拉氏梭菌展示外消旋丙-1,2-二醇未转化或消耗(图 5)。食一氧化碳梭菌消耗所有外消旋丙-1,2-二醇，但仅产生丙-1-醇而非丙-2-酮或丙-2- 醇(图6)。丁酸梭菌也将外消旋丙-1,2-二醇转化为丙-1-醇(图9)，证实了文献中描述的结果(布赖恩等人2004)。对于食一氧化碳梭菌，之前尚未观察到丙-1,2-二醇的转化，但食一氧化碳梭菌具有针对与产酸克雷伯氏菌的维生素B-12依赖性酶同源的脱水酶的基因。

如上文所描述，自产乙醇梭菌的二醇脱水酶是立体特异性的，将丙-1,2-二醇的(S)- 形式和(R)-形式转化为不同产物。使丁酸梭菌的培养物与丙-1,2-二醇的不同立体异构体一起生长，以确定其是否具有类似立体特异性。在接种时以1g L-1(13mM)添加丙-1,2-二醇；外消旋、(R)或(S)。在40小时之后，(S)-丙-1,2-二醇情况下的培养物已经将所有二醇都转化为丙-1-醇。外消旋丙-1,2-二醇情况下的培养物已经将约64％转化为丙-1-醇(8.3mM)。(R)-丙-1,2-二醇情况下的培养物已经将约19％转化为丙-1-醇(2.5mM)(表 4)。

表4：丁酸梭菌中1g L-1(13mM)丙-1,2-二醇异构体在40小时生长之后的转化

引起丁酸梭菌中丙-1,2-醇转化的酶似乎使(S)-异构体以比(R)-异构体更大的速率转化，然而两种异构体都转化为丙-1-醛并且还原为丙-1-醇。这表明，丁酸梭菌的酶是同源二醇脱水酶并且不能如自产乙醇梭菌的酶一样立体特异性转化。两种异构体都不像在自产乙醇梭菌的培养物中观察到的那样由丁酸梭菌酶脱水为丙-2-酮。

表达自产乙醇梭菌中的异源二醇脱水酶以增加转化速率

将磷酸转乙酰酶-乙酸激酶操纵子(Ppta-ack)的启动子区使用引物Ppta-ack-NotI-F (SEQ ID NO:10：GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC)和Ppta-ack-NdeI-R(SEQ IDNO:11：TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)扩增，并且使用NotI和NdeI限制位点克隆到大肠杆菌-梭菌属穿梭载体pMTL83151(FJ797647.1)中(西普等人2009)，产生质粒pMTL83155。将编码产酸克雷伯氏菌的二醇脱水酶的基因pddABC密码子优化 (SEQ ID NO:12)，并且合成。然后将合成的pddABC操纵子使用限制酶NdeI和EcoRI 亚克隆到pMTL83155中。

将质粒pMTL83155-pddABC用以使用上文所描述的方法转化自产乙醇梭菌。在含有15μg mL^-1甲砜霉素的YTF-琼脂(8g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、2g/L NaCl、2.5g/L 果糖和7.5g/L琼脂，pH 5.8)上执行外生长，将细胞由板上刮下并且悬浮于0.5mL PBS 中并且扩散在YTF-琼脂上，并且在37℃下在30psi真正厂气(Real Mill Gas)中孵育。将单一菌落再划线在含有15μg mL^-1甲砜霉素的PETC-MES-琼脂上，然后再划线在含有 15μg mL^-1甲砜霉素和0.5％果糖的PETC-MES-琼脂上。从具有果糖的板中拾取多个菌落，并且在30psi真正厂气下在鲍尔奇管(Balch tube)中在3mL具有0.5％果糖的 PETC-MES中生长。通过PCR验证质粒的存在。

当携带pMTL83155-pddABC的自产乙醇梭菌在丙-1,2-二醇存在下生长时，比在不具有质粒的样品中产生更多丙-1-醇。转基因菌株也比野生型产生更少丙-2-醇(图7)。这些数据表明，转基因菌株以比野生型自产乙醇梭菌更快的速率将丙-1,2-二醇转化为丙-1-醇。

二醇脱水酶活化剂酶

丁酸梭菌的二醇脱水酶理解为甘氨酰基自由基酶，需要活化剂酶通过还原性裂解S- 腺苷甲硫氨酸而产生自由基(雷诺(Raynaud)等人2003，奥布赖恩(O'brien)等人2004)。具有类似甘氨酰基自由基化学性质的其它同源酶，例如丙酮酸甲酸裂解酶和厌氧核糖核苷酸还原酶具有类似结构和活化剂酶(阿塔(Atta)等人,2010)。与丁酸梭菌二醇脱水酶具有59％一致性的自产乙醇梭菌二醇脱水酶(SEQ ID NO:1)理解为具有类似结构并且进行丙-1,2-二醇脱水的类似化学反应。编码自产乙醇梭菌中的活化剂酶(SEQ ID NO: 2)的基因(SEQ ID NO:4)直接在二醇脱水酶的下游，如在丁酸梭菌中和在大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶的基因中所观察到。

大肠杆菌中的二醇脱水酶和活化剂酶的功能表达

为证实对引起新颖活性的基因的鉴别并且展现替代性宿主中的酶功能，编码自产乙醇梭菌的二醇脱水酶(SEQ ID NO:1)和活化剂酶(SEQ ID NO:2)的基因经表达并且证实在大肠杆菌中起作用。合成基因(SEQ ID NO:3-4)，针对大肠杆菌(SEQ ID NO:26) 密码子优化，并且在质粒pTrc99A(安玛西亚法玛西亚(Amersham Pharmacia))上在操纵子中表达。

用构筑的质粒(pTrc-dhaB1B2)和用pTrc99A(作为对照)转化大肠杆菌JM109。将生长于LB中的过夜培养物用以接种补充有0.2mg/mL硫酸铁铵十二水合物并且含有 60mM丙-1,2-二醇(R、S或外消旋)的2X-YT。在4小时37℃下的好氧生长之后，添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷到1mM的最终浓度以诱导二醇脱水酶的表达，并且对管子加盖。然后使培养物在30℃下生长。在48小时之后，通过HPLC测量丙-1,2-二醇和产物的浓度(表5)。在外消旋丙-1,2-二醇的情况下，底物的浓度已经降低到34mM，分别产生9.2mM和14.7mM丙酮(丙-2-酮)和丙-1-醇(图12)。大肠杆菌缺乏仲醇脱氢酶，而无法如自产乙醇梭菌那样将丙-2-酮还原为丙-2-醇。通过GC验证丙-2-酮以确保其不是丙-2-醇，所述醇在所用HPLC方法上具有类似滞留时间。

表5：丙-1,2-二醇异构体通过表达自产乙醇梭菌二醇脱水酶的大肠杆菌的立体特异性转化

这证实了表达自产乙醇梭菌的异源二醇脱水酶操纵子的重组大肠杆菌中丙-1,2-二醇向丙-2-酮和1-丙醇的成功转化。

先前已经描述了用大肠杆菌产生丙-1,2-二醇的路径(杰恩和颜2011)。与自产乙醇梭菌的二醇脱水酶操纵子组合表达这一路径使得可产生丙酮。仲醇脱氢酶基因(如美国专利申请第US 13/403,972号和第US 13/459,211号中所描述)可以经共表达以用于异丙醇产生，而范莱文2012(WO2011032934)中所述的共表达基因允许异丁烯产生。

本文中已经参考某些优选实施例描述本发明，以便读者无需过度实验就能实践本发明。然而，本领域的普通技术人员将易于认识到，许多组分和参数可以在不脱离本发明的范围的情况下在一定程度上加以改变或修改或取代成已知等效物。应了解，所述修改和等效物如同单独阐述般并入本文中。提供标题、小标题等以增强读者对本文件的理解，并且不应被解读为限制本发明的范围。

上文和下文(如果存在的话)提出的所有申请、专利和公开的全部公开内容特此以引用的方式并入。然而，对本说明书中的任何申请、专利和公开的提及不是并且不应被视为其在世界上任何国家中构成有效现有技术或形成部分公共常识的承认或任何形式的建议。

除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和随附的任何权利要求中，词语“包含”、“包含了”等应以与排他性意义相反的包含性意义(也就是说，在“包括但不限于”的意义上)理解。

Claims

1.一种重组微生物，其包含SEQ ID NO: 1的异源、立体特异性二醇脱水酶和SEQ IDNO: 2的异源活化剂酶。

2.一种重组自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）微生物，其包含SEQ IDNO: 1的立体特异性二醇脱水酶和SEQ ID NO: 2的活化剂酶，其中所述微生物与野生型自产乙醇梭菌相比过度表达所述立体特异性二醇脱水酶和/或所述活化剂酶。

3.权利要求2的微生物，其中所述微生物比野生型自产乙醇梭菌具有更高的编码所述立体特异性二醇脱水酶和/或所述活化剂酶的基因的平均拷贝数。

4.权利要求1或2的微生物，其中所述微生物产生丙-2-酮、丙-1-醇和丙醛中的一种或多种。

5.权利要求1或2的微生物，其中所述微生物还包含内源性或外源性醇脱氢酶。

6.权利要求5的微生物，其中所述醇脱氢酶是仲醇脱氢酶。

7.权利要求6的微生物，其中所述微生物产生丙-2-醇。

8.权利要求1或2的微生物，其中所述微生物还包含内源性醇脱氢酶的表达减弱或敲除。

9.权利要求8的微生物，其中所述醇脱氢酶是仲醇脱氢酶。

10.产生丙-2-酮、丙-1-醇和丙醛中的一种或多种的方法，包括在包含丙-1,2-二醇的底物存在下培养权利要求1或2的微生物，从而所述微生物产生丙-2-酮、丙-1-醇和丙醛中的一种或多种。

11.产生丙-2-醇的方法，包括在包含丙-1,2-二醇的底物存在下培养权利要求2或6的微生物，从而所述微生物产生丙-2-醇。

12.权利要求10或11的方法，其中所述丙-1,2-二醇是(R)-丙-1,2-二醇和(S) -丙-1,2-二醇中的一种或两种。

13.权利要求10或11的方法，其中所述底物包括糖、淀粉、纤维素、生物质、合成气、甘油和包含CO的气体中的一种或多种。