KR101577503B1 - 1,3-프로판디올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용하여, 1,3-프로판디올을 생산하는 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 1,3-프로판디올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.
세 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH2OHCH2CH2OH)인 1,3-프로판디올은 폴리에스테르나 폴리우레탄 등 고분자의 단량체로 사용 가능하며, 또한, 화장품 및 개인 위생용품 등의 성질개선 용도로의 첨가제로 사용 가능하다. 특히 1,3-프로판디올과 테레프탈릭산 (terephthalic acid)의 중합 반응에 의해 생성되는 직선성의 방향족 폴리에스터인 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (PTT, polytrimethylene terephthalate)는 semi-crystal 분자 구조 상에서 발생하는 킨크(kink)라 불리는 독특한 꼬임이 고분자 사슬 상에 존재하여 반방 탄성 및 형태 안정성이 우수하며, 이러한 구조적 특성으로 인해 섬유, 포장 및 필름, 부직포 구조물, 엔지니어링 플라스틱 등 폭넓고 다양한 분야에 적용이 가능하다.
1,3-프로판디올은 화학적 합성과 생물학적 합성으로 생산할 수 있다. 화학적 생산 방법으로는 에틸렌옥사이드(ethylene oxide)나 아크롤레인(acrolein)을 원료로 하여 수소첨가반응에 의해 제조하는 방법이 있으나, 비용이 많이 들고 환경 오염물질을 함유한 폐유출물을 발생시킨는 문제점이 있다.
생물학적 방법으로는 옥수수 유래의 당을 원료로 사용한 재조합 대장균 발효에 의한 생산과 글리세롤 등을 원료로 1,3-프로판디올 생성 균주 (1,3-propanediol natural producer) 발효에 의한 생산이 있다. 옥수수와 같은 바이오매스 유래의 당을 탄소 기질로 하여 1,3-프로판디올을 생산하는 단독 미생물 (재조합 대장균)은 미국 듀폰 (DuPont)社에 의해 개발되어 현재 상업 생산에 사용되고 있다 (WO 2001/12833). 한편, 글리세롤을 원료로 1,3-프로판디올을 생산하는 균주들에 대해서는 1세기 전부터 알려져 있는데, 예를 들어, 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 시트로박터 (Citrobacter), 락토바실러스 (Lactobacillus) 군 등이 있다. 이러한 균주들은 글리세롤의 환원적 대사 경로를 통해 1,3-프로판디올을 생산하고, 산화적 대사경로를 통해 성장에 필요한 탄소원, 에너지원 및 1,3-프로판디올 생산에 필요한 조효소 (NAHD)를 공급 받는다.
대표적 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)는 그람 음성 (G(-)) 세균으로, 1,3-프로판디올 뿐 아니라 2,3-부탄디올 생산 능력 역시 뛰어나다. 이러한 특성은 글리세롤을 원료로 1,3-프로판디올 생산에 제약점이 되는데, 2,3-부탄디올이 1,3-프로판디올과 유사한 비점을 가지고 있어 정제 과정을 어렵게 만들고 최종 정제 수율을 낮추는 문제를 발생시킨다. 이를 해결하기 위해 유전자 재조합 기술을 적용하여 글리세롤 대사 경로 중 부산물을 생성하는 산화 대사 경로를 차단하고, 1,3-프로판디올을 생성하는 환원 대사 경로만을 갖는 변이체를 제작하여 2,3-부탄디올을 비롯한 산화 대사 부산물들은 생성하지 않도록 시도하였으나, 1,3-프로판디올 생산성이 떨어져 상용화에 적용하기 힘든 경우도 있었다 (대한민국 특허출원 제 10-2008-0122166호).
이에, 본 발명자들은 1,3-프로판디올 생산 시 2,3-부탄디올을 포함한 산화 대사 부산물의 생성이 적은 재조합 미생물을 연구하던 중 특정 유전자들이 결실된 재조합 미생물의 경우, 1,3-프로판디올의 생산 수율, 생산성 저하 없이 부산물이 저감 생산되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 1,3-프로판디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 글리세롤 대상 경로에서 주요 부산물인 락테이트, 2,3-부탄디올, 포름산 생성이 억제됨으로써, 정제 과정을 어렵게 하는 2,3-부탄디올 생성이 없고, 높은 선택도 및 수율로 1,3-프로판디올을 생산할 수 있다.
도 1은 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니아의 글리세롤 대사 경로를 나타낸다.
도 2는 클렙시엘라 뉴모니아 내에 존재하는 2,3-부탄디올 합성 관련 유전자 오페론을 도식한 것이다.
도 3 내지 6은 재조합 클렙시엘라 균주들을 회분식 발효하여 2,3-부탄디올을 생산한 결과를 나타낸다(2,3-BDO: 2,3-부탄디올, 1,3-PDO:, 1,3-프로판디올) (도 3: Kp △ ldhA △ pflB, 도 4: Kp △ ldhA △ pflB △ budA, 도 5: Kp △ ldhA △ pflB △budC, 도 6: Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC).
도 2는 클렙시엘라 뉴모니아 내에 존재하는 2,3-부탄디올 합성 관련 유전자 오페론을 도식한 것이다.
도 3 내지 6은 재조합 클렙시엘라 균주들을 회분식 발효하여 2,3-부탄디올을 생산한 결과를 나타낸다(2,3-BDO: 2,3-부탄디올, 1,3-PDO:, 1,3-프로판디올) (도 3: Kp △ ldhA △ pflB, 도 4: Kp △ ldhA △ pflB △ budA, 도 5: Kp △ ldhA △ pflB △budC, 도 6: Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC).
본 발명은,
피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
피루베이트
및 아세틸
코에이
생합성 경로를 갖는 미생물
본 발명의 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는다. 본 발명의 아세틸 코에이(Acetyl-CoA) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 아세틸 코에이 생합성 경로는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세틸 코에이가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 본 발명의 피루베이트 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 피루베이트가 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 피루베이트 생합성 경로는 PEP로부터 피루베이트가 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 글리세롤 등의 탄소원으로부터 피루베이트 및 아세틸 코에이를 생합성하는 경로를 갖는다.
본 발명의 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물은 전술한 상기 생합성 경로들을 갖는 미생물이면 되고 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 야생형으로 갖고 있는 미생물 또는 유전자 재조합에 의하여 갖게 되는 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 1,3-프로판디올의 생성능을 갖는 미생물이다. 상기 미생물은 클렙시엘라 (Klebsiella) 속, 엔테로벡터 (Enterobacter) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 속이고, 더욱 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니아이다.
1,3-
프로판디올
생산용 재조합 미생물
본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 1,3-프로판디올의 생산성, 수율이 높으며, 상기 재조합 미생물은 발효 시 야생형 미생물에 비하여 발효액 내 1,3-프로판디올의 농도가 높은 특징이 있다. 또한 본 발명의 재조합 미생물은 락테이트, 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산 등과 같은 산화 부산물들의 생성이 억제되며, 특히 목표 산물인 1,3-프로판디올과 유사한 비점을 가지고 있어 정제 과정을 어렵게 만들고 최종 정제 수율을 낮추는 2,3-부탄디올의 생성이 억제된 것이다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산의 생성능이 없다. 상기, 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산의 “생성능이 없다”는 것은 이들을 실질적으로 생산하지 않는다는 것을 의미하며, 이는 포름산, 2,3-부탄디올, 숙신산을 제거하는 별도의 공정이 필요하지 않다는 것을 의미한다.
바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제된 것이며, 더욱 바람직하게는, 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제되거나 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로 및 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 억제된 것이며, 더더욱 바람직하게는 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로 및 피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 모두 억제된 것이다.
바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 회분식 배양을 기준으로 1,3-프로판디올의 수율이 0.40 g/g 이상이며, 생산성이 1.5 g/L/hr 이상이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 하기 식 1에 의하여 계산할 때, 발효 산물 내 1,3-프로판디올의 비율이 80 중량% 이상이며, 더욱 바람직하게는 85 중량% 이상이고, 더더욱 바람직하게는 88 중량% 이상이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 락테이트의 비율이 5 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 2 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 포름산의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 2,3-부탄디올의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다. 바람직하게는 본 발명의 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물은 발효 산물 내 숙신산의 비율이 1 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만이다.
<식 1>
발효 산물 내 특정 산물의 비율 = {발효 산물 내 특정 산물의 농도/(발효 산물 내 1,3-프로판디올, 락테이트, 포름산, 2,3-부탄디올, 에탄올, 초산 및 숙신산의 농도의 총 합)} X 100
피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로의 억제
피루베이트로부터 2,3-부탄디올을 생산하는 미생물은 도 1에서와 같이 알파-아세토락테이트 합성 효소 (α-acetolactate synthase), 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (α-acetolactate decarboxylase), 아세토인 리덕타아제 (acetoin reductase)와 같은 일련의 전환 효소군을 가지고 있다. 하기 경로 1에서처럼 알파-아세토락테이트 합성 효소는 피루베이트를 알파-아세토락테이트로, 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제는 알파-아세토락테이트를 아세토인으로, 아세토인 리덕타아제는 아세토인을 2,3-부탄디올로의 전환을 촉매한다.
<경로 1>
피루베이트 → 알파-아세토락테이트 (α-acetolactate) → 아세토인 (acetoin) → 2,3-부탄디올
이들 2,3-부탄디올 합성에 관련된 효소들의 전사는 전사 활성화 인자에 의해 조절 받으며, 2,3-부탄디올 합성 효소들 및 전사 활성화 인자를 코딩하는 유전자들은 미생물 내 유전체 상에서 도 2와 같이 군을 이루어 존재하며 이를 2,3-부탄디올 오페론이라 한다. 상기 2,3-부탄디올 오페론 상에 존재하는 효소들의 억제는 각 유전자들의 발현 억제, 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 2,3-부탄디올 오페론 상의 효소들을 코드하는 유전자인 budR(레귤레이터(regulator)를 코드함), budA(ALDC, 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제(α-acetolactate decarboxylase)를 코드함), budB(ALS, 알파-아세토락테이트 합성효소(α-acetolactate synthetase)를 코드함), budC(AR, 아세토인 리덕타아제(acetoin reductase)를 코드함) 중 하나 혹은 그 이상을 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 2,3-부탄디올 합성 효소를 억제할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 재조합 미생물은 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제 중 하나 이상이 억제됨으로써 피루베이트를 2,3-부탄디올로 전환하는 경로가 억제되며, 더욱 바람직하게는 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제되고, 더더욱 바람직하게는 이들을 코드하고 발현을 조절하는 유전자인 budR , budA , budB 및 budC의 발현이 억제된다.
피루베이트를
아세틸
코에이와
포름산으로 전환하는 경로의 억제
피루베이트-포르메이트 리아제(pyruvate-formate lyase)는 통성 혐기 조건에서 피루베이트를 아세틸 코에이와 포름산으로의 전환을 촉매한다 (경로 2).
<경로 2>
피루베이트 → 아세틸 코에이 + 포름산
상기 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제함으로써 피루베이트를 아세틸 코에이로 전환하는 경로 및 포름산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 피루베이트-포르메이트 리아제의 억제는 피루베이트-포르메이트 리아제의 발현 억제, 피루베이트-포르메이트 리아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 피루베이트-포르메이트 리아제를 코드하는 유전자인 pflB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 피루베이트-포르메이트 리아제를 억제할 수 있다.
피루베이트를
락테이트로
전환하는 경로의 억제
락테이트 탈수소화효소 (lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 탈수소화효소를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 탈수소화효소의 억제는 락테이트 탈수소화효소의 발현 억제, 락테이트 탈수소화 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 탈수소화효소를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 탈수소화효소를 억제할 수 있다. 상기 경로가 억제된 본 발명의 재조합 미생물은 발효 산물 내 락테이트의 비율이 12 중량% 미만이며, 더욱 바람직하게는 8 중량% 미만이고, 더더욱 바람직하게는 5 중량% 미만이다.
1,3-
프로판디올의
생산 방법
본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법에 대한 것이다.
상기 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건 (microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
-1,3-프로판디올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 1,3-프로판의 양
-1,3-프로판 수율(g/g): 1,3-프로판디올 생산량(g)/탄소원(g)
-1,3-프로판디올 생산성(g/L/h): 단위 시간, 단위 부피당 생산되는 1,3-프로판디올의 양
<실험예 1> 재조합 미생물의 제조
클렙시엘라
뉴모니아
GSC123
△
ldhA
(
Kp
△
ldhA
) 균주
락테이트 탈수소화효소 (ldhA)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA (Kp △ ldhA) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 락테이트 탈수소화효소를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다(표 1).
표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 뉴모니아 야생형에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.
클렙시엘라
뉴모니아
GSC123
△
ldhA
△
pflB
(
Kp
△
ldhA
△
pflB
) 균주
피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB ( Kp △ ldhA △ pflB) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 피루베이트-포르메이트 리아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 pflB (서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다(표 2).
표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA ( Kp △ ldhA ) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.
클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budA ( Kp △ ldhA △ pflB △budA) 균주
2,3-부탄디올 합성 경로 상에서 알파-아세토락테이트를 아세토인으로 전환시키는 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (α-acetolactate decarboxylase, budA)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budA ( Kp △ldhA △ pflB △ budA) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budA (서열번호 17)의 상동 부위 1 (서열번호 18)을 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 21)를 서열번호 22 및 23의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 24)을 완성하였다(표 3).
표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)와 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB (Kp △ ldhA △ pflB) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.
클렙시엘라
뉴모니아
GSC123
△
ldhA
△
pflB
△
budC
(
Kp
△
ldhA
△
pflB
△budC
) 균주
2,3-부탄디올 합성 경로 상에서 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환시키는 아세토인 리덕타아제 (acetoin reductase, budC)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budC (Kp △ ldhA △ pflB △ budC) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 아세토인 리덕타아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budC (서열번호 25)의 상동 부위 1 (서열번호 26)을 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 29)를 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 32)을 완성하였다(표 4).
표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)와 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB (Kp △ ldhA △ pflB) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.
클렙시엘라
뉴모니아
GSC123
△
ldhA
△
pflB
△
budRABC
(
Kp
△
ldhA
△
pflB
△budRABC
) 균주
2,3-부탄디올 오페론을 구성하는 유전자들 (budRABC), 즉, 전사 활성화 인자 (budR), 알파-아세토락테이트 디카르복실라아제 (budA), 알파-아세토락테이트 합성 효소 (budB), 아세토인 리덕타아제 (budC)가 추가로 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB △ budRABC (Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 뉴모니아의 2,3-부탄디올 오페론을 클로닝하기 위해 표적 유전자인 budRABC (서열번호 33)의 상동 부위 1 (서열번호 34)을 서열번호 35 및 36의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2 (서열번호 37)를 서열번호 38 및 39의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 40)을 완성하였다(표 5).
표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.
상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)와 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB)가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 △ ldhA △ pflB (Kp △ ldhA △ pflB) 균주에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.
상기 본 발명을 위해 제작한 재조합 클렙시엘라 뉴모니아의 genotype은 하기 표 6과 같다.
<실험예 2> 1,3-프로판디올의 생산
상기 실험예 1에서 제작한 재조합 균주들을 배양하여 1,3-프로판디올을 생산하였다. 이 때, 비교예로는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 GSC123 (Kp wt)를 사용하였다.
각 재조합 균주들을 250 ml의 복합배지에 접종하여 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 발효시켰다. 이 때, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 200 rpm), 46 g/L 글리세롤(500mM glycerol), pH 7.0, 배양 온도 37℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 암모니아 (NH3)를 사용하였다. 상기 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 1,3-프로판디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, ldhA이 결실된 재조합 균주(Kp △ ldhA)는 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 (Kp wt)의 최대 부산물이었던 락테이트가 획기적으로 감소하였다. 그러나, 그 외 부산물들인 포름산, 2,3-부탄디올, 에탄올, 초산, 숙신산 모두가 증가하여 최종 1,3-프로판디올 생산 농도 및 생산 수율이 오히려 감소하였다. 또한, ldhA와 pflB 이 동시에 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB)의 경우 상기 야생형 클렙시엘라 뉴모니아 균주인 Kp wt 또는 ldhA가 결실된 클렙시엘라 뉴모니아 균주인 Kp △ ldhA와 비교할 때, 2,3-부탄디올을 제외한 모든 부산물들이 대폭 감소하였고, 최종 1,3-프로판디올 생산 농도 및 생산 수율이 증가하였다. 그러나, 2,3-부탄디올의 농도 증가는 상당하였다.
2,3-부탄디올 합성에 관여하는 효소군 중 일부를 제거한 재조합 균주들 즉, Kp △ ldhA △ pflB △ budA 나 Kp △ ldhA △ pflB △ budC 와 비교할 때, 전체 2,3-부탄디올 오페론을 결실시킨 재조합 균주인 Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC의 경우에서 가장 높은 1,3-프로판디올 농도와 가장 낮은 부산물 생산을 얻을 수 있었고, 생산 수율 및 생산성 측면에서도 가장 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 한편, 2,3-부탄디올 축적을 감소시키기 위한 유전자 결실에서 budA를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △pflB △ budA)와 budRABC를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC)는 효과가 있었으나 budC를 결실시킨 경우(Kp △ ldhA △ pflB △ budC)는 효과가 없었으며, budA가 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB △ budA)의 경우 발효 성능이 좋지 않아 발효 종료 시점인 24 시간 후에도 잔류 글리세롤이 관찰되었다. 그러나, budRABC가 결실된 재조합 균주 (Kp △ ldhA △ pflB △ budRABC)의 경우, 모균주(Kp △l d hA △ pflB)와 유사한 발효 패턴을 보이면서 2,3-부탄디올을 생산하지 않았다(표 7 및 8, 도 3 내지 6).
<110> GS CALTEX
<120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED 1,3-PROPANEDIOL
PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING 1,3-PROPANEDIOL USING
THE SAME
<130> GSP120902
<160> 40
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 1
atgaaaatcg cggtttatag tacgaagcag tacgataaaa agtacctgca gcacgttaat 60
gatgcatacg gctttgaact ggaattcttc gatttcctgc tgacagcgaa gactgccaaa 120
accgccaacg gttgcgaagc ggtatgtatc ttcgtcaatg acgacggcag ccgcccggtg 180
ctggaagagc tgaaggccca cggggtgaaa tatatcgccc tgcgctgcgc cgggtttaac 240
aacgtcgacc ttgaggcggc aaaggagctt ggcctgcgcg tcgtgcgcgt tccagcttac 300
tctccggaag cggtcgctga gcatgcgatc ggtatgatga tgtcgctcaa ccgccgcatc 360
caccgcgctt accagcgtac ccgcgatgcc aatttctccc tcgaaggcct caccggcttc 420
accatgtacg gcaaaaccgc cggggtgatc ggcaccggga aaattggcgt agcgatgttg 480
cggatcctca aaggcttcgg catgcgcctg ctggcgttcg acccgtaccc aagcgccgcc 540
gcgctggagc tgggggtgga atatgttgac ctcgccacgc tgtacaagga atcggacgtg 600
atctccctgc actgtccgct gaccgacgaa aactaccacc tgctcaatcg cgaagctttc 660
gatcagatga aagacggggt gatggtgatc aacaccagcc gcggcgccct gatcgactct 720
caggcggcca tcgacgccct gaagcaccag aaaattggcg cgctggggct ggacgtttat 780
gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagac aaatccaacg acgtgatcca ggacgatgtc 840
ttccgccgcc tctccgcctg ccataacgtg ctgtttaccg gccaccaggc gttcctcacc 900
gccgaggcgc tgatcagcat ttcggagacc actctgggta acctgcagca ggtcgccaac 960
ggcgaaacct gtccgaacgc catcgtc 987
<210> 2
<211> 1200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 2
caagcgtgcg cggtgaaccg ggagagggat cgctggccgg cagtttgctc aggcaggcgc 60
tgttgatctc cagctggcca atatgcagcc gccagcggct gggacgcgag agacgggcat 120
cggtcacccg ggcgatttca cagtcgccca ccagataacg cagatcgggg atcagcaggg 180
ccgaccgcgt caggcgcggg ctctcctgca aagagatacg cgtgcccacg ggcagccaga 240
tgcccgccag cgtcggcacc cagtgggtta gcgtcaacag cagggttagc ggcaataaca 300
ccagaactaa caccagcgcg atggcggctt tatatttacc cttcatgggc agttaatatc 360
ctgattcaac ataagtaaaa gccgaaaggc gtccattgtg acacgttcga ccagtgagtg 420
aaagtttacg gcctgttaaa gcatagttgc cagccggact cgcggcgcga cgttcggcca 480
ttatcattta actgttgttt aagtcgcccc tgccacactc cagccagacg ggaatagctt 540
gcgggagagg cggtgtcgtt aattatctcg ctcatagaga gcgcacagga ccactatcca 600
tgggtattgc tgattgtttt tctgcttacc ttcactaaat cctgcgcatt ggtctcgctg 660
gcaatccccg gcacctccgg cctgctgctg ctggggacat tcgcttccgc cagcctcgga 720
catttcctgt taatgtggtc cagcgccagc ctcggcgcca tcggcggatt ctggctatcg 780
tggcggctgg gcattcgcta ccgtcatcgc ctcacccatc tacgctggct gaccgccgag 840
cgtctggccc gcagccgcct cttctttcag cgctatggcc cgtgggctat ctttttcagc 900
cgctttctct ctcccctgag ggctacgctg cccttcgtta gcggcgccag cagtctgccg 960
ctgtggtcgt ttcagctggc taacgtcagc tccggtctgc tgtggccgct tctgctgctc 1020
gcccccggcg ctttcagcct cagtttgtgg tgaaaaaact ttgtctttca aagagattcc 1080
gcaagtccgc gatatgctct agaattagga ttagcaccct ctcattaaac tattttttaa 1140
taattgtacg attattttaa atatgctacc gtgacggtat aatcactgga gaaaagtctt 1200
1200
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 3
tagaggatcc caagcgtgcg cggtgaaccg 30
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 4
gaggagcaca aaagggaaag gcgaagactt ttctccagtg attatac 47
<210> 5
<211> 1199
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 5
cgcctttccc ttttgtgctc ctctcccggg gggagcacat tcagataatc cccacagatc 60
cctgctgcga taccgttaca ctggcttggt tttattagtt atatgattgt tttggagtga 120
aaatgaacaa atttgcggcg cttctggcgg caggtatgct gctgtccggc tgtgtctata 180
atagtaaggt gtccaccggt gcggaacagc tgcagcatca tcgtttcgtg ctgaccagcg 240
tcaacggcca ggcggtcaac gccagcgacc ggccgctgga gctgagcttc ggtgagaaga 300
tggctattac cggcaagatg tatgtatccg gcaatatgtg caacggcttt agcggggaag 360
gtaaagtgtc ggacggcgag ctgaaggtca aatcgctggc gatgacccgg atgctgtgcc 420
acgacgccca gctcaatacc ctggatgcga cgatcgacaa gatgctgcgc gagggtgcgc 480
aggtcgatct gacggaaaac cagttgacgc tggcgaccgc cgaccagacg ctggtctata 540
agctcgccga cctgatgcac tagccggcgt tgaggtgccg ctgacgctgc cccgcgacgg 600
ggccgctgtt agtagccgca gctgccaccc gccagcgcct gctcgctgca gcgtttgccg 660
ttcggcagcg cgcacatgcc aatcgccgaa ccatcgagct gacgagccac cgataacgag 720
ccgcctatca tggcgcagtt ggcctgaccg gcgtcgctca tcgccgcccg cattcccggc 780
gtgacgtgcg ccgccgtggc ctgctgaacg ggttcactac tgcacgcgga cagcaacagc 840
gccgcacatc ctactaacat cgcagctcgc attctctctc ccctcggaaa cgtcttaaaa 900
aagcaaaccc cagaataata ggcagcgtgg cgggcggcgt cgagagggga agtacgtatt 960
tatgcgcctc attaacattt tctagcaaat tttcgcctaa agcttgatct gcctcggcca 1020
tgtcgcccgg cgcaggtggt tcatctcccg gcaggcagcc attttctccg cgaaccacgc 1080
aaaatattga tctggtcacg ggtacccggc gcattgagga cacaaatgca aaaatggcgg 1140
ggtcagcggt ttgctaaact accccttata taattacagg gcgcgtcgcg gtttcacgc 1199
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 6
gtataatcac tggagaaaag tcttcgcctt tcccttttgt gctcctc 47
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 7
atcgcggccg cgcgtgaaac cgcgacgcgc c 31
<210> 8
<211> 2399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 8
caagcgtgcg cggtgaaccg ggagagggat cgctggccgg cagtttgctc aggcaggcgc 60
tgttgatctc cagctggcca atatgcagcc gccagcggct gggacgcgag agacgggcat 120
cggtcacccg ggcgatttca cagtcgccca ccagataacg cagatcgggg atcagcaggg 180
ccgaccgcgt caggcgcggg ctctcctgca aagagatacg cgtgcccacg ggcagccaga 240
tgcccgccag cgtcggcacc cagtgggtta gcgtcaacag cagggttagc ggcaataaca 300
ccagaactaa caccagcgcg atggcggctt tatatttacc cttcatgggc agttaatatc 360
ctgattcaac ataagtaaaa gccgaaaggc gtccattgtg acacgttcga ccagtgagtg 420
aaagtttacg gcctgttaaa gcatagttgc cagccggact cgcggcgcga cgttcggcca 480
ttatcattta actgttgttt aagtcgcccc tgccacactc cagccagacg ggaatagctt 540
gcgggagagg cggtgtcgtt aattatctcg ctcatagaga gcgcacagga ccactatcca 600
tgggtattgc tgattgtttt tctgcttacc ttcactaaat cctgcgcatt ggtctcgctg 660
gcaatccccg gcacctccgg cctgctgctg ctggggacat tcgcttccgc cagcctcgga 720
catttcctgt taatgtggtc cagcgccagc ctcggcgcca tcggcggatt ctggctatcg 780
tggcggctgg gcattcgcta ccgtcatcgc ctcacccatc tacgctggct gaccgccgag 840
cgtctggccc gcagccgcct cttctttcag cgctatggcc cgtgggctat ctttttcagc 900
cgctttctct ctcccctgag ggctacgctg cccttcgtta gcggcgccag cagtctgccg 960
ctgtggtcgt ttcagctggc taacgtcagc tccggtctgc tgtggccgct tctgctgctc 1020
gcccccggcg ctttcagcct cagtttgtgg tgaaaaaact ttgtctttca aagagattcc 1080
gcaagtccgc gatatgctct agaattagga ttagcaccct ctcattaaac tattttttaa 1140
taattgtacg attattttaa atatgctacc gtgacggtat aatcactgga gaaaagtctt 1200
cgcctttccc ttttgtgctc ctctcccggg gggagcacat tcagataatc cccacagatc 1260
cctgctgcga taccgttaca ctggcttggt tttattagtt atatgattgt tttggagtga 1320
aaatgaacaa atttgcggcg cttctggcgg caggtatgct gctgtccggc tgtgtctata 1380
atagtaaggt gtccaccggt gcggaacagc tgcagcatca tcgtttcgtg ctgaccagcg 1440
tcaacggcca ggcggtcaac gccagcgacc ggccgctgga gctgagcttc ggtgagaaga 1500
tggctattac cggcaagatg tatgtatccg gcaatatgtg caacggcttt agcggggaag 1560
gtaaagtgtc ggacggcgag ctgaaggtca aatcgctggc gatgacccgg atgctgtgcc 1620
acgacgccca gctcaatacc ctggatgcga cgatcgacaa gatgctgcgc gagggtgcgc 1680
aggtcgatct gacggaaaac cagttgacgc tggcgaccgc cgaccagacg ctggtctata 1740
agctcgccga cctgatgcac tagccggcgt tgaggtgccg ctgacgctgc cccgcgacgg 1800
ggccgctgtt agtagccgca gctgccaccc gccagcgcct gctcgctgca gcgtttgccg 1860
ttcggcagcg cgcacatgcc aatcgccgaa ccatcgagct gacgagccac cgataacgag 1920
ccgcctatca tggcgcagtt ggcctgaccg gcgtcgctca tcgccgcccg cattcccggc 1980
gtgacgtgcg ccgccgtggc ctgctgaacg ggttcactac tgcacgcgga cagcaacagc 2040
gccgcacatc ctactaacat cgcagctcgc attctctctc ccctcggaaa cgtcttaaaa 2100
aagcaaaccc cagaataata ggcagcgtgg cgggcggcgt cgagagggga agtacgtatt 2160
tatgcgcctc attaacattt tctagcaaat tttcgcctaa agcttgatct gcctcggcca 2220
tgtcgcccgg cgcaggtggt tcatctcccg gcaggcagcc attttctccg cgaaccacgc 2280
aaaatattga tctggtcacg ggtacccggc gcattgagga cacaaatgca aaaatggcgg 2340
ggtcagcggt ttgctaaact accccttata taattacagg gcgcgtcgcg gtttcacgc 2399
<210> 9
<211> 2280
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 9
atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60
cagaatgaag tcaacgtccg tgactttatt cagaaaaact acaccccata tgaaggcgac 120
gaatccttcc tggctggcgc gactgaagcg accaccaagc tgtgggacac cgtaatggaa 180
ggtgtaaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgacactgc cctggcttcc 240
accatcacct ctcacgacgc gggctatatc gagaaaggtc tggaaaaaat cgttggtctg 300
cagaccgaag cgccgctgaa acgtgcgatc atcccgttcg gtggtatcaa aatggttgaa 360
ggttcctgca aagcgtataa tcgcgagctg gacccgatgc tgaaaaaaat cttcacagag 420
taccgtaaaa ctcacaacca gggcgttttc gacgtctata ccccggacat tctgcgctgc 480
cgtaaatccg gcgtgctgac gggtctgccg gatgcttacg gtcgtggtcg tatcatcggt 540
gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa attcgcccag 600
ttcaactctc tgcaagcgaa actggaaagc ggcgaagacc tggaagcgac catccgtctg 660
cgtgaagaaa tcgctgaaca acaccgcgca ctgggccaga tcaaagagat ggccgctaaa 720
tatggctatg acatctccgg tccggcgacc accgctcagg aagcgattca gtggacctac 780
ttcggttacc tggctgccgt gaaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt cggtcgtacc 840
tccagcttcc tggatatcta catcgagcgt gacctgcagg cgggtaaaat caccgagcaa 900
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accccggaat atgatgaact gttctccggc gacccgattt gggcaacgga atccatcggc 1020
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ccgctgagct tcaagaaatt cgccgctaaa gtgtccatcg atacctcttc tctgcagtat 1200
gagaacgatg acctgatgcg tccggacttc aacaacgacg actacgctat cgcatgctgc 1260
gtaagcccga tggttgttgg taagcaaatg cagttcttcg gcgctcgcgc taacctcgcg 1320
aaaaccatgc tgtacgctat caacggcggc gtggatgaaa aactgaaaat gcaggttggt 1380
ccgaaatctg aaccgatcaa aggcgacgtc ctgaacttcg acgaagtaat ggatcgcatg 1440
gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacgtcaccg cgctgaacat catccactac 1500
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cgcaccatgg cgtgtggtat cgctggtctg tccgttgctg ctgactccct gtctgctatc 1620
aaatatgcga aagttaaacc gattcgtgac gaagacggtc tggctatcga cttcgaaatc 1680
gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaac gaccctcgcg tcgatgacat ggccgttgac 1740
ctggttgaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgcaa cgctatcccg 1800
actcagtctg ttctgaccat cacctctaac gtggtgtacg gtaagaaaac cggtaatacc 1860
ccagacggtc gtcgcgctgg cgcgccgttc ggtccaggtg ctaacccgat gcacggccgt 1920
gaccagaaag gcgcagtagc ctctctgacc tccgtcgcta aactgccgtt tgcttacgcg 1980
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gttcgtaaga ccaacctggc gggtctgatg gatggttact tccatcacga agcgtccatc 2100
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gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgtgtat ctggctacgc cgtacgtttt 2220
aactccctga ccaaagaaca gcagcaggat gttattaccc gtaccttcac tcagaccatg 2280
2280
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 10
gtttgtgctg ctgatgtggt tatcaggcga atatatgact gccaacggcg gctgggggct 60
aaacgttctg cagaccgccg accacaaaat gcaccatact tttgtggagg ccgtgagcct 120
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cctgatggat aaagcgatga tcatggtcct gccggtagcg atgttcgttg ccagcggctt 240
tgagcacagc atcgccaaca tgtttatgat cccgatgggt atcgtaatcc gcaactttgc 300
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tatgaacttc atcactgata acctgattcc ggtaactatc gggaacatta tcggcggggg 420
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gttgtttcag gcagtaaata aaaaatccac ttaagaaggt aggtgttac 529
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 11
ggatccgttt gtgctgctga tgtggttatc aggc 34
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 12
cgccttttca gtcagacagg gaagtaacac ctaccttctt aagtgg 46
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 13
ttccctgtct gactgaaaag gcgtacaata aaggccccac atcagtgggg cctttttaac 60
aagcattccc cgccccagcc tgctttgcca gttatctata ctttgggtac ctgtcaaaac 120
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atggcccagg catccgcttt attacctttt tccagggctg cctgatgcgc tgcctgtact 300
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tgaaagaggt ggtgacctat cgtcacttta tgaatgcttc cggcggcggc gtcaccgcct 420
cgggcggtga ggcgatcctg caggcggagt ttgttcgcga ctggttccgc gcgtgtaaga 480
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tcgacgagct gctggaggta acagacctgg tgatgctgga tctcaagcag atgaac 596
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 14
ccacttaaga aggtaggtgt tacttccctg tctgactgaa aaggcg 46
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 15
gcggccgcgt tcatctgctt gagatccagc atcacc 36
<210> 16
<211> 1125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 16
gtttgtgctg ctgatgtggt tatcaggcga atatatgact gccaacggcg gctgggggct 60
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<210> 17
<211> 777
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 17
atgaatcatt ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctat gcgaaaccct gcgggcgttt 60
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<210> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 18
gcagattaaa ggctttactg ctctcgcacg gcaggcggac gaaggcgata tccagctcgg 60
cctcgctcag ggcggtcatc agattggcca tattgtcttc catctggtgc agggtcaccc 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> artificial sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> artificial sequence
<400> 22
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<212> DNA
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<223> artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 24
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<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
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<213> Artificial Sequence
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<223> artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 30
aagtcgcact tgttaccggc gccatgaccg gtcagtcatt gctgatcg 48
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<220>
<223> artificial sequence
<400> 31
gcggccgccc aggggccgga gttcacttgc c 31
<210> 32
<211> 1216
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 32
gctgcgtatc gttcgcgcca tgcaggacat cgtcaacagc gacgtcacgt tgaccgtgga 60
catgggcagc ttccatatct ggattgcccg ctacctgtac agcttccgcg cccgccaggt 120
gatgatctcc aacggccagc agaccatggg cgtcgccctg ccctgggcca tcggcgcctg 180
gctggtcaat cctgagcgca aagtggtctc cgtctccggc gacggcggct tcctgcagtc 240
gagcatggag ctggagaccg ccgtccgcct gaaagccaac gtgctgcacc tgatctgggt 300
cgataacggc tacaacatgg tggccattca ggaagagaaa aaataccagc gcctgtccgg 360
cgtcgagttt gggccgatgg attttaaagc ctatgccgaa tccttcggcg cgaaagggtt 420
tgccgtggaa agcgccgagg cgctggagcc gaccctgcgc gcggcgatgg acgtcgacgg 480
cccggcggta gtggccatcc cggtggatta tcgcgataac ccgctgctga tgggccagct 540
gcatctgagt cagattctgt aagtcatcac aataaggaaa gaaaaatgaa aaaagtcgca 600
cttgttaccg gcgccatgac cggtcagtca ttgctgatcg acggcggcat ggtgtttaac 660
taataaaaaa aagctctgac atggcttgcc cctgctttcg cgcaggggct ttttttggtt 720
tgggtgtaag tgtaagcatc ccggagaaac gaagcatcga tatttgaggg cttctggcgt 780
tctcacttac gcttcgacac gacgtgggca atctgactgg gatgaaggtc tgatttgagc 840
gaggagcgga agttcgggaa cgggatagct ctgacctgcc accaggatta gatacaaccg 900
tcagttagta aggtcggttt gtttaccttc acattttcca tttcgccacc gtgctgcaaa 960
ctctgatggc gtctgataat tcagtgctga atgtggacga cactcgttat aatcctgccg 1020
ccagtcatta atgattttcc ttgcgtgaac gatatcgctg aaccagtgct cattcaggca 1080
ttcatcgcga aatcgtccgt taaagctctc aataaatccg ttctgcgttg gcttgcccgg 1140
ctggattaag cgcaactcaa caccatgctc aaaggcccat tgatccagtg cacggcaagt 1200
gaactccggc ccctgg 1216
<210> 33
<211> 4236
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 33
gaacatcgcc agaaagcgtt tcaccgtacg cgagcgctcg aagcgccgcc aggcgatggc 60
gatatcggtc ttcagcggcg ccccgctaag cgggtgatag ctgacgttcg gctgctggat 120
gcaggtcatc gactgcggaa ccagcgcgaa gccgaagcca gcattgacca tgctcagcga 180
cgacgaaatt tgcgacgact gccaggcgcg ctccatatcg atcccggcgc gcagacagct 240
gttgtacacc agctcataca gcccgggggc cacctcccgc gggaagagga tcggcgccac 300
gtcgcgcagc tgctccaggg ccagggtcgg ctgcgtcgcc agcgggttat cgcgcggcag 360
cgcgataacc atcggctcct catcgataat ccgcagatta aaggctttac tgctctcgca 420
cggcaggcgg acgaaggcga tatccagctc ggcctcgctc agggcggtca tcagattggc 480
catattgtct tccatctggt gcagggtcac cccggggtgg tcgagctgaa aacggtgcag 540
cagcgtgaag atttgcggat ggaaagcatc agaactggta atgcctagcg acaggctgcc 600
gttcatcccg cgcgcaatgc ccttggcctt ctccagcgcc gcatcgctca tggcgaggat 660
ctggcgggca tcctcataga aagactctcc cgcttccgtc agctccaccc cgcgggttaa 720
acgccggaac agcggggtcc ccacctcgcg ctcaagccgc tgaatttgct gacttaacgg 780
aggctgtgaa atacccagct ccttggcggc ctgggtgaag tgccgcgtcc tggcgacggc 840
gacaaaatag cgaagataac gaagttccat atcgaaaacg tctcaaacca gcatggtttc 900
tatattggaa ctgtgagctg aatcgggtca acatttattt aacctttctt atatttgttg 960
aacgaggaag tggtatatga atcattctgc tgaatgcacc tgcgaagaga gtctatgcga 1020
aaccctgcgg gcgttttccg cgcagcatcc cgagagcgtg ctctatcaga catcgctcat 1080
gagcgccctg ctgagcgggg tttacgaagg cagcaccacc atcgccgacc tgctgaaaca 1140
cggcgatttc ggcctcggca cctttaatga gctggacggg gagctgatcg ccttcagcag 1200
tcaggtctat cagctgcgcg ccgacggcag cgcgcgcaaa gcccagccgg agcagaaaac 1260
gccgttcgcg gtgatgacct ggttccagcc gcagtaccgg aaaacctttg accatccggt 1320
gagccgccag cagctgcacg aggtgatcga ccagcaaatc ccctctgaca acctgttctg 1380
cgccctgcgc atcgacggcc atttccgcca tgcccatacc cgcaccgtgc cgcgccagac 1440
gccgccgtac cgggcgatga ccgacgtact cgacgatcag ccggtgttcc gctttaacca 1500
gcgcgaaggg gtgctggtcg gcttccggac cccgcagcat atgcagggga tcaacgtcgc 1560
cgggtatcac gagcatttta ttaccgatga ccgcaaaggc ggcggtcacc tgctggatta 1620
ccagctcgac cacggggtgc tgaccttcgg cgaaattcac aagctgatga tcgacctgcc 1680
cgccgacagc gcgttcctgc aggctaatct gcatcccgat aatctcgatg ccgccatccg 1740
ttccgtagaa agttaagggg gtcacatgga caaacagtat ccggtacgcc agtgggcgca 1800
cggcgccgat ctcgtcgtca gtcagctgga agcacagggg gtacgccagg tgttcggcat 1860
ccccggcgcc aaaatcgaca aggtcttcga ttcactgctg gattcctcca ttcgcattat 1920
tccggtacgc cacgaagcca acgccgcatt tatggccgcc gccgtcggac gtattaccgg 1980
caaagcgggc gtggcgctgg tcacctccgg tccgggttgt tctaacctga tcaccggcat 2040
ggccaccgcg aacagcgaag gcgacccggt ggtggccctg ggcggcgcgg taaaacgcgc 2100
cgataaagcc aaacaggtcc accagagtat ggatacggtg gcgatgttca gcccggtcac 2160
caaatacgcc gtcgaggtga cggcgccgga tgcgctggcg gaagtggtct ccaacgcctt 2220
ccgcgccgcc gagcagggcc ggccgggcag cgcgttcgtt agcctgccgc aggatgtggt 2280
cgatggcccg gtcagcggca aagtactgcc ggccagcggg gccccgcaga tgggcgccgc 2340
gccggatgat gccatcgacc aggtggcgaa gcttatcgcc caggcgaaga acccgatctt 2400
cctgctcggc ctgatggcca gccagccgga aaacagcaag gcgctgcgcc gtttgctgga 2460
gaccagccat attccagtca ccagcaccta tcaggccgcc ggagcggtga atcaggataa 2520
cttctctcgc ttcgccggcc gggttgggct gtttaacaac caggccgggg accgtctgct 2580
gcagcttgcc gacctggtga tctgcatcgg ctacagcccg gtggaatacg aaccggcgat 2640
gtggaacagc ggcaacgcga cgctggtgca catcgacgtg ctgcccgcct atgaagagcg 2700
caactacacc ccggatgtcg agctggtagg cgatatcgcc ggcactctca acaagctggc 2760
gcaaaatatc gatcatcggc tggtgctctc cccgcaggca gcggagatcc tccgcgaccg 2820
ccagcaccag cgcgagctgc tggaccgccg cggcgcgcag ctcaaccagt ttgccctgca 2880
tccgctgcgt atcgttcgcg ccatgcagga catcgtcaac agcgacgtca cgttgaccgt 2940
ggacatgggc agcttccata tctggattgc ccgctacctg tacagcttcc gcgcccgcca 3000
ggtgatgatc tccaacggcc agcagaccat gggcgtcgcc ctgccctggg ccatcggcgc 3060
ctggctggtc aatcctgagc gcaaagtggt ctccgtctcc ggcgacggcg gcttcctgca 3120
gtcgagcatg gagctggaga ccgccgtccg cctgaaagcc aacgtgctgc acctgatctg 3180
ggtcgataac ggctacaaca tggtggccat tcaggaagag aaaaaatacc agcgcctgtc 3240
cggcgtcgag tttgggccga tggattttaa agcctatgcc gaatccttcg gcgcgaaagg 3300
gtttgccgtg gaaagcgccg aggcgctgga gccgaccctg cgcgcggcga tggacgtcga 3360
cggcccggcg gtagtggcca tcccggtgga ttatcgcgat aacccgctgc tgatgggcca 3420
gctgcatctg agtcagattc tgtaagtcat cacaataagg aaagaaaaat gaaaaaagtc 3480
gcacttgtta ccggcgccgg ccaggggatt ggtaaagcta tcgcccttcg tctggtgaag 3540
gatggatttg ccgtggccat tgccgattat aacgacgcca ccgccaaagc ggtcgcctcc 3600
gaaatcaacc aggccggcgg ccgcgccatg gcggtgaaag tggatgtttc tgaccgcgac 3660
caggtatttg ccgccgtcga acaggcgcgc aaaacgctgg gcggcttcga cgtcatcgtc 3720
aacaacgccg gcgtggcgcc atccacgccg atcgagtcca ttaccccgga gattgtcgac 3780
aaagtctaca acatcaacgt caaaggggtg atctggggca tccaggcagc ggtcgaggcc 3840
tttaagaaag agggtcacgg cgggaaaatc atcaacgcct gttcccaggc cggccacgtc 3900
ggcaacccgg agctggcggt atatagctcg agtaaattcg cggtacgcgg cttaacccag 3960
accgccgctc gcgacctcgc gccgctgggc atcacggtca acggctactg cccggggatt 4020
gtcaaaacgc cgatgtgggc cgaaattgac cgccaggtgt ccgaagccgc cggtaaaccg 4080
ctgggctacg gtaccgccga gttcgccaaa cgcatcaccc tcggccgcct gtccgagccg 4140
gaagatgtcg ccgcctgcgt ctcctatctt gccagcccgg attctgatta tatgaccggt 4200
cagtcattgc tgatcgacgg cggcatggtg tttaac 4236
<210> 34
<211> 701
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 34
ccagctggtg ctcaatggct tcggcgacag cagccacgcc cgggctgaag tcgccgcgct 60
gggcaagatc cccggctatc acgacgccga cctgcgcgac gtcgggcaga tcgaggcgat 120
gatgcgctat gccgaaagca ccttcggcgg cgtcgatatc gtgatcaata acgccggcat 180
ccagcacgtg gccccggtgg agcagttccc ggtggacaaa tggaacgata ttctcgccat 240
caatctctcc agcgtcttcc acaccacccg cctggcgctg ccgggtatgc gccagcgcaa 300
ctgggggcgc atcatcaaca ttgcctcagt gcatggcctg gtggcgtcga aagagaaatc 360
ggcctacgtc gccgccaagc acgcggtggt cgggctgacc aaaaccgtgg ccctggaaac 420
cgcgcgcagc ggtatcacct gcaacgccat ctgccctggc tgggtgctaa ccccgctggt 480
gcagcagcag atcgacaaac gcatcgccga gggggtcgac ccggagcagg ccagcgccca 540
gctgctggcg gaaaaacagc cctccgggga gtttgtcacc ccgcagcagc tgggcgaaat 600
ggcgctgttt ctgtgcagcg atgccgccgc ccaggtgcgc ggcgccgcat ggaacatgga 660
tggcggctgg gtggcgcagt aagccgctgg cgccgcgaag a 701
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 35
tagaggatcc ccagctggtg ctcaatggct tcg 33
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 36
caagccatgt cagagctttt ttttatcttc gcggcgccag cggc 44
<210> 37
<211> 701
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 37
taaaaaaaag ctctgacatg gcttgcccct gctttcgcgc aggggctttt tttggtttgg 60
gtgtaagtgt aagcatcccg gagaaacgaa gcatcgatat ttgagggctt ctggcgttct 120
cacttacgct tcgacacgac gtgggcaatc tgactgggat gaaggtctga tttgagcgag 180
gagcggaagt tcgggaacgg gatagctctg acctgccacc aggattagat acaaccgtca 240
gttagtaagg tcggtttgtt taccttcaca ttttccattt cgccaccgtg ctgcaaactc 300
tgatggcgtc tgataattca gtgctgaatg tggacgacac tcgttataat cctgccgcca 360
gtcattaatg attttccttg cgtgaacgat atcgctgaac cagtgctcat tcaggcattc 420
atcgcgaaat cgtccgttaa agctctcaat aaatccgttc tgcgttggct tgcccggctg 480
gattaagcgc aactcaacac catgctcaaa ggcccattga tccagtgcac ggcaagtgaa 540
ctccggcccc tggtcagttc ttatcgtcgc cggatagcct cgaaacagtg caatgctgtc 600
cagaatacgc gagacctgaa cgcctgaaat cccaaaggca acagtgaccg tcaggcattc 660
ctttgtgaaa tcatcgacgc aggtaagaca cttgatcctg c 701
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 38
gccgctggcg ccgcgaagat aaaaaaaagc tctgacatgg cttg 44
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 39
gatcgcggcc gcgcaggatc aagtgtctta cctgcg 36
<210> 40
<211> 1402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 40
ccagctggtg ctcaatggct tcggcgacag cagccacgcc cgggctgaag tcgccgcgct 60
gggcaagatc cccggctatc acgacgccga cctgcgcgac gtcgggcaga tcgaggcgat 120
gatgcgctat gccgaaagca ccttcggcgg cgtcgatatc gtgatcaata acgccggcat 180
ccagcacgtg gccccggtgg agcagttccc ggtggacaaa tggaacgata ttctcgccat 240
caatctctcc agcgtcttcc acaccacccg cctggcgctg ccgggtatgc gccagcgcaa 300
ctgggggcgc atcatcaaca ttgcctcagt gcatggcctg gtggcgtcga aagagaaatc 360
ggcctacgtc gccgccaagc acgcggtggt cgggctgacc aaaaccgtgg ccctggaaac 420
cgcgcgcagc ggtatcacct gcaacgccat ctgccctggc tgggtgctaa ccccgctggt 480
gcagcagcag atcgacaaac gcatcgccga gggggtcgac ccggagcagg ccagcgccca 540
gctgctggcg gaaaaacagc cctccgggga gtttgtcacc ccgcagcagc tgggcgaaat 600
ggcgctgttt ctgtgcagcg atgccgccgc ccaggtgcgc ggcgccgcat ggaacatgga 660
tggcggctgg gtggcgcagt aagccgctgg cgccgcgaag ataaaaaaaa gctctgacat 720
ggcttgcccc tgctttcgcg caggggcttt ttttggtttg ggtgtaagtg taagcatccc 780
ggagaaacga agcatcgata tttgagggct tctggcgttc tcacttacgc ttcgacacga 840
cgtgggcaat ctgactggga tgaaggtctg atttgagcga ggagcggaag ttcgggaacg 900
ggatagctct gacctgccac caggattaga tacaaccgtc agttagtaag gtcggtttgt 960
ttaccttcac attttccatt tcgccaccgt gctgcaaact ctgatggcgt ctgataattc 1020
agtgctgaat gtggacgaca ctcgttataa tcctgccgcc agtcattaat gattttcctt 1080
gcgtgaacga tatcgctgaa ccagtgctca ttcaggcatt catcgcgaaa tcgtccgtta 1140
aagctctcaa taaatccgtt ctgcgttggc ttgcccggct ggattaagcg caactcaaca 1200
ccatgctcaa aggcccattg atccagtgca cggcaagtga actccggccc ctggtcagtt 1260
cttatcgtcg ccggatagcc tcgaaacagt gcaatgctgt ccagaatacg cgagacctga 1320
acgcctgaaa tcccaaaggc aacagtgacc gtcaggcatt cctttgtgaa atcatcgacg 1380
caggtaagac acttgatcct gc 1402
Claims (14)
- 피루베이트 및 아세틸 코에이 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로 및 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 억제되고,
2,3-부탄디올의 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 디카르복실라아제가 억제됨으로써 아세토락테이트를 아세토인으로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 디카르복실라아제, 알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
서열번호 33의 염기 서열을 갖는 유전자가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
포름산 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
피루베이트를 아세토락테이트로 전환하는 경로 또는 아세토인을 2,3 부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
숙신산 생성이 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
피루베이트를 아세토락테이트로 전환하는 경로 및 아세토인을 2,3 부탄디올로 전환하는 경로가 억제되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
락테이트 탈수소화효소가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
피루베이트를 포름산으로 전환하는 경로가 추가로 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
피루베이트 포르메이트 리아제가 추가로 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 합성효소 또는 아세토인 리덕타아제가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
알파-아세토락테이트 합성효소 및 아세토인 리덕타아제가 억제된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양물로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는,
1,3-프로판디올의 생산 방법.
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