CN101528936A

CN101528936A - 以高产率从甘油生物产生1，3-丙二醇的方法

Info

Publication number: CN101528936A
Application number: CN200680056179A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·索凯勒
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2009-09-09
Also published as: CA2665448A1; MX2009004659A; TW200835793A; KR20090090319A; US20100137655A1; EP2084288A1; EP2400027A1; WO2008052595A1; JP2010508013A; AR065833A1; BRPI0622099A2; US8236994B2

Abstract

本发明提供通过在包含甘油作为碳源的适合的培养基中培养梭菌属菌株并回收1，3－丙二醇来厌氧产生1，3－丙二醇的方法，其中所述梭菌属菌株基本上不产生甘油代谢的其它选自下组的产物：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

Description

以高产率从甘油生物产生1，3-丙二醇的方法

发明领域

本发明包含通过经代谢改造的(metabolically engineered)梭菌属(Clostridium)将甘油以高产率生物转化为1，3-丙二醇的方法。

发明背景

1，3-丙二醇是聚酯纤维的生产中使用的单体，并且在聚氨酯和环状化合物的制备中具有潜在的用途。

1，3-丙二醇可以通过不同的化学途径在膦存在下自i)丙烯醛(acrolein)、水和氢ii)环氧乙烷、一氧化碳和水产生，及在一氧化碳存在下自甘油和氢产生。所有这些方法的共同点是昂贵并且生成含有污染物质的废料流。

1，3-丙二醇可以通过用不同的梭菌属发酵甘油而作为乙酸/丁酸/乳酸/1，3-丙二醇混合物产生。梭菌属中甘油的常规代谢示于图1。

在一种途径中，甘油在两步酶促反应工序中转化为1，3-丙二醇。在第一步中，甘油脱水酶催化甘油转化成3-羟基丙醛(3-HPA)和水。在第二步中，通过NADH依赖性1，3-丙二醇脱氢酶将3-HPA还原成1，3-丙二醇。大多数产1，3-丙二醇的梭菌属使用由dhaB1B2B3结构基因编码的B12依赖性甘油脱水酶，而丁酸梭菌(Clostridum butyricum)使用由dhaB1结构基因编码的B12非依赖性酶。对于B12依赖性甘油脱水酶，orfX和orfZ编码甘油脱水酶再活化因子，而对于仅有的已知的B12非依赖性酶，dhaB2编码S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)依赖性活化因子。在编码结构和活化因子的基因附近，还存在编码1，3-丙二醇脱氢酶(dhaT)的基因。从甘油产生1，3-丙二醇消耗NADH。

在另一种途径中，当甘油不转化成1，3-丙二醇时，其通过分别由glpk和glpA编码的甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶，或通过分别由dhaD编码的甘油脱氢酶继之以dhaK1K2编码的DHA激酶，氧化成二羟丙酮磷酸(DHAP)并伴有NADH产生。然后DHAP将进入糖酵解途径，产生丙酮酸和乙酰辅酶A作为关键中间物。丙酮酸和乙酰辅酶A可以通过ldh基因编码的乳酸脱氢酶和adhE编码的双功能醛-醇脱氢酶分别还原成乳酸和乙醇。乙酰辅酶A也可以转化成丁酰辅酶A，丁酰辅酶A是这样一种中间产物，其能够：

i)通过分别由ptb和buk基因编码的磷酸转丁酰酶和丁酸激酶转化成丁酸，或

ii)通过由adhE编码的双功能醛-醇脱氢酶还原成丁醇。

在产溶剂梭菌属中，通过分别由ctfAB和adc基因编码的辅酶A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶从乙酰乙酰辅酶A(丁酰辅酶A产生过程中的中间物)产生丙酮。氢通过hydA基因编码的仅作用于铁的(iron only)氢化酶产生。

天然和重组梭菌均产生1，3-丙二醇，最大产率为每克甘油0.55g，原因是还原型化合物如丁酸(丁酸盐)、乳酸(乳酸盐)、乙醇或丁醇的共同产生。为了增加1，3-丙二醇的产率，有必要避免所有还原型副产物的产生，并且将1，3-丙二醇的产生与氧化型副产物结合。

不能产生丁酸的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株在文献中已有描述(Green等，1996)。由于与不可复制质粒的单交换而获得的buk基因失活，丁酸形成显著降低。检测了这种突变菌株的1，3-丙二醇产生，如(Gonzalez-Pajuelo，2005，Metabolic Engineering)中所示。这种重组菌株有效地产生1，3-丙二醇作为主要发酵产物，但是也产生使1，3-丙二醇产率降低的丁醇。

梭菌属进行的甘油的1，3-丙二醇发酵可以以分批培养、补料分批培养或连续培养进行。

有待本发明解决的问题是以高产率从甘油生物产生1，3丙二醇，并且不伴随产生还原型化合物如丁酸、乳酸或醇。这种产生通过使用梭菌属的厌氧发酵来进行。

发明内容

申请人已经解决并陈述了问题，并且本发明提供一种通过将梭菌属菌株培养在包含甘油作为碳源的适当培养基中并回收1，3-丙二醇来厌氧产生1，3丙二醇的方法，其中所述梭菌属菌株基本上不产生选自下组的其它甘油代谢产物：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

1，3-丙二醇可以与甘油代谢的单一氧化型产物共同产生。

在本发明的具体方面，梭菌属菌株经修饰以限制1，3-丙二醇以外的来自甘油的代谢物产生，这种产生过程的生物途径消耗NADH或NADPH。

在本发明的一个方面，天然产生1，3-丙二醇的梭菌属经遗传修饰以更高产率产生1，3-丙二醇，所述遗传修饰通过：

i)缺失编码丁酸激酶的基因(buk)或编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因以避免丁酸产生

ii)任选地，缺失全部编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以避免乳酸产生

iii)任选地，缺失编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)以避免醇形成。

在本发明的另一个方面，天然产生丁酸但是不能产生1，3-丙二醇的梭菌属经遗传修饰以高产率产生1，3-丙二醇。通过如下实现这种结果：用编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的丁酸梭菌操纵子替换编码丁酸途径中涉及的酶的ptb或buk基因，并且：

i)任选地，缺失全部编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以避免乳酸产生

ii)任选地，缺失编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)以避免醇形成。

在本发明进一步的方面，天然产生乙醇但是不能产生1，3-丙二醇的梭菌属经遗传修饰而产生1，3-丙二醇。通过如下实现这种结果：用编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的丁酸梭菌操纵子替换编码乙醇途径中涉及的酶的adhE基因之一，并且：

i)任选地，缺失所有编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以避免乳酸产生

ii)任选地，缺失所有编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)以避免醇形成。

在本发明的另一个方面，通过弱化编码氢化酶的基因(hydA)使氢产生通量降低，继而使还原当量通量重新定向于1，3-丙二醇产生。

在本发明的另一个方面，1，3-丙二醇产生通量通过引入来自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操纵子(编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶)的额外拷贝而增加。

本发明的另一个目的是提供重组梭菌属菌株，该菌株可用于高产率产生1，3-丙二醇的方法。

附图简述

纳入并构成本说明书一部分的附图示例了本发明，并且与说明书一起提供用于解释本发明的原理。

图1描述不同梭菌属的中心代谢(central metabolism)。

1：丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶；2：硫解酶；3：β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶；4：巴豆酸酶；5：丁酰辅酶A脱氢酶；6：乳酸脱氢酶；7：磷酸转乙酰酶；8：乙酸激酶；9：乙醛乙醇脱氢酶；10：氢化酶；11：辅酶A转移酶(乙酰乙酰辅酶A：乙酸/丁酸：辅酶A转移酶)；12：乙酰乙酸脱羧酶；13：磷酸转丁酰酶(Phospho-transbutyrylase)；14：丁酸激酶；15：丁醛-丁醇脱氢酶；16：甘油脱水酶；17：1，3丙二醇脱氢酶。

发明详述

如用于本文，以下术语可以用来解释权利要求和说明书。

术语“梭菌属”指属于这个科的各种细菌。

适合的培养基指为了具体使用的梭菌属菌株的生长和二醇产生来优化的培养基。

术语“碳底物”或“碳的来源”的意思是任何能够由微生物代谢的碳源，其中所述底物含有至少一个碳原子。在本发明中，甘油是碳的单一来源。

短语“微生物经修饰”的意思是已经以改变其遗传特征为目的对菌株进行了转化。内源基因可以被弱化、缺失或过表达。外源基因可以被引入、通过质粒携带或整合入菌株的基因组，从而在细胞中表达。

术语“弱化”指基因表达的降低或蛋白质(基因的产物)活性的降低。本领域技术人员已知多种手动来获得这种结果，例如：

-向基因中引入突变，降低这种基因的表达水平，或编码的蛋白质的活性水平。

-用低强度启动子替换基因的天然启动子，导致更低的表达。

-使用使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件。

-如果需要无表达，那么缺失所述基因。

术语“缺失的基因”意指将所述基因编码序列中的实质部分去除。优选地，去除编码序列的至少50％，并且更优选至少80％。

术语“质粒”或“载体”如用于本文指额外染色体元件，其通常携带不是所述细胞中心代谢的部分的基因，并且通常为环状双链DNA分子的形式。

在本发明的说明书中，酶通过它们的比活性来鉴别。因此这种定义包括所有也存在于其它生物中的具有限定的比活性的多肽，更特别是存在于其它微生物中的具有限定的比活性的多肽。具有类似活性的酶通常能够通过将它们分组为如PFAM或COG定义的特定家族来鉴定。

PFAM(蛋白质家族的比对和隐蔽马尔科夫模型数据库(protein familiesdatabase of alighments and hidden Markov models)；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表了蛋白质序列比对的大集合。通过每个PFAM可以显现多个比对，了解蛋白质结构域，评估在多种生物之中的分布，获得对其它数据库的访问，并显现已知的蛋白质结构。

COG(蛋白质直向同源组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较来自43个完整测序的基因组的蛋白质序列而获得的，这些基因组代表30个主要种族发育谱系。每个COG由至少三个谱系定义，这允许对以往保守结构域的鉴定。

鉴定同源序列和它们的百分比同源性的手段是本领域技术人员公知的，并且具体包括BLAST程序，其能够在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站上按该网站上指示的缺省参数使用。然后可以利用(例如，比对)获得的序列，使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，及在这些网站上指示的缺省参数。

使用GenBank中提供的关于已知基因的参考文件，本领域技术人员能够在其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中确定等效基因(equivalent gene)。这种常规工作如下有力地进行：使用共有序列，所述共有序列可以通过如下来确定：使用源自其它微生物的基因进行序列比对，并且设计简并探针从而在另一种生物中克隆相应的基因。这些分子生物学的常规方法是本领域技术人员熟知的，并且在例如Sambrook等(Molecular Cloning：a Laboratory Manual.2^nd ed.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NewYork，1989.)中描述。

本发明提供通过将梭菌属菌株培养在包含甘油作为碳源的适合的培养基中并回收1，3-丙二醇来厌氧产生1，3-丙二醇的方法，其中所述梭菌属菌株基本上不产生选自下组的其它甘油代谢产物：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

“基本上”的意思是在培养基中存在最多为痕量的产物或甘油的降低。痕量优选的意思是应该不干扰1，3-丙二醇回收方法的量，更优选小于10mM。

短语“甘油代谢”指细菌中发生的对甘油的所有生物化学修饰。这包括有机分子的生物合成(合成代谢)和它们的分解(分解代谢)。一些代谢反应消耗NADH/NADPH，而另外一些产生NADH/NADPH。梭菌属菌株中的甘油代谢示于图1。代谢反应的中间物以及终产物称为代谢物。

本发明的方法的特征在于这样一个事实，甘油代谢指向1，3-丙二醇产生，并且所述梭菌属从这种代谢途径伴随1，3-丙二醇不产生其它还原型产物，例如丁酸、乳酸、丁醇、乙醇。事实上，这些还原型产物的产生消耗细胞的NADH/NADPH储备。限制这种消耗将使还原力重新定向于1，3-丙二醇产生。

在本发明的具体实施方案中，1，3-丙二醇与甘油代谢的单一氧化型产物伴随产生，所述氧化型产物例如乙酸、丙酮或二氧化碳。术语“氧化型产物”指不消耗细胞的NADH/NADPH储备而产生的产物。

有利地，所述方法中使用的梭菌属菌株仅产生1，3-丙二醇和乙酸。

根据本发明，可以修饰梭菌属菌株以限制除1，3-丙二醇之外的代谢物自甘油产生，所述产生过程的生物合成途径消耗NADH或NADPH。

有利地，这种修饰由至少一个编码所述代谢物产生过程中涉及的酶的基因的缺失组成。

具体而言，这种酶涉及选自下组的代谢物的产生：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

在本发明的具体实施方案中，梭菌属天然产生1，3-丙二醇，因为它包含编码1，3-丙二醇生物合成中涉及的酶的功能性内源基因。这些基因具体是：甘油脱水酶和1，3-丙二醇脱氢酶。

这种菌株可以经遗传修饰以产生1，3-丙二醇作为主要产物，所述遗传修饰通过缺失至少一个编码磷酸转丁酰酶的基因(ptb)或编码丁酸激酶的基因(buk)以阻断丁酰辅酶A向丁酸的转化。

在另一个具体实施方案中，所述梭菌属还缺失全部编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以阻断乳酸的产生。

在另一个具体实施方案中，所述梭菌属还缺失全部编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)以阻断醇的产生。

梭菌属中基因的缺失可以使用近期在专利申请PCT/EP2006/066997中描述的方法来进行，该方法允许i)用红霉素抗性基因替换待缺失的基因和ii)通过表达FLP重组酶去除红霉素抗性基因。

有利地，所述梭菌属菌株选自下组：丁酸梭菌和巴氏梭菌(C.pasteurianum)。

在本发明的具体实施方案中，梭菌属菌株必须经修饰以能够产生1，3-丙二醇。所述修饰由至少一种异源基因的引入组成，所述基因编码B-12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶。这些基因可以是，但不限于dhaB1、dhaB2、dhaT。

有利地，通过引入编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的丁酸梭菌操纵子来修饰所述菌株。染色体中操纵子的***可以使用近期在专利申请PCT/EP2006/066997中描述的方法来完成。

在本发明的具体实施方案中，使用的梭菌属菌株在修饰之前天然产生丁酸但是不能产生1，3-丙二醇；这种特定的梭菌属经遗传修饰以产生1，3-丙二醇，所述遗传修饰通过用一个编码B-12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的异源基因替换至少一个编码丁酸形成中涉及的酶的基因，特别是编码磷酸转丁酰酶的基因(ptb)或丁酸激酶的基因(buk)，其目的在于在这种菌株中：

-阻断丁酰辅酶A转化成丁酸，和

-允许从甘油产生1，3-丙二醇。

染色体中操纵子的***和基因的缺失可以使用近期在专利申请PCT/EP2006/066997中描述的方法来完成。

优先地，在这种梭菌属菌株中，缺失所有编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以阻断乳酸的产生。

优先地，在这种梭菌属菌株中，缺失所有编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)，以抑制醇的产生。

有利地，这种梭菌属菌株选自下组：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖多丁醇乙酸梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、丁酸梭菌或解纤维梭菌(C.cellulolyticum)。

在本发明的具体实施方案中，所述梭菌属在修饰之前天然产生乙醇但是不能产生1，3-丙二醇；这种菌株经遗传修饰以产生1，3-丙二醇，所述遗传修饰通过用至少一种编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的异源基因替换至少一种编码双功能醛-醇脱氢酶的基因(adhE)。优先地，这种异源基因是编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的丁酸梭菌操纵子。

这种取代导致：

-乙酰辅酶A向乙醇的转化的减少，和

-从甘油产生1，3-丙二醇。

优选地，在这种梭菌属菌株中，缺失所有编码乳酸脱氢酶的基因(ldh)以抑制乳酸的产生。

优选地，在这种梭菌属菌株中，缺失所有编码双工能醛-醇脱氢酶的剩余基因(adhE)以阻断醇的产生。

梭菌属染色体中操纵子的***和先前所述基因的缺失可以使用近期在专利申请PCT/EP2006/066997中描述的方法来完成。

有利地，这种梭菌属菌株选自下组：热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、解糖梭菌(Clostridium saccharolyticum)(现称解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum))、热产硫磺梭菌(Clostridiumthermosulfurogenes)(现称热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosulfurigenes))或热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)(现称产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus))。

在本发明的具体实施方案中，梭菌属菌株具有降低的氢产生通量，因而呈现还原当量通量向1，3-丙二醇产生的重新定向。这种结果可以通过多种手段来实现，并且具体而言是通过弱化编码氢化酶的基因(hydA)来实现，氢化酶为氢产生的形式的还原当量提供接收池(sink)。hydA的弱化可以通过用低强度启动子替换天然启动子或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质去稳定化的元件来完成。如有需要，基因的完全弱化也可以通过相应DNA序列的部分或完全缺失来实现。

在本发明的另一种实施方案中，使用的梭菌属菌株呈现增加的1，3-丙二醇产生通量；这种结果通过引入来自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操纵子(编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶)的额外拷贝来实现，所述额外拷贝通过质粒过表达或整合入重组梭菌属的染色体。例如，pSPD5质粒可以用于过表达1，3-丙二醇操纵子。

在本发明的另一个方面，修饰所述梭菌属菌株以使其能够将乙酸转化成丙酮。这种修饰可以通过向所述微生物中引入人工的“丙酮操纵子”来获得，所述丙酮操纵子含有分别编码硫解酶、辅酶A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶的thl、ctfAB和adc基因，这三种酶涉及丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌中的丙酮形成。这种人工操纵子可以由质粒携带或者可以整合至经转化的梭菌属的染色体中。

在另一种实施方案中，本发明提供高产率发酵制备1，3-丙二醇的方法，其包括：

(a)将梭菌属菌株与甘油接触进行发酵过程，由此产生1，3-丙二醇，

(b)通过蒸馏分离1，3-丙二醇和任选地甘油代谢的单一氧化型产物(主要为乙酸或丙酮)。

所述发酵通常在含有无机培养基的发酵罐中进行，所述无机培养基具有已知的确定的、适合于所用细菌的组成，其至少含有甘油，并且如有必要还含有产生所述代谢物所必需的共底物。

这种方法可以在分批方法以及连续方法中实现。本领域技术人员知晓如何管控这些实验条件中的每一种，以及如何为本发明的微生物限定实验条件。具体而言，将所述梭菌在20℃-60℃的温度发酵，对于嗜中温梭菌属(mesophilic clostridia)优先为25℃-40℃，对于嗜热的梭菌属优先为45-60℃。

本发明还涉及如前文所述的微生物。优选地，这种微生物选自下组：丁酸梭菌、巴氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖多丁醇乙酸梭菌、糖丁酸梭菌、丁酸梭菌、解纤维梭菌、热纤维梭菌、解糖梭菌(现称解糖热厌氧杆菌)、热产硫磺梭菌(现称热产硫磺热厌氧杆菌)或热硫化氢梭菌(现称产乙醇热厌氧杆菌)。

实施例1

构建产1，3-丙二醇并且不能产生丁酸和丁醇的重组丙酮丁醇梭菌：丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515ΔuppΔbuk::PDO

为了获得能够进行遗传操作并且不能产生丁醇和丙酮的菌株，我们首先通过如下从丙酮丁醇梭菌Δcac1515Δupp菌株去除(cure)pSOL1巨型质粒(在专利申请PCT/EP2006/066997中描述)：i)在葡萄糖MS培养基中进行20次传代培养，和ii)在琼脂平板(含有淀粉(2％)和葡萄糖(0.2％)，如Sabathe等(2003)所述)上选择产生淀粉水解小晕圈的克隆以鉴定丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515Δupp菌株。为了缺失buk基因并引入来自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操纵子，使用由Croux & Soucaille(2006)在专利申请PCT/EP2006/066997中描述的同源重组策略。如下构建了pCons::upp载体中整合了来自丁酸梭菌的1，3-丙二醇操纵子的buk缺失盒。

使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板和两对特异性寡核苷酸，用Pwo聚合酶PCR扩增了围绕buk的两个DNA片段。使用引物对BUK 1-BUK21和BUK 31-BUK 4分别获得了两个DNA片段。引物BUK 1和BUK 4均引入BamHI位点，而引物BUK 21和BUK 31具有引入pvuII和NruI位点的互补区。将DNA片段BUK 1-BUK 21和BUK 31-BUK 4在PCR融合实验中结合，该实验使用引物BUK 1和BUK 4，并且将所得的片段克隆入pCR4-TOPO-Blunt产生pTOPO:buk。在pTOPO:buk的唯一nruI位点处，将两侧均有FRT序列的抗生素抗性MLS基因由pUC18-FRT-MLS2的1372bpStuI片段引入。将用BamHI消化所得质粒后获得的BUK缺失盒克隆入pCons::upp的BamHI位点以产生pREPΔBUK::upp质粒。在pREPΔBUK::upp的独特pvuII位点，将1，3-丙二醇操纵子作为pSPD5质粒4854bp平末端的经Klenow处理的SalI片段引入。

使用pREPΔBUK::PDO::upp质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac15Δupp菌株。在Petri(陪替氏)平板上选择对红霉素(40μg/ml)有抗性的克隆之后，将一个菌落在含有40μg/ml红霉素的甘油液体合成培养基中培养24小时，并且将100μl未经稀释的培养物涂布在具有40μg/ml红霉素和400μM 5-FU的RCGA(强化的梭菌属培养基，其中用甘油代替淀粉和葡萄糖作为碳源)上。将对红霉素和5-FU二者均有抗性的菌落影印铺板到含有40μg/ml红霉素的RCA和含有50μg/ml甲砜霉素的RCA上，以选择5-FU抗性还结合有甲砜霉素敏感性的克隆。通过PCR分析(使用位于buk缺失盒外侧的引物BUK 0和BUK 5)检查了对红霉素有抗性并且对甲砜霉素敏感的克隆的基因型。分离了已经失去了pREPΔbuk::upp的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDO::mls^R菌株。

用表达Flp1基因的pCLF1.1载体转化ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDO::mls^R菌株，所述Flp1基因编码酿酒酵母的Flp重组酶。转化并在Petri平板上选择对甲砜霉素(50μg/ml)的抗性之后，将一个菌落培养在具有50μg/ml甲砜霉素的合成液体培养基中，并将适当的稀释液涂布在具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。将甲砜霉素抗性克隆影印铺板到具有40μg/ml红霉素的RCA和具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。使用引物BUK 0和BUK5通过PCR分析检查了具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的克隆的基因型。对具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的Δcac15ΔuppΔbuk菌株进行了两轮连续的24小时培养从而失去pCLF1.1。根据它对红霉素和甲砜霉素二者的敏感性分离了失去pCLF1.1的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDO菌株。

表1

实施例2

构建不能产生丁酸、丙酮和乳酸的菌株：丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515ΔuppΔbuk::PDOΔldh

为了缺失ldh基因，使用了专利申请PCT/EP2006/066997中由Croux &Soucaille(2006)描述的同源重组策略。这种策略允许***红霉素抗性盒，同时缺失大部分的相关基因。如下构建了pCons::upp中的ldh缺失盒。

使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板和两对特异性寡核苷酸，用Pwo聚合酶PCR扩增了围绕ldh(CAC267)的两个DNA片段。使用引物对LDH 1-LDH 2和LDH 3-LDH 4分别获得了1135bp和1177bp的DNA片段。引物LDH 1和LDH 4均引入BamHI位点，而引物LDH 2和LDH 3具有引入StuI位点的互补区。将DNA片段LDH 1-LDH 2和LDH 3-LDH 4在PCR融合实验中结合，该实验使用引物LDH 1和LDH 4，并且将所得的片段克隆入pCR4-TOPO-Blunt产生pTOPO:LDH。在pTOPO:LDH的唯一StuI位点处，将两侧均有FRT序列的抗生素抗性MLS基因由pUC18-FRT-MLS2的1372bp StuI片段引入。将用BamHI消化所得质粒后获得的UPP缺失盒克隆入pCons::upp的BamHI位点以产生pREPΔLDH::upp质粒。

使用pREPΔLDH::upp质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDO菌株。在Petri平板上(RCGA上)选择对红霉素(40μg/ml)有抗性的克隆之后，将一个菌落在含有40μg/ml红霉素的液体甘油合成培养基中培养24小时，并且将100μl未经稀释的培养物涂布在具有40μg/ml红霉素和400μM 5-FU的RGCA上。将对红霉素和5-FU二者均有抗性的菌落影印铺板到含有40μg/ml红霉素的RGCA和含有50μg/ml甲砜霉素的RGCA上，以选择5-FU抗性还结合有甲砜霉素敏感性的克隆。通过PCR分析(使用位于ldh缺失盒外侧的引物LDH 0和LDH 5)检查了对红霉素有抗性并且对甲砜霉素敏感的克隆的基因型。分离了已经失去了pREPΔLDH::upp的ΔΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh::mls^R菌株。

用表达Flpl基因的pCLF1.1载体转化ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh::mls^R菌株，所述Flp1基因编码酿酒酵母的Flp重组酶。转化并在Petri平板上选择对甲砜霉素(50μg/ml)的抗性之后，将一个菌落培养在具有50μg/ml甲砜霉素的合成液体培养基中，并将适当的稀释液涂布在具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。将甲砜霉素抗性克隆影印铺板到具有40μg/ml红霉素的RCA和具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。使用引物LDH O和LDH 5通过PCR分析检查了具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的克隆的基因型。对具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh菌株进行了两轮连续的24小时培养从而失去pCLF1.1。根据它对红霉素和甲砜霉素二者的敏感性分离了失去pCLF1.1的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh菌株。

表2

实施例3

构建具有较低氢产生的菌株：丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515ΔuppΔbuk::PDOΔldhΔhydA

为了缺失hydA基因，使用了专利申请PCT/EP2006/066997中由Croux &Soucaille(2006)描述的同源重组策略。这种策略允许***红霉素抗性盒，同时缺失大部分的相关基因。如下构建了pCons::upp中的hydA缺失盒。

使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板和两对特异性寡核苷酸，用Pwo聚合酶PCR扩增了围绕hydA(CAC028)的两个DNA片段。使用引物对HYD 1-HYD 2和HYD 3-HYD 4分别获得了1269bp和1317bp的DNA片段。引物HYD 1和HYD 4均引入BamHI位点，而引物HYD 2和HYD 3具有引入StuI位点的互补区。将DNA片段HYD 1-HYD 2和HYD 3-HYD 4在PCR融合实验中结合，该实验使用引物HYD 1和HYD 4，并且将所得的片段克隆入pCR4-TOPO-Blunt以产生pTOPO:HYD。在pTOPO:HYD的唯一StuI位点处，将两侧均有FRT序列的抗生素抗性MLS基因由pUC18-FRT-MLS2的1372bp StuI片段引入。将用BamHI消化所得质粒后获得的UPP缺失盒克隆入pCons::upp的BamHI位点以产生pREPΔHYD::upp质粒。

使用pREPΔHYD::upp质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh菌株。在Petri平板(RCGA)上选择对红霉素(40μg/ml)有抗性的克隆之后，将一个菌落在含有40μg/ml红霉素的甘油液体合成培养基中培养24小时，并且将100μl未经稀释的培养物涂布在具有40μg/ml红霉素和400μM 5-FU的RCA上。将对红霉素和5-FU二者均有抗性的菌落影印铺板到含有40μg/ml红霉素的RCGA和含有50μg/ml甲砜霉素的RCA上，以选择5-FU抗性还结合有甲砜霉素敏感性的克隆。通过PCR分析(使用位于hydA缺失盒外侧的引物HYD 0和HYD 5)检查了对红霉素有抗性并且对甲砜霉素敏感的克隆的基因型。分离了已经失去了pREPΔHYD::upp的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldhΔhydA::mls^R菌株。

用表达Flp1基因的pCLF1.1载体转化ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldhΔhydA::mls^R菌株，所述Flp1基因编码酿酒酵母的Flp重组酶。转化并在Petri平板上选择对甲砜霉素(50μg/ml)的抗性之后，将一个菌落培养在具有50μg/ml甲砜霉素的合成液体培养基中，并将适当的稀释液涂布在具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。将甲砜霉素抗性克隆影印铺板到具有40μg/ml红霉素的RCA和具有50μg/ml甲砜霉素的RCA上。使用引物HYD 0和HYD5通过PCR分析检查了具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的克隆的基因型。对具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldhΔhydA菌株进行了两轮连续的24小时培养从而失去pCLF1.1。根据它对红霉素和甲砜霉素二者的敏感性分离了失去pCLF1.1的ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldhΔhydA菌株。

表3

实施例4

构建在1，3-丙二醇途径中具有增加的通量的菌株：丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515ΔuppΔbuk::PDOΔldh pSPD5

为了构建以较高通量将甘油转化成1，3-丙二醇和乙酸的菌株，我们引入pSPD5质粒(在专利申请WO01/04324中描述)，所述质粒表达为来自丁酸梭菌的B12非依赖性1，3-丙二醇途径的操纵子。使用pSPD5质粒通过电穿孔来转化丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh菌株。在Petri平板(RCGA)上选择对红霉素(40μg/ml)有抗性的克隆之后，将一个菌落在具有40μg/ml红霉素的甘油液体合成培养基中培养24小时，并且用于提取pSPD5质粒，该质粒通过其限制图谱来表征。

实施例5

构建产生1，3-丙二醇和丙酮的菌株：丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac1515ΔuppΔbuk::PDOΔldh pSOS95 thl

为了构建将乙酸转化为丙酮的菌株，构建了表达合成丙酮操纵子的pSOS 95thl质粒。为了这个目的，将编码硫解酶的thl基因(来自丙酮丁醇梭菌)引入已经表达为合成操纵子ctfAB和adc基因的pSOS95载体(Genbank登录号AY187686)的BamHI位点。使用丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板和两对特异性寡核苷酸，用Pwo聚合酶PCR扩增了thl基因。使用引物对THL1-THL2获得了1.2kbp DNA片段，并且用BamHI和BglII消化，两个限制位点分别由引物THL 1和THL2引入。与用BamHI消化的pSOS95连接之后，获得了pSOS95-thl质粒。

使用这种pSOS95-thl质粒通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌ΔpSOL1Δcac15ΔuppΔbuk::PDOΔldh菌株。在Petri平板(RCGA)上选择了对红霉素(40μg/ml)有抗性的克隆之后，将一个菌落在具有40μg/ml红霉素的甘油液体合成培养基中培养24小时，并且用于提取pSOS95-thl质粒，该质粒通过它的限制图谱来表征。

表4

名称	引物序列
名称	引物序列	THL 1	cgcggatcctttatctgttaccccgtatcaaaatttagg
THL 2	gaAGATCTTCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGC	THL 1	cgcggatcctttatctgttaccccgtatcaaaatttagg

实施例6

产生1，3-丙二醇的菌株的分批发酵

首先在厌氧摇瓶培养中在由Soni等(Soni et al，1986，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：120-128)描述的培养基中分析菌株，所述培养基补充了2.5g/l醋酸铵，并且用甘油代替了葡萄糖。使用35℃的过夜培养物以接种30ml培养物至OD600为0.05。在35℃将培养物温育3天之后，使用分离用Biorad HPX 97H柱和检测用折光计通过HPLC分析了甘油、有机酸和1，3-丙二醇。

其后在生产条件下在300ml发酵罐(DASGIP)中使用厌氧分批规程检测了具有正确表型的菌株。

为了这个目的，将250ml合成培养基装入发酵罐，喷射氮气30分钟，并用25ml预培养物接种，使光密度(OD600nm)为0.05-0.1。

将培养物的温度恒定保持在35℃，并且使用NH₄OH溶液将pH固定调节在6.5。在发酵过程中将搅拌速率保持在300rpm。

实施例7

产生1，3-丙二醇和乙酸的菌株的连续发酵

在化学恒化器(chemostat)培养中在由Soni等(Soni等，1987，Appl.Microbiol.Biotechnol.)描述的合成培养基(但是用甘油替换了葡萄糖)中分析最佳的产生1，3-丙二醇和乙酸的菌株。使用35℃的过夜培养物接种300ml发酵罐(DASGIP)，其中使用厌氧恒化器规程。

为了这个目的，将250ml合成培养基装入发酵罐，喷射氮气30分钟，并用25ml预培养物接种，至光密度(OD600nm)为0.05-0.1。在35℃，pH6.5(使用NH₄OH溶液调节)和300rpm搅拌速率分批培养12小时之后，按0.05h-1稀释率向发酵罐连续补料不含氧的合成培养基，同时通过连续移出经发酵的培养基使体积保持恒定。培养物的稳定性使用先前描述的HPLC规程通过产物分析来追踪。

参考文件

Gonzalez-Pajuelo M，Meynial-Salles I，Mendes F，Andrade JC，Vasconcelos I，Soucaille P.

Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrialproduction of 1，3-propanediol from glycerol.

Metab Eng.2005，；7：329-36..

Green EM，Boynton ZL，Harris LM，Rudolph FB，Papoutsakis ET，Bennett GN.

Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation inClostridium acetobutylicum ATCC 824.

Microbiology.1996，142：2079-86.

Soni B.K.，Soucaille P.Goma G.

Continuous acetone butanol fermentation：influence of vitamins on themetabolic activity of Clostridium acetobutylicum.

Appl.Microbiol.Biotechnol.1987.27：1-5.

序列表

<110>代谢探索者公司(METABOLIC EXPLORER)

<120>以高产率从甘油生物产生1，3-丙二醇的方法

<130>350459 D24893

<160>20

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 1

<400>1

aaaaggatcc tagtaaaagg gagtgtacga ccagtg 36

<210>2

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 21

<400>2

ggggcagctg gtcgcgaaaa aaggggggat tattagtaat ctatacatgt taacattcct 60

ccac 64

<210>3

<211>53

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 31

<400>3

cccccttttt tcgcgaccag ctgccccact tcttgcactt gcagaaggtg gac 53

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 4

<400>4

aaaaggatcc tctaaattct gcaatatatg ccccccc 37

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 0

<400>5

ataacaggat atatgctctc tgacgcgg 28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Buk 5

<400>6

gatcatcact cattttaaac atggggcc 28

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 1

<400>7

aaaaggatcc gctttaaaat ttggaaagag gaagttgtg 39

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 2

<400>8

ggggaggcct aaaaaggggg ttagaaatct ttaaaaattt ctctatagag cccatc 56

<210>9

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 3

<400>9

cccccttttt aggcctcccc ggtaaaagac ctaaactcca agggtggagg ctaggtc 57

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 4

<400>10

aaaaggatcc cccattgtgg agaatattcc aaagaagaaa ataattgc 48

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 0

<400>11

cagaaggcaa gaatgtatta agcggaaatg c 31

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Ldh 5

<400>12

cttcccatta tagctcttat tcacattaag c 31

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 1

<400>13

aaaaggatcc gcctcttctg tattatgcaa ggaaagcagc tgc 43

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 2

<400>14

ggggaggcct aaaaaggggg tatataaaat aaatgtgcct taacatctaa gttgaggcc 59

<210>15

<211>85

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 3

<400>15

cccccttttt aggcctcccc gtttatcctc ccaaaatgta aaatataatt aaaatatatt 60

aataaacttc gattaataaa cttcg 85

<210>16

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 4

<400>16

aaaaggatcc ccttttagcg tataaagttt tatatagcta ttg 43

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 0

<400>17

catgttctat tgttactatg gaagaggtag tag 33

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Hyd 5

<400>18

gcagttatta taaatgctgc tactagagc 29

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>THL 1

<400>19

cgcggatcct ttatctgtta ccccgtatca aaatttagg 39

<210>20

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>THL 2

<400>20

gaagat cttc tagcactttt ctagcaatat tgc 33

Claims

1.一种1，3-丙二醇的厌氧产生方法，通过在包含甘油作为碳源的适合的培养基中培养梭菌属菌株并回收1，3-丙二醇，其中所述梭菌属菌株基本上不产生选自下组的其它甘油代谢产物：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

2.权利要求1的方法，其中1，3-丙二醇与单一的甘油代谢氧化型产物一起产生。

3.权利要求2的方法，其中所述单一的甘油代谢氧化型产物选自下组：乙酸、丙酮或二氧化碳。

4.权利要求3的方法，其中所述梭菌属菌株从甘油仅产生1，3-丙二醇和乙酸。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株经修饰以限制1，3-丙二醇以外的代谢物从甘油的产生，所述产生过程的生物合成途径消耗NADH或NADPH。

6.权利要求5的方法，其中编码涉及所述代谢物产生的酶的至少一个基因是缺失的。

7.权利要求6的方法，其中所述基因编码选自下组的代谢物的产生中涉及的酶：丁酸、乳酸、丁醇和乙醇。

8.权利要求1-7中的方法，其中所述梭菌属菌株包含用于产生1，3-丙二醇的功能性内源基因。

9.权利要求8的方法，其中所述梭菌属存在至少一个涉及丁酸形成的选自下组的基因的缺失，

·编码磷酸转丁酰酶的ptb

·编码丁酸激酶的buk。

10.权利要求8的方法，其中全部编码乳酸脱氢酶的ldh基因是缺失的。

11.权利要求9或10的方法，其中全部编码醛-醇脱氢酶的adhE基因是缺失的。

12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株选自下组：丁酸梭菌和巴氏梭菌。

13.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株经修饰以产生1，3-丙二醇，所述修饰通过引入至少一个编码B-12依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的异源基因进行。

14.权利要求13的方法，其中通过引入编码B12非依赖性1，3-丙二醇途径中涉及的酶的丁酸梭菌操纵子来修饰所述菌株。

15.权利要求13或14中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株在修饰之前能够产生丁酸，并且引入至少一个异源基因来替换至少一个编码丁酸形成中涉及的酶的基因。

16.权利要求15的方法，其中所述编码丁酸形成中涉及的酶的基因选自：

·编码磷酸转丁酰酶的ptb

·编码丁酸激酶的buk。

17.权利要求16的方法，其中全部编码乳酸脱氢酶的ldh基因是缺失的。

18.权利要求16或17的方法，其中全部编码醛-醇脱氢酶的adhE基因是缺失的。

19.权利要求15-18中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株选自下组：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖多丁醇乙酸梭菌、糖丁酸梭菌、丁酸梭菌和解纤维梭菌。

20.权利要求13或14的方法，其中所述梭菌属菌株在修饰之前能够产生乙醇，并且引入至少一个异源基因来替换至少一个编码乙醇形成中涉及的酶的基因。

21.权利要求20的方法，其中所述编码乙醇形成中涉及的酶的基因选自编码醛-醇脱氢酶的adhE基因。

22.权利要求21的方法，其中全部编码乳酸脱氢酶的ldh基因是缺失的。

23.权利要求21或22的方法，其中全部剩余的编码醛-醇脱氢酶的adhE基因是缺失的。

24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述梭菌属菌株选自下组：热纤维梭菌、解糖梭菌(现称解糖热厌氧杆菌)、热产硫磺梭菌(现称热产硫磺热厌氧杆菌)或热硫化氢梭菌(现称产乙醇热厌氧杆菌)。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中氢通量降低，并且还原力重新定向于1，3丙二醇的产生。

26.权利要求25的方法，其中hydA基因是弱化的。

27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述微生物经修饰以将乙酸转化成丙酮。

28.权利要求27中的方法，其中所述编码丙酮形成中涉及的酶的基因是外源的，并且将所述基因引入梭菌属菌株中。

29.权利要求1-25中任一项的1，3丙二醇的发酵制备方法，包括以下步骤：

·发酵产生1，3丙二醇的微生物

·通过蒸馏分离1，3丙二醇和任选地单一甘油代谢氧化型产物。

30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述培养是连续的。

31.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述培养分批进行。

32.如权利要求1-28中任一项限定的微生物。