BR112012028290B1 - levedura recombinante, processo para converter biomassa em etanol e meio de fermentação compreendendo dita levedura - Google Patents

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Arthur J. Shaw Iv
Alan Benjamin Gilbert
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David A. Hogsett
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Abstract

DESINTOXICAÇÃO DE ACETATO DERIVADO DE BIOMASSA VIA CONVERSÃO METABÓLICA EM ETANOL, ACETONA, ISOPROPANOL OU ACETATO DE ETILA. A presente invenção fornece novas vias metabólicas para desintoxicar acetato derivado de biomassa via conversão metabólica em etanol, acetona, isopropanol ou acetato de etila. Mais especificamente, a invenção fornece um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas construídas para obter: (1) conversão de acetato em etanol; (2) conversão de acetato em acetona; (3) conversão de acetato em isopropanol; ou (4) conversão de acetato em acetato de etila; em que uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas. A invenção também fornece novos organismos adaptados para crescer na presença de compostos inibitórios, incluindo, mas não limitados a acetato.

Description

APOIO DO GOVERNO U.S.
[001] Esta invenção foi parcialmente feita com apoio do governo sob o Department of Energy Grants GO18103 e GO17057. O governo tem certos direitos na invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A conversão de energia, a utilização e o acesso sustentam muitos entre os grandes desafios de nosso tempo, incluindo aqueles associados com sustentabilidade, qualidade ambiental, segurança e escassez. Novas aplicações de tecnologias emergentes são exigidas para responder a estes desafios. A biotecnologia, uma das mais poderosas entre as tecnologias emergentes, pode dar origem a novos processos importantes de conversão de energia. A biomassa vegetal e derivados da mesma são um recurso para a conversão de energia biológica em formas úteis para a humanidade.
[003] Entre as formas de biomassa vegetal, a biomassa lignocelulósica (“biomassa”) é particularmente bem adequada para as aplicações de energia, devido a sua disponibilidade em grande escala, baixo custo e produção ambientalmente favorável. Em particular, muitos ciclos de produção e utilização de energia com base em biomassa celulósica têm emissões de gases de efeito estufa quase zero em uma base de ciclo de vida. O principal obstáculo impedindo a produção de energia mais difundida a partir de matérias-primas de biomassa é a ausência geral de tecnologia de baixo custo para superar a recalcitrância destes materiais para a conversão em produtos úteis. A biomassa lignocelulósica contém frações de carboidrato (por exemplo, celulose e hemicelulose) que podem ser convertidas em etanol ou outros produtos, tais como ácido láctico e ácido acético. De modo a converter estas frações, a celulose e hemicelulose devem ser, essencialmente, convertidas ou hidrolisadas em monossacarídeos; é a hidrólise que provou ser historicamente problemática.
[004] Os processos biologicamente mediados são promissores para a conversão de energia. Os esquemas de processamento de biomassa que envolvem hidrólise enzimática ou microbiana comumente envolvem quatro transformações biologicamente mediadas: (1) a produção de enzimas sacarolíticas (celulases e hemicelulases); (2) a hidrólise de componentes de carboidrato presentes na biomassa pré-tratada em açúcares; (3) a fermentação de açúcares hexose (por exemplo, glicose, manose e galactose); e (4) a fermentação de açúcares pentose (por exemplo, xilose e arabinose). Estas quatro transformações ocorrem em uma única etapa em uma configuração de processo chamada de bioprocessamento consolidado (CBP), que é distinguida de outras configurações menos altamente integradas, em que não envolve uma etapa de processo dedicada para a produção de celulase e/ou hemicelulase.
[005] CBP oferece o potencial para o custo mais baixo e eficácia mais alta em relação aos processos que caracterizam a produção de celulase dedicada. Os benefícios resultam, em parte, de custos de capital, substrato e outros materiais brutos e utilidades evitados associados com a produção de celulase. Além disso, vários fatores ajudam na realização de taxas mais altas de hidrólise, e, consequentemente, volume do reator e investimento de capital reduzidos usando CBP, incluindo sinergia enzima-micróbio e o uso de organismos termofílicos e/ou sistemas de celulase complexados. Além disso, micro-organismos celulolíticos aderentes à celulose, provavelmente, competem com êxito para os produtos de hidrólise de celulose como micróbios não aderidos, por exemplo, contaminantes, que podem aumentar a estabilidade de processos industriais com base na utilização de celulose microbiana. O progresso no desenvolvimento de micro-organismos que permitem CBP está sendo feito por meio de duas estratégias: construção de micro-organismos celulolíticos que ocorrem naturalmente para melhorar as propriedades relacionadas ao produto, tais como rendimento e título; e construção de organismos não celulolíticos que exibem altos rendimentos e títulos do produto para expressar um sistema de celulase e hemicelulase heterólogas possibilitando a utilização de celulose e hemicelulose.
[006] A conversão biológica de biomassa lignocelulósica em etanol ou outros produtos químicos exige um catalisador microbiano para ser metabolicamente ativa durante a extensão da conversão. Para o CBP, uma outra exigência é colocada sobre o catalisador microbiano - ele também deve crescer e produzir enzimas celulolíticas suficientes e outras enzimas hidrolíticas, além de produtos metabólicos. Um desafio significante para um processo de CBP ocorre quando a biomassa lignocelulósica contém compostos inibitórios para o crescimento microbiano, que é comum em matérias-primas lignocelulósicas naturais. Comprovadamente, o composto inibitório mais importante é o ácido acético (acetato), que é liberado durante a desacetilação de substratos poliméricos. O acetato é, particularmente, inibitório para os processos de CBP, conforme as células devem constantemente gastar energia para exportar ânions acetato, que depois difundem livre e novamente na célula como ácido acético. Estes fenômenos, combinados com a liberação de açúcar tipicamente baixa e disponibilidade de energia durante a fermentação, limitam a energia celular que pode ser dirigida para a geração de massa celular e produção de enzima, o que diminui ainda mais a liberação de açúcar.
[007] A remoção de acetato antes da fermentação aperfeiçoaria significantemente as dinâmicas de CBP; entretanto, os sistemas de remoção química e física são tipicamente muito dispendiosos ou impraticáveis para a aplicação industrial. Assim, existe uma necessidade quanto a um sistema de remoção de acetato alternado para o CBP que não sofra dos mesmos problemas associados com estes sistemas de remoção química e física. Como uma nova alternativa, esta invenção descreve a conversão metabólica de acetato em um composto menos inibitório, tal como um solvente não carregado, incluindo mas não limitado a, acetona, isopropanol, acetato de etila ou etanol. Tal conversão negaria os efeitos mais inibitórios de acetato, embora também resultando em vários benefícios de processo descritos abaixo. Esta invenção também descreve a adaptação de organismos de CBP para o crescimento na presença de compostos inibitórios encontrados no processamento de biomassa, tais como acetato.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A invenção é, em geral, dirigida à redução ou remoção de acetato a partir do processamento de biomassa, tal como o processamento CBP de biomassa lignocelulósica. A invenção também é, em geral, dirigida à adaptação de organismos de CBP para o crescimento na presença de compostos inibitórios, incluindo, mas não limitados a, acetato.
[009] Um aspecto da invenção se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em etanol, em que as ditas uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas. Em certas modalidades, o acetato é produzido como um subproduto do processamento de biomassa. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante produz etanol. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante produz um rendimento de etanol selecionado a partir de: (a) pelo menos cerca de 1% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (b) pelo menos cerca de 2% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (c) pelo menos cerca de 3% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (d) pelo menos cerca de 4% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (e) pelo menos cerca de 5% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (f) pelo menos cerca de 6% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (g) pelo menos cerca de 7% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (h) pelo menos cerca de 8% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (i) pelo menos cerca de 9% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (j) pelo menos cerca de 10% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (k) pelo menos cerca de 11% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (l) pelo menos cerca de 12% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (m) pelo menos cerca de 15% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (n) pelo menos cerca de 20% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (o) pelo menos cerca de 30% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (p) pelo menos cerca de 40% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; ou (q) pelo menos cerca de 50% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas.
[0010] Em aspectos particulares, as vias metabólicas engenheiradas compreendem as etapas de: (a) conversão de acetato em acetil-CoA e (b) conversão de acetil-CoA em etanol. Em certas modalidades, acetato é convertido em acetil-CoA através de uma acetil-CoA transferase (ACS). Em outras modalidades, a acetil-CoA transferase (ACS) é codificada por um polinucleotídeo de ACS1. Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-P através de uma acetato quinase, e acetil-P é convertida em acetil-CoA através de uma fosfotransacetilase. Em outras modalidades, a acetato quinase e a fosfotransacetilase são a partir de uma ou mais entre uma espécie Escherichia, Thermoanaerobacter, Clostridia ou Bacillus.
[0011] Em algumas modalidades, acetil-CoA é convertido em acetaldeído através de uma acetaldeído desidrogenase, e o acetaldeído é convertido em etanol através de uma álcool desidrogenase. Em outras modalidades, a acetaldeído desidrogenase é a partir de C. phytofermentans. Em algumas modalidades, a acetil- CoA é convertida em etanol através de uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional. Em outras modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é a partir de E. coli, C. acetobutilicum, T. saccharolyticum, C. thermocellum ou C. phytofermentans. Em algumas modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é a partir de E. coli, T. saccharolyticum, C. phytofermentans, Chlamydomonas reinhardtii, Piromyces SP E2 ou Bifidobacterium adolescentis. Em certas modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é selecionado a partir da SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 66.
[0012] Em aspectos particulares, uma ou mais enzimas nativas infrarreguladas são codificadas por um polinucleotídeo de gpd1, um polinucleotídeo de gpd2 ou tanto um polinucleotídeo de gpd1 quanto um polinucleotídeo de gpd2.
[0013] Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante que converte acetato em etanol é selecionado a partir do grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utliis, Arxula adeninivorans, Pichia stipitis, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Schwanniomyces occidentalis. Em uma outra modalidade, o micro-organismo recombinante é Saccharomyces cerevisiae.
[0014] Um outro aspecto da invenção se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em acetona, em que as ditas uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas. Em certas modalidades, o acetato é produzido como um subproduto do processamento de biomassa. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante produz acetona.
[0015] Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante produz um rendimento de acetona selecionado a partir de (a) pelo menos cerca de 0,05 vez mais acetona em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (b) pelo menos cerca de 0,1 vez mais acetona em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (c) pelo menos cerca de 0,5 vez mais acetona em relação ao que é produzido por um microorganismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (d) pelo menos cerca de 1,0 vez mais acetona em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; (e) pelo menos cerca de 2,0 vezes mais acetona em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas; ou (f) pelo menos cerca de 5,0 vezes mais acetona em relação ao que é produzido por um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas.
[0016] Em aspectos particulares, as vias metabólicas engenheiradas compreendem as etapas de: (a) conversão de acetato em acetil-CoA; (b) conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (c) conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato; e (d) conversão de acetoacetato em acetona. Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-CoA através de uma acetil-CoA sintetase. Em outras modalidades, a acetil-CoA sintetase é codificada por um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste de um polinucleotídeo de ACS1 de levedura e um polinucleotídeo de ACS2 de levedura. Em certas modalidades, o polinucleotídeo de ACS1 de levedura é a partir de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces kluyveri. Em certas modalidades, o polinucleotídeo de ACS2 de levedura é a partir de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces kluyveri. Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-CoA através de uma CoA transferase.
[0017] Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-P através de uma acetato quinase, e acetil-P é convertida em acetil-CoA através de uma fosfotransacetilase. Em outras modalidades, a acetato quinase e a fosfotransacetilase são a partir de T. saccharolyticum. Em algumas modalidades, a acetato quinase é a partir de T. saccharolyticum DSM 8691 (Acesso GenBank No ACA51668) e a fosfotransacetilase é a partir de T. saccharolyticum DSM 8691 (Acesso GenBank No ACA51669).
[0018] Em algumas modalidades, a acetil-CoA é convertida em acetoacetil- CoA através de uma tiolase. Em algumas modalidades, a acetoacetil-CoA é convertida em acetoacetato através de uma CoA transferase. Em algumas modalidades, o acetoacetato é convertido em acetona através de uma acetoacetato decarboxilase. Em outras modalidades, a tiolase, a CoA transferase e a acetoacetato decarboxilase são a partir de C. acetobutilicum. Em certas modalidades, a tiolase é a partir de C. acetobutilicum ou T. thermosaccharolyticum. Em certas modalidades, a tiolase é selecionada a partir de Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306374), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940320) ou Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571 (Acesso GenBank No YP_003852249). Em certas modalidades, a CoA transferase é a partir de uma fonte bacteriana. Em outras modalidades, a fonte bacteriana é selecionada a partir do grupo que consiste de Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermoanaerbacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus e Paenibacillus macerans. Em certas modalidades, a CoA transferase é selecionada a partir de Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306376), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940319), Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306375), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940318) ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a acetoacetato decarboxilase é a partir de uma fonte bacteriana. Em outras modalidades, a fonte bacteriana é selecionada a partir do grupo que consiste de C. acetobutilicum, Paenibacillus macerans, Acidothermus cellulolyticus, Bacillus amyloliquefaciens e Rubrobacter xylanophilus. Em certas modalidades, o Bacillus amyloliquefaciens é Bacillus amyloliquefaciens FZB42 BGSC 10A6 (Acesso GenBank No YP_001422565).
[0019] Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante que converte acetato em acetona é Escherichia coli. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma bactéria termofílica ou mesofílica. Em outras modalidades, a bactéria termofílica ou mesofílica é uma espécie dos gêneros Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter, Clostridium, Geobacillus, Saccharococcus, Paenibacillus, Bacillus, Caldicellulosiruptor, Anaerocellum ou Anoxibacillus. Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de: Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brocki, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium phytofermentans, Clostridium straminosolvens, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus stearothermophilus, Saccharococcus caldoxilosilyticus, Saccharoccus thermophilus, Paenibacillus campinasensis, Bacillus flavothermus, Anoxibacillus kamchatkensis, Anoxibacillus gonensis, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptor owensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus e Anaerocellum thermophilum. Em outras modalidades, o micro-organismo é selecionado a partir do grupo que consiste de Clostridium thermocellum e Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
[0020] Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é eucariótico. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma levedura selecionada a partir do grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utliis, Arxula adeninivorans, Pichia stipitis, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Schwanniomyces occidentalis. Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é Saccharomyces cerevisiae.
[0021] Um outro aspecto da invenção se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em isopropanol, em que as ditas uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas. Em certas modalidades, o acetato é produzido como um subproduto do processamento de biomassa. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante produz isopropanol.
[0022] Em certos aspectos, as vias metabólicas engenheiradas compreendem as etapas de: (a) conversão de acetato em acetil-CoA; (b) conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (c) conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato; (d) conversão de acetoacetato em acetona; e (e) conversão de acetona em isopropanol.
[0023] Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-CoA através de uma acetil-CoA sintetase. Em outras modalidades, a acetil-CoA sintetase é codificada por um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste de um polinucleotídeo de ACS1 de levedura e um polinucleotídeo de ACS2 de levedura.
[0024] Em algumas modalidades, a acetil-CoA é convertida em acetoacetil- CoA através de uma tiolase.
[0025] Em algumas modalidades, a acetoacetil-CoA é convertida em acetoacetato através de uma CoA transferase. Em outras modalidades, a CoA transferase é a partir de uma fonte bacteriana. Em certas modalidades, a fonte bacteriana é selecionada a partir do grupo que consiste de Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermoanaerbacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus e Paenibacillus macerans.
[0026] Em algumas modalidades, o acetoacetato é convertido em acetona através de uma acetoacetato decarboxilase. Em outras modalidades, a acetoacetato decarboxilase é a partir de uma fonte bacteriana. Em certas modalidades, a fonte bacteriana é selecionada a partir do grupo que consiste de C. acetobutilicum, Paenibacillus macerans, Acidothermus cellulolyticus, Bacillus amyloliquefaciens e Rubrobacter xylanophilus.
[0027] Em algumas modalidades, a acetona é convertida em isopropanol através de uma álcool desidrogenase.
[0028] Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante que converte acetato em isopropanol é selecionado a partir do grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utliis, Arxula adeninivorans, Pichia stipitis, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Schwanniomyces occidentalis. Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é Saccharomyces cerevisiae.
[0029] Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante que converte acetato em isopropanol é selecionado a partir de uma bactéria termofílica ou mesofílica. Em algumas modalidades, a bactéria termofílica ou mesofílica é uma espécie dos gêneros Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter, Clostridium, Geobacillus, Saccharococcus, Paenibacillus, Bacillus, Caldicellulosiruptor, Anaerocellum ou Anoxibacillus. Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de: Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brocki, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium phytofermentans, Clostridium straminosolvens, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus stearothermophilus, Saccharococcus caldoxilosilyticus, Saccharoccus thermophilus, Paenibacillus campinasensis, Bacillus flavothermus, Anoxibacillus kamchatkensis, Anoxibacillus gonensis, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptor owensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus e Anaerocellum thermophilum. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante é Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
[0030] Em outros aspectos, as vias metabólicas engenheiradas para a conversão de acetato em isopropanol compreendem as etapas de: (a) conversão de acetato em acetil-P e acetil-P em acetil-CoA; (b) conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (c) conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato; (d) conversão de acetoacetato em acetona; e (e) conversão de acetona em isopropanol. Em alguns aspectos, uma ou mais enzimas nativas infrarreguladas no micro-organismo recombinante que produz isopropanol são selecionadas a partir de fosfotransacetilase, acetato quinase ou ambas.
[0031] Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-P através de uma acetato quinase; e o acetil-P é convertida em acetil-CoA através de uma fosfotransacetilase. Em certas modalidades, a acetato quinase e a fosfotransacetilase são a partir de T. saccharolyticum. Em certas modalidades, a acetato quinase é a partir de T. saccharolyticum DSM 8691 (Acesso GenBank No ACA51668) e a fosfotransacetilase é a partir de T. saccharolyticum DSM 8691 (Acesso GenBank No ACA51669).
[0032] Em algumas modalidades, a acetil-CoA é convertida em acetoacetil- CoA através de uma tiolase. Em certas modalidades, a tiolase é selecionada a partir de Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306374), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940320) ou Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM 571 (Acesso GenBank No YP_003852249).
[0033] Em algumas modalidades, a acetoacetil-CoA é convertida em acetoacetato através de uma CoA transferase. Em certas modalidades, a CoA transferase é a partir de uma fonte bacteriana. Em algumas modalidades, a CoA transferase é selecionada a partir de Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306376), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940319), Thermosipho melanesiensis DSM 12029 (Acesso GenBank No YP_001306375), Kosmotoga olearia DSM 21960 (Acesso GenBank No YP_002940318) ou combinações dos mesmos.
[0034] Em algumas modalidades, o acetoacetato é convertido em acetona através de uma acetoacetato decarboxilase. Em certas modalidades, a acetoacetato decarboxilase é a partir de uma fonte bacteriana. Em algumas modalidades, a acetoacetato decarboxilase é Bacillus amyloliquefaciens FZB42 BGSC 10A6 (Acesso GenBank No YP_001422565).
[0035] Em algumas modalidades, a acetona é convertida em isopropanol através de uma álcool desidrogenase. Em certas modalidades, a álcool desidrogenase é uma álcool desidrogenase secundária (adhB) a partir de T. ethanolicus.
[0036] Um outro aspecto da invenção se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em acetato de etila, em que as ditas uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas. Em certas modalidades, o acetato é produzido como um subproduto do processamento de biomassa. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante produz acetato de etila.
[0037] Em certos aspectos, as vias metabólicas engenheiradas compreendem as etapas de: (a) conversão de acetato em acetil-CoA e (b) conversão de acetil-CoA e etanol em acetato de etila. Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-CoA através de uma acetil-CoA sintetase. Em outras modalidades, a acetil-CoA sintetase é codificada por um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste de um polinucleotídeo de ACS1 de levedura e um polinucleotídeo de ACS2 de levedura.
[0038] Em algumas modalidades, o acetato é convertido em acetil-P através de uma acetato quinase, e a acetil-P é convertida em acetil-CoA através de uma fosfotransacetilase.
[0039] Em algumas modalidades, a acetil-CoA e o etanol são convertidos em acetato de etila através de uma álcool acetiltransferase. Em outras modalidades, a álcool acetiltransferase é codificada por um polinucleotídeo de ATF1 de levedura.
[0040] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante que converte acetato em acetato de etila é uma bactéria termofílica ou mesofílica. Em outras modalidades, a bactéria termofílica ou mesofílica é uma espécie dos gêneros Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter, Clostridium, Geobacillus, Saccharococcus, Paenibacillus, Bacillus, Caldicellulosiruptor, Anaerocellum ou Anoxibacillus. Em certas modalidades, o micro-organismo é uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de: Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brocki, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium phytofermentans, Clostridium straminosolvens, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus stearothermophilus, Saccharococcus caldoxilosilyticus, Saccharoccus thermophilus, Paenibacillus campinasensis, Bacillus flavothermus, Anoxibacillus kamchatkensis, Anoxibacillus gonensis, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptor owensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus e Anaerocellum thermophilum. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é selecionado a partir do grupo que consiste de Clostridium thermocellum e Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
[0041] Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é eucariótico. Em certas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma levedura selecionada a partir do grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utliis, Arxula adeninivorans, Pichia stipitis, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Schwanniomyces occidentalis. Em outras modalidades, o micro-organismo recombinante é Saccharomyces cerevisiae.
[0042] Em outros aspectos da invenção, uma ou mais enzimas nativas infrarreguladas dos micro-organismos recombinantes da invenção são codificadas por um polinucleotídeo de gpd1, um polinucleotídeo de gpd2 ou tanto um polinucleotídeo de gpd1 quanto um polinucleotídeo de gpd2. Em certos aspectos, os micro-organismos recombinantes da invenção compreendem ainda um polinucleotídeo de gpd1 nativo e/ou heterólogo ligado de maneira operável a um promotor de polinucleotídeo de gpd2 nativo ou um polinucleotídeo de gpd2 nativo e/ou heterólogo ligado de maneira operável a um promotor de polinucleotídeo de gpd1 nativo.
[0043] Em aspectos adicionais da invenção, os micro-organismos recombinantes da invenção compreendem ainda uma mutação em uma hidrogenase. Em algumas modalidades, a hidrogenase é uma hfs hidrogenase a partir de T. saccharolyticum. Em certas modalidades, a mutação em uma hfs hidrogenase a partir de T. saccharolyticum é selecionada a partir de: (a) uma deleção de uma adenina na posição 2219 em hfsA (ou 1545) do Acesso GenBank No GQ354412; (b) uma deleção de uma adenina na posição 2954 em hfsB (ou 1546) do Acesso GenBank No GQ354412; (c) uma deleção de uma adenina na posição 2736 em hfsB (ou 1546) do Acesso GenBank No GQ354412; (d) uma deleção de uma adenina na posição 4272 em hfsC (ou 1547) do Acesso GenBank No GQ354412; (e) uma deleção de uma guanina na posição 5386 em hfsD (ou 1548) do Acesso GenBank No GQ354412; (f) uma deleção de uma guanina na posição 5980 em hfsD (ou 1548) do Acesso GenBank No GQ354412; (g) uma deleção de uma adenina na posição 5514 em hfsD (ou 1548) do Acesso GenBank No GQ354412; (h) ou combinações de um ou mais entre (a) a (g).
[0044] Um outro aspecto da invenção se refere a um micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em etanol, em que o dito uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas é uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional. Em algumas modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é a partir de E. coli, C. acetobutilicum, T. saccharolyticum, C. thermocellum ou C. phytofermentans. Em outras modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é a partir de E. coli, T. saccharolyticum, C. phytofermentans, Chlamydomonas reinhardtii, Piromyces SP E2 ou Bifidobacterium adolescentis. Em outras modalidades, a acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é selecionada a partir da SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, ou SEQ ID NO: 66.
[0045] A invenção também se refere a um processo para converter biomassa em etanol, acetona, isopropanol ou acetato de etila compreendendo contatar biomassa com um micro-organismo recombinante da invenção. Em certos aspectos, a biomassa compreende biomassa lignocelulósica. Em algumas modalidades, a biomassa lignocelulósica é selecionada a partir do grupo que consiste de grama, switchgrass, cordgrass, azevém, capim-amarelo, grama de pradaria mista, miscanthus, resíduos de processamento de açúcar, bagaço de cana- de-açúcar, palha de cana-de-açúcar, resíduos agrícolas, palha de arroz, cascas de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereais, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, cascas de aveia, fibra de milho, forragem, resíduos da colheita de soja, resíduos da colheita de milho, resíduos florestais, fibra de polpa de madeira reciclada, lodo de papel, serragem, madeira dura, madeira mole, agave e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a biomassa é pasta de milho ou amido de milho.
[0046] Em certos aspectos, o processo reduz ou remove acetato do meio de bioprocessamento consolidado (CBP). Em algumas modalidades, a redução ou a remoção de acetato ocorre durante a fermentação. Em certos aspectos, o processo exige menos base neutralizante para manter o pH durante a fermentação em relação a um micro-organismo sem ativação, suprarregulação ou infrarregulação de uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas, conforme descrito neste relatório.
[0047] A invenção ainda se refere a um meio de fermentação compreendendo um ou mais micro-organismos recombinantes da invenção.
[0048] A invenção também se refere a uma via metabólica engenheirada para reduzir ou remover acetato do meio de bioprocessamento consolidado (CBP) utilizando os micro-organismos recombinantes da invenção.
[0049] Em certos aspectos, o micro-organismo recombinante compreendendo uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas que funcionam em uma ou mais das vias metabólicas engenheiradas descritas neste relatório é uma cepa de levedura que tem tolerância e robustez melhoradas para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa, incluindo mas não limitado a, acetato e outros subprodutos de CBP.
[0050] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura tendo uma taxa de crescimento específico (h-1) na presença de acetato selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 0,02, b) pelo menos cerca de 0,04, c) pelo menos cerca de 0,06, d) pelo menos cerca de 0,08, e) pelo menos cerca de 0,1, f) pelo menos cerca de 0,12 ou g) pelo menos cerca de 0,14. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura selecionada a partir de M1360, M1361 ou M1362. Em alguns aspectos, o microorganismo recombinante é a cepa de levedura M1927. Em alguns aspectos, a taxa de crescimento específico (h-1) é obtida usando um meio compreendendo xilose.
[0051] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura tendo uma densidade óptica na presença de acetato selecionado a partir de: (a) pelo menos cerca de 0,2, (b) pelo menos cerca de 0,3, (c) pelo menos cerca de 0,4, (d) pelo menos cerca de 0,5 ou (e) pelo menos cerca de 0,6. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é a cepa de levedura M1339. Em alguns aspectos, a densidade óptica é obtida usando um meio compreendendo xilose.
[0052] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura tendo um rendimento de biomassa anaeróbica teórico (%), em prensados de 5%, 7% ou 9% de equivalentes sólidos, selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 10%; b) pelo menos cerca de 20%; c) pelo menos cerca de 30%; d) pelo menos cerca de 40%; e) pelo menos cerca de 50%; f) pelo menos cerca de 60%; g) pelo menos cerca de 70%; h) pelo menos cerca de 80%; i) pelo menos cerca de 90%; ou j) pelo menos cerca de 100%. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é selecionado a partir da cepa de levedura M1360, M1443 ou M1577.
[0053] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura tendo uma taxa de crescimento específico (h-1) na presença de 5- hidroximetilfurfural e furfural selecionados a partir de: a) pelo menos cerca de 0,05, b) pelo menos cerca de 0,1, c) pelo menos cerca de 0,15 ou d) pelo menos cerca de 0,2. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é a cepa de levedura M1715 ou M1577. Em alguns aspectos, a taxa de crescimento específico (h-1) é obtida usando um meio compreendendo xilose.
[0054] Em algumas modalidades, o micro-organismo recombinante é uma cepa de levedura tendo um rendimento de biomassa (g/g), em prensados de 13%, 15% ou 17% de equivalentes sólidos, selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 0,02; b) pelo menos cerca de 0,04; c) pelo menos cerca de 0,06; ou d) pelo menos cerca de 0,08. Em aspectos particulares, o micro-organismo recombinante é selecionado a partir da cepa de levedura M1760, M1818 ou M1819.
[0055] A invenção também se refere às cepas de levedura que têm tolerância e robustez melhoradas para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa. Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de acetato tem uma taxa de crescimento específico (h-1) na presença de um inibidor de biomassa selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 0,005, b) pelo menos cerca de 0,01, c) pelo menos cerca de 0,02, d) pelo menos cerca de 0,04, e) pelo menos cerca de 0,06, f) pelo menos cerca de 0,08, g) pelo menos cerca de 0,1, h) pelo menos cerca de 0,12, ou i) pelo menos cerca de 0,14. Em algumas modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato. Em outras modalidades, a cepa de levedura é selecionada a partir de M1339, M1360, M1361 ou M1362. Em algumas modalidades, a taxa de crescimento específico (h-1) é obtida usando um meio compreendendo xilose.
[0056] Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa tem um rendimento de biomassa teórico (%), em prensados de 5%, 7% ou 9% de equivalentes sólidos, selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 10%; b) pelo menos cerca de 20%; c) pelo menos cerca de 30%; d) pelo menos cerca de 40%; e) pelo menos cerca de 50%; f) pelo menos cerca de 60%; g) pelo menos cerca de 70%; h) pelo menos cerca de 80%; i) pelo menos cerca de 90%; ou j) pelo menos cerca de 100%. Em algumas modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato. Em outras modalidades, a cepa de levedura é selecionada a partir de M1360, M1443 ou M1577.
[0057] Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa tem uma taxa de crescimento específico (h-1) selecionada a partir de: a) pelo menos cerca de 0,05, b) pelo menos cerca de 0,1, c) pelo menos cerca de 0,15 ou d) pelo menos cerca de 0,2. Em algumas modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato. Em outras modalidades, a cepa de levedura é selecionada a partir de M1715 ou M1577. Em algumas modalidades, a taxa de crescimento específico (h-1) é obtida usando um meio compreendendo xilose.
[0058] Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa tem um rendimento de biomassa (g/g), em prensados de 13%, 15%, ou 17% de equivalentes sólidos, selecionado a partir de: a) pelo menos cerca de 0,02; b) pelo menos cerca de 0,04; c) pelo menos cerca de 0,06; ou d) pelo menos cerca de 0,08. Em algumas modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato. Em outras modalidades, a cepa de levedura, de acordo com a reivindicação 93, em que a dita cepa de levedura é selecionada a partir de M1760, M1818 ou M1819.
[0059] Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa produz um rendimento de etanol selecionado a partir de: (a) pelo menos cerca de 1% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (b) pelo menos cerca de 5% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (c) pelo menos cerca de 10% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (d) pelo menos cerca de 20% mais etanol em relação ao que é produzido por um microorganismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (e) pelo menos cerca de 30% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (f) pelo menos cerca de 40% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (g) pelo menos cerca de 50% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (h) pelo menos cerca de 60% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (i) pelo menos cerca de 70% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (j) pelo menos cerca de 80% mais etanol em relação ao que é produzido por um microorganismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (k) pelo menos cerca de 90% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa; (l) pelo menos cerca de 95% mais etanol em relação ao que é produzido por um micro-organismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa. Em algumas modalidades, a cepa de levedura é selecionada a partir de M1927 ou M2108. Em outras modalidades, a cepa de levedura é M2108.
[0060] Em algumas modalidades, a cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa, em uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) realizadas a 38 °C, produz um rendimento de etanol aumentado comparado a um rendimento de etanol produzido por um microorganismo que não foi adaptado para o crescimento na presença do inibidor de biomassa. Em certas modalidades, o rendimento de etanol aumentado é selecionado a partir de: (a) pelo menos cerca de 1%; (b) pelo menos cerca de 5%; (c) pelo menos cerca de 10%; (d) pelo menos cerca de 20%; (e) pelo menos cerca de 30%; (f) pelo menos cerca de 40%; (g) pelo menos cerca de 50%; (h) pelo menos cerca de 60%; (i) pelo menos cerca de 70%; (j) pelo menos cerca de 80%; (k) pelo menos cerca de 90%; (l) pelo menos cerca de 95%.
[0061] Em certos aspectos, o acetato presente no inibidor de biomassa é uma quantidade selecionada a partir de a) pelo menos cerca de 0,1 g/L; b) pelo menos cerca de 1 g/L; c) pelo menos cerca de 2 g/L; d) pelo menos cerca de 3 g/L; e) pelo menos cerca de 4 g/L; f) pelo menos cerca de 5 g/L; g) pelo menos cerca de 6 g/L; h) pelo menos cerca de 7 g/L; ou i) pelo menos cerca de 8 g/L. Em outros aspectos, o acetato presente no inibidor de biomassa é uma quantidade selecionada a partir de a) pelo menos cerca de 0,01% (p/v); b) pelo menos cerca de 0,1% (p/v); c) pelo menos cerca de 0,2% (p/v); d) pelo menos cerca de 0,3% (p/v); e) pelo menos cerca de 0,4% (p/v); f) pelo menos cerca de 0,5% (p/v); g) pelo menos cerca de 0,6% (p/v); h) pelo menos cerca de 0,7% (p/v); ou i) pelo menos cerca de 0,8% (p/v).
[0062] A invenção também se refere a métodos para produzir cepas de levedura adaptadas para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa. Em algumas modalidades, o método para produzir uma cepa de levedura da invenção adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa, compreende incubar continuamente uma cepa de levedura na presença do inibidor de biomassa. Em outras modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato.
[0063] A invenção também se refere a uma cepa de levedura adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa produzido por um processo. Em algumas modalidades, uma cepa de levedura da invenção adaptada para o crescimento na presença de um inibidor de biomassa é produzido por um processo compreendendo incubar continuamente uma cepa de levedura na presença do inibidor de biomassa. Em outras modalidades, o inibidor de biomassa compreende acetato.
[0064] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para gerar uma célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo pelo menos um gene de interesse, em que o dito método compreende: a) gerar uma sequência de nucleotídeos que é capaz de recombinação homóloga com uma célula hospedeira de levedura e que compreende o dito pelo menos um gene de interesse, pelo menos um marcador de seleção positivo, e pelo menos um marcador de seleção negativo; b) transformar uma célula hospedeira de levedura com a dita sequência de nucleotídeos para obter uma primeira população de transformantes da dita célula hospedeira de levedura; c) selecionar quanto à resistência ao dito pelo menos um marcador de seleção positivo para obter células hospedeiras de levedura transformadas com a dita sequência de nucleotídeos; d) transformar as células hospedeiras de levedura de c) com uma segunda sequência de nucleotídeos capaz de remover o dito pelo menos um marcador de seleção positivo e o dito pelo menos um marcador de seleção negativo a partir da célula hospedeira de levedura; e e) selecionar quanto à resistência à 5-fluorodeoxiuridina (FUDR) para obter células hospedeiras de levedura transformadas recombinantes com o dito pelo menos um gene de interesse, em que o dito marcador de seleção negativo compreende o gene de timidina quinase a partir do Vírus do Herpes Simples, que cria sensibilidade à 5- fluorodeoxiuridina (FUDR). Em alguns aspectos, o método compreende ainda transformar a célula hospedeira de levedura de c) com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de recombinação homóloga com a dita célula hospedeira de levedura e que compreende o dito pelo menos um gene de interesse, um segundo marcador de seleção positivo, e pelo menos um marcador de seleção negativo. Em alguns aspectos, a célula hospedeira de levedura é S. cerevisiae.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
[0065] A Figura 1 representa a via de glicólise.
[0066] A Figura 2 apresenta uma representação esquemática da via de glicólise/fermentação.
[0067] A Figura 3 apresenta uma representação esquemática das vias propostas e alterações genéticas durante a absorção de acetato em etanol.
[0068] A Figura 4A apresenta uma representação esquemática da via bacteriana proposta a partir do acetato em acetona.
[0069] A Figura 4B apresenta uma representação esquemática da via de levedura proposta a partir do acetato em acetona.
[0070] A Figura 5A representa a estequiometria de reação global da via bacteriana proposta a partir do acetato em acetona.
[0071] A Figura 5B representa o vetor pMU1299 - pAcet#3 para a conversão de acetato em acetona em T. saccharolyticum e E. coli.
[0072] A Figura 6 é uma representação gráfica que representa o crescimento das cepas M1254 e M1339 em xilose na presença de acetato.
[0073] A Figura 7 é uma representação gráfica que representa a taxa de crescimento específico de cepas M1360, M1361, M1362, M1254 e M1339 em xilose na presença de acetato, nove outros ácidos e cinco aldeídos. Os ácidos incluem ácido lático, 2-furoico, ferúlico, 3,4-di-hidroxibenzóico, 3,5-di-hidroxibenzóico, gálico, homovanílico, siríngico e vanílico; os aldeídos incluem furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF), 3,4-di-hidroxibenzaldeído, siringaldeído e vanilina.
[0074] A Figura 8 é uma representação gráfica que representa o desempenho de cepa M1360 cultivada a 40 °C em Meio de Fermentação Industrial (IFM), conforme medido pela utilização de glicose (g/L) e produção de etanol (g/L).
[0075] A Figura 9 é uma representação gráfica que representa o rendimento de biomassa teórico (%) de cepas M1360, M1443 e M1577 em condições de processo em prensados de 5%, 7% e 9% de equivalentes sólidos.
[0076] A Figura 10 é uma representação gráfica que representa a taxa de crescimento específico de cepas M0509, M1577 e M1715 em xilose e em xilose na presença de inibidores HMF e furfural.
[0077] A Figura 11A é uma representação gráfica que representa o rendimento de biomassa (g/g) de cepas M1760, M1818 e M1819 em um ensaio com prensado.
[0078] A Figura 11B é uma representação gráfica que representa o rendimento de etanol (g/L) de cepas M1760, M1818 e M1819 em um ensaio com prensado.
[0079] A Figura 12 apresenta uma representação esquemática de uma via engenheirada proposta para converter acetato em acetona.
[0080] A Figura 13 representa o vetor pMU22627 para a conversão de acetato em acetona em T. saccharolyticum.
[0081] A Figura 14 é uma representação gráfica que representa os resultados metabólicos de uma fermentação de lavado de hemicelulose derivado de material lignocelulósico com a cepa M2212 de T. saccharolyticum.
[0082] A Figura 15 é uma representação gráfica que representa consumo de glicose e produção de etanol de uma fermentação com as cepas M1442 e M2212 de T. saccharolyticum.
[0083] A Figura 16 é uma representação gráfica que representa o consumo de acetato e a produção de acetona de uma fermentação com as cepas M1442 e M2212 de T. saccharolyticum.
[0084] A Figura 17 é uma representação gráfica que representa o pH de uma fermentação com as cepas M1442 e M2212 de T. saccharolyticum.
[0085] A Figura 18 apresenta uma representação esquemática de uma via engenheirada proposta para converter acetato em isopropanol.
[0086] A Figura 19 representa o vetor pMU2741 para a conversão de acetato em isopropanol.
[0087] A Figura 20A é uma representação gráfica que representa os resultados metabólicos de uma fermentação de meio mínimo compreendendo glicose e acetato com as cepas M2108, M2433 e M2488 de S. cerevisiae.
[0088] A Figura 20B é uma representação gráfica que representa a taxa de crescimento (hr-1) de uma fermentação de meio mínimo compreendendo glicose e acetato com as cepas M2108, M2433 e M2488 de S. cerevisiae.
[0089] A Figura 21A é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação usando sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) com as cepas M2108 e M2488 de S. cerevisiae.
[0090] A Figura 21B é uma representação gráfica que representa a produção de glicerol (g/L) e produção de acetato (g/L) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2108 e M2488 de S. cerevisiae.
[0091] A Figura 22 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2108, M2433 e M2488 de S. cerevisiae.
[0092] A Figura 23A é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) e utilização de xilose (g/L) de uma fermentação do lavado com as cepas M2108, M2433 e M2488 de S. cerevisiae.
[0093] A Figura 23B é uma representação gráfica que representa a produção de acetato (g/L) e a produção de glicerol (g/L) de uma fermentação do lavado com as cepas M2108, M2433 e M2488 de S. cerevisiae.
[0094] A Figura 24A é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) e aumento no rendimento (%) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2108, M2433, M2488 e M2556 de S. cerevisiae.
[0095] A Figura 24B é uma representação gráfica que representa a produção de acetato (g/L) e a produção de glicerol (g/L) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2108, M2433, M2488 e M2556 de S. cerevisiae.
[0096] A Figura 25 apresenta gráficos que representam os resultados metabólicos de uma fermentação usando meio Verduyn com as cepas M139, M2668, M2669 e M2670 de S. cerevisiae.
[0097] A Figura 26A é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação usando 25% de sólidos de pasta de milho com as cepas M139, M2085, M2158 e M2326 de S. cerevisiae.
[0098] A Figura 26B é uma representação gráfica que representa a utilização de acetato (g/L) de uma fermentação usando 25% de sólidos de pasta de milho com as cepas M139 e M2158 de S. cerevisiae.
[0099] A Figura 27 é uma representação gráfica que representa os resultados metabólicos de uma fermentação usando lavado de fibra de milho com as cepas M2108, M2488 e M2556 de S. cerevisiae.
[00100] A Figura 28 é uma representação gráfica que representa as concentrações de xilose, acetato e etanol (g/L) a partir da adaptação do quimiostato de M1927 em líquido de lavagem a partir da madeira dura.
[00101] A Figura 29 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação do líquido de lavagem com as cepas M1818 e M1927 de S. cerevisiae.
[00102] A Figura 30 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação do líquido de lavagem com as cepas M1927 e M2108 de S. cerevisiae.
[00103] A Figura 31 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) de uma fermentação do líquido de lavagem com as cepas M1927 e M2108 de S. cerevisiae.
[00104] A Figura 32 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) e o consumo de açúcar (g/L) de uma fermentação usando SSF com as cepas M1927 e M2108 de S. cerevisiae.
[00105] A Figura 33 é uma representação gráfica que representa a produção de etanol (g/L) e aumento no rendimento (%) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2390 e M2739 de S. cerevisiae.
[00106] A Figura 34 é uma representação gráfica que representa a produção de glicerol (g/L) e a utilização de ácido acético (g/L) de uma fermentação usando SSF com as cepas M2390 e M2739 de S. cerevisiae.
[00107] A Figura 35 é uma representação esquemática que ilustra a recombinação homóloga usando um método de contrasseleção de timidina quinase (TDK).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00108] Os aspectos da presente invenção se referem à construção de um micro-organismo para desintoxicar acetato derivado de biomassa por intermédio da conversão metabólica em etanol, acetona, isopropanol ou acetato de etila. Para superar os efeitos inibitórios do acetato, o acetato pode ser convertido em um composto menos inibitório que é um produto da fermentação bacteriana ou de levedura, conforme descrito neste relatório. Os compostos menos inibitórios, tais como etanol, acetona, isopropanol ou acetato de etila, podem ser facilmente recuperados a partir do meio de fermentação. As vantagens adicionais da presente invenção sobre os meios existentes para a redução de acetato incluem: • Custo reduzido comparado aos sistemas químicos ou físicos de remoção do acetato; • Redução de perdas do rendimento de açúcar (lavagem) em comparação aos sistemas químicos ou físicos de remoção do acetato; • Demanda reduzida para a adição de base durante a fermentação; • Custo da fermentação global reduzido; • Controle do pH melhorado; e • Custos reduzidos, incluindo capital, operação e ambiente, para o tratamento de água servida e reciclagem de água.
Definições
[00109] O termo “heterólogo” quando usado em referência a um polinucleotídeo, um gene, um polipeptídeo ou uma enzima se refere a um polinucleotídeo, gene, polipeptídeo ou uma enzima não encontrada normalmente no organismo hospedeiro. “Heterólogo” também inclui uma região de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente a partir do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. O polinucleotídeo ou gene heterólogo pode ser introduzido no organismo hospedeiro, por exemplo, por transferência de gene. Um gene heterólogo pode incluir uma região de codificação nativa que é uma porção de um gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos.
[00110] O termo “polinucleotídeo heterólogo” é intencionado a incluir um polinucleotídeo que codifica um ou mais polipeptídeos ou porções ou fragmentos de polipeptídeos. Um polinucleotídeo heterólogo pode ser derivado a partir de qualquer fonte, por exemplo, eucariontes, procariontes, vírus ou fragmentos de polinucleotídeos sintéticos.
[00111] O termo “promotor” ou “promotor substituto” é intencionado a incluir um polinucleotídeo que pode controlar transcricionalmente um gene de interesse que ele não controla transcricionalmente na natureza. Em certas modalidades, o controle transcricional de um promotor substituto resulta em um aumento na expressão do gene de interesse. Em certas modalidades, um promotor substituto é colocado 5’ ao gene de interesse. Um promotor substituto pode ser usado para substituir o promotor natural, ou pode ser usado além do promotor natural. Um promotor substituto pode ser endógeno com respeito à célula hospedeira, em que ele é usado, ou pode ser uma sequência de polinucleotídeos heterólogos introduzida na célula hospedeira, por exemplo, exógeno com respeito à célula hospedeira, em que ele é usado.
[00112] Os termos “gene(s)” ou “polinucleotídeo” ou “sequência(s) de polinucleotídeos” são intencionados a incluir moléculas de ácido nucleico, por exemplo, polinucleotídeos que incluem um quadro aberto de leitura que codifica um polipeptídeo, e pode incluir ainda sequências reguladoras não codificantes e íntrons. Além disso, os termos são intencionados a incluir um ou mais genes que mapeiam um loco funcional. Além disso, os termos são intencionados a incluir um gene específico para um propósito selecionado. O gene pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser recombinantemente introduzido na célula hospedeira, por exemplo, como um plasmídeo mantido de forma epissomal ou um plasmídeo (ou fragmento do mesmo) que é estavelmente integrado no genoma. Além da forma de plasmídeo, um gene, por exemplo, pode estar na forma de DNA linear. Em certas modalidades, o gene ou polinucleotídeo é envolvido em pelo menos uma etapa na bioconversão de um acetato a um solvente não carregado, incluindo mas não limitado a, acetona, isopropanol, acetato de etila ou etanol. Consequentemente, o termo é intencionado a incluir qualquer gene que codifica um polipeptídeo, tal como as enzimas acetato quinase (ACK), fosfotransacetilase (PTA), lactato desidrogenase (LDH), piruvato formiato liase (PFL), aldeído desidrogenase (ADH) e/ou álcool desidrogenase (ADH), acetil-CoA transferase (ACS), acetaldeído desidrogenase, acetaldeído/álcool desidrogenase, glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD), acetil- CoA sintetase, tiolase, CoA transferase, acetoacetato decarboxilase, enzimas álcool acetiltransferase na via de D-xilose, tal como xilose isomerase e xiluloquinase, enzimas na via de L-arabinose, tal como L-arabinose isomerase e L-ribulose-5- fosfato 4-epimerase. O termo gene também é intencionado a cobrir todas as cópias de um gene particular, por exemplo, todas das sequências de DNA em uma célula que codifica um produto do gene particular.
[00113] O termo “controle transcricional” é intencionado a incluir a capacidade de modular à expressão do gene no nível da transcrição. Em certas modalidades, transcrição, e assim a expressão do gene, é modulada substituindo ou adicionando um promotor substituto próximo à extremidade 5’ da região codificante de um gene de interesse, desse modo resultando na expressão do gene alterada. Em certas modalidades, o controle transcricional de um ou mais genes é construído para resultar na expressão ótima de tais genes, por exemplo, em uma razão desejada. O termo também inclui controle transcricional induzível, conforme reconhecido na técnica.
[00114] O termo “expressão” é intencionado a incluir a expressão de um gene pelo menos no nível da produção de mRNA.
[00115] O termo “produto de expressão” é intencionado a incluir o produto resultante, por exemplo, um polipeptídeo, de um gene expressado.
[00116] O termo “expressão aumentada” é intencionado a incluir uma alteração na expressão do gene pelo menos no nível de produção de mRNA aumentada e, preferivelmente, no nível da expressão de polipeptídeo. O termo “produção aumentada” é intencionado a incluir um aumento na quantidade de um polipeptídeo expressado, no nível da atividade enzimática do polipeptídeo, ou uma combinação do mesmo, conforme comparado à produção nativa de, ou à atividade enzimática, do polipeptídeo.
[00117] Os termos “atividade”, “atividades”, “atividade enzimática” e “atividades enzimáticas” são usados permutavelmente e são intencionados a incluir qualquer atividade funcional normalmente atribuída a um polipeptídeo selecionado quando produzido sob condições favoráveis. Tipicamente, a atividade de um polipeptídeo selecionado abrange a atividade enzimática total associada com o polipeptídeo produzido. O polipeptídeo produzido por uma célula hospedeira e tendo atividade enzimática pode estar localizado no espaço intracelular da célula, associado à célula, secretado no meio extracelular ou uma combinação dos mesmos. As técnicas para determinar a atividade total conforme comparado à atividade secretada são descritas neste relatório e são conhecidas na técnica.
[00118] O termo “atividade xilanolítica” é intencionado a incluir a capacidade de hidrolisar as ligações glicosídicas em oligopentoses e polipentoses.
[00119] O termo “atividade celulolítica” é intencionado a incluir a capacidade de hidrolisar as ligações glicosídicas em oligo-hexoses e poli-hexoses. A atividade celulolítica também pode incluir a capacidade de despolimerizar ou não ramificar celulose e hemicelulose.
[00120] Conforme usado neste relatório, o termo “lactato desidrogenase” ou “LDH” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter piruvato em lactato. É entendido que LDH também pode catalisar a oxidação de hidroxibutirato. LDH inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 1.1.1.27.
[00121] Conforme usado neste relatório, o termo “álcool desidrogenase” ou “ADH” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetaldeído em um álcool, tal como etanol. ADH também inclui as enzimas capazes de converter acetona em isopropanol. ADH inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 1.1.1.1.
[00122] Conforme usado neste relatório, o termo “fosfotransacetilase” ou “PTA” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetil-fosfato em acetil-CoA. PTA inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.3.1.8.
[00123] Conforme usado neste relatório, o termo “acetato quinase” ou “ACK” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetato em acetil-fosfato. ACK inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.7.2.1.
[00124] Conforme usado neste relatório, o termo “piruvato formiato liase” ou “PFL” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter piruvato em acetil- CoA e formiato. PFL inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.3.1.54.
[00125] Conforme usado neste relatório, o termo “acetaldeído desidrogenase” ou “ACDH” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetil-CoA em acetaldeído. ACDH inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 1.2.1.3.
[00126] Conforme usado neste relatório, o termo “acetaldeído/álcool desidrogenase” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetil-CoA em etanol. Acetaldeído/álcool desidrogenase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Números da Comissão de Enzimas 1.2.1.10 e 1.1.1.1.
[00127] Conforme usado neste relatório, o termo “glicerol-3-fosfato desidrogenase” ou “GPD” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter fosfato de di-hidroxiacetona em glicerol-3-fosfato. GPD inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 1.1.1.8.
[00128] Conforme usado neste relatório, o termo “acetil-CoA sintetase” ou “ACS” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetato em acetil- CoA. Acetil-CoA sintetase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 6.2.1.1.
[00129] Conforme usado neste relatório, o termo “tiolase” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Tiolase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.3.1.9.
[00130] Conforme usado neste relatório, o termo “CoA transferase” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetato e acetoacetil-CoA em acetoacetato e acetil-CoA. CoA transferase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.8.3.8.
[00131] Conforme usado neste relatório, o termo “acetoacetato decarboxilase” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetoacetato em acetona e dióxido de carbono. Acetoacetato decarboxilase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 4.1.1.4.
[00132] Conforme usado neste relatório, o termo “álcool acetiltransferase” é intencionado a incluir as enzimas capazes de converter acetil-CoA e etanol em acetato de etila. Álcool acetiltransferase inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 2.3.1.84.
[00133] O termo “atividade de piruvato decarboxilase” é intencionado a incluir a capacidade de um polipeptídeo converter enzimaticamente piruvato em acetaldeído e dióxido de carbono (por exemplo, “piruvato decarboxilase” ou “PDC”). Tipicamente, a atividade de um polipeptídeo selecionado abrange a atividade enzimática total associada com o polipeptídeo produzido, compreendendo, por exemplo, a afinidade superior ao substrato da enzima, termoestabilidade, estabilidade em pHs diferentes, ou uma combinação destes atributos. PDC inclui aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão de Enzimas 4.1.1.1.
[00134] O termo “etanologênico” é intencionado a incluir a capacidade de um micro-organismo produzir etanol a partir de um carboidrato como um produto de fermentação. O termo é intencionado a incluir, mas não é limitado a, organismos etanologênicos que ocorrem naturalmente, organismos etanologênicos com mutações que ocorrem naturalmente ou induzidas, e organismos etanologênicos que foram geneticamente modificados.
[00135] Os termos “fermentar” e “fermentação” são intencionados a incluir o processo enzimático (por exemplo, celular ou acelular, por exemplo, uma mistura purificada de lisato ou polipeptídeo) pelo qual etanol é produzido a partir de um carboidrato, em particular, como um produto de fermentação.
[00136] O termo “secretado” é intencionado a incluir o movimento de polipeptídeos ao espaço periplásmico ou meio extracelular. O termo “secreção aumentada” é intencionado a incluir situações, em que um dado polipeptídeo é secretado em um nível aumentado (isto é, em excesso da quantidade que ocorre naturalmente de secreção). Em certas modalidades, o termo “secreção aumentada” se refere a um aumento na secreção de um dado polipeptídeo que é pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais, conforme comparado ao nível que ocorre naturalmente de secreção.
[00137] O termo “polipeptídeo secretor” é intencionado a incluir qualquer polipeptídeo(s), sozinho ou em combinação com outros polipeptídeos, que facilitam o transporte de um outro polipeptídeo a partir de espaço intracelular de uma célula ao meio extracelular. Em certas modalidades, o(s) polipeptídeo(s) secretor(es) abrangem todos os polipeptídeos secretores necessários e suficientes para comunicar atividade secretora a uma célula hospedeira Gram-negativa ou Gram- positiva ou a uma célula hospedeira de levedura. Tipicamente, as proteínas secretoras são codificadas em uma única região ou loco que pode ser isolado a partir de uma célula hospedeira e transferida a uma outra célula hospedeira usando engenharia genética. Em certas modalidades, o(s) polipeptídeo(s) secretor(es) são derivados de qualquer célula bacteriana tendo atividade secretora ou qualquer célula de levedura tendo atividade secretora. Em certas modalidades, o(s) polipeptídeo(s) secretor(es) são derivados de uma célula hospedeira tendo atividade secretora Tipo II. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana termofílica. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura.
[00138] O termo “derivado de” é intencionado a incluir o isolamento (em total ou em parte) de um segmento de polinucleotídeo a partir de uma fonte indicada ou da purificação de um polipeptídeo a partir de uma fonte indicada. O termo é intencionado a incluir, por exemplo, clonagem direta, amplificação de PCR ou síntese artificial de ou com base em uma sequência associada com a fonte de polinucleotídeo indicada.
[00139] O termo “termofílico” significa um organismo que prospera em uma temperatura de cerca de 45 °C ou mais alta.
[00140] O termo “mesofílico” significa um organismo que prospera em uma temperatura de cerca de 20 a 45 °C.
[00141] O termo “ácido orgânico” é reconhecido na técnica. “Ácido orgânico”, conforme usado neste relatório, também inclui certos solventes orgânicos, tais como etanol. O termo “ácido láctico” se refere ao ácido orgânico ácido 2-hidroxipropiônico na forma de ácido ou sal livre. A forma de sal do ácido láctico é referida como “lactato”, não obstante o agente neutralizante, isto é, carbonato de cálcio ou hidróxido de amônio. O termo “ácido acético” se refere ao ácido orgânico ácido metanocarboxílico, também conhecido como ácido etanoico, na forma de ácido ou sal livre. A forma de sal do ácido acético é referida como “acetato”.
[00142] Certas modalidades da presente invenção fornecem a “inserção”, (por exemplo, a adição, integração, incorporação ou introdução) de certos genes ou sequências de polinucleotídeos particulares dentro de micro-organismos termofílicos ou mesofílicos, tal inserção de genes ou sequências de polinucleotídeos particulares pode abranger a(s) “modificação(s) genética(s)” ou “transformação(s)”, tal que as cepas resultantes dos ditos micro-organismos termofílicos ou mesofílicos podem ser “geneticamente modificadas” ou “transformadas”. Em certas modalidades, as cepas podem ser de origem bacteriana, fúngica ou de levedura.
[00143] Certas modalidades da presente invenção fornecem a “inativação” ou “deleção” de certos genes ou sequências de polinucleotídeos particulares dentro dos micro-organismos termofílicos ou mesofílicos, tal “inativação” ou “deleção” de genes ou sequências de polinucleotídeos particulares pode abranger “modificação(s) genética(s)” ou “transformação(s)”, tal que as cepas resultantes dos ditos micro-organismos termofílicos ou mesofílicos podem ser “geneticamente modificadas” ou “transformadas”. Em certas modalidades, as cepas podem ser de origem bacteriana, fúngico ou de levedura.
[00144] O termo “organismo de CBP” é intencionado a incluir micro-organismos da invenção, por exemplo, micro-organismos que têm propriedades adequadas para CPF.
[00145] Em um aspecto da invenção, os genes ou sequências de polinucleotídeos particulares são inseridos para ativar a atividade para a qual eles codificam, tal como a expressão de uma enzima. Em certas modalidades, as enzimas codificadoras de genes na produção metabólica de etanol, por exemplo, enzimas que metaboliza os açúcares pentose e/ou hexose, podem ser adicionadas a um organismo mesofílico ou termofílico. Em certas modalidades da invenção, a enzima pode conferir a capacidade para metabolizar um açúcar pentose e ser envolvida, por exemplo, na via de D-xilose e/ou via de L-arabinose. Em certas modalidades da invenção, as enzimas codificadoras de genes na conversão de acetato em um solvente não carregado, incluindo mas não limitado a, acetona, isopropanol, acetato de etila ou etanol, podem ser adicionadas a um organismo mesofílico ou termofílico.
[00146] Em um aspecto da invenção, os genes ou sequências de polinucleotídeos particulares são parcial, substancial ou completamente suprimidos, silenciados, inativados ou regulados, de modo a inativar a atividade para a qual eles codificam, tal como a expressão de uma enzima. As deleções fornecem estabilidade máxima pelo fato de não existir oportunidade para uma mutação reversa para restaurar a função. Alternativamente, os genes podem ser parcial, substancial ou completamente suprimidos, silenciados, inativados ou regulados através da inserção de sequências de ácido nucleico que rompem a função e/ou expressão do gene (por exemplo, transdução de P1 ou outros métodos conhecidos na técnica). Os termos “eliminar”, “eliminação” e “nocaute” são usados permutavelmente com os termos “deleção”, “deleção parcial”, “deleção substancial” ou “deleção completa”. Em certas modalidades, as cepas de micro-organismos termofílicos ou mesofílicos de interesse podem ser engenheiradas por recombinação homóloga sítio-dirigida para nocautear a produção de ácidos orgânicos. Em outras modalidades, o RNAi ou DNA antissentido (asDNA) pode ser usado para silenciar, inativar ou regular parcial, substancial ou completamente um gene particular de interesse.
[00147] Em certas modalidades, os genes alvejados para a deleção ou a inativação, conforme descrito neste relatório, podem ser endógenos à cepa nativa do micro-organismo, e assim, podem ser referidos como “gene(s) nativo(s)” ou “gene(s) endógeno(s)”. Um organismo está em “um estado nativo” se ele não foi geneticamente construído ou, de outro modo, manipulado manualmente em uma maneira que intencionalmente altera a constituição genética e/ou fenotípica do organismo. Por exemplo, os organismos do tipo selvagem podem estar em um estado nativo. Em outras modalidades, o(s) gene(s) alvejado(s) para a deleção ou inativação pode(m) ser não nativo(s) ao organismo.
[00148] Similarmente, as enzimas da invenção, conforme descrito neste relatório, podem ser endógenas à cepa nativa do micro-organismo, e assim, podem ser referidas como “nativas” ou “endógenas”.
[00149] O termo “suprarregulado” significa aumentado em atividade, por exemplo, aumento na atividade enzimática da enzima, conforme comparado à atividade em um organismo hospedeiro nativo.
[00150] O termo “regulado” significa diminuído na atividade, por exemplo, diminuição na atividade enzimática da enzima, conforme comparado à atividade em um organismo hospedeiro nativo.
[00151] O termo “ativado” significa expressado ou metabolicamente funcional.
[00152] O termo “adaptado para o crescimento” significa a seleção de um organismo para o crescimento sob as condições, em que o organismo não cresce ou em que o organismo cresce lentamente ou minimamente. Assim, um organismo que é o dito adaptado para o crescimento sob a condição selecionada, cresce melhor do que um organismo que não foi adaptado para o crescimento sob as condições selecionadas. O crescimento pode ser medido por quaisquer métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, medição da densidade óptica ou taxa de crescimento específica.
[00153] O termo “inibidores de biomassa” significa os inibidores presentes na biomassa que inibe o processamento da biomassa por organismos, incluindo mas não limitado a, organismos de CBP. Os inibidores de biomassa incluem, mas não são limitados a, ácidos, incluindo sem limitação, ácidos acético, lático, 2-furoico, 3,4- di-hidroxibenzoico, 3,5-di-hidroxibenzoico, vanílico, homovanílico, siríngico, gálico e ferúlico; aldeídos, incluindo sem limitação, 5-hidroximetilfurfural, furfural, 3,4- hidroxibenzaldeído, vanilina, e siringaldeído. Os inibidores de biomassa incluem produtos removidos de material celulósico pré-tratado ou produzidos como um resultado do tratamento ou processamento do material celulósico, incluindo mas não limitado a, inibidores removidos de madeira dura mista pré-tratada ou qualquer outra biomassa pré-tratada.
Biomassa
[00154] A biomassa pode incluir qualquer tipo de biomassa conhecida na técnica ou descrita neste relatório. Os termos “material lignocelulósico”, “substrato lignocelulósico” e “biomassa celulósica” significa qualquer tipo de biomassa compreendendo celulose, hemicelulose, lignina ou combinações do mesmo, tais como mas não limitado a biomassa de madeira, gramíneas forrageiras, safras herbáceas de energia, biomassa vegetal que não de madeira, resíduos agrícolas, resíduos florestais, lama da produção de papel e/ou lodo de papel residual, lama de tratamento de água residual, resíduos sólidos urbanos, fibra de milho a partir de vegetais da produção de etanol de milho secos e úmidos e resíduos de processamento de açúcar. Os termos “hemicelulósicos”, “porções hemicelulósicas” e “frações hemicelulósicas” significam os elementos sem lignina, sem celulose do material lignocelulósico, tais como, mas não limitados a, hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucana, xilana, glucuronoxilana, arabinoxilana, manana, glucomanana, e galactoglucomanana, inter alia), pectinas (por exemplo, homogalacturonanas, rhamnogalacturonana I e II, e xilogalacturonana), e proteoglicanas (por exemplo, arabinogalactana-proteína, extensina e proteínas ricas em prolina).
[00155] Em um exemplo não limitante, o material lignocelulósico pode incluir, mas não é limitado a, biomassa de madeira, tal como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira mole e combinações das mesmas; gramas, tais como switchgrass, cordgrass, azevém, capim-amarelo, miscanthus ou uma combinação dos mesmos; resíduos de processamento de açúcar, tais como, mas não limitados a bagaço da cana de açúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não limitados a palha de arroz, cascas de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereais, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, cascas de aveia e fibra de milho; forragem, tal como, mas não limitado a resíduos da colheita de soja, resíduos da colheita de milho; suculentos, tais como, mas não limitados a, Agave; e resíduos florestais, tais como, mas não limitados a, fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, álamo, carvalho, bordo, vidoeiro, salgueiro), madeira mole ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, tais como palhas de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; forragens, tais como resíduos da colheita de milho e resíduos da colheita de soja; gramas, tais como switchgrass, capim-amarelo, cordgrass e miscanthus; ou combinações dos mesmos.
[00156] O lodo de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. O lodo de papel é resíduo sólido que surge da retirada da polpa e fabricação de papel, e é, tipicamente, removido a partir do processo de águas servidas em um clarificador primário. Em um custo final de $30/wet ton, o custo da eliminação lama é igual a $5/tonelada de papel que é produzido para venda. O custo da eliminação de lama úmida é um incentivo significante para converter o material em outros usos, tais como conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou de fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos adicionados de maior valor, tais como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e polímeros intermediários. Acetato
[00157] O acetato é produzido a partir de acetil-CoA em duas etapas de reação catalisadas por fosfotransacetilase (PTA) e acetato quinase (ACK). As reações mediadas por estas enzimas são mostradas abaixo: Reação de PTA: acetil-CoA + fosfato = CoA + fosfato de acetila (EC 2.3.1.8) Reação de ACK: ADP + fosfato de acetila = ATP + acetato (EC 2.7.2.1)
[00158] Tanto C. thermocellum quanto C. cellulolyticum fabricam acetato sob condições de fermentação padrão e têm genes bem anotados que codificam PTA e ACK (veja a Tabela 7 do Pedido Internacional No PCT/US2009/064128, que é incorporado, como referência, neste relatório). Bioprocessamento Consolidado
[00159] O bioprocessamento consolidado (CBP) é uma estratégia de processamento para a biomassa celulósica que envolve consolidar em uma etapa de processo único quatro eventos biologicamente mediados: produção de enzima, hidrólise, fermentação de hexoses e fermentação de pentoses. A implementação desta estratégia exige o desenvolvimento de micro-organismos que utilizam celulose, hemicelulósicos, e outros componentes de biomassa, também produzindo um produto de interesse em rendimentos e concentrações suficientemente altos. A praticabilidade de CBP é sustentada pela análise cinética e bioenergética. Veja, van Walsum e Lynd (1998) Biotech. Bioeng. 58:316. Metabolismo de Xilose
[00160] A xilose é um monossacarídeo de 5 carbonos que pode ser metabolizado em produtos úteis através de uma variedade de organismos. Existem duas vias principais do metabolismo de xilose, cada uma única nas enzimas características que elas utilizam. Uma via é chamada de “Xilose Redutase-Xilitol Desidrogenase” ou via XR-XDH. Xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) são as duas enzimas principais usadas neste método da degradação de xilose. XR, codificada pelo gene XYL1, é responsável pela redução de xilose em xilitol e é adicionada por cofatores NADH ou NADPH. Xilitol depois é oxidado em xilulose por XDH, que é expressado através do gene XYL2, e realizado exclusivamente com o cofator NAD+. Por causa da variação de cofatores necessários nesta via e o grau ao qual eles são disponíveis para o uso, um desequilíbrio pode resultar em uma superprodução de subproduto de xilitol e uma produção ineficaz de etanol desejável. A variação da expressão dos níveis da enzima XR e XDH foi testada no laboratório na tentativa de otimizar a eficácia da via do metabolismo de xilose.
[00161] A outra via para o metabolismo de xilose é chamada de via de “Xilose Isomerase” (XI). A enzima XI é responsável pela conversão direta de xilose em xilulose, e não procedeu por intermédio de um intermediário de xilitol. Ambas as vias criam xilulose, embora as enzimas utilizadas sejam diferentes. Depois da produção de xilulose, as vias tanto XR-XDH quanto XI procederam através da enzima xiluloquinase (XK), codificada no gene XKS1, para modificar ainda xilulose em xilulose-5-P onde ela depois entra na via pentose fosfato para outro catabolismo.
[00162] Estudos sobre o fluxo através da via pentose fosfato durante o metabolismo de xilose revelou que limitar a velocidade desta etapa pode ser benéfica à eficácia da fermentação em etanol. As modificações deste fluxo que podem aperfeiçoar a produção de etanol incluem a) reduzir a atividade de fosfoglucose isomerase, b) deletar o gene GND1, e c) deletar o gene ZWF1 (Jeppsson et al., 2002). Visto que a via pentose fosfato produz NADPH adicional durante o metabolismo, a limitação desta etapa ajudará a corrigir o desequilíbrio já evidente entre os cofatores NAD(P)H e NAD+ e reduzirá o subproduto de xilitol. Um outro experimento que compara as duas vias de metabolização de xilose revelou que a via XI foi mais capaz de metabolizar a xilose para produzir o rendimento máximo de etanol, enquanto a via XR-XDH alcançou uma taxa muito mais rápida de produção de etanol (Karhumaa et al., Microb Cell Fact. 2007 Feb 5;6:5). Veja também a Publicação Internacional No WO 2006/009434, integralmente incorporada neste relatório como referência.
Metabolismo de Arabinose
[00163] A arabinose é um monossacarídeo de 5 carbonos que pode ser metabolizada em produtos úteis por uma variedade de organismos. Os resíduos de L-Arabinose são encontrados amplamente distribuídos entre muitos heteropolissacarídeos de tecidos vegetais diferentes, tais como arabinanas, arabinogalactanas, xilanas e arabinoxilanas. A espécie de Bacillus no solo participa nos estágios precoces da decomposição do material da planta, e B. subtilis secreta três enzimas, uma endo-arabanase e duas arabinosidases, capazes de liberar oligômeros de arabinosil e L-arabinose a partir da célula vegetal.
[00164] Três vias para o metabolismo de L-arabinose em micro-organismos foram descritas. Muitas bactérias, incluindo Escherichia coli, usam arabinose isomerase (AraA; E.C. 5.3.1.4), ribuloquinase (AraB; E.C. 2.7.1.16), e ribulose fosfato epimerase (AraD; E.C. 5.1.3.4) para converter sequencialmente L-arabinose em D-xilulose-5-fosfato através de L-ribulose e L-ribulose 5-fosfato. Veja, por exemplo, Sa-Nogueira I, et al., Microbiology 143: 957 - 69 (1997). A D-xilulose-5- fosfato depois entra na via pentose fosfato para outro catabolismo. Na segunda via, L-arabinose é convertida em L-2-ceto-3-deoxiarabonato (L-KDA) pelo ação consecutiva de enzimas arabinose desidrogenase (ADH), arabinolactona (AL), e arabinonato desidratase (AraC). Veja, por exemplo, Watanabe, S, et al., J. Biol. Chem. 281: 2612 - 2623 (2006). L-KDA pode ser ainda metabolizada em duas vias alternativas: 1) conversão de L-KDA em 2-cetoglutarato por intermédio de semialdeído 2-cetoglutárico (KGSA) por L-KDA desidratase e KGSA desidrogenase ou 2) conversão de L-KDA em piruvato e glicolaldeído por L-KDA aldolase. Na terceira, via fúngica, L-arabinose é convertida em D-xilulose-5-fosfato através de L- arabinitol, L-xilulose e xilitol, por enzimas, tais como aldose redutase de dependente de NAD(P)H (AR), L-arabinitol 4-desidrogenase (ALDH), L-xilulose redutase (LXR), xilitol desidrogenase (XylD), e xiluloquinase (XylB). Estas, e proteínas adicionais envolvidas em metabolismo e regulação de arabinose podem ser encontradas em http://www.nmpdr.org/FIG/wiki/rest.cgi/NmpdrPlugin/SeedViewer?page=Subsystems; subsystem=L-Arabinose_utilization, visitado em 21 de Março de 2011, que é integralmente incorporado como referência neste relatório.
[00165] A proteína AraC regula a expressão de sua própria síntese e dos outros genes do sistema Ara. Veja, Schleif, R., Trends Genet. 16(12): 559 - 65 (2000). Em E. coli, a proteína AraC regula positiva e negativamente a expressão das proteínas necessárias para a absorção e o catabolismo do açúcar L-arabinose. Os homólogos de AraC, tais como proteínas RhaR e RhaS reguladoras do óperon de rhamnose, foram identificados, os quais contêm regiões homólogas ao domínio de ligação ao DNA de AraC (Leal, T.F. e de Sa-Nogueira, I., FEMS Microbiol Lett. 241(1): 41 - 48 (2004)). Tais proteínas reguladoras de arabinose são referidas como a família AraC/XylS. Veja também, Mota, L.J., et al., Mol. Microbiol. 33(3): 476 - 89 (1999); Mota, L.J., et al., J. Bacteriol. 183(14): 4190 - 201 (2001).
[00166] Em E. coli, o transporte de L-arabinose através da membrana citoplasmática de E. coli exige a expressão da operação de transporte de alta afinidade, araFGH, um sistema dependente de proteína de ligação na operação de transporte de baixa afinidade, araE, ou um simpórter protônico. Os transportadores de arabinose adicionais incluem aqueles identificados a partir de K. marxianus e P. guilliermondii, divulgados na Patente U.S. No 7.846.712, que está incorporada como referência neste relatório.
[00167] Em algumas modalidades, os micro-organismos recombinantes da invenção têm a capacidade de metabolizar arabinose usando uma ou mais entre as enzimas acima. Redução de Glicerol
[00168] As condições de crescimento anaeróbico exigem a produção de aceitantes de elétrons endógenos, tais como a coenzima nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+). Nas reações de redox celular, o acoplamento de NAD+/NADH desempenha um papel vital como um reservatório e portador de equivalentes de redução. Ansell, R., et al., EMBO J. 16: 2179 - 87 (1997). A produção de glicerol celular, que gera um NAD+, serve como uma válvula de redox para remover o excesso reduzindo a energia durante a fermentação anaeróbica na levedura. A produção de glicerol é, entretanto, um processo energeticamente desperdiçador que gasta ATP e resulta na perda de um composto de 3 carbonos reduzido. Ansell, R., et al., EMBO J. 16: 2179 - 87 (1997). Para gerar glicerol a partir de uma molécula de glicose de partida, glicerol 3-fosfato desidrogenase (GPD) reduz di-hidroxiacetona fosfato em glicerol 3-fosfato e glicerol 3-fosfatase (GPP) defosforila glicerol 3-fosfato em glicerol. Não obstante, sendo energeticamente desperdiçadora, a produção de glicerol é um processo metabólico necessário para o crescimento anaeróbico, conforme a deleção da atividade de GPD inibe completamente o crescimento sob condições anaeróblicas. Veja, Ansell, R., et al., EMBO J. 16: 2179 - 87 (1997).
[00169] A GPD é codificada por dois isogenes, gpd1 e gpd2. GPD1 codifica a isoforma principal em células anaerobicamente crescentes, enquanto GPD2 é exigida para a produção de glicerol na ausência de oxigênio, que estimula sua expressão. Pahlman, A-K., et al., J. Biol. Chem. 276: 3555 - 63 (2001). A primeira etapa na conversão de di-hidroxiacetona fosfato em glicerol por GPD é o controle da taxa. Guo, Z.P., et al., Metab. Eng. 13: 49 - 59 (2011). GPP também é codificada por dois isogenes, gpp1 e gpp2. A deleção de genes da GPP interrompe o crescimento quando substituída em condições anaeróbicas, demonstrando que a GPP é importante para a tolerância celular ao estresse osmótico e anaeróbico. Veja, Pahlman, A-K., et al., J. Biol. Chem. 276: 3555 - 63 (2001).
[00170] Pelo fato de que o glicerol é um subproduto principal da produção anaeróbica de etanol, muitos esforços foram feitos para deletar a produção celular de glicerol. Entretanto, devido aos equivalentes de redução produzidos pela síntese de glicerol, a deleção da via da síntese de glicerol não pode ser feita sem compensação para esta função metabólica valiosa. Tentativas para deletar a produção de glicerol e construir aceitantes de elétrons alternados foram feitas. Lidén, G., et al., Appl. Env. Microbiol. 62: 3894 - 96 (1996); Medina, V.G., et al., Appl. Env. Microbiol. 76: 190 - 195 (2010). Lidén e Medina deletaram os genes gpd1 e gpd2 e a tentaram contornar a formação de glicerol usando fontes de carbono adicionais. Lidén construiu uma xilose redutase a partir de Pichia stipitis em uma cepa de deleção do gpd1/2 de S. cerevisiae. A atividade de xilose redutase facilita o crescimento anaeróbico da cepa suprimida por glicerol na presença de xilose. Veja, Lidén, G., et al., Appl. Env. Microbiol. 62: 3894 - 96 (1996). Medina construiu uma acetilaldeído desidrogenase, mhpF, a partir de E. coli em uma cepa de deleção do gpd1/2 de S. cerevisiae para converter acetil-CoA em acetaldeído. A atividade de acetilaldeído desidrogenase facilitou o crescimento anaeróbico da cepa de deleção de glicerol na presença de ácido acético, más não na presença de glicose como a única fonte de carbono. Medina, V.G., et al., Appl. Env. Microbiol. 76: 190 - 195 (2010); veja também, EP 2277989. Medina observou vários problemas com a cepa contendo mhpF que precisam ser resolvidos antes da implementação industrial, incluindo o crescimento e as taxas de formação do produto significantemente reduzidos em relação à levedura compreendendo GPD1 e GPD2.
[00171] Assim, em algumas modalidades da invenção, as células hospedeiras recombinantes compreendem uma deleção ou alteração de uma ou mais enzimas produtoras de glicerol. As deleções ou alterações adicionais para modular a produção de glicerol incluem, mas não são limitadas a, construção de uma piruvato formiato liase em uma célula hospedeira recombinante, e são descritas no Pedido U.S. No 61/472.085, integralmente incorporado como referência neste relatório. Micro-organismos
[00172] A presente invenção inclui múltiplas estratégias para o desenvolvimento de micro-organismos com a combinação de propriedades de utilização do substrato e de formação do produto exigidas para CPF. A “estratégia celulolítica nativa” envolve construir micro-organismos celulolíticos que ocorrem naturalmente para aperfeiçoar as propriedades relacionadas ao produto, tais como rendimento e titulação. A “estratégia celulolítica recombinante” envolve construir nativamente organismos não celulolíticos que exibem altos rendimentos e titulações do produto para expressar um sistema de celulase heteróloga que permite a utilização de celulose ou a utilização de hemicelulose ou ambas.
[00173] Muitas bactérias têm a capacidade de fermentar açúcares hexose simples em uma mistura de ácido e produtos de pH-neutro por intermédio do processo de glicólise. A via glicolítica é abundante e compreende uma série de etapas enzimáticas por meio das quais uma molécula de glicose de 6 carbonos é quebrada, por intermédio de múltiplos intermediários, em duas moléculas do piruvato composto de 3 carbonos. Este processo resulta na geração líquida de ATP (fornecimento de energia biológica) e o cofator NADH reduzido.
[00174] O piruvato é um importante composto intermediário do metabolismo. Por exemplo, sob condições aeróbicas, o piruvato pode ser oxidado em acetil coenzima A (acetil-CoA), que depois entra no ácido carboxílico tricíclico (TCA), que, por sua vez, gera precursores sintéticos, CO2, e cofatores reduzidos. Os cofatores depois são oxidados através de doação de equivalentes de hidrogênio, por intermédio de uma série de etapas enzimáticas, ao oxigênio, resultando na formação de água e ATP. Este processo de formação de energia é conhecido como fosforilação oxidativa.
[00175] Sob condições anaeróbicas (nenhum oxigênio disponível), a fermentação ocorre, em que os produtos de degradação dos compostos orgânicos servem como doadores e aceitantes de hidrogênio. NADH em excesso a partir de glicólise foi oxidado em reações que envolve a redução de substratos orgânicos em produtos, tais como lactato e etanol. Além disso, ATP foi regenerado a partir da produção de ácidos orgânicos, tais como acetato, em um processo conhecido como fosforilação de substrato. Portanto, os produtos de fermentação do metabolismo de glicólise e piruvato incluem uma variedade de ácidos orgânicos, álcoois e CO2.
[00176] Anaeróbios mais facultativos metabolizam piruvato aerobicamente por intermédio de piruvato desidrogenase (PDH) e o ácido carboxílico tricíclico (TCA). Sob condições anaeróbicas, a via de energia principal para o metabolismo de piruvato é por intermédio da via piruvato-formiato-liase (PFL) para fornecer formiato e acetil-CoA. Acetil-CoA depois foi convertida em acetato, por intermédio de fosfotransacetilase (PTA) e acetato quinase (ACK) com a coprodução de ATP, ou reduzida em etanol por intermédio de acetalaldeído desidrogenase (AcDH) e álcool desidrogenase (ADH). De modo a manter um equilíbrio de equivalentes de redução, NADH em excesso produzida a partir de glicólise foi reoxidada em NAD+ pela lactato desidrogenase (LDH) durante a redução de piruvato em lactato. NADH também pode ser reoxidada por AcDH e ADH durante a redução de acetil-CoA em etanol, mas isto é uma reação menor em células com uma LDH funcional. Células Hospedeiras
[00177] As células hospedeiras úteis na presente invenção incluem quaisquer células procarióticas ou eucarióticas; por exemplo, micro-organismos selecionados a partir de células bacterianas, de algas e de levedura. Entre as células hospedeiras adequadas para a presente invenção sãos micro-organismos, por exemplo, dos gêneros Aeromonas, Aspergillus, Bacillus, Escherichia, Kluyveromyces, Pichia, Rhodococcus, Saccharomyces e Streptomyces.
[00178] Em algumas modalidades, as células hospedeiras sãos micro-organismos. Em uma modalidade, o micro-organismo é uma levedura. De acordo com a presente invenção, a célula hospedeira de levedura pode ser, por exemplo, a partir dos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces e Yarrowia. A espécie de levedura como células hospedeiras podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas modalidades, a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste de Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma modalidade particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em uma outra modalidade, a levedura é um Saccharomyces cerevisiae termotolerante. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada dentro do escopo daquele habilitado na técnica a partir de ensinamentos neste relatório.
[00179] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um célula oleaginosa. A célula oleaginosa hospedeira pode ser uma célula oleaginosa de levedura. Por exemplo, a célula oleaginosa hospedeira de levedura pode ser a partir dos gêneros Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. De acordo com a presente invenção, a célula oleaginosa hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalga oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de microalga oleaginosa pode ser a partir de gêneros Thraustochytrium ou Schizochytrium. O biodiesel depois pode ser produzido a partir de triglicerídeo produzido pelos organismos oleaginosos usando processos de transesterificação de lipídeo convencional. Em algumas modalidades particulares, as células hospedeiras oleaginosas podem ser induzidas para secretar lipídeos sintetizados. As modalidades usando células hospedeiras oleaginosas são vantajosas, pois elas podem produzir biodiesel a partir de matérias-primas lignocelulósicas que, em relação a substratos de semente oleaginosa, são mais baratas, podem ser cultivadas mais densamente, apresentam emissões de dióxido de carbono com ciclo de vida menor e podem ser cultivadas em terras marginais.
[00180] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um célula hospedeira termotolerante. As células hospedeiras termotolerantes podem ser particularmente úteis em processos simultâneos de sacarificação e fermentação permitindo que as celulases externamente produzidas e células hospedeiras produtoras de etanol apresentem desempenho ideal em faixas de temperatura similares.
[00181] As células hospedeiras termotolerantes podem incluir, por exemplo, células hospedeiras de Issatchenkia orientalis, Pichia mississippiensis, Pichia mexicana, Pichia farinosa, Clavispora opuntiae, Clavispora lusitaniae, Candida mexicana, Hansenula polymorpha e Kluyveromyces. Em algumas modalidades, a célula termotolerante é uma cepa de S. cerevisiae, ou outra cepa de levedura, que foi adaptada para crescer em temperaturas altas, por exemplo, através da seleção para o crescimento em temperaturas altas em um citostato.
[00182] Em algumas modalidades particulares, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de Kluyveromyces. Por exemplo, a célula hospedeira de Kluyveromyces pode ser uma célula hospedeira de K. lactis, K. marxianus, K. blattae, K. phaffii, K. yarrowii, K. aestuarii, K. dobzhanskii, K. wickerhamii K. thermotolerans ou K. waltii. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de K. lactis ou K. marxianus. Em uma outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de K. marxianus.
[00183] Em algumas modalidades, a célula hospedeira termotolerante pode crescer em temperaturas acima de cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C ou cerca de 42 °C. Em algumas modalidades da presente invenção, a célula hospedeira termotolerante pode produzir etanol a partir de celulose em temperaturas acima de cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C, cerca de 42 °C ou cerca de 43 °C, ou cerca de 44 °C ou cerca de 45 °C ou cerca de 50 °C.
[00184] Em algumas modalidades da presente invenção, a célula hospedeira termotolerante pode crescer em temperaturas a partir de cerca de 30 °C a 60 °C, cerca de 30 °C a 55 °C, cerca de 30 °C a 50 °C, cerca de 40 °C a 60 °C, cerca de 40 °C a 55 °C ou cerca de 40 °C a 50 °C. Em algumas modalidades da presente invenção, a célula hospedeira termotolerante pode produzir etanol a partir de celulose em temperaturas de cerca de 30 °C a 60 °C, cerca de 30 °C a 55 °C, cerca de 30 °C a 50 °C, cerca de 40 °C a 60 °C, cerca de 40 °C a 55 °C ou cerca de 40 °C a 50 °C.
[00185] Em algumas modalidades, a célula hospedeira tem a capacidade de metabolizar xilose. A informação detalhada com respeito ao desenvolvimento da tecnologia que utiliza xilose pode ser encontrada nas publicações seguintes: Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 4: 655 - 64 (2004), Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 5: 399 - 409 (2005), e Kuyper M et al. FEMS Yeast Res. 5: 925 - 34 (2005), que são incorporadas neste relatório como referência em sua totalidade. Por exemplo, a utilização de xilose pode ser realizada em S. cerevisiae expressando heterologamente o gene de xilose isomerase, XylA, por exemplo, a partir do fungo anaeróbico Piromyces sp. E2, superexpressando cinco enzimas de S. cerevisiae envolvidas na conversão de xilulose em intermediários glicolíticos (xiluloquinase, ribulose 5-fosfato isomerase, ribulose 5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase) e deletando o gene GRE3 que codifica aldose redutase para minimizar a produção de xilitol.
[00186] As células hospedeiras podem conter ou não marcadores de antibióticos.
[00187] Em certas modalidades, a célula hospedeira é um micro-organismo que é uma espécie dos gêneros Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter, Clostridium, Geobacillus, Saccharococcus, Paenibacillus, Bacillus, Caldicellulosiruptor, Anaerocellum ou Anoxibacillus. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma bactéria selecionada a partir do grupo que consiste de: Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter thermohidrosulfuricus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brocki, Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium phytofermentans, Clostridium straminosolvens, Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus stearothermophilus, Saccharococcus caldoxilosilyticus, Saccharoccus thermophilus, Paenibacillus campinasensis, Bacillus flavothermus, Anoxibacillus kamchatkensis, Anoxibacillus gonensis, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptor owensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus e Anaerocellum thermophilum. Em certas modalidades, a célula hospedeira é Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum ou Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Polinucleotídeos Otimizados no Códon
[00188] Os polinucleotídeos que codificam enzimas heterólogas descritos neste relatório podem ser otimizados no códon. Conforme usado neste relatório, o termo “região codificante otimizada no códon” significa uma região codificante de ácidos nucleicos que foi adaptada para a expressão nas células de um dado organismo através da substituição de pelo menos um, ou mais do que um, ou um número significante, de códons com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes de tal organismo.
[00189] Em geral, os genes altamente expressados em um organismo são inclinados aos códons que são reconhecidos pela espécie de tRNA mais abundante em tal organismo. Uma medição desta inclinação é o “índice de adaptação do códon” ou “CAI”, que mensura a extensão a qual os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem mais frequentemente em um conjunto de referência de genes altamente expressados a partir de um organismo.
[00190] O CAI de sequências otimizadas no códon da presente invenção corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0. Uma sequência otimizada no códon pode ser adicionalmente modificada para a expressão em um organismo particular, dependendo de tais restrições biológicas do organismo. Por exemplo, rodadas grandes de “As” ou “Ts” (por exemplo, rodadas maiores do que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consecutivas) podem ser removidas das sequências se estas são conhecidas efetuar negativamente a transcrição. Além disso, sítios de enzima de restrição específicos podem ser removidos para propósitos de clonagem molecular. Exemplos de tais sítios de enzima de restrição incluem PacI, AscI, BamHI, BglII, EcoRI e XhoI. Adicionalmente, a sequência de DNA pode ser verificada quanto às repetições diretas, repetições invertidas e repetições espelho com comprimentos de dez bases ou mais, que podem ser modificadas manualmente através da substituições de códons com “segundos melhores” códons, isto é, códons que ocorrem na segunda frequência mais alta no organismo particular para o qual a sequência deve ser otimizada.
[00191] Desvios na sequência de nucleotídeos que compreendem os códons que codificam os aminoácidos de qualquer cadeia de polipeptídeos levam em consideração variações na sequência que codifica o gene. Visto que cada códon consiste de três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA são restritos a quatro bases específicas, existem 64 combinações possíveis de nucleotídeos, 61 das quais codificam aminoácidos (os três códons remanescentes codificam sinais que terminam a tradução). O “código genético” que mostra que códons codificam tais aminoácidos é reproduzido neste relatório como Tabela 1. Como um resultado, muitos aminoácidos são designados em mais do que um códon. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, serina e arginina por seis, ao passo que triptofano e metionina são codificados apenas por um tripleto. Esta degeneração permite que a composição de base de DNA varie sobre uma ampla faixa sem alterar a sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo DNA. TABELA 1: O Código Genético Padrão
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[00192] Muitos organismos exibem uma inclinação para o uso de códons particulares para codificar a inserção de um aminoácido particular em uma cadeia de peptídeos crescente. A preferência do códon ou inclinação do códon, diferenças no uso do códon entre organismos, são fornecidas através da degeneração do código genético, e são bem documentadas entre muitos organismos. A inclinação do códon, frequentemente, se correlaciona com a eficácia de tradução do RNA mensageiro (mRNA), que, por sua vez, acredita-se ser dependente, inter alia, das propriedades dos códons que serão traduzidos e da disponibilidade das moléculas de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs selecionado em uma célula é, em geral, uma reflexão dos códons usados mais frequentemente na síntese de peptídeos. Consequentemente, os genes podem ser adaptados quanto à expressão ideal do gene em um dado organismo com base na otimização do códon.
[00193] Dado o grande número de sequências de genes disponíveis para uma ampla variedade de espécies de animais, plantas e microbianas, é possível calcular as frequências relativas do uso do códon. Tabelas de uso de códons estão prontamente disponíveis, por exemplo, no http://www.kazusa.or.jp/codon/(visitado em 18 de Dezembro de 2009), e estas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Veja Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000”, Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). As tabelas de uso de códons para levedura, calculadas a partir do GenBank Release 128.0 [15 de Fevereiro 2002], são reproduzidas abaixo como Tabela 2. Esta tabela usa a nomenclatura de mRNA, e, desse modo, ao invés de timina (T) que é encontrada no DNA, as tabelas usam uracila (U) que é encontrada no RNA. A tabela foi adaptada, de modo que as frequências são calculadas para cada aminoácido, e não para todos os 64 códons. TABELA 2: Tabela de Uso de Códons para Genes de Saccharomyces cerevisiae
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[00194] Através da utilização destas tabelas ou tabelas similares, uma pessoa de habilidade comum na técnica pode aplicar as frequências a qualquer sequência de polipeptídeos fornecida, e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região codificante otimizada no códon que codifica o polipeptídeo, mas que usa códons ideais para uma espécie fornecida. Regiões codificantes otimizadas no códon podem ser designadas por vários métodos diferentes.
[00195] Em um método, uma tabela de uso de códons é usada para encontrar o códon único mais frequente usado para qualquer aminoácido fornecido, e que o códon é usado cada vez que o aminoácido particular aparece na sequência de polipeptídeos. Por exemplo, referindo-se à Tabela 2 acima, para leucina, o códon mais frequente é UUG, que é usado 27,2% do tempo. Assim, todos os resíduos de leucina em uma sequência de aminoácidos fornecida determinariam o códon UUG.
[00196] Em um outro método, as frequências reais dos códons são distribuídas aleatoriamente por toda a sequência codificante. Assim, usando este método para otimização, se uma sequência hipotética de polipeptídeos apresentar 100 resíduos de leucina, referindo-se à Tabela 2 para a frequência de uso em S. cerevisiae, cerca de 5, ou 5% dos códons de leucina seriam CUC, cerca de 11, ou 11% dos códons de leucina seriam CUG, cerca de 12, ou 12% dos códons de leucina seriam CUU, cerca de 13, ou 13% dos códons de leucina seriam CUA, cerca de 26, ou 26% dos códons de leucina seriam UUA, e cerca de 27, ou 27% dos códons de leucina seriam UUG.
[00197] Estas frequências seriam distribuída aleatoriamente por todos os códons de leucina na região codificante que codifica o polipeptídeo hipotético. Conforme será entendido por aqueles de habilidade comum na técnica, a distribuição de códons na sequência pode variar significantemente usando este método; entretanto, a sequência sempre codifica o mesmo polipeptídeo.
[00198] Quando do uso dos métodos acima, o termo “cerca de” é usado precisamente para incluir porcentagens parciais das frequências de códons para um aminoácido fornecido. Conforme usado neste relatório, “cerca de” é definido como um aminoácido a mais ou um aminoácido a menos em relação ao valor fornecido. O valor do número total de aminoácidos é arredondado para cima se a frequência parcial de uso for de 0,50 ou maior, e é arredondado para baixo se a frequência parcial de uso for de 0,49 ou menos. Usando novamente o exemplo da frequência de uso de leucina em genes humanos para um polipeptídeo hipotético tendo 62 resíduos de leucina, a frequência parcial de uso do códon seria calculada multiplicando-se 62 pelas frequências para os vários códons. Assim, 7,28 por cento de 62 é igual a 4,51 códons UUA, ou “cerca de 5”, isto é, 4, 5, ou 6 códons UUA, 12,66 por cento de 62 é igual a 7,85 códons UUG ou “cerca de 8”, isto é, 7, 8, ou 9 códons UUG, 12,87 por cento de 62 é igual a 7,98 códons CUU, ou “cerca de 8”, isto é, 7, 8, ou 9 códons CUU, 19,56 por cento de 62 é igual a 12,13 códons CUC ou “cerca de 12”, isto é, 11, 12, ou 13 códons CUC, 7,00 por cento de 62 é igual a 4,34 códons CUA ou “cerca de 4”, isto é, 3, 4, ou 5 códons CUA, e 40,62 por cento de 62 é igual a 25,19 códons CUG, ou “cerca de 25”, isto é, 24, 25, ou 26 códons CUG.
[00199] Códons aleatoriamente determinados em uma frequência otimizada para codificar uma sequência de polipeptídeos fornecida podem ser manualmente preparados através do cálculo de frequências de códons para cada aminoácido, e depois determinação dos códons para a sequência de polipeptídeos aleatoriamente. Adicionalmente, vários algoritmos e programas de computador estão prontamente disponíveis àqueles de habilidade comum na técnica. Por exemplo, a função da “EditSeq” no Lasergene Package, disponível a partir da DNAstar, Inc., Madison, WI, a função de retrotradução no VectorNTI Suite, disponível a partir da InforMax, Inc., Bethesda, MD, e a função de “retrotradução” no GCG--Wisconsin Package, disponível a partir da Accelrys, Inc., San Diego, CA. Além disso, várias fontes estão publicamente disponíveis para as sequências de região codificante otimizadas no códon, por exemplo, a função de “retrotradução” em http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng (visitado em 18 de Dezembro de 2009) e a função “backtranseq” disponível em http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/backtranseq (visitado em 18 de Dezembro de 2009). A construção de um algoritmo rudimentar para determinar códons com base em uma frequência fornecida também pode ser facilmente realizada com funções matemáticas básicas através de uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[00200] Várias opções estão disponíveis para sintetizar regiões codificantes otimizadas no códon designadas por qualquer um entre os métodos descritos acima, usando manipulações de biologia molecular padrão e de rotina bem conhecidas àqueles de habilidade comum na técnica. Em um método, uma série de pares de oligonucleotídeos complementares de 80 a 90 nucleotídeos cada um em comprimento e transpondo o comprimento da sequência desejada é sintetizada pelos métodos padrão. Estes pares de oligonucleotídeos são sintetizados, tal que sob anelamento, eles formam fragmentos de fita dupla de 80 a 90 pares de base, contendo extremidades coesivas, por exemplo, cada oligonucleotídeo no par é sintetizado para se estender em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais bases além da região que é complementar ao outro oligonucleotídeo no par. As extremidades de fita única de cada par de oligonucleotídeos se anelam com a extremidade de fita única de um outro par de oligonucleotídeos. Os pares de oligonucleotídeos são deixados anelar, e aproximadamente cinco a seis entre estes fragmentos de fita dupla são, em seguida, deixados anelar por intermédio das extremidades de fita única coesivas, e, em seguida, eles são ligados e clonados em um vetor de clonagem bacteriana padrão, por exemplo, um vetor TOPO® disponível a partir da Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA. O constructo depois é sequenciado através de métodos padrão. Vários entre estes constructos consistindo de 5 a 6 fragmentos de 80 a 90 fragmentos de par de base ligados, isto é, fragmentos de cerca de 500 pares de base, são preparados, tal que a sequência total desejada é representada em uma série de constructos de plasmídeo. Os insertos destes plasmídeos depois são cortados com enzimas de restrição apropriadas e ligados para formar o constructo final. O constructo final depois é clonado em um vetor de clonagem bacteriana padrão e sequenciado. Métodos adicionais seriam imediatamente evidentes ao técnico habilitado. Além disso, a síntese do gene está comercialmente disponível.
[00201] Em modalidades adicionais, uma sequência de polipeptídeos de comprimento total é otimizada no códon para uma espécie fornecida resultante em uma região codificante otimizada no códon que codifica o polipeptídeo total, e, em seguida, fragmentos de ácido nucleico da região codificante otimizada no códon, que codificam fragmentos, variantes, e derivados do polipeptídeo são preparados á partir da região codificante otimizada no códon original. Conforme seria bem entendido por aqueles de habilidade comum na técnica, se os códons forem aleatoriamente determinados para a região codificante de comprimento total com base em sua frequência de uso em uma espécie fornecida, fragmentos de ácido nucleico que codificam fragmentos, variantes, e derivados não seriam, necessariamente, completamente otimizados no códon para a espécie fornecida. Entretanto, tais sequências estão ainda muito mais próximas ao uso do códon da espécie desejada em relação ao uso do códon nativo. A vantagem deste método é que a síntese de fragmentos de ácido nucleico otimizados no códon que codificam cada fragmento, variante, e derivado de um polipeptídeo fornecido, embora de rotina, seria demorada e resultaria em custo significante. Transposons
[00202] Para selecionar DNA estranho que entrou em um hospedeiro, é preferível que o DNA seja estavelmente mantido no organismo de interesse. Com respeito aos plasmídeos, existem dois processos pelos quais isto pode ocorrer. Um deles é através do uso de plasmídeos replicativos. Estes plasmídeos têm origens de replicação que são reconhecidas pelo hospedeiro e permitem que os plasmídeos sejam replicados como elementos estáveis, autônomos, extracromossômicos que são particionados durante a divisão celular em células filhas. O segundo processo ocorre através da integração de um plasmídeo no cromossomo. Isto predominantemente acontece através de recombinação homóloga e resulta na inserção do plasmídeo total, ou partes do plasmídeo, no cromossomo hospedeiro. Assim, o plasmídeo e marcador(es) selecionável(is) são replicados como uma parte integral do cromossomo e segregados em células filhas. Portanto, para verificar se o DNA de plasmídeo entra em uma célula durante um evento de transformação através do uso de marcadores selecionáveis, é exigido o uso de um plasmídeo replicativo ou a capacidade de recombinar o plasmídeo no cromossomo. Estes qualificadores nem sempre podem ser satisfeitos, especialmente quando do manejo de organismos que não têm um conjunto de ferramentas genéticas.
[00203] Uma maneira de evitar problemas com respeito aos marcadores associados ao plasmídeo é através do uso de transposons. Um transposon é um elemento de DNA móvel, definido por sequências de DNA de mosaico que são reconhecidas por mecanismo enzimático referido como uma transposase. A função da transposase é inserir aleatoriamente o DNA transposon no hospedeiro ou DNA alvo. Um marcador selecionável pode ser clonado em um transposon através de engenharia genética padrão. O fragmento de DNA resultante pode ser ligado ao mecanismo da transposase em uma reação in vitro e o complexo pode ser introduzido em células alvo através de eletroporação. A inserção estável do marcador no cromossomo exige apenas a função do mecanismo da transposase e alivia a necessidade quanto à recombinação homóloga ou plasmídeos replicativos.
[00204] A natureza aleatória associada com a integração de transposons tem a vantagem adicionada de ação como uma forma de mutagênese. As bibliotecas podem ser criadas, as quais compreendem amalgamações de mutantes de transposon. Estas bibliotecas podem ser usadas em triagens ou seleções para produzir mutantes com fenótipos desejados. Por exemplo, uma biblioteca de transposon de um organismo de CBP pode ser triada quanto à capacidade de produzir mais etanol, ou menos ácido láctico e/ou mais acetato. Estratégia celulósica nativa
[00205] Micro-organismos celulósicos que ocorrem naturalmente são pontos de partida para o desenvolvimento de organismo de CBP por intermédio da estratégia nativa. Anaeróbicos e anaeróbicos facultativos são de particular interesse. O objetivo primário é construir a desintoxicação de acetato derivado de biomassa em um solvente não carregado, incluindo, mas não limitado a, acetona, isopropanol, acetato de etila ou etanol. A construção metabólica de fermentações de ácido misto em relação, por exemplo, à produção de etanol, foi bem sucedida no caso de bactérias mesofílicas, não celulósicas e entéricas. Desenvolvimentos recentes em técnicas de transferência gênica adequadas levar em consideração este tipo de trabalho que deve ser experimentado com bactérias celulósicas. Estratégia celulósica recombinante
[00206] Micro-organismos não celulósicos com propriedades de formação de produto desejadas são pontos de partida para o desenvolvimento de organismo de CBP através da estratégia celulósica recombinante. O objetivo primário de tais desenvolvimentos é construir um sistema de celulase heterólogo que permite crescimento e fermentação na lignocelulose pré-tratada. A produção heteróloga de celulases foi primariamente continuada com hospedeiros bacterianos produzindo etanol em alto rendimento (cepas engenheiradas de E. coli, Klebsiella oxitoca e Zymomonas mobilis) e a levedura Saccharomyces cerevisiae. A expressão de celulase em cepas de K. oxytoca resultou em rendimentos de hidrólise aumentados - mas não crescimento sem celulase adicionada - para a celulose microcristalina, e crescimento anaeróbico em celulose amorfa. Embora dúzias de enzimas sacarolíticas tenham sido funcionalmente expressadas em S. cerevisiae, o crescimento anaeróbico em celulose como o resultado de tal expressão não foi definitivamente demonstrado.
[00207] Aspectos da presente invenção se referem ao uso de microorganismos termofílicos ou mesofílicos como hospedeiros para a modificação por intermédio da estratégia celulósica nativa. Seu potencial em aplicações de processo em biotecnologia se origina de sua capacidade de crescer em temperaturas relativamente altas com altas taxas metabólicas presentes, produção de enzimas física e quimicamente estáveis, e rendimentos elevados de produtos finais. Grupos principais de bactérias termofílicas incluem eubactérias e arqueobactérias. Eubactérias termofílicas incluem: bactérias fototrópicas, tais como cianobactérias, bactérias púrpuras e bactérias verdes; bactérias Gram-positivas, tais como Bacillus, Clostridium, bactérias ácido-lácticas, e Actinomyces; e outras eubactérias, tais como Thiobacillus, espiroqueta, Desulfotomaculum, aeróbios Gram-negativos, anaeróbicos Gram-negativos, e Thermotoga. Dentro de arqueobactérias são considerados Metanógenos, termófilos extremos (um termo reconhecido na técnica), e Thermoplasma. Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a termófilos organotróficos Gram-negativos dos gêneros Thermus, eubactérias Gram-positivas, tais como os gêneros Clostridium, e também que compreendem tanto bastões quanto cocos, gêneros em grupo de eubactérias, tais como Thermosipho e Thermotoga, gêneros de Arqueobactérias, tais como Thermococcus, Thermoproteus (na forma de bastão), Thermofilum (na forma de bastão), Pyrodictium, Acidianus, Sulfolobus, Pyrobaculum, Pyrococcus, Thermodiscus, Staphylothermus, Desulfurococcus, Archaeoglobus e Methanopyrus. Alguns exemplos de termofílicos ou mesofílicos (incluindo bactérias, micro-organismo procariótico e fungos), que podem ser adequados para a presente invenção incluem, mas não são limitados a: Clostridium thermosulfurogenes, Clostridium cellulolyticum, Clostridium thermocellum, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermoaceticum, Clostridium thermosaccharolyticum, Clostridium tartarivorum, Clostridium thermocellulaseum, Clostridium phytofermentans, Clostridium straminosolvens, Thermoanaerobacterium thermosaccarolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermobacteroides acetoetilicus, Thermoanaerobium brockii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Anaerocellum thermophilium, Pyrodictium occultum, Thermoproteus neutrophilus, Thermofilum librum, Thermothrix thioparus, Desulfovibrio thermophilus, Thermoplasma acidophilum, Hydrogenomonas thermophilus, Thermomicrobium roseum, Thermus flavas, Thermus ruber, Pyrococcus furiosus, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Chloroflexus aurantiacus, Thermococcus litoralis, Pyrodictium abyssi, Bacillus stearothermophilus, Cyanidium caldarium, Mastigocladus laminosus, Chlamydothrix calidissima, Chlamydothrix penicillata, Thiothrix carnea, Phormidium tenuissimum, Phormidium geysericola, Phormidium subterraneum, Phormidium bijahensi, Oscillatoria filiformis, Synechococcus lividus, Chloroflexus aurantiacus, Pyrodictium brockii, Thiobacillus thiooxidans, Sulfolobus acidocaldarius, Thiobacillus thermophilica, Bacillus stearothermophilus, Cercosulcifer hamathensis, Vahlkampfia reichi, Cyclidium citrullus, Dactylaria gallopava, Synechococcus lividus, Synechococcus elongatus, Synechococcus minervae, Synechocystis aquatilus, Aphanocapsa thermalis, Oscillatoria terebriformis, Oscillatoria amphibia, Oscillatoria germinata, Oscillatoria okenii, Phormidium laminosum, Phormidium parparasiens, Symploca thermalis, Bacillus acidocaldarias, Bacillus coagulans, Bacillus thermocatenalatus, Bacillus licheniformis, Bacillus pamilas, Bacillus macerans, Bacillus circulans, Bacillus laterosporus, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Desulfotomaculum nigrificans, Streptococcus thermophilus, Lactobacilo thermophilus, Lactobacilo bulgaricus, Bifidobacterium thermophilum, Streptomyces fragmentosporus, Streptomyces thermonitrificans, Streptomyces thermovulgaris, Pseudonocardia thermophila, Thermoactinomyces vulgaris, Thermoactinomyces sacchari, Thermoactinomyces candidas, Thermomonospora curvata, Thermomonospora viridis, Thermomonospora citrina, Microbispora thermodiastatica, Microbispora aerata, Microbispora bispora, Actinobifida dichotomica, Actinobifida chromogena, Micropolispora caesia, Micropolispora faeni, Micropolispora cectivugida, Micropolispora cabrobrunea, Micropolispora thermovirida, Micropolispora viridinigra, Methanobacterium thermoautothropicum, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptor owensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus, variantes dos mesmos, e/ou progênies dos mesmos.
[00208] Em modalidades particulares, a presente invenção se refere a bactérias termofílicas selecionadas a partir do grupo que consiste de Clostridium cellulolyticum, Clostridium thermocellum e Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
[00209] Em certas modalidades, a presente invenção se refere a bactérias termofílicas selecionadas a partir do grupo que consiste de Fervidobacterium gondwanense, Clostridium thermolacticum, Moorella sp. e Rhodothermus marinus.
[00210] Em certas modalidades, a presente invenção se refere a bactérias termofílicas dos gêneros Thermoanaerobacterium ou Thermoanaerobacter, incluindo, mas não limitadas à espécie selecionada a partir do grupo que consiste de: Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polisaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobium brockii, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brockii, variantes dos mesmos e progênies dos mesmos.
[00211] Em certas modalidades, a presente invenção se refere a micro- organismos dos gêneros Geobacillus, Saccharococcus, Paenibacillus, Bacillus e Anoxibacillus, incluindo, mas não limitados à espécie selecionada a partir do grupo que consiste de: Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus stearothermophilus, Saccharococcus caldoxilosilyticus, Saccharoccus thermophilus, Paenibacillus campinasensis, Bacillus flavothermus, Anoxibacillus kamchatkensis, Anoxibacillus gonensis, variantes dos mesmos, e progênies dos mesmos.
[00212] Em certas modalidades, a presente invenção se refere a bactérias mesofílicas selecionadas a partir do grupo que consiste de Saccharophagus degradans; Flavobacterium johnsoniae; Fibrobacter succinogenes; Clostridium hungatei; Clostridium phytofermentans; Clostridiuma cellulolyticum; Clostridium aldrichii; Clostridium termitididis; Acetivibrio cellulolyticus; Acetivibrio ethanolgignens; Acetivibrio multivorans; Bacteroides cellulosolvens; e Alkalibacter saccharofomentans, variantes dos mesmos e progênies dos mesmos. Desenvolvimento do organismo por intermédio da estratégia celulósica nativa
[00213] Um método para o desenvolvimento do organismo para CBP inicia com organismos que naturalmente utilizam celulose, hemicelulose e/ou outros componentes de biomassa, que depois são geneticamente construídos para realçar o rendimento e tolerância do produto. Por exemplo, Clostridium thermocellum é uma bactéria termofílica que tem entre as taxas mais altas de utilização de celulose relatadas. Outros organismos de interesse são termófilos que utilizam xilose, tais como Thermoanaerobacterium saccharolyticum e Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum. A produção de ácido orgânico pode ser responsável pelas baixas concentrações de etanol produzido, em geral, associadas com estes organismos. Assim, um objetivo é eliminar a produção de ácido acético e láctico nestes organismos por intermédio de construção metabólica. Esforços substanciais foram dedicados para o desenvolvimento de sistemas de transferência de gene para os organismos alvo descritos acima e múltiplos isolados de C. thermocellum a partir da natureza foram caracterizados. Veja McLaughlin et al. (2002) Environ. Sci. Technol. 36:2122. A construção metabólica de bactérias termofílicas e sacarolíticas é uma área ativa de interesse, e o nocaute de lactato desidrogenase em T. saccharolyticum foi recentemente relatado. Veja Desai et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:600. O nocaute de acetato quinase e fosfotransacetilase neste organismo também é possível. Desenvolvimento do organismo por intermédio da estratégia celulósica recombinante
[00214] Um método alternativo para o desenvolvimento do organismo para CBP envolve conferir a capacidade de crescer em materiais lignocelulósicos em micro-organismos que naturalmente apresentam alto rendimento e tolerância do produto por intermédio da expressão de um sistema celulásico heterólogo e, talvez, outras características. Por exemplo, Saccharomyces cerevisiae foi construído para expressar em duas dúzias de enzimas sacarolíticas diferentes. Veja Lynd et al. (2002) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:506.
[00215] Considerando que a hidrólise celulósica tem sido abordada na literatura primariamente no contexto de um paradigma intelectual enzimaticamente orientado, a estratégia de processamento CBP exige que a hidrólise celulósica seja vista em termos de um paradigma microbiano. Este paradigma microbiano naturalmente leva a uma ênfase em problemas, organismos, sistemas celulásicos fundamentais diferentes, e marcos aplicados em comparação àqueles do paradigma enzimático. Neste contexto, C. thermocellum foi um organismo modelo por causa de sua alta taxa de crescimento sobre a celulose juntamente com sua utilidade potencial para CBP.
[00216] Em certas modalidades, organismos úteis na presente invenção podem ser aplicáveis ao processo conhecido como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), que é intencionado a incluir o uso dos ditos micro-organismos e/ou um ou mais hospedeiros recombinantes (ou extratos dos mesmos, incluindo extratos purificados ou não purificados) para a degradação ou despolimerização contemporânea de um açúcar complexo (isto é, biomassa celulósica) e bioconversão de tal resíduo de açúcar no etanol através de fermentação. Produção de etanol
[00217] De acordo com a presente invenção, um micro-organismo recombinante pode ser usado para produzir etanol a partir da biomassa, que é referido neste relatório como material lignocelulósico, substrato lignocelulósico ou biomassa celulósica. Métodos para produzir etanol podem ser realizados, por exemplo, através do contato da biomassa com um micro-organismo recombinante, conforme descrito neste relatório, e conforme descrito em Pedido Internacional No PCT/US2009/002902, Pedido Internacional No PCT/US2009/003972, Pedido Internacional No PCT/US2009/003970, Pedido Internacional No PCT/US2009/065571, Pedido Internacional No PCT/US2009/069443, Pedido Internacional No PCT/US2009/064128, Pedido Internacional No PCT/IB2009/005881, Pedido U.S. No 61/116.981, Pedido U.S. No 61/351.165 e Pedido U.S. No 61/420.142, os conteúdos dos quais são integralmente incorporados como referência neste relatório.
[00218] Além disso, para produzir etanol, os micro-organismos recombinantes descritos neste relatório podem ser combinados, como células hospedeiras recombinantes ou como vias metabólicas engenheiradas em células hospedeiras recombinantes, com os micro-organismos recombinantes descritos no Pedido Internacional No PCT/US2009/002902, Pedido Internacional No PCT/US2009/003972, Pedido Internacional No PCT/US2009/003970, Pedido Internacional No PCT/US2009/065571, Pedido Internacional No PCT/US2009/069443, Pedido Internacional No PCT/US2009/064128, Pedido Internacional No PCT/IB2009/005881, Pedido U.S. No 61/351.165 e Pedido U.S. No 61/420.142, os conteúdos dos quais são incorporados como referência neste relatório. O micro-organismo recombinante, conforme descrito neste relatório, também pode ser construído com as enzimas e/ou vias metabólicas descritas no Pedido Internacional No PCT/US2009/002902, Pedido Internacional No PCT/US2009/003972, Pedido Internacional No PCT/US2009/003970, Pedido Internacional No PCT/US2009/065571, Pedido Internacional No PCT/US2009/069443, Pedido Internacional No PCT/US2009/064128, Pedido Internacional No PCT/IB2009/005881, Pedido U.S. No 61/351.165, e Pedido U.S. No 61/420.142, os conteúdos dos quais são incorporados como referência neste relatório.
[00219] Numerosos substratos celulósicos podem ser usados, de acordo com a presente invenção. Os substratos para os ensaios de atividade de celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados, carboximetilcelulose (CMC), ou hidroxietilcelulose (HEC). Substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, tal como celulose intumescida com ácido fosfórico (PASC), celulose pigmentada ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Estes substratos são, em geral, material celulósico altamente ordenado e, assim, apenas frugalmente solúveis.
[00220] Será avaliado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contém celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em uma forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, resíduos da colheita de milho, serragem, casca de árvore, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramas, tais como switchgrass, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábrica de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.
[00221] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um método para hidrolisar um substrato celulósico, por exemplo, um substrato celulósico, conforme descrito acima, através do contato do substrato celulósico com um micro-organismo recombinante da invenção. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um método para hidrolisar um substrato celulósico, por exemplo um substrato celulósico, conforme descrito acima, através do contato do substrato celulósico com uma cocultura compreendendo células de levedura que expressam celulases heterólogas.
[00222] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um método para fermentar celulose. Tais métodos podem ser realizados, por exemplo, através da cultura de uma célula hospedeira ou cocultura em um meio que contém celulose insolúvel para permitir a sacarificação e fermentação da celulose.
[00223] A produção de etanol, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada em temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C, cerca de 42 °C, cerca de 43 °C, cerca de 44 °C, cerca de 45 °C, cerca de 46 °C, cerca de 47 °C, cerca de 48 °C, cerca de 49 °C, ou cerca de 50 °C. Em algumas modalidades da presente invenção, a célula hospedeira termotolerante pode produzir etanol a partir da celulose em temperaturas acima cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C, cerca de 42 °C, ou cerca de 43 °C, ou cerca de 44 °C, ou cerca de 45 °C, ou cerca de 50 °C. Em algumas modalidades da presente invenção, a célula hospedeira termotolerante pode produzir etanol a partir da celulose em temperaturas a partir de cerca de 30 °C a 60 °C, cerca de 30 °C a 55 °C, cerca de 30 °C a 50 °C, cerca de 40 °C a 60 °C, cerca de 40 °C a 55 °C ou cerca de 40 °C a 50 °C.
[00224] Em algumas modalidades, métodos para produzir etanol podem compreender contatar um substrato celulósico com um micro-organismo recombinante ou cocultura da invenção e adicionalmente contatar o substrato celulósico com enzimas celulase externamente produzidas. Enzimas celulase externamente produzidas exemplares são comercialmente disponíveis e são conhecidas àqueles de habilidade na técnica.
[00225] Em algumas modalidades, os métodos compreendem produzir etanol em uma taxa particular. Por exemplo, em algumas modalidades, etanol é produzido em uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro.
[00226] Em algumas modalidades, as células hospedeiras da presente invenção podem produzir etanol em uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora por litro, ou pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro mais do que uma cepa controle (desprovida de celulases heterólogas) e cultivadas sob as mesmas condições. Em algumas modalidades, o etanol pode ser produzido na ausência de quaisquer celulases externamente adicionadas.
[00227] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol nas amostras de fermentação pode ser avaliada usando a análise por HPLC. Muitos kits de ensaio com etanol são comercialmente disponíveis os quais utilizam, por exemplo, ensaios com base na enzima álcool oxidase. Métodos para determinar a produção de etanol estão no escopo daqueles habilitado na técnica a partir dos ensinamentos neste relatório. O Departamento de Energia U.S. (DOE) fornece um método para calcular o rendimento teórico de etanol. Consequentemente, se as porcentagens em peso forem conhecidas de açúcares C6 (isto é, glucano, galactano, manano), o rendimento teórico de etanol em galões por tonelada seca de polímeros C6 totais pode ser determinado através da aplicação de um fator de conversão, como segue: (1,11 libras de açúcar C6/libra de açúcar polimérico) x (0,51 libras de etanol/libra de açúcar) x (2000 libras de etanol/tonelada de açúcar C6 polimérico) x (1 galão de etanol/6,55 libras de etanol) x (1/100%), em que o fator (1 galão de etanol/6,55 libras de etanol) é tomado como a gravidade específica de etanol a 20 °C.
[00228] E se as porcentagens em peso forem conhecidas de açúcares C5 (isto é, xilano, arabinana), o rendimento teórico de etanol em galões por tonelada seca de polímeros C5 totais pode ser determinado através da aplicação de um fator de conversão, como segue: (1,136 libras de açúcar C5/libra de açúcar C5 polimérico) x (0,51 libras de etanol/libra de açúcar) x (2000 libras de etanol/tonelada de açúcar C5 polimérico) x (1 galão de etanol/6,55 libras de etanol) x (1/100%), em que o fator (1 galão de etanol/6,55 libras de etanol) é tomado como a gravidade específica de etanol a 20 °C.
[00229] Segue que a adição do rendimento teórico de etanol em galões por tonelada seca dos polímeros C6 totais ao rendimento teórico de etanol em galões por tonelada seca dos polímeros C5 totais fornece o rendimento teórico total de etanol em galões por tonelada seca de matéria-prima.
[00230] Através da aplicação desta análise, o DOE fornece os exemplos seguintes de rendimento teórico de etanol em galões por tonelada seca de matéria- prima: grão de milho, 124,4; resíduos da colheita de milho, 113,0; palha de arroz, 109,9; lixo descaroçador de algodão, 56,8; desbastes florestais, 81,5; serragem de madeira dura, 100,8; bagaço, 111,5; e papel misto, 116,2. É importante observar que estes são rendimentos teóricos. O DOE adverte que dependendo da natureza da matéria-prima e do processo utilizado, o rendimento real pode ser de 60% a 90% do teórico, e ainda afirma que “obter alto rendimento pode ser caro, entretanto, quanto menores os processos de rendimento mais frequentemente o custo pode ser eficaz.” (Ibid.) Contrasseleção de TDK
[00231] No campo de engenharia genética, as células contendo um evento de construção são frequentemente identificadas através do uso de seleções positivas. Isto é feito através da criação de ligação genética entre a seleção positiva codificada por um marcador dominante, tal como um gene resistente ao antibiótico, a modificação genética desejada, e os locos alvo. Uma vez que as modificações são identificadas, é frequentemente desejável remover o marcador dominante, de modo que ele possa ser reutilizado durante os eventos de engenharia genética subsequentes.
[00232] Entretanto, se um marcador dominante também não têm uma contrasseleção, um gene que expressa uma proteína que confere uma contrasseleção, deve ser geneticamente ligado ao marcador dominante, à modificação genética desejada e ao loco alvo. Para evitar tais limitações, os métodos da invenção incluem ligação e/ou designação de uma transformação associada com recombinação entre o gene da timidina quinase (TDK) a partir do Vírus do herpes simples Tipo 1 (Acesso GenBank No AAA45811; SEQ ID NO: 84) e um ou mais genes resistentes ao antibiótico. Veja, por exemplo, Figura 35. Exemplos de tais genes resistentes ao antibiótico, incluem, mas não são limitados à aminoglicosídeo fosfotransferase (Kan; resistente a G418), nourseotricina acetiltransferease (Nat; resistente à nourseotricina), higromicina B fosfotransferase (hph; resistente à higromicina B), ou um produto do gene Sh ble 1 (ble; resistente à Zeocina). Usando tais métodos de contrasseleção com marcadores selecionáveis positivos/negativos ligados, conforme descrito abaixo no Exemplo 4, transformantes compreendendo a modificação genética desejada foram obtidos em várias cepas de levedura diferentes, incluindo as cepas de S. cerevisiae M139, M2390, e várias cepas de madeira dura descritas neste relatório.
EXEMPLIFICAÇÃO
[00233] A invenção descrita será mais facilmente entendida através de referência aos exemplos seguintes, que são meramente incluídos para propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção e não são intencionados a limitar a invenção. EXEMPLO 1 Desintoxicação De Material Lignocelulósico Através De Absorção In Vivo de Acetato e Formação De Etanol
[00234] Acetato é um principal inibidor do crescimento celular e está presente em grandes quantidades em substratos derivados de biomassa. Durante a conversão de materiais lignocelulósicos em etanol, uma grande porção de energia celular deve ser gasta para evitar os efeitos nocivos de ácido acético. Por causa destes efeitos, o crescimento celular e outros fenótipos importante são diminuídos resultando em um processo subideal.
[00235] De modo a superar os efeitos inibitórios do acetato, é desejado converter o acetato a partir de um composto inibitório em um composto menos inibitório, por exemplo, etanol, que também é o produto primário produzido durante a fermentação da levedura. Tentativas para superar os efeitos inibitórios de acetato contaram com a atividade do gene endógeno para a conversão de acetato em acetil- CoA, um intermediário metabólico antes da formação de etanol, sem sucesso. Recentemente, foi mostrado que um mutante de deleção de glicerol pode ser construído em levedura para a conversão de acetato em um composto menos inibitório. Veja Medina, V.G., et al., Appl. Environ. Microbiol., publicado online antes da impressão em 13 de Nov. de 2009. O mutante de deleção de glicerol não pode regenerar NAD+, e, portanto, é incapaz de crescer anaerobicamente. Através da introdução de uma enzima a partir de E. coli, uma acetaldeído desidrogenase (MhpF), a cepa de levedura foi capaz de crescer anaerobicamente, embora muito mais lento do que a cepa não engenheirada. Pelo fato de que o crescimento deste mutante de deleção foi significantemente inibido, ele exige mais otimização antes que tal cepa ainda possa ser usada em um industrial processo.
[00236] O presente Exemplo, provavelmente, supera os obstáculos para a absorção de acetato e formação de etanol durante o crescimento anaeróbico, através do fornecimento de novas vias (veja Figura 3) para a conversão de acetato em etanol que não foi previamente descrita. Estas vias aperfeiçoam significantemente este processo através da introdução de atividades de enzima adicionais através da conversão do acetato em acetil-CoA, assim como da introdução de enzimas heterólogas a partir de outras fontes microbianas para aperfeiçoar nesta primeira conversão. Adicionalmente, a introdução heteróloga de uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional permite a conversão direta de etanol a partir de acetil-CoA com uma enzima única, com a promessa de aumento significante na cinética de formação in vivo.
[00237] A conversão de acetato em etanol, de acordo com este Exemplo, é como segue: 1) Conversão de acetato em acetil-CoA
[00238] O acetato é convertido em levedura em acetil-CoA através de uma acetil-CoA transferase (ACS). A atividade endógena durante a fermentação anaeróbica é provavelmente realizada pela enzima ACS2. Através da transformação da célula hospedeira de levedura com e expressando a afinidade mais alta da enzima ACS1 durante a fermentação ou através do aumento da expressão da enzima ACS2, maior absorção de acetato e atividade podem ser obtidas. Veja Figura 3, (i). A atividade heteróloga também pode ser obtida através da introdução de acetato em acetil-CoA convertendo os genes a partir de outros organismos, tais como E. coli.
[00239] Vias alternadas a partir de acetato em acetil-CoA podem ser obtidas pela expressão do sistema bacteriano típico de fosfotransacetilase (PTA) e acetato quinase (ACK). Veja Figura 3, (ii). Estas duas enzimas podem atuar sequencialmente para produzir acetil-CoA a partir de acetato. Devido à diferença em cofatores entre PTA/ACK e ACS, esta via pode ter atividade mais alta in vivo quando heterologamente expressada. As fontes para PTA e ACK podem ser originadas de uma ampla variedade de fontes bacterianas, incluindo, mas não limitadas a espécies de Escherichia, Thermoanaerobacter, Clostridia e Bacillus. 2) Conversão de acetil-CoA em etanol
[00240] A conversão de acetil-CoA em acetaldeído pela enzima MhpF foi recentemente usada com os problemas presentes debatidos acima. Veja, Figura 3, (iii). Através da substituição desta atividade com uma acetaldeído desidrogenase aperfeiçoada (por exemplo, a partir de C. phytofermentans ou outra fonte) ou uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional (AADH), o cinética in vivo da reação pode ser aumentada, fornecendo crescimento aperfeiçoado da cepa hospedeira. Veja, a Figura 3, (iv). As fontes para a álcool/aldeído desidrogenase bifuncional podem se originar a partir de uma variedade de fontes microbianas, incluindo, mas não limitadas a E. coli, C. acetobutilicum, T. saccharolyticum, C. thermocellum ou C. phytofermentans. 3) Deleção ou alteração de genes de formação de glicerol
[00241] A deleção ou alteração dos genes de formação de glicerol podem realçar a absorção de acetato através das vias enzimáticas mencionadas acima. A deleção de gpd1, gpd2, ou dos dois genes e/ou deleção de gpp1, gpp2, ou dos dois genes pode ser usada para eliminar a formação de glicerol e realçar o rendimento de etanol. Veja, a Figura 3, (v). Entretanto, a eliminação completa de glicerol pode não ser prática para um processo industrial. Veja Guo, ZP., et al., Metab. Eng. 13:49 - 59 (2011). Assim, ao invés da remoção completa de qualquer um, todos ou algumas combinação destes genes de formação de glicerol, um ou mais entre estes genes pode ser alterado ou infrarregulado para reduzir a formação de glicerol e realçar o rendimento de etanol. EXEMPLO 2 Desintoxicação De Acetato Derivado de Biomassa Via Conversão Metabólica Em Acetona, Isopropanol ou Acetato de etila
[00242] Conforme descrito neste relatório, ácido acético é um produto inevitável de pré-tratamento e hidrólise, e muito prejudicial aos organismos de fermentação, especialmente na faixa de pH industrialmente relevante de 4 a 5. A remoção de ácido acético antes da fermentação através de métodos químicos ou físicos é proibitivamente cara ou resulta em perda do rendimento de açúcar (lavagem). Através da construção de uma via para converter ácido acético em acetona, isopropanol ou acetato de etila em organismos produtores de etanol, toxicidade de ácido acético pode ser diminuída e um coproduto facilmente recuperado pode ser produzido. Além disso, a conversão de acetato em um solvente reduzirá a demanda quanto à adição de base, diminuindo o custo global de fermentação e tornando o controle de pH mais controlável e robusto. Tais considerações se tornam especialmente importantes em escala industrial. Além disso, a remoção de acetato diminuirá a quantidade de compostos orgânicos gastos para o tratamento de águas servidas, que também resultará em menores custos de capital e operação para a reciclagem de água.
[00243] Entretanto, muito pouco é conhecido com respeito ao uso da conversão metabólica para desintoxicar acetato a partir da biomassa lignocelulósica. Em um exemplo, ácido acético foi aerobicamente removido do líquido de sulfito gasto na madeira usando uma levedura mutante. Schneider, H., Enz. Micr. Technol. 19:94 - 98 (1996). A levedura mutante, entretanto, não foi capaz de crescer em açúcares, e exigida uma outra cepa para converter anaerobicamente os açúcares hidrolisados em etanol. As vias que podem ser usadas incluem aquelas que apresentaram propósitos diferentes em organismos hospedeiros diferentes, conforme descrito na técnica. Por exemplo, a conversão metabólica de acetato em acetona foi demonstrada em C. acetobutilicum e organismos relacionados (conversores nativos) e em E. coli (construído para incluir a via de acetona). Veja, por exemplo, Bermejo, L.L., et al., Appl. Environ. Microbiol. 64(3):1079 - 85 (1998). A produção de isopropanol a partir de carboidratos também ocorre naturalmente em organismos relacionados a C. acetobutilicum, e a via de carboidrato-isopropanol foi engenheirada em E. coli e levedura. Veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. No 2008/0293125. Acetato de etila é um produto de algumas fermentações de levedura e bacterianas e é um importante composto de realce de flavor. Entretanto, acetato de etila é considerado indesejável em altos níveis durante fermentações de bebida alcoólica e como tal, tentativas foram feitas para modificar sua produção. Estas vias metabólicas não foram usadas para desintoxicar acetato a partir da biomassa lignocelulósica.
[00244] Este Exemplo descreve o novo uso destas vias metabólicas para desintoxicar biomassa lignocelulósica e hidrolisados derivados e a incorporação destas vias em um organismo produtor de etanol. O organismo produtor de etanol pode ser bacteriano ou fúngico, ou pode ser um organismo de bioprocessamento consolidado (CBP) que também produz celulases e outras enzimas hidrolíticas. 2.1 Construção de Vias de Acetato em Acetona em Plataformas Bacterianas e de Levedura
[00245] O ácido acético é difundido livremente na célula durante a hidrólise de polissacarídeos acetilados, onde sua conversão em acetona envolve quatro etapas principais: (i) ativação de acetato extracelular em acetil-CoA, (ii) condensação de acetil-CoA em acetoacetil-CoA, (iii) transferência de CoA resultando em acetil-CoA e acetoacetato, e (iv) descarboxilação de acetoacetato em acetona. Veja as Figuras 4A e 4B. Em levedura, quatro etapas enzimáticas estão envolvidas (duas enzimas são nativas e duas são engenheiradas a partir de uma fonte bacteriana). Veja Figura 4B.
[00246] Em bactérias, a conversão envolve cinco etapas enzimáticas, em que ácido acético é ativado em acetil-CoA através de acetato quinase (ack) (Figura 12 (1)), fosfotransacetilase (pta) (Figura 12 (2)), e um semirreação de CoA transferase (ctfA ctfB) (Figura 12 (4)). Duas moléculas de acetil-CoA depois são convertidas em acetoacetil-CoA através de tiolase (thl) (Figura 12 (3)), acetoacetato através da outra semirreação de CoA transferase (ctfA ctfB) (Figura 12 (4)), e finalmente em acetona e CO2 através de acetoacetato decarboxilase (adc) (Figura 12 (5)). Embora a via sintética compartilhe um intermediário comum com a via de produção de etanol, carboidrato para a produção de etanol permanece altamente ligado, devido à exigência quanto ao geração de NAD(P)+/NAD(P)H de equilíbrio. As hidrogenases (Figura 12 (6)) atuam para desacoplar a regeneração de aceitante de elétrons e formação de etanol, resultando na produção de ácido acético através da via de acetato quinase e fosfotransacetilase reversível. (i) Ativação de acetato extracelular em acetil-CoA
[00247] A primeira etapa no metabolismo de acetato é a conversão de acetato em acetil-CoA. Veja as Figuras 4A e 4B. Em E. coli e levedura isto pode ser realizado via acetil-CoA sintetase (acetato + ATP + CoA ^ acetil-CoA + AMP + PPi). A expressão constitutiva desta enzima pode ser complicado como em E. coli e S. cerevisiae, o funcionamento desta enzima está sujeito aos circuitos reguladores complexos. Veja Wolfe, A.J., Micr. Mol. Biol. Rev. 69:12 - 50 (2005); van den Berg, M.A., et al., J. Biol. Chem. 271:28953 - 28959 (1996), respectivamente. Em E. coli, a ativação de acetato também pode ser realizada via acetato quinase e fosfotransacetilase, como ambas as reações são reversíveis. Em um aspecto, acetil- CoA sintetase é usada. (ii) Condensação de acetil-CoA em acetoacetil-CoA
[00248] Esta etapa pode ocorrer através de enzimas nativas em levedura, por exemplo, Erg10, ou em bactérias, por exemplo, tiolase em bactérias, ou através de genes isolados a partir de C. acetobutilicum ou T. thermosaccharolyticum. (iii) Transferência de CoA
[00249] Esta etapa é específica à reação de acetoacetil-CoA + acetato θ acetoacetato + acetil-CoA e apenas foi caracterizada em organismos similares a C. acetobutilicum. Outras CoA transferases realizam reações similares e podem ser engenheiradas para realizar esta reação. Tais outras CoA transferases incluem, mas não são limitadas àquelas a partir de fontes bacterianas de Thermoanaerobacter tengcongensis, Thermoanaerbacterium thermosaccharolyticum, Thermosipho africanus e Paenibacillus macerans. (iv) Descarboxilação de acetoacetato em acetona
[00250] Esta etapa pode ser realizada pela acetoacetato decarboxilase encontrada em C. acetobutilicum, Paenibacillus macerans, Acidothermus cellulolyticus, Bacillus amyloliquefaciens e Rubrobacter xylanophilus ou outras bactérias. Acetoacetato decarboxilases eucarióticas também podem ser usadas para construir esta via.
[00251] Para usar a via acima, enzimas para metabolizar a conversão de acetato em acetona em T. saccharolyticum e E. coli foram engenheiradas em pMU1299. Veja Figura 5B. O plasmídeo pMU1299 se replica em levedura e E. coli e se integra no genoma de T. saccharolyticum no loco L-ldh. pMU1299 compreende os genes pta e ack de T. saccharolyticum nativos direcionados pelo promotor de pta nativo e genes de tiolase1 de C. acetobutilicum, CoA transferase (ctfAB), e acetoacetato decarboxilase (adc) direcionados pelo promotor de cbp de C. thermocellum. A integração de plasmídeo ou genômica é selecionada quanto à resistência à canamicina em bactérias, e o plasmídeo é mantido na levedura através da complementação de ura3.
[00252] pMU1299 foi transformado em E. coli e a produção de acetona foi determinada. As culturas foram cultivadas a 37 °C em meio LB suplementado com 25 g/L glicose e 4 g/L de acetato de sódio durante 170 horas. Os resultados a partir de pMU1299 em E. coli foram comparados a uma cepa controle que porta plasmídeo pMU433, que tem apenas os genes pta, ack, e kanR. A estequiometria da reação global é mostrada na Figura 5A. Os resultados da fermentação são mostrados na Tabela 3. Comparados ao meio de amostra apenas, os níveis de acetato diminuem, acetona é produzida e um adicional de 3 g/L de glicose é consumido pelas cepas que portam pMU1299. Tabela 3. Fermentação de E. coli de Ácido Acético Em Acetona
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(v) .1 Diminuição da Produção de Ácido Acético Via PTA e ACK Através De Mutações Espontâneas em Hidrogenase
[00253] Conforme debatido acima, a via sintética de ácido acético em acetona compartilha um intermediário comum (acetil-CoA) com a via de produção de etanol. No último, a produção de carboidrato em etanol permanece altamente ligada, devido à exigência para equilibrar a geração de NAD(P)+/NAD(P)H. Hidrogenases (Figura 12 (6)) atuam para desacoplar a regeneração de aceitante de elétrons e formação de etanol, resultando na produção de ácido acético através da via de acetato quinase e fosfotransacetilase reversível. Assim, para aumentar a conversão de ácido acético exógeno em acetona e reduzir a produção intracelular de ácido acético, hidrogenases podem ser manipuladas usando, por exemplo, mutagênese.
[00254] Durante a adaptação de crescimento da cepa etanologênica Δldh, Δpta e Δack M0863, mutações de hidrogenase hfs espontâneas foram introduzidas. A cepa M0863 foi derivada da cepa M0355, uma cepa de T. saccharolyticum engenheirada para ter deleções sem marcadores dos genes de L-lactato desidrogenase ldh, fosfotransacetilase pta e acetato quinase ack, a construção dos quais é descrita em Shaw et al., AEM 77: 2534 - 2536 (2011). Subsequentemente, a cepa M0355 foi tratada com nitrosoguanidina e triada quanto ao crescimento aperfeiçoado em hidrolisado de madeira dura pré-tratado com vapor através de várias rodadas de mutagênese e seleção (Panlabs Biologics, Taipei, Taiwan). Uma população enriquecida quanto ao crescimento em hidrolisado de madeira dura depois foi inoculada em um citostato (Kacmar et al., J. of Biotechnology 126:163 - 172 (2006)) e selecionada quanto à taxa de crescimento aumentada em uma população de cultura celular fixada. Uma cepa isolada a partir da seleção de citostato via plaqueamento em meio sólido contendo ágar foi designada M0863.
[00255] As mutações de hidrogenase hfs foram caracterizadas e são descritas em Shaw et al., J. Bact. 191:6457 - 64 (2009), incorporado integralmente como referência neste relatório, exemplos das quais são mostrados na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Mutações de hidrogenase hfs espontâneas em T. saccharolyticum
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[00256] Estas mutações depois foram reintroduzidas no T. saccharolyticum do tipo selvagem por intermédio de um plasmídeo não replicante com duas regiões de homologia ao cromossomo de T. saccharolyticum flanqueando um marcador de resistência à canamicina (kanR). A região de homologia a montante, contendo mutações em hfsB e hfsD, foi gerada por PCR a partir do DNA cromossômico da cepa M0863 de T. saccharolyticum. A região a jusante também foi gerada por PCR a partir do DNA cromossômico de M0863, mas não apresentou desvios a partir da sequência do tipo selvagem. O plasmídeo foi construído por intermédio de clonagem de homologia à levedura e transformado em T. saccharolyticum após um protocolo de competência natural (Shaw et al., AEM 76:4713 - 4719 (2010)). Os transformantes foram triados quanto à presença do marcador kanR através de PCR de colônia e depois quanto à presença de mutações de hfsB e hfsD através de sequenciamento de DNA. Visto que a incorporação de mutações de hfs é dependente da localização of recombinação homóloga cruzada, foi esperado que uma certa porcentagem dos transformantes kanR apresentaria os locos hfsB e hfsD de M0863, embora outra apresentaria os locos hfsB e hfsD do tipo selvagem. Uma cepa com o loco de M0863 foi identificada e designada M2204, e uma cepa com o loco do tipo selvagem foi identificada e designada M2205.
[00257] M2204, M2205, e as cepas do tipo selvagem foram incubadas em 10 mL de meio TSC7 inicialmente contendo celobiose 30,4 mM a 55 °C sob uma atmosfera de nitrogênio a 95% e dióxido de carbono a 5% em tubos tampados com butila anaeróbicos. O inóculo foi de 5% v/v a partir de uma cultura durante a noite, e os frascos foram incubados durante 48 horas sem agitação. Ácido láctico, ácido acético e etanol dos metabólitos foram medidos por intermédio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) e um detector de índice refrativo. Conforme mostrado na Tabela 5 abaixo, a cepa M2204, contendo a sequência de hfs de M0863, foi dramaticamente reduzida em ácido acético em comparação às cepas WT e M2205. Os resultados são a média de quatro fermentações em frasco individual. Tabela 5. Mutações em hidrogenase hfs diminuem a produção de ácido acético.
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(vi) 2 Produção de Acetona em T. saccharolyticum
[00258] Para usar a via acima para produzir acetona em T. saccharolyticum, vários genes foram triados em uma cepa de T. saccharolyticum engenheirada para metabolizar a conversão de acetato em acetona.
[00259] Os plasmídeos foram gerados via clonagem de homologia à levedura, conforme descrito por Shanks et al., AEM 72:5027 - 5036 (2006). Os genes de interesse para a via de produção de acetona foram introduzidos a jusante de uma cópia recombinante dos genes de pta e ack de T. saccharolyticum e seu promotor nativo, que criaram um operon do gene sintético para a transcrição dos genes da via de acetona. Além da transcrição que ocorre a partir do promotor de pta, os genes de interesse foram clonados com seu promotor nativo e sequências a montante de Shine-Delgarno, ou seu promotor de cbp e sequência de Shine- Delgarno a partir de C. thermocellum (Genbank HQ157351) ou seu promotor de adhE e sequência de Shine-Delgarno a partir de T. saccharolyticum (Genbank EU313774). Em alguns casos, a transcrição foi confirmada em cepas engenheiradas via PCR em tempo real da transcriptase reversa. Os plasmídeos foram designados para replicar, usando uma origem gram positiva de replicação, veja WO/2010/075529, integralmente incorporado como referência neste relatório, ou para integrar no cromossomo de T. saccharolyticum no loco ldh usando as mesmas regiões de homologia flanqueando ldh, conforme descrito em Shaw et al., AEM 77: 2534 - 2536 (2011), integralmente incorporado como referência neste relatório.
[00260] Os plasmídeos foram transformados em T. saccharolyticum após um protocolo de competência natural (Shaw et al., AEM 76:4713 - 4719 (2010)) e selecionados quanto à resistência ao antibiótico canamicina ou eritromicina (Shaw et al., J. Bact. 191:6457 - 64 (2009)). Transformantes resistentes ao antibiótico foram triados via PCR de colônia ou miniprep de plasmídeos para integração cromossômica apropriada ou manutenção do plasmídeo replicante, respectivamente.
[00261] Acetona foi detectada por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) e um índice refrativo e detector de UV260nm operando em série para distinguir acetona do etanol de quase eluição. Alternativamente, acetona foi detectada diretamente nas culturas de fermentação por intermédio do teste de Rothera, em que 5 mL do meio de fermentação foram saturados com sulfato de amônio (NH4)2SO4, seguido por adição de 50 mg de nitroprusside de sódio e através de mistura. 1 mL de NH4OH 18 M depois foi adicionado como uma camada superior, e acetona foi detectada por intermédio da geração de uma formação de banda vermelha a púrpura dentro de 2 min a 1 hora na interface do meio de fermentação e NH4OH 18 M. Os resultados da triagem são mostrados na Tabela 6 abaixo. Tabela 6. Triagem quanto a genes envolvidos na produção de acetona
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[00262] O plasmídeo pMU2627 (Figura 13; SEQ ID NO: 1), contendo T. saccharolyticum pta e ack codificando fosfotransferase e acetato quinase, T. melanesiensis ctfA e ctfB codificando acetato CoA transferase, T. thermosaccharolyticum thl codificando tiolase, e B. amyloliquefaciens adc codificando acetoacetato decarboxilase, foi integrado no cromossomo da cepa M1442 de T. saccharolyticum, (uma cepa etanologênica contendo as mutações espontâneas derivadas de M0863 em hidrogenase). Lee et al., Biomass and Bioenergy 35:626 - 636 (2011). pMU2627 foi gerado via clonagem de homologia à levedura, conforme descrito por Shanks et al. AEM 72:5027 - 5036 (2006) a partir do plasmídeo pMU433, que apresentou as regiões de homologia alvejando ldh, de T. saccharolyticum pta e ack, do gene resistente ao antibiótico kanR, da origem de p15A E. coli de replicação, da origem S. cerevisiae CEN/ARS de replicação e do gene S. cerevisiae ura3. Os primers X12406, X12407, X12408, X12409, X13293 e X13294 foram usados para amplificar os alvos de gene especificados e criar as caudas 5’ de homologia para a ligação da levedura em pMU433 digerido por restrição de SnaB1. Veja, a Tabela 7 abaixo. Tabela 7. Primers usados na construção de pMU2726 e pMU2741
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[00263] M2212 foi inoculada (em OD600 = 0,36) em meio TSC7 (Tabela 8) e fermentada a 51 °C em uma batelada alimentada de lavado enriquecido com hemicelulose não tratado a 34% v/v contendo xilano acetilado em uma concentração de 147 g/L de carboidratos. O pH foi mantido a 5,8 usando hidróxido de potássio 5 M. Os carboidratos totais alimentados foram de 50 g/L. A fermentação da batelada foi alimentada a 20% v/v da batelada durante as primeiras 26 horas e depois aumentada a 3% v/v por dia em uma concentração final de 34% em 140 horas. Os resultados da fermentação, medição de xilose, etanol, acetato, e acetona, são mostrados na Figura 14. Tabela 8. Meio TSC7
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[00264] Uma comparação da produção de acetona da cepa M2212 engenheirada e da cepa etanologênica M1442 precursora foi realizada em 100 g/L de maltodextrina e 10 g/L de ácido acético. As cepas foram cultivadas em frascos de pressão contendo meio TSC7 com 4 g/L (NH4)2SO4 e sem um controle de pH. Conforme mostrado na Figura 15, M2212 apresentou maior consumo de maltodextrina (relatado como unidades de glicose) e produção de etanol em comparação à cepa parental. M2212 converteu o ácido acético no meio em acetona, conforme mostrado na Figura 16, e também manteve um pH na faixa de 5,6 a 5,9 (Figura 17). A cepa etanologênica precursora, entretanto, não produziu acetona detectável (Figura 16) e o excesso de ácido acético no meio causou uma queda no pH durante o curso da fermentação (Figura 17). Assim, este Exemplo mostra que uma cepa de T. saccharolyticum engenheirada para converter acetato em acetona, também produz um rendimento de etanol aumentado e evita uma diminuição no pH causada por excesso de ácido acético no meio de fermentação. Os dados mostrados nas Figuras 15 a 17 são a partir de fermentações replicadas, com desvios padrão de <1 g/L. 2.2 Construção de Levedura para Metabolizar Ácido Acético Em Isopropanol Anaerobicamente
[00265] Esta via metabólica é engenheirada fora da via de acetato em acetona usando uma etapa final adicional para converter acetona em isopropanol, como segue: 2.3 acetato +2 CoA + 2 ATP ^ 2 acetil-CoA 2 acetilCoA ^ acetoacetil-CoA +CoA acetoacetil-CoA ^ acetoacetato acetoacetato ^ acetona + CO2 acetona +NADH ^ isopropanol
[00266] A introdução destas reações em levedura não apenas eliminará a necessidade de controle de pH (quando ureia é usada como fonte de nitrogênio), mas, provavelmente, também acentuará o rendimento de álcool. Os equivalentes de redução que são formados em excesso durante a formação de biomassa podem ser usados para reduzir acetona, e a formação de glicerol (a partir de açúcar) já não é necessária. A exigência quanto a ATP não é problema, visto que a quantidade é relativamente pequena em comparação à quantidade total formada. Mesmo esta pequena quantidade de ATP para a síntese de isopropanol será benéfica, visto que ela exige produção extra de álcool no custo da formação de biomassa. Adições de acetona às culturas de levedura anaeróbicas mostraram que a acetona diminui com o aparecimento de isopropanol. Até hoje, 200 mg/L de isopropanol foram produzidos desta maneira. Isto ilustra a atividade endógena da atividade de acetona em isopropanol in vivo na levedura. Uma diminuição concomitante na formação de glicerol é observada, sugerindo que o NADH exigido nesta etapa pode reduzir os equivalentes de redução tipicamente produzidos durante a formação de glicerol. 2.3 Construção de T. saccharolyticum para metabolizar Ácido Acético Em Isopropanol
[00267] Esta via metabólica engenheirada fora da via de acetato em acetona para produzir isopropanol. Veja, a Figura 18. A via sintética de acetona descrita acima foi modificada das seguintes formas: adição de uma álcool desidrogenase secundária (adhB) a partir de T. ethanolicus, deleção de pta e ack e integração alvejada da via sintética no loco adhE nativo de T. saccharolyticum, que elimina a formação de etanol. Com estas modificações, a estequiometria seguinte foi prognosticada, com um ΔG0 = -188 kJ/rxn ao pH 7: Glicose + 2 Acetato ^ 2 Isopropanol + 4 CO2 + 2 H2.
[00268] O plasmídeo pMU2741 (Figura 19; SEQ ID NO: 2) foi construído via clonagem de homologia à levedura, conforme descrito por Shanks et al., AEM 72:5027 - 5036 (2006) com os primers X12406, X12407, X12408, X12409, X13293, X13294, X12411, e X12412. Veja a Tabela 7. Ele contém os genes ctfA e ctfB de T. melanesiensis que codificam acetato CoA transferase, o gene thl de T. thermosaccharolyticum que codifica tiolase, o gene adc de B. amyloliquefaciens que codifica acetoacetato decarboxilase e o gene adhB de T. ethanolicus que codifica a álcool desidrogenase secundária (Acesso GenBank No TEU49975). Ele foi transformado na cepa M0355, uma cepa Δldh Δpta Δack descrita em Shaw et al., AEM 77: 2534 - 2536 (2011), com um gene de hidrogenase do tipo selvagem que não apresenta mutações espontâneas. Os transformantes foram triados quanto ao seu perfil de fermentação através de crescimento anaeróbico em meio TSC7 a 55 °C durante 72 horas sem agitação. Vários transformantes seguiram a estequiometria prognosticada, um exemplo dos quais (cepa 4A) é mostrado abaixo na Tabela 9. Tabela 9. Produção de isopropanol em uma cepa de T. saccharolyticum engenheirada
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2.4 Construção de Levedura e Bactérias para converter Acetato e Etanol em Acetato de Etila
[00269] Cada etapa desta via metabólica pode proceder, como segue: acetato + CoA + ATP = acetil-CoA + AMP + H2O acetil-CoA + etanol = acetato de etila + CoA
[00270] Com a reação global procedendo: acetato + etanol + ATP θ acetato de etila + H2O + AMP.
[00271] Acetato e etanol podem ser formados durante a hidrólise e fermentação e as enzimas necessárias para esta via incluem ativação de acetato em acetil-CoA (veja acetona seção 1 acima), e uma álcool acetiltransferase para converter acetil-CoA e etanol em acetato de etila. A levedura contêm acetil-CoA sintetases nativas e uma álcool acetiltransferase nativa (ATF1), que, quando superexpressada foi mostrada reduzir os níveis de acetato de 0,5 g/L para 0,2 g/L durante uma fermentação alcoólica. Lilly, et al., Appl. Environ. Microbiol. 66:744 - 53 (2000). EXEMPLO 3 Construção de Cepas de Levedura com Tolerância Aperfeiçoada Em Acetato e Outros Subprodutos de CBP
[00272] Conforme descrito neste relatório, uma grande porção de energia celular deve ser gasta para evitar os efeitos nocivos do ácido acético durante a conversão de materiais lignocelulósicos em etanol. Por causa destes efeitos, o crescimento celular e outros fenótipos importantes são diminuídos, resultando em um processo subideal. Subprodutos ácidos adicionais e outros subprodutos orgânicos, incluindo aldeídos, também podem ser adicionados ao processamento subideal de materiais lignocelulósicos.
[00273] A presente invenção descreve várias vias engenheiradas para superar os efeitos inibitórios de inibidores de biomassa, incluindo, mas não limitadas a, acetato e outros subprodutos de CBP, através da conversão do acetato em um composto menos inibitório, tal como aquele descrito neste relatório. Para aperfeiçoar a capacidade de as cepas de levedura crescerem na presença de um inibidor de biomassa, as cepas de levedura foram engenheiradas, as quais têm tolerância de crescimento aumentada aos inibidores de biomassa. 1) Adaptação das Cepas de Levedura Ao Acetato e Outros Subprodutos em Material Bruto Celulósico Pré-tratado
[00274] M1254 é uma cepa de levedura previamente isolada com base em alta tolerância ao hidrolisado. Veja o Pedido Internacional No PCT/US2009/065571, os conteúdos do qual são incorporados como referência neste relatório. A utilização de xilose aumentada na presença de inibidores é crítica para o desempenho quanto à plataforma de levedura. M1254 foi, portanto, desenvolvida no citostato usando um meio de alimentação contendo 2 g/L de extrato de levedura, 2 g/L de peptona, 2 g/L de xilose, e 8 g/L de acetato ao pH 5,4 e a 39,8 °C. Depois de aproximadamente 10 dias de cultivo contínuo no citostato, uma amostra foi tomada e M1339 foi isolada como uma colônia única a partir da população heterogênea. M1339 foi selecionada com base nos ensaios de crescimento descritos abaixo.
[00275] M1339 depois foi ainda adaptada no citostato em meio contendo 5 g/L de xilose, 10 ácidos com base em hidrolisado (1 g/L de láctico, 8 g/L de acético, 30 mg/L de 2-furoico, 2,5 mg/L de 3,4-di-hidroxibenzoico, 2,5 mg/L de 3,5-di- hidroxibenzoico, 5 mg/L de vanílico, 2,5 mg/L de homovanílico, 15 mg/L de siríngico, 17,5 mg/L de gálico e 15 mg/L de ferúlico) e cinco aldeídos (175 mg/L de 5- hidroximetilfurfural, 150 mg/L de furfural, 6 mg/L de 3,4-hidroxibenzaldeído, 12 mg/L de vanilina e 27 mg/L de siringaldeído) ao pH 5,4 e 40 °C. Esta adaptação levou ao isolamento de M1360, M1361 e M1362.
[00276] M1360 depois foi ainda adaptada em um quimiostato contendo 0,1 g/L de glicose, 5 g/L de xilose, 0,4 g/L de furfural e 0,4 g/L de 5-hidroximetilfurfural. Depois da seleção, M1499 foi isolada. M1499 depois foi adaptada em correntes separadas, como segue.
[00277] Uma corrente de adaptação iniciou com uma seleção de quimiostato com base em meio contendo 10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de xilose, suplementado com inibidores solúveis removidos da madeira dura mista pré-tratada a 35 °C. Esta seleção de quimiostato resultou na identificação da cepa M1646. M1646 foi subsequentemente adaptada em um quimiostato novamente a inibidores solúveis obtendo água por enxágue através da madeira dura mista pré- tratada, incluindo acetato, e suplementada somente com 6,7 g/L de levedura nitrogênio base sem aminoácidos a 35 °C. Depois da seleção, M1715 foi isolada. M1715 depois foi adaptada em 5 g/L de xilose e 6,7 g/L de levedura nitrogênio base a 40 °C no citostato, de modo a garantir forte termotolerância, e a cepa resultante foi M1760. Partindo de M1646, uma estratégia de seleção adicional foi implementada envolvendo iniciar com 10 g/L de M1646 e realizar fermentações de batelada repetidas de líquido de lavagem a partir da madeira dura pré-tratada, que inclui acetato, com a transferência de todas as células a partir de uma fermentação da batelada até a próxima. Depois de uma série de transferências, M1819 foi isolada a partir destas fermentações.
[00278] Partindo de M1499 novamente, M1499 foi adaptada em um quimiostato com 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de peptona, 5 g/L de xilose e 8 g/L de acetato em um pH de alimentação de 5,4 e 35 °C. Portanto, acetato foi o único inibidor nesta seleção e se torna mais inibitório, visto que o pH no quimiostato foi menor do que no meio de alimentação. Depois de semanas de seleção, M1577 foi isolada. M1577 depois foi adaptada em um quimiostato contendo 6,7 g/L de levedura nitrogênio base sem aminoácidos e 20 g/L de xilose com inibidores solúveis suplementados a partir de madeira dura pré-tratada, que inclui acetato. A cepa resultante a partir desta seleção é M1818.
[00279] A cepa M1818 foi ainda adaptada em cultura de batelada em série usando líquido de lavagem a partir da madeira dura pré-tratada, que inclui acetato e outros inibidores derivados de biomassa. As adaptações foram realizadas a 39 °C, pH 6,5, com 6,7 g/L de levedura nitrogênio base sem aminoácidos como o meio. Depois da adaptação, as colônias derivadas do plaqueamento do meio de crescimento foram triadas quanto ao seu desempenho no meio contendo líquido de lavagem, e a cepa M1927 foi identificada como o desempenho excepcional. M1927 foi adaptada ao lavado gerado a partir de madeira dura mista pré-tratada a 38 °C. O lavado foi suplementado com 5 g/L de xilose, 6,7 g/L de levedura nitrogênio base sem aminoácidos e ergosterol/Tween 80 em concentrações padrão e ajustado ao pH 5,5 usando hidróxido de cálcio. Durante as primeiras 100 h, o meio de alimentação de quimiostato foi lentamente aumentado na concentração do lavado. Em última análise, o meio de alimentação atingiu 33% de lavado e a taxa de crescimento foi de 0,076 h-1. Veja, a Figura 28. As amostras foram regularmente tomadas a partir do quimiostato e desempenho rastreado por HPLC e medição de pH offline. Nenhum controle de pH foi implementado e o pH do efluente foi de aproximadamente 5,2 por toda a adaptação. No total, a adaptação durou quase 900 horas e 97 gerações. Uma amostra foi tomada em aproximadamente 450 h e plaqueada quanto a colônias únicas. A partir das colônias únicas, quase todas as colônias foram aperfeiçoadas com respeito a M1927. Seis colônias foram triadas no total em duplicata, e 11 entre as 12 triagens resultaram em títulos de etanol mais altos e xilose residual menor em relação às fermentações com M1927. Todas as fermentações são inoculadas com aproximadamente 0,03 g/L de DCW e, assim, fermentação significante apenas ocorre em combinação com crescimento substancial no lavado. As colônias triadas a partir da adaptação mostraram maiores taxas e títulos fermentação em relação à M1927. M2108 emergiu como a colônia de alto desempenho. 2) Análise das Cepas de Levedura com Perfis de Crescimento e Desempenho Aperfeiçoados
[00280] Para avaliar a adaptação das cepas de levedura aos inibidores em material bruto celulósico pré-tratado, ensaios de crescimento foram realizados. As cepas de levedura foram cultivadas em xilose na presença de acetato ou na presença de acetato, nove outros ácidos com base em hidrolisado, e cinco aldeídos (veja acima). Ensaios de crescimento envolveram inocular placas de 96 poços e cultivo em temperaturas especificadas com agitação em um leitor de placas BioTek Synergy 2. A densidade óptica inicial (OD) para todas as cepas testadas foi padronizado à mesma OD, tipicamente na OD = 0,03, com um mínimo de 3 medições replicadas por cepa. A OD foi medida a cada 15 minutos em uma absorvância de 600 nm. A taxa de crescimento específica foi calculada usando a técnica padrão para determinar o coeficiente de uma linha com melhor ajuste para um lote semilog de densidade óptica com o passar do tempo. Todos os ensaios de crescimento que seguem usado este método para determinar a taxa de crescimento específica foram usados para identificar cepas mais tolerantes.
[00281] As cepas de levedura M1339 e M1254 foram cultivadas em xilose ao pH 5,4 e 39 °C durante 48 horas na presença de acetato (8 g/L). A taxa de crescimento, conforme medida a uma absorvância de 600 nm, foi monitorada a cada 15 minutos durante o período de incubação. Conforme mostrado na Figura 6, a cepa de levedura M1339 apresentou tolerância aperfeiçoada e cresceu mais rapidamente na presença de acetato em comparação à cepa de levedura M1254. A taxa de crescimento de M1339 nesta condição é aumentada 3 vezes sobre a taxa de crescimento de M1254 neste meio complexo contendo 2 g/L de extrato de levedura, 2 g/L de peptona, 2 g/L de xilose e 8 g/L de acetato ao pH 5,4.
[00282] As cepas de levedura M1360, M1361, M1362, M1254 e M1339 foram cultivadas em xilose ao pH 5,4 e 40 °C durante 48 horas na presença de acetato, nove outros ácidos com base em hidrolisado, e cinco aldeídos (veja acima). A taxa de crescimento específica, conforme medida a uma densidade óptica de 600 nm usando um leitor de placas BioTek Synergy 2, foi calculada a partir do coeficiente de uma linha ajustada a um lote de semilog de densidade óptica com o passar do tempo. Conforme mostrado na Figura 7, as cepas de levedura M1360, M1361, e M1362 apresentaram uma tolerância aperfeiçoada ao crescimento na presença de acetato e outros inibidores em comparação às cepas de levedura M1254 e M1339. A taxa de crescimento específica aumentou dramaticamente neste meio tóxico para M1360, M1361, e M1362, representando um aumento de 16 vezes na taxa de crescimento para M1360 em comparação a M1254, que cresce lentamente neste meio. A taxa de crescimento específica das cepas de levedura M0509, M1577 e M1715 em xilose ou xilose e inibidores 5-hidroximetilfurfural (0,4 g/L) e furfural (0,4 g/L) também foi medida. Conforme mostrado na Figura 10, as cepas M1577 e M1715 apresentaram taxas de crescimento aumentadas em comparação a cepa prévia M0509.
[00283] Para avaliar o desempenho de cepas de levedura aperfeiçoadas em condições de processo, a utilização de glicose, produção de etanol e rendimento de biomassa foram medidos. A cepa de levedura M1360 foi inoculada (60 mg/L) em um meio contendo 150 g/L de glicose, 3 g/L de líquido da maceração do milho, 1,23 g/L de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1,1 ou 2,2 g/L de fosfato de diamônio (DAP), suplementado com metais traço (0,1 mg/L de iodeto de potássio, 1 mg/L de ácido bórico, 3 mg/L de sulfato de ferro hepta-hidratado, 4,5 mg/L de cloreto de cálcio desidratado, 0,4 mg/L de dissódio molibdênio di-hidratado, 0,3 mg/L de sulfato de cobre (II) penta-hidratado, 0,3 mg/L de cloreto de cobalto(II) hexa-hidratado, 0,84 mg/L de cloreto de manganês di-hidratado, 4,5 mg/L de sulfato de zinco hepta- hidratado, 15 mg/L de etildiaminotetra-acetato) e vitaminas (0,05 mg/L de biotina, 1 mg/L de pantotenato de cálcio, 1 mg/L de ácido nicotínico, 25 mg/L de mio-inositol, 1 mg/L de cloridreto de tiamina, 1 mg/L de cloridreto de piridoxol e 0,2 mg/L de ácido para-aminobenzoico) e cultivada a 40 °C ao pH 5,0. A utilização de glicose (g/L) e produção de etanol (g/L) foram medidos durante um período de tempo de 72 horas. Conforme mostrado na Figura 8, utilização de glicose foi rápida na presença ou ausência de 2 x DAP e a produção de etanol foi alta.
[00284] O desempenho aperfeiçoado das cepas de levedura M1360, M1443 e M1577 nas condições de processo também foi medido usando um ensaio com prensado. Brevemente, o ensaio com prensado primeiro exige a remoção de líquido a partir de substrato pré-tratado através da aplicação de pressão a uma batelada de substrato sólido em uma prensa hidráulica. O líquido comprimido a partir dos sólidos é definido como prensado, e o prensado contém a concentração de inibidores solúveis presentes no substrato. Por exemplo, se o substrato apresentou 50% de teor de umidade e 50% de teor de sólido antes da prensa, o prensado criado é definido como 50% de equivalentes sólidos. Portanto, um prensado de 25% de equivalentes sólidos teria um meio em que metade do líquido foi prensado. Tipicamente, uma cepa é inoculada a 0,1 g/L de peso celular seco com 6,7 g/L de levedura nitrogênio base sem aminoácidos e 20 g/L de açúcar (glicose ou xilose) ao pH 5,0 em um frasco anaeróbico vedado. As cepas depois são incubadas durante 24 horas antes que as concentrações terminais de peso celular seco, açúcar e etanol sejam medidas. Assim, o rendimento de biomassa anaeróbica pode ser determinado com base em açúcar consumido; o rendimento de biomassa anaeróbica teórico é de 0,1 g de biomassa/g de açúcar consumido.
[00285] O rendimento de biomassa anaeróbica em 20 g/L de glicose das cepas M1360, M1443 e M1577 em prensados de 5%, 7%, e 9% de equivalentes sólidos foi medido. M1443 é um derivado de CBP de M1360, que foi construído para expressar beta-glucosidase de Saccharomycopsis fibuligera, celobio-hidrolase I de T. emersonii e celobio-hidrolase II de Chrysosporium lucknowense. A Figura 9 mostra os resultados de cada cepa nos vários prensados de equivalentes sólidos. As cepas M1360 e M1443 forneceram rendimentos de biomassa teóricos similares em prensados de 5% e 7% de equivalentes sólidos; entretanto, nos prensados de 9% de equivalentes sólidos, a cepa M1360 apresentou um rendimento de biomassa teórico cerca de 3 vezes menor em comparação à M1443. Veja, a Figura 9. Por comparação, a cepa M1577 forneceu pelo menos cerca de um rendimento de biomassa teórico 3 vezes maior em relação às cepas M1360 ou M1443 em prensados de 5%, 7%, ou 9% de equivalentes sólidos. Veja, a Figura 9. As cepas M1760, M1818 e M1819 também foram avaliadas usando um ensaio com prensado em prensados de 13%, 15%, e 17% de equivalentes sólidos usando 20 g/L de xilose como a fonte de carbono. Veja, a Figura 11A (rendimento de biomassa (g/g)) e 11B (produção de etanol (g/L)). Assim, as cepas adaptadas demonstram altos rendimentos de biomassa anaeróbica e desempenho aperfeiçoado nas condições de processo, quando a mistura de inibidor é comprimida fora dos sólidos usados no processo.
[00286] A cepa M1818 foi comparada diretamente contra M1927 durante a fermentação da batelada do líquido de lavagem a partir de madeira dura pré-tratada. Além disso, M1927 foi comparada diretamente contra M2108 em uma configuração experimental similar depois que esta nova cepa foi derivada. As Figuras 29 e 30 mostram a comparação do desempenho da cepa nestas condições. Quando um líquido de lavagem concentrado (via evaporação do lavado) foi fermentado a 20% do volume de fermentação final ao pH 6, 35 °C com meio de levedura nitrogênio base (6,7 g/L), M1927 claramente apresentou u melhor desempenho em relação à cepa parental M1818, criando >30% mais etanol em 72 horas. Figura 29. Quando M2108 foi comparada à M1927 em uma maneira similar, exceto com condições mais severas (25% v/v de fermentação de lavado, pH 5,5, 38 °C) >30% de aumento no título de etanol foi observado. Figura 30.
[00287] Além destes testes, M2108 foi comparada à M1927 quanto a sua capacidade de tolerar concentrações mais altas de lavado. Veja, a Figura 31. Nestes testes, uma MS928 líquida tóxica foi usada em concentrações v/v diferentes a partir de 20% a 60% com extrato de levedura (10 g/L) e meio de peptona (20 g/L) presentes. As fermentações foram realizadas a 35 °C. Nas concentrações de lavado maiores do que 30%, M2108 apresentou desempenho significantemente melhor em relação à M1927, produzindo um aumento de 40% no título de etanol em 40% v/v do lavado, e um aumento de 4,5 vezes no título em 60% v/v do lavado, onde M1927 cresceu apenas minimamente. Figura 31.
[00288] Finalmente, a Figura 32 demonstra o impacto positivo que a adaptação contra o líquido de lavagem apresentou no processo de SSF para converter os sólidos celulósicos insolúveis a partir do processo de pré-tratamento. Neste relatório, M1927 e M2108 foram comparadas quanto ao seu desempenho a 35 °C e 38 °C durante uma batelada alimentada, 22% de sólidos (finais) de SSF de substrato pré-tratado com MS887 (sólidos, material contendo glucano) em pH e temperatura controlados, biorreatores agitados (reações de 1 L). As fermentações foram conduzidas a 35 °C e 38 °C, pH 5,0, usando 12 g/L de líquido da maceração do milho e 0,5 g/L de DAP (fosfato de diamônio) como componentes do meio e carregando 2 mg de enzima TS celulase por g de sólidos no reator. O substrato pré- tratado com MS887 foi alimentado durante 48 h, e hidróxido de amônio foi usado para o controle de pH. Ambas as cepas apresentaram desempenho satisfatório na temperatura menor fermentando todo o açúcar que foi liberado no etanol. Figura 32. A 38 °C, M2108 foi capaz de fermentar todo o açúcar em etanol e demonstrou um rendimento aumentado, devido à temperatura de hidrólise mais alta. M1927 não foi capaz de fermentar na temperatura mais alta e o açúcar começou a se acumular entre 48 e 96 horas. Figura 32. Estes ajustes de dados indicam que o processo de adaptação aperfeiçoou significantemente o desempenho destes fundos de cepa para converter materiais derivados lignocelulósicos em etanol. EXEMPLO 4 Cepas de Levedura Engenheiradas para a Produção de Etanol
[00289] O presente exemplo descreve a construção de cepas de levedura recombinantes que convertem ácido acético em etanol e a análise de tais cepas em condições de processo industrial. 4.1 Construção da cepa Δura3, M1901
[00290] A cepa de fundo de partida para as cepas de levedura recombinantes foi uma cepa Δura3 auxotrófica, M1901, derivada de M139, que é um etanologênico de alto desempenho a partir da indústria de destilaria (Anchor Yeast, Cape Town, África do Sul). Veja, por exemplo, Borneman, et al., FEMS Yeast Res. 8(7)1185 - 95 (2008). O gene URA3 foi suprimido através da transformação de um fragmento de PCR (usando os primers X11276 e X11279, veja a Tabela 10 abaixo) contendo apenas as sequências reguladoras a montante e a jusante sem as sequências codificantes (SEQ ID NO: 81). Os transformantes resultantes foram plaqueados em 5-FOA, um fármaco comumente usado na genética de levedura para selecionar contra o gene URA3. As colônias foram selecionadas a partir de placas de 5-FOA e a deleção foi confirmada por PCR de colônia. Tabela 10. Primers usados para a construção das cepas de levedura
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Tabela 11. Cepas e Plasmídeos usados neste Exemplo.
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4.2 Construção de uma cepa Δura3Δgpd1Δgpd2, M1991.
[00291] Os genes gpd1 e gpd2 foram suprimidos através de transformação de M1901 com fragmentos de PCR correspondentes à região 5’ a montante, cassete de resistência G418, cassete de resistência Clonat (dois marcadores de antibiótico são usados para deletar cópias de gene a partir de cepas diploides), cassete URA3 de K. lactis (para seleção negativa), e regiões 3’ a jusante de cada loco. A região de gpd1 5’ foi gerada usando os primers X11824 e X11825, região de gpd1 3’ usando os primers X11828 e X11829, marcadores de antibiótico foram amplificado usando X11826 e X11656, gene ura3 de K. lactis usando X11657 e X11827, região de gpd2 5’usando X11816 e X11817 e região de gpd2 3’ usando X11819 e X11821. Veja a Tabela 10 acima. Os transformantes foram selecionados em placas duplas de antibiótico. Os marcadores foram removidos através de transformação com flancos de PCR para as regiões a montante e a jusante e depois selecionados em FOA para a remoção do gene ura3 de K. lactis. As colônias foram triadas por PCR quanto às deleções apropriadas em cada loco. As sequências dos locos suprimidos gpd1 e gpd2 são mostradas abaixo.
[00292] Sequência de deleção GPD1 (SEQ ID NO: 82; uma pequena parte da sequência codificante não foi suprimida, representada em negrito abaixo; deleção representada por Δ entre g542 e t543): tacaaacgcaacacgaaagaacaaaaaaagaagaaaacagaaggccaagacagggtcaatgaga ctgttgtcctcctactgtccctatgtctctggccgatcacgcgccattgtccctcagaaacaaatcaaacacccacaccc cgggcacccaaagtccccacccacaccaccaatacgtaaacggggcgccccctgcaggccctcctgcgcgcggc ctcccgccttgcttctctccccttccttttctttttccagttttccctattttgtccctttttccgcacaacaagtatcagaatgggttc atcaaatctatccaacctaattcgcacgtagactggcttggtattggcagtttcgtagttatatatatactaccatgagtgaa actgttacgttaccttaaattctttctccctttaattttcttttatcttactctcctacataagacatcaagaaacaattgtatattgt acaccccccccctccacaaacacaaatattgataatataaagatgtctgctgctgctgatagΔtctacatgaagat tagatttattggagaaagataacatatcatactttcccccacttttttcgaggctcttctatatcatattcataaattagcattat gtcatttctcataactactttatcacgttagaaattacttattattattaaattaatacaaaatttagtaaccaaataaatataa ataaatatgtatatttaaattttaaaaaaaaaatcctatagagcaaaaggattttccattataatattagctgtacacctcttc cgcattttttgagggtggttacaacaccactcattcagaggctgtcggcacagttgcttctagcatctggcgtccgtatgta tgggtgtattttaaataataaacaaagtgccacaccttcaccaattatgtctttaagaaatggacaagttccaaagagctt gcccaaggctcgacaaggatgtactttggaatatctatattcaagtacgtggcgcgcatatgtttgagtgtgcacacaat aaaggtt
[00293] Sequência de deleção de GPD2 (SEQ ID NO: 83; sequência codificante total foi suprimida; deleção representada por Δ entre c485 e c486): atagccatcatgcaagcgtgtatcttctaagattcagtcatcatcattaccgagtttgttttccttcacatgatga agaaggtttgagtatgctcgaaacaataagacgacgatggctctgccattgttatattacgcttttgcggcgaggtgccg atgggttgctgaggggaagagtgtttagcttacggacctattgccattgttattccgattaatctattgttcagcagctcttctc taccctgtcattctagtattttttttttttttttttggttttacttttttttcttcttgcctttttttcttgttactttttttctagttttttttccttccacta agctttttccttgatttatccttgggttcttctttctactcctttagattttttttttatatattaatttttaagtttatgtattttggtagattca attctctttccctttccttttccttcgctccccttccttatcΔctctgatctttcctgttgcctctttttcccccaaccaatttatcattat acacaagttctacaactactactagtaacattactacagttattataattttctattctctttttctttaagaatctatcattaacgt taatttctatatatacataactaccattatacacgctattatcgtttacatatcacatcaccgttaatgaaagatacgacacc ctgtacactaacacaattaaataatcgccataaccttttctgttatctatagcccttaaagctgtttcttcgagctttttcactgc agtaattctccacatgggcccagccactgagataagagcgctatgttagtcactactgacggctctccagtcatttatgtg attttttagtgactcatgtcgcatttggcccgtttttttccgctgtcgcaacctatttccattaacggtgccgtatggaagagtc atttaaaggcaggagagagagattactcatcttcattggatcagattgatgactgcgtacggcagat 4.3 Construção de uma cepa Δgpd1Δgpd2, M2032.
[00294] A cepa M1991 foi transformada com um produto de PCR que amplifica o gene ura3 do tipo selvagem (primers X10876 e X10877; veja a Tabela 10 acima). As cepas foram selecionadas em uracila menos o meio e triadas por PCR para confirmar a reintrodução do gene ura3 do tipo selvagem. 4.4 Análise de acetaldeído desidrogenases e acetaldeído/álcool desidrogenases bifuncionais.
[00295] O teste de várias acetaldeído desidrogenases (ADHs) e acetaldeído/álcool desidrogenases bifuncionais (AADHs) foi realizado usando um plasmídeo de seleção de ura3 superexpressando os genes alvo. Os genes foram amplificados a partir do DNA genômico (E. coli, C. phytofermentans, T. saccharolyticum, Bifidobacterium adolescentis) ou a partir de genes sintetizados otimizados no códon (Piromyces SP E2 e Chlamydomonas reinhardtii). Os plamídeos foram transformados em M1991 usando técnicas padrão e selecionados em uracila menos o meio. Um ensaio de triagem in vivo foi desenvolvido usando meio YNB mínimo tamponado com acetato a cerca do pH 5,0. Este pH é quase a pKa do ácido acético e permite transporte suficiente de ácido acético na célula para a conversão em etanol. Quando cultivadas anaerobicamente neste meio, as cepas Δgpd1Δgpd2 (por exemplo, M2032) não podem fermentar glicose, devido à incapacidade de a célula reciclar NAD+ durante a glicólise. A introdução de uma ADH ou AADH funcional permite a regeneração de NAD+ através da conversão de ácido acético em etanol. As cepas que mostram crescimento anaeróbico e rendimentos aumentados de etanol através da eliminação da formação de absorção de glicerol e ácido acético são demonstradas como expressando funcionalmente ADHs ou AADHs. Veja a Tabela 12 abaixo. Tabela 12. Formação do Produto, utilização de acetato e taxas de crescimento de ADH s e AADH s em uma cepa de del eção de glicerol.
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[00296] As taxas de crescimento positivo e rendimentos de etanol realçados das cepas que expressam ADH/AADH demonstram a funcionalidade das ADH/AADHs. A taxa de crescimento e título de etanol menores da AADH de Chlamydomonas reinhardtii (Tabela 12) é potencialmente devido a uma sequência alvejante de mitocôndria prognosticada na porção a montante deste gene. A remoção desta sequência pode realçar a taxa de crescimento e título de etanol desta cepa.
[00297] Uma segunda comparação de várias ADH/AADHs foi realizada sob condições de fermentação usando meio Verduyn em pH controlado, fermentadores de biostato espalhados com nitrogênio conduzidos a 35 °C. Conforme mostrado na Tabela 13 abaixo e na Figura 25, as cepas que expressam AADH de Piromyces SP E2 e AADH de B. adolescentis apresentaram melhor desempenho em relação a ADH mhpF de E. coli, que não mostra crescimento robusto. Tabela 13. Sumário do desempenho da cepa em reatores de batelada.
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4.5 Produção de etanol usando cepas de levedura industriais.
[00298] Após a identificação de ADH e AADHs adequadas para a conversão de acetato em etanol, a levedura tolerante ao ácido acético industrial foi engenheirada para substituir a formação de glicerol com a conversão de acetato derivado de lignocelulose em etanol. A cepa precursora M2108 (uma cepa robusta, que utiliza xilose adaptada, criada, conforme descrito no Exemplo 3) foi usada para criar dois derivados, M2433, uma cepa Δgpd1 expressando quatro cópias de AADH de Piromyces SP E2, e M2488, uma cepa Δgpd1Δgpd2 expressando oito cópias de AADH de Piromyces SP E2. M2433 foi criada através da transformação de produtos de PCR que foram construídos através de levedura via recombinação homóloga para criar um cassete que substitui cada uma das duas cópias de GPD1 com duas cópias da AADH de Piromyces SP E2, um marcador de seleção positiva (os marcadores KanMX ou CloNat - um para cada loco de GPD1 em cada cópia do cromossomo), e um marcador de seleção negativa, o gene de timidina quinase (TDK) a partir do vírus do herpes simples (Acesso GenBank No AAA45811; SEQ ID NO: 84), que cria sensibilidade ao fármaco 5-fluorodeoxiuridina (FUDR). Isto resulta em um total de quatro cópias da AADH sendo superexpressada. produtos de PCR que foram gerados para este cassete são mostrados abaixo na Tabela 14. Estes produtos foram transformados através de eletroporação em M2108, primeira seleção quanto à resistência ao fármaco CloNat e confirmação da integração correta via PCR, e, subsequentemente, transformação com os mesmos produtos, exceto usando o marcador KanMX ao invés do marcador CloNat e seleção de fármaco G418 e CloNat. Novamente, estas cepas foram verificadas por PCR quanto ao genótipo correto. Após esta etapa, a cepa resistente dupla foi transformada com dois produtos de PCR que são capazes de remover os marcadores via recombinação homóloga. Estes produtos foram criados com os pares de primer X14180/X14179 e X14180/X14178. Veja a Tabela 10. Depois da transformação com estes fragmentos, as colônias foram selecionadas quanto à resistência a FUDR e confirmadas quanto à sensibilidade a G418 e CloNat, assim conforme verificado via PCR quanto à integração correta. A cepa resultante foi chamada M2433. Tabela 14. Produtos de PCR gerados para a superexpressão de GPD1 nocaute e AADH de Piromyces criados em M2108.
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[00299] Depois que GPD1 foi limpamente substituído em M2108, outras modificações foram feitas para substituir limpamente GPD2 com duas cópias (em cada cromossomo, assim, quatro cópias no total) da AADH de Piromyces SP E2, em uma maneira exatamente análoga àquela descrita acima. A Tabela 15 abaixo contém os fragmentos de PCR que foram gerados para esta etapa. As mesmas etapas foram tomadas, conforme descrito acima, com duas etapas de transformação para criar a substituição de GPD2 dupla, seguido por uma transformação para limpar o antibiótico e marcadores de seleção negativa usando os mesmos dois fragmentos limpos a partir do exposto acima. A cepa com GPD1 e GPD2 suprimidos e oito cópias da AADH de Piromyces SP E2 superexpressadas foi chamada M2488. Tabela 15. Produtos de PCR gerados para criar superexpressão de GPD2
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[00300] M2108, M2433 e M2488 foram examinadas quanto ao rendimento de etanol, produção de glicerol e utilização de acetato. As cepas foram cultivadas em frascos vedados purgados com nitrogênio para estabelecer as condições anaeróbicas, e vários meios diferente foram usados. A média de glicose mínimo (Figura 20A) consistiu de 6,7 g/L de levedura nitrogênio base, 25 g/L de glicose, 2 g/L de ácido acético, 20 mg/L de egosterol, e 420 mg/L de tween 80. Meio de xilose mínimo foi o mesmo conforme o exposto acima, exceto que xilose foi substituída no lugar de glicose. Os meios YPD e YPX continham extrato de levedura (10 g/L), peptona (20 g/L), acetato (2 g/L), 20 mg/L de egosterol, 420 mg/L de tween 80 e 20 g/L de glicose (YPD) ou 20 g/L de xilose (YPX). O pH do meio foi ajustado para 5,0 para o meio mínimo (nenhum ajuste de pH foi realizado para meio com base em YP), e os experimentos de crescimento foram realizados a 35 °C.
[00301] A Figura 20A mostra os títulos do produto e aumentos no rendimento para estas cepas quando cultivadas neste meio mínimo com glicose e acetato. M2433 tem uma via de deleção de glicerol parcial e produziu cerca da metade do glicerol da cepa parental, enquanto M2488 não produziu glicerol. Figura 20A. A cepa M2488 utilizou mais acetato do que M2433 e apresentou um maior aumento no rendimento de etanol. Figura 20A. Não obstante, uma deleção parcial da via de glicerol ainda mostrou um aumento no rendimento de etanol, uma diminuição na formação de glicerol e um aumento na utilização de acetato, em comparação à M2108 precursora. Veja, a Figura 20A. Entretanto, as cepas de deleção mostraram crescimento reduzida em comparação à M2108 precursora em vários meios (YPD, YPX, YMX). Veja, a Figura 20B.
[00302] As cepas M2488 e M2433 depois foram comparadas à M2108 usando sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) em pequena escala (20 mL do volume total) para determinar se os rendimentos de etanol aumentados e utilização de acetato podem ser obtidos com material lignocelulósico. As condições de SSF foram as seguintes: o carregamento de sólidos final foi de 20% (p/p) de substrato MS737 (um substrato insolúvel derivado do pré-tratamento de madeira dura com água), 5 mg de preparação de AB Enzima Celulase/g TS, 1% v/v de inóculo, 35 °C, pH 5,5 controlado com 5 g/L de CaCO3. O meio usado foi extrato de levedura (10 g/L) e peptona (20 g/L) e as reações foram realizadas em frascos de pressão de 150 mL purgados com nitrogênio vedados através de combinação de todos os ingredientes acima em uma cultura de batelada, mistura suave a 125 rpm em um agitador e amostragem durante 144 horas. As Figuras 21A e 21B mostram os níveis finais de etanol, glicerol e acetato de um SSF comparando M2488 e M2108. O título de etanol foi aumentado (Figura 21A) e a produção de glicerol foi diminuída (Figura 21B) para M2488 em comparação à cepa precursora M2108. Independente de apresentar um fundo de Δgpd1Δgpd2, algum glicerol foi detectado em M2488, que provavelmente foi liberado do material lignocelulósico e introduzido pelas enzimas usadas para hidrólise. Significantemente, níveis de acetato finais foram menores na cepa M2488 demonstrando a conversão de acetato derivado de lignocelulose em etanol sob condições de processamento industrial. 4.6 Produção de etanol usando meio de processamento de madeira dura
[00303] Um SSF de grande escala, compreendendo glicose/celulose, foi realizado para comparar a produção de etanol entre as cepas de deleção de gpd M2433 e M2488 e a cepa precursora M2108 sob condições industrialmente relevantes para processamento de madeira dura. As condições de SSF foram as seguintes: o carregamento de sólidos final foi de 22% (p/p) de substrato MS0944 (um substrato insolúvel derivado do pré-tratamento de madeira dura com água), 6 mg de preparação de AB Enzima Celulase/g TS, 0,5 g/L de inóculo de peso celular seco, 35 °C, pH 5,0 controlado com NH4OH 5 M. A batelada alimentada foi realizada durante 50 horas com cinco alimentações iguais nos tempos 0, 18, 26, 42 e 50 horas. O meio usado foi 12 g/L de líquido da maceração do milho (CSL) e 0,5 g/L de fosfato de diamônio (DAP). A reação foi realizada em um tamanho de reação de 1 kg (cerca de 1 L de volume) em um biorreator controlado a partir do pH e temperatura da Sartorius durante 168 horas. Conforme mostrado na Figura 22, M2433 e M2488 trabalharam igualmente de forma sartisfatória, fornecendo um aumento de rendimento de 6% sobre M2108, representando um aperfeiçoamento de cerca de 3 galões de etanol produzidos por ton de biomassa. Tais cepas de deleção de gpd mostraram que um aumento de rendimento similar sobre a cepa precursora foi inesperado, dadas as diferenças observadas entre M2433 e M2488 cultivadas em meio mínimo com glicose. As cepas de deleção de gpd também exigiram menos base neutralizante (12,1 g de NH4OH 5 M para M2433 e 9,4 g de NH4OH 5 M para M2488) para manter o pH no processo de fermentação em comparação à M2108 (15,6 g de NH4OH 5 M).
[00304] As cepas de deleção de gpd também foram examinadas em uma fermentação do lavado, que compreende xilose/hemicelulose. As condições de batelada alimentada do lavado foram as seguintes: o lavado CS 0944 a partir de um pré-tratamento de madeira dura com água foi concentrado através de evaporação para levar a concentração de açúcar (glicose + xilose) a 164 g/L. 2 g/L de peso celular seco foram usados como inóculo para iniciar a fermentação da batelada alimentada, a temperatura foi controlada a 35 °C e o pH foi ajustado e controlado a 6,5 com NH4OH 15 M. O volume da batelada de partida no tempo 0 foi de 575 mL e o lavado consistiu de 17,4% (v/v). A alimentação do lavado iniciou em 3 horas na fermentação, e continuou a 0,14 mL/min para as primeiras 15 h e depois a razão de alimentação foi ajustada a 0,1 mL/min para o restante da alimentação até 72 h. A concentração do lavado final depois da alimentação foi de 53% (v/v) e o volume final foi de 1000 mL. O meio usado foi 12 g/L de CSL e 0,5 g/L de DAP. Conforme mostrado na Figura 23A, durante a fermentação do lavado, M2433 produziu cerca de um aumento de rendimento de 12% em etanol em comparação a M2108, o que representa um aperfeiçoamento de cerca de 1,4 galões de etanol produzidos por ton de biomassa. M2488, os fundos Δgpd1Δgpd2, produziu significantemente menos etanol em relação à M2108 (Figura 23A), não obstante a manutenção de concentrações menores de glicerol e acetato em comparação à M2108 e M2433 (Figura 23B), demonstrando que uma cepa de deleção de gpd dupla não é robusto o suficiente sob as condições de processamento do lavado. Assim, dadas as diferenças na robustez entre as cepas de deleção M2433 e M2488 em meios de processamento de biomassa diferentes, uma pessoa habilitada pode selecionar uma cepa que fornece o perfil de produção ideal para o meio de processamento de biomassa.
[00305] Um outro conjunto de cepas foi criado para examinar os benefícios de rendimento em um fundo do tipo selvagem GPD1/2 durante a fermentação de carboidratos através de S. cerevisiae. As cepas foram engenheiradas, as quais superexpressam quatro cópias da AADH de Piromyces SP E2 no loco FCY1. Isto foi feito em uma maneira muito similar àquela descrita acima. Os produtos de PCR foram gerados e transformados, os quais permitiram que a cepa de levedura criasse uma inserção via recombinação homóloga. Os fragmentos usados para esta transformação são fornecidos na Tabela 16 abaixo. Depois da transformação, as cepas foram selecionadas quanto a resistência a 5-fluorocitosina, que é tóxica a células que têm um loco FCY1 intacto. As cepas com substituição das duas cópias de FCY1 pelos cassetes de gene de AADH de Piromyces SP E2 foram confirmadas por PCR. Este procedimento foi realizado em M2108 (gerando M2556), assim como em M2390 (gerando M2739). Tabela 16. Produtos de PCR usados para substituir o loco FCY1 com 2
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[00306] Um SSF foi realizado para comparar a produção de etanol nestas cepas de deleção de não gpd recém criadas contra aquele produzido pela cepa do tipo selvagem, M2108, assim como as cepas de deleção GPD1 (M2433) e GPD1 e GPD2 (M2488). SSF em pequena escala (20 mL de volume total) foi usado para determinar se os rendimentos de etanol aumentados e utilização de acetato podem ser obtidos com material lignocelulósico. As condições de SSF de pequeno escala foram descritas acima: o carregamento de sólidos final foi de 20% (p/p) de substrato MS737 (um substrato insolúvel derivado do pré-tratamento de madeira dura com água), 5 mg de preparação de AB Enzima Celulase/g TS, 1% v/v de inóculo, 35°C, pH 5,5 controlado com CaCO3 5 g/L. O meio usado foi extrato de levedura (10 g/L) e peptona (20 g/L) e as reações foram realizadas em frascos de pressão de 150 mL purgados com nitrogênio vedados através de combinação de todos os ingredientes acima em uma cultura de batelada, mistura suave a 125 rpm em um agitador e amostragem durante 144 horas. Conforme mostrado na Figura 24A, M2556 produziu mais etanol em comparação a cepa de deleção de gpd, enquanto todas as três produziram mais etanol em relação à cepa precursora M2108. M2556 demonstrou um aumento de cerca de 9% no rendimento de etanol, enquanto M2433 e M2488 mostraram um aumento de cerca de 6,5% e cerca de 5,5% no rendimento de etanol, respectivamente. M2556 também produziu mais glicerol e usou menos acetato em relação à cepa de deleção de gpd, mas M2556 apresentou níveis menores de glicerol e acetato em relação à M2108. Figura 24B. As Figuras 33 e 34 mostram os resultados para um derivado de M2390 expressando a AADH. Esta cepa, M2739, mostrou a mesma capacidade de aumentar o rendimento de etanol, e tomar acetato, em SSF com 20% de sólidos usando madeira dura pré-tratada em frascos pequenos de 20 mL vedados, em relação à cepa parental M2390. Figuras 33 e 34. Estes resultados mostram que a superexpressão de AADH é aplicável a múltiplas cepas de fundo industrial. De maneira global, estes resultados demonstram que os aperfeiçoamentos no rendimento de etanol podem ser obtidos através da construção de uma AADH aperfeiçoada em uma célula hospedeira, na presença ou ausência de deleções de gpd. A superexpressão de AADH também pode levar às diminuições concomitantes em acetato e glicerol em SSF, sem deletar gpd. 4.7 Produção de etanol usando meio de processamento de milho 4.7.1 Pasta de Milho
[00307] A quantidade de substrato fermentável disponível para a produção industrial de etanol através de S. cerevisiae é limitada à glicose liberada durante o processo de colocação em pasta e/ou hidrólise enzimática através da adição de enzimas amilase. Neste processo, uma pequeno quantidade de acetato, entre 0,2 a 0,5 g/L, é produzida. A adição de uma ADH bifuncional pode permitir a absorção deste acetato e conversão em etanol resultando em um maior rendimento de etanol. Adicionalmente, o acetato pode atuar como um dissipador de elétrons durante o crescimento anaeróbico ou microaeróbico considerando a redução de glicerol e rendimento de etanol aumentado. Veja o Pedido U.S. No 61/472.085, integralmente incorporado como referência neste relatório.
[00308] Uma análise da fermentação do frasco agitado foi feita usando 25% de sólidos de pasta de milho para comparar o mutante de deleção de glicerol M2085 (gpd1Δgpd2Δfdh1Δfdh2Δ) com M2158 (fcyΔ::ADHE gpd1Δ::ADHE gpd2Δfdh1Δfdh2Δ), um mutante de deleção de glicerol contendo 8 cópias de uma ADH bifuncional de E. coli (SEQ ID NO: 51). Os frascos foram experimentados múltiplas vezes ou experimentados apenas no ponto final (“apenas amostra”). A análise de níveis de etanol indica que a expressão de AADH permitiu rendimento de etanol aumentado quando as fermentações foram experimentadas múltiplas vezes. Veja, a Figura 26A. Pelo fato de que a amostragem envolve remoção da retenção de ar, um meio aeróbico ou microaeróbico temporário pode ser criado. Quando a retenção de ar foi deixada durante o curso da fermentação, nenhum benefício da expressão de AADH foi observado. A Figura 26B mostra a absorção de acetato através de M2158, mas não pela cepa do tipo selvagem. O aumento leve no acetato no final da fermentação, provavelmente, foi um resultado da lise celular e é, usualmente, observado com todas as cepas. 4.7.2 Fibra de Milho
[00309] O acetato presente na fibra de milho não é acessível após a colocação em pasta e hidrólise enzimática através das amilases usadas na indústria. Entretanto, este acetato pode ser liberado se a fibra que permanece depois da destilação for hidrolisada. Para determinar se o acetato gerado através de hidrólise da fibra de milho pode ser convertido em etanol, as cepas M2556 (contêm a ADH bifuncional de Piromyces SP E2) e M2488 (contém as deleções de gpd1 e gpd2, além da expressão da ADH bifuncional de Piromyces SP E2) foram inoculadas em fermentações contendo 30% de sólidos de lavado de fibra de milho. Os experimentos foram feitos em frascos agitados tampados com retenção de ar e experimentados em 24 e 96 horas, de modo a medir os metabólitos através de HPLC. Conforme mostrado na Figura 27, as cepas contendo AADH são mostradas remover acetato a partir de fibra hidrolisada resultando em uma redução nos níveis de glicerol. Incorporação como Referência
[00310] Todas as Patentes U.S. e Pedidos de Patente U.S. publicados citados neste relatório são incorporados como referência. Equivalentes
[00311] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita neste relatório. É intencionado que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações seguintes.

Claims (6)

1. Levedura recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma ou mais enzimas nativas e uma ou mais enzimas heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas engenheiradas para converter acetato em etanol, em que as ditas uma ou mais enzimas nativas e/ou heterólogas são ativadas, suprarreguladas ou infrarreguladas, em que pelo menos uma das ditas uma ou mais enzimas nativas é uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) que é infrarregulada e codificada por um polinucleotídeo gpd1, um polinucleotídeo gpd2, ou ambos um polinucleotídeo gpd1 e um polinucleotídeo gpd2, em que pelo menos uma das ditas uma ou mais enzimas heterólogas é uma acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional, e em que a dita acetaldeído/álcool desidrogenase bifuncional é derivada de E. coli, C. aceto-butylicum, T. saccharolyticum, C. thermocellum C. phytofermentans, Chlamydomonas reinhardtii, Piromyces SP E2, Bifidobacterium adolescentis, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64 ou SEQ ID NO:66.
2. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que uma entre as ditas vias metabólicas engenheiradas compreende as seguintes etapas: (a) conversão de acetato em acetil-CoA e (b) conversão de acetil-CoA em etanol, em que o dito acetato é convertido em acetil-CoA por uma acetil-CoA transferase (ACS), ou em que o dito acetato é convertido em acetil-P por uma acetato quinase; e o dito acetil-P é convertido em acetil-CoA por uma fosfotansacetilase.
3. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita levedura é selecionado a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utliis, Arxula adeninivorans, Pichia stipitis, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans e Schwanniomyces occidentalis.
4. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende um polinucleotídeo gpd1 nativo e/ou heterólogo ligado de maneira operável a um polinucleotídeo promotor gpd2 nativo, um polinucleotídeo gpd2 nativo e/ou heterólogo ligado de maneira operável a um polinucleotídeo promotor gpd1 nativo, ou uma mutação em uma hidrogenase.
5. Processo para converter biomassa em etanol CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar a biomassa com uma levedura recombinante, como definida na reivindicação 1.
6. Meio de fermentação CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais leveduras recombinantes, como definida na reivindicação 1.
BR112012028290-5A 2010-05-05 2011-05-05 levedura recombinante, processo para converter biomassa em etanol e meio de fermentação compreendendo dita levedura BR112012028290B1 (pt)

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