CN87103534A - 吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用吸附形式的固定化细胞直接和(或)连续发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇的方法。其过程是用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌在5％玉米醪中培养和筛选得到对数生长期菌液，其由瓷环吸附制成固定化细胞，即可直接发醇玉米淀粉料生产丙酮丁醇。本发明的固定化细胞活性高、半衰期长，性能可靠，还可再生，尤其可在反应器中连续生产，大大减少生产投资和生产装备，故本法工艺简单合理，生产成本低，效率高，并易于在工业上推广和应用。

Description

本发明属于发酵或生物合成法生产丙酮丁醇的方法，更具体地说本发明关系到利用吸附形式的固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇的方法及其反应器。

传统的发酵法生产丙酮丁醇是由淀粉质原料直接入一种丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，在发酵罐中进行发酵。一般，淀粉质原料有玉米或薯干等，其经过粉碎、配醪、蒸煮和冷却等处理而获得的，发酵在一定温度和时间下完成，然后经蒸馏得到丙酮丁醇。

这种生产丙酮丁醇的方法主要缺陷是菌体不能充分利用，其次，在发酵的过程中，菌体的活细胞受到代谢产物丁醇的毒害，所以发酵液的浓度不能太高，因此发酵需用庞大的设备，以致传统方法生产丙酮丁醇效率低，成本高。

为了改进上述状况，从80年代初起已有许多国家的科研人员正在从事固定细胞生产丙酮丁醇的研究和使用。该些研究的方向是将微生物细胞固定在一种载体上，作为一种生物催化剂，可放置在生物反应器中不断地将原料基质转化为丙酮丁醇溶液。从所揭示的材料可以看出，其总的固定化形式为包埋法。用作包埋法的载体材料是海藻酸纳等物质，通过海藻酸纳溶液和丙酮丁醇梭状芽状孢杆菌均匀混合，成粒，硬化等步骤，制备成包埋有细胞的凝胶颗粒。

使用固定化细胞生产丙酮丁醇的优点是：基质与细胞容易分离，固定化细胞可以反复使用，从而省去频繁的接种工艺;可以在反应器内高稀释速率下连续进行;固定化形式中，细胞密度增加能提高反应速率，而不致于“冲出”;增加反应器的生产效率;减少细胞增殖所需的原料消耗，相对增加原料对产品的转化率，省去庞大发酵罐，使投资小，便于自动化。

但是，包埋法生产丙酮丁醇中因其胞内酶不能与大分子淀粉原料作用，故限止了以淀粉质粮食为原料的溶剂生产上应用。其只能应用基质是葡萄糖或其它水解糖原料，造成成本提高，原料供应困难。此外，包埋的固定化细胞制备麻烦，强度低，半衰期短。这种方法在实验室中试验的最好结果是69g/l反应器·天。尽管那样，但由于缺少生物反应器的动力学研究，不能在工程方面得到实际应用。

本发明的目的在于对包埋法固定化细胞生产丙酮丁醇的不足之处加以改进，从而提出一种能在生产实践中可应用的，强度高、半衰期长，效率高的瓷环吸附法固定化细胞。这种固定化细胞还可直接发醇淀酵淀粉质原料生产丙酮丁酵使生产成本降低，以及提供能达到连续生产丙酮丁醇的反应器。

吸附法固定化细胞生产丙酮丁醇所用的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌为clostridium    acetobutylicum。这种菌为工厂生产用菌种，经过培养基等培养达到对数生长期可供吸附法固定化细胞应用。一般，培养是把丙酮丁醇梭状芽孢杆菌接种于容有5%的玉米醪培养基的试管中，沸水中处理一分钟，于干燥器内抽真空600～760mm    Hg、38℃保温箱培养24～28小时，扩至250ml三角瓶继续培养14小时左右而得到的。

作为吸附法固定化细胞的载体主要是瓷环，其可选用φ3-φ10mm的多孔陶瓷环。在使用前，把这种瓷环先进行酸碱处理，自来水冲洗，蒸气消毒，供备用。

图1表示用去吸附法固定化细胞生产丙酮丁醇的反应器示意图。

吸附法固定化细胞的细胞固定通过把经上述处理的瓷环放入对数生长期的菌液中浸泡让静止吸附以使该菌液中的梭状芽孢杆菌的一部份进入瓷环的孔隙中，四小时后滤去发酵液，然后将吸附瓷环浸入0～2%海藻酸钠的PH7.0    0.1M的磷酸缓冲液中，0.5～1小时后滤出，再浸于无菌的氯化钙溶液中，在冰箱过夜后用0.5%戊二醛进行交联处理使孔隙内的细菌得到相对固定。这种吸附固定的细胞，可以象游离细胞一样可直接发酵淀粉质原料如玉米或薯干等。

用上述方法制得到吸附法固定化细胞分别与包埋法和游离细胞法分批发酵玉米醪试验比较;在试验中，包埋法采用海藻酸钙包埋凝胶，吸附法固定化细是用φ6×6×1.5瓷环吸附。试验是在5%浓度的三角瓶玉米醪中，温度39+2℃保温培养，其结果如表1所示：

由表1可看出，采用吸附法固定化细胞可以达到传统方法游离细胞相仿的结果，而一般文献采用的海藻酸钙包埋凝胶则发酵不彻底。其原因是由于玉米醪颗粒及淀粉大分子不易与被包埋的细胞接触。

为了观察吸附法固定化细胞的连续使用性能、使用寿命，进行了反复分批式发酵试验。试验按下列方式;将固定化细胞接种于5%浓度的玉米醪，保温发酵65-72小时，滤出发酵液，以无菌水洗涤，再冲洗，共洗4～6次，滤出水份，将滤干瓷环接入新鲜玉米醪继续进行发酵。每次发酵结束后测定总溶剂，残余还原糖，共进行十次（32天）。结果如表2所示：

表2

由表2可见，固定化细胞反复使用十次以后仍具有正常发酵性能，其发酵结果与游离细胞相仿。也完全适合于装入反应器中实行连续生产。

吸附法固定化细胞连续生产溶剂的反应器见图1。反应器包括一个培养基槽[1]二个反应器[2]、[2′]，在反应器[2]和[2′]中放置经吸附的固定化细胞瓷环[5]，在培养基槽[1]内容有5%-8%玉米醪[4]，一个进料泵[6]，其通过连接管分别与槽[1]和反应器[2]的底部连通，一个设在进料泵[6]和反应器[2]之间的阀门[12]提供输送料控制，一个回流泵[7]，它通过管子接通反应器[2]的上部与反应器[2′]的下部，一个装在其管子上的阀[13]提供回流控制，反应器[2]的上部和反应器[2′]的底部用管子连接，一个装在管子上的阀[14]提供流量控制，在反应器[2]和[2′]的顶部设有与可供进水或进液控制的管子和阀门[8]，槽[1]和反应器[2][2′]的底部还都设有一个供换料或冲洗的临时出口阀门[9]、[10]、[11]。连续生产时，作用进料的培养基从槽[1]的顶部加入，由进料泵[6]控速进入反应器[2]，在反应器[2]内培养基将通过经吸附的瓷环[5]发酵，发酵可静止或流动，在流动时通过回流泵[7]从反应器[2]内的瓷环以上出口输回底部，不断循环，然后再送到反应器[2′]，通过其内经吸附的瓷环[5]从上部出料口排出已发酵的丙酮丁醇溶剂等。

在一般室内进行丙酮丁醇的吸附法生产中，如果受到杂菌污染对污染的处理以及处理后发酵情况的试验。通常吸附法固定化细胞直接发酵丙酮丁醇均在超净台或无菌条件下进行操作，可避免污染。现在把第二批移到一般空内进行操作，固定化细胞洗涤和接种时缺乏无菌条件，造成该批发酵污染乳酸菌，其中样品号2特别严重，发酵液和载体均有杂菌污染。但是用适当的方法处理，即转入正常发酵。杂菌污染及处理后的发酵结果见表3。

表3

表3结果表明固定化细胞发酵染菌后得率降低，会造成酸败。但经过处理后，发酵仍可正常进行，恢右原有水平。

固定化细胞反复分批发酵过程的观察与分析：根据发酵三角瓶外观与镜检情况如下：

1.三角瓶接种后6-12小时不断有气泡从载体处冒出。12-24小时开始形成醪盖。24-36小时时醪盖密实下层变清。发酵结束时（65-72小时）醪盖下沉，但载体外仍有气泡产生。

2.固定化细胞制备后第一批发酵起发稍晚，30小时后方形成醪盖。第二批分别从衰老期，如尸体、有孢子、醪盖下沉与旺盛期，如菌体排列整齐、粗壮、有醪盖的固定化细胞接种，发酵旺盛菌种接种比衰老菌种形成醪盖时间提前12小时，即分别为16和28小时。

如上所述吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇采用了瓷环作为载体固定化细胞活性高，发酵效果好，寿命长;性能可靠还可再生。这种固定化细仍可利用传统的玉米，薯干等淀粉质原料发酵，并可放置在反应器中进行连续发酵大大减少生产投资和生产装备，所以本发明法工艺简单合理、生产成本低并适宜于生产中应用。

实施例1

反复分批发酵生产溶剂。将φ3×7×0.8瓷环用5%NaOH溶液煮沸30分钟，自来水冲洗干净，再用1N    HCl浸泡30分钟，再用自来水冲洗至中性，装入500ml三角瓶，121℃蒸汽消毒1小时，冷后备用。

菌种培养是用液体孢子试管1支，无菌条件下接10%比例接种于5%玉米醪试管中，沸水中热处理1分钟，置于真空干燥器中，抽真空为640mm    Hg，38℃保温培养。28小时后达到对数生长期，扩大至250ml三角瓶，5%浓度的玉米醪中，继续38℃保温培养14-20小时，达对数生长期时用于制备固定化细胞。

吸附法固定化细胞是将已处理过的瓷环按1∶1的比例浸泡在对数生长期的培养菌液中，静止吸附0.5-4小时，沥干。浸入原已配制好的2%海藻酸钠的PH、0.1M磷酸缓冲液的无菌溶液中，约30分钟，沥干。倒入2%氯化钙溶液中浸泡。滤出，置于生理盐水中保存。

发酵生产用250ml三角瓶，装150ml5%玉米醪，接种上述方法制备的固定化细胞5-30%，38-40℃保温培养65-72小时。发酵成熟醪滤出，分析总溶剂量，残余淀粉和醪液酸度。固定化细胞滤出后用无菌水冲洗4-6次（证明已无游离细胞），将滤干的固定化细胞重新接入5%新鲜玉米醪，再次进行发酵。每次都进行分析测定，反复进行十次以上，结果稳定为含总溶剂量10.57-13.38g/l，残淀粉0.22～0.48，酸度1.5-1.9。与传统生产方法，即游离细胞法对照，结果相仿。

实施例2

直接在图1的反应器中制备固定化细胞，连续发酵生产溶剂。用φ6×6×1.5瓷环按实施例1方法处理，在反应器（培养瓶，500ml）中按1∶1比例接入实例1方法培养的对数生长期菌液，浸泡吸附后滤去菌液，再按实例1方法用保护剂处理后滤去残液，通入5%-8%的玉米醪进行连续发酵。连续发酵的第一步为静止培养，达到生成溶剂阶段后以0.2～0.6h^-1的稀释速率进行连续，根据排出液的溶剂含量和残余淀粉调节回流比。连续生产的生产率达60-100g/l天。

Claims (5)

1、一种固定化细细胞生产丙酮丁醇的方法，包括用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌作为菌体，其特征在于该菌种经5%玉米醪培养基中培养和筛选得到对数生产期的丙酮丁醇菌液，制备吸附法固定化细胞然后采用吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇溶液。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于所说的吸附法固定化细胞中的载体主要是瓷环，经酸碱、水洗、消毒后侵入所说的对数生长期菌液，再浸入0～2%海藻酸钠PH7.0，0.1M的磷酸缓冲液中，还浸入2%无菌氯化钠溶液中，最后用0.5%戊二醛进行交联，冰箱硬化。

3、根据权利要求2的方法，其特征在于所说的瓷环是多孔陶瓷，直径在φ3～10mm。

4、根据权利要求1或2或3所述的法，其特征在于所说的淀粉质原料是玉米、薯干等粮食淀粉，其中玉米淀粉发酵液浓度为5～8%玉米醪。

5、根据权利要求4的方法，其特征在于所说的反复分批发酵的时间为48～72小时，而采用反应器连续发酵，其第一步为静止培养，达到生成溶液阶段后以0.2～0.6h的稀释速率进行连续，生产率达到60～100g/L·天。

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