CN108456698B - 一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法 - Google Patents

一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于丁酸梭菌的1，3‑丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法，在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵副产物的吸附，解除副产物抑制作用，同时，对发酵液中甘油浓度进行检测，通过流加培养基将发酵过程中菌体生长处于稳定期的甘油浓度控制在5～15g/L，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭。

Description

一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法。
背景技术
1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作药物合成中间体。其最主要的用途是作为聚合体单体合成性能优异的高分子材料，特别是作为单体与对苯二甲酸合成新型聚酯材料一聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。目前工业化生产PDO的方法主要有化学法和生物法，化学法具有高温高压，技术难度大，装置投资高等缺点。而生物法具有利用可再生资源，操作简便，反应条件温和，副产物少，环境污染小等优点，其中利用丁酸梭菌进行发酵生产1，3-丙二醇可以利用生物柴油肥料粗甘油，且不需要添加昂贵的维生素B12。
乳酸是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工等领域具有广泛的应用。比如，在食品工业领域，作为酸味剂、防腐剂；在医药工业领域，可用于手术室、实验室、病房等的消毒剂；在化工领域，可用于处理纺织纤维，使之易于着色。乳酸的生产方法主要有发酵法、酶法和化学合成法。目前，高光学纯度的L～乳酸的生产主要以发酵法为主。
截至目前，并不存在一种基于丁酸梭菌实现1，3-丙二醇和乳酸联产的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法，在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵副产物的吸附，解除副产物抑制作用，同时，对发酵液中甘油浓度进行检测，通过流加培养基将发酵过程中菌体生长处于稳定期的甘油浓度控制在5～15g/L，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30～100g活性炭，上述发酵副产物包括乙酸、丁酸和甲酸。
当甘油浓度低的时候，可以减少甘油对1，3-丙二醇和乳酸生成的抑制，使菌体处于稳定期的时间延长，提高菌体细胞的活性，并且有利于后期的分离及减少甘油的浪费。同时，由于活性炭会吸附丁酸，使得发酵液中丁酸的浓度进一步维持较低的水平，以减少丁酸对就菌体的抑制，进而使丁酸梭菌一直将甘油转化为丁酸，同时为了保持菌体内能量的平衡，丁酸梭菌会将部分甘油转化为乳酸。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)种子液制备：将丁酸梭菌Clostridium butyricum甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；
(2)补料分批发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积40～80％的发酵培养基，再加入活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～25％；发酵条件为：发酵温度34～38℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH通过氢氧化钠控制在7.00，同时在发酵期间对发酵过程中的甘油浓度进行检测，通过调节流加补料培养基的速度控制甘油浓度在5～15g/L。
进一步优选的，所述RCM培养基的配方为：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用NaOH调节为8.5。
进一步优选的，所述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K2HPO4·3H2O4.45g、KH2PO41.3g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。
进一步优选的，所述发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中含有甘油80g、K2HPO4·3H2O1g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
进一步优选的，所述补料培养基的配方为：每升补料培养基中含有甘油120g、
K2HPO4·3H2O1g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
更进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO4.7H2O5g和浓度为37wt％的HCl溶液4mL，每升所述微量元素溶液含有：ZnCl20.07g、MnCl2·4H2O0.1g、H3BO30.06g、CoCl2·6H2O0.2g、CuCl2·2H2O0.02g、NiCl2·6H2O0.025g、Na2MoO4·2H2O0.035g和浓度为37wt％的HCl溶液0.9mL。
更进一步优选的，所添加的活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。
本发明的有益效果是：本发明的通过在发酵培养基中添加适量的活性炭，并将发酵过程中的甘油浓度控制在5～15g/L，实现了基于丁酸梭菌的1，3-丙二醇与乳酸的联产。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中，每升所述Fe溶液中含有FeSO4·7H2O5g和浓度为37wt％的HCl溶液4mL，每升所述微量元素溶液含有：ZnCl20.07g、MnCl2·4H2O0.1g、H3BO30.06g、CoCl2·6H2O0.2g、CuCl2·2H2O0.02g、NiCl2·6H2O0.025g、Na2MoO4·2H2O0.035g和浓度为37wt％的HCl溶液0.9mL。所添加的活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。
实施例1
菌种：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；
发酵方式：机械搅拌罐，补料分批发酵；
具体过程如下：
(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；
(2)发酵培养：向5L发酵罐内装入发酵罐体积60％的发酵培养基，再加入150g活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度37℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH通过氢氧化钠控制在7.00；当发酵液中甘油浓度下降到5～15g/L时，通过检测甘油浓度来控制不同速率流加培养基，将甘油浓度控制在5～15g/L。
上述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。
上述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K2HPO4·3H2O4.45g、KH2PO41.3g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。
上述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油80g、K2HPO4·3H2O1g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
上述补料培养基配方如下：每升发酵培养基中含有甘油120g、K2HPO4·3H2Olg、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
发酵结果：最终发酵液中1，3-丙二醇浓度为60.72g/L，乳酸的浓度为35.43g/L，实现了1，3-丙二醇和乳酸的联产。
实施例2
菌种：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；
发酵方式：机械搅拌罐，补料分批发酵；
具体过程如下：
(1)种子液制备：将丁酸梭菌甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度30～38℃，培养时间18～26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3～10v/v％接种量接入种子培养基，30～37℃，培养18～26h，得到二级种子液；
(2)发酵培养：向5L发酵罐内装入发酵罐体积60％的发酵培养基，再加入150g活性炭，通氮气20～40min以除氧，然后接入步骤(1)制备的二级种子液进行发酵，接种量3～10％；发酵条件为：发酵温度37℃，转速0～300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH通过氢氧化钠控制在7.00；当发酵液中甘油浓度下降到5～15g/L时，通过检测甘油浓度来控制不同速率流加培养基，将甘油浓度控制在5～15g/L。
上述RCM培养基的配方如下：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、氯化钠3g、无水乙酸钠3g、可溶性淀粉1g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH用2mol/L的NaOH调节为8.5。
上述种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20～40g、K2HPO4·3H2O4.45g、KH2PO41.3g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL、Fe溶液1mL，pH＝6.8～7.2。
上述发酵培养基的配方如下：每升发酵培养基中含有甘油50g、K2HPO4·3H2O1g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
上述补料培养基配方如下：每升发酵培养基中含有甘油120g、K2HPO4·3H2O1g、KH2PO40.5g、(NH4)2SO42g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.015g、酵母粉1g、微量元素溶液1mL和Fe溶液1mL。
发酵结果：最终发酵液中1，3-丙二醇浓度为62.45/L，乳酸的浓度为38.00g/L，实现了1，3-丙二醇和乳酸的联产。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (2)

1.一种基于丁酸梭菌的1,3-丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法，其特征在于：在发酵培养基中添加活性炭进行发酵生产，通过该活性炭对发酵副产物的吸附，解除副产物抑制作用，同时，对发酵液中甘油浓度进行检测，通过流加培养基将发酵过程中菌体生长处于稳定期的甘油浓度控制在5~15g/L，其中活性炭的添加量为每升发酵培养基添加30~100g活性炭，上述发酵副产物包括乙酸、丁酸和甲酸；
具体包括如下步骤：
（1）种子液制备：将丁酸梭菌Clostridium butyricum甘油管接入灭菌的RCM培养基中，培养温度 30~38℃，培养时间 18~26h，获得一级种子液；然后将一级种子液按 3~10v/v%接种量接入种子培养基，30~37℃，培养 18~26h ，得到二级种子液；该RCM培养基的配方为：每升RCM培养基含有胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉3 g、葡萄糖5 g、氯化钠3 g、无水乙酸钠3 g、可溶性淀粉1 g和一水半胱氨酸盐酸盐0.5 g，pH 用NaOH 调节为 8.5；该种子培养基的配方为：每升种子培养基中含有甘油20~40 g、 K2HPO4·3H2O 4.45 g、KH2PO4 1.3 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、 CaCl2 0.015 g、酵母粉 1 g、微量元素溶液1 mL、Fe溶液 1 mL，pH=6.8~7.2
（2）补料分批发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积 40~80%的发酵培养基，再加入活性炭，通氮气20~40min以除氧，然后接入步骤（1）制备的二级种子液进行发酵，接种量 3~25% ；发酵条件为：发酵温度 34~38℃，转速0~300r/min，发酵过程通过通氮气保持厌氧环境，pH 通过氢氧化钠控制在 7.00，同时在发酵期间对发酵过程中的甘油浓度进行检测，通过调节流加补料培养基的速度控制甘油浓度在5~15g/L；该发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中含有甘油80g、K2HPO4·3H2O 1 g、KH2PO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2 0.015 g、酵母粉1 g、微量元素溶液1 mL和Fe 溶液 1 mL；该补料培养基的配方为：每升补料培养基中含有甘油120g、K2HPO4·3H2O 1 g、KH2PO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.015 g、酵母粉1 g、微量元素溶液1 mL和Fe 溶液 1 mL；
每升上述Fe溶液中，含有FeSO4·7H2O5 g和浓度为37wt%的HCl溶液4 mL，每升上述微量元素溶液含有：ZnCl20.07 g、MnCl2·4H2O0.1 g、H3BO30.06 g、CoCl2·6H2O0.2 g、CuCl2·2H2O0.02 g、NiCl2·6H2O0.025 g、Na2MoO4·2H2O0.035 g和浓度为37wt%的HCl溶液0.9 mL。
2.如权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于：所添加的活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。
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