SK482004A3 - Kombinácia kombinovaného kontinuálneho a vsádzkového kvasenia - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka výroby pitných alkoholických produktov, najmä piva a obzvlášť použitia hybridného procesu zahŕňajúceho spracovateľské stupne kontinuálneho a periodického kvasenia.

Doterajší stav techniky

Značný počet nedávnych publikácií v tejto oblasti ilustruje veľký záujem pivovarníckeho priemyslu o imobilizáciu. V niekoľkých prehľadných prácach (Enari, 1995; Iserentant, 1995: Masschelein. 1997; Mensour et al., 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999) o všeobecnom stave pivovarníckeho priemyslu je zdôraznená potenciálne revolučná úloha imobilizácie pri výrobe piva. Okrem skupín uvedených v oddieloch 3.1 až 3.5 sa výskumom a vývojom imobilizovaných buniek pre pivovarnícke aplikácie zaoberá veľa ďalších inštitúcií. Miller Brewing Company (Duncombe et al., 1996; Tata et al., 1999) zo Spojených štátov uskutočnila niektoré predbežné hodnotenia na skúšobnej jednotke Meura Delta, rovnako ako na bioreaktore s fluidným lôžkom, ktorý distribuuje Schott Engineering. Coors Brewing, tiež uskutočňovali predbežné experimenty so systémom Meura Delta.

Slovenská technická univerzita, v spolupráci s Heinekenom. skúmala použitie pektátu vápenatého v systéme výroby piva s pneumatickým výťahom (Domény, 1996). V poslednom čase publikovala skupina zo Slovenskej technickej univerzity o svojom prebiehajúcom výskume niekoľko článkov (Smogrovicova et al., 1997; Smogrovicova & Domény, 1999). Guinness skúmal pôvodne použitie rôznych adsorpčných nosičov na imobilizáciu a následné kvasenie v bioreaktore s fluidným lôžkom (Donnelly, 1998). V r. 1999 publikovali Donnelly a kol. prácu, opisujúcu kinetiku metabolizmu cukru vo vnútri ich bioreaktora s fluidným lôžkom (Donnely a spol., 1999). Ich experimentálne zariadenie zahŕňalo použitie poréznych sklenených perličiek Siran ako imobilizačného nosiča pre kvasinky pri vrchnom kvasení. Guinness sa stal súčasťou Immocon Consortium, ktoré bolo opísané v oddiele 2.2.5.

Holsten Brauerei AG a Lurgi AG, obaja z Nemecka, spoločne vyvinuli a uviedli do prevádzky pilotné zariadenie na kontinuálnu výrobu nealkoholického piva (Dziondziak, 1995).

Na kvasenie boli použité perličky z alginátu vápenatého v jednostupňovom fermentore s fluidným lôžkom (130 1) a na dealkoholizáciu piva sa použila kolóna so sitovým dnom (7 sitových dien). Celkový čas výroby v tomto procese bol 8.5 h.

Tím z výskumných laboratórií Sapporo Breweries Ltd. v Japonsku študoval použitie imobilizovaných buniek v reaktore s fluidným lôžkom na hlavné kvasenie piva. Ich štúdie sa zaoberali použitím gélových perličiek z polyvinylalkoholu (Shindo & Kamimur, 1990). gólových perličiek Ca-alginátu (Shindo et al., 1994a), gélových vláken s dvojitou vrstvou (Shindo et al.. 1994b) a perličiek z chitosanového gélu (Shindo et al.. 1994c) ako imobilizačných matríc. V naposledy uvedenej štúdií sa pracovalo s bioreaktorom s pracovným objemom jedného litra, obsahujúcim 25 % obj. perličiek Chitopearl® typu II (chitosanové perličky) na kontinuálnej báze s ošetrením sladiny glukoamylázou. Toto enzymatické spracovanie umožnilo, aby vznik acetátu v systéme imobilizovaných buniek bol podobný ako pri bežnom periodickom kvasení, teda o jeden krok bližšie k úprave produktu.

Výskumná skupina zo Sappora teraz zamerala svoju pozornosť na vývoj fermentora s fluidným lôžkom s chitosanovými perličkami, pracujúceho v režime opakovaných vsádzok. Systém bol schopný pracovať bez väčších problémov 75 dní a kvalita získaného piva bola podobná ako pri komerčnom produkte. Nevločkujúci kmeň sa ukázal ako oveľa účinnejší než llokulentný kmeň (Maeba et al., 2000: Umemoto et al., 1998).

Na kongrese EBC konanom v r. 1997 v Maastrichte boli prednesené dva ďalšie prístupy na zníženie diacetylu. Výskumníci vo Francúzsku (Dulieu et al., 1997) navrhli použitie enkapsulovanej α-acetolaktát dekarboxylázy na rýchlu premenu α-acetolaktátu na acetoín. Meura Delta zdôraznila predbežné výsledky použitia aluminosilikátového zeolitu ako katalyzátora na priamu konverziu acetolaktátu na acetoín za studená (Andries et al., 1997). Ak sa tieto opatrenia ukážu ako účinné a prijateľné pre spotrebiteľa, môžu sa stať realitou lacnejšej alternatívy k systémom na zretie, navrhovaným firmou Cultor a Alfa Laval.

Ďalší nepriemyselný výskum v oblasti imobilizácie na výrobu piva predstavujú výsledky z Singapore Inštitúte of Standards and Industrial Research, kde bolo študované použitie alginátových gélových častíc typu vláken na použitie v reaktore s vrstvou výplne a zistilo sa, že je priaznivejšie než alginátové perličky (Que, 1993). Mafra a kolegovia z Universidade do Minho v Portugalsku rozoberali použitie superflokulentného kmeňa kvasiniek na kontinuálne zretie piva (Mafra et al., 1997). Rovnaká výskumná skupina publikovala tiež prácu o použití svojich flokulentných kvasiniek v stúpačkovom bioreaktore na produkciu etanolu (Vicente et al.. 1999; Domingues et al., 2000)

Použitiu imobilizácie na výrobu piva sa v poslednom čase venovali tiež výskumníci v rôznych akademických inštitúciách (Argiriou et al., 1996; Bardi et al.. 1996; Cashin, 1996; Moli & Duteurtre, 1996; Nedovic et al., 1996a; Nedovic et al., 1996b; Norton et al., 1995; Scott et al., 1995; Wackerbauer et al., 1996a; Wackerbauer et al., 1996b). Technológii imobilizovaných buniek sa tiež venovali a v 80. rokoch výsledky publikovali výskumné skupiny z Číny (Chao et al., 1990; Yuan, 1987; Zhang et al., 1988). Ruska (Kolpachki et al.. 1980; Sinitsyn et al., 1986) a Československa (Chladek et al., 1989; Curin et al., 1987; Polednikova et al., 1981).

Počas prípravných prác pre štúdie, na ktorých sa zakladá tento vynález, boli vzaté do úvahy početné literárne odkazy. Patria medzi ne:

Abbott, B.J. 1978. Immobilized cells. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Ed. Perlman, D., New York: Academic Press, 2: 91.

Anon. 1994. Maturex® L. Novo Nordiskpubication. B 560c-GB.

Anon. 1996. Table Curve 2D. User's Manual, Jandel Scientific.

Anon. 1997. Alfa Laval Brewery Systems. Brewers' Guardian 126: 26.

Anon. 1998. Digox 5 Operating Manual. Dr. Theidigpublication.

Aquilla, T. 1997. The biochemistry of yeast: debunking the myth of yeast respiration and putting oxygen in its proper plače. Brewing Techniques 50.

Aschengreen, N.H., Jepsen, S. 1992. Use of acetolactate decarboxylase in brewing fermentations. Proceedings of the 22^nd Convention of the Inštitúte of Brewing (Austrália and New Zealand Section), Melboume 80.

Atkinson, B. 1986. Immobilised cells, their application and potential. In: Process engineering aspects of immobilized celí systems. Ed. Webb, C., Black, G.M, Atkinson, B. Manchester: Institution of Chemical Engineers 3.

Audet, P., Paquin, C., Lacroix, C. 1988. Immobilized growing lactic acid bacteria with kappacarrageenan - locust bean gel. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 11.

Austin, G.D., Watson, RW.J., Nordstrom, P.A., D'Amore. T. 1994. An on-line capacitance biomass monitor and its correlation with viable biomass. MBAA Technical Quarterly 31:85.

Axcell, B.C., O'Connor-Cox, E.S.C. 1996. The concept of yeast vitality - an alternatíve approach. Proceedings of Convention of the Inštitúte of Brewing (Asia Pacific Sect.). Singapore 24:64.

Axelsson, A., Sisak, C., Westrin, B. A., Szajani, B. 1994. Diffusion characteristics of a swelling gel and its consequences for bioreactor performance. The Chemical Engineering Journal 55: B35.

Bailey. J.E.. Ollis. D.F. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals. New York: McGrawHill, Inc.

Bancel. S.. Hu, W. 1996. Confocal laser scanning microscopy examination of celí distribution in macroporous microcarriers. Biotechnology Progress 12: 398.

Barker, M.G, Smart, K.A. 1996. Morphological changes associated with the cellular aging of a brewing yeast strain. Journal ofthe American Society of Brewing Chemists 54(2): 121.

Bejar. P.. Casas, C., Godia, F.. Sóla, C. 1992. The influence of physical properties on the operation of a three-phase fluidized-bed fermenter with yeast cells immobilized in calcium alginate. Applied Biochemistry and Biotechnology 34: 467.

Bickerstaff, G.F. 1997. Immobilization of enzymes and cells. In: Immobilization of Enzymes and Cells, Ed. Bickerstaff, G. F.. New Jersey, U.S.A.: Humana Press, Inc. 1.

Birnbaum. S., Pendleton. R., Larson, P., Mosbach, K. 1981. Covalent stabilization of alginate gel for the entrapment of living whole cells. Biotechnology Letters 3; 393.

Budac. D.. Margartis, A. 1999. Osobnísdelení.

Buyiikgiingôr, H. 1992. Stability of Lactobacillus bulgaricus immobilized in kappacarrageenan gels. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 53: 173.

Chahal, P.S. 1992. Fluorosensor controlled fed-batch production of Cyclosporin-A from Beciuveria nivea. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. London: Elsevier Applied Science.

Chisti, Y., Moo-Young, M. 1993. Improve the performance of airlift reactors. Chemical Engineering Progress 6: 38.

Cho, G.H.. Choi, C.Y., Choi, Y.D., Han, M.H. 1982. Etanol production by immobilised yeast and its carbon dioxide gas effects in a packed bed reactor. Journal of Chemical Technology' and Biotechnology 32: 959.

Coutts. M.W. 1956. Britain Patent No. 872.391.

Curin, J., Pardonova, B.. Polednikova, M., Sedova, H., Kahler, M. 1987. Beer production with immobilized yeast. European Brewing Convention Congress, Madrid 433.

Dale, C.J., Hough, J.S., Young, T.W. 1986. Freactionation of high and low molecular weight components from wort and beer by adsorption chromatography using the gel Sephadex LH20. Journal of the Inštitúte ofBrewing 92(5): 457.

Daoud, I.S., Searle, B.A. 1986. Yeast vitality and fermentation performance. Monograph - XII European Brewery Convention - Symposium on Brewers' Yeast, Helsinki 108. de Backer, L.. Willaert, R.G., Barón, G.V. 1996. Modelling of immobilized bioprocesses. In: Immobilized Living Celí Systems Modelling and Experimental Methods, Ed. Willaert, R. G.. Barón, G. V., and de Backer, L., Toronto: John Wiley and Sons. 47.

de Beer. D.. Van den Heuvel, J.C.. Ottengraaf, S.P.P. 1993. Microelectrode measurements of the activity distribution in nitrifying bacterial aggregates. Applied Environmental Microbiology 59: 573.

Debourg. A., Laurent, M., Goossens, E., Borremans, E., Van De Winkel, L., Masschelein, C.A. 1994. Wort aldehyde reduction potential in free and immobilized yeast Systems. Journal ofthe American Society ofBrewing Chemists 52: 100.

Dillenhofer, W., Ronn, D. 1996. Secondary fermentation of beer with immobilized yeast. Brauwelt International 14: 344.

Doran, P.M., Bailey, J.E. 1986a. Effects of hydroxyurea on immobilized and suspended yeast fermentation rates and celí cycle operation. Biotechnology and Bioengineering 28: 1814.

Doran, P.M.. Bailey. J.E. 1986b. Effects of immobilization on growth, fermentation properties. and macromolecular composition of Saccharomyces cerevisiae attached to gelatin. Biotechnology and Bioengineering 28: 73.

dos Santos, V.A.P.M, Bruijnse, M., Tramper, J., Wijffels, R.H. 1996. The magic-bead concept: an integrated approach to nitrogen removal with co-immobilized micro-organisms. Applied Microbiology and Biotechnology 45: 447.

Driessen, W., Habets, L., Vereijken, T. 1997. Novel anaeróbic and aeróbic process to meet strict effluent plánt design requirements. Proceedings of the Inštitúte of Brewing (Asia Pacific Sect ion). Aukland 148.

Dulieu, C., Boivin, P.. Dautzenberg, H., Poncelet, D. 1996. Immobilized enzýme systém to avoid diacetyl formation: a new tool to accelerate beer maturation. International Workshop on Bioencapsulation, Potsdam 22.

Dunbar, J.. Campbell. S.L., Banks, D.J., Warren, D.R. 1988. Metabolic aspects of a commercial continuous fermentation systém. Proceedings of the Convention of the Inštitúte of Brewing.

Brisbane 151.

Estapé, D., Gôdia, F., Solá, C. 1992. Determination of glucose and etanol effective diffusion coefficients in Ca-alginate gel. Enzýme and Microbial Technology 14: 396.

Evans. H.A.V., Cleary. P. 1985. Direct Measurement of Yeast and Bacterial Viability.

Journal of the Inštitúte of Brewing 91: 73.

Fan. L.-S. 1989. Gas-Liquid-Solid Fluidization Engineering. Boston: Butterworths.

Femandez, E. 1996. Nuclear magnetic resonance spectroscopy and imaging. In: Immobilized Living Celí Systems: Modelling and Experimental Methods. Toronto: John Wiley and Sons, Chapter 6.

García, A.I.. García, L.A., Díaz. M. 1994. Prediction of ester production in industrial beer fennentation. Enzýme and Microbial Technology’ 16(1): 66.

Geankoplis, C.J. 1993. Transport Processes and Unit Operations. New Jersey: Prentice Halí P.T.R.

Gee. D. A., Ramirez, W.F. 1994. A flavour model for beer fennentation. Journal of the Inštitúte of Brewing 100: 321.

Geiger, K.H.. Compton, J. 1957. Canada Patent No. 545,867.

Gekas, V.C. 1986. Artificial membranes as carriers for the immobilization of biocatalysts. Enzýme and Microbial Technology 8: 450.

Gift. E.A.. Park. H.J., Paradis, G.A., Demain, A.L., Weaver, J.C. 1996. FACS-based isolation of slowly growing cells: double encapsulation of yeast in gel tnicrodrops. Náture Biotechnology 14: 884.

Gikas, P., Livingston, A.G. 1993. Use of ATP to characterize biomass viability in freely suspended and immobilized celí bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 42: 1337.

Gikas, P., Livingston, A.G. 1996. Viability of immobilised cells: use of špecific ATP levels and oxygen uptake rates. Progress in Biotechnolgy 11, Immobilized Cells: Basics and Applications, Noordwijkerhout 11:264.

Gilson, C.D.. Thomas, A. 1995. Etanol production by alginate immobilised yeast in a fluidised bed bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology’ 62: 38.

Gôdia. F.. Casa. C., Castellano, B., Solá, C. 1987. Immobilized cells: behavior of carrageenan entrapped yeast during continuous etanol fennentation. Applied Microbology and Biotechnology 26: 342.

Gopal. C.V., Hammond, J.R.M. 1993. Application of immobilized yeasts for fermenting beer. Brewing and Distilling International 24: 72.

Hannoun, B.J.M., Stephanopoulos, G. 1986. Diffusion coefficients of glucose and etanol in cell-free and cell-occupied calcium alginate membranes. Biotechnology and Bioengineering 28: 829.

Hardwick, W.A. 1995. Handbook ofBrewing. New York: Marcel Dekker, Inc.

Hayat. M.A. 1972. Basic Electron Microscopy Techniques. Toronto: van Nosírand Reinhold Co. 96.

Heijnen. J.J.. van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R., Weltevrede, R., Mulder, A. 1993. Development and scale-up of an aeróbic biofilm air-lift suspension reactor. Water Science and Technology' 27: 253.

Higbie. R. 1935. The role of absorption of a pure gas into a still liquid during short periods of exposure. Transactions of the American Inštitúte of Chemical Engineers 31: 365.

Hines, A.L,. Maddox, R.N. 1985. Mass Transfer Fundamentals and Applications. U.S.A.: Prentice-Hall, Inc.

Hinfray, C., Jouenne, T., Junter, G. 1994. Etanol production from glucose by free and agarentrapped batch cultures of Saccharomyces cerevisiae at different oxygenation levels. Biotechnology Letters 16: 1107.

Hoekstra, S.F. 1975. Wort composition, a review of known and unknown facts. Proceedings of the European Brewery Convention, Nice 465.

Hooijmans, C.M., Ras, C., Luyben, K.Ch.A.M. 1990. Determination of oxygen profiles in biocatalyst particles by means of a combined polarographic oxygen microsensor. Enzýme and Microbial Technology 12: 178.

Hough, J.S., Briggs, D.E., Stevens, R., Young, T.W. 1982. Metabolism of wort by yeast. In: Malting and Brewing Science Voláme 2 Hopped Wort and Beer, Ed. Hough, J. S., Briggs, D. E., Stevens, R., and Young, T. W., London, U.K.: Chapman and Halí. 566.

Htisken, L.E., Tramper, J., Wijffels, R. 1996. Growth and eruption of gel-entrapped microcolonies. In: Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels. R.H., Buitelaar, R.M.., Bucke, C., Tramper. J., Amsterdam: Elsevier Science 336. Hutter. K.J. 1996. Flow-cytometric analyses for assessment of fermentative ability of various yeasts. Brauwelt International 1: 52.

Hwang, S.-J., Fan, L.-S. 1986. Some design consideration of a draft tube gas-liquid-solid spouted bed. The Chemical Engineering Journal 33: 49.

Imai. T. 1996. Recent advances in the determination of yeast vitality. Proceedings of the

Congress oflhe Inštitúte of Brewing (Asia Pacific Sectionf Singapore 24: 60.

Inloes, D.S., Taylor, D.P., Cohen, S.N., Michaels, A.S., Robertson, C.R. 1983. Etanol production by Saccharomyces cerevisiae immobilized in hollow-fiber membráne bioreactors.

Applied and Environmental Microbiology 46: 264.

Inoue, T. 1987. Possibilities opened by new biotechnology and application of immobilized yeast to bcer brewing. Reports of the Research Laboratory of Kirin Brewery Co.. Ltd. 7.

Inoue, T. 1992. A review of diacetyl control technology. Proceedings of the 22^,ld Convention of the Inštitúte of Brewing (Austrália and New Zealand Section), Melboume 76.

Jepsen, S. 1993. Using ALDC to speed up fermentation. Brewers' Guardian. 55.

Jones, M., Pierce, J.S. 1964. Absorption of amino acids from wort by yeasts. Journal of the Inštitúte of Brewing 70: 307.

Jones, R.P., Greenfield, P.F. 1984. A review of yeast ionic nutrition - Part I: growth and fermentation requirements. Process Biochemistry 19(2): 48.

Jones, R.P., Pamment, N., Greenfield, P.F. 1981. Alcohol fermentation by yeast - the effect of environmental and other variables. Process Biochemistry 16(3): 42.

Kara, B.V., Dávid, I., Searle, B.A. 1987. Assessment of yeast quality. Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention, Madrid, 21: 409.

Karamanev, D.G. 1991. Model of the biofilm structure of Thiobacillus ferrooxidans. Journal of Biotechnology 10: 51.

Karel, S.F., Libicki, S.B., Robertson, C.R. 1985. The immobilization of whole cells: engineering principles. Chemical Engineering Science 40: 1321.

Kasten, F.H. 1993. Introduction to fluorescent probes: properties, history and applications. In: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Ed. Mason, W. T. London, U.K.: Academic Press Limited 12.

Klopper, W.J. 1974. Wort composition, a survey. European Brewery Convention Monograph I. Wort Symposium, Zeist 8.

Korgel, B.A., Rotem, A., Monbouquette, H.G. 1992. Effective diffusivity of galactose in calcium alginate gels containing immobilized Zymomonas mobilis. Biotechnology Progress 8:

111.

Kreger-Van Rij. N. 1984. The Yeasts: A Taxonomic Study. Amsterdam: Elsevier Science

Publishers B.V.

Kronlof, J., Virkajärvi, I. 1996. Main fermentation with immobilized yeast - pilot scale.

Proceedings of the European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlin 94.

Kunze, W. 1996. Technology Brewing and Maiting. Berlin: VLB.

Kuriyama, H., Ishibashi, H., Umeda, I.M.T., Kobayashi, H. 1993. Control of yeast flocculation activity in continuous etanol fermentation. Journal of Chemical Engineering Japan 26(4): 429. Kurosawa, H., Matsamura, M., Tanaka, H. 1989. Oxygen diffusivity in gel beads containing viable cells. Biotechnology andBioengineering 34: 926.

Kurosawa, H., Tanaka, H. 1990. Advances in immobilized celí culture: development of a coinnnobilized mixed culture systém of aeróbic and anaeróbic micro-organisms. Process Biochemistry International 25: 189.

Kurtzman, C.P., Fell, J.W. 1998. The Yeasts, A Taxonomic Study, Fourth Edition. Amsterdam: Elsevier 361.

Kyung, K.H., Gerhardt, P. 1984. Continuous production of etanol by yeast immobilized in a membrane-contained fermentor. Biotechnology and Bioengineering 26: 252.

Lee, S.S., Robinson, F.M., Wang, H.Y. 1981. Rapid determination of yeast viability. Biotechnology and Bioengineering Symposium No. 11, Gatlingburg, USA 641.

Lentini, A. 1993. A review of the various methods available for monitoring the physiological status of yeast: yeast viability and vitality. Ferment 6: 321.

Lentini, A.. Takis, S., Hawthome, D.B., Kavanagh, T.E. 1994. The influence of trúb on fermentation and flavour development. Proceedings of the 23^rd Convention of the Inštitúte of Brewing (Asia Pacific Section), Sydney 89.

Leudeking. R. 1967. Fermentation process kinetics. In: Biochemical and Biological Engineering, Ed. Blakebrough, N., London: Academic Press, Inc. 203.

Leudeking, R., Piret, E.L. 1959. A kinetic study of the lactic acid fermentation. Journal of Biochemical and Microbiolial Technology and Engineering 1: 393.

Lewandowski, Z., Altobelli, A., Fukushima, E. 1993. NMR and microelectrode studies of hydrodynamics and kinetics in biofilms. Biotechnology Progress 9: 40.

Lewandowski. Z., Stoodley, P., Altobelli, S. 1995. Experimental and conceptual studies on mass transport in biofilms. Water Science Technology 31: 153.

Lewis. M.. Young, T. 1995. Brevdng. London: Chapman and Halí.

Li, J., Humphrey, A.E. 1991. Use of fluorometry for monitoring and control of a bioreactor. Biotechnology’ and Bioengineering 37: 1043.

Lim, H.-S., Han, B.-K., Kim, J.-H., Peshwa, M.V, Hu, W.-S. 1992. Spadal distribution of mammalian cells grown on macroporous microcarriers with improved attachment kinetics. Biotechnology Progress 8: 486.

Linko, M., Virkajarvi, I., Pohjala, N. 1996. Effect of flocculation characteristics on immobilized yeast performance. European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlín 102.

Lloyd, D., Moran, C.A., Suller, M.T.E., Dinsdale, M.G. 1996. Flow cytometric monitoring of rhodamine 123 and a cyanine dve uptake by yeast during cider fermentation. Journal of

Inštitúte of Brewing 102: 251.

Lundberg. P., Kuchel, P.W. 1997. Diffusion of solutes in agarose and alginate gels: ’H and ²³Na PFGSE and ²³Na TQF NMR studies. Magnetic Resonance in Medicíne 37: 44.

Margaritis, A., te Bokkel, D.W., El Kashab, M. 1987. Repeated batch fermentation of etanol using immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae in a fluidized bioreactor systém. In: Biological Research on Industrial Yeasts, Ed. Stewart, G.G., Russell, L, Klein, R.D., Hiebsch, R.R., Boca Raton: CRC Press 121.

Margaritis, A., Wallace, J.B. 1982. The use of immobilized cells of Zymomonas mobilis in a novel fluidized bioreactor to produce etanol. Biotechnology and Bioengineering Symposium 147.

Margaritis, A., Wilke, C.R. 1978a. The rotorfermentor. Part I: description of the apparatus, power requirements, and mass transfer characteristics. Biotechnology and Bioengineering 20: 709.

Margaritis, A., Wilke, C.R. 1978b. The rotorfermentor. Part II: application to etanol fermentation. Biotechnology and Bioengineering 20: 727.

Marrs, W.M. 1998. The stability of carrageenans to processing. In: Gums and Stabilizers for the Food Industry 9, Cambridge: Royal Society of Chemistry, 218: 345.

Martens, F.B., Egberts, G.T.C., Kempers, J., Robles de Medina, M.H.L., Welton, H.G. 1986. European Brewing Convention Monograph XII, Symposium on Brewing Yeast, Helsinki 339. Masschelein, C.A. 1990. Yeast metabolism and beer flavour. Proceedings of the Third Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling 103.

Masschelein, C.A., Carlier, A., Ramos-Jeunehomme, C., Abe, I. 1985. The effect of immobilization on yeast physiology and beer quality in continuous and discontinuous systems. Proceedings of the 20th European Brewery Convention Congress, Helsinki 339.

Masschelein, C.A., Ramos-Jeunehomme, C. 1985. The potential of alginate immobilized yeast in brewery fermentations. Inštitúte of Brewing Central and Southern Afričan Section Proceedings ofthe Ist Scientific and Technical Convention, Johannesburg 392.

Masschelein, C.A., Vandenbussche, J. 1999. Current outlook and future perspectives for immobilized yeast technology in the brewing industry. Brewers ’ Guardian 28(4): 35.

Masters, B.R., Thaer, A.A. 1994. Real-time scanning slit confocal microscopy of the m vivo human cornea. Applied Optics 33: 695.

Meilgaard, M. 1982. Prediction of flavor differences between beers from their Chemical composition, Brygmesteren 5.

Mensour. N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkíngton. H., Russell. 1. 1996. Application of immobilized yeast cells in the brewing industry. In: Progress in Biotechnology 11. Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels, R.H., Buítelaar. R.M.., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 661.

Mensour. N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H.. Russell, I. 1997. New Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Celí Bioreactor Systems. Journal of the Institute of Brewing 103: 363.

Merchant, F.J.A. 1986. Diffusivity Characteristics of Glucose in Alginate Immobilization Matrices. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Merchant, F.J.A, Margaritis, A., Wallace, J.B. 1987. A novel technique for measuring solute diffusivities in entrapment matrices used in immobilization. Biotechnology and Bioengineering 30: 936.

Mochaba, F.M. 1997. A novel and practical yeast vitality method based on magnesium ion release. Journal of the Institute of Brewing 103: 99.

Mochaba, F., O'Connor-Cox. E.S.C., Axcell, B.C. 1998. Practical procedures to measure yeast viability and vitality prior to pitching. Journal of the American Society of Brewing Chemists 56(1): 1.

Muhr, A.H., Blanshard, J.M.V. 1982. Diffusion in gels. Polymér 23: 1012.

Mulder, M.H.V., Smolders, C.A. 1986. Continuous etanol production controlled by membráne processes. Process Biochemistry 21: 35.

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A., Mitsui, S. 1993. Beer brewing using an immobilized yeast bioreactor systém. Bioprocess Technology 16: 275.

Nakanishi, K., Onaka, T., Inoue, T. 1986. A new immobilized yeast reactor systém for rapid production of beer. Reports of the Research Laboratory of Kirin Brewing Company 13. Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984a. Kinetic study of vicinal diketónes in brewing (I) formation of total vicinal diketónes. MBAA Technical Quarterly 21(2): 73. Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984b. Kinetic study of vicinal diketónes in brewing (II) theoretical aspect for the formation of total vicinal diketónes. MBAA Technical Quarterly 21(4): 175.

Nakatani, K., Fukui, N., Nagami, K., Nishigaki, M. 1991. Kinetic analysis of ester formation during beer fermentation. Journal of the American Sociely ofBrewing Chemists 49(4): 152. Narzip, L., Miedaner, H., Graf, P., Eichhom, P., Lustig, S. 1993. Technological approach to improve flavour stability. MBAA Technical Quarterly 30: 48.

Nava Saucedo, J.E., Roisin, C., Barbotin. J.-N. 1996. Complexity and heterogeneity of microenvironments in immobilized Systems. Progress in Biotechnology 11. Immobilized Cells: Basics and Applications, Noordwijkerhout 39.

Nedovic, A.N., Vunjak-Novakovc. G., Leskosek-Cukalovic, I., Cutkovic, M. 1996. A study on considerably accelerated fermentation of beer using an airlift bioreactor witb calcium alginate entrapped yeast cells. Fifth World Congress of Chemical Engineering 2: 474.

Neufeld, R. J.. Poncelet, D.J., Norton, S.D. 1996. Application for Canadian Patent No. 2133789.

Norton, S., D'Amore, T. 1994. Physiological effects of yeast celí immobilization: applications for brewing. Enzýme and Microbial Technology 16: 365.

Norton, S., Watson, K., D'Amore, T. 1995. Etanol tolerance of imrnobilized brewer's yeast cells. Applied Microbiology and Biotechnology 43: 18.

O'Connor-Cox, E., Mochaba, F.M., Lodolo, E.J., Majara, M., Axcell, B. 1997. Metylene blue staining: use at your own risk. MBAA Technical Quarterly 34(1): 306.

O'Reilly. A.M., Scott, J.A. 1995. Defined coimmobilization of mixed microorganism cultures. Enzýme and Microbial Technology' YT. 636.

Okazaki, M., Hamada, T., Fujji, H., Mizobe, A., Matsuzawa, S. 1995. Development of poly(vinyl alcohol) hydrogel for waste water cleaning. I. Study of poly(vinyl alcohol) gel as a carrier for immobilizing organisms. Journal of Applied Polymér Science 58: 2235.

Oldshue, J.Y., Herbst, N.R. 1992. A Guide to Fluid Mixing. New York: Lightnin.

Opekarova, M., Sigler, K. 1982. Acidification power: indicator of metabolic activity and autolytics changes in Saccharomyces cerevisiae (yeast). Fólia Microbiologia 27: 395.

0vaas. J.. Storro, I., Svendsen, H.. Levine, D.W. 1995. The effective diffusion coefficient and the distribution constant for small molecules in calcium-alginate gel beads. Biotechnology' and Bioengineering 47: 492.

Paiva. T.C.B., Sato, S., Visconti, A.E.S., Castro, L.A.B. 1996. Continuous alcoholic fermentation process in a tower reactor with recycling of flocculating yeast. Applied Biochemistry and Biotechnology 57-58(0): 55.

Pajunen, E., Makinen, V., Gisler, R. 1987. Secondary fermentation with immobilized yeast. European Brewery Convention Congress, Madrid 441.

Parascandola, P, de Alteriis, E. 1996. Pattem of growth and respirátory activity of

Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) cells growing entrapped in an insolubilized gelatin gel. Biotechnology and Applied Biochemistry 23: 7.

Perry. R.H., Green, D.W. 1984. Perry's Chemical Engineers' Handbook. New York: McGrawHill Book Company.

Pilkington, P.H.. Margaritis, A., Mensour, N.A. 1998a. Mass transfer characteristics of immobilized cells used in fermentation processes. Critical Reviews in Biotechnology 18(2 & 3): 237.

Pilkington. P.H., Margaritis, A.. Mensour, N.A., Russell. I. 1998b. Fundamentals of immobilized yeast cells for continuous beer fermentation: a review. Journal of the Institute of Brewing 104: 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobczak, J., Hancock, L, Russell, I. 1999. Kappacarrageenan gel immobilization of láger brewing yeast. Journal of the Institute of Brewing 105(6): 398.

Polson. A. 1950. Some aspects of diffusion in solution and a definition of a colloidal particle. Journal of Physical and Colloidal Chemistry 54: 649.

Power, D.A., McCuen, P.J. 1988. Manual of BBL® Products and Laboratory Procedures, Sixth Edition. Maryland: Becton Dickinson Microbiology Systems 249.

Priest. F.G., Campbell, I. 1996. Brewing Microbiology/ 2nd EdUK: Chapman and Halí.

Rees, D.A. 1972. Polysaccharide gels: a molecular view. Chemistry and Industry 19: 630.

Roca, E., Camesselle, C., Nunez, M. 1995. Continuous etanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae immobilised in Ca-alginate beads hardened with Al³⁺. Biotechnology Letters 9; 815. Roukas, T. 1994. Continuous etanol production from carob pod extract by immobilized Saccharomyces cerevisiae in a packed-bed reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 59: 387.

Russell, I., Stewart, G.G. 1992. Contribution of yeast and immobilization technology to flavour development in fermented beverages. Food Technology 148.

Ryder, D.S. 1985. The growth process of brewing yeast and the biotechnological challenge. MBAA Technical Quarterly 22: 124.

Ryu. D.D.. Kim, Y.J., Kim, J.H. 1984. Effect of air supplement on the performance of continuous etanol fermentation systém. Biotechnology and Bioengineering 26: 12.

Salmon. P.M., Robertson, C.R. 1987. Mass transfer limitations in gel beads containing growing immobilized cells. Journal ofTheoretical Biology 125: 325.

Schumpe, A., Quicker, G., Deckwer, W.-D. 1982. Gas solubilities in microbial culture média. Advances in Biochemical Engineering 24: 1.

Shindo, S.. Sahara, H., Koshino, S. 1994. Suppression of alpha-acetolactate formation in brewing with immobilized yeast. Journal of the Inštitúte of Brewing 100: 69.

Smart. K.A. 1995. The importance of the brewing yeast celí wall. Brewers’ Guardian 124(4): 44.

Smart, K.A. 1999. Ageing in brewing yeast. Brewers’ Guardian 19.

Smart, K.A., Chambers, K.M., Lambert, I., Jenkins, C. 1999. Use of metylene violet procedures to determine yeast viability and vitality. Journal of the American Society of Brewing Chemists 57(1):18.

Sharpe. F.R. 1988. Assessment and control of beer flavour. Journal of the Inštitúte of Brewing 95: 301.

Stewart, G.G. 1977. Fermentation - yesterday, today and tomorrow. MBAA Technical Quarterly 14: 1.

Stewart, G.G., Russell, I. 1986. The relevance of the flocculation properties of yeast in today's brewing industry. European Brewery Convention Symposium on Brewers' Yeast, Helsinki 53. Stewart, G.G., Lyness, A., Younis, O. 1999. The control of ester synthesis during wort fermentation. MBAA Technical Quarterly 36(1): 61.

Takahashi. S. and Kimura, Y. 1996. Effect of main fermentation parameters on stále flavour. Brauwelt International 14 (3): 253.

Taylor, D.G. 1989. Influence of brewhouse practice on wort composition. Brewer's Guardian 118(2): 30.

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (ASBC). 1992. Methods of Analysis. 8^th Edition. Minnesota: ASBC.

Uttamlal, M., Walt, D.R. 1995. A fiber-optic carbon dioxide sensor for fermentation monitoring. Biotechnology 13: 597.

Venäncio, A., Teixeira, J.A. 1997. Characterization of sugar diffusion coefficients in alginate membranes. Biotechnology Technicpies 11: 183.

Vilachá, C., Uhlig, K. 1985. The measurement of low levels of oxygen in bottled beer. Brauwelt International 70.

Virkajärvi. T, Kronlóf, J. 1998. Long-term stability of immobilized yeast columns in primary fermentation. Journal ofthe American Society of Brewing Chemists 56(2): 70.

Vives. C., Casas. C., Gôdia, F., Solä, C. 1993. Determination of the intrinsic fermentation kinetics of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized in calcium alginate beads and observation on their growth. Applied Microbiology and Biotechnology 38: 467.

Wada, M., Kato, J., Chibata, I. 1979. A new immobilization of microbial cells. European

Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 8: 241.

Wang. H.Y.. Lee. S.S., Takach, Y., Cawthon, L. 1982. Maximizing microbial celí loading in immobilized-cell systems. Biotechnology andBioengineering Symp. No. 12 139.

Westrin, B.A., Axelsson, A. 1991. Diffusion in gels containing immobilized cells: a critical review. Biotechnology and Bioengineering 38: 439.

Wheatcroft, R., Lim, Y.M., Hawthome, D.B., Čiarke, B.J., Kavanagh. T.E. 1988. An assessment of the use of špecific oxygen uptake measurements to predict the fcrmentaion perťormance of brewing yeasts. The Inštitúte of Brewing (Austrália and New Zealand Section) Proceedings ofthe Twentieth Convention , Brinsbane 193.

White. F.H., Portno, A.D. 1978. Continuous fermentation by immobilized brewers yeast. Journal of the Inštitúte of Brewing 84: 228.

Wijffels, R.H., de Gooijer, C.D., Schepers, A.W., Tramper, J. 1996. Immobilized-cell growth: diffusion limitation in expanding micro-colonies. In: Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels. R.H., Buitelaar, R.M... Bucke, C., Tramper, J.. Amsterdam: Elsevier Science 249.

Wijffels, R.H.. Englund, G., Hunik, J.H., Leenen, J.T.M., Bakketun, A. et al. 1995. Effects of diffusion limitation on immobilized nitrifying microorganisms at low temperatures. Biotechnology and Bioengineering 45: 1.

Aivasidis, A., 1996. Another Look at Immobilized Yeast Systems. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 27.

Aivasidis, A., Wandrey, C., Eils, H.-G. & Katzke, M., 1991. Continuous Fermentation of Alcohol-Free Beer with Immobilized Yeast in Fluidized Bed Reactors. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Lisbon, 1991, 569.

Akiyama-Jibiki, M., Ishibiki, T., Yamashita, H. & Eto, M., 1997. A Rapid and Simplc Assay to Measure Flocculation in Brewer’s Yeast. Master Brewers of the Americas Technical Quarterly, 34, 278.

Alfa Laval Brewery Systems. 1997. Immobilized Yeast System Reduces Maturation Time. Brewers' Guardian. 126, 26.

Alfa Laval Brewery Systems, 1996. Continuous Maturation of Beer with Immobilized Veast, Company Report.

Al Taweel, A.M. & Walker, L.D., 1983. Liquid Dispersion in Státie In-line Mixers. Canadian

Journal of Chemical Engineering, 61, 527.

Andries, M., Derdelinckx, G., lone, K.G., Delvaux, F., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A.,

1997a. Zeolites as Catalysts for the Cold and Direct Conversion of Acetolactate into Acetoin.

Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Maastricht, Poster 48.

Andries. M., Van Beveren. P.C., Goffin. O. & Masschelein, C.A.. 1995. Design of a MultiPurpose Immobilized Yeast Bioreactor System for Application in the Brewing Process. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry. Espoo, Finland, 134.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O. & Masschelein, C.A., 1996a. Design and Application of an Immobilized Loop Bioreactor for Continuous Beer Fermentation. in Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels, R.M. Buitelaar. C. Bucke & J. Tramper. eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 672.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1996b. Design and Applications of an Immobilized Loop Bioreactor to the Continuous Fermentation of Beer. Proceedings ofthe 6^,h International Brewing Technology Conference, Harrogate, 380.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997b. Practical Results Using the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentation System. Brenvery' Guardian. 26.

Andries, M.. Van Beveren, P.C.. Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997c. First Results on Semi-Industrial Continuous Fermentation with the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentor. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 34, 119.

Argiriou, T., Kanellaki, M., Voliotis, S. & Koutinas, A.A., 1996. Kissiris-Supported Yeast Cells: High Biocatalyic Stability and Productivity Improvement by Successive Preservatives at 0 °C. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 4028.

Audet, P. & Lacroix, C., 1989. Two Phase Dispersion Process for the Production of Biopolymer Gel Beads: Effects of Barious Parameters on Bead Size and theír Distribution. Process Biochemistry, 24, 217.

Axelsson, A. & Persson, B., 1988. Determination of Effective Diffusion Coefficients in Calcium Alginate Gel Plates with Varying Yeast Celí Content. Applied Biochemistry and Biotechnology, 18, 231.

Bardi, E.P., Koutinas, A.A., Soupioni, M.J. & Kanellaki, M.E., 1996. Immobilization of Yeast on Delignified Cellulosic Materiál for Low Temperature Brewing. Journal of Agriculture and

Food Chemistry, 44, 463.

Berkman, P, D. & Calabrese, R, V., 1988. Dispersion of Viscous Liquids by Turbulent Flow in a Státie Mixér. American Institute of Chemical Engineering Journal. 34, 602.

Borremans, E., 1997. Secondary Fermentation of Beer with Immobilized Yeast. C'erevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 33.

Bower, J.L. & Christensen, C.M., 1995. Disruptive Technologies: Catching the Wave. Harvard Business Review, 73, 43.

Breitenbiicher, K. & Mistler, M., 1995. Fluidized Bed Fermenters for the Continuous Production of Non-Alcoholic Beer with Open-Pore Sintered Glass Carriers. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 77.

Brewers Association of Canada, 1988. About Beer And The Brewing Industry, Ottawa, Ontario. Broderick, Harold M., 1979. The Practical Brewer: A Manual for the Brewing Industry, 2nd Ed. Impressions Inc., Wisconsin.

Burns. J. A., 1937. Journal of the Institute of Brewing. 43, 31.

Calleja. G.B. & Johnson, B.F., 1977. A Comparison of Quantitative Methods for Measuring Yeast Flocculation. Canadian Journal ofMicrobiology, 23. 68.

Carberry, J.J., 1976. Chemical and Catalytic Reaction Engineering, McGraw-Hill.

Carberry, J.J. & Varma, A., 1987. Chemical Reaction and Reactor Engineering, Marcel Dekker Inc., New York.

Cashin, M.-M., 1996. Comparative Studies of Five Porous Supports for Yeast Immobilization by Adsorption/Attachment. Journal of the Institute of Brewing, 102, 5.

Champagne, C.P., 1994. OverView: Immobilized Celí Technology in Food Processing. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV, Quebec, Canada, 33.

Chang, C.M., Lu, W.J., Own, K.S. & Hwang, S.J., 1994. Comparison of Airlift and Stirred Tank Reactors for Immobilized Enzýme Reactions. Process Biochemistry, 29, 133.

Chao, X., Ye, G. & Shi, S., 1990. Kinetic Study of the Continuous Fermentative Process of Green Beer Production with Immobilized Yeast. Huagong Jixie, 17, 18.

Chibata, I., 1979. Immobilized Microbial cells with Polyacrylamide Gel and Carrageenan and their Industrial Applications. American Chemical Society Šerieš, 106, 187.

Chisti, M.Y., 1991. Airlift Bioreactors, Elsevier Applied Science, New York.

Chisti, Y. & Moo-Young, M., 1993. Improve the Performance of Airlift Reactors. Chemical Engineering Progress, 6, 38.

Chladek. L., Voborsky, J., Sima, J. & Hosek, Z., 1989. Prumysl Potravín, 40, 590.

Coe. H.S. & Clevenger, G.H., 1916. Methods for Determining the Capacities of Slime Thickening Tanks. Transcripst of the American Inštitúte of Mechanical Engineering, 55, 356. Curin. J.. Pardonova. B., Polednikova, M., Sedova, H. & Kahler, M., 1987. Beer Production with Immobilized Yeast. Proceedings of the European Brewery Convention, Madrid, 433. Decamps, C. & Norton, S., 1994. New Emulsion Process using Státie Mixér for the Production of κ-Carrageenan Gel Beads. Labatt Breweries of Canada Intemal Report.

Del Pozo, M., Briens, C.L. & Wild, G., 1994. Effect of Liquid Coalescing Properties on Mass Transfer, Heat Transfer and Hydrodynamics in a Three-Phase Fluidized Bed. The Chemical Engineering Journal, 55, 1.

Dillenhofer, W. & Ronn, D., 1996a. Alfa Laval/Schott System of Secondary Fermentation w'ith Immobilized Yeast. Brewing & Distilling International, 27, 35.

Dillenhofer, W. & Ronn, D.. 1996b. Secondary Fermentation of Beer With Immobilized Yeast. Brauwelt International, 14, 344.

Dillenhoffer, W. & Ronn, D., 1996c Continuous Maturation of Beer. Beverage World International, 34.

Domény. Z.. Smogrovicova, D., Gemeiner, P., Malovikova, A. & Sturdik, E., 1996. Calcium Pectate Gel to Immobilize Yeast for Continuous Beer Production. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group V, Potsdam, Germany, Poster 12.

Domingues, L.. Lima, N. & Teixeira, J.A., 2000. Contamination of a High-Cell-Density Continuous Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, 68, 584.

Donnelly, D., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Master Brewers Association of the Americas Annual Convention, Minneapolis, Poster 8.

Donnelly. D., Bergin. J., Gardiner, S. & Cahill, G., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36. 183.

Dulieu. C.. Boivin, P,, Malanda, M., Dautzenberg, H. & Poncelet, D., 1997. Encapsulation of α-Acetolactate Decarboxylase to Avoid Diacetyl Formation. Proceedings of the European

Brewery Convention Congress. Maastricht, Poster 44.

Duncombe, D., Bower, P., Bromberg, S., Fehring, J., Lau, V. & Tata, M., 1996. The

Contribution of Free Cells in an Immobilized Yeast System. Journal of the American Society of

Brewing Chemists, Poster Presentation.

Dziondziak. K. & Seiffert, T., 1995. Process for the Continuous Production of Alcohol-Free

Beer. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Bnissels, 301.

Enari, T.-M., 1995. State of the Art of Brewing Research. Proceedings of the European Brewery Convention Congress. Bnissels, 1.

Fix, G., 1989. Principles of Brewing Science. Brewers Publications, USA.

Fouhy, K. & Parkinson. G., 1996. Brewers Break with Tradition. Chemical Engineering, 103, 45.

Gil, G.H., 1991. Continuous Etanol Production in a Two-Stage, Immobilized and Suspended Celí Bioreactor (Alcohol Dehydrogenase). Ph.D. Thesis, Georgia Inštitúte of Technology. Gilliland, R.B., 1951. The Flocculation Characteristics of Brewing Yeasts During Fermentation. Proceedings of the European Brewing Convention, 8, 35.

Groboillot, A.. D.K. Boadi, D. Poncelet & Neufeld, R.J., 1994. Immobilization of Cells for Application in the Food Industry. Critical Reviews in Biotechnology, 14, 75.

Haikara, A., Virkajarvi, I., Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Microbial Contaminations in Immobilized Yeast Bioreactors for Primary Fermentations. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 439.

Heggart. H.M., Margaritis, A., Pilkington, H., Stewart, R.J., Dowhanick, T.M. & Russell, I., 1999. Factors Affecting Yeast Viability and Vitality Characteristics: A Review. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36, 383.

Heijnen, J.J., Mulder, A., Enger, W. & Hoeks, F., 1989. Review on the Application of Anaeróbic Fluidized Bed Reactors in Waste-Water Treatment. The Chemical Engineering Journal, 41, B 37.

Heijnen, J.J., Mulder, A., Weltevrede, R., Hols, J. & van Leeuwen, H.L.J.M., 1991. Large Scale Anaeróbic-Aeróbic Treatment of Complex Industrial Waste-Water Using Biofilm Reactors. [Páter Science Technology, 23, 1427.

Heijnen, J.J., Van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R.W.R. & Mulder, A., 1993. Development and Scale-Up of an Aeróbic Biofilm Air-Lift Suspension Reactor. Water Science Technology’. 27, 253.

Helm, E., Nohr, B. & Thome, R.S.W., 1953. The Measurement of Yeast Flocculence and its Significance in Brewing. Wallerstein Laboratories Communications, 16, 315.

Horitsu, H., Wang, M.Y. & Kawai, K., 1991. A Modified Process for Soy Sauce Fermentation by Immobilized Yeasts. Agricultural and Biological Chemistry, 55, 269.

Flryclik, Kevin, Gerry Ginter, Jim Helmke, & Jim Spiers, 1987. The How’s And Why’s of Brewing, Revision #2, LBOC.

Hunik. J.H., Tramper, J. & Wijffels, R.H., 1994. A Strategy to Scale Up Nitrification Processes with Immobilized Cells of Nitrosomonas eitropaea and Nitrobacter agilis. Bioprocess Engineering, 11.73.

Hwang, S.-J. & Fan, L.-S., 1986. Some Design Considerations of a Draft Tube Gas-LiquidSolid Spouted Bed. The Chemical Engineering Journal, 33, 49.

Hyttinen, I.. Kronlof, J. & Hartwall, P., 1995. Use of Porous Glass at Hartwall Brewery in the Maturation of Beer with Immobilized Yeast. European Brewery Convention Symposinm: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 55.

Ibrahim, Y.A.A., Briens, C.L., Margaritis, A. & Bergougnou, M.A., 1996. Hydrodynamic Characteristics of a Three-Phase Inverse Fluidized Bed Column. Journal of the American Inštitúte of Chemical Engineering, 42, 1889.

Inoue, T., 1995. Development of a Two-Stage Immobilized Yeast Fermentation System for Continuous Beer Brewing. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Briissels, 25.

Iserentant. D.. 1995. Beers: Recent Technological Innovations in Brewing. Fermented Beverage Production. (A.G.H. Lea & J.R. Piggott, eds.) London: Chapman & Halí, 45.

Kaplan, R.S. & Norton, D.P., 1996. The Balanced Scorecard. President and Fellows of Harvard College. Harvard Business School Press, Massachusetts, USA.

Karamanev, D.G., Nagamune, T. & Endo, I., 1992. Hydrodynamic and Mass Transfer Study of a Gas-Liquid-Solid Draft Tube Spouted Bed Bioreactor. Chemical Engineering Science, 47, 3581.

Karel, S.F., Libicki, S.B. & Robertson, C.R., 1985. The Immobilization of Whole Cells: Engineering Principles. Chemical Engineering Science, 40, 1321.

Katzbauer, B.. Narodoslawsky, M. & Moser, A., 1995. Classification System for Immobilization Techniques. Bioprocess Engineering, 12, 173.

Kennard. M. & Janekeh, M., 1991. Two- and Three-Phase Mixing in a Concentric Draft Tube Gas-Lift Fermentor. Biotechnology and Bioengineering, 38, 1261.

Kolot. F.B., 1988. Immobilized Microbial Systems: Principles, Techniques and Industrial Applications. Róbert E. Krieger Publishing Company, Florida.

Kolpachki, A.P., Isaeva, V.S., Kazantsev, E.N. & Fertman, G.I., 1980. Intensification of Wort

Fermentation with Immobilized Yeasts. Fermentnaya ISpirtovaya Promyshlennost, 9.

Krikilion, Ph., Andries, M., Goffin, O., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1995. Optimal

Matrix and Reactor Design for High Gravity Fermentation with Immobilized Yeast.

Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 419.

Kronlof, J., 1994. Immobilized Yeast in Continuous Fermentation of Beer. Ph.D. Thesis, VTT Publications. 167.

Kronlof, J., Linko, M. & Pajunen, E., 1995. Primary Fermentation with a Two-Stage Packed Bed System Pilot Scale Experiences. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 118.

Kronlof, J. & Virkajarví, I., 1996. Main Fermentation with Immobilized Yeast - Pilot Scale European Brewery Convention Brewing Science Group Bulletin, Zoeterwoude, 94.

Kronlof, J., Virkajarví, I., Storgards, E.L., Londesborough, J. & Dymond, G., 2000. Combined Primary and Secondary Fermentation with Immobilized Yeast. World Brewing Congress, Poster #56.

Ku, W.Y., 1982. Fermentation Kinetics for the Production of Etanol by Immobilized Yeast Cells (Biomass). Ph.D. Thesis, The Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College.

Kunze, W.. 1999. Technology Brewing and Malting. VLB Berlín, Germany.

Kynch, G. J., 1952. Transcripts of the Faraday Society, 48, 166.

Lacroix, C., Paquin, C. & Arnaud, J.P., 1990. Batch Fermentation with Entrapped Growing Cells of Lactohacillus casei: Optimization of the Rheological Properties of the Entrapment Gel Matrix. Applied Microbiology and Biotechnology, 32, 403.

Levenspiel, O., 1972. Chemical Reaction Engineering. John Wiley & Sons, New York.

Linko, M., Virkajarví, I., Pohjala, N., Lindborg, K., Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Main Fermentation with Immobilized Yeast - A Breakthrough?. Proceedings of the European Brewery Convention, Maastricht, 385.

Livingston. A.G. & Chase, H.A., 1990. Liquid-Solid Mass Transfer in a Three Phase Draft Tube Fluidized Bed Reactor. Chemical Engineering Communications, 92, 225.

Livingston, A.G. & Zhang, S.F., 1993. Hydrodynamic Behaviour of Three-Phase (Gas-LiquidSolid) Airlift Reactors. Chemical Engineering Science, 48, 1641.

Lommi. H., 1990. Immobilized Yeast for Maturation and Alcohol-Free Beer. Brewing and Distilling International, 21, 23.

Lommi, H., Gronqvist, A., & Pajunen, E., 1990. Immobilized Yeast Reactor Speeds Beer Production. Food Technology, 5,128.

Lorenzen, K., 1996. Immobilized Yeast Plants for Alcohol-Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Singapore, 244.

Maeba, H.. Umemoto, S., Sato, M. & Shinotsuka, K., 2000. Primary Fermentation with Yeast Immobilized in Porous Chitosan Beads - Pilot Scale Trial. Proceedings of the 26^th Convention of the Inštitúte of Brewing - Asia Pacific Section, 82.

Mafra, L, Machado Cruz, J.M. & Teixeira, J.A., 1997. Beer Maturation in a Continuously Operating Bioreactor using a Flocculating Brewer’s Yeast Strain. Proceedings of the European Brewery Convention, 509.

Maiorella, B.L., 1983. Fermentative Etanol Production (Alcohol, Distillation, Economics). Ph.D. Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., 1975. A Study of the Rotorfermentor and the Kinetics of Etanol Fermentation. Ph.D. Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., & Bajpai, P., 1982a. Continuous Etanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part I. Use of Free Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology' and Bioengineering, 24, 1473.

Margaritis, A., & Bajpai, P„ 1982b. Continuous Etanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part II. Use of Immobilized Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology and Bioengineering, 24, 1483.

Margaritis, A. & Merchant, F., 1984. Advances in Etanol Production Using Immobilized Celí Systems. Critical Reviews in Biotechnology, 1, 339.

Margaritis, A. & Rowe, G.E., 1983. Etanol Production Using Zymomonas mobilis Immobilized in Different Carrageenan Gels. Developments in Industrial Microbiology, 24, 329.

Margaritis, A., te Bokkel, D. & El Kashab, M., 1987. Repeated Batch Fermentation of Etanol Using Immobilized Cells of Saccharomyces cerevisiae in a Fluidized Bioreactor Systesm. Biological Research on Industrial Yeasts. Volume I, (G.G. Stewart, I. Russell, R.D. Klein & R.R. Hiebsch, eds.) Boca Raton: CRC Press, 121.

Margaritis, A. & Wallace, J.B., 1982. The Use of Immobilized Cells of Zymomonas mobilis in a Novel Fluidized Bioreactor to Produce Etanol. Fourth Symposium on Biotechnology in Energy' Production and Conservation, Gatlinburg, Tennessee, 12, 147.

Margaritis. A. & Wallace, J.B., 1984. Novel Bioreactor Systems and their Applications. Bio/Technology, 2, 447.

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978a. The Rotorfermentor. Part I: Description of the Apparatus, Power Requirements, and Mass Transfer Characteristics. Biotechnology & Bioengineering, 20. 709.

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978b. The Rotorfermentor: Part II: Application to Etanol Fermentation. Biotechnology & Bioengineering, 20, 727.

Masschelein. C.A.. 1997. A Realistic View on the Role of Research in the Brewing Industry Today. Journal of the Inštitúte of Brewing, 103, 103.

Masschelein, C.A., 1994. State-of-the-Art and Future Developments in Fermentation. Journal ofthe American Society of Brewing Chemists, 52, 1.

Masschelein. C.A. & Andries, M., 1996a. The Meura-Delta Immobilised Yeast Fermenter for the Continuous Production of Beer. Cerevisia Belgian Journal ofBrewing d Biotechnology, 21, 28.

Masschelein, C.A. & Andries, M., 1996b. Meura-Delta’s Immobilized Yeast Fermenter for Continuous Beer Production. Brewing & Dislilling International, 27, 16.

Masschelein. C.A., Andries, M., Franken, F., Van de Winkel, L. & Van Beveren, P.C., 1995. The Membráne Loop Concept: A New Approach for Optimal Oxygen Transfer into High Celí Density Pitching Yeast Suspensions. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 377.

Masschelein. C.A., Ryder, D.S. & Šimon, J-P., 1994. Immobilized Celí Technology in Beer Production. Critical Reviews in Biotechnology, 14, 155.

Matsuura, K., Hirotsune, M., Nakada, F. & Hamachi, M., 1991. A Kinetic Study on Continuous Sake Fermentation. Hakkokogaku Kaishi, 69, 345.

McCabe, J.T., 1999. The Practical Brewer: A Manual for the Brewing Industry. Master Brewers Association of the Americas, USA.

Mensour, N.A.. Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1997. New Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Celí Bioreactor Systems. Journal of the Inštitúte ofBrewing, 103, 363.

Mensour. N.A.. Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1996. Application of Immobilized Yeast Cells in the Brewing Industry. Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels. R.M. Buitelaar, C. Bucke & J. Tramper, eds.) Amsterdam: EIsevier Science, 661.

Mensour, N., Margaritis. A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1995. Gas Lift Systems for Immobilized Celí Fermentation. European Brewery Convention Symposium: Immobilized

Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland. 125.

Mensour, N., Margaritis, A., Russell, I., Briens, C.L., Decamps, C. & Norton, S., 1994. Beer Production with Immobilized Yeast Cells in a Pilot Plánt Scale Airlift Reactor. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV, Ouebec, Canada, 49.

Middleman, S.. 1974. Drop Size Distributions Produced by Turbulent Pipe Flow of Immiscible Fluids Through a Státie Mixér. Industrial Engineering and Chemical Process Design and Development, 13, 78.

Mieth, H.O., 1995. Immobilized Yeast Plants for Alcohol Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Vietor ia Falls, 166.

Mistler, M., Breitenbiicher, K. & Jaeger, R.. 1995. Continuous Fermentation of Beer with Yeast Immobilized on Porous Glass Carriers. Brewers Digest, 70. 48.

Moli, M. & Duteurtre, B., 1996. Fermentation and Maturation of Beer with Immobilized Microorganisms. Brauwelt International, 3, 248.

Motai, H., Hamada, T. & Fukushima, Y., 1993. Application of a Bioreactor System to Sov Sauce Production. in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 315.

Muhr, A.H. & Blanchard, M.V., 1982. Diffusion in Gels. Polymér, 23, 1012.

Mwesigye, P.K & Barford, J.P., 1994. Transport of Sucrose by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 77. 687.

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A. & Mitsui, S., 1993. Beer Brewing Using an immobilized Yeast Bioreactor System, in Industrial Applications o f Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 275.

Nakanishi, K., T. Onaka, T. Inoue & Kubo, S., 1985. A New Immobilized Yeast Reactor System for Rapid Production of Beer. Proceedings of the 20th European Brewing Convention Congress, Helsinki, 331.

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K. & Kumada, J., 1984. Kinetic Study of Vicinal Diketónes in Brewing (I) Formation of Total Vicinal Diketónes. Master Brewers Association of the Americas Technical Committee, 21, 73.

Nedovic, V.A., Leskosek-Cukalovic, I. & Vunjak-Novaki, G., 1996a. Short-Time Fermentation of Beer in an Immobilization Yeast Air-Lift Bioreactor. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Singapore, 244.

Nedovic, V.A.. Vunjak-Novakovic, G., Leskosek-Cukalovic, I. & Cutkovic, M.. 1996b. A Study on Considerably Accelerated Fermentation of Beer Using an Airlift Bioreactor with Calcium Alginate Entrapped Yeast Cells. Proceedings of the 5th World Congress of Chemical Engineering, San Diego. 474.

Neufeld, R.J., Norton, S. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead

Production and a Brewing Process Utílizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells.

Canadian Patent Application 2,133,789.

Nguyen, A.L. & Luong, J.H.T., 1986. Diffusion in k-Carrageenan Gel Beads. Biotechnology and Bioengineering, 28, 1261.

Nielsen, J. & Villadsen, J., 1994. Bioreactor Modeling. Bioreaction Engineering Principles. Plénum Press, New York, 9.

Norton, S. & D’Amore, T., 1994. Physiological Effects of Yeast Celí Immobilization: Applications for Brewing. Enzýme and Microhial Technology/ 16, 365.

Norton, S., Neufeld, R.J. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead Production and a Brewing Process Utilizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells. Canadian Patent Application 2,133,789.

Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Decamps, C. & Russell, I., 1994. Pilot Scale Primary Fermentation of Beer with a Gaslift Immobilized Yeast Reactor. Proceedings of the European Brewing Convention, Sub-Committee, Dublin.

Norton, S., Watson, K. & D'Amore, T., 1995. Etanol Tolerance of Immobilized Brewers’ Yeast Cells. AppliedMicrobiology & Biotechnology, 43, 18.

Nothaft, A., 1995. The Start-Up of an Immobilized Yeast System for Secondarv Fermentation at Brahma. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 41.

Nunokawa, Y. & Hirotsune, M., 1993. Production of Soft Sake by an Immobilized Yeast Reactor System, in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 235.

Pajunen, E., 1996a. The Behaviour of Immobilized Yeast Cells. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 33.

Pajunen, E., 1996b. Immobilized System in the Brewing Industry. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Singapore, 38.

Pajunen, E., 1995. Immobilized Yeast Láger Beer Maturation: DEAE-Cellulose at Sinebrychoff. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 24.

Pajunen E. & Gronqvist A., 1994. Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Láger Beer Maturation. Proceedings for the Inštitúte of Brewing Convention, Sydney, 101.

Pajunen, E., A. Gronqvist &. Lommi, H., 1989. Continuous Secondary Fermentation and Maturation of Beer in an Immobilized Yeast Reactor. MBAA Technical Quarterly, 26, 147.

Pajunen, E., Gronqvist, A., Simonsen, B. & Lommi, H., 1994, Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Láger Beer Maturation. ALAFACE Annual Meeting, Quito, 13.

Pajunen, E., Ranta, B., Andersen, K., Lommi, H., Viljava, T., Bergin, J. & Guercia, H., 2000a.

Novel Process for Beer Fermentation with Immobilized Yeast. Proceedings of the 26^,h

Convention of the Institute of Brewing, Asia-Pacific Section, 91.

Pajunen, E., Viljava. T. & Lommi, H., 2000b. Novel Primary Fermentation with Immobilzied Yeast System. World Brewing Congress, Oral presentation.

Paul, F. & Vignais, P.M., 1980. Photophosphorylation in Bacterial Chromatophores Entrapped in Alginate Gcl: Improvement of the Physical and Biochemical Properties of Gel Beads with Bárium as Gel-Inducing Agent. Enzýme andMicrobial Technology, 2, 281.

Peach, M., 1996. Fermenting Faster Pints. New Scientist, 2058, 23.

Pilkington, P.H, Margaritis, A. & Mensour, N.A., 1998a. Mass Transfer Characteristics of Immobilized Cells Used in Fermentation Processes. Critical Reviews in Biotechnology, 18, 237. Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A. & Russell, I., 1998b. Fundamentals of Immobilized Yeast Cells for Continuous Beer Fermentation: A Review. Journal of the Institute of Brewing, 104, 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobczak, J., Hancock, I. & Russell, I., 1999. Kappa-Carrageenan Gel Immobilization of Láger Brewing Yeast. Journal of the Institute of Brewing, 105, 398.

Pirt, S.J., 1975. Principles ofMicrobe and Celí Cultivation. Blackwell Scientific, Oxford.

Pittner, H. & Back, W., 1995. Continuous Production of Acidified Wort for Alcohol Free Beer Using Immobilized Lactic Acid Bacteria. Master Brewers Association of the Americas TechnicalOuarterly, 32, 163.

Pittner. H., W. Back, W. Swinkels, E. Meersman, B. van Dieren & Lommi, H., 1993.

Continuous Production of Acidified Wort for Alcohol-Free Beer Using Immobilized

Lactic Acid Bacteria. Proceedings of the 24th European Brewing Convention Congress, Oslo, 323.

Polednikova. M., Sedova, H. & Kahler, M., 1981. Immobilized Brewing Yeast. Kvasný Prumysl, 27, 193.

Poncelet, D., Lencki, R., Beaulieu, C., Halle, J, P., Neufeld, R. J. & Foumier, A., 1992. Production of Alginate Beads by Emulsification/Internal Gelation. Applied Microbiology & Biotechnology, 38, 39.

Poncelet, D., Poncelet de Smet, B,. Beaulieu, C. & Neufeld, R. J., 1993. Scale Up of Gel Bead and Microcapsule Production in Celí Immobilization. in Fundamentals of Ani mal Celí Encapsulation and Immobilization, Goosen, M.F.A., Ed., CRC Press Inc., Boca Raton, Florida. Prakash, A., Briens, C.L. & Bergougnou, M.A., 1987. Mass Transfer Between Solid Particles and Liquid in a Three Phase Fluidized Bed. The Canadian Journal of Chemical Engineering. 65, 228.

Prasad, K.Y. & Ramanujam, T.K.. 1995. Overall Volumetric Mass Transfer Coeffícient in a Modified Reversed Flow Jet Loop Bioreactor with Low Density Particles. Bioprocess Engineering, 12, 214.

Pritchett, Price. 1993. Culture Shift. Texas: Pritchett & Associates, Inc.

Que, F., 1993. Using a Thread Type of Alginate Gel Particles as Cell-Immobilised Support and Some Concept of Packed Bed Fermenter Design. Biotechnology Techniques, 7, 755.

Rajotte, P., 1998. Continuous Fermentation with Immobilized Yeast Cells. American Brewer, 76, 42.

Rajotte, P., 1997. Jumping into the Next Millenium Canadian Style. American Brewer, 75,42. Russell, I., Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A. & Briens, C., 1995. Immobilized Yeast Cells: Applications for Brewing. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Victoria Ealls. 159.

Ryder, D.S. & Masschelein, C.A., 1985. The Growth Process of Brewing Yeast and the Biotechnological C'hallenge. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 43, 66. Satterfield, C.N., 1970. Mass Transfer in Heterogeneous Catalysts, MIT Press, Cambridge.

Scott, J.A., O'Reilly, A.M. & Kirkhope, S., 1995. A Fibrous Sponge Matrix to Immobilized Yeast for Beverage Fermentations. Biotechnology Techniques, 9, 305.

Shindo, S. & Kamimur, M., 1990. Immobilization of Yeast with Hollow PVA Gel Beads. Journal of Fermentation and Bioengineering, 70, 232.

Shindo, S., Sahara, H. & Koshino, S., 1994a. Suppression of α-Acetolactate Formation in Brewing with Immobilized Yeast. Journal of the Inštitúte of Brewing, 100. 69.

Shindo, S., Sahara, H.. Koshino, S. & Tanaka, H., 1993. Control of Diacetyl Precursor [aacetolactate] Formation During Alcohol Fermentation with Yeast Cells Immobilized in Alginate Fibers with Double Gel Layers. Journal of Fermentation and Bioengineering, 76, 199. Shindo, S, Sahara, S, Watanabe. N. & Koshino, S., 1994b. Main Fermentation w’ith Immobilized Yeast Using Fluidized-Bed Reactor. Proceedings of the Inštitúte of Brewing Convention, Sydney, 109.

Sinitsyn, A.P., Rajnina, E.L. Efremov, A.B., Gracheva, I.M. & Gemet, M.V., 1986. Fermentation of Hydrolysed Mash by Yeasts Immobilized on Borosilicate Carriers. Fermenlnaya I Spirtovaya Promyshlennost, 31.

Smogrovicova, D. & Domény, Z., 1999. Beer Volatile By-Product Formation at Different Fermentation Temperature using Immobilized Yeasts. Process Biochemistry, 34, 785. Smogrovicova, D.. Domény, Z. Gemeiner, P. Malovikova, A. & Sturdik, E.. 1997. Reactors for Continuous Primary Beer Fermentation using Immobilized Yeast, Biotechnology’ Techniques, 11,261.

Sodini, I., Boquien, C.Y., Corrieu, G. & Lacroix, C., 1997. Use of an Immobilized Celí Bioreactor for the Continuous Inoculation of Milk in Fresh Cheese Manufacturing. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 18, 56.

Speers. R.A. & Ritcey, L.L., 1995. Towards an Ideál Flocculation Assay. Journal of the American Society ofBrewing Chemists, 174.

Stewart, G.G., 1996. Brewing Technology for the Future. The Brewer, 82, 348.

Stewart, G.G. & Russell, I., 2000. Brewer ’s Yeast. The Inštitúte ofBrewing, England.

Stewart, G.G. & Russell, I., 1981. Yeast Flocculation, in Brewing Science, Ed. J.R.A. Pollock, Academic Press, New York.

Stratford, M., 1996. Yeast Flocculation: Restructuring the Theories in Line with Recent Research, Cerevisiae Belgium Journal of Biotechnology, 38.

Sumino, T., Nakamura, H. & Mori, N., 1993. Development of a High-Efficiency Wastewater Treatment System Using Immobilized Microorganisms. in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 377.

Tata, M., Bower, P., Bromberg, S., Duncombe, D., Fehring, J., Lau, V., Ryder, D. & Stassi, P. 1999. Immobilized Yeast Bioreactor Systems for Continuous Beer Fermentation. Biotechnology’ Progress, 15, 105.

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists. 1992. Methods ofAnalysis. 8^th Edition, Minnesota, ASBC.

Teixera, J.M., Teixera, J.A., Motá, M., Manuela, M., Guerra, B., Machado Cruz, J.M. & Sa Almeida, A.M., 1991. The Influence of Celí Wall Composition of a Brewer’s Flocculent Láger Yeast on Sedimentation During Successive Industrial Fermentations. Proceedings of the European Brewery Congress, 241.

Umemoto, S., Mitani, Y. & Shinotsuka, K., 1998. Primary Fermentation with Immobilized Yeast in a Fluidized Bed Reactor. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 35, 58.

Van de Winkel, L., 1995. Design and Optimization of a Multipurpose Immobilized Yeast Bioreactor for Brewery Fermentations. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnoloy,

20. 77.

Van de Winkel, L. & De Vuyst, L., 1997. Immobilized Yeast Celí Systems in Today’s Breweries and Tomorrow’s. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 27.

Van de Winkel. L.. McMurrough. I., Evers, G., Van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1995. Pilot-Scale Evaluation of Silicon Carbide Immobilized Yeast Systems for Continuous AlcoholFree Beer Production. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 90.

Van de Winkel, L., P.C. van Beveren & C.A. Masschelein, 1991a. The Application of an Immobilized Yeast Loop Reactor to the Continuous Production of Alcohol-Free Beer. Proceedings of the 23rd European Brewing Convention Congress, Lisbon, 577.

Van de Winkel, L., P.C. van Beveren, E. Borremans, E. Goosens & C.A. Masschelein, 1991b. Iligh Performance Immobilized Yeast Reactor Design for Continuous Beer Fermentation. Proceedings ofthe 24 th European Brewing Convention Congress, Oslo, 307.

Van Dieren, B., 1995. Yeast Metabolism and the Production of Alcohol-Free Beer. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 66.

Van Iersel, Meersman, E., Swinkels, W., Abee, T. & Rombouts, F.M., 1995. .

Continuous Production of Non-Alcohol Beer by Immobilized Yeast at Low Temperature. Journal of Industrial Microbiology, 14, 495.

Van Loosdrecht, M.C.M. &. Heijnen, J.J., 1993. Biofilm Bioreactors for Waste-Water Treatment. Trends in Biotechnology, 11,117.

Vicente. A.A.. Dluhy, M. & Teixeira, J.A., 1999. Increase of Etanol Productivity in an Airlift Reactor with a Modified Draught Tube. The Canadian Journal of Chemical Engineering, ΊΊ, 497.

Virkajarvi, I. & Linko, M., 1999. Immobilization: A Revolution in Traditional Brewing.

Naturwissehschaften, 86, 112.

Virkajarvi, I. & Kronlof, J., 1998. Long Term Stability of Immobilized Yeast Columns in Main

Fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 56, 70.

Virkajarvi, I. & Pohjala, N., 1999. Profiting from Immobilized Fermentation. Proceedings of the 5^lh Aviemore Conference on Malting. Brewing and Distilling, 290.

Wackerbauer, K., Fitzner, M. & Gunther, J., 1996a. Technisch-technologische Moglichkeiten mit Immobilisierter Hefe. Brauwelt, 136, 2140.

Wackerbauer, K., Fitzner. M. & Lopsien, M., 1996b. Untersuchungen mit dem Neuen MPIBioreaktor-System. Brauwelt, 136, 2250.

Webb. C., G.M. Black Sc B. Atkinson, 1986. Process Engineering Aspects of Immobilized Celí System. England: The Institution of Chemical Engineers.

Westrin. B.A. & A. Axelsson, 1991. Diffusion in Gels Containing Immobilized Cells: A Critical Review. Biotechnology and Bioengineering, 38, 439.

Wu, W.T., Wu, J.Y. & Jong, J.Z., 1992. Mass Transfer in an Airlift Reactor with a Net Draft Tube. Biotechnology Progress, 8. 465.

Yamane, T., 1981. On Approximate Expressions of Effectiveness Factors for Immobilized Biocatalysts. Journal of Fermentation Technology, 59, 375.

Yamauchi. Y. & Kashihara, T., 1995a. Kirin Immobilized System. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland. 99.

Yamauchi, Y.. Kashihara. T., Murayama, H., Nagara, A„ Okamoto, T. & Mawatari, M., 1994. Scaleup of Immobilized Yeast Bioreactor for Continuous Fermentation of Beer. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 31, 90.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Amikura, T., Hiratsu, H., Nagara, A., Kamiya, T. & Inoue, T., 1995b. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. 1. Heat Conversion of α-Acetolactate. Journal of Biotechnology, 38. 101.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Nagara, A. & Noguchi, K., 1995c. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. 2. Balance of Total Diacetyl Reduction and Regeneration. Journal of Biotechnology, 38, 109.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A. & Kashihara, T., 1995d. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Sulfite Formation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 277.

Yamauchi, Y., Okamoto, T.. Murayama, H., Nagara, A.. Kashihara, T., Yoshida, M. & Nakanishi, K.. 1995e. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Balance Control of Extract and Amino Acid Uptake. Applied Biochemistry and Biotechnology’, 53, 245.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M., Yasui, T. & Nakanishi, K., 1995f. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Minor Products of Carbohydrate Metabolism. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 261.

Yuan, X.. 1987. Application of Immobilization Technique in Brewing Industry. Shipirt Kexue, 94, 8.

Zhang, Z., Su, E. & Yu, J., 1988. . Studies on Continuous and Rapid Fermentation of Beer by Immobilized Yeast. Gongye Weishengwu, 18, 11.

Podstata wnálezu

Vynález sa týka spôsobu výroby alkoholických nápojov, ktorý zahŕňa stupeň kontinuálnej fermentácie, ktorý sa používa na zakvasovanie a/alebo aspoň začatie fermentácie sladiny obsahujúcej skvasiteľné cukry.

Vynález najmä poskytuje výhodný postup, pri ktorom sa uskutočňuje kontinuálna fermentácia s použitím bioreaktora s plynovým výťahom, využívajúceho flokulentný (a najmä vysoko flokulentný alebo superflokulentný) kmeň kvasiniek a uplatňujúceho prísnu kontrolu kyslíka.

V obzvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu sa “aspoň čiastočne fermentovaný’' výstup z kontinuálneho procesu vedie do vsádzkového stupňa na konečnú úpravu (ktorá v kontexte patentových nárokov môže zahŕňať - avšak nie je na to obmedzená - dokončenie fermentačného procesu, pri ktorom kvasia uhľohydráty na alkohol).

Vynález sa týka výroby piva (vrátane najmä svetlých pív, ležiakov, a obzvlášť pív severoamerického typu). V tejto súvislosti viď napríklad Essentials of Beer Style - F. Eckhardt.

Postup podľa nároku 1, v ktorom sa kontinuálny stupeň uskutočňuje v bioreaktore s plynovým výťahom:

V súlade s kontinuálnym stupňom, použiteľným v rôznych uskutočneniach vynálezu, je výhodné používať imobilizované bunky (v kontraste k úplne voľným bunkám), a to je možné uskutočňovať s použitím zvoleného typu kvasiniek imobilizovaných na nosiči alebo flokulujúcich. Bez ohľadu na práve uvedené je však výhodné používať flokulujúce kvasinky radšej než imobilizované na nosiči, a obzvlášť výhodné na tento účel sú superflokulujúce kvasinky.

Ďalšie podrobnosti ohľadne výhodných uskutočnení a výhod spojených s kontinuálnymi procesmi sú uvedené v priebehu podrobného opisu vynálezu. Patrí medzi ne použitie umelých (t.j. kontrolovaných) plynných zmesí a použitie dusíka, oxidu uhličitého a kyslíka, rovnako ako vzduchu.

Navyše sú tu uvedené ďalšie podrobnosti ohľadne vsádzkového spracovateľského stupňa. Je potrebné zdôrazniť, že v niektorých uskutočneniach vynálezu vsádzkový stupeň prekračuje koncept „dokončenia premeny skvasiteľných uhľohydrátov na alkohol (ktorá môže byt' v každom prípade prakticky dokončená v kontinuálnom štádiu spracovania). V týchto uskutočneniach je primárnym cieľom vsádzkového stupňa vyrovnanie chuti (čiže remediácia), najmä v súvislosti s diacetylom a acetaldehydom.

Výhodné uskutočnenia vynálezu umožňujú distribúciu zakvasenej a/alebo aspoň čiastočne fermentovanej sladiny po kontinuálnom stupni pomocou distribučného rozvodu (či už ako pevného rozvodu alebo selektívnym spájaním a rozpájaním potrubí) medzi väčším počtom vsádzkových tankov. V procese so sériovou distribúciou sa naplní jeden tank, potom druhý, a tak ďalej. V obzvlášť výhodnom uskutočnení je kapacita priepustnosti kontinuálneho reaktora uvedená do súladu, pokiaľ ide o veľkosť a počet príslušných nádob, so zádržnou kapacitou vsádzky, takže kapacita výrobného prietoku je v priebehu času vyrovnaná. Ideálne sa zo vsádzkových nádob dokončený produkt vypúšťa práve v čase čistenia, potom sa znovu napoja a naplnia z trvalého prítoku z kontinuálneho fermentačného stupňa.

V súlade s ďalším aspektom vynálezu sú niektoré uskutočnenia špeciálne upravené z hľadiska obsahu kyslíka v sladine alebo pive. To sa týka ako kontinuálneho, tak vsádzkového stupňa procesu. Vzhľadom na kontinuálny stupeň má koncentrácia kyslíka rôzne účinky, ale najmä môže byť žiaduce ju minimalizovať na optimalizáciu konverzie vyšších alkoholov na aromatizačné aktívne estery. V tejto súvislosti je nutné poznamenať, že koncentrácia vyšších alkoholov môže zostať vsádzkovým stupňom do značnej miery neovplyvnená, takže, ak je to žiaduce, použije sa prísna kontrola O2 na vyrovnanie chuti pribudlinových esterov. V tejto súvislosti môže byť užitočné prepláchnutie sladiny pomocou CO₂ pred kontinuálnou fermentáciou.

V jednom uskutočnení vynálezu je primárnym cieľom kontinuálneho stupňa spracovania zaistiť zakvasenie v ďalej nadväzujúcej vsádzkovej fermentácii.

Podrobný opis:

Ďalej je uvedený podrobný opis vynálezu v dvoch častiach.

Opis obsahuje grafy, vzorce, obrázky a pod. alebo na ne odkazuje, pričom každý je označený názvom „obr.“ a konkrétnym identifikačným číslom. Ďalej sa odkazuje na pripojené výkresy, na ktorých sú obrázky označené symbolom „OBR.“ a príslušným identifikačným číslom. Predmety znázornené na výkresoch nemusia mať presné meradlo.

Prehľad obrázkov na výkresoch

OBR. 1 predstavuje prúdovú schému pilotného kontinuálneho fermentačného zariadenia, ktorého jednotlivé súčasti sú zhrnuté v tabuľke 5.1.

OBR. 2 predstavuje schematický diagram pilotného bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou na nasávanie plynu s objemom 50 1 (gas-lift draft tube, GLDT).

OBR. 3 predstavuje prierez reaktorom na obr. 2 vrátane umiestnenia vnútornej sacej rúrky, ako aj vnútorného separátora.

OBR. 4 predstavuje podrobný nákres horného nástavca bioreaktora z obr. 2.

OBR. 5 predstavuje podrobný nákres tela bioreaktora z obr. 2.

OBR. 6 predstavuje podrobný nákres kónického dna bioreaktora z obr. 2.

OBR. 7 predstavuje podrobný nákres rúrkového rozdeľovača plynu bioreaktora z obr. 2. Do rúrky rozdeľovača s priemerom 1,27 cm bolo navŕtaných celkom 160 dier (priemer 0,16 cm) s odstupom medzi stredmi 0,8 cm a s dĺžkovým odstupom 0,6 cm.

OBR. 8 predstavuje diagram kontinuálnej perličkovej produkcie s použitím statických ntiešadiel (patentová prihláška firmy Labatt č. 2,133,789).

OBR. 9 znázorňuje sklenené perličky Síran®, dodávané firmou Schott Engineering.

OBR. 10 znázorňuje kremelinové perličky Celíte®, dodávané firmou World Minerals.

OBR. 11 znázorňuje κ-karagénanové gélové perličky, vyrábané v laboratóriách firmy Labatt Brewing Company Limited (“Labatt”).

OBR. 12 je rad obrázkov, znázorňujúcich neflokulentné, resp. reťaziace, resp. flokulentné kvasinky. Snímky boli získané mikroskopicky zaostrovanou kamerou so zväčšením 100 X.

OBR. 13 je mikroskopický snímok stredne flokulentného kmeňa kvasiniek LCC3021 so zväčšením 100 X.

OBR. 14 je mikroskopický snímok superflokulentného kmeňa kvasiniek LCC290 so zväčšením 100 X.

OBR. 15 predstavuje schematický diagram procesu výroby kapa-karagénanových gélových perličiek so statickým miešadlom. V statickom miešadle prechádza tekutina miešadlom (nie miešadlo tekutinou), čo umožňuje miešať tekutiny, ktoré sú čerpané potrubím.

OBR. 16 predstavuje ďalšiu schému bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou na primárnu fermentáciu piva.

OBR. 17 predstavuje fotografiu skutočného bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou z obr. 15.

OBR. 18 predstavuje podrobný nákres 13-litrového (t.j. pracovný objem 8 1) bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou z obr. 16.

OBR. 19 predstavuje podrobný nákres horného nástavca bioreaktora, kde: 1 - výstup kvapaliny pre kyslíkový senzor; 2 - teplomerná záchytka pre teplotný senzor, spojená s termostatickým ovládačom; 3 - teplotná sonda; 4 - spätný vstup kvapaliny pre kyslíkový senzor; 5 - inokulačný vstup; 6 - membránový' vzorkovací vstup s nerezovým vekom.

OBR. 20 predstavuje profil výstupu kvapaliny pre kyslíkový senzor s plniacou jednotkou ponorenou v kvapalnej fáze bioreaktora.

OBR. 21 predstavuje podrobnú schému a nárys kontinuálnej primárnej fermentácie piva v bioreaktore s plynovým výťahom (podrobný opis zariadenia viď tabuľka 5.1).

OBR. 22 predstavuje schému mechanizmu gélovatenia karagénanu (upravené podľa Reesa, 1972).

OBR. 23 predstavuje schému využitia zložiek sladiny imobilizovanými kvasinkami počas primárnej fermentácie.

OBR. 24 je snímok kapa-karagénanových gélových perličiek obsahujúcich imobilizované ležiakové kvasinky v čase 0 fermentácie.

OBR. 25 je snímok skupiny ležiakových kvasiniek, zachytených v kapa-karagénanovej gélovej perličke, po dvoch dňoch vsádzkovej fermentácie, ukazujúci jazvy po púčikoch na jednotlivých kvasinkách.

OBR. 26 je snímok vonkajšieho okraja kapa-karagénanovej gélovej perličky, ukazujúci ležiakové kvasinky po dvoch mesiacoch kontinuálnej fermentácie.

OBR. 27 je snímok ležiakových kvasiniek vo vonkajšej oblasti kapa-karagénanovej gélovej perličky po dvoch mesiacoch kontinuálnej fermentácie.

OBR. 28 je snímok ležiakových kvasiniek v strede kapa-karagénanovej gélovej perličky po dvoch mesiacoch kontinuálnej fermentácie.

OBR. 29 je snímok celej kapa-karagénanovej gélovej perličky po šiestich mesiacoch kontinuálnej fermentácie; mnoho popraskaných perličiek malo dutý stred.

Podrobný opis - Časť 1:

Príprava kmeňa kvasiniek a inokula

Fermentácie používané v tejto práci používali polyploidné kvasinky z čeľade Saccharomyces cerevisiae (označované tiež ako Saccharomyces uvarum a/alebo Saccharomyces carlsbergensis}. Pivovarnícka obec tieto kvasinky obvykle označuje ako kvasinky pre spodné kvasenie, produkujúce pivá typu ležiak. Táto charakteristika sa zakladá na schopnosti ležiakových kvasiniek usadiť sa a oddeliť sa od kvapaliny po dokončení fermentácie. Pivovarské kvasinky, na rozdiel od ležiakových, stúpajú k vrcholu fermentačnej nádoby, a sú preto známe ako kmeň pre vrchné kvasenie. Schopnosť kvasiniek sa usadzovať alebo stúpať nie je nutne závislá od toho, či ide o ležiakový alebo pivovarský typ, ale je špecifická pre kmeň. Ležiakové kvasinky typicky nekvasia pri teplotách nad 34 °C, zatiaľ čo pivovarské kvasinky nemôžu skvasovať melibiózu. Túto charakteristiku používajú vedci na rozlíšenie ležiakových a bežných pivovarských kvasiniek (McCabe, 1999).

Ako pri fermentáciách so samovoľne sa zhlukujúcimi voľnými kvasinkami, tak pri fermentáeiách s imobilizáciou κ-karagénanom bol použitý stredne flokulentný kmeň kvasiniek Saccharomyces cerevisiae 3021 zo zbierky kultúr Labatt Culture Collection. Na pokusy s použitím superflokulentných kvasiniek ako imobilizantu bol použitý variant kmeňa LCC3021. totiž kmeň LCC290.

Čisté kvasinkové kultúry boli kryogénne skladované pri -80 °C v mrazničke umiestnenej v oddelení technologického vývoja firmy Labatt. Podľa potreby boli aeróbne predpestovávané sterilné očká kvasinkovej kultúry pri 21 °C na agarových platniach PYG (3.5 g peptónu, 3,0 g kvasinkového extraktu, 2,0 g KH2PO4, 1,0 g MgSO4*7H₂O, 1,0 g (NH4)SO4. 20,0 g glukózy a 20,0 g agaru, rozpustené v destilovanej vode do objemu 1 litra). Izolované kolónie kvasiniek potom boli prenesené do skúmaviek obsahujúcich 10 ml pasterizovanej sladiny a inkubované 24 h za miešania pri 21 °C. Toto inokulum bolo postupne zväčšené až na objem 5 1 pridávaním vyššie uvedenej kultúry k príslušnému objemu sladiny (10 ml k 190 ml. 200 ml k 800 ml a 1 1 ku 4 1). Táto násada potom bola prenesená do centrifugačnej nádobky a podrobená odstredeniu pri 10000 min'¹ a 4 °C počas 10 min. Zo získaných vlhkých peliet potom bola odoberaná požadovaná hmota pre všetky ďalšie fermentácie (30 % w/v).

Fermentačné médium

Ako živné prostredie pre všetky fermentácie bola použitá ležiaková sladina priemyselnej kvality, vyrobená v pivovare Labatt London. V tejto práci sa odkazuje na mernú hustotu sladiny, vyjadrovanú v stupňoch Plato (°P). Vzťah medzi mernou hustotou a °P opisuje rovnica

4.1.

P = 135.997 ·SG³ - 630.272 ·SG² +1111.14 · SG-616.868 (4.1)

Sladina, používaná vždy v tejto práci, mala 17,5 °P, čo zodpovedá mernej hustote 1,072.

Tabuľka 4.1 poskytuje typický uhľohydrátový profil tejto sladiny, merané vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC), opisovanou v sekcii 4.7.2. Približne 73 % uhľohydrátov v tejto sladine je skvasiteľných, pričom kvasinky použité v tejto štúdii nemôžu ľahko spracovať 27 % uhľohydrátov s dlhším reťazcom.

Tabuľka 4.1. Typické uhľohydrátové zloženie sladiny použité vo fermentačných pokusoch. Sladina bola vyrobená pivovarom Labatt London a mala mernú hustotu nameranú ako 17,5°P.

	priemer (g/i)	variačný koeficient (%)	skvasiteľné (%)	ne skvasiteľné (%)
fruktóza	3,3	18,0	1,9
glukóza	16,5	4,3	9,3
maltóza	87,7	10,1	47,8
maltotrióza	25,2	10,8	14,2
maltotetróza	6,4	18,3		3,6
polysacharidy	41,1	9,1		23,2
celkom	177,2		73,2	26,8

Variačný koeficient pre väčšinu analyzovaných látok sa pohybuje medzi 10 % a 20 %. Táto variabilita je z veľkej časti dôsledkom použitého priemyselného procesu, rovnako ako variability surovín od várky k várke.

Typy imobilizácie

Počas tohto výskumu boli testované tri typy imobilizácie - zachytenie, adsorpcia a samozhlukovanie. Pre nosiče z priemyselných zdrojov sú najprv uvedené údaje dodávateľa a potom sú doplnené vlastnou laboratórnou analýzou. Snímky a distribúcie veľkostí skúmaných nosičov (ak sú k dispozícii) sú tu uvedené na inom mieste.

V poloprevádzkovom bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou boli testované dva typy adsorpčných matríc. Tu sú uvedené snímky oboch týchto nosičov. Nosič z perličiek sintrovaného skla, Siran®, poskytol Schott Engineering. Vybrané častice mali priemer 1 až 2 mm, mali otvorené póry na imobilizáciu kvasiniek s objemom pórov 55 až 60 % a distribúciou veľkosti pórov medzi 60 a 300 pm, čo je vhodná veľkosť pre kvasinky. O tomto typu nosiča sa uvádza, že je biologicky a chemicky stabilný, ľahko sa čistí, je opakovane použiteľný, dá sa sterilizovať parou, nekompaktuje a je chuťovo neutrálny, a teda je schválený pre potraviny.

World Minerals of California dodali sférický nosič, tvorený kremelinou. Tento nosič poskytoval výhody tepelnej a chemickej stability, mechanickej pevnosti a tuhosti. Kremelína, základná surovina, sa v pivovarníckom priemysle bežne používa na filtráciu piva. Nosič Celíte® R-632 bol navrhnutý špecificky na imobilizáciu celých buniek.

Špecifikácia dodávateľa:

Rozmedzie veľkosti: Stredný priemer pórov: Celkový objem pórov: Hustota zhutneného lôžka

0,595 mm až 1,41 mm (frakcia 14/30 mesh) 7.0 pm 1,19 cm³/g 0,334 kg/m³

Kapa-karagénanové gélové perličky, nosič zachytávacieho typu, boli vyrobené v laboratóriách Labatt Brewing Company Ltd. Výrobný proces je opísaný v sekcii 5.2 a výsledky tohto výrobného procesu sú uvedené v sekcii 6.2.1.

Najjednoduchší typ imobilizácie, samozhlukovanie (autoagregácia), bol umožnený voľbou kmeňov kvasiniek, ktoré sú schopné vločkovať. Priemyselné ležiakové kvasinky LCC3021 majú prirodzenú schopnosť vločkovania a považujú sa za stredne flokulentný kmeň. Ako fermentácia postupuje, tvoria sa v kvapalnom prostredí malé chumáčiky kvasiniek, s rozmerom od 0,5 mm do 1,0 mm. Kvasinky LCC290, čo je variant ležiakových kvasiniek LCC3021, tvoria oveľa väčšie vločky (od 1,0 mm do 5,0 mm v závislosti od intenzity miešania), a preto sa označujú ako superflokulentné kvasinky. Snímky rôznych vločiek kvasiniek sú tu uvedené.

Postup odoberania vzoriek

Ako ťermentácie postupovali, bolo nutné v rôznych časových intervaloch odoberať vzorky z fermentujúcej kvapaliny. Na to boli od Scandi-brew zakúpené sterilné vzorkovacie ventily. Tieto ventily sú vyrobené z nerezovej ocele a sú vybavené komorou (vymedzenou horným a spodným vstupom), v ktorej je možné uchovávať etanol na udržanie aseptického prostredia. Pred odobratím vzorky sa etanol z komory vypustí odstránením poistného uzáveru zo spodného hrdla. Komora sa prepláchne čerstvým etanolom (75% obj.) a potom sa umiestni uzáver na horný vstup ventilu. Potom sa vyliahne páka ventilu a do sterilizovanej nádoby sa odoberie približne 50 ml kvapalnej vzorky. Druhá vzorka sa odoberie na fermentácie s použitím superflokulentných kvasiniek, aby bolo možné pred spočítaním buniek uskutočniť riadnu deflokuláciu. Hneď ako je odoberanie vzoriek dokončené, premyje sa komora ventilu horúcou vodou a peroctovou kyselinou a potom nakoniec etanolom. Na spodné hrdlo sa umiestni poistný uzáver a komora sa naplní etanolom, čím je pripravená na budúci odber vzoriek.

Mikrobiologické monitorovanie

Počítanie a životnosť voľných kvasiniek metódou metylénovej modrej

Najprv sa vyššie uvedenou metódou z fermentačného média odoberú kvapalné vzorky obsahujúce voľne suspendované kvasinky. Na spočítanie počtu kvasiniek sa použije prístroj Hemacytometer spoločnosti Hauser Scientific Company s objemom 10'⁴ ml v spojení so svetelným mikroskopom. Kvapalné vzorky sa riedia destilovanou vodou tak, aby sa dosiahol celkový počet 150 až 200 kvasiniek v sledovanom poli. Rôzne faktory, ktoré ovplyvňujú charakteristiky životnosti a životaschopnosti kvasiniek, opisuje Heggart et al. (1999).

Na stanovenie životnosti vo vzorke bola použitá metóda farbenia metylénovou modrou, opísaná American Society of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Živé kvasinky môžu škvrnu metylénovej modrej oxidovať, a tak ju odfarbiť. Oproti tomu mŕtve kvasinky sa farbia na modro. Pri príprave metylénovej modrej na stanovenie životnosti boli použité tieto chemikálie:

Roztok A: 0,1 g metylénovej modrej v 500 ml destilovanej vody

Roztok B: 13,6 g KH2PO4 v 500 ml destilovanej vody

Roztok C: 2,4 g of Na2HPO4*12H2O v 100 ml destilovanej vody

Potom bola pripravená metylénová modrá s pufrom Fink-Kuhles zmiešaním 500 ml roztoku A s 498,75 ml roztoku B a 1,25 ml roztoku C na konečnú zmes s pH 4,6.

V skúmavke sa pripravila zmes zriedenej suspenzie buniek a dôkladne sa premiešala. Potom, čo sa ponechala niekoľko minút odpočinúť (zaisťuje kontakt medzi kvasinkami a farbivom), bola kvapka kvapaliny umiestnená medzi počítacie sklo hemacytometra a kryciu doštičku (definovaný objem). Percento životaschopných kvasiniek sa vypočítalo spočítaním živých i mŕtvych kvasiniek v čítacom poli a podelením počtu živých kvasiniek ich celkovým počtom.

4.5.2. Počítanie imobilizovaných kvasiniek - autoagregácia

Ak sa použijú kvasinky s tendenciou tvoriť vločky, stáva sa presné určenie počtu kvasiniek, prítomných v kvapalnej vzorke, ťažkým, pretože kvasinky majú tendenciu sa usadzovať v odbernej nádobe. Na získanie reprezentatívnej vzorky sa použito deflokulačné činidlo. Na získanie reprezentatívneho počtu sa pri týchto experimentoch použilo 0,5 % obj. roztoku kyseliny sírovej na destabilizáciu flokulovaných kvasiniek. Použil sa rovnaký postup počítania a stanovenia životnosti ako v sekcii 4.5.1, pričom destilovaná voda ako riedidlo bola nahradená kyselinou sírovou.

Počítanie imobilizovaných kvasiniek - gélové perličky

Predtým, než sa uskutočnilo počítanie buniek kvasiniek zachytených na géle, bolo nutné gélovú matricu narušiť pomocou zariadenia Polytron® (Brinkmann Instruments). Vzorka perličiek sa najprv nechala prejsť sterilným sitom (veľkosť ôk 500 pm mesh) a potom sa prepláchla sterilnou vodou. Do 50 ml kontajnera na vzorky sa potom pridal 1 ml gélových perličiek so zachytenými kvasinkami a 19 ml destilovanej vody. Pomocou zariadenia Polytron® sa potom gél fyzicky rozrušil a uvoľnil kvasinky do roztoku. Pri tejto vzorke sa potom uskutočnilo počítanie a zisťovanie životnosti, opísané v sekcii 5.5.1.

Monitorovanie kontaminácie

Všetky fermentácie, uskutočňované v tejto práci, boli pravidelne monitorované z hľadiska kontaminácie. Monitorovací program pozostával z aspoň jednej kontroly kvapaliny v 50 1 kontinuálnych fermentoroch a sladiny v zásobných nádobách za týždeň. Vzorky kvapaliny boli odoberané aseptický a potom nanášané na kultivačné platne s agarom Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) a 10 mg/1 cykloheximidu. Tieto skúšobné vzorky potom boli až 10 dní inkubované pri 28 °C ako v aeróbnych, tak anaeróbnych podmienkach. Požadované anaeróbne prostredie na rast bolo vytvorené tak, že sa vybrané platne umiestnili do nádob obsahujúcich balíček AnaeroGen® (Oxoid), ktorý odstraňuje z nádoby všetok zostávajúci kyslík. Použitie indikátorového prúžka (farbí sa na ružovo, ak je prítomný kyslík) nám umožnilo overiť, že prostredie je naozaj anaeróbne. Touto metódou je možné detegovať bakteriálne prímesi, ak sú v kvapalnej vzorke prítomné.

Detekcia divokých či nepivovamíckych kvasiniek vyžadovala zvláštne rastové médium, ktoré nepodporuje rast bakteriálnych či pivovarníckych kvasiniek. Na selektívne umožnenie rastu potenciálnych divokých kvasiniek boli použité nálevové platne preparované kvasinkovým médiom (YM, Difco Laboratories), doplneným 0,4 g/I CuSCh (inkubácia pri 25 °C počas 7 dní). Po 7 dňoch inkubácie kvapalnej vzorky, nanesenej na agare PYN (Peptone Yeast-Extract Nutrient, Difco Laboratories) pri 37 °C bola možná detekcia neležiakových pivovarských kvasiniek. Rast iežiakových kvasiniek je pri teplotách nad 34 °C inhibovaný, takže ak dôjde na týchto platniach k rastu, indikuje to kontamináciu bežnými pivovarskými kvasinkami.

Analytické metódy

Všetko relevantné zariadenie bolo podrobené príslušnej kalibrácii, ako predpisujú štandardné priemyselné postupy.

Etanol

Koncentrácia etanolu v pive a fermentujúcich vzorkách bola analyzovaná metódou plynovej chromatografie podľa Technical Committee a Editorial Committee, American Society of Brewing Chemists (1992). Odplynená vzorka kvapaliny bola kombinovaná s vnútorným štandardom 5 % v/v izopropanolu a 0,2 μΐ tejto zmesi bolo nastreknuté do plynového chromatografu Perkin Elmer 8500. Presné nastavenie GC je zrejmé z ďalej uvedeného zoznamu:

Plameňový ionizačný detektor (FID)

Automatický vzorkovač Dynatech

Náplň Chromosorb 102, 80- 100 mesh

Nosný plyn hélium s prietokom 20 ml/min

Teplota injektora 175 °C, teplota detektora 250 °C, teplota kolóny 185 °C izotermne.

Uhľohydráty

Koncentrácie glukózy, fruktózy, maltózy, maltotriózy, maltotetrózy, polysacharidov a glycerolu boli merané pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (systém SpectraPhysics SP8100XR HPLC). Na oddeľovanie týchto uhľohydrátov pri ich vymývaní v systéme bola použitá katiónvýmenná kolóna (Bio-Rad Aminex HPX-87K) s dihydrogenfosforečnanom draselným ako mobilnou fázou. Potom bolo stanovené množstvo zlúčenín pomocou detektora indexu lomu s vytvorením príslušných píkov zlúčenín. HPLC sa uskutočňovala s protitlakom

520 kPa (800 psi), teplotou kolóny 85 °C a teplotou detektora 40 °C. Vzorky boli odplynené a zriedené na príslušnú úroveň. Do systému potom bola zavedená injekcia 10 μΐ s prietokom 0,6 ml/min.

V pivovarskom priemysle sa na stanovenie celkovej hladiny uhľohydrátov v kvapaline bežne používa iná metóda. Pomocou denzitometra Anton Paar DMA-58 bola zmeraná špecifická hmotnosť kvapaliny, vyjadrená v stupňoch Plato. Prefiltrované a odplynené vzorky potom boli prenesené do špeciálnej sklenenej rúrky tvaru U, ktorá potom bola podrobená elektronickej oscilácii. Merala sa frekvencia oscilácie v kvapaline a potom korelovala so špecifickou hmotnosťou kvapaliny (g/100 g alebo °P). Je potrebné zdôrazniť, že toto meranie je aproximáciou celkovej koncentrácie uhľohydrátov vo vzorke (alebo špecifickej hmotnosti), pretože kalibrácie sa uskutočňujú na vodných roztokoch sacharózy pri 20 °C, ktorých špecifická hustota je rovnaká ako merané sladiny.

Vicinálne diketóny

Celkové koncentrácie diacetylu (2.3-butándiónu) a 2,3-pentándiónu boli stanovené pomocou plynového chromatografu Perking Elmer 8310, vybaveného detektorom elektrónového záchytu. Ako nosný plyn sa požil 5 % metán v argóne s prietokom 1,0 ml/min a vzorka bola nanesená na kolónu J & W DB-Wax. Teplota injektora sa udržiavala na 105 °C, zatiaľ čo teplota detektora bola nastavená na 120 °C. Analýza bola uľahčená automatickým horným vzorkovačom Hewlett Packard 7694E. Kvantifikácia bola uskutočnená odhadnutím plochy piku zvolenej zložky vzorky a vztiahnutím na kalibračnú krivku vnútorného štandardu 2,3-hexándiónu.

Na zistenie „celkovej“ koncentrácie týchto zlúčenín bolo najprv nutné vzorky kalibrovať na 65 ^CC a potom ich na tejto teplote 30 min ponechať. Takéto spracovanie vzoriek pred analýzou umožnilo premenu α-acetolaktátu a α-hydroxybutyrátu na zodpovedajúce diketóny, diacetyl a 2,3-butándión.

Estery a vyššie alkoholy

Niektoré najvýznamnejšie chuť dodávajúce zlúčeniny, detegované v pive, boli merané pomocou plynovej chromatografie. Acetaldehyd, etylacetát, izobutanol, 1-propanol, izoamylacetát, izoamylalkohol. etylhexanoát a etyloktanoát boli kvantifikovaná s použitím n-butanolu ako vnútorného štandardu. Použil sa plynový chromatograf Hewlett Packard 5890, vybavený plameňovým ionizačným detektorom, horným automatickým vzorkovačom HP 7994 a kapilárnou kolónou J&W DB-Wax. Teplota injektora bola nastavená na 200 °C a teplota detektora bola 220 °C. Teplotný profil piecky bol nasledujúci: 40 °C počas 5 min, vzostup zo 40 °C na 200 °C rýchlosťou 10 °C/min, vzostup z 200 °C na 220 °C rýchlosťou 50 °C/min a nakoniec výdrž pri 220 °C počas 5 min. Héliový nosný plyn s prietokom 6,0 ml/min bol doplnený héliovým doplnkom 30 ml/min (193 kPa, 28 psig), prúdom vodíka 50 ml/min (172 kPa, 25 psig) a prúdom vzduchu 300 ml/min (241 kPa, 35 psig). Celkový cyklus GC pre slučku 1 ml vzorky činil 40 minút.

Ďalšie analýzy

Na kvapaline z fermentora. ktorá bola podrobená starnutiu a baleniu, sa podľa potreby uskutočňovalo niekoľko ďalších analytických meraní. Analýzy dokončeného produktu sa uskutočňovali oddelením kvality firmy Labatt podľa štandardov hotového piva. Základom týchto meraní boli metódy opísané Technical Committee a Editorial Committee, American Society of Brewing Chemists (1992). Zoznam týchto analýz, rovnako ako stručný opis príslušných meraní, je uvedený v tabuľke 4.2.

Tabuľka 4.2. Analýza kontroly kvality

Špecifikácia

Vzduch

Oxid uhličitý

Oxid siričitý

Dimetylsulfid

Opis

Celkový vzduch vnesený počas baliaceho procesu; špecifikácia je menej než 1 ml

Hladina saturácie zanesená do produktu; udávaná ako % so špecifikáciou 2,75 %

Množstvo oxidu siričitého v pive merané pomocou GC; cieľ <10 mg/1

Množstvo dimetylsulfidu (vôňa varenej kukurice) v pive

Horkosť

Farba pH

Zdanlivý extrakt

Skutočný extrakt

Vypočítaný pôvodný extrakt

Zákal za tepla

Počiatočný zákal za studená

Pena merané GC; cieľ <70 pg/l

Množstvo horčín dodaných pivu chmeľom; meranie alfakyselín v pive; 1 jednotka horkosti (BU) je ekvivalentná ~1 mg/1 alfa-kyseliny.

Farba piva meraná spektrofotometricky; absorbancia vzorky pri 430 nm pre svetelnú dráhu 12,7 mm (0,5 inch) Merané kalibrovaným pHmetrom; pH = -logio[H⁺] Množstvo dostupného rozpustného podielu v kvapaline bez kompenzácie vplyvu alkoholu na relatívnu hustotu kvapaliny; merané hydrometrom a udávané ako °P; AE To isté ako zdanlivý extrakt okrem toho, že pre tento experiment sa berie do úvahy alkohol; RE

Založené na Ballingovom experimente, že 2,0665 g extraktu produkuje 1,0000 g alkoholu; COE = 100 * [(2,0665 * (% w/w alkohol) + RE)/(100 + 1,0665 * (% w/w alkohol))]

Zákal prítomný v pive pri izbovej teplote (21 °C) bez narušenia sedimentu; hodnotí sa nefelometrickou metódou založenou na rozptyle svetla a udáva sa ako jednotky turbidity Formazin (Formazin Turbidity Unit, FTU); špecifikácia je < 200 FTU

Zákal vzniknutý v pive, ak sa ochladí z izbovej teploty (21 °C) na 0 °C bez narušenia sedimentu; meracia metóda ako vyššie; špecifikácia je <100 FTU Meranie peniaceho potenciálu piva pomocou zariadenia NIBEM; pena sa tvorí kontrolovaným spôsobom a zaznamenáva sa rýchlosť padania peny; špecifikácia >170 sekúnd

Meranie sedimentácie kvasiniek - LCC290

Príprava skúšobného vzoru kvasiniek

Superflokulentné kvasinky (LCC290) boli pestované v sladine. ako je opísané v sekcii

4.1. Toto inokulum sa potom odstreďovalo 15 min pri 4 °C a 10000 min'¹ na získanie pelety kvasiniek na ďalšiu inokuláciu. Sladina bola, ako je opísané v sekcii 4.2, pasterizovaná 60 min pri 100 °C a potom bol 1 1 aseptický prenesený do 6 x 2 l sterilizovaných trepacích baniek. Každá trepacia banka bola naočkovaná 4 g odstredených kvasiniek. Banky boli umiestnené na trepačku bežiacu rýchlosťou 135 min'¹ (okolitá teplota 21 °C) a ponechané fermentovať.

V časových intervaloch 24 h. 40 h. 48 h. 64 h, 71 h a 192 h bola odberaná jedna banka.

V každom intervale bola odobraná malá vzorka kvapaliny pre analýzu uhľohydrátov a meranie koncentrácie a životaschopnosti kvasiniek (použité metódy sú opísané v kapitole 4). Zostávajúca zmes kvapaliny a kvasiniek bola podrobená meraniu sedimentácie kvasiniek, opísanému v sekcii 4.7.2.

Meranie sedimentácie kvasiniek

Rýchlosť usadzovania kmeňa LCC290 superflokulentných kvasiniek bola meraná nasledujúcou metódou. Každá vzorka bola ponechaná fermentovať až do požadovaného intervalu, ako je opísané v sekcii 4.7.1. V predpísanom okamžiku bola odobraná príslušná banka so vzorkou. Vzorky boli premiešané, aby sa zaistilo, že všetky častice sú suspendované. Obsah banky potom bol okamžite prenesený do 1000 ml odmemého valca. Ako sa vločky usadzovali, bola meraná v 30 sekundových intervaloch vzdialenosť medzi povrchom kvapaliny a rozhraním vločka - kvapalina. Rýchlosť usadzovania (settling rate) bola vypočítaná podľa nasledujúcej rovnice:

n* ui r EH (Ho-Hi) ,_e

Rychlost =-= --i (5.1) usadzovania & v ~^to)

Pomocou štandardnej Kynchovej metódy (1952) bola z kriviek usadzovania získaných pre každý interval fermentácie zostavená krivka rýchlosti usadzovania verzus koncentrácia kvasiniek.

Metódy merania cirkulácie a rýchlosti miešania

Na meranie času miešania a rýchlosti cirkulácie vo vnútri trojfázového bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou bol použitý systém vstrekovania kyseliny napojený na systém zhromažďovania údajov. Pri aplikácii pulzu silnej kyseliny do bioreaktora bolo možné vypočítať ako rýchlosť cirkulácie, tak čas miešania na základe monitorovania zmien pH v priebehu času a ich priradenie rovniciam uvedeným v sekcii 3.2.2. Systém zhromažďovania údajov pozostával z:

pH sondy Ingold (Cole-Parmer, kat. #P-05990-90), napojenej na snímač pH Ingold na báze mikroprocesora (Model 2300), karty na preklad údajov DT2805, osobného počítača 386DX a programu zhromažďovania údajov Quick Basic data acquisition program (autori C. Hudson a J. Beltrano, 1994, modifikácia N. Mensour, 1998).

Do prstencovej sekcie bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou sa tesne pod umiestnením sondy pH nastreklo 10 ml 10 N kyseliny chlorovodíkovej (diagram na obr. 5.5). Táto vzdialenosť zodpovedala výške 26 cm pod hornou doskou. Pred začatím experimentov zmiešaním bola pH sonda podrobená dvojbodovej kalibrácii overenými štandardnými puframi (zelený pufer Beckman pH 7,0 a červený pufer Beckman pH 4,0). Prúd 4 až 20 mA, produkovaný pH-metrom, bol napojený na svorkovnicu, kde bol prúd premenený na napätie, ktoré potom bolo merané kartou na zhromažďovanie údajov, umiestnenou vo vnútri počítača. Program zhromažďovania údajov sa začal súčasne s nástrekom kyseliny. Čas zberu údajov bola 5 min pri frekvencii odberu vzoriek 50 Hz. Veľkosť poľa v programe bola nastavená na 3750 (celkom zobraných 15000 bodov) so ziskom 1 nastaveným pre kartu na zhromažďovanie údajov.

Zhromaždené údaje boli prenesené z laboratória na silnejší počítač (mikroprocesor Pentium II) na ďalšiu analýzu. Na analýzu údajov bol použitý program TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Kanada), ktorý je schopný pracovať s veľkými súbormi údajov a okrem toho má početné zabudované funkcie na manipuláciu s údajmi (vyrovnávanie údajov, konštrukcia kriviek atď.). Na elimináciu šumu bol na pôvodné údaje aplikovaný algoritmus Savitzky-Golay, metóda vyrovnávania v časovej oblasti založená na bikvadratickom polynomiálnom vyrovnávaní metódou najmenších štvorcov v pohyblivom okne. Vyvážené údaje potom boli nastavené tak, aby odrážali zmenu pH namiesto skutočnej nameranej hodnoty pH. Nastaveným údajom potom bola prispôsobená slabnúca sínusoidová funkcia. Z prispôsobovacích parametrov potom boli vypočítané časy miešania a rýchlosti cirkulácie.

Tieto miešacie experimenty boli uskutočňované pri skutočných fermentáciách vo vnútri bioreaktora s plynovým výťahom s objemom 50 1, v ktorom bol prítomný jeden z troch imobilizačných nosičov (superflokulentné kvasinky LCC290, stredne flokulentné kvasinky LCC3021 alebo κ-karagénanové gélové perličky). Kvapalnú fázu tvorilo fermentované pivo so špecifickou hustotou 2,5 °P a plynná fáza bola tvorená oxidom uhličitým. Teplota fermentácie bola kontrolovaná na 15 °C. Povrchová rýchlosť distribuovaného plynu sa pohybovala medzi 2,0 a 6,0 mm/s. Systém sa ponechal 10 min ekvilibrovať pri danom prietoku plynu. Potom sa začai test nástreku kyseliny, ktorý bol trikrát opakovaný. Zvolila sa ďalšia hodnota prietoku plynu a pH zmesi vo vnútri reaktora bolo nastavené späť na východiskovú hodnotu.

Konštrukcia bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou v pilotnom meradle

Fermentačný systém bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Systémy fluidného lôžka so sacou rúrkou (draft tube fluidized bed. DTFB) preukázali svoju hodnotu pre použitie v trojfázových systémoch. V experimentálnom pivovare spoločnosti Labatt Brewing Company Ltd. boli na uskutočnenie experimentálnej časti na túto prácu navrhnuté, postavené a inštalované dva identické bioreaktory s plynovým výťahom a sacou rúrkou v pilotnom meradle. Okrem toho bolo niekoľko existujúcich nádob modifikovaných na skladovanie sladiny a odber piva. Celkový proces, použitý v týchto poloprevádzkových experimentoch s kontinuálnou fermentáciou, je znázornený na prúdovej schéme na obr. 1 a v tabuľke 5 je zariadenie zobrazené na obr. 1 podrobnejšie opísané.

Sladina bola dodávaná zo závodu London Brewing potrubím z nerezovej ocele s priemerom 5,08 cm a vedená do skladovacích tankov s pracovným objemom 1600 1 (WT1 a WT2), Systém dvoch tankov umožňoval kontinuálnu dodávku živného prostredia do poloprevádzkových kontinuálnych fermentorov (Rl a R2). Každá nádrž je vybavená rozdeľovacím systémom pre oxid uhličitý na kontrolu kyslíka a homogenity a chladiacim plášťom s glykolovým systémom na kontrolu teploty. Tento centrálny zdroj živnej pôdy bol nastavený tak, aby pomocou rozdeľovacieho systému (V7, V8 a V9) obsluhoval až 3 nezávislé fermentory. Dodávanie predpísaného množstva sladiny do pilotných bioreaktorov (R1 a R2) sa uskutočňovalo pomocou peristaltických čerpadiel Masterflex (P 1 a P2).

Tabuľka 5.1. Opis jednotlivých častí zariadenia zobrazeného na obr. 5.1

Položka	Opis
Vzduch	Dodávka 690 kPa (100 psig) zo závodu London
CO2	Dodávka 690 kPa (100 psig) oxidu uhličitého zo závodu London
F1	Sterilný filter na vstupe oxidu uhličitého
F2	Sterilný filter na vstupe oxidu uhličitého
F3	Sterilný filter na odvzdušňovacom ventile WT1
F4	Sterilný filter na odvzdušňovacom ventile WT2
F5	Sterilný filter na vstupe miešacieho plynu
F6	Sterilný filter na vstupe miešacieho plynu
F7	Sterilný filter na výstupe WBT1
GLR	Spätné potrubie glycerolu; 173 kPa (25 psig)
GLS	Privádzacie potrubie glycerolu; 311 kPa (45 psig)
NV1	Ihlový ventil oxidu uhličitého
NV2	Ihlový ventil oxidu uhličitého
NV3	Ihlový ventil na vstupe vzduchu
NV4	Ihlový ventil na vstupe oxidu uhličitého
NV5	Ihlový ventil na vstupe vzduchu
NV6	Ihlový ventil na vstupe oxidu uhličitého
Pl	Peristaltické napájacie čerpadlo Masterflex pre R1
P2	Peristaltické napájacie čerpadlo Masterflex pre R2
PRI	Tlakový regulátor oxidu uhličitého
PR2	Tlakový regulátor oxidu uhličitého
PR3	Tlakový regulátor vzduchu
PR4	Tlakový regulátor oxidu uhličitého
PR5	Tlakový regulátor vzduchu
PR6	Tlakový regulátor oxidu uhličitého
R1	Pilotný bioreaktor s plynovým výťahom a sacou rúrkou; pracovný objem 50 1
R2	Pilotný bioreaktor s plynovým výťahom a sacou rúrkou; pracovný objem 50 1

Položka	Opis
RM1	Rotameter oxidu uhličitého; stupnica 0 až 20 scfh
RM2	Rotameter oxidu uhličitého; stupnica 0 až 20 scfh
RM3	Rotameter vzduchu; stupnica 0 až 2,5 scfh
RM4	Rotameter oxidu uhličitého; stupnica 0 až 10 scfh
RM5	Rotameter vzduchu; stupnica 0 až 2,5 scfh
RM6	Rotameter oxidu uhličitého; stupnica 0 až 10 scfh
V1,V2,V3	Klapkové uzávery na vstupe/výstupe WT1
V4,V5.V6	Klapkové uzáver)· na vstupe/výstupe WT2
V7,V8.V9	Guľový ventil na rozdeľovacej hlave sladiny
νιο,νιι	Guľové ventily na vstupe sladiny do Rl
VI2	Pohotovostní odpojovací ventil na vstupe miešacieho plynu
V13	Klapkový uzáver na výstupe Rl
V14,V15	Guľové ventily na vstupe sladiny do R2
V16	Pohotovostný odpojovací ventil na vstupe miešacieho plynu
V17	Klapkový uzáver na výstupe R2
V18	Klapkový uzáver na výstupe WBT1
WBT1	Tank na vyfermentovanú pôdu; pracovný objem 200 1
WT1	Skladovací tank sladiny opatrený glykolovým plášťom a zariadením na
WT2	prebublávanie; pracovný objem 1600 1 Skladovací tank sladiny opatrený glykolovým plášťom a zariadením na prebublávanie; pracovný objem 1600 1

Plynný oxid uhličitý a vzduch boli do systému plynového výťahu vháňané rúrkovými rozdeľovačmi z nerezovej ocele (obr. 7). Prietok nástrekov do systému sa monitoroval rotametrami (RM3, RM4, RM5 a RM6). Na plynových potrubiach boli inštalované sterilné filtre (veľkosť oka 0.2 pm), aby sa zabránilo vstupu kontaminujúcich nečistôt do bioreaktorov. Produkt odtekal z reaktora prepadovým systémom (obr. 4). Čas zdržania kvapaliny teda kontrolovalo iba napájacie čerpadlo. Oba reaktory (Rl a R2) boli napojené na tank na vyfermentovanú pôdu (WBT1), ktorý zachytával prepadajúcu kvapalinu. Na zachytávanie produktu a spracovanie podľa potreby boli použité špeciálne 50 1 tanky.

Podrobnejšie diagramy a presné rozmery tohto 50 1 pilotného bioreaktora sú uvedené v sekcii 5.1.1. Postup spracovania a skladovania sladiny je uvedený v sekcii 5.1.2 a postup čistenia a sterilizácie systému kontinuálnej fermentácie sú diskutované v sekcii 5.1.3. Sekcia 5.1.4 opisuje postup fermentácie, používaný v celom tomto texte.

Konštrukcia a špecifikácia reaktora

Bioreaktor s pracovným objemom 50 1, navrhnutý na túto prácu, bol zhotovený výhradne z nerezovej ocele 304L so štyrmi plexisklovými priezormi, umiestnenými v telese reaktora tak, aby bolo možné pozorovať pohyb častíc a tekutín. Konštrukčný materiál bol zvolený pre svoju odolnosť proti dezinfekčným chemikáliám (lúh a kyselina), rovnako ako proti sterilizácii parou. Ďalším významným aspektom konštrukcie bola minimalizácia závitových súčastí v priamom kontakte s fermentačnou pôdou. Namiesto toho boli vstupy zvarené, a kde to bolo nutné, boli použité sanitárne armatúry TriClover. Reaktor bol konštruovaný s rozšírenou hornou oblasťou na maximalizáciu uvoľňovania plynu, a tým podporu lepšieho prenosu hmoty kvapalina - pevná látka (Chisti & Moo-Young, 1993). Spodná časť reaktora bola konštruovaná s kužeľovým uhlom 90 ° na minimalizáciu usadzovania pevného podielu na dne.

OBR. 2 predstavuje schematický diagram 50 1 poloprevádzkových systémov, ktoré boli inštalované v pokusnom pivovare spoločnosti Labatt. Tento diagram znázorňuje umiestnenie vstupu miešacieho plynu, vstupu kvapaliny, glykolového chladiaceho plášťa, výstupu produktu, systému snímania a kontroly teploty, a tiež umiestnenie dvoch sanitárnych vstupov pre vzorku. OBR. 3 je schéma rovnakého GLDT bioreaktora s rozmermi uvedenými v cm. OBR. 4 až. 6 sú podrobné nákresy 50 1 bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou v rezu a OBR. 7 je schéma rozdeľovacieho zariadenia plynu, použitého v týchto experimentoch.

Vnútorná sacia rúrka a rozdeľovač častíc (narážka) sú zobrazené na OBR. 3. Na základe údajov z literatúry (Chisti, 1991) bol zvolený pomer priemeru sacej rúrky k priemeru reaktora 2/3. Rozmery rozdeľovača častíc boli zvolené tak, aby umožňovali lepšie oddelenie plynu od zmesi kvapalina - pevná látka. Zväčšením priemeru tohto usmerňovacieho zariadenia (20,32 cm oproti priemeru sacej rúrky 10,16 cm) je možné získať väčší diferenciál medzi rýchlosťou stúpania bublín a rýchlosťou zostupu zmesi kvapalina - pevná látka. Strhávanie plynu do prstenca systému sacej rúrky sa zníži a dosiahne sa lepší prestup hmoty pevná látka - kvapalina.

Na nástrek miešacieho oxidu uhličitého do sekcie sacej rúrky bol navrhnutý rúrkový rozdeľovač (OBR. 7). Do rozdeľovača s priemerom 1,27 cm bolo navŕtaných celkom 160 otvorov s priemerom 0,16 cm. Otvory boli rozmiestnené s pozdĺžnym rozstupom od stredu ku stredu 0,8 cm a šírkovým rozstupom medzi stredmi 0,6 cm (8 rad po 20 otvoroch). Priemer otvoru 0,16 cm bol vybraný preto, že primárnou funkciou plynu je miešanie.

Postup spracovania a skladovania sladiny

V tradičnej kvasnej praxi sa sladina neuchováva dlhší čas bez toho, aby bola zakvasená kvasinkami. Okysličená sladina je vynikajúcim rastovým médiom pre veľa organizmov vrátane kvasiniek. Pretože postup fermentácie pre kontinuálne systémy s plynovým výťahom vyžadoval prítomnosť veľkého množstva sladiny, bolo nutné vyvinúť postupy dopravy a uchovávania sladiny. Názor výskumníkov bol, že neokysličenú sladinu je možné skladovať až dva týždne bez toho, aby došlo k poškodeniu kontamináciou, ak sa sladina riadne prenesie do uskladňovacej nádoby.

Taktiež sa považovalo za nutné zaistiť, aby pri sladine, keď je v uskladňovacej nádobe, bola riadne kontrolovaná teplota. Tanky, ktoré boli k dispozícii v pokusnom pivovare, boli pôvodne navrhnuté na kvasenie, nie na uchovávanie sladiny. Uskutočnil sa test schopnosti týchto tankov uchovávať teplotu nepohybujúcej sa kvapaliny. OBR. 2 zreteľne ukazuje, že tieto tanky nemôžu byť používané bez miešania, ak má byť dodržaná konštantná teplota 4 °C. Do tankov bola vnesená sladina pri teplote 4 °C. Na niekoľkých miestach po celej nádobe sa uskutočňovali merania teploty na lepšie pochopenie skutočných teplotných pomerov. Keď bola kvapalina ponechaná v nádobe 24 h bez miešania, stúpla jej teplota blízko hladiny na približne 20 °C. Teplota kvapaliny v strede tanku tiež mierne stúpla (ΔΤ ~3 °C), zatiaľ čo v kužeľovom dne tanku zostala blízko pôvodným 4 °C.

CJ ο 10

ο.

φ

* A
	• s miešaním
	A bez miešania :
A
A
• · · · - -,-J-,—	* i *

8

1 2 3 4 5 6

Umiestnenie meradiel

Obr. 5.8. Účinok miešania plynom na teplotný profil vo valcovo-kužeľovom tanku na sladinu. Sladina bola do tanku uvedená pri teplote 4 °C. Merania sa uskutočňovali 24 h po naplnení tanku. Oxid uhličitý bol do nádoby vháňaný s prietokom 0,113 cm³/h. Teplota okolia bola 19,8 °C. Umiestnenie meradiel: (1) vrch tanku pri stene; (2) vrch tanku v strede; (3) stred tanku pri stene; (4) stred tanku v strede; (5) vrch kužeľového dna pri stene; (6) vrch kužeľového dna v strede; (7) dno kužeľovej časti

Zavedením mierneho miešania vstrekovaním oxidu uhličitého s prietokom 0,133 cm³/h bolo možné udržiavať teplotu sladiny v skladovacej nádobe na 4 °C. Na základe týchto zistení boli obe skladovacie nádoby na sladinu vybavené na spodku kužeľovej časti sanitárnym potrubím 2,54 cm určeným na miešanie sladiny.

Neprevzdušnená sladina potom bola zo zariadenia Labatt London prevedená rúrkou z nerezovej ocele 5.08 cm do vyrovnávacej nádrže. Z tejto nádrže prechádzala sladina cez bleskový pastér do jedného z uchovávacích tankov na sladinu (WT1 alebo WT2), kde bola skladovaná až 2 týždne pri 2 °C. Tento pasterizačný krok bol zaradený ako predbežné opatrenie na elimináciu nežiaducich mikroorganizmov v sladine počas jej uchovávania. Pri použití neokysličenej sladiny je minimalizované poškodenie sladiny kyslíkom (tvorba aldehydov).

Navyše bolo možné pomocou vzduchu privádzaného spolu s miešacím plynom prísne kontrolovať prívod kyslíka do kontinuálnych fermentorov.

Meranie rozpusteného kyslíka sa uskutočňovalo hneď potom, ako bola sladina umiestnená do uchovávacej nádoby. Obr. 5.9 znázorňuje koncentráciu rozpusteného kyslíka v sladine v závislosti od času po premiestnení sladiny troma postupmi. V prvom prípade bola sladina prenesená do uchovávacej nádoby a začal sa privádzať oxid uhličitý (0.085 m³/h) na zaistenie správnej kontroly teploty. Koncentrácia kyslíka, rozpusteného v sladine, počas prvého dňa rástla až na približne 1,3 mg/1 a potom sa postupne znižovala až na približne 0,1 mg/1 piaty deň. Pri druhom pokuse bola uchovávacia nádoba na sladinu pred naplnením 3 h preplachovaná prúdom 0,85 m³/h oxidu uhličitého. Počiatočné pohlcovanie kyslíka sa silne znížilo a sladina so žiaducim obsahom kyslíka (< 0,1 mg/1) bola získaná počas 2 dní.

Sladina prebublávaná s 0.085 m³/h oxidu uhličitého po naplnení tanku

Tank na sladinu vopred preplachovaný 3 h pri 0.85 nT/h

Tank na sladinu vopred prepláchnutý a sladina prebublávaná počas plnenia

Obr. 5.9. Kontrola rozpusteného kyslíka v sladine počas prenosu zo zariadenia London plánt.

Hodnotili sa tri postupy, z ktorých tretí bol obyčajnou kombináciou oboch predchádzajúcich.

Teplota sladiny bola udržiavaná na 4 °C.

V poslednom pokuse bol tank vopred prepláchnutý vyššie opísaným spôsobom a pri procese plnenia, rovnako ako počas uchovávania bol privádzaný nepretržitý prúd oxidu uhličitého (0,085 m³/h). Počas fázy uchovávania bol obsah rozpusteného kyslíka udržiavaný na minime (<0,l mg/1). Táto metóda potom bola aplikovaná ako záväzný postup pre všetok ďalší odber sladiny.

5.1.2. Postup čistenia a sterilizácie

Tanky na uchovávanie sladiny boli podrobené cyklu čistenia, ktorý zahŕňal predbežné umývanie horúcou vodou (85 °C), čistenie lúhom (40 % lúh s teplotou 60 °C) a následné umývanie opäť horúcou vodou (85 °C). Dezinfekcia nádob sa uskutočňovala kontaktom stien s roztokom kyseliny peroctovej (2 % w/v). Potrubie na rozvod sladiny bolo podrobené rovnakému režimu čistenia a dezinfekcie.

1 bioreaktory boli čistené a sterilizované odlišným postupom. Systémy boli prepláchnuté horúcou vodou (60 °C) a potom naplnené až nahor vodou 40 °C teplou. K tejto vode potom bol pridaný priemyselný čistiaci prostriedok Diversol CX/A (DiverseyLever, Kanada), aby vytvoril roztok 2 % w/v. Do dna reaktora bol vháňaný vzduch s povrchovou rýchlosťou plynu 5 mm/s na zaistenie riadneho rozpustenia a riadneho kontaktu s reaktorom. Po 1 h kontakte bol reaktor vyprázdnený a prepláchnutý pitnou vodou. Tento čistiaci postup sa opakoval ešte druhý krát a nakoniec sa uskutočnili dva cykly naplnenia studenou pitnou vodou a vyprázdnenia.

Odpadová vyfermentovaná pôda bola čistená 2% w/v roztokom Diversol CX/A. Na rozdiel od bioreaktorov s plynovým výťahom nebolo použité miešanie plynom, pretože WBT nebol vybavený rozdeľovačom. Mechanické miešanie sa uskutočňovalo nakláňaním nádoby na bok. Cyklus sa opakoval dvakrát a nasledovali dva cykly naplnenia vodou a vyprázdnenia.

Pred parnou sterilizáciou boli 50 1 bioreaktory napojené na nádobu na vyfermentovaná pôdu a bol odpojený prívod sladiny, rovnako ako prívod miešacieho plynu. Ventily V10, Vil, V12, V13, V14, V15, V16, V17 a V18 boli otvorené a filtre F5, F6 a F7 boli odstránené. Tieto plynové potrubia a filtre boli oddelene autoklávované počas 15 min pri 121 °C. K ventilom V12 a VI6 bol pripojený prívod pary. Pamý ventil bol otváraný pomaly, aby sa minimalizovalo poškodenie zariadenia, a starostlivo sa monitorovala teplota vo vnútri reaktora. Keď sa dosiahla vnútorná teplota 100 °C, uskutočnila sa 1 h sterilizácia. Najprv boli uzavreté ventily V10, VI1.

V14, V15 a V18. Potom bol uzavretý prívod pary a bol pripojený sterilizovaný filter F7. K prívodnému potrubiu plynu boli okamžite pripojené sterilizované filtre F5 a F6 a začal sa privádzať oxid uhličitý s povrchovou rýchlosťou 3 mm/s. Tento prúd plynu nielen zaisťuje, že sa reaktory nezrútia počas chladenia, ale taktiež vytesňuje všetok vzduch, prítomný v 50 1 bioreaktoroch s plynovým výťahom.

Prívodné potrubie sladiny bolo k reaktoru pripojené, hneď ako sa dosiahla vnútorná teplota 20 °C. S ventilmi V2, V5, V10 a V14 v doposiaľ uzavretej polohe a s otvorenými ventilmi V6, V7, V8, V9, Vil a V15 bol prívod pary napojený buď na V3 alebo V6, podľa použitého prívodu sladiny. Parný cyklus trval i h, po uplynutí ktorej bolí ventily V9, Vil a V15 uzavreté súčasne s prívodom pary. Keď potrubie dosiahlo teplotu miestnosti (20 °C), boli ventily V3 a V6 uzavreté a bol odpojený prívod pary. V tomto okamžiku bol celý systém kontinuálneho kvasenia, vrátane zásoby sladiny, 50 1 bioreaktorov a tanku na vyfermentovanú pôdu, sterilný a pripravený na kvasenie.

5.1.3. Postup fermentácie

Na kontinuálne primáme kvasenie pivovarskej sladiny na pivo boli použité poloprevádzkové 50 l bioreaktory s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Kontrola teploty bola zaistená glykolovým tepelným plášťom, pričom cieľom bola teplota kvapaliny počas celej fermentácie 15 °C. Každý reaktor bol vybavený teplotnou sondou na meranie a tepelným termočlánkom a glykolovým solenoidovým ventilom na nastavenie prítoku glykolu do reaktora. Tieto fermentory s plynovým výťahom boli vybavené tiež plynom na primáme miešanie (oxid uhličitý alebo dusík), rovnako ako prívodom kyslíka na dávkovanie kyslíka. Požadovaná zmes plynov bola zvolená nastavením príslušnej kombinácie rotametra a ihlového ventilu a priechodom tejto plynnej zmesi sterilným filtrom (Millipore, Millex®-FG₅o, filtračná jednotka 0,2 pm) a do sacej rúrky bioreaktora. Vzduch bol pre všetky fermentácie do reaktora nastrekovaný s povrchovou rýchlosťou 0,39 mm/s (0,4 scfh), zatiaľ čo prietok primárneho miešacieho plynu bol nastavený tak, aby zodpovedal konkrétnemu typu imobilizácie.

Pred začatím kontinuálnej prevádzky bol v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom aplikovaný tradičný vsádzkový začiatok. Po vyčistení a sterilizácii postupom opísaným v sekcii 5.1.2 bol bioreaktor s plynovým výťahom naplnený 50 1 sladiny z uchovávacích tankov na sladinu (WT1 alebo WT2) a potom bolo sterilným vzorkovacím vstupom Scandi-Brew'⁸ nastreknutých 200 g kvasiniek (4 g/1). V prípade κ-karagénanových gélových perličiek bolo do reaktora nastreknulých 20 1 perličiek, čo poskytlo počiatočnú koncentráciu stredne flokulentných kvasiniek LCC3021 4 g/1. Z bioreaktorov boli denne odoberané vzorky a starostlivo sa monitoroval vývin diacetylu a špecifická hmotnosť kvapaliny. Keď dosiahla špecifická hmotnosť minimálnu hodnotu a koncentrácia diacetylu poklesla pod 30 pg/l, bol systém posúdený ako vhodný na začatie kontinuálnej prevádzky.

Fermentačné médium (sladina) bolo kontinuálne privádzané z dna reaktora, zatiaľ čo mladé pivo prepadávalo nálevkou na vrchu reaktora. Keď sa ustálil pracovný objem reaktora, bol priemerný čas zdržania kvapaliny regulovaný prietokom čerstvej sladiny do reaktora. Z reaktora boli denne odoberané pomocou sterilného vzorkovacieho ventilu (Scandi-Brew¹¹) vzorky kvapaliny na chemickú a mikrobiologickú analýzu (metódy sú opísané v kapitole 4).

Vo zvolených časových intervaloch bol z 50 1 fermentačného bioreaktora odoberaný produkt fermentácie vo väčšom množstve (40 I sterilné nádoby z nerezovej ocele) a podrobený dokvasovaciemu spracovaniu na získanie hotového predajného piva na hodnotenie a porovnanie s priemyselne vyrobeným kontrolným pivom. Zvolený 50 1 bioreaktor bol odpojený od nádoby na vyfermentovanú pôdu a ihneď napojený na zachytávaciu nádobu na pivo. Keď bola zachytená požadovaná kvapalina, bol bioreaktor napojený opäť na nádobu na vyfermentovanú pôdu. Odobraná mladina bola podrobená dokvasovacej prestávke na zníženie obsahu diacetylu v kvapaline pod 30 pg/l. Kvasinky, unášané kvapalinou, boli ponechané sa usadiť a kvapalina (koncentrácia kvasiniek ~ 1 až 5 miliónov kvasiniek/ml) bola ponechaná zrieť v chladnom sklade (7 dní pri 2 °C). Po ukončení zretia bola kvapalina prefiltrovaná, zriedená na 5 % obj. alkoholu, nasýtená oxidom uhličitým a plnená do pivných fliaš s objemom 341-ml. Všetka takto balená kvapalina potom bola podrobená pasterizácii v zariadení závodu Labatt.

5.2. Kontinuálny postup výroby gélových perličiek

Cieľom tejto sekcie experimentálnej práce bolo zhodnotiť kontinuálny postup výroby perličiek na výrobu gélových perličiek inokulovaných kvasinkami na dodávanie imobilizovaných kvasiniek LCC3021 do 50 1 kontinuálnych bioreaktorov s plynovým výťahom a sacou rúrkou, opísaných v sekcii 5.1.

Výrobný proces (OBR. 8) zahŕňal najprv vytvorenie emulzie medzi nevodnou kontinuálnou fázou (rastlinný olej) a vodnou dispergovanou fázou (κ-karagénanový gélový roztok zmiešaný s kvasinkami) s použitím statických miešadiel. Po tomto stupni nasledovalo rýchle ochladenie na vyvolanie gélovatenia polyméru. Vzniknuté perličky potom boli uvedené do roztoku chloridu draselného, ktorý podporil vytvrdenie a zároveň oddelenie perličiek od olejovej fázy.

Tvorba emulzie κ-karagénanových gélových perličiek sa uskutočňovala vo vodnom kúpeli skontrolovanou teplotou 37 °C. aby sa zabránilo predčasnému zgélovateniu karagénanového gélu. Pred začatím imobilizácie bol sterilizovaný polymér udržiavaný na vodnom kúpeli s kontrolovanou teplotou 37 °C a kvasinkové inokulum bolo uchovávané pri 20 °C. Gél a suspenzia kvasiniek boli s použitím peristaltických čerpadiel Masterflex (Cóle Parmer Company, USA), čerpané cez 24 prvkov statického miešadla s priemerom 6,4 mm, aby sa zaistila rovnomerná dispergácia kvasiniek v géle. Sterilizovaný olej, skladovaný pri teplote miestnosti, bol čerpaný (peristaltické čerpadlo Masterflex) do horúceho vodného kúpeľa, aby sa dosiahla tiež teplota 37 °C.

Inokulovaný polymér (vodná fáza) bol potom v ďalšom rade statických miešadiel zmiešaný s olejom (kontinuálna fáza) na požadovanú emulziu. Táto vzniknutá emulzia bola v kúpeli voda/ľad rýchle ochladená na 5 °C, čo vyvolalo gélovatenie kvapiek polyméru na perličky. Perličky potom boli vedené do sterilného roztoku chloridu draselného s koncentráciou 22 g/1, ktorý podporil ich vytvrdenie a umožnil ich oddelenie od olejovej fázy. Použitý olej bol recyklovaný späť do procesu a vodná fáza (perličky a roztok chloridu draselného) bola pred napustením do 50 1 bioreaktorov prenesená do zvláštnej nádoby na veľkostnú klasifikáciu.

5.2.1. Statické miešadlo - typ Kenics

V centre tohto nového výrobného procesu perličiek sú statické miešadlá Kenics (Cóle Parmer Inštrument Company, Niles, Illinois, USA). Sú tvorené radom statických prvkov, umiestnených v rúrke, ktorej vnútorný priemer je ekvivalentný priemeru statického miešadla. Tieto prvky tvoria skrížené kanáliky, ktoré podporujú rozdeľovanie a pozdĺžnu rekombináciu kvapaliny prúdiacej statickým miešadlom. Týmto miešacím systémom je ďalej vyvolané priečne lámanie týchto jemne vytvorených prúdových línií do stále homogénnejšej emulzie. Tabuľka 5.2 uvádza tri typy statických miešadiel, ktoré boli použité v tejto štúdii.

Tabuľka 5.2. Opis použitých statických miešadiel Kenics (dodal Cóle Parmer)

Model	Priemer statického miešadla D (mm)	Počet prvkov (Nr)
G-04667-04	6,4	12
G-04667-06	9,5	12
G-04667-08	12,7	12

5.2.2. Materiály na výrobu gélu

Dvoma hlavnými surovinami na výrobu gélových perličiek boli olej a polymér, kKaragénan (typ X-0909, lot 330360, Copenhagen Pectin, Dánsko), polysacharidový polymér získavaný z červených morských rias bol láskavým darom od Copenhagen Pectin A/S. Tento polymér má jedinečnú vlastnosť tepelného gélovatenia, keď je jeho teplota gélovatenia závislá od koncentrácie κ-karagénanu ([Car]) i chloridu draselného ([KC1]). Polymér bol rozpustený na koncentráciu 30 g/1 v destilovanej vode s teplotou 80 °C obsahujúcej 2,0 g/1 KC1. Vzniknutý gélový roztok mal teplotu gélovatenia 28 °C. Gél bol 1 h autoklávovaný pri 121 °C a potom umiestnený na vodný kúpeľ 40 °C, aby nestvrdol. Kukuričný olej technickej kvality (Pasquale Bros. Inc.. Kanada) bol tiež sterilizovaný 1 h pri 121 °C a potom do použitia uchovávaný pri teplote miestnosti (20 °C). Suspenzia kvasiniek bola pripravená postupom opísaným v sekcii

4.1.

5.2.3. Meranie priemeru perličiek

Vzorky perličiek boli odoberané na výstupe z výmenníka tepla 5 °C do baniek obsahujúcich 100 ml roztoku KC1 s koncentráciou 22 g/1. Perličky boli ponechané ponorené v tomto roztoku 2 h, aby sa podporilo ich vytvrdenie. Olej bol z vodnej fázy odstránený postupným vymývaním roztokom chloridu draselného. Potom boli vzorky do analýzy uchovávané pri 4 °C na zamedzenie mikrobiálnej kontaminácie.

Meranie priemeru perličiek sa uskutočňovalo s použitím softwaru na analýzu obrazu

Optimas (Version 4.02, BioScan. Inc, USA) napojeného na videokameru (Pentax Macro 50 mm). Vzorka perličiek bola prenesená na Petriho misku obsahujúcu tenký film vody (použitý na separáciu perličiek) a potom umiestnená pod kameru. Pomocou tohto systému sa zmeralo celkom 300 až 400 perličiek. Spoľahlivosť softwaru Optimas leží medzi 100 pm a niekoľkými mm s maximálnou absolútnou chybou 30 pm. Údaje získané z Optimas boli ďalej analyzované pomocou Microsoft Excel. Získané distribúcie veľkostí vzoriek boli charakterizované stredným priemerom vzorky (Dr) a variačným koeficientom (COV).

5.2.4. Hodnotenie systému perličiek - plán experimentu

Porovnali sa celkom 3 priemery statického miešadla (D_s = 6,4 mm, 9,5 mm a 12,7 mm) na zistenie, aký typ populácie perličiek sa bude produkovať, merané stredným priemerom perličky vo vzorke a variačným koeficientom distribúcie veľkostí. Počet prvkov statického miešadla (N_s) sa pohyboval medzi 12 a 120 a bola študovaná objemová frakcia polyméru (c_c) medzi 8,3 % v/v a 50 % v/v gélu v olejovom roztoku. Nad e_c 50 % sa prevráti dispergovaná (gél) a kontinuálna (olej) fáza. tzn. vznikne inklúzia olejových kvapiek v polymémej matrici namiesto gélových kvapiek v olejovej matrici. Povrchová rýchlosť kvapaliny emulzie olej/gél v rezu emulziou bola nastavená v rozmedzí 3,6 cm/s až 17,8 cm/s. Povrchová rýchlosť kvapaliny (Vsi.) v statickom miešadle emulzie bola vypočítaná z rovnice:

Vsl (Qoil⁺ QcarVS kde S je plocha prierezu potrubia, ktoré obsahuje statické miešadlo, Q₀;j je objemový prietok olejovej fázy a Q_car je objemový prietok karagénanového gélového roztoku.

Výsledky a diskusia: Fermentácia a dynamika miešania v 50 1 bioreaktoroch s plynovým výťahom

Použitie imobilizovaných kvasiniek na výrobu etanolu bolo publikované. V posledných dvoch desaťročiach sa výskumníci pokúšajú proces výroby etanolu optimalizovať spojením technológie imobilizovaných kvasiniek s kontinuálnym procesom (Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella. 1983). Mnohí dosiahli značný úspech a použitie kontinuálnych systémov s imobilizovanými kvasinkami sa začalo priemyselne používať. Aplikácia takéhoto kontinuálneho postupu v pivovarníckom priemyslu pre primáme kvasenie piva však nie je tak jednoduchá. Pivo nie je tvorené len etanolom, ale i mnohými chuť dodávajúcimi zlúčeninami, ktoré finálnemu produktu dodávajú ako komplexnosť, tak hĺbku. Nasledujúca kapitola opisuje výsledky, získané autorom pri skúmaní výroby vyrovnaného piva v poloprevádzkovom fermentore GLDT.

6.1. Vsádzkové kvasenie v pilotnom systéme GLDT

Vsádzkové kvasenie s voľne suspendovanými kvasinkami sa uskutočňovalo v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou v poloprevádzkovom (pilotnom) meradle. Tieto pokusy poskytli príležitosť zhodnotiť schodnosť použitia takéhoto systému na kvasenie sladiny na pivo. Okrem toho tieto pokusy poslúžili na stanovenie kritéria na budúce porovnanie s nepretržitým kvasením. V 50 1 bioreaktore sa uskutočnili dve vsádzkové kvasenia s použitím kmeňa ležiakových kvasiniek z Labatt Culture Collection (LCC3021). V priebehu kvasenia bola sledovaná rýchlosť rastu kvasiniek, rovnako ako spotreba živín a vylučovanie produktu.

Obr. 6.1 a 6.2 znázorňujú profily koncentrácie a životnosti kvasiniek pre vsádzkové kvasenie 1, resp. 2. V oboch prípadoch rast kvasiniek sledoval klasické parametre publikované v literatúre. Životnosť, meraná metylénovou modrou, zostávala stále vysoká a hodnoty zostávali okolo 90 %. Profil koncentrácie uhľohydrátov pre vsádzku 1, resp. 2, je uvedený na obr. 6.3. resp. 6.4. Ako prvé pohlcovali kvasinky jednoduché cukry, glukózu a fruktózu, a potom došlo na spotrebu maltózy a maltotriózy. Hladiny maltotetrózy a väčších polysacharidov zostali v priebehu kvasenia nezmenené.

Jedným z najdôležitejších vedľajších produktov metabolizmu kvasiniek je etanol. Optimalizovaným anaeróbnym kvasením vznikne asi 48 g etanolu a 47 g oxidu uhličitého na 100 g metabolizovanej glukózy. Ďalej vznikne malé množstvo glycerolu (3,3 g na 100 g glukózy), pretože tento vedľajší produkt sa zúčastňuje na udržiavaní redox rovnováhy vo fermentujúcich kvasinkách a taktiež podporuje osmotickú rovnováhu kvasiniek, najmä v hypertonickom prostredí. Obr. 6.5 a 6.6 ilustrujú vývoj koncentrácie etanolu a glycerolu v priebehu kvasenia. Hladina etanolu stúpa na začiatku kvasenia veľmi pomaly v dôsledku prítomnosti kyslíka vo fermentačnom prostredí, pretože kvasinky sú v aeróbnej fáze svojho rastu. Keď sa kyslík spotrebuje, stúpa hladina etanolu exponenciálne až do spotrebovania skvasiteľných cukrov, a v tomto okamžiku sa koncentrácia ustáli. Veľmi významnými vedľajšími produktmi metabolizmu kvasiniek sú ďalej vicinálne díketóny. Celkové koncentrácie diacetylu a pentándiónu pre vsádzky 1 a 2 sú uvedené na obr. 6.7 a 6.8. Tieto zlúčeniny stúpali počas kvasenia až asi do 40 h, čo zodpovedá maximálnej koncentrácii kvasiniek, a sú výsledkom syntéz aminokyselín, ktorým kvasinky podliehajú počas svojej rastovej fázy.

V poslednej časti kvasenia sú diacetyl, pentándión a ich prekurzory α-acetolaktát a aketobutyrát kvasinkami premieňané na zodpovedajúce, menej chuťovo výrazné dioly.

Z výsledkov uvedených v tejto sekcii sa javí, že obe vsádzkové kvasenia prebehli v bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou normálne. Rast kvasiniek a pohlcovanie uhľohydrátov prebiehalo očakávaným spôsobom, rovnako ako tomu bolo pri vedľajších produktoch etanolu, diacetylu a pentándiónu. Porovnanie údajov zjednotlivých vsádzok ukazuje, že obe vsádzky kvasili veľmi podobným spôsobom. Obr. 6.9 porovnáva koncentráciu etanolu zo vsádzok 1 a 2. Jednotlivé krivky sledujú rovnaký profil, pričom sa mnohé body navzájom prekrývajú, čo naznačuje úroveň reprodukovateľnosti. Aj keď sa však poradie spotreby substrátov a následné vylučovanie produktov v systéme s plynovým výťahom nezmenilo, zmenila sa rýchlosť kvasenia. Dokončenie primárneho kvasenia, reprezentovaného maximálnou koncentráciou etanolu, bolo pri oboch vsádzkach dosiahnuté po asi 80 až 85 h. Zníženie obsahu diacetylu pod 30 pg/l sa dosiahlo za ďalších 20 h. Tieto výsledky naznačujú, že primáme kvasenie vysokostupňovej sladiny je možné dokončiť počas asi 100 h oproti 120 až 168 h pri tradičnom vsádzkovom kvasení ležiaka. K tomuto skráteniu času kvasenia prispelo premiešavame v bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou v dôsledku zvýšeného prestupu hmoty, ktorý tento systém umožňuje. Na základe týchto informácií boli ďalšie fermentačné pokusy uskutočňované s predpokladom, že bioreaktor s plynovým výťahom a sacou rúrkou nemení významne fermentačný metabolizmus kvasiniek a že fermentácia s voľne suspendovanými kvasinkami v tomto systéme môže skrátiť čas kvasenia o aspoň 20 h.

- A Koncentrácia kvasiniek · - Životnosť

Obr. 6.1. Celková koncentrácia a životnosť kvasiniek proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 1 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

A “ Koncentrácia kvasiniek - Životnosť «

o c

4-»

O >

>N

Obr. 6.2. Celková koncentrácia a,.životnosť kvasiniek proti času feranentácie pre vsádzkovú fermentáciu 2 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

-O-polysacharidy maltotetróza -maltotrióza ♦-maltóza fruktóza «glukóza

Obr. 6.3. Profil koncentrácie uhľohydrátov proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 1 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

Obr. 6.4. Profil koncentrácie uhľohydrátov proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 2 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

etanol -O- glycerol

Obr. 6.5. Koncentrácia etanolu a glycerolu proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 1 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

Obr. 6.6. Koncentrácia etanolu a glycerolu proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 2 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

Obr. 6.7. Koncentrácia diacetylu a pentándiónu proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 1 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

Čas fermentácie (h) —B—- diacetyl · - pentándión

Obr. 6.8. Koncentrácia diacetylu a pentándiónu proti času fermentácie pre vsádzkovú fermentáciu 2 s kvasinkami LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

♦ Vsádzka 1 □ Vsádzka 2

Obr, 6.9. Porovnanie koncentrácie etanolu pre vsádzku 1 a vsádzku 2 proti času fermentáeie. Použili sa kvasinky LCC3021 v pilotnom GLDT bioreaktore.

6.2. Imobilizačné nosiče

Počas tohto výskumného projektu sa skúmalo niekoľko nosičov na identifikáciu najsľubnejších alternatív pre budúce vývojové práce. V 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou boli testované tri odlišné spôsoby imobilizácie. Hodnotili sa dva komerčne dostupné adsorpčné nosiče ds veľkosťou v rozmedzí medzi 1 a 2 mm. Testované boli výrobky ® . ®

Siran , nosič zo sklenených perličiek, dodávaný firmou Schott Engineering (obr. 9), a Celite , perličky z rozsievkovej zeminy, poskytované firmou World Minerals (obr. 10), kvôli svojej uvádzanej ľahkej manipulovateľnosti a svojej komerčnej dostupnosti. Nosiče na adsorpčnej báze poskytujú možnosť viac aseptickej prevádzky, pretože reaktor sa dá najprv naplniť nosičom, na mieste sterilizovať a nakoniec naočkovať kvasinky priamo do reaktora. Z priemyselného hľadiska je táto alternatíva veľmi atraktívna, pretože nosič nevyžaduje špeciálne uskladnenie a závod nemusí významne meniť svoju inokulačnú prax.

Počiatočné výsledky fermentáeie s oboma týmito nosičmi v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou boli nepriaznivé. Problémy, ktoré vznikli, boli väčšinou dôsledkom vysokej hustoty častíc produktov Siran a Celite v porovnaní s kvapalným médiom. Trojfázové systémy s plynovým výťahom a sacou rúrkou fungujú najlepšie, ak sa udržiava pomer hustoty kvapaliny a nosiča blízko jednej. V prípade Siran® bol pomer 1,34, zatiaľ čo pomer pre Celíte® bol 1,31. Dôsledkom takéhoto veľkého rozdielu hustôt medzi pevnou a kvapalnou fázou bolo významné zvýšenie minimálnej rýchlosti fluidizácie plynu nutné na prevádzku 50 1 bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pre 4 1 nosiča Siran® (pevný podiel 8 % v/v) bola na dosiahnutie cirkulácie nutná rýchlosť plynu 21,5 mm/s (vztiahnuté na priemer sacej rúrky). Táto vyššia rýchlosť plynu nebola vážnym problémom, pokiaľ sa test uskutočňoval vo vodnom roztoku, avšak keď bola kvapalným médiom sladina, došlo v systéme plynového výťahu so sacou rúrkou (GLDT) ku katastrofickému zlyhaniu. Požadovaná rýchlosť plynu spôsobila v reaktore nadmerné penenie, ktoré nakoniec znížilo hladinu kvapaliny až pod saciu rúrku, čím sa zastavila cirkulácia kvapaliny a pevného podielu. Podobné zlyhanie ako v prípade nosiča Siran® nastalo, keď bol ako imobilizačný materiál použitý Celíte®. Kvôli týmto výsledkom sa v ďalších testoch fermentácie s plynovým výťahom od týchto nosičov na adsorpčnej báze upustilo.

Použitie nosiča na báze záchytu, ako je κ-karagénan, umožnilo plniť systém 40 % (v/v) pevného podielu a na jeho fluidizáciu a následnú cirkuláciu potom bola vyžadovaná rýchlosť plynu asi 0,17 m³/h (povrchová rýchlosť plynu 5,8 mm/s). Pozitívne výsledky, získané pri prevádzke systému s perličkami kvasiniek, zachytených na karagénane, boli dôsledkom nižšej hustôt}' nosiča (asi 1100 kg/m³) a z toho vyplývajúcej ľahkosti fluidizácie. Podobne sa dosiahla požadované náplň pevného podielu pri autoagregujúcich kvasinkách LCC 3021 (stredne flokulentné) a LCC290 (superflokulentné) pri rýchlosti fluidizácie plynu približne 3 mm/s, nutnej na zaistenie správnej cirkulácie. Sekcia 6.2.1 opisuje podrobnejšie κ-karagénanový gélový nosič a sekcia 6.2.2 opisuje autoagregujúce kvasinky - vločky LCC3021 a vločky LCC290, ktoré boli hodnotené ako imobilizačné matrice na kontinuálnu primárnu fermentáciu v 50 1 fermentore GLDT.

6.2.1. κ-Karagénanové gélové perličky

Imobilizačné metódy na báze záchytu vyžadujú uzavretie kvasiniek v matrici pred ich vnesením do fermentačnej nádoby. Pretože inokulácia in situ v reaktore nie je v súčasnosti uskutočniteľná, je nutné tieto gélové perličky získať pred začatím fermentácie. Doteraz nie je jasné, aké účinky má na inokulované gélové perličky dlhodobejšie skladovanie. Aby sa minimalizoval akýkoľvek možný negatívny vplyv skladovania, bolo rozhodnuté zhotoviť veľké množstvo gélových perličiek v krátkom čase (8 h). Na tento účel bol preto použitý proces výroby perličiek so statickým miešadlom, opísaný v sekcii 5.2. Ideálne perličky by mali mať priemer častíc (Db) medzi 0,8 mm a 1,4 mm s variačným koeficientom (COV) distribúcie veľkostí udržovaným na minime. Na získanie požadovaného množstva a konzistencie perličiek bolo nutné upraviť niekoľko parametrov procesov výroby perličiek. V nasledujúcej sekcii je zhrnutý výber parametrov procesu výroby perličiek a v sekcii 6.2.1.2 sú opísané perličky použité v testoch kontinuálnej fermentácie.

6.2.1.1. Proces výroby perličiek. Voľba premenných

Charakterizácia procesu výroby perličiek bola uskutočnená v spolupráci s ďalšími výskumníkmi s dôrazom kladeným na tieto parametre procesu: priemer statického miešadla (D_s), počet prvkov statického miešadla (N_s), povrchový prietok kvapaliny (V_SL) a objemová frakcia polyméru (sc). Výsledky získané počas experimentov sú zhrnuté v obr. 6.12 až 6.21.

Obr. 6.12 znázorňuje typickú distribúciu veľkostí častíc získanú procesom imobilizácie kvasiniek karagénanovým gélom so statickým miešadlom. V tomto príklade boli použité nasledujúce parametre: priemer statického miešadla 12,7 mm, 60 prvkov statického miešadla, povrchová rýchlosť kvapaliny 10,5 cm/s a objemová frakcia polyméru 0,25. Nameral sa stredný priemer perličiek 701 pm s variačným koeficientom 45 %. Zdá sa, že kumulatívna distribúcia veľkostí, znázornená na obr. 6.13, zodpovedá normálnej kumulatívnej distribúcii, vypočítanej zo strednej a štandardnej odchýlky vzorky. Na testovanie normality bola použitá de Kolmorogofova-Smimovova metóda (Scheaffer et McClave, 1990). Maximálny rozdiel medzi experimentálnymi údajmi a údajmi upravenými (K-S štatistika D) bol vypočítaný na 0,0274. Modifikovaná D hodnota zodpovedajúca údajom podľa normálnej distribúcie musí ležať pod 0,895 s hladinou spoľahlivosti 95 %. V našom prípade bola vypočítaná D hodnota 0,174, teda bezpečne pod 0,895, a dá sa odvodiť, že naše údaje zodpovedajú normálnej distribúcii.

Všetky údaje, získané z tohto procesu výroby perličiek, vykázali distribúciu veľkostí s iba jedným píkom. Poncelet et al· (1992) však opísali pre alginátové perličky, získané dispergáciou v miešanom tanku, výskyt satelitných píkov a/alebo sekundárneho piku, zodpovedajúceho perličkám s priemerom menším než 200 Pm. Je možné, že malé perličky, vzniknuté pri našom procese, proste zmizli počas stupňa premývania perličiek, a teda sa v našich údajoch z distribúcie veľkostí neobjavujú.

Účinky povrchovej rýchlosti kvapaliny a priemeru statického miešadla na stredný priemer perličiek a na variačný koeficient distribúcie veľkostí sú znázornené na obr. 6.14, resp. 6.15. Stredný priemer perličiek klesá so vzrastom povrchovej rýchlosti pri všetkých troch priemeroch statického miešadla s výraznejším efektom pre statické miešadlo 12,7 mm. So statickými miešadlami s menšími priemermi (6,4 mm a 9,5 mm) sa pri všetkých testovaných rýchlostiach kvapaliny nezískali perličky so stredným priemerom väčším než 700 pm, zatiaľ čo so statickým miešadlom s priemerom 12,7 mm sa perličky väčšie než 700 pm získali pri rýchlostiach kvapaliny pod 11 cm/s. Všetky tri priemery statického miešadla viedli k variačnému koeficientu medzi 38 % a 58 %. Zdalo sa taktiež, že pri zvyšovaní rýchlosti variačný koeficient vo všetkých troch prípadoch klesal. Variačný koeficient sa menil s priemerom statického miešadla, pričom najnižšie hodnoty sa dosahovali s najmenším priemerom statického miešadla.

Pri povrchovej rýchlosti kvapaliny 3,5 cm/s sa zdalo, že objemová frakcia polyméru ovplyvňuje stredný priemer perličiek, zatiaľ čo rýchlosti nad 7 cm/s nespôsobujú relatívne žiadny rozdiel v experimentálnych hodnotách s_c pohybujúcich sa medzi 0,083 a 0,5 (obr. 6.16). Pri zvyšujúcich sa povrchových rýchlostiach kvapaliny sa zdal byť malý alebo vôbec žiadny účinok objemovej frakcie polyméru na variačný koeficient (obr. 6.17).

Obr. 6.18 a 6.19 znázorňujú vplyv povrchovej rýchlosti kvapaliny a počtu prvkov statického miešadla na stredný priemer perličiek. So zvyšujúcou sa rýchlosťou kvapaliny stredný priemer perličiek klesal pre všetky obmeny počtu prvkov statického miešadla (obr. 6.18). Stredný priemer perličiek pri danej rýchlosti kvapaliny bol podobný pre 24 až 120 prvkov, zatiaľ čo konfigurácia s 12 prvkami viedla k priemeru perličiek väčšiemu než ostatných 5 testovaných konfigurácií. Obr. 6.19 taktiež ukazuje, že stredný priemer perličiek dosahuje minimum nad 24 prvkami statického miešadla.

Obr. 6.20 znázorňuje vplyv povrchovej rýchlosti kvapaliny na variačný koeficient rôznych počtov prvkov statického miešadla. Zdá sa, že rýchlosť kvapaliny v testovaných konfiguráciách variačný koeficient neovplyvnila. Vplyv počtu prvkov statického miešadla na variačný koeficient bol výraznejší (obr. 6.21). Variačný koeficient klesal so vzrastom počtu prvkov statického miešadla a dosiahol maximum 45 % pri 60 prvkoch a viac. Tieto výsledky sú konzistentné pre povrchové rýchlosti kvapaliny v rozmedzí 3,6 cm/s až 17,8 cm/s.

ΊΟ

Malo sa za to, že zväčšenie priemeru statického miešadla (D_s) by malo v miešadle vytvoriť heterogenitu šmykových síl, ktorá by viedla ku zvýšeniu rozptylu veľkostí, merané variačným koeficientom. Súčasne by zväčšenie D_s znížilo intenzitu šmykových síl, a tak zväčšilo stredný priemer perličiek. Oba tieto účinky boli pozorované v experimentoch so statickým miešadlom s najmenším priemerom s produkciou perličiek s najmenším stredným priemerom (400 pm až 500 μπι), a s najnižším variačným koeficientom (približne 40 %) alebo rozptylom veľkostí.

Energia nutná na vytvorenie emulzie je úmerná ploche rozhrania tvorenej polymérom a olejovou fázou. Čím menšia je veľkosť častíc, tým väčšia je energia nutná na jej vytvorenie. Berkman a Calabrese (1988) ukázali, že zvýšenie priemernej povrchovej rýchlosti kvapaliny (V_s) provokuje vzrast disipovanej energie na jednotku hmoty tekutiny, čo uprednostňuje zmenšenie veľkosti perličiek. Zvýšenie priemernej povrchovej rýchlosti kvapaliny (testované medzi 3,6 cm/s a 17,8 cm/s) viedlo ku zníženiu priemernej veľkosti perličiek. Takéto zvýšenie rýchlosti vyvoláva tlakový diferenciál medzi vstupom a výstupom statického miešadla. Tento tlakový diferenciál je úmerný disipovanej energii na jednotku hmoty kvapaliny. Zvýšenie rýchlosti preto vyvoláva zvýšenie disipovanej energie systému, ktoré podporuje zmenšenie veľkosti perličiek. Zmenšovanie priemeru perličiek D_B bolo pozorované so zvyšovaním povrchových rýchlostí kvapaliny. Al Taweel a Walker (1983) preukázali, že pri vysokých rýchlostiach, zodpovedajúcich úrovni významnej turbulencie, sa nastolí dynamická rovnováha medzi tvorbou perličiek a koalescenciou medzi perličkami. Pri konštantnom priemere statického miešadla (D_s) a počte prvkov (N_s) mala povrchová rýchlosť malý vplyv na variačný koeficient. Rýchlosť je preto parametrom, ktorý umožňuje manipuláciu a voľbu stredného priemeru perličiek bez významnej modifikácie rozptylu veľkostí.

V rozsahu tohto výskumu mala objemová frakcia karagénanového gélu (s_c) malý vplyv ako na stredný priemer perličiek, tak na variačný koeficient s výnimkou najmenšej študovanej rýchlosti 3,6 cm/s, keď stredný priemer perličiek klesal s poklesom e_c. Audet a Lacroix (1989) študovali tento parameter na výrobu karagénanových perličiek v dvojfázovom disperznom systéme (vsádzkový miešaný tank, nie kontinuálny proces so statickým miešadlom) a vyvodili, že pre roztok polyméru s koncentráciou karagénanu 3 % hmotn. nemá e_c žiadny vplyv na stredný priemer perličiek. Konkrétny vplyv koncentrácie ^K-karagénanového gélu na distribúciu veľkostí perličiek skúmali Audet a Lacroix (1989), ktorí ukázali, že tento parameter distribúciu veľkostí silne ovplyvňuje. Zvyšujúce sa koncentrácie gélu mali za následok zvyšujúci sa stredný priemer perličiek (D_B) a variačný koeficient (COV). Zaznamenaný účinok bol prisúdený zvýšenej viskozite gélu pri vyšších koncentráciách, vedúcej k nižším šmykovým rýchlostiam na emulzii, a teda k väčším perličkám. Aj keď v tejto práci nebol študovaný vplyv koncentrácie gélu na veľkosť perličiek, môže byť v prípade potreby použitý ako ďalší prostriedok regulácie veľkosti perličiek.

Zvýšenie počtu miešacích prvkov (N_s) zvyšuje priemerný čas zdržania, ktorý strávi prvok tekutiny vo vnútri statického miešadla, čo vedie k homogénnejšej zmesi, a teda ku vzniku menších a tesnejšie dispergovaných perličiek. Počas experimentov bola dosiahnutá v disperzii rovnováha (merané variačným koeficientom) okolo 60 až 72 prvkov. Middleman (1974) ukázal, že v prípade emulzií s nízkou viskozitou (0,6 až 1,0 cP) postačuje na dosiahnutie takej rovnováhy 10 prvkov. Karagénanový roztok, použitý v týchto experimentoch [3% w/v)]. mal priemernú viskozitu 200 cP a viskozita oleja bola 25 cP. V dôsledku toho táto vyššia viskozita vyžadovala na dosiahnutie pseudohomogenity dlhší čas zdržania v miešadle.

Obr. 6.12. Typická distribúcia veľkostí perličiek získaných procesom s použitím statického miešadla. Parametre procesu v tomto príklade: Ds = 12,7 mm, Ns = 60, Vsl = 10,5 cm/s a cc = 0.25.

Obr. 6.13. Typická kumulatívna distribúcia veľkostí perličiek získaných procesom s použitím statického miešadla. Parametre procesu v tomto príklade: Ds = 12,7 mm, Ns = 60, Vsl = 10,5 cm/s a Ec = 0,25.

• Ds=12.7 Ds=9.5 ADs=6.4

Obr. 6.14. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) proti strednému priemeru perličiek (pm).

Hodnotili sa tri rôzne priemery statického miešadla (D_s 12,7 mm, 9,5 mm a 6,4 mm). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol udržiavaný konštantné na 48 a polyméma frakcia (sc) bola nastavená na 0,25.

Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s)

I !· Ds=12.7 Ds=9.5 ▲ Ds=6.4 |

Obr. 6.15. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) proti variačnému koeficientu priemeru perličiek (%).Hodnotili sa tri rôzne priemery statického miešadla (D_s 12,7 mm, 9,5 mm a 6,4 mm). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol udržiavaný konštantné na 48 a polyméma frakcia (sc) bola nastavená na 0,25.

♦ ε=0.5 ε=0.25 Αε=0.125 · ε=0.083 j

Obr. 6.16. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s). Proti strednému priemeru perličiek (pm). Boli hodnotené štyri polyméme frakcie (ec 0,5, 0,25, 0,125 a 0,083). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol udržiavaný konštantné na 48 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7 mm.

[♦ ε=0.5 ε=0,25 Α ε=0.125 · £=0.083

Obr. 6.17. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) proti variačnému koeficientu priemeru perličiek (%).Hodnotili sa štyri polyméme frakcie (ec 0,5, 0,25, 0,125 a 0,083). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol udržiavaný konštantné na 48 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7 mm.

mm.

Obr. 6.18. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) proti strednému priemeru perličiek (pm). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol menený na 12, 24, 48, 60, 72 a 120. Polyméma frakcia (e_c) bola udržiavaná konštantné na 0,25 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7

♦ Ns=12· Ns=24A Ns=48A Ns=60a Ns=72· Ns=120

Obr. 6.19. Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) proti variačnému koeficientu priemeru perličiek (pm). Počet prvkov statického miešadla (N_s) bol menený na 12, 24, 48, 60, 72 a 120. Polyméma frakcia (ες) bola udržiavaná konštantné na 0,25 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7 mm.

♦ VSL=3.6 BVSL=7.0 aVSL=10.6 ·νδΐ=13.2 DVSL=17.8

Obr. 6.20. Stredný priemer perličiek (pm) proti počtu prvkov statického miešadla (N_s). Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) bola menená na 3,6, 7,0, 10,6, 13,2 a 17,8. Polyméma frakcia (f-c) bola udržiavaná konštantné na 0,25 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7 mm.

Obr. 6.21. Variačný koeficient priemeru perličiek (%) proti počtu prvkov statického miešadla (N_s). Povrchová rýchlosť kvapaliny (cm/s) bola menená medzi 3,6 a 17,8. Polyméma frakcia (ες) bola udržiavaná konštantné na 0,25 a priemer statického miešadla (D_s) bol nastavený na 12,7 mm.

6.2.1.2. Proces výroby perličiek: charakteristika κ-karagénanovej perličky

Z údajov uvedených v predchádzajúcej sekcii bolo možné zvoliť parametre procesu výroby perličiek s požadovanými charakteristikami pre fermentačné pokusy. Na minimalizáciu variačného koeficientu pre konkrétny priemer statického miešadla bolo zvolených 60 prvkov na vytvorenie emulzie olej-gél. Zvolili sa perličky so stredným priemerom približne 1 mm na minimalizáciu externého prenosu hmoty a na uľahčenie separácie mechanickými prostriedkami od fermentačnej kvapaliny. S týmto cieľom sa zvolilo najväčšie testované statické miešadlo (12,7 mm) a najnižšia testovaná rýchlosť (3,6 cm/s). Pretože polyméma frakcia mala na variačný koeficient malý vplyv, bol použitý pomer gélu k oleju 50/50 (ε = 0,5) na maximalizáciu produktivity perličiek.

V laboratóriu bolo s použitím postupu opísaného v sekcii 5.2 s hodnotami D_s = 12,7 mm, N_s - 60, V_SL = 3,9 cm/s a sc = 0,5 vyrobených niekoľko šarží gélových perličiek so zabudovanými kvasinkami LCC3021. Získané perličky (obr. 11) boli preosiate na rade sít na odstránenie perličiek väčších než 2,0 mm a menších než 0,5 mm. Získaná distribúcia veľkostí častíc je znázornená na obr. 6.23. Obr. 6.24 ilustruje kumulatívnu distribúciu veľkostí

ΊΊ týchto perličiek. Toto bola typická distribúcia použitá v 50 1 fermentačných pokusoch s plynovým výťahom.

Obr. 6.23. Distribúcia veľkostí κ-karagénanových gélových perličiek použitých v kontinuálnych fermentačných pokusoch v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou.

Obr. 6.24. Kumulatívna distribúcia veľkostí κ-karagénanových gélových perličiek použitých v kontinuálnych fermentačných pokusoch v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou.

6.2.1.3. Limitácia perličkového procesu vzhľadom na aplikáciu v priemyselnom meradle

Bol vyvinutý a v poloprevádzkovom meradle aplikovaný proces produkujúci 10 1 perličiek za hodinu s použitím statického miešadla. Predtým, než môže byť uvažovaná výroba perličiek v priemyselnom meradle, vyžadujú niektoré aspekty tohto procesu ďalší vývoj a/alebo optimalizáciu. Nevyhnutné je zvýšenie objemovej produktivity systému, aby mohol byť poskytovaný objem imobilizovaných kvasiniek, požadovaný ako vstup do veľkorozmerového bioreaktora. Napríklad 2000 hl bioreaktor s plynovým výťahom a sacou rúrkou by vyžadoval približne 800 hl perličiek. Na dosiahnutie týchto objemov je nutné zvýšenie prietoku gélu aj oleja. Z údajov vyplýva, že dosiahnuté zvýšenie rýchlosti s použitím statických miešadiel s priemerom 6,4 mm až 12,7 mm vedie ku vzniku perličiek príliš malých na to, aby mohli byť použité vo fermentačnom systéme. Preto by bolo potrebné zväčšiť priemer statických miešadiel, a tak zvýšiť strední priemer perličiek. Avšak použitím statických miešadiel s väčším priemerom sa tiež zvýši rozptyl veľkosti perličiek a vzniká väčšie množstvo perličiek s veľkosťou mimo požadovaného rozmedzia.

Inou možnosťou by bolo použitie systému so statickými miešadlami strednej veľkosti (12,7 mm), umiestnenými paralelne. So systémom s desiatimi statickými miešadlami sú predstaviteľné produktivity dosahujúce 100 1/h. Pri priemyselnom príklade 2000 hl by proces bežal kontinuálne 800 hodín alebo približne 34 dní, aby bol produkovaný požadovaný objem perličiek. Bolo by možné použiť rôzne systémy na skrátenie produkčného času, avšak to by pridávalo navyše ďalšiu úroveň zložitosti. Produkčný čas by sa mohol stať menším problémom, keby bolo možné perličky na zamýšľaný čas skladovať so zachovaním životnosti kvasiniek. Je predstaviteľné, že by mohol byť vyvinutý proces sušenia perličiek alebo ich skladovanie vo vákuovej nádobe.

Poncelet a spolupracovníci (1993) publikovali prácu naznačujúcu, že je treba brať do úvahy typ statického miešadla, použitého na vytvorenie disperzie. S ich navrhovaným systémom s použitím iného typu statického miešadla, oproti typu Kenics, použitému v tomto výskume, by mohlo byť možné používať miešadlo s väčším priemerom bez ohrozenia veľkostnej distribúcie perličiek (so zachovaním nízkeho variačného koeficientu).

Ďalšie problémy doterajšieho pilotného procesu zahŕňajú prácu systému pri 40 °C a použitie rastlinného oleja a roztoku chloridu draselného na produkciu perličiek. Z dôvodu vysokej produkčnej teploty vyžaduje proces ako vyhrievacie, tak chladiace systémy.

Potenciálny tepelný šok, ktorému sú vystavené kvasinky, vyžaduje ďalší výskum, aby bolo možné urobiť odhad možných negatívnych dôsledkov. V tejto štúdii boli produkované perličky imobilizovaných kvasiniek s vysokou životnosťou (nad 90 %), ale neboli skúmané žiadne ďalšie vplyvy, ktoré by proces mohol mať na populáciu kvasiniek.

Pretože sa na vytvorenie požadovanej emulzie a následne tvorbu perličiek používa olej a pretože olej pôsobí ako tenzid, a teda potláča tvorbu peny, je problémom zvyškové množstvo oleja na povrchu perličiek. Tento zvyšok síce pomáha počas fermentačného stupňa, ale jeho prenesenie do konečného piva by bolo nežiaduce, pretože pena je v konečnom produkte žiaduca. Pozornosť vyžadujú veľké objemy roztoku chloridu draselného, používaného na separáciu pevnej fázy (perličiek) od oleje, a metóda odstraňovania tohto soľného roztoku zo suspenzie perličiek pred zavedením perličiek do bioreaktora. Inak môže nastať nutnosť vypláchnuť tento roztok z reaktora po prídavku perličiek do reaktora.

Pretože sa perličky imobilizovaných kvasiniek vyrábajú mimo bioreaktora, je potrebné počas celého procesu tvorby perličiek používať aseptické metódy a dodržiavať sterilitu až do vnesenia perličiek do bioreaktora. Príležitosť na kontamináciu poskytujú rôzne prenosové body medzi tankami a je potrebné ich monitorovať, pretože prítomnosť nečistoty môže vyústiť do jej imobilizácie v perličke spolu s kvasinkami. V dôsledku riadnej starostlivosti v laboratóriu bolo možné produkovať konzistentne aseptické perličky. Prostredia v priemyselnom zariadení však nemusí byť tak priaznivé ako v laboratóriu, a preto vyžaduje prísnejšiu kontrolu.

6.2.2. Flokulentné kvasinky

Jednou z najprirodzenejších foriem imobilizácie je autoagregácia mikroorganizmu do vločiek buniek. Calleja a Johnson (1977) navrhli tri možné dôvody, prečo sa bunky zhlukujú do agregátov, s odlišnými väzbovými vlastnosťami. Prvý predstavujú bunky odlišných pohlaví, ktoré sú navzájom priťahované uvoľňovanými feromónmi (faktory ct a a). Tento typ väzby je dočasný a je tvorený väzbou proteín-proteín medzi aglutinínmi a a a, ukotvenými v stenách komplementárnych buniek.

Bunky môžu tiež agregovať tak, že nedôjde k oddeleniu od materskej bunky počas procesu pučania. Tento nedostatok môže byť vlastný konkrétnemu kmeňu kvasiniek alebo môže byť spôsobený nedostatkom živín alebo mutácií niektorých génov. Tento jav sa označuje ako tvorba reťazca a nie flokulácia. Väzby medzi týmito kvasinkami je možné nevratne porušiť mechanickým šmykovým namáhaním (Stratford, 1996).

Tretí scenár je všeobecne známy ako flokulácia. Stewart a Russell (1981) flokuláciu definovali ako vratný “jav, pri ktorom sa kvasinky zhlukujú do chumáčov a buď rýchle sedimentujú z média, v ktorom sú suspendované, alebo stúpajú k povrchu média ”, Rozsiahle dôkazy naznačujú, že flokulácia je riadená geneticky a mechanizmus flokulácie spočíva na vybraných molekulách, ktoré pôsobia ako mostíky medzi stenami susedných buniek. Konkrétne sa má za to, že určité lektíny sú viazané na α-manány susediacich buniek v prítomnosti Ca²⁺ iónov (Calleja a Johnson, 1977). Táto väzba proteín/uhľohydrát, je, ako sa ukázalo, vratne inhibovaná chelatačnými činidlami alebo určitými cukrami.

OBR. 12 znázorňuje tri možné konfigurácie kvasiniek, konkrétne neflokulentné kvasinky, kvasinky tvoriace reťazce a flokulentné kvasinky. V prípade kvasiniek tvoriacich reťazce, aj keď sú bunky agregované, sa to nepovažuje za typ flokulácie, pretože tieto bunky neboli na začiatku nikdy samostatné a flokulácia znamená, že sa samostatné bunky zhlukujú na hmotu v dôsledku priaznivých okolitých podmienok (Ca²⁺ ióny a nízka hladina inhibičných cukrov). V prípade flokulentných kvasiniek môže byť konkrétna veľkosť vločky závislá od genetiky bunky, rovnako ako od hydrodynamických podmienok, ktorým je bunka vystavená (šmykové pôsobenie).

OBR. 13 a OBR. 14 znázorňujú dva kmene ležiakových kvasiniek Labatt s rôznymi stupňami flokulácie. Stredne flokulentný kmeň kvasiniek LCC3021 je znázornený na obr. 13. V prítomnosti vápenatých iónov tvorí tento kmeň agregáty 0,5 mm až 1,0 mm, keď sa z kvapalného média odstráni glukóza. Obr. 14 znázorňuje superflokulentný kmeň kvasiniek LCC290, ktorý tvorí vločky s veľkosťou väčšou než 1 mm a za podmienok nízkeho šmyku agreguje do zhlukov s priemerom až 5 mm. Za podmienok mierneho miešania je priemer vločky LCC290 medzi 1 a 2 mm.

Na hodnotenie flokulácie kvasiniek boli navrhnuté rôzne meracie metódy (Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki et al., 1997; Teixera et al, 1991; Stewart & Russell, 2000). V “Brewer’s Yeast” (Stewart & Russell, 2000), bolo navrhnuté, že spôsoby flokulácie kvasiniek je možné ďalej rozdeliť na tri kategórie, a to sedimentačné metódy, metódy statickej fermentácie a priame pozorovanie tvorby vločiek v živnom médiu.

Sedimentačnú metódu, opísanú po prvý krát Burnsem v r. 1937, modifikoval Helm a spolupracovníci v r. 1953 a je v súčasnosti súčasťou štandardných analytických metód, uznávaných výborom Technical Committee and the Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Táto metóda sa označuje ako j_{n v}j_lro technika, pretože charakteristiky usadzovania kvasiniek sa hodnotia v kalcium-sulfátovom pufre, a nie v skutočnom fermentačnom médiu. Metóda statickej fermentácie (známa tiež ako Gillilandova metóda) spočíva v pestovaní kvasiniek v mladine a meraní ich flokulačných charakteristík _{z/? v}i_v0. Obe tieto metódy zahŕňajú meranie absorbancie vzoriek usadených kvasiniek proti vzorkám kvasiniek, ktoré boli deflokulované, s použitím spektrofotometra UV/viditeľné svetlo.

Stewart a Russell (2000) opisujú metódu merania ílokulácie kvasiniek pomocou vizuálneho opisu úrovne flokulácie, ku ktorej dochádza vo vzorkách kvasiniek pestovaných v sklenených fľaštičkách so skrutkovacím uzáverom s objemom 20 ml. Na vyjadrenie stupňa flokulácie použili subjektívne meradlo, napríklad: 5 - extrémne flokulentný, 4 - veľmi flokulentný; 3- mierne flokulentný, 2- slabo flokulentný, 1 - hrubý a 0 - neflokulentný. Superflokulentný kmeň kvasiniek LCC290 dostal klasifikáciu 4 - veľmi flokulentný, zatiaľ čo kvasinkový kmeň LCC3021 bol klasifikovaný stupňom 3 - mierne flokulentný.

Flokulencia je v pivovarníctve významnou charakteristikou, pretože sa prirodzená tendencia kvasiniek buď sedimentovať alebo stúpať k povrchu bežne používa ako separačná metóda na oddelenie týchto kvasiniek od fermentujúcej kvapaliny. Kvasinkový kmeň, ktorý flokuluje predtým, než je dokončená fermentácia, je však nežiaduci, pretože kvapalina nedosiahne ideálny obsah alkoholu a zvyškových cukrov. Pri kontinuálnej fermentácii, a najmä kontinuálnej fermentácii s plynovým výťahom a sacou rúrkou, pôsobia flokulentné kvasinky ako imobilizačná matrica. Ich tendencia sa usadzovať je kompenzovaná nástrekom plynu, ktorý ich udržiava v suspenzii. Pri takomto systéme je odstránená obava z nedokvasenia kvapalného média, pretože pevné častice neustále cirkulujú a sú udržiavané v tesnom kontakte s fermentujúcou kvapalinou.

V sekcii 6.2.2.1 boli charakterizované superflokulentné kvasinky LCC290 z hľadiska svojich sedimentačných vlastností a výkonu pri fermentácii. Dôraz bol položený na identifikáciu nástupu flokulácie pre tento konkrétny kmeň kvasiniek. Okrem toho bola stanovená rýchlosť usadzovania kvasiniek, poskytujúca cennú informáciu, ktorá môže byť použitá v budúcnosti na projektovanie usadzovacích nádob na kvasinky.

6.2.2.1. Charakterizácia superflokulentných kvasiniek LCC290

Pred uskutočnením kontinuálnej fermentáeie so superflokulentným kmeňom LCC290 v bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou bolo rozhodnuté charakterizovať kvasinky v laboratórnom meradle pri fermentácii v trepačkách. Obr. 6.28 ukazuje vývoj populácie kvasiniek v čase. Podľa očakávania koncentrácia počas prvých 48 h prudko rástla, potom sa vyrovnala a ku koncu fermentáeie došlo k miernemu poklesu. Počas prvých 48 h bol v sladine prítomný dostatok živín a kyslíka na rast kvasiniek. Tým, že kvasinky konzumujú uhľohydráty v neprítomnosti kyslíka, sa nereprodukujú a namiesto toho vstupujú do svojej anaeróbnej fermentatívnej fázy. Keď je zásoba uhľohydrátov spotrebovaná, malá populácia kvasiniek začína hynúť. Tento jav je znázornený na obr. 6.29, kde životnosť kvasiniek klesla z približne 97 % na tesne nad 90 %.

Obr. 6.30 znázorňuje spotrebu uhľohydrátov v priebehu fermentáeie Kvasinky spotrebovali najskôr cukry glukózu a fruktózu a potom postupne vychytávali maltózu a maltotriózu. Pivovarské kvasinky však nie sú schopné metabolizovať ani maltotetrózu ani polysacharidy s dlhším reťazcom (poly 1 & 2). So znižovaním celkovej koncentrácie uhľohydrátov (predstavovaným krivkou špecifickej hmotnosti na obr. 6.31) úmerne vzrastala koncentrácia etanolu. Približne po 37 h fermentáeie boli koncentrácie etanolu a uhľohydrátov rovnaké.

Z hľadiska rastu a metabolizmu uhľohydrátov sa zdá, že superflokulentné kvasinky LCC290 sa chovali rovnako ako priemyselný kmeň kvasiniek LCC3021. Zdalo sa, že fermentácia bola dokončená, keď špecifická hmotnosť kvapaliny dosiahla približne 2,7 °P. Pri flokulentných kmeňoch kvasiniek je obvyklé, že tvoria veľké zhluky (vločky) a pred ukončením fermentáeie sa usadzujú z roztoku; tento jav je v pivovarníckom priemysle známy ako „zavesená“ fermentácia. V našich vsádzkových pokusoch sme boli schopní fermentáciu ukončiť, pretože banky sa trepali a tak boli kvasinky udržiavané v suspenzii a v tesnom kontakte so zásobou živín.

Ďalšou významnou charakteristikou, ktorá sa skúmala, bola schopnosť kvasiniek flokulovať. Zaujímalo nás najmä zistenie rýchlosti, s ktorou sa kvasinky usadzujú, rovnako ako získanie ukazovateľa, keď tento konkrétny kmeň kvasiniek začne flokulovať. Obe tieto charakteristiky majú význam pre pokusy s kontinuálnou fermentáciou, pretože hrajú úlohu pri udržiavaní zdravej populácie kvasiniek vo fermentore s plynovým výťahom. Obr. 6.32 ukazuje krivky usadzovania kvasiniek v priebehu fermentácie. K. veľmi malému usadzovaniu došlo pri vzorke testovanej 24 h po začatí fermentácie. Flokulácia je inhibovaná prítomnosťou určitých cukrov; známym inhibítorom je glukóza, a preto k flokulácii dôjde, len ak sa tento inhibítor odstráni. Vo vzorke po 40 h vsádzkovej fermentácii začali kvasinky flokulovať a odlučovať sa z roztoku pri testovaní metódou opísanou v sekcii 4.7. Usadzovanie bolo vo všetkých testovaných intervaloch veľmi rýchle s výnimkou intervalu 24 h, kde k usadzovaniu nedošlo. Počas najpomalšieho usadzovacieho pokusu, uskutočneného po 40 h, trvalo kvasinkám 90 s, než sa celkom odlúčili z testovacieho zariadenia. Po 71 h vyžadovalo usadenie menej než 50 s.

Výskumníci predpokladajú, že rýchlosť usadzovania je funkciou koncentrácie pevného podielu (Coe a Clevenger, 1916). Na obr. 6.33 je vynesená rýchlosť usadzovania pevného podielu pri danej koncentrácii kvasiniek. Body vytvárajúce túto krivku boli generované metódou, ktorú navrhol Kynch (1952) pre údaje zhromaždené v každom intervale fermentácie. Výsledky ležia na približne rovnakej krivke, čo potvrdzuje rovnaký jav, aký pozorovali Coe a Clevenger (1916).

Výsledky, získané počas testu usadzovania, naznačujú, že superflokulentný kmeň kvasiniek LCC290 bude flokulovať pri špecifickej hmotnosti kvapaliny 6 °P a nižšej. Táto hodnota môže byť použitá ako vodidlo pre kontinuálnu fermentáciu, naznačujúce, kde má byť udržiavaná špecifická hmotnosť pseudo-ustáleného stavu, ak sa majú kvasinky udržiavať flokulované. Prevádzka reaktora nad 6 °P by mohla viesť k destabilizácii flokulovaných buniek a prípadne viesť k vymytiu populácie imobilizovaných kvasiniek. Usadzovacie charakteristiky supeflokulentných kvasiniek naznačujú, že sa populácia kvasiniek bude rýchlo odlučovať, ak sa ponechá stagnantná. S trojfázovým bioreaktorom s plynovým výťahom a sacou rúrkou bude možné tieto kvasinky udržať v obehu, avšak v prípade poruchy systému prívodu plynu sa populácia kvasiniek rýchlo odlúči a prípadne bude nutné k opätovnému suspendovaniu pevného podielu zaviesť pomocné prebublávanie. Na post-fermentačné spracovanie je táto charakteristika rýchleho usadzovania výhodná, pretože na odstránenie veľkého objemu pevného podielu je možné použiť separačné zariadenie pre pevné látky, ako sú gravitačné usadzovače. V pivovarníckom priemysle sa tým zníži záťaž odstred’ovacieho zariadenia pevným podielom, a teda sa umožní dlhší beh medzi vyprázdňovaním nádoby odstredivky. Je možné očakávať menšie straty piva a minimalizáciu cudzích pachov (aj keď nepatrných), dodávaných pivu odstreďovaním, v dôsledku nižšej hladiny biomasy kvasiniek, prechádzajúcej odstredivkou.

á¹ c

£,

Φ

1.80E+08

1.60E+08

1.40E+08

1.20E+08

1.00E+08

8.00E+07

6.00E+07

4.00E+07

2.00E+07

O.OOE+OO

100 150

Čas fermentácie (h)

200

250

Obr. 6.28. Celková koncentrácia kvasiniek LCC290 pri miešanej vsádzkovej fermentácii proti času fermentácie. Teplota fermentácie sa udržiavala na 15 °C.

Obr. 6.29. Životnosť kvasiniek, merané metylénovou modrou, proti času fermentácie.

Obr. 6.30. Profily koncentrácie uhľohydrátov proti času fermentácie pre vsádzkové fermentácie s kvasinkami LCC290.

Špecifická hmotnosť(°P)

Obr. 6.31. Koncentrácie etanolu a glycerolu a špecifická hmotnosť kvapaliny proti času fermentácie pre vsádzkové fermentácie s kvasinkami LCC290.

h -o—40 h —*—48 h -»-64 h -ô-71 h -»-192 h

Obr. 6.32. Výška rozhrania suspenzie kvasiniek proti času usadzovania. Hodnoty pre tento diagram boli získané v rôznych fermentačných intervaloch.

Obr. 6.33. Rýchlosť usadzovania suspenzie kvasiniek proti koncentrácii kvasiniek. Hodnoty pre tento diagram boli získané v rôznych fermentačných intervaloch.

6.3. Hodnotenie technológie plynového výťahu na kontinuálnu fermentáciu piva

Prvým a najdôležitejším cieľom tejto práce bolo zhodnotiť možnosť použitia pilotného 50 1 bioreaktora s plynovým výťahom pri kontinuálnej prevádzke s použitím _K-karagénanových gélových perličiek na zachytenie kvasiniek Saccharomyces carlsbergensis (opísané v sekcii 6.2.1). Okrem toho bolo naším želaním zistiť, či je možné v takomto systéme produkovať ležiak severoamerického typu s prijateľnou kvalitou chuti. Rozhodli sme sa tiež stanoviť minimálny čas zdržania, nutný na úplné prekvasenie sladiny s vysokou hmotnosťou (17,5 °P), ako aj stanoviť pracovné rozmedzie pre kyslík v systéme kontinuálnej fermentácie.

Minimálny čas zdržania, pri ktorom boli spotrebované všetky cukry zo sladiny, bol 24 h. To je možné porovnať s klasickým časom vsádzkovej fermentácie 5 až 7 dní. Koncentrácia rozpusteného kyslíka, meraná zabudovanou Ingoldovou kyslíkovou sondou v bioreaktore, bola blízka nule bez ohľadu na kyslík pridávaný k prebublávaciemu plynu (pohybujúca sa od 0 do 20 % obj.). To ukazuje, že kyslík, dodávaný do sladiny, bol buď rýchlo spotrebovaný kvasinkami alebo bol proste vypustený v odvádzanom plyne. Množstvo voľných kvasiniek v prepade piva bolo rádu 10⁸ buniek na ml mladiny. Množstvo vicinálnych diketónov, diacetylu a 2,3-pentándiónu, rovnako ako množstvo acetaldehydu, klesalo so znižujúcim sa pomerom kyslíka v prebublávacom plyne (obr. 6.34 a 6.35). Nezdalo sa, že by namerané estery (etylacetát a izoamylacetát) a vyššie alkoholy (propanol, izobutanol, izoamylalkohol) boli ovplyvnené zmenou dodávky kyslíka (obr. 6.36).

Obr. 6.37 porovnáva rôzne chuťovo aktívne zlúčeniny v dvoch hotových skúšobných pivách, produkovaných s kontinuálnym systémom imobilizovaných kvasiniek, s kontrolným pivom, vyrobeným priemyselne (vsádzková fermentácia s voľnými kvasinkami). Medzi kontinuálne fermentovaným pivom a kontrolou boli konzistentne pozorované určité rozdiely v esteroch (etylacetát, izoamylacetát) a vo vyšších alkoholoch (propanol) bez ohľadu na veľkosť dodávky kyslíka. Chuť hotového piva, vyrobeného s 2 % kyslíka, bola skúsenými odborníkmi na testovanie chuti posúdená ako blízka kontrolnému pivu (priemyselnému produktu). Pivo, vyrobené s 20 % kyslíka však bolo posúdené ako neprijateľné so známkami oxidácie pachu a s “papierovou” a “vínnou” chuťou.

V pseudo-ustálenom stave bol pilotný bioreaktor s časom zdržania 24 h v prevádzke 6 týždňov. “Mladé” pivo malo prijateľný profil pachu a neboli zaznamenané väčšie defekty (sírny pach). Množstvo kyslíka v prebublávacom plyne sa v týchto experimentoch ukázalo byť kritickým prvkom. Najlepší chuťový profil mali pivá vyrábané s 2 až 5 % kyslíka v prebublávacom plyne. Tento kritický kontrolný bod vyžaduje ďalšiu pozornosť so sústredením na presnejšie metódy merania kyslíka s meraniami uskutočňovanými na väčšej sade pre-fermentačných a post-fermentačných analytov.

V tradičnej vsádzkovej primárnej fermentácii sa do sladiny dávkuje kyslík predtým, než je prevedená do fermentora. Po inokulácii média koncentrácia rozpusteného kyslíka rýchlo klesá s tým, ako ho kvasinky konzumujú (prvých 24 h fermentácie, keď dochádza k rastu kvasiniek). Zvyšok fermentácie sa preto uskutočňuje za prevažne anaeróbnych podmienok. Použitie kontinuálneho homogénneho systému na primárnu fermentáciu túto zmenu koncentrácie kyslíka v čase neumožňuje. Z toho dôvodu môže byť veľmi ťažké dosiahnuť úplné vyrovnanie chuti piva, produkovaného kontinuálnou a vsádzkovou fermentáciou.

Bez ohľadu na tieto rozdiely bolo s konfiguráciou bioreaktora, testovanou v tomto počiatočnom hodnotení, produkované pivo s neprijateľnou kvalitou chuti a analytickým profilom. S použitím bioreaktora s plynovým výťahom s relatívne malými perličkami (~1 mm) bolo možné zvýšiť objemovú produktivitu reaktora skrátením času primárnej fermentácie o niekoľko dní. Hladina biomasy, uvoľnenej v odchádzajúcom pive, ukázala, že úroveň rastu kvasiniek v bioreaktore s imobilizovanými kvasinkami je za podobných podmienok ekvivalentná ako pri vsádzkovej fermentácie s voľnými kvasinkami. Tieto pozorovania potvrdzujú závislosť tvorby chuti od úrovne rastu kvasiniek. Tým sa dá vysvetliť nezdar predchádzajúcich pokusov o výrobu prijateľného piva s imobilizovanými systémami s obmedzeným rastom kvasiniek. Prívod regulovanej plynnej zmesi môže byť významným nástrojom pri jemnom nastavovaní organoleptických vlastností piva pri kontinuálnych fermentáciách s imobilizovanými kvasinkami.

Vysoká hladina diacetylu v odchádzajúcej kvapaline bola pozorovaná tiež ďalšími výskumníkmi (Virkajärvi & Pohjala, 1999; Kronlof et ak, 2000). V ležiakoch severoamerického typu je cieľová hladina diacetylu 30 pg/l, oproti 400-800 pg/l v odchádzajúcej kvapaline z kontinuálnej fermentácie. Použitím tradičnej technológie zretia (zretie za studená pri 2 °C počas 14 dní) sa obsah diacetylu znížil do žiaduceho rozmedzia, ale na úkor celkovej produktivity procesu. Použitie technológie rýchlej sekundárnej fermentácie, spomenutej v kapitole 2, napomôže zníženiu diacetylu bez významného zníženia produktivity (2-hodinový proces). Náklady navyše však môžu byť neúnosné a nie všetci pivovarníci môžu byť ochotní vystavovať pivo vysokým teplotám (80 až 90 °C).

diacetyl —•—pentándión

Obr. 6.34. Koncentrácia vicinálnych diketónov proti percentu kyslíka v prebublávacom plyne. Fermentácie sa uskutočňovali v 50 1 systéme s plynovým výťahom, plnenom 40 % (obj.) karagénanových gélových perličiek. Celková rýchlosť prebublávacieho plynu bola udržiavaná konštantné na 6,4 scfh. Čas zdržania bol 24 hodín.

% kyslíka v prebublávacom plyne

Obr. 6.35. Koncentrácia acetaldehydu proti percentu kyslíka v prebublávacom plyne.

Fermentácie sa uskutočňovali v 50 1 systéme s plynovým výťahom, plnenom 40 % (obj.) karagénanových gélových perličiek. Celková rýchlosť prebublávacieho plynu bola udržiavaná konštantné na 6,4 scfh. Čas zdržania bol 24 hodín.

etylacetát —»— propanol —izobutanol —ή— izoamylacetát —Θ— izoamylalkohol

Obr. 6.36. Koncentrácia esterov a pribudlinových alkoholov proti percentu kyslíka v prebublávacom plyne. Fermentácie sa uskutočňovali v 50 1 systéme s plynovým výťahom, plnenom 40 % (obj.) karagénanových gélových perličiek. Celková rýchlosť prebublávacieho plynu bola udržiavaná konštantné na 6,4 scfh. Čas zdržania bol 24 hodín.

I— “kontrola—* - 2% kyslíka - < - 20% kyslíka-chuťový prah ί

Obr. 6.37. Porovnanie konečného produktu vyrobeného s 2% kyslíka a 20 % kyslíka v prebublávacom plyne oproti priemyselne vyrobenému pivu a chuťovým prahom. Pre produkty kontinuálnej fermentácie sa fermentácie uskutočňovali v 50 1 systéme s plynovým výťahom, plnenom 40 % (obj.) karagénanových gélových perličiek. Celková rýchlosť prebublávacieho plynu bola udržiavaná konštantné na 6,4 scfh. Čas zdržania bol 24 hodín.

6.4. Rýchlosti miešania a cirkulácie pri fermentáciách v trojfázovom bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Miešacie experimenty sa uskutočňovali s použitím metódy nástreku kyseliny, opísanej v sekcii 4.8. Táto fáza experimentov mala dva ciele. Najprv sme chceli zistiť, či je systém s plynovým výťahom dobre miešaný, vypočítaním rýchlosti cirkulácie kvapaliny a výsledného času miešania pre rôzne imobilizačné nosiče pri rôznych povrchových rýchlostiach fluidizačného plynu. Rozdiel oproti pokusom opísaným v literatúre spočíval v tom, že celý experiment sa uskutočňoval na skutočnom fermentačnom médiu s aktívnymi kvasinkami namiesto na modelových roztokoch (systémy voda-pevná látka-plyn). Tieto miešacie systémy boli zamerané tiež na výpočet povrchových rýchlostí kvapaliny, ktoré by mohli byť použité na budúce zväčšenie meradla pilotného systému.

6.4.1. Kalibrácia sond pH sonda, používaná v štúdiách miešania, bola kalibrovaná pomocou metódy opísanej v sekcii 4.8. 4-20 mA signál, vysielaný pH sondou, bol vedený cez 250-ohmový rezistor a transformovaný na 1-5 voltový signál, ktorý mohol byť zaznamenaný štítkom na zber údajov (data acquisition card; DAC). pH sonda bola postupne ponáraná do týchto pufrov: pufer s pH 4,6, pufer s pH 4,0, pufer s pH 5,0, pufer s pH 6,0 a nakoniec do pufra s pH 7,0 (Beckmanove osvedčené štandardy, Cóle Parmer). Obr. 6.38 uvádza údaje získané zberným systémom pre reakciu Ingoldovej pH sondy na 5 štandardných pH roztokov. Obr. 6.39 predstavuje kalibračnú krivku pH sondy, na ktorej je vynesená skutočná hodnota pH proti nameranému napätiu signálu. Optimálna kalibračná krivka pre tento systém (korelační koeficient 0,9996) bola definovaná pomocou rovnice:

pH = 3,68 x napätie - 3,53 (6.1)

Získané údaje o miešaní boli transformované pomocou rovnice 6.1, aby odrážali skutočné hodnoty pH namerané vo vnútri bioreaktora s plynovým výťahom.

Taktiež sa meral čas reakcie pH sondy na zmenu pH. Obr. 6.40 až 6.43 znázorňujú typickú odpoveď pH sondy na rôzne skokové zmeny pH, konkrétne 0,6, 1,2, 2,3 a 3,4 jednotiek. Pôvodné údaje boli prispôsobené pulzovej funkcii pomocou zabudovaného Software na zobrazovanie a analýzu údajov TableCurve 2D (Jandel Scientific). Výsledné preloženie krivky malo vždy korelačný koeficient vyšší než 0,994. Z týchto kriviek bol vypočítaný čas, za ktorý sonda reaguje na 98 % skokových zmien (čas reakcie), a bol vynesený proti skokovej zmene pH (obr. 6.44). V testovaných rozmedziach čas reakcie klesal so skokovou zmenou pH. Pre najmenšiu skokovú zmenu 0,6 bola reakcia pH sondy ~ 6,4 sekúnd. Pre skokovú zmenu pH 3,4 čas reakcie klesol na asi 4,2 sekúnd.

Tento typ charakterizácie sondy je významný, najmä ak sa systém používa na hodnotenie času miešania a rýchlosti cirkulácie. Sonda by mala mať krátky čas reakcie, aby mohla pri meraní odrážať zmeny v médiu. Čas reakcie pH sondy musí byť najmä menší než je rýchlosť cirkulácie v reaktore, ak má byť pri tomto meraní používaná presne. Kvázi okamžitá reakcia však nie je nutná, pretože mierne oneskorenie odpovede sa proste odrazí v následných meraniach rýchlosti cirkulácie, a teda sa vynuluje.

Obr. 6.38. Pôvodné údaje získané zberným systémom na odpoveď Ingoldovej pH sondy na rôzne roztoky pufrov proti času. Frekvencia zberu bola 50 Hz pre celkom 15000 bodov.

Obr. 6.39. Kalibračná krivka pH sondy, predstavujúca pH v závislosti od nameraného napätia (V). Optimálna čiara zodpovedá rovnici: pH - 3,68 x napätie - 3,53 s korelačným koeficientom 0,9996. (n=2500).

[PulseCum] y=a+b(1-exp(-(x-dln(1-2° ⁵/2)-c)/d))²

Obr. 6.40. Typické údaje času reakcie pH sondy na skokovú zmenu pH ~0,6. Reakcia bola upravená pomocou Software TableCurve. Optimálna pulzná funkcia mala korelačný koeficient 0,995.

Obr. 6.41. Typické údaje času reakcie pH sondy na skokovú zmenu pH ~1,2. Reakcia bola upravená pomocou Software TableCurve. Optimálna pulzná funkcia mala korelačný koeficient

0.999.

2.75 (PulseCum) y=a+b(1-exp(-(x-dln(1-2° ⁵/2>c)/d))² r²=0.99871074 Fstat=3872162.7

2.75

2.5

-2.5

2.25 >

.3*

4J :« a 9

Π3 2

Z

1.751.5 ^l2.25 >

{rrtiýéifrqír·*; fr j

- * ľ Lľ L.:’ · · :«

Q.

-1.75

100 „ 200

Čas odozvy (s) .1.5

300

Obr. 6.42. Typické údaje času reakcie pH sondy na skokovú zmenu pH-~2.3. Reakcia bola upravená pomocou Software TableCurve. Optimálna pulzná funkcia mala korelačný koeficient 0,999.

>

O ira 2.5 a

n z

1.5 [PulseCum] y=a+b(1-exp(-(x-dln(1-2° ⁵/2)-c)1d))² r²=0.99948433 Fstat=9688579.1

		1
ľ. t . J J	J/“
			J

3.5 >

O a

ra

Z

100 ~ 200 Čas odozvy (s)

11.5

300

Obr. 6.43. Typické údaje času reakcie pH sondy na skokovú zmenu pH ~3,4. Reakcia bola upravená pomocou Software TableCurve. Optimálna pulzná funkcia mala korelačný koeficient

0,999.

	7
T5 C	6
o
w
ľĽ	5
Q.
Φ
O	4 -
Π3
Φ	3
(/>
>o	2
	1
	0

0.5

1.5 2 2.5 3 3.5 4 !

skoková zmena pH

Obr. 6.44. Čas reakcie Ingoldovej pH sondy na skokovú zmenu (n = 3). Sondy boli ponorené do pufra s vyšším pH a potom ihneď vystavené pufru s nižším pH 4,0. Pre každú krivku odpovede bola ideálna krivka použitá na výpočet času nutného na to, aby sonda dosiahla 98 % skokovej zmeny.

6.4.2. Čas miešania a rýchlosti cirkulácie

Experimenty, týkajúce sa času miešania a rýchlosti cirkulácie, boli uskutočňované na troch typoch fermentácie s imobilizovanými kvasinkami. Experimenty boli vykonávané v 50 1 pilotnom bioreaktore so sacou rúrkou na modelovom vodnom roztoku, neobsahujúcom pevný podiel, a potom na fermentačnej živnej pôde so špecifickou hmotnosťou 2,7 °P, obsahujúcej buď κ-karagénanové gélové perličky, superflokulentné kvasinky LCC290 alebo stredne flokulentné kvasinky LCC3021. Obr. 6.45 a 6.46 sú vzorkové zobrazenia nespracovaných údajov, získaných pomocou systému pH sond po nástreku pulzu kyseliny (metóda opísaná v sekcii 4.8). Obr. 6.45 znázorňuje reakciu pH sondy na nástrek kyseliny do vodného roztoku, neobsahujúceho pevný podiel, zatiaľ čo obr. 6.46 znázorňuje odpoveď na nástrek kyseliny do fermentačného média obsahujúceho vysoko flokulentné kvasinky LCC290. Signály boli prispôsobené útlmovej sínusoide a pre zodpovedajúce reakcie bol vypočítaný korelačný koeficient 0,96, resp. 0,90. Parametre “b” a “c v diagramoch zodpovedajú hodnotám “a” a “a” uvedeným v útlmovej sínusoide (3.1). Tieto numerické hodnoty boli použité v rovniciach 3.2 a 3.3 na výpočet rýchlosti cirkulácie a času miešania pre daný systém. Zvyšné údaje o miešaní a získaní krivky pre všetky experimenty sú uvedené v prílohe B.

Obr. 6.47 a 6.48 predstavujú grafy času miešania a rýchlosti cirkulácie pre nástrek kyseliny do vodného roztoku neobsahujúceho pevný podiel. Obr. 6.49 a 6.50 predstavujú zodpovedajúce grafy pre miešacie experimenty s vysoko flokulentnými kvasinkami LCC290. zatiaľ čo výsledky miešacích testov s κ-karagénanom sú zobrazené na obr. 6.51 a 6.52. Konečné časy miešania a časy cirkulácie pre stredne flokulentné kvasinky LCC3021 sú zobrazené na obr. 6.53 a 6.54. Bez ohľadu na typ testovanej pevnej látky ako čas miešania, tak rýchlosť cirkulácie klesala so zodpovedajúcim vzrastom povrchovej rýchlosti plynu. Vzťah medzi rýchlosťou cirkulácie a povrchovou rýchlosťou kvapaliny pre všetky testované systémy zodpovedal rovnici 3.11, ktorú navrhli Kennard a Janekah (1991). Čas miešania sa vzťahom daným rovnicou 3.11 riadil pri systéme voda/žiadny pevný podiel a systéme kkaragénanových gélových perličiek. Oba systémy s flokulentnými kvasinkami ako imobilizačnou matricou nevykazovali s teoretickým modelom Kennard a Janekah silnú koreláciu. Systémy LCC290 a LCC3021 mali počiatočný čas miešania (než povrchová rýchlosť plynu prekročila 4 mm/s) nižší, než model predpokladá. Rýchlosť poklesu času miešania sa však pri povrchových rýchlostiach plynu väčších než 4 mm/s spomalila pri nižších hodnotách modelu. Tabuľka 6.1 poskytuje odvodené rovnice pre čas cirkulácie a čas miešania na základe ich vzťahu k povrchovej rýchlosti plynu.

Obr. 6.55 znázorňuje vzťah času miešania proti povrchovej rýchlosti plynu pre všetky štyri systémy. Scenár voda/žiadny pevný podiel vykázal najdlhší čas pre 98 % miešaní pH pulzu (cca 220 sekúnd pri V_sg 3 mm/s) a systém LCC290 preukázal najlepšiu schopnosť minimalizovať účinok pulzu kyseliny na systém (cca 110 sekúnd pri V_sg 3 mm/s). Hodnoty pre systémy s LCC3021 a κ-karagénanom boli medzi týmito dvoma systémami. Pevný podiel v bioreaktore s plynovým výťahom napomáha dispergácii tekutých prvkov kvapalnej fázy tým, že stimuluje tvorbu vírov a podporuje koaxiálne miešanie. Superflokulentné kvasinky LCC290, aj keď majú rovnakú náplň pevných látok (16 % w/v) ako stredne flokulentné kvasinky LCC3021, umožňovali pri všetkých testovaných povrchových rýchlostiach plynu rýchlejšie časy miešania.

Obr. 6.56 zobrazuje časy cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu pre všetky štyri testované systémy. Pri povrchovej rýchlosti plynu 2 mm/s sa čas cirkulácie pohyboval medzi a 35 sekundami, pričom systém voda/žiadny pevný podiel mal najväčšie rýchlosti cirkulácie a systém LCC290 vykazoval najmenšiu rýchlosť cirkulácie. Pri vyšších rýchlostiach plynu sa rozdiel medzi všetkými 4 systémami znížil na približne 3 sekundy. Pri všetkých testovaných rýchlostiach však systém LCC290 vykazoval mierne nižšie rýchlosti cirkulácie, zatiaľ čo systém voda/žiadny pevný podiel mal najväčšiu rýchlosť cirkulácie.

Obr. 6.57 znázorňuje vzťah medzi povrchovou rýchlosťou plynu a povrchovou rýchlosťou kvapaliny. Pre vý'počet povrchovej rýchlosti kvapaliny pre danú rýchlosť cirkulácie a typ pevnej látky bola použitá rovnica 3.7, ktorú navrhli Livingston a Zhang (1993). Povrchová rýchlosť kvapaliny vzrastala so zodpovedajúcim vzrastom povrchovej rýchlosti plynu. Systémy LCC3021 a voda/žiadny pevný podiel mali podobný trend, zatiaľ čo systémy s LCC290 a κ-karagénanom vykazovali určitú podobnosť. Na krivky povrchovej rýchlosti kvapaliny proti povrchovej rýchlosti plynu na obr. 6.57 bola aplikovaná modelová rovnica, ktorú navrhli Kennard a Jenekah. Na obr. 6.58 je vynesená experimentálne vypočítaná povrchová rýchlosť kvapaliny proti teoreticky vypočítanej povrchovej rýchlosti kvapaliny s použitím rovnice 3.10. Všetky štyri systémy s navrhnutou rovnicou súhlasia, ako vyplýva z lineárnej funkcie so smernicou 1 a počiatkom y = 0. Tabuľka 6.1 uvádza korelácie, ktoré boli odvodené pre systémy testované v tejto výskumnej práci.

Rank 1 Eqn8Q01 [UDF 1]y=Sine_decay(a,b,c,d) r³=0.96404252 DF Adj r³=0.96402494 FitStdErr=0.033051996 Fstat=73121.512 a=0.56210072 5=0.015274599

Čas (s)

Obr. 6.45. Údaje o reakcii pH sondy v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Do vodného roztoku neobsahujúceho pevný podiel bol nastreknutý pulz kyseliny. Povrchová rýchlosť plynu bola nastavená na 1,94 mm/s. Pôvodnými údajmi bola preložená útlmová sínusoida. Koeficient korelácie bol 0,96.

100

Rank 1 EqnSOOl [UDF 1] y=Sine_decay(a,b,c,d) r²=O.89998615 DF Adj r²=O 89993725 FitStdErr=0.016230014 Fstat=24545.221 a=0.28431857 b=0.040116063

Obr. 6.46. Údaje o reakcii pH sondy v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Do fermentačného média obsahujúceho vysoko flokulentné kvasinky LCC290 bol nastreknutý pulz kyseliny. Povrchová rýchlosť plynu bola nastavená na 1,94 mm's. Pôvodnými údajmi bola preložená útlmová sínusoida. Koeficient korelácie bol 0,90.

ΙΟΙ

Povrchová rýchlosť plynu (mm/s) i l -.------- I ♦ experimentálna-teoretická J \

Obr. 6.47. Čas miešania proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Do vodného roztoku neobsahujúceho pevný podiel bol nastreknutý pulz kyseliny. Čas miešania zodpovedá času nutnému na anuláciu 98% skokovej zmeny, (n = 3)

Povrchová rýchlosť plynu (mm/s) > experimentálna-teoretická

Obr. 6.48. Čas cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Do vodného roztoku neobsahujúceho pevný podiel bol nastreknutý pulz kyseliny, (n = 3)

102

Obr. 6.49. Čas miešania proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Do fermentačného média obsahujúceho vysoko flokulentné kvasinky LCC290 (veľkosť vločky > 1,0 mm) bol nastreknutý pulz kyseliny. Čas miešania zodpovedá času nutnému na anuláciu 98 % skokovej zmeny (n = 3)

Povrchová rýchlosť plynu (mm/s) ♦ experimentálna-teoretická

Obr. 6.50. Čas cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastreknutý do fermentačného média obsahujúceho vysoko flokulentné kvasinky LCC290 (veľkosť vločky > 1,0 mm) (n = 3)

103

Obr. 6.51. Čas miešania proti povrchovej rýchlosti plynu v 50-1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastrieknutý do fermentačného média obsahujúceho kvasinky LCC3021, imobilizované v κ-karagénanových gélových perličkách (veľkosť perličiek 1 - 2 mm). Čas miešania zodpovedá času nutnému na anuláciu 98 % skokovej zmeny (n = 3)

Obr. 6.52. Čas cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastreknutý do fermentačného média obsahujúceho kvasinky LCC3021. imobilizované v κ-karagénanových gélových perličkách (veľkosť perličiek 1 - 2 mm) (n = 3)

104

j 0 2 4 6 8 ! Povrchová rýchlosť plynu (mm/s) í f

! ♦ experimentálna—— teoretická j

Obr. 6.53. Čas miešania proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastreknutý do fermentačného média obsahujúceho stredne flokulentné kvasinky LCC3021 (veľkosť vločky < 0.5 mm). Čas miešania zodpovedá času nutnému na anuláciu 98 % skokovej zmeny, (n = 3) r

Povrchová rýchlosť plynu (mm/s) i ♦experimentálna —teoretická

Obr. 6.54. Čas cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastreknutý do fermentačného média obsahujúceho stredne flokulentné kvasinky LCC3021 (veľkosť vločky < 0.5 mm) (n = 3)

105

LCC3021 □ LCC290 Δ karagénan · žiadny pevný podiel

Obr. 6.55. Čas miešania proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastrieknutý do fermentačného média obsahujúceho rôzne pevné látky. Čas miešania zodpovedá času nutnému na anuláciu 98 % skokovej zmeny (n - 3)

♦ LCC3021 □ LCC290 Δ karagénan · žiadny pevný podiel

Obr. 6.56. Čas cirkulácie proti povrchovej rýchlosti plynu v 50 l bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Pulz kyseliny bol nastreknutý do fermentačného média obsahujúceho rôzne pevné látky (n = 3)

106

>>	350
c rc Q.	300
rc >	250
K ΐ O E	200
ΐ e	150
*rc > 0	100
X O	50
> 0 Q.	0

Povrchová rýchlosť plynu (mm/s)

S ♦ LCC3021 □ LCC290 Δ karagénan • žiadny pevný podiel i

Obr. 6.57. Povrchová rýchlosť kvapaliny (mm/s) proti povrchovej rýchlosti plynu (mm/s) pre štyri testované systémy - kvasinky LCC3021, kvasinky LCC290, karagénanové gélové perličky a systém voda/žiadny pevný podiel. Testovanie sa uskutočňovalo vo vnútri 50 1 pilotného bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Experimentálna povrchová rýchlosť kvapaliny mm/s ♦ LCC3021 □ LCC290 Δ karagénan • žiadny pevný podiel — lineárna krivka

Obr. 6.58. Teoretická povrchová rýchlosť kvapaliny (mm/s) proti experimentálnej povrchovej rýchlosti kvapaliny (mm/s) pre štyri testované systémy. Teoretická hodnota bola vypočítaná s použitím vzťahu, ktorý navrhli Kennard a Janekah (1991): V_si ccV_sg ^m. Lineárna krivka mala smernicu 1 a priesečník y = 0.

107

Tabuľka 6.1. Súhrn vypočítaných korelácií pre dobu miešania, rýchlosť cirkulácie a povrchovú rýchlosť kvapaliny pre štyri testované systémy

	čas miešania	rýchlosť cirkulácie	povrchová rýchlosť kvapaliny
voda/žiadny pevný podiel	tm=336.04 VSG 04	V37.94 VSG-°4	Vsi=189.06VSG°·283
kvasinky LCC290	tm=181.55 Vsď0·4	tc=44.67 VSG 04	VSL=134.75VSG <)·419
κ-karagénanový gél	tm=254.68 VSG °'4	tc=41.73 VSG°·4	VSl=171.92Vsg<’'283
kvasinky LCC3021	tm=322.07 VSG-°·4	tc=37.90 VSG’°'4	Vsl=158.12Vsg 0427

Pre povrchovú koreláciu kvapaliny navrhli Kennard a Janekah (1991) exponent 0,41 v destilovanej vode a 0,64, keď roztok obsahoval karboxymetylcelulózu a etanol. Systémy LCC290 a LCC3021 mali exponent 0,419, resp. 0,427, zatiaľ čo κ-karagénanový systém a systém voda/žiadny pevný podiel malí exponent 0,283.

Základný predpoklad pri technológii s plynovým výťahom a sacou rúrkou je, že systém je schopný poskytnúť adekvátne miešanie tak, aby prvok tekutiny, opúšťajúci reaktor, bol dokonale premiešaný. Pri prevádzke 50 1 pilotných systémov ako kontinuálnych fermentorov bolo do spodku reaktora nastriekavané čerstvé živné médium s prietokom 36 ml/min do celkového objemu reaktora 50 1. To predstavuje približne 1000-násobné zriedenie zložiek suroviny. Pri miešacích charakteristikách vypočítaných pre systém s kvasinkami LCC290 je prvok tekutiny miešaný v asi 3 slučkách cirkulácie v reaktore, zatiaľ čo pre režim voda/žiadny pevný podiel je treba 10 slučiek cirkulácie v reaktore. Čas zdržania (24 h) je okrem toho približne 1000-krát väčší než čas miešania (180 s). Rýchle miešanie kombinované so zriedením živín v systéme a veľkým rozdielom medzi časom miešania a časom zdržania ukazuje na adekvátne miešaný systém. Pôvodný predpoklad na použitie bioreaktora s plynovým výťahom bol, že poskytuje ideálne miešané prostredie na fermentáciu piva. Výsledky miešacích štúdií, uskutočňovaných na všetkých troch fermentačných nosičoch, tento predpoklad potvrdzujú.

108

6.5. Hodnotenie niekoľkých imobilizačných metód kontinuálnej primárnej fermentácie v systéme s plynovým výťahom

Kontinuálne fermentácie sa uskutočňovali v 50 1 pilotnom bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou s použitím troch typov imobilizačných nosičov - κ-karagénanových gélových perličiek, superflokulentných kvasiniek LCC290 a stredne flokulentných kvasiniek LCC3021. Všetky fermentácie boli na počiatku naočkované rovnakou úrovňou kvasinkového inokula (4 g/1) a ako živné médium bola použitá priemyselná ležiaková sladina. Fermentácie sa začali vsádzkovo, aby bola umožnená rýchla redukcia cukrov v sladine a aby bol podporený rast kvasiniek vo fermentore. V prípade flokulentných kvasiniek táto vsádzková fáza umožnila vytvorenie vločiek kvasiniek, ktoré potom mohli byť v bioreaktore zadržané aj po začatí kontinuálnej fázy. Sotva klesla úroveň diacetylu vo fermentačnej kvapaline pod 30 pg/l, začal sa kontinuálny prívod sladiny. Nasledujúce sekcie podrobnejšie opisujú fermentačné analý'zy, získané u týchto troch typov imobilizačných matríc.

6.5.1. Použitie κ-karagénanových gélových perličiek: Zachytenie

Použitie κ-karagénanových gélových perličiek ako imobilizačnej matrice napomohlo hodnoteniu použiteľnosti technológie plynového výťahu na kontinuálnu primárnu fermentáciu piva (sekcia 6.3). Bolo ešte nutné zhodnotiť, či môže taký systém bežať dlhší čas (až 2 mesiace) bez väčších prevádzkových ťažkostí, ako je nestabilita fermentácie a kontaminácia. Prevádzkové parametre tohto fermentačného pokusu sú znázornené na obr. 6.59. Povrchová rýchlosť plynu oxidu uhličitého bola nastavená na 5,5 mm/s a v tomto prebublávacom plyne bolo do reaktora privádzaných 0,9 mm/s vzduchu. Rýchlosť oxygenácie bola preto nastavená na 3 % celkového prebublávacieho plynu, v súlade s výsledkami v sekcii 6.3, ktoré naznačujú, že preferované pivo je produkované, ak sa do systému privádza 2 až 5 % kyslíka. Teplota fermentácie bola regulovaná na 15 °C. Medzi údajmi je možné pozorovať určitú fluktuáciu, ktorá sa vzťahuje k charakteru kontrolnej slučky, ktorá bola použitá.

Obr. 6.60 predstavuje vývoj voľnej populácie kvasiniek v čase a životnosť kvasiniek. Životnosť zostávala počas celej 2-mesačnej fermentácie relatívne vysoká s dočasným poklesom nameraným okolo 200 hodín. To zodpovedá bodu tesne pred začatím kontinuálneho prívodu sladiny. Pri vsádzkovej fermentácii je obvyklé, že životnosť na konci

109 fermentácie klesá, pretože kvasinky majú nedostatok živín. Sotva sa začal kontinuálny prívod sladiny, životnosť opäť stúpla nad 90 %. Populácia voľných kvasiniek bola počas prvých 400 hodín fermentácie nízka a potom, v priebehu ďalších 300 hodín, stúpla asi desaťkrát z cca 100 miliónov buniek na ml na cca 1,5 miliardy buniek na ml. Len čo bola na tejto maximálnej koncentrácii, uchovávala si populácia voľných kvasiniek túto hodnotu pseudoustáleného stavu po zvyšok času fermentácie.

Náhly nárast koncentrácie voľných kvasiniek je pravdepodobne spojený s populáciou imobilizovaných kvasiniek. Na začiatku fermentácie kvasinky zachytené v géle rastú vo vnútri gélu. kým nespotrebujú všetok voľný priestor. Len čo sú gélové perličky kvasinkami vyplnené, preteká expandujúca populácia do kvapalného média. Naše výsledky, zdá sa. naznačujú, že počas prvých 400 hodín rástli imobilizované kvasinky v géle a po cca 700 hodinách už nemali pre rast v perličkách miesto, a preto začali uvoľňovať väčšie množstvo kvasiniek do fermentačného média.

Táto nestabilita populácie kvasiniek sa odráža v profiloch etanolu a špecifickej hmotnosti (obr. 6.61). Počas počiatočných 200 hodín fermentácie sa očakávalo v súlade s tradičnou vsádzkovou kinetikou, že etanol bude s časom rásť a špecifická hmotnosť bude klesať. Medzi 200 a 600 hodinami dosiahol etanol plató 45 g/1 a špecifická hmotnosť zostala na cca 6 °P. Tento výsledok nebol očakávaný, pretože kvapalina na konci fermentácie by mala mať špecifickú hmotnosť cca 2,5 až 2,7 °P. Po asi 600 hodinách, keď populácia voľných kvasiniek práve zhruba dosiahla svoje maximum, stúpla hladina etanolu na asi 70 g/1 a špecifická hmotnosť sladiny poklesla na asi 2,2 ^CP. Bližší pohľad na konkrétne profily uhľohydrátov v čase (obr. 6.62) ukazuje, že koncentrácia maltózy sa ustálila až po približne 600 hodinách procesu. Ostatné cukry sa znížili podľa očakávania.

Dva ďalšie kľúčové analyty - diacetyl a 2,3-pentándión - boli monitorované po celý čas 2-mesačnej kontinuálnej prevádzky (obr. 6.63). Nízke body po približne 180 hodinách zodpovedajú koncu vsádzkovej začiatočnej fázy. Sotva sa začal kontinuálny prívod, diacetyl i 2,3-pentándión rýchle stúpli na asi 500 pg/l, resp. 400 pg/l. Tento počiatočný vzrast bol očakávaný, pretože dodávka čerstvého živného prostredia by mala stimulovať rásť kvasiniek, a teda zvýšiť hladinu prebytkových metabolitov, poskytujúcich diacetyl a 2.3-pentándión. Počas celého fermentačného pokusu zostala hladina 2,3-pentándiónu nad 400 pg/l, zatiaľ čo koncentrácia diacetylu v polovici kontinuálneho priebehu fermentácie klesla z 500 pg/l na

110

275 μσ/l. Tento okamžik sa zhodoval aj s poklesom hladiny diacetylu pod hladinu 2,3pentándiónu, ktorý bol pozorovaný pri hodnotení uskutočniteľnosti, opísanom v sekcii 6.3.

♦—teplota —θ—oxid uhličitý vzduch

W O

JĽ u

E

-ra E > *o

JC u

L.

>

o

Q.

(Λ

Obr. 6.59. Prevádzkové parametre na fermentáciu s karagénanovou imobilizáciou v závislosti od času fermentácie.

—A bunky '♦ ' životnostj

Obr. 6.60. Celková koncentrácia a životnosť kvasiniek imobilizovaných na κ-karagénane v závislosti od času fermentácie

111

Obr. 6.61. Koncentrácia etanolu a špecifická hmotnosť pri kontinuálnej fermentácii s karagénanom imobilizovanými kvasinkami v závislosti od času fermentácie >

o +-* ra k_

Ό

JZ

O ?

.2 -2 ‘o c

o u

c o

x:

400 600 800

Čas fermentácie (h)

1000

200

1200 polysacharidy maltóza maltotetróza glycerol maltotrióza

Obr. 6.62. Profil uhľohydrátov pri kontinuálnej fermentácii s karagénanom imobilizovanými kvasinkami v závislosti od času fermentácie

112

Obr. 6.63, Koncentrácia vicinálnych diketónov pri kontinuálnej fermentácii s karagénanom imobilizovanými kvasinkami v závislosti od času fermentácie

6.5.2. Použitie superflokulentného kmeňa kvasiniek: Autoflokulácia

Boli vykonávané kontinuálne fermentácie s použitím poloprevádzkového 50 1 bioreaktora s plynovým výťahom, plneného superflokulentnými kvasinkami LCC290, počas 3 mesiacov. Prebublávací plyn CO2 bol nastavený na cca 2,5 mm/s a vzduch bol privádzaný v množstve cca 0,4 mm/s, aby bol podporený určitý rast kvasiniek (zodpovedá to celkom 1,51 1/min privádzaného plynu, ktorého 3 % tvorí kyslík). Počas celého pokusu bola fermentačná teplota v reaktore udržiavaná na cca 15 °C. Prerušenie dodávky prúdu nás prinútilo znížiť teplotu fermentora počas troch dní (1 700 h fermentácie) na 4 °C (obr. 6.64). Toto ochladenie reaktora bolo uskutočnené na spomalenie metabolizmu kvasiniek a uchovanie ich životnosti počas prerušenia dodávky prúdu. Táto neočakávaná udalosť poskytla príležitosť zistiť odolnosť systému voči príhodám, ktoré môžu byť v priemyselných situáciách obvyklé. Len čo bola dodávka elektriny obnovená, bola teplota reaktora znovu upravená na 15 °C a fermentácia pokračovala ďalších 30 dní.

113

Po dokončení nábehovej fázy (cca 180 h), bola do systému kontinuálne privádzaná sladina s prietokom 2,16 1/h, takže čas zdržania pri pracovnom objeme reaktora 50 1 bol 24 h. Po počiatočnej fáze vsádzky sa koncentrácia kvasiniek zvýšila a dosiahla po asi 750 h fermentáeie 3 miliardy buniek/ml (obr. 6.65). Táto hmota kvasiniek potom po asi 1 000 h poklesla na približne 1 miliardu buniek/ml a na tejto hladine zostala až do skončenia fermentáeie. Životnosť kvasiniek bola po celý čas fermentáeie nad 90 % (obr. 6.65).

Koncentrácia etanolu a špecifická hmotnosť fermentačného média dosiahli pseudoustálený stav krátko po začiatku kontinuálnej dodávky (obr. 6.66). Koncentrácia etanolu stúpla na približne 70 g/1 a špecifická hmotnosť kvapaliny bola po zvyšok fermentáeie cca 2,3 °P. Profily uhľohydrátov na obr. 6.67 potvrdzujú tento pseudo-ustálený stav po približne 270 h kontinuálnej fermentáeie. Koncentrácia polysacharidov klesla po asi 1 400 h fermentáeie z cca 42 g/1 na cca 33 g/1. Tento jav bol dôsledkom premenlivosti šarží sladiny. Pretože ležiakové kvasinky nie sú schopné tieto polysacharidy konzumovať, nemala táto anomália živín sladiny výrazný vplyv na výkon primárnej fermentačnej nádoby. Tento rozdiel v nefermentovanom cukrovom podiele by poznal skúsený degustátor, ktorý by si všimol, že produkt má “riedku” konzistenciu.

Koncentrácie diacetylu a 2,3-pentándiónu v priebehu času sú znázornené na obr. 6.68. Ako pri κ-karagénanových kontinuálnych fermentáciách, hladiny diacetylu a 2,3-pentándiónu stúpli, len čo sa začal kontinuálny prívod sladiny. Diacetyl dosiahol približne 375 pg/l, zatiaľ čo koncentrácia 2,3-pentándiónu bola približne 600 pg/l. Tieto hladiny koncentrácie sa udržali po celý čas fermentáeie až do prerušenia dodávky prúdu po cca 1 700 h. Pretože kvapalina zostala vo vsádzke 3 dni bez metabolizmu kvasiniek (vplyvom prerušenia dodávky živín), znížili sa hladiny vicinálnych diketónov. Len čo bol prívod sladiny obnovený, vrátili sa diacetyl a 2,3-pentándión na svoje hodnoty pseudo-ustáleného stavu.

114

Obr. 6.64. Pracovné parametre fermentácie s LCC290 v závislosti od času fermentácie

Obr. 6.65. Celková koncentrácia a životnosť kvasiniek LCC290 v závislosti od času fermentácie

115

etanol špecifická hmotnosť J

Obr. 6.66. Koncentrácia etanolu a špecifická hmotnosť kvasiniek LCC290 pri kontinuálnej fermentácii v závislosti od času fermentácie

1000 1500 2000

Čas fermentácie (h)

2500 3000

-O- polysacharidy —♦— maltóza maltotetróza glycerol maltotrióza

Obr. 6.67. Profil uhľohydrátov pri kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v závislosti od času fermentácie

116

Obr. 6.68. Koncentrácia vicinálnych diketónov pri kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v závislosti od času fermentácie

6.5.3. Použitie stredne ílokulentných kvasiniek: Autoflokulácia

Bolo uskutočnených niekoľko fermentačných pokusov s použitím stredne flokulentného kmeňa kvasiniek LLC3021 ako imobilizačnej matrice v poloprevádzkovom 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom. Rovnako ako u oboch predchádzajúcich spôsobov imobilizácie bola počiatočná koncentrácia kvasiniek nastavená na 4 g/1. Týmito kvasinkami bola zakvasená sladina priemyselného ležiaku (opísané v sekcii 4.2) a bola ponechaná fermentovať vo vsádzke, kým neboli skonzumované všetky skvasiteľné cukry a úroveň diacetylu neklesla pod 30 pg/l. Fermentačná teplota bola udržiavaná na 15 °C a prietok prebublávacieho plynu bol udržiavaný na rovnakej hodnote, ako u kvasiniek LCC290 (povrchová rýchlosť oxidu uhličitého cca 2,5 mm/s a cca 0,4 mm/s vzduchu, teda približne 3 % kyslíka v celkovom plyne) (obr. 6.69).

Tento počiatočný vsádzkový stupeň umožnil flokuláciu kvasiniek, ktoré tak boli ľahšie zadržiavané systémom plynového výťahu. Na konci vsádzkového nábehu bola rýchlosť prívodu sladiny nastavená na 2,16 1/h, čo zodpovedá času zdržania cca 24 h,

117 vztiahnuté na pracovný objem reaktora 50 1. Populácia kvasiniek (obr. 6.70) vzrástla na asi 1 miliardu buniek/ml a na tejto úrovni zostala práve cez 1 000 h (medzi 500 a 1 500 h behu kontinuálnej fermentácie). Po cca 1 500 h fermentácie sa populácia kvasiniek náhle zdvojnásobila a potom sa ustálila na 2 miliardách buniek/ml. Táto zmena populácie kvasiniek bola neočakávaná. Životnosť kvasiniek sa po celý čas fermentácie udržiavala nad 90 % (obr. 6.70).

Obr. 6.71 uvádza údaje o koncentrácii etanolu a špecifickej hmotnosti fermentačného média počas 3-mesačného kontinuálneho pokusu. Krátko po vsádzkovom nábehu (180 h) sa koncentrácia etanolu ustálila na 70 g/1 a špecifická hmotnosť dosiahla minimum cca 2.2 °P. Vyššie diskutované náhle zvýšenie populácie kvasiniek sa neodrazilo v poklese koncentrácie etanolu. Najlogickejšie vysvetlenie pre tento vzrast populácie kvasiniek je, že väčšia časť celkovej populácie kvasiniek vstúpila do rastovej fázy a tak došlo k tomuto zdvojnásobeniu koncentrácie kvasiniek. Súčasne so vzrastom koncentrácie kvasiniek by sa očakával pokles koncentrácie etanolu; to však jasne nebol tento prípad, pretože etanol zostal počas celého kontinuálneho behu na svojej hodnote pseudo-ustáleného stavu 70 g/1. Závislosť profilov koncentrácie uhľohydrátov na dobe fermentácie (obr. 6.72) odhalila rovnaký záver ako krivky etanolu a špecifickej hmotnosti. Tento beh dosiahol pseudo-ustálený stav približne po 250 h kontinuálnej fermentácie.

Obr. 6.73 poskytuje krivky koncentrácií diacetylu a 2,3-pentándiónu v závislosti od času kontinuálnej fermentácie. Rovnako ako výsledky vicinálnych ketónov u kkaragénanového gélu a kvasiniek LCC290, koncentrácia diacetylu a 2,3-pentándiónu po vsádzkovej nábehovej fáze stúpala a dosiahla hodnoty pseudo-ustáleného stavu cca 225 pg/l, resp. 400 pg/l.

118

Obr. 6.69. Prevádzkové parametre pre fermentáciu LCC3021 v závislosti od času fermentácie

bunky -·— životnosť

Obr. 6.70. Celková koncentrácia a životnosť kvasiniek LCC3021 v závislosti od času fermentácie

119

Obr. 6.71. Koncentrácia etanolu a špecifická hmotnosť pri kontinuálnej fermentácii kvasiniek LCC3021 v závislosti od času fermentácie

Obr. 6.72. Profil uhľohydrátov pri kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC3021 v závislosti od času fermentácie

120

diacetyl -·— pentándión ]

Obr. 6.73. Koncentrácia vicinálnych diketónov pri kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC3021 v závislosti od času fermentácie

6.5.4 Porovnanie rôznych nosičov

V sekciách 6.5.1 až 6.5.3 boli opísané výsledky fermentácie s κ-karagénanovými gélovými perličkami, superflokulentnými kvasinkami LCC290 a stredne flokulentnými kvasinkami LCC3021 ako imobilizačnými matricami. Všetky tri nosiče sa považovali za vhodné na primárnu kontinuálnu fermentáciu v poloprevádzkovom 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Vo všetkých troch prípadoch bol dosiahnutý čas zdržania kvapaliny 24 h. Fermentačné behy s použitím superflokulentných kvasiniek LCC290 dosiahli pseudo-ustálený stav omnoho rýchlejšie než systémy so stredne flokulentnými kvasinkami LCC3021 a imobilizované systémy s κ-karagénanom. Fermentácia LCC290 dosiahla svoju maximálnu koncentráciu etanolu 70 g/1 po asi 250 h behu. Beh LCC3021 dosiahol svoju koncentráciu etanolu v ustálenom stave 70 g/1 po cca 600 h. Počas kontinuálnej fermentácie s κ-karagénanom sa etanol v priebehu pokusu ustálil na dvoch rôznych bodoch. Etanol najprv medzi 200 a 500 h dosiahol 45 g/1 a potom asi po 575 h stúpol na 70 g/1 a na tejto koncentrácii zostal do skončenia pokusu.

121

Zdalo sa, že všetky tri fermentačné systémy dosiahli maximálnu koncentráciu voľných kvasiniek cca 1 miliarda buniek/ml. Nekonzistencia koncentrácie kvasiniek mala negatívny dopad na produktivitu etanolu v κ-karagénanovom systéme (nižšia počiatočná koncentrácia etanolu v pseudo-ustálenom stave v porovnaní so systémom s kvasinkami LCC290). Koncentrácia kvasiniek dosahovala maximum v každom systéme v rôznych časových intervaloch. Pre beh LCC290 dosiahol etanol maximum medzi 500 a 1 000 h kontinuálnej fermentácie, zatiaľ čo fermentácia LCC3021 mala maximálny počet buniek medzi 1 500 a 2 000 h kontinuálneho behu. Imobilizované systémy s κ-karagénanom dosiahli maximálnu koncentráciu buniek medzi 700 a 1 000 h kontinuálnej prevádzky.

Koncentrácie pseudo-ustáleného stavu pre diacetyl a 2,3-pentándión boli v týchto troch typoch fermentácie s imobilizovanými kvasinkami - superflokulentné kvasinky LCC290, stredne flokulentné kvasinky LCC3021 a kvasinky imobilizované na κ-karagénane - rozdielne. Pri fermentácii LCC290 sa diacetyl ustálil na 375 pg/l, zatiaľ čo pri fermentácii LCC3021 sa ustálil na asi 225 pg/l. V prípade fermentácie s κ-karagénanom dosiahla koncentrácia diacetylu 500 pg/l a uprostred kontinuálneho behu jeho úroveň postupne klesala v časovom rámci 500 h na asi 200 pg/l. Koncentrácia 2,3-pentándiónu vo všetkých troch pokusoch odrážala koncentráciu diacetylu, pričom pri fermentáciách s LCC290 a LCC3021 bola po celý čas fermentácie koncentrácia 2,3-pentándiónu vyššia než diacetylu. Beh s kkaragénanon vykazoval odlišnú schému, keď pri prvom pseudo-ustálenom stave bola úroveň diacetylu vyššia než 2,3-pentándiónu, potom koncentrácia diacetylu poklesla pod koncentráciu 2,3-pentándiónu. Z údajov o koncentrácii kvasiniek a produkcii etanolu tiež vyplýva, že počas fermentácie s κ-karagénanom boli dosiahnuté dva rôzne a jedinečné pseudo-ustálené stavy.

Úloha porovnať rôzne fermentačné systémy a zhodnotiť, ktorý sa chová lepšie, sa môže stať zložitejšou, ak je podstata systému založená na viac než jednom kritériu. Napríklad ak by mierou úspechu bola iba celková produktivita etanolu, boli by všetky tri testované systémy hodnotené ako rovnako dobré, pretože vo všetkých prípadoch bolo dosiahnutých 70 g/1 etanolu na objem reaktora 501 pri čase zdržania 24 h.

Výroba predajného piva vyžaduje viac než iba produkciu etanolu. Navrhnutý fermentačný systém je nutné hodnotiť z hľadiska schopnosti produkovať prijateľné pivo (produktivita etanolu a hladina diacetylu medzi ďalšími hľadiskami), potenciálnych ďalších

122 nákladov na nosič, dostupnosti nosiča, ľahkostí ovládania systému, ekologických otázok, ako je nakladanie s odpadovým nosičom, stability nosiča, rovnako ako flexibility poskytovanej nosičovým systémom. Na hodnotenie takéhoto viacprvkového scenára sa v obchodnom svete používa postup bezrozmemej analýzy nazývaný “Balanced Scorecard” (Kaplan a Norton. 1996). Prvý stupeň spočíva v identifikácii kritérií, podľa ktorých musí byť systém hodnotený. Každému kritériu je prisúdená hodnotiaca stupnica od 1 do 5, pričom 1 je najmenej priaznivé a 5 najpriaznivejšie hodnotenie. Po skončení analýzy sa sčítajú jednotlivé hodnotenia a alternatíva s najlepším výsledkom predstavuje najlepší výber za daných okolností.

Tabuľka 6.2 predstavuje výsledky analýzy Balanced Scorecard uskutočnenej pre imobilizačné nosiče, ktoré boli považované za potenciálne alternatívy na použitie v poloprevádzkovom 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou na fermentáciu. Bolo hodnotených celkom 6 nosičov - chitozanové perličky Chitopearl®, kremelinové perličky Celíte®, sklenené perličky Siran®, κ-karagénanové gélové perličky, stredne flokulentné kvasinky LCC3021 a superflokulentné kvasinky LCC290 - s primárnou úlohou získať predajné pivo. Každý systém bol hodnotený pomocou vyššie opísanej stupnice. Celkovo boli najlepšie hodnotené superflokulentné kvasinky LCC290, ktoré boli tesne nasledované stredne flokulentnými kvasinkami LCC3021. Ostatné štyri nosiče dostali hodnotenie medzi 16 a 20. Tretia preferencia bola daná κ-karagénanovému systému, pretože v pilotnej jednotke bola produkovaná predajná kvapalina.

Z tohto hodnotenia nosičov jasne vyplýva, že budúci vývoj kontinuálnych fermentačných systémov by mal byť zameraný na autoagregáciu ako na spôsob imobilizácie. Dostupnosť (ľahko dostupné), cena (nízke náklady, pretože nie je treba zavádzať ďalšie zariadenia), ľahkosť ovládania (hodí sa na prevádzku súčasných zariadení) tejto alternatívy preváži potenciálnu nestabilitu vločiek kvasiniek v miešanom systéme. Na kontrolu veľkosti vločiek počas fermentačného procesu je možné používať citlivosť autoagregátu ku šmyku, a prípadne dosiahnuť väčší prenos hmoty, a tým dosiahnuť ďalšie zvýšenie objemovej produktivity bioreaktora.

123

Tabuľka 6.2. Porovnanie niekoľkých imobilizačných nosičov pre primárnu fermentáciu piva v systéme bioreaktora s plynovým výťahom

	ChitopearU	Celíte®	Síran®	Karagénan	LCC3021	LCC290
Dobré pivo	3	1	1	4	5	4
Cena	2	3	1	3	5	5
Dostupnosť	1	5	5	2	5	5
Ľahkosť prevádzky	O 3	1	1	3	4	5
Zaobchádzanie s odpadom/ekológia	4	3	4	2	3	3
Stabilita	4	1	1	3	2	3
Flexibilita	3	n J	3	1	2	5
Celkom	20	17	16	18	26	30

6.6. Výroba ležiakového piva severoamerického typu s použitím technológie s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Výroba čisto chutnajúceho ležiakového piva severoamerického typu (NA) kladie na pivovarníka mnoho výziev. Ležiaky typu NA sú charakterizované svetlou farbou a chuťovým profilom s nízkou horkosťou, nízkymi zvyškovými cukrami (riedke), žiadnou dominantnou príchuťou, a teda relatívne žiadnou pachuťou. Kvôli týmto vlastnostiam môže pivovarník zamaskovať len veľmi málo chuťových defektov. Najbežnejšími problémami s príchuťou, sužujúcimi dnešných pivovarníkov, sú vysoká hladina diacetylu (maslová), acetaldehydu (zelené jablko) a tiež sírne pachute (spálená guma, tchor, zhnité vajcia, príchuť varenej zeleniny). Aj ked¹ môže byť príčinou týchto pachutí piva tiež kontaminácia baktériami, častejšie vedie k vyšším než očakávaným hladinám pachutí nesprávne riadenie fermentačného procesu.

Po celý čas pokusov s kontinuálnou fermentáciou, vykonávaných ako súčasť tejto práce, bola úroveň kontaminácie ako v sladine, tak vo fermentačných nádobách, kontrolovaná starostlivým vykonávaním aseptických metód. Fermentačné pokusy so všetkými tromi typmi nosiča, ktoré trvali niekoľko mesiacov, nevykázali detegovateľnú úroveň kontaminácie (monitorované metódami opísanými v kapitole 4). Produkty primárnej kontinuálnej fermentácie mali vyššie než žiaduce hladiny diacetylu (cieľ menej než 30 pg/l) a acetaldehydu (cieľ menej než 10 mg/1), ale tie neboli dôsledkom bakteriálnej infekcie. Tieto

124 zistenia sa nelíšia od údajov uvedených v literatúre (Pajunen et al., 2000; Kronlof et al., 2000). Jeden belgický pivovar urobil z vysokej hladiny acetaldehydu v pive z procesu kontinuálnej fermentácie predajnú prednosť a ponúkal svoj produkt ako pivo chutnajúce po jablkách (Andries et al., 1996b).

Vysoké hladiny diacetylu po primárnej fermentácii sú v pivovarníckom priemysle tiež bežné. Niektorí pivovarníci zaviedli, na pomoc pri znižovaní diacetylu, po dokončení primárnej fermentácie prax nazývanú “voľný vzostup teploty”. Iní zvolili proste dlhšie zdržanie produktu počas zrenia, aby dosiahli zníženie vicinálnych diketónov (diacetyl a 2,3pentándión) na požadovanú úroveň. V inom prístupe vyvinulo niekoľko výskumných skupín na vyrovnanie sa s vysokou hladinou diacetylu technológiu rýchleho zrenia, diskutovanú v kapitole 2. Aj keď je tento prístup veľmi efektívny, pridáva celkovému procesu varenia piva ďalšiu úroveň zložitosti, ktorú môžu niektorí pokladať za ťažko akceptovateľnú.

Ekonomika procesu rýchleho zrenia je úplne jasná, avšak v týchto počiatkoch kontinuálneho spracovania v pivovarníckom priemysle môže byť účelné minimalizovať technologickú zložitosť, aby sa uľahčil prechod od tradičnej vsádzkovej fermentácie ku kontinuálnej produkcii. Z tohto dôvodu bolo rozhodnuté skúmať použitie vsádzkového zdržania po primárnej kontinuálnej fermentácii v 50 1 pilotných systémoch s plynovým výťahom na obmedzenie vysokej hladiny diacetylu v hotovom pive. Tento ďalší spracovateľský stupeň sa pri otváraní tohto Ph.D. programu nepredpokladal, ale zavedenie takého opatrenia bolo nutné na porovnanie pív produkovaných kontinuálne s pivami so vsádzkovou kontrolou.

6.6.1. Použitie vsádzkového zdržania po primárnej kontinuálnej fermentácii

Kritickým parametrom pri stanovení dokončenia primárnej fermentácie je hladina diacetylu v konečnej fermentovanej kvapaline. Konverzia prekurzora diacetylu, aacetolaktátu, na diacetyl je rýchlosť limitujúcim krokom v ceste vzniku diacetylu (obr. 3.5). Táto prvá reakcia je povahou chemická a je silne závislá od teploty. Ak “mladé” pivo podstúpi proces zrenia za studená skôr, než došlo k chemickej konverzii α-acetolaktátu na diacetyl, môže mať výsledné pivo hladinu diacetyl nad chuťovým prahom 20 pg/l, ak sa nepoužije predĺžený čas zretia za studená, aby mohlo dochádzať k pomalej konverzii prekurzora. Pri všetkých troch kontinuálnych fermentáciách opísaných v sekcii 6.5 bola

125 hladina diacetylu pri opustení reaktora nad požadovanou cieľovou hodnotou 30 pg/l v nezriedenom pive. Ak bola kvapalina v tomto štádiu prefiltrovaná na odstránenie kvasiniek, zostal diacetyl vysoký, a preto bol aplikovaný vsádzkový interval za tepla, aby sa hodnota diacetylu znížila pod prijateľnú hranicu.

Kontinuálne fermentované pivo bolo zachytávané a uchovávané v 40 1 tankoch z nehrdzavejúcej ocele pri 21 °C. Z kvapaliny boli pravidelne odoberané malé vzorky (100 ml) a analyzované na diacetyl. etanol, špecifickú hmotnosť, estery a pribudlinu. Obr. 6.74 znázorňuje zníženie diacetylu v závislosti od času zdržania za tepla pre jednu vsádzku piva, fermentovaného kontinuálne s kvasinkami LCC290 ako imobilizačnou matricou. Interval zdržania za tepla účinne znížil hladinu diacetylu z cca 600 pg/l pod 30 pg/l. čo sa v pivovarníckom priemysle považuje za predbežnú hranicu.

V inom teste bol skúmaný vplyv miešania na zníženie diacetylu v čase zdržania. Do zbernej nádoby piva bol rúrkou z nehrdzavejúcej ocele s priemerom 1,27 cm v dne privádzaný prebublávací oxid uhličitý (0,14 m³/h), aby bola kvapalina v čase zdržania miešaná. Výsledky tohto experimentu znázorňuje obr. 6.75. Zdá sa, že miešanie pomocou COj malo na rýchlosť znižovania diacetylu v tomto sekundárnom zbernom tanku veľmi malý vplyv. Tento výsledok môže ukazovať na neadekvátnosť miešania pomocou CO2, ktoré preto nezvy šuje reakčnú rýchlosť prvej chemickej reakcie (konverzia α-acetolaktátu na diacetyl) alebo nezvyšuje rýchlosť prestupu hmoty, aby druhá reakcia prebiehala rýchlejšie (konverzia diacetylu na acetoín kvasinkami). Tiež je možné, že nemiešaná nádoba obsahuje dostatok buniek v suspenzii, aby ďalej redukovali diacetyl na chuťovo inaktívny acetoín, len čo dôjde k rýchlosť limitujúcej chemickej konverzii (1. stupeň).

Účinky tohto vsádzkového zdržania za tepla, nasledujúceho po primárnej kontinuálnej fermentácii, na koncentráciu esterov a pribudlín a na koncentráciu etanolu a špecifickú hmotnosť kvapaliny sú znázornené na obr. 6.76, resp. 6.77. Z týchto výsledkov sa zdalo, že interval zdržania za tepla má malý vplyv na koncentrácie acetaldehydu, etylacetátu, propanolu, izobutanolu, izoamylalkoholu a izoamylacetátu (obr. 6.76). Špecifická hmotnosť kvapaliny v zbernej nádobe poklesla počas prvých 12 h času zdržania z 2,7 °P na 2,0 °P a potom sa ustálila na tejto nižšej hodnote. Koncentrácia etanolu počas celého 65 h testu stála na 70 mg/1. Tieto výsledky ukázali, že čas zdržania primáme ovplyvňuje koncentráciu diacetylu a 2,3-pentándiónu, zatiaľ čo dopad na estery, pribudlinu a etanol je minimálny.

126

Koncentrácia diacetylu/pentándiónu (pg/l)

700

600

500

400

300

200

100

20 30 40 50

Čas zdržania za tepla (h) diacetyl pentándión cieľová koncentr. diacetylu

Obr. 6.74. Koncentrácia vicinálnych diketónov v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v systéme s plynovým výťahom.

ro

Φ o

ce

Ό

CC υ

•CC k· +* c

0) u

c o

700

600'

500

400

300

200

100

20 30 40 50

Čas zdržania (h) ♦ bez miešania · miešanie ' cieľová koncentrácia diacetylu

Obr. 6.75. Koncentrácia diacetylu v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v systéme s plynovým výťahom. Jedna vzorka bola miešaná prebublávaním oxidu uhličitého, zatiaľ čo druhá bola ponechaná statická.

127

Obr. 6.76. Koncentrácia esterov a pribudliny v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v systéme s plynovým výťahom

Obr. 6.77. Koncentrácia etanolu a špecifická hmotnosť v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290 v systéme s plynovým výťahom

128

Postup so vsádzkovým zdržaním bol aplikovaný na kvapalinu získanú z kontinuálnej fermentácie v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom s použitím superflokulentných kvasiniek LCC290, stredne flokulentných kvasiniek LCC3021 alebo κ-karagénanom imobilizovaných kvasiniek. Profily redukcie diacetylu pre tieto tri skúšobné behy sú znázornené na obr. 6.78. Vo všetkých troch prípadoch bol diacetyl úspešne znížený na cieľovú hodnotu 30 pg/l. Čas nutný na toto zníženie sa však vo všetkých troch prípadoch líšil. V situácii LCC290 bolo zníženie zo 600 pg/l na 30 pg/l dosiahnuté približne za 48 h, zatiaľ čo fermentácie s LCC3021 a s κ-karagénanom vyžadovali na dosiahnutie tejto cieľovej hodnoty iba cca 24 h a cca 40 h. Bolo postulované, že tento rozdiel sa vzťahoval na počiatočnú hodnotu diacetylu a nie na typ použitej imobilizačnej matrice.

Obr. 6.79 zobrazuje výsledky diacetylu z obr. 6.78 s úpravou času uskutočnenou pre výsledky fermentácií s LCC3021 a κ-karagénanom. Pôvodné krivky zníženia diacetylu z posledných dvoch fermentácií boli posunuté tak, aby ich počiatočné hodnoty spadli na krivku zníženia diacetylu, vytvorenú superflokulentnými kvasinkami LCC290. Po tejto transformácii sa zdá, že profil redukcie diacetylu spadá pre všetky tri systémy na rovnakú čiaru. S použitím Software TableCurve2D bola týmito výsledkami preložená krivka kinetickej rovnice prvého rádu (Levenspiel, 1972) (obr. 6.80). Bolo vypočítané, že upravené experimentálne údaje z obr. 6.79 vyhovujú rovnici:

[Diacetyl] = 648,54 _e ⁽'°’°^426,) (6.1) s korelačným koeficientom 0,96. Tento výsledok silne podporuje teóriu, že všetky tri mobilizačné systémy majú rovnaký potenciál redukcie diacetylu. Tieto výsledky by nemali byť prekvapujúce, pretože redukcia diacetylu je často spojená s kmeňom kvasiniek (Nakatani et al., 1984). κ-Karagénanový systém imobilizoval kvasinky LCC3021 vo svojej gélovej štruktúre a kvasinky LCC290 boli selektovaným variantom kmeňa LCC3021.

Len čo bola hladina diacetylu pod cieľovou hodnotou 30 qg/l, boli výsledné pivá podrobené zretiu v tankoch za studená (2 °C) počas 7 dní, potom podstúpili finálnu úpravu produktu (filtrácia, riedenie, sýtenie a balenie). V tabuľke 6.3 je zhrnutá analýza pív produkovaných v 50 1 pilotných systémoch buď s kvasinkami LCC290, kvasinkami LCC3021 alebo k-karagénanom imobilizovanými kvasinkami ako imobilizačnou matricou. Obr. 6.81 je radarový' graf esterov a pribudlín týchto troch pív vyrobených kontinuálne a kontrolného piva, vyrobeného priemyselne vsádzkovým spôsobom. V porovnaní

129 s priemyselne vyrobenou vsádzkovou kvapalinou (kontrola) mali kontinuálne získané kvapaliny nižšie estery (etylacetát, izoamylacetát) a vyšší propanol a nižší izobutanol, primárny amylalkohol a izoamylalkohol. Hladina acetaldehydu v produktoch kontinuálnej fermentácie bola vyššia než pri kontrolnej kvapaline. Hladina penenia, počiatočný chladový zákal, tepelný zákal, hladina dimetylsulfidu, oxidu siričitého, oxidu uhličitého a vzduchu boli v hraniciach špecifikácií.

f

♦ LCC290 LCC3021 · karagénan cieľová koncentr. diacetylu' j

Obr. 6.78. Koncentrácia diacetylu v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290, LCC3021 a kvasinkami imobilizovanými karagénanovým gélom v systéme s plynovým výťahom

130

Obr. 6.79. Koncentrácia diacetylu v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290, LCC3021 a kvasinkami imobilizovanými karagénanovým gélom v systéme s plynovým výťahom. Hodnoty na fermentáciu s LCC3021 a s karagénanom boli upravené v čase, aby mali rovnaký východiskový bod ako fermentácia LCC290

131 [Diacetyll = 643.54 exp(-0.04261) r²=0.9641173 Fstat=564.24018

Obr. 6.80 Koncentrácia diacetylu v závislosti od zdržania za tepla po primárnej kontinuálnej fermentácii s kvasinkami LCC290, LCC3021 a kvasinkami imobilizovanými karagénanovým gélom v systéme s plynovým výťahom. Hodnoty na fermentáciu s LCC3021 a s karagénanom boli upravené v čase, aby mali rovnaký východiskový bod ako fermentácia LCC290

Niektoré iné parametre (zdanlivý extrakt, skutočný extrakt, vypočítaný pôvodný extrakt, farba, horkosť), ktoré sú tesne ovplyvnené riedením produktu z pôvodnej koncentrácie etanolu na konečnú hodnotu 5,0 % v/v, boli odlišné než pri kontrole, pretože kontinuálne produkty vyžadovali vyššie riedenie vodou na dosiahnutie požadovanej hodnoty etanolu kvôli vyšším pôvodným koncentráciám etanolu (70 g/1 oproti 60 g/1 vo vsádzke). Obr. 6.82 je radarový graf alkoholu, diacetylu, pH, farby a horkosti tých istých kvapalín opísaných vyššie. Hladina alkoholu, diacetylu a pH sú v cieľových hraniciach, zatiaľ čo farba a horkosť sú mimo špecifikácie. Nižšia farba súvisí s vyšším riedením, ktoré podstúpili kontinuálne kvapaliny, a je ju možné upraviť zvýšením farby v živinách dodávaných do sladiny. Hodnoty horkosti podliehajú rovnakej chybe riedenia a je možné ich tiež upraviť v prívode živín do sladiny.

132

Tabuľka 6.3. Súhrn analýzy pív produkovaných s použitím systému plynového výťahu.

Špecifikácia	kvapalina fermentovaná priemyslovo vo vsádzke	kvapalina kontinuálne fermentovaná s LCC290	kvapalina kontinuálne fermentovaná sLCC3021	kvapalina kontinuálne fermentovaná s karagénanom
vzduch (ml)	< 1	0,40	0,35	0,35
oxid uhličitý (%)	2,75	2,90	2,81	2,73
oxid siričitý (mg/1)	< 10	0	0	0
dimetylsulfid (pg/l)	<70	59	30	30
horkosť (BU)	12,00	11,30	13,74	13,18
farba (SRM)	3,20	2,20	2,10	2,30
PH	4,10	4,15	4,10	4,09
diacetyl (gg/l)	<20	12	12	9
alkohol (%v/v)	5,00	4,99	5,03	5,04
alkohol (%w/w)	3,93	3,93	3,96	3,96
zdanlivý extrakt (°P)	1,55	1,02	1,40	1,44
skutočný extrakt (°P)	3,36	2,84	3,4	3,27
vypočít. pôv. extrakt (°P)	11,0	10,5	11,0	11,0
tepelný zákal (FTU)	<200	45	50	47
počiatočný chladový zákal (FTU)	< 100	43	51	54
pena (s)	> 170	167	187	175
acetaldehyd (mg/1)	4,4 ±1,3	10,0	21,9	11,6
propanol (mg/1)	12,8 ±6,8	57,6	51,7	84,3
etylacetát (mg/1)	32,4 ± 4,3	11,0	10,6	8,7
izobutanol (mg/1)	21,6 ±3,4	10,6	8,3	8,9
primárny amylalkohol (mg/1)	20,0 ± 2,3	15,2	9,4	6,4
izoamylalkohol (mg/1)	60,9 ± 8,6	48,0	40,9	46,5
izoamylacetát (mg/1)	2,5 ± 0,7	0,32	0,25	0,18

133 izoamylacetát x 10

etylacetát izobutanol acetaldehyd x 4 izoamylalkoho)<; _ \propanol primárny amylalkoh

j...... kontrola· B - LCC290 —A — LCC3021 —o- karagénan I

Obr. 6.81. Radarový graf pív fermentovaných kontinuálne v systéme s plynovým výťahom s použitím buď kvasiniek LCC290, LCC3021 alebo kvasiniek LCC3021 imobilizovaných v karagénanových gólových perličkách. V tomto grafe sú znázornené estery a pribudlina hotových pív. Všetky produkty boli po skončení primárnej fermentácie podrobené zdržaniu za tepla.

farba (SRM) j— -kontrola- h - LCC290 —A— LCC3021 —o- karagénan

Obr. 6.82. Radarový graf pív fermentovaných kontinuálne v systéme s plynovým výťahom s použitím buď kvasiniek LCC290, LCC3021 alebo kvasiniek LCC3021 imobilizovaných v karagénanových gélových perličkách. V tomto grafe sú znázornené estery a pribudlina hotových pív. Všetky produkty boli po skončení primárnej fermentácie podrobené zdržaniu za tepla.

134

6.6.2. Výber najlepšieho prebublávacieho plynu

Oxid uhličitý je vo väčšine pivovarov ľahko k dispozícii, pretože ide o prirodzený vedľajší produkt fermentáeie kvasiniek. Pivovary uvoľňovaný CO₂ zhromažďujú a potom plynný prúd perú na odstránenie drobných nečistôt, ktoré mohli do neho byť zanesené (typicky sírnych zlúčenín). Tento prečistený prúd je potom stlačený a skladovaný ako kvapalina na budúce použitie v pivovare (čistota 99,95 %). Použitie oxidu uhličitého ako prebublávacieho plynu pri kontinuálnej fermentácii sa z prevádzkového hľadiska zdalo ako logická voľba. Zariadenie by malo byť schopné využiť svoj zberný systém a získavať späť CO₂ opúšťajúci kontinuálny fermentor. Použitie iných plynov by iba pridávalo ďalšiu úroveň zložitosti k doterajšiemu zariadeniu.

Aby sa však kontinuálna fermentácia stala životaschopnou alternatívou k doterajším vsádzkovým prevádzkam, je treba získavať produkt tesne sa vyrovnávajúci doterajším značkám. Má sa za to, že takého priblíženie produktu je možné minimalizáciou biologických/biochemických dopadov, ktorým sú kvasinky vystavené počas kontinuálnej fermentáeie. Je známe, že oxid uhličitý nepriaznivo ovplyvňuje metabolizmus kvasiniek počas primárnej fermentáeie. Tento efekt sa zväčšuje vo vysokých cylindrokónických nádobách, kde hlavový tlak systému potláča voľné uvoľňovanie CO₂ z kvapalného média. Tieto podmienky podporujú tendenciu k výrobe pív s nižším obsahom esterov a vyšším obsahom pribudliny. Uskutočnili sa úspešné pokusy na odstraňovanie časti tohto CO₂ z fermentáeie periodickým nastrekovaním pomocného prúdu plynu do dna cylindrokónickej nádoby. Účinky inhibície s CO₂ sa zdali byť redukované a získané produkty obsahovali menej pribudliny a vyššiu hladinu esterov.

Na základe tejto znalosti bolo skúmané použitie dusíka namiesto oxidu uhličitého ako prebublávacieho plynu v systéme s plynovým výťahom. Bolo odobratých niekoľko kvapalín fermentovaných v 50 1 reaktoroch s výťahom a spracovaných v experimentálnom pivovare Labatt s použitím nasledujúceho postupu. Po 14 h od odobraní kvapaliny z reaktora (čas zdržania 24 h), bolo “mladé pivo” dekantované od kvasiniek. Táto kvapalina potom bola podrobená časovému zdržaniu 48 h pri teplote miestnosti (21 °C), po ktorej sa dosiahli Labattove špecifikácie ako pre diacetyl, tak pre acetaldehyd (diacetyl <30 pg/l a acetaldehyd <10 mg/1). Táto kvapalina potom bola ponechaná zrieť za studená počas 7 dní a potom spracovaná štandardným priemyselným postupom.

135

V tabuľke 6.4 je uvedené porovnanie výsledkov hotových pív, získaných kontinuálnou fermentáciou s kvasinkami LCC290 v systémoch s prebublávaním CO2 a N2 so štandardne priemyselne získanou kvapalinou (kontrola). Kvapalina prebublávaná dusíkom má voči priemyselne získanej kvapaline priaznivé výsledky. Analýzy ukázali, že v tejto kvapaline je dvakrát viac 1-propanolu, zatiaľ čo koncentrácia dimetylsulfidu je približne trikrát nižšia. Hodnoty farby aj horkosti sa javili vyššie než u priemyselnej kvapaliny, rovnako ako potenciál penenia, meraný testom NIBEM. Pivo prebublávané CO2 malo nižšie estery (etylacetát, izoamylacetát) a vyšší 1-propanol než pivo prebublávané dusíkom. Pre kontrolnú kvapalinu, kvapalinu prebublávanú CO2 a kvapalinu prebublávanú dusíkom boli vypočítané pomery esterov (etylacetát, izoamylacetát, etylhexanoát, etyloktanoát, etyldekanoát) k pribudline (1-propanol, izobutanol, izoamylalkohol) a boli 0,30, 0,27, resp. 0,15.

Tabuľka 6.4. Súhrn chemických analýz pre niekoľko produktov kontinuálne fermentovaných s použitím systému s plynovým výťahom plneného superflokulentnými kvasinkami LCC290.

Analýza	priemyselne vsádzkovo fermentovaná kvapalina	kontinuálne fermentovaná kvapalina s prebublávaním dusíkom	kontinuálne fermentovaná kvapalina s prebublávaním CO2
acetaldehyd (mg/1)	2,53	3,68	4,80
etylacetát (mg/í)	28,08	30,90	14,14
1-propanol (mg/1)	13,03	28,45	40,03
izobutanol (mg/1)	17,15	17,89	7,01
izoamylacetát (mg/1)	2,57	2,06	0,69
izoamylalkohol (mg/1)	74,54	78,45	51,35
etylhexanoát (mg/1)	0,140	0,180	0,074
etyloktanoát (mg/1)	0,110	0,280	0,059
etyldekanoát (mg/1)	0,0079	0,0630	0,0081
diacetyl (pg/l)	6	9	10
2,3-pentándión (pg/l)	4	5	14
oxid siričitý (mg/1)	1,3	1	0
dimetylsulfid (mg/1)	79	24	64
horkosť (BU)	11,5	20,6	15,5

136

farba (SRM)	3,1	4,1	3,7
pena (s)	176	210	195
FAN (mg/1)		92	84
pH	4,13	4,10	4,19
RE(°P)	3,38	4,08	3,601
COE (°P)	10,97	12,77	11,50
alkohol (% v/v)	4,93	5,74	5,17

Obr. 6.83 je radarový graf, znázorňujúci koncentrácie esterov, pribudliny a acetaldehydu v týchto troch kvapalinách. Profil kvapaliny prebublávanej dusíkom sa veľmi blíži profilu kontrolnej kvapaliny, až na vyššiu hladinu propanolu. Fermentácia s prebublávaním CO₂ vykazovala omnoho nižšie estery a pribudlinu, ktoré sa líšili od kontroly. V oboch kvapalinách z kontinuálnej fermentácie boli hladiny diacetylu a acetaldehydu pod špecifikáciami Labatt.

Z týchto zistení vyplynulo, že prebublávanie dusíkom zvyšuje produkciu esterov na podobnú úroveň, ako u komerčných pív, zatiaľ čo prebublávanie oxidom uhličitým produkuje kvapaliny s relatívne nízkou koncentráciou esterov. Tieto výsledky ukazujú na zmenený metabolizmus kvasiniek v prostredí prebublávanom CO₂. Hladina propanolu, bez ohľadu na prebublávací plyn, bola v kontinuálne fermentovaných pivách omnoho vyššia než v priemyselne fermentovaný ch kontrolných pivách. Aj keď sú koncentrácie propanolu stále pod chuťovým prahom 100 mg/1, zaznamenané rozdiely môžu byť ukazovateľom mierne zmeneného metabolizmu pri kontinuálnej fermentácii v porovnaní so vsádzkovou fermentáciou. Je tiež možné, že vyššia hladina propanolu je dôsledkom kontinuálnej dodávky aminokyseliny treonínu, ktorá poskytuje oxo-kyslou degradačnou cestou propanol.

137 izoamylalkohol acetaldehyd x 10 izoamylacetát x 10

etylacetát

1-propanol izobutanol kontrola N2-prebublávanie ····· CO2-prebublávanie

Obr. 6.83. Radarový graf porovnávajúci estery a pribudlinu v kvapalinách z kontinuálnej fementácie s plynovým výťahom s dusíkom a CO2 voči priemyselne získanej kvapaline

Kapitola 7.0: Závery

Z výskumov, vykonávaných v celom priebehu tejto práce, je možné urobiť nasledujúce závery. S použitím 50 1 pilotného bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou ako primárneho kontinuálneho fermentora je možné vyrobiť prijateľné pivo bez závažných chuťových defektov, ak nasleduje 2-denné zdržanie vo vsádzke na obmedzenie diacetylu. Na fermentáciu sladiny s vysokou hmotnosťou (17,5 °P) na konečnú fermentačnú pôdu (2,5 °P) je dosiahnuteľný minimálny čas zdržania 24 h alebo 1 obrat objemu reaktora za deň. Použitie superflokulentných kvasiniek LCC290, stredne flokulentných kvasiniek LCC3021 a kvasiniek imobilizovaných κ-karagénanom ako nosičov je v systéme s plynovým výťahom uskutočniteľné. Použitie ťažších prefabrikovaných nosičov, ako sú sklenené perličky Siran a kremelinové perličky Celíte nepredstavuje pre systém s plynovým výťahom a sacou rúrkou praktické alternatívy. Je možné dosiahnuť minimálne 2 mesiace nepretržitej prevádzky v prípade κ-karagénanových gélových perličiek a minimálne 3 mesiace nepretržitej prevádzky v prípade fermentácií LCC290 a LCC3021 bez akejkoľvek zaznamenanej mikrobiálnej kontaminácie alebo nestability výkonu reaktora. Okrem toho bol

138 kontinuálny systém schopný manipulačného potenciálu a predpokladaných zmien v dodávke pri dlhodobej prevádzke.

Kontinuálnou fermentáciou s použitím superflokulentných kvasiniek LCC290 s dusíkom ako prebublávacím plynom, s následným 2-dňovým zdržaním vo vsádzke, sa dosiahla najbližšia porovnateľná chuť s kontrolným priemyselným pivom. 2-dňové vsádzkové zdržania, navrhované na vyrovnanie sa s vysokými koncentráciami diacetylu vo výstupnej kvapaline z primárneho kontinuálneho fermentora, boli účinným, aj keď nie optimálnym kontrolným mechanizmom. Schopnosť všetkých troch testovaných systémov kontinuálnej fermentácie znížiť diacetyl bola veľmi podobná, a ako bolo vopred očakávané, tento rys je možné priradiť k typu kmeňa. Vsádzkové zdržania neovplyvnili koncentráciu esterov a pribudliny v pive počas štádia zdržania.

Použitie 3 % kyslíka v prebublávacom plyne poskytlo adekvátnu hladinu zdroja kyslíka v sladine, čoho výsledkom bolo udržanie životaschopnej populácie kvasiniek (nad 90 %) po celý čas fermentácie pri produkcii piva s prijateľným chuťovým profilom. Kontinuálne fermentácie s použitím kvasiniek LCC290 a LCC3021 ako imobilizačných matríc dosiahli pseudo-ustálený stav rýchlejšie, než systém s κ-karagénanovými gélovými perličkami. Nestabilita fermentácii s imobilizáciou κ-karagénanom, pravdepodobne v dôsledku zvýšenia populácie imobilizovaných kvasiniek, spôsobila fermentáciu produktu pod cieľovými hodnotami. Na ideálnu kontinuálnu produkciu je tento jav vysoko nežiaduci, pretože predĺžený nábeh zväčšuje čas nutný na reagovanie a znovuzačatie po katastrofickom výpadku. Dlhšia nábehová fáza vyžaduje tiež dlhšiu fázu kontinuálneho behu, aby bol atraktívny.

Kontinuálnym procesom výroby gélových perličiek bolo získané požadované množstvo perličiek na testovanie v poloprevádzkových jednotkách. Proces výroby perličiek je však nutné ďalej optimalizovať na získanie perličiek s užšou distribúciou veľkostí. Proces tiež vyžaduje ďalší výskum na stanovenie jeho vhodnosti pre priemyselné meradlo. Skôr než miešadlo typu Kenics, skúmané v tejto práci, musí byť nájdený nový typ statického miešadla, u ktorého je možné dosiahnuť dimenzovanie zväčšením priemeru, nie iba počtu statických prvkov, a testovaný, aby sa táto možnosť stala uskutočniteľnou.

Technika sledovania pulzu kyseliny, použitá v tejto práci, nám umožnila zisťovať čas miešania a rýchlosť cirkulácie v 50 1 pilotnom bioreaktore počas skutočných fermentácii s

139 použitím superflokulentných kvasiniek LCC290, stredne flokulentných kvasiniek LCC3021 a κ-karagénanom imobilizovaných kvasiniek. Údajmi o miešaní bola preložená útlmová sínusoida, z ktorej bol vypočítaný čas miešania a rýchlosť cirkulácie.

Systém s plynovým výťahom a sacou rúrkou poskytuje rýchle miešanie s časom miešania vypočítaným na menej než 200 s pre všetky tri typy imobilizačných nosičov. Vo všetkých troch testovaných verziách čas miešania mierne klesal so vzrastom povrchovej rýchlosti plynu. Pri všetkých testovaných povrchových rýchlostiach plynu (2 mm/s až 6 mm/s) vykazoval systém LCC290 najrýchlejší čas miešania (medzi 100 s a 120 s). Časy cirkulácie kvapaliny boli pre všetky tri typy nosičov veľmi podobné bez ohľadu na povrchovú rýchlosť plynu. Tiež lineárne klesali so zodpovedajúcim vzrastom rýchlosti plynu. Ku kompletnému premiešaniu kvapaliny (98% odpoveď na pulz) došlo pri všetkých testovaných imobilizačných nosičoch počas troch až šiestich cirkulačných cyklov reaktora. Tieto výsledky potvrdili, že testovaný 50 1 pilotný systém poskytuje adekvátne miešanie pre kontinuálnu fermentáciu. Zlé časy miešania by ukazovali na možné mŕtve zóny, ktoré by boli pri fermentácii piva nežiaduce.

Táto výskumná práca Ph.D. jasne preukázala uskutočniteľnosť ďalšieho dimenzovania výrobného zariadenia navrhnutého, vystaveného a prevádzkovaného v experimentálnom pivovare Labatt. Použitie bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou so superflokulentnými kvasinkami LCC290 a dusíkom ako prebublávacím plynom s následným 2-dňovým vsádzkovým zdržaním pri 21 °C je odporúčané ako systém voľby.

Podrobný opis - Časť 2:

Kapitola 4.: Materiály a metódy

4.1. Kmeň kvasiniek a jeho charakteristika

V celej tejto práci bol používaný kmeň ležiakových kvasiniek Saccharomyces cerevisiae, uložený v zbierke Labatt Culture Collection (LCC) 3021. Saccharomyces cerevisiae je synonymom Saccharomyces uvarum Beijerinck var. carlsbergensis Kudryavtsev, 1960 (Kurtzman, 1998). Pri 37 °C LCC 3021 nerastie. To umožňuje rozlíšiť LCC 3021 od väčšiny pivovarských kvasiniek, ktoré rastú pri 37 °C a vyšších teplotách. LCC 3021 je spodne kvasiaci kmeň, podobne ako väčšina ležiakových kvasiniek, ale existujú

140 výnimky. Tento kmeň tiež kvasí glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, rafmózu a melibiózu, ale nie škroby. Schopnosť kvasiť melibiózu je pre taxonómov jedným z nástrojov, ako ich odlíšiť od ostatných pivovarských kvasiniek.

Podobne ako väčšina pivovarských kmeňov je LCC 3021 polyploidná a reprodukuje sa mitotickým delením. V normálnych podmienkach varenia piva sa ležiakové kvasinky nereprodukujú meiózou. To má výhodu, že je kmeň geneticky stály, pretože je menej pravdepodobné kríženie genetického materiálu (Kreger-van Rij, 1984).

4.2. Príprava inokula kvasiniek

Kvasinky boli odobraté z fľaštičky, kryogénne uchovávanej v mrazničke pri -80 °C, a nanesené na agarové živné médium speptónom a kvasničným extraktom (PYN; peptón 3,5 g/1, kvasničný extrakt 3,0 g/1, KH2PO4 2,0 g/1, MgSCLTH^O 10 g/1, (NPLt^SCL 1,0 g/1, glukóza 20,0 g/1, agar 20,0 g/1 v dľ^O) na získanie dobre oddelených kolónií. Z 3 až 4 starej platne rastúcich kvasiniek bolo odobraté sterilné oko, tvorené niekoľkými kolóniami, a tieto kolónie boli naočkované do 10 ml objemu sladiny v skúmavke. Sladina bola ponechaná cez noc pri 21 °C, odtiaľ termín “nočná kultúra”, a potom bola pridaná do väčšieho objemu sladiny, obvykle 200 ml, na zvýšenie biomasy kvasiniek. V nasledujúcich dňoch bola táto zmes pridaná do ďalšieho väčšieho objemu sladiny, a tak ďalej, kým nedošlo k propagácii požadovaného množstva kvasničnej biomasy. Obvykle sa očakáva produkcia približne 20 g ležiakových kvasiniek na liter sladiny. Na prípravu inokulácie kvasiniek bola kultúra odstreďovaná 10 min pri 4 °C a 1,0 X 10⁴ min'¹ (rádius = 0,06 m). Po odstredení bola kvapalina dekantovaná a z pelety bola získaná príslušná mokrá váha kvasiniek na očkovanie.

4.3. Médium na fermentáciu sladiny

Pivovar Labatt Breweries of Canada dodal pivovarskú sladinu so špecifickou hmotnosťou 17,5 °P. Koncentrácia skvasiteľných uhľohydrátov, špecifická hmotnosť a voľný amínový dusík v pivovarskej sladine používanej na fermentáciu v celej tejto práci sú uvedené v prílohe A2.1. Ďalšie podrobnosti ohľadne zloženia sladiny uvádza Dale et al., 1986, Hoekstra, 1975, Hough et al., 1982, Klopper, 1974, and Taylor, 1989.

141

Vsádzkové fermentácie: Sladína bola zahrievaná 45 min v autokláve na 100 °C a potom ochladená, potom bola naočkovaná imobilizovanými perličkami alebo voľne suspendovanými kvasinkami.

Kontinuálne fermentácie: Sladina používaná na kontinuálne fermentácie bola bleskovo pasterizovaná (doskový tepelný výmenník Fisher, typ combi-flow Eurocal 5FH) predtým, než bola zavádzaná do bioreaktora s plynovým výťahom, a táto sladina bola pravidelne monitorovaná na mikrobiálne kontaminanty, ako je opísané v sekcii 4.6. Ak bola v sladine detegovaná kontaminácia, bola okamžite zničená a zo zariadenia bola získaná nová sladina.

Bleskový pastér pracoval s objemovým prietokom 0,8 m³ / h. Jednotka mala rúrkovú zdržiavaciu sekciu, kde bola sladina udržiavaná na priemernej teplote 85 ^DC s minimálnou teplotou 80 °C. Objem zdržiavacej sekcie bol 1,13 x 10‘² m³ a poskytoval čas zdržania v zdržiavacej sekcii 51 s. Po ohrievacom stupni bola sladina po výstupe z jednotky rýchlo ochladená na teplotu 2 °C.

4.4. Metodika imobilizácie

Kapa-karagénanový gél X-0909 bol láskavým darom od Copenhagen Pectin A/S. Kapa-karagénanové gélové perličky, obsahujúce zachytené ležiakové kvasinky, boli vyrobené procesom s použitím statického miešadla, ako ho podrobne opisuje Neufeld et al. (1996), s počiatočnou záťažou 10⁷ až 10⁸ kvasiniek/ml gélu, ktorá je špecifikovaná pre každé zariadenie. Ako je znázornené na obr. 15, proces so statickým miešadlom je založený na vzniku emulzie medzi nevodnou kontinuálnou fázou, rastlinným olejom (kukuričný olej Mazola) a dispergovanou vodnou fázou, roztokom kapa-karagénanu (3% w/v) v KC1 (0,2% w/v), naočkovanej kvasinkami, s použitím radových polyacetálových statických miešadiel (Cole-Parmer Inštrument Co., USA). V ohrievacej sekcii schémy, kde sa kvasinky rýchlo miešali s roztokom karagénanu a tvorila sa emulzia, bola teplota 37 °C. Gélovatenie kapakaragénanový ch kvapiek v emulzii bola vyvolaná rýchlym ochladením na ľadovom kúpeli a následným vytvrdením v kúpeli chloridu draselného (22 g/1). Na vytvorenie zmesi kvasiniek a karagénanu bolo použité 24-prvkové statické miešadlo s priemerom 6,4 mm. Na vytvorenie emulzie bolo použité druhé 42-prvkové miešadlo s priemerom 12,7 mm. Perličky použité na experimenty v tejto práci boli 0,5 mm < (priemer perličky) < 2,0 mm.

142

4.5. Kumulatívna distribúcia veľkostí častíc kapa-karagénanových gélových perličiek

S obsahom imobilizovaných kvasiniek

Na výpočet distribúcie veľkostí častíc na báze mokrej hmotnosti boli kapakaragénanové gélové perličky náhodne odobraté z 30 1 produkčného zariadenia gélových perličiek. Každá vzorka mala približnú hmotnosť za mokra 500 g. Na určenie distribúcie veľkostí perličiek bolo použité sieťovanie. Perličky prechádzali radom sít s veľkosťou oka 2,0, 1,7, 1,4, 1,18, 1,0 a 0,5 mm. Na uľahčenie sitovania každej vzorky perličiek bol použitý objem 4,5 1 roztoku KC1 22 g/1. Predpokladalo sa, že kapa-karagénanové gélové perličky sú dokonale guľaté, takže priemer sita bol považovaný za priemer častice. Tiež sa predpokladalo, že hustota častíc je rovnomerná a nezávislá od veľkosti častice.

4.6. Počítanie a životnosť kvasiniek

Životnosť a koncentrácia voľne suspendovaných kvasiniek: Na meranie životnosti kvasiniek bola použitá medzinárodná metóda metylénovej modrej podľa The American Society of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Farbením sa zisťuje, či je populácia kvasiniek životaschopná alebo nie je, na základe schopnosti životaschopných kvasiniek oxidovať farbivo na jeho bezfarebnú formu. Neživotaschopným kvasinkám chýba schopnosť oxidovať farbivo, a teda sa farbia modro. Metylénová modrá, tlmená pufrom Fink-Kuhles, bola pripravená zmiešaním 500 ml roztoku A (0,1 g metylénovej modrej/500 ml dELO) s 500 ml roztoku B (498,65 ml 13,6 g KH2PO4 / 500 ml d H2O v zmesi s 1,25 ml 2,5 g Na2HP04-12H20/100 ml d H2O) za vzniku konečného tlmeného roztoku metylénovej modrej s hodnotu pH 4,6.

Zriedený roztok kvasiniek bol v skúmavke zmiešaný s roztokom metylénovej modrej na suspenziu približne 100 kvasiniek v políčku mikroskopu. Malá kvapka dobre premiešanej suspenzie bola umiestnená na mikroskopické sklíčko a prekrytá krycím sklíčkom. Po 1 až 5 minútach kontaktu s farbivom sa kvasinky sfarbili modro a boli spočítané tie bunky, ktoré zostali bezfarebné. Percento životaschopných buniek bolo uvedené ako percento spočítaných buniek z celkového počtu. Koncentrácia kvasiniek bola určená pomocou svetelného mikroskopu a prístroja Hemacytometer (Hauser Scientific Company).

143

Životnosť a koncentrácia imobilizovaných kvasiniek: Gélové perličky boli oddelené od kvasiacej kvapaliny prechodom zmesi cez sterilné sito (veľkosť pórov 500 pm) a premytím 10 ml destilovanej vody. Gélové perličky, 1 ml, obsahujúce zachytené kvasinky, boli pridané do sterilnej 50 ml vzorkovnice, obsahujúcej 19 ml destilovanej vody. Perličky potom boli s použitím zariadenia Polytron® (Brinkmann Instruments) rozrušené, aby sa kvasinky uvoľnili z gélu. Životnosť a koncentrácia kvasiniek potom bola meraná spôsobom opísaným pre voľne suspendované kvasinky.

4.7. Mikrobiologické analýzy

Analýzy v kvapalnej fáze: Vzorky pre mikrobiologické analýzy boli z kontinuálnej fermentácie odoberané aspoň raz za týždeň. Sladina, ktorá bola používaná na kontinuálnu fermentáciu, bola tiež pred prenesením do reaktora testovaná na kontamináciu. Na zistenie prítomnosti aeróbnych a anaeróbnych baktérií boli vzorky nanesené na Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) s prídavkom 10 mg/1 cykloheximidu a inkubované 10 dní pri 28 °C. Platne, ktoré boli testované na kontamináciu anaeróbnymi baktériami, boli umiestnené do anaeróbnej nádoby s balíčkom AnaeroGen® (Oxoid), ktorý vychytáva všetok kyslík zostávajúci v nádobe, a tak vytvára anaeróbne prostredie. Na potvrdenie anaeróbnych podmienok v nádobe bol použitý anaeróbny indikátor (Oxoid), ktorý sa v prítomnosti kyslíka farbí na ružovo. Kontaminácia divokými kvasinkami bola testovaná nanesením vzoriek na kvasnicové médium (YM agar, Difco Laboratories) plus CUSO4 (0,4 g/L), inkubované pri 25 °C počas 7 dní. Na testovanie vzoriek na kontamináciu neležiakovými kvasinkami bol použitý vyššie opísaný agar s peptónom a kvasnicovým extraktom (PYN) pri 37 °C počas 7 dní. Absencia rastu kvasiniek na PYN pri 37 °C ukazuje, že nie sú prítomné žiadne pivovarské kvasinky, ktoré rastú pri 37 °C.

Analýzy v gélovej fáze: V našom laboratóriu bol vyvinutý test, zaisťujúci, že imobilizované perličky s kvasinkami, používané na fermentáciu, sú pred naočkovaním do bioreaktora bez kontaminujúcich baktérií. Hlavným problémom bolo zamedziť kontaminácii organizmami, ktoré kazia pivo, ako je Pediococcus sp. a Lactobacillus sp. alebo divoké kvasinky. Objem 3 ml karagénanových gélových perličiek bol naočkovaný do 100 ml niekoľkých rôznych selektívnych kvapalných médií, opísaných ďalej, umiestnený do 250 ml baniek pri 25 °C a trepaný v inkubátorovej trepačke rýchlosťou 100 min’¹. Médium NBB (Nachweis von Bierschädlichen Bacterien) (BBL cat # 98139, NBB Broth Base, 0,02 g/1 cykloheximidu) je

144 semiselektívne médium, ktoré sa používa pre baktérie kaziace pivo, ako je Pediococcus sp. a Lactobacillus sp. Médium so síranom meďnatým (16 g/1 média YM, Difco; 0,4 g/1 CuSCE) je semiselektívne médium na testovanie na kontamináciu divokými kvasinkami. Konečne médium Standard Methods (STA) + cykloheximid (16 g/1 média “Standard Methods”, Difco; 0,02 g/1 cykloheximidu) sa používa na testovanie na baktérie nachádzajúce sa vo vode, odpadovej vode, mliekarenských produktoch a potravinách (Power and McCuen, 1988). Na detekciu a identifikáciu potenciálnych organizmov kaziacich pivo počas troch dní boli zvolené selektívne médiá,. Kontaminované vzorky boli indikované zákalom vo vzorke a uskutočnila sa predbežná identifikácia kontaminantov.

Metodika detekcie respiračné deficitných (RD) kvasiniek: Technika prekrývania trifenyltetrazóliumchoridom (TTC): Táto metóda bola použitá na rozlíšenie respiračné deficitných kvasiniek od zvyšku populácie a je založená na princípe, že TTC je bezfarebná soľ, ktorá tvorí pri redukcii červenú zrazeninu. Ak sa TTC navrství na kolónie kvasiniek rastúcich na agare YPD (kvasnicový extrakt 10 g/1, peptón 20 g/1, dextróza 20 g/1, agar 20 g/1 v dTEO), respiračné dostatočné kvasinky TTC redukujú a tieto kolónie sa sfarbia do tmavo ružová až červená. Respiračné deficitné kvasinky však toto farbivo neredukujú a zachovajú si svoju pôvodnú farbu.

Pred nanesením na platne boli kultúry sériovo nariedené na vhodnú koncentráciu mikroorganizmov, cca 100 buniek/0,2 ml. Platne YPD potom boli inkubované približne 3 dni pri 21 °C, kým neboli kolónie kvasiniek viditeľné v aeróbnom prostredí. Každá platňa potom bola prevrstvená 20 ml TTC agaru s teplotou 50 °C. TTC agar bol pripravený po ochladení jednotlivých roztokov na 50 °C zmiešaním 1:1 roztoku A (12,6 g/1 NaHjPCh, 11,6 g/1 Na2HPO4, 30,0 g/1 agaru v dH2O, autoklávované pri 121 °C 15 min) s roztokom B (2,0 g/1 2,3,5-trifenyltetrazóliumchIoridu v dTTO, autoklávované pri 121 °C 15 min). Platne boli odčítané po 3 h inkubácie pri teplote miestnosti. Percento RD bolo uvedené ako percento nesfarbených kolónií z celkového pozorovaného počtu.

4.8. Skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) kvasiniek imobilizovaných v kapakaragénanových gélových perličkách

Kapa-karagénanové gélové perličky obsahujúce imobilizované kvasinky boli zbioreaktora odobrané vzorkovacím otvorom a umiestnené do sklenenej fľaštičky so skrutkovacím uzáverom s objemom 10 ml, pričom perličky boli ponorené v malom objeme

145 fermentačného média. Fľaštička bola okamžite prekrytá ľadom a prenesená v izolovanej nádobe do zariadenia SEM. Kapa-karagénanové gélové perličky obsahujúce imobilizované kvasinky boli fixované v 2% (v/v) glutaraldehyde pripravenom v Sorensenovom fosfátovom pufre, 0,07 M, pH 6,8 (Hayat, 1972). Potom sa uskutočnila post-fixácia v 1 % (w/v) oxide osmičelom, pripravenom v rovnakom pufri, a dehydratácia postupnou radou alkoholických roztokov 50, 70, 80, 90, 95, 100 % (v/v), každý počas 15 min, a potom 3 výmeny pri 100 %. Pred sušením v kritickom bode (Ladd Research Industries, Burlington, VT) pomocou oxidu uhličitého boli niektoré perličky zmrazené v kvapalnom dusíku, narušené a zhromaždené do 100 % alkoholu. Narušenie mrazom umožňuje expozíciu vnútorného povrchu perličiek s minimálnou distorziou. Po sušení v kritickom bode bolo na vzorky nanesené rozprašovaním (rozprašovacie zariadenie Polaron SC500, Fison Instruments, England ) 30 nm zlato/paládium a potom boli vzorky podrobené skenovaniu autoemisným skenovacím elektrónovým mikroskopom Hitachi S-4500 (Nissei Sangyo, Tokyo, Japonsko).

4.9 Protokol odoberania vzoriek z bioreaktora

Rezervoár vzorkovacieho otvoru bioreaktora (membránový vzorkovací ventil ScandiBrew Type T) bol naplnený 70 % (v/v) roztokom etanolu na zachovanie aseptických podmienok v okolí otvoru medzi odoberaním vzoriek. Na odber vzorky bola predtým, než bol vzorkovací otvor otvorený, z dna etanolového rezervoáru vytiahnutá zátka, rezervoár bol vypustený a dôkladne prepláchnutý etanolom. Vzorky boli zhromažďované do ampúl so stisnutými koncami alebo do nádoby so skrutkovacím uzáverom a objemy sa pohybovali od 5 - 60 ml v závislosti od požadovanej analýzy. Na testovanie na mikrobiologickú kontamináciu bolo 10 ml fermentačnej kvapaliny vákuovo prečerpaných cez sterilnú filtračnú jednotku. Membrána s veľkosťou pórov 0,45 pm bola umiestnená do vhodného selektívneho média, ako je opísané v sekcii 4.6.

Na chemické analýzy bolo 60 ml vzorky odobraných cez septum zo 100 ml ampulky so stisnutými koncami a prefiltrovaných cez dvojvrstvový ihlový filtračný systém Schleicher a Schúli FP-050 s veľkosťou pórov 5 pm a 0,45 pm. Požadovaný objem vzorky bol potom umiestnený do nádobky s horným objemom 20 ml, ktorá bola uzavretá Teflónovým šeptom a alumíniovým uzáverom. Potrebné objemy vzoriek sú uvedené v tabuľke 4.1.

146

Tabuľka 4.1. Požiadavky na objem vzoriek pre rôzne chemické analýzy.

Vzorka Objem (ml)

etanol	5
dioly s krátkym reťazcom	10
prchavý podiel piva	12
vicinálne diketóny	5
uhľohydráty/špecifická hmotnosť/	12
voľný amínový dusík/proteíny	12

4.10. Meranie rozpusteného kyslíka

Analyzátor rozpusteného kyslíka Dr. Thiediga Digox 5 meria rozpustený kyslík v rozmedzí 0,001 až 19,99 mg/1 v sladine, kvasiacej zápare a pive (Anon, 1998). Vilachá a Uhlig (1985) testovali mnoho prístrojov na meranie rozpusteného kyslíka v pive a zistili, že analyzátor Digox poskytuje dôveryhodné a presné hodnoty.

Elektrochemická metóda, používaná prístrojom Digox 5, je založená na ampérometrickom usporiadaní troch elektród s potenciometrom. Merací článok pozostáva z meracej elektródy (katódy) a protielektródy (anódy). Tieto elektródy sú vystavené kvapaline, v ktorej má byť meraná koncentrácia kyslíka. Po fixácii definovaného meracieho potenciálu dôjde na meracej elektróde k reakcii. Na veľkej striebornej meracej elektróde sú molekuly kyslíka redukované na hydroxylové ióny. Dve molekuly vody reagujú podľa rovnice 4.1 s jednou molekulou kyslíka za pohltenia štyroch elektrónov na štyri hydroxylové ióny.

O₂ + 2H₂O + 4e'4OH' (4.1)

Anóda z nerezovej ocele absorbuje štyri elektróny uvoľnené na katóde na zaistenie toku prúdu. Podľa rovnice 4.2 je meraný prúd I priamo úmerný koncentrácii kyslíka C_L,o:

I = K x C_L,₀ (4.2) kde konštanta K je ovplyvnená Faradayovou konštantou, počtom elektrónov prevedených na molekulu, povrchovou plochou katódy a hrúbkou hraničnej vrstvy na povrchu meracej elektródy.

147

Konštantný charakteristický merací potenciál je kritický pre selektivitu (na kyslík) a presnosť merania. Meracie napätie je stabilizované referenčnou elektródou, ktorá nie je zaťažená prúdom. Táto elektróda, spolu s potenciostatom, ktorý poskytuje elektronickú spätnú väzbu, dodáva konštantný merací potenciál. Povrch meracej elektródy je elektrolyticky spojený s referenčnou elektródou pomocou diafragmy.

Chyba, vztiahnutá na merací rozsah konečnej koncentrácie rozpusteného kyslíka, bola ±3 % (Anon, 1998). Analyzátor rozpusteného kyslíka bol kalibrovaný pomocou Thiedig Active Calibration, pri ktorej Dígox 5 poskytol definované množstvo kyslíka podľa Faradayovho zákona (0,500 mg/1), ktoré potom bolo krížovo skontrolované s hodnotami nameranými v matrici. Tak bolo možné prístroj kalibrovať počas 1 min za podmienok tlaku, teploty a toku, ktoré zodpovedajú podmienkam merania. Pretože výmena molekúl v senzore je difúzny proces, je ovplyvnená teplotou, čo vedie k väčším reakčným rýchlostiam a zvýšeniu meraného prúdu, preto je zariadenie Digox 5 tiež vybavené senzorom, ktorý meria teplotu a vykonáva automatickú kompenzáciu výchyliek.

Zariadenie Digox 5 má určité výhody oproti kyslíkovým senzorom na báze membrán. Pretože Digox nepoužíva elektrolyt, je strata citlivosti relatívne pomalá a na meracej elektróde dochádza iba k drobným usadeninám. Citlivosť je tiež možné zisťovať kedykoľvek uskutočnením aktívnej kalibrácie. Jedná sa o jednoduchý proces čistenia elektródy a rekalibrácíe prístroja. Pri väčšine membránových senzorov sa na katóde usadzuje chlorid strieborný a roztok elektrolytu sa mení, čo vedie k postupne nižším odčítaným hodnotám, preto sa odporúča membrány a elektrolyty každých niekoľko týždňov meniť a potom rekalibrovať, čo je zdĺhavá a ťažká práca. Kalibrácia membránových senzorov sa obvykle uskutočňuje v laboratóriu pri hladine nasýtenia kyslíkom, čo môže spôsobiť nezanedbateľné chyby, najmä v matrici sladiny a piva pri veľmi nízkej hladine kyslíka. Teplota má na membránové kyslíkové senzory trojaký vplyv: mení sa priepustnosť membrány, mení sa parciálny tlak kyslíka a mení sa rozpustnosť kyslíka v elektrolyte. Tepelná kompenzácia týchto troch faktorov je pri membránových senzoroch zložitá.

Meranie rozpusteného kyslíka v sladine počas skladovania: Ohybná rúrka potravinárskej kvality Tygon (vnútorný priemer *Z inch - 6,35 mm) bola aseptický napojená na vzorkovací otvor umiestnený v blízkosti vrcholu kužeľovej základne skladovacích tankov sladiny T-l a T-2 (pozri sekciu 4.2.1). Peristaltické čerpadlo s premenlivou rýchlosťou poskytovalo ® TM objemový prietok 11 1/h blokom analyzátora rozpusteného kyslíka ((Masterflex L/S Digital

148

Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50)). Meranie rozpusteného kyslíka v sladine potom boli zaznamenávané po 4 až 5 minútach.

Meranie rozpusteného kyslíka v bioreaktore: Pred uskutočnením merania rozpusteného kyslíka v bioreaktore bol blok analyzátora Digox 5 dezinfikovaný. Vstup senzora bol napojený na sterilnú rúrku potravinárskej kvality Tygon (vnútorný priemer ‘Λ inch - 6,35 mm). Do analyzátora bol počas 15 min čerpaný 70 % (v/v) roztok etanolu s objemovým prietokom približne 10 1/h. Analyzátor rozpusteného kyslíka bol napojený na laboratórny rozvod vody a minimálne 2 h bola do senzora púšťaná horúca voda (70 °C). Táto metóda bola použitá namiesto sterilizácie parou, pretože materiály bloku analyzátora neznášajú teplotu nad 70 °C. Po dvojhodinovej dezinfekcii bolo potrubie na vstupe i výstupe zaškrtené, aby bola vo vnútri analyzátora zachovaná sterilita. V digestore s laminámym prúdením bolo na vstup a výstup analyzátora napojené čerstvo sterilizované potrubie. Voľné konce potrubia boli aseptický upnuté na vstupy na hlave bioreaktora z nerezovej ocele s vnútorným priemerom Ά ”(6,35 mm) a boli vykonávané merania. Keď neboli vstupy na bioreaktore používané, boli uzavreté krátkym úsekom sterilizovaného potravinárskeho potrubia Tygon .

Rozpustený kyslík bol v bioreaktore s plynovým výťahom meraný on-line odoberaním kvapaliny z fermentácie výstupom umiestneným v hlave bioreaktora.

Fermentačná kvapalina opúšťala bioreaktor cez nerezový filter (pozri sekciu 4.1.2), napojený na nerezovú rúrku s priemerom % ” (6,35 mm), ktorá zasahovala do hlavy bioreaktora.

Kvapalina potom prúdila ohybnou potravinárskou rúrkou Tygon (vnútorný priemer Ά ” 6,35 mm), ktorá bola napojená na peristaltické čerpadlo s premenlivou rýchlosťou ® ™ (Masterflex L/S Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50), poskytujúce objemový prietok 11 1/h blokom analyzátora rozpusteného kyslíka. Fermentačná kvapalina potom bola recyklovaná druhým štvrťpalcovým nerezovým vstupom, ktoiý zasahoval do hlavy bioreaktora. Na napojenie senzora na bioreaktor bolo použité potrubie potravinárskej kvality Tygon (Cole-Parmer, 1999) pre svoju dodávateľom špecifikovanú nízku priepustnosť pre kyslík 30 cm³mm/(s-cm²-cmHg) x 10'¹⁰. Meranie bolo vykonávané po 4 až 5 minútach obehu.

149

4.11. Chemické analýzy

Kalibrácie boli vykonávané s použitím príslušných štandardných činidiel. Všetky činidlá používané na analýzu mali čistotu >99 %. V prípade potreby bolo uskutočnené ďalšie prečistenie destiláciou.

4.11.1. Etanol

Koncentrácia etanolu bola stanovená s použitím metódy plynového chromatografu s vnútorným štandardom (GC) podľa Technical Committee a Editorial Committee spoločnosti American Society of Brewing Chemists (1992). Odplynené vzorky boli priamo ošetrené izopropanolom ako vnútorným štandardom, 5 % (v/v), a nastreknuté do plynového chromatografu Perkin Elmer 8500, vybaveného plameňovým ionizačným detektorom (FID) a automatickým vzorkovačom Dynatech. Použila sa kolóna Chromosorb 102, 80-100 mesh s héliom ako nosným plynom. Podmienky chromatografie: prietok 20 ml/min, teplota injektora 175 °C, teplota detektora 250 °C a teplota kolóny 185 °C.

4.11.2. Súhrnný prehľad uhľohydrátov

Koncentrácie glukózy, fruktózy, maltózy, DP3 (maltotrióza), DP4 (maltotetróza), poly-1 (polysacharidový pík 1) a glycerolu vo fermentačných vzorkách boli kvantifikované pomocou vysokoúčinného kvapalinového chromatografu (HPLC) Spectra-Physics (SP8100XR), vybaveného katiónmeničovou kolónou (Bio-Rad Aminex, HPX-87K) a detektorom indexu lomu (Spectra-Physics, SP6040XR). Mobilnú fázu tvoril 0,01 M monohydrofosforečnan draselný a systém bol vybavený automatickým vzorkovačom SpectraPhysics (SP8110). Zariadenie pracovalo s protitlakom 800 psi. Prietok vzorky a eluentu kolónou bol 0,6 ml/min, teplota kolóny 85 °C a teplota detektora 40 °C. Objem nástreku bol 10 μΐ.

4.11.3. Špecifická hmotnosť

Špecifická hmotnosť sladiny a fermentačného média je v tejto štúdii uvádzaná prostredníctvom skutočného extraktu (stupne Plato, °P), čo je uznávaná jednotka používaná v pivovarníckom priemysle.

150

Fermentačné vzorky boli prefiltrované, ako je opísané v sekcii 4.8, a premiešané, potom bola vykonávaná analýza digitalizovaným meračom hustoty (denzitometer Anton Paar

DMA-58) na zistenie špecifickej hmotnosti sladiny (stupne Plato). Fermentačné vzorky boli vložené do sklenenej trubice tvaru U, ktorá elektronicky oscilovala, a tak bola stanovená špecifická hmotnosť, nepriamo poskytujúca stupne Plato.

Stupne Plato označujú číselnú hodnotu percenta (w/v) roztoku sacharózy vo vode pri 20 °C, ktorého špecifická hmotnosť je rovnaká ako pri meranej sladine. Pretože škála stupňov Plato a výsledné tabuľky, vzťahujúce špecifickú hmotnosť roztoku ku koncentráciám solutu, sú založené na vodnom roztoku sacharózy, jedná sa iba o aproximáciu množstva extraktu. Extrakt je termín označujúci celkovú disponibilnú rozpustnú hmotu v kvasiacom materiáli “ako takú” a /alebo potenciálne po spracovaní (Hardwick, 1995), ako uhľohydráty, proteíny, taníny. Extrakt sa v pivovarníckom priemysle doposiaľ vyjadruje ako špecifická hmotnosť v stupňoch Plato, pretože chýba vhodnejšie označenie, lepšie vyjadrujúce variabilitu zloženia sladiny rôzneho pôvodu.

4.11.4. Celkový diacetyl

Celkový diacetyl (2,3-butándión) v pive a fermentačných vzorkách bol meraný s použitím techniky horného odberu vzoriek analytu s následným delením kapilárnou GC (Hewlett-Packard 5890) a detekciou elektrónového záchytu (ECD), založenej na metóde Technical Committee a Editorial Committee spoločnosti American Society of Brewing Chemists (1992). Metóda sa vzťahuje k “celkovému diacetylu”, pretože meria množstvo diacetylu a jeho prekurzora, alfa-acetolaktátu. Nosným plynom bol 5 % metán v argóne s prietokom 1,0 ml/min a bola použitá kolóna J & W DB-Wax. Pomer štiepenia bol 2:1 a pomocným plynom bolo hélium s prietokom 60 ml/min. Teplota injektora bola 105 °C a teplota detektora 120 °C.

Systém bol vybavený horným automatickým vzorkovačom Hewlett Packard 7694E a ako vnútorný štandard bol použitý 2,3-hexándión. Čas cyklu vzorky bol 40 min, s časom ekvilibrácie fľaštičky 30 min pri 65 °C, časom natlakovania 2 min pri 4,8 psig, časom plnenia slučky 0,2 min, časom ekvilibrácie slučky 0,1 min, a časom nástreku 0,27 min. Tlak nosiča bol 18,8 psig, teplota postupovej linky 95 °C a teplota slučky 65 °C.

151

4.11.5. Prchavý podiel piva

Prchavý podiel piva, zahŕňajúci acetaldehyd, etylacetát, izobutanol, 1-propanol, izoamylacetát, izoamylalkohol, etylhexanoát a etyloktanoát, bol meraný metódou GC (Hewlett Packard 5890) s použitím vnútorného štandardu (w-butanol) a plameňového ionizačného detektora (FID). Nosným plynom bolo hélium s prietokom 6,0 ml/min a GC bola vybavená horným automatickým vzorkovačom Hewlett Packard 7694.

Teplota injektora GC bola 200 °C a teplota detektora 220 °C. Teplotný profil piecky: 40 °C (5 min), 40 až 200 °C (10 °C/min), 200 až 220 °C (50 °C/min), 220 °C (5 min). Plyny FID zahŕňali nosný plyn s prietokom 6,0 ml/min, dodatok hélium 30 ml/min a 28 psig, H2 50 ml/min a 25 psig a vzduch 300 ml/min a 35 psig.

Septum bolo preplachované s prietokom 0,8 ml /min. Tlak v hlave bol 4,0 psig. Keď bol na nástrekový otvor napojený automatický vzorkovač, bol tlak vo fľaštičke 15,9 psig, tlak nosiča 7,1 psig, hlavový tlak v kolóne 4 psig, prietok odštiepeného prúdu 18 ml/min a prietok v kolóne 6 ml/min. Teploty zón: fľaštička 70 °C, slučka 80 °C, prenosová linka 150 °C.

Čas cyklu GC bol 40 min, s časom ekvilibrácie fľaštičky 35 min, časom natlakovania 0,25 min, časom plnenia slučky 0,1 min, časom ekvilibrácie slučky 0,1 min, časom nástreku 3 min a objemom slučky vzorky 1 ml.

4.11.6. Voľný amínový dusík (FAN)

Na stanovenie koncentrácie voľného amínového dusíka vo fermentačnej vzorke bola použitá medzinárodná metóda pre voľný amínový dusík podľa Technical Committee a Editorial Committee spoločnosti American Society of Brewing Chemists (1992), s použitím spektrofotometra Perkin Elmer LS50B. Táto spektrofotometrická metóda zobrazuje farebnú reakciu medzi ninhydrínom a dusíkom prítomným vo vzorke. Veľkosť absorbancie sa priamo vzťahuje na množstvo prítomného voľného amínového dusíka.

a) Farebné činidlo: 19,83 g hydrogenfosforečnanu disodného (Na2HPO4)

30,00 dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4)

2,78 g ninhydrín monohydrát

1,50 g fruktóza

152

b) Riedidlo: 2,00 g jodičnan draselný (KI03)

596 ml destilovaná, deionizovaná voda 404 ml 95% (v/v) etanol

Uchovávané v chladničke a používané pri teplote miestnosti.

c) Zásobný roztok glycínu: 0,1072 g/100 ml destilovanej deionizovanej vody

d) Štandardný roztok glycínu: zásobný roztok bol zriedený 1:100 (v/v) destilovanou, deionizovanou vodou. Tento štandard obsahuje 2 mg/1 FAN.

Vzorky boli zriedené destilovanou vodou v pomere 100:1 a do každej z troch skúmaviek boli naliate 2 ml nariedenej vzorky. Slepý pokus bol pripravený naliatím 2 ml destilovanej deionizovanej vody do každej z troch skúmaviek. Boli tiež pripravené tri skúmavky, z ktorých každá obsahuje 2 ml štandardného roztoku glycínu.

Ku všetkým vzorkám bol pridaný 1 ml farebného činidla a boli vložené na presne 16 min do vodného kúpeľa s teplotou 100 °C. Potom boli skúmavky 20 min chladené vo vodnom kúpeli s teplotou 20 °C. Potom bolo do každej skúmavky pridaných 5 ml riedidla a dôkladne premiešané. Vzorky potom boli ponechané 10 až 15 min stáť. Potom bola spektrofotometrom meraná absorbancia pri 570 nm a množstvo FAN vo vzorke bolo vypočítané podľa rovnice 4.3.

FAN (mg/L) - (Ap - Ab - Af) 2d / As (4.3) kde FAN je množstvo voľného aminového dusíka vo vzorke v mg/1, Ap je priemer absorbancií testovaných roztokov, Ab je priemer absorbancií pre slepé pokusy, Af je priemer absorbancií na korekciu na tmavé sladiny a pivá, 2 je množstvo FAN v štandardnom roztoku glycínu, d je faktor riedenia vzorky a As je priemer absorbancií pre štandardný roztok glycínu.

Kapitola 5. Kontinuálna fermentácia s použitím systému bioreaktora s plynovým výťahom

Pre kontinuálnu fermentáciu bol zvolený systém bioreaktora s plynovým výťahom pre svoje publikované výborné charakteristiky prenosu hmoty (kvapalina - pevná látka) a miešania. Prenos hmoty kvapalina - pevná látka je zvlášť dôležitý, pretože zahŕňa prenos živín z kvapalnej fázy do pevného biokatalyzátora s imobilizovanými kvasinkami, ktorý

153 poskytuje substrát pre enkapsulované kvasinky. Tieto reaktory tiež majú dobré prevzdušnenie, nižšiu spotrebu energie a jednoduchú konštrukciu. Tým sú bioreaktory s plynovým výťahom veľmi atraktívne pre operácie vo veľkom meradle, ako napríklad pre priemyselné spracovanie odpadových vôd (Driessen et al., 1997; Heijnen, 1993).

5.1. Opis bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Táto sekcia uvádza podrobný opis bioreaktora s plynovým výťahom, použitého v tejto práci.

5.1.1. Teleso bioreaktora

Bioreaktor s plynovým výťahom a sacou rúrkou s objemom 13 1 (pracovný objem 8 1), navrhnutý pre túto prácu, bol tvorený trojfázovým fluidným lôžkom (kvapalina/pevná látka/plyn), kde boli imobilizované kvasinky udržiavané v suspenzii vnútornou cirkuláciou kvapaliny, poháňanou plynným oxidom uhličitým (Heijnen, 1996), ako je znázornené na obr.

16. Fotografia nádoby bioreaktora je na obr. 17 a podrobný nákres s rozmermi na obr. 18. Oxid uhličitý a vzduch prúdi do spodného kužeľa bioreaktora z prebublávacej rúrky zo sintrovanej nerezovej ocele (dýza pre CO2, časť #9222, Hagedom & Gannon, USA) s dĺžkou 0,11 m a vonkajším priemerom 0,013 m. Oxid uhličitý bol použitý ako fluidizačný plyn a vzduch na dodávanie kyslíka kvasinkám.

Sacia rúrka, umiestnená vo valcovom bioreaktore sústredne, fungovala v tomto systéme fluidného lôžka ako stúpacia rúrka, zatiaľ čo vonkajší prstenec slúžil ako klesacia rúrka. Vnútorná sacia rúrka bola zavesená z cylindrického odlučovača častíc, usadeného na troch výstupkoch z nerezovej ocele v rozšírenej hlavovej Časti bioreaktora. Umiestnenie armatúr sacej rúrky a odlučovača častíc vo vnútri bioreaktora minimalizovalo riziko mikrobiálnej kontaminácie z vonkajšieho prostredia.

Pôvodne mal bioreaktor sito na oddeľovanie imobilizovaných kvasiniek od kvapaliny na výstupe. Sito však bolo náchylné na upchávanie, takže bol použitý valec z nerezovej ocele, ktorý oddeľoval perličky imobilizovaných kvasiniek od kvapalnej fázy, keď prechádzali cez vrchol sacej rúrky a pretekali prstencom dolu. Namiesto toho, aby opúšťali bioreaktor ako prepad, narážali častice do valca a padali späť do kvapalnej fázy. Tak vznikala malá oblasť

154 blízko výstupu z bioreaktora, ktorá bola bez imobilizovaných kvasiniek. Rozšírená hlavová oblasť bioreaktora tiež zväčšovala plochu povrchu na odpútanie bublín plynu.

5.1.2. Veko bioreaktora

Na obr. 19 je uvedený schematický náčrt veka bioreaktora. Otvory veka boli udržiavané na minime, aby sa minimalizovalo nebezpečenstvo kontaminácie. Otvory boli buď priamo navarené na veko alebo boli použité tlakové armatúry (Swagelok®). Veko bolo vybavené inokulačným otvorom, teplomemou záchytkou, teplomerom, šeptom pre odber vzoriek plynu a vstupy a výstupy pre kvapalinu na meranie rozpusteného kyslíka. Do teplomemej záchytky bol vložený teplotný senzor, ktorý bol napojený na systém regulácie teploty. Regulátor teploty ovládal solenoidový ventil, ktorý otváral a uzatváral prívod glykolu to tepelného plášťa bioreaktora. Teplota bola monitorovaná pomocou teplomera (vodovzdomý termočlánkový teplomer Cole-Parmer Waterproof, #90610-20) a sondy typu T, ktorá bola navarená do veka bioreaktora. Rozpustený kyslík bol meraný pomocou analyzátora rozpusteného kyslíka (Dr. Theidig, Digox 5), ktorý na presné odčítanie kyslíka vyžadoval prietok 9 až 11 1/h kvapalného média blokom analyzátora. Kvapalina na meranie kyslíka sa z bioreaktora odvádzala rúrkou s vnútorným priemerom Ά, ktorá prechádzala vekom do fermentačnej kvapaliny. Ako je znázornené na obr. 20, vrchol rúrky bol vybavený filtrom na odstraňovanie väčších častíc z kvapaliny pri jej čerpaní cez analyzátor rozpusteného kyslíka. Kvapalina potom bola do bioreaktora vracaná iným Ά otvorom vo veku.

5.1.3. Sanitárne ventily na aseptický odber vzoriek

Bioreaktor bol vybavený membránovým vzorkovacím ventilom (Scandi-Brew®), navareným do steny bioreaktora. Ventil bol určený na odber vzoriek za aseptických podmienok. Membrána tesnila priamo proti fermentačnej kvapaline, vďaka čomu bol ventil plne sterilizovateľný parou a alkoholom prostredníctvom dvoch výstupov (obr. 18). Membrána bola obklopená malým vonkajším rezervoárom etanolu na uchovanie sterility medzi odbermi. Tento ventil bol používaný pre všetky odbery vzoriek v bioreaktore a predpokladalo sa, že zloženie kvapaliny v bode odberu vzoriek nebolo významne odlišné od kvapaliny opúšťajúcej výstup z reaktora. Ako je uvedené v tejto práci v kapitole Materiály a metódy, bol odber vzoriek z bioreaktora vykonávaný z ventilu umiestneného na vonkajšej stene bioreaktora. Na potvrdenie predpokladu, že zloženie kvapaliny vystupujúcej z výstupu

155 bioreaktora je rovnaké ako pri kvapaline odobratej z telesa bioreaktora, boli uskutočnené štúdie časov miešania.

Na stanovenie času miešania v bioreaktore s plynovým výťahom bola použitá metóda detektora pulzov (Chistie, 1989). Do prstenca bioreaktora bol rýchle nastreknutý 1 ml 10 N HCl a zmena pH bola logaritmovaná v čase s časom t = 0 s v okamžiku nástreku. Hodnota pH sa nástrekom 10 N NaOH vrátila na pôvodnú hodnotu. pH elektróda (Cole-Parmer, cat. #P05990-90) mala dĺžku 277 mm a priemer 3,5 mm. Na monitorovanie pH bol použitý snímač pH Ingold Model 2300. Dvojbodová kalibrácia pH bola uskutočnená pomocou certifikovaných štandardných pufrov, Beckmanovho zeleného pufra s pH 7,0, Part #566002 a Beckmanovho červeného pufra s pH 4,0, Part #566000. Údaje boli logaritmované s frekvenciou 3750 Hz počas 300 s použitím programu, ktorý zostrojili Cheryl Hudson a John Beltrano v r. 1994 a modifikoval Norm Mensour v r. 1999 (University of Western Ontario, London, Ontario).

pH údaje potom boli vyvážené s použitím algoritmu Savitsky-Golay v TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Guelph, Ontario). Algoritmus Savitzky-Golay je metóda vyvažovania čas - doména, založená na bikvadratickom polynomiálnom preložení najmenších štvorcov v pohyblivom okne pozdĺž údajov pH (Anon, 1996). Vyvážené údaje potom boli normalizované a bola zostrojená závislosť ΔρΗ od času. Zobral sa čas miešania po najbližšiu minútu, keď pH dosiahlo cca 95 % rovnovážnej hodnoty. Čas miešania bol meraný s použitím troch rôznych objemových prietokov oxidu uhličitého: 283 cm³/min, 472 cm³/min (objemový prietok používaný v celej tejto práci) a 661 cm³/min. Vo všetkých troch prípadoch sa pH v bioreaktore vyrovnalo (na cca 95 %) za menej než 2 minúty, ako je zrejmé z prílohy 1. Čas miešania bol považovaný za dostatočne krátky na potvrdenie nášho pôvodného predpokladu, že bioreaktor je dobre miešaný. To nám umožnilo predpokladať, že zloženie kvapaliny, odobrané zo steny bioreaktora nie je významne odlišné od kvapaliny, ktorá odteká na výstupe s priemerným časom zdržania v bioreaktore 24 h. Z pripojených obrázkov je vidieť určitá recirkulácia kvapaliny, vznikajúca navyše miešaním dispergáciou, ktorá je typická pre bioreaktory s plynovým výťahom (Chisti, 1989).

5.2. Prúdová schéma systému kontinuálnej fermentácie piva

Prúdová schéma systému kontinuálnej fermentácie piva, ktorý bol umiestnený v pilotnom mikropivovare Labatt Brewing Company Limited, London, Ontario, je

156 znázornená na obr. 21 s podrobným opisom, súčastí v tabuľke 5.1. Sladina bola získaná zo závodu Labatt v meste London, sterilizovaná v bleskovom pastéri (doskový výmenník tepla Fisher s kombinovaným tokom typ Eurocal 5FH), a skladovaná vo veľkých tankoch (T-l a T2). Počas kontinuálnej fermentácie bola sladina prevádzaná s kontrolovaným prietokom do bioreaktora s plynovým výťahom (BR-1), obsahujúceho imobilizované kvasinky. Fermentovaná kvapalina opúšťala bioreaktor ako prepad a bola zachytávaná do zbernej nádrže (T-3). V nasledujúcej sekcii je podrobne opísaná prevádzka systému kontinuálnej fermentácie znázorneného na obr. 21.

5.2.1. Odber a skladovanie sladiny

Neokysličená sladina pre kontinuálnu fermentáciu bola odoberaná potrubím z londonského závodu Labatt do 1600 1 cylindrokónického skladovacieho tanku, vopred prepláchnutého oxidom uhličitým na minimalizáciu príjmu kyslíka sladinou. Všetky tanky tohto meradla, vrátane uchovávacích tankov na sladinu T-l a T-2, boli pred použitím dezinfikované podľa najlepšej praxe firmy Labatt. Sladina potom bola podrobená bleskovej pasterizácii a pri 2 °C prevedená do voľného uchovávacieho tanku T-l alebo T-2 (tiež vopred prepláchnutého oxidom uhličitým). Sladina bola v týchto tankoch pri 2 °C uchovávaná až 2 týždne a dodávala kvapalinu do kontinuálne fermentačného bioreaktora BR-1. Po skončení dvojtýždenného intervalu bol vstup suroviny do bioreaktora prepnutý, takže sladina bola dodávaná z druhého uchovávacieho tanku, ktorý obsahoval čerstvú sladinu. Použili sa dva identické uchovávacie tanky, T-l a T-2, aby sa minimalizoval čakací čas počas prepínania na čerstvú sladinu. Vo všetkých prípadoch bola sladina minimálne 2 dni pred zavedením do bioreaktora (BR-1) testovaná na kontamináciu. Ak bola sladina kontaminovaná, bola zničená a okamžite bola odobraná a pasterizovaná čerstvá sladina.

Minimalizácia koncentrácie rozpusteného kyslíka v sladine počas skladovania: Cieľom bolo skladovať sladinu s minimom kyslíka s konštantnou hladinou a pri nízkej teplote bez zmrazovania sladiny. To bolo potrebné na zamedzenie nežiaduceho zvetrávania sladiny v dôsledku chemických reakcií s kyslíkom (Narzip et al., 1993), na poskytovanie konzistentnej dodávky sladiny do bioreaktora a na minimalizáciu nebezpečenstva kontaminácie sladiny mikróbami počas skladovania. Veľké 1600 1 (čistý objem) cylindrokónické nádoby (T-l a T-2), používané na uchovávanie sladiny na kontinuálnu fermentáciu, boli pôvodne navrhnuté ako vsádzkové fermentory, nie uchovávacie tanky na sladinu. Preto nebolo chladenie týchto

157 nádob adekvátne na uchovávanie sladiny pri 2 °C. Po troch dňoch uchovávania sladiny sa teplota od jednej oblasti tanku k druhej menila až o 15 °C (tabuľka 5.2). Tieto teplé oblasti v tankoch zvyšovali nebezpečenstvo rastu mikróbov. Preto bolo nutné tieto tanky nejako miešať, aby sa všade zaistila rovnomerne nízka teplota.

Z týchto dôvodov bol do základového kužeľa každého uchovávacieho tanku na sladinu (T-l a T-2) umiestnený rúrkový rozdeľovač. Vykonávali sa experimenty na nájdenie najlepšieho postupu na plnenie tankov sladinou a udržovanie konštantnej nízkej hladiny rozpusteného kyslíka. V prvom experimente bol uchovávací tank naplnený sladinou, ktorá bola odobratá bez okysličenia a bleskovo pasterizovaná. Len čo bol uchovávací tank naplnený 1 600 1 sladiny, bolo do základne tanku vpúšťaných 0,113 m³/h oxidu uhličitého. Počas druhého experimentu bola sladina opäť odobratá bez okysličenia a bleskovo pasterizovaná. Tentoraz bol ale tank preplachovaný oxidom uhličitým (0,85 m³/h) 3 hodiny pred naplnením a malé množstvo oxidu uhličitého (0,113 m³/h) bolo do uchovávacej nádoby kontinuálne privádzané súčasne s prevádzaním sladiny do tanku. Tento malý prietok oxidu uhličitého bol kontinuálne prebublávaný sladinou, uchovávanou v tanku, počas jej dodávania do kontinuálnej fermentácie. V oboch experimentoch bola počas týždňa skladovania pravidelne monitorovaná koncentrácia kyslíka rozpusteného v sladine.

Na obr. 5.7 je vynesená koncentrácia rozpusteného kyslíka proti času skladovania sladiny. Keď nebol uchovávací tank vopred prepláchnutý oxidom uhličitým, vzduch v hlavovom priestore umožnil určité zachytenie kyslíka v sladine. Bez predchádzajúceho prepláchnutia tanku tak trvalo významne dlhšie, než koncentrácia rozpusteného kyslíka v sladine dosiahla minimálnu a konštantnú hladinu. Keď bol tank vopred prepláchnutý, zostala koncentrácia rozpusteného kyslíka v sladine po celý čas skladovania na konštantnej úrovni. Preto bolo predbežné preplachovanie skladovacích tankov sladiny (T-l a T-2) a pokračovanie v prívode malého množstva oxidu uhličitého počas skladovania sladiny na udržanie mierneho pretlaku v tankoch prijaté ako súčasť procedúry uchovávania sladiny pri všetkých kontinuálnych fermentáciách.

Bol tiež porovnaný teplotný profil v uchovávacích nádobách s preplachovaním a bez preplachovania 0,113 m³/h oxidu uhličitého. Namiesto so sladinou bol tento experiment vykonávaný s vodou s použitím teplotnej sondy typu T napojenej na teplomer (vodovzdomý termočlánkový teplomer Cole-Parmer, kat. #90610-20). Do uchovávacej nádrže na sladinu bola nabratá vodovodná voda (1600 1) a tri dny ekvilibrovaná a bola zaznamenávaná teplota

158 vody v rôznych oblastiach tanku. Potom bola voda v tanku 24 h preplachovaná 0,113 m³/h oxidu uhličitého a opäť bola zaznamenaná teplota. V každom prípade bola zaznamenaná teplota okolia a požadovaná teplota v uchovávacej nádrži bola 2 °C.

Ako je zrejmé z tabuľky 5.2, pri prebublávaní oxidom uhličitým bola teplota v uchovávacích tankoch rovnomernejšia, v meraných oblastiach ležala medzi 0,1 a 4,1 °C a obsah nádrží nezamŕzal. Táto nižšia teplota pomáhala zabraňovať nežiaducemu rastu mikróbov v sladine počas skladovania.

Plyn bol z uchovávacích tankov na sladinu vypúšťaný cez sterilný plynový filter, umiestnený na vrchu tanku. Sladina potom bola odvádzaná pomocou peristaltického čerpadla ® ™ s premenlivou rýchlosťou (P-l) (Masterflex L/S Digital Standard Drive, Cole-Parmer kat.

#P-07523-50) do vstupu do 8 1 bioreaktora (BR-1) s použitím ohybného potrubia ®

potravinárskej kvality Norprene L/S 16.

5.2.2. Kontinuálna fermentácia s použitím systému bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou

Sladina bola do bioreaktora BR-1 zavádzaná v blízkosti spodného kužeľa štvrťpalcovým vstupom. Zmes filtračné sterilizovaného (filtračná jednotka Millipore, Millex -FG50) vzduchu a oxidu uhličitého (čistota 99,99 %) bola do reaktora privádzaná rozdeľovačom zo sintrovanej nerezovej ocele. Na kontrolu prietoku oxidu uhličitého na STP bol použitý rotameter (R-3) a na kontrolu prietoku vzduchu na STP bol použitý vopred kalibrovaný hmotnostný prietokomer (M-l). Fermentovaná kvapalina odchádzala z bioreaktora ako prepad rúrkou z vystuženého PVC s vnútorným priemerom ľ' do 30 1 zbernej nádoby z nerezovej ocele (T-3), ktorá bola chladená vonkajšou glykolovou špirálou a udržiavaná na teplote 4 °C.

5.2.3. Zachytávanie produktu

Nádoba na zachytávanie produktu (T-3) mala veľký vstupný otvor (vnútorný priemer 1”), ktorý bol konštruovaný tak, že fermentovaná kvapalina tiekla zbernou nádobou dolu, aby sa minimalizovalo penenie. Táto nádoba bola tiež vybavená sterilným plynovým filtrom (filtračná jednotka Millipore, Millex -FG50, 0,2 pm) na vypúšťanie plynu z bioreaktora (BR159

1) a zbernou nádobou (T-3). Zberná nádoba sa periodicky vyprázdňovala pomocou ^lA ventilu (V-12), umiestneného 2” nad základňou tanku.

5.2.4. Glykolová chladiaca slučka

Glykol bol z londonského pivovaru do pilotného mikropivovaru prepravovaný pri teplote -23 °C a tlaku 45 psig a obiehal v chladiacich plášťoch uchovávacích tankov na sladinu (T-l a T-2), bioreaktora s plynovým výťahom (BR-1) a zbernej nádoby produktu (T3). Oba uchovávacie tanky na sladinu a bioreaktor boli vybavené teplotnými sondami pre kvapalnú fázu, ktoré udávali hodnoty regulátorom teploty, ktoré potom regulovali prietok chladeného glykolu do plášťov nádob. Uchovávacie tanky na sladinu uchovávali sladinu pri 2 °C, zatiaľ čo teplota v bioreaktore bola udržiavaná na 12 až 22 °C, v závislosti od konkrétneho experimentu. Zberná nádoba produktu nemala automatickú reguláciu teploty, ale prietok glykolu bol regulovaný manuálne tak, aby udržiaval teplotu nádoby na približne 4 °C. Teplotu zbernej nádoby produktu (T-3) nebolo nutné presne regulovať, pretože kvapalina v tejto nádobe sa iba vypúšťala do odpadu a nebola ďalej analyzovaná alebo spracovávaná.

Glykol bol používaný tiež na oplášťovanie a chladenie dopravných liniek sladiny z tankov sladiny (T-l a T-2) do bioreaktora (BR-1). Potom, čo glykol cirkuloval v danom plášti, bol vrátený do hlavného potrubia v pilotnom mikropivovare a potom vrátený do závodu v meste London, obvykle pri teplote -15 °C a tlaku 40 psig.

5.3. Protokol sterilizácie bioreaktora

Bioreaktor (BR-1) bol naplnený 2% (v/v) roztokom Diversol CX/A (DiverseyLever, Kanada), čo je dezinfekčný detergent, a ponechaný cez noc napustený s preplachovaním plynom. Potom bol reaktor vypustený a vypláchnutý studenou vodou. Tento cyklus čistiaceho roztoku a vyplachovania vodou sa dvakrát opakoval. Na prípravu bioreaktora na parnú sterilizáciu boli odpojené potrubia sladiny a plynu. K bioreaktoru bolo pripojené potrubie pary a boli otvorené tieto ventily: vstupný a čistiaci ventil bioreaktora (V-7, V-6), ventil vstupu plynu (V-17), ventily výstupu produktu (V-9, V-ll), membránové vzorkovacie ventily (V-8, V-10), a vypúšťací výstup zbernej nádoby (V12). Potom bol pomaly otvorený pamý ventil zariadenia a ventily bioreaktora boli nastavené tak, aby na výstupe z každého vonkajšieho otvoru bol pozorovaný malé množstvo pary. Po 60 minútach expozície parou

160 boli uzavreté všetky vonkajšie ventily na bioreaktore (V-17, V-8, V-10, V-12) okrem prepúšťacieho ventilu sladiny (V-6). Po uzavretí parného ventilu bol prepúšťací ventil sladiny uzavretý a ku zbernej nádobe bol pripojený sterilný filter, aby sa zabránilo kontaminácii nesterilným vzduchom, vstupujúcim do systému pri chladení. Po uzavretí parného potrubia zariadenia bolo tiež napojené plynové potrubie reaktora na V-17 na udržanie pretlaku počas chladenia.

5.4. Naštartovanie fermentačného systému

Pivovarská sladina bola zo zariadenia odoberaná do 20 1 nerezovej tlakovej nádoby a zahrievaná 45 min v autokláve na 100 °C. Do vychladenej sladiny boli aseptický prenesené imobilizované kvasinky (40 % v/v). Tesne uzavretá nádoba bola dopravená do pilotného zariadenia mikropivovaru, kde bol umiestnený systém bioreaktora. Potom bola táto 20 1 nádoba napojená na rýchloupínaciu armatúru (Comelius Anoka, MN, USA), ktorá bola uchytená na 3/8” potrubie z vystuženého PVC (Cole-Parmer, USA). Druhý koniec PVC potrubia bol napojený na membránový vzorkovací ventil (V-8) v stene bioreaktora. Do 20 1 nádoby bol privádzaný filtračné sterilizovaný oxid uhličitý v množstve 10 psig a membránový vzorkovací vstup bol otvorený na prenesenie imobilizovanej zmesi kvasiniek z nádoby do bioreaktora, bez toho aby sa inokulum vystavilo okolitému vzduchu. Vnútorné súčasti „rýchloupínacích“ armatúr 20 1 nádoby boli odstránené, aby nedošlo kupchaniu imobilizovanými kvasinkami pri prenose do bioreaktora. Kumulatívna distribúcia veľkosti častíc (podsitové) kapa-karagénanových gélových perličiek je znázornená na obr. 5.8. Aritmetický stredný priemer častíc, D_pam, bol vypočítaný ako 1,252 mm a Sauterov stredný priemer častíc, D_psm, bol 1,17 mm. Stredný priemer častíc bol 1,255 mm. Experimentálne údaje a stredný priemer častíc sú uvedené v prílohe 1.

Po inokulácii imobilizovanými kvasinkami pracoval bioreaktor vsádzkovým spôsobom, do času, než koncentrácie cukrov a diacetylu dosiahli požadované hodnoty menej než 3°Pluto, ak ide o špecifickú hmotnosť, a menej než 100 pg/l diacetylu. Potom bol systém pripravený na kontinuálnu prevádzku. Na prepláchnutie prenosového potrubia sladiny horúcou vodou a jeho parnú sterilizáciu boli otvorené ventily V-2 (alebo V-4 pre T-2), V-5 a V-6, zatiaľ čo V-l (alebo V-3 pre T-2) a V-7 boli uzavreté, a tak bolo potrubie sladiny izolované. Prenosové potrubie sladiny bolo prepláchnuté horúcou vodou s teplotou približne 80 °C, ktorá bola dodávaná cez V-2 (alebo V-4 pre T-2). Po skončení cyklu preplachovania

161 horúcou vodou bolo na rovnaké miesto napojené parné potrubie zariadenia a prenosové potrubie sladiny bolo minimálne 30 min sterilizované parou. V rovnakom okamžiku, keď bolo uzavreté parné potrubie, bol tiež uzavretý prepúšťací ventil (V-6). Len čo systém vychladol, bol uzavretý V-2 (alebo V-4 pre T-2) a bolo odpojené parné potrubie. Bol otvorený ventil tanku sladiny, V-l (alebo V-3 pre T-2) a prepúšťací ventil (V-6) a bolo naštartované čerpadlo sladiny (P-l). Sladina bola prepúšťacím ventilom (V-6) odvádzaná do kanalizácie, kým nebol kondenzát v potrubí nahradený čerstvou studenou sladinou. V tomto okamžiku bol uzavretý prepúšťací ventil a vstupný ventil do reaktora (V-6) na reaktore bol otvorený, a tak sa začal proces kontinuálnej fermentácie.

Každé dva týždne sa tank, ktorý dodával sladinu, vymenil medzi oboma uchovávacími tankami (T-l a T-2). Po dvoch týždňoch dodávky sladiny z T-l bolo zastavené kontinuálne dávkovacie čerpadlo P-l a uzavretý ventil (V-5) na vstupe do bioreaktora. Prenosové potrubie sladiny bolo potom napojené na druhý uchovávací tank (T-2) a prepláchnuté a sterilizované spôsobom opísaným v predchádzajúcom odseku. Kontinuálna fermentácia potom pokračovala po iba krátkej odstávke menej než 1 h.

Ό

1)

Q

C 'tí

O

N

O

I

CO jtí ^3 ’u

CJ tí ε

.2 ’2 o

>N j2

N

-Q

Č

O

X

S o

x σι

Ui 'C3

C ese

X X X cm n cm o o ca ca c d >03 -c3

CM CM CM θ' θ' ο ca ca d

>ca d

'ca ca d

d o

u > 34 x o

Xí ^4 o o >N

3Ω -O 43

CZ) 00 kO

00 00 kO

CZ! CZ3 45

CZ! 00 Ό

ί- Ο x ε

© <u c o u ΓΊ .

x ε d ε

-O ε d ε

X) ε D ε

-O ε d ε

JO ε d ε

x ε d ε

'tí -ä 1 ô

> _o H

> _o s

·>. > _o b

CZ) 00 Ό

CC CC 4>

OO CZ) KO

1—«

1—·

l—M

r—·

O

tr

x

x

w

x

x

x

-

ca

tí

x

t—I

co

CO

co

CO

tí

O

x

x

x

x

x

x

CO

rc

CO

’_c

Z

H

H

H

H

H

H

O

w”

00

CC

<>

x

x

x

x

x

x

CC

00

CC

PS OJ

-

*·

«·

•

·

tí

4)

ό

4)

x

x

d

x

x

X

-

·—1

© © © d d o o *—» M—» > > o 3 T3 Ό d <u

CC CZ! CZ! Vt

4>

*O a

tí

U

-u ϋ

w

J>>

O cu i

m

X

H x

kO uo u

C tí c

tí ε

ό

X u

O) 'tí >

C 'tí u

X

C u

X ca d

CC

CC □

>d ča >

X o

X x

_>>

o cx o

íX o

cx o

u cx x

o u

IX >>

o cc ca ca m x

X Ό

O O O cx cx x

ΓΊ <3 >O 'tí tf)

X

C '>» tí

X

O

U

C

X tí x

tí x

tí

H tf) o

Xí >

t/) ’x tí _o o

X

o

O

C

c

d d

ts <D

O £3

’s

u

u.

u

u

u

u

c u

£

£

Cí

D

tí

tí

tí

tí

tí

ca

CJ

d

Q

tí

’—1

x>

40

40

40

-O

X

tf)

00

tf)

Q

00

(N

tí

CN

CN

CM

O

O

O

O Ό

O kO

O CO

o θ'

V

V

V

V

V

V

O oo \/

V

T—4 V

CM

V d- d, Xl o o o o o o v v v d d .d e •x ad ca ca ca ca d d ca ca o

d ω

u

X ca d

cn _O ľtí

O o

>

x ca d

xä d

ca 'ca _d i

&

>

MU _, x: O .2 tí ® ~ o M x

H ϋ

x tí •4—» tf) >

tí tí

C >»

H o

X tí

-4—» tf) > tí tí >»

u O M—·	o tí >	o tí >	o tí	'X £	H N	x o	Ή CJ
tí	'tí >	'tí >	> o	=3		u X	u X
ϋ u. Q	o 4^	o 43	73 -2	tí x u	tí 3	u (U -4—·	l_ O
	U	O	2	1>	.2
5		□	oo	Ό	75	ix	ix
1 x m		CS	CO				CN
H	H	H	X		x	X

(N j

H o

x tí ·*->

tf) >

tí tí tí ’x <7 tí h m (D

X d

u» <ZI >

ca d

d ’x <u d

X d

—C/5 >

ca d

d ’x u

tí m

o ’X jd o

d ’X

N >

d d

O <? U H d x d +j M > ca d ΰ d ’X d .5 b ^u X -ca u d u

x o

X 'd d

4-i cn

O d

r-1 CM

H H o o ’X Ό & d >d >o • i-M x d d •x -o ’x o

tí o

’X d

’X • u x

d en x d X tí •ar ‘ci o

CM
H
|	ώ
H	x
o	o
Ό	73
	Μ-»
>d
X	S
d	tí
TJ	73
‘S	’S
o	o
d	o
u	u
x	X
ί-	u
Ο	O
x	t2
3	tí
on	0D
d u	O Ui

tí m

o ’X d

d ’X

N >

d

H >

d .S ^x ca

-ca d

u

X >

O

O Q ε g ..

tí tí tí d s 22 >, o

H >

o >o tf) x

>—H u

>

tí .S t/)

0) x

?

_o ’X

S o

tí o

tí cm m

O	o	r* O	ľtí	ΓΧ
tí	x ca	4^ tí	*-.» tí ϋ	Μ—» tí ϋ
H	H	H	>	>
1	CM 1	co 1	__,	Ο)
d X	tí X	X x	1 >	1 >

V-3 Ventil (krídlový) pre sladinu v T-2 1 316 SS, sedlo Viton

V-4 Ventil (krídlový) pre sladinu v CIP slučke v T-2 1 316 SS, sedlo Viton

ΓΛ •O

ΓΜ

Z

XI o

cd £3 ε

-u x

o cn >

O

Ό

L·,

CL,

Q

CL, (Λ >CJ !/>

cn

CL,

O

É?

cd —

U c

>

O >o

Kl

X x

H *G <υ ε

D 'S u

>N

O

R cn

O

X >

en a

O _O

O a

-2 3 CJ

O g o

3 aj

_o g cj

_O G

o g □

_o 3 aj

JO 3 o

-2 g o

-2 ”3 OJ

O g o

.2 g CJ

-2 g o

je g CJ

73

73

cn

73

CJ 73

73

cn

en

73

73

73

73

73

73

-CJ

Ό

-aj

KCJ

•aj

•aj

'CJ

'CJ

-cj

-CJ

-u

»CJ

>

>

>

'CJ

>

>

>

>

>

>

>

>

>

O

O

O

O

o

o

O

O

O

o

o

o

o

G

G

tí

G

O

G

c

C

G

G

G

G

q

G

-O

-O

-O

G

u

-o

-o

-o

Ό

-O

“O

-O

-O

SO

44

X

Λί

O

• H

x

x

Λ4

Λ4

2ä

CZ)

CZ)

00

czľ

CZ) c/^

CZ?

CZ?

CZ?

CZ?

cz?

00

cz?

CZ?

CZ?

CZ)

CZ)

00

CZ)

CZ)

CZ)

CZ)

CZ)

CZ)

00

CZ)

CZ)

CZ)

NO

no

X

no

<o

<o

Ό

Ό

Ό

Ό

NO

NO

r—1

—-1

f*0

r—<

e-H

r—1

R—1

T—1

r~4

m

ΓΊ

m

m

m

Γ*Ί

m

m

m

m

m

C^i

m

ε t.

ΓΜ ε

ε á

ΓΜ

CM CM

Ai

CZ m

o >>

C

>o	G 73	CQ
G u O	CJ CL	o x
.O N	G ·+-» 73	>. _c
‘G	>	3
ÍX	G	«
G	C	» “H 73
.S	xc	CL
*3	o	G
	.S	+-* 73
*3	o	>
CJ	OJ	OJ
u	u	u
ÍX	CX	CL
z—\	/—s	z—\

7 cZ OQ o C aj —M , 3 t! tí υ

>

O

X ίΟ

N >

>

O

CZ

CQ

N >

a

4—» >

aj

La cZ cq

N >

'a a

+-» czs >

aj

L— a

υ >

O x

ΙΟ

N >

>

O

CZ m

N >

• r··*

CL

CJ £

>

«5 β

CO i

H

N

G « R«4 cl

G >

CJ

O

Ό

O

X

-aj

-G

G

G

OJ >73

-G

CL £* tí

X tí

Ό '3

O aj •

G o

G

CJ >

G

O

Ό

O

X

OJ

ΓΜ i

H o

Ό

O

X ><u cZ ca

O

Ό

O x

-aj ; t* t· o

x

o	O	-G	->·	-G		o	O
x	x	U	>	u	X	X
>CJ	>o	-O	o		_o	>CJ	>CJ
<o 3 •29	<o 3 •29	ε o g	3 S	ε aj ε,	3 -w 3	<° 3 bD	<o 3 bo

ľG	G	CC	G	G
G	G	G	G	G
o	o	CJ	CJ	CJ
>	>	>	>	>
tn	x		oo	a\
>	>	>	>	>

tí tí υ o > >

tí aj aj > > H

CM γμ m

I I > >

>o >o ΐ

G

G ·£

O

G* +-»

7) >

O u

ex

G

G o

g*

-t-» >

O

U.

CX

X •3 'S

O aj

X cZ ca o

xs tí v

O O

3

S s o

a aj a

?

o x

>o <p bO a

4-»

OS >

aj

1-4 a

oL c

CZ oq o T3 3 X ej 3

N > aj

G cj G cj > G G ? o x >CJ <o o 3 a on tí C tí aj aj aj > > >

•t LC, X i i i > > >

c: tí aj aj > >

164

Symboly použité na OBR. 21:

Flexibilný konektor a spojka

Plynový filter

Tlakový regulátor

Čerpadlo

X Ventil x

o >>

<o

(l/6uu) e>|i|SÁ3i oqauaisndzoj eioejiuaouoyi >» c

TJ ro (Λ ra ’c ra ’Ľ

TJ

N

OT ra >O ra

S] r?

H o

Xi

JU

Ί3

H .s *3 ra <u x

o

Ό

-ra c

*5?

o ra >

o

T) ra •S *s ra >N u-,

Ό

N ra

VI ra >o o

V3

C >

-ra

N <U ra

Ό w

>

ra x

V3 >»

X

O x

-<U ra <D

4—» <Z) ra a

N

O ira •

Q

-ra £

ra u

o ra o

ra

-š ro c t>

Έ. aa o r- c <u ε

T3 O

o.

u

X>

O

166

Tabuľka 5.2. Teplotný profil vody vuchovávacej nádobe sladiny (T-l alebo T-2) po 3-dennej ekvilibrácii bez prebublávania oxidom uhličitým, a po 24 h prebublávaní oxidom uhličitým v množstve 0,113 cm³/h.

Teplota (°C)

Miesto merania v cylindrokónickej nádobe Bez prebublávania S prebublávaním

CO₂_CO₂

10 cm pod povrchom kvapaliny a 10 cm od steny nádoby	20,6	0,4
10 cm pod povrchom kvapaliny a v strede nádoby	20,1	0,1
na dne valcovej sekcie a 10 cm od steny nádoby	3,8	3.7
na dne valcovej sekcie a v strede nádoby	3,7	4,1
Okolie pilotného závodu	21,4	19,8

Priemer častíc D_pi, mm

Obr. 5.8. Kumulatívna distribúcia veľkosti častíc kapa-karagénanových gólových perličiek obsahujúcich imobilizované kvasinky (n = 5)

167 'Kapitola 6. Imobilizácia ležiakových kvasiniek v kapa-karagénanovom géle

Vedci študovali rôzne matrice na fyzikálne zachytenie celých buniek, vrátane alginátu vápenatého (Bejar et al., 1992: Curin et al., 1987; Masschelein a Ramos-Jeunehomme, 1985; Nedovic et al.. 1996: Shindo et al., 1994; White a Portno, 1978), agarózv (Hooijmans et al., 1990; Lundberg a Kuchel, 1997), a karagénanových gélov (Norton et al., 1995; Wang et al., 1982). Karagénan je materiál potravinárskej čistoty a je uprednostňovaný na enkapsuláciu buniek pre svoju vynikajúcu mechanickú pevnosť v porovnaní s inými gélmi (Buyíikgungôr, 1992).

V prvej časti tejto kapitoly bola počas troch cyklov opakovanej vsádzkovej fermentáeie monitorovaná kolonizácia kapa-karagénanových gélových perličiek imobilizovanými kvasinkami. Zisťovala sa životnosť imobilizovaných kvasiniek a množstvo kvasiniek uvoľnených do kvapalnej fázy. V priebehu opakovaných vsádzkových fermentácii boli sledované parametre fermentáeie, zahŕňajúce etanol, maltózu, maltotriózu, fruktózu a glukózu, a potom porovnávané s kontrolnou fermentáciou používajúcou iba voľne suspendované kvasinky za rovnakých nutričných podmienok.

Doteraz existuje málo publikovaných informácií týkajúcich sa fyzikálnych účinkov na kvasinky po dlhodobej imobilizácii (Virkajärvi a Kronlof, 1998) a trvalom vystavení vonkajšiemu stresu a fermentačným produktom. Druhá časť tejto kapitoly skúma životnosť, distribúciu populácie kvasiniek a fyzický vzhľad kvasiniek imobilizovaných v karagénanových gélových perličkách počas dlhšieho obdobia kontinuálnej fermentáeie v bioreaktore s plynovým výťahom. Počas dlhšieho obdobia bol tiež skúmaný relatívny percentuálny podiel respiračné deficitných kvasiniek v populácii imobilizovaných a voľne suspendovaných kvasiniek v bioreaktore.

Karagénan je tvorený opakujúcimi sa 3-6-anhydrogalaktózovými jednotkami a rôzne druhy karagénanov sa líšia počtom a polohou sulfátových esterových skupín na opakujúcich sa galaktózových jednotkách. Schematické znázornenie mechanizmu gélovatenia karagénanu je uvedené na obr. 22. Ak je karagénan v stave sólu, majú jeho polysacharidové reťazce konfiguráciu náhodnej skrutkovice. Keď sa vytvorí dosť skrutkovíc. aby poskytli priečne väzby

Verzia sekcie 6.0 bola publikovaná (Pilkington et al.. 1999).

168 pre kontinuálnu sieť, dôjde ku gélovateniu. S tým, ako vzniká viac skrutkovíc alebo ako skrutkovice tvoria agregáty, stáva sa gél pevnejším a tuhším (Rees, 1972).

Tri obvyklé typy karagénanu sú lambda, iota a kapa. Ako je uvedené na obr. 6.2, líšia sa obsahom sulfátových esterov a množstvo sulfátových esterov ovplyvňuje rozpustnosť polysacharidového reťazca. Lambda-karagénan je vysoko sulfátovaný a nemá schopnosť tvoriť gél (Marrs, 1998). Iota-karagénan tvorí v prítomnosti vápenatých iónov vysoko elastický, slabý gél a nevykazuje významnú syneréziu. Synerézia vzniká, ak je tendencia gélu ďalej tvoriť skrutkovice alebo agregáty taká silná, že sa sieť zráža a spôsobuje “potenie” kvapaliny (Rees, 1972). Kapa-karagénan je mierne sulfátovaný, a tak tvorí v prítomnosti draslíkových iónov silnejší a tuhší gél a podlieha určitej synerézii. Zvýšená pevnosť gélu, poskytovaná kapakaragénanom, ho robí žiaducim na imobilizáciu celých kvasiniek.

Obr. 6.2. Chemické štruktúry lambda-, iota- a kapa-karagénanu.

Významnou charakteristikou karagénanu sú jeho reverzibilné termogelačné vlastnosti. Pri chladení roztoku karagénanu vzrastá viskozita a dochádza ku gélovateniu. Pri zahrievaní roztoku viskozita klesá a karagénan sa vracia späť do stavu sólu. Kontrolou zloženia gélujúceho katiónového roztoku je možné meniť teplotu, pri ktorej sa karagénan transformuje zo sólu na gél. Gelačná teplota kapa-karagénanu vzrastá so vzrastajúcou koncentráciou chloridu draselného v roztoku. Tento jav bol použitý pri vyvíjam postupu imobilizácie buniek, pretože je možné zamedziť vážnemu kolísaniu teploty (Neufeld et al., 1996). Gelačná teplota karagénanu môže byť kontrolovaná tak, aby bola dosť vysoká na to, aby bol za podmienok fermentácie gélom, ale pritom dosť nízka, aby mohli byť kvasinky miešané s karagénanom v jeho stave sólu bez nepriaznivých účinkov na životnosť pred gélovatením perličiek.

Avšak existuje rada faktorov, ktoré ukazujú na potrebu ďalšieho štúdia účinkov imobilizácie v gélových matriciach na metabolizmus a fyziológiu kvasiniek. Imobilizované kvasinky nie sú vystavené rovnakému mikroprostrediu ako voľné kvasinky v kvapalnej fáze, pretože tu sú ďalšie bariéry z gélovej matrice a ďalšie zachytené kvasinky, ktoré musia byť

169 prekonané, než môže byť substrát dopravený k ich povrchu (obr. 23). Vykonávali sa početné štúdie prenosu hmoty v gélových matriciach (Estapé et al., 1992; Hannoun a Stephanopoulos, 1986; Korgel et al., 1992; Kurosawa et al., 1989; Merchant et al., 1987; Oyaas et al., 1995; Venäncio a Tiexiera, 1997) na dosiahnutie lepšieho pochopenia potenciálnych negatívnych účinkov, ktoré môže mať obmedzenie živín pre imobilizované bunky, na priebeh fermentácie. Účinné difuzivity malých molekúl v karagénanovom géle sú porovnateľné s difuzivitami rovnakých molekúl v samotnej vode, a gél umožňuje molekulárnu difúziu malých molekúl, ako je glukóza a etanol. Avšak pri typickej fermentácii s imobilizovanými kvasinkami sú živiny rýchlo dopravované k perličkám s imobilizovanými kvasinkami okrem molekulárnej difúzie hlavne konvekčným transportom (Hannoun a Stephanopoulos, 1986). Len čo živiny vstúpia do perličiek, je transport relatívne pomalý, pretože dominuje molekulárna difúzia. To znamená, že kvasinky na periférii gélových perličiek môžu mať určitú nutričnú výhodu oproti kvasinkám v strede perličiek.

Je nutné brať do úvahy tiež vek imobilizovaných kvasiniek. Zachytené kvasinky starnú, ako kontinuálna fermentácia prebieha počas mesiacov, a fermentujú pri definovanej sade podmienok pseudo-ustáleného stavu. Avšak počas vsádzkovej fermentácie sú kvasinky vystavené prostrediu, ktoré sa mení s časom, a kvasinky, než sú zlikvidované, sa používajú iba v obmedzenom počet fermentácii. Je preto potrebný ďalší výskum na štúdium dlhodobých účinkov kontinuálnej fermentácie na životnosť kvasiniek vo vzťahu k výkonu fermentácie.

V časti A tejto kapitoly bola skúmaná kinetika kolonizácie kapa-karagénanových gélových perličiek kvasinkami počas troch cyklov opakovanej vsádzkovej fermentácie. Sledovala sa životnosť a koncentrácia imobilizovaných a voľne suspendovaných kvasiniek, spolu s etanolom, stupňami Plato a koncentráciou cukru.

V časti B boli skúmané účinky času fermentácie na polohu a distribúciu kvasiniek v gélovej perličke a na morfológiu kvasiniek. Použila sa elektrónová mikroskopia (SEM) na skúmanie kapa-karagénanom imobilizovaných kvasiniek v rôznych oblastiach gélovej perličky v štyroch rôznych časoch: 1) bezprostredne po vytvorení perličky; 2) po dvoch dňoch vsádzkovej fermentácie; 3) po dvoch mesiacoch kontinuálnej fermentácie v pilotnom bioreaktore s plynovým výťahom; 4) po šiestich mesiacoch kontinuálnej fermentácie v pilotnom bioreaktore s plynovým výťahom. Merala sa tiež životnosť a koncentrácie kvasiniek, ako imobilizovaných, tak v kvapalnej fáze. Skúmal sa tiež relatívny percentuálny podiel respiračné deficitných kvasiniek (imobilizovaných a voľných v kvapalnej fáze) po piatich

170 mesiacoch kontinuálnej fermentácie v bioreaktore s plynovým výťahom a bol porovnaný s percentuálnymi podielmi, zisťovanými pri tradičnej vsádzkovej fermentácii piva. V celej štúdii bol používaný produkčný kmeň ležiakových kvasiniek.

6.1. Experimentálny postup

Produkcia kapa-karagénanových gélových perličiek: kapa-karagénanový gél X-0909 bol láskavým darom od Copenhagen Pectin A/S. Kapa-karagénanové gélové perličky, obsahujúce zachytené ležiakové kvasinky, boli vyrábané procesom s použitím statického miešadla s počiatočným množstvom kvasiniek 2,6 x 10⁷ buniek/ml gélu (patentová prihláška 2133789 (Neufeld et al., 1996) a priemerom perličiek 0,5 až 2,0 mm.

Fermentačné prostredie: Labatt Breweries of Canada dodali pivovarskú sladinu so špecifickou hmotnosťou 17,5 °P, podrobnejšie opísanú v sekcii Materiály a metódy.

Časť A: Kinetika kvasiniek imobilizovaných na kapa-karagénanových gélových perličkách pri opakovaných vsádzkach

Fermentácie boli vykonávané vo 2 1 Erlenmeyerových bankách pri 21°C, s miešaním 150 mim¹. Náplň nosiča bola 40 % (v/v) imobilizovaných perličiek v s kvasinkami a celkový fermentačný objem bol 1 1. Každá fermentácia trvala sedem dní. V Rl boli čerstvé perličky s imobilizovanými kvasinkami naočkované do sladiny a po skončení fermentácie boli tieto perličky oddelené od fermentovanej kvapaliny prechodom cez sterilné nerezové sito (veľkosť ôk 500 μΐη). Perličky potom boli vo rovnakom pomere znovu naočkované do čerstvej sterilnej sladiny na uskutočnenie druhej (R2) a potom tretej (R3) vsádzkovej fermentácie. Odber vzoriek sa uskutočňoval pri každej fermentácii prvé tri dni dvakrát denne a potom štvrtý a piaty deň jeden krát denne. Fermentácie sa vykonávali duplicitne alebo triplicitne. Všetky fermentácie boli vykonávané s kontrolnými fermentáciami s voľne suspendovanými kvasinkami, ktoré sa vykonávali za tých istých podmienok okrem toho, že do fermentácie boli naočkovávané iba voľné kvasinky v množstve 4 g/1. Vzorky boli analyzované na životnosť a koncentráciu imobilizovaných kvasiniek a koncentráciu uhľohydrátov a etanolu v kvapalnej fáze.

Hodnoty výťažku Y_p/S produktu etanolu zo substrátu celkovej skvasiteľnej glukózy boli pre tri imobilizované fermentačné cykly a pre kontrolu s voľnými kvasinkami vypočítané s

171 použitím rovnice 3.20. Pre všetky fermentácie bol výťažok počítaný od začiatku fermentácie do času, keď bola dokončená spotreba maltózy.

Produktivita etanolu V_etanoi· t.j. množstvo etanolu produkované na celkový pracovný objem bioreaktora na jednotku času fermentácie, bola pre Rl, R2, R3 a kontrolu s voľnými kvasinkami vypočítaná s použitím rovnice 3.25 od začiatku fermentácie do čase, keď bola úplne spotrebovaná maltóza. V prípade výťažku a produktivity etanolu nebol navzájom odlíšený prínos imobilizovaných a voľne suspendovaných kvasiniek.

Lokálna maximálna špecifická rýchlosť rastu p_max a čas zdvojnásobenia kvasiniek boli vy počítané pre spriemerovanú kontrolu s voľnými kvasinkami s použitím 3.3 a 3.4.

Časť B: Životnosť a morfologické charakteristiky imobilizovaných kvasiniek pri predĺženom čase fermentácie

Podmienky vsádzkovej fermentácie: Vsádzkové fermentácie boli vykonávané v 2 1 Erlenmeyerových bankách pri 21°C, s miešaním 150 min'¹. Náplň nosiča bola 40 % (v/v) s celkovým objemom fermentácie 1 1.

Podmienky' kontinuálnej fermentácie: Na kontinuálne fermentácie boli použité bioreaktorv s plynovým výťahom a sacou rúrkou pilotného meradla. Všetky získané údaje pochádzali z bioreaktora s pracovným objemom 8 1, okrem snímok z elektrónového skenovacieho mikroskopu po 2 mesiacoch, ktoré boli získané z 50 1 bioreaktora s použitím rovnakého fermentačného prostredia a metódy imobilizácie. Perličky s imobilizovanými kvasinkami v množstve 40 % (v/v) boli v bioreaktoroch fluidizované pomocou zmesi vzduchu a oxidu uhličitého. Bioreaktory pracovali za rôznych podmienok s teplotou fermentácie udržiavanou na 12. 17 a 22 °C a časom zdržania udržiavaným medzi 0,9 a 1,8 dny. Počas šesťmesačného experimentu dosiahol bioreaktor s plynovým výťahom maximálnu koncentráciu etanolu 73 kg/nť s priemernou koncentráciou 58 kg/m³.

Mikrobiologické analýzy: Z kvapalnej fázy bioreaktora s plynovým výťahom boli odoberané aspoň raz týždenne vzorky na testovanie na nečistoty, zahŕňajúce divoké kvasinky, neležiakové kvasinky a aeróbne a anaeróbne baktérie kaziace pivo. Po piatich mesiacoch boli kvasinky v kvapalnej fáze duplicitne testované na mutáciu respiračného deficitu.

172

Skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM): Kapa-karagénanové gélové perličky (priemer 1,0 až 1,5 mm), obsahujúce imobilizované ležiakové kvasinky, boli pre SEM analýzu odoberané v štyroch rôznych časových bodoch: 1) po vytvorení perličiek s imobilizovanými kvasinkami a pred ich inokuláciou do fermentačného média; 2) po 2 dňoch vsádzkovej fermentácie; 3) po 2 mesiacoch kontinuálnej fermentácie v pilotnom bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou; 4) po 6 mesiacoch kontinuálnej fermentácie v pilotnom bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou. Metodika použitá pre SEM a súvisiacu prípravu vzoriek je opísaná v sekcii 4.7.

S použitím metód opísaných v sekcii 4.6 bola súčasne so SEM zisťovaná koncentrácia a životnosť kvasiniek (imobilizovaných i voľne suspendovaných).

6.2. Výsledky a diskusia

Časť A: Kinetika kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách v opakovaných vsádzkach

Čas fermentácie sa značne skrátil zakaždým, keď boli imobilizované kvasinky naočkované do čerstvej sladiny, ako je zrejmé z obr. 6.4 (a), (b) a (c), znázorňujúcich maltózu, maltotriózu, glukózu, fruktózu a etanol v závislosti od času fermentácie pre tri cykly fermentácie v opakovaných vsádzkach. Z týchto obrázkov je zrejmé, že čas úplnej spotreby cukrov bola pre Rl 64 h, pre R2 44 h a pre R3 26 h. Pri kontrolnej fermentácií s voľne suspendovanými kvasinkami, ktorá neobsahovala imobilizované kvasinky, znázornenej na obr. 6.5, trvalo 82 h, než došlo k úplnej spotrebe cukrov. Z grafu na obr. 6.4 je tiež zrejmé, že konečná koncentrácia etanolu bola najvyššia pri tretej z opakovaných vsádzkových fermentácií s imobilizovanými kvasinkami. Pretože kapa-karagénan je hydrogél, je určité množstvo etanolu prenášané v perličkách, keď sa očkujú do čerstvej sladiny. preto bol v čase nula pre R2 a R3 vo fermentačnej kvapaline prítomný v určitom množstve etanol a počiatočná koncentrácia glukózy, maltózy, maltotriózy a fruktózy bola pri fermentácií s imobilizovanými kvasinkami (obr. 6.4) nižšia v porovnaní s kontrolnou fermentáciou s voľnými kvasinkami, ktorá je znázornená na obr. 6.5. Vypočítali sa výťažky fermentácie tak, aby mohol byť výťažok v gramoch etanolu na gramy spotrebovaných cukrov skúmaný na porovnateľnej báze.

173

Koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy, etanolu (kg/m^J)

-♦-maltóza -O-- glukóza -A-fruktóza -φ- etanol maltotriózŕ

Obr. 6.4. a) Rl, koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy a etanolu v závislosti od času fermentácie pre opakované vsádzkové fermentácie s použitím ležiakových kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách.

174

Koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy,

maltóza -B-glukóza -ir- fruktóza ' -·- etanol i -K- maltolňóza

Obr. 6.4. b) R2, koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy a etanolu v závislosti od času fermentácie pre opakované vsádzkové fermentácie s použitím ležiakových kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách.

175

Koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy, etanolu ((kg/m³)

f H H

Obr. 6.4. c) R3, koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy a etanolu v závislosti od času fermentácie pre opakované vsádzkové fermentácie s použitím ležiakových kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách.

176

—·— maltóza —D—glukóza —*— fruktóza —*— maltotrióza -♦—etanol

Obr. 6.5. Koncentrácia maltózy, maltotriózy, glukózy, fruktózy a etanolu v závislosti od času fermentácie pre kontrolné fermentácie s voľne suspendovanými ležiakovými kvasinkami (bez imobilizovaných kvasiniek).

Obrázky 6.6 (a) a (b) porovnávajú koncentráciu maltózy, resp. etanolu v závislosti od času fermentácie pre Rl, R2 a R3. Počas opakovanej R1 bola maltóza kvasinkami spotrebovaná takmer bezprostredne po naočkovaní do čerstvej sladiny. Koncentrácie etanolu dosahovali v opakovanej Rl skôr svoje maximá a tiež dosahovali vyššie koncentrácie než prvé dve vsádzkové fermentácie. Ako je vidieť z obr. 6.6 (b), počiatočné oneskorenie produkcie etanolu v Rl sa drasticky znížilo, keď boli tieto imobilizované kvasinky znovu naočkované do R2, a ďalej sa znížilo po naočkovaní do R3.

177

ΐ H

Čas fermentácie (h)

Obr. 6.6. a) Koncentrácia maltózy v závislosti od času fermentácie pre opakované vsádzkové fermentácie Rl, R2 a R3 s použitím ležiakových kvasiniek imobilizovaných v kapakaragénanových gélových perličkách.

178

Obr. 6.6. b) Koncentrácia etanolu v závislosti od času fermentácie pre opakované vsádzkové fermentácie Rl, R2 a R3 s použitím Iežiakových kvasiniek imobilizovaných v kapakaragénanových gélových perličkách..

Obr. 6.7 (a) ukazuje koncentráciu imobilizovaných kvasiniek na celkový objem bioreaktora v závislosti od času fermentácie pre Rl, R2 a R3. Voľné kvasinky, uvoľnené z imobilizačnej matrice do kvapalnej fázy pri týchto fermentáciách, v závislosti od času sú znázornené na obr. 6.7 (b). Na obr. 6.7 (c) je pre tieto tri vsádzky znázornené celkové množstvo imobilizovaných a voľných kvasiniek na celkový objem reaktora. Obr. 6.7 (a) ukazuje, že koncentrácia imobilizovaných kvasiniek v kapa-karagénanovom géle po ich počiatočnom naočkovaní do sladiny v Rl stále rástla. Keď boli kvasinky potom naočkované do čerstvej sladiny na opakovanie v R2, objavoval sa v gélových perličkách stále rast. Keď boli enkapsulované kvasinky naočkované do čerstvej sladiny po tretí krát, rýchlosť zvyšovania koncentrácie imobilizovaných kvasiniek sa spomalila.. Koncentračný profil voľných kvasiniek,

179 uvoľnených z kapa-karagénanovej gélovej matrice do kvapalnej fázy, imobilizovaných kvasiniek a celkových kvasiniek pri fermentácii pre Rl je znázornený na obr. 6.8.

Čas fermentácie (h)

Obr. 6.7. a) Priemerná koncentrácia imobilizovaných ležiakových kvasiniek na celkový objem bioreaktora v závislosti od času fermentácie pre fermentácie Rl, R2 a R3. Úsečky chýb predstavujú dolné a horné medze experimentálnych údajov (n = 2).

180

Obr. 6.7. b) Koncentrácia ležiakových kvasiniek, uvoľnených do kvapalnej fázy, na celkový objem bioreaktora v závislosti od času fermentácie pre fermentácie Rl, R2 a R3. Úsečky chýb predstavujú dolné a horné medze experimentálnych údajov (n = 2).

181

Koncentrácia kvasiniek imobilizovaných a v kvapalnej fáze na celkový objem bioreaktora (kvasinky/ml)

Obr. 6.7. c) Celková koncentrácia ležiakových kvasiniek (imobilizovaných i v kvapalnej fáze) na celkový objem bioreaktora v závislosti od času fermentácie pre fermentácie Rl, R2 a R3. Úsečky chýb predstavujú dolné a horné medze experimentálnych údajov (n = 2).

182

-kvas. v kvap. fáze - imobil. kvasinky -celk. kone kvas

Obr. 6.8. Profil koncentrácie imobilizovaných kvasiniek, kvasiniek v kvapalnej fáze a celkovej koncentrácie kvasiniek (imobilizovaných i v kvapalnej fáze) v závislosti od času fermentácie pre prvú z troch opakovaných fermentácii Rl s použitím ležiakových kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách.

V Rl koncentrácia kvasiniek imobilizovaných v kapa-karagénanových gélových perličkách stúpala rýchlosťou podobnou ako pri kontrolnej fermentácii, ktorá obsahovala iba kvasinky v kvapalnej fáze. To bolo potvrdené porovnaním krivky priemerného rastu kontrolnej fermentácie s voľnými bunkami na obr. 6.9 s podobnou rastovou krivkou kvasiniek imobilizovaných v karagénane v Rl na obr. 6.10. Počas Rl neboli gélové perličky ešte plne kolonizované a zdá sa, že gélová matrica nemala inhibičný efekt na rast kvasiniek v perličkách. Pri R2 sa zdalo, že matrica obmedzuje rast kvasiniek v gélovej perličke, na čo poukazuje nižší vzrast počtu kvasiniek počas tohto fermentačného cyklu. To môže byť spôsobené povahou gélu alebo nahromadením kvasiniek v perličkách alebo nedostatkom dodávky živín pre kvasinky.

183

Obr. 6.9. Priemerná koncentrácia voľne suspendovaných ležiakových kvasiniek pri kontrolnej fermentácii (n = 3) na celkový objem bioreaktora v závislosti od času fermentácie. Počas týchto fermentácií neboli prítomné žiadne imobilizované kvasinky.

184

Obr. 6.10. Koncentrácia imobilizovaných ležiakových kvasiniek na ml gélových perličiek v závislosti od času fermentácie pre fermentácie Rl, R2 a R3. Úsečky chýb predstavujú dolné a horné medze experimentálnych údajov (n = 2).

V tabuľke 6.1 sú zhrnuté výťažky etanolu zo skvasiteľných cukrov substrátu, Yp/s, pre tri vsádzkové fermentácie a kontrolu. V tabuľke 6.2 sú tiež uvedené volumetrické produktivity etanolu v bioreaktore, vypočítané pomocou údajov uvedených v tabuľke 6.1. Výťažky etanolu z cukrov sa v jednotlivých fermentáciách alebo v kontrole vzájomne príliš nelíšili. Všetky výťažky boli nad 90 % teoretického výťažku 0,51, predpokladaného z Guy-Lussacovej rovnice. Ako bolo skôr uvedené, produkcia biomasy a ďalších vedľajších produktov z kvasiniek bráni tomu, aby mohla byť dosiahnutá účinnosť vyššia než 95 % teoretickej (Hardvvick, 1995). Volumetrická produktivita etanolu v bioreaktore sa v troch opakovaných vsádzkových fermentáciách v jednotlivých vsádzkach významne líšila. Produktivita etanolu sa s každým cyklom opakovaejé vsádzkovej fermentácie zvyšovala a v R3 boli imobilizované kvasinky produktívnej šie než v kontrolnej fermentácii. Celkové množstvo etanolu produkované v R2 nebolo významne väčšie než množstvo produkované v Rl, ale čas fermentácie bol menší než polovica v Rl a v kontrolnej fermentácii. Existuje mnoho faktorov, ktoré mohli prispieť k tejto

185 zvýšenej rýchlosti fermentácie imobilizovaných kvasiniek s každým opakovaním vsádzky, ako je adaptácia kvasiniek na podmienky fermentácie a progresívne rastúca koncentrácia kvasiniek. Celkový počet kvasiniek na objem bioreaktora je iba v R3 významne väčší než v kontrole. Na obr. 6.7 (b) znázorňuje graf závislosti koncentrácie voľne suspendovaných kvasiniek (uvoľnených z gélovej matrice) v kvapaline od času fermentácie, že počet kvasiniek uvoľnených z gélových perličiek s každou vsádzkovou generáciou vzrastá. Len čo sa perličky kvasinkami viac zaplnili, zdá sa, že uvoľňovali viac kvasiniek do kvapalnej fázy. Husken et al. (1996) uskutočňovali štúdie, v ktorých skúmali expanziu kolónií bakteriálnych buniek a ich praskanie, resp. uvoľňovanie z kapa-karagénanových gélových plátkov. Vives et al. (1993) uvádzajú, že maximálna koncentrácia kvasiniek, akú dosiahli v kapa-karagénanových gélových perličkách, bola 10⁹ kvasiniek na gram gélu, čo je koncentrácia, ktorá bola dosiahnutá v gélových časticiach pri R2. Podobné maximálne koncentrácie kvasiniek sa vyskytovali počas kontinuálnej fermentácie v časti B. Maximálna náplň gélu kvasinkami v gélovej matrici však závisí od počiatočnej náplne kvasiniek, zloženia gélu a ďalších faktorov.

Tabuľka 6.1. Výťažok Y_ľ/S produktu P, etanolu, zo substrátov glukózy (Glc), fruktózy (Pre), maltózy (Mal) a maltotriózy (DP3) pre Rl, R2, R3 a kontrolnú fermentáciu s voľne suspendovanými kvasinkami.

>o cn

O

C3

S o

CJ

P-

CQ o

5— (X

G

G4

N

Ό •g ca .2 ’3 •g g

o t/n un ’zy un O O* O θ'

tC		o	cn
	un	d
			cs
CZ	cn	O	ej
θ'	tc	rí	—T
x	Mn	Ό	σ'
CZ	<o	OO	x
cn	c^f	ci	cn
cz	Γ'γ	oy	>/n
cn	O<	oc	σΓ
, ,		o	o.
O	oC	ra·	x
fn	Tt	</·)	x
τζ	, |	ra	CS
CS	cn	rn	nŕ
CZ	o	o	<Z
o	o	d	CD
<o	o	o	O
θ'	o	o	θ'
CZ	CZ	o	CZ
θ'	θ'	d	θ'
O	CZ	o	CZ'
θ'	θ'	d	o
o	O	o	o.
Tŕ	τΤ	d	H
x	TT	ca	00

>

_G

O tC

O

D ca

G >o >

£ *G

G g

C ca

O •g »

a o

Q

G

O

G

Ό ca

C

N

C

X

O

Ό

G ca

G •g

S

G

N

G

O .G

G ií

G

O

O

O o

Ό

X

O •G .2 o

CZ)

G >O

O

X)

CZD *

O ‘G +->

G <U ε

u _fu <4-1 >

O x

n χ O G •G G ta G > X p .ε

D- G „ > O

G

U

G

Q ε

u d

o o

c!

ra o

Λ

Ό

C ra >

o

O

£.

6Ď >

(U

O

-t-t ra o

ε c

c3 >

O

O <V

Gε .2 ’5 •G >->

G li >

O x

N

Ό •ra >

o

7) 'S ra c

>

o t-.

O

CU m

Oá ra ž S >

= S o

Ί c

X

G

Ό

O ca

G >

X *

lc

5Ό .ra '5 •ra c

u ε

μ1»

U-

CZ	oo	X	Mn
r-	ao	Tt	o
TJ-	<O	CS	00
θ'	d	X'	o

ε ra

-z c

G >

X — cl rc Cd & Dá j=

O >

ca o

u +-»

G

O ŕn

N •O

G .U II o

•G

N

G

O ’5?

G •G

O

Cl.

•D

G

G

-w >o o

P, >>

>

KCS

X

G x

g x

G

H ε

c ra >

o

N

1S o

ε

187

Ďalší faktor ovplyvňujúci zvýšenú produktivitu bioreaktora, pozorovanú pri každej opakovanej vsádzkovej fermentácii, zahŕňa adaptáciu kvasiniek. Ku koncu prvej fermentácie kvasinky adaptovali svoj metabolický aparát na dané podmienky fermentácie. To môže viesť ku skráteniu lag fázy na začiatku nasledujúcich vsádzkových fermentácii a ku zvýšeniu rýchlosti fermentácie. Počas tejto štúdie boli všetky kontrolné fermentácie vykonávané s čerstvo pripravenými ležiakovými kvasinkami. Bolo by zaujímavé preočkovať voľne suspendované kontrolné kvasinky súbežne s preočkovanými imobilizovanými kvasinkami a ďalej skúmať tento efekt vo vzťahu k efektom koncentrácie kvasiniek.

Obr. 6.11 ukazuje, že životnosť imobilizovaných kvasiniek s použitím metylénovej modrej ako indikátora bola nízka (< 50%), ak boli imobilizované kvasinky naočkované pôvodne do sladiny v R1, ale po 48 h fermentácie bola životnosť imobilizovaných kvasiniek nad 90 %. Kvasinky rýchle kolonizovali perličky a životnosť zostala vysoká i v R3. Avšak pri opakovanej R3 životnosť ku koncu fermentácie mierne stagnovala. Počas všetkých troch opakovaných fermentácii ale mali voľné kvasinky, ktoré boli uvoľnené do kvapalného média, väčšiu životnosť než ich imobilizované náprotivky, [mobilizačná matrica môže teda mať negatívny vplyv na životnosť kvasiniek (limitácia v dôsledku prenosu hmoty a/alebo priestorové obmedzenia), alebo môžu byť životaschopné kvasinky uvolňované z imobilizačnej matrice do kvapaliny prednostne oproti neživotaschopným kvasinkám.

S použitím spriemerovaných údajov z troch oddelených kontrolných fermentácii s voľne suspendovanými kvasinkami obsiahnutých v prílohe l bol vytvorený graf ln (X/X_o) verzus čas fermentácie, ktorý je znázornený na obr. 6.12. Smernica je rovná miestnej maximálnej špecifickej rýchlosti rastu kvasiniek pri 21 °C s miešaním rýchlosťou 150 min'¹ v pivovarskej sladine. Bolo zistené, že miestna maximálna špecifická rýchlosť rastu kvasiniek je 0,096 h'¹ a čas zdvojnásobenia kvasiniek bol 7,22 h. Hodnota p_ma)í zistená v tejto práci bola definovaná ako miestne p_maK, pretože, ako je uvedené v sekcii Teórie, skutočné p_max používané v Monodovej rovnici sa získa, iba ak je S významne väčšie než Monodova konštanta K_s. Sú potrebné ďalšie práce na zistenie Monodovej konštanty K_s limitujúceho substrátu v týchto fermentáciách, aby bolo možné potvrdiť, že vypočítané miestne p_max je skutočné maximum, ako je definované Monodovou rovnicou.

120

188

-*-R1

R2

R3

Q I-----------------------------Ο 20 40 60 80 100

Čas (b)

120

Obr. 6.11. Životnosť imobilizovaných ležiakových kvasiniek (metylénová modrá) v závislosti od času fermentácie pre fermentácie Rl, R2 a R3.

189

Obr. 6.12. Ln (Χ/Χ„) oproti času vsádzkovej fermentácie počas exponenciálnej rastovej fázy spriemerovaných kontrolných vsádzkových fermentácii s voľne suspendovanými kvasinkami, kde X je koncentrácia kvasiniek v čase t a X_o je koncentrácia kvasiniek v čase t = 0 (n = 3).

Časť B: Životnosť a morfologické charakteristiky imobilizovaných kvasiniek pri predĺženom čase fermentácie

Predtým, než boli gélové perličky vystavené fermentačnému médiu a po vytvorení imobilizovaných gélových perličiek procesom s použitím statického miešadla bola koncentrácia kvasiniek 2,6 x 10⁷ kvasiniek/ml gélových perličiek (tabuľka 6.3, kde hodnoty sú priemerom dvoch vzoriek). SEM zobrazenie ukazuje, že kvasinky sú individuálne a rovnomerne rozdelené v celej gélovej perličke (obr. 24).

190

Tabuľka 6.3. Životnosť (metylénová modrá) a koncentrácia voľne suspendovaných a imobilizovaných ležiakových kvasiniek zachytených v kapa-karagénanových gélových perličkách v priebehu času fermentácie.

Čas	Spôsob fermentácie	Voľne suspendované kvasinky v kvapalnej fáze	Imobilizované kvasinky v gélovej fáze
životnosť kone.kvasiniek	životnosť kone. kvasiniek
(%)	(buniek/ml v kvapaline)	(%)	(buniek/ml gélu)
0	-	-	-	-	2,6E+07
2 dni	vsádzková	98	5,5E+07	92	2,35E+08
2 mesiace	kontinuálna	93	2,35E+08	76	8,60E+08
6 mesiacov	kontinuálna	92	2,11E+08	<50*	1,40E+09*

*založené na jedinej vzorke.

Po 2 dňoch fermentácie bola životnosť >90 % a koncentrácia kvasiniek v gelovej perličke vzrástla desaťkrát (tabuľka 6.3). Kvasinky (>90% životaschopnosť) sa tiež začali z gélu uvoľňovať do kvapalnej fermentačnej fázy a dosiahli koncentráciu 10⁷ buniek/ml kvapaliny. Vo vnútri gélových perličiek sa vytvorili malé kolónie kvasiniek s mnohými jazvami po púčikoch na jednotlivých kvasinkách, ako je zrejmé z OBR. 25.

Životnosť imobilizovaných kvasiniek po 2 mesiacoch kontinuálnej fermentácie v bioreaktore s plynovým výťahom klesla (tabuľka 6.3), ale kvasinky voľné v kvapalnej fáze zostali vysoko životaschopné (>90 %), a toto zistenie bolo podporené počas niekoľkých rôznych kontinuálnych fermentácii v pilotných bioreaktoroch s plynovým výťahom. SEM na OBR. 26 ukazuje, že po dvoch mesiacoch sa smerom k obvodu perličky vytvorili veľké kolónie kvasiniek, čo podporuje výsledky iných pracovníkov (Bancel a Hu, 1996; Gôdia et al., 1987; Wada et al., 1979; Wang et al., 1982), V niekoľkých vzorkách bolo pomocou SEM zobrazenia uskutočnené porovnanie morfológie kvasiniek umiestnených pri vonkajšom okraji perličky s kvasinkami nachádzajúcimi sa v prostriedku gelovej perličky. Kvasinky nachádzajúce sa pri obvode boli vajcovité a hladké s mnohými jazvami po púčikoch (obr. 27), čo ukazuje na multiplikáciu kvasiniek (Smart, 1995). Kvasinky, ktoré boli zobrazené v prostriedku perličky (obr. 28), sa zdali zdeformované a vykazovali málo známok tvorby jaziev po púčikoch. Nedostatok jaziev po púčikoch môže byť známkou možného obmedzenia živín, ako je kyslík, v strede perličiek. Povrchová nepravidelnosť pozorovaná na povrchu kvasiniek na obr. 28 môže byť tiež známkou starnutia kvasiniek (Barker a Smart, 1996; Smart, 1999).

191

Životnosť kvasiniek imobilizovaných v karagénanovom géle po 6 mesiacoch kontinuálnej fermentácie v bioreaktore s plynovým výťahom klesal pod 50 % (tabuľka 6.3). Je treba uviesť, že zatiaľ čo po šiestich mesiacoch bola koncentrácia a životnosť imobilizovaných kvasiniek zisťovaná iba pre jeden údaj, údaje po piatich mesiacoch boli podobné; koncentrácia imobilizovaných kvasiniek bola 1.14 x 10⁹ buniek/ml gélu a životnosť <50 %. Zatiaľ čo pri imobilizovaných kvasinkách bol pozorovaný postupný pokles životnosti v čase, životnosť kvasiniek v kvapalnej fáze zostala spoľahlivo vysoká. Okrem toho, aj keď bola životnosť imobilizovaných kvasiniek v perličkách ako celok nízka, bioreaktor produkoval počas týchto šiestich mesiacov kontinuálnej fermentácie plne fermentované pivo. Medzi možné dôvody tohto pozorovania patrí významný prínos vysoko životaschopných voľne suspendovaných kvasiniek k fermentácii. Taktiež existuje potenciálny prínos životaschopných imobilizovaných kvasiniek, umiestnených na periférii gélovej perličky, kde je menej bariér pre prenos hmoty, v porovnaní s kvasinkami nachádzajúcimi sa v prostriedku perličky. Nie je jasné, či majú imobilizované kvasinky schopnosť sa v gélovej matrici premiestňovať alebo či zostávajú stacionárne na mieste, kde boli na začiatku. Koncentrácia 10⁹ buniek/ml gélových perličiek bola maximálna hodnota, dosiahnutá pri týchto perličkách počas šiestich mesiacov kontinuálnej fermentácie.

Na OBR. 29 je pomocou SEM zobrazená celá perlička. Táto perlička má dutý stred a túto štruktúru vykazovala približne polovica všetkých skúmaných perličiek. Dutina môže byť výsledkom degradácie gélovej štruktúry karagénanu a ďalej môže byť podporená preparáciou SEM. Táto dutina nebola pozorovaná pri čerstvo pripravených perličkách. Predchádzajúce práce iných autorov (Bancel et al., 1996) ukázali, že rastúce kvasinky vyvolávajú zoslabovanie gélovej siete. Audet et al. (1988) uvádzajú, že prídavok rohovníkovej živice ku kapakaragénanu modifikoval mechanickú pevnosť gélových perličiek na imobilizáciu baktérií.

Počas celého šesťmesačného experimentu s fermentáciou piva bol bioreaktor s plynovým výťahom testovaný aspoň jeden krát za týždeň na kontamináciu. Nikdy počas experimentu neboli detegované bakteriálne kontaminanty. V posledných dvoch mesiacoch pokusu boli detegované kontaminujúce kvasinky v koncentrácii, ktorá sa pohybovala medzi 1 a 5 cfu/ml. Tieto kvasinky boli schopné rásť na médiu PYN pri 37 °C, ale nerástli aeróbne ani anaeróbne na médiu DUBA (selektívnom pre baktérie), neskvasovali dextríny a nevykazovali rast na médiu C11SO4 (selektívnom pre divoké kvasinky).

192

Po piatich mesiacoch bol priemerný percentuálny podiel respiračné deficitných kvasiniek 7 %, čo je vyšší, než sa normálne vyskytuje pri použití tohto kmeňa v priemyselných vsádzkových fermentáciách (priemer 2 %). Ďalší autori publikovali podobné zistenia (Norton a D'Amore. 1995). Respiračné deficitné kvasinky vznikajú mutáciou, ktorá spôsobuje neschopnosť kvasiniek premieňať glukózu na oxid uhličitý a vodu. Tieto kvasinky majú mitochondrie s trvalé zhoršenou aktivitou a obvykle vznikajú v dôsledku mutácie mitochondriálnej DNA (Hardwick, 1995).

Nálezy z preparátov SEM môžu byť mätúce. Na neinvazívne skúmanie kvasiniek sa používajú technológie ako jadrová magnetická rezonancia (NMR) (Femandez, 1996) a konfokálna mikroskopia (Bancel a Hu, 1996). Zobrazovacie techniky NMR výskumníkom umožňujú študovať transport, tok a priestorovú distribúciu kvasiniek a biochemikálií v biofilmoch. Výskumníci (Bancel a Hu, 1996) taktiež ukázali, že konfokálnu laserovú skenovaciu mikroskopiu je možné použiť na pozorovanie buniek imobilizovaných v poréznych želatínových mikronosičoch s použitím sériových optických rezov.

Aj keď sa metylénová modrá používa v pivovarníckom priemysle ako štandardný indikátor životnosti kvasiniek, má táto metóda mnoho nevýhod (Mochaba et al.. 1998). Zisťuje, či je populácia kvasiniek životaschopná, na základe schopnosti životaschopných buniek oxidovať toto farbivo na jeho bezfarebnú formu. Neživotaschopné bunky schopnosť oxidovať farbivo nemajú a teda zostávajú modré (O’Connor-Cox et al., 1997). Metódy počítania na platniach a kultivácie na sklíčkach sú založené na schopnosti buniek rásť a produkovať makrokolónie na agarových platniach alebo mikrokolónie v médiu pokrývajúcom mikroskopické sklíčko (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Prebiehajúce práce na skúmaní dlhodobej životaschopnosti kvasiniek v imobilizovaných matriciach vo firme Labatt teraz používajú nielen metylénovú modrú, ale tiež vyššie uvedené metódy, a taktiež vyvíjajú techniku konfokálnej mikroskopie s použitím vitálneho farbenia. Okrem merania životaschopnosti kvasiniek je nutné sa v budúcich prácach zamerať tiež na otázku “vitality” imobilizovaných kvasiniek. Zatiaľ čo životaschopnosť sa používa na opis schopnosti buniek rásť a reprodukovať sa, vitalita meria fermentačný výkon kvasiniek, ich aktivitu alebo schopnosť sa zotaviť zo stresu (Smart et al., 1999).

193

Kapitola 7. Dosahovanie príchute v systéme kontinuálnej fementácie s plynovým výťahom

7.1. Experimentálny postup

Použitie kontinuálnej fermentácie na výrobu piva je veľmi odlišné od iných aplikácií používajúcich imobilizované bunky, pretože výsledný produkt sa nemeria z hľadiska jednej danej zložky, ako je etanol. Namiesto toho ide o rovnováhu viacerých chemických zlúčenín, ktoré musia byť vyvážené, aby poskytli kvalitný konečný produkt. Skúmali sa účinky kyslíka na chuťové metabolity kvasiniek počas kontinuálnej primárnej fermentácie a počas sekundárneho vsádzkového zdržania. Účinok času zdržania na chuťové metabolity bol taktiež skúmaný na dvoch úrovniach. Konečne bol ku sladine, privádzanej do kontinuálnej fermentácie, pridaný komerčný enzýmový preparát alfa-acetolaktát dekarboxylázy a bola monitorovaná celková koncentrácia diacetylu v kvapalnej fáze.

7.1.1. Účinok relatívnych množstiev vzduchu vo fluidizačnom plyne bioreaktora na metabolity kvasiniek počas primárnej kontinuálnej fermentácie

Množstvo vzduchu, a teda kyslíka, vo fluidizačnom plyne bioreaktora sa menilo, zatiaľ čo čas zdržania, teplota a všetky ďalšie regulovateľné premenné procesu boli udržiavané konštantné. Celkový objemový prietok plynu bol udržiavaný konštantný na 472 ml/min za normálneho tlaku, teplota bola 15 °C a počas celého pokusu boli používané kapa-karagénanové gélové perličky, obsahujúce imobilizované kvasinky LCC 3021 s počiatočným nákladom kvasiniek 1 x 10⁸ buniek/ml gélu. Počas pokusu boli použité štyri rôzne objemové prietoky vzduchu (tabuľka 7.1) a priemerný čas zdržania v bioreaktore R_t bol 1,18 dňa.

194

Tabuľka 7.1. Objemové prietoky vzduchu dodávaného rozdeľovačom do bioreaktora počas kontinuálnej fermentácie. Celkový objemový prietok dodávaný do reaktora bol 472 ml/min za normálneho tlaku, pričom zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý.

Objemový prietok Percentuálny podiel vzduchu Začiatok Ukončenie Celkový vzduchu vo fluidizačnom plyne čas

(ml/min)	(% v/v)	(dny)	(dny)	(dny)
94	19,9	10	26	17
354	75,0	27	40	14
34	7,2	41	58	18
0	0	59	66	8

Počas experimentu boli opakovane uskutočňované nasledujúce analýzy: voľný amínový dusík (FAN), celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza), etanol, celkový diacetyl, prchavý podiel piva (vybrané estery a alkoholy) a koncentrácia a životnosť kvasiniek v kvapalnej fáze. Bioreaktor bol tiež aspoň jeden krát za týždeň testovaný na kontamináciu.

Koncentrácia rozpusteného kyslíka v kvapalnej fáze v bioreaktore bola meraná, keď bol stav kontinuálnej fermentácie pre každý objemový prietok vzduchu považovaný za pseudoustálený (minimum z troch obratov reaktora).

7.1.2. Vsádzkové zdržanie po fermentácii: Účinky kyslíka na metabolity kvasiniek

Aj keď množstvo kyslíka vo fluidizačnom plyne bioreaktora bolo relatívne nízke (34 ml/min za normálneho tlaku), boli koncentrácie acetaldehydu a celkového diacetylu. zistené počas experimentu uskutočneného v sekcii 7.1.2, pre severoamerický trh ležiakového piva neprijateľne vysoké. Preto bol prijatý nový prístup, keď bola kvapalina odoberaná z kontinuálneho primárneho bioreaktora na zníženie koncentrácie týchto dvoch zlúčenín udržiavaná 48 hodín vo vsádzke pri mierne zvýšenej teplote 21 °C. Výsledky z predchádzajúcej sekcie 7.1.2 tiež naznačili významný vplyv, aký malo množstvo vzduchu vo fluidizačnom plyne na merané chuťové zlúčeniny. Preto bol skúmaný vplyv aeróbnych verzus anaeróbnych podmienok za primárnou fermentáciou, kde dochádzalo k sekundárnemu vsádzkovému zdržaniu, na chuťové metabolity kvasiniek.

195

Kontinuálna primárna fermentácia bola v tomto pokuse uskutočňovaná v 50 1 bioreaktore s plynovým výťahom s použitím vysoko flokulentného variantu kmeňa kvasiniek LCC3021, pretože požiadavky na objem vzorky boli príliš veľké vzhľadom na objem bioreaktora 8 1. Pracovné podmienky boli 1180 ml/min CO2 a 189 ml/min vzduchu za normálneho tlaku vo fluidizačnom plyne, priemerný čas zdržania v bioreaktore R_t 1.0 deň. teplota 15 °C a vysokostupňová pivovarská ležiaková sladina 17,5 °P.

Boli odobrané celkom 4 vzorky (uzatváracie fľaštičky 100 ml), z ktorých dve boli spracovávané za anaeróbnych podmienok a druhé dve boli vystavené aeróbnemu prostrediu.

Anaeróbne spracovanie vzoriek prebiehalo nasledovne: dve 100 ml a šesť 25 ml fľaštičiek sa ošetrilo v autokláve a potom umiestnilo do anaeróbneho boxu (Labmaster 100. mbraun, USA) s argónom ako preplachovacím plynom. 100 ml fľaštičky sa nechali 45 min ekvilibrovať a potom boli uzavreté pomocou hliníkových zátok a Teflon® septa. Na odber vzoriek z bioreaktora bola použitá 50 ml injekčná striekačka vybavená 3” ihlou veľkosti 16, dezinfikovaná 70% (v/v) roztokom etanolu, pričom bolo prepichnuté septum membrány ventilu pre vzorku, a vzorka bola nastreknutá do 100 ml vopred prepláchnutých anaeróbnych fľaštičiek. Fľaštičku bolo nutné pomocou ďalšej sterilnej injekčnej ihly odvzdušniť, aby sa uvoľnil tlak vo fľaštičke počas plnenia. Aeróbne vzorky boli vystavené atmosfére pri odbere z bioreaktora bez použitia injekčnej striekačky a ihly, pričom bol membránový ventil pre vzorku plne otvorený do neuzavretých 100 tni fľaštičiek na vzorky.

Kvapalná vzorka bola ponechaná 2 h v pokoji pri teplote miestnosti, aby sa umožnilo usadenie kvasiniek z roztoku, pričom koncentrácia kvasiniek v kvapaline potom bola približne 10⁶ buniek/ml. Po usadení bola kvapalina z každej 100 ml fľaštičky dekantovaná do troch 25 ml fľaštičiek. Anaeróbne vzorky boli spracovávané v anaeróbnom boxe, aby sa minimalizoval príjem kyslíka, zatiaľ čo aeróbne vzorky boli spracovávané v digestore s laminámym prúdením. Každá zo vzoriek v 100 ml fľaštičkách bola rozdelená do 3 menších 25 ml fľaštičiek, takže analýzy vzoriek mohli byť uskutočňované bez zmeny priebehu fermentácie kvôli odoberaniu vzoriek. Hneď ako boli aeróbne vzorky prenesené do menších fľaštičiek, boli bez uzavretia inkubované pri 21 °C. Anaeróbne vzorky boli prenesené do troch menších fľaštičiek a uzavreté hliníkovou zátkou a Teflon® šeptom. Aby sa zabránilo vytvoreniu pretlaku v dôsledku vývinu oxidu uhličitého vo fľaštičkách a zároveň vystaveniu vzoriek aeróbnej vonkajšej atmosfére, boli šeptá prepichnuté ihlou. Koniec ihly, vystavený vonkajšej atmosfére, bol ponorený do etanolu (menej než 1 cm tlakovej hlavy), aby sa zabránilo spätnému prúdeniu vzduchu do vzorky. Na

196 analýzu boli vzorky odoberané po 2. 24 a 48 hodinách. Odobrala sa tiež vzorka priamo z bioreaktora a okamžite analyzovala, aby sa zistil stav fermentácie v bioreaktore v čase odberu. Vzorky boli analyzované na celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza), etanol, celkový diacetyl a prchavé podiely piva (\ybrané estery a alkoholy).

7.1.3. Vplyv času zdržania kvapaliny na metabolity kvasiniek počas kontinuálnej primárnej fermentácie piva

Na zistenie vplyvu času zdržania kvapaliny na metabolickú aktivitu kvasiniek bol uskutočnený experiment, pri ktorom bola počas kontinuálnej primárnej fermentácie piva s kvasinkami LCC3021 imobilizovanými v kapa-karagénanových gélových perličkách aplikovaná stupňovitá zmena objemového prietoku sladiny. Teplota v bioreaktore bola počas pokusu udržiavaná konštantné na 17 °C. Objemový prietok plynu, dodávaného do bioreaktora, bol taktiež konštantný, 472 ml/min za normálneho tlaku. Plyn tvorila zmes vzduchu (11 ml/min za normálneho tlaku) a oxidu uhličitého (461 ml/min za normálneho tlaku). Počiatočná koncentrácia kvasiniek v kapa-karagénanovom géle bola 2,6 x 10⁷ buniek/ml gélovej perličky a bioreaktor obsahoval 40 % (v/v) perličiek.

Počas pokusu boli opakovane uskutočňované tieto analýzy: uhľohydráty, voľný amínový dusík (FAN). celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza), etanol, celkový diacetyl, prchavý podiel piva (vybrané estery a alkoholy) a koncentrácia a životnosť kvasiniek v kvapalnej fáze. Bioreaktor bol tiež aspoň jeden krát za týždeň testovaný na kontamináciu.

7.1.4. Použitie komerčného preparátu alfa-acetolaktát dekarboxylázy na redukciu celkového diacetylu počas kontinuálnej primárnej fermentácie piva

Vysoké koncentrácie diacetylu považuje väčšina severoamerických pivovarníkov za nežiaduci chuťový defekt piva. Pri doteraz uskutočňovaných kontinuálnych primárnych fermentáciách boli koncentrácie celkového diacetylu stále nad prahovou hladinou pre tradičné vsádzkové fermentácie (70 až 150 pg/l) pri severoamerickom ležiaku. Pri vsádzkovej fermentácii sa diacetyl znižuje v neskorších štádiách fermentácie, keď už nie je prítomný kyslík a neprivádzajú sa ďalšie cukry. V systéme kontinuálnej fermentácie sa do bioreaktora dodáva jednak rozdeľovačom konštantná hladina kyslíka a jednak čerstvá sladina. Preto bola skúmaná

197 nová stratégia obmedzenia koncentrácie diacetylu v kontinuálnom bioreaktore s použitím komerčného enzýmového preparátu.

Pri fermentácii sladiny vzniká diacetyl, ak je alfa-acetolaktát, medziprodukt syntézy valínu, oxidatívne dekarboxylovaný mimo kvasinky. Kvasinka potom reabsorbuje diacetyl a premieňa ho na menej chuťovo aktívny acetoín. Táto oxidatívna dekarboxylácia alťaacetolaktátu na diacetyl je rýchlosť určujúca pri vsádzkových fermentáciách sladiny. Pri kontinuálnej fermentácii opúšťa celkový diacetyl bioreaktor v neprijateľne vysokých koncentráciách (300 až 400 pg/l). Komerčný enzým alfa-acetolaktát dekarboxyláza (ALDC) od NovoNordisk A/S môže prevádzať alfa-acetolaktát priamo na acetoín, a tak zamedziť tvorbe nežiaduceho medziproduktu diacetylu (obr. 7.1) (Jepsen, 1993).

O O CO₂ + [2H] II

O alfa-acetolaktát _D

Obr. 7.1. Pôsobenie alfa-acetolaktát dekarboxylázy (ALDC).

198

Do sladiny v bioreaktore bola pridávaná alfa-acetolaktát dekarboxyláza na zistenie jej čistého účinku na celkovú koncentráciu diacetylu. Skúmali sa aj iné stratégie znižovania diacetylu, vrátane vsádzkového zdržania po fermentácií za tepla počas 48 h a imobilizovaných systémov sekundárnej fermentácie, technológia od Alpha-Laval (Anon, 1997). Obe tieto ďalšie stratégie dosiahli úspech pri znižovaní hladiny diacetylu po fermentácií, ale ani jedna neovplyvnila hladinu diacetylu pri zdroji (t.j. na výstupe z bioreaktora). Použitím ALDC v sladine na znižovanie koncentrácie diacetylu vychádzajúceho z bioreaktora je možné minimalizovať alebo eliminovať časy spracovania po skončení fermentácie.

Aktivita ALDC je optimálna pri pH 6,0 v ležiakovej sladine pri 10 °C. Pri pH 5,0, typickom pre priemyselné sladiny, je aktivita ALDC maximalizovaná pri teplote 35 °C (Anon, 1994). Za typických podmienok kvasenia piva, t.j. nižšej teplote a pH, je aktivita ALDC nižšia než optimálna.

Health Canada novelizovala v r. 1997 kanadské predpisy pre potraviny a liečivá (SOR/97-81) a povolila použitie ALDC v alkoholických nápojoch, čo otvorilo dvere jej použitiu v pivovaroch v Kanade. Bacillus subtilis, nesúci gén pre ALDC (E.C. 4.1.1.5) zBacillus brevis, produkuje enzým ALDC. Pretože ALDC je enzým, produkovaný geneticky upraveným organizmom (GMO). existujú otázky vnímania verejností, ktoré je treba pred použitím tohto enzýmu v potravinárskom produkte zobrať do úvahy.

Na tieto experimenty boli použité ležiakové kvasinky LCC3021. Vysokostupňová ležiaková pivovarská sladina s hodnotou 17,5 °P bola dodaná pivovarom Labatt London. Bol monitorovaný etanol, celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza), celkový diacetyl a koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze. Kvasinky boli imobilizované v kapa-karagénanových gélových perličkách, ako je opísané v kapitole 4. Bioreaktor bol ponechaný bežať tri obraty a potom sa predpokladalo, že dosiahol pseudo-ustálený stav. Ako je uvedené vyššie, metóda pre diacetyl použitá v tejto práci sa označuje ako ,.celkový diacetyl“, pretože meria množstvo diacetylu i jeho prekurzora alfa-acetolaktátu. Zníženie celkového diacetylu, pozorované počas tohto experimentu, teda bolo súčtom účinku enzýmu premieňajúceho alfa-acetolaktát priamo na acetoín a následnej zníženej koncentrácie jeho derivátu diacetylu.

Alfa-acetolaktát dekarboxyláza (ALDC) bola dodaná ako láskavý dar na laboratórne účely od Novo Nordisk A/S, Dánsko, pod značkou Maturex® L. Aktivita enzýmu bola 1500

ADU/g, kde ADU je množstvo enzýmu, ktoré za štandardných podmienok dekarboxyláciou

199 alfa-acetolaktátu produkuje 1 pmol acetoínu za minútu, ako je opísané v metodike Novo Nordisk, Method AF27 (Anon, 1994).

Podmienky kontinuálnej fermentácie: Kontinuálne fermentácie sa uskutočňovali v 8 1 bioreaktore s plynovým výťahom a sacou rúrkou, naočkovanom 40 % (v/v) kapa-karagénanových gélových perličiek, obsahujúcich imobilizované ležiakové kvasinky. Bioreaktor bol prebublávaný zmesou oxidu uhličitého (438 ml/min za normálneho tlaku) a vzduchu (34 ml/min za normálneho tlaku). Teplota fermentácie bola počas pokusov udržiavaná na 15 °C a čas zdržania v bioreaktore R_t bol 1,5 dňa. Celková koncentrácia diacetylu bola monitorovaná za týchto podmienok a dosiahla sa priemerná kontrolná koncentrácia diacetylu v pseudoustálenom stave. Potom sa ku sladine pridala ALDC v koncentrácii 72 pg/l (108 ADU/l) a bola monitorovaná reakcia celkovej koncentrácie diacetylu v bioreaktore.

Experiment 1: Z bioreaktora bola odobraná sladina do 20 1 nádoby z nerezovej ocele a zahrievaná 45 min na 100 °C v autokláve. Pri dodávaní do bioreaktora bola sladina udržiavaná na 2 °C vo vodnom kúpeli s kontrolovanou teplotou. Len čo sa v bioreaktore dosiahla koncentrácia celkového diacetylu v pseudo-ustálenom stave, bolo ku sladine v 20 1 nádobe pridané 72 pg/l (108 ADU/l) 1 ALDC. Počiatočné množstvo biomasy v kapa-karagénanových gélových perličkách bolo 3 x 10⁷ buniek/ml gélu.

Experiment 2; Na minimalizáciu nebezpečnej kontaminácie bol systém tvorený uzavretou slučkou na výstupe a boli uskutočnené aj ďalšie úpravy opísané v kapitole 4. Rovnako ako v experimente 1 bola sladina odoberaná z pivovaru do 20 1 nádoby z nerezovej ocele a autoklávovaná 45 min pri 100 °C. Pri napúšťaní do bioreaktora bola sladina udržiavaná vodným kúpeľom s kontrolovanou teplotou na 2 °C. Počiatočné množstvo biomasy v kapakaragénanových gélových perličkách bolo 3 x 10⁷ buniek/ml gélu. Len čo bola v bioreaktore dosiahnutá celková koncentrácia diacetylu pseudo-ustáleného stavu, bolo v 20 1 nádobe ku sladine pridané 72 pg/l (108 ADU/l) ALDC.

Experiment 3: Neokysličená pivovarská sladina 17,5 °P (14 hl) bola zachytávaná do veľkej uchovávacej nádoby (T-l) v pilotnom zariadení. Potom bola rýchlo pasterizovaná a uchovávaná s prebublávaním oxidom uhličitým, aby bola dodržaná konštantná koncentrácia rozpusteného kyslíka <0.10 mg/1. ako je opísané v kapitole 5. Z tejto nádrže bola sladina privádzaná do bioreaktora. kým sa nedosiahla koncentrácia celkového diacetylu pseudo-ustáleného stavu. Potom bola po zvyšok pokusu ku sladine aseptický pridávaná ALDC (72 pg/l). Pridávanie

200

ALDC sa uskutočňovalo meraním množstva sladiny, zostávajúcej v skladovacej nádobe, a vypočítaním množstva ALDC potrebného na uvedenie koncentrácie enzýmu na cieľovú hodnotu 72 pg/l (108 ADU/1). Príslušné množstvo enzýmu potom bolo rozpustené v 10 1 sterilnej sladiny. Tento roztok bol prenesený do 20 1 tlakovej nádoby z nerezovej ocele, ktorá bola pomocou sterilného potrubia napojená na otvor na vzorku uchovávacej nádoby na sladinu (T-l). Potom bola do uchovávacej nádoby na sladinu tlačená ALDC pomocou tlaku sterilného oxidu uhličitého. Na zaistenie správneho premiešania roztoku ALDC so sladinou bol prietok oxidu uhličitého do tanku na 1 hodinu zvýšený na 4720 ml/min za normálneho tlaku a potom vrátený na normálnu hodnotu. V uchovávacej nádobe potom bolo dosť sladiny s prídavkom ALDC na dokončenie pokusu. Počiatočné množstvo biomasy v kapa-karagénanových gélových perličkách bola 10^x buniek/ml gélu.

7.2. Výsledky a diskusia

7.2.1. Vplyv relatívnych množstiev vzduchu vo fluidizačnom plyne bioreaktora na metabolity kvasiniek počas primárnej kontinuálnej fermentácie

Na obr. 7.2 až 7.11 je vynesená životnosť a koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze, voľný amínový dusík (FAN). celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza), koncentrácia etanolu, celkového diacetylu, acetaldehydu, etylacetátu, 1-propanolu, izobutanolu, izoamylacetátu. izoamylalkoholu, etylhexanoátu a etyloktanoátu proti času kontinuálnej fermentácie. Všetky prevádzkové podmienky bioreaktora boli v priebehu pokusu udržiavané konštantné s výnimkou percentuálneho podielu vzduchu v prebublávacom plyne bioreaktora, ktorý je vyznačený priamo v obrázkoch. V tabuľke 7.2 sú uvedené priemery pre každý analyt v pseudoustálenom stave (po minimálne troch obratoch reaktora).

201

Tabuľka 7.2. Súhrnná tabuľka vplyvu objemového prietoku vzduchu rozdeľovačom do bioreaktora na koncentrácie kvasiniek a kľúčových metabolitov kvasiniek v kvapalnej fáze v bioreaktore pri čase zdržania R_t 1,18 dňa, priemery pri pseudo-ustálenom stave.

Priemerná* koncentrácia analytu Objemový prietok vzduchu (ml/min)

	94	354	34
kone. kvasiniek (buniek/ml)	3,87E+08	2,98E+08	4.73E+08
celková skvasiteľná glukóza (g/100 ml)	1,36	1,25	2,07
FAN (mg/1)	196,9	171,7	162,8
etanol (g/100 ml)	6,14	5,46	5,74
celkový diacetyl (ug/1)	346	1417	389
acetaldehyd (mg/1)	75,62	329,48	28,63
etylacetát (mg/1)	22,38	21,13	18,01
1-propanol (mg/1)	44,74	50,89	53,04
izobutanol (mg/1)	8,73	16,09	8,05
izoamylacetát (mg/1)	0,38	0,21	0,30
izoamylalkohol (mg/1)	58,62	61,64	59,16
etylhexanoát (mg/1)	0,060	0,030	0,053
etvloktanoát (mg/1)	0,031	0,013	0.025

pri každej z prevádzkových podmienok priemer z posledných štyroch dní

Obr. 7.2 a 7.3 ukazujú, že populácia kvasiniek v kvapaline počas tohto experimentu nedosiahla nulu. Chuťové zlúčeniny, ktoré boli v tejto práci študované, boli produkované kombináciou voľných a imobilizovaných kvasiniek a nebol stanovovaný relatívny prínos z jednotlivých zdrojov. V tejto práci bol viac než jeden zdroj voľne suspendovaných kvasiniek: rast biomasy a kvasinky, ktoré boli do kvapalného média uvoľnené z gélových perličiek. Výskum na zložitých modeloch uvoľňovania a rastu kvasiniek ukázal, že ak sú kvasinky uvoľňované z biofilmov, aj keď bioreaktor pracuje pri veľkom zriedení, bude vo výstupnej kvapaline stále určitá populácia kvasiniek (Karamanev, 1991).

202

Koncentrácia kvasiniek v kvap. fáze (buniek/ml)

1.00E+10

1.00E+09

1.00E+08

1.00E+07

1.00E+06

1.00E+05

1.00E+04

100E+03

1.00E+02

1.00E+01

1.00E+00 ♦♦♦♦♦ ♦ ♦** * ♦♦♦ φ**** ♦ ♦♦♦ ♦♦♦* ♦%

M-^l<4 :p^; ib'p -►

354 ml/min 0 ml/min

15 20 25 30 35 40 45 50 55

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

65 70

Obr. 7.2. Koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze proti relatívnemu času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu za normálneho tlaku, dodávaný do bioreaktora rozdeľovačom. Zostávajúcu časť plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas celého pokusu konštantné 472 ml/min za normálneho tlaku.

203

120100-ί k* ♦ ♦ •Λ i ♦♦♦ ♦ ♦ ♦♦♦ ♦♦♦♦♦ * * ♦♦♦ * * ♦ ♦ ♦

Q.

ra >

80354 ml/min c o

> 40 ml/min 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentáeie (dni)

Obr. 7.3. Životnosť kvasiniek v kvapalnej fáze proti relatívnemu času kontinuálnej fermentáeie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu za normálneho tlaku, dodávaný do bioreaktora rozdeľovačom. Zostávajúcu časť plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas celého pokusu konštantné 472 ml/min za normálneho tlaku.

Na obr. 7.4 bola vynesená koncentrácia voľného amínového dusíka (FAN) v kvapalnej fáze. Je zaujímavé, že minimálne koncentrácie FAN boli pri 34 ml/min vzduchu za normálneho tlaku. Toto nekoincidovalo s maximálnou koncentráciou etanolu alebo minimálnou koncentráciou celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza).

Koncentrácia etanolu v kvapalnej fáze bioreaktora klesala, zatiaľ čo celkové skvasiteľné uhľohydráty (ako glukóza) stúpali, keď bol objemový prietok vzduchu v prebublávacom plyne zvýšený z 94 na 354 ml/min, ako je zrejmé z obr. 7.5. To môže naznačovať, že v dôsledku zvýšenej dostupnosti kyslíka dochádza k väčšej respirácii kvasiniek oproti fermentácii. Keď bol objemový prietok opäť znížený z 354 ml/min na 34 ml/min za normálneho tlaku, koncentrácia etanolu opäť stúpla, avšak nedosiahla koncentráciu, ktorá bola pozorovaná pri prietoku 94 ml/min za normálneho tlaku. Je ťažké presne porovnávať koncentráciu etanolu pri 34 ml/min a 94 ml/min za normálneho tlaku, pretože sú prítomné ďalšie faktory ovplyvňujúce systém, ktoré vyplývajú zo starnutia kvasiniek, účinkov trvalého vystavenia relatívne vysokému množstvu kyslíka v čase, keď bol prietok 354 ml/min za normálneho tlaku, a zmien v populácii

204 imobilizovaných kvasiniek. Na obr. 2.4 znázornili White a Portno (1978) zmeny koncentrácií chuťových metabolitov kvasiniek s časom kontinuálnej fermentácie v ich vežovom fermentore.

300

250

200σ>

£ z

<

LL

150

100 354 ml/min ml/min

-44 ml min -► ◄- 3-í mi mm -►

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.4. Koncentrácia voľného amínového dusíka, zostávajúceho v sladine, v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

205

7,00 ε 6.00 ο

•S 5,00 _□

Ο) ’δΓ < 4.00 '55

Π3 >

1Λ

S 3.00 ο

c <ο «-» φ

(0 ο 2.00 •«ο

-^4 mt mm ♦ ♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦ ♦ ♦ ♦

354 ml/min ml/min ♦ Etanol i Ferm. glukóza c

1.00

0,00

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.5. Koncentrácia etanolu a celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

Na obr. 7.6 je zrejmý zvýraznený účinok kyslíka na produkciu celkového diacetylu. Pretože diacetyl sa všeobecne považuje za nežiaducu chuťovú zložku piva, je jedným z hlavných dôvodov optimalizácie množstva kyslíka v bioreaktore kontrola hladiny tejto chuťovej zložky. Po fáze s 354 ml/min vzduchu bol prietok znížený na 34 ml/min za normálneho tlaku a celkový diacetyl poklesol. Počas vsádzkovej fermentácie je známe, že zvýšená hladina kyslíka vedie ku zvýšeniu tvorby alfa-acetolaktátu, prekurzora diacetylu (Kunze, 1996).

Na obr. Ί.Ί vznikol zreteľný vzťah medzi množstvom vzduchu v prebublávacom plyne a acetaldehydu. So vzrastom percentuálneho podielu vzduchu v prebublávacom plyne vzrástlo taktiež množstvo acetaldehydu. Acetaldehyd dodáva pivu charakter zeleného jablka a v komerčných pivách je normálne prítomný v množstvách nižších než 20 mg/1.

206

2000

1800 1600

1400 σι •J4 !V:í TI.n-►

-4 it,··) ->

B ¹²⁰⁰ αι o 1000

354 ml/min ml/min c

φ u

c o

*

800 600 J

400

200

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.6. Koncentrácia celkového diacetylu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

207

400

350 ,-. 300 σι

E.

£ ²⁵⁰ m

g 200 n

ra

150

100 ♦♦♦ ♦♦♦♦

354 ml/min ml/min ♦♦♦♦ ♦♦♦

15 20 25 30 35 40 45

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

55 60 65 70

Obr. 7.7. Koncentrácia acetaldehydu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

V tabuľke 7.2 a na obr. 7.8 až 7.9 sú uvedené koncentrácie v pseudo-ustálenom stave pre etylacetát, izoamylacetát, etylhexanoát a etyloktanoát v závislosti od času kontinuálnej fermentácie. Pre všetky merané estery viedla skoková zmena rýchlosti aerácie z 94 na 354 ml/min za normálneho tlaku k poklesu koncentrácie. Keď bola rýchlosť aerácie znížená z 354 ml/min na 34 ml/min za normálneho tlaku, koncentrácie izoamylacetátu, etylhexanoátu a etyloktanoátu stúpli. Nestúpli však na hodnoty, pozorované pri aeračnej rýchlosti 94 ml/min. Charakter odpovede týchto zlúčenín sa navzájom blízko podobal, s tým, že etylhexanoát a etyloktanoát vykazovali relatívnejšie fluktuácie než izoamylacetát. Koncentrácia etylacetátu ďalej klesla, keď bol objemový prietok vzduchu znížený na 34 ml/min za normálneho tlaku. Pre všetky estery merané v tejto štúdií vykazovali koncentrácie vzrast, keď bol vzduch z

208 fluidizačného plynu celkom odstránený. Koncentrácia každého esteru vzrástla a potom sa ustálila s tým, ako rýchlo klesala koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze reaktora.

3025 ♦♦ ♦*

G)

E 20i ♦♦♦

1510 i

354 ml/min ml/min

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.8. Koncentrácia etylacetátu v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

209

-Izoamylacetát

-Etylhexanoát

-Etyloktanoát

Obr. 7.9. Koncentrácia izoamylacetátu, etylhexanoátu a etyloktanoátu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

Vyššie alkoholy izoamylalkohol, izobutanol a 1-propanol v závislosti od času kontinuálnej fermentácie sú uvedené na obr. 7.10 a 7.11. Pre merané alkoholy sa koncentrácia v dôsledku skokovej zmeny aerácie z 94 na 354 ml/min za normálneho tlaku zvýšila. Izobutanol vykazoval pri zmene rýchlosti aerácie najväčšie fluktuácie. Koncentrácie 1propanolu boli bezpečne pod prahovou hodnotou chuti 600 až 800 mg/1. ale počas celého experimentu kontinuálnej fermentácie boli vysoko nad hodnotou typickou pre komerčné vsádzkovo vyrábané pivá, kde je táto koncentrácia obvykle pod 16 mg/1. To nebol prípad izoamylalkoholu alebo izobutanolu, ktoré boli v normálnych medziach. Má sa za to, že zlúčenina 1-propanol vzniká redukciou kyslého propionátu (Gee a Ramirez, 1994). Iní (Hough et al., 1982; Yamauchi et al., 1995) spájajú tvorbu 1-propanolu tiež s metabolizmom

210 aminokyselín o'.-aminomaslovej a treonínu, pričom zodpovedajúcou oxo-kyselinou, resp. aldehydom je α-oxomaslová kyselina, resp. propiónaldehyd.

Koncentrácia izoamylalkoholu (mg/1)

O £

o c

O

O ‘2 w

C

Φ

Q

C

O *

-Izoamylalkohol 'Izobutanol

Obr. 7.10. Koncentrácia izoamylalkoholu a izobutanolu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

211 ί

♦♦♦ ♦ σι

Ε 40 ♦♦

10♦-44 ml míli-► ml nim

354 ml/min ml/min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.11. Koncentrácia 1-propanolu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie. V grafe je uvedený objemový prietok vzduchu dodávaného do bioreaktora rozdeľovačom za normálneho tlaku. Zvyšok plynu tvoril oxid uhličitý a celkový objemový prietok plynu bol počas experimentu udržiavaný konštantné na 472 ml/min za normálneho tlaku.

Pretože nadbytočné množstvo diacetylu, acetaldehydu a pribudlinových alkoholov je v pive nežiaduce, je regulácia kyslíka významná na obmedzenia ich produkcie. Ako je diskutované v prehľade literatúry, ak sa zvýši dodávka kyslíka pre kvasinky, dôjde ku zvýšenej anabolickej tvorbe prekurzorov aminokyselín, a teda nadbytku vyšších alkoholov, oxo-kyselín a diacetylu. Je známe, že koncentrácia esterov sa s dostupnosťou kyslíka znižuje, pretože tvorba esterov je katalyzovaná acetyltransferázou. Acetyltransferáza je inhibovaná nenasýtenými mastnými kyselinami a ergosterolom, ktoré zase stúpajú v prítomnosti kyslíka (Norton a D'Amore. 1994).

Pre podmienky bioreaktora, použité v tomto experimente, boli koncentrácie rozpusteného kyslíka v pseudo-ustálenom stave (minimálne po troch obratoch reaktora) namerané v kvapalnej fáze bioreaktora blízke nule (menej než 0,03 mg/1).

212

Tento experiment neumožňoval priame porovnanie údajov pre fluidizačný plyn pre prietoky 94 ml/min a 34 ml/min vzduchu za normálneho tlaku, pretože boli oddelené vyšším prietokom vzduchu (354 ml/min). Je to tak preto, že fyziologický stav kvasiniek, vyplývajúci z vystavenia predchádzajúcim podmienkam bioreaktora, imobilizačná matrica a čas kontinuálnej fermentácie mohli spôsobiť ďalšie zmeny konečnej chuti.

V žiadnom okamžiku počas toho experimentu nebola v bioreaktore detegovaná kontaminácia.

Na vyváženie potreby kvasiniek mať k dispozícii určité množstvo kyslíka na uchovanie svojej životnosti a nutnosti kyslík minimalizovať na získanie piva so žiaducim chuťovým profilom je možné skúmať ďalšie stratégie, ako prídavok živín, napríklad zinku, horčíka, alebo dodávanie ďalších exogénnych zlúčenín potrebných na udržanie životnosti kvasiniek. Takéto prídavky umožnia ďalšie zníženie potreby kyslíka pre kvasinky. Ďalšou možnosťou je pracovať väčšinu času s veľmi nízkou koncentráciou kyslíka a s pravidelnými periodickými pulzmi dodávky kyslíka kvasinkám na uchovanie ich životnosti.

7.2.2. Vsádzkový čas zdržania po fermentácii: Účinok vystavenia metabolitov kvasiniek pôsobeniu kyslíka

Pretože po skončení primárnej fermentácie nebol celkový diacetyl v normálnom rozmedzí pre komerčné pivo, prijalo sa niekoľko prístupov na zníženie koncentrácie tejto zlúčeniny na prijateľnú úroveň. Jeden takýto prístup spočíva v aplikácii času zdržania za tepla bezprostredne po kontinuálnej primárnej fermentácii.

Na obr. 7.12 až 7.21 sú vynesené koncentrácie celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza), etanolu, celkového diacetylu, acetaldehydu, etylacetátu, 1-propanolu, izobutanolu, izoamylacetátu, izoamylalkoholu a etylhexanoátu v kvapalnej fáze proti času zdržania po fermentácii. Vzorky, odobraté z primárneho kontinuálneho fermentora v pseudoustálenom stave, boli udržiavané za aeróbnych alebo anaeróbnych podmienok, ako je uvedené v legende ku každému obrázku.

Na obr. 7.12 koncentrácia celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) ako u aeróbnej, tak anaeróbnej vzorky počas prvých dvoch hodín klesala rýchlo a potom po zvyšok času zdržania klesala pomalšie. Možným dôvodom tohto pozorovania je, že počas prvých

213 dvoch hodín bolo prítomných viac kvasiniek pred dekantáciou a koncentrácia cukrov bola na začiatku času zdržania vyššia. Nebol významný rozdiel v príjme skvasiteľnej glukózy medzi aeróbnou a anaeróbnou vzorkou, aj keď spočiatku boli určité rozdiely pozorované.

Koncentrácia etanolu na obr. 7.13 stúpla na začiatku času zdržania rýchlo a potom pri anaeróbnej i aeróbnej vzorke stúpala v čase takmer paralelne. Počiatočný vzrast etanolu pre anaeróbnu vzorku súhlasil s časom, keď dochádzalo k najväčšej konzumácii cukru. Na konci času zdržania bola koncentrácia etanolu vyššia u anaeróbne ošetrených vzoriek.

3,0

Čas zdržania po fermentácii (h)

-♦-Aeróbne -* Anaeróbne

Obr. 7.12. Stredná koncentrácia skvasiteľnej glukózy v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n - 2).

214

8,0

c αι o 2,0o * ¹’°1

0,0-t-·----·-.-10 20 30 40 50 60

Čas zdržania po fermentácií (h)

Obr. 7.13. Stredná koncentrácia etanolu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

Na obr. 7.14 vykázali aeróbne vzorky skorý vzostup acetaldehydu po vystavení aeróbnym podmienkam mimo bioreaktora. Na tomto výsledku sa môže podieľať kombinácia aeróbnych podmienok so spotrebou cukru a produkciou etanolu. Ku koncu 48-hodinové času zdržania klesla koncentrácia acetaldehydu v anaeróbnej vzorke zo 17 mg/1 na 9 mg/1, takže potom zodpovedala špecifikáciám pre kvalitný severoamerický ležiak (menej než 10 mg/1).

Koncentrácia celkového diacetylu v závislosti od času zdržania je uvedená na obr. 7.15. Výsledky ukazujú, že eliminácia kyslíka zo systému počas tohto času zdržania poskytuje priaznivejšie podmienky na redukciu diacetylu. Tvar krivky celkového diacetylu môže súvisieť s úbytkom voľného amínového dusíka a následnou intracelulárnou produkciou valínu, kde je diacetyl vedľajším produktom (Nakatani et al., 1984a; Nakatani et al., 1984b). Koncentrácia celkového diacetylu na konci primárnej kontinuálnej fermentácie bola 326 pg/l a na konci anaeróbneho času zdržania 33 pg/l, čo je bezpečne pod chuťovým prahom pre komerčné pivá.

215

Čas zdržania po fermentácii (h)

Obr. 7.14. Stredná koncentrácia acetaldehydu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

216

Čas zdržania po fermentácii (h)

Obr. 7.15. Stredná koncentrácia celkového diacetylu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

Na obr. 7.16 až 7.18 sú vynesené koncentrácie esterov etylacetátu, izoamylacetátu a etylhexanoátu proti času zdržania po fermentácii. Pri všetkých esteroch bola pozorovaná rovnaká schéma pre aeróbne aj anaeróbne vzorky. Koncentrácia esterov sa medzi anaeróbnymi a aeróbnymi vzorkami nelíšila až do neskoršej fázy času zdržania, keď koncentrácia esterov v aeróbnych vzorkách poklesla a v anaeróbnych sa zvýšila. Pretože koncentrácia esterov v kontinuálnych fermentáciách je trochu nízka v porovnaní s koncentráciou vyskytujúcou sa v komerčnom pive, je žiaduce voliť také podmienky, ktoré favorizujú produkciu esterov.

217 σ>

E, ‘(U +-»

Φ

O

J2 >

φ .2 ô

c φ

o c

o

-•-Aeróbne h Anaeróbne

30 40

60

Čas zdržania po fermentácií (h)

Obr. 7.16. Stredná koncentrácia etylacetátu v závislosti od času zdržania po fermentácií pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácií v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

Obr. 7.17. Stredná koncentrácia izoamylacetátu v závislosti od času zdržania po fermentácií pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácií v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

218

Obr. 7.18. Stredná koncentrácia etylhexanoátu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

Obr. 7.19 až 7.21 ukazujú koncentráciu izoamylalkoholu, 1-propanolu a izobutanolu proti času zdržania po fermentácii. Na konci 48-hodinového času zdržania neboli pri týchto alkoholoch pozorované významné rozdiely medzi aeróbnym a anaeróbnym spracovaním. Vzorky po 24 h však vykázali vo všetkých prípadoch vyššiu koncentrácii pri aeróbnom spracovaní.

219

rc 'Š 30 •rc c

3)

S 20 c

o s:

j-,-,-_----10 20 30 40 50 60

Čas zdržania po fermentácii (h)

Obr. 7.19. Stredná koncentrácia izoamylalkoholu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

o u

c o

Ír 10

-4- Aeróbne Anaeróbne

OJ---.-,-,-,10 20 30 40 50 60

Čas zdržania po fermentácii (h)

Obr. 7.20. Stredná koncentrácia 1-propanolu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Chybové úsečky predstavujú hornú a dolnú hranicu experimentálnych údajov (n = 2).

220

TO

E, z

o c

ra

M

O

N ro '5 >ra c

ω u

c o

s;

-•-Aeróbne|

-i -Anaeróbne]

20 30 40 50

Čas zdržania po fermentácii (h)

Obr. 7.21. Stredná koncentrácia izobutanolu v závislosti od času zdržania po fermentácii pre aeróbne a anaeróbne ošetrené vzorky po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom, (n = 2).

Radarový graf na obr. 7.22 umožňuje porovnanie počtu chuťových zlúčenín po 48 h času zdržania za aeróbnych a anaeróbnych podmienok s profilom komerčného piva. Radarové grafy sa v pivovarníckom priemysle používajú obvykle na uľahčenie skúmania a porovnávania rôznych charakteristík piva dohromady v jednom grafe (Sharpe, 1988). Z tohto obrázku je zrejmé, že kontinuálne fermentované pivo, udržiavané za anaeróbnych podmienok, sa najviac blíži typickému tržnému pivu. Z prílohy 6 je zrejmé, že anaeróbna kvapalina bola v normálnych rozmedziach pre tržné pivo, okrem 1-propanolu, ktorý bol významne vyšší než pri vsádzkovo fermentovaných pivách. Táto vyššia hodnota pri 1-propanole bola pozorovaná pri všetkých kontinuálne fermentovaných pivách v tejto práci.

Tvorba 1-propanolu prebiehala v štádiu primárnej kontinuálnej fermentácie a počas času zdržania sa významne neznížila, či boli podmienky aeróbne alebo anaeróbne. Kunze (1996) uvádza, že na zvýšenie vyšších alkoholov, ako je 1-propanol, počas vsádzkovej fermentácie prispievajú tieto faktory: miešanie, intenzívne prevzdušňovanie sladiny a opakované pridávanie čerstvej sladiny k existujúcim kvasinkám.

221

Optimálne sa teda zdá celkom eliminovať sekundárny čas zdržania optimalizáciou podmienok v bioreaktore na primárnu kontinuálnu fermentáciu. Ďalšie výhody však je možné získať použitím času zdržania, optimalizáciou teploty zdržania (odstraňovanie diacetylu kvasinkami je silne závislé od teploty), množstvom skvasiteľných cukrov zostávajúcich v kvapaline na začiatku času zdržania, optimalizáciou koncentrácie prítomných kvasiniek, hydrodynamickými charakteristikami nádoby (odstránenie diacetylu môže byť vylepšené zlepšením kontaktu medzi kvasinkami a pivom) a ďalšími opatreniami na elimináciu kyslíka v tomto štádiu.

Výpočty objemovej produktivity piva sú uvedené v prílohe 3. Postup, opisovaný v tejto sekcii, s kontinuálnym bioreaktorom pracujúcim s časom zdržania 24 h a s následným vsádzkovým zdržaním 48 h, je 1,8-krát produktívnejší než súčasný priemyselný vsádzkový proces. Relatívne rýchly priemyselný vsádzkový proces s cyklom 7,5 dňa má objemovú produktivitu piva 0,093 m³ produkovaného piva / (m³ objemu nádoby x deň), zatiaľ čo tu popisovaný kontinuálny proces má produktivitu 0,165 m³ produkovaného piva / (m³ objemu nádoby x deň). Keby ďalší výskum umožnil skrátenie vsádzkového času zdržania na menej než 24 h, stala by sa produktivita piva 2,3-krát väčšia než priemyselný vsádzkový štandard. Ak by sa dosiahol ideálny scenár s 24 h kontinuálnym procesom a žiadnym vsádzkovým zdržaním, bola by objemová produktivita piva 7,5-krát vyššia než vsádzkový štandard. Okrem zvýšenej objemovej produktivity je nutné so starostlivou analýzou relatívnych prevádzkových nákladov vybalansovať dodatočné prínosy, realizované prechodom zo vsádzkového na kontinuálny proces, ako je kratší čas na dodanie na trh, zníženie veľkosti pivovaru a menej častá propagácia kvasiniek.

Iní výskumníci (Kronlôf a Virkajärvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauchi et al., 1995) sa zamerali na vývoj viacstupňovej kontinuálnej fermentácie, kde prvý stupeň kontinuálnej fermentácie (aeróbny) vedie iba k čiastočnej spotrebe skvasiteľných cukrov prítomných v sladine. Aj keď táto stratégia vykázala určitý úspech, pokiaľ ide o produkciu chuti, sú tieto systémy zložité. Prvé aeróbne štádium týchto procesov tiež vytvára prostredie, ktoré je viac náchylné na mikrobiálnu kontamináciu (t.j. vysoká koncentrácia cukru, teplota a kyslík, s nízkou koncentráciou etanolu). V systéme bioreaktora s plynovým výťahom, opisovanom v tejto práci, má bioreaktor nízku koncentráciu skvasiteľných cukrov, nízke pH, vysokú koncentráciu etanolu a nízku koncentráciu kyslíka, čo robí prostredie nehostinným pre potenciálne kontaminanty.

222 diacetyl

1,00.·.

' _Hsceta!dehyd χ* \ \

Γ . .g. - aeróbne uchovávame j . — .....anaeróbne uchovávanej i —komerčné pivo etylacetát izobutanol

1-propanol

Obr. 7.22. Radarový graf normalizovaných koncentračných údajov, získaných po 48 h aeróbneho alebo anaeróbneho uchovávania po primárnej kontinuálnej fermentácii v bioreaktore s plynovým výťahom. Normalizované údaje sú založené na priemeroch zdvojených vzoriek a údaje pre komerčné piva boli zobraté ako stred údajov uvedených v prílohe 6.

7.2.3. Vplyv času zdržania kvapaliny na kľúčové metabolity kvasiniek počas kontinuálnej primárnej fermentácie piva

Obr. 7.23 až 7.28 ukazujú analytické výsledky, získané z kvapalnej fázy bioreaktora. V tabuľke 7.3 sú uvedené priemerné koncentrácie a prietoky meraných analytov v pseudoustálenom stave (po minimálne troch obratoch bioreaktora) pri dvoch časoch zdržania kvapaliny, použitých počas tohto experimentu. Zatiaľ čo životnosť kvasiniek v kvapalnej fáze sa pri zvýšení prietoku sladiny do bioreaktora významne nezmenila, koncentrácia kvasiniek sa zmenila, ako je zrejmé z obr. 7.23.

223

Tabuľka 7.3. (a) Súhrnná tabuľka vplyvu času zdržania v bioreaktore na koncentráciu kvasiniek a ich kľúčových metabolitov v kvapalnej fáze, priemery v pseudo-ustálenom stave; (b) Súhrnná tabuľka vplyvu času zdržania v bioreaktore na prietok kvasiniek a ich kľúčových metabolitov v kvapaline na výstupu z bioreaktora, priemery v pseudo-ustálenom stave.

(a) Priemerná koncentrácia analytu	Čas zdržania v bioreaktore
1,8 dňa	0,9 dňa
kone. kvasiniek (buniek/ml)	2,38E+08	E32E+08
celk. skvas, glukóza (g/100 ml)	0,29	6,09
FAN (mg/1)	106,3	246,4
etanol (g/100 ml)	5,16	4,80
celkový diacetyl (ug/1)	292	. 460
acetaldehyd (mg/1)	19,47	37,07-
etylacetát (mg/1)	41,00	38,29
1 -propanol (mg/1)	44,95	13,53
izobutanol (mg/1)	22,78	9,13
izoamylacetát (mg/1)	0,90	1,28
izoamylalkohol (mg/1)	76,67	• 51,39
(b) Priemerný prietok analytu	Čas zdržania v bioreaktore
	1,8 dňa	0,9 dňa
prietok kvasiniek (buniek/min)	7,38E+08	8,22E+08
celk. skvas, glukóza (g/min)	8,93E-03	3,72E-01
FAN (g/min)	3,65E-04	E50E-03
etanol (g/min)	l,60E-01	2,93E-01
celkový diacetyl (g/min)	9,06E-07	2,81E-06
acetaldehyd (g/min)	6,04E-05	2,26E-04
etylacetát (g/min)	l,27E-04	2,34E-04
1-propanol (g/min)	l,39E-04	8,25E-05
izobutanol (g/min)	7,06E-05	5,57E-05
izoamylacetát (g/min)	2,80E-06	7,30E-06
izoamylalkohol (g/min)	2,38E-04	3,13E-04

224

Ο 2 4 S 8 10 12 14 16 18

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.23. Koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie, vplyv času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R, je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

Na obr. 7.24 a 7.25 sa koncentrácie substrátov sladiny, voľného amínového dusíka (FAN) i celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza), zvýšili, keď čas zdržania kvapaliny poklesol z 1,8 na 0,9 dňa. Z hmotnostných bilancií v tabuľke 7.4 sa so znížený časom zdržania v bioreaktore rýchlosť spotreby celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) zvýšila, zatiaľ čo rýchlosť spotreby voľného amínového dusíka sa znížila. Faktor výťažku Y_P/S produktu fermentácie etanolu z fermentovateľného glukózového substrátu sa pri znížení času zdržania kvapaliny zvýšil z 0,3 na 0,5. Pretože systém bol prebublávaný vzduchom a oxidom uhličitým, boli v plynnej fáze pravdepodobne menšie straty etanolu, čo by malo dopad na faktor výťažku Yp/s ovplyvnením bilancie etanolu. Výskum uskutočňovaný v spolupráci s Budacom a Margaritisom (1999) kvalitatívne demonštroval s použitím metódy plynovej chromatografiehmotnostnej spektroskopie (GC-MS), že v hlavovom priestore bioreaktora s plynovým výťahom sú počas kontinuálnej fermentácie detegované prchavé chuťové podiely piva zahŕňajúce etanol, acetaldehyd, etylacetát a izoamylacetát.

225

♦ Etanol '· Ferm glukóza

2 4

8

12

16 18

Čaa kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.24. Koncentrácia etanolu a skvasiteľnej glukózy v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie, vplyv- času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R, je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

226

300 σι 250

200

150

100

R, - 1.8 dňa

R_t = 0.9 dňa σι E

9 (♦FÄŇ

-20 £

1-propanol

8 10 12 14

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

18

Obr. 7.25. Koncentrácia voľného amínového dusíka a 1-propanolu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie, vplyv času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R_t je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

Tabuľka 7.4. Hmotnostná bilancia voľného amínového dusíka a celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) na základe priemerných údajov z tabuľky 7.3, vplyv času zdržania.

Čas zdržania 1,8 dňa 0,9 dňa voľný amínový dusík (g/min)

1,8 dňa 0,9 dňa celková ferm. glukóza (g/min)

vstup*	8,84E-04	R74E-03	4,71E-01	9,26E-0l
výstup	3.65E-04	l,50E-03	8,93E-03	3,72E-01
spotreba (AS)	5.18E-04	2,35E-04	4,62E-0l	5.54E-01
faktor výťažku (Yp,s)			0,3	0.5

*koncentrácia na vstupe z prílohy 1

Koncentrácia fermentačného produktu etanolu v kvapalnej fáze so skokovou zmenou času zdržania kvapaliny poklesla. Systém ako celok však pri rýchlejšom čase zdržania kvapaliny produkoval viac etanolu, vyjadrené hmotnostným prietokom. Pretože cieľom tejto

227 práce bolo nielen izolovane produkovať etanol, ale skôr získať pivo s vyváženosťou mnohých zložiek, musí byť maximalizácia produktivity etanolu vyvážená s ďalšími faktormi. Na konci komerčnej primárnej fermentácie piva musí byť spotrebovaná väčšina skvasiteľného glukózového substrátu.

Na obr. 7.26 je uvedená odpoveď koncentrácie acetaldehydu a celkového diacetylu na skokovú zmenu prietoku sladiny. Pri oboch analytoch ich koncentrácia i produktivita vzrástla so znížením času zdržania kvapaliny. Počas vsádzkovej fermentácie piva je počas niekoľkých prvých dní fermentácie kvasinkami vylučovaný acetaldehyd (Kunze, 1996).

600·

500 ·- 35 σι 400 --30 v

3

20.2 ♦ Diacetyl F Acetaldehyd

200

100

R, = L8 dňa

R₍ = 0,9 dňa

-- 5

8 10 12 Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

Obr. 7.26. Koncentrácia celkového diacetylu a acetaldehydu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie, vplyv času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R_t je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

Obr. 7.25 a 7.27 ukazujú vplyv klesajúceho času zdržania v bioreaktore na koncentráciu vyšších alkoholov 1-propanolu, izobutanolu a izoamylalkoholu v kvapalnej fáze. Pri všetkých troch vyšších alkoholoch po znížení času zdržania v bioreaktore koncentrácia klesla.

228

♦ Izobutanol ϋ Izoamylalkohol

2 4

8

12 14 16

Čas kontinuálnej fermentáeie (dni)

Obr. 7.27. Koncentrácia izobutanolu a izoamylalkoholu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentáeie, vplyv času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R_t je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

Hmotnostné prietoky etylacetátu a izoamylacetátu uvedené v tabuľke 7.3 (b) sa oba v reakcii na znížený čas zdržania kvapaliny zvýšili. Na obr. 7.28 sa koncentrácia etylacetátu v kvapalnej fáze znížila a koncentrácia izoamylacetátu sa zvýšila. Pretože tento experiment umožnil zvýšenie rastu kvasiniek v kvapalnej fáze bez zvýšenia dodávky kyslíka do systému, podporovali podmienky v bioreaktore produkciu esterov. Hough et al. (1982) uvádzajú, že podmienky zvýšeného rastu a zníženého kyslíka podporujú tvorbu esterov.

229

431.6

Η ε 4ΐ -ι

403S1

R, = 1,8 dňa

Ri = 0.9 dňa ι

37-ί0

S 8 10 12 14

Čas kontinuálnej fermentácie (dni)

1,4

- 1,2 ci E

0,8 n o

---1- 0

18 • Etylacetát ¹ ’zoamyiacetát

Obr. 7.28. Koncentrácia etylacetátu a izoamylacetátu v kvapalnej fáze v závislosti od relatívneho času kontinuálnej fermentácie, vplyv času zdržania kvapaliny v bioreaktore. R, je čas zdržania kvapaliny v bioreaktore v dňoch.

7.2.4. Použitie komerčného preparátu alfa-acetolaktát dekarboxylázy na zníženie celkového diacetylu počas primárnej kontinuálnej fermentácie piva

Experiment 1: Skôr než mohol byť pokus dokončený, bol bioreaktor kontaminovaný aeróbne rastúcimi Gram pozitívnymi kokmi. Zistilo sa, že bol kontaminovaný bioreaktor samotný, pretože mikrobiologické testovania sladiny kontamináciu nevykázalo. To ukázalo na nutnosť modernizácie bioreaktora so zlepšenými zárukami proti kontaminácii. Avšak než bol systém uzavretý, bol pozorovaný pokles koncentrácie celkového diacetylu, keď bola k dodávke sladiny pridaná ALDC. Z týchto údajov však bohužiaľ nebolo možné urobiť akýkoľvek záver v dôsledku mätúcich účinkov kontaminácie.

Experiment 2: Po mnohých modernizáciách bioreaktora pracoval systém počas celého trvania experimentu 2 bez kontaminácie. Údaje z tohto experimentu sú uvedené na obr. 7.29 až 7.31. V tabuľke 7.5 sú zhrnuté priemerné koncentrácie celkového diacetylu v pseudo-ustálenom stave pred prídavkom ALDC ku sladine a po ňom. Celková koncentrácia diacetylu klesla s

230 prídavkom ALDC ku sladine o 47 %, čo robí použitie tohto enzýmu sľubným pre budúcnosť (priemery sú braté po troch časoch obratu bioreaktora). Ako je zrejmé na obr. 7.30 a 7.31, koncentrácie celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) a kvasiniek sa počas tohto pokusu mierne odchýlili, čo mohlo byť spôsobené miernymi rozdielmi v sladine. dodávanej do bioreaktora pred a po prídavku ALDC.

600

500,

400

300

200

100

Prídavok

ALDC

100 150 200 250

Čas kontinuálnej fermentácie (h)

300

350

Obr. 7.29. Celková koncentrácia diacetylu v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie, účinok prídavku ALDC do sladinového fermentačného média, experiment 2.

231

Koncentrácia etanolu a skvasiteľnej glukózy (gMOOml)

MB
		B
«*	B	H “	Ii
K			H a
9
		-►
				l a Etanol
		Prídavok		Ferm. glukóza j
		ALDC
		-►

040

100 150 200 . 250 300

Čas kontinuálnej fermentácie (h)

350

Obr. 7.30. Koncentrácia skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) a etanolu v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie, účinok prídavku ALDC do sladinového fermentačného média, experiment 2.

232 .ΟΟΕ+1 Οτ

Ε >» c

-Ο

G?

(í

Q.

(O >

>

’c '</) o

‘5 c

o c

1.00E+09Í !

i

1.00E+08\

1.00E+071.00E+06’:

1.00E+05’

1.Q0E+04' ί,ΟΟΕ+03

1.00E+02

I

1.00E+011 .OOE+OOÉ-►

Prídavok

ALDC

-► ♦♦ *♦ *

100 150 200 250 300 350

Čas kontinuálnej fermentácie (h)

Obr. 7.3L. Koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie. účinok prídavku ALDC do sladinovébo fermentačného média, experiment 2.

Na elimináciu potenciálne mätúceho vplyvu variability sladiny bolo počas experimentu 3 z varne odobraté veľké množstvo sladiny (14 hl) a ALDC bola pridaná priamo ku sladine zostávajúcej v tejto uchovávacej nádobe, len čo sa dosiahli základné hodnoty pseudoustáleného stavu. Tým sa ďalej odstránili potenciálne nekonzistencie sladiny, ktoré mohli ovplyvniť priebeh fermentácie v experimente 2. Táto uchovávacia nádoba na sladinu bola vybavená tiež prebublávaním oxidu uhličitého tak, aby bola hladina rozpusteného kyslíka v sladine udržiavaná konzistentne na nízkej úrovni.

Experiment 3: Obr. 7.32 až 7.34 ilustrujú účinok prídavku ALDC k zásobe sladiny na koncentrácie celkového diacetylu, celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza), etanolu a voľne suspendovaných kvasiniek počas kontinuálnej fermentácie piva. Tabuľka 7.6 udáva tiež priemernú celkovú koncentráciu diacetylu v pseudo-ustálenom stave pred a po prídavku ALDC k zásobe sladiny (priemery braté po troch obratoch bioreaktora). V žiadnom okamžiku tohto experimentu nebola detegovaná kontaminácia. Koncentrácia celkového diacetylu sa po prídavku ALDC znížila o 45 %. neboli pozorované významné rozdiely v

233 koncentrácii etanolu, celkových skvasiteľných uhľohydrátov (ako glukóza) ani voľne suspendovaných kvasiniek, čo súhlasí so vsádzkovými hodnotami, ktoré zistili Aschengreen a

Jepsen (1992).

o (Ό '2 c

u c

o £

Prídavok

ALDC

100 150 200 250

Čas kontinuálnej fermentácie (h)

300

350

Obr. 7.32. Celková koncentrácia diacetylu v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie, vplyv prídavku ALDC k fermentačnému médiu sladiny, experiment 3.

234

87□) '5?

,Ε α

ro >

t/3

C ra

Φ .2 'υ

65432ΙΟ 40

Etanol Ferm. glukóza

Prídavok

ALDC

-►

100 150 200 250 300 čas kontinuálnej fermentácie (h)

350

Obr. 7.33. Koncentrácia etanolu a celkových skvasiteľných cukrov (ako glukóza) v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie, vplyv prídavku ALDC k fermentačnému médiu sladiny, experiment 3.

235

1.00Ε+00

1.00Ε+11

1.00Ε+10

1.00Ε+09 ο -Μ

Π3

ΈΓ 1.00Ε+07 c

ro m 1.00Ε+06 χ 1.00Ε+05 0> c <8 1.00Ε+04 >

ο 1.00Ε+033 1.00Ε+02 c

ο * 1Ό0Ε+01

	♦ ♦ ♦ ♦	♦
	Prídavok ALDC
	F

100 150 200 250

Čas kontinuálnej ferrmentácie (h)

300

350

Obr. 7.34. Koncentrácia kvasiniek v kvapalnej fáze v závislosti od času kontinuálnej fermentácie, vplyv' prídavku ALDC k sladinovému fermentačnému médiu, experiment 3.

Výsledky experimentov 2 a 3 ukazujú, že ALDC pri kontinuálnej fermentácii v bioreaktoroch s plynovým výťahom skutočne mala významný vplyv na celkovú koncentráciu diacetylu a poskytla priemerné zníženie koncentrácie celkového diacetylu 46 %. To umožňuje znížiť alebo odstrániť sekundárne spracovanie na zníženie koncentrácie diacetylu v kontinuálnych systémoch s plynovým výťahom. Na tieto počiatočné experimenty bolo použité relatívne vysoké dávkovanie ALDC a ak by mal byť tento enzým na proces aplikovaný, bolo by nutné optimalizovať množstvo, spôsob a čas jeho dávkovania do sladiny. Ďalšie úspory by bolo možné dosiahnuť, keby bol k dispozícii enzým s vyššou aktivitou za podmienok pivovarských fermentácii alebo keby enzým sám bol imobilizovaný, čo by umožnilo jeho opätovné použitie (Dulieu et ak, 1996). Inou úvahou by bola prijateľnosť enzýmových prísad, ktoré boli získané s použitím geneticky upravených organizmov, pre verejnosť.

Pri dávke 2 kg/1000 hl, odporúčanej dodávateľom, a pri cene komerčného enzýmového prípravku $131.05/kg by sa materiálové náklady fermentácie zvýšili o $0,26/hl. V

236 uskutočnených experimentoch bolo použité dávkovanie enzýmu 72 pg/l (108 ADU/1), čiže

7,2 kg/1000 hl ALDC, čo znamená zvýšenie materiálových nákladov o $0,94/hl. Ekonomickosť použitia ALDC na znižovanie diacetylu pri kontinuálnych fermentáciách s plynovým výťahom bude závisieť od optimálneho dávkovania enzýmu za podmienok bioreaktora a od času ušetreného jeho použitím.

Tabuľka 7.5. Súhrn priemerného účinku prídavku ALDC k fermentačnému médiu sladiny v pseudo-ustálenom stave na koncentráciu celkového diacetylu počas kontinuálnej fermentácie piva v bioreaktore s plynovým výťahom.

Priemerná koncentrácia celkového Percento diacetylu zníženia

Experiment	W)	diacetylu
(bez ALDC)	(ALDC, 60 μΐ/ΐ)
Experiment II	495	260	47
Experiment III	445	245	45

*priemery založené na hodnotách pseudo-ustáleného stavu po troch obratoch reaktora

Vyššie uvedené podporuje domnienku, že kontinuálnou fermentáciou s použitím imobilizovaných kvasiniek a asociovaných voľných kvasiniek v systéme bioreaktora s plynovým výťahom a sacou rúrkou je pri výrobe piva reálnou alternatívou k vsádzkovej fermentácií na základe nasledujúcich kritérií:

- dosiahnutá vyrovnaná chuť vyššia objemová produktivita bioreaktora

- minimálna zložitosť preukázaná dlhodobá kontinuálna prevádzka regulácia vzduchu (kyslíka) vo fluidizačnom plyne na kontrolu chuti možnosť prídavku enzýmu α-acetolaktát dekarboxylázy na kontrolu diacetylu žiadna bakteriálna kontaminácia

- finančný prínos.

237

Existuje ešte mnoho oblastí, ktoré je nutné ďalej študovať, ale táto technológia je pripravená na testovanie vo väčšom meradle. Bioreaktory s plynovým výťahom sa už v priemyselnom meradle používajú na spracovanie odpadovej vody, takže zväčšenie meradla systému kontinuálnej fermentáeie piva sa javí technicky schodné. Uvádza sa, že pivovar Grolsch v Holandsku používa na spracovanie svojich odpadových vôd bioreaktor s plynovým výťahom s objemom 230 m³ (Driessen et al., 1997). Jednou z najväčších bariér pre kontinuálnu fermentáciu v pivovarskom priemysle v komerčnom meradle môže byť prijateľnosť nového procesu pre pivovarníkov, pretože ide o odvetvie, ktoré je hlboko zviazané s tradíciou.

Údaje získané pre sekundárne metabolity kvasiniek, vznikajúce počas kontinuálnej fermentáeie piva, vykonávanej v tejto práci, osvetlili význam regulácie kyslíka vo fluidizačnom plyne na tvorbu chuti piva. Zistené výsledky ukázali, že za daných prevádzkových podmienok zvýšenie množstva vzduchu v bioreaktore spôsobilo zvýšenie acetaldehydu, diacetylu a vyšších alkoholov (izoamylalkoholu a izobutanolu), zatiaľ čo koncentrácie esterov (izoamylacetátu, etylhexanoátu, etyloktanoátu) a etanolu sa znížili. Z týchto údajov vyplýva, že existuje možnosť kontroly chuti piva pomocou zloženia fluidizačného plynu do bioreaktora, a teda možnosť výroby jedinečných produktov.

S výnimkou času, keď bol z fluidizačného plynu odstránený vzduch, bola v kvapalnej fáze bioreaktora udržiavaná koncentrácia voľne suspendovaných kvasiniek vyššia než 10⁸ buniek/ml. V systéme teda v bioreaktore koexistovala viac než jedna populácia kvasiniek, imobilizované kvasinky a kvasinky suspendované v kvapalnej fáze. Vzhľadom na veľké množstvo životaschopných kvasiniek, rastúcich v kvapalnej fáze bioreaktora, existuje možnosť použitia kontinuálneho bioreaktora ako propagátora kvasiniek.

Keď bolo po skončení kontinuálnej primárnej fermentáeie pridané 48 h vsádzkové zdržanie, bol získaný chuťový profil, ktorý bol v medziach pre tržné pivá. Teplota tohto zdržania bola 21 °C a experimentálne bol preukázaný význam minimalizácie vystavenia kvapaliny vplyvu kyslíka počas zdržania na tvorbu chuti. Zavedením zdržania sa proces predĺži o dva dni a skomplikuje, ale stále je významne rýchlejší než komerčné vsádzkové fermentáeie, ktoré trvajú medzi siedmimi a štrnástimi dňami.

Konečným ideálnym stavom by bolo sekundárne zdržanie celkom eliminovať optimalizáciou podmienok v primárnom kontinuálnom bioreaktore. Ďalšie skrátenie sekundárneho zdržania je možné však krátkodobo dosiahnuť optimalizáciou teploty zdržania

238 (odstraňovanie diacetylu kvasinkami je silne závislé od teploty), množstva skvasiteľných cukrov zostávajúcich v kvapaline na začiatku zdržania, koncentrácie prítomných kvasiniek, hydrodynamických charakteristík nádoby na zdržanie (odstraňovanie diacetylu môže byť zlepšené zlepšením kontaktu medzi kvasinkami a pivom) a pomocou ďalších opatrení na elimináciu kyslíka z tohto stupňa.

Ďalší výskumníci (Kronlof a Virkajarvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauchi et al., 1995) sa zamerali na vývoj viacstupňovej kontinuálnej fermentácie, v ktorej v prvom stupni kontinuálnej fermentácie (aeróbny) dochádza k iba čiastočnej spotrebe skvasiteľných cukrov prítomných v sladine. Táto stratégia síce vykázala určitý úspech, pokiaľ ide o produkciu chuti, ale tieto systémy sú zložité. Prvý aeróbny stupeň týchto systémov navyše vytvára prostredie, ktoré je náchylnejšie na mikrobiálnu kontamináciu (t.j. vysoká koncentrácia cukrov, teplota a kyslík s nízkou koncentráciou etanolu). V bioreaktore s plynovým výťahom, opísanom v tejto práci, má bioreaktor v ustálenom stavu nízku koncentráciu skvasiteľných cukrov, nízke pH, vysokú koncentráciu etanolu a nízku koncentráciu kyslíka, čo robí prostredie nehostinným pre potenciálne kontaminanty. V menej rozvinutom pivovarníctve je minimalizácia zložitosti a vývoj robustného procesu, odolného proti kontaminácii, významným faktorom úspechu.

Prídavok komerčného prípravku alfa-acetolaktát dekarboxylázy (ALDC) k sladine dodávanej do kontinuálnej fermentácie vykázal priemerné zníženie diacetylu o 46 %. Pretože však ALDC je enzým, ktorý je produkovaný geneticky upraveným organizmom (GMO), existujú tu problémy s vnímaním verejnosti, na ktoré je nutné brať ohľad pred použitím takého enzýmu v komerčnom produkte. Okrem toho komerčne dostupné enzýmy na kontrolu diacetylu nemajú optimálnu aktivitu za podmienok fermentácie.

V priebehu šiestich mesiacov kontinuálnej fermentácie s použitím imobilizácie kapakaragénanovým gélom si voľne suspendované kvasinky v kvapalnej fáze uchovali životnosť väčšiu než 90 %, zatiaľ čo životnosť imobilizovaných kvasiniek klesla na menej než 60 %. Fotografie z elektrónového mikroskopu odhalili, že kvasinky umiestnené blízko obvodu gélovej perličky mali viacpočetné jazvy po púčikoch a pravidelnú morfológiu, zatiaľ čo kvasinky v blízkosti jadra perličky mali nepravidelný tvar a menej jaziev po púčikoch, čo ukazuje na zhoršený rast. Z mikrofotografií tiež vyplýva, že kvasinky umiestnené v blízkosti jadra perličky vykazovali znaky starnutia. Ako je diskutované v sekcii 5, kapa-karagénanový gél má mnoho vlastností, kvôli ktorým je žiaducou imobilizačnou matricou pre kvasinky. Nie je však v súčasnosti k dispozícii žiadna priemyselná metóda výroby perličiek, a pretože kvasinky sú

239 v matrici zachytávané ako súčasť procesu vzniku perličiek, zvyšuje manipulácia s perličkami v komerčnom zariadení jeho zložitosť a náklady. V budúcnosti by mali byť skúmané ďalšie metódy imobilizácie, ako je autoagregácia alebo flokulácia. Tým by sa odstránila komplikovanosť manipulácie s perličkami v priemyselnom prostredí, a pokiaľ by dochádzalo k pravidelnému praskaniu vločiek kvasiniek, bolo by zaistené, že sú z bioreaktora pravidelne odstraňované zostarnuté kvasinky.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob výroby alkoholických nápojov, vyznačujúci sa tým, že sa použije bioreaktor s plynovým výťahom s vnútornou cirkuláciou na uskutočnenie stupňa kontinuálnej fermentácie, v ktorom je sladina obsahujúca skvasiteľné cukry počiatočné sfermentovaná s použitím ílokulentných kvasiniek imobilizovaných autoagregáciou za obmedzenej dodávky kyslíka a aspoň čiastočne sfermentovaný výstup z kontinuálneho procesu sa vedie na dokončenie do stupňa vsádzkového spracovania.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že alkoholickým nápojom je pivo.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že pivom je pivo svetlého typu.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že pivom je ležiak.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pivom je pivo severoamerického typu.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že kvasinkami sú vysoko flokulentné alebo superflokulentné kvasinky.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že fermentáciou je primárna fermentácia.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sladina sa pred fermentáciou prebubláva oxidom uhličitým.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa v reaktore používa prebublávací oxid uhličitý obsahujúci asi 3 % kyslíka.
10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že dokončenie primárnej fermentácie sa uskutočňuje v uvedenom stupni vsádzkového zdržania.

    241
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje zníženie koncentrácie diacetylu.
12. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje zníženie koncentrácie acetaldehydu.
13. 13. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia vyšších pribudlinových alkoholov zostáva v podstate nezmenená spracovateľským stupňom vsádzkového zdržania.
14. 14. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že výstup zo stupňa kontinuálnej fermentácie sa rozvádza rozdeľovačom do jednotlivých z množstva nádob vsádzkového zdržania, kde prebieha uvedený proces vsádzkového zdržania.
15. 15. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedeným kontinuálnym procesom je proces naočkovania nasledujúcich vsádzkových fermentácií v stupni vsádzkového zdržania.