RO122457B1 - Procedeu de fermentaţie continuă/în şarje pentru producere de alcooli potabili - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu pentru producerea de alcooli potabili, în care se utilizează un bioreactor cu injecţie de gaze, în care are loc o circulaţie internă, pentru realizarea unei etape de fermentaţie continuă, în care fermentează iniţial un must care conţine zaharuri fermentabile, prin utilizarea de celule de drojdie floculantă, imobilizate prin auto-agregare, la o alimentare restricţionată de oxigen, şi produsul evacuat, cel puţin parţial fermentat, din procedeul continuu este furnizat într-o etapă de prelucrare în şarje, pentru finisare.

Description

Prezenta invenție se referă la producerea de produse alcoolice potabile, în special bere, utilizând un procedeu hibrid alcătuit din etape de prelucrare de fermentație continuă și în șarje.

Numărul mare de publicații recente din acest domeniu ilustrează marele interes în imobilizare, în industria de fabricare a berii. în mai multe treceri în revistă (Enari, 1995; Iserentant, 1995; Masschelein, 1997; Mensourși colab.; 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999) asupra stării generale a industriei de fabricare a berii, a fost subliniat rolul revoluționar posibil al imobilizării în producerea de bere. în plus față de grupurile menționate în secțiunile 3.1 până la 3.5, multe alte instituții au fost implicate în cercetare și dezvoltare pentru celule imobilizate pentru aplicații de fabricare a berii: Miller Brewing Company (Duncombe și colab., 1996; Tata și colab., 1999) din Statele Unite conduc anumite evaluări preliminare asupra unei unități de testare Meura Delta, cât și asupra bioreactorului cu pat fluidizat distribuit de Schott Engineering. Coors Brewing a realizat de asemenea experimente preliminare cu sistemul Meura Delta.

SlovakTechnical University, în colaborare cu Heineken, au investigat utilizarea gelului de pectat de calciu într-un sistem cu presiune de aer comprimat pentru producerea berii (Domeny, 1996). Mai recent, grupul de la Slovak Technical University a publicat mai multe articole despre cercetarea lor aflată în desfășurare (Smogrovicova și colab.; 1997; Smogrovicova & Domeny, 1999). Guinness a investigat inițial utilizarea de diverși purtători de adsorbție pentru imobilizarea și fermentația ulterioară într-un bioreactor cu pat fluidizat (Donnelly, 1998). în 1999, Donnelly și colegii au publicat un document care descria cinetica metabolismului zahărului în interiorul bioreactorului lor cu pat fluidizat (Donnely și colab., 1999). Amenajarea lor experimentală a implicat utilizarea de sfere de sticlă poroasă Siran ca purtător de imobilizare pentru o drojdie de fermentație superioară. Guinness a devenit parte a Immocon Consortium care a fost descris în secțiunea 2.2.5.

Holsten Brauerei AG și Lurgi AG, amândouă din Germania, au dezvoltat și exploatat împreună o instalație pilot pentru producția continuă de bere fără alcool (Dziondziak, 1995). Au fost utilizate sfere de alginat de calciu într-un fermentator cu pat fluidizat cu buclă cu o singură treaptă (1301) pentru fermentație în timp ce pentru dezalcoolizarea berii a fost utilizată o coloană cu sită de fund (7 site de fund). Timpul total de producție pentru acest procedeu a fost 8,5 h.

O echipă de la Sapporo Breweries Ltd. Brewing Research Laboratories din Japonia a studiat utilizarea celulelor imobilizate într-un reactor cu pat fluidizat pentru fermentația principală a berii. Studiile lor au implicat utilizarea de sfere de gel din alcool polivinilic (Shindo & Kamimur, 1990), sfere de gel Ca-alginat (Shindo și colab., 1994a), fibre de gel cu două straturi (Shindo și colab., 1994b) și sfere de gel din chitosan (Shindo și colab., 1994c) ca matrici de imobilizare. în studiul din urmă, a fost exploatat continuu un bioreactor cu volumul de lucru de 1 litru conținând 25% în volume sfere de Chitopearl® tip II (sfere de chitosan), cu must tratat cu glucoamilază. Acest tratament enzimatic a permis formarea de ester acetat în sistemul de celule imobilizate pentru a fi similar celui de la fermentația în șarje convențională, astfel cu un pas mai aproape de potrivirea produsului.

Grupul de cercetare de la Sapporo își concentrează acum atenția asupra dezvoltării unui fermentator cu pat fluidizat cu sfere de chitosan funcționând în mod în șarje repetate. Sistemul a fost exploatabil timp de 75 zile fără nici o problemă majoră iar berea rezultată a fost similară în ceea ce privește calitatea cu un produs comercial. S-a arătat că o tulpină nefloculantă este mai eficientă decât o tulpină floculantă (Maeba și colab., 2000; Umemoto și colab., 1998).

RO 122457 Β1

Alte două abordări ale reducerii de diacetil au fost prezentate la Congresul EBC ținut 1 în Maastrichtîn 1997. Cercetătorii din Franța (Dulieu și colab., 1997) au propus utilizarea de α-acetolactat decarboxilază încapsulată pentru a converti rapid α-acetolactatul în acetoină. 3 Meura Delta a subliniat rezultatele preliminare asupra utilizării zeolitului de aluminosilicat drept catalizator pentru conversia directă și la rece a acetolactatului în acetoină (Andries și colab., 5 1997). Dacă asemenea, tratamente se dovedesc a fi eficiente și acceptabile pentru clienți, alternativele de cost redus la sistemele de maturare propuse de Cultor și Alfa Laval ar putea 7 deveni realitate.

Alte cercetări neindustriale în domeniul imobilizării pentru producția de bere includ 9 pe cele ale Singapore Institute of Standards and Industrial Research unde a fost studiată utilizarea unei particule de gel din alginat de tip fir pentru utilizarea într-un reactor cu strat 11 compact și s-a găsit că este mai favorabilă decât sferele din alginat (Que. 1993). Mafra și colegii de la Universidade do Minho din Portugalia au discutat utilizarea unei tulpini de drojdie 13 superfloculante pentru maturarea continuă a berii (Mafra și colab., 1997). Același grup de cercetare a publicat de asemenea lucrarea despre utilizarea drojdiei lor floculante într-un 15 bioreactor cu presiune de aer comprimat pentru producția de etanol (Vicente și colab., 1999; Domingues și colab., 2000). 17

Cercetători de la diverse instituții academice au investigat de asemenea recent utilizarea imobilizării pentru producerea berii (Argiriou și colab., 1996; Bardi și colab., 1996; 19

Cashin, 1996; Moli & Duteurtre, 1996; Nedovic și colab., 1996a; Nedovic și colab., 1996b;

Norton și colab., 1995; Scott și colab., 1995; Wackerbauer și colab., 1996a; Wackerbauer 21 și colab., 1996b). Grupuri de cercetare din China (Chao și colab., 1990; Yuan, 1987; Zhang și colab., 1988), Rusia (Kolpachki și colab., 1980; Sinitsyn și colab., 1986) și Cehoslovacia 23 (Chladek și colab., 1989; Curin și colab., 1987; Polednikova și colab., 1981) au fost de asemenea implicate în tehnologia celulelor imobilizate și au publicat rezultate în anii 1980. 25

Au fost considerate numeroase referințe în timpul muncii de fundamentare a studiilor pe care se bazează prezenta invenție. Acestea includ: 27

Abbott, B.J. 1978. Immobilized cells.în: AnnualReportsonFermentation Processes,

Ed. Perman, D., New York: Academic Press, 2: 91. 29

Anon. 1994. Maturex® L. Novo Nordisk pubication. B 560c-GB.

Anon. 1996. Table Curve 2D. User's Manual, Jandel Scientific. 31

Anon. 1997. Alfa Laval Brewery Systems. Brewers' Guardian 126: 26.

Anon 1998. Digox 5 Operating Manual. Dr Theidig publication 33

Aquilla, T. 1997. The biochemistry of yeast: debunking the myth of yeast respiration and putting oxygen in its proper place. Brewing Techniques 50. 35

Aschengreen, N.H., Jepsen, S. 1992. Use of acetolactate decarboxylase in brewing fermentations. Proceedings of the 22^nd Convention of the Institute of Brewing (Australia and 37

New Zealand Section), Melbourne 80.

Atkinson, B. 1986. Immobilised cells, their application and potențial. In: Process 39 engineering aspects of immobilized cell systems. Ed. Webb, C., Black, G.M, Athinson, B. Manchester: Institution of Chemical Engineers 3. 41

Audet, P., Paquin, C., Lacroix, C. 1988. Immobilized growing lactic acid bacteria with kappa-carrageenan-locust bean gel. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 11. 43

Austin, G.D., Watson, RW.J., Nordstrom, P.A., D’Amore, T. 1994. An on-line capacitance biomass monitor and its correlation with viable biomass. MBAA Technical 45

Quarterly 31: 85.

Axcell, B.C., O’Connor-Cox, E.S.C. 1996. The concept of yeast vitality—an alternative 47 approach. Proceedings of Convention of the Institute of Brewing (Asia Pacific Sect.).

Singapore 24: 64. 49

RO 122457 Β1

Axelsson, A., Sisak, C., Westrin, B.A., Szajani, B. 1994. Diffusion characteristics of a swelling gel and its consequences for bioreactor performance. The Chemical Engineering Journal 55: B35.

Bailey, J.E., Ollis, D.E. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals. New York: McGraw-Hill, Inc. Bancel, S., Hu, W. 1996. Confocal laser scanning microscopyexamination of cell distribution in macroporous microcarriers. Biotechnology Progress 12: 398.

Barker, M.G, Smart, K.A. 1996. Morphological changes associated with the cellular aging of a brewing yeast străin. Journal of the American Society of Brewing Chemists 54(2): 121.

Bejar, P., Casas, C, Godia, F., Sola, C 1992. The influence of physical properties on the operation of a three-phasefluidized-bed fermenterwith yeast cells immobilized in calcium alginate. Applied Biochemistry and Biotechnology 34: 467.

Bickerstaff, G.F. 1997. Immobilization of enzymes and cells. In: Immobilization of Enzymes and Cells, Ed.Bickerstaff, G.F., New Jersey, U.S.A.: Humana Press, Inc. 1.

Birnbaum, S., Pendleton, R., Larson, P., Mosbach, K. 1981. Covalentstabilization of alginate gel for the entrapment of living whole cells. Biotechnology Letters 3: 393.

Budac, D., Margartis, A. 1999. Personal communication.

Biiyukgijngor, H. 1992. Stability of Lactobacilus bulgaricus immobilized in kappacarrageenan gels. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 53: 173.

Chahal, P.S. 1992. Fluorosensorcontrolledfed-batchproductionofCyclosporin-A from Beauveria nivea. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Chisti, M.Y. 1989. Airlift bioreactors. London: Elsevier Applied Science.

Chisti, Y., MooYoung, M. 1993. Improvethe performance of airlift reactors. Chemical Engineering Progress 6: 38.

Cho, G.H., Choi, C.Y., Choi, Y.D., Han, M.H. 1982. Ethanol production by immobilised yeast and its carbon dioxide gas effects in a packed bed reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 32: 959.

Coutts, M.W. 1956. Britain Patent No. 872,391.

Curin, J., Pardonova, B., Polednikova, M., Sedova, H., Kahler, M. 1987. Beer production with immobilized yeast. European Brewing Convention Congress, Madrid 433.

Dale, C.J., Hough, J.S., Young, T.W. 1986. Freactionation of highand low molecular weight componente from wort and beer by adsorption chromatography using the gel Sephadex LH20. Journal of the Institute of Brewing 92(5): 457.

Daoud, I.S., Searle, B.A. 1986. Yeast vitality and fermentation performance. Monograph-XII European Brewery Convention-Symposium on Brewers’ Yeast, Helsinki 108. de Backer, L., Willaert, R.G., Baron, G.V. 1996. Modelling of immobilized bioprocess.

In: Immobilized Living Cell Systems Modelling and Experimental Methods, Ed. Willaert, R.G., Baron, G.V., and de Backer, L., Toronto: John Wiley and Sons. 47.

de Beer, D., Van den Heuvel, J. C., Ottengraaf, S.P.P. 1993. Microelectrode measurements of the activity distribution in nitrifying bacterial aggregates. Applied Environmental Microbiology 59: 573.

Debourg, A., Laurent, M., Goossens, E, Borremans, E., Van De Winkel, L., Masschelein, C.A. 1994. Wort aldehyde reduction potențial in free and immobilized yeast Systems. Journal of the American Society of Brewing Chemists 52: 100.

Dillenhofer, W., Ronn, D. 1996. Secondary fermentation of beer with immobilized yeast. Brauwelt International 14: 344.

Doran, P.M., Bailey, J.E. 1986a. Effects of hydroxyurea on immobilized and suspended yeast fermentation rates and cell cycle operation. Biotechnology and Bioengineering 28: 1814.

RO 122457 Β1

Doran, P.M., Bailey, J.E. 1986b. Effects of immobilization on growth, fermentation 1 properties, and macromolecularcomposition of Saccharomyces cerevisiae attached to gelatin. Biotechnology and Bioengineering 28: 73. 3 dos Santos, V.A.P.M, Bruijnse, M., Tramper, J., Wijffels, R.H. 1996. The magic-bead concept: an integrated approach to nitrogen removal with co-immobilized micro-organisms. 5 Applied Microbiology and Biotechnology 45: 447.

Driessen, W., Habets, L., Vereijken, T. 1997. Novei anaerobic and aerobic process 7 to meet strict effluent plant design requirements. Proceedings of the Institute ofBrewing (Asia Pacific Section), Aukland 148. 9

Dulieu, C, Boivin, P., Dautzenberg, H., Poncelet, D. 1996. Immobilized enzyme system to avoid diacetyl formation: a new tool to accelerate beer maturation. International Workshop 11 on Bioencapsulation, Potsdam 22.

Dunbar, J., Campbell, S.L., Banks, D.J., Warren, D.R. 1988. Metabolic aspects of a 13 commercial continuous fermentation system. Proceedings of the Convention of the Institute of Brewing, Brisbane 151. 15

Estape, D., Gndia, F., Solr, C. 1992. Determination of glucose and ethanol diffusion coefficients in Ca-alginate gel. Enzyme and Microbial Technology 14: 396. 17

Evans, H.A.V., Cleary, P. 1985. Direct Measurement ofYeast and Bacterial Viability. Journal of the Institute of Brewing 91:73. 19

Fan, L.-S. 1989. Gas-Liquid-Solid Fluidization Engineering. Boston: Butterworths.

Femandez, E. 1996. Nuclear magnetic resonance spectroscopy and imaging. In: 21

Immobilized Living Cell Systems: Modelling and Experimental Methods. Toronto: John Wiley and Sons, Chapter 6. 23

Garcia, A.I., Garcia, L.A., Diaz, M. 1994. Prediction of ester production in industrial beer fermentation. Enzyme and Microbial Technology 16(1): 66. 25

Geankoplis, C.J. 1993. Transport Processes and Unit Operations. New Jersey: Prentice Hali P.T.R. 27

Gee, D.A., Ramirez, W.F. 1994Aflavour model for beer fermentation. Journal of the Institute of Brewing 100: 321. 29

Geiger, K.H., Compton, J. 1957. Canada Patent No. 545,867.

Gekas, V.C. 1986. Artificial membranes as carriers for the immobilization of 31 biocatalysts. Enzyme and Microbial Technology 8: 450.

Gift E.A., Park, H.J., Paradis, G.A., Demain, A.L., Weaver, J.C. 1996. FACS-based 33 isolation of slowly growing cells: double encapsulation of yeast in gel microdrops. Nature Biotechnology 14: 884. 35

Gikas, P., Livingston, A.G. 1993. UseofATPto characterizebiomass viability in freely suspended and immobilized cell bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 42: 1337. 37

Gikas, P., Livingston, A.G. 1996. Viability of immobilised cells: use of specific ATP levels and oxygen uptake rates. Progress in Biotechnolgy II. Immobilized Cells: Basics and 39

Applications, Noordwijkerhout 11: 264.

Gilson, CD., Thomas, A. 1995. Ethanol production by alginate immobilised yeast in 41 a fluidised bed bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 62: 38.

Gndia, F., Casa, C., Castellano, B., Solr, C. 1987. Immobilized cells: behavior of 43 carrageenan entrapped yeast during continuous ethanol fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology 26: 342. 45

Gopal, C.V., Hammond, J.R.M. 1993. Application of immobilized yeastsforfermenting beer. Brewing and Distilling International 24: 72. 47

RO 122457 Β1

Hannoun, Stephanopoulos, G. 1996. Diffusion coefficients of glucose and ethanol in cell-free and cell-occupied calcium alginate membranes. Biotechnology and Bioengineering 28: 829.

Hardwick, W.A. 1995. Handbook of Brewing. New York: Marcel Dekker, Inc. Hayat, M.A. 1972. Basic Electron Microscopy Techniques. Toronto: van Nostrand Reinhold Co. 96.

Heijnen, J.J., van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R., Weltevrede, R., Mulder, A. 1993. Development and scale-up of an aerobic biofilm air-lift suspension reactor. Water Science and Technology 27: 253.

Higbie, R. 1935. The role of absorption of a pure gas into a still liquid during short periods of exposure. Transactions of the American Institute of Chemical Engineers 31. 365.

Hines, A.L,. Maddox, R.N. 1985. Mass Transfer Fundamentals and Applications. U.S.A.: Prentice-Hall, Inc.

Hinfray, C., Jouenne, T., Junter, G. 1994. Ethanol production from glucose by free and agar-entrapped batch cultures of Saccharomyces cerevisiae at different oxygenation levels. Biotechnology Letters 16: 1107.

Hoekstra, S.F. 1975. Wort composition, a review of known and unknown facts. Proceedings of the European Brewery Convention, Nice 465.

Hooijmans, C.M., Ras, C., Luybrn, K.Ch.A.M. 1990. Determination ofoxygen profiles in biocatalyst particles by means of a combined polarographic oxygen microsensor. Enzyme and Microbial Technology 12: 178.

Hough, J.S., Briggs, D.E., Stevens. R., Young, T.W. 1982. Metabolism of wort by yeast. In: Malting and Brewing Science Volume 2 Hopped Wort and Beer, Ed. Hough, J.S., Briggs, D.E., Stevens, R., and Young, T.W., London, U.K.: Chapman and Hali. 566.

Husken, L.E., Tramper, J., Wijffels, R. 1996. Growth and eruption of gel-entrapped microcolonies. In: Progress in Biotechnology II, Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 336.

Hutter, K.J. 1996. Flow-cytometricanalysesforassessmentoffermentativeabilityof various yeasts. Brauwelt International 1: 52.

Hwang, S.-J., Fan, L.-S. 1986. Some design consideration ofadrafttube gas-liquidsolid spouted bed. The Chemical Engineering Journal 33: 49.

Imai, T. 1996. Recent advances in the determination of yeast vitality. Proceedings of the Congress of the Institute of Brewing (Asia Pacific Section), Singapore 24: 60.

Inloes, D.S., Taylor, D.P., Cohen, S.N., Michaels, A.S., Robertson, C.R. 1983. Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae immobilized in hollow-fiber membrane bioreactors. Applied and Environmental Microbiology 46: 264.

Inoue, T. 1987. Possibilities opened by “Anew biotechnology” and application of immobilized yeast to beer brewing. Reports of the Research Laboratory ofKirin Brewery Co., Ltd. 7.

Inoue, T. 1992. A review of diacetyl control technology. Proceedings of the 22^nd Convention of the Institute of Brewing (Australia and New Zealand Section), Melbourne 76.

Jepsen, S. 1993. Using ALDC to speed up fermentation. Brewers' Guardian. 55.

Jones, M, Pierce, J.S. 1964. Absorption of amino acids from wort by yeasts. Journal of the Institute of Brewing 70: 307.

Jones, R.P., Greenfield, P.F. 1984. A review of yeast ionic nutrition--Part I: growth and fermentation requirements. Process Biochemistry 19(2): 48.

Jones, R.P., Pamment, N., Greenfield, P.F. 1981. Alcohol fermentation by yeast--the effect of environmental and other variables. Process Biochemistry 16(3): 42.

Kara, B.V., David, I., Searle, B.A. 1987. Assessment of yeast quality. Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention, Madrid, 21: 409.

RO 122457 Β1

Karamanev, D.G. 1991. Model of the biofilm structure of Thiobacillus ferrooxidans. 1 Journal of Biotechnology 10: 51.

Karel, S.F., Libicki, S.B., Robertson, C.R. 1985. The immobilization of whole cells: 3 engineerig principles. Chemical Engineering Science 40:1321.

Kasten, F.H. 1993. Introduction to fluorescent probes: properties, history and 5 applications. In: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Ed. Mason, W.T. London, U.K.: Academic Press Limited 12. 7

Klopper, W.J. 1974. Wort composition, a survey. European Brewery Convention Monograph I. Wort Symposium, Zeist 8. 9

Korgel, B.A., Rotem, A., Monbouquette, H.G. 1992. Effective diffusivity of galactose in calcium alginate gels containing immobilized Zymomonas mobilis. Biotechnology Progress 11

8: 111.

Kreger-Van Rij, N. 1984. The Yeasts: A Taxonomic Study. Amsterdam: Elsevier 13 Science Publishers B.V.

Kronlof, J., Virkajărvi, 1.1996. Main fermentation with immobilized yeast--pilot scale. 15 Proceedings of the European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlin 94.

Kunze, W. 1996. Technology Brewing and Malting. Berlin: VLB. 17

Kuriyama, H., Ishibashi, H., Umeda, I.M.T., Kobayashi, H. 1993. Control of yeast flocculation activity in continuous ethanol fermentation. Journal of Chemical Engineering 19 Japan 26(4): 429.

Kurosawa, H., Matsarnura, M., Tanaka, H. 1989. Oxygen diffusivity in gel beads 21 containing viable cells. Biotechnology and Bioengineering 34: 926.

Kurosazwa, H., Tanaka, H. 1990. Advances in immobilized cell culture: development 23 of a co-immobilized mixed culture system of aerobic and anaerobic micro-organisms. Process Biochemistry International 25: 189. 25

Kurtzman, C.P., Fell, J.W. 1998. The Yeasts. A Taxonomic Study, Fourth Edition. Amsterdam: Elsevier 361. 27

Kyung, K.H., Gerhardt, P. 1984. Continuous production of ethanol by yeast “immobilized” in a membrane-contained fermentor. Biotechnology and Bioengineering 29

26: 252.

Lee, S.S., Robinson, F.M., Wang, H.Y. 1981 Rapid determination of yeast viability. 31 Biotechnology and Bioengineering Symposium No. 11, Gatlingburg, USA 641.

Lentini, A. 1993. A review of the various methods available for monitoring the 33 physiological status of yeast: yeast viability and vitality. Ferment 6: 321.

Lentini, A., Takis, S., Hawthome, D.B., Kavanagh, T.E. 1994. The influence of trub 35 on fermentation and flavour development. Proceedings of the 23f^d Convention of the Institute of Brewing (Asia Pacific Section), Sydney 89. 37

Leudeking, R. 1967. Fermentation process kinetics, In: Biochemical and Biological Engineering, Ed. Blakebrough, N., London; Academic Press, Inc. 203. 39

Leudeking, R., Piret, E.L. 1959. A kinetic study of the lactic acid fermentation. Journal of Biochemical and Microbiolial Technology and Engineering 1: 393. 41

Lewandowski.Z., Altobelli, A., Fukushima, E. 1993. NMRand microelectrodestudies of hydrodynamics and kinetics in biofilms. Biotechnology Progress 9: 40. 43

Lewandowski, Z., Stoodley, P., Altobelli, S. 1995. Experimental and conceptual studies on mass transport in biofilms. Water Science Technology 31: 153. 45

Lewis, M., Young, T. 1995. Brewing. London: Chapman and Hali.

Li, J., Humphrey, A.E. 1991. Use of fluorometry for monitoring and control of a 47 bioreactor. Biotechnology and Bioengineering 37: 1043.

RO 122457 Β1

Lim, H.-S., Han, B.-K., Kim, J.-H., Peshwa, M.V, Hu, W.-S. 1992. Spațial distribution of mammalian cells grown on macroporous microcarriers with improved attachment kinetics. Biotechnology Progress 8: 486.

Linko, M., Virkajarvi, I., Pohjala, N. 1996. Effect of flocculation characteristics on immobilized yeast performance. European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlin 102.

Lloyd, D., Moran, C.A., Suller, M.T.E., Dinsdale, M.G. 1996. Flow cytometric monitoring of rhodamine 123 and a cyanine dye uptake by yeast during ciderfermentation. Journal of Institute of Brewing 102: 251.

Lundberg, P., Kuchel, P. W. 1997. Diffusion of solutes in agarose and alginate gels: ¹H and ²³Na PFGSE and ²³Na TQF NMR studies. Magnetic Resonance in Medicine 37: 44.

Margantis, A., te Bokkel, D.W., El Kashab, M. 1987. Repeated batch fermentation of ethanol using immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae in a fluidized bioreactor system. In: Biological Research on Industrial Yeasts, Ed. Stewart, G.G., Russell, I., Klein, R.D., Hiebsch, R.R., Boca Raton; CRC Press 121.

Margaritis, A., Wallace, J.B. 1982. The use of immobilized cells of Zymomonas mobilis in a novei fluidized bioreactor to produce ethanol. Biotechnology and Bioengieering Symposium 147.

Margaritis, A., Wilke, C.R. 1978a. The rotorfermentor. Part I: description of the apparatus, power requirements, and mass transfer characteristics. Biotechnology and Bioengineering 20: 709.

Marganitis, A., Wilke, C.R. 1978b. The rotorfermentor. Part II: application to ethanol fermentation. Biotechnology and Bioengineering 20: 727.

Marrs, W.M. 1998. The stability of carrageenans to processing. In: Gums and Stabilizers for the Food Industry 9, Cambridge: Royal Society of Chemistry, 218: 345.

Martens, F.B., Egberts, G.T.C., Kempers, J., Roblesde Medina, M.H.L., Welton, H.G. 1986. European Brewing Conventon MonographXII, Symposium on Brewing Yeast, Helsinki 339.

Masschelein, C.A. 1990. Yeast metabolism and beerflavour. ProceedingsoftheThird Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling 103.

Masschelein, C.A., Carlier, A., Ramos-Jeunehomme, C., Abe, I. 1985. The effect of immobilization on yeast physiology and beerquality in continuous and discontinuous Systems. Proceedings of the 20th European Brewery Convention Congress, Helsinki 339.

Masschelein, C.A., Ramos-Jeunehomme. C. 1985. The potențial of alginate immobilized yeast in brewery fermentations. Institute of Brewing Central and Southern African Section Proceedings of the Ist Scientific and Technical Convention, Johannesburg 392.

Masschelein, C.A., Vandenbussche, J. 1999. Current Outlook and future perspectives for immobilized yeast technology in the brewing industry. Brewers' Guardian 28(4): 35.

Masters, B.R., Thaer, A.A. 1994. Real-time scanning slitconfocal microscopy ofthe in vivo human cornea. Applied Optics 33: 695.

Meilgaard, M. 1982. Prediction offlavordifferences between beersfrom theirchemical composition, Brygmesteren 5.

Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H., Russell, 1.1996. Application of immobilized yeast cells in the brewing industry. In: Progress in Biotechnology II, Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M.., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 661.

Mensour, N., Magaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H., Russell, I. 1997. New

Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Cell Bioreactor Systems.

Journal ofthe Institute of Brewing 103: 363.

RO 122457 Β1

Merchant, F.J.A. 1986. DiffusivityCharacteristicsofGlucose in Alginate Immobilization 1 Matrices. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Merchant, F.J.A, Margartis, A., Wallace, J.B. 1987. A novei technique for measuring 3 solute diffusivities in entrapment matrices used in immobilization. Biotechnology and Bioengineering 30: 936. 5

Mochaba, F.M. 1997. A novei and practicai yeast vitality method based on magnesium ion release. Journal ofthe Institute ofBrewing 103: 99. 7

Mochaba, F., O’Connor-Cox, E.S.C., Axcell, B.C. 1998. Practicai procedures to measure yeast viability and vitality prior to pitching. Journal of the American Society of 9

Brewing Chemists 56(1): 1.

Muhr, A.H., Blanshard, J.M.V. 1982. Diffusion in gels. Polymer 23: 1012. 11

Mulder, M.H.V., Smolders, C.A. 1986. Continuous ethanol production controlled by membrane processes. Process Biochemistry 21: 35. 13

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A., Mitsui, S. 1993. Beer brewing using an immobilized yeast bioreactor system. Bioprocess Technology 16: 275. 15

Nakanishi, K., Onaka, T., Inoue, T. 1986. A new immobilized yeast reactor system for rapid production of beer. Reports of the Research Laboratory of Kirin Brewing 17

Company 13.

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984a. Kinetic study of vicinal 19 diketones in brewing (I) formation of total vicinal diketones. MBAA Technical Quarterly 21(2):73. 21

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984b. Kinetic study of vicinal diketones in brewing (II) theoretical aspect for the formation of total vicinal diketones. MBAA 23 Technical Quarterly 21(4): 175.

Nakatani, K., Fukui, N., Nagami, K., Nishigaki, M. 1991. Kinetic analysis of ester 25 formation during beer fermentation. Journal ofthe American Society of Brewing Chemists 49(4): 152. 27

Narzip, L., Miedaner, H., Graft, P., Eichhorn, P., Lustig, S. 1993. Technological approach toimproveflavourstability. MBAA Technical Quarterly 30:48. NavaSaucedo, J.E., 29

Roisin, C., Barbotin, J.-N. 1996. Complexity and heterogeneity of microenvironments in immobilized systems. Progress in Biotechnology II, Immobilized Cells: Basics and 31 Applications, Noordwijkerhout 39.

Nedovic, A.N., Vunjak-Novakovc, G., Leskosek-Cukalovic, I., Cutkovie, M. 1996. A 33 study on considerably accelerated fermentation of beer using an airlift bioreactor with calcium alginate entrapped yeast cells. Fifth World Congress of Chemical Engineering 2: 474. 35

Neufeld, R.J., Poncelet, D.J., Norton, S.D. 1996. Application for Canadian Patent No. 2133789. 37

Norton, S., D’Amore, T. 1994. Physiological effects of yeast cell immobilization: applications for brewing. Enzyme and Microbial Technology 16: 365. 39

Norton, S., Watson, K., D’Amore, T. 1995. Ethanol tolerance of immobilized brewer’s yeast cells. Applied Microbiology and Biotechnology 43: 18. 41

O’Connor-Cox, E., Mochaba, F.M., Lodolo, E.J., Majara, M, Axcell, B. 1997. Methylene blue staining: use at your own risk. MBAA Technical Quarterly 34(1): 306. 43

O’Reilly, A.M., Scott, J.A. 1995. Defined coimmobilization of mixed microorganism cultures. Enzyme and Microbial Technology 17: 636. 45

Okazaki, M., Hamada, T., Fujji, H., Mizobe, A., Matsuzawa, S. 1995. Development of poly(vinyl alcohol) hydrogel for waste water cleaning. I. Study of poly(vinyl alcohol) gel as 47 a carrier for immobilizing organisme. Journal of Applied Polymer Science 58: 2235.

RO 122457 Β1

Oldshue, J.Y., Herbst, N.R. 1992. A Guide to Fluid Mixing. New York: Lightnin.

Opekarova, M., Sigler, K. 1982. Acidification power: indicatorof metabolic activity and autolytics changes in Saccharomyces cerevisiae (yeast). Folia Microbiologia 27: 395.

Ryaas, J., Storro, I., Svendsen, H., Levine, D.W. 1995. The effective diffusion coefficient and the distribution constant for small molecules in calcium-alginate gel beads. Biotechnology and Bioengineering 47: 492.

Paiva, T.C.B., Sato, S., Visconti, A.E.S., Castra, L.A.B. 1996. Continuous alcoholic fermentation process in a tower reactor with recycling of flocculating yeast. Applied Biochemistry and Biotechnology 57-58(0): 55.

Pajunen, E., Makinen, V., Gisler, R. 1987. Secondary fermentation with immobilized yeast. European Brewery Convention Congress, Madrid 441.

Parascandola, P., de Alteriis, E. 1996. Pattern of growth and respiratory activity of Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells growing entrapped in an insolubilized gelatin gel. Biotechnology and Applied Biochemistry 23: 7.

Perry, R.H., Green, D.W. 1984. Perry’s ChemicalEngineers’Handbook. New York: McGraw-Hill Book Company.

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A. 1998a. Mass transfer characteristics of immobilized cells used in fermentation processes. Criticai Reviews in Biotechnology 18 (2 & 3): 237.

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A., Russell, I. 1998b. Fundamentals of immobilized yeast cells for continuous beer fermentation: a review. Journal of the Institute of Brewing 104: 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobczak, J., Hancock, I., Russell, 1.1999. Kappa-carrageenan gel immobilization of lager brewing yeast. Journal of the Institute of Brewing 105(6): 398.

Polson, A. 1950. Some aspects of diffusion in solution and a definition of a colloidal partide. Journal of Physical and Colloidal Chemistry 54: 649.

Power, D.A., McCuen, P. J. 1988. Manual of BBL® Products and Laboratory Procedures, Sixth Edition. Maryland: Becton Dickinson Microbiology Systems 249.

Priest, F.G., Campbell, 1.1996. Brewing Microbiology 2ndEd., UK: Chapmanand Hali.

Rees, D.A. 1972. Polysaccharide gels: a molecular view. Chemistry and Industry 19: 630.

Roca, E., Camesselle, C., Nunez, M. 1995. Continuous ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae immobilised in Ca-alginate beads hardened with Al³⁺. Biotechnology Letters 9: 815.

Roukas, T. 1994. Continuous ethanol production from carob pod extract by immobilized Saccharomyces cerevisiae in a packed-bed reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 59: 387.

Russell, I., Stewart G.G. 1992. Contribution of yeast and immobilization technology to flavour development in fermented beverages. Food Technology 148.

Ryder, D.S. 1985. The growth process of brewing yeast and the biotechnological challenge. MBAA Technical Quarterly22: 124.

Ryu, D.D., Kim, Y.I., Kim, J.H. 1984. Effect of air supplement on the performance of continuous ethanol fermentation system. Biotechnology and Bioengineering 26: 12.

Salmon, P.M., Robertson, C.R. 1987. Mass transfer limitations in gel beads containing growing immobilized cells. Journal of Theoretical Biology 125: 325.

Schunmpe, A., Quicker, G., Deckwer, W.-D, 1982. Gas solubilities in microbial cultura media. Advances in Biochemical Engineering 24: 1.

RO 122457 Β1

Shindo, S., Sahara, H., Koshino, S. 1994. Suppression of alpba-acetolactateformation 1 in brewing with immobilized yeast. Journal of the Institute of Brewing 100: 69.

Smart, K.A. 1995. The importance of the brewing yeast cell wall. Brewers’ Guardian 3 124(4): 44.

Smart, K.A. 1999. Ageing in brewing yeast. Brewers’ Guardian 19. 5

Smart, K.A., Chambers, K.M., Lambert, I., Jenkins, C. 1999. Use of methylene violet proceduresto determine yeast viability and vitality. Journal ofthe American Society of Brewing 1

Chemists 57(1): 18.

Sharpe, F.R. 1988. Assessment and control of beer flavour. Journal of the Institute 9 of Brewing 95: 301.

Stewart, G.G. 1977. Fermentation--yesterday, today and tomorrow. MBAA Technical 11 Quarterly 14: 1.

Stewart, G.G., Russell, 1.1986. The relevance ofthe flocculation properties of yeast 13 in today’s brewing industry. European Brewery Convention Symposium on Brewers’ Yeast, Helsinki 53. 15

Stewart, G.G., Lyness, A., Younis, 0.1999. The control of ester synthesis during wort fermentation. MBAA Technical Quarterly 36(1): 61. 17

Takahashi, S. and Kimutra, Y. 1996. Effectof main fermentation parameters on stale flavour. Brauwelt International 14(3): 253. 19

Taylor, D.G. 1989. Influence of brewhouse practice on wort composition. Brewer’s Guardian 118(2): 30. 21

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (ASBC). 1992. Methods of Analysis. 8^th Edition. Minnesota: ASBC. 23

Uttamlal, M., Walt, D.R. 1995. A fiber-optic carbon dioxide sensor for fermentation monitoring. Biotechnology 13: 597. 25

Venâncio, A., Teixeira, J.A. 1997. Characterization of sugar diffusion coefficients in alginate membranes. Biotechnology Techniques 11: 183. 27

Vilachâ, C, Uhlig, K. 1985. The measurement of low levels of oxygen in bottled beer. Brauwelt International 70. 29

Virkajarvi, I., Kronlof, J. 1998. Long-term stability of immobilized yeast columns in primary fermentation. Journal ofthe American Society of Brewing Chemists 56(2): 70. 31

Vives, C., Casas, C., Gfidia, F., Solr, C. 1993. Determination ofthe intrinsicfermentation kinetics of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized in calcium alginate beads and 33 observation on their growth. Applied Microbiology and Biotechnology 38: 467.

Wada, M., Kato, J., Chibara, 1.1979. Anewimmobilizationofmicrobialcells. European 35 Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 8: 241.

Wang, H.Y., Lee, S.S., Takach, Y., Cawthon, L. 1982. Maximizing microbial cell load- 37 ing in imobilized-cell systems. Biotechnology and Bioengineering Symp. No. 12 139.

Westrin, B.A., Axelsson, A. 1991. Diffusion in gels containing immobilized cells: a 39 criticai review. Biotechnology and Bioengineering 38: 439.

Wheatcroft, R., Lim, Y.M., Hawthorne, D.B., Clarke, B.J., Kavanagh, T.E. 1988. An 41 assessment of the use of specific oxygen uptake measurements to predici the fermentaion performance of brewing yeasts. The Institute of Brewing (Australia and New Zealand Section) 43

Proceedings of the Twentieth Convention, Brinsbane 193.

White, F. H., Portno, A.D. 1978. Continuous fermentation by immobilized brewers 45 yeast. Journal ofthe Institute of Brewing 84: 228.

Wijffels, R.H., de Gooijer, C.D., Schepers, A.W., Tramper, J. 1996. Immobilized-cell 47 growth: diffusion limitation in expanding micro-colonies. In: Progress in Biotechnology II,

Immobilized Cells: Basics and Applications Ed. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M., Bucke, C., 49

Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 249.

RO 122457 Β1

Wijffels, R.H., Englund, G., Hunik, J.H., Leenen, J.T.M., Bakketun, A. și colab. 1995. Effects of diffusion limitation on immobilized nitrifying microorganisms at lowtemperatures. Biotechnology and Bioengineering 45: 1.

Aivasidis, A., 1996. Another Look at Immobilized Yeast Systems. Cerevisia Belgian Journal ofBrewing & Biotechnology, 21, 27.

Aivasidis, A., Wandrey, C., Eils, H.-G. & Katzke, M., 1991. Continuous Fermentation of Alcohol-Free Beerwith Immobilized Yeast in Fluidized Bed reactors. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Lisbon, 1991, 569.

Akiyama-Jibiki. M., Ishibiki, T., Yamashita, H. & Eto, M., 1997. A Rapid and Simple Assayto Measure Flocculation in Brewer’s Yeast. Mașter Brewers of the Americas Technical Quarterly, 34, 278.

Alfa Laval Brewery Systems, 1997. Immobilized Yeast System Reduces Maturation Time. Brewers’ Gurardian, 126, 26.

Alfa Laval Brewery Systems, 1996. Continuous Maturation of Beerwith Immobilized Yeast, Company Report.

Al Taweel, A.M. & Walker, L.D., 1983. Liquid Dispersion in Static ln-line Mixers. Canadian Journal of Chemical Engineering, 61, 527.

Andries, M., Derdelinckx, G., lone, K.G., Delvaux, F., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1997a. Zeolites as Catalysts for the Cold and Direct Conversion of Acetolactate into Acetoin. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Maastricht, Poster 48.

Andries, M., Van Beveren, P.C, Goffin, O. & Masschelein, C.A., 1995. Design of a MultiPurpose Immobilized Yeast Bioreactor System for Application in the Brewing Process. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 134.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., & Masschelein, C.A., 1996a. Design and Application of an Immobilized Loop Bioreactor for Continuous Beer Fermentation, in Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels, R.M. Buitelaar, C. Bucke & J. Tramper, eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 672.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1996b. Design and Applications of an Immobilized Loop Bioreactor to the Continuous Fermentation of Beer. Proceedings of the &^h International Brewing Technology Conference, Harrogate, 380.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997b. Practicai Results Using the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentation System. Brewers’ Guardian, 26.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997c. First Results on Semi-lndustrial Continuous Fermentation with the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentor. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly. 34,119.

Argiriou, T., Kanellaki, M., Voliotis, S. & Koutinas, A.A., 1996. Kissiris-Supported Yeast Cells: High Biocatalyic Stability and Productivity Improvement by Successive Preservatives at 0°C. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 44, 4028.

Audet, P. & Lacroix, C., 1989. Two Phase Dispersion Process for the Production of Biopolymer Gel Beads: Effects of Barious Parameters on Bead Size and their Distribution. Process Biochemistry, 24, 217.

Axelsson, A. & Persson, B., 1988. Determination of Effective Diffusion Coefficients in Calcium Alginate Gel Plates with Varying Yeast Cell Content. Applied Biochemistry and

Biotechnology, 18, 231.

RO 122457 Β1

Bardi, B.P., Koutinas, A.A., Soupioni, M.J. & Kanellaki, M.E., 1996. Immobilization 1 of Yeast on Delignified Cellulosic Material for Low Temperature Brewing. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 463. 3

Berkman, P.D. &Calabrese, R.V., 1988. Dispersion of Viscous Liquids by Turbulent Flow in a Static Mixer. American Institute of Chemical Engineering Journal. 34, 602. 5

Borremans, E., 1997. Secondary Fermentation of Beer with Immobilized Yeast Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 33. 7

Bower, J.L. &Christensen, C.M., 1995. Disruptive Technologies: Catching the Wave. Harvard Business Review, 73, 43. 9

Breitenbucher, K. & Mistler, M., 1995. Fluidized Bed Fermenters for the Continuous Production of Non-Alcoholic Beer with Open-Pore Sintered Glass Carriers. European Brewery 11

Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 77. 13

Brewers Association of Canada, 1988. About Beer And The Brewing Industry, Ottawa, Ontario. 15

Broderick, Harold M., 1979. The Practicai Brewer: A Manual forthe Brewing Industry,

2nd Ed. Impressions Inc., Wisconsin. 17

Burns, J. A., 1937. Journal of the Institute of Brewing, 43, 31.

Calleja, G.B. & Johnson, B.F., 1977. A Comparison of Quantitative Methods for 19 Measuring Yeast Flocculation. Canadian Journal of Microbiology, 23, 68.

Carberry, J.J., 1976. Chemical and Catalytic Reaction Engineering, McGraw-Hill. 21

Carberry, J.J.&Varma, A., 1987. Chemical Reaction and Reactor Engineering, Marcel Dekker Inc., New York. 23

Cashin, M.-M., 1996. Comparative Studies of Five Porous Supports for Yeast Immobilization by Adsorption/Attachment. Journal of the Institute of Brewing, 102, 5. 25

Champagne, C.P., 1994 OverView: Imbobilized Cell Technology in Food Processing. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV. Quebec, Canada, 33. 27

Chang, CM., Lu, W.J., Own, K.S. & Hwang, S.J., 1994. Comparison of Airlift and Stirred Tank Reactors for Immobilized Enzyme Reactions. Process Biochemistry, 29, 133. 29

Chao, X., Ye, G. & Shi, S., 1990. Kinetic Study of the Continuous Fermentative Process of Green Beer Production with Immobilized Yeast. Huagong Jixie, 17, 18. 31

Chibata, I., 1979. Immobilized Microbial cells with Polyacrylamide Gel and Carrageenan and their Industrial Applications. American Chemical Society Series, 106,187. 33

Chisti, M.Y., 1991. Airlift Bioreactors, Elsevier Applied Science, New York.

Chisti, Y. & Moo-Young, M., 1993. Improve the Performance of Airlift Reactors. 35 Chemical Engineering Progress, 6, 38.

Chladek, L., Voborsky, J., Sima, J. & Hosek, Z., 1989. Prumysl Potravin, 40, 590. 37

Coe, H.S. &Clevenger, G.H., 1916. Methods for Determining the Capacities of Slime Thickening T anks. Transcripst of the American Institute of Mechanical Engineering, 55, 356. 39

Curin, J., Pardonova, B., Polednikova, M., Sedova, H. & Kahler, M., 1987. Beer Production with Immobilized Yeast. Proceedings of the European Brewery Convention, 41

Madrid, 433.

Decamps, C. & Norton, S., 1994. New Emulsion Process using Static Mixer for the 43 Production of K-Carrageenan Gel Beads. Labatt Breweries of Canada Internai Report.

Del Pozo, M., Briens, C.L. & Wild, G., 1994. Effect of Liquid Coalescing Properties 45 on Mass Transfer, Heat Transferând Hydrodynamics in a Three-Phase Fluidized Bed. The Chemical Engineering Journal, 55, 1. 47

RO 122457 Β1

Dillenhofer, W. & Ronn, D., 1996a. Alfa Laval/Schott System of Secondary Fermentation with Immobilized Yeast. Brewing & Distilling International, 27, 35.

Dillenhofer, W. & Ronn, D., 1996b. Secondary Fermentation of Beer With Immobilized Yeast. Brauwelt International, 14, 344.

Dillenhoffer, W. & Ronn, D., 1996c Continuous Maturation of Beer. Beverage World International, 34.

Domeny, Z., Smogrovicova, D., Gemeiner, P., Malovikova, A. & Sturdik, E., 1996. Calcium Pectate Gel to Immobilize Yeast for Continuous Beer Production. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group V. Potsdam, Germany, Poster 12.

Domingues, L., Lima, N. &Teixeira, J.A., 2000. Contamination of a High-Cell-Density Continuous Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, 68, 584.

Donnelly, D., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Mașter Brewers Association of the Americas Annual Convention, Minneapolis, Poster 8.

Donnelly, D., Bergin, J., Gardiner, S. & Cahill, G., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36, 183.

Dulieu, C., Boivin, P., Malanda, M., Dautzenberg, H. & Poncelet, D., 1997. Encapsulation of α-Acetolactate Decarboxylase to Avoid Diacetyl Formation. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Maastricht, Poster 44.

Duncombe, D., Bower, P., Bromberg, S., Fehring, J., Lau, V. & Tata, M., 1996. The Contribution of Free Cells in an Immobilized Yeast System. Journal of the American Society of Brewing Chemists, Poster Presentation.

Dziondziak, K. &Seiffert, T., 1995. Process forthe Continuous Production of AlcoholFree Beer. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 301.

Enari, T.-M., 1995. State oftheArt of Brewing Research. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 1.

Fix, G., 1989. Principles of Brewing Science. Brewers Publications, USA.

Fouhy, K. & Parkinson, G., 1996. Brewers BreakwithTradition. ChemicalEngineering, 103, 45.

Gil, G.H., 1991. Continuous Ethanol Production in a Two-Stage, Immobilized and Suspended Cell Bioreactor (Alcohol Dehydrogenase). Ph.D. Thesis, Georgia Institute of Technology.

Gilliland, R.B., 1951. The Flocculation Characteristics of Brewing Yeasts During Fermentation. Proceedings of the European Brewing Convention, 8, 35.

Groboillot, A., D.K. Boadi, D. Poncelet & Neufeld, R.J., 1994. Immobilization of Cells for Application in the Food Industry. Criticai Reviews in Biotechnology, 14, 75.

Haikara, A., Virkajarvi, I, Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Microbial Contaminations in Immobilized Yeast Bioreactors for Primary Fermentations. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 439.

Heggart, H.M., Margaritis, A., Pilkington, H., Stewart, R. J., Dowhanick, T.M. & Russell,

I., 1999. Factors Affecting Yeast Viability and Vitality Characteristics: A Review. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36, 383.

Heijnen, J.J., Mulder, A., Enger, W. & Hocks, F., 1989. Review on the Application of

Anaerobic Fluidized Bed Reactors in Waste-Water Treatment. The Chemical Engineering

Journal, 41, B 37.

RO 122457 Β1

Heijnen, J.J., Mulder, A., Weltevrede, R., Hols, J. & van Leeuwen, H.L.J.M., 1991. 1

Large Scale Anaerobic-AerobicTreatment of Complex Industrial Waste-Water Using Biofilm Reactors. Water Science Technology, 23, 1427. 3

Heijnen, J.J., Van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R.W.R. & Mulder, A., 1993. Developmentand Scale-Upof an Aerobic Biofilm Air-LiftSuspension Reactor. Water Science 5

Technology, 27, 253.

Helm, E., Nohr, B. &Thorne, R.S.W., 1953. The Measurement ofYeast Flocculence 7 and its Significance in Brewing. Wallerstein Laboratories Communications, 16, 315.

Horitsu, H., Wang, M.Y. & Kawai, K., 1991. A Modified Process for Soy Sauce 9 Fermentation by Immobilized Yeasts. Agricultural and Biologica! Chemistry, 55, 269.

Hryclik, Kevin, Gerry Ginter, Jim Helmke, & Jim Spiers, 1987. The How’sAnd Why’s 11 of Brewing, Revision #2, LBOC.

Hunik, J.H., Tramper, J. & Wijffels. R H., 1994. A Strategy to Scale Up Nitrification 13 Processes with Immobilized Cells of Nitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis. Bioprocess Engineering, 11, 73. 15

Hwang, S.-J. & Fan, L.-S., 1986. Some Design Considerations of a DraftTube GasLiquid-Solid Spouted Bed. The Chemical Engineering Journal, 33, 49. 17

Hyttinen, I., Kronlof, J. &Hartwall, P., 1995. Use of Porous Glass at Hartwall Brewery in the Maturation of Beer with Immobilized Yeast. European Brewery Convention Symposium: 19

Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 55.

Ibrahim, Y.A.A., Briens. C.L., Margaritis, A. & Bergougnou, M. A., 1996. Hydrodynamic 21 Characteristics of a Three-Phase Inverse Fluidized Bed Column. Journal of the American Institute of Chemical Engineering, 42, 1889. 23

Inoue, T., 1995. DevelopmentofaTwo-Stage Immobilized Yeast Fermentation System for Continuous Beer Brewing. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 25

Brussels, 25.

Iserentant, D., 1995. Beers: Recent Technological Innovationsin Brewing. Fermented 27 Beverage Production. (A.G.H. Lea & J.R. Piggott, eds.) London: Chapman& Hali, 45.

Kaplan, R.S. & Norton, D.P., 1996. The Balanced Scorecard. Presidentand Fellows 29 of Harvard College, Harvard Business School Press, Massachusetts, USA.

Karamanev, D.G., Nagamune, T. &Endo, I., 1992. Hydrodynamic and Mass Transfer 31 Study of a Gas-Liquid-Solid Draft Tube Spouted Bed Bioreactor. Chemical Engineering Science, 47, 3581. 33

Karel, S.F., Libicki, S.B. & Robertson, C.R., 1985. The Immobilization ofWhole Cells: Engineering Principles. Chemical Engineenng Science, 40, 1321. 35

Katzbauer, B., Narodoslawsky, M. & Moser, A., 1995. Classification System for Immobilization Techniques. Bioprocess Engineering, 12, 173. 37

Kennard, M. & Janekeh, M., 1991. Two- and Three-Phase Mixing in a Concentric Draft Tube Gas-Lift Fermentor. Biotechnology and Bioengineering, 38,1261. 39

Kolot, F.B., 1988. Immobilized Microbial Systems: Principles, Techniques and Industrial Applications. Robert E. Krieger Publishing Company, Florida. 41

Kolpachki, A.P., Isaeva, V.S., Kazantsev, E.N. & Fertman, G.I., 1980. Intensification of Wort Fermentation with Immobilized Yeasts. Fermentnaya I Spirtovaya Promyshlennost, 9. 43

Krikilion, Ph., Andries, M., Goffin, O., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1995. Optimal Matrix and Reactor Design for High Gravity Fermentation with Immobilized Yeast. 45

Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 419.

Kronlof, J., 1994. Immobilized Yeast in Continuous Fermentation of Beer. Ph.D. 47 Thesis, VTT Publications, 167.

RO 122457 Β1

Kronlof, J., Linko, M. & Pajunen, E., 1995. Primary Fermentation with a Two-Stage Packed Bed System Pilot Scale Experiences. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 118.

Kronlof, J. & Virkajarvi, I., 1996. Main Fermentation with Immobilized Yeast--Pilot Scale European Brewery Convention Brewing Science Group Bulletin, Zoeterwoude, 94.

Kronlof, J., Virkajarvi, L, Storgards, E.L., Londesborough, J. & Dymond, G., 2000. Combined Primary and Secondary Fermentation with Inmmobilized Yeast World Brewing Congress, Poster #56.

Ku, W. Y., 1982. Fermentation Kinetics for the Production of Ethanol by Immobilized Yeast Cells (Biomass). Ph.D Thesis, The Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College.

Kunze, W., 1999. Technology Brewing and Malting. VLB Berlin, Germany.

Kynch, G.J. 1952. Transcripts of the Faraday Society, 48, 166.

Lacroix, C., Paquin, C. & Arnaud, J.P., 1990. Batch Fermentation with Entrapped Growing Cells of Lactobacillus casei: Optimization of the Rheological Properties of the Entrapment Gel Matrix. Applied Microbiology and Biotechnology, 32, 403.

Levenspiel, O., 1972. Chemical Reaction Engineering. John Wiley & Sons, New York.

Linko, M, Virkajaivi, I., Pohjala, N., Lindborg, K., Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Main Fermentation with Immobilized Yeast--A Breakthrough?. Proceedings of the European Brewery Convention, Maastricht, 385.

Livingston, A.G. & Chase, H.A., 1990. Liquid-Solid Mass Transfer in a Three Phase DraftTube Fluidized Bed Reactor. Chemical Engineering Communications, 92, 225.

Livingston, A.G. &Zhang, S.F., 1993. HydrodynamicBehaviourofThree-Phase (GasLiquid-Solid) Airlift Reactors. Chemical Engineering Science, 48, 1641.

Lommi, H., 1990. Immobilized Yeast for Maturation and Alcohol-Free Beer. Brewing and Distilling International, 21, 23.

Lommi, H., Gronqvist, A., & Pajunen, E., 1990. Immobilized Yeast Reactor Speeds Beer Production. Food Technology, 5, 128.

Lorenzen, K., 1996. Immobilized Yeast Plants for Alcohol-Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Singapore, 244.

Maeba, FL, Umemoto, S., Sato, M. & Shinotsuka, K., 2000. Primary Fermentation with Yeast Immobilized in Porous Chitosan Beads-Pilot Scale Trial. Proceedings of the 26^th Convention of the Institute of Brewing - Asia Pacific Section, 82.

Mafra, I., Machado Cruz. J.M. & Teixeira, J.A., 1997. Beer Maturation in a Continuously Operating Bioreactor using a Flocculating Brewer's Yeast Străin. Proceedings of the European Brewery Convention, 509.

Maiorella, B.L., 1983. Fermentative Ethanol Production (Alcohol, Distillation, Economics). Ph.D Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., 1975. A Study of the Rotorfermentor and the Kinetics of Ethanol Fermentation. Ph.D. Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., & Bajpai, P., 1982a. Continuous Ethanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part I. Use of Free Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology and Bioengineering, 24, 1473.

Margaritis, A., & Bajpai, P, 1982b. Continuous Ethanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part II. Use of Immobilized Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology and Bioengineering, 24, 1483.

Margaritis, A. & Merchant, F., 1984. Advances in Ethanol Production Using Immobilized Cell Systems. Criticai Reviews in Biotechnology, 1, 339.

RO 122457 Β1

Margaritis, A. & Rowe, G. E., 1983. Ethanol Production Using Zymomonas mobilis 1 Immobilized in Different Carrageenan Gels. Developments in Industrial Microbiology, 24,329.

Margaritis, A., to Bokkel, D. & El Kashab, M., 1987. Repeated Batch Fermentation 3 of Ethanol Using Immobilized Cells of Saccharomyces cerevisiae in a Fluidized Bioreactor System. Biological Research on Industrial Yeasts. Volume /, (G.G. Stewart, I. Russell, R.D. 5 Klein & R.R. Hiebsch, eds.) Boca Raton: CRC Press, 121.

Margaritis, A. & Wallace, J.B., 1982. The Use of Immobilized Cells of Zymomonas 1 mobilis in a Novei Fluidized Bioreactor to Produce Ethanol. Fourth Symposium on Biotechnology in Energy Production and Conservation, Gatlinburg, Tennessee, 12, 147. 9

Margaritis, A. &Wallace, J.B., 1984. Novei Bioreactor Systems and their Applications,

Bio/Technology, 2, 447. 11

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978a. The Rotorfermentor. Part I: Description of the Apparatus, Power Requirements, and Mass Transfer Characteristics. Biotechnology & 13

Bioengineering, 20, 709.

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978b. The Rotorfermentor: Part II: Application to Ethanol 15

Fermentation. Biotechnology & Bioengineering, 20, 727.

Masschelein, C.A., 1997. A Realistic View on the Role of Research in the Brewing 17 Industry Today. Journal of the Institute of Brewing, 103, 103.

Masschelein, C.A., 1994. State-of-the-Art and Future Developments in Fermentation. 19

Journal of the American Society of Brewing Chemists, 52, 1.

Masschelein, C.A. & Andries, M., 1996a. The Meura-Delta Immobilised Yeast 21 Fermenter for the Continuous Production of Beer. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 28. 23

Masschelein, C.A. &Andries, M., 1996b. Meura-Delta’s Immobilized Yeast Fermenter for Continuous Beer Production. Brewing & Distilling International, 27,16. 25

Masschelein, C.A., Andries, M., Franken, F., Van de Winkel, L. & Van Beveren, P.C.,

1995. The Membrane Loop Concept: A New Approach for Optimal Oxygen Transfer into High 27

Cell Density Pitching Yeast Suspensions. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 377. 29

Masschelein, C.A., Ryder, D.S. & Simon, J-P., 1994. Immobilized Cell Technology in Beer Production. Criticai Reviews in Biotechnology, 14, 155. 31

Matsuura, K., Hirotsune, M., Nakada, F. & Hamachi, M., 1991. A Kinetic Study on Continuous Sake Fermentation. Hakkokogaku Kaishi, 69, 345. 33

McCabe, J.T., 1999. The Practicai Brewer: A Manual forthe Brewing Industry. Mașter Brewers Association of the Americas, USA. 35

Mensour, N.A., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1997. New Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Cell Bioreactor Systems. 37

Journal of the Institute of Brewing, 103, 363.

Mensour, N.A., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1996. 39

Application of Immobilized Yeast Cells in the Brewing Industry. Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels, R.M. Buitelaar, C. Bucke&J. Tramper, eds.) Amsterdam: Elsevier 41 Science, 661.

Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I, 1995. Gas Lift 43 Systems for Immobilized Cell Fermentation. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 125. 45

Mensour, N., Margaritis, A., Russell, I., Briens, C. L., Decamps, C. & Norton, S., 1994.

Beer Production with Immobilized Yeast Cells in a Pilot Plant Scale Airlift Reactor. 47

Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV, Quebec, Canada, 49.

RO 122457 Β1

Middleman, S., 1974. Drop Size Distributions Produced by Turbulent Pipe flow of Immiscible Fluids Through a Static Mixer. Industrial Engineering and Chemical Process Design and Development, 13, 78.

Mieth, H.O., 1995. Immobilized Yeast Plants for Alcohol Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Victoria Falls, 166.

Mistler, M., Breitenbucher, K. & Jaeger, R., 1995. Continuous Fermentation of Beer with Yeast Immobilized on Porous Glass Carriers. Brewers Digest, 70, 48.

Moli, M. &Duteurtre. B., 1996. Fermentation and Maturation of Beerwith Immobilized Microorganisms. Brauwelt International, 3, 248.

Moțai, H., Hamada, T. & Fukushima, Y., 1993. Application of a Bioreactor System to Soy Sauce Production. In Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 315.

Muhr, A.H. & Blanchard, M.V., 1982. Diffusion in Gels. Polymer, 23, 1012.

Mwesigye, P.K. & Barford, J.P., 1994. Transport of Sucrose by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 77, 687.

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A. & Mitsui, S., 1993. Beer Brewing Using an Immobilized Yeast Bioreactor System. In Industrial Applications of immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 275.

Nakanishi, K.,T. Onaka.T. Inoue&Kubo, S., 1985. A New Immobilized Yeast Reactor System for Rapid Production of Beer. Proceedings of the 2Cf^h European Brewing Convention Congress, Helsinki, 331.

Nakatani, K.,Takahashi,T., Nagami, K. &Kumada, J., 1984. KineticStudyofVicinal Dikerones in Brewing (I) Formation of Total Vicinal Diketones. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Committee, 21, 73.

Nedovic, V.A., Leskosek-Cukalovic, I. & Vunjak-Novaki, G., 1996a. Short-Time Fermentation of Beer in an Immobilization Yeast Air-Lift Bioreactor. Proceedings of the institute of Brewing Convention, Singapore, 244.

Nedovic, V.A., Vunjak-Novakovic, G., Leskosek-Cukalovic, I. & Cutkovic, M., 1996b. A Study on Considerably Accelerated Fermentation of Beer Using an Airlift Bioreactor with Calcium Alginate Entrapped Yeast Cells. Proceedings of the 5^th World Congress of Chemical Engineering, San Diego, 474.

Neufeld, R.J., Norton, S. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead Production and a Brewing Process Utilizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells. Canadian Patent Application 2,133,789.

Nguyen, A.L. & Luong, J.H.T., 1986. Diffision in k-Carrageenan Gel Beads. Biotechnology and Bioengineering, 28, 1261.

Nielsen, J. & Villadsen, J., 1994. Bioreactor Modeling. Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, New York, 9.

Norton, S. & D’Amore, T., 1994. Physiological Effects of Yeast Cell Immobilization: Applications for Brewing. Enzyme and Microbial Technology, 16, 365.

Norton, S., Neufeld, R.J. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead Production and a Brewing Process Utilizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells. Canadian Patent Application 2,133,789.

Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Decamps, C. & Russcll, I., 1994. Pilot Scale Primary Fermentation of Beer with a Gaslift Immobilized Yeast Reactor. Proceedings of the European Brewing Convention, Sub-Commiltee, Dublin.

Norton, S., Watson, K. & D’Amore, T., 1995. Ethanol Tolerance of Immobilized Brewers’ Yeast Cells. Applied Microbiology & Biotechnology, 43, 18.

RO 122457 Β1

Nothaft, A., 1995. The Start-Up of an Immobilized Yeast System for Secondary 1 Fermentation at Brahma. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 41. 3

Nunokawa, Y. &Hirotsune, M., 1993. ProductionofSoftSake byan Immobilized Yeast Reactor System. In Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa 5 & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 235.

Pajunen, E., 1996a. The Behaviour of Immobilized Yeast Cells. Cerevisia Belgian 7 Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 33.

Pajunen, E., 1996b. Immobilized System in the Brewing Industry. Proceedings of the 9 Institute of Brewing Convention, Singapore, 38.

Pajunen, E., 1995. Immobilized Yeast Lager Beer Maturation: DEAE-Cellulose at 11 Sinebrychoff. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 24. 13

Pajunen E. &Gronqvist A., 1994 Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Lager Beer Maturation. Proceedings for the Institute of Brewing Convention, Sydney, 101. 15

Pajunen, E., A. Gronqvist & Lommi, H., 1989. Continuous Secondary Fermentation and Maturation of Beer in an Immobilized Yeast Reactor. MBAA Technical Quarterly, 26,147. 17

Pajunen, E., Gronqvist, A., Simonsen, B. & Lommi, H., 1994. Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Lager Beer Maturation. ALAFACE Annual Meeting, Quito, 13. 19

Pajunen, E., Ranta, B., Andersen, K., Lommi, H., Viljava, T., Bergin, J. & Guercia, H.,

2000a. Novei Process for Beer Fermentation with Immobilzed Yeast. Proceedings of the 26^th 21

Convention of the Institute of Brewing. Asia-Pacfic Section, 91.

Pajunen E., Viljava, T. & Lommi, H., 2000b. Novei Primary Fermentation with 23 Immobilzied Yeast System. World Brewing Congress, Oral presentation.

Paul, F. & Vignais, P.M., 1980. Photophosphorylation in Bacterial Chromatophores 25 Entrapped in Alginate Gel: Improvement of the Physical and Biochemical Properties of Gel Beads with Barium as Gel-lnducing Agent. Enzyme and Microbial Technology, 2, 281. 27

Peach, M., 1996. Fermenting Faster Pints. New Scientist, 2058, 23.

Pilkington, P.H, Margaritis, A. &Mensour, N.A., 1998a. Mass Transfer Characteristics 29 of Immobilized Cells Used in Fermentation Processes. Criticai Reviews in Biotechnology,

18,237. 31

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A. & Russell I., 1998b. Fundamentale of Immobilized Yeast Cells for Continuous Beer Fermentation: A Review. Journal of the Institute 33 of Brewing, 104, 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobezak, J., Hancock, I. & Russell, I., 1999. 35

Kappa-Carrageenan Gel Immobilization of Lager Brewing Yeast. Journal of the Institute of Brewing, 105, 398. 37

Pirt, S.J., 1975. PrinciplesofMicrobeand CellCultivation, Blackwell Scientific, Oxford.

Pittner, H. & Back, W., 1995. Continuous Production of Acidified Wortfor Alcohol Free 39

BeerUsing Immobilized Lactic Acid Bacteria. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 32, 163. 41

Pittner, H., W. Back, W. Swinkels, E. Meersman, B. van Dieren & Lommi, H., 1993.

Continuous Production of Acidified Wort for Alcohol-Free Beer Using Immobilized 43 Lactic Acid Bacteria. Proceedings of the 24^th European Brewing Convention Congress,

Oslo, 323. 45

Polednikova, M., Sedova, H. & Kahler, M., 1981. Immobilized Brewing Yeast. Kvasny Prumysl, 27, 193. 47

RO 122457 Β1

Poncelet, D., Lencki, R., Beaulieu, C., Halle, J., P., Neufeld, R. J. & Fournier, A., 1992. Production of Alginate Beads by Emulsification/lnternal Gelation. Applied Microbiology & Biotechnology, 38, 39.

Poncelet, D., Poncelet de Smet B., Beaulieu, C. & Neufeld, R. J., 1993. Scale Up of Gel Bead and Microcapsule Production in Cell Immobilization. In Fundamentate of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, Goosen, M.F.A., Ed., CRC Press Inc., Boca Raton, Florida.

Prakash, A., Briens, C.L. & Bergougnou, M.A., 1987. Mass Transfer Between Solid Particles and Liquid in a Three Phase Fluidized Bed. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 65, 228.

Prasad, K.Y. &Ramanujarn,T.K., 1995. Overall Volumetric Mass Transfer Coefficient in a Modified Reversed Flow Jet Loop Bioreactor with Low Density Particles. Bioprocess Engineering, 12, 214.

Pritchett, Price. 1993. Culture Shift. Texas: Pritchett & Associates, Inc.

Que. F., 1993. Using a Thread Type of Alginate Gel Particles as Cell-lmmobilised Support and Some Concept of Packed Bed Fermenter Design. Biotechnology Techniques, 7, 755.

Rajotte, P., 1998. Continuous Fermentation with Immobilized Yeast Cells. American Brewer, 76, 42.

Rajotte, P., 1997. Jumping into the Next Millenium Canadian Style. American Brewer,

75, 42.

Russell, I., Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A. & Briens, C., 1995. Immobilized Yeast Cells: Applications for Brewing. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Victoria Falte, 159.

Ryder, D.S. & Masschelem, C.A., 1985. The Growth Process of Brewing Yeast and the Biotechnological Challenge. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 43,66.

Satterfield, C.N., 1970. Mass Transfer in Heterogeneous Catalysts, MIT Press, Cambridge.

Scott, J.A., O’Reilly, A.M. & Kirkhope, S., 1995. A Fibrous Sponge Matrix to Immobilized Yeast for Beverage Fermentations. Biotechnology Techniques, 9, 305.

Shindo, S. &Kamimur, M., 1990. Immobilization of Yeast with HoilowPVAGel Beads. Journal of Fermentation and Bioengineering, 70, 232.

Shindo, S., Sahara, H. & Koshino, S., 1994a. Suppression of α-Acetolactate Formation in Brewing with Immobilized Yeast. Journal of the Institute of Brewing, 100, 69.

Shindo, S., Sahara, H., Koshino, S. &Tanaka, H., 1993. Control of Di acetyl Precursor [α-acetolactate] Formation During Alcohol Fermentation with Yeast Cells Immobilized in Alginate Fiberswith DoubleGel Layers. Journal of Fermenlation and Bioengineering, 76,199.

Shindo, S, Sahara, S, Watanabe, N. & Koshino, S., 1994b. Main Fermentation with Immobilized Yeast Using Fluidized-Bed Reactor. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Sydney, 109.

Sinitsyn, A.P., Rajnina, E.I., Efremov, A.B., Gracheva, I.M. & Gemet, M.V., 1986. Fermentation of Hydrolysed Mash by Yeasts Immobilized on Borosilicate Carriers. Fermentnaya I Spirtovaya Promyshlennost, 31.

Smogrovicova, D. & Domeny, Z., 1999. Beer Volatile By-Product Formation atDifferent Fermentation Temperature using Immobilized Yeasts. Process Biochemistry, 34, 785.

Smogrovicova, D., Domeny, Z. Gemeiner, P. Malovikova, A. & Sturdik, E., 1997. Reactors for Continuous Primary Beer Fermentation using Immobilized Yeast, Biotechnology Techniques, 11, 261.

RO 122457 Β1

Sodini, I., Boquien, C.Y., Corrieu, G. & Lacroix, C., 1997. Use of an Immobilized Cell 1 Bioreactor for the Continuous Inoculation of Milk in Fresh Cheese Manufacturing. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 18, 56. 3

Speers, R.A. & Ritcey, L.L., 1995. Towards an Ideal Flocculation Assay. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 174. 5

Stewart, G.G., 1996. Brewing Technology for the Future. The Brewer, 82, 348.

Stewart, G.G. & Russell, I., 2000. Brewer’s Yeast. The Institute of Brewing, England. 7

Stewart, G.G. & Russell, I., 1981. Yeast Flocculation, in Brewing Science, Ed. J.R.A. Pollock, Academic Press, New York. 9

Stratford, M, 1996. Yeast Flocculation: Restructuring the Theories in Line with Recent Research, Cerevisiae Belgium Journal of Biotechnology, 38. 11

Sumino, T., Nakamura, H. & Mori, N., 1993. Development of a High-Efficiency WastewaterTreatment System Using Immobilized Microorganisms. In Industrial Application 13 of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 377. 15

Tata, M., Bower, P., Bromberg, S., Duncombe, D., Fehring, J., Lau, V., Ryder, D. &

Stassi, P. 1999. Immobilized Yeast Bioreactor Systems for Continuous Beer Fermentation. 17 Biotechnology Progress, 15, 105.

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing 19 Chemists. 1992. Methods ofAnalysis. 8^th Edition, Minnesota, ASBC.

Teixera, J.M., Teixera, J.A., Moța, M., Manuela, M., Guerra, B., Machado Cruz, J.M. 21 & Sa Almcida, A.M., 1991. The Influence of Cell Wall Composition of a Brewer’s Flocculent Lager Yeast on Sedimentation During Successive Industrial Fermentations. Proceedings of 23 the European Brewery Congress, 241.

Umemoto, S., Mitani, Y. & Shinotsuka, K., 1998. Primary Fermentation with 25 Immobilized Yeast in a Fluidized Bed Reactor. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 35, 58. 27

Van de Winkel, L., 1995. Design and Optimization of a Multipurpose Immobilized Yeast Bioreactor for Brewery Fermentations. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & 29

Biotechnoloy, 20, 77.

Van de Winkel, L. & De Vuyst, L., 1997. Immobilized Yeast Cell Systems in Today’s 31 Breweries and Tomorrow’s. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 27.

Van de Winkel, L., McMurrough, I., Evers, G., Van Beveren, P. C. & Masschelein, C. 33 A., 1995. Pilot-Scale Evaluation of Silicon Carbide Immobilized Yeast Systems for Continuous Alcohol-Free Beer Production. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast 35 Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 90.

Van de Winkel, L., P.C van Beveren & C.A. Masschelein, 1991a. The Application of 37 an Immobilized Yeast Loop Reactor to the Continuous Production of Alcohol-Free Beer. Proceedings of the 23^rd European Brewing Convention Congress, Lisbon, 577. 39

Van de Winkel. L.P.C. van Beveren, E. Borremans, E. Goosens & C.A. Masschelein,

1991b. High Performance Immobilized Yeast Reactor Design for Continuous Beer 41 Fermentation. Proceedings of the 24^th European Brewing Convention Congress, Oslo, 307.

Van Dieren, B., 1995. Yeast Metabolism and the Production of Alcohol-Free Beer. 43 European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 66. 45

Van lersel, M.F.M., Meersman, E., Swinkels, W., Abee, T. & Rombouts, F.M., 1995.

Continuous Production of Non-Alcohol Beer by Immobilized Yeast at Low Temperature. 47

Journal of Industrial Microbiology, 14, 495.

RO 122457 Β1

Van Loosdrecht, M.C.M. & Heijnen, J.J., 1993. Biofilm Bioreactors for Waste-Water Treatment. Trends in Biotechnology, 11, 117.

Vicente, A.A., Dluhy, M. &Teixeira, J.A., 1999. Increase of Ethanol Productivity in an Airlift Reactorwith a Modified DraughtTube. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 77, 497.

Virkajarvi, I. & Linko, M., 1999. Immobilization: A Revolution in Tradițional Brewing. Naturwissehschaften, 86, 112.

Virkajarvi, I. & Kronlof, J., 1998. Long Term Stability of Immobilized Yeast Columns in Main Fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 56, 70.

Virkajarvi, I. &Pohjala, N., 1999. Profitingfrom Immobilized Fermentation. Proceedings of the &^h Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, 290.

Wackerbauer, K., Fitzner, M. & Gunther. J., 1996a. Technisch-technologische Moglichkeiten mit Immobilisierter Hefe. Brauwelt, 136, 2140.

Wackerbauer, K., Fitzner, M. & Lopsien, M., 1996b. Untersuchungen mitdem Neuen MPI-Bioreaktor-System. Brauwelt, 136, 2250.

Webb, C, G.M. Black & B. Atkinson, 1986. Process Engineering Aspects of Immobilized Cell System. England: The Institution of Chemical Engineers.

Westrin, B.A. & A. Axelsson, 1991. Diffusion in Gels Conținând Immobilized Cells: A Criticai Review. Biotechnology and Bioengineering, 38, 439.

Wu, W.T., Wu, J.Y. & Jong, J.Z., 1992. Mass Transfer in an Airlift Reactorwith a Net Draft Tube. Biotechnology Progress, 8, 465.

Yamnane, T., 1981. On Approximate Expressions of Effectiveness Factors for Immobilized Biocatalysts. Journal of Fermentation Technology, 59, 375.

Yamauchi, Y. & Kashihara, T., 1995a. Kirin Immobilized System. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 99.

Yamauchi, Y., Kashihara, T., Murayama, H., Nagara, A., Okamoto, T. & Mawatari, M., 1994. Scaleupof Immobilized Yeast BioreactorforContinuous Fermentation of Beer. Mașter Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 31, 90.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Amikura, T., Hiratsu, H., Nagara, A., Kamiya, T. & Inoue, T., 1995b. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. I. Heat Conversion of α-Acetolactate. Journal of Biotechnology, 38, 101.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Nagara, A. ĂNoguchi, K., 1995c. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. 2. Balance of Total Diacetyl Reduction and Regeneration. Journal of biotechnology, 38, 109.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A. & Kashihara, T., 1995d. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Sulfite Formation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 277.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M. & Nakanishi K., 1995e. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Balance Control of Extract and Amino Acid Uptake. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 245.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M., Yasui, T. & Nakanishi, K., 1995f. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Minor Products of Carbohydrate Metabolism. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 261.

Yuan, X., 1987. Application of Immobilization Technique in Brewing Industry. Shipin Kexue, 94, 8.

Zhang, Z., Su, E. & Yu, J., 1988. Studies on Continuous and Rapid Fermentation of Beer by Immobilized Yeast. Gongye Weishengwu, 18, 11.

RO 122457 Β1

Rezumatul invenției 1

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru producerea de alcooli potabili, care cuprinde o etapă de fermentație continuă, care este utilizată pentru a inocula mustul cu un 3 inițiator de drojdie și/sau cel puțin a fermenta inițial un must conținând zaharuri fermentabile.

în particular, se furnizează un procedeu preferat în care fermentația continuă este 5 realizată utilizând un bioreactor de tipul cu injecție de gaze, utilizând o tulpină de drojdie floculantă (și în special una foarte floculantă sau superfloculantă) și utilizând un control strict 7 al oxigenului.

într-o formă preferată în particular a prezentei invenții, evacuarea “cel puțin fermentată 9 parțial din procedeul continuu este introdusă într-o etapă de prelucrare în șarje pentru finisare, (care în contextul revendicărilor prezentei invenții poate include - dar nu este limitată 11 la acestea - încheierea procesului de fermentație prin care se fermentează carbohidrați în alcool). 13

Prezenta invenție se referă la producerea de bere, (incluzând în particular tipuri de bere deschisă la culoare, lager, și în special tipuri de bere Nord Americane). în legătură cu 15 aceasta, vezi de exemplu, Essentials of Beer Style - F. Eckhardt.

în procedeul conform revendicării 1 etapa continuă este realizată într-un bioreactor 17 cu gaz comprimat.

în conformitate cu o etapă continuă utilă în diverse practici conform prezentei invenții, 19 este de preferat să se utilizeze celule imobilizate, (spre deosebire de celulele pur libere) și aceasta se poate realiza utilizând una dintre drojdiile imobilizate pe purtător sau floculante. 21 în ciuda celor de mai sus, este de preferat să se utilizeze drojdii floculante în loc de celule imobilizate pe purtător, și în acest scop sunt preferate în special drojdiile superfloculante. 23

Mai multe detalii referitoare la practicile preferate și avantajele asociate cu procedeele continue sunt furnizate în cursul descrierii detaliate a prezentei invenții. Acestea includ 25 utilizarea de amestecuri de gaze artificiale (de exemplu, controlate), utilizarea de azot, dioxid de carbon și oxigen, cât și aer. 27 în plus, aici sunt furnizate mai multe detalii referitoare la etapa de prelucrare de menținere în șarje. Rețineți că în anumite variante de realizare ale prezentei invenții, 29 concentrarea asupra procedeului de menținere în șarje trece mai departe de problemele “încheierii conversiei carbohidraților fermentabili în alcool (care în orice caz poate fi încheiată 31 practic în etapa continuă a prelucrării). în asemenea variante de realizare, grija principală a etapei de prelucrare cu menținere în șarje este potrivirea aromei (sau remedierea), în 33 particular în legătură cu diacetilul și acetaldehida.

Variante preferate de realizare ale prezentei invenții susțin distribuirea mustului 35 inoculat al etapei post continue și/sau cel puțin a mustului fermentat parțial printr-o colector de distribuție (fie ca un colector fix, fie printr-o conductă conectată și deconectată selectiv) 37 între o multitudine de rezervoare colectoare ale șarjei. într-un procedeu de distribuire serial, se umple un rezervor, urmat de următorul, și așa mai departe. într-o variantă de realizare 39 preferată în particular, capacitatea de producție a reactorului continuu și capacitatea de menținere a șarjei corespund în termenii dimensiunii și numărului reactoarelor/vaselor de 41 menținere a șarjei - astfel încât debitul de producție este potrivit în termeni de capacitate față de timp. în mod ideal, un vas de menținere a șarjei este drenat de produsul finit exact la timp 43 pentru a fi curățat, reconectat și apoi reumplut cu evacuarea neîntreruptă din etapa de fermentație continuă. 45 în conformitate cu alt aspect al prezentei invenții, anumite variante de realizare sunt gestionate în mod particular în legătură cu conținutul de oxigen al mustului/berii. Aceasta se 47 aplică atât etapei continue cât și etapei de menținere a șarjei ale procedeului. în legătură cu

RO 122457 Β1 etapa continuă, concentrația de oxigen are o varietate de efecte, dar în mod remarcabil, poate fi de dorit să se minimizeze aceasta pentru a optimiza conversia alcoolilor superiori în esteri activi de aromă. în legătură cu aceasta, se remarcă faptul că concentrațiile de alcooli superiori pot rămâne neafectate în mare măsură de etapa de prelucrare cu menținerea șarjei dacă se dorește aceasta, se utilizează controlul strict al O₂ pentru a gestiona echilibrul aromei de ester de fuzel. Pre-purjarea mustului cu CO₂ înainte de fermentația continuă poate fi utilă în legătură cu aceasta.

într-o variantă de realizare a prezentei invenții, scopul principal al etapei continue de prelucrare este de a asigura inițierea fermentației în șarje în aval care survine în procedeul de menținere în șarje.

Pentru o siguranță mai mare, conținuturile documentelor de prioritate sunt încorporate aici în formă completă și formează o parte a prezentei descrieri ca și cum acestea au fost reproduse aici integral.

Descrierea detaliată

Ceea ce urmează este o descriere detaliată în două părți a aspectelor prezentei invenții.

Descrierea conține și/sau se referă la grafice, formule, figuri și altele asemenea, fiecare dintre acestea fiind referită cu termenul “fig.“ urmat de un număr specific de identificare. în aceste desene, se poate ca articolele ilustrate să nu fie la o scară exactă.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta un procedeu pentru producerea de alcooli potabili în etape de prelucrare de fermentație continuă și în șarje. Procedeul pentru producerea de alcooli potabili, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că se utilizează un bioreactor cu injecție de gaze în care are loc o circulație internă pentru realizarea unei etape de fermentație continuă în care fermentează inițial un must conținând zaharuri fermentabile, prin folosirea de celule de drojdie floculantă imobilizate prin auto-agregare, la o alimentare restricționată cu oxigen și produsul evacuat cel puțin parțial fermentat din procedeul continuu este furnizat într-o etapă de prelucrare în șarje pentru finisare.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- simplificare constructivă a sistemului de producție.

- se obține o băutură de alcooli potabili fără defecte majore de aromă și gust.

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru producerea de alcooli potabili, care cuprinde o etapă de fermentație continuă care este utilizată pentru a inocula mustul cu un inițiator de drojdie și/sau cel puțin a fermenta inițial un must conținând zaharuri fermentabile.

în particular, se furnizează un procedeu preferat în care fermentația continuă este realizată utilizând un bioreactor de tipul cu injecție de gaze, utilizând o tulpină de drojdie floculantă (și în special una foarte floculantă sau superfloculantă) și utilizând un control strict al oxigenului.

într-o formă preferată în particulara prezentei invenții, evacuarea “cel puțin fermentată parțial din procedeul continuu este introdusă într-o etapă de prelucrare în șarje pentru finisare, (care în contextul revendicărilor prezentei invenții poate include - dar nu este limitată la acestea - încheierea procesului de fermentație prin care se fermentează carbohidrați în alcool).

Prezenta invenție se referă la producerea de bere, (incluzând în particular tipuri de bere deschisă la culoare, lager, și în special tipuri de bere Nord Americane). în legătură cu aceasta, vezi de exemplu, Essentials of Beer Style - F. Eckhardt.

Procedeul conform revendicării 1 în care etapa continuă este realizată într-un bioreactor cu gaz comprimat.

RO 122457 Β1 în conformitate cu o etapă continuă utilă în diverse practici conform prezentei invenții, 1 este de preferat să se utilizeze celule imobilizate, (spre deosebire de celulele pur libere) și aceasta se poate realiza utilizând una dintre drojdiile imobilizate pe purtător sau floculante. 3 în ciuda celor de mai sus, este de preferat să se utilizeze drojdii floculante în loc de celule imobilizate pe purtător, și în acest scop sunt preferate în special drojdiile superfloculante. 5

Mai multe detalii referitoare la practicile preferate și avantajele asociate cu procedeele continue sunt furnizate în cursul descrierii detaliate a prezentei invenții. Acestea includ utili- 7 zarea de amestecuri de gaze artificiale (de exemplu, controlate), și utilizarea de azot, dioxid de carbon și oxigen cât și aer. 9 în plus, aici sunt furnizate mai multe detalii referitoare la etapa de prelucrare de menținere în șarje. Rețineți că, în anumite variante de realizare ale prezentei invenții, concentrarea 11 asupra procedeului de menținere în șarje trece mai departe de problemele “încheierii conversiei carbohidraților fermentabili în alcool (care în orice caz poate fi încheiată practic 13 în etapa continuă a prelucrării). în asemenea variante de realizare, grija principală a etapei de prelucrare cu menținere în șarje este potrivirea aromei (sau remedierea), în particular în 15 legătură cu diacetilul și acetaldehida.

Variante preferate de realizare ale prezentei invenții susțin distribuirea mustului inocu- 17 lat al etapei post continue și/sau cel puțin a mustului fermentat parțial printr-o colector de distribuție (fie ca un colector fix, fie printr-o conductă conectată și deconectată selectiv) între 19 o multitudine de rezervoare colectoare ale șarjei. într-un procedeu de distribuire serial, se umple un rezervor, urmat de următorul, și așa mai departe. într-o variantă de realizare prefe- 21 rată în particular, capacitatea de producție a reactorului continuu și capacitatea de menținere a șarjei corespund în termenii dimensiunii și numărului reactoarelor/vaselor de menținere a 23 șarjei - astfel încât debitul de producție este potrivit în termeni de capacitate față de timp. în mod ideal, un vas de menținere a șarjei este drenat de produsul finit exact la timp pentru a 25 fi curățat, reconectat și apoi reumplut cu evacuarea neîntreruptă din etapa de fermentație continuă. 27 în conformitate cu alt aspect al prezentei invenții, anumite variante de realizare sunt gestionate în mod particular în legătură cu conținutul de oxigen al mustului/berii. Aceasta se 29 aplică atât etapei continue cât și etapei de menținere a șarjei ale procedeului. în legătură cu etapa continuă, concentrația de oxigen are o varietate de efecte, darîn mod remarcabil, poate 31 fi de dorit să se minimizeze aceasta pentru a optimiza conversia alcoolilor superiori în esteri activi de aromă. în legătură cu aceasta, se remarcă faptul că concentrațiile de alcooli superiori 33 pot rămâne neafectate în mare măsură de etapa de prelucrare cu menținerea șarjei dacă se dorește aceasta, se utilizează controlul strict al O₂ pentru a gestiona echilibrul aromei de ester 35 de fuzel. Pre-purjarea mustului cu CO₂ înainte de fermentația continuă poate fi utilă în legătură cu aceasta. 37 într-o variantă de realizare a prezentei invenții, scopul principal al etapei continue de prelucrare este de a asigura inițierea fermentației în șarje în aval care survine în procedeul 39 de menținere în șarje.

Pentru o siguranță mai mare, conținuturile documentelor de prioritate sunt incorporate 41 aici în formă completă și formează o parte a prezentei descrieri ca și cum acestea au fost reproduse aici integral. 43

Ceea ce urmează este o descriere detaliată în două părți a aspectelor prezentei invenții. 45

Descrierea conține și/sau se referă la grafice, formule, figuri și altele asemenea, fiecare dintre acestea fiind referită cu termenul “Fig.“ urmat de un număr specific de 47 identificare. în aceste desene, se poate ca articolele ilustrate să nu fie la o scară exactă.

RO 122457 Β1 în desenele anexate:

Fig. 1 este un flux tehnologic de procedeu pentru sistemul pilot de fermentație continuă, piesele individuale ale echipamentului arătat fiind rezumate în Tabelul 5.1 de aici.

Fig. 2 este o diagramă schematică a bioreactorului pilot de 501 cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze (GLDT).

Fig. 3 este o secțiune transversală a reactorului din fig. 2 incluzând poziția țevii de aspirația interne cât și separatorul intern.

Fig. 4 este un desen detaliat al plăcii superioare a bioreactorului din fig. 2.

Fig. 5 este un desen detaliat al corpului bioreactorului din fig. 2.

Fig. 6 este un desen detaliat al fundului conic al bioreactorului din fig. 2.

Fig. 7 este un desen detaliat al conductei pulverizatorului de gaz a bioreactorului din fig. 2. în conducta pulverizatorului cu diametru de 1,27 cm s-a dat un total de 160 de găuri (diametru de 0,16 cm) cu o spațiere longitudinală de 0,8 cm între centre, și o spațiere pe lățime de 0,6 cm.

Fig. 8 este o diagramă a producerii continue de sfere utilizând amestecătoare statice (cererea de brevet de invenție Labatt nr. 2,133,789).

Fig. 9 este o fotografie a sferelor de sticlă Siran® furnizate de Schott Engineering.

Fig. 10 este o fotografie a sferelor de kiselgur Celite® furnizate de World Minerals.

Fig. 11 este o fotografie a sferelor de gel din κ-caragenină produse în laboratoarele de la Labatt Brewing Company Limited (“Labatt).

Fig. 12 este o serie de fotografii reprezentând drojdie nefloculantă; drojdie formatoare de catene și respectiv drojdie floculantă. Aceste imagini au fost luate utilizând o cameră cu focalizare microscopică la o mărire de 100X.

Fig. 13 este o fotografie microscopică a tulpinii de drojdie mediu floculantă LCC3021 la o mărire de 100X.

Fig. 14 este o fotografie microscopică a tulpinii de drojdie superfloculantă LCC290 la o mărire de 100X.

Fig. 15 este o diagramă schematică a procedeului amestecătorului static pentru producerea sferelor de gel din kappa-caragenină. în amestecătorul static, fluidul se deplasează prin amestecător (mai degrabă decât amestecătorul prin fluid) permițând amestecarea fluidelor pe măsură ce acestea sunt pompate prin conductă.

Fig. 16 este altă schemă a unui sistem cu bioreactor cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze pentru fermentația primară a berii.

Fig. 17 este o fotografie a vasului actual al bioreactorului cu țeavă de aspirație pentru injecția gazelor din fig. 15.

Fig. 18 este un desen detaliat al vasului reactorului de 13 I (adică volum de lucru de 8 I) cu țeavă de aspirație pentru injecția gazelor din fig. 16.

Fig. 19 este un desen detaliat al plăcii superioare a vasului bioreactorului, unde: 1orificiul de extragere a lichidului pentru senzorul de oxigen; 2-teacă de termocuplu pentru senzorul de temperatură, legat de controlorul termostatic; 3-sondă de temperatură; 4-orificiul de retur al lichidului pentru senzorul de oxigen; 5-orificiuI de inoculare; 6-orificiuI cu membrană pentru eșantioane cu capac din oțel inoxidabil.

Fig. 20 este un profil al orificiului pentru extragerea lichidului pentru senzorul de oxigen cu unitate de umplere scufundată în faza lichidă a bioreactorului.

Fig. 21 este o diagramă detaliată a echipamentului pentru fermentația primară continuă a berii utilizând un sistem cu bioreactor cu injecție de gaze (vezi Tabelul 5.1 pentru descrierea detaliată a echipamentului).

Fig. 22 este o schemă a mecanismului gelatinizării carageninei (adaptată de laRees,

1972).

RO 122457 Β1

Fig. 23 este o schemă a utilizării constituenți lor mustului cu drojdie imobilizată în timpul 1 fermentației primare.

Fig. 24 este o fotografie a sferei de gel din kappa-caragenină conținând drojdie lager 3 imobilizată la momentul zero al fermentației.

t

Fig. 25 este o fotografie a unei incluziuni de drojdie lager înglobate în sfera de gel din 5 kappa-caragenină după două zile de fermentație în șarje, care arată urme de cicatrici de înmugurire pe celulele individuale de drojdie. 7

Fig. 26 este o fotografie a marginii exterioare a sferei de gel din kappa-caragenină arătând celulele de drojdie lager după două luni de fermentație continuă. 9

Fig. 27 este o fotografie a celulelor de drojdie lager într-o regiune exterioară a unei sfere de gel din kappa-caragenină după două luni de fermentație continuă. 11

Fig. 28 este o fotografie a celulelor de drojdie din centrul unei sfere de gel din kappacaragenină după două luni de fermentație continuă. 13

Fig. 29 este o fotografie a întregii sfere de gel din kappa-caragenină după șase luni de fermentație continuă; multe dintre sferele rupte au centre goale. 15

Descrierea detaliată

Prepararea inoculatului și tulpinii de drojdie 17

Fermentațiile conduse în această descriere utilizează o drojdie poliploidă din familia Saccharomyces cerevisiae (la care se face de asemenea referire ca Saccharomyces uvarum 19 și/sau Saccharomyces carlsbergensis). Comunitatea fabricanților de bere face referire în mod obișnuit la această drojdie ca fermentație de fund producătoare de bere tip lager. Această 21 caracterizare este atribuibilă capacității drojdiei lager de a se depune din mediul lichid la încheierea fermentației. O drojdie de bere de malț, spre deosebire de drojdia lager, se va 23 ridica la partea superioară a vasului de fermentație și prin urmare, a fost cunoscută drept tulpină de fermentație superioară. Capacitatea drojdiei de a se depune sau a se ridica nu este 25 dependentă neapărat de faptul că drojdia este tip lager sau de malț dar este specifică tulpinii.

Drojdia lager, în mod tipic nu fermentează la temperaturi peste 34°C, în timp ce drojdia de 27 malț nu poate fermenta melibioza. Oamenii de știință vor utiliza aceste caracteristici pentru a diferenția tulpinile lager de drojdia de malț (McCabe, 1999). 29

Tulpina de drojdie mediu floculantă Saccharomyces cerevisiae 3021 de la Labatt Culture Collection a fost utilizată atât în fermentațiile cu celule libere auto-agregate, cât și în 31 fermentațiile imobilizate pe k-caragenină. Pentru încercările care implică utilizarea de drojdie superfloculantă ca imobilizant, a fost utilizată o variantă a tulpinii LCC3021, și anume 33 LCC290.

Culturile de drojdie pură au fost depozitate criogenie într-un răcitor la -80°C localizat 35 în Departamentul de Dezvoltare Tehnologică de la Labatt. Atunci când a fost necesar au fost pre-crescute în mod aerob bucle sterile de cultură de drojdie la 21 °C pe plăci de agar PYG 37 (3,5 g de peptonă, 3,0 g extract de drojdie, 2,0 g de KH₂PO₄, 1,0 g de MgSO₄ · 7H₂0,1,0 g de (NH₄)SO₄,20,0 g de glucoză, și, 20,0 g de agar dizolvate în apă distilată până la un volum 39 de un litru). Coloniile izolate de drojdie au fost transferate apoi în eprubete conținând 10 ml de must pasteurizat și incubate cu agitare la 21 °C pe o perioadă de 24 ore. Acest inoculat 41 a fost scalat progresiv până la un volum de 5 I prin adăugarea culturii de mai înainte în volumul adecvat de must (10 ml în 190 ml, 200 ml în 800 ml și 1 I în 41). Inoculatul de drojdie 43 a fost transferat apoi în vase de centrifugare și supus centrifugării la 10000 rpm și 4°C timp de 10 min. Masa dorită de drojdie pentru toate fermentațiile ulterioare a fost extrasă din 45 peletele umede de drojdie rezultate (30% greut./vol.).

Mediu de fermentație 47

Mustul industrial lager produs de fabrica de bere Labatt London a fost utilizat ca mediu nutritiv pentru toate fermentațiile. Se face referire pe parcursul acestei descrieri la greutatea 49

RO 122457 Β1 specifică a mustului exprimată ca grade Plato (°P). Formula 4.1 descrie relația dintre greutatea specifică și °P.

’P=135,997 · SG³-630,272 SG²+1111,14 · SG-616,868 (4.1)

Mustul utilizat în această descriere a avut 17,5°P care corespund unei greutăți specifice de 1,072. Tabelul 4.1 furnizează profilul tipic de carbohidrat al acestui must, măsurat prin metoda cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) descrisă în secțiunea 4.7.2. Aproximativ 73% din carbohidrații din acest must sunt fermentabili, în timp ce drojdia de producere a berii utilizată în acest studiu nu poate prelua cu ușurință până la 27% din carbohidrații cu catenă lungă.

Tabelul 4.1

Compoziția tipică a carbohidraților din mustul utilizat în încercările de fermentație. Mustul a fost produs de fabrica de bere Labatt London și a avut o greutate specifică măsurată de 17,5P

	Media (g/l)	Coeficient de variație (%)	Fermentabil (%)	Nefermentabil (%)
Fructoză	3,3	18,0	1,9
Glucoză	16,5	4,3	9,3
Maltoză	87,7	10,1	47,8
Maltotrioză	25,2	10,8	14,2
Maltotetroză	6,4	18,3		3,6
Polizaharide	41,1	9,1		23,2
Total	177,2	73,2	26,8

Coeficientul de variație pentru majoritatea substanțelor analizate a fost în domeniul 10% și 20%. Această variabilitate se datorează în mare parte procedeului industrial de producție utilizat, cât și variabilității materiilor prime de la o fermentație la alta.

Tipuri de imobilizare în timpul acestei cercetări de doctorat au fost testate trei tipuri de imobilizări înglobare, adsorbție și auto-agregare. Pentru purtătorii din surse industriale, sunt prezentate mai întâi datele furnizorului și apoi sunt suplimentate de analiza de laborator. Fotografiile și distribuțiile granulometrice ale purtătorilor investigați (atunci când sunt disponibile) sunt prezentate în altă parte, aici.

în bioreactorul pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze au fost testate două tipuri de matrici de adsorbție. Aici sunt prezentate fotografiile ambelor tipuri dintre acești purtători. Schott Engineering a furnizat un purtător cu sfere din sticlă sinterizată, Siran®. Particulele selectate au avut 1-2 mm în diametru, au avut pori deschiși pentru imobilizarea drojdiei, cu un volum al porului de 55-60% și o distribuție granulometrică a porului între 60 și 300 pm, o dimensiune adecvată pentru celulele de drojdie. S-a raportat că acest tip de purtător este stabil din punct de vedere biologic și chimic, ușor de curățat, reutilizabil, sterilizabil cu aburi, non-compactor și neutru la gust, și prin urmare este aprobat din punct de vedere alimentar.

World Minerals din California a furnizat un purtător sferic compus din kiselgur. Acest purtător a furnizat avantajele stabilității termice și chimice, rezistenței mecanice și rigidității. Diatomitul, materia primă de bază, este utilizată în mod obișnuit în industria de fabricare a berii pentru filtrarea berii. Purtătorul Celite® R-632 a fost proiectat special pentru imobilizarea celulelor integrale.

RO 122457 Β1

Specificațiile furnizorului au fost după cum urmează: 1

Domeniul de dimensiuni: 0,595 mm până la 1,41 mm (fracțiune 14/30 mesh)

Diametrul mediu al porului: 7,0 pm 3

Volumul total al porului: 1,19 cm³/g

Densitatea patului compactat: 0,334 kg/m³ 5

Sferele de gel din kappa-caragenină, un purtător pe bază de înglobare, au fost produse în laboratoarele Labatt Brewing Company Ltd. Procedeul de producție este descris în 7 Secțiunea 5.2 iar rezultatele acestui procedeu de producție sunt prezentate în Secțiunea 6.2.1. 9

Cel mai simplu mod de imobilizare, auto-agregarea, a fost posibil prin selecția de tulpini de drojdie capabile de floculare. Drojdia lager industrială LCC3021 posedă capacitatea 11 naturală de floculare și este considerată ca o tulpină mediu floculantă. Pe măsură ce se desfășoară fermentația, în mediul lichid se vor forma mici aglomerări de drojdie, măsurând 13 de la 0,5 mm până la 1,0 mm. Drojdia LCC290, o variantă a drojdiei lager LCC3021, va forma flocoane mult mai mari (de la 1,0 mm până la 5,0 mm depinzând de gradul de agitare) și prin 15 urmare, este clasificată drept drojdie superfloculantă. Imaginile diverselor flocoane de drojdie sunt prezentate alăturat. 17

Protocol de eșantionare

Pe măsură ce s-au desfășurat fermentațiile, a fost necesar să se extragă eșantioane 19 din lichidul în fermentație la intervale numeroase de timp. Pentru realizarea acestei sarcini, au fost achiziționate supape de eșantionare sterile de la Scandi-brew®. Aceste supape sunt 21 construite din oțel inoxidabil și sunt echipate cu o cameră (delimitată de un orificiu superior și inferior) în care poate fi păstrat etanol pentru a menține un mediu aseptic. înainte de prelu- 23 area unui eșantion, etanolul este eliminat din cameră prin eliminarea capacului de reținere din scurgerea inferioară. Prin cameră se circulă etanol proaspăt (75% în volume) și apoi se 25 plasează capacul pe orificiul superior al supapei. Apoi se trage levierul supapei și se colectează aproximativ 50 ml de eșantion de lichid într-un container sterilizat. Un al doilea eșantion 27 este colectat pentru fermentațiile care implică drojdie superfloculantă astfel încât poate fi realizată o defloculare adecvată înainte de enumerarea celulelor. Odată ce eșantionarea este 29 încheiată, camera supapei este clătită cu apă fierbinte și acid peracetic și apoi, în final, cu etanol. Capacul de reținere este plasat pe scurgerea inferioară și camera este umplută cu 31 etanol în pregătirea următoarei eșantionări.

Monitorizare microbiologică 33

Enumerarea celulelor de drojdie libere și viabilitatea se realizează prin metoda albastrului de metilen. 35

Eșantioanele de lichid conținând celule de drojdie suspendate liber sunt colectate mai întâi din mediul de fermentație prin procedura de eșantionare de mai sus. Se utilizează un 37 hemacitometru Hauser Scientific Company cu un volum de 1 (Γ* ml împreună cu un microscop cu fascicul luminos pentru a realiza numărarea celulelor. Eșantioanele de lichid trebuie să 39 fie diluate cu apă distilată pentru a obține o numărătoare totală a drojdiei de 150 până la 200 celule în câmpul de numărare. Heggart și colab, (1999) descriu toți factorii care afectează 41 caracteristicile de viabilitate și vitalitate a drojdiei. Pentru a evalua gradul de viabilitate din eșantion, a fost utilizată metoda colorării cu albastru de metilen descrisă de American Society 43 of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Celulele vii pot face pata de albastru de metilen, incoloră prin oxidarea acesteia. Celulele 45 moarte, pe de altă parte, vor colora în albastru. în prepararea albastrului de metilen au fost utilizați următorii reactivi pentru evaluarea viabilității: 47

RO 122457 Β1

Soluția A: 0,1 g de albastru de metilen în 500 ml apă distilată

Soluția B: 13,6 g de KH₂PO₄ în 500 ml apă distilată

Soluția C: 2,4 g de Na₂HPO₄ · 12H₂O în 100 ml apă distilată

S-a preparat apoi albastrul de metilen tamponat Fink-Kuhles prin amestecarea a 500 ml din soluția A cu 498,75 ml din soluția B și 1,25 ml din soluția C pentru a produce un amestec final la un pH de 4,6.

S-a preparat un amestec din suspensia celulară diluată și albastru de metilen într-o eprubetă și apoi s-a amestecat minuțios. După ce acest amestec a fost lăsat să se liniștească timp de câteva minute (pentru a asigura contactul dintre celule și colorant), o picătură de lichid a fost plasată între sticla numărătorului hemacitometrului și foița de acoperire (volum definit). A fost determinat procentul de celule viabile prin numărarea atât a celulelor viabile cât și a celulelor moarte din câmpul de numărare și împărțirea apoi a numărului de celule viabile la numărul total de celule.

4.5.2 Numărătoarea celulelor de drojdie imobilizate - auto-agregare

Atunci când se utilizează celule de drojdie cu o tendință la formarea de flocoane, devine dificil să se evalueze cu precizie numărul de celule prezent într-un eșantion de lichid deoarece celulele vor tinde să se depună în vasul de eșantionare. Pentru a se obține un eșantion reprezentativ, a fost utilizat un agent defloculant. în aceste experimente, a fost utilizată o soluție 0,5% în volume de acid sulfuric pentru a destabiliza celulele de drojdie floculate, permițând astfel o numărare reprezentativă a celulelor de drojdie. A fost utilizată aceeași procedură de enumerare și viabilitate subliniată în secțiunea 4.5.1 cu acidul sulfuric înlocuind apa distilată ca agent de diluare.

Numărătoarea celulelor de drojdie imobilizate - sfere de gel înainte de realizarea numărătorii drojdiei pe celule înglobate în gel, a fost necesar să se sfâșie matricea de gel utilizând un aparat Polytron® (Brinkmann Instruments). Mai întâi, un eșantion de sfere a fost trecut printr-o sită sterilă (dimensiune 500 pm mesh) și apoi spălate cu apă sterilă. într-un container de eșantionare de 50 ml s-au adăugat un mililitru de sfere cu celule înglobate în gel și 19 ml de apă distilată. Apoi s-a utilizat aparatul Polytron® pentru a sfâșia fizic gelul și astfel și să se elibereze drojdia în soluție. Metodele de enumerare și viabilitate descrise în secțiunea 5.5.1, au fost realizate apoi pe eșantionul de gel sfâșiat.

Monitorizarea contaminării

Toate fermentațiile realizate pe parcursul acestei cereri au fost monitorizare regulat pentru contaminare. Programul de monitorizare a constat din cel puțin o verificare pe săptămână a lichidului din linurile de fermentație continuă de 50-1 și mustul din vasele de depozitare. S-au extras eșantioane de lichid aseptic și apoi s-au împrăștiat pe plăci de cultură compuse din Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) și 10 mg/l de cicloheximidă. Aceste eșantioane de test au fost apoi incubate la 28°C timp de până la 10 zile atât în condiții aerobe, cât și anaerobe. Plasarea plăcilor selectate în vase conținând un pachet AnaeroGen® (Oxoid), care elimină orice oxigen rămas în vas, a creat mediul anaerob de creștere dorit. Utilizarea unei benzi indicatoare (care devine roz dacă este prezent oxigen) a permis verificarea faptului că mediul a fost într-adevăr anaerob. Contaminanții bacterieni, dacă sunt prezenți în eșantion, vor fi apoi detectați prin această metodă. Detectarea drojdiei sălbatice sau care nu este bună pentru producerea de bere a necesitat un mediu de creștere separat care nu favorizează creșterea bacteriană și/sau a drojdiei de bere. Au fost utilizate patru plăci preparate cu mediu de drojdie (YM, Difco Laboratories) suplimentat cu 0,4 g/l CUSO₄ pentru a permite selectiv creșterea oricărei drojdii sălbatice potențiale (incubare la 25°C timp de 7 zile). Incubarea eșantionului de lichid placat pe agar PYN (mediu nutritiv peptonă-extract de drojdie, Difco Laboratories) timp de 7 zile la 37°C a permis detectarea drojdiei de bere nonlager. Creșterea drojdiei lager este inhibată la temperaturi peste 34°C, astfel orice creștere pe aceste plăci ar indica o contaminare cu drojdie de malț.

RO 122457 Β1

Metode analitice 1

Au fost realizate calibrări adecvate ale tuturor echipamentelor relevante așa cum este prescris de procedurile de operare industrială standard. 3

Etanol

Concentrația de etanol din bere și eșantioanele de fermentație a fost analizată utili- 5 zând metoda cromatografiei în gaze descrisă de Technical Committee și de Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Un eșantion degazeificat 7 de lichid a fost combinat cu 5% v/v de etalon intern izopropanol urmat de injectarea de 0,2 pL din acest amestec într-un cromatograf cu gaz Perkin Elmer 8500. Următoarea listă fu mizează 9 detalii suplimentare în legătură cu setarea exactă a cromatografului cu gaz:

Detector de ionizare a flăcării (FID) 11

Autoeșantionator Dynatech

Umplutură suport Chromosorb 102, 80-100 mesh 13

Gaz purtător heliu cu debit de 20 ml/min.

Temperatura injectorului de 175°C, temperatura detectorului de 250’C & temperatura 15 coloanei de 185°C, izoterm.

Carbohidrați 17

Concentrațiile de glucoză, fructoză, maltoză, maltotrioză, maltotetroză, polizaharide și glicerol au fost măsurate utilizând un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță 19 (Spectra-Physics SP8100XR HPLC). Afost utilizată o coloană cu schimb de cationi (Bio-Rad Aminex HPX-87K) cu fosfat dibazic de potasiu ca fază mobilă pentru a separa acești 21 carbohidrați pe măsură ce erau eluați prin sistem. Cantitatea de compuși a fost determinată apoi utilizând un detector de index de refracție pentru a genera vârfurile corespunzătoare ale 23 compușilor. HPLC a fost exploatat la o contra-presiune de 800 psi, o temperatură a coloanei de 85°C și o temperatură a detectorului de 40°C. Eșantioanele au fost degazeificate și diluate 25 la nivelurile adecvate. Apoi s-a introdus în sistem o injecție de 10 pl la un debit de 0,6 ml/min.

Industria de fabricare a berii utilizează în mod obișnuit o altă măsurare pentru a evalua 27 nivelul global de carbohidrați ai lichidului. A fost măsurată greutatea specifică a lichidului exprimată în grade Plato utilizând un densitometru Anton Paar DMA-58. Eșantioanele filtrate 29 și degazeificate au fost transferate într-un tub U din sticlă special, care a fost supus apoi oscilației electronice. A fost măsurată frecvența oscilației prin lichid și apoi s-a corelat cu o 31 greutate specifică a lichidului (g/100 g sau °P). Trebuie remarcat că această măsurătoare este o aproximare a concentrației totale de carbohidrați din eșantion (sau greutate specifică) 33 deoarece calibrările sunt realizate pe soluții apoase de zaharoză la 20’C a căror greutate specifică este aceeași ca a mustului în chestiune. 35

Dicetone apropiate

Au fost determinate concentrațiile de diacetil total (2,3-butandionă) și 2,3-pentandionă 37 totală utilizând un cromatograf cu gaz Perking Elmer 8310 echipat cu un detector de captură a electronilor. S-a utilizat un gaz purtător 5% metan în argon curgând la 1,0 ml/min. drept gaz 39 purtător și eșantionul a fost trecut printr-o coloană J & W DB-Wax. Temperatura injectorului a fost menținută la 105°C în timp ce temperatura detectorului a fost stabilită la 120°C. Un 41 autoeșantionator Hewlett Packard 7694E a facilitat analiza. Cuantificarea a fost calculată prin evaluarea ariei vârfului componentului de eșantion selectat și apoi trimiterea la alte referințe, 43 la valoarea de calibrare etalon intern a 2,3-hexandionei.

Pentru a evalua concentrația “totală” a acestor compuși, a fost necesar mai întâi să 45 se echilibreze aceste eșantioane la 65°C și apoi să se mențină timp de 30 min la această temperatură. Această manipulare pre-analiză a eșantionului a permis conversia a-acetolactatului 47 și α-hidroxibutiratului în dicetonele respective ale acestora, diacetil și 2,3-butandionă.

RO 122457 Β1

Esteri și alcooli superiori

A fost măsurată o parte dintre cei mai importanți compuși de aromă detectați în bere, utilizând o metodă de cromatografie cu gaz în spațiul superior. Acetaldehida, acetatul de etil, izobutanolul, 1-propanolul, acetatul de izoamil, alcoolul izoamilic, hexanoatul de etil și octanoatul de etil au fost cuantificate utilizând n-butanol ca etalon intern. A fost utilizat un cromatograf cu gaz Hewlett Packard 5890 echipat cu un detector de ionizare a flăcării, un autoeșantionator HP 7994 cu spațiu superior și o coloană capilară J&W DB-Wax. Temperatura injectorului a fost stabilită la 200°C și temperatura detectorului a fost 220’C. Apoi, profilul temperaturii cuptorului a fost după cum urmează: 40°C timp de 5 min., rampă de la 40’C până la 200°C la o viteză de 10°C/min, rampă de la 200°C până la 220’C la o viteză de 50°C/min, și la final o menținere la 220°C timp de 5 min. Un gaz de completare din heliu la 30 ml/min (28 psig), un curent de hidrogen la 50 ml/min (25 psig) și un curent de aer la 300 ml/min (35 psig) au suplimentat un curent de gaz purtător din heliu la 6,0 ml/min. întregul ciclu al cromatografiei cu gaz pentru o buclă de eșantionare de 1 ml a fost de 40 min.

Alte analize

Au fost realizate mai multe alte măsurări analitice la nevoie, ale lichidului de fermentație care a fost supus maturării și ambalării. Analizele produsului finit au fost realizate de către departamentul de control al calității de la Labatt conform standardelor de bere finisată. Metodele descrise de Technical Committee și Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992) au fost baza acestor măsurători. O listă a analizelor, cât și o scurtă descriere a relevanței acestor măsurători, este furnizată în Tabelul 4.2.

Tabelul 4.2

Analizele controlului calității și descriere

Specificație	Descriere
Aer	Aerul total transportat în timpul procesului de ambalare; specificația este mai mică de 1 ml
Dioxid de carbon	Nivelul de carbonatare introdus în produs; raportat ca % cu specificația de 2,75%
Dioxid de sulf	Cantitatea de dioxid de sulf din bere măsurată prin CG; tintă <10 mq/l
Sulfură de dimetil	Cantitatea de sulfură de dimetil (miros de porumb copt) din bere măsurată prin CG; tintă <70 uq/I
Amăreală	Cantitatea de amăreală cu care a contribuit hameiul la bere; măsurarea a//a-acizilor din bere; 1 unitate de amăreală (BU) este echivalentă cu ~1 mg/l a/fa-acid Culoare Culoarea berii măsurată prin spectrofotometrie; absorbanța eșantionului la 430 nm pentru o cale de lumină de 0,5 toii
PH	Măsurat utilizând un pH-metru calibrat; pH =-loqin[H+l
Extract aparent	Cantitatea de masă solubilă disponibilă în lichid fără compensarea efectului alcoolului asupra densității relative a lichidului; măsurată utilizând un hidrometru și raportată ca °P; AE
Extract real	Același ca extractul aparent, în afară de faptul că alcoolul este luat în calcul la această măsurătoare. RE
Extract original calculat	Pe baza experimentului Bal ling că 2,0665 g de extract produc 1,0000 g de alcool, COE=100*[(2,0665*(% în greutate alcool)+RE)/100+1,0665* (% în qreutate alcool))!

RO 122457 Β1

Tabelul 4.2 (continuare)

Specificație	Descriere
Abur cald	Aburul prezent în bere la temperatura camerei (21 °C) fără tulburarea sedimentului; evaluat utilizând metoda nefelometrică bazată pe împrăștierea luminii și raportată ca unitate de turbiditate a formazinei (FTU); specificația este <200 FTU
Aburul inițial de răcire	Aburul format în bere atunci când aceasta este răcită de la temperatura camerei (21°C) la 0°C fără tulburarea sedimentului; metoda de măsurare ca mai sus; specificația este <100 FTU
Spumă	Măsurarea potențialului de spumare a berii utilizând instrumentul NIBEM; spuma este generată într-o manieră controlată și se înregistrează viteza de turtire a spumei; specificația este >170 secunde

PROTOCOLUL DE SEDIMENTAREA DROJDIEI—LCC290

Prepararea eșantionului de testare a drojdiei

Drojdia superfloculantă (LCC290) a fost crescută în must așa cum s-a descris în secțiunea 4.1. Acest inoculat a fost apoi centrifugat la 4°C și 10000 rpm timp de 15 min pentru a se obține o peletă de drojdie pentru inoculare suplimentară. Mustul, așa cum s-a descris în secțiunea 4.2, a fost pasteurizat la 100°C timp de 60 min și apoi, un litru a fost transferat aseptic în baloane de agitare 6x2 I sterilizate. Fiecare balon de agitare a fost inoculat cu 4 g de drojdie centrifugată. Baloanele au fost plasate pe un agitatorfuncționând la 135 rpm (21°C temperatura camerei ambientale) și lăsate să fermenteze. Câte un balon a fost retras la următoarele intervale de timp: 24 h, 40 h, 48 h, 64 h, 71 h, și 192 h. La fiecare interval, a fost preluat un mic eșantion de lichid pentru analiza carbohidraților și pentru măsurătorile concentrației și viabilității drojdiei (metodele actuale descrise în Capitolul 4). Amestecul lichid/drojdie rămas a fost supus protocolului de sedimentare a drojdiei descris în secțiunea 4.7.2.

Protocolul de sedimentare a drojdiei

Viteza de sedimentare pentru tulpinile de drojdie superfloculante LCC290 a fost măsurată utilizând următoarea metodă. Fiecare eșantion a fost lăsat să fermenteze intervalele dorite descrise în secțiunea 4.7.1. La momentul prescris, s-a extras balonul cu eșantionul adecvat. Eșantioanele au fost agitate pentru a se asigura că toate particulele au fost suspendate. Conținutul baloanelor a fost transferat imediat într-un cilindru gradat de 1000 ml. Pe măsură ceflocoanele s-au depus, s-a măsurat distanța dintre suprafața lichidului și interfața dintre flocoane-lichid la intervale de 30 s.

Viteza de sedimentare a fost calculată prin aplicarea următoarei ecuații:

Viteza de sedimentare ® -â£t=i^-2—îhl (5.1)

Ar (/-r₀)

Utilizând metoda Kynch standard (1952), s-a generat curba viteză de sedimentare față de concentrația de celule din curbele de sedimentare obținute pentru fiecare interval de fermentație.

Metode de viteză de amestecare & circulație

Pentru a măsura timpul de amestecare și viteza de circulație în interiorul bioreactorului trifazic cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, a fost utilizat un sistem de injectare de acid legat la un sistem de achiziție de date. Prin aplicarea unui impuls dintr-un acid tare în bioreactor, a fost posibil să se calculeze atât viteza de circulație cât și timpul de amestecare

RO 122457 Β1 prin monitorizarea schimbării de pH în timp și legarea acestora de ecuațiile prezentate în secțiunea 3.2.2. Sistemul de achiziție de date a constat din:

o sondă pH Ingold (Cole-Parmer, cat, #P-05990-90) cuplată la un transmițătorde pH Ingold pe bază de microprocesor (Model 2300) o cartelă de translație a datelor DT2805 un calculator personal 386DX și un program de achiziție de date Quick Basic (scris de C. Hudson și J. Beltrano în 1994 și modificat de N. Mensourîn 1998).

în secțiunea inelară a bioreactorului cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze s-au injectat zece mililitri de acid clorhidric 10N (diagrama este furnizată în fig. 5.5) exact sub poziția sondei pH. Această distanță a corespuns unei înălțimi de 26 cm sub placa superioară.

Sonda pH a fost supusă unei calibrări în două puncte cu tampoane standard certificate (tampon verde Beckman pH 7,0 și tampon roșu Beckman pH 4,0) înainte de orice experiment de amestecare. Curentul de 4-20 mA produs de pH-metru a fost conectat la o placă terminală cu șuruburi, unde curentul a fost transformat într-o tensiune, care a fost măsurată apoi de cartela de achiziție de date localizată în interiorul calculatorului. Programul de achiziție de date a fost pornit simultan cu injectarea de acid. Lungimea de colectare a datelor a fost de minute la o frecvență de eșantionare de 50 Hz. Dimensiunea tabelului din program a fost stabilită la 3750 (total din 15000 puncte colectate) cu un câștig de 1 stabilit pentru cartela de achiziție de date.

Datele colectate au fost transferate din laborator într-un calculator mai puternic (microprocesor Pentium II) pentru analiză suplimentară. A fost utilizat extensiv TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Canada) pentru analiza datelor, datorită capacității sale de a lucra cu seturi mari de date, cât și multitudinii de funcții de prelucrare implicite (netezire de date, fitare de curbe etc,). Algoritmul Savitzky-Golay, o metodă de netezire pe domeniu de timp bazată pe cele mai mici polinoame de gradul patru fitând peste o fereastră în mișcare, a fost aplicat datelor originale pentru eliminarea zgomotului. Datele netezite au fost apoi ajustate pentru a reflecta o schimbare a pH-ului mai degrabă decât măsurătoarea actuală a pH-ului. Datele ajustate s-au fitat cu o funcție sinusoidală amortizată. Timpii de amestecare și vitezele de circulație au fost calculate apoi din parametrii de fitare.

Aceste experimente de amestecare au fost executate pe fermentații actuale în bioreactorul cu injecție de gaze de 501 cu unu din trei purtători de imobilizare prezent (fie drojdie superfloculantă LCC290, drojdie mediu floculantă LCC3021 sau sfere de gel din κ-caragenină). Faza lichidă a fost bere fermentată cu o greutate specifică de 2,5°P și faza gazoasă a cuprins gaz de barbotaj dioxid de carbon. Temperatura de fermentație a fost controlată la 15°C. Vitezele superficiale ale gazului de barbotaj au variatîntre 2,0 și 6,0 mm/s. La un anumit debit, sistemul a fost lăsat să se echilibreze timp de 10 minute. Testul injecției acide a fost început și repetat de 3 ori. S-a selectat debitul următor de gaz și amestecului din interiorul reactorului i s-a reajustat pH-ul la nivelul de pornire.

Proiectarea unui sistem pilot cu bioreactor cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze

S/'sfem de fermentație cu bioreactor cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze

Sistemele cu pat fluidizat cu țeavă de aspirație (DTFB) și-au arătat valoarea pentru utilizarea în sisteme trifazice. Au fost concepute, construite și instalate două bioreactoare pilot identice, cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze în Experimental Brewery de la Labatt Brewing Company Ltd., pentru a se realiza munca experimentală pentru această teză. în plus, au fost modificate mai multe vase existente atât pentru depozitarea mustului, cât și pentru colectarea berii. Diagrama din fig. 1 descrie procedeul global utilizat în experimentele pilot de fermentație continuă, iar Tabelul 5.1 listează o descriere mai detaliată a echipamentului reprezentat în fig. 1.

RO 122457 Β1

Mustul a fost furnizat de fabrica London Brewing prin conducte de 5,08 cm din oțel 1 inoxidabil și transferat în rezervoare de depozitare a mustului cu volum de lucru de 1600 I (WT1 & WT2). Cu un sistem cu două rezervoare, a fost posibil să se asigure o alimentare 3 continuă cu mediu nutritiv a linurilor de fermentare continue pilot (R1 & R2). Fiecare rezervor colector este echipat cu un sistem de barbotaj pentru dioxid de carbon pentru controlul 5 oxigenului și omogenității și un sistem cu manta de răcire cu glicol pentru controlul temperaturii. Această sursă centrală de mediu nutritiv a fost setată pentru a alimenta până la 3 linuri 7 de fermentare independente printr-un sistem colector cu supape (V7, V8 & V9). Au fost utilizate pompe peristaltice Masterflex (P1 & P2) pentru a livra un debit prescris de must către 9 bioreactoarele pilot (R1 & R2).

Tabelul 5.1 11

Descrierea echipamentului individual reprezentat în fig. 5.1

Articol	Descriere
Aer	alimentare de aer cu 100 psig din fabrica London	15
CO?	alimentare de dioxid de carbon cu 100 psig din fabrica London
F1	Filtru steril la admisia dioxidului de carbon	17
F2	Filtru steril la admisia dioxidului de carbon
F3	Filtru steril la ieșirea ventilației lui WT1	19
F4	Filtru steril la ieșirea ventilației lui WT2
F5	Filtru steril la admisia gazului de barbotaj	21
F6	Filtru steril la admisia gazului de barbotaj
F7	Filtru steril la evacuarea WBT1	23
GLR	Returul conductei de glicol; 25 psig
GLS	Alimentarea conductei de glicol; 45 psig	25
NV1	Supapă cu ac pentru dioxid de carbon
NV2	Supapă cu ac pentru dioxid de carbon	27
NV3	Supapă cu ac la admisia aerului
NV4	Supapă cu ac la admisia dioxidului de carbon	29
NV5	Supapă cu ac la admisia aerului
NV6	Supapă cu ac la admisia dioxidului de carbon	31
P1	Pompă peristaltică de alimentare Masterflex pentru R1
P2	Pompă peristaltică de alimentare Masterflex pentru R2	33
PR1	Regulator de presiune pentru dioxid de carbon
PR2	Regulator de presiune pentru dioxid de carbon	35
PR3	Regulator de presiune pentru aer
PR4	Regulator de presiune pentru dioxid de carbon	37
PR5	Regulator de presiune pentru aer
PR6	Regulator de presiune pentru dioxid de carbon	39
R1	Bioreactor pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze; volum de lucru 50 I	41
R2	Bioreactor pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze; volum de lucru 50 I	43
RM1	Rotametru pentru dioxid de carbon; scală 0 până la 20 scfh
RM2	Rotametru pentru dioxid de carbon; scală 0 până la 20 scfh	45
RM3	Rotametru pentru aer; scală 0 până la 2,5 scfh
RM4	Rotametru pentru dioxid de carbon; scală 0 până la 10 scfh	47
RM5	Rotametru pentru aer; scală 0 până la 2,5 scfh
RM6	Rotametru pentru dioxid de carbon; scală 0 până la 10 scfh	49
V1 ,V2,V3	Supape fluture la admisia/evacuarea WT1
V4,V5,V6	Supape fluture la admisia/evacuarea WT2	51

RO 122457 Β1

Tabelul 5.1 (continuare)

Articol	Descriere
V7,V8,V9	Supapă cu bilă la blocul de distribuție a mustului
V10.V11	Supape cu bilă la admisia mustului lui R1
V12	Supapă de deconectare rapidă la admisia gazului de barbotaj
V13	Supapă fluture la evacuarea R1
V14,V15	Supape cu bilă la admisia mustului lui R2
V16	Supapă de deconectare rapidă la admisia gazului de barbotaj
V17	Supapă fluture la evacuarea R2
V18	Supapă fluture la evacuarea WBT1
WBT1	Rezervor de bere de deversare; volum de lucru 200 I
WT1	Rezervor de depozitare a mustului echipat cu manta cu pereți cu glicol și capacități de barbotaj; volum de lucru de 1600 I
WT2	Rezervor de depozitare a mustului cu manta cu pereți cu glicol și capacități de barbotaj; volum de lucru de 1600 I

Gazul dioxid carbon și aerul au fost barbotate în sistemul cu injecție de gaze prin pulverizatoare de gaz din țeavă de oțel inoxidabil (fig. 7). Rotametrele (RM3, RM4, RM5 și RM6) au fost utilizate pentru a monitoriza debitele injectate în sistem. S-au instalat filtre sterile (0,2 pm mesh) pe conductele de gaz pentru a se asigura că în bioreactoare nu s-a introdus nici un contaminant. Produsul a curs din reactor printr-un sistem de preaplin (fig. 4). Prin urmare, pompa de alimentare a controlat singură timpul de rezidență a lichidului. Ambele reactoare (R1 și R2) au fost conectate la un rezervor de bere de deversare (WBT1) pentru a colecta lichidul în surplus. Au fost utilizate rezervoare de colectare speciale de 501 pentru colectarea produsului și prelucrarea după necesitate.

Diagrame mai detaliate și dimensiunile exacte ale bioreactorului pilot de 50 I sunt furnizate în secțiunea 5.1.1. Protocolul de manipulare și depozitare a mustului va fi prezentat în secțiunea 5.1.2 în timp ce protocoalele de curățare și sterilizare pentru sistemul de fermentație continuă va fi discutat în secțiunea 5.1.3. Secțiunea 5.1.4 acoperă protocolul de fermentație urmat pe întreg parcursul acestei teze.

Proiectarea reactorului și specificații

Bioreactorul cu volum de lucru de 501 proiectat pentru această lucrare a fost construit în întregime din oțel inoxidabil 304L cu 4 ferestre de vizitare din Plexiglas localizate în corpul reactorului, astfel încât să poată fi observată mișcările fluidului particulelor. Materialul de construcție a fost ales pentru rezistența sa la substanțele chimice de curățire (caustice și acide), cât și pentru durabilitatea sa la sterilizarea cu aburi. Un alt aspect important al conceptului a fost minimizarea fitingurilor filetate în contact direct cu mediul de fermentație. în loc de acestea, orificiile au fost sudate, și unde a fost necesar, au fost utilizate fitinguri sanitare TriClover. Reactorul a fost proiectat cu o regiune superioară mărită astfel încât să se maximizeze eliberarea gazului și astfel să se promoveze un transfer de masă lichid-solid mai bun (Chisti & Moo-Young, 1993). Partea inferioară a reactorului a fost proiectată cu un unghi conic de 90 grade astfel încât să se minimizeze colectarea oricăror solide la partea inferioară.

RO 122457 Β1

Fig. 2 este o diagramă schematică a sistemelor pilot de 501 care au fost instalate în 1 Labatt Experimental Brewery. Această diagramă indică poziția admisiei gazului de barbotaj, admisia lichidului, mantaua de răcire cu glicol, evacuarea produsului, sistemul de sesizare 3 și control a temperaturii, cât și poziția celor două orificii sanitare de eșantionare. Fig. 3 este o schemă a aceluiași bioreactor GLDT cu dimensiunile furnizate în centimetri. Fig. 4 până 5 la 6 sunt desene în secțiune detaliate ale bioreactorului de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, iar fig. 7 este o schemă a dispozitivului de barbotaj cu gaz utilizat în aceste 7 experimente.

Țeava de aspirație interioară și separatorul de particule (șicana) sunt ilustrate în fig. 3. 9

A fost ales un raport între diametrul țevii de aspirație față de diametrul reactorului de 2/3 pe baza datelor din literatură (Chisti, 1991). Separatorul de particule a fost dimensionat pentru 11 a permite o mai bună separare a gazului din amestecul solid-lichid. Prin creșterea diametrului acestui dispozitiv de șicanare (20,32 cm comparativ cu diametrul unei țevi de aspirație de 13 10,16 cm), este posibil să se obțină o mai mare diferență între viteza de ridicare a bulelor și viteza de coborâre a fluidului lichid-solid. Antrenarea gazului în spațiul inelar sistemului cu 15 țeavă de aspirație va fi redusă și va rezulta un transfer de masă solid-lichid mai bun.

A fost proiectat un pulverizator cu țeavă (fig. 7) pentru injectarea de gaz de ameste- 17 care dioxid de carbon în secțiunea țevii de aspirație. în pulverizatorul cu diametru de 1,27 cm s-a executat un total de 160 găuri măsurând 0,16 cm în diametru. Găurile au fost pozițio- 19 nate cu o distanțiere longitudinală de 0,8 cm între centre și o distanțiere pe lățime de 0,6 cm între centre (8 rânduri a 20 găuri). Deoarece amestecarea a fost funcția principală a gazului 21 barbotat, a fost selectat un diametru de 0,16 cm al găurii de barbotaj.

Protocolul de manipulare și depozitare a mustului 23 în practicile tradiționale de fermentație, mustul nu este ținut pe perioade mari fără să fie inoculat cu drojdie. Mustul oxigenat este un excelent mediu de creștere pentru multe 25 organisme, inclusiv drojdia. Deoarece protocolul de fermentație pentru sistemele continue cu injecție de gaze a necesitat cantități mari de menținere a mustului, a fost necesar să se 27 dezvolte protocoale de transfer și menținere a mustului. A existat opinia cercetătorilor că mustul rece neoxigenat poate fi depozitat până la două săptămâni fără să fie compromis prin 29 contaminare, dacă mustul a fost transferat în mod adecvat în vasul colector.

S-a considerat de asemenea necesar să se asigure că temperatura mustului a fost 31 controlată adecvat, odată ce acesta a fost în interiorul vasului colector de must. Rezervoarele disponibile în Experimental Brewery au fost proiectate inițial pentru fermentație mai degrabă 33 decât pentru păstrarea mustului. S-a realizat un test al capacității acestor rezervoare de a menține temperatura lichidului stagnant. Fig. 2 ilustrează în mod clar că aceste vase nu pot 35 fi utilizate fără agitare, dacă trebuie menținută o temperatură constantă de 4°C. Mustul a fost introdus mai întâi în aceste vase la o temperatură de 4°C. Măsurările de temperatură au fost 37 realizate în mai multe puncte din rezervor pentru a avea o mai bună înțelegere a temperaturii reale. Când lichidul a fost lăsatîn vas timp de 24 h fără agitare, temperatura lichidului aproape 39 de partea superioară a urcat la aproximativ 20°C. Lichidul din mijlocul rezervorului a crescut de asemenea ușor (ΔΤ de ~3°C), în timp ce acela din conul rezervorului a rămas aproape 41 de cele 4°C inițiale.

RO 122457 Β1

Figura 5.8. Efectul agitării prin barbotaj de gaz asupra profilului de temperatură în rezervorul cilindro-conic de colectare a mustului. Mustul a fost introdus în vas la o temperatură de 4’C. Măsurătorile au fost realizate la 24 de h după umplerea rezervorului. S-a barbotat gaz dioxid de carbon în vas, la un debit de 0,113 cm³/oră. Temperatura camerei ambiante a fost 19,8*C. Poziția măsurătorii: (1) partea superioară a rezervorului la perete; (2) partea superioară a rezervorului în centru; (3) mijlocul rezervorului la perete; (4) mijlocul rezervorului în centru; (5) partea superioară a conului la perete; (6) partea superioară a conului în centru; (7) partea inferioară a conului.

Prin introducerea unei ușoare agitări prin injectarea de dioxid de carbon la un debit de 0,133 cm³/oră, a fost posibil să se menzină temperatura mustului din interiorul vasului de colectare la 4°C. Ca rezultat al acestor descoperiri, ambele vase de colectare a mustului au fost prevăzute la baza conului cu o țeavă sanitară de 2,54 cm pentru utilizarea la agitarea mustului.

Mustul neaerat a fost transferat ulterior din fabrica Labatt London printr-o conductă de 5,08 cm din oțel inoxidabil într-un rezervortampon. Din acest rezervor, mustul a fost trecut printr-un pasteurizator cu detentă într-unul dintre rezervoarele de colectare a mustului (WT1 sau WT2) unde a fost depozitat la 2°C până la 2 săptămâni. Această etapă de pasteurizare a fost instaurată ca o măsură de precauție pentru a se asigura că microorganismele nedorite au fost eliminate din must pe întreaga perioadă de păstrare. Prin utilizarea de must neoxigenat, deteriorarea mustului fierbinte de către oxigen (formarea de aldehide cu miros stătut) va fi minimizată. în plus, aerul introdus cu gazul de barbotare, poate prin urmare să realizeze cu strictețe controlul oxigenului în linurile de fermentare continuă.

Au fost realizate măsurători ale oxigenului dizolvat asupra mustului odată ce acesta a fost în interiorul vasului de colectare a mustului. Fig. 5.9 descrie concentrația de oxigen dizolvat a mustului în timp, după trei protocoale de transfer. în primul caz, mustul a fost transferat în vasul de colectare și a fost începută barbotarea de dioxid de carbon (0,085 m³/h) pentru a se asigura un control adecvat al temperaturii. Concentrația de oxigen dizolvat în must a crescut în prima zi pentru a atinge aproximativ 1,3 mg/l și a fost ulterior redusă la aproximativ 0,1 mg/l până în ziua a cincea. în al doilea experiment, vasul de colectare a mustului a fost purjat timp de 3 h cu 0,85 m³/h dioxid de carbon înainte de umplere. Preluarea inițială de oxigen a fost scăzută puternic și mustul cu conținutul dorit de oxigen (<0,1 mg/l) a fost obținut în 2 zile.

RO 122457 Β1

.....X.....cli 1),085 ft/'h diotid de cafbon dupl umplerea rczcnoiutiu

Kcarrvor de must prc-puij»( timp de 3 h ta β,ίί mVh —4— Btecnxx de nwm pre-patjtț ți tnutl betbetet In mnpd umpterit

Fig. 5.9. Controlul oxigenului dizolvat în must în timpul transferului din fabrica 17 London. Au fost evaluate trei protocoale de umplere, cel de-al treilea fiind pur și simplu o combinație a celor două metode anterioare. Temperatura mustului a fost menținută 19 la 4’C.

în experimentul final, rezervorul a fost pre-purjat ca mai sus și s-a introdus o barbotare continuă de dioxid de carbon (0,085 m³/h) prin procesul de umplere, cât și pe timpul perioadei 23 de păstrare. Conținutul de oxigen dizolvat a fost menținut la minimum (<0,1 mg/l) pe parcursul fazei de păstrare. în consecință, această metodă a fost adoptată ca protocol pentru toate 25 colectările viitoare de must.

5.1.2 Protocol de curățare și sterilizare 27

Rezervoarele de colectare a mustului au fost supuse unui ciclu de curățare constând dintr-o pre-clătire cu apă fierbinte (85°C), o clătire caustică de curățare (40% caustică la 60°C) 29 urmată de o post-clătire cu apă fierbinte (85°C). Sterilizarea acestor vase a fost realizată prin aducerea pereților în contact o soluție de acid peracetic (2% greut./vol.). Tubulatura de 31 transfer a mustului a trecut de asemenea prin același regim de curățare și sterilizare.

Bioreactoarele de 501 au urmat un protocol diferit de curățare și sterilizare. Sistemele 33 au fost clătite cu apă fierbinte (60°C) și apoi umplute până la partea superioară cu apă caldă la 40°C. La această apă s-a adăugat apoi un agent industrial de curățare, Diversol CX/A 35 (DiverseyLever, Canada), pentru a forma o soluție 2% greut./vol. S-a barbotat aer în partea inferioară a reactorului cu o viteză superficială a gazului de 5 mm/s pentru a asigura dizol- 37 varea adecvată și contactul adecvat cu reactorul. După un timp de contact de o oră, reactorul a fost golit și curățat cu apă proaspătă din rețea. Această procedură de curățare a fost repe- 39 tată o a două oară, culminând cu două cicluri de umplere-golire cu apă de rețea rece.

Vasul de bere de deversare a fost curățat utilizând o soluție 2% greut./vol. Diversol 41 CX/A. Spre deosebire de bioreactoarele cu injecție de gaze, nu s-a utilizat barbotajul deoarece WBT nu a fost prevăzut cu pulverizator. Agitarea mecanică a fost realizată prin rosto- 43 golirea acestui vas pe parte. Acest ciclu a fost repetat de două ori și a fost urmat de două cicluri de umplere-golire cu apă. 45 înainte de sterilizarea cu aburi, bioreactoarele de 50 I au fost conectate la vasul de bere de deversare și s-a deconectat conducta de alimentare cu must, așa cum s-a întâmplat 47 și cu conducta de gaz barbotare. Supapele V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17 și V18

RO 122457 Β1 au fost deschise și filtrele F5, F6 și F7 au fost eliminate. Aceste conducte de gaz și filtrele au fost autoclavizate separat timp de 15 min la 121 °C. Alimentarea cu aburi a fost conectată la supapele V12 și V16. Supapa de aburi a fost deschisă încet, pentru a minimiza deteriorarea echipamentului și temperatura din interiorul reactorului a fost monitorizată atent. S-a realizat o sterilizare de 1 oră odată ce s-a atins o temperatură internă de 10O’C. Supapele V10, V11, V14, V15 și V18 au fost închise primele. Apoi a fost întreruptă alimentarea cu aburi și s-a conectat filtrul sterilizat F7. Filtrele sterilizate F5 și F6 au fost conectate imediat la conducta de alimentare cu gaz și s-a început cu o viteză superficială a gazului dioxid de carbon de 3 mm/s. Acest curent de gaz nu numai că a asigurat faptul că reactoarele nu vor prăbuși în timpul răcirii, dar au înlocuit de asemenea orice aer prezent în bioreactoarele de 50 I cu injecție de gaze.

Conducta de alimentare cu must a fost conectată la bioreactor după ce s-a atins o temperatură internă de 20°C. Cu supapele V2, V5, V10 și V14 tot în poziția închis și cu supapele V6, V7, V8, V9, V11, și V15 deschise, alimentarea cu aburi a fost conectată fie la V3, fie la V6, depinzând de alimentarea cu must utilizată. Ciclul de aburire a durat timp de 1 oră, timp după care supapele V9, V11 și V15 au fost închise simultan cu alimentarea de aburi. Odată ce conductele au atins temperatura camerei (20°C), supapele V3 și V6 au fost închise și alimentarea cu aburi a fost deconectată. în acest punct, întregul sistem de fermentație continuă, inclusiv alimentarea cu must, bioreactoarele de 50 I și rezervorul de bere de deversare a fost sterilizat și gata pentru fermentație.

5.1.3 Protocol de fermentație

Bioreactoarele pilot de 50 I cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze au fost utilizate pentru fermentația primară continuă a mustului de bere în bere. O manta termică cu glicol a furnizat controlul temperaturii, cu o temperatură a lichidului de 15°C vizată pe parcursul tuturor încercărilor de fermentație. Fiecare reactor a fost echipat cu o sondă de temperatură în scopuri de măsurări și un termocuplu pentru temperatură și supapă cu solenoid pentru glicol, pentru ajustarea alimentării cu glicol în reactor. Linurile de fermentare cu injecție de gaze au fost de asemenea echipate cu un gaz de amestecare primară (dioxid de carbon sau azot), cât și cu o alimentare de aer pentru dozarea oxigenului. Amestecul dorit de gaz a fost selectat prin ajustarea combinației adecvate rotametru/supapă cu ac și apoi trecând acest amestec gazos printr-un filtru steril (unitate de filtrare Millipore, Millex®-FG50, 0,2 pm) și în țeava de aspirație a bioreactorului. în reactor a fost injectată o viteză superficială a aerului de 0,39 mm/s (0,4 scfh) pentru toate fermentațiile, în timp ce debitul gazului de amestecare primară a fost ajustat pentru a se potrivi cu tipul specific de imobilizare.

Bioreactorul de 50 I cu injecție de gaze a urmat o pornire tradițională în șarje înainte de pornirea modului de funcționare continuu. După curățarea și sterilizarea descrise în secțiunea 5.1.2. bioreactorul cu injecție de gaze a fost umplut cu 501 de must din rezervoarele de colectare a mustului (WT1 sau WF2) și apoi injectat cu 200 grame de drojdie (4 g/l) prin orificiul steril de eșantionare Scandi-Brew®. în cazul sferelor de gel din k-caragenină, în reactor s-au injectat 20 I de sfere, producând o concentrație inițială de drojdie mediu floculantă LCC3021 de 4 g/l. Bioreactoarele au fost eșantionate zilnic și au fost monitorizate atent evoluția diacetilului și greutatea specifică a lichidului. Odată ce greutatea specifică și-a atins valoarea minimă, și concentrația de diacetil a scăzut sub 30 pg/l, s-a considerat că sistemul poate fi setat în funcționare continuă.

Mediul de fermentație (must) a fost alimentat continuu prin partea inferioară a reactorului în timp ce berea “verde” a debordat prin pâlnia din partea superioară a reactorului. După ce s-a fixat volumul de lucru al reactorului, selectarea debitului de must proaspăt introdus în reactor

RO 122457 Β1 a controlat timpul mediu de rezidență a lichidului. Din reactor s-au extras zilnic eșantioane 1 de lichid pe la evacuare prin supapele sterile de eșantionare (Scandi-Brew®) atât pentru analize chimice cât și microbiologice (metodele descrise în Capitolul 4). 3

La perioade de timp selectate, s-a colectat produsul de fermentație continuă din bioreactorul de fermentație primară de 50 I în cantități mari (vase din oțel inoxidabil de 40 I 5 sterile) și supuse prelucrării post-fermentație pentru a produce o bere finită, vandabilă pentru evaluarea și comparația cu bere produsă industrial. Bioreactorul de 50 I selectat a fost 7 deconectat de la vasul de bere de deversare și conectat imediat la vasul de colectare a berii.

Odată ce lichidul dorit a fost colectat, bioreactorul a fost reconectat la vasul de bere de 9 deversare. Berea “verde” colectată a fost supusă unei perioade de păstrare post-fermentație pentru a reduce nivelul de diacetil al lichidului sub 30 pg/l. Drojdia transportată cu lichidul a 11 fost lăsată să se depună și lichidul (concentrație de celule de -1-5 milioane celule/ml) a fost plasat în depozitare la rece pentru maturare (7 zile la 2°C). După perioada de maturare, 13 lichidul a fost filtrat, diluat la 5% alcool în volume și carbonatat înainte de a fi ambalat în sticle de bere de 341 ml. Tot lichidul ambalat a fost supus apoi pasteurizării prin echipamentul din 15 fabrica Labatt.

5.2 Procedeul de producție continuă de sfere de gel 17

Obiectivul acestei secțiuni de muncă experimentală a fost evaluarea unui procedeu de producție continuă de sfere de gel pentru producția de sfere de gel inoculate cu drojdie 19 pentru a furniza celule de drojdie LCC3021 imobilizate bioreactoarelor continue de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, descrise în secțiunea 5.1. 21

Procedeul de producție (fig. 8) a necesitat mai întâi formarea unei emulsii între faza continuă neapoasă (ulei vegetal) și faza dispersată apoasă (soluție de gel de κ-caragenină 23 amestecat cu celule de drojdie) cu utilizarea de amestecătoare statice. Acestei etape i-a urmat răcirea rapidă pentru a induce gelatinizarea polimerului. Sferele formate au fost intro- 25 duse apoi într-o soluție de clorură de potasiu care a promovat atât întărirea cât și separarea sferelor din faza uleioasă. 27

Formarea emulsiei de sfere de gel din κ-caragenină a fost condusă într-o baie cu apă, cu temperatura controlată la 37°C pentru a preîntâmpina gelatinizarea prematură a gelului 29 de caragenină. Polimerul sterilizat a fost menținut într-o baie cu apă cu temperatura reglată la 37°C și inoculatul de drojdie a fost menținut la 20°C înainte de imobilizare. Utilizând pompe 31 peristaltice Masterflex (Cole Parmer Company, USA), gelul și suspensia de drojdie au fost pompate prin 24 elemente ale amestecătorului static cu diametru de 6,4 mm pentru a dispersa 33 uniform celulele prin gel. Uleiul sterilizat, depozitat la temperatura camerei, a fost pompat (pompă peristaltică Masterflex) în baia de apă fierbinte pentru a atinge de asemenea o 35 temperatură de 37°C.

Polimerul inoculat (faza apoasă) a fost amestecat apoi cu uleiul (faza continuă) printr-o 37 altă serie de amestecătoare statice pentru a crea emulsia dorită. Această emulsie rezultată a fost răcită rapid la 5°C într-o baie de apă/gheață, provocând gelificarea picăturilor mici de 39 polimer în sfere. Sferele au trecut apoi într-o soluție sterilă de clorură de potasiu 22 g/l care a ajutat la întărirea lor și a permis separarea lor din faza uleioasă. Uleiul de prelucrare a fost 41 reciclat înapoi în procedeu și faza apoasă (sfere și soluția de clorură de potasiu) au fost transferate într-un rezervor separat pentru clasificarea pe dimensiuni înainte de încărcarea 43 în bioreactoarele de 50 I.

5.2.1 Amestecător static - tip Kenics 45 în inima acestui procedeu nou de producere a sferelor se află amestecătoarele statice

Kenics (Cole Parmer Instrument Company, Niles, Illinois, USA). Acestea sunt compuse dintr-o 47 serie de elemente staționare plasate într-un tub cu diametrul intern echivalent cu diametrul

RO 122457 Β1 amestecătorului static. Aceste elemente formează canale încrucișate, care promovează diviziunea și recombinarea pe înălțime a lichidului care curge prin amestecătorul static. Ruperea transversală a acestor linii de curent fine create într-o emulsie cu omogenitate crescătoare este provocată și mai mult de acest sistem de amestecare. Tabelul 5.2 listează cele trei tipuri de amestecătoare statice care au fost utilizate în acest studiu.

Tabelul 5.2

Descrierea amestecătoarelor statice Kenics utilizate, (furnizate de Cole Parmer)

Model	Diametrul D al amestecătorului static (mm)	Număr de elemente (Nr)
G-04667-04	6,4	12
G-04667-06	9,5	12
G-04667-08	12,7	12

5.2.2 Materiale pentru producerea gelului

Cele două materiale principale pentru producerea de sfere de gel au fost ulei și polimer, κ-caragenina (tip X-0909, lot 330360, Copenhagen Pectin, Denmark), un polimer polizaharidă extras din alge roșii, a fost un cadou generos de la Copenhagen Pectin A/S. Acest polimer posedă o proprietate unică de termo-gelatinizare, unde temperatura sa de gelatinizare depinde atât de concentrația κ-carageninei ([Car]) cât și a clorurii de potasiu ([KCI]). Polimerul a fost dizolvat până la o concentrație de 30 g/l în apă distilată la 80’C conținând 2,0 g/l de KCI. Soluția de gel rezultată a avut o temperatură de gelificare de 28°C. Gelul a fost autoclavizat timp de 1 oră la 121 ’C și apoi plasat într-o baie de apă la 40°C astfel încât nu s-a întărit. S-a sterilizat de asemenea ulei de porumb comercial (Pasquale Bros. Inc., Canada) timp de 1 oră la 121 °C și apoi a fost depozitat la temperatura camerei (20’C) până la utilizare. S-a preparat o suspensie de drojdie așa cum s-a descris în secțiunea 4.1.

5.2.3 Măsurarea diametrului sferelor

S-au colectat eșantioane de sfere la ieșirea de 5°C a schimbătorului de căldură, în baloane conținând 100 ml de soluție KCI 22 g/l. Sferele au fost lăsate să se înmoaie în această soluție timp de 2 h pentru a promova întărirea lor. Uleiul a fost eliminat din faza apoasă prin spălări succesive cu soluție de clorură de potasiu. Eșantioanele au fost apoi depozitate la 4°C pentru a preveni contaminarea microbiană înainte de analiză.

Măsurarea diametrului sferelor s-a realizat utilizând programul de analiză a imaginii Optimas (versiunea 4.02, BioScan, Inc, USA) legat la o cameră video (Pentax Macro 50 mm). Un eșantion de sfere a fost transferat într-un vas Petri conținând o peliculă fină de apă (utilizată pentru a separa sferele) și plasat apoi sub cameră. S-a măsurat un total de 300 până la 400 sfere utilizând acest sistem. Capacitățile programului Optimas se află între 100 pm și mai mulți mm cu o eroare absolută maximă de 30 pm. Datele obținute de la Optimas au fost analizate mai departe utilizând Microsoft Excel. Distribuțiile granulometrice rezultate ale eșantioanelor au fost caracterizate de diametrul mediu al eșantioanelor (D_B) și coeficientul de variație (COV).

5.2.4 Evaluarea sistemului cu sfere - plan experimental

S-a comparat un numărtotal de 3 diametre de amestecător static (D_s=6,4 mm, 9,5 mm și 12,7 mm) pentru a se evalua care tip de populație de sfere s-ar produce așa cum s-a măsurat prin diametrul mediu ai sferelor din eșantion și coeficientul de variație al distribuției granulometrice. Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a variat între 12 și 120 elemente în timp ce fracțiunea volumetrică a polimerului (e_c) a fost studiată între 8,3% v/v și 50% v/v gel în soluție uleioasă. Peste un e_c de 50%, fazele dispersate (gel) și continue (ulei) s-au inversat, adică, a rezultat includerea de picături fine de ulei în matricea de polimer în loc de

RO 122457 Β1 picături fine de gel în matricea uleioasă. Viteza superficială a lichidului emulsiei ulei-gel prin 1 secțiunea de emulsie a fost ajustată în domeniul 3,6 cm/s și 17,8 cm/s. Viteza superficială a lichidului (V_SL) prin amestecătorul static de emulsie a fost calculată de ecuația următoare: 3

VsL⁼(Q_ui_ei + Q_car)/S unde S este aria secțiunii transversale a tubulaturii care conține amestecătorul static, Q_u,_ei 5 este debitul volumetric ai fazei uleioase și Q_car este debitul volumetric al soluției de gel de caragenină. 7

Rezultate și discuție: fermentații și dinamica amestecării în bioreactoare de 501 cu injecție de gaze 9

Utilizarea celulelor imobilizate pentru producția de etanol a fost publicată, în ultimele două decenii, cercetătorii au încercat să optimizeze procesul de producție al etanolului prin 11 cuplarea tehnologiei celulelor imobilizate cu prelucrarea continuă (Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella, 1983). Mulți au reușit cu succes și utilizarea sistemelor continue cu celule imobili- 13 zate pentru producția de etanol a devenit industrială. Cu toate acestea, implementarea unui asemenea procedeu continuu în industria berii pentru fermentația primară a berii nu este așa 15 de simplu. Berea cuprinde nu numai etanol, dar de asemenea nenumărați compuși de aromă, care adaugă atât complexitate cât și profunzime produsului final. Capitolul următor descrie 17 rezultatele obținute de autor în căutările pentru producerea unei beri foarte bine echilibrată în linul de fermentare pilot GLDT. 19

6.1 Fermentații în șarje în sistemul pilot GLDT

Fermentațiile în șarje utilizând celule de drojdie suspendate liber au fost conduse în 21 bioreactorul de 50 I pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. Aceste încercări au furnizat oportunitatea de evaluare a fezabilității utilizării unui asemenea sistem pentru 23 fermentația mustului în bere. în plus, încercările au servit la stabilirea unui reper pentru comparațiile viitoare cu lichidele de fermentație continuă. Au fost executate două fermentații 25 discontinue în bioreactorul de 50 I utilizând o tulpină de drojdie lager de la Labatt Culture Collection (LCC3021). Au fost monitorizate pe parcursul fermentațiilor viteza de creștere a 27 drojdiei, cât și consumul de elemente nutritive și eliberarea de produși.

Fig. 6.1 și 6.2 prezintă concentrația de drojdie și profilele de viabilitate pentru fermen- 29 tația în șarje 1 și respectiv 2. în ambele cazuri, creșterea drojdiei a urmat vitezele clasice raportate în literatură. Viabilitățile măsurate prin albastru de metilen au rămas ridicate peste 31 tot, cu valori rămânând în domeniul apropiat de nouăzeci de procente. Profilele de concentrație ale carbohidraților pentru șarjele 1 și 2 sunt prezentate în fig. 6.3 și 6.4. Zaharurile 33 simple, glucoza și fructoza, au fost preluate mai întâi de drojdie, urmate de consumul de maltoză și maltotrioză. Nivelurile de maltotetroză cât și polizaharide mai mari au rămas 35 neschimbate pe parcursul fermentației.

Etanolul este unul dintre cele mai importante produse secundare ale metabolismului 37 drojdiei. O fermentație anaerobă optimizată va produce aproximativ 48 g de etanol și 47 g de dioxid de carbon per 100 g de glucoză metabolizată. Se vor produce de asemenea cantități 39 mici de glicerol (3,3 g per 100 g glucoză), deoarece acest produs secundar este implicat în menținerea echilibrului redox în drojdia de fermentație, cât și în susținerea celulei în echilibrul 41 ei osmotic, în particular în medii hipertonice. Fig. 6.5 și 6.6 ilustrează evoluția concentrațiilor de etanol și glicerol în timpul de fermentație. Nivelurile de etanol cresc foarte încet la începutul 43 fermentației datorită prezenței oxigenului în mediul de fermentație, deoarece celulele de drojdie sunt în faza lor de creștere aerobă. Odată ce oxigenul a fost consumat, nivelurile de 45 etanol cresc exponențial până când se epuizează zaharurile fermentabile, moment în care nivelurile concentrațiilor se plafonează. Dicetonele apropiate sunt de asemenea produse se- 47 cundare importante ale metabolismului drojdiei. Concentrațiile de diacetil total și pentandionă

RO 122457 Β1 pentru șarjele 1 și 2 sunt furnizate în fig. 6.7 și 6.8. Acești compuși cresc până la aproximativ 40 h în fermentație, corespunzând nivelurilor de vârf ale concentrației de drojdie și sunt un rezultat al sintezei aminoacizilor pe care o suferă drojdia în timpul fazei de creștere. în timpul ultimei porțiuni a fermentației, diacetilul, pentandiona și precursorii lor, α-acetolactat și acetobutirat, sunt convertite de drojdie în diolii acestora, mai puțini activi din punct de vedere al aromei.

Din rezultatele prezentate în această secțiune, se pare că cele două fermentații în șarje au continuat normal în țeava de aspirație pentru injecție de gaze din bioreactor. Creșterea drojdiei și absorbția de carbohidrat au urmat căile așteptate, așa cum s-a întâmplat și cu produșii secundari, etanol, diacetil și pentandionă. O comparație a datelor șarjei individuale indică faptul că cele două șarje au fermentat în moduri foarte similare. Fig. 6.9 compară concentrația de etanol din șarjele 1 și 2. Curbele individuale urmează același profil, cu multe dintre punctele datelor suprapunându-se, indicând un nivel de repetabilitate. Deși secvența de consum a substraturilor și producerea ulterioară de produși nu s-a schimbat în sistemul cu injecție de gaze, viteza de fermentație s-a schimbat, încheierea fermentației primare reprezentată de concentrația de etanol de vârf a fost obținută în ambele șarje la aproximativ 80-85 ore. Reducerea de diacetil sub 30 pg/l a fost obținută după încă 20 ore. Aceste rezultate sugerează că fermentația primară a mustului cu greutate mare poate fi încheiată în aproximativ 100 h comparativ cu 120-168 h pentru fermentația lager tradițională în șarje. Agitarea asigurată de bioreactorul cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze a contribuit la această reducere a timpului de fermentație datorită transferului de masă îmbunătățit, permis de asemenea sisteme. Cu aceste informații, încercările viitoare de fermentație au fost realizate cu încrederea că bioreactorul cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze nu a modificat semnificativ metabolismul fermentației drojdiei și că fermentând cu drojdie suspendată liber în acest sistem se poate reduce timpul de fermentație în șarje cu cel puțin 20 ore.

y o

.S «M*· tu

C y

y c

o

O

. Cooccnws) a celulita

Viabilitate

Fig. 6.1. Concentrația totală de celule și viabilitatea față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 1 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

RO 122457 Β1

Fig. 6.2. Concentrația totală de celule și viabilitatea față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 2 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

Polizați aride Maltoză

Makotriozi

- Glucoză

-e— Msltotetrozfl A- Fructoză

Fig. 6.3. Profilele de concentrație a carbohidrațilorfață de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 1 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

RO 122457 Β1

Fig. 6.4. Profilele de concentrație a carbohidrațilorfață de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 2 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

...........................................

-tIj—Etanol O~ Glicerol

Fig. 6.5. Concentrațiile de etanol și glicerol față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 1 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

RO 122457 Β1

Fig. 6.6. Concentrațiile de etanol și glicerol față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 2 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

Fig. 6.7. Concentrațiile de diacetil și pentandionă față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 1 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

RO 122457 Β1

Fig. 6.8. Concentrațiile de diacetil și pentandionă față de timpul de fermentație pentru fermentația în șarje 2 cu drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

o o

.2 ***· <3 fc

C

U

O d

O u

♦ Șarja 1 O șarja 2

Fig. 6.9. Comparația concentrației de etanol pentru șarja 1 și șarja 2 față de timpul de fermentație. A fost utilizată drojdie LCC3021 într-un bioreactor GLDT pilot.

6.2 Purtători de imobilizare

Pe parcursul acestui proiect de cercetare au fost investigați mai mulți purtători, pentru a identifica cele mai promițătoare alternative pentru munca de cercetare viitoare. Au fost testate trei moduri distincte de imobilizare în bioreactorul de 501 cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. Au fost evaluați doi purtători de adsorbție disponibili comercial, cu dimensiuni în domeniul între 1 și 2 mm. Au fost testate Siran®, un purtător din sfere de sticlă furnizat de Schott Engineering (fig. 9), și Celite®, sfere din kiselgur furnizate de World Minerals (fig. 10), din cauza ușurinței de manipulare a acestora, și disponibilității comerciale. Purtătorii pe bază

RO 122457 Β1 de adsorbție asigură oportunitatea unei exploatări mai aseptice deoarece reactorul poate fi 1 încărcat mai întâi cu purtător, urmată de sterilizarea la poziție și inocularea finală de drojdie direct în reactor. Dintr-un punct de vedere industrial, această opțiune este foarte atractivă 3 deoarece purtătorul nu necesită depozitare specială și instalația nu va trebui să-și modifice semnificativ practicile de inoculare. 5

Rezultatele fermentației inițiale cu ambii purtători în bioreactorul de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze au fost nefavorabile. Problemele care au apărut s-au datorat 7 în principal densității ridicate a particulelor de Siran® și Celite® comparativ cu mediul lichid. Sistemele trifazice cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze funcționează cel mai bine 9 când raportul dintre densitățile purtătorului și lichidului este menținut apropiat de unitate. în cazul Siran®, raportul a fost 1,34, în timp ce raportul pentru Celite® a fost 1,31. Consecința 11 existenței unor asemenea diferențe mari de densitate între fazele lichidă și solidă a fost o creștere semnificativă a vitezei minime a gazului de fluidizare necesară pentru exploatarea 13 bioreactorului de 50 I cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze. Pentru 4 I de purtător Siran® (încărcare solide 8% v/v), a fost necesară o viteză a gazului de 21,5 mm/s (pe baza 15 diametrului țevii de aspirație) pentru a se realiza circulația. Această viteză mai mare a gazului nu a fost o problemă semnificativă atunci când testarea a fost realizată într-o soluție apoasă, 17 totuși, imediat ce mediul lichid a fost mustul, în sistemul cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze (GLDT) a apărut o defecțiune catastrofică. Viteza necesară a gazului a provocat o 19 spumare excesivă în reactor, care în final a redus nivelul de lichid sub țeava de aspirație, stopând efectiv circulația de lichid și solide. Un eșec similar celui întâlnit la Siran® a apărut 21 și atunci când materialul de imobilizare a fost substituit cu Celite®. Datorită acestor rezultate, ambii purtători pe bază de adsorbție au fost abandonați în încercările de fermentație cu 23 injecție de gaze viitoare.

Utilizarea unui purtător pe bază de înglobare cum ar fi κ-caragenină a permis încăr- 25 carea sistemului cu 40% (v/v) solide și a necesitat aproximativ 0,17 m cubi standard pe oră de gaz (viteză superficială a gazului de 5,8 mm/s) pentru fluidizarea acestuia și circulația 27 ulterioară. Rezultatele pozitive avute cu exploatarea sistemului cu sfere de caragenină cu drojdie înglobată s-au datorat densității mai reduse a purtătorului (aproximativ 1100 kg/m³) 29 și ușurința ulterioară a fluidizării. în mod similar, încărcările dorite cu solide cu drojdia autoagregantă LCC 3021 (mediu floculantă) și LCC290 (superfloculantă), s-au realizat cu viteze 31 de fluidizare a gazului de aproximativ 3 mm/s necesare pentru a asigura o circulație adecvată. Secțiunea 6.2.1 descrie mai detaliat purtătorul cu gel de κ-caragenină iar secțiunea 6.2.2 33 descrie flocoanele de drojdie autoagregantă LCC3021 și flocoanele LCC290 care au fost evaluate ca matrici de imobilizare pentru fermentația continuă primară în linul de fermentare 35 de 50 I GLDT.

6.2.1 Sfere de gel din κ-caragenină. 37

Metodele imobilizării pe bază de înglobare necesită includerea celulelor de drojdie în matrice înainte de introducerea acestora în vasul de fermentație. Deoarece inocularea in 39 situ a reactorului nu este fezabilă în acest moment, este necesar să se producă aceste sfere de gel înainte de începerea fermentației. Nu este încă clar ce efecte are depozitarea pe 41 termen lung asupra sferelor de gel inoculate. Pentru a minimiza orice potențial negativ al efectelor depozitării, s-a decis să se producă cantități mari de sfere de gel într-o perioadă 43 scurtă de timp (8 h). Prin urmare, în acest scop a fost utilizat procedeul amestecătorului static pentru sfere descris în Secțiunea 5.2. Sferele ideale au diametre ale particulelor (D_B) între 45 0,8 mm și 1,4 mm cu coeficientul de variație (COV) al distribuției granulometrice menținut la minimum. A fost necesar să se ajusteze mai mulți parametri ai procesului de fabricație al 47 sferelor pentru a se produce cantitatea dorită și consistența sferelor. Următoarea secțiune prezintă un rezumat al selecției parametrilor procesului pentru sfere și Secțiunea 6.2.1.2 49 descrie sferele utilizate în încercările de fermentație continuă.

RO 122457 Β1

6.2.1.1 Procedeul de producție al sferelor: Selecția variabilelor.

Caracterizarea procesului de fabricație al sferelor a fost realizată în colaborare cu alți cercetători, cu precădere asupra următorilor parametri de proces diametrul amestecătorului static (D_s), numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s), debitul superficial de lichid (V_SL) și fracțiunea de volum polimeric (e_c). Fig. 6.12 până la 6.21 rezumă rezultatele obținute în acest experiment.

Fig. 6.12 ilustrează o distribuție granulometrică tipică obținută utilizând procedeul amestecătorului static pentru a imobiliza drojdia în gelul de caragenină. în acest exemplu, s-au utilizat următorii parametri: diametrul amestecătorului static de 12,7 mm, 60 elemente ale amestecătorului static, viteza superficială a lichidului de 10,5 cm/s, și fracțiunea de volum polimeric de 0,25. Diametrul mediu al sferelor a fost măsurat la 701 pm cu un coeficient de variație de 45%. Distribuția granulometrică cumulativă ilustrată în fig. 6.13 a părut să se fiteze cu o distribuție cumulativă normală calculată cu media de selecție și abaterea standard. S-a utilizat metoda lui Kolmorogof Smirnov (Scheaffer și McCIave, 1990) pentru a testa normalitatea. Distanța maximă dintre datele experimentale și datele fitate (K-S statistic D) s-a calculat la 0,0274. Valoarea D modificată corespunzând datelor urmând o distribuție normală trebuie să se situeze sub 0,895 la un nivel de încredere de 95%. în cazul nostru, valoarea D modificată a fost calculată la 0,174, cu mult sub limita de 0,895, și se poate concluziona că datele noastre se potrivesc unei distribuții normale.

Toate datele colectate din acest procedeu de fabricație a sferelor au arătat distribuții granulometrice cu doar un vârf. Cu toate acestea, Poncelet și colab. (1992) au arătat apariția de vârfuri satelit și/sau a unui vârf secundar corespunzând sferelor cu diametre mai mici de 200 pm pentru sfere de alginat produse prin dispersia într-un rezervor agitat. Este posibil ca sferele mai mici produse în procedeul nostru să se piardă pur și simplu în timpul etapei de spălare a sferelor și prin urmare nu apar în datele noastre despre distribuția granulometrică.

Efectele vitezei superficiale a lichidului și diametrul amestecătorului static asupra diametrului mediu al sferei și asupra coeficientului de variație al distribuției granulometrice sunt descrise în fig. 6.14 și respectiv 6.15. Diametrul mediu al sferelor scade odată cu o creștere a vitezei superficiale a lichidului pentru toate trei diametrele amestecătorului static cu un efect mai pronunțat la amestecătorul static de 12,7-mm. Nu au fost produse sfere cu diametre medii mai mari de 700 pm cu amestecătoarele statice cu diametre mai mici (6,4 mm și 9,5 mm) la toate vitezele de lichid testate, în timp ce amestecătorul static de 12,7 mm a produs sfere mai mari de 700 pm la viteze ale lichidului sub 11 cm/s. Toate trei diametrele de amestecătoare statice au produs sfere cu coeficienți de variație între 38% și 58%. A părut de asemenea că pe măsură ce viteza a crescut, a scăzut coeficientul de variație în toate trei cazurile. Coeficientul de variație a variat cu diametrul amestecătorului static, valorile cele mai scăzute fiind produse cu amestecătorul static cu diametrul cel mai mic.

La o viteză superficială a lichidului de 3,5 cm/s, fracțiunea de volum polimeric a părut să afecteze diametrul mediu al sferei, în timp ce vitezele peste 7 cm/s nu au produs diferențe relative la valorile experimentale ale e_c variind între 0,083 și 0,5 (fig. 6.16). A părut să existe un mic efect sau să nu existe deloc un efect asupra coeficientului de variație prin fracțiunea de volum polimeric cu creșterea vitezelor superficiale ale lichidului (fig. 6.17). Fig. 6.18 și 6.19 ilustrează efectele vitezei superficiale a lichidului și numărul de elemente ale amestecătorului static asupra diametrului mediu al sferelor. Pe măsură ce viteza lichidului a crescut, diametrul mediu al sferelor a scăzut pentru toate variațiile numărului de elemente ale amestecătorului static (fig. 6.18). Diametrul mediu al sferelor la o anumită viteză a lichidului a fost similar pentru 24 elemente până la 120 elemente în timp ce configurația cu 12 elemente a produs diametre ale sferelor mai mari decât celelalte cinci configurații testate. Fig. 6.19 arată de asemenea că diametrul mediu al sferelor atinge un minim la peste 24 elemente ale amestecătorului static.

RO 122457 Β1

Fig. 6.20 descrie efectul vitezei superficiale a lichidului asupra coeficientului de variație 1 pentru mai multe numere de elemente ale amestecătorului static. A părut că viteza lichidului nu a afectat coeficientul de variabilitate pentru toate configurațiile testate. Efectul numărului 3 de elemente ale amestecătorului static asupra coeficientului de variabilitate a fost mult mai pronunțat (fig. 6.21). Coeficientul de variație a scăzut odată cu o creștere a numărului de 5 elemente ale amestecătorului static și a atins un minimum de 45% la 60 elemente și peste acesta. Aceste rezultate au fost corespunzătoare pentru viteze superficiale ale lichidului în 7 domeniul 3,6 cm/s și 17,8 cm/s.

S-a emis ipoteza că o creștere a diametrului elementelor amestecătorului static (D_s) 9 ar crea eterogenitate a forțelor de forfecare în amestecător, inducând o creștere a dispersiei granulometrice măsurată prin coeficientul de variație. în mod corespunzător, o creștere a D_s 11 va scădea intensitatea forțelor de forfecare crescând astfel diametrul mediu al sferei. Ambele efecte au fost observate în experimentul cu amestecătorul static cu diametrul cel mai mic 13 producând sfere cu cel mai mic diametru mediu al sferelor (400 pm - 500 pm) și cel mai mic coeficient de variație (aproximativ 40%) sau dispersie granulometrică. 15

Energia necesară pentru a crea o emulsie este proporțională cu aria interfacială creată de polimer și faza uleioasă. Cu cât dimensiunea sferelor este mai mică, cu atât mai mare este 17 energia necesară pentru formare. Berkman și Calabrese (1988) au arătat că o creștere a vitezei superficiale medii a lichidului (V_s) provoacă o creștere a energiei disipate per unitate 19 de masă a fluidului, favorizând astfel o reducere a dimensiunii sferei. O creștere a vitezei superficiale medii a lichidului (testată între 3,6 cm/s și 17,8 cm/s) a produs o scădere a dimen- 21 siunii medii a sferei. O asemenea creștere a vitezei are ca rezultat o diferență de presiune între admisia și evacuarea amestecătorului static. Această diferență de presiune este prapor- 23 țională cu energia disipată per unitate de masă a lichidului. O creștere a vitezei induce prin urmare o creștere a energiei disipate a sistemului, care favorizează o reducere a dimensiunii 25 sferei. Reducerea diametrului sferei, D_B, a fost observată pe măsură ce au crescut vitezele superficiale ale lichidului. Al Taweel și Walker (1983) au arătat că s-a stabilit un echilibru 27 dinamic între formarea de sfere și coalescența dintre sfere pentru viteze mari corespunzând unor niveluri semnificative de turbulență. Pentru un diametru constant al amestecătorului 29 static (D_s) și numărul de elemente (N_s), viteza superficială a avut un efect redus asupra coeficientului de variație. Prin urmare, viteza este un parametru, care permite manipularea și 31 selecția diametrului mediu al sferei fără modificarea semnificativă a dispersiei granulometrice.

în întinderea acestei cercetări, fracțiunea de volum de gel de caragenină (e_c) a avut 33 un efect redus atât asupra diametrului mediu al sferei cât și asupra coeficientului de variație, în afară de cea mai joasă viteză studiată de 3,6 cm/s unde diametrul mediu al sferei a scăzut 35 la o scădere a e_c. Audet și Lacroix (1989) au studiat acest parametru pentru producerea sferelor de caragenină într-un sistem de dispersie bifazic (procedeu cu amestecător static 37 necontinuu cu rezervor agitat în șarje) și au concluzionat că e_c nu a avut efect asupra diametrului mediu al sferei pentru o soluție de polimer cu o concentrație de caragenină de 3% 39 (greut./vol.). Efectul specific al concentrației de gel de κ-caragenină asupra distribuției granulometrice a sferelor a fost examinat de Audet și Lacroix (1989) care au arătat că acest 41 parametru a influențat puternic distribuția granulometrică. Creșterea concentrațiilor de gel a avut ca rezultat creșterea diametrului mediu al sferelor (D_B) și coeficientul de variație (COV). 43 Efectul remarcat a fost atribuit viscozității crescute a gelului la concentrații mai mari având ca rezultat forțe de forfecare mai reduse asupra emulsiei și astfel sfere mai mari. Deși efectul 45 concentrației de gel asupra dimensiunii sferelor nu a fost investigat în această teză, acesta poate fi folosit ca un alt mijloc de control al dimensiunii sferelor, dacă este necesar. 47

RO 122457 Β1

O creștere a numărului de elemente de amestecare (N_s) crește timpul mediu de rezidentă al unui element fluid în interiorul amestecătorului static, având ca rezultat un amestec mai omogen și astfel formarea de sfere mai mici și dispersate mai strâns. în experiment, s-a atins un echilibru al dispersiei (măsurat prin coeficientul de variație) în jurul a 60 până la 72 elemente. Middleman (1974) a arătat că 10 elemente au fost suficiente pentru a atinge un asemenea echilibru în cazul emulsiilor cu viscozitate redusă (0,6 până la 10 cP). Soluția de caragenină utilizată în aceste experimente [3% greut./vol.)] a avut o viscozitate medie de 200 cP iar viscozitatea uleiului a fost 25 cP. în consecință, această viscozitate mai mare a necesitat un timp de rezidență mai mare în amestecător pentru a se atinge pseudoomogenitatea.

Fig. 6.12. Distribuția granulometrică tipică a sferelor produse utilizând procedeul amestecătorului static. Parametrii de procedeu din acest exemplu au fost: D_s=12,7 mm, N_s=60, V_sl=10,5 cm/s și e_c=0,25.

Fig. 6.13. Distribuția granulometrică cumulativă tipică a sferelor produse utilizând procedeul amestecătorului static. Parametrii de procedeu din acest exemplu au fost: D_s=12,7 mm, N_s=60, V_SL=10,5 cm/s și e_c=0,25.

RO 122457 Β1

• Ds=>12.7 Os=9.5 ADe»6.4

Fig. 6.14. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de diametrul mediu al sferei (μ_Μ). Au fost evaluate trei diametre diferite ale amestecătoarelor statice (D_s de 12,7 mm, 9,5 mm și 6,4 mm). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost menținut constant la 48 iar fracțiunea polimerică (e_c) a fost stabilită la 0,25.

Fig. 6.15. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de coeficientul de variație al diametrului sferelor (%). Au fost evaluate trei diametre diferite ale amestecătoarelor statice (D_s de 12,7 mm, 9,5 mm și 6,4 mm). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost menținut constant la 48 iar fracțiunea polimerică e_c) a fost stabilită la 0,25.

RO 122457 Β1

Fig. 6.16. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de diametrul mediu al sferelor (μ_Μ). Au fost evaluate patru fracțiuni polimerice (e_cde 0,5; 0,25; 0,125 și 0,083). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost menținut constant la 48 iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

C .Si o

ts <a o

U

♦e=0.5 »«=0.25 A ε--0.125 · 6*0.083

Fig. 6.17. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de coeficientul de variație al diametrului sferelor (%). Au fost evaluate patru fracțiuni polimerice (e_c de 0,5; 0,25; 0,125 și 0,083). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost menținut constant ia 48, iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

RO 122457 Β1

Fig. 6.18. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de diametrul mediu al sferelor (μ_Μ). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost variat la 12, 24, 48, 60, 72 și 120. Fracțiunea polimerică e_c a fost menținută constantă la 0,25, iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

»NtM2»Ns*24 ț lfr*0 O N»»72 · N*»120

Fig. 6.19. Viteza superficială a lichidului (cm/s) față de coeficientul de variație al diametrului sferelor (μ_Μ). Numărul de elemente ale amestecătorului static (N_s) a fost variat la 12, 24,48, 60, 72 și 120. Fracțiunea polimerică e_c a fost menținută constantă la 0,25 iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

RO 122457 Β1

Fig. 6.20. Diametrul mediu al sferelor (μ_Μ) față de numărul de elemente (N_s) ale amestecătorului static. Viteza superficială a lichidului (cm/s) a fost variată la 3,6; 7,0; 10,6; 13,2 și 17,8. Fracțiunea polimerică (e_c) a fost menținută constantă ia 0,25, iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

v Zs 'Z* u 2 £ 7« > 3

4» 5 T3 2

3 o ja cs -c s I , ** '· «»

70%

80%

50%

40%

30% •§10%

Sm· ^0%

Numărul de elemente ale amestecătorului static ♦V8L-3.6 eVSL»7.0 AV8L»iae «VSL-IS 2 O V8L-17.8

Fig. 6.21. Coeficientul de variație al diametrului sferelor (%) față de numărul de elemente statice (N_s) ale amestecătorului static. Viteza superficială a lichidului (cm/s) a fost variată între 3,6 și 17,8. Fracțiunea polimerică (e_c) a fost menținută constantă la 0,25, iar diametrul amestecătorului static (D_s) a fost stabilit la 12,7 mm.

6.2.1.2 Procedeul de producție a sferelor: caracteristicile sferelor de κ-caragenină Din datele descrise în secțiunea anterioară, a fost posibil să se selecteze parametrii de procedeu ai sferelor pentru a produce sfere cu caracteristicile dorite pentru încercările de fermentație. Pentru a minimiza coeficientul de variație pentru un diametru particular al amestecătorului static, au fost alese 60 elemente de amestecare pentru a crea o dispersia ulei-gel. Au fost selectate sferele cu un diametru mediu de aproximativ un mm pentru a minimiza transferul de masă extern și pentru a facilita separarea prin mijloace mecanice din lichidul în fermentație. Pentru a realiza aceasta, au fost selectate cel mai mare amestecător static testat (12,7 mm) și cea mai joasă viteză testată (3,6 cm/s). Deoarece fracțiunea polimerică a avut un efect redus asupra coeficientului de variație, s-a utilizat un raport 50/50 (e=0,5) de gel față de ulei pentru a maximiza productivitatea sferelor.

RO 122457 Β1

Au fost produse în laborator mai multe șarje de sfere de gel, cu drojdie LCC3021 1 înglobată, utilizând procedeul descris în Secțiunea 5.2 cu D_s=12,7 mm, N_s=60, V_SL=3,9 cm/s și e_c=0,5. Sferele rezultate (fig. 11) au fost trecute printr-o serie de site pentru îndepărtarea 3 sferelor mai mari de 2,0 mm și pe cele mai mici de 0,5 mm. Distribuția granulometrică a particulelor rezultată este prezentată în fig. 6.23. Fig. 6.24 ilustrează distribuția granulometrică 5 cumulativă a acestor sfere. Aceasta a fost distribuția tipică utilizată în încercările de fermentație cu linuri de fermentare de 50 I cu injecție de gaze. 7

Fig. 6.23. Distribuția granulometrică a sferelor de gel din κ-caragenină utilizate în încercările de fermentație continuă în bioreactorul de 50 I cu țeava de aspirație 23 pentru injecție de gaze.

Fig. 6.24. Distribuția granulometrică cumulativă a sferelor de gel din κ-caragenină utilizate în încercările de fermentație continuă în bioreactorul de 501 cu țeavă de aspirație 41 pentru injecție de gaze.

6.2.1.3 Limitări ale procedeului de obținere a sferelor în legătură cu aplicația pe scară industrială 45

A fost dezvoltat un procedeu de producere a 10 I de sfere pe oră, per amestecător static, și a fost implementat la nivelul unei instalații pilot. Mai multe aspecte ale acestui 47 procedeu necesită dezvoltare și/sau optimizare suplimentară înainte de luarea în considerație

RO 122457 Β1 a producției la scară industrială. Este necesară o creștere a productivității volumetrice a sistemului pentru a furniza volumul de celule imobilizate necesar pentru alimentarea unui bioreactor pe scară mare. De exemplu, un bioreactor de 2000-hl cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze va necesita aproximativ 800 hi de sfere. Pentru obținerea unor asemenea volume, este necesară o creștere atât a fluxului de gel cât și de ulei. Datele sugerează că viteza crescută rezultată utilizând amestecătoare statice cu diametre de 6,4 mm până la

12,7 mm va induce formarea de sfere prea mici pentru a fi utilizate în sistemul de fermentație. Prin urmare, va fi necesar să se crească diametrul amestecătoarelor statice, crescând astfel diametrul mediu al sferelor. Cu toate acestea, utilizarea de amestecătoare statice cu un diametru mai mare va crește de asemenea dispersia granulometrică a sferelor, producând un procent mai mare de sfere în afara domeniului dorit.

O altă alternativă arfi implementarea unui sistem utilizând amestecătoare statice de dimensiune medie (12,7 mm) plasate în paralel. Cu un sistem cu zece amestecătoare statice, productivitățile atingând 100 l/h sunt de conceput. Pentru exemplul industrial de 2000-hl, procedeul va trebui executat continuu timp de 800 h sau aproximativ 34 zile pentru a produce volumul necesar de sfere. Pot fi implementate mai multe sisteme pentru a reduce timpul de producție dar aceasta ar adăuga un alt nivel de complexitate. Timpul de producție poate să nu fie o problemă dacă ar fi posibil să se depoziteze sferele pe perioade întinse de timp păstrând în același timp viabilitatea drojdiei. Poate fi concepută dezvoltarea unui procedeu de uscare a sferelor sau depozitarea sferelor într-un container închis ermetic sub vid.

Poncelet și colegii (1993) au publicat o lucrare care indică faptul că trebuie considerat tipul de amestecator static utilizat pentru a crea dispersia. Cu sistemul propus de ei utilizând un alt tip de amestecător static, opus tipului Kenics utilizat în această cercetare, poate fi posibil să se utilizeze un amestecător cu un diametru mai mare fără compromiterea distribuției granulometrice a sferelor (menținând un coeficient redus de variație).

Grijile suplimentare în legătură cu procedeul pilot existent includ exploatarea sistemului la 40°C și utilizarea de soluții de ulei vegetal și clorură de potasiu pentru producția de sfere. Datorită temperaturii ridicate de producție, în acest proces sunt necesare atât sisteme de încălzire cât și de răcire. Șocul termic potențial la care sunt expuse celulele de drojdie necesită o investigație suplimentară astfel încât să se poată face o evaluare a implicațiilor negative potențiale. în acest studiu, au fost produse sfere cu celule imobilizate cu viabilități ridicate ale drojdiei (peste 90%) dar nici un alt efect pe care procedeul l-ar putea provoca populației de drojdie nu a fost investigat.

Deoarece uleiul este utilizat pentru a produce emulsia dorită și în consecință formarea sferelor, și deoarece uleiul va acționa ca un surfactant, prin aceasta suprimând formarea de spumă, reziduul de ulei pe suprafața sferei este o problemă. Deși acest reziduu va ajuta în timpul etapei de fermentație, orice transfer în berea finală va fi dăunător, deoarece spuma este dorită în produsele finite. Volumele mari de soluție de clorură de potasiu utilizate pentru a separa faza solidă (sferele) de ulei și metoda de eliminare a acestei soluții saline din suspensia de sfere înainte de introducerea sferelor în bioreactor necesită atenție. Altfel, poate fi necesar să se scurgă această soluție din reactor după adiția de sfere în reactor.

Deoarece sferele cu celule imobilizate sunt produse în afara bioreactorului, în timpul procedeului de formare a sferelor trebuie utilizate tehnici aseptice și trebuie menținută sterilitatea până când sferele sunt introduse în bioreactor. Diversele puncte de transfer dintre rezervoare furnizează oportunitatea de contaminare și trebuie monitorizate datorită faptului că prezența unui contaminant poate avea ca rezultat co-imobilizarea acestuia în sfere. Ca rezultat al strădaniei din laborator, a fost posibil să se producă în mod corespunzător sfere aseptice. Cu toate acestea, mediul din cadrul unei instalații poate să nu fie la fel de ospitalier ca laboratorul, necesitând prin urmare un control mai strict.

RO 122457 Β1

6.2.2 Celule de drojdie floculantă 1

Una dintre cele mai naturale forme de imobilizare este auto-agregarea de microorganisme în flocoane de celule. Calleja și Johnson (1977) au propus trei motive posibile pentru 3 celule de a veni în contact una cu cealaltă pentru a forma agregate, cu toate proprietățile de legare distinctive. Prima implică celule de diferite sexe atrase una către cealaltă prin elibe- 5 rarea de feromoni (a și a-factori). Acest tip de legare este temporar și implică legare proteinăproteină între a și a-aglutinine ancorate în pereții celulei complementare. 7

Celulele se pot agrega de asemenea în urma eșecului separării de celula mamă în timpul procesului de înmugurire. Acest eșec poate fi inerent tulpinii particulare de drojdie sau 9 poate fi cauzat de privarea de elemente nutritive sau mutația unui număr de gene. Acest fenomen este referit ca formare de catene și nu floculare. Legăturile dintre aceste celule pot 11 fi distruse ireversibil de forfecarea mecanică (Stratford, 1996). Al treilea scenariu este cunoscut mai obișnuit ca floculare. Stewart și Russell (1981) au definit flocularea ca un 13 “fenomen reversibil în care celulele de drojdie aderă în cocoloașe și fie sedimentează rapid din mediul în care sunt suspendate fie se ridică către suprafața mediului”. Probe extensive 15 indică faptul că flocularea este controlată genetic și mecanismul de floculare se bazează pe molecule selectate care acționează ca punți între pereții celulelor adiacente. Mai precis, se 17 crede că lecitinele specifice sunt legate de α-mananii celulelor adiacente în prezență de ioni Ca²⁺ (Calleja și Johnson, 1977). S-a găsit că această legătură proteină/carbohidrat a fost 19 inhibată reversibil de agenți chelatori sau de zaharuri specifice.

Fig. 12 descrie trei configurații posibile de celule de drojdie, și anume drojdie 21 nefloculantă, drojdie formatoare de catene și drojdie floculantă. în cazul drojdiei formatoare de catene, deși celulele s-au agregat, acesta nu este considerat ca un tip de floculare deoa- 23 rece aceste celule nu au fost singulare de la început și flocularea implică celule singulare care se adună împreună pentru a forma o masă din cauza condițiilor favorabile de mediu (ioni Ca²⁺ 25 și niveluri reduse de zaharuri inhibitoare). în cazul celulelorfloculante, dimensiunea specifică a flocoanelor poate depinde de genetica celulei cât și de condițiile hidrodinamice la care este 27 expusă celula (mediu de forfecare).

Fig. 13 și fig. 14 subliniază două tulpini de drojdie lager Labatt cu diverse grade de 29 floculare. Tulpina de drojdie mediu floculantă LCC3021, este prezentată în fig. 6.26. în prezența ionilor calciu, această tulpină va forma agregate de 0,5 mm până la 1,0 mm odată ce 31 glucoză a fost epuizată din mediul lichid. Fig. 14 este o imagine a tulpinii de drojdie superfloculantă, LCC290, care va forma flocoane cu dimensiuni mai mari de 1 mm și în condiții de 33 mediu de forfecare redusă se va agrega în cocoloașe măsurând până la 5 mm în diametru, în condiții moderate de agitare, diametrul floconului de LCC290 va fi între 1 și 2 mm. 35

Au fost propuse mai multe metode de măsurare pentru evaluarea floculării drojdiei (Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki și colab., 1997: Teixera și colab., 1991; Stewart & 37

Russell, 2000). în “Brewer’s Yeast” (Stewart & Russell. 2000), s-a propus că metodele de floculare a drojdiei pot fi subîmpărțite în trei categorii, și anume metode de sedimentare, me- 39 tode de fermentație statică și observarea directă a formării de flocoane în mediu de creștere.

Metoda de sedimentare descrisă inițial de Bums în 1937 a fost modificată de Helm 41 și colegii în 1953 și este parte curentă a metodelor standard de analiză recunoscute de Technical Committee și Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists 43 (1992). Această tehnică este referită ca tehnică in vitro, deoarece caracteristicile de sedimentare ale drojdiei sunt evaluate într-un tampon calciu-sulfat și nu în mediul de fermentație actual. 45 Metoda fermentației statice (cunoscută de asemenea ca metoda Gilliland) implică creșterea drojdiei în must cu hamei și măsurarea caracteristicilor de floculație ale acestuia in vivo. Ambele 47 aceste metode implică măsurări ale absorbantei eșantioanelor de drojdie sedimentată față de eșantioane de drojdie care au fost defloculate utilizând un spectrofotometru UV/vizibil. 49

RO 122457 Β1

Stewart și Russell (2000) prezintă o metodă de măsurare a floculației drojdiei prin descrierea vizuală a nivelului de floculare care apare în eșantioane de drojdie crescute în sticle de 20 ml cu capace filetate. Pentru a exprima gradul de floculare, aceștia au utilizat o măsură subiectivă, de exemplu: 5-extrem de floculant, 4-foarte floculantă; 3-moderat floculantă, 2-slab floculantă, 1-grosier și 0-nefloculantă. Tulpina de drojdie superfloculantă, LCC290 a primit o clasificare de 4-foarte floculantă în timp ce tulpina de drojdie LCC3021 a fost clasificată ca 3-moderat floculantă.

Floculența este o caracteristică importantă în industria de fabricare a berii, deoarece tendința naturală a drojdiei fie de a se sedimenta, fie de a se ridica la suprafață este utilizată în mod obișnuit ca o metodă de separare pentru această drojdie din lichidul de fermentație. Cu toate acestea, o tulpină de drojdie care floculează înainte de încheierea fermentației nu este de dorit, deoarece lichidul nu și-a atins nivelul ideal de alcool și zahăr rezidual. în fermentația continuă și, în particular, fermentația continuă cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, drojdia floculantă acționează ca o matrice de imobilizare. Tendința acestora la sedimentare este compensată prin injectarea de gaz de barbotaj, care le ține în suspensie. Cu un asemenea sistem, se elimină grija sub-fermentației mediului lichid, deoarece particulele solide sunt circulate continuu și menținute în contact intim cu lichidul în fermentație.

în secțiunea 6.2.2.1, au fost caracterizate proprietățile de sedimentare și performanța fermentației drojdiei superfloculante, LCC290. Interesul a fost în identificarea debutului floculării pentru această tulpină particulară de drojdie. în plus, a fost determinată viteza de sedimentare a drojdiei pentru a furniza informații valoroase care pot fi folosite în viitor pentru proiectarea de vase de sedimentare a drojdiei.

6.2.2.1 Caracterizarea drojdiei superfloculante, LCC290 înainte de realizarea de fermentații continue cu drojdia superfloculantă LCC290 în bioreactorul cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze, s-a decis să se caracterizeze drojdia prin fermentații în baloane agitate, la scară de laborator. Fig. 6.28 arată evoluția populației de drojdie în timp. Așa cum era de așteptat, concentrația a crescut brusc în primele 48 h apoi a rămas constantă cu o ușoară descreștere la sfârșitul fermentației. în primele 48 ore, au existat suficiente elemente nutritive și oxigen prezent în must pentru a permite creșterea drojdiei. Cu toate acestea, pe măsură ce drojdia continuă să consume carbohidrații în absența oxigenului, nu se va reproduce ci mai degrabă intră în faza de fermentație anaerobă. Odată ce alimentarea de carbohidrați s-a epuizat, o mică populație de drojdie a început să moară. Acest fenomen este descris în fig. 6.29, unde viabilitatea celulelor a scăzut de la aproximativ 97% până la aproximativ peste 90%.

Fig. 6.30 arată consumul de carbohidrați în cursul fermentației. Celulele de drojdie au consumat mai întâi zaharurile simple glucoza și fructoză apoi secvențial au preluat maltoza și maltotrioza. Cu toate acestea, drojdia de bere nu poate să metabolizeze fie maltotetroza fie polizaharidele cu catenă mai lungă (poli 1 și 2). Pe măsură ce concentrația globală de carbohidrat a scăzut (reprezentată de curba greutății specifice din fig. 6.31), concentrația de etanol a crescut proporțional. La aproximativ 37 h de fermentație, concentrațiile de etanol și carbohidrat au fost egale.

Dintr-o perspectivă a creșterii și a metabolismului carbohidraților, a părut că drojdia superfloculantă LCC290 s-a comportat, așa cum a făcut-o tulpina de drojdie industrială LCC3021. Fermentația a părut să ajungă la încheiere atunci când greutatea specifică a lichidului a atins aproximativ 2,7.°P. Este obișnuit pentru tulpinile de drojdie floculante să formeze cocoloașe

RO 122457 Β1 mari (flocoane) și să sedimenteze din soluție înainte deîncheierea fermentației; acestfenomen 1 este cunoscut în industria de fabricare a berii ca o fermentație ‘suspendată’. în încercările noastre în șarje, am fost capabili să încheiem fermentația deoarece baloanele au fost agitate, 3 menținând prin urmare drojdia în suspensie și în contact strâns cu alimentarea de elemente nutritive. 5

O altă caracteristică importantă care a fost investigată a fost capacitatea drojdiei de a flocula. în particular, am fost interesați în stabilirea vitezei, cu care ar sedimenta drojdia, 7 cât și obținerea unei indicații a momentului în care această tulpină de drojdie particulară va începe flocularea. Amândouă aceste caracteristici sunt de importanță pentru încercările de 9 fermentație continuă, deoarece acestea joacă un rol în menținerea unei populații sănătoase de drojdie în linul de fermentare cu injecție de gaze. Fig. 6.32 arată curbele de sedimentare 11 a drojdiei în cursul fermentației. în eșantionul testat la 24 h de fermentație a apărut foarte puțină sedimentare. Flocularea este inhibată de prezența anumitor zaharuri; glucoza este 13 un inhibitor cunoscut, deoarece flocularea va începe doar odată ce acest inhibitor s-a epuizat, în eșantionul la 40 h de fermentație în șarje, celulele au început să floculeze și s-au sedimen- 15 tat din soluție atunci când au fost testate utilizând metoda descrisă în secțiunea 4.7. Sedimentarea a fost foarte rapidă pentru toate intervalele testate, în afară de cel la 24 h când 17 nu a apăru nici o sedimentare. în timpul celei mai lente încercări de sedimentare, condusă la 40 ore, drojdiei i-au trebuit 90 s să sedimenteze complet în aparatul detestare. La 71 ore, 19 au fost necesare mai puțin de 50 s pentru sedimentare.

Cercetătorii au propus că viteza de sedimentare este o funcție de concentrația soli- 21 delor (Coe și Clevenger, 1916). Fig. 6.33 reprezintă grafic viteza de sedimentare a solidelor la o anumită concentrație a celulelor de drojdie. Punctele pentru această curbă au fost gene- 23 rate utilizând metoda propusă de Kynch (1952) asupra datelor de sedimentare colectate la fiecare interval de fermentație. Rezultatele află pe aproximativ aceeași curbă, confirmând 25 același fenomen pe care îl observaseră Coe și Clevenger (1916).

Rezultatele colectate în timpul testului de sedimentare au indicat că tulpina de drojdie 27 superfloculantă LCC290 va flocula la greutăți specifice ale lichidului de 6°P și mai jos. Această valoare poate fi utilizată ca un ghid pentru fermentații continue pentru a indica unde trebuie 29 menținută greutatea specifică a lichidului în stare pseudo-stabilă dacă se dorește menținerea celulelor floculate. Exploatarea reactorului peste 6°P riscă destabilizarea celulelor floculate 31 și este posibil să conducă la spălarea populației de drojdie imobilizată. Caracteristicile de sedimentare ale drojdiei superfloculante indică că populația de drojdie va sedimenta destul 33 de repede dacă este lăsată în stagnare. Cu un bioreactor trifazic cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, va fi posibil să se mențină aceste celule în circulație. Cu toate acestea, în 35 cazul unei defecțiuni a sistemului de alimentare cu gaz, populația de celule va sedimenta rapid și posibil va necesita gaz de barbotaj auxiliar pentru a resuspenda solidele. Pentru 37 prelucrarea post-fermentație, această caracteristică de sedimentare rapidă este avantajoasă deoarece pot fi utilizate dispozitive de separare a solidelor cum arfi decantoare prin gravitație 39 pentru eliminarea solidelor vrac. în industria de fabricare a berii, aceasta va scădea încărcarea cu solide a echipamentului de centrifugare și, prin urmare, permite timpi de funcționare 41 mai mari între descărcările vasului centrifugei. Se așteaptă pierderi mai mici de bere și nivelul de arome necorespunzătoare conferite berii de către centrifugă (deși minime) vorfi minimizate 43 din cauza nivelurilor mai reduse de biomasă de drojdie care trece prin centrifugă.

RO 122457 Β1

Fig. 6.28. Concentrația totală de celule de drojdie ale fermentațiilor în șarje agitate de LCC290 față de timpul de fermentație. Temperatura de fermentație a fost menținută la 15*.

Fig. 6.29. Viabilitatea celulelor de drojdie, măsurată cu albastru de metilen, față de timpul de fermentație.

—Poh/ahtttJe —»— Maketemzl -e— MiWottK»»4 „Φ— Maltezi (ftwcmzl -jv-Frectezi

Fig. 6.30. Profilele de concentrație ale carbohidraților față de timpul de fermentație pentru fermentațiile în șarje ale drojdiei LCC290.

RO 122457 Β1

Timpul de fermentație (h) —«►— Gliccro

-Etanol

Orvutate specifici

Fig. 6.31. Concentrațiile de etanol și glicerol și greutatea specifică a lichidului față de timpul de fermentație pentru fermentațiile în șarje ale drojdiei LCC290.

j φ '24 h 40h pt4SIi φ.....64ll Ά......71 fi o 192 li * ..... -............- ...... ......................- - . u........ ............

Fig. 6.32. înălțimea interfeței unei suspensii de drojdie față de timpul de sedimentare. Valorile pentru acest grafic au fost colectate la mai multe intervale de fermentație.

|o40hm «fetlw» Δ.71 hm 1»hm b—,,,,,,,.........—

Fig. 6.33. Viteza de sedimentare a suspensiei de drojdie față de concentrația celulară. Valorile pentru acest grafic au fost colectate la mai multe intervale de fermentație.

RO 122457 Β1

6.3 Evaluarea tehnologiei cu injecție de gaze pentru fermentația continuă a berii.

Primul și cel mai important scop al acestei descrieri a fost evaluarea fezabilității exploatării bioreactorului de 501 pilot cu injecție de gaze în modul continuu utilizând sfere de gel din κ-caragenină pentru a îngloba celule de Saccharomyces carlsbergensis (descrise în secțiunea 6.2.1). în plus, dorința inventatorilor a fost de a investiga dacă se poate produce cu un asemenea sistem un tip de bere lager Nord Americană cu calități acceptabile ale aromei. Inventatorii au hotărât de asemenea să determine timpul minim de rezidență pentru atenuarea completă a mustului cu greutate ridicată (17,5°P) cât și stabilirea unui domeniu de exploatare pentru oxigen în sistemul de fermentație continuă. Timpul minim de rezidență în care toate zaharurile din must au fost consumate a fost 24 ore. Acesta poate fi comparat cu un timp de fermentație clasică în șarje de cinci până la șapte zile. Concentrația de oxigen dizolvat măsurată de sonda de oxigen Ingold la locul de lucru din bioreactor a fost apropiată de zero indiferent de oxigenul adăugat la gazul de barbotaj (în domeniul 0 până la 20% v/v). Aceasta a indicat faptul că oxigenul furnizat în must a fost fie consumat rapid de celulele de drojdie fie a fost pur și simplu evacuat în gazul rezidual. Nivelul de celule libere din deversarea de bere a fost de ordinul 10⁸ celule per ml de bere verde. Nivelurile de dicetone apropiate, diacetil și 2,3-pentandionă, cât și nivelul de acetaldehidă, au scăzut cu proporții descrescătoare de oxigen în gazul de barbotaj (fig. 6.34 și 6.35). Esterii măsurați (acetat de etil și acetat de izoamil) și alcoolii superiori (propanol, izobutanol, alcool izoamilic) nu au părut să fie afectați de schimbarea din alimentarea cu oxigen (fig. 6.36).

Fig. 6.37 compară diverși compuși activi din punct de vedere al aromei în două beri finite de testare produse cu sistemul continuu cu celule imobilizate cu o bere de control produsă industrial (fermentație în șarje cu celule libere). Au fost observate în mod consecvent anumite diferențe în esteri (acetat de etil, acetat de izoamil) și în alcooli superiori (propanol) între berea fermentată continuu și cea de control, indiferent de nivelul alimentării cu oxigen. Gustul berii finite produse cu 2% oxigen a fost judecat de un consiliu de degustare cu experiență ca fiind relativ apropiat de cel al berii de control (produs industrial). Berea produsă cu 20% oxigen, totuși, a fost judecată ca inacceptabilă, cu semne de oxidare a aromei și un gust de “asemănător hârtiei” și “asemănător vinului”.

La starea pseudo-stabilă, bioreactorul pilot a fost exploatat cu un timp de rezidență de 24 pe o perioadă de 6 săptămâni. Berea “verde” a avut un profil de arome acceptabil și nu s-au remarcat defecte majore (urme necorespunzătoare sulfuroase). Cantitatea de oxigen din gazul de barbotaj s-a dovedit a fi un element critic în acest experiment. Berile produse cu 2 până la 5% oxigen în gazul de barbotaj au dat cele mai bune profile de gust. Acest punct de control critic necesită atenție suplimentară cu concentrarea asupra unor tehnici de măsurare mai precise a oxigenului cu măsurători realizate pe un set mai mare de analiți de pre-fermentație și post-fermentație.

în fermentația primară în șarje tradițională, mustul este dozat cu oxigen înainte de fi transferat în linul de fermentare. După inocularea mediului, concentrația oxigenului dizolvat scade rapid pe măsură ce celulele de drojdie îl consumă (primele 24 h de fermentație când are loc creșterea drojdiei). Restul de fermentație este realizat prin urmare în condiții în principal anaerobe. Utilizarea unui sistem omogen continuu pentru fermentația primară nu permite această schimbare a concentrației de oxigen în timp. Din acest motiv, poate fi dificil să se atingă o potrivire completă a gustului pentru berea produsă utilizând fermentații continue și în șarje.

RO 122457 Β1

Indiferent de aceste diferențe, configurația bioreactorului testat în această evaluare inițială a produs o bere cu o calitate acceptabilă a aromei și profil analitic. Prin utilizarea unui bioreactor cu injecție de gaze cu sfere cu dimensiuni relativ mici (-1 mm), a fost posibil să se crească productivitatea volumetrică a bioreactorului prin reducerea timpului pentru fermentația primară cu câteva zile. Nivelul de biomasă eliberat în berea produsă a arătat că nivelul de creștere a drojdiei din bioreactorul cu celule imobilizate a fost echivalent cu cel al fermentației în șarje cu celule libere în condiții similare. Aceste observații confirmă sprijinul formării aromei pe nivelul creșterii drojdiei. Aceasta poate explica eșecul încercărilor anterioare de producere de bere acceptabilă cu sisteme cu celule imobilizate cu creștere restricționată. Furnizarea unui amestec controlat de gaze poate fi o unealtă puternică în reglajul fin al proprietăților organoleptice ale berii în fermentațiile continue cu celule imobilizate. Nivelul ridicat de diacetil în lichidul care iese a fost de asemenea observat de alți cercetători (Virkajarvi & Pohjala, 1999; Kronlof și colab., 2000). în berile tip lager Nord Americane, nivelul țintă de diacetil este 30 pg/l comparativ cu niveluri de 400-800 pg/l în lichidul de fermentație continuă la ieșire. Utilizarea de tehnologie de maturare tradițională (maturare prin răcire la 2°C timp de 14 zile) a redus diacetilul la domeniul dorit dar în detrimentul productivității globale a procedeului. Utilizarea tehnologiei fermentației secundare rapide raportată în Capitolul 2 va ajuta la reducerea diacetilului fără scăderea semnificativă a productivității (procedeu de 2 h). Cu toate acestea, costurile adiționale, pot fi prohibitive și s-ar putea ca nu toți fabricanții de bere să dorească să-și supună berile la temperaturi ridicate (80°C până la 90°C).

j» —o— PfiKUwdKMd

Fig. 6.34. Concentrația de dicetone apropiate față de procentul de oxigen din gazul de barbotaj. Fermentațiile au fost realizate într-un sistem de 50 I cu injecție de gaze încărcat cu 40% (v/v) sfere de gel din caragenină. Viteza totală a gazului de barbotaj a fost menținută constantă la 6,4 scfh. Timpul de rezidență a fost de 24 h.

RO 122457 Β1

Fig. 6.35. Concentrația de acetaldehidă față de oxigenul procentual din gazul de barbotaj. Fermentațiile au fost realizate într-un sistem de 50 I cu injecție de gaze încărcat cu 40% (v/v) sfere de gel din caragenină. Viteza totală a gazului de barbotaj a fost menținută constantă la 6,4 scfh. Timpul de rezidență a fost de 24 h.

Fig. 6.36. Concentrația de esteri și alcooli de fuzel față de oxigenul procentual din gazul de barbotaj. Fermentațiile au fost realizate într-un sistem de 50 I cu injecție de gaze încărcat cu 40% (v/v) sfere de gel din caragenină. Viteza totală a gazului de barbotaj a fost menținută constantn la 6,4 scfh. Timpul de rezidență a fost de 24 h.

RO 122457 Β1

Fig. 6.37. Comparația produsului finit produs cu 2% oxigen și 20% oxigen în gazul de barbotaj față de berea produsă industrial și pragurile de gust. Pentru produ- 17 sele fermentației continue, fermentațiile au fost realizate într-un sistem de 50 I cu injecție de gaze încărcat cu 40% (v/v) sfere de gel din caragenină. Viteza totală a gazului 19 de barbotaj a fost menținută constantă la 6,4 scfh. Timpul de rezidență a fost de 24 h.

6.4 Vitezele de amestecare și circulație a fermentațiilor într-un bioreactor trifazic cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze 23

Experimentele de amestecare au fost conduse utilizând metoda injectării de acid subliniată în secțiunea 4.8. Scopurile acestei faze de experimentare au fost în două direcții. S-a 25 dorit mai întâi evaluarea faptului dacă sistemul cu injecție de gaze a fost bine amestecat prin calcularea vitezei de circulație a lichidului și a timpului de amestecare rezultat pentru un 27 număr de purtători de imobilizare la diferite viteze superficiale ale gazului de fluidizare. Distincția dintre aceste încercări față de cele raportate în literatură a fost că întreaga experi- 29 mentare a fost condusă pe medii actuale de fermentație cu celule de drojdie active mai degrabă decât pe soluții model (sisteme apă-solid-gaz). Aceste experimente de amestecare 31 au fost de asemenea echipate pentru calcularea vitezelor superficiale ale lichidului, care ar putea fi folosite pentru scalarea viitoare a sistemului pilot. 33

6.4.1. Calibrarea sondelor

Sonda pH utilizată în studiile de amestecare a fost calibrată utilizând metoda descrisă 35 în secțiunea 4.8. Semnalul de 4-20 mA emis de sonda pH a trecut printr-un rezistor de 250 Ohm și transformat într-un semnal de 1-5 Volt, care a putut fi înregistrat de placa de 37 achiziție de date (DAC). Sonda pH a fost imersată secvențial într-o serie de tampoane după cum urmează: tampon pH 4,6, tampon pH 4,0, tampon pH 5,0, tampon pH 6,0 și în final 39 tampon pH 7,0 (standarde certificate Beckman, Cole Parmer). Fig. 6.38 prezintă datele colectate de sistemul de achiziție pentru răspunsul sondei pH Ingold la cele 5 soluții cu pH 41 standard. Fig. 6.39 este curba de calibrare a sondei de pH reprezentând grafic valoarea actuală a pH-ului față de tensiunea semnalului măsurat. Cea mai bună curbă de calibrare 43 fitată pentru acest sistem (coeficient de corelație de 0,9996) a fost definită de următoarea ecuație: 45 pH = 3.68*Tensiune-3,53 (6.1) 47

RO 122457 Β1

Datele de amestecare colectate au fost transformate utilizând ecuația 6.1. pentru a reflecta valorile pH actuale măsurate în interiorul bioreactorului cu injecție de gaze.

Afost de asemenea măsurattimpul de răspuns al sondei pH la o schimbare a pH-ului. Fig. 6.40 până la fig. 6.43 descriu răspunsul tipic al sondei pH la patru schimbări în trepte diferite ale pH-ului, și anume 0,6; 1,2; 2,3 și 3,4 unități. Datele originale au fost fitate la o funcție sinusoidală utilizând capacitățile integrate în programul de analiză și reprezentare grafică a datelor TableCurve 2D (Jandel Scientific). Ajustările curbei rezultate au avut coeficienți de corelație mai mari de 0,994. Din aceste curbe, s-a calculat timpul necesar sondei să răspundă la 98% din schimbarea în trepte (timp de răspuns) și s-a reprezentat grafic față de schimbarea în treaptă a pH-ului (fig. 6.44). Timpul de răspuns a scăzut cu schimbarea în trepte a pH-ului în domeniile testate. Pentru cea mai mică schimbare în treaptă de 0,6, timpul de răspuns al sondei pH a fost ~6,4 s. Timpul de răspuns a scăzut până la aproximativ 4,2 secunde pentru o schimbare în treaptă de 3,4.

Acest tip de caracterizare a sondei este important, în special atunci când sistemul este utilizat pentru evaluarea timpului de amestecare și a vitezei de circulație. Sonda trebuie să aibă un timp de răspuns redus pentru a reflecta schimbările din mediul pe care îl măsoară, în particular, timpul de răspuns al sondei pH trebuie să fie mai mic decât viteza de circulație din reactor dacă se dorește folosirea cu precizie în asemenea măsurări. Cu toate acestea, nu este necesar un răspuns cvasi-instantaneu, deoarece o ușoară întârziere a răspunsului va fi reflectată pur și simplu în măsurări consecutive ale vitezei de circulație și prin urmare anulată.

Fig. 6.38. Datele originale achiziționate de sistemul de achiziție de date la răspunsul sondei pH Ingold la diverse soluții tampon, față de timp. Frecvența de achiziție a fost de 50 Hz pentru un total de 15000 puncte.

RO 122457 Β1

Fig. 6.39. Reprezentarea grafică a curbei de calibrare a sondei pH față de tensiunea măsurată (V). Linia celei mai bune fitări sau linia de calibrare are următoarea ecuație: pH=3,68*tensiune-3,53 cu un coeficient de corelație de 0,9996 (N=2500).

Fig. 6.40. Datele tipice ale timpului de răspuns al sondei pH la o schimbare în treaptă de ~0,6. Răspunsul a fost fitat utilizând programul TableCurve. Funcția impuls de cea mai bună fitare a avut un coeficient de corelație de 0,995.

RO 122457 Β1

Fig. 6.41. Datele tipice ale timpului de răspuns al sondei pH la o schimbare în treaptă de ~1,2. Răspunsul a fost fitat utilizând programul TableCurve. Funcția impuls de cea mai bună fitare a avut un coeficient de corelație de 0,999.

Timp de răspuns (s)

Fig. 6.42. Datele tipice ale timpului de răspuns al sondei pH la o schimbare în treaptă de ~2,3. Răspunsul a fost fitat utilizând programul TableCurve. Funcția impuls de cea mai bună fitare a avut un coeficient de corelație de 0,999.

RO 122457 Β1 [PutseCinj χ=»*β<1·«φ(·<ι»»<)·«<1·3^β,/3>β>Μ»³

Fig. 6.43. Datele tipice ale timpului de răspuns al sondei pH la o schimbare în treaptă de ~3,4. Răspunsul a fostfitat utilizând programul TableCurve. Funcția impuls de cea mai bună fitare a avut un coeficient de corelație de 0,999.

*

Fig. 6.44. Timpul de răspuns al sondei pH Ingold la o schimbare în trepte. (N=3). Sondele au fost imersate în tamponul cu pH-ul cel mai mare și apoi supuse imediat tamponului cu pH-ul cel mai mic de 4,0. S-a utilizat linia de cea mai bună fitare pentru fiecare curbă de răspuns pentru a calcula timpul necesar ca sonda să atingă 98% din schimbarea în trepte.

6.4.2 Timpul de amestecare și vitezele de circulație

Experimentele pentru timpul de amestecare și viteza de circulație au fost realizate pe trei tipuri de fermentații cu celule imobilizate. Experimentele au fost realizate în interiorul bioreactorului pilot de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecția gazelor pe o soluție apoasă model care nu a conținut solide și apoi pe bulion de fermentație cu o greutate specifică de 2,7°P conținând fie sfere de gel din κ-caragenină, drojdie superfloculantă LCC290 fie drojdie mediu floculantă LCC3021. Fig. 6.45 și 6.46 sunt descrieri eșantion ale datelor brute colectate

RO 122457 Β1 utilizând sistemul cu sondă pH după injectarea unui impuls de acid (metoda descrisă în secțiunea 4.8). Fig. 6.45 ilustrează răspunsul sondei pH la o injectare de acid într-o soluție apoasă care nu conține solide, în timp ce fig. 6.46 este răspunsul la injectarea de acid într-un bulion de fermentație conținând drojdia foarte floculantă LCC290. Semnalele au fost fitate la o curbă sinusoidală amortizată, iar coeficienții de corelație de 0,96 și respectiv 0,90 au fost calculați pentru ecuațiile corespunzătoare. Parametrii de fitare “b” și “c” din grafice corespund valorilor “a” și descrise în ecuația sinusoidală amortizată (3.1). Aceste valori numerice au fost utilizate în ecuațiile 3.2 și 3.3 pentru a calcula viteza de circulație și timpul de amestecare pentru sistemul dat. Anexa B conține restul de date de amestecare data și fitările curbei pentru tot experimentul.

Fig. 6.47 și 6.48 sunt graficele timpului de amestecare și vitezei de circulație pentru o injectare de acid într-o soluție apoasă care nu conține solide. Fig. 6.49 și 6.50 sunt graficele corespunzătoare pentru experimentele de amestecare utilizând drojdia foarte floculantă LCC290, în timp ce rezultatele din testele de amestecare cu κ-caragenină sunt prezentate în fig. 6.51 și 6.52. în sfârșit, timpul de amestecare și timpul de circulație al drojdiei mediu floculante LCC3021 sunt arătați în fig. 6.53 și 6.54. Indiferent de tipul de solid testat, atât timpul de amestecare cât și viteza de circulație au scăzut odată cu creșterile corespunzătoare ale vitezei superficiale a gazului. Relația dintre viteza de circulație și viteza superficială a lichidului a urmat ecuația 3.11 propusă de Kennard și Janekah (1991) pentru toate patru sistemele testate. Timpul de amestecare a urmat relația din ecuația 3.11 pentru sistemul apă/fără solide și sistemul cu sfere de gel din κ-caragenină. Niciunul dintre sistemele cu drojdie floculantă ca matrice de imobilizare nu a arătat o corelație puternică cu modelul teoretic al lui Kennard și Janekah. Sistemele cu LCC290 și LCC3021 aveau timpi inițiali de amestecare (până când viteza superficială a gazului a depășit 4 mm/s) mai reduși decât cei preziși de model. Cu toate acestea, viteza de descreștere a timpului de amestecare, s-a redus la viteze superficiale ale gazului mai mari de 4 mm/s în timp ce modelul reduce valorile. Tabelul 6.1 furnizează ecuațiile obținute prin derivare pentru timpul de circulație și timpul de amestecare care sunt legate de viteza superficială a gazului.

Fig. 6.55 ilustrează timpul de amestecare față de relația vitezei superficiale a gazului pentru toate patru sistemele. Scenariul apă/fără solide a demonstrat timpul cel mai ridicat pentru amestecarea 98% a unui impuls pH. (-220 secunde la V_sg de 3 mm/s) și sistemul LCC290 a arătat cea mai bună capacitate de a minimiza efectul unui impuls de acid în sistem (-110 secunde la V_sg de 3 mm/s). Valorile pentru sistemul LCC3021 și cu κ-caragenină au fost între sistemele apă/fără solide și LCC290. Solidele din bioreactorul cu injecție de gaze ajută la dispersia elementelor fluide din faza lichidă prin stimularea formării de vârtejuri și promovând amestecarea coaxială. Drojdia superfloculantă LCC290, deși la aceeași încărcare cu solide (16% greut./vol.) ca și drojdia mediu floculantă LCC3021, a permis timpi de amestecare mai reduși la toate vitezele superficiale testate ale gazelor.

Fig. 6.56 descrie timpul de circulație față de viteza superficială a gazului pentru toate patru sistemele. La o viteză superficială a gazului de 2 mm/s, timpul de circulație a fost în domeniul 28 s și 35 s, sistemul apă/fără solide având cea mai rapidă viteză de circulație și sistemul LCC290 afișând cea mai redusă viteză de circulație. La viteze mai mari ale gazului, diferența dintre cela 4 sisteme a fost redusă la aproximativ 3 s. Cu toate acestea, la toate vitezele testate, sistemul cu LCC290 a demonstrat viteze de circulație puțin mai reduse, în timp ce sistemul cu apă/fără solide a avut cele mai rapide viteze de circulație.

Fig. 6.57 ilustrează relația dintre viteza superficială a gazului și viteza superficială a lichidului. S-a utilizat ecuația 3.7 propusă de Livingston și Zhang (1993) pentru a calcula viteza superficială a lichidului pentru o viteză de circulație și un tip de solid date. Viteza superficială a lichidului a crescut cu creșteri corespunzătoare ale vitezei superficiale a gazului. Sistemele cu LCC3021 și apă/fără solide au avut tendințe similare, în timp ce sistemele cu LCC290 și

RO 122457 Β1 κ-caragenină au arătat o oarecare similaritate. Ecuația model sugerată de Kennard și Jenekah a fost fitată la curbele vitezei superficiale a lichidului față de viteza superficială a gazului în fig. 6.57. Fig. 6.58 reprezintă grafic viteza superficială a lichidului calculată experimental față de viteza superficială a lichidului calculată teoretic utilizând ecuația 3.10. Toate patru sistemele fitează ecuația propusă așa cum este indicat de funcția liniară cu panta 1 și originea la y=0. Tabelul 6.1 listează corelațiile care au fost derivate din sistemele care au fost testate în această lucrare de cercetare.

Timp (s)

Fig. 6.45. Datele răspunsului sondei pH într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-o soluție apoasă fără conținut de solide. Viteza superficială a gazului a fost stabilită la 1,94 mm/s. Datele originale au fost fitate la o curbă sinusoidală amortizată. Coeficientul de corelație a fost 0,96.

Ecuație de gradul ! M(M>I p OF lj=sutm. amortiwu(a.b,c,d)

Fig. 6.46. Datele răspunsului sondei pH într-un bioreactor de 50 I cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia puternic floculantă LCC290. Viteza superficială a gazului a fost stabilită la 1,94 mm/s. Datele originale au fost fitate ia o curbă sinusoidală amortizată. Coeficientul de corelație a fost 0,90.

RO 122457 Β1

Fig. 6.47. Timpul de amestecare față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-o soluție apoasă fără conținut de solide. Timpul de amestecare corespunde timpului necesar pentru anularea a 98% din schimbarea în trepte. (N=3).

Fig. 6.48. Timpul de circulație față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-o soluție apoasă fără conținut de solide. (N=3).

RO 122457 Β1

Vite? : upcrficială a gazului (mat/s) I « » M>crimcnul ................. Teoretic

Fig. 6.49. Timpul de amestecare față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia puternic floculantă, LCC290 (dimensiunea floconului >1,0 mm). Timpul de amestecare corespunde timpului necesar pentru anularea a 98% din schimbarea în trepte. (N=3).

Fig. 6.50. Timpul de circulație față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia puternic floculantă, LCC290 (dimensiunea floconului >1,0 mm). (N=3).

RO 122457 Β1

» Expwiffwnfli'yurctic J

Fig. 6.51. Timpul de amestecare față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia LCC3021 imobilizată cu sfere de gel din κ-caragenină (dimensiunea sferei 1-2 mm). Timpul de amestecare corespunde timpului necesar pentru anularea a 98% din schimbarea în trepte. (N=3).

Viteza superficială a gazului (mm/s) • Expertnuntal——îeoieec j

Fig. 6.52. Timpul de circulație față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia LCC3021 imobilizată cu sfere de gel din κ-caragenină (dimensiunea sferei 1-2 mm). (N=3).

RO 122457 Β1

Viteza superficială a gazului (mm/s) ♦ Experimental ——Teoreme

Fig. 6.53. Timpul de amestecare față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia mediu floculantă, LCC3021 (dimensiunea floconului < 0,5 mm). Timpul de amestecare corespunde timpului necesar pentru anularea a 98% din schimbarea în trepte. (N=3).

Viteza superficială a gazului (mm/s) φ Experimental —Teoretic

Fig. 6.54. Timpul de circulație față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls 37 de acid într-un mediu de fermentație conținând drojdia mediu floculantă, LCC3021 (dimensiunea floconului < 0,5 mm). (N=3). 39

RO 122457 Β1

Viteza superficiala a gazului (mm/s) ’ *1X03021 o LC€Î2ăo ACarageninâ •FaS’soîîde

Fig. 6.55. Timpul de amestecare față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând diferite solide. Timpul de amestecare corespunde timpului necesar pentru anularea a 98% din schimbarea în trepte. (N=3).

) '«»' 40

5³⁵

30 ²⁵ 3 20 ¹⁰ .§ 5

1—80 2 4 8 8

Viteza superficiala a gazului (iran s) [♦ LCC3g21 oLCGSO AC^geruni efid

Fig. 6.56. Timpul de circulație față de viteza superficială a gazului într-un bioreactor de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. S-a injectat un impuls de acid într-un mediu de fermentație conținând diferite solide. (N=3).

RO 122457 Β1

+LCC3021 □ LCC29O Δ Caragenină 5«»hd^

Fig. 6.57. Viteza superficială a lichidului (mm/s) față de viteza superficială a gazului (mm/s) pentru cele patru sisteme testate - sistemul cu drojdie LCC3021, drojdie LCC290, sfere de gel din caragenină și apă/fără solide. Testarea a fost condusă în bioreactorul pilot de 50 I, cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze.

Fig. 6.58. Viteza superficială teoretică a lichidului (mm/s) față de viteza superficială experimentală a lichidului (mm/s) pentru cele patru sisteme testate. Valoarea teoretică a fost calculată utilizând următoarea relație propusă de Kennard și Janekah (1991): V_SL °° V_SG“. Linia liniară are o pantă de 1 și o intersecție cu axa Y în 0.

Tabelul 6

Rezumatul corelațiilor calculate pentru timpul de amestecare, viteza de circulație și viteza superficială a lichidului pentru cele patru sisteme testate

	Timpul de amestecare	Viteza de circulație	Viteza superficială a lichidului
Apă/fără solide	tm=336,04 VSG°·4	tc=37,94 Vsg 0·4	Vsl—189,06 Vsg0,283
Drojdie LCC 290	tm=181,55 VSG°·4	tc=44,67 Vsg 0·4	Vsl=1 34,75 Vsg0,419
gel de K-caragenină	tm=254,68 VSG°·4	tc=41,73 Vsg 0'4	Vsl=171,92 Vsg0'283
Drojdie LCC3021	tm=322,07 VSG°'4	tc=37,90 Vsg 0·4	Vsl=158,12 Vsg0,427

RO 122457 Β1

Pentru corelația superficială a lichidului, Kennard și Janekah (1991) au propus un exponent de 0,41 în apă distilată și 0,64 când soluția a conținut carboximetil celuloză și etanol. Sistemele cu LCC290 și the LCC3021 au avut exponenți de 0,419 și respectiv 0,427, în timp ce sistemul cu κ-caragenină și cel cu apă/fără solide au avut un exponent de 0,283.

O presupunere de bază a tehnologiei cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze este că sistemul poate furniza o amestecare adecvată, astfel încât elementul fluid care iese din reactor este complet amestecat. în exploatarea sistemelor pilot de 50 I ca linuri de fermentare continuă, s-a injectat mediu nutritiv proaspăt în partea inferioară a reactorului la un debit de 36 ml/min într-un volum total al reactorului de 501. Aceasta reprezintă aproximativ o diluție de 1000 de ori a componentelor de alimentare. Cu caracteristicile de amestecare calculate pentru sistemul cu drojdie LCC290, un element fluid este amestecat în aproximativ 3 bucle de circulație în reactor, în timp ce pentru scenariul cu apă/fără solide sunt necesare 10 bucle de circulație în reactor. în plus, timpul de rezidență (24 h) este de aproximativ 1000 ori mai mare decât timpul de amestecare (180 s). Amestecarea rapidă cuplată cu diluția elementelor nutritive din sistem și diferența mare dintre timpul de amestecare față de timpul de rezidență sugerează puternic un sistem amestecat în mod adecvat. Premiza originală a utilizării unui bioreactor cu injecție de gaze a fost că acesta a furnizat un mediu amestecat în mod ideal pentru fermentația berii. Rezultatele studiilor de amestecare realizate pe toți cei trei purtători de fermentație susțin această premiză.

6.5 Evaluarea mai multor metode de imobilizare pentru fermentația primară continuă într-un sistem cu injecție de gaze

Fermentațiile continue au fost realizate în bioreactorul pilot de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze utilizând trei tipuri de purtător de imobilizare - sfere de gel din κ-caragenină, drojdie superfloculantă LCC290 și drojdie mediu floculantă LCC3021. Toate fermentațiile au fost inoculate inițial cu același nivel de inoculat de drojdie (4 g/l) și s-a utilizat must lager industrial ca mediu nutritiv. Fermentațiile au fost începute în șarje pentru a permite reducerea rapidă a zaharurilor din must, cât și pentru a promova creșterea drojdiei în linul de fermentare. în cazul drojdiei floculante, această fază în șarje a permis formarea flocoanelor de drojdie, care au putut fi reținute apoi în bioreactor odată ce a fost începută o alimentare continuă. Odată ce nivelul de diacetil din lichidul de fermentație a scăzut sub 30 pg/l, a fost începută alimentarea continuă cu must. Următoarele secțiuni descriu mai detaliat analizele de fermentație rezultând din aceste trei tipuri de matrici de imobilizare.

6.5.1 Utilizarea sferelor de gel din κ-caragenină: înglobare

Utilizarea sferelor de gel din κ-caragenină ca o matrice de imobilizare a ajutat în evaluarea fezabilității tehnologiei cu injecție de gaze pentru fermentația primară continuă a berii (secțiunea 6.3). A fost totuși necesar să se evalueze dacă un asemenea sistem poate fi exploatat pe perioade întinse de timp (până la 2 luni) fără să se înregistreze dificultăți operaționale majore, inclusiv instabilitatea fermentației și contaminare. Parametrii operaționali pentru această încercare de fermentație sunt descriși în fig. 6.59. Viteza superficială a gazului dioxid de carbon a fost stabilită la 5,5 mm/s, în timp ce în acest gaz de barbotare s-au introdus în reactor 0,9 mm/s de aer. Viteza de oxigenare a fost stabilită prin urmare la 3% din gazul total de barbotare pentru a coincide cu rezultatele din secțiunea 6.3, ceea ce a indicat producerea berii preferate atunci când s-a introdus în sistem 2-5% oxigen. Temperatura de fermentație a fost controlată la 15°C. în date se pot observa anumite fluctuații și acestea sunt legate de natura buclei de control care a fost utilizată.

Fig. 6.60 reprezintă evoluția populației de celule de drojdie libere în timp, cât și viabilitatea drojdiei. Viabilitatea a rămas relativ ridicată în timpul fermentației de 2 luni cu o scădere temporară măsurată în jurul a aproximativ 200 h. Aceasta corespunde exact punctului dinaintea pornirii alimentării continue cu must. în fermentația în șarje, este obișnuit ca viabilitatea să scadă la sfârșitul fermentației deoarece celulele sunt private de elemente

RO 122457 Β1 nutritive. Odată ce a fost pornită alimentarea continuă cu must, viabilitatea a urcat la loc peste 90%. Populație de celule de drojdie libere a fost redusă în timpul primelor 400 h de fermentație și apoi, în următoarele 300 h, a crescut de aproximativ 10 ori de la -100 milioane celule pe ml până la —1,5 miliarde celule pe ml. Odată ajunse la această concentrație, populația de celule de drojdie libere și-a menținut această valoare de stare pseudo-stabilă pentru restul perioadei de fermentație.

Creșterea bruscă a concentrației drojdiei libere este legată probabil de populația de celule de drojdie imobilizate. La începutul fermentației, drojdia înglobată în gel va crește în interiorul gelului până când tot spațiul disponibil va fi ocupat. Odată ce sferele din gel sunt umplute cu drojdie, populația în expansiune va deborda în mediul lichid. Rezultatele noastre par să indice că în timpul primelor 400 h, drojdia imobilizată a crescut în gel și, la -700 h, drojdia nu a mai avut loc să crească în sfere, începând prin urmare să elibereze cantități mari de celule în bulionul de fermentație.

t

Această instabilitate a populației de drojdie se reflectă în profilele de greutate specifică și ale etanolului (fig. 6.61). în timpul celor 200 h inițiale de fermentație, s-a așteptat ca etanolul să crească în timp și ca greutatea specifică să scadă urmând cinetica tradițională a șarjelor, între 200 și 600 h, etanolul a atins un platou de 45 g/l și greutatea specifică a rămas la ~6°P. Acest rezultat nu a fost așteptat din moment ce un lichid cu fermentația încheiată are o greutate specifică de -2,5 până la 2,7°P. La aproximativ 600 ore, când populația de drojdie liberă și-a atins aproximativ maximul, nivelul de etanol a crescut la aproximativ 70 g/l și greutatea specifică a mustului a scăzut la aproximativ 2,2°P. O privire mai atentă la profilele specifice ale carbohidrațilorîn timp (fig. 6.62) indică faptul că concentrația de maltoză nu s-a plafonat până la aproximativ 600 h în procedeu. Celelalte zaharuri s-au redus după cum era de așteptat.

Alți doi analiți cheie - diacetilul și 2,3-pentandiona - au fost monitorizați pe parcursul funcționării continue de 2 luni (fig. 6.63). Punctele joase de la aproximativ 180 h corespund sfârșitului fazei de pornire în șarje. Odată ce a început alimentarea continuă, atât diacetilul cât și 2,3-pentandiona au crescut rapid la aproximativ 500 pg/l și respectiv 400 pg/l. Această creștere inițială era de așteptat, deoarece alimentarea cu elemente nutritive proaspete stimulează creșterea drojdiei și, prin urmare, creșterea nivelurilor de metaboliți ai deversării, producând diacetil și 2,3-pentandionă. Pe parcursul etapei de fermentație, nivelurile de 2,3-pentandionă au rămas peste 400 pg/l în timp ce concentrațiile de diacetil au scăzut de la 500 pg/l la 275 pg/l pe la jumătatea etapei de fermentație continuă. Acest punct a coincis de asemenea cu nivelul de diacetil scăzând sub nivelul de 2,3-pentandionă așa cum s-a observat în evaluarea de fezabilitate raportată în secțiunea 6.3.

Temperaiurâ

Fig. 6.59. Parametru de exploatare pentru fermentația imobilizată cu caragenină față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1 §

•st.

«9

Η ο

„VtifcibW i

Fig. 6.60. Concentrația totală de celule și viabilitatea drojdiei imobilizată cu kcaragenină față de timpul de fermentație.

Timp dc fermentație (h) Etanol —9—CrcmaU: \p«(5câ j '<1'......

Fig. cu drojdie

6.61. Concentrația de etanol și greutatea specifică a fermentației continue imobilizată cu caragenină față de timpul de fermentație.

Fig. 6.62. Profilul de carbohidrați al fermentației continue cu drojdie imobilizată cu κ-caragenină față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1

Fig. 6.63. Concentrația de dicetone apropiate din fermentația continuă cu 15 imobilizare cu caragenină față de timpul de fermentație.

6.5.2 Utilizarea unei tulpini de drojdie superfloculantă: auto-flocularea

Fermentațiile continue utilizând bioreactorul pilot de 501 cu injecție de gaze încărcat 19 cu drojdia superfloculantă LCC290 au fost realizate pe o perioadă de 3 luni. Gazul de barbotaj CO₂ a fost stabilit la ~2,5 mm/s în timp ce aerul a fost introdus la ~0,4 mm/s pentru a promova 21 o anumită creștere a drojdiei (aceasta corespunde unui total de 1,511 de gaz pe minut introdus, 3% fiind oxigen). Temperatura de fermentație în reactor a fost menținută la -15°C pe 23 parcursul întregii funcționări. O întrerupere în alimentarea cu energie i-a forțat pe inventatori să reducă temperatura linului de fermentare la 4°C pe o perioadă de trei zile (aproximativ 25 1700 h în fermentație) (fig. 6.64). Această răcire a reactorului a fost realizată pentru a încetini metabolismul drojdiei, și a menține viabilitatea drojdiei pe perioada întreruperii de energie. 27 Acest eveniment neașteptat a furnizat o oportunitate de evaluare a rezilienței sistemului la evenimente care potfi obișnuite în situații industriale. Odată ce electricitatea a fost restabilită, 29 temperatura reactorului a fost reajustată la 15°C și fermentația a continuat timp de încă 30 zile. 31

Odată ce faza de pornire în șarje a fost încheiată (-180 h), s-a alimentat continuu cu must sistemul la un debit de 2,16 I pe oră, furnizând astfel un timp de rezidență de 24 h pe 33 baza unui volum de lucru de reactor de 501. După perioada inițială în șarje, concentrația celulară a crescut, atingând 3 miliarde de celule/ml la aproximativ 750 h în fermentație (fig. 6.65). 35

Această masă de drojdie a scăzut apoi la aproximativ 1 miliard de celule pe ml la aproximativ 1000 h și a rămas la acest nivel până la sfârșitul fermentației. Viabilitatea drojdiei a fost la 37 aproximativ 90% pe parcursul etapei de fermentație (fig. 6.65).

Concentrația de etanol și greutatea specifică a bulionului de fermentație au atins o 39 stare pseudostabilă la scurt timp după începerea alimentării continue (fig. 6.66). Concentrația de etanol a crescut la aproximativ 70 g/l, iar greutatea specifică a lichidului a fost ~2,3°P 41 pentru restul fermentației. Profilele carbohidrațilordin fig. 6.67 confirmă această stare pseudostabilă la aproximativ 270 h din etapa de fermentație continuă. Concentrația de polizaharide 43 a scăzut de la -42 g/l la -33 g/l la aproximativ 1400 h în fermentație. Acest rezultat s-a datorat unei variații în șarjele de must. Deoarece drojdia lager nu poate consuma aceste polizaharide, 45 această anomalie a elementelor nutritive ale mustului nu a avut efect notabil asupra performanței vasului de fermentație primară. Această diferență în porțiunea de zaharuri nefermen- 47 tabile va fi detectată de un consiliu de degustători cu experiență care ar remarca că produsul a avut o esență “subțire”. 49

RO 122457 Β1

Concentrațiile de diacetil și 2,3-pentandionă în timp sunt prezentate în figura 6.68. Ca și la fermentațiile continue cu κ-caragenină, nivelurile de diacetil și 2,3-pentandionă au crescut imediat ce s-a început alimentarea continuă cu must. Concentrația de diacetil a atins aproximativ 375 pg/l în timp ce concentrația de 2,3-pentandionă a fost de aproximativ 600 pg/l. Aceste niveluri de concentrație au fost menținute pe parcursul etapei de fermentație până la întreruperea de energie la -1700 ore. Deoarece lichidul a stat în șarjă timp de 3 zile fără metabolism al drojdiei suplimentar (datorită lipsei de alimentare cu element nutritiv), nivelurile de dicetone apropiate au fost reduse. Odată ce a fost repornită alimentarea cu must, atât diacetilul cât și 2,3-pentandiona au revenit la valorile lor din starea pseudo-stabilă.

Fig. 6.64. Parametru de exploatare pentru fermentație cu LCC290 față de timpul de fermentație.

6,00£*0β

E s.ooE’Oa v 4,006*09 w .23,006*0» ε

}§ φ,006*0» (§ <

rpttrt.........«...........100% es%

S 70% 3 s

55% J» : > î

40%

25%

500 1000 1500 2000 2500 3000

Timp de fermentație (h) ’ M««j

10%

Fig. 6.65. Concentrația totală de celule de drojdie și viabilitatea drojdiei LCC290 față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1

Fig. 6.66. Concentrația de etanol și greutatea specifică din fermentația continuă cu drojdie LCC290 față de timpul de fermentație.

Fig. 6.67. Profilul carbohidraților din fermentația continuă cu drojdie LCC290 față de timpul de fermentație.

Fig. 6.68. Concentrația de dicetone apropiate din fermentația continuă cu

LCC290 față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1

6.5.3 Utilizarea unei drojdii mediu floculante: auto-flocularea

Au fost efectuate mai multe cicluri de fermentație utilizând tulpina de drojdie mediu floculantă LLC3021, ca matrice de imobilizare în bioreactorul pilot de 501 cu injecție de gaze. Ca și cu cele două moduri de imobilizare anterioare, concentrația inițială de drojdie a fost stabilită la 4 g/l. Această drojdie a fost inoculată în must lager industrial (descris în secțiunea 4.2) și lăsată să fermenteze în șarje până când s-au consumat toate zaharurile și nivelul de diacetil a scăzut sub 30 pg/l. Temperatura de fermentație a fost controlată la 15°C și viteza gazului de barbotare a fost controlată la același nivel ca la fermentația cu LCC290 (viteza superficială a gazului dioxid de carbon de ~2,5 mm/s și ~0,4 mm/s aer având ca rezultat aproximativ 3% oxigen în gazul de barbotare total) (fig. 6.69).

Această etapă inițială în șarje a permis celulelor de drojdie să floculeze și prin urmare să fie reținute mai ușor în sistemul cu injecție de gaze. La sfârșitul fiecărei porniri a șarjei, debitul de alimentare cu must a fost stabilit la 2,16 I pe oră, care a corespuns unui timp de rezidență de ~24 h pe baza unui volum de lucru de reactor de 50 I. Populația de drojdie (fig. 6.70) a crescut la aproximativ 1 miliard de celule pe m iii litru și a rămas la acest nivel timp de peste 1000 h (între 500 și 1500 h din etapa de fermentație continuă). Populația de drojdie s-a dublat brusc la -1500 h în fermentație și s-a plafonat apoi la 2 miliarde celule/ml. Această schimbare a populației de drojdie a fost neașteptată. Viabilitatea drojdiei pe parcursul etapei de fermentație s-a menținut la peste 90% (fig. 6.70).

Figura 6.71 prezintă datele pentru concentrația de etanol greutatea specifică a bulionului de fermentație pe parcursul etapei continue de 3 luni. La scurt timp după pornirea șarjei (180 ore), concentrația de etanol s-a plafonat la 70 g/l și greutatea specifică a atins un minim de ~2,2°P. Creșterea bruscă a populației de drojdie discutată mai sus nu s-a reflectat într-o scădere a concentrației de etanol. Cea mai logică explicație pentru această creștere a populației drojdie este că o porțiune mai mare din populația globală de drojdie a intrat în faza de creștere, producând această dublare a concentrației de drojdie. Arfi de așteptat ca o scădere a concentrației de etanol să coincidă cu creșterea concentrației drojdiei, dar în mod clar nu acesta a fost cazul, deoarece etanolul a rămas la valoarea sa de stare pseudo-stabilă de 70 g/l pe parcursul etapei continue. Profilele concentrației de carbohidrați față de timpul de fermentație (fig. 6.72) au dezvăluit aceeași concluzie ca și curbele etanolului și greutății specifice. Această etapă și-a atins starea pseudo-stabilă la aproximativ 250 h în fermentația continuă.

Fig. 6.73 furnizează curbele de concentrații ale diacetilului și 2,3-pentandionei față de timpul de fermentație continuă. Ca și la rezultatele dicetonelorapropiate cu gel de κ-caragenină și LCC290, concentrația de diacetil și 2,3-pentandionă a crescut după faza de pornire a șarjei pentru a atinge valorile de stare pseudo-stabilă de -225 pg/l și respectiv 400 pg/l.

RO 122457 Β1

Fig. 6.69. Parametru de exploatare pentru fermentația cu LCC3021 față de timpul de fermentație.

8.00E+09 « 5.00E+09 â 4,00 E+09 u

_3,00E+09

S 1= g jj2,OOE+O9 o Jl ,ΟΟΕ+09

0,00 E+00

10%

2500

500 1000 1500 2000

Timp de fermemațsc (h)

Iz*

Cehie . VcaMfWc

Fig. 6.70. Concentrația totală de celule de drojdie și viabilitatea drojdiei LCC3021 37 față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1

Fig. 6.71. Concentrația de etanol și greutatea specifică a fermentației continue cu drojdie LCC3021 față de timpul de fermentație.

500 1000 tsoo

Timp de fermentație (h j

2000

Mahotctrodl (Biterul

Mahtxriu/l

2500

Polizaharide

MaiW/â

Fig. 6.72. Profilul carbohidraților din fermentația continuă cu drojdie LCC3021 față de timpul de fermentație.

RO 122457 Β1

Fig. 6.73. Concentrația de dicetone apropiate din fermentația continuă cu LCC3021 față de timpul de fermentație.

6.5.4 Comparația diverșilor purtători în secțiunile 6.5.1 până la 6.5.3, au fost prezentate performanțele de fermentație ale sferelor de gel din κ-caragenină, drojdiei superfloculante LCC290 și drojdiei mediu floculante LCC3021 ca matrici de imobilizare. Toți trei purtătorii au fost considerați adecvați pentru fermentația primară continuă în bioreactorul pilot de 501 cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. în toate trei cazurile au fost obținuți timpi de rezidență ai lichidului de 24 ore. Etapele de fermentație utilizând drojdia superfloculantă LCC290 au atins o stare pseudo-stabilă mult mai repede decât sistemele imobilizate cu drojdie mediu floculantă LCC3021 și cu κ-caragenină. Fermentația cu LCC290 și-a atins maximul de concentrație de etanol de 70 g/l la aproximativ 250 h din etapă. Exploatarea cu LCC3021 și-a atins concentrația de etanol a stabile de 70 g/l la -600 ore. în timpul fermentației continue cu κ-caragenină, etanolul s-a plafonat în două puncte separate în cursul etapei. Mai întâi, etanolul a atins 45 g/l între 200 și 500 h și apoi a crescut la 70 g/l la aproximativ 575 h și a rămas la acea concentrație până la sfârșitul încercării.

Cele trei sisteme de fermentație au părut să atingă un maxim al concentrației celulelor de drojdie libere de -1 miliard celule pe mililitru. Inconsistența concentrației de drojdie a avut un impact negativ asupra productivității de etanol a sistemului cu κ-caragenină (concentrație de etanol în starea pseudo-stabilă inițială mai redusă comparativ cu sistemul cu drojdie LCC290). Concentrația de drojdie a atins un maxim la diferite intervale de timp în fiecare sistem. Pentru exploatarea cu LCC290, etanolul și-a atins maximul între 500 și 1000 h din fermentația continuă, în timp ce fermentația cu LCC3021 a avut un maximum al numărătorii de celule între 1500 și 2000 h din etapa continuă. Sistemul cu imobilizare cu κ-caragenină a atins un maxim de concentrație celulară între 700 și 1000 h de exploatare continuă.

Concentrațiile stării pseudo-stabile de diacetil și 2,3-pentandionă în cele trei tipuri de fermentație cu celule imobilizate - drojdie superfloculantă LCC290, drojdie mediu floculantă LCC3021 și drojdie imobilizată cu κ-caragenină - au fost diferite. Pentru fermentația cu LCC290, diacetilul s-a stabilit la 375 pg/l în timp ce nivelul din fermentația cu LCC3021 s-a plafonat la aproximativ 225 pg/l. în cazul fermentației cu κ-caragenină, concentrația de diacetil a atins

RO 122457 Β1

500 pg/l, și la jumătatea etapei continue, nivelul a scăzut gradat la aproximativ 200 pg/l într-un interval de timp de 500 ore. Concentrația de 2,3-pentandionă a fost similară cu concentrația de diacetil în toate trei exploatările cu concentrații de 2,3-pentandionă mai ridicate decât diacetilul pe parcursul fermentațiilor cu LCC290 și LCC3021. Exploatarea cu κ-caragenină a prezentat un șablon diferit, cu niveluri de diacetil mai mari decât 2,3-pentandiona în timpul primei stări pseudo-stabile, timp după care concentrația de diacetil a scăzut sub concentrația de 2,3-pentandionă. Datele concentrației drojdiei și datele producerii de etanol sugerează de asemenea că s-au atins două stări pseudo-stabile separate și unice în timpul fermentațiilor cu κ-caragenină.

Sarcina comparării diferitelor sisteme de fermentație și evaluarea sistemului care a funcționat mai bine poate deveni complexă atunci când meritele sistemului se bazează pe mai mult de un criteriu. De exemplu, dacă s-a utilizat doar productivitatea de etanol ca măsură a succesului, toate trei sistemele testate ar fi punctate egal deoarece producția de 70 g/l etanol per volum de 501 de reactor pentru un timp de rezidență de 24 h a fost obținută în toate trei cazurile.

Producerea unei beri vandabile necesită mai mult decât simpla producere de etanol. Sistemul de fermentație propus trebuie evaluat din punct de vedere al capacității sale de a produce o bere acceptabilă (productivitate de etanol și niveluri de diacetil printre alte lucruri), asupra costurilor crescătoare potențiale ale purtătorului, asupra disponibilității purtătorului, asupra ușurinței de exploatare a sistemului, asupra problemelor legate de mediu cum ar fi eliminarea purtătorului, asupra stabilității purtătorului cât și flexibilității furnizate de sistemul de purtător. Pentru a evalua un asemenea scenariu multiplu, lumea afacerilor utilizează un procedeu de analiză adimensională numit “Balanced Scorecard” (Kaplan și Norton, 1996). Prima etapă implică identificarea criteriilor pentru care sistemul trebuie evaluat. Fiecare criteriu este punctat apoi pe o scară de la 1 la 5, 1 fiind cel mai puțin favorabil și 5 fiind cel mai favorabil. La sfârșitul analizei, se totalizează punctajul pentru fiecare opțiune și alternativa cu punctajul cel mai mare este cea mai bună alegere în circumstanțele date.

Tabelul 6.2 prezintă rezultatele analizei “Balanced Scorecard” realizată pe purtătorii de imobilizare care au fost văzuți ca alternative potențiale pentru utilizarea în bioreactorul pilot de 50 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze pentru fermentație. S-a evaluat un total de 6 purtători - sfere de chitosan Chitopearl®, sfere din kiselgur Celite®, sfere din sticlă Siran®, sfere de gel din κ-caragenină, drojdie mediu floculantă LCC3021 și drojdie superfloculantă LCC290 - cu obiectivul primaral producerii unei beri vandabile. Fiecare sistem de purtător a fost punctat utilizând scara menționată mai sus. Pe ansamblu, drojdia superfloculantă LCC290 a acționat cel mai bine urmată îndeaproape de drojdia mediu floculantă, LCC3021. Ceilalți patru purtători au primit punctaje între 16 și 20. A treia preferință a fost acordată sistemului cu κ-caragenină, deoarece în unitatea pilot s-a produs un lichid vandabil.

Această evaluare a purtătorului sugerează puternic că focalizarea viitoare asupra dezvoltării sistemelor de fermentație continuă trebuie angrenată către auto-agregare ca mod de imobilizare. Disponibilitatea (disponibil cu ușurință), costul (cost redus, deoarece nu necesită echipament suplimentar pentru exploatare), ușurința exploatării (se potrivește în exploatările instalațiilor existente) furnizate de o asemenea alternativă depășește în importanță instabilitatea potențială a flocoanelor de drojdie într-un sistem agitat. Poate fi posibil să se utilizeze sensibilitatea la forfecare a auto-agregatului pentru a controla dimensiunea floconului în timpul procesului de fermentație, și obținerea unui transfer de masă crescut și prin urmare obținerea de productivități volumetrice crescute ale bioreactorului.

RO 122457 Β1

Tabelul 6.2

Comparația mai multor purtători de imobilizare pentru fermentația primară a berii într-un sistem cu bioreactor cu injecție de gaze

	Chitopearl®	Celite®	Siran®	Caragenină	LCC3021	LCC290
Bere bună	3	1	1	4	5	4
Cost	2	3	1	3	5	5
Disponibilitate	1	5	5	2	5	5
Ușurință în exploatare	3	1	1	3	4	5
Eliminare/mediu	4	3	4	2	3	3
Stabilitate	4	1	1	3	2	3
Flexibilitate	3	3	3	1	2	5
TOTAL	20	17	16	18	26	30

6.6 Producerea unei berilagertip Nord American utilizând tehnologia țevii de aspirație 15 pentru injecție de gaze

Producerea unei beri lager tip Nord American (NA) cu gust curat ridică multe provocări 17 fabricantului de bere. Berile lager tip NA sunt caracterizate de o culoare deschisă și un profil de gust cu amăreală redusă, zahăr rezidual redus (subțire), fără aromă dominantă și prin 19 urmare relativ fără gust ulterior. Din cauza acestor proprietăți inerente, fabricantul de bere poate masca foarte puține defecte de aromă. Niveluri ridicate de diacetil (untos), acetaldehidă 21 (mărverde) cât și note sulfuroase necorespunzătoare (cauciucars, stătut, ouă clocite, legume gătite) sunt cele mai obișnuite probleme legate de aromă cu care se confruntă fabricanții de 23 bere din ziua de azi. Deși contaminarea bacteriană a mediului de fermentație poate fi de asemenea o cauză a acestor arome necorespunzătoare din bere, controlul impropriu al 25 procesului de fermentație produce adesea niveluri mai ridicate de arome necorespunzătoare decât se așteaptă. 27

Pe parcursul încercărilor de fermentație continuă, conduse ca parte a acestei teze, au fost controlate nivelurile de contaminare atât în must cât și în vasele de fermentație printr-o 29 practică sârguincioasă de tehnici aseptice. încercările de fermentație cu toate trei tipurile de purtători, care au durat mai multe luni, nu au arătat niveluri detectabile de contaminanți (moni- 31 torizate prin metode raportate în Capitolul 4). Niveluri de diacetil (țintă mai puțin de 30 pg/l) și acetaldehidă (țintă mai puțin de 10 mg/l) mai mari decât cele dorite, au pus probleme pro- 33 duselor din fermentațiile primare continue dar aceste niveluri nu s-au datorat infecției bacteriene. Aceste descoperiri nu diferă de cele raportate în literatură (Pajunen și colab., 35 2000; Kronlof și colab., 2000). Un producător de bere belgian și-a transformat nivelurile ridicate de acetaldehidă din berea dintr-un procedeu de fermentație continuă într-o caracte- 37 ristică de vânzare și și-a comercializat produsul ca o bere de malț cu aromă de măr (Andries și colab., 1996b). Niveluri ridicate de diacetil după fermentația primară sunt de asemenea 39 normale în industria de fabricare a berii. Anumiți producători de bere au adoptat o practică numită “creștere liberă de temperatură” după încheierea fermentației primare pentru a ajuta 41 la reducerea diacetilului. Alții au optat pur și simplu pentru păstrarea produselor lor pe perioade mai lungi de timp în timpul procesului de maturare pentru a obține reducerea dicetonelor 43 apropiate (diacetil și 2,3-pentandionă) la nivelurile dorite. în altă abordare, mai multe grupuri de cercetare au dezvoltat tehnologia de maturare rapidă discutată în capitolul 2 pentru a 45 gestiona nivelurile ridicate de diacetil. Deși această abordare este foarte eficientă, ea adaugă un alt nivel de complexitate la procedeul global de fabricare a berii, care poate fi acceptat greu 47 de către unii.

RO 122457 Β1

Rațiunile economice ale procedeului de maturare rapidă sunt întrucâtva clare; cu toate acestea, în aceste zilele incipiente ale prelucrării continue din industria de fabricare a berii, poate fi recomandabil să se minimizeze complexitatea tehnologică pentru a se facilita tranziția de ia fermentație în șarje tradițională la producția continuă. Din acest motiv, s-a decis investigarea utilizării unei mențineri în șarje după fermentația primară continuă în sistemele pilot de 50 I cu injecție de gaze pentru a controla nivelurile ridicate de diacetil din berea finită. Această etapă suplimentară de prelucrare nu a fost prevăzută la începutul acestui program de doctorat, totuși, a fost necesar să se implementeze o asemenea măsură pentru a compara berile produse continuu cu berile de control în șarje.

6.6.1 Utilizarea menținerii în șarje după fermentația primară continuă

Un parametru critic în determinarea încheierii fermentației primare este nivelul de diacetil din lichidul fermentat final. Conversia precursorului de diacetil, α-acetolactatul, în diacetil este etapa limitatoare de viteză din calea diacetilului (fig. 3.5). Această primă reacție are natură chimică și este puternic dependentă de temperatură. Dacă berea “verde” intră în procesul de maturare la rece înainte de apariția conversiei chimice a α-acetolactatului în diacetil, berea rezultată poate avea niveluri de diacetil peste pragul de gust de 20 pg/l, în afară de faptul când sunt utilizate perioade întinse de maturare la rece pentru a permite apariția unei conversii lente a precursorului. în toate trei fermentațiile continue descrise în secțiunea 6.5, nivelul diacetilului la ieșirea din reactor a fost peste valoarea țintă dorită de 30 pg/l în berea nediluată. Dacă lichidul a fost filtrat în acest stadiu pentru eliminarea drojdiei, diacetilul va rămâne ridicat deoarece s-a utilizat o perioadă în șarje la cald pentru a reduce valoarea diacetilului sub limita acceptabilă.

Berea fermentată continuu a fost colectată și păstrată în vase de bere de 401 din oțel inoxidabil la 21°C. S-au extras regulat mici eșantioane (100 ml) din lichid și s-au analizat pentru diacetil, etanol greutate specifică, esteri și alcooli de fuzel. Fig. 6.74 arată reducerea diacetilului față de timpul de menținere la cald pentru o șarjă de bere fermentată continuu cu drojdia LCC290 ca matrice de imobilizare. Perioada de menținere la cald a fost eficientă în reducerea nivelului de diacetil de la -600 pg/l sub 30 pg/l, ceea ce este considerat în industria de fabricare a berii ca limita “pre-drop”.

în alt test, a fost investigat efectul agitării asupra reducerii diacetilului în timpul perioadei de menținere. S-a introdus un gazde barbotare dioxid de carbon (0,14 m³/h) printr-o tubulatură de 1,27 cm din oțel inoxidabil, în partea inferioară a vasului de colectare a berii pentru a menține lichidul agitat în timpul perioadei de menținere. Fig. 6.75 prezintă rezultatele acestui experiment. A părut că agitarea furnizată de barbotarea de CO₂ a avut un impact foarte redus asupra vitezei de reducere a diacetilului în acest rezervor secundar de colectare. Acest rezultat poate fi un indicator al amestecării inadecvate furnizată de gazul de amestecare CO₂, prin urmare, necrescând viteza de reacție a primei reacții chimice (conversia a-acetolactatului în diacetil) sau necrescând viteza de transfer de masă pentru ca doua reacție să aibă loc mai rapid (conversia diacetilului în acetoină de către drojdie). Poate fi de asemenea posibil ca vasul neagitat să fi avut suficiente celule în suspensie pentru a reduce suplimentar diacetilul în acetoină inactivă din punct de vedere al aromei odată ce a avut loc conversia chimică limitatoare de viteză (prima etapă).

Efectele acestei mențineri a șarjei la cald după fermentația primară continuă asupra concentrației de esteri și alcooli de fuzel și asupra concentrației de etanol și greutății specifice a lichidului sunt prezentate în fig. 6.76 și respectiv 6.77. Din aceste rezultate, a apărut că perioada de menținere la cald a avut un efect redus asupra concentrațiilor de acetaldehidă, acetat de etil, propanol, izobutanol, alcool izoamilicși acetat de izoamil (fig. 6.76). Greutatea specifică a lichidului din vasul de colectare a scăzut de la 2,7°P la 2,0°P în primele 12 h ale

RO 122457 Β1 perioadei de menținere și apoi s-a plafonat la această valoare mai redusă. Concentrația de etanol a fost stabilă la 70 mg/l pe parcursul perioadei de test de 65 h. Aceste rezultate au indicat faptul că perioada de menținere afectează în principal concentrația de diacetil și 2,3pentandionă în timp ce impactul asupra esterilor, alcoolilor de fuzel și etanolului va fi minim.

, ePefiiandioma —.Țcntldiacc^·

Fig. 6.74. Concentrația de dicetone apropiate față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290în sistemul cu injecție de gaze.

| ♦ Fara agitare *Cu agitate—— Țin» diacetil

Fig. 6.75. Concentrația de diacetil față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290 în sistemul cu gaz comprimat. S-a agitat un eșantion prin barbotaj cu gaz dioxid de carbon în timp ce alt eșantion a fost lăsat nemișcat.

RO 122457 Β1

Perioada de menținere în șarjă la cald (h)

Fig. 6.76. Concentrațiile de ester și alcool de fuzel față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290 în sistemul cu injecție de gaze.

Fig. 6.77. Concentrația de etanol și greutatea specifică față de menținerea șarjei la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290 în sistemul cu injecție de gaze.

Protocolul de menținere în șarje a fost executat asupra lichidului produs din fermentațiile continue în bioreactorul de 501 cu injecție de gaze utilizând drojdia superfloculantă LCC290, drojdia mediu floculantă LCC3021 sau drojdia imobilizată cu κ-caragenină. Profilele de reducere a diacetilului ale acestor trei etape de test sunt prezentate în fig. 6.78. Diacetilul a fost redus cu succes la valoarea lui țintă de 30 pg/l în toate trei cazurile. Timpul care a fost necesar pentru realizarea acestei reduceri, totuși, a variat în toate cele trei cazuri. în situația cu LCC290, reducerea de la 600 pg/l la 30 pg/l a fost realizată în aproximativ 48 ore, în timp ce fermentația cu LCC3021 și fermentația cu κ-caragenină au necesitat doar ~24 h și ~40 pentru a atinge această valoare țintă. S-a postulat că această discrepanță a avut legătură cu valoarea inițială de pornire a diacetilului și nu cu tipul de matrice de imobilizare utilizat.

RO 122457 Β1

Fig. 6.79 ilustrează aceleași rezultate pentru diacetil din fig. 6.78 cu o ajustare a timpului executată asupra rezultatelor de la fermentațiile cu LCC3021 și κ-caragenină. Curbele de reducere inițială a diacetilului ale acestora din urmă două fermentații au fost deplasate astfel încât valorile lor inițiale cad pe curba de reducere a diacetilului generată de drojdia superfloculantă LCC290. Cu această transformare, profilul de reducere al diacetilului pentru toate cele trei sistemele a părut să cadă pe aceeași linie. Utilizând programul TableCurve2D, aceste rezultate au fost fitate la o curbă a unei ecuații cinetice de ordinul 1 (Levenspiel, 1972) (fig. 6.80). S-a calculat că datele experimentale ajustate din fig. 6.79 se potrivesc următoarei ecuații:

» [Diacetil]=648,54 _e ^{( 0 0426t)} (6.1) cu o corelație cu coeficient 0,96. Acest rezultat susține puternic teoria că toate cele trei sistemele de imobilizare au prezentat același potențial de reducere a diacetilului. Rezultatele nu trebuie să fie surprinzătoare deoarece reducerea diacetilului este legată adesea de tulpina de drojdie (Nakatani și colab., 1984). Sistemul cu κ-caragenină a imobilizat drojdia LCC3021 în structura sa de gel și drojdia LCC290 a fost o variantă selectată a tulpinii LCC3021.

Odată ce nivelul de diacetil a fost sub nivelul țintă de 30 pg/l, berile rezultate au fost maturate prin depozitare la rece (2°C) timp de 7 zile înainte să sufere prepararea finală de produs (filtrare, diluare, carbonatare și ambalare). Tabelul 6.3 rezumă analiza berilor produse în sistemele pilot de 501 fie cu drojdie LCC290, drojdie LCC3021 fie drojdie imobilizată în κ-caragenină, ca matrici de imobilizare. Fig. 6.81 este un grafic radar al esterilor și alcoolilor de fuzel din cele trei beri produse continuu și a unei beri de control produsă industrial în șarje. Comparativ cu lichidul în șarje produs industrial (control), lichidele continue au avut mai puțini esteri (acetat de etil, acetat de izoamil) și mai mult propanol și mai puțin izobutanol, în principal alcool amilic, și alcool izoamilic. Nivelurile de acetaldehidă din produsele fermentațiilor continue au fost mai ridicate decât lichidul de control. Nivelul de spumare, aburii de răcire inițiali, aburii de încălzire, sulfura de dimetil, dioxid de sulf, dioxid de carbon și nivelurile de aer au fost în specificații.

Fig. 6.78. Concentrația de diacetil față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290, drojdie LCC3021 și drojdie imobilizată în gel de caragenină, în sistemul cu injecție de gaze.

RO 122457 Β1

Fig. 6.79. Concentrația de diacetil față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290, drojdie LCC3021 și drojdie imobilizată în gel de caragenină, în sistemul cu injecție de gaze. Valorile pentru fermentația cu LCC3021 și cu caragenină au fost ajustate în timp pentru a avea același punct de plecare ca și fermentația cu LCC290.

lOiacehl » l«MWÎ t)

Fig. 6.80. Concentrația de diacetil față de menținerea în șarje la cald după fermentația primară continuă cu drojdie LCC290, drojdie LCC3021 și drojdie imobilizată în gel de caragenină, în sistemul cu injecție de gaze. Valorile pentru fermentația cu LCC3021 și cu caragenină au fost ajustate în timp pentru a avea același punct de plecare ca și fermentația cu LCC290.

Mai mulți alți parametri (extract aparent, extract real, extract original calculat, culoare, amăreală) care sunt afectați strâns de diluția produsului de la concentrația sa inițială de etanol la valoarea finală de 5,0% v/v au fost diferiți față de control, deoarece produșii continui au necesitat o diluție mai mare cu apă pentru a atinge valoarea de etanol dorită datorită concentrațiilor inițiale de etanol mai ridicate (70 g/l față de 60 g/l în șarje). Fig. 6.82 este un grafic

RO 122457 Β1 radar pentru alcool, diacetil, pH, culoare și amăreală ale acelorași lichide descrise ca mai sus. 1 Nivelul de alcool, diacetil și pH sunt în domeniul țintă în timp ce culoarea și amăreală sunt în afara specificațiilor. Culoarea mai redusă are legătură cu diluția mai ridicată pe care 3 lichidele continue au suferit-o și aceasta poate fi ajustată prin creșterea culorii din alimentarea cu substanță nutritivă must. Valorile amărelii fac de asemenea obiectul aceleiași erori de 5 diluție și vor fi de asemenea ajustate în alimentarea cu substanță nutritivă must.

Tabelul 6.3

Rezumatul analizei berilor produse utilizând sistemul cu injecție de gaze 9

Specificație	Lichid fermentat industrial în șarje	Lichid fermentat continuu cu	Lichid continuu fermentat cu	Lichid fermentat continuu cu	11 13
Aer (ml)	<1	0,40	0,35	0,35	15
Dioxid de carbon (%)	2,75	2,90	2,81	2,73
Dioxid de sulf (mg/l)	<10	0	0	0	17
Sulfură de dimetil (pg/l)	<70	59	30	30
Amăreală (BU)	12,00	11,30	13,74	13,18	19
Culoare (SRM)	3,20	2,20	2,10	2,30
pH	4,10	4,15	4,10	4,09	21
Diacetil (pg/l)	<20	12	12	9
Alcool (% v/v)	5,00	4,99	5,03	5,04	23
Alcool (% greut/greut.)	3,93	3,93	3,96	3,96
Extract aparent (°P)	1,55	1,02	1,40	1,44	25
Extract real (°P)	336	2,84	3,24	3,27
Extract original calc. (°P)	11,0	10,5	11,0	11,0	27
Abur de încălzire (FTU)	<200	45	50	47
Abur inițial de răcire (FTU)	<100	43	51	54	29
Spumă(e)	>170	167	187	175
Acetaldehidă (mg/l)	4,4+1,3	10,0	21,9	11,6	31
Propanol (mg/l)	12,8±6,8	57,6	51,7	84,3
Acetat de etil (mg/l)	32,4+4,3	11,0	10,6	8,7	33
Izobutanol (mg/l)	21,6±3,4	10,6	8,3	8,9
Alcool amilic primar (mg/l)	20,0±2,3	15,2	9,4	6,4	35
Alcool izoamilic (mg/l)	60,9±8,6	48,0	40,9	46,5
Acetat de izoamil (mg/l)	2,5±0,7	0,32	0,25	0,18	37

RO 122457 Β1

Acctaidehidi χ 4

i | _ ______

P-~^rtrol - a - LCC2BO —A-LCCWai -o- Cangeninâ ]

Fig. 6.81. Graficul radar al berilor fermentate continuu în sistemul cu injecție de gaze utilizând fie drojdie LCC290, drojdie LCC3021, fie drojdie LCC3021 imobilizată în sfere de gel din caragenină. Esterii și alcoolii de fuzel ale berilor finite sunt reprezentate în acest grafic. Toate produsele au fost supuse unei mențineri în șarje la cald după etapa de fermentație primară.

Cortrol -’b . LCC290 -LCC3021 —O -Gwarâninâ ·

- —— iinmmnrs»~e· — ...............— n

Fig. 6.82. Graficul radar ai berilor fermentate continuu în sistemul cu injecție de gaze utilizând fie drojdie LCC290, drojdie LCC3021 fie drojdie LCC3021 imobilizată în sfere de gel din caragenină. Esterii și alcoolii de fuzel ale berilor finite sunt reprezentate în acest grafic. Toate produsele au fost supuse unei mențineri în șarje la cald după etapa de fermentație primară.

RO 122457 Β1

6.6.2 Selectarea celui mai bun gaz de barbotaj 1

Dioxidul de carbon este disponibil cu ușurință în toate instalație de fabricare a berii deoarece este un produs secundar natural al fermentației drojdiei. Fabricile de bere 3 colectează CO₂ evoluat și apoi spală curentul de gaz pentru a elimina ușoarele impurități care ar putea fi cărate de acesta în curentul de colectare (în mod tipic compuși sulfurași). Acest 5 curent purificat este comprimat apoi și depozitat ca lichid pentru utilizări viitoare în fabrica de bere (puritate 99,95%). Utilizarea de dioxid de carbon ca gaz de barbotaj în fermentația 7 continuă a părut o alegere logică din punct de vedere al exploatării. Instalația este capabilă să-și utilizeze sistemul de colectare și să recupereze CO₂ care iese din linul de fermentare 9 continuă. Utilizarea de alte gaze va adăuga doar un alt nivel de complexitate la exploatările existente ale instalației. 11

Cu toate acestea, pentru ca fermentația continuă să devină o alternativă viabilă la exploatările în șarje existente, este necesar să se obțină un produs care să fie o potrivire 13 apropiată a mărcilor existente. Se crede că prin minimizarea impacturilor biologic/biochimic, la ca drojdia este expusă în timpul fermentației continue, poate fi posibil să obțină o aseme- 15 nea potrivire de produs. Se știe că dioxidul de carbon afectează în mod defavorabil metabolismul drojdiei în timpul fermentației primare. Acest efect este amplificat în vase cilindroconice 17 înalte unde presiunea superioară inerentă sistemului suprimă eliberarea liberă de CO₂ din mediul lichid. Aceste condiții tind să producă beri cu mai puțini esteri și mai mulți alcooli de 19 fuzel. S-au făcut încercări reușite pentru eliminarea unei părți din acest CO₂ din fermentație prin injectarea periodică a unui curent de gaz auxiliar în partea inferioară a vasului cilindro- 21 conic. Efectele inhibării CO₂ au părut să fie reduse, cu produșii rezultați conținând niveluri mai reduse de alcooli de fuzel și niveluri mai ridicate de ester. 23

Pe baza acestor cunoștințe, a fost investigată utilizarea azotului gazos în loc de dioxid de carbon, ca gaz de barbotaj în sistemul cu injecție de gaze. Au fost colectate și prelucrate 25 mai multe lichide fermentate în reactoarele de 501 cu injecție de gaze din Labatt Experimental Brewery utilizând următoarele etape. După 14 h de colectare de lichid din reactor (timp de 27 rezidență 24 ore), “berea verde” a fost decantată din drojdie. Acest lichid a fost apoi supus unei perioade de menținere de 48 h la temperatura camerei (21°C), care a permis atât 29 diacetilului cât și acetaldehidei să atingă specificațiile Labatt (diacetil <30 pg/l și acetaldehidă <10 mg/l). Acest lichid a fost apoi maturat la rece timp de 7 zile și prelucrat apoi utilizând 31 practici industriale standard.

Tabelul 6.4 compară rezultatele berilor finite obținute din fermentația continuă cu 33 drojdie LCC290 cu sisteme cu barbotaj de CO₂ și sisteme cu barbotaj de N₂ cu un lichid standard produs în mod industrial (control). Lichidul cu barbotaj cu azot este comparat 35 favorabil cu lichidul produs industrial. Analizele au indicat că a existat de două ori mai mult 1 -propanol în lichid în timp ce concentrația de sulfura de dimetil a fost de aproximativ trei ori 37 mai redusă. Valorile atât ale culorii cât și amărelii au părut să fie mai mari decât lichidul industrial cum a fost și potențialul de spumare măsurat prin testul NIBEM. Berea cu CO₂ 39 barbotat a avut mai puțini esteri (acetat de etil, acetat de izoamil) și mai mult 1 -propanol decât a avut lichidul cu azot barbotat. Rapoartele esterilor (acetat de etil, acetat de izoamil, 41 hexanoat de etil, octanoat de etil, decanoat de etil) față de alcoolul de fuzel (1-propanol, izobutanol, alcool izoamilic) au fost calculate pentru lichidul de control, lichidul cu azot 43 barbotat și lichidul cu CO₂ barbotat și s-a găsit că sunt 0,30, 0,27, respectiv 0,15.

RO 122457 Β1

Tabelul 6.4

Rezumatul analizelor chimice pentru mai multe produse fermentate continuu utilizând sistemul cu gaz comprimat încărcat cu drojdia superfloculantă LCC290

Analiză	Lichid fermentat industrial în șarje	Lichid fermentat continuu cu barbotaj de azot	Lichid fermentat continuu cu barbotaj de CO2
Acetaldehidă (mg/l)	2,53	3,68	4,80
Acetat de etil (mg/l)	28,08	30,90	14,14
1-propanol (mg/l)	13,03	28,45	40,03
Izobutanol (mg/l)	17,15	17,89	7,01
Acetat de izoamil (mg/l)	2,57	2,06	0,69
Alcool izoamilic (mg/l)	74,54	78,45	51,35
Hexanoat de etil (mg/l)	0,140	0,180	0,074
Octanoat de etil (mg/l)	0,110	0,280	0,059
Decanoat de etil (mg/l)	0,0079	0,0630	0,0081
Diacetil (pg/l)	6	9	10
2,3-pentandionă (pg/l)	4	5	14
Dioxid de sulf (mg/l)	1,3	1	0
Sulfură de dimetil (mg/l)	79	24	64
Amăreală(BU)	11,5	20,6	15,5
Culoare (SRM)	3,1	4,1	3,7
Spumă(e)	176	210	195
FAN (mg/l)		92	84
PH	4,13	4,10	4,19
RE (°P)	3,38	4,08	3,601
COE (’P)	10,97	12,77	11,50
Alcool (% v/v)	4,93	5,74	5,17

Fig. 6.83 este graficul radar reprezentând concentrațiile de esteri, alcooli de fuzel și acetaldehidă pentru cele trei lichide. Profilul lichidului barbotat cu azot îl urmărește îndeaproape pe cel al berii de control, în afară de un nivel mai ridicat de propanol. Fermentația cu CO₂ barbotat a prezentat esteri și alcool de fuzel mult mai reduși care nu s-au potrivit cu controlul. în ambele lichide de fermentație continuă, nivelurile de diacetil și acetaldehidă au fost sub specificațiile Labatt.

Descoperirile au sugerat că barbotajul de azot a crescut producerea de esteri la niveluri similare celor ale berilor comerciale, în timp ce barbotajul de dioxid de carbon a produs lichide cu concentrații de ester relativ mai reduse. Aceste rezultate sugerează un metabolism modificat al drojdiei în mediul cu barbotaj de CO₂. Nivelurile de propanol, indiferent de gazul de barbotaj, au fost mult mai mari în berile fermentate continuu decât cele măsurate în berile de control fermentate industrial. Deși concentrațiile de propanol sunt cu mult sub pragul de gust de 100 mg/l, diferențele remarcate pot fi un indicator al metabolismului ușor modificat ce apare în fermentația continuă comparativ cu fermentația în șarje. Este de asemenea posibil ca nivelul mai ridicat de propanol să se datoreze alimentării continue cu aminoacidul treonină, care, pe calea degradării oxo-acidului va produce propanol.

100

RO 122457 Β1

Acetiktehidft x 10

Fig. 6.83. Grafic radar care compară esterii și alcooli de fuzel ai lichidelor de fermentație continuă cu injecție de gaze cu barbotaj de azot și CO₂ față de lichidul produs industrial.

CAPITOLUL 7.0. CONCLUZII

Din cercetarea efectuată pe parcursul acestei descrieri pot fi trase următoarele concluzii. Poate fi produsă o bere acceptabilă fără defecte majore de aromă utilizând un bioreactor pilot de 50 I cu țeava de aspirație pentru injecție de gaze ca lin de fermentare primară continuă atunci când este urmată de o menținere de 2 zile a șarjei pentru controlul diacetilului. Un timp de rezidență minim de 24 sau un ciclu de 1 volum de reactor pe zi este realizabil pentru fermentația mustului cu greutate ridicată (17,5°P)în bulionul fermentat final (2,5°P). Utilizarea drojdiei superfloculante LCC290, a drojdiei mediu floculante LCC3021 și a drojdiei imobilizată în κ-caragenină sunt cu toții purtători fezabili în sistemul cu injecție de gaze. Utilizarea de purtători mai grei preformați cum arfi sfere din sticlă Siran® și sfere din kiselgur Celite® nu sunt alternative practice într-un sistem cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. Un minim de 2 luni de exploatare continuă în cazul sferelor de gel din κ-caragenină și un minim de 3 luni de exploatare continuă în cazul fermentațiilor cu LCC290 și LCC3021 sunt realizabile fără să apară nici o contaminare microbiană sau instabilitate a performanței reactorului. în plus, sistemul continuu a fost capabil de potențial de manipulare și variații presupuse în alimentarea industrială cu must în timpul perioadelor întinse de funcționare.

Fermentația continuă utilizând drojdia superfloculantă LCC290 cu azot drept gaz de barbotaj, urmată de o perioadă de menținere de 2 zile a șarjei, a produs cea mai apropiată potrivire de aromă cu o bere industrială de control. Menținerea de 2 zile a șarjei prevăzută pentru a trata cu concentrațiile ridicate de diacetil în lichidul de evacuare al linului de fermentare primară continuă a fost un mecanism de control eficient, deși nu optim. Capacitatea de reducere a diacetilului ale celor trei sisteme de fermentație continuă a fost foarte similară, așa cum s-a suspectat anterior, această trăsătură poate fi atribuită tipului de tulpină. Perioada de menținere a șarjei nu a afectat concentrațiile de esteri și alcooli de fuzel din bere în timpul etapei de menținere.

101

RO 122457 Β1

Utilizarea de 3% oxigen în gazul de barbotare a furnizat niveluri adecvate de oxigen element nutritiv în must, având ca rezultat menținerea unei populații viabile de drojdie (peste 90%) pe parcursul ciclurilor de fermentație cu producerea de beri cu un profil de aromă acceptabil. Fermentațiile continue utilizând drojdia LCC290 și drojdia LCC3021 ca matrici de imobilizare au atins o stare pseudo-stabilă mult mai rapid decât sistemul cu sfere de gel din κ-caragenină. Instabilitatea fermentațiilor imobilizate pe κ-caragenină, rezultată posibil dintr-o creștere a populației de drojdie imobilizată, a cauzat fermentația unui produs sub nivelurile țintă. Pentru o producție continuă ideală, acest fenomen este de nedorit, deoarece demarări prelungite cresc timpul necesar reacției și repornirii după o cădere catastrofică. O față de pornire mai lungă va necesita de asemenea o față de exploatare continuă mai lungă pentru a deveni atractivă.

Procedeul de producție continuă de sfere de gel a produs cantitățile necesare de sfere pentru testarea în interiorul unităților pilot. Cu toate acestea, este necesar să se optimizeze suplimentar procedeul de producție al sferelor, astfel încât să se producă sfere cu o distribuție granulometrică mai strânsă. Procedeul necesită de asemenea o investigație suplimentară pentru determinarea adecvabilității sale la scară industrială. Pentru ca această opțiune să devină viabilă, trebuie găsit și testat un nou tip de amestecător static, mai degrabă decât cel de tip Kenics investigat în această cercetare, pentru care scalarea poate fi realizată prin creșterea diametrului mai degrabă decât doar a numărului de amestecătoare statice.

Tehnica markerului cu impuls de acid utilizată în această descriere a permis evaluarea timpului de amestecare și a vitezei de circulație în bioreactorul pilot de 501 în timpul fermentațiilor actuale, implicând drojdia superfloculantă LCC290, drojdia mediu floculantă LCC3021 și drojdia imobilizată pe κ-caragenină. Datele amestecării au fost fitate la o funcție sinusoidală amortizată din care au fost calculate timpul de amestecare și viteza de circulație. Amestecarea rapidă este furnizată în sistemul cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze cu timpi de amestecare calculați la mai puțin de 200 s pentru toate trei tipurile de purtători de imobilizare. Timpul de amestecare a scăzut ușor odată cu creșterea vitezei superficiale a gazului în toate trei scenariile testate. La toate vitezele superficiale ale gazului testate (2 mm/s până la 6 mm/s), sistemul cu LCC290 a arătat cei mai rapizi timpi de amestecare (între 100 s și 120 s). Timpii de circulație ai lichidului au fost similari pentru toate trei tipurile de purtător indiferent de viteza superficială a gazului. Aceștia au scăzut de asemenea liniar cu creșterile corespunzătoare ale vitezei gazului. Amestecarea completă a lichidului (răspuns 98% la un impuls) a survenit în trei până la șase cicluri de circulație în reactor pentru toți purtătorii de imobilizare testați. Aceste rezultate au confirmat faptul că sistemul pilot de 501 a furnizat o amestecare adecvată pentru fermentația continuă. Timpi de amestecare slabi ar fi fost un indicator al unor posibile zone moarte care ar fi fost nedorite pentru fermentația berii.

Descrierea detaliată-Partea a 2-a:

CAPITOLUL 4. MATERIALE Șl METODE

4.1 Tulpina de drojdie și caracteristici

Pe parcursul acestei lucrări a fost utilizată o tulpină de fermentație lager de Saccharomyces cerevisiae, Labatt Culture Collection (LCC) 3021. Saccharomyces cerevisiae este sinonimă cu Saccharomyces uvarum Beijerinck var. carlsbergensis Kudryavtsev, 1960 (Kurtzman, 1998). La 37°C LCC 3021 nu va crește. Aceasta ajută la distingerea drojdiei lager LCC 3021 de majoritatea drojdiei de bere de malț, care va crește la 37°C și temperaturi mai ridicate. LCC 3021 este o tulpină de fermentație de fund, așa cum este majoritatea tulpinilor lager, dar există și excepții. De asemenea, această tulpină va fermenta glucoză, galactoză, sucroză, maltoză, rafinoză, și melibioză, dar nu amidonuri. Capacitatea de a fermenta melibioză este o unealtă utilizată de taxonomiști pentru a o distinge de drojdiile de bere de malț.

102

RO 122457 Β1

Ca și cu majoritatea tulpinilor pentru fabricarea de bere, LCC 3021 este poliploidă și 1 se reproduce prin diviziune mitotică. în condiții normale de fabricare a berii, drojdiile lager nu se reproduc prin meioză. Acest lucru prezintă avantajul că tulpina de fabricare a berii este 3 stabilă genetic deoarece crossover-ul materialului genetic este mai puțin probabil (Kreger-van Rij, 1984). 5

4.2 Prepararea inoculatului de drojdie

Drojdia a fost preluată dintr-o fiolă conservată criogenie într-un refrigerator la ~80°C 7 și întins în dungi pe mediu de creștere din element nutritiv din agar de extract de drojdie și peptonă (PYN) (peptonă, 3,5 g/l; extract de drojdie, 3,0 g/l; KH₂PO₄, 2,0 g/l; MgSO₄ · 7H₂O, 9

1,0 g/l; (NH₄)₂SO₄,1,0 g/l; glucoză, 20,0 g/l; agar, 20,0 g/l în dH₂O) pentru obținerea de colonii bine separate. S-a preluat o buclă sterilă constând din mai multe colonii, din placa veche de 11

3-4 zile de drojdie în creștere, și aceste colonii au fost inoculate într-un volum de 10 ml de must într-o eprubetă. Acesta a fost lăsat să crească la 21°C peste noapte, de unde și terme- 13 nul “cultură peste noapte”, și apoi a fost adăugată la un volum de must lager, uzual 200 ml, pentru a crește biomasa de drojdie. în zile consecutive, acest amestec a fost adăugat la un 15 alt volum mai mare de must, și așa mai departe, până când s-a propagat cantitatea dorită de biomasă de drojdie. în general, se așteaptă producerea a aproximativ 20 g de drojdie lager 17 pe litru de must. Pentru prepararea inoculării drojdiei, cultura a fost centrifugată la 4°C și 1,0x10⁴ rpm (raza=0,06 m) timp de 10 min. După centrifugare, lichidul a fost decantat și s-a 19 obținut greutatea umedă adecvată de drojdie din peletă, pentru inoculare.

4.3 Mediul de fermentație al mustului 21

Labatt Breweries of Canada a furnizat must de producere a berii cu o greutate specifică de 17,5°P. Concentrația de carbohidrați fermentabili, greutatea specifică, și azotul amino 23 liber din mustul de fabricare a berii utilizat pentru fermentațiile pe parcursul acestei lucrări sunt date în Anexa A2.1. Detalii suplimentare despre compoziția mustului sunt date de Dale 25 și colab., 1986, Hoekstra, 1975, Hough și colab. 1982, Klopper, 1974, și Taylor, 1989.

Fermentațiile în șarje: mustul a fost încălzit într-o autoclavă timp de 45 min. la 100°C 27 și apoi răcit, înainte de inocularea cu sfere cu celule imobilizate sau drojdie suspendată liber.

Fermentații continue: mustul utilizat pentru fermentațiile continue a fost pasteurizat 29 cu detentă (schimbător de căldură Fisher Plate, cu curenți combinați tip Eurocal 5FH) înainte de introducerea în bioreactorul cu injecție de gaze și acest must a fost monitorizat regulat 31 pentru contaminanți microbieni, așa cum s-a descris în secțiunea 4.6. Dacă în must s-a detectat contaminare, acesta a fost eliminat imediat și s-a colectat must nou din instalație. 33

Pasteurizatorul cu detentă a fost exploatat la un debit volumetric de 0,8 m³/oră. Unitatea a avut o secțiune tubulară de menținere unde mustul a fost menținut la o temperatură 35 medie de 85°C cu o temperatură minimă de 80°C. Volumul secțiunii de menținere a fost 1,13x10² m³, rezultând un timp de rezidență de 51 s în secțiunea de menținere. După etapa 37 de încălzire, mustul a fost răcit rapid la o temperatură de 2°C la ieșirea din unitate.

4.4 Metodologia de imobilizare 39

Gelul de kappa-caragenină X-0909 a fost un cadou generos de la Copenhagen Pectin

A/S. Sferele de gel din kappa-caragenină conținând celule de drojdie lager înglobate au fost 41 produse utilizând procedeul amestecătorului static, așa cum s-a descris detaliat de către Neufeld și colab. (1996), cu încărcări celulare inițiale de 10⁷-10⁸ celule/ml de gel, care sunt 43 specificate pentru fiecare experiment. Așa cum este ilustrat în fig. 15, procedeul amestecătorului static se bazează pe formarea unei emulsii între o față continuă neapoasă, ulei vegetal 45 (Mazola Corn Oii), și o față dispersată apoasă, kappa-caragenină (3% greut./vol.) în soluție

KCI (0,2% greut./vol.), inoculată cu drojdie, utilizând amestecătoare statice seriale cu 47 poliacetal (Cole-Parmer Instrument Co., USA). în secțiunea de încălzire din schemă, unde

103

RO 122457 Β1 drojdia a fost amestecată rapid cu Soluția de caragenină și a fost formată emulsia, temperatura a fost de 37°C. Gelificarea picăturilor fine de kappa-caragenină în emulsie a fost indusă cu răcire rapidă într-o baie cu gheață și întărire ulterioară într-o baie de clorură de potasiu (22 g/l). Pentru a crea amestecul de drojdie și caragenină s-a utilizat un amestecător static cu 24 elemente de 6,4 mm în diametru. Afost utilizat un al doilea amestecător cu 42 elemente de 12,7 mm în diametru pentru a crea emulsia. Sferele utilizate pentru experimentele din această lucrare au fost de 0,5 mm < (diametrul sferei) < 2,0 mm.

4.5 Distribuția granulometrică cumulativă a particulelor sferelor de gel din kappacaragenină conținând celule de drojdie imobilizate

Sferele de gel din kappa-caragenină au fost eșantionate aleator dintr-o exploatare de producție de 301 de sfere de gel pentru a calcula o distribuție granulometrică a particulelor pe baza masei greutății ude. Fiecare eșantion a avut aproximativ 500 g greutate udă. A fost utilizată cernerea pentru determinarea distribuției granulometrice a particulelor sferelor. Sferele au fost trecute printr-o serie de site cu dimensiuni ale rețelei de 2,0, 1,7, 1,4, 1,18, 1,0, și 0,5 mm. S-a utilizat un volum de 4,5 I de soluție 22 g/l KCI pentru a facilita cernerea fiecărui eșantion de sfere. S-a presupus că sferele de gel din kappa-caragenină sunt perfect sferice astfel încât diametrul sitei a fost luat ca diametrul particulei. S-a presupus de asemenea că densitatea particulelor a fost uniformă și independentă de dimensiunea particulei.

4.6 Enumerarea și viabilitatea celulelor de drojdie

Viabilitatea drojdiei suspendate liber și concentrația celulară: A fost utilizată tehnica de colorare cu albastru de metilen a American Society of Brewing Chemists International (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992) pentru a măsura viabilitatea celulară. Colorarea măsoară dacă o populație de drojdie este viabilă sau non-viabilă pe baza capacității celulelor viabile de a oxida colorantul în forma sa incoloră. Celulelor non-viabile le lipsește capacitatea de a oxida colorantul și prin urmare acesta rămâne albastru. S-a preparat albastru de metilen tamponat cu Fink-Kuhles prin amestecarea a 500 ml din Soluția A (0,1 g albastru de metilen/500 ml dH₂O) cu 500 ml din Soluția B (498,65 ml de 13,6 g KH₂P0₄/500 ml dH₂O amestecați cu 1,25 ml de 2,5 g Na₂HPO₄ · 12H₂0/100 ml dH₂O) pentru a da o soluție finală tamponată de albastru de metilen cu un pH de 4,6.

Soluția de drojdie diluată a fost amestecată cu soluția de albastru de metilen într-o eprubetă, până la o suspensie de aproximativ 100 celule de drojdie într-un câmp microscopic. O picătură mică din suspensia bine amestecată a fost plasată pe o lamă de microscop și acoperită cu o folie. După unu până la cinci minute de contact cu colorantul, au fost enumerate celulele colorate în albastru și celulele rămase incolore. Procentul de celule viabile a fost raportat ca procent din numărul total de celule enumerate. Concentrația celulară a fost determinată utilizând un microscop cu lumină și un hemacotometru (Hauser Scientific Company).

Viabilitatea celulelor imobilizate și concentrația celulară: Sferele de gel au fost separate din lichidul în fermentație prin trecerea amestecului printr-o sită sterilă (dimensiune a porului de 500 pm) și clătirea cu 10 ml de apă distilată. Sferele de gel, 1 ml, conținând drojdie înglobată au fost adăugate la un container de specimene de 50 ml steril conținând 19 ml de apă distilată. Aceste sfere au fost apoi dislocate utilizând un aparat Polytron® (Brinkmann Instruments), pentru a elibera celulele din gel. Viabilitatea și concentrația celulară au fost măsurate apoi așa cum s-a descris pentru celulele suspendate liber.

4.7 Analize microbiologice

Analizele fazei lichide: S-au preluat eșantioane din fermentațiile continue cel puțin o dată pe săptămână pentru analize microbiologice. Mustul care a fost utilizat pentru fermentațiile continue a fost de asemenea testat pentru contaminare înainte de transferul acestuia în bioreactor. Pentru a testa prezența atât a bacteriilor aerobe cât și anaerobe, eșantioanele

104

RO 122457 Β1 au fost puse pe plăci de Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories), cu adiția de 10 mg/l 1 de cicloheximidă, și incubate la 28°C timp de 10 zile. Plăcile care au fost testate pentru contaminare cu bacterii anaerobe au fost plasate într-un vas anaerob cu un pachet AraeroGen® 3 (Oxoid), care preia orice oxigen rămas în vas, creând un mediu anaerob. A fost utilizat un indicator anaerob (Oxoid), care devine roz în prezența oxigenului, pentru a verifica condițiile 5 anaerobe din vas. Contaminarea cu drojdie sălbatică a fost testată prin punerea eșantioanelor pe plăci pe mediu de drojdie (agar YM, Difco Laboratories) plus CuSO₄ (0,4 g/l) incubate la 7 25’C timp de 7 zile. S-a utilizat agar element nutritiv peptonă-extractde drojdie (PYN), descris anterior, pentru a cerceta eșantioanele pentru contaminanți de drojdie non-lager, la 37°C timp 9 de 7 zile. Absența creșterii drojdiei pe PYN la 37’C a indicat că nu au fost prezenți nici o drojdie de malț sau contaminanți care cresc la 37°C. 11

Analizele fazei de gel: S-a dezvoltat o evaluare în laboratoarele inventatorilor pentru a se asigura că sferele cu celule imobilizate pentru utilizarea în fermentații au fost lipsite de 13 bacterii contaminante înainte de a fi inoculate în bioreactor. Grija principală a fost evitarea contaminării cu organisme de care strică berea cum ar fi Pediococcus sp. și Lactobacillus sp. 15 sau drojdie sălbatică. S-a inoculat un volum de 3 ml de sfere de gel din caragenină în 100 ml diferite medii lichide selective descrise mai jos și plasate în baloane de 250 ml la 25’C, și agitate 17 la 100 rpm într-un agitator incubator. Bulionul NTBB (Nachweis von Bierscnhdlichen Bacterien) (BBLcat#98139, NBB Broth Base, 0,02 g/l cicloheximidă) este un mediu semi-selectiv care 19 este utilizat pentru testarea bacteriilor care strică berea, cum ar fi Pediococcus sp. și Lactobacillus sp. Bulionul de sulfat de cupru (16 g/l YM bulion, Difco; 0,4 g/l CuSO₄) este un 21 mediu semi-selectiv pentru testarea contaminanțilorcu drojdie sălbatică. în sfârșit, Standard Methods (STA)+bulion de cicloheximidă (16 g/l “Standard Methods” bulion, Difco; 0,02 g/l 23 cicloheximidă) este utilizat pentru testarea bacteriilor găsite în apă, ape reziduale, produse lactate, și alimente (Power și McCuen, 1988). Mediile selective au fost alese pentru a detecta 25 și identifica organisme potențiale care strică berea, în trei zile. Eșantioanele contaminate au fost indicate de turbiditatea din eșantion și a fost făcută o identificare prezumtivă a 27 contaminanți lor.

I

Metodologia detectării celulelor de drojdie deficiente respirator (RD): tehnica încărcării 29 cu clorură de trifeniltetrazoliu (TTC): Această metodă a fost utilizată pentru a distinge celule de drojdie deficiente respirator de restul populației, și se bazează pe principiul că TTC este 31 o sare incoloră care formează un precipitat roșu la reducere. Atunci când TTC este suprapusă pe colonii de drojdie care cresc pe agar drojdie-peptonă-dextroză (YPD) (extract de drojdie, 33 10 g/l; peptonă, 20 g/l; dextroză, 20 g/l, agar, 20 g/l în dH₂O), drojdia suficientă respirator va reduce TTC, și aceste colonii vor deveni de la roz închis până la roșu. Totuși, drojdia defici- 35 entă respirator nu reduce colorantul și își păstrează culoarea originală.

Culturile au fost diluate serial la o concentrație adecvată de microorganisme, ~100 37 celule/0,2 ml, pentru placare. Plăcile YPD au fost incubate apoi timp de aproximativ 3 zile la 21’C până când coloniile de drojdie au fost vizibile într-un mediu aerob. Fiecare placă a 39 fost apoi acoperită cu 20 ml din agar de suprapunere TTC 50’C. După răcirea soluțiilor individuale la 50’C, agarul de acoperire TTC a fost realizat prin amestecarea 1:1a Soluției 41 A (12,6 g/l NaH₂PO₄; 11,6 g/l Na₂HPO₄; 30,0 g/l agarîndH₂O, autoclavizat la 121’C, 15 min.) cu Soluția B (2,0 g/l 2,3,5-clorură de trifeniltetrazoliu în dH₂O, autoclavizată la 121°C 15 min.). 43

Plăcile au fost citite după 3 h de incubare la temperatură ambiantă. RD procentual a fost raportat ca procent al coloniilor necolorate din numărul total observat. 45

4.8 Microscopia cu scanare electronică (SEM) a drojdiei imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină 47

105

RO 122457 Β1

Sfere de gel din kappa-caragenină conținând drojdie imobilizată au fost extrase din bioreactor prin orificiul de eșantionare și plasate într-un flacon de 10 ml din sticlă cu capac cu filet, cu sferele imersate într-un volum redus de bulion de fermentație. Flaconul a fost acoperit imediat cu gheață și transportat într-un container izolat la unitatea SEM. Sferele de gel din Kappa-caragenină conținând drojdie imobilizată au fost fixate în 2% (v/v) glutaraldehidă preparată în tampon fosfat Sorensen, 0,07 M, pH 6,8 (Hayat, 1972). Aceasta a fost urmată de post-fixarea în 1 % (greut./vol.) tetroxid de osmiu, preparat în același tampon, și deshidratare printr-o serie gradată de soluții alcoolice 50, 70, 80, 90, 95,100% (v/v), 15 min. pentru fiecare, și apoi 3 schimbări la 100%. înainte de punctul de uscare critic (Ladd Research Industries, Burlington, Vt.) prin dioxid de carbon, câteva sfere au fost înghețate în azot lichid, rupte și colectate în alcool 100%. Ruperea prin înghețare permite expunerea fețelor interne ale sferelor cu distorsiune minimă. După punctul de uscare critică, eșantioanele au fost acoperite prin bombardare (dispozitiv de acoperire prin bombardare Polaron SC500, Fison Instruments, England) cu 30 nm de aur/paladiu și apoi scanate cu un microscop electronic cu scanare cu emisie de câmp Hitachi S-4500 (Nissei Sangyo, Tokyo, Japan.

4.9 Protocolul de eșantionare a bioreactorului

Rezervorul orificiului de eșantionare a bioreactorului (supapă de eșantionare cu membrană Scandi-Brew tip T) a fost umplut cu soluție etanolică 70% (v/v) pentru a menține condiții aseptice în jurul orificiului între eșantionări. Pentru prelevarea unui eșantion, a fost îndepărtat dopul din baza rezervorului de etanol, drenat, și clătit cu minuțiozitate cu etanol, înainte de deschiderea orificiului. Eșantioanele au fost colectate într-un flacon bordurat sau un borcan cu capac filetat și volumele au variat de la 5-60 ml, depinzând de analiza necesară. Pentru a testa pentru contaminare microbiologică, s-au pompat cu vid 10 ml din lichidul de fermentație printr-o unitate de filtrare cu membrană sterilă. Membrana, cu 0,45 pm dimensiune a porului, a fost plasată pe mediul adecvat selectiv, așa cum s-a descris în Secțiunea 4.6.

Pentru analize chimice, s-au extras 60 ml de eșantion prin diafragma flaconului de 100 ml bordurat și s-a filtrat prin seringă printr-un sistem de filtrare cu seringă cu două straturi Schleicher și Schull, FP-050, 5 pm și 0,45 pm dimensiuni ale porilor. Volumul necesar de eșantionare a fost dispensat apoi într-un flacon cu spațiu superior de 20 ml și etanșat cu o diafragmă din Teflon și capac de aluminiu. Volumele necesare de eșantionare sunt listate în Tabelul 4.1.

Tabelul 4.1

Cerințele volumelor de eșantionare pentru diverse analize chimice

Eșantion	Volum (ml)
etanol	5
dioli cu catenă scurtă	10
volatile din bere	12
dicetone apropiate	5
carbohidrați/greutate specifică	12
azot amino liber/proteine	12

4.10 Măsurarea oxigenului dizolvat

Analizorul de oxigen dizolvat Dr. Thiedig Digox 5 măsoară oxigenul dizolvat în domeniul 0,001-19,99 mg/l în must, must de fermentație și bere (Anon, 1998). Vilachâ și Uhlig, (1985) au testat mai multe instrumente pentru măsurarea oxigenului dizolvat în bere și au găsit că analizorul Digox dă valorile cele mai precise și de încredere.

Metoda măsurării electrochimice utilizată de Digox 5 se bazează pe o dispunere ampermetrică cu trei electrozi cu un potențiometru. Celula de măsurare constă dintr-un electrod de măsurare (catod) și electrod de numărare (anod). Acești electrozi sunt expuși la

106

RO 122457 Β1 lichidul a cărui concentrație de oxigen trebuie măsurată. După fixarea unui potențial definit 1 de măsurare are loc o reacție la electrodul de măsurare. La electrodul de măsurare mai mare, din argint, moleculele de oxigen sunt reduse la ioni hidroxil. Două molecule de apă reacțio- 3 nează în ecuația 4.1, cu o moleculă de oxigen, absorbind patru electroni, producând patru ioni hidroxil. 5

O₂+2H₂O+4e >40fT (4.1) 7

Anodul din oțel inoxidabil absoarbe cei patru electroni eliberați la catod pentru a asi- 9 gura fluxul de curent. în ecuația 4.2, curentul de măsură, I, este direct proporțional cu concentrația de oxigen, C_{L o}: 11 l=KxC_LO (4.2) 13 unde constanta, K, influențată de constanta Faraday, numărul de electroni convertiți per mole- 15 culă, aria suprafeței catodului, și lățimea stratului de margine la suprafața electrodului de măsură. 17

Un potențial de măsură caracteristic, constant, este critic pentru selectivitatea (pentru oxigen) și precizia măsurării. Tensiunea de măsurare este stabilizată de electrodul de refe- 19 rință, care nu este încărcat de curent. Acesta, împreună cu potențiostatul, care asigură feedback electronic, asigură un potențial de măsură constant. Suprafața electrodului de 21 măsură este conectată electrolitic la electrodul de referință printr-o diafragmă.

Eroarea, pe baza domeniului de măsurare a concentrației finale de oxigen dizolvat, 23 a fost ±3% (Anon, 1998). Analizorul de oxigen dizolvat a fost calibrat utilizând Thiedig Active Calibration, în care Digox 5 a produs o cantitate de oxigen definită pe baza legii lui Faraday 25 (0,500 mg/l) și apoi verificarea încrucișată a acesteia cu valorile măsurate în matrice. Aceasta a permis calibrarea instrumentului în condiții de presiune, temperatură și curgere corespun- 27 zând celor măsurării, într-un minut. Deoarece schimbul de molecule din senzor este un proces de difuzie, acesta este influențat de temperatură, având ca rezultat viteze de reacție mai 29 rapide și creșteri ale curentului măsurat. Prin urmare, Digox 5 este echipat de asemenea cu un senzor, care măsoară temperatura și compensează automat fluctuațiile. 31

Digox 5 are anumite avantaje față de senzorii de oxigen pe bază de membrană. Deoarece Digox nu utilizează electrolit, pierderea de sensibilitate este relativ lentă și pe 33 electrodul de măsură apar doar depozite minore. De asemenea, sensibilitatea poate fi determinată în orice moment, prin executarea unei calibrări active. Aceasta este o procedură 35 simplă de curățare a electrodului și recalibrare a instrumentului. La majoritatea senzorilor cu membrană, pe catod se depune clorură de argint, și soluția de electrolit se schimbă, având 37 ca rezultat citiri progresiv mai lente. Din acest motiv, se recomandă schimbarea membranelor și electroliților la fiecare câteva săptămâni și apoi recalibrarea, o sarcină îndelungată și inco- 39 modă. Calibrarea senzorilor pe bază de membrană este executată uzual în laborator la niveluri de saturare cu oxigen, care pot provoca erori apreciabile, în special în must și 41 matricea de bere la niveluri foarte reduse de oxigen. Temperatura va avea o influență în trei direcții asupra senzorilor de oxigen pe bază de membrană: permeabilitatea membranei se 43 va schimba, presiunea parțială a oxigenului se va schimba, și solubilitatea oxigenului în electrolit se va schimba. Compensarea temperaturii pentru acești trei factori în senzorii pe 45 bază de membrană este dificilă.

Măsurarea oxigenului dizolvat în must în timpul depozitării: S-a conectat aseptic o 47 tubulatură flexibilă de grad alimentarTygon® (1/4 țoii i.d.) la un orificiu de eșantionare poziționat aproape de partea superioară a bazelor conice a rezervoarelor de depozitare a mustului, T-1 49

107

RO 122457 Β1 și T-2 (vezi secțiunea 4.2.1). O pompă peristaltică cu viteză variabilă a furnizat un debit volumetric de 11 l/h prin blocul analizorului de oxigen dizolvat. ((Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50)). Măsurările oxigenului dizolvat în must au fost înregistrate apoi după 45 min.

Măsurarea oxigenului dizolvat în bioreactor: înainte de executarea măsurărilor de oxigen dizolvat în bioreactor, blocul analizor al Digox 5 a fost sterilizat. Admisia senzorului a fost conectată la o tubulatură de grad alimentar sterilă, Tygon® (1/4 țoii i.d.). Prin analizor s-a pompat o soluție 70% (v/v) etanol la un debit volumetric de aproximativ 10 l/h timp de 15 min. Analizorul de oxigen dizolvat a fost conectat la un robinet de apă de laborator și prin senzor s-a trecut apă fierbinte (70°C) timp de minimum 2 h. A fost utilizată această metodologie mai degrabă decât sterilizarea cu aburi deoarece materialele blocului analizor nu pot tolera temperaturi peste 70°C. După perioada de două h de sterilizare, tubulatura la admisia și evacuarea unității a fost strânsă pentru a păstra sterilitatea în analizor. într-o hotă de curgere laminară, tubulatura proaspăt sterilizată a fost conectată la admisia și evacuarea analizorului. Capetele libere ale tubulaturii au fost prinse apoi aseptic de orificiile din oțel inoxidabil 1/4 I.D. de pe placa superioară a bioreactorului și s-au executat măsurătorile. Atunci când orificiile de pe bioreactor nu au fost utilizate, acestea au fost etanșate utilizând o bucată de lungime mică de tubulatură sterilizată de grad alimentar Tygon®.

Oxigenul dizolvat a fost măsurat direct în bioreactorul cu injecție de gaze prin extragerea de lichid din fermentație printr-un orificiu situat pe placa superioară a bioreactorului. Lichidul de fermentație a ieșit din bioreactor printr-un filtru din oțel inoxidabil (vezi secțiunea 4.1.2) conectat la o țeavă din oțel inoxidabil de 1/4 țoii care a penetrat placa superioară a bioreactorului. Lichidul a curs apoi prin tubulatura flexibilă de grad alimentar Tygon® (1/4 țoii id.) care a fost conectată la o pompă peristaltică cu viteză variabilă (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P-07523-50), asigurând un debit volumetric de 11 l/oră prin blocul analizorului de oxigen dizolvat. Lichidul de fermentație a fost apoi recirculat printrun al doilea orificiu din oțel inoxidabil de L’ țoii care a penetrat placa superioară a bioreactorului. S-a utilizat tubulatură de grad alimentar Tygon® (Cole-Parmer, 1999) pentru a conecta senzorul la bioreactor, din cauza permeabilității sale reduse la oxigen specificată de furnizor, de 30 cm³mm/(s · cm² · cmHg)x1O'¹⁰. Măsurătoarea a fost efectuată după 4-5 min de circulație.

4.11 Analize chimice

Calibrările au fost efectuate utilizând reactivii adecvați standard. Toți reactivii utilizați pentru analize au avut puritate > 99%. Unde a fost necesar, s-a realizat purificare ulterioară prin distilare.

4.11.1 Etanol

Concentrația de etanol a fost determinată utilizând metoda cromatografului cu gaz (GC), etalon intern al Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Eșantioanele degazeificate au fost tratate direct cu etalon intern izopropanol, 5% (v/v) și injectate într-un cromatograf cu gaz Perkin Elmer 8500 echipat cu detector de ionizare a flăcării (FID) și un autoeșantionator Dynatech. S-a utilizat o coloană Chromosorb 102, de 80-100 mesh cu heliu drept gaz purtător. Condiții cromatografice: debit de 20 ml/min, temperatura injectorului de 175’C, temperatura detectorului de 250°C, și temperatura coloanei de 185°C.

4.11.2 Sumarul de carbohidrați

Concentrațiile de glucoză, fructoză, maltoză, DP3 (maltotrioză), DP4 (maltotetroză), poli-1 (vârf 1 polizaharidă) și glicerol din eșantioanele de fermentație au fost cuantificate utilizând un cromatograf lichid de înaltă performanță Spectra-Physics (SP8100XR) (HPLC)

108

RO 122457 Β1 echipat cu o coloană cu schimb de cationi (Bio-Rad Aminex, HPX-87K) și un detector de 1 index de refracție (Spectra-Physics, SP6040XR). Faza mobilă a fost fosfat de potasiu, dibazic,

0,01 M, și sistemul a fost echipat cu un autoeșantionator Spectra-Physics (SP8110). 3

Instrumentul a fost exploatat cu o presiune inversă de 800 psi. Debitul de eșantion și eiuant prin coloană a fost 0,6 ml/min, cu o temperatură a coloanei de 85°C și o temperatură a 5 detectorului de 40°C. Volumul de injectare a fost 10 pl.

4.11.3 Greutatea specifică 7

Greutatea specifică a mustului și mediului de fermentație este descrisă în acest studiu în termenii extractului real (grade Plato, °P), care este unitatea acceptată utilizată în industria 9 de fabricare a berii.

Eșantioanele de fermentație au fost filtrate așa cum s-a descris în secțiunea 4.8 și 11 amestecate înainte de analiza cu un densimetru digital (densitometru Anton Paar DMA-58) pentru a măsura greutatea specifică a mustului (grade Plato). Eșantioanele de fermentație 13 au fost introduse într-un tub U de sticlă, care a oscilat electronic pentru a determina greutatea specifică, furnizând astfel indirect gradele Plato. 15

Gradele Plato se referă la valoarea numerică a unui procent (greut./vol) de soluție de zaharoză în apă la 20°C a cărei greutate specifică este aceeași ca a mustului în chestiune. 17 Deoarece scara gradelor Plato și tabelele rezultate care leagă greutatea specifică a soluției de concentrațiile de substanță dizolvată se bazează pe soluția apoasă de zaharoză, aceasta 19 este doar o aproximare a cantității de extract. Extractul este un termen care se referă la masa solubilă totală disponibilă dintr-un material de fabricare a berii “ca atare”, și/sau potențial prin 21 prelucrare (Hardwick, 1995) cum arfi carbohidrați, proteine, tanini. Extractul este încă exprimat în mod curent în procedeul de fabricare a berii ca greutatea specifică în grade Plato, din 23 cauza lipsei unei referințe mai adecvate, legată mai bine de variabilitate, din compozițiile de musturi de diferite origini. 25

4.11.4 Diacetilul total

Diacetilul total (2,3-butandiona) din bere și eșantioanele de fermentație au fost măsu- 27 rate utilizând o tehnică de eșantionare a analitului headspace din partea superioară, urmată de separare GC capilară (Hewlett-Packard 5890) și detecție cu captură de electroni (ECD) 29 pe baza metodei Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Metoda se referă la “diacetil total” deoarece metoda măsoară 31 cantitatea de diacetil și precursorul acestuia, alfa-acetolactatul. Gazul purtător a fost 5% metan în argon la 1,0 ml/min și s-a utilizat o coloană J & W DB-Wax. Raportul de divizare 33 a fost 2 : 1 și gazul auxiliar a fost heliu la 60 ml/min. Temperatura injectorului a fost 105°C și temperatura detectorului a fost 120°C. 35

Sistemul a fost echipat cu un autoeșantionator superior Hewlett Packard 7694E și s-a utilizat 2,3-hexandionă ca etalon intern. Timpul ciclului de eșantionare a fost 40 min., cu un 37 timp de echilibrare al flaconului de 30 min. la 65’C, un timp de presurizare de 2 min. la 4,8 psig, un timp de umplere a buclei de 0,2 min, un timp de echilibrare al buclei de 0,1 min., 39 și un timp de injectare de 0,27 min. Presiunea purtătorului a fost 18,8 psig, temperatura conductei de transfer a fost 95°C și temperatura buclei a fost 65°C. 41

4. 11.5 Volatilele din bere

Volatilele din bere incluzând acetaldehidă, acetat de etil, izobutanol, 1-propanol, acetat 43 de izoamil, alcool izoamilic, hexanoat de etil, și octanoat de etil au fost măsurate utilizând o metodă pentru partea superioară GC (Hewlett Packard 5890) cu etalon intern (n-butanol) și 45 un detector de ionizare a flăcării (FID). Gazul purtător a fost heliu la 6,0 ml/min și GC a fost echipat cu un autoeșantionator Hewlett Packard 7694. Temperatura injectorului GC a fost 47 200°C iar temperatura detectorului a fost 220°C. Profilul de temperatură al cuptorului: 40°C

109

RO 122457 Β1 (5 min.), 40-200’C (10’C/min.), 200-220’C (50’C/min.), 220’C (5 min.). Gazele FID au inclus purtătorul la 6,0 ml/min., alimentare de adaos cu heliu la 30 ml/min. și 28 psig, H₂ la 50 ml/min. și 25 psig, și aer la 300 ml/min și 35 psig. Diafragma a fost purjată la un debit de 0,8 ml/min. Presiunea superioară a fost 4,0 psig. Atunci când autoeșantionatorul a fost conectat prin intermediul unui ac la orificiul de eșantionare, presiunea flaconului a fost 15,9 psig, presiunea purtătorului a fost 7,1 psig, presiunea capului de coloană a fost 4 psig, debitul de divizare a fost 18 ml/min. și debitul coloanei a fost 6 ml/min. Temperaturile pe zone: flacon la 70°C, bucla la 80°C, conducta de transfer la 150’C.

Timpul ciclului GC a fost 40 min., cu un timp al echilibrării flaconului de 35 min., un timp de presurizare de 0,25 min., un timp de umplere a buclei de 0,1 min., un timp de echilibrare a buclei de 0,1 min., un timp de injectare de 3 min. și un volum al buclei de eșantionare de 1 ml.

4.11.6 Azotul amino liber (FAN)

A fost utilizată metoda internațională a azotului amino liber a Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992) pentru determinarea concentrației de azot amino liber dintr-un eșantion de fermentație, utilizând un spectrofotometru Perkin Elmer LS50B. Această metodă spectrofotometrică afișază o reacție de culoare între ninhidrină și azotul prezent în eșantion. Mărimea absorbanței este legată direct de cantitatea de azot amino liber prezentă.

a) Reactivul de culoare:

19,83 g fosfat acid disodic (Na₂HPO₄)

30,00 fosfat acid de potasiu (KH₂PO₄)

2,78 g ninhidrină monohidrat

1,50 g fructoză

b) Reactiv de diluție;

2,00 g iodat de potasiu (KIO₃)

596 ml apă distilată, deionizată

404 ml 95% (v/v) etanol

Depozitat în refrigerator și utilizat la temperatura camerei.

c) Soluția mamă de glicină: 0,1072 g/100 ml apă distilată deionizată

d) Soluția etalon de glicină: Soluția mamă a fost diluată 1:100 (v/v) cu apă distilată deionizată. Acest etalon conține 2 mg/l FAN.

Eșantioanele au fost diluate la un raport de 100:1 cu apă distilată și 2 ml din eșantionul distilat au fost introduși în fiecare dintre cele trei eprubete. Proba de control a fost preparată prin introducerea a 2 ml de apă distilată deionizată în fiecare dintre cele trei eprubete. Au fost preparate de asemenea trei eprubete conținând fiecare 2 ml de soluție etalon de glicină.

Pentru toate eșantioanele, s-a adăugat 1 ml de reactiv de culoare și apoi au fost plasate într-o baie cu apă la 100°C timp de exact 16 min. Eprubetele au fost apoi răcite într-o baie de apă la 20°C timp de 20 min. S-a adăugat apoi la fiecare dintre eprubete cinci ml de reactiv de diluție și s-a amestecat cu minuțiozitate. Eșantioanele au fost apoi lăsate să se liniștească timp de 10-15 min. Apoi s-a măsurat absorbanța la 570 nm utilizând un spectrofotometru și s-a calculat cantitatea de FAN dintr-un eșantion utilizând ecuația 4.3.

FAN (mg/l)=(A_p-A_B-A_F)2d/A_s (4.3) unde FAN este cantitatea de azot amino liber din eșantion în mg/l, A_p este media absorbanțelor soluțiilor de test, A_B este media absorbanțelor pentru probele de control, A_F este media absorbanțelor pentru corecția musturilor și berilor închise la culoare, 2 cantitatea de FAN din soluția etalon de glicină, d este factorul de diluție al eșantionului, și A_s este media absorbanțelor pentru soluția etalon de glicină.

110

RO 122457 Β1

CAPITOLUL 5. FERMENTAȚIA CONTINUĂ UTILIZÂND UN SISTEM CU BIOREAC- 1

TOR CU INJECȚIE DE GAZE 1

Pentru fermentația continuă a berii a fost ales un sistem cu bioreactor cu țeavă de 3 aspirație pentru injecție de gaze din cauza excelentului transfer de masă publicat (lichid-solid) și caracteristicilor de amestecare. Transferul de masă lichid-solid este important în special 5 deoarece acesta implică transferul de elemente nutritive din faza lichidă către biocatalizatorul solid de celule imobilizate, asigurând substraturi pentru drojdia încapsulată. Aceste bioreac- 7 toare asigură de asemenea o bună aerare, consum redus de energie, și sunt simplu de construit. Acestea au făcut ca sistemele cu bioreactoare cu injecție de gaze să fie foarte 9 atractive pentru exploatări la scară mare, cum ar fi cele utilizate comercial pentru tratarea apelor reziduale (Driessen și colab., 1997; Heijnen, 1993). 11

5.1 Descrierea bioreactorului cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze

Această secțiune oferă o descriere detaliată a bioreactorului cu injecție de gaze utilizat 13 în această lucrare.

5.1.1 Corpul bioreactorului 15

Bioreactorul de 131 (81 volum de lucru) cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze proiectat pentru această lucrare a fost un pat fluidizat trifazic (lichid/solid/gaz) unde celulele 17 imobilizate au fost menținute în suspensie prin circulație internă de lichid acționată cu gaz dioxid de carbon (Heijnen, 1996) așa cum este arătat în fig. 16.0 fotografie a vasului bioreac- 19 torului este dată în fig. 17 și un desen detaliat cu dimensiuni detaliate este dat în fig. 18. Dioxidul de carbon și aerul curg în conul inferior al bioreactorului printr-un pulverizator din 21 oțel inoxidabil sinterizat (duză de purjare CO₂, piesa #9222, Hagedorn & Gannon, USA), cu lungime de 0,11 m și 0,013 m diametru exterior. S-a utilizat dioxid de carbon drept gaz de 23 fluidizare iar aerul a fost utilizat pentru a furniza oxigen celulelor de drojdie.

O țeavă de aspirație, localizată concentric în interiorul bioreactorului sub formă de 25 coloană, a funcționat ca porțiune ascendentă în acest sistem cu pat fluidizat în timp ce partea inelară exterioară a servit drept porțiune descendentă. Țeava de aspirație interioară a fost 27 suspendată dintr-un separator de particule cilindric, așezat pe trei umeri din oțel inoxidabil în regiunea dilatată superioară a bioreactorului. Menținerea țevii de aspirație și a fitingurilor 29 separatorului de particule în interiorul bioreactorului, a minimizat riscul de contaminare microbiană din mediul exterior. 31

Inițial, bioreactorul a avut o sită cu ochiuri pentru separarea celulelor imobilizate din lichidul de la evacuare. Cu toate acestea, sita a fost predispusă la colmatare, astfel încât a 33 fost utilizat un cilindru din oțel inoxidabil pentru a separa sferele de celule imobilizate de faza lichidă pe măsură ce acestea se deplasau peste partea superioară a țevii de aspirație și 35 curgeau în jos pe partea inelară. Particulele lovesc cilindrul și cad înapoi în faza lichidă în vrac mai degrabă decât să părăsească bioreactorul ca deversare. Astfel, a existat o mică 37 regiune aproape de evacuarea bioreactorului care a fost lipsită de particule cu celule imobilizate. Regiunea superioară dilatată a bioreactorului a crescut de asemenea aria 39 suprafeței pentru eliminarea bulelor de gaz.

5.1.2 Placa superioară a bioreactorului 41 în fig. 19 este dată o schemă a plăcii superioare a bioreactorului. Orificiile plăcii superioare au fost menținute la minimum pentru a reduce riscul de contaminare. Orificiile au 43 fost fie sudate direct pe placa superioară fie s-au utilizat fitinguri de compresie (Swagelok®).

Placa superioară a încorporat un orificiu de inoculare, o teacă de termocuplu, un termometru, 45 o diafragmă pentru eșantionarea de gaze și orificii pentru extragerea de lichid și de retur pentru măsurarea oxigenului dizolvat. în teaca de termocuplu s-a introdus un senzor de 47 temperatură, care a asigurat feedback sistemului de control al temperaturii. Controlerul de

111

RO 122457 Β1 temperatură a asigurat feedback unei supape cu bobină, care a deschis și închis alimentarea cu glicol a mantalei termice a bioreactorului. Temperatura a fost monitorizată utilizând un termometru (termometru cu termocuplu, etanș la apă Cole-Parmer, #90610-20) și o sondă tip T, care a fost sudată în placa superioară a bioreactorului. Oxigenul dizolvat a fost măsurat utilizând un analizor de oxigen dizolvat (Dr. Thiedig, Digox 5), care a necesitat un debit de

9-11 l/oră de bulion lichid prin blocul analizorului pentru citiri precise ale oxigenului. Lichidul a fost extras din bioreactor pentru măsurarea oxigenului printr-o țeava de 1 /4 i.d. care a trecut prin placa superioară în lichidul de fermentație. Așa cum este arătat în Fig. 20, vârful țevii a fost prevăzut cu un filtru pentru a elimina particulele mai mari din lichid, pe măsură ce acesta a fost pompat prin analizorul de oxigen dizolvat. Lichidul a fost întors apoi în bioreactor prin alt orificiu de 1/4 din placa superioară.

5.1.3 Supape sanitare pentru prelevarea aseptică de eșantioane

Bioreactorul a fost echipat cu supapă de eșantionare cu membrană (Scandi-Brew®) sudată în peretele bioreactorului. Supapa a fost proiectată pentru eșantionare în condiții aseptice. Membrana a etanșat direct împotriva lichidului de fermentație, permițând ca supapa să fie complet sterilizabilă cu aburi și alcool prin două orificii de evacuare (fig. 18). Un mic rezervor extern de etanol a înconjurat membrana pentru a menține sterilitatea între eșantionări. Această supapă a fost utilizată pentru toate eșantionările bioreactorului și s-a presupus că compoziția lichidului la momentul eșantionării nu a fost semnificativ diferită de compoziția lichidului care a ieșit prin orificiul de evacuare al bioreactorului. Așa cum s-a menționat în capitolul Materiale și Metode al acestei lucrări, bioreactorul a fost eșantionat dintr-o supapă localizată pe peretele exterior al bioreactorului. Pentru a valida presupunerea că compoziția lichidului care iese prin orificiul de evacuare al bioreactorului a fost aceeași cu ce a lichidului eșantionat din corpul bioreactorului, au fost efectuate studii ale timpilor de amestecare. S-a utilizat o metodă a urmării impulsului pentru a determina timpul de amestecare în bioreactorul cu injecție de gaze (Chistie, 1989). S-a injectat rapid un volum de 1 ml de HC1 10 N în partea inelară a bioreactorului și schimbarea de pH a fost înregistrată în timp, cu timpul, t=0 secunde la momentul injectării. pH-ul a fost readus la valoarea lui inițială prin injectarea de NaOH 10 N. Electrodul de pH (Cole-Parmer, cat. #P-05990-90) a avut 277 mm lungime și 3,5 mm în diametru. Pentru a monitoriza pH-ul s-a utilizat un transmițător de pH de procedeu Ingold Model 2300. S-a efectuat o calibrare în două puncte a pH-ului cu tampoane etalon certificate, tampon verde Beckman pH 7,0, Part#566002 și tampon roșu Beckman pH 4,0, Part#566000. Datele au fost înregistrate la o frecvență de 3750 Hz timp de 300 secunde utilizând un program proiectat de Cheryl Hudson și John Beltrano în 1994, și modificat de Norm Mensour în 1999 (University of Western Ontario, London, Ontario).

Datele pH-ului au fost apoi netezite utilizând algoritmul Savitsky-Golay din TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Guelph, Ontario). Algoritmul Savitzky-Golay este o metodă de netezire pe domeniu de timp bazată pe fitarea cu cele mai mici polinoame de gradul patru pe o fereastră în mișcare a datelor pH (Anon, 1996). Datele netezite au fost apoi normalizate și s-a generat un grafic al ΔρΗ față de timp. Timpul de amestecare a fost luat la cel mai apropiat minut, unde pH-ul atinsese ~95% din valoarea de echilibru. Timpul de amestecare a fost măsurat utilizând trei debite volumetrice diferite de dioxid de carbon: 283 cm³/min., 472 cm³/min. (debitul volumetric utilizat pe parcursul acestei lucrări), și 661 cm³/min. în toate trei cazurile, pH-ul din bioreactor s-a echilibrat în mai puțin de 2 min (întrerupere -95%), așa cum se vede în Anexa 1. S-a considerat că timpul de amestecare a fost suficient de scurt pentru a valida presupunerea inițială a inventatorilor că bioreactorul a fost bine amestecat. Aceasta a permis inventatorilor să presupună că compoziția lichidului eșantionat din peretele bioreactorului nu a fost diferită semnificativ de cea a

112

RO 122457 Β1 lichidului care a curs din orificiul de evacuare, cu un timp de rezidență mediu de 24h în 1 bioreactor. Din figurile anexate, s-a văzut o recirculare clară de lichid suprapusă peste amestecare prin dispersie, ceea ce este tipic pentru bioreactoarele cu injecție de gaze 3 (Chisti, 1989).

5.2 Schema procesului tehnologic a sistemului de fermentație continuă a berii 5

O schemă a procesului tehnologic pentru sistemul de fermentație continuă a berii, care a fost găzduit în instalația pilot de micro producție a berii a Labatt Brewing Company Limited 7 din London, Ontario, este dată în fig. 21 cu o descriere detaliată a elementelor componente în Tabelul 5.1. în rezumat, mustul pentru producerea berii a fost colectat din London Labatt 9 Plant, sterilizat utilizând un pasteurizator cu detentă (schimbător de căldură Fisher Plate, cu curgere combinată tip Eurocal 5FH), și depozitat în rezervoare colectoare mari (T-1 și T-2). 11 în timpul fermentației continue mustul a fost transferat cu un debit controlat în bioreactorul cu injecție de gaze (BR-1) conținând celule de drojdie imobilizate. Lichidul fermentat a părăsit 13 bioreactorul ca deversare și a fost colectat într-un vas de recepție (T-3). în următoarele secțiuni, se detaliază sistemul de fermentație continuă a berii dat în fig. 21. 15

5.2.1 Colectarea și depozitarea mustului

Mustul neoxigenat din fermentația continuă a fost colectat din fabrica Labatt London 17 prin țevi într-un rezervor de depozitare cilindroconic de 16001, pre-purjat cu dioxid de carbon pentru a minimiza preluarea de oxigen de către must. Toate rezervoarele de această scară, 19 inclusiv rezervoarele colectoare de must, T-1 și T-2, au fost curățate și sterilizate conform Labatt Best Practices înainte de utilizare. Mustul a fost apoi pasteurizat cu detentă și trans- 21 ferat la 2°C în rezervorul colector de must disponibil, T-1 sau T-2 (de asemenea pre-purjat cu dioxid de carbon). Mustul a fost păstrat în aceste rezervoare la 2°C timp de până la 2 23 săptămâni, alimentând cu lichid bioreactorul de fermentație continuă, BR-1. La sfârșitul perioadei de două săptămâni, alimentarea bioreactorului a fost schimbată astfel încât mustul 25 a fost furnizat din al doilea rezervor de must, care conținea must proaspăt. Au fost utilizate două rezervoare de depozitare a mustului identice, T-1 și T-2, pentru a minimiza timpul de 27 întrerupere în timpul schimbării către must proaspăt. în toate cazurile, mustul a fost testat pentru contaminare cu minimum două zile înainte da fi introdus în bioreactor (BR-1). Dacă mustul 29 a fost contaminat, acesta a fost eliminat și s-a colectat și pasteurizat imediat must proaspăt.

Minimizarea concentrației de oxigen dizolvat în must în timpul depozitării 31

Scopul a fost depozitarea mustului cu oxigen minim, la un nivel constant, și la o temperatură redusă, fără înghețarea mustului. Aceasta a fost necesar pentru a preveni reacții 33 de arome stătute nedorite în must din reacțiile chimice cu oxigen (Narzifp și colab., 1993), pentru a asigura o alimentare consistentă cu must în bioreactor, și pentru a minimiza riscul 35 contaminării mustului cu microbi în timpul depozitării. Vasele cilindroconice mari de 1.600 I (net) (T-1 și T-2) utilizate pentru depozitarea mustului pentru fermentațiile continue, au fost 37 proiectate inițial ca linuri de fermentare în șarje, nu ca rezervoare de depozitare a mustului.

Din cauza aceasta, răcirea pentru aceste rezervoare nu a fost adecvată pentru menținerea 39 mustului la 2°C. După trei zile de păstrare a mustului, temperatura a variat cu până la 15°C între o regiune și alta a rezervorului (Tabelul 5.2). 41

Aceste regiuni calde din rezervoare au mărit riscul creșterii microbiene. Astfel, a fost necesară o anumită agitare în aceste rezervoare pentru a asigura o temperatură uniformă 43 redusă peste tot.

Din aceste motive, s-a instalat un barbotor cu țeava în conul de bază al fiecărui rezervor 45 de depozitare a mustului (T-1 și T-2). S-au efectuat experimente pentru determinarea celui mai bun protocol pentru umplerea rezervorului cu must și menținerea de niveluri reduse con- 47 stante de oxigen dizolvat. în primul experiment, rezervorul de depozitare a fost umplut cu must

113

RO 122457 Β1 care a trebuit să fie colectat fără oxigenare și pasteurizat cu detentă. Odată ce rezervorul de depozitare a fost umplut cu 1.6001 de must, s-au barbotat 0,113 m³/oră de dioxid de carbon în baza rezervorului. în timpul celui de-al doilea experiment, mustul a fost colectat din nou fără oxigenare și pasteurizat cu detentă. De această dată, rezervorul de depozitare a fost purjat cu dioxid de carbon (0,85 m³/oră) timp de 3hînainte de umplere și s-a barbotat continuu o mică cantitate de dioxid de carbon (0,113 m³/oră) în vasul de depozitare pe măsură ce mustul a fost transferat în rezervor. Acest flux redus de dioxid de carbon a fost barbotat continuu prin mustul depozitat în rezervor în timp ce acesta a furnizat must fermentației continue. Pentru ambele experimente, a fost monitorizată regulat concentrația de oxigen timp de o săptămână de depozitare.

în fig. 5.7, este dată concentrația de oxigen dizolvat față de timpul de depozitare al mustului. Atunci când rezervorul colector nu a fost pre-purjat cu dioxid de carbon, aerul din spațiul superior al rezervorului a permis o anumită preluare de oxigen de către must. Astfel, fără pre-purjarea rezervorului a fost necesară de o perioadă de timp semnificativ mai mare pentru ca concentrația de oxigen dizolvat din must să atingă un nivel minim și constant. Atunci când rezervorul a fost pre-purjat, concentrația oxigenului dizolvat în must a rămas la un nivel redus constant pe parcursul perioadei de depozitare. Astfel, pre-purjarea rezervoarelor de depozitare a mustului (T-1 și T-2), și continuarea furnizării unui flux redus de dioxid de carbon prin must în timpul depozitării pentru a menține o ușoară presiune pozitivă în rezervoare, a fost adoptată ca parte a procedurii de depozitare a mustului pentru toate fermentațiile continue.

Profilul de temperatură din vasele de depozitare a fost de asemenea comparat cu și fără barbotarea de 0,113 m³/oră de dioxid de carbon. Aceasta s-a efectuat cu apă mai degrabă decât cu must utilizând o sondă de temperatură tip T conectată la un termometru (termometru cu termocuplu, etanș la apă Cole-Parmer, cat #90610-20). S-a colectat apă urbană (1.600 I) într-un rezervor de depozitare a mustului și s-a echilibrat timp de trei zile și s-a înregistrat temperatura apei în diferite regiuni ale rezervorului de depozitare. Apa din rezervor a fost apoi barbotată timp de 24 h cu 0,113 m³/oră dioxid de carbon și temperatura a fost înregistrată din nou. în fiecare caz s-a înregistrat temperatura ambiantă iar valoarea de referință a temperaturii din rezervorul de depozitare a fost 2,0°C. Așa cum se vede din Tabelul 5.2., cu barbotare de dioxid de carbon, temperatura din rezervoarele de depozitare a fost mai uniformă, cu temperaturi variind între 0,1 și 4,1°C în regiunile măsurate, și conținutul rezervoarelor nu a înghețat. Această temperatură mai redusă a ajutat la prevenirea creșterii nedorite de microbi în must pe timpul depozitării.

Gazul a fost eliberat din rezervoarele de depozitare a mustului printr-un filtru steril de gaze situat în partea superioară a rezervorului. Mustul a fost transferat apoi utilizând o pompă peristaltică cu viteză variabilă (P-1) (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat #P-07523-50), în admisia bioreactorului de 81 (BR-1) utilizând tubulatură flexibilă de grad alimentar Norprene® L/S 16.

5.2.2 Fermentația continuă utilizând sistemul cu bioreactor cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze

Mustul a fost introdus în apropierea conului inferior al bioreactorului, BR-1, printr-un orificiu 1/4. Un amestec de aer sterilizat prin filtru (unitate de filtrare Millipore, Millex®-FG₅₀, 0,2 pm), și dioxid de carbon (puritate 99,99%) a curs în bioreactor prin pulverizatorul din oțel inoxidabil sinterizat. S-a utilizat un rotametru (R-3) pentru a controla debitul dioxidului de carbon la STP, și s-a utilizat un controlor de flux de masă precalibrat (M-1) pentru a controla debitul aerului la STP. Lichidul fermentat a părăsit bioreactorul ca deversare și a curs prin tubulatură 1 I.D. din PVC armat într-un vas de colectare din otel inoxidabil de 301 (T-3) care a fost răcit cu o serpentină externă cu glicol și menținut la o temperatură de 4°C.

114

RO 122457 Β1

5.2.3 Colectarea produsului 1

Vasul de colectare a produsului (T-3) a avut un orificiu de admisie mare (1I.D.) care a fost proiectat astfel încât lichidul fermentat să curgă în jos pe peretele vasului de colectare 3 pentru a minimiza spumarea. Acest vas a avut de asemenea un filtru steril de gaze (unitate de filtrare Millipore, Millex®-FG₅₀, 0,2 pm), pentru eliberarea gazului din bioreactor (BR-1) 5 și vasul de colectare (T-3). Vasul de colectare a fost golit periodic utilizând o supapă 1/4 (V-12) situată la 2 deasupra bazei rezervorului. 7

5.2.4 Bucla de răcire cu glicol

Glicolul a fost transferat de la London Brewery către Microbrewery Pilot Plant la o 9 temperatură de -23°C și o presiune de 45 psig, și circulat prin mantale de răcire pentru rezervoarele colectoare de must (T-1 și T-2), bioreactorul cu injecție de gaze (BR-1), și vasul 11 de colectare a produsului (T-3). Cele două rezervoare colectoare de must și bioreactorul au fost echipate cu sonde de temperatură pentru faza lichidă care au asigurat feedback contro- 13 loarelor de temperatură, care la rândul lor au controlat fluxul de glicol rece către mantalele vaselor. Rezervoarele colectoare de must au depozitat mustul la 2’C, în timp ce temperatura 15 din bioreactor a fost controlată la valori de 12°C până la 22°C, depinzând de experimentul specific. Vasul de colectare a produsului nu a avut control automat al temperaturii, dar mai 17 degrabă, s-a controlat manual fluxul de glicol pentru a menține vasul la aproximativ 4’C. Nu a fost necesar să se controleze precis temperatura vasului de colectare a produsului (T-3), 19 deoarece lichidul din acest vas a fost eliminat pur și simplu și nu a fost analizat sau prelucrat suplimentar. 21

S-a utilizat de asemenea glicol pentru a căptuși și răci țevile de transfer de must din rezervoarele de must (T-1 și T-2) către bioreactorul (BR-1). Odată ce glicolul a circulat printr-o 23 anumită manta, a fost returnat într-o conductă principală din Pilot Plant Microbrewery și apoi a fost returnat la London Plant, în general la o temperatură de -15°C și o presiune de 40 psig. 25

5.3 Protocolul de sterilizare a bioreactorului

Bioreactorul (BR-1) a fost umplut cu o soluție 2% (v/v) de Diversol® CX/A (DiverseyLever, 27

Canada), un detergent de salubrizare, și înmuiat peste noapte cu barbotare de gaz. Reactorul a fost apoi scurs și clătit cu apă rece. Acest ciclu de soluție de curățare și clătire cu apă a 29 fost repetat de două ori. Pentru a pregăti bioreactorul pentru sterilizarea cu aburi, s-au deconectat țevile de must și gaze. Țeava de aburi a fost conectată la admisia bioreactorului și s-au deschis 31 următoarele supape: supapa de admisie și de purjare a bioreactorului (V-7, V-6), admisia gazelor (V-17), supapele de evacuare ale produsului (V-9, V-11), supapele de eșantionare cu membrană 33 (V-8, V-10), și orificiul de scurgere al vasului de colectare (V-12). Apoi s-a deschis lent supapa instalației de aburi și s-au ajustat supapele bioreactorului astfel încât la ieșirea fiecărui orificiu 35 extern s-a observat o șuviță de aburi. După 60 min de expunere la aburi, s-au închis toate supapele exterioare ale bioreactorului (V-17, V-8, V-10, V-12) în afară de supapa de bypass 37 a mustului (V-6). Atunci când a fost închisă supapa de aburi, s-a închis supapa de bypass a mustului și s-a conectat un filtru steril la vasul de colectare pentru a preveni contaminarea 39 cu aer nesterilizat care intră în sistem pe măsură ce acesta se răcește. Conducta de gaze a bioreactorului a fost de asemenea reconectată la V-17 pe măsură ce a fost închisă conducta 41 instalației de aburi pentru a menține o presiune pozitivă în timpul răcirii sistemului.

5.4 Demararea sistemului de fermentație 43

Mustul de producere a berii a fost colectat din instalație într-un vas de presiune de

201 din oțel inoxidabil și încălzit într-o autoclavă timp de 45 min la 100°C. Celulele imobilizate 45

115

RO 122457 Β1 au fost transferate aseptic în mustul răcit (40% v/v). Vasul închis ermetic a fost transportat la Microbrewery Pilot Plant unde a fost găzduit sistemul cu bioreactor. Vasul de 20 I a fost conectat la un fiting cu conectare rapidă (Cornelius Anoka, Minnesota, USA), care fost prins de tubulatură de 3/8 din PVC armat (Cole-Parmer, USA). Celălalt capăt al tubulaturii din PVC a fost prins la supapa de eșantionare cu membrană (V-8) din peretele bioreactorului. S-a aplicat dioxid de carbon sterilizat prin filtru ca o presiune de 10 psig vasului de 20 I și s-a deschis orificiul de eșantionare cu membrană astfel încât amestecul de celule imobilizate a fost transferat din vas în bioreactor, fără expunerea inoculatului la mediul înconjurător din aer. Componentele interne ale fitingurilor “cu conectare rapidă” ale vasului de 201 au fost eliminate pentru a preveni colmatarea cu celule imobilizate la transferul în bioreactor. Distribuția cumulativă granulometrică a particulelor (dimensiune mai mică decât cea nominală) pentru sferele de gel din kappa-caragenină este arătată în fig. 5.8. Diametrul aritmetic mediu al particulelor, D_pam, a fost calculat să fie 1,252 mm și diametrul mediu Sauter al particulelor, D_psm, a fost 1,17 mm. Diametrul median al particulelor a fost 1,255 mm. Datele experimentale și calculele diametrului mediu al particulelor sunt date în Anexa 1.

După inocularea cu celule imobilizate, bioreactorul a fost exploatat în modul în șarje până când concentrațiile de zaharuri și diacetil au atins ținte cu mai puțin de 3° Plato în termeni de greutate specifică și mai puțin de 100 pg/l diacetil. Sistemul a fost apoi pregătit pentru exploatarea continuă. Pentru clătirea cu apă fierbinte și sterilizarea cu aburi a conductei de transfer al mustului, s-au deschis supapele V-2 (sau V-4 pentru T-2), V-5, și V-6, în timp ce V-1 (sau V-3 pentru T-2) și V-7 au fost închise, izolând conducta de must. Conducta de transfer a mustului a fost clătită cu apă fierbinte la aproximativ 80°C, care a fost furnizată prin V-2 (sau V-4 pentru T-2). După ciclul de clătire cu apă fierbinte, s-a conectat conducta instalației de aburi în aceeași poziție și s-a sterilizat conducta de transfer a mustului timp de minimum 30 min. în același timp cu închiderea conductei de aburi, a fost închisă de asemenea supapa de bypass (V-6). Odată ce sistemul s-a răcit, s-a închis V-2 (sau V-4 pentru T-2) și conducta de aburi a fost deconectată. Supapa rezervorului de must, V-1 (sau V-3 pentru T-2), și supapa de bypass (V-6) au fost deschise și s-a pornit pompa de transfer al mustului (P-1) Mustul a fost trimis la scurgerea de canalizare prin supapa de bypass (V-6) până când condensatul din conductă a fost înlocuit cu must proaspăt rece. în acest moment a fost închisă supapa de bypass și s-a deschis supapa de admisie a bioreactorului (V-6) de pe reactor, începând procesul de fermentație continuă.

La fiecare două săptămâni, mustul furnizat a fost alternat între rezervoarele de depozitare (T-1 și T-2). După două săptămâni de alimentare cu must din T-1, s-a oprit pompa de alimentare continuă, P-1 și s-a închis supapa (V-5) la admisia bioreactorului. Conducta de transfer al mustului a fost conectată apoi la al doilea rezervor de depozitare (T-2) și conducta a fost spălată și sterilizată așa cum s-a descris în paragraful anterior. Fermentația continuă a continuat apoi după doar o perioadă scurtă de întrerupere de mai puțin de o oră.

116 co in co in σ>

CM co

CM «o ^3

Φ

-Q ί

co uo .05 *£:

<5 ’-S >CD co .o .o o

c

-c

Φ

DQ

IO

CM

CM o

QÎ o

CO

CD o

g

Q.

co ε

-c £

§

Q.

•Kl c

c o

§ o

o

O

-g c

Φ ε

-9?

CO

3S .o •o co g

.05 o

co ω

Q

117

118 co σ>

CN co

CN

RO 122457 Β1

Simboluri utilizate în fig. 21:

X

Conector flexibil și joncțiune

Filtru de gaze

Regulator de presiune Pompă

Supapă

Fig. 5.7. Concentrația de oxigen dizoivatîn must față de timpul de menținere din 37 vasul de depozitare a mustului (T-1 sau T-2) în diferite condiții de încărcare a rezervorului. 39

119

RO 122457 Β1

Tabelul 5.2

Profilul temperaturii în vasul de depozitare a mustului (T-1 sau T-2) după echilibrarea timp de trei zile fără barbotaj de dioxid de carbon și după 24h de barbotaj de dioxid de carbon la 0,113 cm³/h

	Temperatura (’C)
Poziția de măsurare în vasul cilindroconic	Fără barbotaj de CO2	Cu barbotaj de CO2
10 cm sub suprafața lichidului și 10 cm de la peretele vasului	20,6	0,4
10 cm sub suprafața lichidului și în centrul vasului	20,1	0,1
în partea inferioară a secțiunii cilindrice și la 10 cm de peretele vasului	3,8	3,7
în partea inferioară a secțiunii cilindrice și în centrul vasului	3,7	4,1
Mediul ambiant al instalației pilot	21,4	19,8

Fig. 5.8. Distribuția granulometrică cumulativă a sferelor de gel din kappacaragenină conținând celule de drojdie imobilizate (n=5).

CAPITOLUL 6. IMOBILIZAREA DROJDIEI DE BERE LAGER PE GEL DE KAPPACARAGENINĂ

Oamenii de știință au studiat o varietate de matrici pentru înglobarea fizică a celulelor integrale incluzând alginat de calciu (Bejar și colab., 1992; Curin și colab., 1987; Masschelein și Ramos-Jeunehomme, 1985; Nedovic și colab., 1996; Shindo și colab., 1994; White și Portno, 1978), agaroză (Hooijmans și colab., 1990; Lundberg și Kuchel, 1997), și geluri de caragenină (Norton și colab., 1995; Wang și colab., 1982). Caragenina este un material de grad alimentar și a fost favorizată pentru încapsularea celulelor datorită rezistenței sale mecanice superioare comparativ cu alte geluri (Buyijkgijngor, 1992).

în prima parte a acestui capitol, s-a monitorizat colonizarea celulelor de drojdie în sfere de gel din caragenina pe perioada a trei cicluri de fermentație în șarje repetată. A fost examinată viabilitatea celulelor imobilizate și celulelor eliberate în faza lichidă. Parametrii de

120

RO 122457 Β1 fermentație incluzând etanol, maltoză, maltotrioză, fructoză, și glucoză au fost urmați pe 1 parcursul fermentațiilor în șarje repetate și apoi comparate cu fermentații de control utilizând doar celule de drojdie liber suspendate în aceleași condiții de element nutritiv. 3

Până acum au existat puține informații publicate despre efectele fizice asupra celulelor după imobilizarea pe termen lung (Virkajărvi și Kronlof, 1998) și expunerea continuă la 5 tensiuni externe și produși de fermentație. A doua parte a acestui capitol examinează viabilitatea, distribuția populației de celule și aspectul fizic al celulelor de drojdie imobilizate 7 în sfere de gel din caragenină pe o perioadă întinsă de timp de fermentație continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Au fost examinate de asemenea, pe perioade întinse de timp, 9 procentul relativ de celule deficiente respirator din populația de celule suspendate liber și imobilizate din bioreactor. 11

Caragenina este alcătuită din unități de 3-6-anhidrogalactoză care se repetă și carageninele asortate diferă prin numărul și poziția grupărilor sulfat ester pe unitățile repetitive 13 de galactoză. O schemă a mecanismului de gelificare a carageninei poate fi văzut în fig. 22.

Când caragenina este în stare de soluție coloidală, catenele de polizaharide ale acesteia sunt 15 într-o configurație de spirală aleatoare. Când s-au format destule elice pentru a furniza legături între catene pentru o rețea continuă, are loc gelificarea. Pe măsură ce mai multe elice 17 sunt formate, sau, pe măsură ce elicele formează agregate, gelul devine mai puternic și mai rigid (Rees, 1972). 19

Cele trei tipuri comune de caragenina sunt lambda, iota, și kappa. Așa cum este ilustrat în fig. 6.2, acestea diferă în conținutul de sulfat ester și cantitatea de sulfat ester va afecta 21 solubilitatea catenei de polizaharidă. Lambda-caragenina este puternic sulfatată și îi lipsește capacitatea de a forma un gel (Marrs, 1998). lota-caragenina formează un gel slab, cu elasti- 23 citate ridicată, în prezența ionilor de calciu, și nu prezintă o sinereză semnificativă. Sinereza survine atunci când tendința gelului la formarea suplimentară de elice sau agregate este atât 25 de puternică încât rețeaua se contractă provocând “transpirația” de lichid (Rees, 1972). Kappa-caragenina este moderat sulfatată și astfel formează un gel mai puternic și mai rigid 27 gel în prezența ionilor de potasiu, și va suferi oarecare sinereză. Rezistența crescută a gelului permisă de kappa-caragenină o face de dorit pentru imobilizarea celulelor de drojdie integrale. 29

Lambda Iota Kappa

Figl. 6.2. Structurile chimice ale lambda-, iota-, și kappa-carageninelor ^f 33

O caracteristică importantă a carageninei sunt proprietățile reversibile de termogeli- 37 ficare a acesteia. Pe măsură ce soluția de caragenină este răcită, crește viscozitatea și survine gelificarea. Pe măsură ce soluția este încălzită, viscozitatea scade și caragenină revine 39 la starea de soluție coloidală. Prin controlarea compoziției soluției de gelificare, se poate modifica temperatura la care caragenină este transformată dintr-o soluție coloidală într-un 41 gel. Temperatura de gelificare a kappa-carageninei crește odată cu creșterea concentrației de clorură de potasiu din soluție. Acest fenomen a fost utilizat pentru a proiecta un procedeu 43 pentru imobilizarea celulelor, deoarece potfî evitate fluctuații severe de temperatură (Neufeld și colab., 1996). Temperatura de gelificare a carageninei poate fi controlată astfel încât este 45 suficient să fie un gel în condiții de fermentație, dar destul de puțin, astfel încât celulele de drojdie să poată fi amestecate cu caragenină în starea de soluție coloidală a acesteia fără 47 efecte dăunătoare asupra viabilității înainte de gelificarea sferelor.

121

RO 122457 Β1

Totuși, există un număr de factori, care indică nevoia de studii suplimentare asupra efectelor imobilizării în matrici de gel asupra metabolismului celular și fiziologiei drojdiei. Celulele imobilizate nu sunt supuse aceluiași micro-mediu ca celulele libere din faza lichidă, deoarece există bariere suplimentare din matricea de gel și alte celule de drojdie înglobate care trebuie surmontate, înainte ca substraturile să poată fi transportate către suprafețele lor (fig. 23). Au existat multe studii asupra vitezelor de transfer de masă în matrici de gel (Estap și colab., 1992; Hannoun și Stephanopoulos, 1986; Korgel și colab., 1992; Kurosawa și colab., 1989; Merchant și colab., 1987; Ryaas și colab., 1995; Venâncio și Tiexiera, 1997) pentru a avea o mai bună înțelegere a efectelor negative potențiale pe care limitarea elementului nutritiv la celule imobilizate o poate avea asupra performanței fermentației. Difuzivitățile efective ale moleculelor mici din gelul de caragenină sunt comparabile cu difuzivitățile acelorași molecule doar în apă, și gelul permite difuzia moleculară a moleculelor mici, cum ar fi glucoză și etanol. Cu toate acestea, într-o fermentație tipică cu celule imobilizate, elementele nutritive sunt transportate rapid la sferele de celule imobilizate în principal prin transport convectiv în plus față de difuzia moleculară (Hannoun și Stephanopoulos, 1986). Odată ce elementele nutritive intră în sfere, transportul este relativ lent, deoarece domină difuzia moleculară. Aceasta înseamnă că celulele de drojdie de la periferia sferelor de gel pot avea un avantaj nutrițional distinct față de cele din centrul sferelor.

Vârsta drojdiei imobilizate trebuie luată de asemenea în considerare. Celulele înglobate se maturează pe măsură ce fermentația continuă în cursul lunilor și fermentează într-un set definit de condiții de stare pseudo-stabilă. Cu toate acestea, în timpul fermentației în șarje, celulele de drojdie sunt expuse la un mediu care se schimbă cu timpul și celulele sunt reutilizate doar pentru un număr limitat de fermentații înainte de eliminare. Sunt necesare mai multe cercetări pentru studierea efectelor pe termen lung al fermentațiilor continue asupra vitalității celulelor de drojdie, în legătură cu performanța fermentației.

în Partea A a acestui capitol, a fost examinată cinetica colonizării drojdiei în sfere de gel din kappa-caragenină în timpul a trei cicluri de fermentație în șarje repetată. S-au monitorizat viabilitatea și concentrația celulelor drojdiei imobilizate și suspendate liber, împreună cu etanolul, gradul Plato, și concentrația de zaharuri. în Partea B, au fost examinate efectele timpului de fermentație asupra poziției și distribuției celulelor în sfera de gel și morfologia celulei de drojdie. A fost utilizată microscopia electronică cu scanare (SEM) pentru examinarea celulelor de drojdie imobilizate în kappa-caragenină în diferite regiuni ale sferei din gel în patru momente diferite: 1) imediat după producerea sferei; 2) după două zile de fermentație în șarje; 3) după două luni de fermentație continuă într-un bioreactor pilot cu injecție de gaze;

4) după șase luni de fermentație continuă într-un bioreactor pilot cu injecție de gaze. A fost măsurată de asemenea viabilitatea și concentrația drojdiei atât a celulelor fazei lichide cât și ale fazei imobilizate. S-a examinat de asemenea procentul relativ de drojdie deficientă respirator (celule libere și imobilizate din faza lichidă) după cinci luni de fermentație continuă în bioreactorul cu injecție de gaze și acesta a fost comparat cu procentele găsite în fermentațiile tradiționale în șarje a berii. Pe parcursul studiului s-a utilizat o tulpină de drojdie lager de producție.

6.1 Procedura experimentală

Producerea de sfere de gel din kappa-caragenină: gelul de kappa-caragenină X-0909 a fost un cadou generos de la Copenhagen Pectin A/S. Sferele de gel din kappa-caragenină conținând celule de drojdie lager înglobate au fost produse utilizând procedeul amestecătorului static cu o încărcare inițială de celule de 2,6x10⁷ celule/ml de gel (cererea de brevet U.S. nr. 2,133,799 (Neufeld și colab. 1996) și un diametru al sferei de 0,5 până la 2,0 mm.

122

RO 122457 Β1

Mediul de fermentație: Labatt Breweries of Canada a furnizat mustul de bere cu o gre- 1 utate specifică de 17,5°P așa cum s-a descris detaliat în secțiunea Materiale și Metode.

Partea A: Cinetica șarjelor repetate a drojdiei imobilizate în sfere de gel din kappa- 3 caragenină

Fermentațiile au fost conduse în baloane de Erlenmeyer 2 I la 21°C, cu agitare la 5 150 rpm. încărcarea purtătorului a fost 40% (v/v) de sfere de celule imobilizate și volumul total de fermentație a foști I. Fiecare fermentație a durat șapte zile. în R1 s-au inițiat în fermentație 7 sfere cu celule imobilizate proaspăt în must și la sfârșitul fermentației, aceste sfere au fost separate din lichidul fermentat prin trecerea amestecului printr-o sită sterilă din oțel inoxidabil 9 (dimensiune a ochiului 500 pm). Sferele au fost apoi reinoculate în aceeași proporție în must proaspăt, steril pentru o a doua (R2) și apoi a treia (R3) fermentație în șarje. S-a executat 11 eșantionarea de două ori pe zi pentru primele trei zile, și apoi odată pe zi pentru a patra și a cincea zi a fiecărei fermentații. Fermentațiile au fost efectuate în duplicat sau triplicat. Toate 13 fermentațiile au fost conduse cu fermentații de control cu celule suspendate liber, care au fost conduse în aceleași condiții în afară de faptul că doar celulele libere au fost inoculate 15 în fermentații la o rată de 4 g/l. S-au analizat eșantioanele pentru viabilitatea și concentrația celulelor libere și imobilizate, și concentrațiile de carbohidrat și etanol ale fazei lichide. 17

S-au calculat factorii de producție, Y_P/S, ai produsului etanol, din glucoză totală fermentabilă substrat, utilizând ecuația 3.20 pentru cele trei cicluri de fermentație cu celule 19 imobilizate și controlul celulelor libere. Pentru toate fermentațiile s-au calculat factorii de producție de la începutul fermentației până în momentul în care consumul de maltoză a fost 21 încheiat.

S-a calculat productivitatea etanolului, V_etanol, cantitatea de etanol produsă per volumul 23 total de lucru al bioreactorului per unitate de timp de fermentație utilizând ecuația 3.25 pentru R1, R2 și R3, și controlul celulelor libere de la începutul fermentației până la momentul în care 25 consumul de maltoză a fost încheiat. în cazul factorilor de producție și productivitatea etanolului, contribuțiile celulelor de drojdie imobilizate și suspendate liber nu au fost distinse 27 una de cealaltă.

S-au calculat viteza maximă de creștere specifică locală, p_max, și timpul de dublare 29 al celulelor pentru controlul mediat al celulelor libere utilizând ecuațiile 3.3 și 3.4.

Partea B: Viabilitatea și caracteristicile morfologice ale drojdiei imobilizate pe perioade 31 întinse de timp de fermentație

Condițiile fermentației în șarje: fermentațiile în șarje au fost conduse în baloane 33 Erlenmeyer de 2 I la 21 °C, cu agitare la 150 rpm. încărcarea purtătorului a fost 40% (v/v) cu un volum total de fermentație de 1 I. 35

Condiții de fermentație continuă: Pentru fermentațiile continue s-au utilizat bioreacl t I toare pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. Toate datele colectate au fost de la 37 un bioreactor cu un volum de lucru de 81, în afară de micrografiile electronice cu scanare de la 2 luni, care au fost colectate dintr-un bioreactor de 501 utilizând același mediu de fermen- 39 tație și metodă de imobilizare. Sferele cu celule imobilizate la 40% (v/v) au fost fluidizate în bioreactoare utilizând un amestec de aer și dioxid de carbon. Bioreactoarele au fost exploa- 41 tate în condiții variate cu temperaturi de fermentație controlate la 12, 17 și 22°C și timpi de rezidență menținuți între 0,9 și 1,8 zile. Reactorul cu injecție de gaze a atins o concentrație 43 maximă a etanolului de 73 kg/m³ în timpul experimentului de șase luni, cu o concentrație medie de 58 kg/m³. 45

Analize microbiologice: Eșantioanele au fost prelevate din faza lichidă a bioreactorului cu injecție de gaze cel puțin o dată pe săptămână pentru a testa contaminanții incluzând 47 drojdie sălbatică, drojdie non-lager, și bacterii aerobe și anaerobe care strică berea. După cinci luni, au fost testate celulele de drojdie din faza lichidă, în duplicat, pentru mutații de 49 deficiență respiratorie.

123

RO 122457 Β1

Microscopia electronică cu scanare (SEM): Sferele de gel din kappa-caragenină (1,0-1,5 mm diametru) conținând celule de drojdie lager imobilizate au fost eșantionate pentru examinarea SEM în patru momente diferite: 1) după producția de sfere cu celule imobilizate și înainte de inocularea sferelor în mediul de fermentație; 2) după 2 zile în fermentație în șarje; 3) după 2 luni de fermentație continuă într-un bioreactor pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze; 4) după 6 luni de fermentație continuă într-un bioreactor pilot cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze. Metodologia de utilizare cu SEM și prepararea eșantioanelor în legătură cu aceasta sunt descrise în secțiunea 4.7.

Utilizând metodele descrise în secțiunea 4.6, au fost evaluate concentrația și viabilitatea celulelor de drojdie (imobilizate și suspendate liber) în aceleași momente ca și SEM.

6.2 Rezultate și discuție

Partea A: Cinetica șarjelor repetate a drojdiei imobilizate în sfere de gel din kappacaragenină

Timpul de fermentație a fost redus puternic de fiecare dată când celulele imobilizate au fost reinoculate în must proaspăt, așa cum se vede în fig. 6.4 (a), (b), și (c) ilustrând maltoza, maltotrioza, glucoza, fructoza și etanolul față de timpul de fermentație pentru cele trei cicluri de fermentație în șarje repetate. Din aceste figuri se poate vedea că timpul pentru consumul complet al zahărului a fost 64 h pentru R1, 44 h pentru R2, și 26 h pentru R3. Fermentația de control cu celule suspendate liber care nu a conținut sfere cu celule imobilizate, arătată în fig. 6.5, a durat 82 h până la consumul complet de zahăr. Din graficele din fig. 6.4 se poate vedea de asemenea că concentrațiile finale de etanol au fost cele mai mari în cea de a treia dintre cele trei fermentații cu celule imobilizate, în șarje, repetate. Deoarece kappa-caragenina este un hidro-gel, o parte din etanol este transportată în sfere atunci când acestea au fost reinoculate în must proaspăt, în consecință, la momentul zero pentru R2 și R3, în lichidul de fermentație a fost prezent ceva etanol și concentrația inițială de glucoză, maltoză, maltotrioză, și fructoză a fost mai redusă în fermentațiile cu celule imobilizate (fig. 6.4) comparativ cu fermentația de control cu celule libere, așa cum se vede în fig. 6.5. Astfel, factorii de producție au fost calculați pentru fermentații astfel încât randamentul, g producție etanol per g zahăr consumat, poate fi examinat prin comparație.

Maltez*

Glucoza

Frueuw*

Etanol

-»· Maftotnoz*

Fig. 6.4. a) R1, concentrația de maltoză, maltotrioză, glucoză, fructoză și etanol față de timpul de fermentație pentru fermentațiile în șarje repetate utilizând celule de drojdie lager imobilizate în sfere de gei din kappa-caragenină.

124

RO 122457 Β1

•MaltoM •Glucoii • Fntstort

Fig 6.4. b) R2, concentrația de maltoză, maltotrioză, glucoză, fructoză și etanol față de timpul de fermentație pentru fermentațiile în șarje repetate utilizând celule de drojdie lager imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină.

Mafcwl *♦“ hwort >♦- lianut <· Mattoinoza

Fig. 6.4. c) R3, concentrația de maltoză, maltotrioză, glucoză, fructoză, și etanol față de timpul de fermentație pentru fermentațiile în șarje repetate utilizând celule de drojdie iager imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină.

125

RO 122457 Β1

-*> Mrttat» M»- (thjcoU -#· Fructei «*- Γînnoi hk Mnltolnoi*

Fig. 6.5. Concentrația de maltoză, maltotrioză, glucoză, fructoză, și etanol față de timpul de fermentație pentru fermentațiile de control ale drojdiei lager suspendată liber (fără celule imobilizate).

Fig. 6.6 (a) și (b) compară concentrațiile de maltoză și respectiv etanol față de timpul de fermentație al R1, R2, și R3. Pe perioada R1 repetată, maltoză a fost preluată de celulele de drojdie aproape imediat după inocularea în must proaspăt. Concentrațiile de etanol și-au atins maximul devreme în R1 repetată și de asemenea, a atins concentrații mai mari decât primele două fermentații în șarje. Așa cum este arătat în fig. 6.6 (b), întârzierea inițială din producția de etanol din R1 a fost redusă drastic atunci când aceste celule imobilizate au fost reinoculate în R2 și s-a redus în continuare după reinocularea pentru R3.

Fig. 6.6. a) Concentrația de maltoză față de timpul de fermentație pentru fermentații în șarje repetate, R1, R2 și R3, utilizând celule de drojdie lager imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină.

126

RO 122457 Β1

Timpul dc fermentație (h)

Fig. 6.6. b) Concentrația de etanol față de timpul de fermentație pentru fermentații în șarje repetate R1, R2 și R3 utilizând celule de drojdie lager imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină.

Fig. 6.7 (a) arată concentrația de celule imobilizate per volum total al bioreactorului față de timpul de fermentație pentru R1, R2 și R3. Celulele libere eliberate din matricea de celule imobilizate în faza lichidă în vrac din aceste fermentații față de timp sunt arătate în fig. 6.7 (b). în fig. 6.7 (c) este arătat totalul celulelor de drojdie imobilizate și libere per volum total al reactorului pentru cele trei șarje. Figura 6.7 (a) arată că concentrația de celule imobilizate în gelul de kappa-caragenină a continuat să crească după inocularea lor inițială în must pentru R1. Când sferele au fost reinoculate în must proaspăt pentru R2 repetată, creșterea a continuat să aibă loc în sferele din gel. A treia oară când celulele încapsulate au fost reinoculate în must proaspăt, rata de creștere a concentrației de celule imobilizate s-a redus. Profilul concentrației celulelor libere eliberate din matricea de gel de kappa-caragenină în faza lichidă în vrac, celulele imobilizate și celulele totale din fermentație pentru R1 sunt arătate în fig. 6.8.

127

RO 122457 Β1

LE u

Fig. 6.7. a) Concentrația medie a celulelor de drojdie lager imobilizate per volum total de bioreactor față de timpul de fermentație pentru fermentațiile R1, R2 și R3. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

<3 xi *5

V

-Q

-«M·

Fig. 6.7. b) Concentrația per volum total de bioreactor a celulelor de drojdie lager eliberate în faza lichidă în vrac față de timpul de fermentație pentru fermentațiile R1, R2 și R3. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

128

RO 122457 Β1

Fig. 6.7. c) Concentrația totală (fază lichidă și imobilizată) de celule de drojdie lager per volum total de bioreactor față de timpul de fermentație pentru fermentațiile R1, R2 și R3. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

Timpul de fermentație (h)

-♦«Citete 1« (m* hduttt -β-Cdute uaoMimc ·-*-Cetele (aude

Fig. 6.8. Profilul concentrației celulelor imobilizate, în fază lichidă și totale (fază 39 lichidă și imobilizate) față de timpul de fermentație pentru R1, prima dintre cele trei fermentații în șarje repetate utilizând celule de drojdie lager imobilizate în sfere de gel 41 din kappa-caragenină.

în R1, concentrația de celule imobilizate în sfera de gel din kappa-caragenină a fost crescătoare la o rată similară fermentației de control, care a conținut numai celule în fază 45 lichidă. Aceasta a fost confirmată prin compararea curbei de creștere medie a fermentațiilor de control cu celule libere din fig. 6.9 cu curbele de creștere similare ale celulelor imobilizate 47

129

RO 122457 Β1 în caragenină în R1 din fig. 6.10. în timpul R1, sferele de gel nu au fost colonizate complet și matricea de gel nu a părut să aibă un efect inhibitor asupra creșterii celulelor de drojdie din sfere. Prin R2, matricea a părut să restricționeze creșterea celulelor din sfera de gel, indicată de o mică creștere a numărului de celule în timpul acestui ciclu de fermentație. Aceasta se poate datora naturii gelului sau aglomerării celulelor de drojdie în sfere, sau unei lipse de alimentare a celulelor cu elemente nutritive.

Fig. 6.9. Concentrația medie a celulelor de drojdie lager suspendate liber în fermentația de control (n=3) pervolum total de bioreactor față de timpul de fermentație, în timpul acestor fermentații nu au fost prezente celule imobilizate.

Fig. 6.10. Concentrația drojdiei lager imobilizată per ml de sfere de gel față de timpul de fermentație pentru fermentațiile R1, R2 și R3. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

130

RO 122457 Β1 în tabelul 6.1 sunt arătate randamentele de etanol din zaharuri fermentabile substrat, 1 Y_P/S, pentru cele trei generații în șarje și control. în Tabelul 6.2, sunt date de asemenea productivitățile volumetrice de etanol ale bioreactorului, calculate utilizând datele date în 3 Tabelul 6.1. Productivitățile de etanol din zaharuri pentru fermentații nu au fost diferite semnificativ una față de cealaltă sau față de control. Randamentele au fost toate peste 90% 5 din randamentul teoretic de 0,51 prezis din ecuația Guy-Lussac. Așa cum s-a menționat mai devreme, producția de biomasă și alte produse secundare formate de celulele de drojdie 7 împiedică eficiența să fie mai mare de 95% din cea teoretică (Hardwick, 1995). Productivitatea volumetrică de etanol a bioreactorului în cele trei fermentații în șarje repetate a variat 9 semnificativ de la șarjă la șarjă repetată. Productivitatea etanolului a crescut cu fiecare ciclu de fermentație în șarjă repetată și, până la R3, celulele imobilizate au fost mai productive 11 decât fermentația de control. Cantitatea totală de etanol produsă în R2 nu a fost semnificativ mai mare decât cea produsă în timpul R1, dar timpul de fermentație a fost mai mic de juma- 13 tatea lui R1 și al fermentației de control. Există mulți factori care pot contribui la această viteză de fermentație crescută a celulelor imobilizate cu fiecare repetare a șarjei, cum ar fi adaptarea 15 celulelor de drojdie la condițiile de fermentație și creșterea progresivă a concentrației celulare. Numărul total de celule per volum de bioreactor devine semnificativ mai mare decât cel al 17 controlului până la R3. înfig. 6.7 (b), graficul concentrației celulelor suspendate liber (eliberate din matricea de gel) în lichidul în vrac față de timpul de fermentație a demonstrat că numărul 19 de celule eliberat din sferele de gel a crescut cu fiecare generație în șarjă. Odată ce sferele devin mult mai încărcate integral cu celule de drojdie, au părut să elibereze mai multe celule 21 în faza lichidă. Husken și colab. (1996) au condus studii care au examinat expansiunea coloniei de celule bacteriene și erupția/eliberarea din sferele de gel din kappa-caragenină. Vives 23 și colab. (1993) au raportat că concentrația maximă de celule de drojdie pe care au obținut-o în sferele de gel din kappa-caragenină a fost 10⁹ celule pergram de gel, care este concentra- 25 ția care a fost obținută în particulele de gel prin R2. Concentrații similare maxime ale celulelor au fost găsite în timpul fermentațiilor continue din Partea B. Cu toate acestea, încărcările 27 maxime de celule în matricea de gel vor depinde de încărcarea celulară inițială, compoziția gelului și alți factori. 29

131

CO

Φ

-Q £

ιο o

io o

IO co o

o

CM co φι tp

Φ Φ Μ 43 ε -8

-X, ³

Țj φ £ 8φ Φ Ο 2 **-* X ο 2 3 φ 2 Ο - ³ θ' υ Ο ρ o

o co o

o .3

Φ £

Φ

Φι

CO

Ο.

Ω <r

Γ-

Γ— io o

co co

K

CM _ο

Ο o

co o_ co o

co o

io co_ <t

IO

CM

CM

IO o

cm r— σ>

o cn

-oco cm oj co ’T io co_ co io o

co co

RO 122457 Β1 >φ

Ν

Ο ³ 3 °> ,φ § 2' -2 c 2 φ Ε φ

Φ

C

Φι co ο:

° φ, Φ C\| φ ο:

. cc

2 ³ fe

Φ C φ ο.

1F? θ 0φ ο.

Μ £ C0 2 £ c a= φ φ Ε Ε φ

c φ

ο;

CO

LO

CO

ο.

Ω <r

C\Î co

CM co

CM o·

Φ

c	c.
Φ	Φ
ș	O
2	2
3	2
-fa	Xj
C	c
Φ	Φ
CL	8-
3	3
3	Φ
c	2
2
o Φ Φ	φ o
c.	3
.O	CJ
O	Φ
Φ	CO
--,	Φ
	Φι
	<S
c.
o	>♦3.
Ci	2
Φ	c
p	φ

φ Φ •2 g ro co o

o_ o

o_ o

o_ o

ο ι_

Li_ o

o o

o o

o o

co cn _cT

O o

o o

o co

CL ro o

o o

O

OCM

CL o

o o

o o

co

CM co

CL σ>

o o

o o

CM

Φ

Φ o

JP _o

Φ o

o o

>C0

N o

π

E ω

XI ’<D _o

2?

o.

CD

Φ l_ ω

<D

-£= o

c c

CD

Q.

D

Q.

E o

-Q

Ξ ώ

co o

E	3
3	CJ
9	2
CQ	2
£	φ
	Q.
	E
	o CJ
Ό o	co1
c	o:
Q.
	Φι
o c	CM
2	o:
φ
o>	Q£
11^	φ
c	φ
CD	.N
έ	O
	O
o c	E
2	2
φ
φ	φ CJ
φ	3
2	CJ

g •φ £

tn

* <*> E oj o c ro CD >	O Γ- Ο- Ο	0,668	1,246	0,805
ermentatie ί		CM	co	ontrol cu celule libere
U_	CL	CL	DL	O

calculat la încheierea preluării de maltoză

CM

CO

CM

CM

C0

RO 122457 Β1

Un alt factor care afectează productivitatea volumetrică crescută a bioreactorului observată cu fiecare fermentație în șarje repetată, implică adaptarea celulelor de drojdie. Până la sfârșitul primei fermentații, celulele de drojdie și-au adaptat mașina metabolică la condițiile date de fermentație. Aceasta poate avea ca rezultat scăderea fazei de întârziere la începutul fermentații lor în șarje următoare, crescând viteza de fermentație. în timpul acestui studiu, toate fermentațiile de control au fost realizate cu drojdie lager preparată proaspăt. Ar fi interesant să se reinoculeze drojdia de control suspendată liberîmpreună cu celulele imobilizate reinoculate pentru a se examina suplimentar acest efect în legătură cu efectele concentrației celulare.

Fig. 6.11 indică faptul că viabilitatea celulelor imobilizate, utilizând metoda albastrului de metilen ca indicator, a fost redusă (<50%) când celulele imobilizate au fost inoculate inițial în must în R1, dar viabilitatea celulelor imobilizate a fost peste 90% după 48 h de fermentație. Celulele de drojdie au colonizat rapid sferele și viabilitatea a rămas ridicată pe parcursul R3. Cu toate acestea, prin R3 repetată, viabilitatea s-a modificat ușor către sfârșitul fermentației. Totuși, pe parcursul tuturor celor trei fermentații în șarje repetate, celulele libere care au fost eliberate în mediul lichid în vrac au avut viabilitate mai ridicată decât perechile lor imobilizate. Matricea de imobilizare poate avea un efect negativ asupra viabilității celulelor de drojdie (limitări ale transferului de masă și/sau limitări spațiale), sau celulele de drojdie viabile pot fi eliberate preferențial din matricea de imobilizare în mediul lichid în vrac față de celule neviabile. Utilizând datele mediate din trei fermentații de control separate cu drojdie suspendată liber conținute în Anexa 1, se dă o reprezentare grafică a In (X/X_o) față de timpul de fermentație, în fig. 6.12. Panta este egală cu viteza specifică maximă locală de creștere a celulelor la 21 ’C în must de bere, cu agitare la 150 rpm. S-a găsit că viteza specifică maximă locală de creștere a drojdiei este 0,096 h'¹ și timpul de dublare al celulelor a fost 7,22 ore. p_max găsit în această lucrare a fost definit ca un p_max local deoarece, așa cum s-a menționat în secțiunea teoretică, adevărata p_max utilizată în ecuația Monod este realizabilă doar când S este semnificativ mai mare decât constanta Monod, K_s. Este necesară o muncă suplimentară pentru a evalua constanta Monod, K_s, din substratul limitator din aceste fermentații, pentru a confirma faptul că p_max local calculat a fost un maximum adevărat, definit de ecuația Monod.

Fig. 6.11. Viabilitatea celulelor de drojdie lager imobilizate (albastru de metilen) față de timpul de fermentație pentru fermentațiile R1, R2 și R3.

133

RO 122457 Β1

Fig. 6.12. InțX/Xg) față de timpul de fermentație în șarje pe perioada fazei de creștere exponențială a fermentațiilor de control cu drojdie suspendată liber mediate, unde X este concentrația celulară la momentul t, iar X_o este concentrația celulară la momentul t=0 (n=3).

Partea B: Viabilitatea și caracteristicile morfologice ale drojdiei imobilizate pe perioade întinse de fermentație înainte ca sferele de gel să fie expuse la mediul de fermentație, și după producerea sferelor cu celule imobilizate, utilizând procedeul amestecătorului static, concentrația celulară a fost 2,6x10⁷ celule/ml de sfere de gel (Tabelul 6.3, unde valorile sunt mediile a două eșantioane). Imagistica SEM arată că celulele sunt distribuite individual și uniform pe întinderea sferelor de gel (fig. 24).

Tabelul 6.3.

Viabilitatea (albastru de metilen) și concentrația celulelor de drojdie lager suspendate liber și imobilizate înglobate în sfere de gel din kappa-caragenină pe perioada timpului de fermentație

Timp	Mod de fermentație	Drojdie suspendată liber în faza lichidă	Drojdie imobilizată în faza de gel
Viabilitate (%)	Concentrația celulară (celule/ml în lichid)	Viabilitate (%)	Concentrația celulară (celule/ml de gel)
0	n/a	n/a	n/a	n/a	2,6 E+07
2 zile	șarje	98	5,5 E+07	92	2,35 E+08
2 luni	continuă	93	2,35 E+08	76	8,60 E+08
6 luni	continuă	92	2,11 E+08	<50*	1,40 E+09*

* Pe baza unui singur eșantion

134

RO 122457 Β1

Viabilitatea a fost >90% după 2 zile de fermentație în șarje, și concentrația celulară 1 în sferele de gel a crescut de zece ori (Tabelul 6.3). Celulele (>90% viabile) au început de asemenea să fie eliberate din gel în faza lichidă în vrac a fermentației, producând o concen- 3 trație de 10⁷ celule/ml de lichid. în interiorul sferelor de gel s-au format mici colonii de drojdie, cu multe cicatrici de înmugurire prezente pe celulele individuale așa cum se vede în fig. 25. 5

Viabilitatea celulelor de drojdie imobilizate a scăzut după 2 luni de fermentație continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze (Tabelul 6.3), dar celulele din faza lichidă în 7 vrac au rămas puternic viabile (>90%), și această descoperire a fost susținută în timpul mai multor fermentații continue diferite în bioreactoare pilot cu injecție de gaze. SEM din fig. 26 9 a arătat că la două luni, către periferia sferei se formaseră colonii mari de drojdie, confirmând rezultatele altor cercetători (Bancel și Hu, 1996; Gndia și colab., 1987; Wada și colab., 1979; 11

Wang și colab., 1982). S-a realizat o comparație a morfologiei drojdiei poziționate către marginea exterioară a unei sfere cu celule imobilizate cu drojdia poziționată în centrul unei sfere 13 de gel în mai multe eșantioane utilizând imagistică SEM. Celulele localizate către periferia sferelor au fost ovoide și netede cu multe cicatrici de înmugurire (fig. 27), o indicație a multi- 15 plicării drojdiei (Smart, 1995). Celulele care apar în imaginea din centrul sferei (fig. 28) au părut malformate și au prezentat puține urme de formare a cicatricilor de înmugurire. Lipsa 17 cicatricilor de înmugurire poate fi o indicație a unei posibile limitări a elementelor nutritive, cum arfi oxigen, în centrul sferelor. Neregularitatea suprafeței observată pe suprafața drojdiei 19 din Fig. 28, poate fi de asemenea o indicație a maturării celulei (Barker și Smart, 1996; Smart,

1999). 21

Viabilitatea drojdiei imobilizate în gelul de caragenină a scăzut sub 50% după șase luni de fermentație continuă în bioreactorul cu injecție de gaze, (Tabelul 6.3). Trebuie remar- 23 cat că în timp ce s-a colectat doar un punct din datele pentru concentrația și viabilitatea celulelor imobilizate la șase luni, datele la momentul cinci luni au fost similare, cu o concentrație 25 a celulelor imobilizate de 1,14x10⁹celule/ml de gel și viabilitate <50%. în timp ce s-a observat un declin gradat în timp al viabilității celulelor imobilizate, viabilitatea celulelor din faza lichidă 27 în vrac a rămas ridicată în mod serios. în plus, chiar dacă viabilitățile celulelor imobilizate au fost reduse în sfere ca într-un întreg, bioreactorul a produs o bere complet fermentată în 29 timpul exploatării continue a acestuia timp de șase luni. Motivele posibile pentru această descoperire includ contribuția semnificativă a celulelor de drojdie suspendate liber, înalt viabile 31 la fermentație. De asemenea, există contribuția potențială a celulelor imobilizate viabile localizate la periferia sferei de gel unde există mai puține bariere pentru transferul de masă, com- 33 parativ cu celulele localizate în centrul sferei. Este neclar dacă celulele imobilizate au avut capacitatea de a se redistribui singure în matricea de gel, sau dacă aceste celule au rămas 35 staționare unde au fost poziționate prima dată. O concentrație de 10⁹ celule/ml de sfere de gel a fost maximul obținut în aceste sfere pe perioada de șase luni de fermentație continuă. 37 în fig. 29 s-a reprezentat imaginea unei sfere întregi utilizând SEM. Această sferă a avut un miez gol și, din multitudinea de sfere examinate, aproximativ jumătate au prezentat 39 această structură. Miezul gol în interior ar putea fi rezultatul degradării structurii gelului de caragenină și promovat suplimentar de prepararea SEM. Acest miez gol în interior nu a fost 41 observat în preparările de sfere proaspete. Lucrările anterioare ale altora (Bancel și colab.,

1996) au arătat că celulele care cresc au indus slăbirea rețelei de gel. Audet și colab. (1988) 43 au raportat că adiția de gumă de roșcove la kappa-caragenină a modificat rezistența mecanică a sferelor de gel pentru imobilizarea bacteriilor. 45

Pe întreaga perioadă de șase luni a experimentului de fermentație a berii, bioreactorul cu injecție de gaze a fost testat minimum odată pe săptămână pentru contaminare. Nu s-au 47 detectat contaminanți bacterieni în niciun moment în timpul experimentului. în ultimele două

135

RO 122457 Β1 luni ale încercării, s-a detectat o drojdie pe post de contaminantîn concentrații care au fluctuat între 1 și 5 cfu/l. Această drojdie a fost capabilă de creștere pe un mediu PYN la 37°C, dar nu a crescut aerob sau anaerob pe mediu DUBA (selectiv pentru bacterii), nu a fermentat dextrine, și nu a arătat creștere pe mediu CuSO₄ (selectiv pentru drojdii sălbatice).

După cinci luni, procentul mediu de celule de drojdie deficiente respirator a fost 7%, care este mai mare decât ceea ce se găsește în mod normal utilizând această tulpină în timpul fermentațiilor industriale în șarje (medie 2%). Alți cercetători au raportat descoperiri similare (Norton și D’Amore, 1995). Drojdia deficientă respirator rezultă dintr-o mutație care determină drojdia să fie incapabilă să respire glucoză la dioxid de carbon și apă. Această drojdie are mitocondrii cu activitate afectată permanent și apare uzual din cauza unei mutații a ADN-ului mitocondrial (Hardwick, 1995).

Artefactele din prepararea eșantionului SEM pot provoca confuzie. S-au utilizattehnologii cum arfi rezonanță nucleară magnetică (RMN), spectroscopie (Fernandez, 1996) și microscopie confocală (Bancel și Hu, 1996) pentru a examina neinvaziv celulele imobilizate. Tehnicile de imagistică RMN au permis cercetătorilor să studieze transportul, fluxul și distribuția spațială a celulelor și materiilor biochimice în biofilme. Cercetătorii (Bancel și Hu, 1996) au arătat de asemenea că se poate utiliza microscopia confocală cu baleiere laser pentru observarea celulelor imobilizate în micropurtători poroși de gelatină prin secționare optică serială.

Deși se utilizează albastrul de metilen ca un indicator etalon al viabilității celulei în industria de fabricare a berii, metoda are multe dezavantaje (Mochaba și colab., 1998). Aceasta măsoară dacă o populație de drojdie este viabilă sau neviabilă pe baza capacității celulelor viabile de a oxida colorantul în forma sa incoloră. Celulelor neviabile le lipsește capacitatea de a oxida colorantul și prin urmare rămân albastre (O’Connor-Cox și colab., 1997). Tehnicile contorizării plăcilor și culturii pe lamă se bazează pe capacitatea celulelor de a crește și produce macrocolonii pe plăci de agar sau micro-colonii pe medii de lame microscopice acoperite (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Lucrările în curs ale examinării viabilității drojdiei în matrici imobilizate pe perioade întinse de timp la Labatt utilizează acum, nu numai metoda albastrului de metilen, ci de asemenea metodele menționate mai sus cât și dezvoltarea tehnicii microscopiei confocale utilizând colorare vitală. în plus față de măsurarea viabilității celulelor, în viitoarea lucrare trebuie considerată de asemenea și problema “vitalității” celulelor imobilizate. Acolo unde s-a utilizat viabilitatea pentru a descrie capacitatea celulelor de a crește și a se reproduce, vitalitatea măsoară performanța fermentației drojdiei, activitatea, sau capacitatea drojdiei de a se reface din stres (Smart și colab., 1999).

CAPITOLUL 7. PRODUCEREA DE AROME ÎNTR-UN SISTEM DE FERMENTAȚIE CONȚINUT A BERII CU INJECȚIE DE GAZE

I I

7.1 Procedura experimentală

Utilizarea fermentației continue pentru a produce bere este foarte diferită de alte aplicații utilizând celule imobilizate deoarece produsul rezultat nu este măsurat în termenii unui component de interes cum ar fi etanolul. în loc de aceasta, există o balanță de numeroși compuși chimici care trebuie echilibrată pentru a realiza un produs finit de calitate. Au fost examinate efectele oxigenului asupra metaboliților de aromă din drojdie în timpul fermentației primare continue și în timpul unei a doua perioade de menținere în șarje. Efectul timpului de rezidență asupra metaboliților de aromă a fost examinat de asemenea la două nivele. în cele din urmă, s-a adăugat un preparat enzimatic comercial din alfa-acetolactat decarboxilază în alimentarea cu must a fermentației continue și s-a monitorizat concentrația de diacetil total din faza lichidă.

136

RO 122457 Β1

7.1.1 Efectul cantităților relative de aer în gazul de fluidizare al bioreactorului asupra 1 metaboliților drojdiei în timpul fermentației continue primare

Cantitatea de aer și prin urmare oxigen din gazul de fluidizare al bioreactorului a fost 3 variată în timp ce timpul de rezidență, temperatura și toate celelalte variabilele de proces controlabile au fost menținute constante. Debitul volumetric total de gaz a fost menținut con- 5 stant la 472 ml/min. la STP, temperatura a fost 15°C, și pe parcursul încercării s-au utilizat sfere de gel din kappa-caragenină conținând drojdie LCC 3021 imobilizată, cu o încărcare 7 inițială cu celule de 1x10® celule/ml de gel. S-au impus patru debite volumetrice diferite de aer în sistem, pe parcursul încercării (Tabelul 7.1), și timpul mediu de rezidență în bioreactor, 9 R„ a fost 1,18 zile.

Tabelul 7.1. 11

Debitele volumetrice de aer furnizate bioreactorului prin pulverizator în timpul fermentației continue. Debitul volumetric total furnizat bioreactorului 13 a fost de 472 ml/min. la STP, restul de gaz fiind dioxid de carbon de adaos

Debitul volumetric de aer (ml/min.)	Procentul de aer din gazul de fluidizare (% v/v)	Pornire (ziua)	Sfârșit (ziua)	Timp total (zile)
94	19,9	10	26	17
354	75,0	27	40	14
34	7,2	41	58	18
0	0	59	66	8

S-au efectuat repetat următoarele analize pe parcursul experimentului: azotul amino 23 liber (FAN), carbohidratul total fermentabil (ca glucoză), etanol, diacetilul total total, volatilele din bere (esteri selectați și alcooli), și concentrația și viabilitatea celulelor de drojdie din faza 25 lichidă. Bioreactorul a fost de asemenea testat pentru contaminare, minimum o dată pe săptămână. 27

Concentrația de oxigen dizolvat în faza lichidă în vrac a bioreactorului a fost măsurată când s-a presupus că fermentația continuă a fost la starea pseudo-stabilă pentru fiecare debit 29 volumetric de aer (minimum trei timpi de tranzit ai reactorului).

7.1.2 Perioada de menținere în șarje post-fermentație: efectele expunerii la oxigen 31 asupra metaboliților drojdiei

Chiar când cantitatea de oxigen din gazul de fluidizare al bioreactorului a fost relativ 33 redusă (34 ml/min. la STP), concentrațiile de acetaldehidă și diacetil total găsite în timpul experimentului condus în secțiunea 7.1.2, au fost inacceptabil de ridicate pentru piața de bere 35 lager Nord Americann. Prin urmare, s-a ales o nouă abordare, în care lichidul preluat din bioreactorul primar continuu a fost menținut în șarje timp de 48 h la o temperatură ușor ridi- 37 cată de 21°C pentru a reduce concentrația acestor doi compuși. De asemenea, rezultatele din secțiunea anterioară 7.1.2 au indicat efectul semnificativ pe care l-a avut cantitatea de 39 aer din gazul de fluidizare asupra compușilor de aromă măsurați. Prin urmare, s-a examinat efectul asupra metaboliților de aromă din drojdie în condiții aerobe față de condiții anaerobe 41 în avalul fermentației primare, unde a avut loc a doua menținere în șarjă.

Fermentația primară continuă a fost realizată într-un bioreactor de 501 cu injecție de 43 gaze utilizând o variantă puternic floculantă a tulpinii de drojdie LCC3021 pentru această încercare deoarece cerința volumului de eșantionare pentru studiu a fost prea mare față de 45 volumul bioreactorului de 81. Condițiile de exploatare au fost 1180 ml/min. CO₂ și 189 ml/min. aer la STP în gazul de fluidizare, un timp de rezidență mediu în bioreactor, R_t, de 1,0 zi, o 47 temperatură de 15°C, și must de bere lager cu greutate ridicată de 17,5° P.

137

RO 122457 Β1

S-a preluat un total de 4 eșantioane (flacoane bordurate de 100 ml), două fiind manipulate în condiții anaerobe și celelalte două expuse mediului aerob.

Procedura de eșantionare anaerobă a fost după cum urmează: două flacoane bordurate de 100 ml și șase flacoane bordurate de 25 ml au fost autoclavizate și apoi plasate într-o cutie anaerobă (Labmaster 100, mbraun, USA) cu argon ca gaz de purjare. Flacoanele de 100 ml au fost lăsate să se echilibreze timp de 45 min și apoi au fost închise ermetic utilizând capace de aluminiu și diafragme de Teflon®. S-a utilizat o seringă de 50 ml, prevăzută cu un ac mărimea 16, de 3 țoii, sterilizat utilizând o soluție etanolică 70% (v/v), pentru a extrage eșantionul din bioreactor prin înțeparea diafragmei membranei supapei de eșantionare și eșantionul a fost injectat în flacoanele de 100 ml pre-purjate anaerob. Afost necesar să se prevadă o ventilare a flacoanelor bordurate, printr-un ac de seringă steril suplimentar, pentru a permite eliberarea presiunii din flacon în timpul umplerii. Eșantioanele aerobe au fost expuse atmosferei pe măsură ce au fost extrase din bioreactor prin deschiderea completă a supapei de eșantionare cu membrană în flacoanele de eșantionare de 100 ml deschise, fără să se utilizeze o seringă și un ac.

Lichidul eșantion a fost lăsat să se liniștească la temperatura camerei timp de 2 h pentru a permite drojdiei să sedimenteze din soluție, lăsând o concentrație celulară în lichidul în vrac de aproximativ 10⁶ celule/ml. Odată sedimentat, lichidul din fiecare flacon de 100 ml a fost decantat în trei flacoane de 25 ml. Eșantioanele anaerobe au fost manipulate într-o cutie anaerobă pentru a minimiza preluarea de oxigen în timp ce eșantioanele aerobe au fost prelucrate sub o hotă de curgere laminară. Fiecare dintre eșantioanele din flacoanele de 100 ml au fost împărțite în trei flacoane mai mici de 25 ml, astfel încât analizele eșantioanelor au putut fi realizate fără alterarea cursului fermentației datorată extragerii eșantioanelor. Odată ce eșantioanele aerobe au fost transferate în flacoanele mai mici, acestea au fost incubate, fără capace, la 21 °C. Eșantioanele anaerobe au fost transferate în trei flacoane mai mici și închise ermetic utilizând un capac de aluminiu și diafragmă din Teflon®. Pentru a evita creșterea presiunii datorită evoluției dioxidului de carbon în flacoane, și în același timp împiedicând expunerea eșantioanelor la mediul exterior aerob, diafragmele au fost înțepate cu un ac. Capătul acului expus mediului exterior a fost scufundat în etanol (mai puțin de 1 cm coloană de presiune), împiedicând orice intrare a aerului în eșantion. Eșantioanele au fost colectate pentru analiză la 2, 24, și 48 h. S-a preluat de asemenea un eșantion direct din bioreactor și s-a analizat imediat pentru a se evalua starea fermentației din bioreactor în momentul protocolului. Eșantioanele au fost analizate pentru carbohidratul fermentabil total (ca glucoză), etanol, diacetil total, și volatilele din bere (esteri selectați și alcooli).

7.1.3 Efectul timpului de rezidență a lichidului asupra metaboliților drojdiei în timpul fermentației primare continue a berii

Pentru a examina efectul timpului de rezidență a lichidului asupra activității metabolice a drojdiei, s-a realizat un experiment în care s-a impus o schimbare în trepte a debitului volumetric de must al bioreactorului, în timpul fermentației primare continue a berii utilizând celule de drojdie LCC3021 imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină. Temperatura bioreactorului a fost menținută constantă la 17°C pe parcursul încercării. Debitul volumetric de gaz furnizat bioreactorului a fost de asemenea constant la 472 ml/min. la STP. Gazul a fost un amestec de aer (11 ml/min la STP) și dioxid de carbon (461 ml/min. la STP). Concentrația inițială de celule de drojdie din gelul de kappa-caragenină gel a fost 2,6x10⁷ celule/ml de sfere de gel și bioreactorul a conținut 40% (v/v) sfere.

S-au efectuat repetat următoarele analize pe parcursul încercării: carbohidrați, azot amino liber (FAN), carbohidrat fermentabil total (ca glucoză), etanol, diacetil total, volatile din bere (esteri selectați și alcooli), și concentrația și viabilitatea celulelor de drojdie din faza lichidă. Bioreactorul a fost de asemenea testat pentru contaminare, minimum odată pe săptămână.

138

RO 122457 Β1

7.1.4 Utilizarea unui preparat comercial de alfa-acetolactat decarboxilază pentru a reduce diacetilul total în timpul fermentației primare continue a berii

Concentrațiile ridicate de diacetil sunt considerate de majoritatea producătorilor Nord Americani de bere ca fiind un defect de aromă nedorit în bere. în fermentațiile primare continue realizate până acum, concentrațiile de diacetil total au fost în mod consistent peste nivelurile de prag pentru fermentațiile în șarje tradiționale (70-150 pg/l) într-o bere lager Nord Americană. în timpul fermentației în șarje, diacetilul este redus pe parcursul etapelor finale ale fermentației, când oxigenul nu mai este prezent și nu se introduc zaharuri suplimentare.

în sistemul de fermentație continuă se furnizează bioreactorului un nivel constant redus de >

oxigen printr-un pulverizator, și în bioreactor se alimentează continuu must proaspăt. Prin urmare, s-a explorat o nouă strategie utilizând un preparat enzimatic comercial pentru a controla concentrația de diacetil din bioreactorul continuu.

I într-o fermentație cu must, diacetilul se formează când a/fa-acetolactatul, un intermediar în sinteza valinei, este decarboxilat oxidativ în afara celulei de drojdie. Celula de drojdie reabsoarbe apoi diacetilul și îl convertește în acetoina mai puțin activă din punct de vedere al aromei. Această decarboxilare oxidativă a a/fa-acetolactatului în diacetil) este limitatoare de viteză în fermentațiile mustului în șarje. în timpul fermentațiilor continue, diacetilul total a ieșit din bioreactor la concentrații inacceptabil de ridicate (300-400 pg/l). Enzima comercială a/fa-acetolactat decarboxilaza (ALDC), de la Novo-Nordisk A/S poate converti a/fa-acetolactatul direct în acetoină, evitând astfel intermediarul diacetil nedorit (fig. 7.1) (Jepsen, 1993).

Acetoina

A/fa-acetolactat decarboxilaza a fost adăugată la mustul introdus în bioreactor pentru a se examina efectul net al acesteia asupra concentrației de diacetil total. Au fost explorate și alte strategii pentru reducerea diacetilului, inclusiv o perioadă de menținere în șarje la cald de 48 h post-fermentație și sisteme de fermentație secundară imobilizate, tehnologie de la Alpha-Laval (Anon, 1997). Amândouă aceste alte strategii au avut succes în reducerea nivelurilor de diacetil post fermentație, dar niciuna nu se ocupă de nivelul de diacetil la sursă (adică la evacuarea bioreactorului). Prin utilizarea de ALDC în must pentru a reduce concentrația de diacetil care iese din bioreactor, perioadele de tratament post-fermentație pot fi minimizate sau eliminate.

139

RO 122457 Β1

Activitatea ALDC este optimă la pH 6,0 în mustul lager la 10°C. La pH 5,0, tipic pentru musturile industriale, activitatea ALDC este maximizată la o temperatură de 35°C (Anon, 1994). Astfel, în condițiile tipice de fermentație a berii de temperatură și pH reduse, activitatea ALDC este mai mică decât cea optimă.

Health Canada a amendat în 1997 Canada’s Food and Drug Regulations (SOR/97-81) pentru a permite utilizarea de ALDC în băuturile alcoolice, ceea ce a deschis o ușă pentru utilizarea acesteia în fabricile de bere canadiene. Bacillus subtilis, purtător al genei care codifică ALDC (E.C. 4.1.1.5) din Bacillus brevis, produce enzimă ALDC. Deoarece ALDC este o enzimă care este produsă de un organism modificat genetic (GMO), există probleme legate de percepția publicului care trebuie rezolvate înainte de utilizarea unei asemenea enzime într-un produs comercial.

Pentru aceste experimente, s-a utilizat drojdia lager LCC3021. Mustul de bere lager cu greutate mare, de 17,5° P, a fost furnizat de fabrica de bere Labatt London. Au fost monitorizate etanolul, carbohidratul fermentabil total (ca glucoză), diacetilul total, și concentrația și viabilitatea celulelor din faza lichidă. Celulele de drojdie au fost imobilizate în sfere de gel din kappa-caragenină așa cum s-a descris în Capitolul 4. Bioreactorul a fost lăsat trei timpi de tranzit, înainte să se presupună că a atins starea pseudo-stabilă. Așa cum s-a menționat mai devreme, metoda diacetilului utilizată în această lucrare este referită ca “diacetil total deoarece metoda măsoară cantitatea de diacetil și precursorul acestuia, alfa-acetolactatul. Astfel, o reducere observată a diacetilului total în timpul acestui experiment s-ar datora efectului combinat al enzimei care convertește direct a/fa-acetolactatul în acetoină și concentrația redusă ulterioară a derivatului acesteia, diacetilul.

Alfa-acetolactat decarboxilaza (ALDC) a fost furnizată ca un cadou generos în scopuri de laborator de Novo Nordisk A/S, Danemarca sub formă de Maturex® L. Activitatea enzimei a fost 1500 ADU/g, unde ADU este cantitatea de enzimă care în condiții standard, produce prin decarboxilarea alfa-acetolactatului, 1 pmol de acetoină per minut așa cum este descris în Metoda Novo Nordisk AF27 (Anon, 1994).

Condiții de fermentație continuă: Fermentațiile continue au fost efectuate în bioreactorul de 8 I cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze inoculat la 40% (v/v) cu sfere de gel din kappa-caragenină conținând celule de drojdie lager imobilizate. Bioreactorul a fost barbotat cu un amestec de dioxid de carbon (438 ml/min. la STP) și aer (34 ml/min. la STP). Temperatura de fermentație a fost controlată la 15°C pe parcursul încercărilor și timpul de rezidență în bioreactor, R„ a fost 1,5 zile. Concentrația de diacetil total a fost monitorizată în aceste condiții și s-a atins o concentrație de diacetil de control medie a stării pseudo-stabile. S-a adăugat apoi ALDC la must la o concentrație de 72 pg/l (108 ADU/I) și concentrația de diacetil total din bioreactor a fost monitorizată pentru un răspuns.

Experimentul 1. Mustul a fost colectat din fabrica de bere într-un vas din oțel inoxidabil de 201, și încălzit într-o autoclavă timp de 45 min la 100°C. Mustul a fost menținut la 2°C într-o baie de apă cu temperatură controlată în timp ce era introdus în bioreactor. Odată ce în bioreactor s-a atins o concentrație de diacetil total a stării pseudo-stabile, s-au adăugat 72 pg/l (108 ADU/I) de ALDC la mustul din interiorul vasului de 20 I. încărcarea inițială de biomasă din sferele de gel din the kappa-caragenină a fost 3x10⁷ celule/ml de gel.

Experimentul 2. Pentru a minimiza riscul decontaminare, sistemul a fost închis în buclă la evacuare și s-au făcut de asemenea alte actualizări ale sistemului așa cum s-a descris în Capitolul 4. Ca și în Experimentul 1, mustul a fost colectat din fabrica de bere într-un vas de 20 I din oțel inoxidabil, și autoclavizat timp de, 45 min la 100°C. în timpul alimentării bioreactorului, mustul a fost menținut la 2°C într-o baie de apă cu temperatură controlată. încărcarea inițială de biomasă din sferele de gel din kappa-caragenină a fost 3x10⁷ celule/ml de gel. Odată ce în bioreactor s-a atins concentrația de diacetil total a stării pseudo-stabile, s-au adăugat 72 pg/l (108 ADU/I) de ALDC la must din interiorul vasului de 20 I.

140

RO 122457 Β1

Experimentul 3. S-a colectat must de bere de 17,5° P neoxigenat (14 hi) într-un vas 1 mare de depozitare a mustului (T-1) din instalația pilot. Acesta a fost pasteurizat cu detentă și depozitat cu barbotaj de dioxid de carbon pentru a menține o concentrație constantă de 3 oxigen dizolvat <0,10 mg/l, așa cum s-a descris în Capitolul 5. Mustul a fost introdus în bioreactor din acest rezervor până când s-a atins o concentrație de diacetil total a stării 5 pseudo-stabile. Apoi s-a adăugat aseptic ALDC (72 pg/l) la must pentru restul încercării. Adiția de ALDC a fost realizată prin măsurarea cantității de must rămas în vasul de depozitare și 7 calcularea cantității de ALDC necesară pentru aducerea concentrației de enzimă până la concentrația țintă de 72 pg/l (108 ADU/I). Cantitatea adecvată de enzimă a fost apoi dizolvată 9 în 10 I de must steril. Această soluție a fost transferată într-un vas de presiune din oțel inoxidabil de 201, care a fost conectat printr-o tubulatură sterilă la orificiul de eșantionare de 11 pe vasul de colectare (T-1). Soluția de ALDC a fost apoi împinsă utilizând presiune de dioxid de carbon steril, în vasul de colectare a mustului. Pentru a asigura că soluția de ALDC a fost 13 amestecată adecvat cu mustul din vasul de colectare, debitul de dioxid de carbon barbotat în rezervor a fost crescut la 4720 ml/min. la STP timp de 1 oră și apoi readus la debitul său 15 normal. Rezervorul de depozitare a conținut atunci suficient must dozat cu ALDC pentru încheierea încercării. încărcarea inițială cu biomasă din sferele de gel din kappa-caragenină 17 a fost 10⁸ celule/ml de gel.

7.2 Rezultate și discuție 19

7.2.1 Efectul cantităților relative de aer din gazul de fluidizare al bioreactorului asupra metaboliților drojdiei în timpul fermentației primare continue a berii 21 în fig. 7.2-7.11 sunt reprezentate grafic viabilitatea și concentrația celulelor din faza lichidă, concentrațiile de azot amino liber (FAN), carbohidrat fermentabil total (ca glucoză), 23 etanol, diacetil total, acetaldehidă, acetat de etil, 1-propanol, izobutanol, acetat de izoamil, alcool izoamilic, hexanoat de etil, și octanoat de etil față de timpul de fermentație. Toate con- 25 dițiile de exploatare a bioreactorului au fost menținute constante pe parcursul protocolului în afară de procentul de aer din gazul de barbotaj al bioreactorului, care este marcat direct 27 pe figuri. în Tabelul 7.2 sunt rezumate mediile pentru fiecare analit la starea pseudo-stabilă (după un minimum de trei timpi de tranzit). 29

Tabelul 7.12.

Tabelul cu rezumatul efectului debitului volumetric de aer din bioreactor prin 31 barbotor asupra drojdiei în față lichidă și concentrațiile metaboliților de drojdie cheie din bioreactor la un timp de rezidență, R_t de 1,18 zile, 33 medii la starea pseudo-stabilă

	Debitul vo	lumetric de aer	(ml/min.)	35
Concentrația medie* de analit	94	354	34
Concentrația celulară (celule/ml)	3,87 E+08	2,98 E+08	4,73 E+08	37
Glucoza totală fermentabilă (g/100 ml)	1,36	1,25	2,07
FAN (mg/l)	196,9	171,7	162,8	39
Etanol (g/100 ml)	6,14	5,46	5,74
Diacetil total (ug/l)	346	1417	389	41
Acetaldehidă (mg/l)	75,62	329,48	28,63
Acetat de etil (mg/l)	22,38	21,13	18,01	43
1-propanol (mg/l)	44,74	50,89	53,04
Izobutanol (mg/l)	8,73	16,09	8,05	45
Acetat de izoamil (mg/l)	0,38	0,21	0,30
Alcool izoamilic (mg/l)	58,62	61,64	59,16	47
Hexanoat de etil (mg/l)	0,060	0,030	0,053
Octanoat de etil (mg/l)	0,031	0,013	0,025	49

* media celor patru zile finale ale fiecărei condiții de exploatare

141

RO 122457 Β1

Fig. 7.2 și 7.3 arată că populația de drojdie din faza lichidă nu a ajuns la zero în timpul acestui experiment. Compușii de aromă care au fost studiați în această lucrare au fost produși de o combinație de celule de drojdie libere și imobilizate și nu s-au determinat contribuțiile relative din fiecare sursă. A exista mai mult de o sursă de celule de drojdie suspendate liber în această lucrare: creșterea biomasei și celulele care au fost eliberate din sferele de gel în mediul lichid în vrac. Cercetarea cu modele de compuși ai eliberării și creșterii de celule a arătat că atunci când celulele sunt eliminate din biofilme, chiar dacă bioreactorul este exploatat la viteze de diluție ridicate, tot va exista o populație de celule în lichidul de evacuare (Karamanev, 1991).

Timpul de fermentație continui (zile)

Fig. 7.2. Concentrația celulelor de drojdie din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul gazului a fost dioxid de carbon iar debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul acestui experiment.

3 ·0ιΐ»Ϊ3Χ)«4β«ΐ5056»««

Timpul dc fermentație continuă (zile)

Fig. 7.3. Viabilitatea drojdiei din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

142

RO 122457 Β1 în fig. 7.4 a fost urmărită concentrația fazei lichide a azotului amino liber (FAN). A fost interesant de remarcat că, concentrațiile minime de FAN au survenit la 34 ml/min. la STP de aer. Aceasta nu a coincis cu concentrația maximă de etanol sau concentrațiile minime ale carbohidratului total fermentabil (ca glucoză). Concentrația de etanol din faza lichidă a bioreactorului a scăzut în timp ce carbohidratui total fermentabil (ca glucoză) a crescut când debitul volumetric al aerului din gazul de barbotare a fost crescut de la 94 la 354 ml/min., așa cum se vede în fig. 7.5. Aceasta poate indica că a survenit mai multă respirație celulară, opusă fermentației, datorită creșterii disponibilității oxigenului. Când debitul volumetric a fost redus din nou de la 354 ml/min. la 34 ml/min. la STP, concentrația de etanol a crescut din nou, totuși nu a atins concentrația văzută atunci când debitul a fost la 94 ml/min. la STP. Este dificil de comparat în termeni preciși concentrațiile de etanol la 34 ml/min. cu cele la 94 ml/min. la STP, deoarece au existat alți factori care au influențat sistemul, rezultând din maturarea celulară, efecte ale expunerii continue la cantități relativ ridicate de oxigen pentru momentul de la 354 ml/min. la STP, și schimbări ale populației de celule imobilizate. în Figura 2.4, White și Portno (1978) au remarcat schimbări ale concentrațiilor metabolitului de aromă din drojdie cu timpul de fermentație continuă în linul lor de fermentare tip coloană.

î

Timpul de fermentație continui (zile)

Fig. 7.4. Concentrația azotului amino liber rămas în must față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

143

RO 122457 Β1

Timpul de fcrmcuUlie continuă (zile)

Fig. 7.5. Concentrația de etanol din faza lichidă și carbohidratfermentabil total (ca glucoză) față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

în fig. 7.6, se vede efectul pronunțat al oxigenului asupra producției de diacetil total. Deoarece diacetilul este considerat în general un compus de aromă nedorit în bere, unul dintre motivele principale ale optimizării cantității de oxigen din bioreactor este de a controla nivelurile acestui compus de aromă. După faza de aer de 354 ml/min., debitul a fost scăzut la 34 ml/min. la STP și diacetil total a scăzut. în timpul fermentației în șarje, este cunoscut că oxigenul crescut duce la o creștere a formării de alfa-acetolactat, precursorul diacetilului (Kunze, 1996).

în fig. 7.7 a apărut o relație clară între cantitatea de aer din gazul de barbotare și concentrația de acetaldehidă. Pe măsură ce procentul de aer din gazul de barbotare a crescut, a crescut de asemenea cantitatea de acetaldehidă. Acetaldehida conferă berii un caracter de măr verde, și este prezentă în mod normal în berea comercială la nivele mai mici de 20 mg/l.

144

RO 122457 Β1

9 10!Î30»S3»«e50S5a09S70

Timpul dc fermentație continui (zilei

Fig. 7.6. Concentrația de diacetil total din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

9 ·0'9»ΐ5»»«0«»»55β0*9ηΐ

Timpul de fermentație continui (zile)

Fig. 7.7. Concentrația acetaldehidei din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

în Tabelul 7.2 și fig. 7.8-7.9 sunt date concentrațiile stării pseudo-stabile de acetat 43 de etil, acetat de izoamil, hexanoat de etil, și octanoat de etil față de timpul de fermentație continuă. Pentru toți esterii măsurați, schimbarea în trepte a vitezei de aerare de la 94 la 45 354 ml/min. la STP a avut ca rezultat o scădere a concentrației. Când viteza de aerare a fost scăzută de la 354 ml/min. la 34 ml/min. la STP, concentrația de acetat de izoamil, hexanoat 47 de etil, și octanoat de etil a crescut. Cu toate acestea, nu au crescut la valorile văzute la viteza de aerare de 94 ml/min. Tiparul de răspuns al acestor compuși s-a potrivit foarte bine unul 49 cu celălalt, hexanoatul de etil și octanoatul de etil arătând mai multe fluctuații relative decât

145

RO 122457 Β1 acetatul de izoamil. Concentrația de acetat de etil a scăzut de fapt mai mult când debitul volumetric de aer a fost redus la 34 ml/min. la STP. Pentru toți esterii măsurațiîn acest studiu, concentrația a arătat o creștere când aerul a fost eliminat complet din gazul de fluidizare. Concentrația fiecărui ester a crescut și apoi s-a modificat ușor, pe măsură ce concentrația celulelor din faza lichidă a scăzut rapid în bioreactor.

O 5 10 ’S » î» 36 » «0 «S » »S »0 M 70

Timpul tk fcrmcntițic conținu* (?îk)

Fig. 7.8. Concentrația de acetat de etil față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

a

Timpul de fermentație continuă (zile)

Fig. 7.9. Concentrațiile de acetat de izoamil, hexanoat de etil și octanoat de etil din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 mi/min. la STP pe parcursul experimentului.

146

RO 122457 Β1

Alcoolii superiori alcool izoamilic, izobutanol și 1 -propanol față de timpul relativ de fermentație sunt dați în fig. 7.10 și 7.11. Pentru alcoolii măsurați, concentrația a crescut ca rezultat al creșterii schimbării în trepte a aerării de la 94 la 354 ml/min. la STP. Izobutanolul a arătat cele mai mari fluctuații relative atunci când s-a schimbat viteza de aerare. Concentrațiile de 1-propanol au fost cu toate acestea mult sub valorile de prag ale aromei de 600-800 mg/l, totuși, pe parcursul experimentului de fermentație continuă, concentrația a fost cu mult deasupra celei găsite în berile tipice comerciale produse în șarje, unde concentrațiile sunt uzual sub 16 mg/l. Acesta nu a fost cazul pentru alcool izoamilic sau izobutanol, care au fost în limite normale. Se crede că compusul 1-propanol apare din reducerea propionatului acid (Gee și Ramirez, 1994). Alții (Hough și colab., 1982; Yamauchi și colab., 1995) au legat de asemenea formarea de 1 -propanol de metabolismul aminoacizilor α-aminobutiric și treonină, cu oxo-acidul și aldehida corespunzătoare fiind acid α-oxobutiric și respectiv propionaldehidă.

Fig. 7.10. Concentrațiile de alcool izoamilic și izobutanol din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

147

RO 122457 Β1

5 10 «5 » » 30 Μ « « se S5 60 O» 70

Timpul de fermentație continui (zile.

Fig. 7.11. Concentrația de 1-propanol din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă. Debitul volumetric de aer la STP furnizat bioreactorului prin barbotor este indicat pe grafic. Restul de gaz a fost dioxid de carbon și debitul volumetric total de gaz a fost constant la 472 ml/min. la STP pe parcursul experimentului.

Deoarece diacetilul, acetaldehida și alcooli de fuzel în exces sunt nedoriți în bere, controlul oxigenului pentru limitarea producerii acestora este important. Așa cum s-a discutat în trecerile în revistă din literatură, atunci când se crește furnizarea de oxigen celulelor de drojdie, există o formare anabolică îmbunătățită de precursori de aminoacid și astfel o deversare de alcooli superiori, oxo-acizi, și diacetil. Este cunoscut faptul că concentrația de esteri scade cu o creștere a disponibilității oxigenului deoarece formarea de esteri este catalizată de acetil transferază. Acetil transferaza este inhibată de acizii grași nesaturați și ergosterol, care la rândul lor vor crește în prezența oxigenului (Norton și DAmore, 1994).

Pentru condițiile de bioreactor utilizate în acest experiment, concentrațiile de oxigen dizolvat ale stării pseudo-stabile (după un minimum de trei timpi de tranzit ai reactorului) măsurate în faza lichidă a bioreactorului au fost apropiate de zero (mai puțin de 0,03 mg/l).

Acest experiment nu a permis o comparație directă a datelor de la 94 ml/min. și 34 ml/min. de aer la STP în gazul de fluidizare, deoarece au fost separate de cel mai mare debit de aer (354 ml/min). Aceasta este din cauză că starea fiziologică a drojdiei rezultată din expunerea la condițiile anterioare de bioreactor, matricea de imobilizare și timpul de fermentație continuă pot provoca de asemenea alte schimbări în producția de aromă.

în bioreactor nu s-a detectat nici o contaminare în niciun punct pe parcursul acestui experiment. Pentru a echilibra cerința drojdiei pentru câtva oxigen, pentru a menține viabilitatea drojdiei și nevoia de a minimiza oxigenul pentru a obține o bere cu un profil de aromă dorit, pot fi explorate alte strategii cum ar fi adiția de elemente nutritive cum ar fi zinc, magneziu, sau furnizarea de alți compuși exogeni ceruți de celulele de drojdie pentru menținerea viabilității. Asemenea adiții permit o scădere suplimentară a cerinței de oxigen a drojdiei. O altă posibilitate ar fi exploatarea la concentrații foarte scăzute de oxigen în majoritatea timpului, cu impulsuri periodice regulate de oxigen furnizat drojdiei, pentru menținerea viabilității celulelor.

148

RO 122457 Β1

7.2.2 Perioada de menținere în șarje post fermentație: efectele expunerii la oxigen asupra metaboliților drojdiei

Deoarece diacetilul total nu a fost în limite normale pentru o bere comercială la sfârșitul fermentației primare, au fost urmate mai multe abordări pentru reducerea concentrației acestui compus la niveluri acceptabile. O asemenea abordare a fost utilizarea unei perioade de menținere la cald imediat după fermentația primară continuă.

în fig. 7.12-7.21, sunt reprezentate grafic concentrațiile de carbohidrat fermentabil total (ca glucoză), etanol, diacetil total, acetaldehidă, acetat de etil, 1-propanol, izobutanol, acetat de izoamil, alcool izoamilic, și hexanoat de etil din faza lichidă față de timpul de menținere post fermentație. Eșantioanele colectate din linul de fermentare primară continuă în starea pseudo-stabilă au fost menținute în condiții aerobe sau anaerobe, așa cum s-a indicat în legenda fiecărei figuri.

în fig. 7.12, concentrația de carbohidrat fermentabil total (ca glucoză) a scăzut rapid în primele două h și apoi a scăzut cu o viteză mai mică pe restul perioadei de menținere atât în eșantioanele aerobe cât și în cele anaerobe. Motive posibile pentru această observație au fost că în timpul primelor două ore, a fost prezentă mai multă drojdie înainte de decantare, și concentrația de zaharuri a fost mai ridicată la începutul perioadei de menținere. Nu au existat diferențe semnificative în preluarea de glucoză fermentabilă între eșantioanele aerobe și cele anaerobe, deși s-au remarcat unele diferențe inițial.

Concentrația de etanol din fig. 7.13a crescut rapid la începutul perioadei de menținere și apoi, eșantioanele anaerobe și cele aerobe au crescut în concentrația de etanol în timp, într-un mod aproape paralel. Creșterea inițială de etanol pentru eșantionul anaerob a coincis cu perioada unde a survenit cea mai mare absorbție de zahăr. La sfârșitul perioadei de menținere, concentrația de etanol a fost mai mare în eșantioanele tratate anaerob.

Perioada de timp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.12. Concentrația medie de glucoză fermentabilă față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

149

RO 122457 Β1

Perioada de timp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.13. Concentrația medie de etanol față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

în fig. 7.14, eșantioanele aerobe au arătat o creștere incipientă a acetaldehidei la expunerea la condiții aerobeîn afara bioreactorului. Combinația de condiții aerobe, cu consum de zahăr și producere de etanol, poate fi responsabilă pentru acest rezultat. Până la sfârșitul perioadei de menținere de 48 h, concentrația acetaldehidei scăzuse de la 17 mg/l la 9 mg/l în eșantionul anaerob, care aduce concentrația lichidului în specificațiile pentru o bere lager Nord Americană de calitate (mai puțin de 10 mg/l).

Concentrația de diacetil total față de timpul de menținere este dată în fig. 7.15. rezultatele arată că eliminarea de oxigen din sistem în timpul acestei perioade de menținere furnizează condiții mai favorabile pentru reducerea diacetilului. Forma curbei diacetilului total poate fi legată de epuizarea azotului amino liber și producerea intracelulară ulterioară de valină, din care diacetilul este un produs secundar (Nakatani și colab., 1984a; Nakatani și colab., 1984b). Concentrația diacetilului total la sfârșitul fermentației continue primare a fost 326 pg/l și la sfârșitul perioadei de menținere anaerobe a fost la o concentrație de 33 pg/l, care este cu mult sub pragul de gust din berile comerciale.

Perioada de timp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.14. Concentrația medie de acetaldehidă față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

150

RO 122457 Β1

Perioada de timpde menținere post fermentație (h)

Fig. 7.15. Concentrația medie de diacetil total față de timpul de menținere post 15 fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele 17 superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

în fig. 7.16-7.18, sunt reprezentate grafic concentrațiile de esteri acetat de etil, acetat de izoamil, și hexanoat de etil față de timpul de menținere post fermentație. Pentru toți esterii 21 s-au observat același tipar pentru eșantioanele aerobe și anaerobe. Concentrația de esteri nu s-a deosebit între eșantioanele anaerobe și aerobe până târziu în perioada de menținere, 23 unde concentrația esterilor din eșantioanele aerobe a scăzut și concentrația din eșantioanele anaerobe a crescut. Deoarece concentrația de esteri din fermentațiile continue este întrucâtva 25

I I redusă comparativ cu concentrațiile de ester găsite în berea comercială, este de dorit să se selecteze condiții, care favorizează producerea de ester. 27

Perioada dc Itmp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.16. Concentrația medie de acetat de etil față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară 43 continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2). 45

151

RO 122457 Β1

Perioada de timp de menținere posi fermentație (h)

Fig. 7.17. Concentrația medie de acetat de izoamil față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

Perioada de timp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.18. Concentrația medie de hexanoat de etil față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

Fig. 7.19-7.21 arată concentrațiile de alcool izoamilic, 1-propanol, și izobutanol față de timpul de menținere post fermentație. La sfârșitul perioadei de menținere de 48 h, nu au fost remarcate diferențe semnificative la acești alcooli între tratamentele aerobe și anaerobe. Cu toate acestea, eșantioanele de 24 h au arătat o concentrație mai mare în toate cazurile pentru tratamente aerobe.

152

RO 122457 Β1

Perioada de timp de menținere post fermentație (h)

Fig. 7.19. Concentrația medie de alcool izoamilic față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

Perioada Je timp de menținere post fermentație (hl

Fig. 7.20. Concentrația medie de 1-propanol față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

Perioada de timp de mențirere post fermentație <h)

Fig. 7.21. Concentrația medie de izobutanol față de timpul de menținere post fermentație pentru eșantioanele tratate aerob și anaerob după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Barele de eroare reprezintă limitele superioare și inferioare ale datelor experimentale (n=2).

153

RO 122457 Β1 în fig. 7.22, se dă un grafic radar pentru a permite comparația unui număr dintre compușii de aromă după perioada de menținere aerobă și anaerobă de 48 h cu un profil al unei beri comerciale. Graficele radar sunt utilizate în mod obișnuit în industria de fabricare a berii pentru a permite examinarea și compararea laolaltă a unei varietăți de caracteristici diferite ale berii, pe un singur grafic (Sharpe, 1988). Din această figură, se poate vedea că berea fermentată continuu menținută anaerob este potrivirea cea mai apropiată față de o bere comercială tipică. Din Anexa 6, se poate vedea că lichidul anaerob a fost în domenii normale pentru o bere comercială, în afară de cazul 1 -propanolului, care a fost semnificativ mai mare decât berile fermentate în șarje. Acest nivel mai mare decât normal de 1-propanol a fost observat în toate produsele fermentate continuu, din această lucrare.

Formarea de 1-propanol a survenit în timpul etapei de fermentație primară continuă și nu a scăzut semnificativ în timpul perioadei de menținere, indiferent de condițiile aerobe sau anaerobe. Kunze (1996) afirmă că următorii factori vor crește alcoolii superiori cum ar fi 1-propanol în timpul fermentației în șarje: amestecarea, aerarea intensivă a mustului, și adiția repetată de must proaspăt la drojdia existentă.

în final, scenariul ideal arfi eliminarea în întregime a celei de-a doua perioade de menținere prin optimizarea condițiilor din bioreactorul continuu primar. Cu toate acestea, câștiguri suplimentare se mai pot obține utilizând perioada de menținere, prin optimizarea temperaturii de menținere (eliminarea diacetilului prin drojdie este foarte dependentă de temperatură), cantitatea de zaharuri fermentabile rămasă în lichid la începutul perioadei de menținere, optimizarea concentrației drojdiei prezente, caracteristicile hidrodinamice ale vasului de menținere (eliminarea diacetilului poate fi îmbunătățită prin îmbunătățirea contactului dintre drojdie și bere), și luarea de măsuri suplimentare pentru eliminarea oxigenului din această etapă.

Calculele productivității volumetrice de bere sunt date în Anexa 3. Procedeul descris în această secțiune, cu un bioreactor continuu funcționând cu un timp de rezidență de 24 h urmate de o menținere în șarje de 48 h, este de 1,8 ori mai productiv decât un procedeu industrial în șarje curent. Un procedeu industrial în șarje relativ rapid cu un timp de tranzit de 7,5 zile are o productivitate volumetrică de bere de 0,093 m³ bere produsă/(m³ volum vas x zi), în timp ce procedeul continuu descris aici are o productivitate de 0,165 m³ bere produsă/(m³ volum vas x zi). Dacă cercetarea suplimentară a permis scurtarea perioadei de menținere în șarje la 24 h, productivitatea de bere ar deveni de 2,3 ori mai productivă decât etalonul industrial în șarje. Dacă s-ar realiza scenariul ideal al unui procedeu continuu de 24 h fără menținere în șarje, productivitatea volumetrică de bere ar deveni de 7,5 ori cea a etalonului în șarje. în plus față de productivitatea volumetrică crescută, beneficiile suplimentare realizate prin trecerea de la un procedeu în șarje la un procedeu continuu, cum arfi un timp mai scurt până la scoaterea pe piață, scădere a dimensiunii fabricii de bere, și propagarea mai puțin frecventă a drojdiei, trebuie echilibrate cu o analiză atentă a costurilor relative de exploatare.

Alți cercetători (Kronlof și Virkajărvi, 1996; Nakanishi și colab., 1993; Yamauchi și colab., 1995) s-au concentrat pe dezvoltarea de fermentații continue multi-etapă în care prima etapă de fermentație continuă (aerobă) are ca rezultat doar un consum parțial al zaharurilor fermentabile prezente în must. în timp ce această strategie a arătat un oarecare succes în termeni de producție de aromă, aceste sisteme sunt complexe. De asemenea, prima etapă aerobă a unor asemenea sisteme creează un mediu, care este mai susceptibil la contaminare microbiană (adică concentrație mai mare de zaharuri, temperatură, și oxigen, cu concentrații reduse de etanol). în sistemul cu bioreactor cu injecție de gaze prezentat în această lucrare, bioreactorul are o concentrație redusă de zahăr fermentabil, pH redus, concentrație ridicată de etanol, și concentrații reduse de oxigen, făcând mediul inospitalier pentru potențialii contaminați.

154

RO 122457 Β1

• ·- Berc mcnfmui* «mb

.....O......Bere mcniKiull intern* —O— Bere εβηκτΐΜϋ

Fig. 7.22. Graficul radar al datelor concentrației normalizate obținute după 48 h de menținere aerobă sau anaerobă, după fermentația primară continuă într-un bioreactor cu injecție de gaze. Datele normalizate se bazează pe mediile eșantioanelor duplicat iar datele berii comerciale au fost luate ca mijlocul datelor listate în Anexa 6.

7.2.3 Efectul timpului de rezidență a lichidului asupra metaboliților cheie din drojdie 21 în timpul fermentației primare continue a berii

Fig. 7.23-7.28 arată rezultatele analitice obținute din faza lichidă a bioreactorului. în 23 Tabelul 7.3, sunt listate concentrațiile medii și debitele analiților măsurați în starea pseudostabilă (după un minimum de trei timpi de tranzit ai bioreactorului) la cei doi timpi de rezidență 25 a lichidului utilizați în timpul acestui experiment. în timp ce viabilitatea drojdiei din faza lichidă nu s-a schimbat semnificativ atunci când debitul de must către bioreactor a fost crescut, 27 concentrația celulelor de drojdie s-a schimbat așa cum se vede în fig. 7.23.

Tabelul 7.3. 29 (a) Tabelul rezumat al efectului timpului de rezidență în bioreactor asupra drojdiei în fază lichidă și concentrațiile metaboliților cheie din drojdie, medii la starea pseudo-stabilă; (b) Tabel 31 rezumat al efectului timpului de rezidență în bioreactor asupra drojdiei din faza lichidă și debitelor metaboliților cheie din drojdie la evacuarea bioreactorului, medii la starea pseudo-stabilă. 33

(a) Concentrația medie de analit	Timpul de rezidență în bioreactor	35
1,8 zile	0,9 zile
Concentrația celulară (celule/ml)	2,38 E+08	1,32 E+08
Glucoza totală fermentabilă (g/100 ml)	0,29	6,09	37
FAN (mg/l)	106,3	246,4
Etanol (g/100 ml)	5,16	4,80	39
Diacetil total (ug/l)	292	460
Acetaldehidă (mg/l)	19,47	37,07	41
Acetat de etil (mg/l)	41,00	38,29
1-propanol (mg/l)	44,95	13,53	43
Izobutanol (mg/l)	22,78	9,13
Acetat de izoamil (mg/l)	0,90	1,28	45
Alcool izoamilic (mg/l)	76,67	51,39

155

RO 122457 Β1

Tabelul 7.3. (continuare)

(b) Debitul mediu de analit	Timpul de rezidență în bioreactor
1,8 zile	0,9 zile
Concentrația celulară (celule/min)	7,38 E+08	8,22 E+08
Glucoza totală fermentabilă (g/min)	8,93 E-03	3,72 E-01
FAN (g/min)	3,65 E-04	1,50 E-03
Etanol (g/min)	1,60 E-01	2,93 E-01
Diacetil total (g/min)	9,06 E-07	2,81 E-06
Acetaldehidă (g/min)	6,04 E-05	2,26 E-04
Acetat de etil (g/min)	1,27 E-04	2,34 E-04
1-propanol (g/min)	1,39 E-04	8,25 E-04
Izobutanol (g/min)	7,06 E-05	5,57 E-05
Acetat de izoamil (g/min)	2,80 E-06	7,30 E-06
Alcool izoamilic (g/min)	2,38 E-04	3,13 E-04

Timpul dc fermentație continui (zile)

Fig. 7.23. Concentrația celulelor de drojdie din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efectul timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. R, este timpul de rezidență a lichidului din bioreactor în zile.

în fig. 7.24 și 7.25, au crescut atât concentrația azotului amino liber (FAN) al substraturilor de must cât și carbohidratul fermentabil total (ca glucoză) când timpul de rezidență a lichidului a scăzut de la 1,8 la 0,9 zile. Din balanțele de masă din Tabelul 7.4, viteza de consum a carbohidratului fermentabil total (ca glucoză) a crescut în timp ce viteza de consum a azotului amino liber a scăzut, cu scăderea timpului de rezidență în bioreactor. Factorul de randament, Y_p/S, al produsului de fermentație etanol din substratul de glucoză fermentabil, a crescut de la 0,3 la 0,5 cu reducerea timpului de rezidență a lichidului. Deoarece sistemul a fost barbotat cu aer și dioxid de carbon, au existat probabil pierderi minore de etanol în faza gazoasă, care ar avea un impact asupra factorului de randament, Y_p/S, prin afectarea echilibrului etanolului. Cercetarea condusă în colaborarea cu Budac și Margaritis (1999) a demonstrat

156

RO 122457 Β1 calitativ, utilizând o tehnică de spectroscopie de masă-cromatografie cu gaz (GC-MS), că volatilele de aromă din bere, inclusiv etanol, acetaldehidă, acetat de etil, și acetat de izoamil sunt detectate în partea superioară a bioreactorului cu injecție de gaze în timpul fermentației continue.

Fig. 7.24. Concentrația de glucoză fermentabilă și etanol din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efectul timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. Rj este timpul de rezidență a lichidului în zile.

Fig. 7.25. Concentrația de 1 -propanol și azot amino liber din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efect al timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. R, este timpul de rezidență a lichidului în zile.

157

RO 122457 Β1

Tabelul 7.4

Balanțele de masă ale azotului amino liber și carbohidratul fermentabil total (ca glucoză) pe baza datelor medii din tabelul 7.3, efect al timpului de rezidență

Timp de rezidență	1,8 zile	0,9 zile	1,8 zile	0,9 zile
Azot amino liber (g/min.)	Glucoză fermentabilă totală (g/min.)
Admisie*	8,84 E-04	1,74 E-03	4,71 E-01	9,26 E-01
Evacuare	3,65 E-04	1,50 E-03	8,93 E-03	3,72 E-01
Consum (AS)	5,18 E-04	2,35 E-04	4,62 E-01	5,54 E-01
Factor de randament (YP/S)			0,3	0,5

* Concentrațiile de la admisie, din Anexa 1

Concentrația din faza lichidă a produsului de fermentație etanol a scăzut cu schimbarea în trepte a timpului de rezidență a lichidului. Cu toate acestea, sistemul ca un întreg a produs mai mult etanol pe baza unui debit masic la timpul de rezidență a lichidului mai scurt. Deoarece obiectivul acestei lucrări a fost nu numai producerea de produse etanol în izolare, ci mai degrabă o bere cu un echilibru din mai multe componente, maximizarea productivității de etanol trebuie echilibrată cu alți factori. La sfârșitul fermentației primare a unei beri comerciale, majoritatea substratului de glucoză fermentabilă trebuie consumat.

în fig. 7.26, este dat răspunsul concentrației de diacetil total și acetaldehidă, la schimbarea în trepte a debitului de must. Ambii analiți au crescut în concentrație și în viteza de producție atunci când a fost scăzut timpul de rezidență a lichidului. în timpul fermentațiilor în șarje ale berii, se excretă acetaldehidă de către drojdie în timpul primelor zi le de fermentație (Kunze, 1996).

Fig. 7.26. Concentrația de diacetil total și acetaldehidă din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efect al timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. R, este timpul de rezidență a lichidului în zile.

Fig. 7.25 și 7.27 arată efectul scăderii timpului de rezidență în bioreactor asupra concentrațiilor din faza lichidă a alcoolilor superiori 1-propanol, izobutanol și alcool izoamilic. Toți trei alcoolii superiori au scăzut în concentrație când s-a scăzut timpul de rezidență în bioreactor.

158

RO 122457 Β1

Fig. 7.27. Concentrația de izobutanol și alcool izoamilic din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efect al timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. Rf este timpul de rezidență a lichidului în zile.

Debitele masice de acetat de etil și acetat de izoamil date în Tabelul 7.3 (b) au crescut amândouă ca răspuns la scăderea timpului de rezidență a lichidului. în fig. 7.28 concentrația de acetat de etil din faza lichidă a scăzut în timp ce acetatul de izoamil a crescut. Deoarece acest experiment a permis o mărire a creșterii celulare din faza lichidă fără creșterea alimentării de oxigen a sistemului, condițiile din bioreactor au promovat producerea de ester. Hough și colab. (1982) afirmă că niște condiții de creștere mărită și oxigen scăzut încurajează formarea de ester.

Timpul tfe fermentație continui (zile)

Fig. 7.28. Concentrația de acetat de etil și acetat de izoamil din faza lichidă față de timpul relativ de fermentație continuă, efect al timpului de rezidență a lichidului din bioreactor. Rf este timpul de rezidență a lichidului în zile.

159

RO 122457 Β1

7.2.4 Utilizarea unui preparat comercial de alfa-acetolactat decarboxilază pentru reducerea diacetilului total în timpul fermentației primare continue a berii

Experimentul 1: Bioreactorul a fost contaminat cu coci Gram pozitivi cu creștere aerobă înainte ca încercarea să poată fi terminată. S-a determinat că bioreactorul însuși a fost contaminat, deoarece testarea microbiologică a alimentării cu must nu a arătat nici o contaminare. Acest lucru a indicat nevoia de actualizare a bioreactoarelor cu garanții îmbunătățite împotriva contaminării. Cu toate acestea, înainte de închiderea sistemului, s-a observat o scădere a concentrației de diacetil total când s-a adăugat ALDC la alimentarea cu must. Din nefericire, nu a fost posibil să se tragă nici o concluzie din aceste date datorită efectelor care induc în eroare ale contaminări bioreactorului.

Experimentul 2: Ca rezultat al actualizărilor numeroase ale bioreactorului, sistemul a fost exploatat fără contaminare pe întreaga durată a Experimentului 2. Datele pentru acest experiment sunt date în Fig. 7.29-7.31. în Tabelul 7.5 sunt rezumate concentrațiile medii ale stării pseudo-stabile a diacetilului total înainte și după adiția de ALDC la must. Concentrația de diacetil total a scăzut cu 47% la adiția de ALDC la must, ceea ce face utilizarea acestei enzime promițătoare pentru viitor (medii preluate după trei timpi de tranzit de bioreactor). Așa cum se vede în fig. 7.30 și 7.31, concentrațiile celulare și de carbohidrat fermentabil total (ca glucoză) s-au deplasat ușorîn timpul acestei încercări, putând fi cauzate de ușoare diferențe de must, furnizat bioreactorului înainte și după adiția de ALDC.

Ot 400 3L

.3 200

δ

U

• Adiție de

»00 ISO 200 25

Timpul dc fermentație continua (h)

Fig. 7.29. Concentrația de diacetil total din faza lichidă față de timpul de fermentație continuă, efect al aditiei de ALDC la mediul de fermentație din must, » ’ J J ⁹

Experimentul 2.

160

RO 122457 Β1 £

Έο a

• 1	î ί î j a · · · ί·”	a ·
» »» **	i_. ! Adiție de j ALDC 5-► i ί *
	A* *a * . * \ S	* A
	1 ......... ......„	A

a trenul

A CrhKOL* felBMWWbtU o 50 toc 5» K» 3»

Timpul do fermentație continui (h>

Fig. 7.30. Concentrația de carbohidrat fermentabil total (ca glucoză) și etanol față de timpul de fermentație continuă, efect al adiției de ALDC la mediul de fermentație din must, Experimentul 2.

Timpul de fermentație continui (h)

Fig. 7.31. Concentrația celulară din faza lichidă față de timpul de fermentație continuă, efect al adiției de ALDC la mediul de fermentație din must, Experimentul 2.

Pentru a elimina efectul potențial care induce în eroare al variabilității mustului, în timpul 41

Experimentului 3 s-a colectat o cantitate mare de must din fabrica de bere (14 hl) și s-a adăugat ALDC direct la mustul rămas în acest vas de colectare, odată ce s-a atins o stare pseudo- 43 stabilă de referință. Acest lucru a eliminat suplimentar orice inconsecvențe potențiale ale mustului care ar fi putut afecta performanța fermentației din Experimentul 2. Acest vas de 45 depozitare a mustului a fost de asemenea echipat cu barbotaj de dioxid de carbon, astfel încât nivelurile de oxigen dizolvat din alimentarea cu must au fost menținute la un nivel redus 47 corespunzător.

161

RO 122457 Β1

Experimentul 3. Fig. 7.32-7.34 ilustrează efectul adiției de ALDC la alimentarea cu must, asupra concentrației de diacetil total, carbohidrat fermentabil total (ca glucoză), etanol, și concentrației de celule suspendate liber în timpul fermentației continue a berii. Tabelul 7.6 dă de asemenea concentrația medie de diacetil total a stării pseudo-stabile înainte și după adiția de ALDC la alimentarea cu must (mediile luate după trei timpi de turnover ai bioreactorului). Nu s-a detectat nici o contaminare în nici un punct în timpul acestui experiment. Concentrația de diacetil total a fost redusă cu 45% la adiția de ALDC. Nu s-au observat diferențe semnificative la concentrațiile de etanol, carbohidrat fermentabil total (ca glucoză) sau celule suspendate liber, ceea ce este în acord cu descoperirile de la șarje ale lui Aschengreen și Jepsen (1992).

» ț-^!----!----— ♦ l ♦

♦ * !

j

f t ♦ ! * * ♦ ț

| • Adiție de | ALDC o so ton «aa aoo 2S0 309 350

Timpul de fermentație continuă (h)

Fig. 7.32. Concentrația de diacetil total din faza lichidă față de timpul de fermentație continuă, efect al adiției de ALDC asupra mediului de fermentație din must, Experimentul 3.

Fig. 7.33. Concentrația de etanol și zahăr fermentabil total (ca glucoză) din faza lichidă față de timpul de fermentație continuă, efect al adiției de ALDC asupra mediului de fermentație din must, Experimentul 3.

162

RO 122457 Β1 tmt»u *obc*w , ,Οββ·Ι »oee«·

i «a v & O v

1OCC-0T ieee»a· tcac«e» μκ*»4μ iooe»e» îoae-or «,οκ»βι ioae*M i

» '' » i

t Adiție de < ALDC

I «0 100 t» K» 290 300 3»

Timpul de fermentație continuă (h)

Fig. 7.34. Concentrația celulară din faza lichidă față de timpul de fermentație continuă, efect al adiției de ALDC asupra mediului de fermentație din must, Experimentul

3.

Rezultatele Experimentelor 2 și 3 indică faptul că ALDC a avut un efect semnificativ asupra concentrației de diacetil total în timpul fermentației continue într-un bioreactor cu injecție de gaze dând o reducere medie a concentrației de diacetil total de 46%. Aceasta are potențial să scadă, sau să elimine prelucrarea secundară pentru reducerea de diacetil în sistemele continue cu injecție de gaze. Pentru aceste experimente inițiale s-a utilizat o dozare relativ mare de ALDC, și arfi necesar să se optimizeze cantitatea, metoda și timpul de dozare ALDC, în must, dacă pentru procedeu se alege această enzimă. Pot fi realizate economii suplimentare dacă o enzimă devine disponibilă, cu niveluri ridicate de activitate în condiții de fermentației a berii sau dacă enzima însăși a fost imobilizată, permițând astfel reutilizarea acesteia (Dulieu și colab., 1996). O altă considerație va fi acceptarea publică a aditivilor enzimatici care au fost produși utilizând organisme modificate genetic.

La recomandarea furnizorului, dozarea de 2 kg/1000 hl, și, cu costul preparatului din enzimă comercială la $131,05/kg, se vor adăuga $0,26/hl la costurile materiale de fermentație. Așa cum este utilizată în experimentele efectuate, dozarea de enzimă a fost 72 pg/l (108 ADU/I) sau 7,2 kg/1000 hl ALDC, dând un cost material adăugat de $0,94/hl. Economiile utilizării de ALDC pentru reducerea diacetilului în timpul fermentațiilor continue cu injecție de gaze vor depinde de dozarea optimă de enzimă în condițiile bioreactorului și cantitatea de timp economisit prin utilizarea acesteia.

Tabelul 7.5.

Rezumatul stării medii pseudo-stabile efect al adiției de ALDC la un mediu de fermentație din must asupra concentrației de diacetil total în timpul fermentației continue a berii într-un bioreactor cu injecție de gaze

	Concentrația medie a diacetilului total (pg/l)	Procent reducere diacetil
Experiment	(fără ALDC)	(ALDC, 60pl/l)
Experiment II	495	260	47
Experiment III	445	245	45

* mediile pe baza valorilor stării pseudo-stabile după trei timpi de turnover ai reactorului

163

RO 122457 Β1

Cele ce urmează susțin propunerea că fermentația continuă, utilizând drojdie imobilizată și celulele libere asociate, într-un sistem cu bioreactor cu țeavă de aspirație pentru injecție de gaze, este o alternativă viabilă la fermentația în șarje pentru producția de bere, pe baza criteriilor următoare:

- potrivirea de aromă realizată

- productivitate volumetrică mai ridicată a bioreactorului

- complexitate minimă

- exploatare continuă pe termen lung demonstrată

- controlul aerului (oxigen) din gazul de fluidizare pentru controlul aromei

- adiția de enzimă α-acetolactat decarboxilază pentru controlul diacetilului ca opțiune

- fără contaminare bacteriană

- beneficii financiare.

Există încă multe zone, care necesită să fie studiate suplimentar, dar tehnologia este gata de a fi testată la o scară mai mare. Bioreactoarele cu injecție de gaze sunt utilizate deja la o scară industrială pentru tratarea apelor uzate, care face prospectul scalării sistemului de fermentație continuă a berii fezabil din punct de vedere tehnic. Fabrica de bere Grolsch din Țările de Jos a raportat utilizarea unui bioreactor cu injecție de gaze de 230 m³ pentru tratamentul apelor uzate ale acesteia (Driessen și colab., 1997). Una dintre cele mai mari bariere către fermentația continuă la scară comercială în industria fabricării berii poate fi acceptarea de către producătorii de bere a unui nou procedeu, într-o industrie care este adânc ancorată în tradiție.

Datele colectate despre metaboliții secundari ai drojdiei produși în timpul fermentațiilor continue ale berii conduse în această lucrare au subliniat importanța controlului oxigenului din gazul de fluidizare pentru formarea aromei berii. Descoperirile au arătat că în condițiile date de exploatare, aerul crescut din gazul de fluidizare din bioreactor a provocat o creștere a acetaldehidei, diacetilului, și alcoolilor superiori (alcool izoamilic și izobutanol), în timp ce concentrațiile de esteri (acetat de izoamil, hexanoat de etil, octanoat de etil) și etanol s-au redus. Aceste date sugerează că există potențial pentru controlul aromei berii prin compoziția gazului de fluidizare a bioreactorului, permițând producerea de produse unice.

Cu excepția situației în care aerul a fost eliminat din gazul de fluidizare, în faza lichidă din bioreactor s-a menținut o concentrație a celulelor suspendate liber mai mare de 10⁸ celule/ml. Astfel, sistemul are mai mult de o populație de celule de drojdie coexistând în bioreactor, drojdia imobilizată și drojdia suspendată în faza lichidă. Din cauza cantităților mari de drojdie viabilă care crește în faza lichidă din bioreactor, există posibilitatea de utilizare a bioreactorului continuu ca propagator de drojdie. Atunci când după fermentația primară continuă s-a adăugat o perioadă secundară de 48 h de menținere în șarje, s-a obținut un profil de aromă în domeniul berilor comerciale. Temperatura acestei perioade de menținere a fost 21 °C și importanța minimizării expunerii lichidului la oxigen în timpul perioadei de menținere pentru formarea aromei a fost demonstrată experimental. Adăugarea unei perioade de menținere adaugă două zile la procedeu cât și complexitate adițională, cu toate acestea este totuși încă mai rapid decâtfermentațiile comerciale în șarje, care durează între șapte și paisprezece zile.

în final, scenariul ideal arfi eliminarea în întregime a perioadei secundare de menținere prin optimizarea condițiilor din bioreactorul continuu primar. Cu toate acestea, pot fi obținute reduceri suplimentare ale timpului de menținere secundară pe termen scurt, prin optimizarea temperaturii de menținere (eliminarea de diacetil prin drojdie este foarte dependentă de temperatură), cantitatea de zaharuri fermentabile rămasă în lichid la începutul perioadei de menținere, concentrația drojdiei prezente, caracteristicile hidrodinamice a vasului

164

RO 122457 Β1 de menținere (eliminarea de diacetil poate fi îmbunătățită prin îmbunătățirea contactului dintre 1 drojdie și bere), și prin luarea de măsuri suplimentare pentru eliminarea oxigenului din această etapă. 3

Alți cercetători (Kronlof și Virkajarvi, 1996, Nakanishi și colab., 1993; Yamauchi și colab.,

1995) s-au concentrat pe dezvoltarea de fermentații continue multi-etapă în care prima etapă 5 a fermentației continue (aerobă) are ca rezultat consumul doar parțial al zaharurilorfermentabile prezente în must. în timp ce această strategie a arătat ceva succes în termeni de producție 7 de aromă, aceste sisteme sunt complexe. De asemenea, prima etapă aerobă a unor asemenea sisteme creează un mediu, care este mai susceptibil la contaminarea microbiană (adică 9 concentrație ridicată de zaharuri, temperatură, și oxigen, cu concentrații reduse de etanol). în bioreactorul cu injecție de gaze prezentat în această lucrare, bioreactorul are o concentrație 11 redusă de zahăr fermentabil al stării stabile, pH redus, concentrație ridicată de etanol, și concentrații reduse de oxigen, făcând mediul inospitalier pentru contaminanții potențiali. într-o 13 fabrică de bere mai puțin dezvoltată, minimizarea complexității și dezvoltarea unui procedeu robust, rezistent la contaminare este un factor important de succes. 15

Adiția unui preparat comercial din alfa-acetolactat decarboxilază (ALDC) la mustul care alimentează fermentația continuă a arătat o reducere medie a diacetilului de 46%. Cu 17 toate acestea, deoarece ALDC este o enzimă care este produsă de un organism modificat genetic (GMO), există probleme legate de percepția publicului care trebuie adresate înainte 19 de utilizarea unei asemenea enzime într-un produs comercial. în plus, enzimele comerciale disponibile pentru controlul diacetilului nu au activitate optimă în condițiile de fermentație. 21

După șase luni de fermentație continuă utilizând imobilizare pe gel de kappa-caragenină, celule suspendate liber în faza lichidă au păstrat viabilități mai mari de 90%, în timp ce 23 viabilitatea celulelor imobilizate a scăzut la mai puțin de 60%. Microfotografiile baleierii cu electroni au evidențiat că celulele localizate aproape de periferia sferei din gel a avut multiple 25 cicatrici de înmugurire și o morfologie obișnuită, în timp ce acelea apropiate de miezul sferei au avut o formă neregulată și mai puține cicatrici de înmugurire, sugerând o creștere afectată. 27 Microfotografiile sugerează de asemenea că drojdia localizată în apropiere de miezul sferei a arătat semne de îmbătrânire. Așa cum s-a discutat în secțiunea 5, gelul de kappa-caragenină 29 are multe caracteristici care îl fac o matrice de imobilizare a drojdiei dorită. Cu toate acestea, nu există în mod curent o metodă industrială disponibilă pentru fabricarea sferelor și, deoarece 31 drojdia este înglobată în matrice ca parte a procedeului de realizare a sferelor, manipularea sferelor într-o instalație comercială crește complexitatea și costul. în viitor vortrebui explorate 33 alte metode de imobilizare cum ar fi autoagregarea sau flocularea. Aceasta va elimina complexitatea manipulării sferelor în mediul unei instalații, și, dacă flocoanele de drojdie au 35 fost rupte în mod regulat, se poate asigura eliminarea regulată a celulelor îmbătrânite din bioreactor. 37

Claims (15)

1. Revendicări 39

   1. Procedeu pentru producerea de alcooli potabili, în care se utilizează un bioreactor 41 cu injecție de gaze în care are loc o circulație internă pentru realizarea unei etape de fermentație continuă în care fermentează inițial un must conținând zaharuri fermentabile, prin folosirea 43 de celule de drojdie floculantă imobilizate prin auto-agregare, la o alimentare restricționată de oxigen și produsul evacuat cel puțin parțial fermentat din procedeul continuu este furnizat 45 într-o etapă de prelucrare în șarje, pentru finisare.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, în care respectivul alcool potabil este o bere. 47
3. 3. Procedeu conform revendicării 2, în care berea este o bere deschisă la culoare.

   165

   RO 122457 Β1
4. 4. Procedeu conform revendicării 3, în care berea menționată este o bere lager.
5. 5. Procedeu conform revendicării 1, în care berea menționată este o bere stil Nord Americană.
6. 6. Procedeu conform revendicării 1, în care drojdia menționată este o drojdie puternic floculantă sau o drojdie superfloculantă.
7. 7. Procedeu conform revendicării 1, în care fermentația menționată este o fermentație primară.
8. 8. Procedeu conform revendicării 1, în care mustul este purjat cu dioxid de carbon înainte de fermentație.
9. 9. Procedeu conform revendicării 1, în care reactorul utilizează un gaz de barbotare din dioxid de carbon conținând aproximativ 3% oxigen.
10. 10. Procedeu conform revendicării 1, în care încheierea fermentației primare este efectuată în etapa de menținere în șarje menționată.
11. 11. Procedeu conform revendicării 10, în care se realizează reducerea concentrației de diacetil.
12. 12. Procedeu conform revendicării 10, în care se realizează reducerea concentrației de acetaldehidă.
13. 13. Procedeu conform revendicării 10, în care concentrația de alcooli superiori din fuzel rămâne substanțial neafectată de etapa de prelucrare prin menținere în șarje.
14. 14. Procedeu conform revendicării 1, în care evacuarea din etapa de fermentație continuă este distribuită printr-un distribuitor la unele dintre o multitudine de vase de menținere în șarje în care are loc procedeul de menținere în șarje menționat.
15. 15. Procedeu conform revendicării 1, în care procedeul continuu menționat este un procedeu pentru inocularea fermentațiilor în șarje ulterioare din etapa de menținere în șarje.