HRP20040005A2

HRP20040005A2 - Combination continuous/batch fermentation processes

Info

Publication number: HRP20040005A2
Authority: HR
Inventors: Phyllis Heather Pilkington; Normand Anthony Mensour
Original assignee: Labatt Brewing Co Ltd
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2004-12-31
Also published as: CZ200455A3; RU2361908C2; DE60210451T2; CZ304820B6; JP2004532646A; BG66230B1; KR100910238B1; MXPA03011982A; RO122457B1; BR0210552A; WO2002102961A3; WO2002102961A2; SI21561A; CA2451330C; EP1397481B1; EP1397481A2; KR20040022430A; ATE322535T1; RU2004100827A; YU100503A

Description

Područje izuma

Ovaj izum odnosi se na proivodnju alkoholnih pića, posebno piva, konkretno upotrebom hibridnog procesa koji se sastoji od procesnih stadija kontinuirane i šaržne fermentacije.

Pozadina izuma

Znatan broj nedavno objavljenih publikacija iz ovog područja ilustrira velik interes pivarske industrije za imobilizaciju. U nekoliko preglednih članaka o općem stanju pivarske industrije (Enari, 1995; Iserentant, 1995; Masschelein, 1997; Mensour i sur., 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999), naglašena je moguća revolucionarna uloga imobilizacije u proizvodnji piva. Kao dodatak grupama spomenutim u sekcijama 3.1 do 3.5, brojne druge institucije bile su uključene u istraživanje i razvoj imobiliziranih stanica za primjenu u pivarstvu. Miller Brewing Company iz SAD-a (Duncombe i sur.., 1996; Tata i sur.., 1999) provela je nekoliko preliminarnih procjena na probnoj jedinici Meura Delta, kao i na bioreaktoru sa fluidiziranim slojem kojeg distribuira Schott Engineering. U Coors Brewing su također provedeni preliminarni eksperimenti se sistemom Meura Delta.

Na slovačkom tehničkom sveučilištu je, u suradnji sa Heineken-om, istraživana upotreba kalcij-pektatnog gela u proizvodnji piva u ‘air-lift’ sustavu (Domeny, 1996), a kasnije je grupa sa istog sveučilišta objavila još nekoliko radova o svojim tekućim istraživanjima (Smogrovicova i sur., 1997, Smogrovicova i Domeny, 1999). Guinness je prvotno istraživao upotrebu raznih adsorpcijskih nosača za imobilizaciju i kasniju fermentaciju u reaktoru sa fluidiziranim slojem (Donnelly, 1998), a 1999. god. Donnelly je zajedno sa svojim suradnicima objavio rad gdje je opisana kinetika metabolizma ugljikohidrata unutar jednog takvog bioreaktora. U tim su eksperimentima kao nosač za imobilizaciju kvasca gornjeg vrenja korištene porozne staklene kuglice od Sirana. Kasnije je Guinness postao dio konzorcija Immocon, što je opisano u sekciji 2.2.5.

Holsten Brauerei AG i Lurgi AG iz Njemačke zajednički su razvili i upravljali probnim postrojenjem za kontinuiranu proizvodnju bezalkoholnog piva (Dziondziak, 1995). U fermentaciji su korištene kuglice kalcijevog alginata smještene unutar jednofaznog fermentora sa fluidiziranim slojem (130L), za dealkoholizaciju piva korištena je kolona sa sitastim dnom (7 sitastih dna), a ukupno vrijeme trajanja procesa iznosilo je 8.5 sati.

Tim iz Sapporo Breweries Ltd. Brewing Research Laboratories iz Japana je istraživao upotrebu imobiliziranih stanica u reaktoru sa fluidiziranim slojem u glavnoj fermentaciji piva. Njihova se studija bazirala na korištenju gel kuglica od polivinilnog alkohola (Shindo & Kamimur, 1990), kalcijevog alginata (Shindo i sur., 1994a), hitozana (Shindo i sur., 1994c), te dvoslojnih gel vlakana, (Shindo i sur., 1994b) kao kalupa za imobilizaciju. U narednim istraživanjima korišten je bioreaktor radnog volumena 1L, sa 25% v/v kuglica od hitozana (ChitopearlR kuglice tipa II), u kojem je tokom kontinuiranog procesa sladovina tretirana sa glukoamilazom. Upotreba ovog enzima omogućila je da nastajanje acetatnog estera u sustavu s imobiliziranim stanicama bude slično kao i u konvencionalnoj šaržnoj fermentaciji, čime je u tom procesu napravljen korak naprijed u postizanju identičnosti proizvoda.

Istraživački tim iz Sapporo-a trenutno je fokusiran na razvoj fermentora sa fluidiziranim kuglicama od hitozana u kojem se opetovano provodi šaržna fermentacija. Sustav je radio 75 dana bez većih problema, a dobiveno je pivo po kvaliteti bilo slično komercijalom proizvodu. Pokazano je i da je neflokulirajući soj kvasca znatno efikasniji od flokulirajućeg soja. (Maeba et el., 2000; Umemoto i sur.., 1998).

Na kongresu EBC-a održanom u Maastrichtu 1997. god. prezentirana su dva pristupa za smanjenje koncentracije diacetila. Istraživači u Francuskoj (Dulieu i sur., 1997) su predložili upotrebu inkapsulirane alfa-acetolaktat dekarboksilaze za brzu konverziju acetolaktata u acetoin. Meura Delta je istaknula preliminarne rezultate upotrebe aluminosilikatnog zeolita kao katalizatora za hladnu i brzu konverziju acetolaktata u acetoin (Andries i sur., 1997) Ako se ovakvi tretmani pokažu efikasnim i prihvatljivim potrošaču, jeftinije alternative maturacijskim sustavima predloženim od Cultor i Alfa Laval mogu postati stvarnost.

U druga, ne-industrijska istraživanja imobilizacije u proizvodnji piva, ulaze ona od Singapore Institute of Standards and Industrial Research, u kojima je pokazano da je upotreba vlaknastih čestica alginatnog gela u bireaktoru sa imobiliziranim biokatalizatorom pakiranim u kolonu (‘packed bed’ reaktor) povoljnija od kuglica alginata (Que 1993). Mafra i sur., sa Universidado do Minho iz Portugala razmotrili su upotrebu superflokulirajućeg soja kvasca u kontinuiranom sazrijevanju piva. (Mafra i sur., 1997). Ova ista grupa je objavila rad o upotrebi vlastitog flokulirajućeg kvasca za proizvodnju etanola u ‘air-lift’ bioreaktoru. (Vicente i sur., 1999; Domingues i sur., 2000).

Istraživači iz različitih akademskih institucija su također ispitivali upotrebu imobilizacije u proizvodnji piva (ref.). Istraživački timovi iz Kine (ref), Rusije, i Čehoslovačke su također bili uključeni u tehnologiju imobiliziranih stanica, te su u vezi s tim objavili razultate u 80-im godinama 20-og stoljeća.

Tokom priprema za studije na kojima se temelji ovaj izum konzultirane su brojne reference. One uključuju:

Abbott, B.J. 1978. Immobilized cells. U: Annual Reports on Fermentation Processes, Ured. Perlman, D., New York: Academic Press, 2: 91.

Anon. 1994. Maturex® L. Novo Nordisk pubication. B 560c-GB.

Anon. 1996. Table Curve 2D. User’s Manual, Jandel Scientific.

Anon. 1997. Alfa Laval Brewery Systems. Brewers' Guardian 126: 26.

Anon. 1998. Digox 5 Operating Manual. Dr. Theidig publication.

Aquilla, T. 1997. The biochemistry of yeast: debunking the myth of yeast respiration and putting oxygen in its proper place. Brewing Techniques 50.

Aschengreen, N.H., Jepsen, S. 1992. Use of acetolactate decarboxylase in brewing fermentations. Proceedings of the 22nd Convention of the Institute of Brewing (Australia and New Zealand Section), Melbourne 80.

Atkinson, B. 1986. Immobilised cells, their application and potential. U: Process engineering aspects of immobilized cell systems. Ured. Webb, C., Black, G.M, Atkinson, B. Manchester: Institution of Chemical Engineers 3.

Audet, P., Paquin, C., Lacroix, C. 1988. Immobilized growing lactic acid bacteria with kapa-carrageenan - locust bean gel. Applied Microbiology and Biotechnology 29: 11.

Austin, G.D., Watson, RW.J., Nordstrom, P.A., D'Amore, T. 1994. An on-line capacitance biomass monitor and its correlation with viable biomass. MBAA Technical Quarterly 31: 85.

Axcell, B.C., O'Connor-Cox, E.S.C. 1996. The concept of yeast vitality - an alternative approach. Proceedings of Convention of the Institute of Brewing (Asia Pacific Sect.). Singapore 24:64.

Axelsson, A., Sisak, C., Westrin, B.A., Szajani, B. 1994. Diffusion characteristics of a swelling gel and its consequences for bioreactor performance. The Chemical Engineering Journal 55: B35.

Bailey, J.E., Ollis, D.F. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals. New York: McGraw-Hill, Inc.

Bancel, S., Hu, W. 1996. Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporous microcarriers. Biotechnology Progress 12: 398.

Barker, M.G, Smart, K.A. 1996. Morphological changes associated with the cellular aging of a brewing yeast strain. Journal of the American Society of Brewing Chemists 54(2): 121.

Bejar, P., Casas, C., Godia, F., Sola, C. 1992. The influence of physical properties on the operation of a three-phase fluidized-bed fermenter with yeast cells immobilized in calcium alginate. Applied Biochemistry and Biotechnology 34: 467.

Bickerstaff, G.F. 1997. Immobilization of enzymes and cells. U: Immobilization of Enzymes and Cells, Ured. Bickerstaff, G. F., New Jersey, U.S.A.: Humana Press, Inc. 1.

Birnbaum, S., Pendleton, R., Larson, P., Mosbach, K. 1981. Covalent stabilization of alginate gel for the entrapment of living whole cells. Biotechnology Letters 3: 393.

Budac, D., Margartis, A. 1999. Personal communication.

Büyükgüngör, H. 1992. Stability of Lactobacillus bulgaricus immobilized in kapa-carrageenan gels. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 53: 173.

Chahal, P.S. 1992. Fluorosensor controlled fed-batch production of Cyclosporin-A from Beauveria nivea. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Chisti, M.Y. 1989. Airlift bioreactors. London: Elsevier Applied Science.

Chisti, Y., Moo-Young, M. 1993. Improve the performance of airlift reactors. Chemical Engineering Progress 6: 38.

Cho, G.H., Choi, C.Y., Choi, Y.D., Han, M.H. 1982. Ethanol production by immobilised yeast and its carbon dioxide gas effects in a packed bed reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 32: 959.

Coutts, M.W. 1956. Britain Patent No. 872,391.

Curin, J., Pardonova, B., Polednikova, M., Sedova, H., Kahler, M. 1987. Beer production with immobilized yeast. European Brewing Convention Congress, Madrid 433.

Dale, C.J., Hough, J.S., Young, T.W. 1986. Freactionation of high and low molecular weight components from wort and beer by adsorption chromatography using the gel Sephadex LH20. Journal of the Institute of Brewing 92(5): 457.

Daoud, I.S., Searle, B.A. 1986. Yeast vitality and fermentation performance. Monograph - XII European Brewery Convention - Symposium on Brewers' Yeast, Helsinki 108.

de Backer, L., Willaert, R.G., Baron, G.V. 1996. Modelling of immobilized bioprocesses. U: Immobilized Living Cell Systems Modelling and Experimental Methods, Ured. Willaert, R. G., Baron, G. V., and de Backer, L., Toronto: John Wiley and Sons. 47.

de Beer, D., Van den Heuvel, J.C., Ottengraaf, S.P.P. 1993. Microelectrode measurements of the activity distribution in nitrifying bacterial aggregates. Applied Environmental Microbiology 59: 573.

Debourg, A., Laurent, M., Goossens, E., Borremans, E., Van De Winkel, L., Masschelein, C.A. 1994. Wort aldehyde reduction potential in free and immobilized yeast systems. Journal of the American Society of Brewing Chemists 52: 100.

Dillenhofer, W., Ronn, D. 1996. Secondary fermentation of beer with immobilized yeast. Brauwelt International 14: 344.

Doran, P.M., Bailey, J.E. 1986a. Effects of hydroxyurea on immobilized and suspended yeast fermentation rates and cell cycle operation. Biotechnology and Bioengineering 28: 1814.

Doran, P.M., Bailey, J.E. 1986b. Effects of immobilization on growth, fermentation properties, and macromolecular composition of Saccharomyces cerevisiae attached to gelatin. Biotechnology and Bioengineering 28: 73.

dos Santos, V.A.P.M, Bruijnse, M., Tramper, J., Wijffels, R.H. 1996. The magic-bead concept: an integrated approach to nitrogen removal with co-immobilized micro-organisms. Applied Microbiology and Biotechnology 45: 447.

Driessen, W., Habets, L., Vereijken, T. 1997. Novel anaerobic and aerobic process to meet strict effluent plant design requirements. Proceedings of the Institute of Brewing (Asia Pacific Section), Aukland 148.

Dulieu, C., Boivin, P., Dautzenberg, H., Poncelet, D. 1996. Immobilized enzyme system to avoid diacetyl formation: a new tool to accelerate beer maturation. International Workshop on Bioencapsulation, Potsdam 22.

Dunbar, J., Campbell, S.L., Banks, D.J., Warren, D.R. 1988. Metabolic aspects of a commercial continuous fermentation system. Proceedings of the Convention of the Institute of Brewing, Brisbane 151.

Estapé, D., Gòdia, F., Solà, C. 1992. Determination of glucose and ethanol effective diffusion coefficients in Ca-alginate gel. Enzyme and Microbial Technology 14: 396.

Evans, H.A.V., Cleary, P. 1985. Direct Measurement of Yeast and Bacterial Viability.

Journal of the Institute of Brewing 91: 73.

Fan, L.-S. 1989. Gas-Liquid-Solid Fluidization Engineering. Boston: Butterworths.

Fernandez, E. 1996. Nuclear magnetic resonance spectroscopy and imaging. U: Immobilized Living Cell Systems: Modelling and Experimental Methods. Toronto: John Wiley and Sons, Chapter 6.

García, A.I., García, L.A., Díaz, M. 1994. Prediction of ester production in industrial beer fermentation. Enzyme and Microbial Technology 16(1): 66.

Geankoplis, C.J. 1993. Transport Processes and Unit Operations. New Jersey: Prentice Hall P.T.R.

Gee, D.A., Ramirez, W.F. 1994. A flavour model for beer fermentation. Journal of the Institute of Brewing 100: 321.

Geiger, K.H., Compton, J. 1957. Canada Patent No. 545,867.

Gekas, V.C. 1986. Artificial membranes as carriers for the immobilization of biocatalysts. Enzyme and Microbial Technology 8: 450.

Gift, E.A., Park, H.J., Paradis, G.A., Demain, A.L., Weaver, J.C. 1996. FACS-based isolation of slowly growing cells: double encapsulation of yeast in gel microdrops. Nature Biotechnology 14: 884.

Gikas, P., Livingston, A.G. 1993. Use of ATP to characterize biomass viability in freely suspended and immobilized cell bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 42: 1337.

Gikas, P., Livingston, A.G. 1996. Viability of immobilised cells: use of specific ATP levels and oxygen uptake rates. Progress in Biotechnolgy 11, Immobilized Cells: Basics and Applications, Noordwijkerhout 11:264.

Gilson, C.D., Thomas, A. 1995. Ethanol production by alginate immobilised yeast in a fluidised bed bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 62: 38.

Gòdia, F., Casa, C., Castellano, B., Solà, C. 1987. Immobilized cells: behavior of carrageenan entrapped yeast during continuous ethanol fermentation. Applied Microbology and Biotechnology 26: 342.

Gopal, C.V., Hammond, J.R.M. 1993. Application of immobilized yeasts for fermenting beer. Brewing and Distilling International 24: 72.

Hannoun, B.J.M., Stephanopoulos, G. 1986. Diffusion coefficients of glucose and ethanol in cell-free and cell-occupied calcium alginate membranes. Biotechnology and Bioengineering 28: 829.

Hardwick, W.A. 1995. Handbook of Brewing. New York: Marcel Dekker, Inc.

Hayat, M.A. 1972. Basic Electron Microscopy Techniques. Toronto: van Nostrand Reinhold Co. 96.

Heijnen, J.J., van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R., Weltevrede, R., Mulder, A. 1993. Development and scale-up of an aerobic biofilm air-lift suspension reactor. Water Science and Technology 27: 253.

Higbie, R. 1935. The role of absorption of a pure gas into a still liquid during short periods of exposure. Transactions of the American Institute of Chemical Engineers 31: 365.

Hines, A.L,. Maddox, R.N. 1985. Mass Transfer Fundamentals and Applications. U.S.A.: Prentice-Hall, Inc.

Hinfray, C., Jouenne, T., Junter, G. 1994. Ethanol production from glucose by free and agar-entrapped batch cultures of Saccharomyces cerevisiae at different oxygenation levels. Biotechnology Letters 16: 1107.

Hoekstra, S.F. 1975. Wort composition, a review of known and unknown facts. Proceedings of the European Brewery Convention, Nice 465.

Hooijmans, C.M., Ras, C., Luyben, K.Ch.A.M. 1990. Determination of oxygen profiles in biocatalyst particles by means of a combined polarographic oxygen microsensor. Enzyme and Microbial Technology 12: 178.

Hough, J.S., Briggs, D.E., Stevens, R., Young, T.W. 1982. Metabolism of wort by yeast. U: Malting and Brewing Science Volume 2 Hopped Wort and Beer, Ured. Hough, J. S., Briggs, D. E., Stevens, R., and Young, T. W., London, U.K.: Chapman and Hall. 566.

Hüsken, L.E., Tramper, J., Wijffels, R. 1996. Growth and eruption of gel-entrapped microcolonies. U: Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications Ured. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M.., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 336.

Hutter, K.J. 1996. Flow-cytometric analyses for assessment of fermentative ability of various yeasts. Brauwelt International 1: 52.

Hwang, S.-J., Fan, L.-S. 1986. Some design consideration of a draft tube gas-liquid-solid spouted bUred. The Chemical Engineering Journal 33: 49.

Imai, T. 1996. Recent advances in the determination of yeast vitality. Proceedings of the Congress of the Institute of Brewing (Asia Pacific Section), Singapore 24: 60.

Inloes, D.S., Taylor, D.P., Cohen, S.N., Michaels, A.S., Robertson, C.R. 1983. Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae immobilized in hollow-fiber membrane bioreactors. Applied and Environmental Microbiology 46: 264.

Inoue, T. 1987. Possibilities opened by "new biotechnology" and application of immobilized yeast to beer brewing. Reports of the Research Laboratory of Kirin Brewery Co., Ltd. 7.

Inoue, T. 1992. A review of diacetyl control technology. Proceedings of the 22nd Convention of the Institute of Brewing (Australia and New Zealand Section), Melbourne 76.

Jepsen, S. 1993. Using ALDC to speed up fermentation. Brewers’ Guardian. 55.

Jones, M., Pierce, J.S. 1964. Absorption of amino acids from wort by yeasts. Journal of the Institute of Brewing 70: 307.

Jones, R.P., Greenfield, P.F. 1984. A review of yeast ionic nutrition – Part I: growth and fermentation requirements. Process Biochemistry 19(2): 48.

Jones, R.P., Pamment, N., Greenfield, P.F. 1981. Alcohol fermentation by yeast – the effect of environmental and other variables. Process Biochemistry 16(3): 42.

Kara, B.V., David, I., Searle, B.A. 1987. Assessment of yeast quality. Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention, Madrid, 21: 409.

Karamanev, D.G. 1991. Model of the biofilm structure of Thiobacillus ferrooxidans. Journal of Biotechnology 10: 51.

Karel, S.F., Libicki, S.B., Robertson, C.R. 1985. The immobilization of whole cells: engineering principles. Chemical Engineering Science 40: 1321.

Kasten, F.H. 1993. Introduction to fluorescent probes: properties, history and applications. U: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, Ured. Mason, W. T. London, U.K.: Academic Press Limited 12.

Klopper, W.J. 1974. Wort composition, a survey. European Brewery Convention Monograph 1. Wort Symposium, Zeist 8.

Korgel, B.A., Rotem, A., Monbouquette, H.G. 1992. Effective diffusivity of galactose in calcium alginate gels containing immobilized Zymomonas mobilis. Biotechnology Progress 8: 111.

Kreger-Van Rij, N. 1984. The Yeasts: A Taxonomic Study. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V.

Kronlöf, J., Virkajärvi, I. 1996. Main fermentation with immobilized yeast - pilot scale. Proceedings of the European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlin 94.

Kunze, W. 1996. Technology Brewing and Malting. BerlU: VLB.

Kuriyama, H., Ishibashi, H., Umeda, I.M.T., Kobayashi, H. 1993. Control of yeast flocculation activity in continuous ethanol fermentation. Journal of Chemical Engineering Japan 26(4): 429.

Kurosawa, H., Matsamura, M., Tanaka, H. 1989. Oxygen diffusivity in gel beads containing viable cells. Biotechnology and Bioengineering 34: 926.

Kurosawa, H., Tanaka, H. 1990. Advances in immobilized cell culture: development of a co-immobilized mixed culture system of aerobic and anaerobic micro-organisms. Process Biochemistry International 25: 189.

Kurtzman, C.P., Fell, J.W. 1998. The Yeasts, A Taxonomic Study, Fourth Edition. Amsterdam: Elsevier 361.

Kyung, K.H., Gerhardt, P. 1984. Continuous production of ethanol by yeast "immobilized" in a membrane-contained fermentor. Biotechnology and Bioengineering 26: 252.

Lee, S.S., Robinson, F.M., Wang, H.Y. 1981. Rapid determination of yeast viability. Biotechnology and Bioengineering Symposium No. 11, Gatlingburg, USA 641.

Lentini, A. 1993. A review of the various methods available for monitoring the physiological status of yeast: yeast viability and vitality. Ferment 6: 321.

Lentini, A., Takis, S., Hawthorne, D.B., Kavanagh, T.E. 1994. The influence of trub on fermentation and flavour development. Proceedings of the 23rd Convention of the Institute of Brewing (Asia Pacific Section), Sydney 89.

Leudeking, R. 1967. Fermentation process kinetics. U: Biochemical and Biological Engineering, Ured. Blakebrough, N., London: Academic Press, Inc. 203.

Leudeking, R., Piret, E.L. 1959. A kinetic study of the lactic acid fermentation. Journal of Biochemical and Microbiolial Technology and Engineering 1: 393.

Lewandowski, Z., Altobelli, A., Fukushima, E. 1993. NMR and microelectrode studies of hydrodynamics and kinetics in biofilms. Biotechnology Progress 9: 40.

Lewandowski, Z., Stoodley, P., Altobelli, S. 1995. Experimental and conceptual studies on mass transport in biofilms. Water Science Technology 31: 153.

Lewis, M., Young, T. 1995. Brewing. London: Chapman and Hall.

Li, J., Humphrey, A.E. 1991. Use of fluorometry for monitoring and control of a bioreactor. Biotechnology and Bioengineering 37: 1043.

Lim, H.-S., Han, B.-K., Kim, J.-H., Peshwa, M.V, Hu, W.-S. 1992. Spatial distribution of mammalian cells grown on macroporous microcarriers with improved attachment kinetics. Biotechnology Progress 8: 486.

Linko, M., Virkajarvi, I., Pohjala, N. 1996. Effect of flocculation characteristics on immobilized yeast performance. European Brewery Convention Brewing Science Group, Berlin 102.

Lloyd, D., Moran, C.A., Suller, M.T.E., Dinsdale, M.G. 1996. Flow cytometric monitoring of rhodamine 123 and a cyanine dye uptake by yeast during cider fermentation. Journal of Institute of Brewing 102: 251.

Lundberg, P., Kuchel, P.W. 1997. Diffusion of solutes in agarose and alginate gels: 1H and 23Na PFGSE and 23Na TQF NMR studies. Magnetic Resonance in Medicine 37: 44.

Margaritis, A., te Bokkel, D.W., El Kashab, M. 1987. Repeated batch fermentation of ethanol using immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae in a fluidized bioreactor system. U: Biological Research on Industrial Yeasts, Ured. Stewart, G.G., Russell, I., Klein, R.D., Hiebsch, R.R., Boca Raton: CRC Press 121.

Margaritis, A., Wallace, J.B. 1982. The use of immobilized cells of Zymomonas mobilis in a novel fluidized bioreactor to produce ethanol. Biotechnology and Bioengineering Symposium 147.

Margaritis, A., Wilke, C.R. 1978a. The rotorfermentor. Part I: description of the apparatus, power requirements, and mass transfer characteristics. Biotechnology and Bioengineering 20: 709.

Margaritis, A., Wilke, C.R. 1978b. The rotorfermentor. Part II: application to ethanol fermentation. Biotechnology and Bioengineering 20: 727.

Marrs, W.M. 1998. The stability of carrageenans to processing. U: Gums and Stabilizers for the Food Industry 9, Cambridge: Royal Society of Chemistry, 218: 345.

Martens, F.B., Egberts, G.T.C., Kempers, J., Robles de Medina, M.H.L., Welton, H.G. 1986. European Brewing Convention Monograph XII, Symposium on Brewing Yeast, Helsinki 339.

Masschelein, C.A. 1990. Yeast metabolism and beer flavour. Proceedings of the Third Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling 103.

Masschelein, C.A., Carlier, A., Ramos-Jeunehomme, C., Abe, I. 1985. The effect of immobilization on yeast physiology and beer quality in continuous and discontinuous systems. Proceedings of the 20th European Brewery Convention Congress, Helsinki 339.

Masschelein, C.A., Ramos-Jeunehomme, C. 1985. The potential of alginate immobilized yeast in brewery fermentations. Institute of Brewing Central and Southern African Section Proceedings of the 1st Scientific and Technical Convention, Johannesburg 392.

Masschelein, C.A., Vandenbussche, J. 1999. Current outlook and future perspectives for immobilized yeast technology in the brewing industry. Brewers’ Guardian 28(4): 35.

Masters, B.R., Thaer, A.A. 1994. Real-time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Applied Optics 33: 695.

Meilgaard, M. 1982. Prediction of flavor differences between beers from their chemical composition, Brygmesteren 5.

Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H., Russell, I. 1996. Application of immobilized yeast cells in the brewing industry. U: Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications Ured. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M.., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 661.

Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H., Russell, I. 1997. New Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Cell Bioreactor Systems. Journal of the Institute of Brewing 103: 363.

Merchant, F.J.A. 1986. Diffusivity Characteristics of Glucose in Alginate Immobilization Matrices. Ph.D. Thesis. University of Western Ontario.

Merchant, F.J.A, Margaritis, A., Wallace, J.B. 1987. A novel technique for measuring solute diffusivities in entrapment matrices used in immobilization. Biotechnology and Bioengineering 30: 936.

Mochaba, F.M. 1997. A novel and practical yeast vitality method based on magnesium ion release. Journal of the Institute of Brewing 103: 99.

Mochaba, F., O’Connor-Cox, E.S.C., Axcell, B.C. 1998. Practical procedures to measure yeast viability and vitality prior to pitching. Journal of the American Society of Brewing Chemists 56(1): 1.

Muhr, A.H., Blanshard, J.M.V. 1982. Diffusion in gels. Polymer 23: 1012.

Mulder, M.H.V., Smolders, C.A. 1986. Continuous ethanol production controlled by membrane processes. Process Biochemistry 21: 35.

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A., Mitsui, S. 1993. Beer brewing using an immobilized yeast bioreactor system. Bioprocess Technology 16: 275.

Nakanishi, K., Onaka, T., Inoue, T. 1986. A new immobilized yeast reactor system for rapid production of beer. Reports of the Research Laboratory of Kirin Brewing Company 13.

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984a. Kinetic study of vicinal diketones in brewing (I) formation of total vicinal diketones. MBAA Technical Quarterly 21(2): 73.

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K., Kumada, J. 1984b. Kinetic study of vicinal diketones in brewing (II) theoretical aspect for the formation of total vicinal diketones. MBAA Technical Quarterly 21(4): 175.

Nakatani, K., Fukui, N., Nagami, K., Nishigaki, M. 1991. Kinetic analysis of ester formation during beer fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists 49(4): 152.

Narziβ, L., Miedaner, H., Graf, P., Eichhorn, P., Lustig, S. 1993. Technological approach to improve flavour stability. MBAA Technical Quarterly 30: 48.

Nava Saucedo, J.E., Roisin, C., Barbotin, J.-N. 1996. Complexity and heterogeneity of microenvironments in immobilized systems. Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications, Noordwijkerhout 39.

Nedovic, A.N., Vunjak-Novakovc, G., Leskosek-Cukalovic, I., Cutkovic, M. 1996. A study on considerably accelerated fermentation of beer using an airlift bioreactor with calcium alginate entrapped yeast cells. Fifth World Congress of Chemical Engineering 2: 474.

Neufeld, R. J., Poncelet, D.J., Norton, S.D. 1996. Application for Canadian Patent No. 2133789.

Norton, S., D'Amore, T. 1994. Physiological effects of yeast cell immobilization: applications for brewing. Enzyme and Microbial Technology 16: 365.

Norton, S., Watson, K., D'Amore, T. 1995. Ethanol tolerance of immobilized brewer's yeast cells. Applied Microbiology and Biotechnology 43: 18.

O’Connor-Cox, E., Mochaba, F.M., Lodolo, E.J., Majara, M., Axcell, B. 1997. Methylene blue staining: use at your own risk. MBAA Technical Quarterly 34(1): 306.

O'Reilly, A.M., Scott, J.A. 1995. Defined coimmobilization of mixed microorganism cultures. Enzyme and Microbial Technology 17: 636.

Okazaki, M., Hamada, T., Fujji, H., Mizobe, A., Matsuzawa, S. 1995. Development of poly(vinyl alcohol) hydrogel for waste water cleaning. I. Study of poly(vinyl alcohol) gel as a carrier for immobilizing organisms. Journal of Applied Polymer Science 58: 2235.

Oldshue, J.Y., Herbst, N.R. 1992. A Guide to Fluid Mixing. New York: Lightnin.

Opekarova, M., Sigler, K. 1982. Acidification power: indicator of metabolic activity and autolytics changes in Saccharomyces cerevisiae (yeast). Folia Microbiologia 27: 395.

Øyaas, J., Storro, I., Svendsen, H., Levine, D.W. 1995. The effective diffusion coefficient and the distribution constant for small molecules in calcium-alginate gel beads. Biotechnology and Bioengineering 47: 492.

Paiva, T.C.B., Sato, S., Visconti, A.E.S., Castro, L.A.B. 1996. Continuous alcoholic fermentation process in a tower reactor with recycling of flocculating yeast. Applied Biochemistry and Biotechnology 57-58(0): 55.

Pajunen, E., Makinen, V., Gisler, R. 1987. Secondary fermentation with immobilized yeast. European Brewery Convention Congress, Madrid 441.

Parascandola, P., de Alteriis, E. 1996. Pattern of growth and respiratory activity of Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) cells growing entrapped in an insolubilized gelatin gel. Biotechnology and Applied Biochemistry 23: 7.

Perry, R.H., Green, D.W. 1984. Perry's Chemical Engineers' Handbook. New York: McGraw-Hill Book Company.

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A. 1998a. Mass transfer characteristics of immobilized cells used in fermentation processes. Critical Reviews in Biotechnology 18(2 & 3): 237.

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A., Russell, I. 1998b. Fundamentals of immobilized yeast cells for continuous beer fermentation: a review. Journal of the Institute of Brewing 104: 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobczak, J., Hancock, I., Russell, I. 1999. Kappa-carrageenan gel immobilization of lager brewing yeast. Journal of the Institute of Brewing 105(6): 398.

Polson, A. 1950. Some aspects of diffusion in solution and a definition of a colloidal particle. Journal of Physical and Colloidal Chemistry 54: 649.

Power, D.A., McCuen, P.J. 1988. Manual of BBL® Products and Laboratory Procedures, Sixth Edition. Maryland: Becton Dickinson Microbiology Systems 249.

Priest, F.G., Campbell, I. 1996. Brewing Microbiology 2nd Ed ., UK: Chapman and Hall.

Rees, D.A. 1972. Polysaccharide gels: a molecular view. Chemistry and Industry 19: 630.

Roca, E., Camesselle, C., Nunez, M. 1995. Continuous ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae immobilised in Ca-alginate beads hardened with Al3+. Biotechnology Letters 9: 815.

Roukas, T. 1994. Continuous ethanol production from carob pod extract by immobilized Saccharomyces cerevisiae in a packed-bed reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 59: 387.

Russell, I., Stewart, G.G. 1992. Contribution of yeast and immobilization technology to flavour development in fermented beverages. Food Technology 148.

Ryder, D.S. 1985. The growth process of brewing yeast and the biotechnological challenge. MBAA Technical Quarterly 22: 124.

Ryu, D.D., Kim, Y.J., Kim, J.H. 1984. Effect of air supplement on the performance of continuous ethanol fermentation system. Biotechnology and Bioengineering 26: 12.

Salmon, P.M., Robertson, C.R. 1987. Mass transfer limitations in gel beads containing growing immobilized cells. Journal of Theoretical Biology 125: 325.

Schumpe, A., Quicker, G., Deckwer, W.-D. 1982. Gas solubilities in microbial culture media. Advances in Biochemical Engineering 24: 1.

Shindo, S., Sahara, H., Koshino, S. 1994. Suppression of alpha-acetolactate formation in brewing with immobilized yeast. Journal of the Institute of Brewing 100: 69.

Smart, K.A. 1995. The importance of the brewing yeast cell wall. Brewers’ Guardian 124(4): 44.

Smart, K.A. 1999. Ageing in brewing yeast. Brewers’ Guardian 19.

Smart, K.A., Chambers, K.M., Lambert, I., Jenkins, C. 1999. Use of methylene violet procedures to determine yeast viability and vitality. Journal of the American Society of Brewing Chemists 57(1):18.

Sharpe, F.R. 1988. Assessment and control of beer flavour. Journal of the Institute of Brewing 95: 301.

Stewart, G.G. 1977. Fermentation – yesterday, today and tomorrow. MBAA Technical Quarterly 14: 1.

Stewart, G.G., Russell, I. 1986. The relevance of the flocculation properties of yeast in today's brewing industry. European Brewery Convention Symposium on Brewers' Yeast, Helsinki 53.

Stewart, G.G., Lyness, A., Younis, O. 1999. The control of ester synthesis during wort fermentation. MBAA Technical Quarterly 36(1): 61.

Takahashi, S. and Kimura, Y. 1996. Effect of main fermentation parameters on stale flavour. Brauwelt International 14 (3): 253.

Taylor, D.G. 1989. Influence of brewhouse practice on wort composition. Brewer’s Guardian 118(2): 30.

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (ASBC). 1992. Methods of Analysis. 8th Edition. Minnesota: ASBC.

Uttamlal, M., Walt, D.R. 1995. A fiber-optic carbon dioxide sensor for fermentation monitoring. Biotechnology 13: 597.

Venâncio, A., Teixeira, J.A. 1997. Characterization of sugar diffusion coefficients in alginate membranes. Biotechnology Techniques 11: 183.

Vilachá, C., Uhlig, K. 1985. The measurement of low levels of oxygen in bottled beer. Brauwelt International 70.

Virkajärvi, I., Kronlöf, J. 1998. Long-term stability of immobilized yeast columns in primary fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists 56(2): 70.

Vives, C., Casas, C., Gòdia, F., Solà, C. 1993. Determination of the intrinsic fermentation kinetics of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized in calcium alginate beads and observation on their growth. Applied Microbiology and Biotechnology 38: 467.

Wada, M., Kato, J., Chibata, I. 1979. A new immobilization of microbial cells. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 8: 241.

Wang, H.Y., Lee, S.S., Takach, Y., Cawthon, L. 1982. Maximizing microbial cell loading in immobilized-cell systems. Biotechnology and Bioengineering Symp. No. 12 139.

Westrin, B.A., Axelsson, A. 1991. Diffusion in gels containing immobilized cells: a critical review. Biotechnology and Bioengineering 38: 439.

Wheatcroft, R., Lim, Y.M., Hawthorne, D.B., Clarke, B.J., Kavanagh, T.E. 1988. An assessment of the use of specific oxygen uptake measurements to predict the fermentaion performance of brewing yeasts. The Institute of Brewing (Australia and New Zealand Section) Proceedings of the Twentieth Convention , Brinsbane 193.

White, F.H., Portno, A.D. 1978. Continuous fermentation by immobilized brewers yeast. Journal of the Institute of Brewing 84: 228.

Wijffels, R.H., de Gooijer, C.D., Schepers, A.W., Tramper, J. 1996. Immobilized-cell growth: diffusion limitation in expanding micro-colonies. U: Progress in Biotechnology 11, Immobilized Cells: Basics and Applications Ured. Wijffels, R.H., Buitelaar, R.M.., Bucke, C., Tramper, J., Amsterdam: Elsevier Science 249.

Wijffels, R.H., Englund, G., Hunik, J.H., Leenen, J.T.M., Bakketun, A. i sur. 1995. Effects of diffusion limitation on immobilized nitrifying microorganisms at low temperatures. Biotechnology and Bioengineering 45: 1.

Aivasidis, A., 1996. Another Look at Immobilized Yeast Systems. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 27.

Aivasidis, A., Wandrey, C., Eils, H.-G. & Katzke, M., 1991. Continuous Fermentation of Alcohol-Free Beer with Immobilized Yeast in Fluidized Bed Reactors. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Lisbon, 1991, 569.

Akiyama-Jibiki, M., Ishibiki, T., Yamashita, H. & Eto, M., 1997. A Rapid and Simple Assay to Measure Flocculation in Brewer’s Yeast. Master Brewers of the Americas Technical Quarterly, 34, 278.

Alfa Laval Brewery Systems, 1997. Immobilized Yeast System Reduces Maturation Time. Brewers' Guardian, 126, 26.

Alfa Laval Brewery Systems, 1996. Continuous Maturation of Beer with Immobilized Yeast, Company Report.

Al Taweel, A.M. & Walker, L.D., 1983. Liquid Dispersion in Static In-line Mixers. Canadian Journal of Chemical Engineering, 61, 527.

Andries, M., Derdelinckx, G., Ione, K.G., Delvaux, F., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1997a. Zeolites as Catalysts for the Cold and Direct Conversion of Acetolactate into Acetoin. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Maastricht, Poster 48.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O. & Masschelein, C.A., 1995. Design of a Multi-Purpose Immobilized Yeast Bioreactor System for Application in the Brewing Process. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 134.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O. & Masschelein, C.A., 1996a. Design and Application of an Immobilized Loop Bioreactor for Continuous Beer Fermentation. in Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels, R.M. Buitelaar, C. Bucke & J. Tramper, eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 672.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1996b. Design and Applications of an Immobilized Loop Bioreactor to the Continuous Fermentation of Beer. Proceedings of the 6th International Brewing Technology Conference, Harrogate, 380.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997b. Practical Results Using the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentation System. Brewers' Guardian, 26.

Andries, M., Van Beveren, P.C., Goffin, O., Rajotte, P. & Masschlein, C.A., 1997c. First Results on Semi-Industrial Continuous Fermentation with the Meura-Delta Immobilized Yeast Fermentor. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 34, 119.

Argiriou, T., Kanellaki, M., Voliotis, S. & Koutinas, A.A., 1996. Kissiris-Supported Yeast Cells: High Biocatalyic Stability and Productivity Improvement by Successive Preservatives at 0 °C. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 4028.

Audet, P. & Lacroix, C., 1989. Two Phase Dispersion Process for the Production of Biopolymer Gel Beads: Effects of Barious Parameters on Bead Size and their Distribution. Process Biochemistry, 24, 217.

Axelsson, A. & Persson, B., 1988. Determination of Effective Diffusion Coefficients in Calcium Alginate Gel Plates with Varying Yeast Cell Content. Applied Biochemistry and Biotechnology, 18, 231.

Bardi, E.P., Koutinas, A.A., Soupioni, M.J. & Kanellaki, M.E., 1996. Immobilization of Yeast on Delignified Cellulosic Material for Low Temperature Brewing. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 463.

Berkman, P, D. & Calabrese, R, V., 1988. Dispersion of Viscous Liquids by Turbulent Flow in a Static Mixer. American Institute of Chemical Engineering Journal. 34, 602.

Borremans, E., 1997. Secondary Fermentation of Beer with Immobilized Yeast. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 33.

Bower, J.L. & Christensen, C.M., 1995. Disruptive Technologies: Catching the Wave. Harvard Business Review, 73, 43.

Breitenbücher, K. & Mistler, M., 1995. Fluidized Bed Fermenters for the Continuous Production of Non-Alcoholic Beer with Open-Pore Sintered Glass Carriers. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 77.

Brewers Association of Canada, 1988. About Beer And The Brewing Industry, Ottawa, Ontario.

Broderick, Harold M., 1979. The Practical Brewer: A Manual for the Brewing Industry, 2nd Ured. Impressions Inc., Wisconsin.

Burns, J.A., 1937. Journal of the Institute of Brewing, 43, 31.

Calleja, G.B. & Johnson, B.F., 1977. A Comparison of Quantitative Methods for Measuring Yeast Flocculation. Canadian Journal of Microbiology, 23, 68.

Carberry, J.J., 1976. Chemical and Catalytic Reaction Engineering, McGraw-Hill.

Carberry, J.J. & Varma, A., 1987. Chemical Reaction and Reactor Engineering, Marcel Dekker Inc., New York.

Cashin, M.-M., 1996. Comparative Studies of Five Porous Supports for Yeast Immobilization by Adsorption/Attachment. Journal of the Institute of Brewing, 102, 5.

Champagne, C.P., 1994. Overview: Immobilized Cell Technology in Food Processing. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV, Quebec, Canada, 33.

Chang, C.M., Lu, W.J., Own, K.S. & Hwang, S.J., 1994. Comparison of Airlift and Stirred Tank Reactors for Immobilized Enzyme Reactions. Process Biochemistry, 29, 133.

Chao, X., Ye, G. & Shi, S., 1990. Kinetic Study of the Continuous Fermentative Process of Green Beer Production with Immobilized Yeast. Huagong Jixie, 17, 18.

Chibata, I., 1979. Immobilized Microbial cells with Polyacrylamide Gel and Carrageenan and their Industrial Applications. American Chemical Society Series, 106, 187.

Chisti, M.Y., 1991. Airlift Bioreactors, Elsevier Applied Science, New York.

Chisti, Y. & Moo-Young, M., 1993. Improve the Performance of Airlift Reactors. Chemical Engineering Progress, 6, 38.

Chladek, L., Voborsky, J., Sima, J. & Hosek, Z., 1989. Prumysl Potravin, 40, 590.

Coe, H.S. & Clevenger, G.H., 1916. Methods for Determining the Capacities of Slime Thickening Tanks. Transcripst of the American Institute of Mechanical Engineering, 55, 356.

Curin, J., Pardonova, B., Polednikova, M., Sedova, H. & Kahler, M., 1987. Beer Production with Immobilized Yeast. Proceedings of the European Brewery Convention, Madrid, 433.

Decamps, C. & Norton, S., 1994. New Emulsion Process using Static Mixer for the Production of κ-Carrageenan Gel Beads. Labatt Breweries of Canada Internal Report.

Del Pozo, M., Briens, C.L. & Wild, G., 1994. Effect of Liquid Coalescing Properties on Mass Transfer, Heat Transfer and Hydrodynamics in a Three-Phase Fluidized BUred. The Chemical Engineering Journal, 55, 1.

Dillenhofer, W. & Ronn, D., 1996a. Alfa Laval/Schott System of Secondary Fermentation with Immobilized Yeast. Brewing & Distilling International, 27, 35.

Dillenhofer, W. & Ronn, D., 1996b. Secondary Fermentation of Beer With Immobilized Yeast. Brauwelt International, 14, 344.

Dillenhoffer, W. & Ronn, D., 1996c Continuous Maturation of Beer. Beverage World International, 34.

Domeny, Z., Smogrovicova, D., Gemeiner, P., Malovikova, A. & Sturdik, E., 1996. Calcium Pectate Gel to Immobilize Yeast for Continuous Beer Production. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group V, Potsdam, Germany, Poster 12.

Domingues, L., Lima, N. & Teixeira, J.A., 2000. Contamination of a High-Cell-Density Continuous Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, 68, 584.

Donnelly, D., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Master Brewers Association of the Americas Annual Convention, Minneapolis, Poster 8.

Donnelly, D., Bergin, J., Gardiner, S. & Cahill, G., 1998. Kinetics of Sugar Metabolism in a Fluidized Bed Bioreactor for Beer Production. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36, 183.

Dulieu, C., Boivin, P., Malanda, M., Dautzenberg, H. & Poncelet, D., 1997. Encapsulation of α-Acetolactate Decarboxylase to Avoid Diacetyl Formation. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Maastricht, Poster 44.

Duncombe, D., Bower, P., Bromberg, S., Fehring, J., Lau, V. & Tata, M., 1996. The Contribution of Free Cells in an Immobilized Yeast System. Journal of the American Society of Brewing Chemists, Poster Presentation.

Dziondziak, K. & Seiffert, T., 1995. Process for the Continuous Production of Alcohol-Free Beer. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 301.

Enari, T.-M., 1995. State of the Art of Brewing Research. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 1.

Fix, G., 1989. Principles of Brewing Science. Brewers Publications, USA.

Fouhy, K. & Parkinson, G., 1996. Brewers Break with Tradition. Chemical Engineering, 103, 45.

Gil, G.H., 1991. Continuous Ethanol Production in a Two-Stage, Immobilized and Suspended Cell Bioreactor (Alcohol Dehydrogenase). Ph.D. Thesis, Georgia Institute of Technology.

Gilliland, R.B., 1951. The Flocculation Characteristics of Brewing Yeasts During Fermentation. Proceedings of the European Brewing Convention, 8, 35.

Groboillot, A., D.K. Boadi, D. Poncelet & Neufeld, R.J., 1994. Immobilization of Cells for Application in the Food Industry. Critical Reviews in Biotechnology, 14, 75.

Haikara, A., Virkajarvi, I., Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Microbial Contaminations in Immobilized Yeast Bioreactors for Primary Fermentations. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 439.

Heggart, H.M., Margaritis, A., Pilkington, H., Stewart, R.J., Dowhanick, T.M. & Russell, I., 1999. Factors Affecting Yeast Viability and Vitality Characteristics: A Review. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 36, 383.

Heijnen, J.J., Mulder, A., Enger, W. & Hoeks, F., 1989. Review on the Application of Anaerobic Fluidized Bed Reactors in Waste-Water Treatment. The Chemical Engineering Journal, 41, B 37.

Heijnen, J.J., Mulder, A., Weltevrede, R., Hols, J. & van Leeuwen, H.L.J.M., 1991. Large Scale Anaerobic-Aerobic Treatment of Complex Industrial Waste-Water Using Biofilm Reactors. Water Science Technology, 23, 1427.

Heijnen, J.J., Van Loosdrecht, M.C.M., Mulder, R.W.R. & Mulder, A., 1993. Development and Scale-Up of an Aerobic Biofilm Air-Lift Suspension Reactor. Water Science Technology, 27, 253.

Helm, E., Nohr, B. & Thorne, R.S.W., 1953. The Measurement of Yeast Flocculence and its Significance in Brewing. Wallerstein Laboratories Communications, 16, 315.

Horitsu, H., Wang, M.Y. & Kawai, K., 1991. A Modified Process for Soy Sauce Fermentation by Immobilized Yeasts. Agricultural and Biological Chemistry, 55, 269.

Hryclik, Kevin, Gerry Ginter, Jim Helmke, & Jim Spiers, 1987. The How’s And Why’s of Brewing, Revision #2, LBOC.

Hunik, J.H., Tramper, J. & Wijffels, R.H., 1994. A Strategy to Scale Up Nitrification Processes with Immobilized Cells of Nitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis. Bioprocess Engineering, 11, 73.

Hwang, S.-J. & Fan, L.-S., 1986. Some Design Considerations of a Draft Tube Gas-Liquid-Solid Spouted BUred. The Chemical Engineering Journal, 33, 49.

Hyttinen, I., Kronlof, J. & Hartwall, P., 1995. Use of Porous Glass at Hartwall Brewery in the Maturation of Beer with Immobilized Yeast. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 55.

Ibrahim, Y.A.A., Briens, C.L., Margaritis, A. & Bergougnou, M.A., 1996. Hydrodynamic Characteristics of a Three-Phase Inverse Fluidized Bed Column. Journal of the American Institute of Chemical Engineering, 42, 1889.

Inoue, T., 1995. Development of a Two-Stage Immobilized Yeast Fermentation System for Continuous Beer Brewing. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 25.

Iserentant, D., 1995. Beers: Recent Technological Innovations in Brewing. Fermented Beverage Production. (A.G.H. Lea & J.R. Piggott, eds.) London: Chapman & Hall, 45.

Kaplan, R.S. & Norton, D.P., 1996. The Balanced Scorecard. President and Fellows of Harvard College, Harvard Business School Press, Massachusetts, USA.

Karamanev, D.G., Nagamune, T. & Endo, I., 1992. Hydrodynamic and Mass Transfer Study of a Gas-Liquid-Solid Draft Tube Spouted Bed Bioreactor. Chemical Engineering Science, 47, 3581.

Karel, S.F., Libicki, S.B. & Robertson, C.R., 1985. The Immobilization of Whole Cells: Engineering Principles. Chemical Engineering Science, 40, 1321.

Katzbauer, B., Narodoslawsky, M. & Moser, A., 1995. Classification System for Immobilization Techniques. Bioprocess Engineering, 12, 173.

Kennard, M. & Janekeh, M., 1991. Two- and Three-Phase Mixing in a Concentric Draft Tube ‘gas-lift’ Fermentor. Biotechnology and Bioengineering, 38, 1261.

Kolot, F.B., 1988. Immobilized Microbial Systems: Principles, Techniques and Industrial Applications. Robert E. Krieger Publishing Company, Florida.

Kolpachki, A.P., Isaeva, V.S., Kazantsev, E.N. & Fertman, G.I., 1980. Intensification of Wort Fermentation with Immobilized Yeasts. Fermentnaya I Spirtovaya Promyshlennost, 9.

Krikilion, Ph., Andries, M., Goffin, O., van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1995. Optimal Matrix and Reactor Design for High Gravity Fermentation with Immobilized Yeast. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 419.

Kronlof, J., 1994. Immobilized Yeast in Continuous Fermentation of Beer. Ph.D. Thesis, VTT Publications, 167.

Kronlof, J., Linko, M. & Pajunen, E., 1995. Primary Fermentation with a Two-Stage Packed Bed System Pilot Scale Experiences. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 118.

Kronlof, J. & Virkajarvi, I., 1996. Main Fermentation with Immobilized Yeast – Pilot Scale European Brewery Convention Brewing Science Group Bulletin, Zoeterwoude, 94.

Kronlof, J., Virkajarvi, I., Storgards, E.L., Londesborough, J. & Dymond, G., 2000. Combined Primary and Secondary Fermentation with Immobilized Yeast. World Brewing Congress, Poster #56.

Ku, W.Y., 1982. Fermentation Kinetics for the Production of Ethanol by Immobilized Yeast Cells (Biomass). Ph.D. Thesis, The Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College.

Kunze, W., 1999. Technology Brewing and Malting. VLB Berlin, Germany.

Kynch, G.J., 1952. Transcripts of the Faraday Society, 48, 166.

Lacroix, C., Paquin, C. & Arnaud, J.P., 1990. Batch Fermentation with Entrapped Growing Cells of Lactobacillus casei: Optimization of the Rheological Properties of the Entrapment Gel Matrix. Applied Microbiology and Biotechnology, 32, 403.

Levenspiel, O., 1972. Chemical Reaction Engineering. John Wiley & Sons, New York.

Linko, M., Virkajarvi, I., Pohjala, N., Lindborg, K., Kronlof, J. & Pajunen, E., 1997. Main Fermentation with Immobilized Yeast – A Breakthrough?. Proceedings of the European Brewery Convention, Maastricht, 385.

Livingston, A.G. & Chase, H.A., 1990. Liquid-Solid Mass Transfer in a Three Phase Draft Tube Fluidized Bed Reactor. Chemical Engineering Communications, 92, 225.

Livingston, A.G. & Zhang, S.F., 1993. Hydrodynamic Behaviour of Three-Phase (Gas-Liquid-Solid) Airlift Reactors. Chemical Engineering Science, 48, 1641.

Lommi, H., 1990. Immobilized Yeast for Maturation and Alcohol-Free Beer. Brewing and Distilling International, 21, 23.

Lommi, H., Gronqvist, A., & Pajunen, E., 1990. Immobilized Yeast Reactor Speeds Beer Production. Food Technology, 5, 128.

Lorenzen, K., 1996. Immobilized Yeast Plants for Alcohol-Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Singapore, 244.

Maeba, H., Umemoto, S., Sato, M. & Shinotsuka, K., 2000. Primary Fermentation with Yeast Immobilized in Porous Chitosan Beads – Pilot Scale Trial. Proceedings of the 26th Convention of the Institute of Brewing – Asia Pacific Section, 82.

Mafra, I., Machado Cruz, J.M. & Teixeira, J.A., 1997. Beer Maturation in a Continuously Operating Bioreactor using a Flocculating Brewer’s Yeast Strain. Proceedings of the European Brewery Convention, 509.

Maiorella, B.L., 1983. Fermentative Ethanol Production (Alcohol, Distillation, Economics). Ph.D. Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., 1975. A Study of the Rotorfermentor and the Kinetics of Ethanol Fermentation. Ph.D. Thesis, University of California, Berkeley.

Margaritis, A., & Bajpai, P., 1982a. Continuous Ethanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part I. Use of Free Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology and Bioengineering, 24, 1473.

Margaritis, A., & Bajpai, P., 1982b. Continuous Ethanol Production from Jerusalem Artichoke Tubers, Part II. Use of Immobilized Cells of Kluyveromyces marxianus. Biotechnology and Bioengineering, 24, 1483.

Margaritis, A. & Merchant, F., 1984. Advances in Ethanol Production Using Immobilized Cell Systems. Critical Reviews in Biotechnology, 1, 339.

Margaritis, A. & Rowe, G.E., 1983. Ethanol Production Using Zymomonas mobilis Immobilized in Different Carrageenan Gels. Developments in Industrial Microbiology, 24, 329.

Margaritis, A., te Bokkel, D. & El Kashab, M., 1987. Repeated Batch Fermentation of Ethanol Using Immobilized Cells of Saccharomyces cerevisiae in a Fluidized Bioreactor Systesm. Biological Research on Industrial Yeasts. Volume I, (G.G. Stewart, I. Russell, R.D. Klein & R.R. Hiebsch, eds.) Boca Raton: CRC Press, 121.

Margaritis, A. & Wallace, J.B., 1982. The Use of Immobilized Cells of Zymomonas mobilis in a Novel Fluidized Bioreactor to Produce Ethanol. Fourth Symposium on Biotechnology in Energy Production and Conservation, Gatlinburg, Tennessee, 12, 147.

Margaritis, A. & Wallace, J.B., 1984. Novel Bioreactor Systems and their Applications. Bio/Technology, 2, 447.

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978a. The Rotorfermentor. Part I: Description of the Apparatus, Power Requirements, and Mass Transfer Characteristics. Biotechnology & Bioengineering, 20, 709.

Margaritis, A. & Wilke, C.R., 1978b. The Rotorfermentor: Part II: Application to Ethanol Fermentation. Biotechnology & Bioengineering, 20, 727.

Masschelein, C.A., 1997. A Realistic View on the Role of Research in the Brewing Industry Today. Journal of the Institute of Brewing, 103, 103.

Masschelein, C.A., 1994. State-of-the-Art and Future Developments in Fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 52, 1.

Masschelein, C.A. & Andries, M., 1996a. The Meura-Delta Immobilised Yeast Fermenter for the Continuous Production of Beer. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 28.

Masschelein, C.A. & Andries, M., 1996b. Meura-Delta’s Immobilized Yeast Fermenter for Continuous Beer Production. Brewing & Distilling International, 27, 16.

Masschelein, C.A., Andries, M., Franken, F., Van de Winkel, L. & Van Beveren, P.C., 1995. The Membrane Loop Concept: A New Approach for Optimal Oxygen Transfer into High Cell Density Pitching Yeast Suspensions. Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Brussels, 377.

Masschelein, C.A., Ryder, D.S. & Simon, J-P., 1994. Immobilized Cell Technology in Beer Production. Critical Reviews in Biotechnology, 14, 155.

Matsuura, K., Hirotsune, M., Nakada, F. & Hamachi, M., 1991. A Kinetic Study on Continuous Sake Fermentation. Hakkokogaku Kaishi, 69, 345.

McCabe, J.T., 1999. The Practical Brewer: A Manual for the Brewing Industry. Master Brewers Association of the Americas, USA.

Mensour, N.A., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1997. New Developments in the Brewing Industry Using Immobilized Yeast Cell Bioreactor Systems. Journal of the Institute of Brewing, 103, 363.

Mensour, N.A., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1996. Application of Immobilized Yeast Cells in the Brewing Industry. Immobilized Cells: Basics and Applications. (R.H. Wijffels, R.M. Buitelaar, C. Bucke & J. Tramper, eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 661.

Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Pilkington, H. & Russell, I., 1995. Gas Lift Systems for Immobilized Cell Fermentation. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 125.

Mensour, N., Margaritis, A., Russell, I., Briens, C.L., Decamps, C. & Norton, S., 1994. Beer Production with Immobilized Yeast Cells in a Pilot Plant Scale Airlift Reactor. Proceedings of the Bioencapsulation Research Group IV, Quebec, Canada, 49.

Middleman, S., 1974. Drop Size Distributions Produced by Turbulent Pipe Flow of Immiscible Fluids Through a Static Mixer. Industrial Engineering and Chemical Process Design and Development, 13, 78.

Mieth, H.O., 1995. Immobilized Yeast Plants for Alcohol Free Beer Production and Rapid Maturation. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Victoria Falls, 166.

Mistler, M., Breitenbücher, K. & Jaeger, R., 1995. Continuous Fermentation of Beer with Yeast Immobilized on Porous Glass Carriers. Brewers Digest, 70, 48.

Moll, M. & Duteurtre, B., 1996. Fermentation and Maturation of Beer with Immobilized Microorganisms. Brauwelt International, 3, 248.

Motai, H., Hamada, T. & Fukushima, Y., 1993. Application of a Bioreactor System to Soy Sauce Production. in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 315.

Muhr, A.H. & Blanchard, M.V., 1982. Diffusion in Gels. Polymer, 23, 1012.

Mwesigye, P.K & Barford, J.P., 1994. Transport of Sucrose by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 77, 687.

Nakanishi, K., Murayama, H., Nagara, A. & Mitsui, S., 1993. Beer Brewing Using an Immobilized Yeast Bioreactor System. in Industrial Applications of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 275.

Nakanishi, K., T. Onaka, T. Inoue & Kubo, S., 1985. A New Immobilized Yeast Reactor System for Rapid Production of Beer. Proceedings of the 20th European Brewing Convention Congress, Helsinki, 331.

Nakatani, K., Takahashi, T., Nagami, K. & Kumada, J., 1984. Kinetic Study of Vicinal Diketones in Brewing (I) Formation of Total Vicinal Diketones. Master Brewers Association of the Americas Technical Committee, 21, 73.

Nedovic, V.A., Leskosek-Cukalovic, I. & Vunjak-Novaki, G., 1996a. Short-Time Fermentation of Beer in an Immobilization Yeast Air-Lift Bioreactor. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Singapore, 244.

Nedovic, V.A., Vunjak-Novakovic, G., Leskosek-Cukalovic, I. & Cutkovic, M., 1996b. A Study on Considerably Accelerated Fermentation of Beer Using an Airlift Bioreactor with Calcium Alginate Entrapped Yeast Cells. Proceedings of the 5th World Congress of Chemical Engineering, San Diego, 474.

Neufeld, R.J., Norton, S. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead Production and a Brewing Process Utilizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells. Canadian Patent Application 2,133,789.

Nguyen, A.L. & Luong, J.H.T., 1986. Diffusion in k-Carrageenan Gel Beads. Biotechnology and Bioengineering, 28, 1261.

Nielsen, J. & Villadsen, J., 1994. Bioreactor Modeling. Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, New York, 9.

Norton, S. & D’Amore, T., 1994. Physiological Effects of Yeast Cell Immobilization: Applications for Brewing. Enzyme and Microbial Technology, 16, 365.

Norton, S., Neufeld, R.J. & Poncelet, D.J.C.M., 1994. Immobilized-Cell Carrageenan Bead Production and a Brewing Process Utilizing Carrageenan Bead Immobilized Yeast Cells. Canadian Patent Application 2,133,789.

Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A., Briens, C.L., Decamps, C. & Russell, I., 1994. Pilot Scale Primary Fermentation of Beer with a Gaslift Immobilized Yeast Reactor. Proceedings of the European Brewing Convention, Sub-Committee, Dublin.

Norton, S., Watson, K. & D'Amore, T., 1995. Ethanol Tolerance of Immobilized Brewers’ Yeast Cells. Applied Microbiology & Biotechnology, 43, 18.

Nothaft, A., 1995. The Start-Up of an Immobilized Yeast System for Secondary Fermentation at Brahma. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 41.

Nunokawa, Y. & Hirotsune, M., 1993. Production of Soft Sake by an Immobilized Yeast Reactor System. in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 235.

Pajunen, E., 1996a. The Behaviour of Immobilized Yeast Cells. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 21, 33.

Pajunen, E., 1996b. Immobilized System in the Brewing Industry. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Singapore, 38.

Pajunen, E., 1995. Immobilized Yeast Lager Beer Maturation: DEAE-Cellulose at Sinebrychoff. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 24.

Pajunen E. & Gronqvist A., 1994. Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Lager Beer Maturation. Proceedings for the Institute of Brewing Convention, Sydney, 101.

Pajunen, E., A. Gronqvist & Lommi, H., 1989. Continuous Secondary Fermentation and Maturation of Beer in an Immobilized Yeast Reactor. MBAA Technical Quarterly, 26, 147.

Pajunen, E., Gronqvist, A., Simonsen, B. & Lommi, H., 1994. Immobilized Yeast Fermenters for Continuous Lager Beer Maturation. ALAFACE Annual Meeting, Quito, 13.

Pajunen, E., Ranta, B., Andersen, K., Lommi, H., Viljava, T., Bergin, J. & Guercia, H., 2000a. Novel Process for Beer Fermentation with Immobilized Yeast. Proceedings of the 26th Convention of the Institute of Brewing, Asia-Pacific Section, 91.

Pajunen, E., Viljava, T. & Lommi, H., 2000b. Novel Primary Fermentation with Immobilzied Yeast System. World Brewing Congress, Oral presentation.

Paul, F. & Vignais, P.M., 1980. Photophosphorylation in Bacterial Chromatophores Entrapped in Alginate Gel: Improvement of the Physical and Biochemical Properties of Gel Beads with Barium as Gel-Inducing Agent. Enzyme and Microbial Technology, 2, 281.

Peach, M., 1996. Fermenting Faster Pints. New Scientist, 2058, 23.

Pilkington, P.H, Margaritis, A. & Mensour, N.A., 1998a. Mass Transfer Characteristics of Immobilized Cells Used in Fermentation Processes. Critical Reviews in Biotechnology, 18, 237.

Pilkington, P.H., Margaritis, A., Mensour, N.A. & Russell, I., 1998b. Fundamentals of Immobilized Yeast Cells for Continuous Beer Fermentation: A Review. Journal of the Institute of Brewing, 104, 19.

Pilkington, H., Margaritis, A., Mensour, N., Sobczak, J., Hancock, I. & Russell, I., 1999. Kappa-Carrageenan Gel Immobilization of Lager Brewing Yeast. Journal of the Institute of Brewing, 105, 398.

Pirt, S.J., 1975. Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific, Oxford.

Pittner, H. & Back, W., 1995. Continuous Production of Acidified Wort for Alcohol Free Beer Using Immobilized Lactic Acid Bacteria. Master Brewers Association of the Americas TechnicalQuarterly, 32, 163.

Pittner, H., W. Back, W. Swinkels, E. Meersman, B. van Dieren & Lommi, H.,1993. Continuous Production of Acidified Wort for Alcohol-Free Beer Using Immobilized Lactic Acid Bacteria. Proceedings of the 24th European Brewing Convention Congress, Oslo, 323.

Polednikova, M., Sedova, H. & Kahler, M., 1981. Immobilized Brewing Yeast. Kvasny Prumysl, 27, 193.

Poncelet, D., Lencki, R., Beaulieu, C., Halle, J, P., Neufeld, R. J. & Fournier, A., 1992. Production of Alginate Beads by Emulsification/Internal Gelation. Applied Microbiology & Biotechnology, 38, 39.

Poncelet, D., Poncelet de Smet, B., Beaulieu, C. & Neufeld, R. J., 1993. Scale Up of Gel Bead and Microcapsule Production in Cell Immobilization. in Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, Goosen, M.F.A., Ured., CRC Press Inc., Boca Raton, Florida.

Prakash, A., Briens, C.L. & Bergougnou, M.A., 1987. Mass Transfer Between Solid Particles and Liquid in a Three Phase Fluidized BUred. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 65, 228.

Prasad, K.Y. & Ramanujam, T.K., 1995. Overall Volumetric Mass Transfer Coefficient in a Modified Reversed Flow Jet Loop Bioreactor with Low Density Particles. Bioprocess Engineering, 12, 214.

Pritchett, Price. 1993. Culture Shift. Texas: Pritchett & Associates, Inc.

Que, F., 1993. Using a Thread Type of Alginate Gel Particles as Cell-Immobilised Support and Some Concept of Packed Bed Fermenter Design. Biotechnology Techniques, 7, 755.

Rajotte, P., 1998. Continuous Fermentation with Immobilized Yeast Cells. American Brewer, 76, 42.

Rajotte, P., 1997. Jumping into the Next Millenium Canadian Style. American Brewer, 75, 42.

Russell, I., Norton, S., Mensour, N., Margaritis, A. & Briens, C., 1995. Immobilized Yeast Cells: Applications for Brewing. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Victoria Falls, 159.

Ryder, D.S. & Masschelein, C.A., 1985. The Growth Process of Brewing Yeast and the Biotechnological Challenge. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 43, 66.

Satterfield, C.N., 1970. Mass Transfer in Heterogeneous Catalysts, MIT Press, Cambridge.

Scott, J.A., O'Reilly, A.M. & Kirkhope, S., 1995. A Fibrous Sponge Matrix to Immobilized Yeast for Beverage Fermentations. Biotechnology Techniques, 9, 305.

Shindo, S. & Kamimur, M., 1990. Immobilization of Yeast with Hollow PVA Gel Beads. Journal of Fermentation and Bioengineering, 70, 232.

Shindo, S., Sahara, H. & Koshino, S., 1994a. Suppression of α-Acetolactate Formation in Brewing with Immobilized Yeast. Journal of the Institute of Brewing, 100, 69.

Shindo, S., Sahara, H., Koshino, S. & Tanaka, H., 1993. Control of Diacetyl Precursor [α-acetolactate] Formation During Alcohol Fermentation with Yeast Cells Immobilized in Alginate Fibers with Double Gel Layers. Journal of Fermentation and Bioengineering, 76, 199.

Shindo, S, Sahara, S, Watanabe, N. & Koshino, S., 1994b. Main Fermentation with Immobilized Yeast Using Fluidized-Bed Reactor. Proceedings of the Institute of Brewing Convention, Sydney, 109.

Sinitsyn, A.P., Rajnina, E.I., Efremov, A.B., Gracheva, I.M. & Gernet, M.V., 1986. Fermentation of Hydrolysed Mash by Yeasts Immobilized on Borosilicate Carriers. Fermentnaya I Spirtovaya Promyshlennost, 31.

Smogrovicova, D. & Domeny, Z., 1999. Beer Volatile By-Product Formation at Different Fermentation Temperature using Immobilized Yeasts. Process Biochemistry, 34, 785.

Smogrovicova, D., Domeny, Z. Gemeiner, P. Malovikova, A. & Sturdik, E., 1997. Reactors for Continuous Primary Beer Fermentation using Immobilized Yeast, Biotechnology Techniques, 11, 261.

Sodini, I., Boquien, C.Y., Corrieu, G. & Lacroix, C., 1997. Use of an Immobilized Cell Bioreactor for the Continuous Inoculation of Milk in Fresh Cheese Manufacturing. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 18, 56.

Speers, R.A. & Ritcey, L.L., 1995. Towards an Ideal Flocculation Assay. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 174.

Stewart, G.G., 1996. Brewing Technology for the Future. The Brewer, 82, 348.

Stewart, G.G. & Russell, I., 2000. Brewer’s Yeast. The Institute of Brewing, England.

Stewart, G.G. & Russell, I., 1981. Yeast Flocculation, in Brewing Science, Ured. J.R.A. Pollock, Academic Press, New York.

Stratford, M., 1996. Yeast Flocculation: Restructuring the Theories in Line with Recent Research, Cerevisiae Belgium Journal of Biotechnology, 38.

Sumino, T., Nakamura, H. & Mori, N., 1993. Development of a High-Efficiency Wastewater Treatment System Using Immobilized Microorganisms. in Industrial Application of Immobilized Biocatalysts. (A. Tanaka, T. Tosa & T. Kobayashi, eds.) New York: Marcel Dekker, 377.

Tata, M., Bower, P., Bromberg, S., Duncombe, D., Fehring, J., Lau, V., Ryder, D. & Stassi, P. 1999. Immobilized Yeast Bioreactor Systems for Continuous Beer Fermentation. Biotechnology Progress, 15, 105.

Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists. 1992. Methods of Analysis. 8th Edition, Minnesota, ASBC.

Teixera, J.M., Teixera, J.A., Mota, M., Manuela, M., Guerra, B., Machado Cruz, J.M. & Sa Almeida, A.M., 1991. The Influence of Cell Wall Composition of a Brewer’s Flocculent Lager Yeast on Sedimentation During Successive Industrial Fermentations. Proceedings of the European Brewery Congress, 241.

Umemoto, S., Mitani, Y. & Shinotsuka, K., 1998. Primary Fermentation with Immobilized Yeast in a Fluidized Bed Reactor. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 35, 58.

Van de Winkel, L., 1995. Design and Optimization of a Multipurpose Immobilized Yeast Bioreactor for Brewery Fermentations. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnoloy, 20, 77.

Van de Winkel, L. & De Vuyst, L., 1997. Immobilized Yeast Cell Systems in Today’s Breweries and Tomorrow’s. Cerevisia Belgian Journal of Brewing & Biotechnology, 22, 27.

Van de Winkel, L., McMurrough, I., Evers, G., Van Beveren, P.C. & Masschelein, C.A., 1995. Pilot-Scale Evaluation of Silicon Carbide Immobilized Yeast Systems for Continuous Alcohol-Free Beer Production. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 90.

Van de Winkel, L., P.C. van Beveren & C.A. Masschelein, 1991a. The Application of an Immobilized Yeast Loop Reactor to the Continuous Production of Alcohol-Free Beer. Proceedings of the 23rd European Brewing Convention Congress, Lisbon, 577.

Van de Winkel, L., P.C. van Beveren, E. Borremans, E. Goosens & C.A. Masschelein, 1991b. High Performance Immobilized Yeast Reactor Design for Continuous Beer Fermentation. Proceedings of the 24th European Brewing Convention Congress, Oslo, 307.

Van Dieren, B., 1995. Yeast Metabolism and the Production of Alcohol-Free Beer. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 66.

Van Iersel, M.F.M., Meersman, E., Swinkels, W., Abee, T. & Rombouts, F.M., 1995. . Continuous Production of Non-Alcohol Beer by Immobilized Yeast at Low Temperature. Journal of Industrial Microbiology, 14, 495.

Van Loosdrecht, M.C.M. & Heijnen, J.J., 1993. Biofilm Bioreactors for Waste-Water Treatment. Trends in Biotechnology, 11, 117.

Vicente, A.A., Dluhy, M. & Teixeira, J.A., 1999. Increase of Ethanol Productivity in an Airlift Reactor with a Modified Draught Tube. The Canadian Journal of Chemical Engineering, 77, 497.

Virkajarvi, I. & Linko, M., 1999. Immobilization: A Revolution in Traditional Brewing. Naturwissehschaften, 86, 112.

Virkajarvi, I. & Kronlof, J., 1998. Long Term Stability of Immobilized Yeast Columns in Main Fermentation. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 56, 70.

Virkajarvi, I. & Pohjala, N., 1999. Profiting from Immobilized Fermentation. Proceedings of the 5th Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, 290.

Wackerbauer, K., Fitzner, M. & Gunther, J., 1996a. Technisch-technologische Moglichkeiten mit Immobilisierter Hefe. Brauwelt, 136, 2140.

Wackerbauer, K., Fitzner, M. & Lopsien, M., 1996b. Untersuchungen mit dem Neuen MPI-Bioreaktor-System. Brauwelt, 136, 2250.

Webb, C., G.M. Black & B. Atkinson, 1986. Process Engineering Aspects of Immobilized Cell System. England: The Institution of Chemical Engineers.

Westrin, B.A. & A. Axelsson, 1991. Diffusion in Gels Containing Immobilized Cells: A Critical Review. Biotechnology and Bioengineering, 38, 439.

Wu, W.T., Wu, J.Y. & Jong, J.Z., 1992. Mass Transfer in an Airlift Reactor with a Net Draft Tube. Biotechnology Progress, 8, 465.

Yamane, T., 1981. On Approximate Expressions of Effectiveness Factors for Immobilized Biocatalysts. Journal of Fermentation Technology, 59, 375.

Yamauchi, Y. & Kashihara, T., 1995a. Kirin Immobilized System. European Brewery Convention Symposium: Immobilized Yeast Applications in the Brewing Industry, Espoo, Finland, 99.

Yamauchi, Y., Kashihara, T., Murayama, H., Nagara, A., Okamoto, T. & Mawatari, M., 1994. Scaleup of Immobilized Yeast Bioreactor for Continuous Fermentation of Beer. Master Brewers Association of the Americas Technical Quarterly, 31, 90.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Amikura, T., Hiratsu, H., Nagara, A., Kamiya, T. & Inoue, T., 1995b. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. 1. Heat Conversion of α-Acetolactate. Journal of Biotechnology, 38, 101.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Kajino, K., Nagara, A. & Noguchi, K., 1995c. Rapid Maturation of Beer Using an Immobilized Yeast Bioreactor. 2. Balance of Total Diacetyl Reduction and Regeneration. Journal of Biotechnology, 38, 109.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A. & Kashihara, T., 1995d. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Sulfite Formation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 277.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M. & Nakanishi, K., 1995e. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Balance Control of Extract and Amino Acid Uptake. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 245.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M., Yasui, T. & Nakanishi, K., 1995f. Rapid Fermentation of Beer Using an Immobilized Yeast Multistage Bioreactor System: Control of Minor Products of Carbohydrate Metabolism. Applied Biochemistry and Biotechnology, 53, 261.

Yuan, X., 1987. Application of Immobilization Technique in Brewing Industry. Shipin Kexue, 94, 8.

Zhang, Z., Su, E. & Yu, J., 1988. . Studies on Continuous and Rapid Fermentation of Beer by Immobilized Yeast. Gongye Weishengwu, 18, 11.

Kratki prikaz izuma

Ovaj izum odnosi se na proizvodnju alkoholnih pića. Proizvodnja obuhvaća fazu kontinuirane fermentacije koja se upotrebljava za inokuliranje i/ili barem početnu fermentaciju sladovine koja sadrži fermentabilne šećere.

Potanko je pripremljen unaprijeđeni proces u kojem je korišten ‘gas-lift’ bioreaktor i flokulirajući (i posebice visoko flokulirajući ili superflokulirajući ) soj kvasca, i gdje je primjenjena stroga kontrola koncentracije kisika. U posebno preferiranom obliku ovog izuma, "barem djelomično fermentiran" otpust iz kontinuiranog procesa doprema se za dovršenje u šaržnu prerađivačku fazu. (koja u kontekstu tvrdnji za ovaj izum može uključiti - ali nije limitirana sa - završetkom fermentacijskog procesa u kojem se fermentabilini šećeri prevode u alkohol). Ovaj izum odnosi se na proizvodnju piva, (posebno svijetlih tipova, lager piva, i sjevernoameričkih tipova piva). U vezi s tim vidi Essentials of Beer Style - F. Eckhardt.

Proces prema zahtjevu 1, gdje se kontinuirana faza provodi u ‘gas-lift’ bioreaktoru.

U skladu sa kontinuiranom fazom koja se pokazala korisnom u raznim aspektima prikazanog izuma, poželjno je da se upotrijebe imobiliziriane stanice (naspram potpuno slobodnih stanica), a to je moguće upotrebom odabranog nosača za imobilizaciju ili flokulirajućih kvasaca. Usprkos gore navedenom, poželjno je koristiti flokulirajuće kvasce umjesto stanica imobiliziranih u nosaču, a za to su posebno pogodni superflokulirajući kvasci.

Više detalja u vezi sa preferiranim postupcima i prednostima kontinuiranih procesa dani su u deteljnom opisu ovog izuma. U te detalje spadaju i upotreba umjetnih (kontroliranih) smjesa plinova, i upotreba dušika, ugljičnog dioksida, ali i zraka. Dodatno je ovdje dano više detalja o procesnoj fazi držanja šarže. Valja primjetiti da je u nekim slučajevima u ovom izumu fokus procesa držanja šarže ide dalje od pitanja "završteka" konverzije fermentabilnih ugljikohidrata u alkohol (koja u svakom slučaju može biti završena u kontinuiranoj procesnoj fazi). U tim slučajevima glavni fokus procesne faze držanja šarže je na podudarnosti okusa (ili popravljanju), posebno u vezi sa diactilom i acetaldehidom. Preferirani slučajevi ovog izuma osiguravaju distribuciju inokulirane i/ili barem djelomično fermentirane sladovine u post-kontinuiranoj fazi kroz mnogostruku distribuciju (fiksna raznovrsnost ili selektivno spajanje i odspajanje dovodnih cijevi) u veliki broj tankova za držanje. U serijskoj distribuciji, najprije su puni jedan spremnik, pa drugi, i tako dalje. U posebno preferiranom slučaju, globalni kapacitet kontiuiranog reaktora i kapacitet držanja šarži se podudaraju u veličini i broju reaktora/posuda za držanje šarži-tako da produktivnost odgovara kapacitetu tokom vremena. Idealno, iz posude za držanje šarže ispusti se produkt taman na vrijeme da se posudu očisti, ponovno spoji i napuni nadoilazećim izljevom if stadija kontinuirane fermentacije. U skladu sa jednim drugim aspektom ovog izuma, posebna pažnja posvećena je sadržaju kisika u sladovini/pivu, a to se odnosi i na kontinuiranu fazu i na fazu držanja šarže. U kontinuiranoj fazi koncentracija kisika ima cijeli niz utjecaja, ali osobito bi moglo biti poželjno njeno minimiziranje kako bi se osigurala optimalna konverzija viših alkohola u estere koji daju okus pivu. U vezi s tim primjećeno je da koncentracije viših alkohola za vrijeme držanja šarže ostaju uglavnom nepromijenjene, pa je po potrebi korištena stroga kontrola kontrola O2 za balansiranje hlapivih estera okusa. U vezi s tim, rasprskivanje CO2 u sladovinu prije fermentacije može biti korisno. U jednom slučaju ovog izuma, glavna svrha kontinuirane faze je da se njome nizvodno inokulira šaržne fermentacije koja se odvija u procesu držanja šarže. Radi veće sigurnosti, ovdje su u cijelosti sadržane informacije iz prioritetnih dokumenata, i tvore onoliki dio ove specifikacije kao da su u potpunosti reproducirani unutar ovog rada.

Detaljan opis

Slijedi detaljan opis aspekata ovog izuma, u dva dijela:

Opis sadrži i/ili upućuje na grafove, formule, prikaze, i sl., svaki od kojih je označen sa pojmom "Slika", nakon čega slijedi identifikacijski broj, i na priložene slike od kojih je svaka opisana i/ili na koju se upućuje terminom "SL." nakon čega slijedi specifični identifikacijski broj. U ovim slikama nacrtani predmeti ne moraju biti u mjerilu.

Priložene slike

SL. 1 je dijagram toka procesa za sistem kontinuirane fermentacije u probnom mjerilu

SL. 2 je shematski dijagram 50 L GLDT (‘‘gas-lift’ draft tube’) bioreaktora u probnom mjerilu

SL. 3 je prikaz poprečnog presjeka reaktora iz SL. 2, uključujući i lokaciju draft cijevi i unutarnjeg separatora

SL. 4 je detaljan crtež glavene obloge

SL. 5 je detaljan crtež tijela bioreaktora iz SL. 2

SL. 6 je detaljan crtež konusnog dna bioreaktora iz SL. 2

SL. 7 je detaljan crtež cjevastog raspršivača plina u bioreaktoru iz SL. 2. Ukupno je izbušeno 160 rupica (promjera 0.16 cm) u cijevi promjera 1.27 cm sa duljinskim razmakom od 0.8 cm od centra do centra, i širinskom razmakom od 0.6 cm.

SL. 8 je dijagram kontinuirane proizvodnje kuglica upotrebom statičnih mješala (Labatt Patent Application No. 2,133,789)

SL. 9 je slika Siran® staklenih kuglica dostavljenih od Schott Engineering

SL. 10 je slika Celite® kuglica dijatomejske zemlje dostavljnih od World Minerals

SL. 11 je slika kuglica kapa-karaginana proizvedenih u laboratorijima Labatt Brewing Company Limited ("Labatt")

SL. 12 je serija slika koja prikazuje neflokulirajući kvasac, kvasac koji formira lance, i flokulirajući kvasac, respektivno. Ove slike dobivene su mikroskopskom fokusirajućom kamerom pri povećanju 100 X.

SL. 13 je mikroskopska snimka srednje flokulirajućeg soja kvasca LCC3021 pri povećanju 100 X.

SL. 14 je mikroskopska snimka superflokulirajućeg soja kvasca LCC290 pri povećanju 100 X.

SL. 15 je shematski dijagram procesa sa statičnim mješalima za proizvodnju gel kuglica od kapa-karaginana. U statičnom mješalu, tekućina prolazi kroz mješalo (a ne mješalo kroz fluid), što omogućava mješanje tekućina na njihovom putu kroz cjevovod.

SL. 16 je još jedna shema sustava sa GLDT (‘‘gas-lift’ draft tube’) bioreaktorom za primarnu proizvodnju piva

SL. 17 je fotografija posude GLDT bioreaktora iz SL. 15.

SL. 18 je detaljan crtež 13L posude (tj. (8L radnog volumena) GLDT bioreaktora iz SL 16.

SL. 19 je detaljan crtež glavne obologe bioreaktora, uz oznake: 1-otvor za izuzimanje tekućine za senzor kisika; 2-termobunar za senzor temperature, povezan sa termostatskim kontrolerom; 3-temepraturna proba; 4-otvor za povrat tekućine iz senzora za kisik; 5-otvor za inokulaciju; 6-memranski otvor za uzorke sa čepom od nehrđajućeg čelika.

SL. 20 je profil otvora za izuzimanje tekućine za senzor kisika sa jedinicim za punjenje uronjenom u tekuću fazu bioreaktora.

SL. 21 je detaljna oprema i nacrt kontinuirane primarne fermetnacije piva u sistemu sa ‘gas-lift’ bioreaktorom (v. tablicu 5.1 za detaljan opis opreme)

SL. 22 je shematski prikaz sistema za geliranje karaginana (prilagođeno iz Rees, 1992)

SL. 23 je shema korištenja sastojaka melase od strane imobiliziranog kvasca za vrijeme fermentacije

SL. 24 je slika kapa-karaginanske gel kuglice sa imobiliziranim stanicama lager kvasce u nultom vremenu fermentacije.

SL. 25 je slika čahure lager kvasca uhvaćenog u kapa-karaginansku gel kuglicu nakon dva dana šaržne fermetnacije. Na kvaščevim stanicama se vide ožiljci od pupanja

SL. 26 je slika vanjskog ruba kapa-karaginanske gel kuglice gdje se vide lager kvasci nakon dva mjeseca kontinuirane fermentacije.

SL. 27 je slika vanjske regije kapa-karaginanske gel kuglice gdje se vide lager kvasci nakon dva mjeseca kontinuirane fermentacije.

SL. 28 je slike lager kvasaca u središtu kapa-karaginanske gel kuglice nakon dva mjeseca kontinuirane fermentacije.

SL. 29 je slike cijele kapa-kariganske gel kuglice nakon šest mjeseci kontinuirane fermentacije; mnoge izlomljene kuglice imale su šuplja središta.

Detaljan opis - Prvi dio

KVAŠČEV SOJ I PRIPREMA INOKULUMA

U fermentacijama provedenim u ovom radu korišten je poliploidni kvasac iz obitelji Saccharomyces cerevisiae (poznat i kao Saccharomyces uvarum i/ili Saccharomyces carlsbergensis). Ovaj kvasac, koji se koristi u proizvodnji piva tipa lager, pivarska zajednica uobičajeno naziva kvascem donjeg vrenja. Ovakva karekterizacija pripisiva je sposobnosti lager kvasaca da se istalože nakon završetka fermenracije. Ale kvasac se, za razliku od lager kvasca, podiže na vrh fermentacijske posude, te je stoga poznat kao kvasac gornjeg vrenja. Sposobnost kvasca da se istaloži ili ispliva ne ovisi nužno o tome da li je kvasac lager ili ale tip, već ona ovisi o soju. Lager kvasac obično ne fermentira pri temperaturama iznad 34oC, dok ale kvasac ne može fermentirati melibiozu, pa znanstvenici za razlikovanje lager od ale kvasaca koriste upravo ova obilježja. (McCabe, 1999).

Srednje flokulirajući soj kvasca Saccharomyces cerevisiae soj 3021 iz Labatt Culture Collection korišten je u fermentacijama sa slobodnim samo-agregiranim stanicama i u fermentacijama sa stanicama imobiliziranim s �-karaginanom. Za pokusne fermentacije sa superflokulirajućim kvascem kao sredstvom za imobilziaciju, korištena je varijanta soja LCC3021, naime LCC290.

Čiste kulture kvasca pohranjene su kriogenički na -80oC u hladioniku smještenom unutar Labatt Technology Development Department. Po potrebi je kvaščeva kultura aerobno uzgojena na 21oC na PYG pločama (3.5 g peptona, 3.0 g kvaščevog ekstrakta, 2.0g KH2PO4, 1.0 g MgSO4•7H2O, 1.0 g of (NH4)SO4, 20.0 g glukoze, i 20.0 g agara otopljeno u destiliranoj vodi do volumena od 1 L). Izolirane kolonije su potom prenesene u epruvete sa 10 mL pasterizirane sladovine i inkubirane uz potresanje na 21oC u periodu od 24 h. Inokulum je progresivno propagiran do volumena od 5 L dodatkom prethodno uzgojene kulture u odgovarajući volumen sladovine (10 ml u 190 ml, 200 mL u 800 mL i 1L u 4L). Kvaščev inokulum je tada prenesen u posude za centrifugiranje i podvrgnut centrifugiranju 10 min. pri 10000 okretaja u minuti na 4oC, a željena masa kvasca za sve naredne fermentacije uzimana je iz dobivenih mokrih peleta kvasca (30% w/v).

MEDIJ ZA FERMENTACIJU:

Lager sladovina industrijske kakvoće, proizvedena u varionici Labatt London, korištena je u svim fermentacijama kao hranjivi medij. Specifična težina sladovine u ovom radu izražena je u stupnjevima Plato-a (oP). Formula 4.1 opisuje vezu između specifične težine i oP.

oP = 135.997· SG3 - 630.272· SG2 + 1111.14· SG - 616.868 (4.1)

Sladovina korištena u ovom radu bile je 17.5 oP što odgovara specifičnoj težini od 1.072.

Tablica 4.1 prikazuje tipičan profil sadržaja ugljikohidrata ove sladovine, koji je određen metodom tekućinske kromatografije visokog učinka (HPLC), opisanom u sekciji 4.7.2. Približno 73% ugljikohidrata u ovoj sladovini je fermantabilno, dok kvasac korišten u ovom radu ne može upotrijebiti i do 27 % ugljikohidrata s dužim lancima.

Tablica 4 .1 Tipični ugljikohidratni sastav sladovine korištene u pokusnim fermentacijama. Sladovinu je proizvedena u pogonu Labatt London, a njena specifična težina iznosila je 17.5 oP.

[image]

Koeficijent varijacije za većinu analiziranih supstancija kreće se između 10 i 20%. Ova varijabilnost je najvećim djelom posljedica upotrebljenih industrijskih procesa, ali i varijabilnosti sirovina od varenja do varenja.

TIPOVI IMOBILIZACIJE

Tri tipa imobilizacije - hvatanje u stupicu, adsorpcija i samo-nagomilavanje - ispitvana su za potrebe ovog disertacijskog istraživanja. Za nosače porijeklom iz industrije najprije su prikazani podaci dobavljača, a njima su onda pridodani rezultati laboratorijskih analiza. Slike i distribucije veličina ispitivanih nosača prikazani su drugdje u ovom radu (kada je bilo moguće).

Dva tipa adsorpcijskih matriksa korištena su za GLDT bioreaktor u probnom mjerilu, a slike obaju ovih nosača prikazana su u ovom radu. Nosač u obliku kuglica od sinter stakla, Siran®, dobavio je Schott Engineering. Odabrane čestice imale su dijametar 1-2 mm, otvorene pore za imobilizaciju kvasca koje su sačinjavale 55-60 % volumena, te distribuciju veličina pora između 60 i 300 mikrometara, što je prikladna veličina za kvaščeve stanice. Za ovaj tip nosača izvješteno je da je kemijski i biološki stabilan, lagano ga se čisti, može ga se iznova upotrebljavati, sterilizirati parom, ne može ga se zbiti, neutralan je okusom, pa je stoga dopušten i u namirnicama.

Sferni nosač od dijatomejske zemlje dobavljen je od World Minerals of California. Prednosti ovog nosača su toplinska i kemijska stabilnost, mehanička čvrstoća i rigidnost. Diatomit, osnovna sirovina, uobičajeno se upotrebljava za filtraciju piva u pivarskoj industriji. Nosač CeliteRR-632 je dizajniran posebno za imobilizaciju cijelih stanica.

Specifikacije proizvođača bile su kako slijedi:

Raspon veličine: 0.595 mm do 1.41 mm (14/30 mesh cut)

Srednji promjer pora: 7.0 μm

Ukupni volumen pora: 1.19 cm3/g

Gustoća zbijenih kuglica: 0.334 kg/m3

Gel kuglice od kapa-karaginana, nosača koji se temelji na hvatanju u zamku, proizvedene su u laboratorijima Labbat Brewing Company Ltd. Postupak proizvodnje opisan je u sekciji 5.2, a rezultati proizvodnje prikazani su u sekciji 6.2.1

Najednostavniji način imobilizacije, samo-nagomilavanje, bilo je moguće odabirom kvaščevih sojeva koji mogu flokulirati. Industrijski lager kvasac LCC3021 posjeduje prirodnu sposobnost flokulacije i smatra ga se srednje flokulirajućim sojem. Kako fermentacija napreduje, mali grumeni kvasca, veličine od 0.5 mm do 1.0 mm, formirat će se u tekućem mediju. Kvasac LCC290, varijanta lager kvasca LCC3021, tvori znatno veće flokule (od 1.0 mm do 5.0 mm, ovisno o brzini potresanja) pa je stoga klasificiran kao superflokulirajući kvasac. U ovom su radu prikazane slike raznovrsnih flokula kvasca.

PROTOKOL ZA UZORKOVANJE

Kako je fermentacija napredovala, bilo je potrebno u brojnim vremenskim intervalima uzimati uzorak iz fermentirajućeg medija, i u tu svrhu su kupljeni sterilni ventili za uzorkovanje Scandi-brew®. Ti su ventili izrađeni od nehrđajučeg čelika, i opremljeni su komorom (razdijeljenom gornjim i donjim otvorom) u kojoj se može pohraniti etanol radi održavanja aseptične okoline. Prije uzimanja uzorka, etanol se ispusti iz komore uklanjanem kapice sa donjeg odlijeva. Svježi etanol (75 % volumena), propusti se kroz komoru i potom se kapica postavi na gornji otvor ventila. Ventil se tada otvori i 50 mL tekućeg uzorka se ispusti u sterilizrani spremnik. U fermentacijama sa superflokulirajućim kvascem prikuplja se i drugi uzorak, kako bi se prije određivanja broja stanica mogla obaviti kvalitetna deflokulacija. Kada je prikupljanje uzorka završeno, komorica ventila se ispere vrućom vodom, peroctenom kiselinom, i na kraju sa etanolom. Kapica se postavi na donji odlijev i komora se napuni sa etanolom, kao priprema za naredno uzorkovanje.

MIKROBIOLOŠKI MONITORING

Određivanje vijabilnosti i broja stanica metodom metilenskog modrila

Tekući uzorci sa suspendiranim kvaščevim stanica prikupe se iz fermentirajućeg medija na gore opisani način. Za brojanje stanica korištenu su komorica Hauser Scientific Company Hemacytometer, volumena 10-4 mL i svijetlosni mikroskop. Tekući uzorci trebaju biti razrijeđeni destiliranom vodom kako bi u brojnom polju ukupan broj stanica kvasca bio od 150 do 200. Heggart i sur., (1999) opisali su sve čimbenike koji utječu na svojstva vijabilnosti i vitalnosti kvasca. Za određivanje stupnja vijabilnosti unutar uzorka, korištena je tehnika bojenja metilenskim modrilom, opisana od American Society of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Žive stanice mogu oksidirati metilensko modrilo, i time ga obezbojiti. Nasuprot tome, mrtve stanice će se obojati plavom bojom. U pripremi metilenskog modrila za procijenjivanje vijabilnosti korišteni su slijedeći reagensi:

Otopina A: 0.1g metilenskog modrila u 500 mL destilirane vode

Otopina B: 13.6 g KH2PO4 u 500 ml destilirane vode

Otopina C: 2.4 g Na2HPO4*12H2O u 100 ml destilirane vode

Puferirana, Fink-Kuhles, otopina metilenskog modrila pripremljena je potom mjećanjem 500 mL otopine A sa 498.75 mL otopine B i 1.25 mL otopine C čime je dobivena otopina konačnog pH=4.6. Smjesa razrijeđene suspenzije stanica i metilenskog modrila pripremljena je u epruveti, temeljito pomješana, i ostavljena da miruje nekoliko minuta (čime se omogučava kontakt svih stanica sa bojilom). Potom je jedna kap ove suspenzije stavljena između komorice za brojanje i pokrovnog stakalca (definirani volumen). Postotak vijabilnih stanica određen je brojanjem i živih i mrtvih stanica unutar brojnog polja, i potom djeljenjem broja vijabilnih stanica sa ukupnim brojem stanica.

4.5.2 Određivanje broja imobiliziranih stanica - samo-nagomilavanje.

Upotrebom kvaščevih stanica koje imaju tendenciju tvorbe flokula, točno određivanje broja stanica u tekućem uzorku postaje otežano zbog toga što stanice u uzorku imaju tendenciju taloženja. Kako bi se dobio reprezentativni uzorak, korišten je agens za deflokulaciju. U ovim eksperimentima je za destabilizaciju flokuliranih stanica kvasca upotrebljena 0.5% (v/v) sulfatna kieslina, čime je omogućeno reprezentativno određivanje broja kvaščevih stanica. Za brojanje i određivanje vijabilnosti korištena je procedura opisana u sekciji 4.5.1, uz zamjenu vode sa sulfatnom kiselinom kao sredstva za razrijeđivanje.

Određivanje broja imobiliziranih stanica - gel kuglice

Prije određivanje broja stanica zarobljenih u gelu, bilo je potrebno razoriti gel upotebom aparata Polytron® (Brinkmann Instruments). Uzorak kuglica najprije je propušten kroz sterilno sito (veličina pora 500mm) i potom ispran sterilnom vodom. Jedan mililitar gel kuglica sa imobiliziranim stanicama i 19 mL destilirane vode dodano je u posudu za uzorke volumena 50 mL, gel je fizički razoren upotrebom uređaja Polytron®, čime su stanice oslobođene u otopinu. Nakon toga su za brojanje i određivanje vijabilnosti u uzorku sa disruptiranim gelom upotrebljene metode opisane u sekciji 5.5.1.

Kontrola kontaminacije

U svim fermentacijama provedenim za potrebe ovog rada redovito su provođene kontrole za kontaminaciju. Program kontrole obuhvaćao je provjeru tekućine u kontinuiranim fermentorima od 50 L i sladovine u skladišnim posudama, barem jednom tjedno. Tekući uzorci uzeti su aseptično i razmazani na hranjive podloge sa Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) i 10 mg/L cikloheksimida. Ovi probni uzorci su tada inkubirani na 28oC i do 10 dana u aerobnim i anaerobnim uvjetima. Željeni anaerobni uvjeti stvoreni su stavljanjem odabranih ploča u posude sa paketom AnaeroGen®, koji uklanja sav kisik preostao u posudama. Za provjeru anaerobnih uvjeta korištena je indikator traka (oboji se rozo u prisutnosti kisika). Ovom se metodom može detektirati kontaminacija u tekućem uzorku, ako je ima.

Za detekciju nepivskih ili divljih tipova kvasca korištena je zasebna hranjiva podloga koja ne podržava rast bakterija i/ili pivskog kvasca. Podloge pripremljene sa kvaščevim medijem (YM, Difco Laboratories), uz dodatak 0.4 g/L CuSO4 korištene su za detekciju rasta bilo kojeg od divljih kvasaca (inkubacija 7 dana na 25oC). Detekcija pivskih kvasaca koji nisu lager tipa omogućena je nacijepljivanjem tekućeg uzorka na PYN podloge (Peptone Yeast-Extract Nutrient), Difco Laboratories) i inkubacijom 7 dana na 37oC. Kvasci lager tipa ne rastu iznad 34oC, pa je stoga porast kvasaca na ovim pločama pokazatelj kontaminacije ale kvascima.

ANALITIČKE METODE

Sva oprema kalibrirana je na odgovarajući način, kako je opisano u standarndim industrijskim postupcima za rukovanje

Etanol

Koncentracija etanola u pivu i fermentirajućim uzorcima analizirana je plinskom kromatografijom kako je opisano od Technical Comitee and the Editorial Comitee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Deaerirani uzorak tekućine pomijećan je sa 5%- tnim izopropanolom (v/v) kao unutarnjim standardom, te je potom 0.2 mL ove smjese injektirano u plinski kromatograf Perkin Elmer 8500. U potonjem popisu dani su detalji podešavanja plinskog kromatografa:

Plameno-ionizacijski detektor (FID)

Uređaj za automatsko uzorkovanje Dynatech

Chromosorb 102, pakirani mrežasti potporanj, 80-100 (‘mesh support packing’)

Plin nosač - helij (protoka od 20 mL/min)

Temperatura injektora 175oC, temperatura detektora 250oC i temperatura kolone 185oC izotermno.

Ugljikohidrati

Koncentracije glukoze, fruktoze, maltoze, maltotetroze, polisaharida i glicerola određivane su tekućinskom kromatografijom visokog učinka (sustav Spectra-Physics SP8100XR HPLC). Kolona sa kationskim izmjenjivačem (Bio-Rad Aminex-87K) i dibaznim kalijevim difosfatom kao mobilnom fazom, korištena je za razdvajanje ugljikohidrata. Količine pojedinih spojeva određivane su upotrebom detektora indeksa refrakcije, pomoću kojeg su generirani ‘peak’-ovi za svaki pojedini spoj.

Kromatografija je provedena pri tlaku od 800 psi, temperaturi kolone 85oC i temperaturi detektora 40oC. Uzorci su deaerirani i razrijeđeni do odgovarajuće koncentracije, te je potom u sistem injektirano 10 mikrolitara uzorka uz brzinu protoka 0.6mL/min.

U pivarskoj se industriji uobičajeno koristi i druga metoda za određivanje ukupne količine ugljikohidrata u tekućini. Specifična težina tekućine izražena u stupnjevima Plato-a izmjerena je upotrebom denzitometra Anton Paar DMA-58. Filtirirani i deaerirani uzorci su potom preneseni u posebu staklenu u-cijev, koja je potom podvrgnuta elektroničkoj oscilaciji. Izmjerena frekvencija oscilacije kroz tekućinu dovedena je u vezu sa specifičnom težinom tekućine (g/100g ili oP). Valja napomenuti da se ovakvim mjerenjem mogu samo aproksimativno odrediti ukupni ugljikohidrati u uzorku, budući da se kalibriranje provodi se vodenim otopinama saharoze pri 20oC, čija je specifilna težina ista kao i specifična težina ispitivane sladovine.

Vicinalni diketoni

Ukupne koncentracije diacetila (2,3-butandiona) i 2,3-pentandiona određivane su pomoću plinskog kromatografa Perkin-Elmer 8310, opremljenog sa detektorom koji radi na principu uhvata elektrona (‘electron capture detector’). Plin nosač bio je argon sa 5% metana, sa brzinom protoka 1.0 mL/min, a uzorak je propušten kroz kolonu J & W DB-Wax. Temperatura injektora održavana je na 105 oC, dok je temperatura detektora postavljena na 120 oC. Analizu je olakšao sustav za automatsko uzorkovanje Hewlett Packard 7694E, a kvantifikacija spojeva provedena je računanjem površine ispod ‘peak’-a za svaki pojedini uzorak i usporedbom sa vrijednostima sa unutarnjim standardom za kalibriranje (2,3-heksandioon). Kako bi se odredile "ukupne" koncentracije ovih spojeva, uzorke je najprije bilo potrebno kalibrirati na 65oC i držati ih na toj temperaturi 30 minuta. Ovakvo tretiranje uzoraka prije analize omogućilo je konverziju alfa-acetolaktata i gama-hidroski butirata u njihove respektivne diketone, diacetil i 2,3-butandion.

Esteri i viši alkoholi

Koncentracije nekih od najvažnijih spojeva u pivu mjereni su headspace plinskom kromatografijom. Acetaldehid, etil-acetat, izobutanol, 1-propanol, izoamil acetat, izoamilni alkohol, etil heksanoat i etil oktanoat kvantificirani su uz upotrebu n-butanola kao unutarnjeg standarda. Za samo određivanje korišten je uređaj ze plinsku kromatografiju Hewlett Packard 5890, opremljen sa plameno-ionizacijskim detektorom, uređajem za automatsko uzorkovanje HP 7004 i kapilarnom kolonom J&W DB-Wax. Temperatura injektora bila je 200 oC, detektora 220 oC. Temperaturni program postavljen je na slijedeći način: 40 oC 5 min., skok sa 40 oC na 200 oC brzinom od 10 oC/min, skok sa 200oC na 220 oC brzinom 50oC/min, i konačno održavanje temperature na 220 oC 5 min. Kao dodatak plinu nosaču (helij, protok 6.0 mL/min), dodan je za usporavanje kondenzacije korišten helij (‘makeup gas’) (30ml/min, 28 psig), struja vodika (50mL/min, 25 psig) i struja zraka (300mL/min, 35 psig). Cijeli ciklus plinskog kromatografa za 1mL uzorka trajao je 40 minuta.

Druge analize

Po potrebi su na fermentirajućoj tekućini koja je bila podvrgnuta dozrijevanju i pakiranju provođena i druga analitička mjerenja. Analize gotovog proizvoda provedene su u zavodu Labatt Quality Control prema standardima za pivo, a kao osnova za mjerenje poslužili su postupci opisani od Technical Committee and the Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Popis analiza, zajedno sa kratkim opisom relevantnosti mjerenja prikazan je u tablici 4.2.

Tablica 4.2 Analize kvalitete kontrole i njihov opis

[image]

PROTOKOL ZA TALOŽENJE KVASCA - LCC290

Priprema uzorka

Superflokulirajući kvasac (LCC290) uzgojen je u sladovini prema postupku opisanom u sekciji 4.1. Takav inokulum je potom centrifugiran 15 minuta na 10000 o/min pri temperaturi od 4oC, čime je dobiven pelet kvaščevih stanica za daljnju inokulaciju. Sladovina je, kako je opisano u sekciji 4.2, pasterizirana na 100oC 60 minuta, te je potom 1L ovakve sladovine aseptično preneseno u 6x2L sterilizirane posude. Svaka posude inokulirana je sa 4g kvaščevih stanica dobivenih centrifugiranjem. Posude su stavljene na inkubaciju uz potresanje 135rpm, 21oC - sobna temepratura. Po jedna posuda je uzimana u vremenskim intervalima od 24h, 40h, 48h, 64h, 71h i 192h, te su u malom uzorku tekućine iz svake posude u datom vremenskom intervalu analizirani ugljikohidrati, koncentracija i vijabilnost kvaščevih stanica (korištene metode su opisane u poglavlju 4). Ostatak tekućine/mješavine kvasca korišten je za taloženje stanica prema protokolu opisanom u sekciji 4.7.2.

Protokol za taloženje kvasca

Brzina taloženja za superflokulirajuće sojeve kvasca LCC290 mjerena je upotrebom slijedeće metode. U svakom uzorku provedena je fermentacija u određenom vremenskom intervalu (sekcija 4.7.1), te je na kraju intervala odgovarajući uzorak uzet za analizu. Uzorci su dobro promješani kako bi se osiguralo suspendiranje svih čestica, te potom odmah preneseni u graduirani cilindar od 1000ml. Dok su se flokule taložile, u intervalima od 30 sekundi mjerena je udaljenost između površine tekućine i granice talog-tekućina, a brzina taloženja izračunata je prema slijedećoj formuli:

[image]

Krivulja ovisnosti brzine taloženja o koncentraciji stanica nacrtana je iz krivulja taloženja dobivenih za svaki fermentacijski inerval upotrebom standardne Kynch-ove metode (1952).

Metode cirkulacije i mješanja

Kako bi se izračunalo vrijeme mješanja i brzina cirkulacije unutar trofazong ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora, korišten je sustav za injekciju kiseline povezan sa sustavom za prikupljanje podataka. Praćenjem promjene pH tokom vremena nakon pulsnog injektiranja jake kiseline u bioreaktor bilo je moguće izračunati brzinu cirkulacije i vrijeme mješanja te ih potom povezati sa jednadžbama prezentiranim u sekciji 3.2.2. Sustav za prikupljanje podataka sastojao se od slijedećeg:

Ingold-ova pH proba (Cole-Parmer, cat. #P-05990-90) povezana sa Ingold-ovim pH transmiterom sa ugrađenim mikroprocesorom (Model 2300)

Kartica za prijevod podataka DT2805

Osobno računalo 386DX

Program za prikupljanje podataka napisan u Quick Basic-u (autori C. Hudson i J. Beltrano, 1994, modificrao N. Mensour 1998.)

Deset mililitara 10N kloridne kiseline injektirano je u prstenasto odjeljenje gas lift draft tube bioreaktora (dijagram je prikazan na slici 5.5), tik ispod mjesta gdje je locirana pH proba. Ova udaljenost je odgovarala visini od 26 cm ispod glavne obloge. pH proba je prije svih eksperimanata dva puta kalibrirana sa standardnim puferima (Beckman-ov pH 7.0 zeleni pufer i Beckman-ov pH 4.0 crveni pufer). Struja jakosti 4-20 mA koju je proizveo pH metar transformirana je na vijčanoj kontrolnoj ploči u napon koji je potom mjeren na kartici za prikupljanje podataka smještenoj unutar računala. Program za prikupljanje podataka pokrenut je simultano sa injekcijom kiseline u bioreaktor. Vrijeme prikupljanja podataka bilo je 5 minuta, sa frekvencijom uzorkovanja 50Hz. Duljina niza je u programu postavljena na 3750 (prikupljeno ukupno 15000 točaka), uz dobitak jednog skupa po kartici za prikupljanje podataka.

Za daljnju analizu prikupljeni podaci preneseni su iz laboratorija u snažnije računalo (Pentium II mikroprocesor). Program TableCurve 2D (Jandel Scientific Software Labtronics, Canada) ekstenzivno je upotrebljavan za analizu podataka zbog mogućnosti obrađivanja velikih skupova podataka, kao i zbog mnogih ugrađenih funkcija za rukovanje podacima (data smoothing, curve fitting). Za uklanjanje šuma korišten je algoritam Savitzky-Golay, metoda zaglađivanja u vremenskoj domeni temeljena na najmanjem kvadratu polinoma četvrtog stupnja ugođena duž pomičnog prozora. Podešeni podaci su prilagođeni tako da pokazuju promjenu pH umjesto izmjerenog pH. Podešeni podaci aproksimirani su prigušenom sinusnom krivuljom. Vremena mješanja i brzine cirkulacije su onda izračunate iz parametara krivulje. Eksperimenti mješanja provedeni su na stvarnim fermentacijama unutar 50 litarskog ‘gas lift’ bioreaktora sa jednim od tri nosača za imobilizaciju (superflokulirajući kvasac LCC290, srednje flokulirajući kvasac LCC3021 ili gel-kuglice od kapa-karaginana). Tekuća faza bilo je fermentirano pivo specifične težine 2.5 oP, a plinovita faza sastojala se od ugljičnog dioksida kao plina za mješanje. Temperatura fermentacije održavana je na 15oC. Prividne brzine plina za mješanje varirane su od 2.0 do 6.0 mm /s. Pri danoj brzini protoka plina sistem je ekvilibriran 10 minuta, te bi započeo test injektiranja kiseline koji bi bio ponovljen tri puta. Potom bi se odabrala slijedeća brzina protoka plina, i smjesi unutar reaktora bi se podesio pH na početnu razinu.

KONSTRUKCIJA SISTEMA SA ‘GAS-LIFT’ DRAFT-TUBE BIOREAKTOROM U PROBNOM MJERILU

FERMENTACIJSKI SUSTAV S ‘GAS-LIFT’ DRAFT-TUBE BIOREAKTOROM

Sistemi ‘draft-tube’, sa fluidiziranim slojem pokazali su svoju vrijednost u trofaznim sustavima. Za potrebe eksperimentalnog dijela ovog rada, dizajnirana su, izgrađena i postavljena dva ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora u probnom mjerilu u Experimental brewery of the Labatt Brewing Company. Dodatno su i neki od postojećih spremnika modificrani za uskladištavanje sladovine i prikupljanje piva. Dijagram toka na SL.1 prikazuje cjelokupni proces provedenih kontinuiranih fermentacija u probnom mjerilu, a u tablizi 5.1 dan je popis sa detaljnijim opisom opreme prezentirane na SL. 1.

Sladovina je dostavljena iz pogona London Brewing i prenešena u spremnike za sladovinu radnog volumena 1600 L (WT1 i WT2) kroz cijevi od nehrđajućeg čelika promjera 5.08 cm. Ovakav sustav sa dva spremnika osigurava kontinuirani pritok hranjivog medija u fermentore u probnom mjerilu (R1 i R2), a svaki spremnik je opremljen sustavom za raspršivanje radi kontrole oksigenacije i homogenosti, te plaštom za hlađenje sa glikolom kao rashladnim sredstvom, radi kontrole temperature. Na ovaj način postavljen centralni sustav omogućava prihranjivanje i do tri nezavisna fermentora putem središnjeg sustava ventila (V7, V8 i V9). Peristaltičnim crpkama Masterflex® osiguran je željeni pritok sladovine u probne bioreaktore.

Tablica 5.1. Opis pojedinih djelova opreme prikazane na Slici 5.1

[image] [image]

Ugljik dioksid i zrak raspršivani su u ‘gas-lift’ sistem kroz raspršivače za zrak izrađene o nehrđajućeg čelika (SL. 7). Rotametri (RM3, RM4, RM5 i RM6) korišteni su za praćenje protoka zraka. Sterlini filteri (mreža 0.2 μm) instalirani su na plinovode kako bi se osiguralo da se u bireaktore ne uvedu kontaminanti. Prdukt se iz bioreaktora prelijevao preko prelijevnog sustava (SL. 4), te je na taj način samo pumpa za prihranjivanje regulirala vrijeme zadržavanja. Oba reaktora (R1 i R2) spojena su sa otpadnom posudom za pivo (WBT1) u kojoj se skupljala prelivena tekućina. Za procesiranje i sakupljanje proizvoda su po potrebi korišteni posebne 50 litarske posude. Detaljniji dijagram i točne dimenzije 50 litarskog bioreaktora u probnom mjerilu dane su u sekciji 5.1.1. Protokol za rukovanje sladovinomi njeno skladištenje biti će opisan u sekciji 5.1.2, dok će protokoli za čišćenje i sterilizaciju sustava za kontinuiranu fermentaciju biti prodiskutirani u sekciji 5.1.3. U sekciji 5.1.4 pokriven je protokol za fermentaciju korišten u ovom radu.

Specifikacije i dizajn reaktora.

Bioreaktor volumena 50 litara dizajniran za potrebe ovog rada bio je u potpunosti izrađen od nehrđajućeg čelika 304L, sa četiri prozora od Plexiglas-a smještenih na tijelu reaktora, kako bi se moglo pratiti kretanje tekućine i čestica. Ovaj materijal odabran je zbog rezistentnosti na kemikalije za sanaciju (lužina i kiselina), kao i postojanosti prilikom sterilizacije parom. Drugi važan aspekt dizajna bila je minimizacija opreme bioreaktora u direktnom kontaktu sa medijem za fermentaciju. Stoga su otvori zavareni, a gdje je bilo potrebno, korišteni su sanitarni fitinzi TriClover. Reaktor je dizajniran tako da ima proširenu glavnu regiju radi boljeg otpuštanja plina, čime se poboljšava transfer mase tekućina- krutina (Chisti & Moo-Young, 1993). Dno reaktora bilo je čunjastog oblika sa kutem od 90 stupnjeva, kako bi se spriječilo nagomilavanje krutina na dnu. Na SL.2 prikazan je shematski dijagram 50 litarskih probnih sistema koji su instalirani u Labatt Experimental Brewery. Na dijagramu su pokazane lokacije ulaza raspršivanog plina, ulaza tekućine, plašta za hlađenje glikolom, izlaza produkta, sistem za mjerenje i kontrolu temperature, kao i lokacije dvaju sanitarnih otvora za uzorkovanje. SL.3 prikazuje isti GLDT bioreaktor, ali su dimnezije dane u centimetrima. Na SL. 4-SL.6 detaljno su prikazane sekcije GLDT bioreaktora, a SL.7 pokazuje shemu raspršivača za zrak korištenog o ovim eksperimentima.

Unutarnja draft cijev i separator čestica (ploča) ilustrirani su na SL. 3. Omjer promjera draft cijevi i reaktora od 2/3 odabran je na temelju literaturnih podataka (Chisti, 1991). Povećanjem promjera ploče za kontrolu protoka tekućine (20.32 cm u usporedbi sa promjerom draft cijevi od 10.16 cm), moguće je postići veću razliku između brzine dizanja mjehurića i brzine spuštanja tekućine-krutog fluida. Zbog toga će biti smanjeno povlečanje plina u kružni dio bioreaktora, što rezulira boljim prijenosom mase krutine-tekućina.

Cjevasti raspršivač (SL. 7) dizajniran je za injektiranjeugljičnog dioksida kao plina za mješanje u dio sa centralnom cijevi. U raspršivaču promjera 1.27 cm izbušeno je ukupno 160 rupica promjera 0.16 cm. Longitudinalni razmak između rupica bio je 0.8 cm od centra jedne rupice do centra druge rupice (8 redova sa po 20 rupica). Promjer rupice od 0.16 cm odabran je zbog toga što je jedina namjera raspršivanog plina bila mješanje bioreaktora.

Protokol za rukovanje sladovinom i njeno skladištenje

U tradicionalnim fermentacijskim procesima sladovina se ne skladišti duži vremenski period bez da ju se inokulira sa kvascem. Oksigenirana sladovina je izvrstan medij za rast velikog broja mikroorganizama, uključujući kvasac. Budući da je za fermentaciju u kontinuiranim gas-lift sustavima potrebno uskladištiti veliku količinu sladovine, bilo je nužno razviti postupke za njeno uskladištenje i transport. Mišljenje je istraživača da se neoksigenirana sladovina može skladištiti do dva tjedna bez opasnosti od kontaminacije, pod uvjetom da je na odgovarajući način bila prenesena u spremnik za sladovinu. Također se smatralo da se temperatura sladovine u spremniku mora kontrolirati na odgovarajući način. Dostupni spremnici u ekperimentalnom postrojenju su dizajnirani za fermentaciju, a ne za skladištenje sladovine, pa je proveden pokus u kojem je testirana sposobnost ovih spremnika da održavaju konstantnu temperaturu uskladištene tekućine. SL. 2 jasno pokazuje da se ovi spremnici ne mogu koristiti za skladištenje na konstantnoj temperaturi od 4 oC ukoliko se ne primjeni mješanje. Sladovina je najprije prenesena u spremnike pri temperaturi od 4 oC, te su potom mjerene temperature na nekoliko mjesta unutar spremnika kako bi se stekao bolji uvid u stvarnu temperaturu sladovine. Kada je sladovina bila pohranjena u spremniku 24 sata, bez mješanja, njena temperatura na vrhu spremnika dosegla je 20 oC. U sredini spremnika porast temperature je bio nešto manji (�T ~ 3 oC), dok je u konusnom dijelu temperatura ostala blizu početnih 4 oC.

[image]

Slika 5.8 utjecaj mješanja pomoću plina na profil temperatura unutar konusno-clilindričnog spremnika za sladovinu. Sladovina je unesena u spremnik na temperaturi od 4 oC, a mjerenja su provedena 24 sata nakon punjenja spremnika. Protok upuhivanog ugljičnog dioksida bio je 0.113 cm3/h, a ambijentalna temperatura 19.8 oC. Mjesta mjerenja: (1) vrh spremnika uz stijenku; (2) vrh spremnika u sredini; (3) sredina spremnika uz stijenku; (4) sredina spremnika u sredini; (5) vrh konusnog djela uz stijenku; (6) vrh konusnog djela u sredini; (7) dno konusnog djela

Održavanje temperature sladovine na temperaturi 4 oC omogućeno je iniciranjem plinovitog ugljičnog dioskida s brzinom protoka od 0.133 cm3/h. Kao rezultat ovih nalaza, oba spremnika za sladovinu opremljena su na bazi konusnog dijela spremnika sa sanitarnim cjevovodima promjera 2.54 cm, radi mješanja sladovine.

Neaerirana sladovina potom je iz postrojenja Labatt London prenesena u posudu sa puferom kroz cijevi od nehrđajučeg čelika, promjera 5.08 cm. Iz ove je posude sladovina provedena kroz flash uređaj za pasteurizaciju, i konačno uskladištena u jednom od dva spremnika za sladovinu (WT1 ili WT2) do dva tjedna.na temperaturi od 2 oC. Navedeni korak sa pasteriziranjem uveden je kao mjera predostrožnosti, kako bi se, za vrijeme perioda skladištenja sladovine, iz nje eliminirali neželjeni mikroorganizmi. Upotrebom neoksigenirane sladovine minimiziran je štetni učinak kisika na vruću sladovinu (formiranje aldehida), a dodatno je postignuta i kontrola kisika u kontinuiranim fermentorima pomoću zraka uvedenog sa raspršivanim plinom.

Nakon što je sladovina pohranjena u spremnike za sladovinu, mjerena je koncentracija otopljenog kisika, i na Prikazu 5.9 pokazane se koncentracije otopljenog kisika tokom skladištenja i to za tri različita protokola prijenosa sladovine. U prvom slučaju, nakon prijenosa sladovine u spremnik započeto je upuhivanje ugljičnog dioksida (0.085 m3/h) kako bi se osigurala kontrola temperature. Koncentracija otopljenog kisika je tijekom prvog dana porasla do 1.3 mg/L, da bi potom postupno opadala do koncentracije od 0.1 mg/L, zaključno sa petim danom. U drugom je slučaju spremnik za sladovinu najprije pročišćen upuhivanjem ugljičnog dioksida s protokom 0.85 m3/h u trajanju tri sata, čime je znatno smanjeno otapanje kisika u sladovini i postignuta je željena koncentracija kisika u sladovini (< 0.1 mg/L) u vremenu od dva dana.

[image]

Prikaz 5.9 Kontrola koncentracije otopljenog kisika u sladovini za vrijeme prijenosa iz pogona London. Procijenjena su tri protokola, pri čemu je treći protokol zapravo kombinacija dvaju prethodnih. Temperatura sladovine održavana je na 4 oC.

U trećem je slučaju spremnik ponovno pročišćen ugljičnim dioksidom, kako je opisano u gonjem tekstu, a dodatno je za vrijeme punjenja spremnika sladovinom, kao i tokom cijelog vremena skladištenja, u spremnik kontinuirano uvođen ugljični dioksid (0.085 m3/h). Na ovaj način je koncentracija otopljenog kisika u sladovini tokom cijelog perioda skladištenja svedena na minimum (<0.1 mg/L), pa je ova metoda čuvanja korištena za svaku narednu pošiljku sladovine.

5.1.2 Protokol za sterilizaciju i čišćenje

Spremnici za skladištenje sladovine podvrgnuti su ciklusu čišćenja koji se sastojao od slijedećih koraka: predpranje vrućom vodom (85 oC), pranje kaustičnim sredstvom (40 % sredstvo pri 60 oC), i naposljetku ispiranje vrućom vodom (85 oC). Sanacija spremnika postignuta je ispiranjem dovođenjem u kontakt stjenki spremnika sa otopinom peroctene kiseline (2 % w/v). Sustav cijevi za prijenos sladovine podvrgnut je istom režimu čišćenja i sanacije.

Bioreaktori volumena 50 L čišćeni su i sterilizirani na drugi način. Najprije su isprani vrućom vodom (60 oC), i zatim napunjeni do vrha toplom vodom (40 oC). U vodu je dodano industrijsko sredstvo za čišćenje Diversol CX/A (DiverseyLever, Canada), do konačne koncentracije 2 % w/v, a u dno reaktora je potom uvođen zrak prividnom brzinom 5 mm/s, kako bi se omogućilo temeljito otapanje sredstva i njegov kontakt sa reaktorom. Nakon jednog sata, reaktor je ispražnjen i ispran vodom iz gradskog sustava vodoopskrbe. Ovaj postupak ponovljen je još jednom, nakon čega je reaktor dvaput napunjen gradskom vodom i potom ispražnjen.

Otpadni spremnik za pivo čišćen je 2%-nom (w/v) otopinom sredstva Diversol CX/A. Za razliku od gas-lift bioreaktora, za čišćenje ovog spremnika nije korišteno uvođenje zraka, budući da na njega nije postavljen upuhivač. Mehaničko mješanje je stoga ostvareno kotrljanjem spremnika po njegovom plaštu, a ovaj ciklus ponovljen je dvaput, nakon čega je spremnik dvaput ispran vodom.

Biorektori volumena 50 L su, prije sterilizacije parom, spojeni na otpadni spremnik za pivo, te je iskopčana dovodna cijev za sladovinu i uvođenje plina u bioreaktor. Potom su otvoreni ventili V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17 i V18, i uklonjeni filteri F5, F6 i F7. Ovi filteri i cjevovodi odvojeno su autoklavirani 15 minuta na 121 oC. Dotok pare povezan je sa ventilima V12 i V16, ventil za paru lagano je otvoren kako bi se minimiziralo oštećenje opreme, i pomno je praćena temperatura unutar reaktora. Nakon što je unutarnja temperatura dosegnula 100 oC, sterilizacija je provođena jedan sat. Na kraju tog perioda najprije su zatvoreni ventili V10, V11, V14, V15 i V18, zatim je prekinut dotok pare i spojen je sterilni filter F7. Neposredno zatim na cjevovod za dotok plina spojeni su sterilizirani filteri F5 i F6, te je započeto upuhivanje ugljičnog dioksida prividnom brzinom 3 mm/s. Struja ugljičnog dioksida na samo da je sprečavala kolaps bioreaktora za vrijeme hlađenja, već je i iz gas-lift bioreaktora istisnula eventualno prisutni zrak.

Dovodna cijev za sladovinu spojena je sa bioreaktorom nakon što je postignuta unutarnja temperatura od 20 oC. Dotok pare je, uz još uvijek zatvorene ventile V2, V5, V10 i V14, te otvorene ventile V6, V7, V8, V9, V11, i V15, povezan na ventil V3 ili V6, ovisno o korištenoj zalihi melase. Ciklus sterilizacije parom trajao je 1 sat, nakon čega su simultano zatvoreni ventili V9, V11 i V15 i dotok pare. Kad su se cijevi ohladile na sobnu temperaturu (20 oC), zatvoreni su ventili V3 i V6 i iskopčan je dotok pare. U ovom je trenutku cijeli sustav za kontinuiranu fermentaciju, uključujući spremnike sladovine, 50 litarske bioreaktore i otpadni spremnik za pivo, bio sterilan i spreman za fermentaciju.

5.1.3 Protokol za fermentaciju

Gas lift draft tube bioreaktori volumena 50 L u probnom mjerilu korišteni su za primarnu fermentaciju sladovine u pivo. Kontrola temperature omogućena je hlađenjem plašta sa glikolom, a ciljna temperatura kroz cijelo vrijeme trajanja pokusnih fermentacija bila je 15 oC. Svaki bioreaktor opremljen je sa temperaturnom probom kojom se mjerila temperatura, i termočlankom i solenoidnim ventilom za glikol za regulaciju dohranjivanja glikola u reaktor. Fermentori su također bili opremljeni sa primarnim plinom za mješanje (ugljični dioksid ili dušik), kao i sa dotokom zraka za doziranje kisika. Željena mješavina plinova postignuta je podešavanjima odgovarajućeg rotametra/needle ventila i provođenjem smjese plinova kroz sterilni filter (Millipore, Millex®-FG50, jedinica filtera0.2 μm) u draft cijev bioreaktora. U svim fermentacijama prividna brzina zraka bila je 0.39 mm/s (0.4 scfh), dok je brzina primarnog plina za mješanje za svaki tip imobilizacije bila podešavana po potrebi.

U početku je fermentacjia u 50 L gas-lift bioreaktoru vođena šaržno, a kasnije je nastavljena kontinuirano. Nakon čišćenja i sterilizacije postupcima opisanim u sekciji 5.1.2, bioreaktor je napunjen sa 50 litara sladovine iz spremnika za sladovinu (WT1 i WT2), koja je onda inokulirana sa 200 grama kvasca (4g/L) kroz sterili otvor za uzorak Scandi-Brew®. Kada su korištene gel-kuglice od κ-karaginana, u bioreaktor je inokulirano 20 L kuglica, što je rezultiralo početnom koncentracijom srednje flokulirajućeg kvasca LCC3021 od 4g/L. Iz bioreaktora su svakodnevno uzimani uzorci te je pomno praćena promjena koncentracije diacetila i specifična težina tekućine. Proces je vođen šaržno sve do trenutka kada je specifična težina dosegnula minimum i koncentracija diacetila pala ispod 30 μg/L, kada se prešlo na kontinuirano vođenje procesa.

Medij za fermentaciju (sladovina) je kontinuirano dostavljana kroz dno bioreaktora, dok se nezrelo pivo izljevalo preko lijevka na vrhu reaktora. Kako je radni volumen reaktora bio konstantan, prosječno vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru bilo je kontrolirano brzinom pritoka svježe sladovine u reaktor. Tekući uzorci svakodnevno su uzimani kroz sterilni ventil (Scandi-Brew®) iz izlaznog djela reaktora, radi kemijskih i mikrobioloških analiza. (metode su opisane u Poglavlju 4)

U odabranim vremenskim razdobljima, proizvod kontinuirane fermentacije u velikim količinama (sterilne posude od nehrđajučeg čelika volumena 40 L) prikupljan je iz bioreaktora za primarnu fermentaciju i podvrgnut post-fermentacijskoj obradi kako bi se proizvelo zrelo, prodajno pivo za procjenu i usporedbu sa industrijski proizvedenim kontrolnim pivom. Odabrani 50 litarski bioreaktor najprije je odpojen od otpadnog spremnika za pivo i neposredno nakon toga spojen sa spremnikom za prikupljanje piva. Nakon prikupljanja, bioreaktor je ponovno spojen sa otpadnim spremnikom za pivo. Sakupljeno nezrelo pivo potom je podvrgnuto odležavanju radi smanjenja koncentracije diacetila ispod 30 μg/L. Prisutne kvaščeve stanice se istalože (koncentracija stanica ~ 1-5 milijuna stanica / mL), i pivo spremi na hladno mjesto radi dozrijevanja (7 dana na 2 oC). Nakon dozrijevanja, pivo je filtrirano, razrijeđeno do volumnog udjela alkohola u pivu od 5 %, i karbonizirano prije pakiranja u pivske boce volumena 341 mL. Pakirano pivo je potom podvrgnuto pasterizaciji (oprema pogona Labatt).

5.2 KONTINUIRANA PROIZVODNJA GEL-KUGLICA

Da bi se omogućila dobava imobiliziranih stanica kvasca LCC3921 u kontinuirane 50 litarske GLDT bioreaktore opisane u sekciji 5.1, cilj ovog djela rada bila je procjena procesa za kontinuiranu proizvodnju kuglica u proizvodnji gel-kuglica inokuliranih sa stanicama kvasca.

Proces proizvodnje (SL. 8) zahtjevao je najprije stvaranje emulzije između nevodene kontinuirane faze (biljno ulje) i dispergirane vodene faze (otopina κ-karaginanskog gela pomješana sa kvaščevim stanicama) pomoću statičnih mješala. Nakon stvaranja emulzije slijedilo je njeno brzo hlađenje kako bi se induciralo geliranje polimera, a formirane kuglice su zatim uronjene u otopinu kalijevog klorida koji potiče učvršćivanje kuglica kao i odvajanje kuglica od uljne faze.

Formiranje gel kuglica od κ-karaginana provođeno je u vodenoj kupelji temperiranoj na 37 oC, kako bi se spriječila prerana tvorba karaginanskog gela. Sterilizirani polimer čuvan je u vodenoj kupelji na 37 °C, a kvaščev inokulum čuvan je prije imobilizacije na 20 oC. Kako bi se stanice ravnomjerno dispergirale u gelu, gusta otopina kvasca i gel pumpani su pomoću peristaltičkih pumpi Masterflex kroz 24 elementa statičnog mješala promjera 6.4 mm. Sterilizirano ulje, pohranjeno na sobnoj temperaturi, pumpano je (peristaltička pumpa Masterflex) u vruću vodenu kupelj radi postizanja temperature od 37 °C.

Inokulirani polimer (vodena faza) je potom pomješan sa uljem (kontinuirana faza) u seriji statičnih mješala, čime je stvorena željena emulzija, koja je potom brzo ohlađena na 5 °C u vodenoj/ledenoj kupelji. Hlađenje je izazvalo geliranje kapljica polimera u obliku kuglica, koje su nakon toga prebačene u sterilnu otopinu kalijevog klorida koncentracije 22 g/L, što je pomoglo njihovom učvršćivanju i izdvajanju iz uljne faze. Korišteno ulje je reciklirano u postupak, a vodena faza (kuglice i otopina kalijevog klorida) prebačena je u novi spremnik radi određivanja veličina kuglice prije no što će njima biti punjeni 50 litarski bioreaktori.

5.2.1 Statična mješala - tip Kenics

U srcu postupka proizvodnje novih kuglica nalaze se statična mješala Kenics (Cole Parmer Instrument Company, Niles, Illinois, SAD). Oni su sastoje od niza stacionarnih elemenata smještenih u cijevi promjera jednakog promjeru statičnog mješala. Ovi elementi tvore prekrižene kanale, koji pomažu razdiobu i longitudinalnu rekombinaciju tekućine koja prolazi kroz statično mješalo. Ovaj sustav za mješanje dodatno potpomaže poprečno kidanje ovih fino formiranih tokova i njihovo mješanje u emulziju veće homogenosti.

Tablica 5.2 prikazuje tri tipa statičnih mješala korištenih u ovom radu.

Tabica 5.2 Opis statičnih mješala Kenics korištenih u ovom radu. (dobavljač - Cole Parmer)

[image]

5.2.2 Materijali za proizvodnju gela

Dva glavna materijala korištena u proizvodnju gel kuglica bili su ulje i polimer. κ-karaginan (tip X-0909, lot 330360, Copenhagen Pectin, Denmark), polisaharidni polimer dobiven ekstrakcijom iz crvenih algi nem je velikodušno poklonila tvrtka Copenhagen Pectin A/S. Ovaj polimer posjeduje jedinstvena svojstva termo-geliranja, pri čemu temperatura geliranja ovisi i o koncentraciji κ-karaginana ([Car]) i o koncentraciji kalijevog klorida ([KCl]). Polimer je otopljen u destiliranoj vodi sa 2.0 g/L KCl na 80°C, do koncentracije od 30 g/L, a nastala otopina imala je temperaturu geliranja 28ºC. Gel je autoklaviran 1 sat na 121 oC i spremljen u vodenu kupelj na temperaturu od 40 oC kako bi se spriječilo skrutnjavanje. Standardno komercijalno ulje (Pasquale Bros. Inc., Canada) također je sterilizirano 1 sat na 121 oC, te potom, do upotrebe, pohranjeno na sobnu temperaturu (20°C). Gusta suspenzija kvasca pripravljena je postupkom opisani u sekciji 4.1.

5.2.3 Mjerenje promjera kuglica

Uzorci kuglica prikupljanji su na izlazu iz izmjenjivača topline (temperatura 5 °C) u tikvice sa 100 mL otopine KCl-a koncentracije 22 g/L, gdje su držane dva sata kako bi se omogućilo dobro upijanje tekućine i poduprlo njihovo skrutnjavanje. Ulje je iz vodene faze uklonjeno uzastopnim ispiranjem sa otopinom kalijevog klorida, a uzorci su potom pohranjeni na 4 °C kako bi se prije analize spriječila kontaminacija mikroorganizmima.

Promjer kuglica mjeren je pomoću programa za analizu slike Optimas (Version 4.02, BioScan, Inc, USA) povezanim sa video-kamerom (Pentax Macro 50 mm). Uzorak kuglice prebačen je u petrijevku u kojoj se nalazio fini film vode (radi razdvajanja kuglica) i postavljen ispod kamere. Ukupno je ovi sustavom izmjeren promjer 300-400 kuglica, a navedenim programom moguće je mjeriti između 100 μm i nekoliko mm, uz maksimalnu apsolutnu pogrešku od 30 μm. Podaci dobiveni programom Optimas dalje su analizirani u Microsoft Excel-u, a dobivene distribucije veličina u uzorku opisane su srednjim promjerom uzorka (DB) i koeficijentom varijacije (COV).

5.2.4 Procjena sustava za proizvodnju kuglica – plan ekperimenta

Kako bi se na temelju srednjeg promjera uzorka i koeficijenta varijacije distribucije, dobila procijena o tipu populacije proizvedenih kuglica, uspoređeni su rezultati upotrebe statičnih mješala triju različith promjera (Ds = 6.4 mm, 9.5 mm i12.7 mm). Broj elemenata statičnog mješala (Ns) variran je između 12 i 120 dok je volumni udio polimera (�C) u eksperimentima iznosio od 8.3 % v/v do 50 %v/v gela u uljnoj otopini. Kada je �C iznosio više od 50 %, došlo je do inverzije dispergirane (gel) i kontinuirane (ulje) faze. Drugim riječima, došlo je do inkluzije kapljica ulja unutar mreže polimera, umjesto inkluzije kapljica gela unutar uljnog matriksa. Prividna brzina emulzije ulje/gel u sekciji za emulgiranje podešena je u rasponu od 3.6 cm/s do 17.8 cm/s. Prividna brzina tekućine kroz statično mješalo za emulziju izračunata je pomoću slijedeće jednadžbe:

VSL = (Qoil+ Qcar)/S

gdje je S površina poprečnog presjeka cijevi sa statičnim mješalom, Qoil je brzina protoka uljne faze, a Qcar je bzina protoka otopine karaginanskog gela.

Rezultati i diskusija: fermentacije i dinamika mješanja unutar gas-lift bioreaktora volumena 50 l

Već ranije je objavljena upotreba imobiliziranih stanica u proizvodnji etanola, a u zadnja dva desetljeća istraživači su pokušali optimizirati proces proizvodnje etanola povezivanjem tehnologije imobiliziranih stanica sa kontinuiranim vođenjem procesa (Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella, 1983). Velik broj istraživača postigao je uspjeh, pa je upotreba kontinuiranih sistema sa imobilizranim stanicama našla primjenu u industriji. Međutim, implementacija takvih kontinuiranih procesa u pivarskoj industriji za primarnu fermentaciju piva nije tako jednostavna, zato što se pivo ne sastoji samo od etanola, već i od cijele palete spojeva koji mu daju okus, što konačnom proizvodu daje kompleksnost i dubinu. U narednom su poglavlju opisani rezultati dobiveni u ovom radu, koji su rezultat potrage ovog autora za procesom proizvodnje dobro izbalansiranog piva u probnom GLDT bioreaktoru.

6.1 Šaržne fermentacije u probnom GLDT sistemu

Šaržne fermentacije, za koje su korištene suspendirane stanice kvasca, provođene su u probnom, 50 litarskom, gas-lift draft tube bioreaktoru. Ove probne fermentacije pružile su mogućnost procjene ostvarivosti upotrebe takvog sistema za fermentaciju sladovine u pivo, a dodatno su poslužile kao standard za buduće usporedbe sa tekućinama iz kontinuiranih fermentacija. Provedene su dvije šaržne fermentacjie u probnim 50 litarskim GLDT bioreaktorima sa lager kvascima iz Labatt Culture Collection (LCC3021). Tokom fermentacija praćene su brzina rasta kvaščevih stanica, potrošnja nutrijenata i nastajanje produkata. U prikazima 6.1 i 6.2 prezentirani su profili koncentracija kvaščevih stanica i vijabilnosti za Šaržnu fermetnaciju 1 i 2, respektivno. U oba slučaja rast kvasca odvijao se uobičajenim brzinama opisanim u literaturi, a vijabilnosti stanica, praćene metodom metilenskog modrila, ostale su tokom fermentacija na visokom nivou, sa vrijednostima blizu devedeset posto. Profili koncentracija ugljikohidrata za šarže 1 i 2 prikazani su na Prikazima 6.3 i 6.4.

Kvasac je najprije upotrijebio jednostave ugljikohidrate, glukozu i fruktozu, a nakon njih maltozu i maltotriozu. Koncentracije maltotetroze i većih ugljikohidrata su tokom fermentacije ostale nepromijenjene.

Jedan od najvažnijih nusprodukata kvaščevog metabolizma je etanol. U optimiziranom procesu anaerobne fermentacije nastaje otprilike 48 g etanola i 47 g ugljičnog dioksida po 100 g metaboliziranoe glukoze, a isto tako nastaju i male količine glicerola (3.3 g po 100 g glukoze), budući da je ovaj nusprodukt uključen u održavanje redoks ravnoteže unutar kvaščevih stanica koje fermentiraju, ali i u održavanje osmotske ravnoteže stanica, posebno u hipertoničnim otopinama.

Nastajanje etanola i glicerola tokom fermentacija prezentirano je na Prikazima 6.5 i 6.6. Koncentracija etanola na početku fermentacije raste polagano zbog prisutnosti kisika u mediju za fermentaciju, budući su stanice u aerobnoj fazi rasta. Kad stanice iskoriste sav kisik, koncentracija etanola raste eksponencijalno dok se ne potroše svi fermentabilni šećeri, nakon čega koncentracija etanola više ne raste. Vicinalni diketoni su također vrlo važni nusprodukti kvaščevog metabolizma. Ukupne koncentracije diacetila i pentandiona za šerže 1 i 2 prikazane su na Prikazima 6.7 i 6.8. Koncentracija ovih spojeva rasla je do otprilike 40-og sata fermentacije, kada je i koncentracija kvaščevih stanica bila najveća, a njihovo nastajanje je rezultat sinteze aminokiselina u kvaščevim stanicama tokom faze rasta. U zadnjem dijelu fermentacije, diacetil, pentandion i njihove prekursore α-acetolaktat and α-ketobutirat kvasac prevede u odgovarajuće, manje aromatične diole.

Na temelju razultata prikazanih u ovoj sekciji, činilo se da su se dvije šaržne fermentacije unutar gas-lift draft tube bioreaktora odvijale normalno. Rast kvasca i potrošnja ugljikohidrata tekle su očekivano, kao i nastajanje nusprodukata, etanola, diacetila i pentandiona. Usporedba rezultata jedne fermentacije sa drugom pokazala je da su se obje fermentacije odvijale na sličan način. Na Prikazu 6.9 uspoređena je koncentracija etanonla u šaržama 1 i 2. Svaka od krivulja prati isti profil, te se mnogo točaka međusobno preklapa, što je pokazatelj nivoa reproducibilnosti. No, iako se redoslijed upotrebe supstrata i prinos produkata nisu promijenili unutar gas-lift sustava, brzina fermentacije jest. Smatralo se da je fermentacija završena kada je postignuta najveća kocentracija etanola u obje šarže, i to je postignuto nakon otprilike 80-85 sati. Redukcija koncentracije diacetila ispod 30 μg/L postignuta je nakon dodatnih 20 sati. Ovi rezultati ukazivali su na mogućnost kompletiranja high-gravity sladovine u otprilike 100 sati, u usporedbi sa 120-168 sati u tradicionalnim šaržnim lager fermentacijama. Smanjeno vrijeme fermentacije omogućio je mješanje u GLDT bioreaktoru, budući da je u takvom sistemu povećan transfer mase. S ovom informacijom na umu, sve daljnje pokusne fermentacije provedene su sa sigurnošću da GLDT bioreaktor nije bitno promijenio metabolizam kvasca i da bi se fermentacijom sa slobodno suspendiranim stanicama kvasca u ovakvom sustavu moglo skratiti vrijeme fermentacije za barem 20 sati.

[image]

Slika 6.1 Ukupna koncentracija i vijabilnost stanica u ovisnosti o trajanju šaržne fermentacije 1 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.2 Ukupna koncentracija i vijabilnost stanica u ovisnosti o trajanju šaržne fermentacije 2 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.3 Profili koncentracija ugljikohidrata u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 1 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.4 Profili koncentracija ugljikohidrata u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 1 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.5 Koncentracije etanola i glicerola u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 1 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.6 Koncentracije etanola i glicerola u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 2 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.7 Koncentracije diacetila i pentandiona u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 1 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.8 Koncentracije diacetila i pentandiona u ovisnosti o trajanju Šaržne fermentacije 2 unutar probnog GLDT bioreaktora, sa kvascem lcc3021.

[image]

Slika 6.9 Usporedba koncentracija etanola u šaržama 1 i 2 u ovisnosti o trajanju Fermentacije. U probnom GLDT bioreaktoru korišten je kvasac Lcc3021.

6.2 Nosači za imobilizaciju

U ovom je radu, sa ciljem identifikacije najperspektivnijh alternativa za budući razvoj, ispitano nekoliko nosača, te su testirana tri različita načina imobilizacije u 50 litarskom GLDT bioreaktoru. Procijenjena su dva komercijalno dostupna adsorpcijska nosača, sa rasponom veličina od 1 do 2 mm. Jedan je bio Siran®, nosač u obliku staklenih kuglica tvrtke Schott Engineering (SL. 10), a drugi, Celite®, tvrtke World Minerals, su kuglice dijatomejske zemlje (SL. 10). Ovi nosači su za ispitivanje odabrani zbog lakoće rukovanja i komercijalne dostupnosti. Nosači bazirani na adsorpciji omogućuju veću aseptičnost tokom rada, zato što se reaktor može najprije napuniti nosačem, potom sterilizirati, i napokon inokulirati kvascem. Sa točke gledišta industrije, ova opcija je vrlo privlačna zato što nosač ne zahtjeva posebne uvjete skladištenja, te nisu potrebne promjene u postupcima inokulacije.

Probne fermentacije sa oba ova nosača u 50 litarskom GLDT reaktoru nisu dale zadovoljavajuće rezultate. Nastali problemi bili su prije svega uzrokovani relativno velikim gustoćama čestica Siran®-a i Celite®-a u usporedbi sa gustoćom tekućeg medija. Trofazni gas-lift drasft tube sistemi rade najbolje kada je omjer gustoć nosača i tekućine blizu jedan. U slučaju Siran®-a, ovaj omjer iznosio je 1.34, dok je za Celite® omjer bio 1.31. Kao posljedica ovako velikih razlika u gustoći između krute i tekuće faze, potrebno je povećati najmanju brzinu fluidizacije plina neophodnu za rad 50 litarskog GLDT bioreaktora.

Kako bi se postigla cirkulacija, bila je potebna brzina plina od 21.5 mm/s (na temelju promjera cijevi), ako je upotrebljeno 4 litara Siran®- a (8% krute tvari). Ova veća brzina plina nije bila značajan problem kada je testiranje provedeno sa vodom, ali kada je upotrebljena sladovina došlo je do katastrofalnog neuspjeha unutar GLDT reaktora. Naime, povećana brzina plina uzrokovala je prekomjerno pjenjenje u bioreaktoru, što je za posljedicu imalo povlačenje nivoa tekućine ispod draft cijevi, i posljedično svaku cirkulaciju krute i tekuće faze. Sličan neuspjeh dogodio se i sa upotebom Celite®-a kao imobilizacijskog materijala. Zbog ovih rezultata napuštena je upotreba obaju ovih nosača u budućim pokusnim gas-lift fermentacijama.

Upotebom nosača koji se temelji na hvatanju stanica u stupicu, poput κ-karaginana, bilo je moguće sistem napuniti i sa do 40% krute faze (v/v), što je zahtjevalo otprilike 0.17 standardnih kubnih metara plina po satu (prividna brzina plina 5.8 mm/s) za njegovu fluidizaciju i naknadnu cirkulaciju. Pozitivni rezultati u sustavu u kojem su korištene kuglice karaginana sa uhvaćenim stanicama kvasca rezultat su manje gustoće ovog nosača (otprilike 1100 kg/m3) a potom i lakše fluidizacije. Slično tome, punjenje bioreaktora potrebnom količinom krute faze - samo-agregirajućim kvascima LCC3021 (srednje flokulirajući), te LCC290 (superflokulirajući), postignuto je brzinama fluidizacije plina od približno 3 mm/s, potrebnim za pravilnu cirkulaciju. U sekciji 6.2.1 detaljnije je opisan nosač od gela κ-karaginana, a u sekciji 6.2.2 opisane su flokule samo-agregirajućeg kvasca LCC3021 i LCC290, koje su ispitane kao potencijalne matrice za imobilizaciju u kontinuiranoj primarnoj fermentaciji unutar 50 litarskog GLDT fermentora.

6.2.1 Gel kuglice κ-karaginana

Metode imobilizacije temeljene na hvatanju u stupicu zahtjevaju prethodnu inkluziju kvaščevih stanica unutar matriksa, prije njihova uvođenja u posudu za fermentaciju. Budući da u ovom trenutku in situ inokulacija bioreaktora nije izvediva, potrebno je proizvesti gel-kuglice prije opčetka fermentacije. Još uvijek nije poznato kakav je utjecaj dugotrajnog skladištenja na inokulirane gel-kuglice, pa je s ciljem minimiziranja bilo kakvog potencijalnog negativnog učinka uzrokovanog skladištenjem, proizveden velik broj kuglica u kratkom vremenskom periodu (8 sati). U tu je svrhu korišten postupak sa statičnim mješalima opisan u Sekciji 5.2. Idealne kuglice trebale bi imati promjer (DB) između 0.8 mm i 1.4 mm, i minimalni koeficijent varijacije distribucije veličina. Kako bi se proizvele željena količina kuglica sa odgovarajućom konzistencijom, bilo je potrebno podesiti nekoliko parametara u procesu proizvodnje kuglica. U narednoj je sekciji prezentiran je kratki pregled odabira parametara za proces proizvodnje kuglica, a u Sekciji 6.2.1.2 opisane su kuglice korištene u pokusnim kontinuiranim fermentacijama.

6.2.1.1 Proces proizvodnje kuglica – odabir varijabli

U usporedbi sa drugim istraživačima provedena je karakterizacija procesa proizvodnje kuglica, s naglaskom na slijedeće procesne parametre: radijus statičnog mješala(Ds), broj elemenata statičnog mješala (Ns), prividna brzina strujanja tekućine (VSL) i volumni udio polimera (εC). U Prikazima 6.12 i 6.21 sumarno su prikazana rezultati provedenih eksperimenata. Prikaz 6.12 ilustrira distribuciju veličina dobivenu korištenjem postupka sa statičnim mješalom za imobilizaciju stanica unutar karaginanskog gela.

U ovm primjeru upotrebljeni su slijedeći parametri: promjer mješala 12.7 mm, 60 elemenata statičnog mješala, prividna brzina tekućine 10.5 cm/s, i volumni udio polimera 0.25. Srednji promjer kuglica iznosio je 701 μm, a koeficijent varijecije bio je 45%.

Kumulativna distribucija veličina ilustrirana na Prikazu 6.13 odgovarala je normalnoj kumulativnoj distribuciji proračunatoj sa srednjom vrijednosti uzorka i standardnom devijacijom. Testiranje normalnosti provedeno je Kolmogorof Smirnov metodom (Scheaffer et McClave, 1990). Najveće odstupanje eksperimentalnih podataka od aproksimativne distribucije (K-S statistika D) iznosila ja 0.0274. Modificirana D vrijednost za vrijednosti iz normalne distribucije mora biti <0.895 za interval povjerenja od 95 %. U našem slučaju, modificirana D vrijednost iznosila je 0.174, što je znatno ispod limita od 0.895, pa se sa sigurnošću može zaključiti da podaci mjerenja prate normalnu distribuciju.

Svi podaci iz procesa pripreme kuglica dali su distribucije veličina sa samo jednim maksimumom. Međutim, Ponc.et i sur. (1992) su u svojim eksperimentima pokazali postojanje satelitnih maksimuma i/ili sekundarnog maksimuma koji je odgovarao alginatnim kuglicama proizvedenim disperzijom u posudi sa mješanjem, sa promjerom manjim od 200 μm. Moguće je da je u našem postupku tijekom ispiranja došlo do gubitka manjih kuglica, čije se veličine stoga ne bi nalazile u podacima o distribuciji veličina.

Na Prikazima 6.14 i 6.15 pokazan je utjecaj prividne brzine tekućine i promjera statičnog mješala na prosječni promjer kuglica i koeficijent varijacije distribucije veličina, respektivno. Prosječni promjer kuglica se smanjuje sa porastom prividne brzine tekućine za sva tri promjere statičnih mješala, sa naglašenim efektom na mješalu promjera 12.7 mm. Kuglice sa prosječnim promjerom većim od 700 μm nisu bile proizvedene sa statičnim mješalima manjeg promjera ( 6.4 mm i 9.5 mm) pri svim ispitivanim brzinama tekućine, dok su upotrebom mješala promjera 12.7 mm dobivene kuglice veće od 700 μm pri svim brzinama tekućine ispod 11 cm/s. U svim tri statična mješala dobivene kuglice imale su koeficijent varijacije između 38% i 58%. Također se čini da povećanje brzine u sva tri slučaja dovodi do smanjenja koeficijenta varijacije, koji je varirao ovisno u promjeru statičnog mješala, pri čemu su najniže vrijednosti dobivene upotrebom mješala najmanjeg promjera.

Primjećeno je da pri prividnoj brzini tekućine od 3.5 cm/s volumni udio polimera utječe na prosječni promjer kuglica, dok pri brzinama iznad 7 cm/s nisu primjećene razlike za eksperimentalnim vrijenosti εC između 0.083 i 0.5 (Prikaz 6.16). Također je primjećeno da volumni udio polimera uz porast prividne brzine tekućine vrlo slabo ili nikako ne utječe na koeficijent varijacije (Prikaz 6.17).

Na Prikazima 6.18 i 6.19 ilustriran je utjecaj prividne brzine tekućine i broj elemenata statičnog mješala na prosječan promjer kuglica. Sa porastom brzine tekućine, prosječni promjer kuglica je opadao za sve varijacije broja elemenata statičnog mješala (Prikaz 6.18). Prosječni promjer kuglica je, pri danoj brzini tekućine, bio sličan za broj elemenata od 24 do 120, dok je konfiguracija sa 12 elemenata dala kuglice promjera većeg od pet drugih ispitivanih konfiguracija. Prikaz 6.19 također pokazuje da prosječni promjer kuglica doseže maksimum ako se upotrebi više od 24 elementa statičnog mješala.

Prikaz 6.20 prikazuje učinak prividne brzine tekućine na koeficijent varijacije za nekoliko brojeva elemenata statičnog mješala. Primjećeno je da brzina tekućine u svim ispitivanim konfiguracijama nije utjecala na koeficijent varijabilnosti, ali je zato na njega bio izraženiji utjecaj broja elemenata statičnog mješala (Prikaz 6.21). Koeficijent varijacije smanjivao se sa porastom broja elemenata statičnog mješala i dosegnuo je minimum od 45 % ako je broj elemenata bio 60 ili više. Ovi su rezultati bili konzistentni za prividne brzine tekućine od 3.6 cm/s do 17.8 cm/s. Predloženo je da bi povećanje promjera statičnog mješala (Ds) moglo stvoriti heterogenost smičnih sila unutar mješala, i time induciralo povećanje u disperziji veličina mjerenoj kao koeficijent varijacije. Istovremeno bi povećanje Ds smanjilo intenzitet smičnih sila što bi rezultiralo povećanjem srednjeg promjera kuglica. Oba ova efekta primjećena su u eksperimentima sa statičnim mješalom najmanjeg promjera u kojem nastaju kuglice s najmanjim prosječnim promjerom (400 μm – 500 μm) i koeficijentom varijacije (približno 40%), odn. disperzijom veličine.

Energija potrebna za nastanak emulzije proporcionalna je dodirnoj površini između polimera i uljne faze. Što je manja veličina kuglica, potrebna je veća energija za njeno nastajanje. Berkman and Calabrese (1988) su pokazali da povećanje srednje prividne brzine tekućine (Vs) uzrokuje povećan rasip energije po jedinici mase fluida, i na taj način pogoduje smanjenju veličine kuglice. Povećanje prosječne prividne brzine tekućine (ispitivano u rasponu 3.6 cm/s – 17.8 cm/s) rezultiralo je smanjenjem prosječne veličine kuglica. Zbog povećanja brzine dolazi do stvaranje razlike tlakova na ulazu i izlazu iz statičnog mješala, i ta je razlika proporcionalna rasapu energije po jedinici mase tekućine. Povećanje brzine stoga inducira povećanje rasapa energije sistema, što pogoduje smanjenju veličine kuglica, i ovo je smanjenje promjera kuglica, DB, primjećeno kada je povećana prividna brzina tekućine. Al Taweel and Walker (1983) su pokazali da pri velikim brzinama, što odgovara značajnom stupnju turbulencije, postoji dinamična ravnoteža između formiranja kuglica i njihova srastanja.

Pri konstantnim vrijednostima promjera statičnog mješala (Ds) i broja elemenata (Ns), prividna brzina slabo je utjecala na koeficijent varijacije. Stoga je brzina parametar koji omogućava manipulaciju i odabir prosječnog promjera kuglica baz značajnijeg utjecaja na disperziju veličine.

U okvirima ovog istraživanja, volumni udio karaginanskog gela (εC) slabo je utjecao bilo na prosječni promjer kuglica, bilo na koeficijent varijacije, osim pri najmanjoj ispitivanoj brzini od 3.6 cm/s, pri kojoj se prosječni promjer kuglica smanjivao sa smanjenjem εC. Audet i Lacroix (1989) proučavali su ovaj parametar u proizvodnji karaginanskih kuglica u dvofaznom disperzijskom sustavu (šaržni tank sa mješanjem i nekontinuirani proces proizvodnje sa statičnim mješalom) i zaključili da εC ne utječe na prosječni promjer kuglica ako je korištena otopina polimera gdje je koncentracija karaginana iznosila 3% (w/v). Specifični učinak koncentracije κ-karaginanskog gela na distribuciju veličina kuglica također su ispitivali Audet i Lacroix (1989), i pokazali da ovaj parametar znatno utječe na distribucije veličina. Povećanje koncentracije gela rezultiralo je u porastu prosječnog promjera kuglica (DB) i koeficijenta varijacije (COV). Ovaj pažnje vrijedan efekt pripsan je povećanoj viskoznosti gela pri većim koncentracijama, što kao posljedicu ima djelovanje slabijih smičnih sila na emulziju i stoga nastajanje većih kuglica.

Iako u ovom radu nije ispitivan utjecaj koncentracije gela na veličinu kuglica, ovaj bi parametar, ukoliko je to potrebno, mogao biti upotrebljen kao drugi način reguliranja veličine kuglica

Povećanje broja elemenata mješala (Ns) povećava prosječno vrijeme zadržavanja koje dani element fluida provede unutar statičnog mješala, što rezultira u većoj homogenosti smjese i formiranju manjih i usko dispergiranih kuglica. U eksperimentima je ravnoteža disperzije (mjerena kao koeficijent varijacije), dosegnuta sa otprilike 60 do 72 elementa. Middleman (1974) je pokazao da je 10 elemenata dovoljno za postizanje ove ravnoteže u slučaju emulzija niskog viskoziteta (0.6 to 1.0 cP). Otopia karaginana korištena u ovim eksperimantima [3% w/v)] imala je prosječni viskozitet od 200 cP, a viskozitet ulja bio je 25 cP. Kao posljedica toga je za postizanje pseudo-homogenosti uz ovako povišenu viskoznost bilo potrebno duže vrijeme zadržavanja unutar mješala.

[image]

Slika 6.12. Tipična distribucija veličina kuglica proizvedenih pomoću statičnih mješala. Parametri procesa u ovom primjeru su: DS = 12.7 mm, NS = 60, VSL = 10.5 cm/s and εC = 0.25.

[image]

Slika 6.13. Tipična kumulativna distribucija veličina kuglica dobivenih pomoću statičnih mješala. Parametri procesa u ovom primjeru su: DS = 12.7 mm, NS = 60, VSL = 10.5 cm/s and εC = 0.25.

[image]

Slika 6.14. Ovisnost prosječnog promjera kuglica (μm) o Prividnoj brzini tekućini (cm/s), za tri različita promjera statičnih mješala (Ds of 12.7 mm, 9.5 mm and 6.4 mm). Broj elemenata statičnog mješala (Ns) u svim slučajevima bio je 48, a udio polimera (εC) ostavljen je na 0.25.

[image]

Slika 6.15. Ovisnost koeficijenta varijacije promjera kuglica (%) o prividnoj brzini tekućine (cm/s), za tri različita promjera statičnih mješala (Ds of 12.7 mm, 9.5 mm and 6.4 mm).

Broj elemenata statičnog mješala (Ns) u svim slučajevima bio je 48, a udio polimera (εC) ostavljen je na 0.25.

[image]

Slika 6.16. Ovisnost prosječnog promjera kuglica (μm) o prividnoj brzini tekućine (cm/s) za četiri različita udjela polimera (εC = 0.5, 0.25, 0.125 i 0.083). Broj elemenata statičnog mješala (Ns) u svim slučajevima bio je 48, a promjer statičnog mješala bio je 12.7 mm.

[image]

Slika 6.17. Ovisnost koeficijenta varijacije distribucije veličina o prividnoj brzini tekućine (cm/s) za četiri različita udjela polimera (εC = 0.5, 0.25, 0.125 i 0.083). Broj elemenata statičnog mješala (Ns) u svim slučajevima bio je 48, a promjer statičnog mješala bio je 12.7 mm.

[image]

Slika 6.18. Ovisnost prosječnog promjera kuglica (μm) o prividnoj brzini tekućine (cm/s) za 12, 24 48, 60 70 i 120 elemanta statičnog mješala. Udio polimera (εC) bio je konstantan i iznosio je 0.25, a promjer statičnog mješala iznosio je 12.7 mm.

[image]

Slika 6.19. Ovisnost koeficijenta varijacije promjera kuglica (μm) o prividnoj brzini tekućine (cm/s) za 12, 24 48, 60 70 i 120 elemanta statičnog mješala Udio polimera (εC) bio je konstantan i iznosio je 0.25, a promjer statičnog mješala iznosio je 12.7 mm.

[image]

Slika 6.20. Ovisnost prosječnog promjera kuglica (μm) o broju elemenata statičnog mješala (Ns) za Prividne brzine tekućine od 3.6, 7.0, 10.6, 13.2 i 17.8. Udio polimera (εC) bio je konstantan i iznosio je 0.25, a promjer statičnog mješala iznosio je 12.7 mm.

[image]

Slika 6.21. Ovisnost koeficijenta varijacije promjera kuglica (�) o broju elemenata statičnog mješala (Ns) za Prividne brzine tekućine od 3.6, 7.0, 10.6, 13.2 i 17.8. Udio polimera (εC) bio je konstantan i iznosio je 0.25, a promjer statičnog mješala iznosio je 12.7 mm.

6.2.1.2 Proces proizvodnje kuglica: svojstva κ-karaginanskih kuglica

Iz podataka opisanih u prethodnoj sekciji bilo je moguće odabrati parametre procesa proizvodnje kuglica kako bi se proizvele kuglica željenih svojstava za upotrebu u pokusnim fermentacijama. Radi minimiziranja koeficijenta varijacije za dani promjer statičnog mješala, za tvorbu disperzije ulje-gel odabrano je 60 elemenata mješala, a za minimiziranje vanjskog prijenosa mase i olakšavanje separacije iz fermentacijske tekućine mehaničkim putem odabrane su kuglice prosječnog promjera jedan mm. U tu je svrhu ispitano najveće statično mješalo (12.7 mm) pri najmanjoj ispitivanoj brzini (3.6 cm/s). Budući da je udio polimera slabo utjecao na koeficijent varijacije, za maksimiziranje produktivnosti kuglica upotrebljena je smjesa sa omjerom gela i ulja 50/50 (ε = 0.5).

Upotrebom procesa opisanog u Sekciji 5.2 sa parametrima Ds = 12.7 mm, Ns = 60, VSL = 3.9 cm/s i εC = 0.5 proizvedeno je nekoliko šarži gel kuglica sa uhvaćenim kvascem LCC3021. Dobivene kuglice (SL.11) prosijane su kroz niz sita kako bi se uklonile kuglice veće od 2.0 mm i manje od 0.5 mm, a kao rezultat su dobivene kuglice sa distribucijom veličina prezentiranom na Prikazu 6.23. Prikaz 6.24 ilustrira kumulativnu distribuciju veličina ovih kuglica i to je bila tipična distribucija za kuglice korištene za pokusne fermentacije u 50 litarskom gas-lift bioreaktoru.

[image]

Slika 6.23. Distribucija veličina k-karaginanskih gel kuglica korištenih za pokusne fermentacije u 50L gas-lift-draft-tube bioreaktoru.

[image]

Slika 6.24. Kumulativna distribucija veličina k-karaginanskih kuglica korištenih za probne kontinuirane fermentacije u 50 L gas-lift-draft-tube bioreaktoru.

6.2.1.3 Ograničenja procesa proizvodnje kuglica u industrijskoj primjeni

U pokusnom pogonu razvijen je i impelmentiran postupak kojim se proizvodi 10 L kuglica na sat u jednom statičnom mješalu, ali je za upotebu u industrijskom mjerilu potrebno dalje razvijati i optimizirati nekoliko aspekata proizvodnog postupka.Potrebno je povećati volumnu produktivnost sustava kako bi se proizveo dovoljni volumen imobiliziranih stanica za upotrebu u industrijskim bioreaktorima. Na primjer, GLDT bioreaktor volumena 2000 hL zahtjevao bi otprilike 800 hL kuglica, a za postizanje takvih volumena potebno je povećanje protoka i gela i ulja. Dobiveni podaci ukazuju da bi povećanjem brzine u mješalima promjera od 6.4 mm –do 12.7 mm dobivene kuglice imale premali promjer za upotrebu u fermentacijama, pa bi stoga bilo potrebno povećati promjer statičnih mješala, te samim tim i prosječnog promjera kuglica. Međutim, upotrebom mješala sa većim promjerom došlo bi do povećanja disperzije veličina kuglica, čime bi veći postotak kuglica bio izvan željenog raspona. Alternativno, moguća je upoteba sistema sa paralelno spojenim statičnim mješalima srednjeg promjera (12.7 mm). Sa sistemom od 10 mješala moguće su produktivnosti i do 100 L/h, a za naš primjer sa industrijskim bioreaktorom volumena 2000 hL proces bi se trebao odvijati kontinuirano 800 sati, ili približno 34 dana, da bi se proizveo potrebni volumen kuglica. Za skraćivane vremena proizvodnje moguće je implementirati nekoliko sistema, koji bi, međutim, u postupak dodali još jedan stupanj kompleksnosti.

Vrijeme proizvodnje ne bi bilo toliki poblem kada bi bilo moguće skladištiti kuglice na dulji vremenski period, uz očuvanje vijabilnosti kvasca. Moguće je da će doći do razvoja procesa za sušenje kuglica i pohranjivanje u spremniku zapečaćenom vakuumom. Poncelet i sur. (1993) objavili su rad u kojem je pokazano da treba obratiti pažnju na tip statičnog mješala koje se koristi za tvorbu disperzije.

U njihovom sustavu, sa drugačijim tipom statičnog mješala, nasuprut mješalima tipa Kenicks korištenim u ovom radu, moglo bi biti moguće koristiti mješala sa većim promjerom bez kompromitirajućeg utjecaja na distribuciju veličina kuglica (održavanje niskog koeficijenta varijacije). Dodatni problemi u ovom probnom procesu su vođenje procesa na 40 oC i upotreba otopina biljnog ulja i kalijevog klorida u proizvodnji kuglica. Zbog visoke temperature proizvodnje u procesu su potrebni sustavi za hlađenje i grijanje, a kako bi se stekao uvid u eventualne negativne implikacije, potrebno je dodatno istražiti potencijalni toplinski šok kojem su izložene kvaščeve stanice. U ovom radu proizvedene su kuglice sa visoko vijabilnim imobiliziranim stanicama (iznad 90%), ali nije istražen niti jedan drugi učinak procesa imobilizacije na kvaščevu populaciju. Budući da je za proizvodnju željene emulzije, a kasnije i za formiranje kuglica, korišteno ulje koje se ponaša i kao površinski aktivna tvar te na taj način sprečava pjenjenje, njegovo prisustvo na kuglicama predstavlja problem za procesu. Iako bi prisutnost rezidualnog ulja pomogla tijekom stadija fermentacije, ulje preneseno u konačno pivo bilo bi štetno budući da je u njemu pjena poželjna.

Veliki volumeni otopine kalijevog klorida korišteni za razdvajanje krute faze (kuglica) od ulja i postupak uklanjanja otopine te soli sa kuglica prije punjenja bioreaktora zahtjeva pažnju bez koje bi bilo potrebno izbaciti tu otopinu iz bioreaktora nakon njegova punjenja sa kuglicama. Budući da se kuglice sa imobiliziranim stanicama proizvode izvan bioreaktora, potrebno je za vrijeme proizvodnje, do trenutka punjenja bioreaktora, primjenjivati tehnike sterilnog i aseptičnog rada. Različita mjesta transfera između bioreaktora predstavljaju opasnost za kontaminaciju i moraju biti redovito pregledavana, zbog toga što bi prisutnost kontaminanta rezultirala njegovom ko-imobilizacijom u kuglicu gela. U laboratoriju su, kao rezultat predanosti, redovito proizvedene sterilene kuglice. Međutim, okolina unutar pogona možda ne bi bila toliko gostoljubiva kao u laboratoriju, što onda zahtjeva puno strožu kontrolu.

6.2.2 Flokulirajuće stanice kvasca

Jedan od najprirodnijih oblika imobilizacije je samo-agregacija mikrorganizma u flokule. Calleja and Johnson (1977) su predložili tri moguća razloga zbog kojih stanice koje dolaze u kontak da formiraju agregate, sa svim izraženim svojstvima vezanja. Prvi razlog je privlačenje stanica različitih tipova parenja zbog izlučivanja feromona (α i a-faktori). Ovaj tip veze je privremen i uključuje protein-protein interakcije između α i a-aglutinina usidrenim u komplementarnim staničnim stjenkama. Stanice također mogu agregirati zbog neuspješnog odvajanja od stanice majke u procesu diobe. Ovo bi svojstvo moglo biti urođeno pojedinim sojevima kvasca ili može biti uzrokovano nedostatkom hranjivih tvari ili mutacijama u određenom broju gena. Ova pojava ne naziva se flokulacija, već tvorba lanaca, a veze između tako povezanih stanica mogu se ireverzibilno narušiti mehaničkim smikom (Stratford, 1996). Pod nazivom flokulacija uobičajeno je poznat treći razlog, a Stewart and Russell (1981) su je definirali kao “fenomen pri kojem se kvaščeve stanice u mediju slažu u grudice i potom ili istalože ili isplivaju na površinu medija”. Brojni dokazi pokazuju da je flokulacija genetički kontroliran proces i da mehanizam flokulacije ovisi o molekulama koje služe kao mostovi između susjednih staničnih stijenki. Konkretnije, smatra se da se specifični lektini vežu na α-manane susjednih stanica u prisutnosti Ca2+ iona (Calleja and Johnson, 1977), a ovo povezivanje proteina i ugljikohidrata može se reverzno inhibirati kelirajućim agensima ili specfičnim šećerima.

SL. 12 pokazuje tri moguće konfiguracije stanica kvasca: neflokulirajuće kvasce, kvasce koji tvore lance i flokulirajuće kvasce. Za lančaste kvasce se smatra da, iako su stanice agregirale, nije riječ o vrsti flokulacije zato što stanice nisu pojedinačne, a flokulacija podrazumjeva agregaciju pojedinačnih stanica do koje dolazi zbog povoljnih uvjeta u okolišu (ioni Ca2+ i niske koncentracije inhibirajućih šećera). Kod flokulirajućih stanica, specifična veličina flokule ovisi o genetičkom ustroju stanice kao i o hidrodinamičkim uvjetima u kojima se stanice nalaze (okolina smičnih sila)

Na SL.13 i SL. 14 prikazani su dva Labatt-ova soja lager kvasaca sa različitim stupnjem flokulacije. Srednje flokulirajući soj, LCC3021, pokazan je na SL. 13. U prisutnosti kalcijevih iona, ovaj soj tvori agregate veličine 0.5 mm do 1.0 mm kada u tekućoj podlozi nestane ponestane glukoze. Na SL. 14 prikazan je superflokulirajući soj kvasca, LCC290, koji tvori flokule veće od 1 mm, a u okolini sa slabim smičnim silama agregacijom nastaju flokule promjera i do 5 mm. Uz umjereno mješanje, promjer flokula soja LCC290 biti će između 1 i 2 mm.

Za procjenu sposobnosti flokulacije nekog soja kvasca predloženo je nekoliko postupaka (Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki i sur.., 1997; Teixera i sur., 1991; Stewart & Russell, 2000). U “Brewer’s Yeast” (Stewart & Russell, 2000), predloženo je da se postupci za određivanje flokulacije mogu podijeliti u tri kategorije, a to su: postupci sedimantacije, postupci statične fermentacije i direktno promatranje tvorbe flokula u hranjivom mediju. Metodu sedimantacije koju je prvi opisao Burns 1937. god., kasnije su modificirali Helm i suradnici 1953. god, te je ta metoda danas dio standardnih metoda analize priznatih od Technical Committee and the Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Ovaj metoda naziva se in vitro metodom budući da se sposobnost taloženja kvasca procjenjuje u kalcij sulfatnom puferu a ne u fermentacijskom mediju. Metoda statične fermentacije (poznata i kao Gililand-ova metoda) uključuje uzgoj stanica u hopped sladovini i mjerenjem svojstava flokulacije in vivo. U obje ove metode se pomoću UV/VIS spektrofotometra mjeri apsorbancija uzorka sa istaloženim kvascima i uspoređuje sa uzorcima u kojima je izvršena deflokulacija.

Stewart and Russell (2000) predložili su metodu mjerenja flokulacije koja se temelji na vizualnom opisu stupnja flokulacije u uzorcima kvasca uzgojenim u staklenim bocama volumena 20 mL, sa čepom na odvrtanje. Za izražavanje stupnja flokulacije ovi su autori koristili subjektivno mjerilo, npr: 5 – ekstremno flokulirajći, 4 – vrlo flokulirajući; 3 – umjereno flokulirajući, 2 – slabo flokulirajući, 1 – grubi i 0 – neflokulirajući. Superflokulirajući soj kvasca, LCC290 je klasificiran kao 4 – vrlo flokulirajući, dok je soj kvasca LCC3021 klasificiran kao 3 – umjereno flokulirajući.

Flokulacija je važno svojstvo u pivarskoj inustriji, budući da se prirodna tendencija kvasca da se ili istaloži, ili ispliva na površinu, obično upotrebljava u separaciji kvasca od fermentirajuće tekućine. Međutim, kvasac koji flokulira prije no što je fermentacija završena je nepoželjan, budući da neće biti postignuta idelna koncentracija alkohola i rezidualnoh ugljikohidrata. U kontinuiranim fermentacijama, a naročito u kontinuiranim gas-lift draft tube fermentacijama glokulirajući kvasac se ponaša kao matriks za imobilizaciju. Njihova tendencija da se istalože kompenzira se uvođenjem zraka za mješanje, koji ih održava u suspenziji. Sa ovakvim sistemom je strah od nedovršene fermentacije eliminiran, budući da krute čestice kontinuirano cirkuliraju i u bliskom su kontaktu sa fermetirajućom tekućinom. U sekciji 6.2.2.1 okarakterizirana su taložna svojstva superflokulirajućeg soja LCC290 i njegove performanse u fermentaciji, sa ciljem identifikacije početka flokulacije.

Dodatno je određena brzina taloženja kvasca radi dobivanja vrijedne informacije koja bi mogla biti upotrebljena kod dizajniranja posuda za taloženje kvasca.

6.2.2.1 Karakterizacija superflokulirajućeg kvasca, LCC290

Prije provedbe kontinuiranih fermentacija sa superflokulirajućim kvascem LCC290 u gas-lift draft tube bioreaktoru, odlučeno je da se ovaj kvasac okarakterizira u fermentacijama u laboratorijskom mjerilu u tikvicama uz potresanje. Slika 6.28 pokazuje razvoj populacije kvasca u vremenu. Prema očekivanjima, koncentracija je strmo rasla tijekom prvih 48 sati, potom je prestala s rastom da bi prema kraju fermentacije lagano opala. U prvih 48 sati u sladovini je bilo dovoljno nutrijenata i kisika za rast kvasca. Međutim, kako kvasac nastavlja konzumaciju ugljikohidrata u odsutnosti kisika ulazi u fazu anaerobne fermentacije i prestaje se reproducirati. Kada se potroše zalihe ugljikohidrata, malen dio populacije kvasca počinje umirati. Ovaj fenomen prikazan je na Slici 6.29, gdje se vidi da je vijabilnost stanica pala sa približno 97 % na malo iznad 90 %.

Slika 6.30 pokazuje potrošnju ugljikohidrata tokom fermentacije. Kvaščeve su stanice najprije utrošile jednostavne ugljikohidrate, glukozu i fruktozu, a potom maltozu i maltotriozu. Pivski kvasac, međutim, ne može metabolizirati niti maltotetrozu niti polisaharide dugih lanaca (poli 1 i 2). Sa padom ukupne koncentracije ugljikohidrata (prikazano krivuljom specifične težine na Slici 6.31), proporcionalno je došlo do porasta koncentracije etanola. U približno 37-om satu fermentacije koncentracije etanola i ugljikohidrata bile su jednake.

Iz perspektive rasta i metabolizma ugljikohidrata, činilo se da se superflokulirajući kvasac LCC290 ponaša isto kao i industrijski soj kvasca LCC3021. Izgledalo je da je fermentacija gotova kada je specifična težina tekućine iznosila približno 2.7 oP. Uobičajeno je da flokulirajući sojevi kvasca tvore velike grudice (flokule) i istalože se prije kraja fermentacije; ovaj fenomen poznat je u pivarskoj industriji kao ‘hung’ fermentacija. U našim pokusnim šaržama bilo je moguće provesti fermentacjiu do kraja zato što su tikvice bile mješane što je stanice kvasca održavalo u kontaktu sa hranjivim tvarima u suspenziji.

Drugo važno ispitivano svojstvo bila je sposobnost flokuliranja kvasca. Konkretno, nas je zanimala brzina taloženja kvaščevih stanica kao i dobivanje indikacije kada ovaj soj kvasca započinje flokulrati. Ova svojstva važna su za probne kontinuirane fermentacije, jer igraju važnu ulogu u održavanju zdrave populacije kvasca unutar gas-lift fermentora. Slika 6.32 pokazuje krivulje taloženja kvasca tokom fermetnacije. U uzorku ispitanom nakon 24 sata fermentacije došlo je do slabog taloženja. Flokulacija je inhibirana prisustvom nekih šećera, glukoza je poznati inhibitor, pa će flokulacija započeti onda kada se ovaj inhinitor utroši. U uzorku ispitanom metodom opisanom u Sekciji 4.7, nakon 40 sati šaržne fermentacije stanice su započele sa flokuliranjem i taloženjem. Taloženje je bilo vrlo brzo u svim ispitivanim intervalima, osim nakon 24 h kada nije došlo do taloženja. U najsporijem slučaju, nakon 40 sati, za potpuno taloženja kvasca u aparatu za testiranje bilo je potrebno 90 s. Nakon 71 sat za taloženje je nilo potrebno manje od 50 s.

Istraživači predlažu da je brzina taloženja funkcija koncentracije krute tvari (Coe and Clevenger, 1916). Slika 6.33 prikazuje brzinu taloženja krutina za danu koncantraciju kvaščevih stanica. Točke za ovu krivulju generirane su metodom koju je predložio Kynch (1952) primjenjenom na podatke o taloženju prikupljene za svaki interval fermentacije. Rezultati leže na pribilžno istoj krivulji, što potvrđuje fenomen kojeg su opazili Coe i Clevenger (1916).

Rezultati prikupljeni mjerenjem taloženja indicirali su da superflokulirajući soj kvasca LCC290 flokulira ako je specifična težina tekućine 6 oP ili manja. Ova vrijednost može poslužiti kao indikator specifične težine tekućine u pseudo-ravnotežnom stanju, koja mora biti održavana kako bi stanice u kontinuiranim fermentacijama ostale u flokulama. Vođenjem reaktora iznad 6 oP stvara se rizik destabilizacije flokuliranih stanica i isipranja imobilizirane populacije stanica. Svojstva taloženja superflokulirajućeg kvasca ukazuju ukazuju na to da će se populacija kvasca prilično brzo istaložiti ako se ostavi u mirovanju. U trofaznom gas-lift draft tube bioreaktoru biti će moguće održati ove stanice u cirkulaciji, ali ako dođe do kvara u sustavu za dovod plina, stanice bi se brzo istaložile što bi moglo uzrokovati potrebu za pomoćnim plinom za mješanje. Za post fermentacijsko procesiranje je brzo taloženje prednost, budući da separatori za odvajanje krutina, npr. gravitacijski taložnici, mogu biti korišteni za uklanjanje krupnijih krutina, što bi u pivarskoj industriji dovelo do rasterećenja opreme za centrifugiranje i omogućilo dulje vrijeme rada prije pražnjenja centrifuga. Očekivano je i manje gubitaka piva, a prijenos neželjenih okusa sa centrifuge na pivo, bio bi minimalan zbog manje količine kvaščeve biomase koja prolazi kroz centrifugu.

[image]

Slika 6.28 Ukupna koncentracija stanica kvasca LCC290 u šaržnim fermetnacijam uz mješanje, u ovisnosti o vremenu fermetacije. Temperatura fermentacije bila je 15 oC.

[image]

Slika 6.29 Vijabilnost kvaščevih stanica u ovisnosti o vremenu fermenatcije, mjereno metodom metilneskog modrila.

[image]

Slika 6.30 Profili koncentracija ugljikohidrata u ovisnosti o vremenu šaržne fermentacije

sa sojem LC290.

[image]

Slika 6.31 Koncentracije etanola i glicerola, i specifična težina tekućine u ovisnosti o vremenu šaržne fermentacije sa kvascem LCC290.

[image]

Slika 6.32 Visina granice faza suspenzije stanice u ovisnosti o vremenu taloženja. Vrijednosti za ovaj graf prikupljene su u različitim vremenskim intervalima.

[image]

Slika 6.33 Brzina taloženja suspenzije kvaščeve suspenzije u ovisnosti o koncentraciji stanica. Vrijednosti za ovaj graf prikupljene su u različitim vremenskim intervalima.

6.3 Procjena tehnologije gas-lift za kontinuiranu fermentaciju piva

Prvi i najvažniji cilj ovog rada bila je procjena izvedivosti vođenja 50-1- probnog gas-lift bioreaktora kontinuiranim načinom uz upotrebu κ-karaginanskih gel-kuglica za imobilizacjiu stanica kvasca Saccharomyces carlsbergensis opisano u sekciji (6.2.1). Dodatno nam je želja bila ispitati da li se u takvom sistemu može proizvesti sjevernoamerički tip lager piva prihvatljive kvalitete. Također smo željeli utvrditi minimalno vrijeme zadržavanja potrebno za kompletno razrijeđivanje koncentrirane sladovine (17.5 oP) i uporabljivi raspon koncentracija kisika unutar sustava za kontinuiranu fermentaciju. Minimalno vrijeme zadržavanja u kojem su utrošeni svi šećeri iz sladovine iznosilo je 24 sata, što se može usporediti sa vremenom klasične šaržne fermentacije od pet do sedam dana. Koncentracija otopljenog kisika, mjerena Ingold probom za kisik unutar bioreaktora bila je blizu nule, bez obzira na kisik dodan sa plinom za mješanje (u rasponu od 0 do 20% v/v), što je ukazivalo na to da stanice kvasca brzo utroše kisik unešen u sladovinu, ili da on jednostavno izlazi van. Koncentracija stanica u preljevnom pivu bile je reda veličine 108 stanica / mL prvijenca, a koncentracije vicinalnih diketona, diacetila i acetaldehida smanjivale su se zajedno sa smanjenjem udjela kisika u plinu za mješanje (Slike 6.34 i 6.35). Na koncentracije pojedinih estera (etil-acetat, izoamil-acetat) i viših alkohola (propanol, izobutanol, izoamilni alkohol) nije utjecala promjena u dotoku kisika (Slika 6.36)

Na Slici 6.37 prikazana je usporedba različitih tvari okusa u dva probna piva proizvedena u kontinuiranom sustavu sa miobiliziranim stanicama sa kontrolnim, industrijski proizvedenim pivom. (šaržna fermentacija slobodno suspendiranih stanica).

Redovito su zabilježene male razlike u esterima (etil-acetat, izoamil-acetat) i višim alkoholima između piva proizvedenog kontinuiranog fermentacijom i kontrolnog piva. Okus gotovog piva proizvedenog uz 2 % kisika procjenjivalo je uvježbano tijelo za testiranje okusa, te je zeključeno da je on blizak kontrolnom pivu (industrijskom proizvodu). Pivo proizvedeno uz 20 % kisika, je, međutim, bilo ocjenjeno kao neprihvatljivo, uz znakove oksidacije tvari okusa i “papirnatim” i “vinskim” okusom.

U stanju pseudo ravnoteže, probni bioreaktor vođen je uz vrijeme zadržavanja 24 sata tokom 6 tjedana. Prvijenac je imao prihvatljv profil okusa, i nije zabilježeno nijedan veći defekt (sumporna nota). Količina kisika u plinu za mješanje bila je kritičan faktor u ovim eksperimentima. Piva proizvedena uz 2 % - 5 % kisika u plinu za mješanje dala su najbolji profil okusa. Ova kritična točka kontrole zahtjeva veću pažnju, uz naglasak na preciznije tehnike mjerenja kisika uzajedno sa mjerenjima provedenim na većem skupu pred fermentacijskih i post fermentacijskih analita.

U tradicionalnoj primarnoj šaržnoj fermentaciji, sladovina se dozira sa kisikom prije prijenosa u fermentor. Nakon inokulacije medija, koncentracija otopljenog kisika brza pada jer ga troše kvasščeve stanice (prva 24 sata feremntacije gdje dolazi do rasta kvasca). Ostatak fermentacije se stoga odvija uglavnom u anaerobnim uvjetima. Upotreba kontinuiranog homogenom sistema za primarnu fermentaciju ne dopušta ovakvu promjenu koncentracije kisika tokom vremena. Iz tog razloga teško je postići poklapanje okusa pive proizvedeniog kontinuiranom i piva dobivenog šaržnom fermentacijom. Bez obzira na ove razlike, konfiguracija bioreaktora ispitana u ovim inicijalnim procjenama, omogućila je proizvodnju piva sa prihvatljivom kvalitetom okusa i analitičkim profilom. Upotrebom gas-lift bioreaktora i relativno malih (~1 mm) kuglica, bilo je moguće povećati volumnu produktivnost bioreaktora skraćivanjem vremena potrebnog za primarnu fermentaciju za nekoliko dana. Koncentracija biomase u izlaznom pivu iz bioreaktora sa imobiliziranim stanicama bila je ekvivalentna koncentraciji iz šaržne fermentacije provedene opd sličnim uvjetima. Ova opažanja potvrđuju ovisnost formiranja okusa o stupnju rasta kvasca, te mogu objasniti neuspješne pokušaje proizvodnje prihvatljivog piva u sustavima sa imobiliziranim stanicama u kojima je rast kvasca bio ograničen. Dotok kontrolirane smjese plinova može biti moćno oružje za fino podešavanje organoleptičnih svojstava piva u kontinuiranim fermentacijama sa imobiliziranim stanicama.

Visoke koncentracije diacetila u izlaznoj tekućini također su opazili i drugi istraživači (Virkajarvi & Pohjala, 1999; Kronlof i sur., 2000). U sjevernoameričkim lager pivima, ciljna koncentracija diacetila iznosi 30 μg/L, u usporedbi sa koncentracijom od 400-800 μg/L u izlaznoj fermentacijskoh tekućini. Upoteba tradicionalnog postupka odležavanja (hladno dozrijevanje na 2 oC 14 dana) smanjuje koncentraciju diacetila na željenu razinu, ali na štetu cjelokupne produktvnosti procesa. Upotrebom brze tehnologije za sekundarnu fermentaciju, opisane u drugom oglavlju, bilo bi moguće smanjiti koncentraciju diacetila bez značajnijeg smanjivanja produktivnosti (trajanje procesa dva sata). Dodatni troškovi bi međutim mogli spriječiti upotrebu te tehnologije, i svi pivari možda ne bi željeli izlagati svoje pivo visokim temepraturama (80 oC do 90 oC).

[image]

Slika 6.34 Koncantracija vicinalnih diketona u ovisnosti o postotku kisika u plinu za mješanje. Fermentacije su provedene u 50-L gas-lift sustavu punjenog sa 40% (v/v) karaginanskim gel kuglicama. Brzina ukupnog plina za mješanje bile je konstantna i iznosila je 6.4 scfh. Vrijeme zadržavanja bilo je 24 sata.

[image]

Slika 6.35. Koncentracija acetaldehida u ovisnosti o postotku kisika u plinu za mješanje.

Fermentacije su provedene u 50-L gas-lift sustavu punjenog sa 40% (v/v) karaginanskim gel kuglicama. Brzina ukupnog plina za mješanje bile je konstantna i iznosila je 6.4 scfh. Vrijeme zadržavanja bilo je 24 sata.

[image]

Slika 6.36 Koncentracije estera i viših alkohola u ovisnosti o postotku kisika u plinu za mješanje. Fermentacije su provedene u 50-L gas-lift sustavu punjenog sa 40% (v/v) karaginanskim gel kuglicama. Brzina ukupnog plina za mješanje bila je konstantna i iznosila je 6.4 scfh. Vrijeme zadržavanja bilo je 24 sata.

[image]

Slika 6.37. Usporedba gotovog proizvoda proizvedenog sa 2 % i 20 % kisika u plinu za mješanje i industrijski proizvedenog piva te praga okusa.Fermentacije su provedene u 50-L gas-lift sustavu punjenog sa 40% (v/v) karaginanskim gel kuglicama. Brzina ukupnog plina za mješanje bila je konstantna i iznosila je 6.4 scfh. Vrijeme zadržavanja bilo je 24 sata.

6.4 MJEŠANJE I BRZINA CIRKULACIJE U FERMENTACIJAMA U TROFAZNOM ‘‘GAS-LIFT’ DRAFT TUBE’ BIOREAKTORU

Eksperimenti mješanja provedeni metodom injekcije kiseline u kratkim su crtama opisani u sekciji 4.8. Ciljevi tog dijela rada bili su dvostruki. Najprije smo, računajući brzinu cirkulacije tekućine i vrijeme mješanja koje iz nje proizlazi, htjeli procijeniti da li je u ‘gas-lift’ sistemu osigurano dobro mješanje za niz imobilizacijskih nosača pri različitim brzinama fluidizirajućeg plina. Razlika između ovih pokusa od onih već prikazanih u literaturi jest ta da su u ovom slučaju svi pokusu provedeni na stvarnim medijima za fermentaciju sa aktivnim stanicama kvasca, a ne na modelnim otopina (sistami voda-krutina-plin). Također su eksperimenti mješanja bili usmjereni prema izračunu prividne brzine tekućine, čto bi se moglo upotrijebiti u budućnosti za propagaciju pilot sistema u veće mjerilo.

6.4.1 Kalibracija probe

pH proba korištena u studijama mješanja kalibrirana je postupkom opisanim u sekciji 4.8. Signal jakosti 4-20 mA kojeg je emitirala pH proba prolazio je kroz otpornik od 250 Ohm-a i transformiran u napon od 1-5 V, koji je onda pohranjen u kartici za prikupljanje podataka (DAC). Proba je uranjana u seriju pufera različitih pH, slijedećim redoslijedom: pufer pH 4.6, pufer pH 4.0, pufer pH 5.0, pufer pH 6.0, pufer pH 7.0 (Beckmann certified standards, Cole Parmer). Na Slici 6.38 prikazan je odgovor Ingold-ove pH probe u 5 različitih standardnih otopina, a podatke je prikupio sustav za prikupljanje podataka. Na Slici 6.39 prikazana je kalibracijska krivulja za pH probu, kao ovisnost pH vrijednosti o izmjerenom naponu. Jednadžba pravca koja najbolje aproksimira eksperimentalne vrijednosti u ovom sustavu (koeficijent korelacije 0.9996) je:

pH = 3.68*Napon - 3.53 (6.1)

Podaci prikupljeni iz eksperimenata mješanja transformirani su pomoću gornje jednadžbe kako bi odražavali stvarne pH vrijednosti unutar ‘gas-lift’ bioreaktora.

Također je mjereno vrijeme odgovora pH probe na promjenu pH. Na Slikama 6.40 do 6.43 prikazan je tipičan odgovor pH probe na četiri koraka promjene pH jedinica: 0.6, 1.2, 2.3 i 3.4. Originalni podaci aproksimirani su pulsnom funkcijom pomoću programa za prikaz i analizu podataka TableCurve 2D (Jandel Scientific), a odgovarajuće aproksimacije imale su koeficijent korelacije veći od 0.994. Iz ovih je krivulja izračunato vrijeme potrebno da proba odgovori na promjenu 98 %, koje je onda prikazano u ovisnosti o promjeni pH (Slika 6.44). Vrijeme odogovara probe smanjivalo se u ispitivanim područjima. Za najmanju promjenu pH, 0.6, vrijeme odgovora probe bilo je ~ 6.4 sekunde i smanjilo se na oko 4.2 sekunde za promjenu pH od 3.4 jedinice.

Ovakav način karakteriziranje probe posebno je važan ako se koristi za procjenu vremena mješanja i brzine cirkulacije. Proba mora imati kratko vrijeme odgovora kako bi odražavala promjene u mediju u kojem se vrši mjerenje, a naročito je važno da, ako je se korisiti za ovakve eksperimente, njeno vrijeme odgovora bude manje od brzine mješanja unutar bioreaktora. Međutim, kvazi-trenutno vrijeme odgovora nije potrebno budući da će se mali zastoj u odgovoru jednostavno odražavati, te time i anulirati, u svim mjerenjima brzine cirkulacije.

[image]

Slika 6.38 Originalni podaci prikupljeni sustavom za prikupljanje podataka o odgovoru pH probe u razilčitim otopinama pufera u vremenu. Frekvencija prikupljanja bila je 50 Hz za ukupno 15000 točaka.

[image]

Slika 6.39 prikaz kalibracijske krivulje – veza između pH i izmjerenog napona (v). Jednadžba pravca Regresije je: pH = 3.68*Napon – 3.53, uz koeficijent koerlacije 0.9996 (N=2500)

[image]

Slika 6.40 Tipični podaci dobiveni mjerenjem vremena odgovora pH Probe na promjenu pH od ~0.6 jedinica. Podaci su aproksimirani krivuljom pomoću programa TableCurve 2d, A krivulja kojom su aproksimirani podaci imala je koeficijent korelacije 0.9995

[image]

Slika 6.41 Tipični podaci dobiveni mjerenjem vremena odgovora pH Probe na promjenu pH od ~1.2 jedinica. Podaci su aproksimirani krivuljom pomoću programa TableCurve 2d, A krivulja kojom su aproksimirani podaci imala je koeficijent korelacije 0.999.

[image]

Slika 6.42 Tipični podaci dobiveni mjerenjem vremena odgovora pH Probe na promjenu pH od ~2.3 jedinice. Podaci su aproksimirani krivuljom pomoću programa TableCurve 2d, A krivulja kojom su aproksimirani podaci imala je koeficijent korelacije 0.999.

[image]

Slika 6.43 Tipični podaci dobiveni mjerenjem vremena odgovora pH Probe na promjenu pH od ~3.4 jedinice. Podaci su aproksimirani krivuljom pomoću programa TableCurve 2d, A krivulja kojom su aproksimirani podaci imala je koeficijent korelacije 0.999.

[image]

Slika 6.44 Vrijeme odgovora pH probe na skokovitu promjenu pH. (n=3). Probe su uronjene u pufer većeg pH, i potom odmah u pufer niže pH vrijednosti (4.0). Za proračun vremena potrebnog da se postigne 98% skokovite Promjene korištene se krivulje koje najbolje aproksimiraju vrijeme odgovora.

6.4.2 Vrijeme mješanja i brzine cirkulacije

Vrijeme mješanja i brzina cirkulacije određivani su u fermentacijama sa tri tipa imobiliziranih stanica. Eksperimenti su provedeni u probnom 50 litarskom draft tube bioreaktoru najprije sa vodom bez krutina kao modelom, a kasnije i u hranjivoj podlozi za fermentaciju specifične težine 2.7 oP u kojoj su bile ili karaginanske gel-kuglice, ili superflokulirajući kvasac LCC290, ili srednje fllokulirajući kvasac LCC3021. Tipični primjeri podataka dobivenih sistemom sa pH probom nakon pulsnog injektiranja kiseline (postupak opisan u sekciji 4.8) prikazani su na Slikama 6.45 i 6.46. Na Slici 6.45 prikazan je odgovor pH probe na injekciju kiseline u vodenu otopinu bez krutina, a Slika 6.46 prikazuje odgovor na injekciju kiseline u hranjivu podlogu za fermentaciju koja sadrži superflokulirajući kvasac LCC290. Podaci su aproksimirani prigušenom sinusnom funkcijom, a dobiveni koeficijenti korelacije, 0.96 i 0.90, respektivno, izračunati su iz odgovarajućih jednadžbi. Parametri aproksimacije, b i c, odgovaraju vrijednostima "a" i "ω" u prigušenim sinusnim krivuljama, i te su numeričke vrijednosti korištene u jednadžbama 3.2 i 3.3 za izračunavanje brzine cirkulacije i vremena mješanja u danom sistemu. Dodatak B sadrži preostale rezultate mješanja i aproksimiranih krivulja za sve eksperimente.

Na Slikama 6.47 i 6.48 prikazani su grafovi vremena mješanja i brzine cirkulacije kada je kiselina injektirana u vodu bez krutina, a na Slikama 6.49 i 6.50 odgovarajući grafovi kada je korišten superflokulirajući kvasac LCC290, dok su rezultati sa upotrebom k-karaginana prikazani na Slikama 6.51 i 6.52. Konačno, vrijeme mješanja i brzina cirkulacije kada je korišten srednje flokulrajući kvasac LCC3021 prikazani su na Slikama 6.53 i 6.54. Bez obzira na ispitivani tip krutine, porast prividne brzine plina je kao posljedicu imao pad brzine cirkulacije i vremena mješanja. Odnos brzine cirkulacije i prividne brzine plina slijedio je u sva četiri ispitivana sistema jednadžbu 3.11, koju su predložili Kannard i Janekah (1991).Vrijeme mješanja ponašalo se prema jednadžbi 3.11 za sisteme sa vodom bez krutina i karaginanskim gel kuglicama, dok oba sistema sa flokulirajućim kvascima nisu pokazala jaku korelaciju sa njihovim teoretskim modelom. Ta dva sistema imala su početno vrijeme mješanja (dok prividna brzina plina nije prešla 4 mm/s) manje od vremena predviđenog modelom. Međutim, brzina skraćivanja vremena mješanja počela je padati pri prividnim brzinama plina većim od 4 mm/s, dok je model niže vrijednosti. U tablici 6.1 dane su izvedene jednadžbe za brzinu cirkulacije i vrijeme mješanja i njihov odnos sa prividnom brzinom tekućine.

Na Slici 6.55 ilustriran je odnos vremena mješanja i prividne brzine plina za sva četiri sistema. Za 98 %-tno mješanje pulsa kiseline najviše je vremena bilo potrebno u sustavu voda bez krutina (-220 sekundi pri Vsg 3 mm/s), dok je sistem sa LCC290 pokazao najbolji kapacitet za minimiziranje utjecaja pulsa kiseline u sistem (-110 s pri Vsg 3 mm/s). Vrijednosti za sisteme sa LCC3021 i k-karaginanom nalazile su se između ovih dvaju vrijednosti. Krutine unutar ‘gas-lift’ bioreaktora pomažu raspršivanje elemenata fluida tekuće faze zato što stimuliraju nastajanje vrtloga i potiču koaksijalno mješanje. Superflokulirajući kvasac LCC3021, iako prisutan u istom masenom omjeru kao i srednje flokulirajući kvasac, LCC290, omogućavao je brže vrijeme mješanja pri svim ispitivanim prividnim brzinama plina.

Na Slici 6.56 prikazana je ovisnost vremena cirkulacije o prividnoj brzini plina za sva četiri sistema. Kod prividne brzine plina od 2 mm/s vrijeme mješanja iznosilo je između 28 (voda bez krutina) i 35 sekundi (LCC290). Kod većih brzina plina razlika između sva 4 sistema smanjena je na približno 3 sekunde, ali je kod svih ispitivanih brzina sistem LCC290 pokazao nešto sporije brzine cirkulacije, dok je sistem voda bez krutina imao najveće brzine mješanja.

Na Slici 6.57 ilustriran je odnos između prividne brzine plina i prividne brzine tekućine. Za izračunavanje prividne brzine tekućine kod dane brzine cirkulacije i za dani tip krutine, korištena je jednadžba 3.7, koju su predložili Livingston i Zhang (1993). Prividna brzina tekućine porasla je sa odgovarajućim porastom prividne brzine plina. U sistemima LCC3021 i voda bez krutina zabilježeni su slični trendovi, dok su sistemi LCC290 i karaginan pokazali tek nešto sličnosti. Krivulje ovisnosti prividne brzine tekućine o prividnoj brzini plina prikazane na Slici 6.57 aproksimirane su modelnom jednadžbom Kennard-a i Jenekah-a. Na Slici 6.58 prikazane su eksperimentalno izračunate prividne brzine tekućine naspram teoretski izračunatih brzina pomoću jednadžbe 3.10. Sva četiri sistema odgovaraju predloženoj jednadžbi, što pokazuje linearna funkcija nagiba 1 i ishodišta u y=0. Tablica 6.1 sadrži korelacije izvedene za sisteme testirane u ovom radu.

[image]

Slika 6.45 Vrijeme odgovora pH probe unutar 50 litarskog gas-lift draft tube bioreaktora. Puls kiseline injektiran je u vodenu otopinu bez krutina. Prividna brzina plina postavljena je na 1.94 mm/s. Originalni podaci aproksimirani su prigušenom sinusnom krivuljom. Koeficijent korelacije bio je 0.96

[image]

Slika 6.46 Vrijeme odgovora pH probe unutar 50 litarskog gas-lift draft tube bioreaktora. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao visoko flokulirajući kvasac LCC290. Prividna brzina plina postavljena je na 1.94 mm/s. Originalni podaci aproksimirani su prigušenom sinusnom krivuljom. Koeficijent korelacije bio je 0.90

[image]

Slika 6.47 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u vodenu otopinu bez krutina. Vrijeme mješanja jest vrijeme potrebno za anuliranje 98% skokovite promjene pH. (N=3)

[image]

Slika 6.48 Povezanost vremena cirkulacije i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u vodenu otopinu bez krutina. (N=3)

[image]

Slika 6.49 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao visoko flokulirajući kvasac LCC290 (Veličina flokula > 1.0 mm). Vrijeme mješanja jest vrijeme potrebno za anuliranje 98% skokovite promjene pH. (N=3)

[image]

Slika 6.50 Povezanost vremena cirkulacije i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao visoko flokulirajući kvasac LCC290 (Veličina flokula > 1.0 mm). (N=3)

[image]

Slika 6.51 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao superflokulirajući kvasac LCC3021, imobilizran unutar κ-karaginanskih gel-kuglica (veličina kuglica 1-2 mm). Vrijeme mješanja jest vrijeme potrebno za anuliranje 98% skokovite promjene pH. (N=3)

[image]

Slika 6.52 Povezanost vremena cirkulacije i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao superflokulirajući kvasac LCC3021, imobilizran unutar κ-karaginanskih gel-kuglica (veličina kuglica 1-2 mm). (N=3)

[image]

Slika 6.53 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao Srednje Flokulirajući kvasac LCC3021 (Veličina flokula < 0.5 mm). Vrijeme mješanja jest vrijeme potrebno za anuliranje 98% skokovite promjene pH. (N=3)

[image]

Slika 6.54 Povezanost vremena cirkulacije i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao Srednje Flokulirajući kvasac LCC3021 (Veličina flokula < 0.5 mm). (N=3)

[image]

Slika 6.55 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao različite krutine. Vrijeme mješanja jest vrijeme potrebno za anuliranje 98% skokovite promjene pH. (N=3)

[image]

Slika 6.56 Povezanost vremena mješanja i prividne brzine plina u 50 litarskom Gas-lift draft tube bioreaktoru. Puls kiseline injektiran je u medij za fermentaciju koji je sadržavao različite krutine. (N=3)

[image]

Slika 6.57 Povezanost Prividne brzine tekućine (mm/s) i Prividne brzine plina (mm/s) u četiri ispitivana sistema– kvasac lcc3021, kvasac Lcc 290, Karaginanske gel-kuglice i sustav vode/bez krutina. Testiranje je provedeno unutar 50 litarskog Gas-lift draft tube bioreaktora.

[image]

Slika 6.58 Povezanost teoretske Prividne brzine tekućine (mm/s) i eksperimentalne Prividne brzine tekućine (mm/s) u četiri ispitivana sistema. Teoretska vrijednost izračunata je pomoću relacije Vsl ∝Vsgm , koju su predložili Kennard and Janekah (1991). Pravac ima nagib 1 i sječe apscisu u nuli.

Table 6.1 Sažetak izračunatih korelacija za vrijeme mješanja, brzinu cirkulacije i prividnu brzinu tekućine za četiri ispitivana sistema

[image]

Za koeficijent korelacije prividne brzine tekućine Kennar i Janekah su predložili eksponent 0.41, ako je u pitanju destilirana voda, i 0.64 kada su u tekućini prisutni karboksimetil celuloza i etanol. Sistemi LCC290 i LCC3021 imali su eksponente 0.419 i 0.427, respektivno, dok su sistemi k-karaginan i voda bez krutina imali eksponent 0.283

Osnovna pretpostavka tehnologije ‘‘gas-lift’ draft tube’ je ta da se sistemu osigura adekvatno mješanje kako bi svaki element fluida na izlazu iz reaktora bio potpuno promješan. U vođenju 50 litarskih probnih sistema kontinuirano, svježi hranjivi medij injektiran je u dno reaktora sa protokom od 36 mL u minuti u ukupni volumen reaktora od 50 L, što približno odgovara tisućerostrukom razrijeđenju komponenti kojima se prihranjuje bioreaktor. Uz karakteristike mješanja izračunate za sustav sa kvascem LCC290, element fluida se izmješa u otprilike tri cirkulacijske petlje, dok je 10 cirkulacijskih petlji potrebno u scenariju voda/bez krutina. Dodatno, vrijeme zadržavanja (24h) je približno 1000 puta veće od vremena mješanja (180 sekundi). Brzo mješanje u kombinaciji sa razrijeđivanjem hranjivih tvari u sistemu i velike razlike između vremena mješanja i vremena zadržavanja čvsrto sugeriraju da je u pitanju dobro mješani sistem. Ishodna pretpostavka bila je upotreba gas-lift bioreaktora zbog toga što osigurava idealno mješanje za fermentaciju piva. Rezultati studija mješanja provedenih sa sva tri nosača podržavaju tu pretpostavku.

6.5 PROCJENA NEKOLIKO METODA IMOBILIZACIJE ZA KONTINUIRANU PRIMARNU FERMENTACIJU UNUTAR GAS-LIFT SISTEMA

Kontinuirane fermentacije provedene su u 50 litarskom gas-lift draft tube bioreaktoru u probnom mjerilu, uz korištenje tri različita nosača za imobilizaciju – κ-karaginanske gel kuglice, superflokulirajući kvasac LCC290 i srednje flokulirajući kvasac LCC3021. Sve fermentacije inokulirane su na početku sa jednakom koncentracijom kvaščevog inokuluma (4g/L), a kao hranjivi medij upotrebljena je industrijska lager sladovina. Fermentacije su započete šaržno, kako bi se osigurala brza potrošnja šećera iz sladovine, te kako bi se promovirao rast kvasca u fermentoru. U slučaju flokulirajućeg kvasca, ova faza omogućavala je stvaranje flokula, koje su potom mogle biti zadržane u bioreaktoru kada je započeto kontinuirano vođenje. Kad jekoncentracija diacetila u mediju pala ispod 30μg/L, započeto je kontinuirano prihranjivanje sladovine. U slijedećim su sekcijama detaljnije opisane analize fermentacija sa tri različita tipa imobilizacijskih matriksa.

6.5.1 Upotreba κ-karaginanskih gel-kuglica: hvatanje u stupicu

Upotreba κ-karaginanskih gel kuglica kao imobilizacijskog matriksa pomogla je kod procjenjivanja isplativosti gas-lift tehnologije za primarnu fermentaciju piva (sekcija 6.3). Ipak je bilo potrebno procijeniti da li se takav sistem može voditi u duljem vremenskom periodu (do 2 mjeseca), bez nekih velikih poteškoća u vođenju, uključujući nestabilnost fermentacije i kontaminaciju. Parametri vođenja za ovu pokusnu fermentaciju prikazani su na Slici 6.59. Prividna brzina ugljičnog dioskida postavljena je na 5.5 mm/s, dok je brzina zraka unošenog kroz raspršivač bila 0.9 mm/s. Iz toga slijedi da je brzina oksigenacije postavljena na 3% ukupno raspršenog plina, kako bi se podudaralo sa rezultatima u sekciji 6.3, koji su pokazali da se željeno pivo može proizvesti sa unošenjem 2-5% kisika u sistem. Temperatura fermentacije održavana je na 15 oC. U podacima se mogu vidjeti stanovite fluktuacije koje su posljedica korištene kontrolne petlje. Na Slici 6.60 prikazan je razvoj kvaščeve populacije tokom vremena, zajedno sa vijabilnosti kvasca. Vijabilnost je tokom dvomjesečne fermentacije ostala na visokom nivou, sa privremenim padom zabilježenim oko 200-tog sata, što odgovara točci tik prije početka kontinuiranog dohranjivanja sladovine. Uobičajeno je da u šaržnim fermentacijama vijabilnost stanica padne pred kraj fermentacije, budući da stanice više nemaju hranjivih tvari. Kada je pokrenuto kontinuirano prihranjivanje sladovine, vijabilnost se popela iznad 90%. Populacija sloodnih kvaščevih stanica bila je mala tokom prvih 400 sati fermentacije, a onda, tijekom narednih 300 sati, porasla je deseterostruko, od ~100 milijuna stanica po mL do ~ milijarde stanica po mL. Jednom kada je dosegnuta ova vrijednost, populacije je ostala u pseudo-ravnotežnom stanju do kraja fermentacije.

Nagli porast koncentracije slobodnih stanica vjerojatno je povezan sa populacijom imobiliziranih stanica. Na početku fermentacije, kvasac uhvaćen u gelu će rasti unutar gela sve dok ne iskoristi sav raspoloživi prostor. Jednom kada se kuglice napune kvascima, ekspandirajuća populacija će se iz kuglica preliti u tekući medij. Naši rezultati sugeriraju da tokom prvih 400 sati kvasac raste unutar gela, a nakon otprilike 700 sati više nema prostora za rast u gelu, te se stoga u fermentacijsku podlogu otpuštaju veće količine kvaščevih stanica. Nestabilnost populacije kvasca odražava se na profile etanola i specifične težine (Slika 6.61) Tokom prvih 200 sati fermentacije, očekivalo se da će koncentracija etanola rasti, a specifična težina opadati, u skladu sa kinetikom tradicionalnih šaržnih fermentacija. Između 200 i 600 sati etanol je dosegao plato od 45 g/L a specifična težina ostala je na 6 oP. Ovo je bio neočekivani rezultat, budući da do kraja fermentirana tekućina ima specifičnu težinu od ~ 2.5 oP – 2.7 oP. Nakon otprilike 600 sati, kada je populacija slobodnih kvaščevih stanica dosegla maksimum, koncentracija etanola je porasla do otprilike 70g/L , aspecifična težina sladovine je pala na oko 2.2 oP. Pažljiviji pogled na specifične profile ugljikohidrata tokom vremena (Slika 6.22) upućuje na to da se koncentracija maltoze nije poravnala do otprilike 600 sata procesa. Drugi šećeri bili su prema očekivanom. Druga dva ključna analita – diacetil i 2,3-pentandion, također su praćeni tokom kontinuiranog dvomjesečnog procesa (Slika 6.63). Niske vrijednosti oko 180-og sata odgovaraju kraju startne, šaržne faze. Jednom kada je započeto kontinuirano prihranjivanje, koncentracije i diacetila i 2,3-pentandiona su strmo porasle do otprilike 500 μg/L i 400 μg/L, respektivno. Početni rast je bio očekivan budući da dotok svježeg hranjiva stimulira rast kvasca i time povećava protok metabolita, pri čemu nastaju diacetil i 2,3-pentandion. Tokom procesa koncentracija 2,3-pentandiona bila je iznad 400 μg/L, dok je koncentracija diacetila pala sa 500 μg/L na 275 μg/L, kao što je zabilježeno u procjeni isplativosti opisanoj u sekciji 6.3.

[image]

Slika 6.59 Parametri vođenja za fermentaciju sa kapa-karaginanom u ovisnosti o vremenu fermentacije

[image]

Slika 6.60 Ukupna koncentracija stanica kvasca i vijabilnost stanica imobiliziranih u κ-karaginanu u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.61 Koncentracija etanola i specifična težina u kontinuiranoj fermentaciji sa stanicama imobiliziranim u k-karaginanu u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.62 Profil ugljikhodirata u kontinuiranoj fermentaciji sa stanicama imobiliziranim u k-karaginanu u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.63 Koncentracija vicinalnih diketona u kontinuiranoj fermentaciji sa stanicama imobiliziranim u k-karaginanu u ovisnosti o vremenu fermentacije.

6.5.2 Upotreba superflokulirajućeg soja kvasca: samoflokulacija

Kontinuirane fermentacije u 50 litarskom gas-lift bioreaktoru u probnom mjerilu napunjenom sa superflokulirajućim kvascem vođene su u periodu od tri mjeseca. Raspršivani plin bio je CO2 uz protok od 2.5 mm/s dok je zrak unošen sa 0.4 mm/s kao bi se donekle promovirao rast kvasca (ovo odgovara unosu plina od 1.5L / minuti, od čega je 3% kisik). Tokom cijelog procesa temperatura fermentacije je održavana na 15 oC. Prekid u napajanju natjerao nas je da snizimo temperaturu fermentora na 4oC u trajanju od tri dana (oko 1700-og sata fermentacije) (Slike 6.64). Ovo hlađenje reaktora je provedeno kako bi se usporio metabolizam kvasca, i održala vijabilnost stanica za vrijeme prekida. Ovaj neočikavani događaj omogućio nam je da procijenim robustnost sistema na događaje koji bi u industrijskim situacijama mogli biti česti. Jednom kada je struja opet dobivena, temperatura reaktora je ponovno podešana na 15 oC, a fermentacija je nastavljena još 30 dana. Nakon kraja startne šaržne faze (~180 sati), sladovina je kontinuirano dohranjivanau sistem protokom od 2.16 L po satu, čime je vrijeme zadržavanja u bioreaktoru volumena 50 litara bilo 24 sata. Koncentracija stanice je nakon početnog šaržnog perioda porasla do 3 milijarde stanica/mL nakon otprilike 750 sati fermentacije (Slika 6.65). Masa kvasca je tada opala na približno milijardu stanica / mL kod 1000-og sata, i ostala je na tom nivou do kraja fermentacije. Tokom cijele fermentacije vijabilnost stanica kvasca bila je iznad 90 % (Slika 6.65).

Koncentracije etanola i specifična težina fermentacijske podloge dosegle su pseudo-ravnotežno stanje ubrzo nakom što je započeto sa kontinuiranim prihranjivanjem sladovine (Slika 6.66). Koncentracija etanola je porasla do otprilike 70 g/L, a do kraja fermentacije specifična težina tekućine bila je 2.3 oP. Profili ugljikohidrata na Slici 6.67 potvrđuju postizanje pseudo-ravnotežnog stanja nakon približno 270 sati fermentacije. Koncentracija polisaharida opala je sa ~42 g/L do ~ 33g/L nakon otprilke 1400 sati fermentacije. Ovaj rezultat posljedica je različitosti u šaržama sladovine. Budući da kvasac ne može upotrijebiti ove polisaharide, ova anomalija u sladovini nije imala bitan utjecaj na performanse posude za primarnu fermentaciju. Ovu razliku u udjelu nefermentirajućih šećera primjetio bi odbor treniranih kušača, koji bi primjetili da produkt ima ‘tanko’ tijelo. Koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona tokom vremena prikazane su na lici 6.68. Kao i u kontinuiranim fermentacijama sa κ-karaginanom, koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona su porasle čim je otpočeto s kontinuiranim prihranjivanjem sladovine. Diacetil je dosegao koncentraciju od približno 375 μg/L, dok je koncentracija 2,3-pentandiona bila približno 600 μg/L. Ove razine koncentracija održavane su tokom cijele fermentacije sve do prekida u napajanju kod ~1700-og sata fermentacije. Budući da je tekućina stajala 3 dana, te u njoj nije bilo metabolizma kvasca (zbog nedostatka hranjivih tvari), sdošlo je do smanjivanja razine vicinalnih diketona. Kada je prihrnjivenje sladovine nastavljeno, koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona dosegle su pseudo-ravnotežne vrijednosti.

[image]

Slika 6.64 Parametar vođenja za fermentaciju s LCC290 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.65 Ukupna koncentracija kvaščevih stanica i vijabilnost kvasca LCC290 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.66 Koncentracija etanola i specifična težina u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC290 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.67 Profil ugljikohidrata u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC290 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.68 Koncentracija vicinalnih diketona u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC290 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

6.5.2 Upotreba srednje flokulirajućeg kvasca: samoflokulacija

U nekoliko provedenih fermentacija je kao matriks za imobilizaciju unutar 50 litarskog probnog gas-lift bioreaktora korišten srednje flokulirajući soj kvasca LLC3021. Kao i o dvije prethoden metode imobiliziacije, početni inokulum bio je 4 g/L. Kvasac je inokuliran u industrijsku lager sladovinu (opisano u sekciji 4.2), gdje je fermentirao sve dok nisu utrošeni fermentabilni šećeri, i postignuta koncentracija diacetila od 30 μg/L. Temperatura fermentacije bila je 15oC, a rasršivani plin bio je korišten i kontroliran na jednak način kao i u fermentaciji sa LCC290 (prividna brzina ugljičnog dioksida od ~2.5 mm/s, zrak 0.4 mm/s, što rezultira sa ukupno 3% kisika u raspršivanom plinu) (Slika 6.69). Početna šaržna faza omogućila je flokulaciju kvaščevih stanica i njihovo zadržavanje u gas-lift sistemu. Na kraju startne, šaržne faze, pritok sladovine podešen je na 2.16 L/h, što je odgovaralo vremneu zadržavanja od 24 sata u reaktoru radnog volumena 50 litara. Kvaščeva populacija (Slika 6.70) se povećala na otprilke milijardu stanica po mililitru, i ostala je na toj razini nešto više od 1000 sati (između 500-og i 1000-og sata procesa). Na 1500-om satu fermentacije se kvaščeva populacija najedamput udvostručila i dosegla koncentraciju od 2 milijarde stanica / mL. Ova promjena u koncentraciji stanice bila je neočekivana. Vijabilnost stanica tokom cijele fermentacije održavana je iznad 90 % (Slika 6.70).

Na Slici 6.71 predstavljeni su podaci o koncentraciji etanola i specifičnoj težini sladovine tokom tri mjeseca fermentacije. Ubrzo nakon startne faze (~180 h) koncentracija etanola zadržala se na 70g/L a specifična težina dosegla je minimum od 2.2 oP. Gore opisani nagli porast koncentracije stanica nije bio popraćem smanjenjem koncentracije etanola. Najlogičnije objašnjenje za ovo povećanje populacije kvasca je to da je velik udio populacije ušao u fazu rasta, što je rezultiralo udvostručivanjem populacije. Za koncentraciju etanola bi se očekivalo podudaranje sa koncentracijom kvasca, ali ovo očito nije bio slučaj budući da je koncentracija etanola ostala na nivou pseudo-ravnotežnog stanja (70 g/L) tokom cijele fermentacije. Profili koncentracija ugljikohidrata u ovisnosti o vremenu fermentacije (Slika 6.72) doveli su do istog zaključka kao i krivulje etanoal i specifične težine. Ovaj proces je dosegnuo ravnotežno stanje sa približno 250-im satom kontinuirane fermentacije.

Na Slici 6.73 dane su krivulje koncentracija diacetila i 2,3-pentandiona u ovisnosti o vremenu kontinuirane fermentacije. Kao i u slučaju κ-karaginanskih kuglica i LCC290, koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona porasle su nakon startne šaržne faze i potom dosegle vrijednosti pseudo-ravnotežng stanja od ~225 μg/L i 400 μg/L, respektivno.

[image]

Slika 6.69 Parametar vođenja za fermentaciju s LCC3021 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.70 Ukupna koncentracija kvaščevih stanica i vijabilnost kvasca LCC3021 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.71 Koncentracija etanola i specifična težina u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC3021 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.72 Profil ugljikohidrata u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC3021 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

[image]

Slika 6.73 Koncentracija vicinalnih diketona u kontinuiranoj fermentaciji sa kvascem LCC3021 u ovisnosti o vremenu fermentacije.

6.5.4 Usporedba različitih nosača

U sekcijama 6.5.1 do 6.5.3 prezentirane su performanse u fermentaciji k-karaginanskih gel-kuglica, superflokulirajućeg kvasca LCC290 i srednje flokulirajućeg kvasca LCC3021 kao matriksa za imobilizaciju. Sva tri nosača su se smatrala prikladnim za kontinuiranu primarnu fermetnaciju unutar 50 litarskog gas-lift draft tube bioreaktora u probnom mjerilu. U sva tri slučaja postignuto je vrijeme zadržavanja od 24 sata. U fermentacijama sa superflokulirajućim kvascem LCC290 dosegnuto je stanje psudo-ravnoteže puno ranije nego u sistemima sa srednje flokulirajućim kvascem LCC3021 i stanicama imobiliziranim u κ-karaginanu. U fermentacijis s LCC290 maksimalna koncetracija etanola od 70 g/L postignuta je nakon 250 sati, a u slučaju LCC3021 ravnotežna koncentracija etanola od 70 g/L postignuta je nakon ~600 sati. Za vrijeme kontinuirane fermentacije s κ-karaginanom koncentracija etanola se ustalila dva puta, jednom između 200 i 500 sati fermentacije na 45 g/L i potom na 70 g/L nakon otprilike 575 sati nakon čega je ostala na toj razini do kraja fermentacije.

U sva tri sistema maksimalan broj stanice bio je 1 milijarda po mililitru. Nekonzistentnost u koncentraciji stanica u slučaju κ-karaginana negativno je utjecala na prduktivnost etanola (manja početna koncetracija etanola u pseudo-ravnotežnom stanju u usporedbi sa sistemom s LCC290). Koncentracije stanica u ova tri sistema dosizale su maksimum u različitim vremenskim intervalima. U slučaju LCC290, etanol je dosegnou maksimum između 500 i 1000 sati kontinuirane fermentacije, kod fermentacije s LCC3021 maksimum stanica postignut je između 1500 i 2000 sati, dok je u sistemu sa stanicama immobiliziranim u karaginanu maksimalan broj stanica dosegnut između 700 i 1000 sati kontinuirane fermentacije. Pseudo-ravnotežne koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona su u sva tri sistema bile različite. U sistemu sa LCC290, ravnotežna koncentracija diacetila bila je 375 μg/L, u sistemu sa LCC3021 ustalila se na 225 μg/L, u slučaju fermentacije sa κ-karaginanom koncentracija diacetila je najprije dosegnula vrijednost od 500�μg/L, a na pola puta se smanjila do vrijednosti od 200 μg/L u vremenskom okviru od 500 sati. U sva tri slučaja koncentracija 2,3-pentandiona odražavala je koncentraciju diacetila, uz to da je ona bila više u sistemima sa LCC290 i LCC3021. Fermentacije sa κ-karaginanom pokazale su drugačiji trend, kod njih je razina diacetila tokom prvog pseudo-ravnotežnog stanja bila veća od razine 2,3-pentandiona, nakon čega jekoncentracija diacetila pala ispod koncentracije 2.3-pentandiona. Podaci o koncentraciji kvasca i proizvodnji etanola također ukazuju na postojanje dva jedinstvena, odvojena pseudoravnotežna stanja postignuta tokom fermentacija s κ-karaginanom.

Kada se vrijednosti sistema baziraju na više kriterija, zadatak usporedbe različitih fermentacijskih sistema i procjene koji od sistema je dao bolje rezultate, postaje kompleksan. Npr, ako bi se kao kriterij uspjeha koristila jedino produktivnost etanola, onda bi sva tri sistema bila približno jednako ocjenjena, budući da je u svim slučajevima u reaktoru volumena 50 litara s vremenom zadržavanja od 24 sata proizvedeno 70 g/L etanola. Za proizvodnju prodajnog piva potrebno je puno više od proizvodnje etanola. Predloženi sisetm mora biti ocjenjen na temelju sposobnosti proizvodnje prihvatljivog piva (produktivnost etanola i koncentracije diacetila, među ostalim), potencijalnih dodatnih troškova nosača, dostupnosti nosača, lakoće rukovanja sistemom, ekoloških pitanja kao što je odlaganje nosača, stabilnosti nosača, kao i fleksibilnosti osigurane sistemom nosača. Kako bi se mogao ispitati jedan multivarijabilni sustav, u poslovnom se svijetu koristi bezdimenzionalna analiza poznata po imenu “Balanced Scorecard” (Kaplan i Norton, 1996). U prbom koraku identificiraju se kriteriji po kojima se procjenjuje sistem. Svaki kriterij se potom ocjenjuje sa ocjenom od 1 do 5, uz oznake 1 - najmanje favoriziran a 5 – najviše favoriziran. Na kraju analize, ocjene za svaku opciju se zbroje, i alternativa sa najviše bodova proglašava se najboljim izborom u danim okolnostima. U tablici 6.2 dani su rezultati takve analize za nosače za imobilizaciju koji su bili segledani kao alternative za upotrebu u 50 litarskom gas-lift draft tube bioreaktoru u probnom mjerilu. Ukupno je, sa ciljem proizvodnje prodajnog piva, ispitano ukupno 6 nosača – Chitopearl® kuglice od hitozana, Celite® kuglice od dijatomejske zemlje, Siran® kuglice od stakla, κ-karaginanske gel-kuglice, srednje flokulirajući kvasac LCC3021 i superflokulirajući kvasac LCC290. Svaki sistem je ocijenjen prema gore opisanoj skali. Ukupni rezultati pokazali su da je najbolje performanse dao superflokulirajući kvasac LCC290, kojeg je u stopu pratio srednje flokulirajući kvasac LCC3021. Ostala četiri nosača dobila su između 16 i 20 bodova. Treće mjesto zauzeo je sistem s κ-karaginanom, budući da je proizvedena prodajan tekućina u probnoj jedinici. Ova procjena nosača snažno sugerira da bi u budućnosti fokus razvoja sistema za kontinuirano fermentaciju trebao biti usmjeren na samo-agregaciju kao tip imobilizacije. Dostupnost (lako dostopno), cijena (niska, budući da ne zahtjeva dodatnu opremu), lakoća rukovanja (uklapa se u postojeće pogonske procese), ove alternative premašuje opasnost od potencijalne nestabilnosti flokula u mješanom sistemu. Za kontrolu veličine flokula tokom fermentacije moguća je upotreba osjetljivosti na razaranje ovakvog samo-agragata, a moguće je i postići povećani transfer mase i samim time povećati volumetrijsku produktivnost bioreaktora.

Tablica 6.2 Usporedba različitih nosača za imobilizaciju za primarno fermetnaciju piva unutar sistema s gas-lift bioreaktorom

[image]

6.6 Proizvodnja sjevernameričkog tipa piva upotrebom tehnologije gas-lift draft tube

Proizvodnja sjevernoameričkog (NA) piva čistog okusa postavlja pred pivara brojne izazove. Za lager piva tipa NA karakteristična je svijetla boja, niska gorčina, malo nefermentiranih šećera (tankost), i nedostatak dominantnog okusa i stoga s relativno malo paokusa. Zbog ovih urođenih svojstava pivar može maskirati vrlo malo defekata u okusu piva. Visok udio diacetila (putravost), acetaldehida (zelena jabuka) i nota sumpora (spaljena guma, miris tvora, pokvarena jaja, kuhano povrće) najčešći su preoblemi sa kojima se susreću moderni pivari. Iako uzrok ovih neželjenih okusa u pivu može biti i bakterijska kontaminacija, češće do njih dovodi nepravilno vođena fermentacija. Tokom pokusnih kontinuiranih fermentacija, koje su bile sastavni dio ovog rada, razina kontaminacije i u sladovini i u posudama za fermentaciju praćena je predanim prakticiranjem aseptičniih tehnika rada. U pokusnim fermentacijama sa tri različita tipa nosača, koje su trajale nekoliko mjeseci, nije pokazano prisustvo kontaminanata (praćeno metodama opisanim u poglavlju 4.). Primarne fermentacije praćene su koncentracijama diacetila i acetaldehida većim od željene koncentracije (<30 μg/L i <10 mg/L respektivno), ali to nije bila posljedica bakterijske infekcije. Ovi rezultati ne razlikuju se od ostalih rezultata iz literature ((Pajunen i sur., 2000; Kronlof i sur., 2000). Belgijski pivar iskoristio je visoku koncentraciju acetaldehida u pivu iz kontinuirane fermentacije, prikazao ju kao prodajno svojstvo, i plasirao proizvod kao pivo s okusom jabuke (Andreis i sur., 1996b). Visoke koncentracije diacetila nakon primarne fermetnacije također su normalna pojava u pivarskoj industriji. Neki pivari su prihvatili proces nazvan “temperature free rise” nakon završetka primarne fermentacije sa ciljem smanjenja koncentracije diacetila. Drugi su se jednostavno odlučili za duži period odležavanja sa ciljem smanjivanja vicinalnih diketona (diacetil i 2,3-pentandion) do željenih razina. Nekoliko istraživačkih grupa razvilo je tehnologiju brzog sazrijevanja, koja je prodiskutirana u poglavlju 2, za smanjivanje visoke razine diacetila. Iako je ovaj pristup vrlo efikasan, u proces proizvodnje dodaje još jedno razinu kompleksnosti koju neki teško prihvaćaju. Ekonomija brzog sazrijevanja je jasna; međutim, u ranim danima kontinuiranog procesiranja u pivarsko industriji, preporučljivo je minimizirati tehnološku kompleksnost kako bi se olakšao prijelaz sa tradicionalne, šeržne fermentacije na kontinuiranu proizvodnju. Iz tog je razloga odlučeno da se ispita upotreba držanja šarže nakon kontinuirane primarne fermentacije unutar 50 litarskih gas-lift sistema u probnom mjerilu radi kontrole visoke razine diacetila u konačnom pivu. Ovaj dodatni korak na početku ove dizertacije nije bio predviđen, ali ga je bilo potrebno implementirati kako bi se mogla izvršiti usporedba piva proizvedenih kontinuiranim postupkom sa kontrolnim pivima proizvedenim šaržno.

6.6.1 Upotreba držanja šarže nakon kontinuirane primarne fermentacije

Kritični parametar u određivanju svršetka primarne fermentacije jest razina diacetila u do kraja fermentiranoj tekućini. Konverzija prekursora diacetila, α-acetolaktata, u diacetil je korak koji određuje brzinu reakcije u putu diacetila (Slika 3.5). Prva reakcija je po prirodi kemijska, i vrlo je ovisna o temperaturi. Ako prvijenac uđe u proces hladnog sazrijevanja prije no što je došlo do kemijske konverzije α-acetolaktata u diacetil, nastalo pivo može sadržavati diacetil u koncentracijama većim od praga osjetljivosti okusa (20 μg/L), osim ako se hladno odležavanje ne provodi kroz dulji vremenski period, čime sa omogućava polagana konverzija prekursora. U svim kontinuiranim fermentacijama opisani u sekciji 6.5, razina diacetila na izlazu iz reaktora bila je iznad željene ciljne razine od 30μg/L u nerazrijeđenom pivu. U slučaju da je u ovom stadiju tekućina filtrirana kako bi se uklonio kvasac, razina diacetila bi ostala visoka, pa je stoga primjenjen topli period šarže za smanjivanje razine diacetila ispod prihvatljive granice. Pivo proizvedeno kontinuiranim postupkom sakupljano je i skladišteno u 40 litarskim posudama za pivo od nehrđajućeg čelika na temperaturi 21 oC. Mali uzorci (100mL) redovito su izuzimani iz tekućine za anlizu diacetila, etanola, specifične težine, estera i hlapivih alkohola. Na Slici 6.74 prikazana je redukcija diacetila u ovisnosti o vremenu toplog dozrijevanja za jednu šaržu piva proizvedenog kontinuiranom fermentacijom sa kvascem LCC290 kao matriksom za imobilizaciju. Period toplog dozrijevanja bio je efikasan u smanjivanju razine diacetila sa 600 μg/L do ispod 30 μg/L, što su u pivarskoj industriji smatra graničnom vrijednošću.

U drugom testu istražen je utjecaj mješanja na redukciju diacetila tokom perioda sazrijevanja. Ugljični dioksid je raspršivan (0.14 m3/h) kroz cijev promjera 1.27 cm u dno posude za prikupljanje piva, kako bi se tokom sazrijevanja mješala tekućina. Na Slici 6.75 prikazani su rezultati ovog eksperimenta. Činilo se da mješanje ugljičnim dioksidom nije imalo velik utjecaj na brzinu redukcije diacetila u sekundarnom spremniku za sazrijevanje. Ovakav rezultat može ukazivati na neadakvatno miješanje pomoću CO2, zbog čega onda ne dolazi ili do povećanja brzine prve kemijeske reakcije (konverzija α-acetolaktata u diacetil), ili do povećanja brzine prijenosa mase kako bi se brže odvijala druga reakcija (konverzija diacetila u acetoin pomoću kvasca). Isto tako jemoguće da se u meješanoj posudi nalazilo dovoljno suspendiranih stanica koje su mogle onda dalje reducirati diacetil u okusno inaktivan acetoin jedno kad je došlo do kemijske konverzija (prvi korak). Na Slikama 6.76 i 6.77 prikazan je utjecaj toplog sazrijevanja nakon primarne kontinuirane fermentacije na koncentraciju estera i viših alkohola i koncentraciju etanola i specifičnu težinu tekućine, respektivno. Iz ovih se rezultata činilo da ja period toplog sazrijevanja slabo utjecao na koncentracije acetladehida, etil acetata, propanola, izobutanola, izoamilnog akohola i izoamil acetata. (Slike 6.76). Specifična težina tekućine u posudi za držanje smanjila se od 2.7 oP do 2.0 oP u prvih 12 sati perioda sazrijevanja, da bi se onda poravnala na nižoj vrijednosti. Ovi rezultati upućivali su na to da je period sazrijevanja najprije utjecao na koncentracije diacetila i 2,3-pentandiona, dok je utjecaj na estere, hlepive alkohole i etanol bio minimalan.

[image]

Slika 6.74 Koncentracija vicinalnih diketona u ovisnosti o periodu toplog sazriejvanja nakon primarne kontinuirane fermentacije sa kvascem LCC290 u gas-lift sistemu.

[image]

Slika 6.75 Koncentracija diacetila u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarne kontinuirane fermentacije sa kvascem LCC290 u gas-lift sistemu. Jedan uzorak je bio mješan pomoću raspršivanog plina, a drugi je uzorak bio statičan.

[image]

Slika 6.76 Koncentracije estera ihlapivih alkohola u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarne kontinuirane fermentacije sa kvascem LCC290 u gas-lift sistemu.

[image]

Slika 6.77 Koncentracija etanola i specifična težina u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarne kontinuirane fermentacije sa kvascem LCC290 u gas-lift sistemu.

Protokol držanja šarži proveden je na tekućinama iz kontinuiranih fermentacija u 50 litarskom gas-lift bioreaktoru u kojima je upotrebljavan superflokulirajući kvasac LCC290, srednje flokulirajući kvasac LCC3021 ili kvasac imobiliziran u κ-karaginanu. Profili redukcije diacetila za ove tri probne fermnetacjie prikazani su na Slici 6.78, i u sva tri slučaja je diacetil reduciran na željenu razinu od 30 μg/L. Međutim, vrijeme potrebno za redukciju variralo je u sva tri slučaja. U slučaju LCC290, redukcija sa 600 μg/L na 30 μg/L postignuta je nakon otprilike 48 sati, dok je za fermentacije provedene s LCC3021 i κ-karaginanom bilo potrebno svega ~24 i ~40 sati. Pretpostavljamo da je ova diskrepancija uzrokovana početnom vrijednošću diacetila, te da ne ovisi o upotrebljanom matriksu za imobilizaciju.

Slika 6.79 prikazuje iste rezultate kao i Slika 6.78, samo što je prilagođeno vrijeme na rezultatima fermentacija s LCC3021 i κ-karaginanom. Ishodne krivulje redukcije diacetila iz potonjih fermentacija su pokanute tako da njihove početne vrijednosti padnu na krivulju redukcije diacetila u slučaju superflokulirajućeg kvasca LCC290. Uz ovu transfromacjiu, profil redukcije diacetila nalazio se na isoj liniji. Upotrebom programa TableCurve 2D ovi su podaci najbolje aproksimirani slijedećom jednadžbom kinetike prvog reda (Levenspiel, 1972) (Slika 6.80),

[Diacetil] = 648.54 e-0.0426t (6.1)

sa koeficijentom korelacije 0.96. Ovi rezultati podržavaju teoriju prema kojoj sva tri sustava imaju isti potencijal redukcije diacetila. Ovi rezultati ne bi trebali nikoga iznenaditi, budući da se redukcija diacetila povezuje sa sojem kvasca (Nakatani i sur., 1984). K-karaginan imobilizira stanice kvasca LCC3021 unutar svoje gel strukture a soj LCC290 bila je odabrana varijanta soja LCC3021. Kada je postignuta željena koncentracija diacetila od 30 μg/L, dobivena piva stavljena su na hladno dozrijevanje (2 oC) kroz 7 dana, prije konačne obrade proizvoda (filtracija, razrijeđivanje, karoniranje i pakiranje). U tablici 6.3 sumarno je prikazana analiza piva u 50 litarskim sistemima sa kvascima LCC290, LCC3021, ili kvascima imobiliziranim u κ-karaginanu. Na Slici 6.81 prikazan je radarski graf estera i hlapivih alkohola u tri kontinuirano proizvedena piva, te jednog kontrolnog industrijskog piva proizvedenog šaržno. U usporedbi sa industrijskom tekućinom (kontrola), kontinuirane tekućine imale su manje estera (rtil acetat, izoamil acetat), više propanola i manje izobutanola, primarnog amilnog alkohola i izoamilnog alkohola. Razine acetaldehida u produktima kontinuirane fermentacije bile su više od razina u kontrolnoj tekućini. Prema specifikacijama su bili razina pjene, početni hladni talog, topli talog, dimetil sulfid, sumpor dioksid ugljični dioksid i zrak.

[image]

Slika 6.78 Koncentracija diacetila u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarnih kontinuiranih fermentacija u gas-lift sistemu sa kvascem LCC290, kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanskom gelu.

[image]

Slika 6.79 Koncentracija diacetila u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarnih kontinuiranih fermentacija u gas-lift sistemu sa kvascem LCC290, kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanskom gelu. Vrijednosti za fermentaciju s LCC3021 su podešene vremenski tako da imaju jednaku startnu točku kao i fermantacije s LCC290.

[image]

Slika 6.80 Koncentracija diacetila u ovisnosti o periodu toplog sazrijevanja nakon primarnih kontinuiranih fermentacija u gas-lift sistemu sa kvascem LCC290, kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanskom gelu. Vrijednosti za fermentacije s LCC3021 i karagninanom su podešene vremenski tako da imaju jednaku startnu točku kao i fermantacije s LCC290.

Tablica 6.3 Sumarni rezultati analize piva proizvedenih upoterbom gas-lift sistema.

[image]

Slika 6.81 Radarski graf piva fermentiranih kontinuirano u gas-lift sustavu sa kvascem LCC290, kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanskom gelu. U grafu su prikazani esteri i hlapvi alkoholi u gotovim pivima. Svi proizvodi podvrgnuti su toplom dozrijevanju nakon primarne fermentacije.

[image]

Slika 6.82 Radarski graf piva fermentiranih kontinuirano u gas-lift sustavu sa kvascem LCC290, kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanskom gelu. U grafu su prikazani esteri i hlapvi alkoholi u gotovim pivima. Svi proizvodi podvrgnuti su toplom dozrijevanju nakon primarne fermentacije.

6.6.2 Odabir najboljeg plina za mješanje

Ugljični dioksid je lako dostupan u većini pivovara, zato što je on nusprodukt kvaščevog metabolizma. U pivovarama se razvijeni CO2 sakuplja, te se iz njega uklanjaju male nečistoće koje su mogle biti prenesene tokom sakupljanja (najčešće sumporni spojevi). Pročišćena struja CO2 se potom komprimira i pohranjuje u tekućem stanju za buduće upotrebe (čistoća 99.95 %). Sa točke gledišta vođenja procesa, odabir ugljičnog dioskida kao raspršivanog plina činilo se kao logičan izbor, zato što postrojenje može koristiti vlastiti sustav za kolekciju i tako prikupiti CO2 na izlazu iz fermentora. Upotreba drugih plinova samo bi dodala još jednu razinu kompleksnosti u postojeće operacije u pogonu. Međutim, kako bi kontinuirana fermentacija postala živuća alternativa šaržnim operacijama, neophodno je osigurati proizvod koji je sličan postojećem proizvodu. Vjeruje se da bi se smanjenjem bioloških/biokemijskih utjecaja kojima je kvasac izložen za vrijeme kontinuirane fermentacije moglo postići takvo izjednačavanje proizvoda. Za ugljični dioksid se zan da štetno utječe na kvašče metabolizam tijekom primarne fermentacije.Ovaj efekt se povećava u visokim cilindrično-konusnim posudama gdje glavni pritisak svojstven sistemu suprimira slobodno otpuštanje CO2 iz tekućeg medija. U ovakvim uvjetima nastaju piva sa manje estera i više hlapivih alkohola. postoji nekoliko uspješnih pokušaja u kojima je CO2 iz fermentacija uklanjan periodičkim injektiranjem struje pomoćnog plina u dno cilindro-konične posude. Na ovaj način smanjeni su inhibitorni utjecaji CO2, a dobiveni proizvodi imali su manje razine hlapivih alkohola i veće razine estera. Uz ova znanja, ispitana je upotreba dušika umjesto ugljičnog dioksida kao raspršivanog plina unutar gas-lift sustava. Prikupljeno je nekoliko tekućina fermentiranih u 50 litarskim uplift reaktorima i obrađeno u Labatt Experimental Brewery slijedećim postupkom. Nakon 14-satnog prikupljanja tekućine iz reaktora (vrijeme zadržavanja 24 sata), prvijenac je dekantiran od kvasca. Tekućina je potom podvrgnuta sazrijevanju na sobnoj temperaturi (21 oC) 48 sati, čime su koncentracije diacetila i acetaldehida dosegnule razinu specifikacija Labatt (diacetil <30 μg/L i acetaldehid <10 mg/L). Tekućina je potom prebačena na hladno sazrijevanje u trajanju od 7 dana i potom obrađena prema standardnim postupcima.

U Tablici 6.4 uspoređeni su rezultati gotovih piva, dobivenih kontinuiranom fermentacijom sa kvascem LCC290 u sustavima sa raspršivanim CO2 i N2, i standardnie, industrijski proizvdene tekućine (kontrola). Tekućina sa raspršivanim dušikom dobro se uspoređuje sa industrijski proizvedenom tekućinom. Analize su upućivale na to da je u tekućini bilo dvostruko više 1-propanola, dok je koncentracija dimetil sulfida bila otprilike tri puta niža. Boja i mutnoća bile su nešto veće u indistrijskoj tekućini, kao i potencijal pjenjenja, mjeren testom NIBEM. Pivo sa raspršivanim CO2 sadržavalo je manje estera (etil acetat, izoamil acetat) i više 1-propanola od piva sa raspršivanim N2. Omjeri estera (etil acetat, izoamil acetat, etil heksanoat, etil oktanoat, etil dekanoat) i hlapivih alkohola (1-propanol, izobutanol, izoamilni alkohol) izračunati su za kontrolnu tekućinu, tekućinu sa raspršivanim N2 i tekućinu sa raspršivanim CO2, te su iznosili 0.30, 0.27 i 0.15, respektivno.

Table 6.4 Sažetak kemijskih analiza za nekoliko kontinuirano fermentiranih proizvoda upotrebom gas-lift sustava napunjenog sa superflokulirajućimkvascem LCC290.

[image]

Na Slici 6.83 prikazan je radarski graf estera, hlapivih alkohola i koncentracija acetaldehida za tri tekućine. Profil tekućine sa raspršivanim dušikom u stopu prati profil kontrolnog piva, osim u slučaju više razine propanola. Fermentacije s raspršivanim CO2 sadržavale su bitno manje estera i hlapivih alkohola, što se nije podudaralo s kontrolom. U obje tekućine dobivene kontinuiranom fermentacijom, razina diacetila i acetaldehida bile su ispt specifikacija Labatt. Ovi pronalasci sugeriraju da je raspršivanje povećalo proizvodnju estera do razina sličnih razinama u komercijalnim pivima, dok su raspršivanjem CO2 dobivene tekućine sa relativno malo estera. Ovi rezultati upućuju na drugačiji metabolizam kvasca u atmosferi ugljičnog dioksida. Raine propanola su, neovisno o raspršivanom plinu, u kontinuiranim fermetnacijama bile više od razina u industrijski fermentiranim pivima. Iako bitno ispod praga osjetljivosti od 100 mg/L, zabilježene razlike mogu biti indikator malih promjena u metabolizmu do kojih dolazi u kontinuiranim fermantacijama. Isto tako je moguće da je veća razina izopropaniola posljedica kontinuiranog dotoka treonina, koji u razgradnom putu okso-kiselina daje propanol.

[image]

Slika 6.83 Radarski graf u kojem su uspoređene razine estera i hlapivih aklohola u tekućinama fermentiranim kontinuirano unutar gas-lift sustava, sa industrijski proizvedeno tekućinom.

POGLAVLJE 7.0 ZAKLJUČCI

Iz istraživanja provedenih u ovom radu mogu se izvesti slijedeći zaključci. Moguće je proizvesti prihvatljivo pivo bez većih defekata u okusu vođenjem 50 L probnog ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora kao primarnog fermentora, uz dvodnevno odležavanje radi kontrole diacetila. Fermentaciju koncentrirane sladovine (17.5 oP) u fermentiranu podlogu (2.5oP) moguće je postignuti uz vrijeme zadržavanja od 24 sata, tj. uz obrtaj jednog volumena reaktora dnevno.

Pogodni nosači za imobilizaciju untar ‘gas-lift’ sustava su superflokulirajući kvasac LCC290, srednje flokulirajući kvasac LCC3021 i kvasac imobiliziran u k-karaginanu. Upotreba težih, preformiranih nosača poput staklenih kuglica Siran i kuglica dijatomejske zemlje Celite nije praktična alternativa unutar ‘‘gas-lift’ draft tube’ sistema. Moguće je najmanje dvomjesečno kontinuirano vođenje procesa u slučaju fermentacija s k-karaginanskih gel kuglica, i najmanje tromjesečno kontinuirano vođenje u slučaju fermentacija s LCC290 i LCC3021, bez bilo kakvih mikrobioloških kontaminacija ili nestabilnosti performansi bioreaktora. Dodatno se kontinuirani sistem dobro nosio sa potencijalnim i pretpostavljenim varijacijama u dobavljenoj sladovini tokom duljih perioda rada.

Kontinuirana fermentacija u kojoj je korišten superflokulirajući kvasac LCC290 uz dušik kao plin za mješanje, praćeno dvodnevnim odležavanjem dobiveno je pivo okusom najsličnije industrijskom pivu, Dvodnevno odležavanje razvijeno radi smanjivanja visoke koncentracije diacetila u izlaznom pivu bio je efikasan, ali ne i optimalan mehanizam. Sposobnost redukcije diacetila u tri ispitana sistema kontinuirane fermentacije bila je vrlo slična, i kako se ranije smatralo, ovisna o soju. Odležavanje nije utjecalo na koncentracije estera i viših alkohola u fazi zadržavanja. Upotreba 3% kisika u plinu za mješanje osiguravala je adekvatnu koncentraciju kisika u sladovini, što je rezultiralo u održavanju vijabilne populacije kvasca (iznad 90%) kroz period odvijanja fermentacija i proizvodnji piva sa prihvatljivim profilom okusa. U kontinuiranim fermentacijama sa kvascima LCC290 i LCC3021 kao imobiliziranim mrežama pseudo-ravnotežno stanje dosegnuto je brže nego u sistemu sa k-karaginanskim gel kuglicama. Nestabilnost fermentacija sa imobiliziranim k-karaginanom, vjerojatno posljedica porasta imobilizirane populacije kvasca, urokovala je fermentaciju ispod željenog nivoa. Za idealnu kontinuiranu proizvodnju ovaj je fenomen vrlo nepoželjan, budući da produljeni start povećava vrijeme reakcije i ponovnog započinjanja nakon katastrofalnog neuspjeha. Duži period faze starta također će, kako bi postao atraktivan, zahtjevati i dulje vrijeme trajanje kontinuirane fermetacije. U kontinuiranom procesu proizvodnje gel kuglica proizvedene su potrebne količine kuglica za testiranja u probnim jedinicama. Međutim, ovaj je proces potrebno dodatno optimizirati, kako bi se proizvele kuglice sa užom distribucijom veličina, te je potrebno ispitati da li je prikladan za proizvodnju u industrijskom mjerilu. Umjesto mješala tipa Kenicks, ispitanim u ovom radu, mora se pronaći i ispitati novi tip mješala sa kojim je moguće prevesti proizvodnju u veće mjerilo i to povećanjem promjera mješala, a ne samo povećanjem broja statičnih mješala. Tehnika kiselinskog pulsa korištena u ovom radu omogućila nam je procjenu vremena mješanja i brzine cirkulacije unutar 50 L probnog bioreaktora tokom fermentacija sa superflokulirajućim kvascem LCC290, srednje flokulirajućim kvascem LCC3021 i kvascem imobiliziranim u karaginanu. Dobiveni podaci aproksimirani su prigušenom sinusnom funkcijom iz koje su izračunati vrijeme mješanja i brzina cirkulacije.

Sa gas lift draft tube sistemom omogućeno je brzo mješanje, sa vremenuma mješanja kraćim od 200 sekundi za sva tri tipa imobilizacijskih nosača. U sva tri sustava vrijeme mješanja polagano je opadalo sa porastom prividne brzine plina. Pri testiranim prividnim brzinama plina (2 mm/s do 6 mm/s), sistem LCC290 pokazao je najveće brzine mješanja (između 100 i 120 sekundi). Vremena cirkulacije tekućine bila su slična u sva tri sustava, bez obzira na tip nosača i prividnu brzinu plina, i također su opadala linearno sa ogovarajućim porastima u brzini plina. Potpuno mješanje tekućine (98%-tni odgovor na puls) zbilo se unutar tri do šest ciklusa cirkulacije reaktora za sva tri tipa korištenih nosača.Ovi rezultati potvrđuju da ispitani 50 L probni sistem osigurava adekvatno mječanje za kontinuiranu fermentaciju. Slaba vremena mješanja bila bi indikator mogućih mrtvih džepova koji bi bili nepoželjni za fermentaciju piva.

Ova disertacija jasno demonstrira prihvatljivost bavljenja daljnjom propagacijom sistema za proizvodnju diazajniranog, izgrađenog i vođenog u Labatt Experimental Brewery. Preporučeni sistem sastoji se od ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora sa superflokulirajućim kvascem LCC290 i dušikom kao plinom za mješanje, uz odležavanje 2 dana na 21 oC.

Drugi dio - Detaljan Opis

POGLAVLJE 4. MATERIJALI I METODE

4.1 Kvaščev soj i njegova svojstva

U ovom radu koriđten je lager soj pivskog kvasca Saccharomyces cerevisiae, iz Labatt Culture Collection (LCC) 3021. Saccharomyces cerevisiae je sinonim za Saccharomyces uvarum Beijerinck var. carlsbergensis Kudryavstev, 1960 (Kurtzmann, 1998). Na 37 oC, LCC3021 ne raste, što omogućava njegovo razlikovanje od većine ale kvasaca, koji rastu na temperaturama od 37oC i više. LCC 3021 je kvasac donjeg vrenja, kao i većina lager kvasaca, uz neke iznimke. Ovaj soj može fermentirati glukozu, galaktozu, saharozu, maltozu, rafinozu i melibiozu, ali ne i škrob, a njegovo svojstvo da fermentira melibiozu koristi se u taksonomiji za razlikovanje od ale kvasaca. Kao i većina pivskih sojeva, LCC3021 je poliploid i razmnožava se mitozom. U normalnim uvjetima lager kvacie ne razmnožavaju se mejozom, što omogućava održavanje soja genetički stabilnim zato što rijeđe dolazi do krosing-overa-a u genetičkom materijalu (Kreger-van Rij, 1984).

4.2 Priprema kvaščevog inokuluma

Kvasac je iz bočice pohranjene kriogenički u hladnjaku na -80oC razmazan na Peptone Yeast-Extract Nutrient (PYN) hranjivom agaru (pepton 3.5g/L; yeast extract, 3.0 g/L; KH2PO4, 2.0 g/L; MgSO4•7H2O, 1.0 g/L; (NH4)2SO4, 1.0 g/L; glukoza, 20.0 g/L; agar, 20.0 g/L u destiliranoj H2O), kako bi se dobile dobro odvojene kolonije. Sterilnom ušicom preneseno je nekoliko kolonija kvasca sa ploče stare 3-4 dana, i te kolonije su potom inokulirane u 10 mL sladovine koja se nalazila u epruveti. Inokulirana sladovina inkubirana ja preko noći na 21oC, odavde pojam "prekonoćna kultura", i potom je cijela suspenzija prebačena u veći volumen sladovine, obično 200 mL, radi povećanja biomase kvasca. U narednim danima je ova suspenzija dodana u još veći volumen sladovine, i tako dalje, sve dok nije propagirana željena količina kvaščeve bioamse. Općenito se očekuje da se po jednoj litri sladovine može dobiti oko 20 g lager kvasca.

Da bi se kvasac pripremio za inokulaciju, kultura je centrifugirana 10 minuta pri 4oC i 1x104 okretaja u minuti (radijus = 0.06 m). Nakon centrifugiranja, tekućina je dekantirana čime je iz peleta dobivena suha tvar kvasca za inokulaciju.

4.3 Sladovina za fermentaciju

Sladovina specifične težine 17.5oP bila je iz Labatt Breweries of Canada. Koncentracija fermentabilnih ugljikohidrata, specifična težina, i slobodni amino dušik u sladovini korištenoj za fermentacije u ovom radu dane su u Dodatku A2.1. Dodatni podaci o sastavu sladovine dali su Dale i sur., 1986, Hoekstra, 1975, Hough i sur., 1982, Klopper, 1974, and Taylor, 1989.

Šaržne fermentacije: sladovina je u autoklavu zagrijana na 100oC 45 min, i ohlađena prije inokulacije sa imobiliziranim ili slobodno suspendiranim stanicama.

Kontinuirane fermentacije: Sladovina korištena za kontinuirane fermentacije je flash pasterizirana prije prihranjivanja u gas -lift bioreaktor, te je redovito kontrolirana na kontaminaciju mikroorganizmima, kao što je opisano u sekciji 4.6. Ako je sladovina bila kontaminirana, odmah je odbačena i zamijenjena novom.

Flash uređaj za pasterizaciju vođen je sa brzinom protoka od 0.8m3 / satu. Jedinica je imala tubularnu sekciju za zadržavanje, u kojoj je sladovina držana na temperaturi od otprilike 85oC, uz najmanju temperaturu od 80oC, Volumen sekcije za zadržavanje bio je 1.13x10-2 m3, što je omogućavalo vrijeme zadržavanja u sekciji od 51 sekunde. Po zagrijavanju, sladovina je nakon izlaska iz uređaja naglo ohlađena na 2oC.

4.4. Metodologija imobilizacije

Kapa-karaginanski gel X-0909 bio je velikodušni poklon od Copenhagen Pectin A/S. Kapa-karaginanske gel kuglice, sa uhvaćenim stanicama lager kvasca, proizvedene su u procesu sa statičnim mješalom, prema postupku detaljno opisanom u radu Neufeld-a i sur. (1996), sa početnim koncentracijama stanica od 107-108 stanica/mL gela, koje su specificirane za svaki eksperiment. Kao što se vidi iz SL. 15, postupak sa statičnim mješalima temelji se na stvaranju kvascem inokulirane emulzije između nevodene, kontinuirane faze - biljnog ulja (Mazola Corn Oil), i vodene, dispergirane faze - kapa-karaginana (3% w/v) u otopini KCl-a (0.2% w/v), upotrebom serije poliacetalnih statičnih mješala (Cole-Parmer Instrument Co., USA). U sekciji za zagrijavanje, prikazanoj na shemi, u kojoj je kvasac brzo pomješan sa otopinom karaginana te se formirala emulzija, temperatura je biola 37oC. Geliranje kapa-karaginanskih kapljica unutar emulzije inducirano je brzim hlađenjem u ledenoj kupelji i naknadnim učvrščivanjem u kupelji sa kalijevim kloridom (22g/L). Za stvaranje smjese kvasca i karaginana korišteno je statično mjepalo promjera 6.4 mm sa 24 elemenata, a za stvaranje emulzije upotrebljeno je drugo mješalo promjera 12.7 mm sa 42 elementa. Kuglice korištene u eksperimentima imale su promjer od 0.5 - 2.0 mm.

4.5 Kumulativna distribucija veličina gel kuglica od kapa-karaginana sa imobiliziranim kvaščevim stanicama

Radi utvrđivanja distribucije veličina gel kuglica, iz proizvodnog procesa u kojem je proizvedeno 30 L kuglica, nasumično je uzet uzorak kapa-karaginanskih gel kuglica. Svaki uzorak imao je otprilke 500 g mokre mase. Za određivanje distribucije veličina, kuglice su propuštane kroz seriju sita sa veličinima mrežastih pora od 2.0, 1.7, 1.4, 1.8, 1.0 i 0.5 mm.

Radi olakšavanja prosijavanja za svaki je uzorak upotrebljeno 4.5 L otopine KCl koncentracije 22 g/L. U ovim eksperimentima pretpostavljeno je da su gel kuglice savršenog sfernog oblika, pa je uzeto da je promjer sita jednak promjeru kuglica, te je dodatno pretpostavljeno da je gustoća kuglica uniformna i neovisna o veličini kuglica.

4.6 Određivanje broja i vijabilnosti stanica kvasca

Koncentracija i vijabilnost slobodno suspendiranih stanica kvasca: Za određivanje vijabilnosti stanica kvasca korištena je tehnika bojanja sa metilenskim modrilom prema uputama The American Society of Brewing Chemists International (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Određivanje vijabilnosti temelji se na sposobnosti vijabilnih stanica da oksidiraju bojilo u bezbojni oblik. Nevijabilne stanice nemaju tu sposobnost, te se stoga oboje plavom bojom. Puferirana otopina metilenskog modrila prema Fink-Kuhles-u pripremljena je mješanjem 500mL otopine A (0.1g metilenskog modrila u 500 mL destilirane vode) sa 500 ml otopine B (13.6 g KH2PO4 u 500 ml destilirane vode) pomješane sa 2.4 g Na2HPO4· 12H2O u 100 ml destilirane vode. Time je dobivena puferirana otopina metilenskog modrila pH=4.6.

Razrijeđena suspenzija kvasca pomješana je u epruveti sa otopinom metilenskog modrila, kako bi se dobila suspenzija koja daje otprilike 100 kvaščevih stanica u brojnom polju. Mala kapljica dobro homogenizirane suspenzije stavljena je na predmetno stakalce i pokrivena sa pokrovnim stakalcem. Nakon što je kontakt stanica i bojila trajao od jedne do pet minuta, prebrojene se obojene i neobojene stanice. Postotak vijabilnih stanica izražen je kao postotak od ukupnog broja stanica. Koncentracija stanica određivana je svjetlosnim mikroskopom i hemocitometrom (Hauser Scientific Company).

Koncentracija i vijabilnost imobiliziranih stanica kvasca: Gel kuglice izdvojene su iz fermentirajuće tekućine prosijavanjem kroz sterilno sito (veličina pora 500 μm) i isprane sa 10 mL destilirane vode. 1 mL gel kuglica sa uhvaćenim stanicama kvasca dodan je u 19 mL destilirane vode u sterilnom spremniku za uzorke volumena 50 mL. Kuglice su potom razorene pomoću uređaja Polytron® (Brinkmann Instruments), čime su iz kuglica oslobođene stanice kvasca. Vijabilnost i koncentracija stanica su potom određivane kao i za slobodno suspendirane stanice.

4.7 Mikrobiološke analize

Analize tekuće faze: Za mikrobiološku analizu uzimani su uzorci iz tekuće faze barem jednom tjedno. Sladovina koriđtena za kontinuirane fermentacije je prijenosa u bioreaktor također testirana na kontaminaciju. Za određivanje prisutnosti i aerobnih i anaerobnih bakterija uzorci su nacijepljeni na podloge Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories), uz dodatak 10mg/mL cikloheksimida, i inkubirane na 28oC 10 dana. Ploče za detekciju anaerobnih bakterija stavljene su u anaerobnu bocu sa paketom Anaerogen® (Oxoid), koji na sebe veže sav kisik iz boce, i na taj način stvara anaerobnu atmosferu. Za provjeru anaerobnih uvjeta unutar boce korišten je anaerobni indikator (Oxoid), koji u prisutosti kisika poprimi roza boju. Za detekciju kontaminacije divljim kvascima uzorci su nacijepljeni na kvaščev medij (YM agar, Difco Laboratories) uz dodatak CuSO4 (0.4 g/L) i podloge inkubirane 7 dana na 25oC. Hranjiva podloga Peptone Yeast-Extract Nutrient Agar, opisana ranije, korištena je za detekciju kontaminacije ne-lager kvascima, inkubacijom na 37oC 7 dana. Nedostatak rasta na pločama PYN indicira da nema kontaminacije ale kvascima ili kontaminantima koji rastu na 37oC.

Analize gel faze: U našem je laboratoriju razvijen postupak kojim je osigurano da kuglice sa imobiliziranim stanicama ne budu kontaminirane bakterijama prije inokulacije u bioreaktor. Glavna briga bila je izbjegavanje kontaminacije organizmima koji uzrokuju kvarenje piva, kao što su. ili divlji kvasci. 3 mL otopine karaginanskih gel kuglica inokulirano je u 100 mL raznih selektivnih hranjivih podloga, opisanih u donjem tekstu, i inkubirano u bocama od 250 mL na 25oC uz potresanje na tresilici brzinom 100 obrtaja u minuti. Podloga NBB (Nachweis von Bierschädlichen Bacterien) (BBL kat # 98139, NBB Broth Base, 0.02 g/L cikloheksimida) je semi-selektivan medij koji se koristi za ispitvanje prisustva bakterija kvarenja piva, kao npr. Pediococcus sp. i Lactobacillus sp

Hranjiva podloga sa bakrenim sulfatom (16 g/L YM, Difco; 0.4 g/L CuSO4) je semi-selektivan medij za detekciju kontaminacije divljim kvascima. Na kraju, podloga Standard Methods (STA) + cikloheksimidna podloga ("Standar Methods" podloga 16 g/L; 0.02 g/L cikloheksimida) upotrebljava se za detekciju bakterija u vodi, otpadnoj vodi, mliječnim proizvodima i hrani (Power i McCuen, 1998). Selektivne podloge odabrane su tako da se omogući detekcija i identifikacija potencijalnih organizama kvarenja piva u roku tri dana. Kontaminacija je indicirana mutnoćom uzorka, nakon čega je provedena pretpostavljena identifikacija kontaminanata.

Metodologija detekcije respiratorno deficijentnih (RD) stanica kvasca: tehnika prevlačenja trifenil-tetrazolij kloridom (TTC): Ova metoda korištena je za razlikovanje respiratorno deficijentnih stanica kvasca od ostatka populacije, a bazira se na tome da je TTC bezbojna sol koja nakon redukcije tvori crveni talog. Kada se kolonije kvasca koje rastu na YPD (Yeast-Peptone-Dextrose) agaru (kvaščev ekstrakt, 10 g/L; pepton, 20 g/L; dekstroza, 20 g/L; agar, 20 g/L u destiliranoj vodi) prevuku TTC-om, respiratorno sposobne stanice kvasca će ga reducirati, te će se obojati tamno rozom do crvenom bojom. Respiratorno deficijentne stanice neće, naprotiv, reducirati TTC, i ostat će neobojane.

Za dobivanje suspenzija sa prikladnom koncentracijom mikroorganizama za nacijepljivanje, -100 stanica/0.2 mL, pripravljena su serijska razrijeđenja kultura. YPD ploče su potom inkubirane približno 3 dana na 21 oC, dok kvaščeve kolonije nisu postale vidljive u aerobnoj okolini. Na svaku podlogu je potom dodano 20 mL TTC top agara temperiranog na 50oC. Nakon hlađenja pojedinih otopina na 50 oC, TTC top agar pripravljen je mješanjem Otopine A (12.6 g/L NaH2PO4; 11.6 g/L Na2HPO4; 30.0 g/L agara u destiliranoj vodi, autoklavirano 15 min na 121 oC) i otopine B (2.0 g/L 2,3,5-trifenil-tetrazolij klorid u destiliranoj vodi, autoklavirano 15 min na 121 oC) u omjeru 1:1. Rezultati su sa ploča očitani nakon inkubacije od tri sata na ambijentalnoj temperaturi. Postotak RD stanica izražen je kao postotak neobojanih kolonija.

4.8 Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) kvasca imobiliziranog u kapa-karaginanskim gel kuglicama

Kapa-karaginanske gel kuglice sa imobiliziranim stanicama kvasca izuzete su iz bioreaktora kroz otvor za uzimanje uzorka i premještene u staklenu bočicu sa čepom na zavrtanje volumena 10 mL, gdje su kuglice uronjene u malom volumenu fermentacijske podloge. Bočica je odmah smještena u led, i transportirana u izoliranom spremniku do postrojenja sa SEM-om. Kapa-karaginanske gel kuglice sa imobiliziranim stanicama kvasca fiksirane su u 2%-tnom (v/v) glutaraldehidu pripravljenom u Sorensen-ovom fosfatnom puferu, 0.07 M, pH 6.8 (Hayat, 1972).

Nakon toga slijedilo je naknadno fiksiranje u 1%-tnom (w/v) osmijevom tetroksidu, pripravljenom u istom puferu, te dehidracija kroz seriju otopina alkohola rastućih koncentracija; 50, 70, 80, 95 i 100 % (v/v), u trajanju od 15 minuta za svaku koncentraciju, te na kraju uz 3 izmjene u otopini koncentracije 100%. Prije kritične točke sušenja (Ladd Research Industries, Burlington, VT) kroz ugljični dioksid, neke su kuglice zamrznute u tekućem dušiku, razlomljene i pohranjene u 100%-tnom etanolu. Ovim postupkom (freeze-fracture), unutarnja strana kuglice može se izložiti uz minimalno oštećenje. Nakon kritične točke sušenja, uzorci su obloženi prskanjem zlata/paladijuma do sloja debljine 30 nm od (Polaron SC500 sputter coater, Fision Instruments, England) i potom skenirani skenirajućim elektronskim mikroskopom sa emisijom polja Hitachi S-4500 (Nissei Sangyo, Tokyo, Japan)

4.9 Protokol za uzorkovanje iz bioreaktora

Posuda za uzimanje uzorka iz bioreaktora (membranski ventil za uzorke Scandi Brew Type T), punjena je sa 70%-tnom (v/v) otopinom etanola, kako bi se u vremenu između uzimanja uzorka održali aseptični uvjeti oko otvora. Kod uzimanja uzorka, sa baze rezervoara sa etanolom je uklonjem čep, posuda je osušena, i isprana temeljito sa etanolom prije otvaranja vratašca. Uzorci su spremani u naborane bočice ili u posude sa čepom na zavrtanje, a volumeni su, ovisno o provođenoj analizi, varirali od 5-60 mL. Za ispitvanje mikrobioloških kontaminacija, 10 ml fermentacijske tekućine je pomoću vakuuma prepumpano kroz jedinicu sa sterilnim membranskim filterom. Membrana (veličina pora 0.45 μm) postavljena je na odgovarajući hranjivi medij, kako je opisano u sekciji 4.6. Za kemijske analize, 60 mL uzorka izuzeto je kroz pregradu sa naborane bočice i filtirano siringom kroz sustav sa dvoslojnim filterom za siringe Schleicher i Schull FP-050, s veličinama pora 5 μm i 0.45 μm. Potrebni volumen uzorka je potom razdijeljen u bočicu zatvorenu pregradom od Teflon-a i aluminijskim čepom. Potrebni volumeni uzorka prikazani su u Tablici 4.1

Tablica 4.1 Volumeni uzorka potrebni za razne kemijske analize

[image]

4.10 Mjerenje koncnetracije otopljenog kisika

Analizator otopljenog kisika Dr. Thiedig Digox, mjeri koncentracije otopljenog kisika u sladovini, fermentirajućoj sladovini i pivu u rasponu od 0.001 - 19.99 mg/L (Anon, 1998). Vilachá i Uhlig (1985) testirali su velik broj instrumenata za mjerenje koncentracije otopljenog kisika u pivu, i pronašli da analizator Digox daje pouzdane i točne vrijednosti.

Elektrokemijska metoda koju koristi Digox 5 temelji se na amperometrijskom uređenju triju elektroda u potenciometru. Ćelija za mjerenje sastoji se od mjerne elektrode (katode)i i protuelektrode (anode). Ove elektrode izložene su tekućini u kojoj se treba izmjeriti koncentracija kisika. Na mjernoj elektrodi dolazi do reakcije nakon što se narine definirani potencijal mjerenja. Na većoj, srebrnoj, mjernoj elektrodi molekule kisika reduciraju se do hidroksi-iona. Prema jednadžbi 4.1, dvije molekule vode reagiraju sa jednom molekulom kisika i absorbiraju četiri elektrona, pri čemu nastaju 4 hidroksi-iona

O2 + 2H2O + 4e- -> 4OH- (4.1)

Anoda od nehrđajučeg čelika apsorbira 4 elektrona oslobođena n katoda, čime je osiguran protok struje. U jednadžbi 4.2, mjerena struja, I, je direktno proporcionalna koncentraciji kisika, CL,O:

I = K x CLO (4.2)

gdje na konstantu K utječe Faraday-eva konstanta, broj konvertiranih elektrona po molekuli, površina katode i širina graničnog sloja na površini mjerne elektrode. Za preciznost i selektivnost (kisik) mjerenja kritični su konstantan, karakterističan potencijal mjerenja i preciznost mjerenja. Mjerni napon stabilizira referentna elektroda, kroz koju ne prolazi struja. Ovakav sustav, zajedno sa potenciostatom, koji osigurava elektronsku povratnu vezu, osiguran je konstantni potencijal mjereanj. Površina mjerne elktrode je elektrolitski povezana sa referntom elektrodom kroz dijafragmu. Pogreška, temeljena na mjerenom rasponu konačne koncentracije otopljenog kisika, bila je ± 3% (Anon, 1998). Analizator otopljenog kisika kalibriran je pomoću Thiedig Active Calibration, u kojoj Digox 5 proizvodi definiranu količinu kisika baziranu na Faraday-evom zakonu (0.500 mg/l) i paralelno provjeren sa vrijednostima izmjerenim u matriksu. Ovime je omogućeno da se instrument kalibrira pod tlakom, temperaturom i uvjetima protoka koji vladaju u eksperimnetu u vremenu od jedne minute. Budući da je izmjena molekula u senzoru po prirodi proces difuzije, na nju utječe temperature, što rezultira većim brzinama reakcija i povećanjem mjerene struje. Stoga je Digox 5 opremljen sa senzorom koji mjeri temperaturu i automatski kompenzira fluktuacije.

Digox 5 ima neke prednosti u usporedbi sa membranskim senzorima za kisik. Budući da Digox 5 ne koristi elektrolit, gubitak osjetljivosti je relativno polagan, te dolazi do vrlo slabog taloženja na mjernoj elektrodi. Osjetljivost mu se može odrediti u bilo kojem trenutku, provođenjem aktivne kalibracije. To je jednostavan postupak u kojem treba očistiti elektrodu i rekalibrirati instrument. U većini membranskih senzora, na katodi se taloži srebrni klorid, te dolazi do promjena u otopini elektrolita, što uzrokuje sve niža očitanja. Iz tog razloga se membrane i elektroliti moraju mijenjati svakih nekoliko tjedana, i ponovno rekalibrirati što je dug i mukotrpan posao. Kalibracija membranskih senzora provodi se u laboratoriju u uvjetima zasićenosti kisikom , što može uzrokovati znatne pogreške, posebno u sladovini i matriksu piva pri vrlo niskim koncentracijama kisika. Temperatura ima trostruki utjecaj na membranske senzore: mijenja permeabilnost membrana, mjenja parcijalni tlak kisika i njegovu topivost u elektrolitu. Vrlo je teško kompenzirati ova tri faktora kod upotrebe memranskih senzora.

Mjerenje koncentracije otopljenog kisika u sladovini tijekom skladištenja: Flexible Tygon®Food Grade cijev (promjera 1/4 inča), aseptično je spojen na vratašca za uzorak smještena pri vrhu konusnog dijela spremnika za sladovinu T-1 i T-2 (vidi sekciju 4.2.1). Peristaltična pumpa promjenjive brzine osiguravala je protok od 11L/satu kroz blok za analizu otopljenog kisika. ((Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer kat. #P07523-50)). Mjerenja kisika otopljenog u sladovini su provedena nakon 4-5 minuta.

Mjerenje otopljenog kisika u bioreaktoru: Prije mjerenja otopljenog kisika u bioreaktoru, analizator Digox 5 je saniran. Ulaz senzora spojen je na cijev Flexible Tygon®Food Grade (promjera 1/4 inča), ta je kroz analizator propumpana 70%-tna (v/v) otopina etanola uz protok od 10L/satu u vremenu od 15 minuta. Analizator otopljenog kisika spojen je na laboratorijsku pipu za vodu, te je ispiran sa vrućom vodom (70oC) najmanje dva sata. Ovaj postupak korišten je umjesto sterilizacije parom zato što materijali od kojih je izgrađen analizator ne podnose temperaturu višu od 70 oC. Nakon dvosatnog perioda sanacije cijevi su na ulazu i izlazu iz jedinice pritegnute kako bi se održala sterilnost unutar analizatora. Slobodni krajevi cijevi su potom aseptično pritegnuti na otvore promjera 1/4" od nehrđajučeg čelika na glavnoj oblozi bioreaktora te su provedena mjerenja. Kada otvori nisu bili korišteni, zapečačeni su sa kratkim, steriliziranim cijevima Flexible Tygon®Food Grade. Otopljeni kisik u ‘gas-lift’ biorektoru mjeren je on-linena taj način da je tekućina iz bioreaktora izuzimana kroz otvor na glavnoj oblozi bioreaktora. Fermentacijska tekućina je iz bioreaktora izlazila kroz filter od nehrđajućeg čelika (vidi sekciju 4.1.2) spojen na cijev od nehrđajućeg čelika 1/4" inča, koja je prolazila kroz glavnu oblogu bioreaktora. Tekućina je potom prolazila kroz Flexible Tygon®Food Grade cijevi, povezane sa peristaltičnom pumpom promjenjive brzine (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer kat. #P07523-50) koja je osiguravala protok od 11L/satu kroz blok za analizu otopljenog kisika. Fermentacijska tekućina je potom reciklirana kroz drugi otvor veličine 1/4 inča, smješten na glavnoj oblozi bioreaktora. Za spajanje senzora na bioreaktor korištene su cijevi Flexible Tygon®Food Grade (Cole-Parmer, 1999), zbog toga što proizvođač tvrdi da imaju nisku permeabilnost kisika od 30 cm3mm/(s-cm2· cmHg) x 10-10. Mjerenje je provedeno nakon 4-5 minuta cirkulacije.

4.11 Kemijske analize

Kalibracije su provedene korištenjem standardnih reagensa. Svi reagensi korišteni u analizama su bili >99% čisti. Kada je bilo potrebno, dodatno su pročišćeni destilacijom.

4.11.1 Etanol

Koncentracija etanola određena je metodom interne plinske kromatografije (GC) od Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Deaerirani uzorci su direktno tretirani 5%-tnim (v/v) unutarnjim standardom, izopropanolom, i injektirani u plinski kromatograf Perkin Elmer Gas Chromatograph opremljen sa plameno-ionizacijskim detektorom (FID) i uređajem za automatsko uzorkovanje Dynatech. Kolona Chromosorb 102, 80-100 koriđtena je sa helijem kao plinom nosačem. Uvjeti kromatografije: protok 20 mL/min, temperatura injektora 175 oC, temperatura detektora 250oC, temperatura kolone 185oC.

4.11.2 Sažeti prikaz ugljikohidrata

Koncentracije glukoze, fruktoze, maltoze, DP3 (maltotrioze), DP4 (maltotetroze), poly-1 (pik polisaharida 1) i glicerola u uzorcima fermentacijske tekućine kvantificirani su tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti

(HPLC) u uređaju Spectra-Physics (SP8100XR), opremljenim sa kolonom sa kationskim izmjenjivačem (Bio-Rad Aminex, HPX-87K) i detektorom indeksa refrakcije (Spectra Physics, Sp6040XR).

Mobilna faza bio je dibazni kalijev difosfat koncentracije 0.01 M, a sustav je bio opremljen uređajem za automatsko uzorkovanje Spectra-Physics (SP8110). Uređaj je vođen pri tlaku od 800 psi. Protok uzorka i eluenta kroz kolonu bio je 0.6 mL/min, temperatura kolone 85oC i temperatura detektora 40 oC. Injektirani volumen bio je 10 μL.

4.11.3 Specifična težina

Specifična težina sladovine i medija za fermentaciju izražena je u ovom radu kao Stvarni ekstrakt (stupnjevi Plato-a, oP)., što je prihvaćena jedinica u pivarskoj industriji. Uzorci su filtrirani kako je opisano u sekciji 4.8, vorteksirani prije analize na uređaju za mjerenje gustoće (Anton Paar DMA-58 Densitometer) radi mjerenja specifične težine sladovine (stupnjevi Plato-a). Uzorci su ubačeni u staklenu u-cijev, koja je elektronički oscilirala kako bi se utvrdila specifična težina, a time i indirektno stupnjevi Plato-a. Stupnjevi Plato-a odnose se na numeričku vrijednost postotka (w/v) otopine saharoze u vodi na 20oC čija je specifična težina jednaka ispitivanoj sladovini. Kako se skala sa stupnjevima Plato-a i razultirajuće tablice koje postavljaju u vezu specifičnu težinu otopine i koncentraciju soluta, temelje na vodenoj otopini saharoze, ovo je samo aproksimacija količine ekstrakta. Ekstrakt je pojam koji se odnosi na ukupnu dostupnu topivu masu, u pivarskom materijalu prije i za vrijeme procesiranja (Hardwick, 1995), kao što su ugljikohidrati, proteini, tanini. Ekstrakt se još uvijek u pivarskoj industriji izražava kao specifična težina u stupnjevima Plato-a, zbog nedostatka prikladnije reference koja je bolje povezana sa varijabilnostima u sladovinama iz različitih izvora.

4.11.4 Ukupni diacetil

Ukupni diacetil (2,3-butandion) u pivu i uzorcima iz fermentacije mjeren je "headspace" tehnikom uzorkovanja analita, nakon čega je slijedila kapilarna separacija u plinskom kromatografu i detekcija uhvatom elektrona (ECD) temeljena na metodi danoj od Technical Committee and Editorial Committe of the American Society of Brewing Chemists (1992). Ova metoda odnosi se na "ukupni diacetil" zato što se njome mjeri količina diacetila, i njegovo prekursore, alfa-acetolaktata. Plin nosač boi je 5%-tni metan u argonu pri 1.0ml/min, a upotrebljena je kolona J & W DB-Wax. Omjer razdiobe bio je 2:1 pomoćni plin je bio helij pri 60 /ml/min. Temperatura injektora bila je 105oC a detektora 120 oC. Sistem je opremljen sa "headspace" uređajem za automatsko uzorkovanje (Hewlett Packard 7649E) a kao unutarnji standard korišten je 2,3-heksandion. Vrijeme ciklusa za uzorak bilo je 40 minuta, uz vrijeme ekvilibracije od 30 min na 65 oC, vrijeme stvaranja pritiska 2 min na 4.8 psig, vrijeme punjenja petlje 0.2 min, vrijeme ekvilibracije petelje 0.1 min i vremenom injektiranja od 0.27 min. Pritisak nosača bio je 18.8 psig, temperatura linije za prijenos 95 oC i temperatura petlje 65 oC.

4.11.5 Hlapive komponente piva

Hlapive komponente piva, uključujući acetaldehid, etil-acetat, izobutanol, 1-propanol, izoamil-acetat, izoamilni alkohol, etil heksanoat i etil oktanoat mjerene su "headspace" plinsko-kromatografskom metodom (Hewlett Packard 5890), sa plameno-ionizacijskim detektorom, (FID), uz upotrebu unutarnjeg standarda (n-butanol).

Plin nosač bio je helij pri 6.0 mL/min a plinski kromatograf upremljen je "headspace" uređajem za automatsko uzorkovanje Hewlett Packard 7694. Temperatura injektora bila je 200 oC a detektora 220 oC. Temperaturni profil rada kromatografa bio je: 40 oC (5 min), 40-200 oC (10oC/min), 200-220 oC (50 oC/min), 220 oC (5 min). Plinovi za FID bili su: plin nosač pri 6.0 mL/min, helij pri 30 mL/min i 28 psig, H2 pri 50 mL/min i 25 psig i zrak pri 300 ml/min i 35 psig. Pregrada je očišćena pri protoku od 0.8 mL/min. Temperatura glave bila je 4.0 psig. Kada je urešaj za automatsko uzorkovanje bio iglom spojen na ulaz za injektiranje, pritisak u bočici bio je 15.9 psig, pritisak nosača 7.1 psig, početka kolone 4 psig, protok je bio 18 mL/min i protok kolone 6 mL/min. Temperatura zona; bočica na 70 oC, petlja na 80oC, linija za prijenos na 150 oC. Ciklus kromatografa trajao je 40 min, vrijeme ekvilibriranje bočice 35 min, vrijeme stvaranja pritiska 0.25 min, vrijeme punjenja petlje 0.1 min, vrijeme ekvilibracije petlje 0.1 min, vrijeme injektiranja 3 min i volumen uzorka 1 mL.

4.11.5 Slobodni amino dušik (FAN)

Za određivanje slobodnog amino dušika u uzorku fermentacije, pomoću spektrofotometra Perkin-Elmer, korištena je metoda prema preporukama od Free Amino Nitrogen Internatioanl Method of the Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). U ovoj spektrofotometrijskoj metodi reakcija između ninhidrina i dušika prisutnog u uzorku dovodi do razvijanja boje. Apsorbancija je direktno povezana sa količinom prisutnog slobodnog amino-dušika.

a) kolorni reagens : 19.83 g dinatrij hidrogen fosfata (Na2HPO4)

30.00 g kalij dihidrogen fosfata (KH2PO4)

2.78 g ninhidrin monohidrata

1.50 g fruktoze

b) reagens za razrijeđivanje: 2.00 g kalij jodata (KIO3)

596 mL destilirane, deionizirane vode

404 mL 95%-tnog (v/v) etanola

Pohranjeno u hladnjaku i korišteno na sobnoj temperaturi.

c) glavna otopina glicina: 0.1072g/100 mL destilirane deionizirane vode

d) standardna otopina glicina: glavna otopina razrijeđena u omjeru 1:100 (v/v) sa destiliranom, deioniziranom vodom. Ovaj standard sadrži 2 mg/l FAN

Uzorci su razrijeđeni u omjeru 1:100 sa destiliranom vodom, 1 2mL razrijeđenog uzorka prenešeno je u tri epruvete. Slijepa proba pripremljena je dodatkom 2 mL destilirane, deionizirane vode u svaku od tri epruvete. Također su pripremljene tri epruvete sa po 2 mL standardne otopine glicina. U sve uzorke dodan je 1 mL kolornog reagensa, te su potom uzprci inkubirani na 100 oC u vodenoj kupelji točno 16 min. Epruvete su potom ohlađene inkubacijom na 20 oC 20 minuta u vodenoj kupelji. Potom je u svaku epruvetu dodano 5 mL reagensa za razrijeđivanje, te je cijeli sadržaj temeljito promješan. Uzorci su potom ostavljeni da miruju 10-15 min, nakon čega je pomoću spektrofotometra izmjerena apsorbancija na 570 nm, a količina FAN-a u uzorku izračunata je pomoću jednadžbe 4.3

FAN (mg/L) = (Ap - Ab - AF) 2d / As (4.3)

FAN je količina slobodnog amino dušika u uzorku u mg/L, Ap je srednja vrijednost apsorbancija ispitivanih otopina, Ab je srednja vrijednost apsorbancija slijepih proba, AF je prosjek apsorbancija za korekcije za tamne sladovine i piva, 2 je količina FAM-a u standardnoj otopini glicina, d je faktor razrijeđenja uzorka i As je srednja vrijednost apsorbancija za standardnu otopinu glicina.

POGLAVLJE 5. KONTINUIRANA FERMETNACIJA U ‘GAS-LIFT’ BIOREAKTORU

Za kontinuiranu fermentaciju piva odabran je ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktor, zbog poznatog izvrsnog prijenosa mase (tekućina-krutina) i karakteristika mješanja. Prijenos mase tekućina-krutina je posebno važan za transfer nutrijenata iz tekuće faze do krutog katalizatora-imobiliziranih stanica, čime se osigurava supstrat za uhvaćene stanice kvasca. Ovi bioreaktori također imaju dobru aeraciju, nisku potrošnju energije i jednostavno ih je konstruirati. Ova svojstva učinila su ‘gas-lift’ bioreaktore vrlo privlačnim za operacije u velikom mjerilu, kao npr. u komercijalnoj obradi otpadnih voda (Driessen i sur., 1997; Heijnen, 1993).

5.1 Opis ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora

U ovoj sekciji dan je detaljan opis ‘gas-lift’ bioreaktora korištenog u ovom radu

5.1.1. Tijelo bioreaktora

‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktor volumena 13L (radni volume 8L) dizajniran za potrebe ovog rada je trofazni bioreaktor sa fluidizirani slojem (tekućina/krutina/plin) gdje su imobilizirane stanice održavane u suspenziji cirkulacijom koju je osiguravao ugljični-dioksid (Heijnen, 1996), kako je prikazano na SL. 16. Fotografija posude bioreaktora dana je na SL.17, a detaljan crtež i detaljne dimenzije dan je na SL.18. Bioreaktor je aeriran strujom ugljičnog dioksida i strujom zraka kroz donji konusni dio kroz sinterirani raspršivač zraka od nehrđajučeg čelika. (rasprskivač za CO2, Dio #9222, Hagedorn i Gannon, USA), duljine 0.11m, vanjskog promjera 0.013 m. Ugljični dioksid je koriđten kao plin za fluidizaciju a zrak je koriđten za dopremanje kisika kvaščevim stanicama. Draft cijev, smještena koncentrično unutar valjkastog bioreaktora, poslužila je kao podizač u ovom sistemu sa fluidiziranim slojem, a vanjski prsten kao spuštač. Unutarnja draft cijev bila je obješena na cilindrični seprator čestica, postavljen na tri naušnjaka u proširenom glavnom djelu reaktora. Zadržavanjem draft cijevi i separatora čestica unutar bioreaktora minimizira rizik mikrobne kontaminacije iz okoline. Originalno je bioreaktor na izlazu imao mrežasti zaslon za separaciju imobiliziranih stanica od tekućine, ali se on često začepljivao, pa je umjesto njego korišten cilindar od nahrđajućeg čelika za separaciju kuglica sa imobiliziranim stanicama od tekuće faze na njihovom putu preko vrha draft cijevi niz prstenasti dio bioreaktora. Čestice bi udarile u cilindar i pale nazad u tekuću fazu umjesto da, kao prelijev, napuste bioreaktor. Dakle, postojalo je malo područje blizu izlaza iz bioreaktora u kojem se nisu nalazile imobilizirane stanice. Prošireni glavni dio bioreaktora je također povećao površinu za oslobađanje mjehurića plina.

5.1.2 Glavna obloga bioreaktora

Na SL. 19 prikazana je shema glavne obloge bioreaktora. Otvori na glavnoj oblozi bili su najmanje moguće veličine, kako bi se smanjio rizik od kontaminacije. Otvori su ili izravno zavareni na glavnu oblogu, ili su upotrebljeni kompresijski fitinzi (Swagelok®).

Glavna obloga bioreaktora sadržavala je otvor za inokulaciju, termo bunar, termometar, pregradu za uzorkovanje plina i izuzimanje tekućine, i povratne otvore za mjerenje koncentracije kisika. U termobunar je ubačen senzor za temperaturu, koji je bio povezan sa sistemom za kontrolu temperature. Kontroler temperature je povratnom vezom davao informaciju solenoidnom ventilu, koji je otvarao i zatvarao dotok glikola u plašt za hlađenje. Temperatura je praćena termometrom (Cole-Parmer Waterproof Thermocouple, #90610-20) i probom tipa T koja je zavarena u glavnu oblogu bioreaktora. Otopljeni kisik mjeren je pomoću analizatora otopljenog kisika (Dr. Theidig, Digox 5), koji je za točno mjerenje zahtjevao protok tekućine od 9-11 L/satu kroz analizator. Za mjerenje otopljenog kiska , tekućina je iz bioreaktora izuzeta kroz cijev promjer 1/4" koja je prolazi kroz glavnu oblogu u fermentacijsku tekućinu. Kao što je pokazano na SL. 20 vrh cijevi opremljen je filterom kako bi se iz tekućine izdvojile veće čestice, prije prolaska kroz analizator otopljenog kiska. Nakon mjerenja tekućina je vraćena u bioreaktor kroz drug 1/4" otvor u glavnoj oblozi.

5.1.3 Sanitarni ventili za aseptično uzorkovanje

Bioreaktor je bio opremljen membranskim ventilom za uzorke (Scandi-Brew®) zavarenim na stijenku bioreaktora. Ventil je dizajniran za uzorkovanje u aseptičnim uvjetima. Membrana je zapečaćena izravno nasuprot fermentacijske tekućine, što je omogućilo cjelovitu sterilizaciju ventila sa parom i alkoholom, kroz dva otvora (SL. 18). Mali vanjski rezervoar etanola okruživao je membranu kako bi se održala sterilnost u periodi između uzimanja uzorka. Ovaj ventil korišten je za sva uzorkovanja, te je pretpostavljeno da sastav tekućine u trenutku uzorkovanja nije bitno različit od sastava tekućine na izlazu iz bioreaktora. Kao što je napomenuto u poglavlju Materijali I metode, uzorkovanje je provođeno na ventilu smještenom sa vanjske strane bioreaktora. Kako bi se pretpostavka o jednakom sastavu tekućina na izlazu iz bioreaktora i tekućine uzete iz tijela bioreaktora ulinila pravomoćnom, provedene su studije mješanja. Metoda pulsnog traga koriđtena je za određivanje vremena mješanja u ‘gas-lift’ bioraktoru (Christie, 1989). 1 mL 10 N HCL brzo je injektiran u kružni dio bioreaktora, i mjerena je promjena pH u vremenu, gdje je vrijeme t=0 bilo trenutak injekcije. pH je vraćen na početnu vrijednost injektiranjem 10 N NaOH. pH elektroda (Cole-Parmer, kat. #P-05990-90) bila je dugačka 277 mm sa promjerom od 3.5 mm. Za praćenje pH koriđten je pH transmiter Ingold Model 2300 Process pH Transmitter. Kalibriranje je provedeno sa standardnim puferima, Beckman-ovim zelenim pufer pH7.0, Dio #566002 i Beckman-ovim crvenim pufer pH 4.0, Dio #566000. Podaci su prikupljani sa frekvencijom od 3750 Hz u vremenu od 300 sekundi sa programom kojeg su napisali Cheryl Hudson i John Beltrano 1994., godine, a kojeg jemodifcirao Norm Mensour 1999. god. (Universiti of Western Ontario, London, Ontario)

Podaci o pH vrijednostima uglađeni su algoritmom Savitzky-Golay u programu TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Gueloh, Ontario). Algoritam Savitzky-Golay metoda zaglađivanja u vremenskoj domeni temeljena na najmanjem kvadratu polinoma četvrtog stupnja ugođena duž pomičnog prozora Uglađeni podaci su potom normalizirani te je generiran graf ovisnosti �pH o vremenu. Vrijeme mješanja uzeto je do najbliže minute, kada je pH vrijednost dosegla 95% vrijednosti ravnotežnog stanja. Vrijeme mješanja odrešivano je za tri različite brzine protoka ugljičnog dioksida: 283 cm3/min, 472 cm3/min (protok korišten u ovom radu) i 661 cm3/min. U sva tri slučaja pH vrijednost je ekvilibrirana za manje od dvije minute, kao što je prikazano u Dodatku 1.

Vrijeme mješanja bilo je dovoljno kratko da opravda našu pretpostavku da je bioreaktor dobro mješan. To nam je omogućilo da pretpostavimo da sastav uzorka tekućine iz bioreaktora nije bitno različit od tekućine na izlazu iz bioreaktora, uz prosječno vrijeme zadržavanja u bioreaktoru od 24 sata. Iz priloženih slika, zapažena je recirkulacija tekućine superponirana na mješanje disperzijom, što je tipično za ‘gas-lift’ bioreaktore. (Chisti, 1989).

5.2 Dijagram toka sistema kontinuirane fermentacije

Dijagram toka sistema kontinuirane fermentacije, koji je bio smješten u Microbrewery Pilot Plant of Labatt Brewing Company Limited u Londonu, Ontario, je dan na SL. 21, sa detaljnimopisom djelova u tablici 5.1. Ukratko, sladovina je prikupljanu iz London Labatt Plant, sterilizirana upotrebom flash pasterizatora (Fisher Plate Heat Exchanger, combi-flow Type Eurocal 5FH) i pohranjena u velike spremnike za sladovinu (T-1 i T-2). Tokom fermentacije sladovina je prihranjivanja, uz kontrolirani protok, u ‘gas-lift’ bioreaktor (BR-1) koji je sadržavao imobilizirane stanice kvasca. Fermentirana tekućina je iz bioreaktora odlazila preljevnim sistemom te je pohranjena u spremnik za prijam (T-3). U narednim sekcijama detaljno je opisano vođenje sistema za kontinuiranu fermentaciju sistema prikazanog na SL. 21.

5.2.1 Dopremanje i skladištenje sladovine

Naoksigenirana sladovina za kontinuiranu fermentaciju dopremljena je putem cijevi iz pogona Labatt London u cilindrično-konusni spremnik volumena 1600 L, pročišćenog sa ugljičnim dioksidom kako bi se smanjila koncnetracija kisika u sladovini. Svi spremnici ove velićine, uključujući i spremnike za sladovinu , T-1 i T-2, očišćeni su i sanirani prije upotrebe prema Labatt Best Practices. Sladovina je potom flash pasterizirana i prebačena pri temepraturi od 2 oC u dostupne spremnike za sladovinu, (t-1 i T-2, također pročišćene ugljičnim dioksidom). Sladovina je u ovim spremnicim skladištena na temperaturi 2oC, do dva tjedna, i kontinuirano prihranjivanja u bioreaktor, BR-1. Na kraju dvotjednog perioda, u bioreaktor je dopremana sladovina iz drugog spremnika, u kojem se nalazila svježa sladovina. Kako bi se skratilo vrijeme praznog hoda za vrijeme prebacivanja na svježu sladovinu, korištena su dva identična spremnika za skladištenje sladovine, T-1 i T-2. U svim slučajevima je sladovina testirana na kontaminacije najmanje dva dana prije pirhranjivanja u bioreaktor BR-1. Ako je sladovina bila kontaminirana, bačena je te je odmah prikupljena i sterilizirana svježa sladovina.

Minimiziranje otopljenog kisika u sladovini tijekom skladištenja: Cilj je bio uskladištiti sladovinu sa minimalnom, konstantnom količinom kisika pri niskoj temperaturi, bez da dođe do njenog zamrzavanja. Takav način skladištenja potreban je zbog sprečavanja nepotrebnih kemijskih reakcija sa kiskikom koje dovode do ustajalosti sladovine (Narzi� i sur., 1993), zbog osiguravanja dotoka konzistentne sladovine u bioreaktor, i zbog minimiziranja kontaminacije sladovine tokom skladištenja sa mikrobima. Veliki cilindrično-konusni spremnici (T-1 i T-2), volumena 1600 litara, korišteni za skladištenje sladovine su inicijalno bili dizajnirani kao fermentori za šaržne fermentacije, a ne kao spremnici za sladovinu. Zbog toga sistem hlađenja ovih posuda nije bio adekvatan za održavanje temperature na 2 oC. Nakon tri dana skladištenja, temperatura se od jednog du drugog dijela spremnika razlikovala i do 15 oC (Tablica 5.2).

Ovi topli džepovi povećavali su rizik od kontaminacije, pa je stoga za održavanje uniformno niske temperature u ovim spremnicima bila potreban neka vrst mješanje. Iz tog je razloga u bazu konusnog dijela svakog spremnika za sladovinu (T-1 i T-2) instaliran cjevast raspršivač zraka, te su provedeni eksperimnetima kojima je cilj bio odrediti najbolji protokol za punjenje spremnika sladovinom i održavanje konstatne niske vrijednosti otopljenog kisika. U prvom eksperimentu je spremnik napunjen pasteriziranom sladovinom prikupljenom bez oksigenacije. Nakon što je spremnik napunjem sa 1600 litara sladovine, kroz raspršivač u bazi spremnika uvođen je ugljični dioksid protokom od 0.113 m3/satu. U drugom eksperimentu je opet sladovina prikupljena bez oksigenacije i pasterizirana, ali je ovaj put spremnik prije punjenja pročišćen ugljičnim dioksidom (0.85 m3/satu) u trajanju od tri sata, te je mala količina ugljičnog dioksida (0.113 m3/satu) kontinuirano rasprskivana u spremnik za vrijeme prijenosa melase. Ovaj ugljičnog dioksida malog protok je kontinuirano u mjehurićima prolazio kroz sladovinu pohranjenu u spremniku, dok je ona prihranjivana u kontinuiranu fermentaciju. U oba eksperimenta je redovito tokom skladištenja praćena koncentracija otopljenog kisika u sladovini. Na Slici 5.7 pokazana je koncentracija otopljenog kisika u sladovini tokom vremena skladiđtenja. Kada spremnik nije bio pročišćen ugljičnim dioksidom, prisustvo zraka u praznom djelu bioreaktora omogućavalo je otapljanje kisika u sladovini. Stoga je bez pročišćavanja spremnika bio potreban puno duži period da kokoncentracija kisika dosegna minimalnu i konstantnu razinu. Kada je spremnik bio pročišćen, koncentracija otopljenog kisika u sladovine je ostala na niskoj razini tokom cijelog perioda skladištenja. Stoga je, kao dio postupka skladištenja sladovine za sve kontinuirane fermentacije, prihvaćena praksa pročišćavanja spremnika za skladištenje sladovine (T-1 i T-2) uz kontinuirano raspršivanje ugljičnog dioksida kroz sladovinu radi održavanja pozitivnog pritiska na spremnike. Temperaturni profil posuda sa i bez raspršavanja 0.113 m3/satu ugljičnog dioksida je također uspoređen. Usporedba je provedena na vodi, a ne na sladovini, upotrebom temperaturne probe Type T, spojene sa termometrom (Cole-Parmer Waterproof Thermocouple Thermometer, kat. #90610-20). Spremnik je napunjen sa 1600 litara gradske vode i ekvilibriran tri dana, pri čemu je bilježena temperatura vode u različitim djelovima spremnika za skladištenje. U svakom mjerenju zabilježena je i ambijentalna temperatura, a postavljena temperatura unutar spremnika bila je 2oC. Kao što se vidi u Tablici 5.2., temperatura je uz raspršivanje ugljičnog dioksida nila uniformnija, sa rasponom između 0.1 do 4.1 oC u mjerenim područjima, a nije zabilježeno niti smrzavanje sadržaja spremnika. Ova, niža, temperatura pomogla je u sprečavanju rmikrobnog rasta u sladovini tokom skladištenja. Plin je iz spremnika za sladovinu otpuštan kroz sterilni filter za plin smješten na vrhu spremnika. Sladovina je potom pomoću peristaltične pumpe promjenjive brzine (P-1) (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer kat. #P07523-50)) u ulazni dio 8 litarskog bioreaktora putem fleksibilnog sustava cijevi Norprene® Food Grade L/S 16.

5.2.2. Kontinuirana fermentacija pomoću ‘‘gas-lift’ draft tube’ bioreaktora

Sladovina je u bioreaktor BR-1 uvedena u blizini donjeg konusa, kroz 1/4" otvor. Smjesa zraka i ugljičnog dioksida (čistoća 99.99%), sterilizirana filtracijom (Millipore, Millex®-FG50 0.2 μm), raspršivana je u bioreaktor kroz sinterirani raspršivač od nehrđajučćeg čelika. Za kontrolu protoka ugljičnog dioksida pri STp korišten je rotametar (R-3), a za kontrolu protoka zraka pri STP koriđten je kontroler protoka mase (M-1).

Fermentirana tekućina je napuštala bioreaktor kao prelijev, i prolazila kroz pojačane PVC cijevi od 1" u 30 litarski spremnik za prikupljanje od nehrđajućeg čelika, koji je hlađen glikolom kroz vanjsku zmijaču, i održavan na temperaturi od 4oC.

5.2.3 Sakupljanje produkta

Posuda za prikupljanje produkta (T-3) imala je veliki ulazni otvor (1") koji je dizajniran tako da fermentirana tekućina teče niz stijenku posude kako bi se minimiziralo pjenjenje. Ova posuda je također imala i sterilni filter za plin, (Millipore, Millex®-FG50 0.2 μm), za oslobađanje plina iz bioreaktora (BR-1) i posude za prikupljanje (T-3). Posuda za prikupljanje je periodički pražnjena kroz 1/4" ventil (V-12) smješten 2" iznad baze spremnika.

5.2.4 Petlja za hlađenje glikolom

Glikol je iz London Brewery prebačen u Microbrewery Pilot Plant pri temperaturi od -23 oC i tlak uod 45 psig, te je cirkulirao kroz plašteve za hlađenje spremnika za skladiđtenje sladovine (T-1 i T-2), ‘gas-lift’ bioreaktora (BR-1) i posude za prikupljanje produkta (T-3). Dva spremnika za skladištenje sladovine i bioreaktor bili su opremljeni temperaturnim probama za tekuću fazu, koji su povratnom vezom komunicirali sa kontrolerima tempearture, koji su pak kontrolirali protok hladnog glikola u plašteve posuda. U spremnicima za skladištenje sladovine, sladovina je pohranjena na 2 oC, dok je temperatura unutar bioreaktora održavana u rasponu od 12 oC do 22 oC, ovisno o eksperimentu. Posuda za prikupljanje produkta nije imala sustav za automatsko hlađenje, već je protok glikola kontroliran ručno, tako da temperatura u posudi bude otprilike 4 oC. Nije bilo potrebno točno kontrolirati temperaturu za prikupljanje produkta (T-3), zato što je tekućina iz posude jednostavno odbačena, i nije dalje proučavana ili procesirana. Glikol je također korišten za hlađenje cjevovoda za prijenos sladovine iz spremnika za skladištenje sladovine (T-1 i T-2) u bioreaktor (BR-1). Kada je glikol jednom procirkulirao, vraćen je u glavni cjevovod unutar Pilot Plant Microbrewery, i potom vraćen u London Plant, uglavnom pri temperaturi od -15oC i tlaku od 40 psig.

5.3 Protokol sterilizacije bioreaktora

Bioreaktor BR-1 napunjen je 2%-tnom (v/v) otopinom sredstva za sanaciju Diversol® CX/A (DiverseyLever, Canada), i namakan preko noči uz raspršivanja plina. Reaktor je potom ispražnjen i ispran hladnom vodom., a ovaj ciklus pranja i ipiranja ponovljen je dva puta. Kao priprema za sterilizaciju bioreaktora parom, odspojene su cjevi za dovod plina i slaodvine. Cjevovod za paru spojen je sa ulazom u bioreaktor, te su otvoreni slijedeći ventili: ulazni ventili i ventili za čišćenje (V-7 i V-6), ulaz plina (V-17), ventili za izlaz produkta (V-9, V-11), membranski ventili za uzorkovanje (V-8 i V-10) i otvor za pražnjenje posude za prikupljanje (V-12). Potom je polagano otvoren ventil za dovod pare iz pogona, a ventili na bioreaktori su podešeni tako da se na izlazu svakog vanjskog otvora mogla primjetiti mala količina pare. Nakon 60 minuta izloženosti pari, zatvoreni su svi vanjski ventili na bioreaktoru (V-17, V-8, V-10, V-12) osim premosnog ventila za sladovinu (V-6). Kada je zatvoren vantil za paru, zatvoren je i premosni ventil za sladovinu i sterilni filter je spojen na posudu za prikupljanje kako bi se spriječila kontaminacija nesterilnim zrakom dok se sistem hladi. Cjevovod za plin je zatim spojen ne V-17, te je zatvoren cjevovod za dotok pare kako bi se održao pozitivni pritisak za vrijeme hlađenja sistema.

5.4 Pokretanje sistema za fermentaciju

Pivska sladovina je iz postrojenja prenešena u 20 litarske posude od nehrđajućeg čelika otporne na pritisak, i zagrijana u autoklavu 45 min na 100 oC. Imobilizirane stanice su aseptično prenesene u ohlađenu sladovinu (40% v/v). Zapečaćena posuda je potom transportirana u Microbrewery Pilot Plant, gdje je bio smješten bioreaktorski sistem. 20 litarska posuda spojena je na brzo spajajući fiting (Cornelius Anoka, MN, USA), koji je spojen sa pojačanim PVC cijevima od 3/8" (Cole-Parmer, USA). Drugi kraj cijevi spojen je sa membranskim ventilom za uzorkovanje (V-8) na stijenci bioreaktora. Ugljični dioksid steriliziran filtracijom uvođen je pod pritiskom od 10 psig-a u 20 litarsku posudu, te je otvoren membranski ventil za uzorkovanje kako bi se smjesa imobiliziranih stanica prenijela iz posude u bioreaktor, a da se inokulum ne izloži okolnom zraku. Unutarnje komponente brzo spajajućeg fitinga 20 litarske posude su potom uklonjeni kako bi se spriječilo začepljivanje sa imobiliziranim stanicama nakon prijenosa u bioraktor. Kumulativna distribucija veličina (ispod normalne veličine) za kapa-karaginanske gel.kuglice je prikazana na Slici 5.8. Aritmetička sredina promjera kuglica Dpam iznosila je 1.252 mmm i Sauter-ov srednji promjer kuglica Dpsm bio je 1.17 mm. Medijan promjera kuglica bio je 1.255 mm. Eksperimentalni podaci i izračun srednje vrijednosti prosmjera kuglica dani su u Dodatku 1.

Nakon inukulacije imobiliziranim stanicama, bioraktor je vođen šaržno dok koncentracije šećera i diacetila nisu dosegnule željeni nivo - manje od 3o Plato-a izraženo preko specifične težine, i manje od 100μg/L diacetila. Nakon toga je sistem pripremljen za kontinuirano vođenje. Najprije su otvoreni ventili V-2 (ili V-4 za T-2), V-5 i V-6 kako bi se cjevovod za dotok sladovine isprao i sterilizirao parom, a zatovreni su ventili V-1 (ili V-3 za T-2) i V-7, čime je izolirana linija za sladovinu. Linija za prijenos sladovine isprana je sa vrućom vodon od približno 80 oC, koja je dostavljena kroz V-2 (ili V-4 za T-2). Naon cikulas ispiranja sa vodom, na isto je mjesto spojena linija za dotok pare, te je linija za prijenos sladovine sterilizirana najmanje 30 minuta. Istovremeno sa zatvaranjem linije za dotok pare, zatvoren je i premosni vemtil V-6. Nakon štio se sistem ohladio, V-2 (ili V-4 za T-2) je zatvoren i odspojena je linija za dotok pare. Otvoreni su ventili na tanku za sladovinu, V-1 (ili V-3 za T-2) i premosni ventil (V-6) i pokrenuta je pumpa (P-1) za prijenos sladovine. Sladovina je ispuštana u kanalizaiju kroz premosni ventil V-6 dok kondenzat u liniji nije zamijenjen svježom ohlađenom sladovinom. U tom trenuktku je premosni ventil zatvoren, te je otvoren ulazni ventil bioreaktora (V-6) čime je zapoečeta kontinuirana fermentacija. Svaka dva tjedna mjenjan je spremnik iz kojeg se prihranjuje sladovina u bioreaktor. Nakon dva tjedna prihranjivanja sladovine iz T-1, zaustavljena jekontinuirana pumpa za prijenos P-1, i zatvoren je ulazni ventil (V-5) na bioreaktoru. Linija za prijenos melase je tada spojena na drugi spremnik za sladovinu (T-2) te je potom isprana i sterilizirana kako je opisano u gornjem tekstu. Kontinuirana fermentacija je nakon ovakvog kratkog prekida, potom nastavljena nakon manje od sat vremena.

Tabica 5.1. Detaljan popis djelova za dijagram toka prikazan na Slici 5.6; PTFE, politetrafluoroethilen; SS, nehrđajući čelik

[image] [image]

Tablica 5.1 (nastavljeno). Detaljan popis djelova za dijagram toka prikazan na Slici 21

[image]

Simboli korišteni na SL.21

[image]

Slika 5.7. Koncentracija otopljenog kisika u sladovini u ovisnosti o vremenu skladištenja sladovine u spremniku za sladovinu (T-1 i T-2) u različitim uvjetima punjenja spremnika.

Tablica 5.2. Temperaturni profil vode u spremniku za skladištenje sladovine (T-1 ili T-2), nakon ekvilibriranja od tri dana. bez raspršivanja ugljičnog dioksida, i 24 sata nakom raspršivanja ugljičnog dioksida pri 0.113 cm3/h.

[image]

Slika 5.8. Kumulativna distribucija veličina kapa-karaginanskih gel kuglica sa imobiliziranim stanicama kvasca (n=5).

POGLAVLJE 6. Kappa-karaginanski gel za imobilizaciju

KVASCI KOJI SE KORISTE U PROIZVODNJI LAGER PIVA

Znanstvenici su proučavali mnoštvo kalupa za fizičko hvatanje cijelih stanica uključujući kalcijev alginat (Bejar i sur., 1992; Curin i sur., 1987; Masschelein and Ramos-Jeunehomme, 1985; Nedovic i sur., 1996; Shindo i sur., 1994; White and Portno, 1978), agarozu (Hooijmans i sur., 1990; Lundberg and Kuchel, 1997), i karaginanski gelovi (Norton i sur., 1995; Wang i sur., 1982). Karaginan je vrsta hranjive tvari i osim što je vrlo jak gel, u odnosu na druge gelove, koristi se i za poticanje inkapsulacije (Büyükgüngör, 1992).

U prvom dijelu ovog poglavlja promatra se kolonizacija kvasaca u kapa-karaginanskim kuglicama gela kroz tri ciklusa ponavljane šaržne fermentacije. Promatrana je vijabilnost imobiliziranih stanica i stanica puštenih u tekuću fazu. Parametri fermentacije, uključujući etanol, maltozu, maltotriozu, fruktozu i glukozu, su praćeni kroz ponavljane šaržne fermentacije i onda uspoređivane sa kontrolnom fermentacijom koristeći samo slobodno suspendirane stanice kvasaca u uvjetima s istim hranjivim tvarima.

Objavljeno je malo podataka o fizičkim učincima na stanice nakon dugotrajne imobilizacije (Vikarjärvi and Kronlöf, 1998) i kontinuiranog izlaganja vanjskim stresovima i fermentacijskim produktima. Drugi dio ovog poglavlja proučava vijabilnost, rasprostranjenost populacija stanica i fizički izgled stanica kvasaca u karaginskim kuglicama gela kroz duži period kontinuirane fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Kroz duže vrijeme je također proučavan i relativan postotak respiratornog deficijenta kvasaca u imobiliziranim i slobodno suspendiranim stanicama kvasaca bioreaktora.

Karaginan se sastoji od jedinica 3-6-anhidrogalaktoze koje se ponavljaju, a posloženi karaginani se međusobno razlikuju po broju i smještaju sulfatnih esternih skupina na ponavljajućim jedinicama glukoze. Shema slaganja molekula karaginana unutar gela prikazana je na slici 22. Kad je karaginan u stanju sol, njegovi polisaharidni lanci su u nasumičnoj spiralnoj konfiguraciji. Čim se stvori dovoljna količina uzvojnica za stvaranje unakrsnih veza neprekidne mreže, dolazi do tvorbe gela. Gel postaje jači i čvršći stvaranjem sve većeg broja uzvojnica ili njihovom agregacijom (Rees, 1972).

Tri najčešća tipa karaginana su lambda, iota i kapa. Kao što je prikazano na slici 6.2., oni se razlikuju u sadržaju sulfatnih estera, čija količina utječe na topivost polisaharidnih lanaca.

Lambda-karaginan sadrži veliku količinu sulfata zbog čega ne može stvarati gel (Marrs, 1998). Iota-karaginan tvori vrlo elastičan i slab gel u prisutnosti iona kalcija, i ne pokazuje značajniju sinerezu. Sinereza se javlja kad je gel toliko sklon stvaranju više uzvojnica i agregata da se mreža skuplja i uzrokuje ''plakanje'' tekućine (Rees, 1972). Kappa-karaginan je umjereno sulfoniran i zato tvori jači i čvršći gel u prisutnosti iona kalija, a i podvrgnuti će se sinerezi. Kappa-karaginan stvara gel dovoljno jak za imobilizaciju cijelih stanica kvasaca.

[image]

Slika 6.2. Kemijske strukture lambda-, iota- i kapa-karaginana.

Vrlo važna karakteristika karagina je njegova mogućnost reverzibilne termogelacije. Hlađenjem karaginske otopine dolazi do povećanja viskoziteta i stvaranja gela. Zagrijavanjem otopine viskoznost se smanjuje i karagin se vraća u stanje sola. Kontroliranjem sadržaja kationa u otopini gela može se mijenjati temperatura pri kojoj se karagin mijenja iz stanja sol u stanje gel. Povećavanjem količine kalijevih iona u otopini, povećava se temperatura stvaranja gela kapa-karaginana. Kako su na ovaj način izbjegnute velike promjene u temperaturi, ova pojava se iskoristila za imobilizaciju stanica (Neufeld i sur., 1996). Temperatura stvaranja karaginanskog gela se može tako kontrolirati da je dovoljno visoka da se stvara gel u uvjetima fermentacije, a opet dovoljno niska da omogući miješanje stanica kvasaca sa molekulama karagina u sol stanju bez štetnih utjecaja na vijabilnost stanica ili stvaranje gela.

Postoje brojni faktori koji ukazuju na potrebu za daljnjim istraživanjima utjecaja imobilizacije na metabolizam i fiziologiju kvasaca unutar gela. Imobilizirane stanice ne podliježu istim mikrouvjetima kao slobodne stanice u tekućoj fazi zato što kod imobiliziranih stanica postoje dodatne zapreke u mreži gela kao i druge zarobljene stanice kvasaca; sve ove prepreke moraju biti svladane prije nego supstrat može biti transportiran do površine stanice (Slika 23). Napravljeni su mnogi znanstveni radovi o brzini prijenosa mase u kalupima gela (Estapé i sur., 1992; Hannoun and Stephanopoulos, 1986; Korgel i sur., 1992; Kurosawa i sur., 1989; Merchant i sur., 1987; Øyaas i sur., 1995; Venâcio and Tiexiera, 1997) kako bi se bolje razumjeli mogući negativni učinci ograničene količine hranjivih tvari na imobilizirane stanice prilikom fermentacije. Djelotvorna difuzija malih molekula u karaginanskom gelu je usporediva sa difuzijom istih molekula u vodi. Kroz gel mogu difundirati male molekule, poput glukoze i etanola. No, kod tipične fermentacije imobiliziranih stanica, hranjive tvari se vrlo brzo prenose u kuglice sa imobiliziranim stanicama i to uglavnom konvektivnim transportom i molekularnom difuzijom (Hannoun and Stephanopoulos, 1986). Čim hranjive tvari uđu u kuglice, prijenos postaje veoma spor jer predvladava molekularna difuzija. To znači da stanice kvasaca koje se nalaze na rubu kuglica gela imaju drugačiju količinu hranjivih tvari nego one unutar kuglica.

Također je važno uzeti u obzir i starost imobiliziranih stanica kvasaca. Zarobljene stanice stare kako traje fermentacija tijekom više mjeseci i fermentiraju pod umjetno određenim uvjetima. No, tijekom šaržne fermentacije, stanice kvasaca su izložene promjenjivim utjecajima okoliša i ponovo se koriste za određen broj fermentacija prije razlaganja. Potrebna su dodatna istraživanja dugotrajnih učinaka kontinuirane fermentacije na vitalnost stanica kvasaca.

U dijelu A ovog poglavlja promatrala se kinetika kolonizacije kvasaca u kapa-karaginanskim kuglicama gela tijekom tri ciklusa ponavljane šaržne fermentacije. Promatrana je vijabilnost i koncentracija imobiliziranih stanica i stanica puštenih u tekuću fazu, zajedno sa etanolom, stupnjem Plato-a i koncentracijom šećera.

U dijelu B promatrani su utjecaji vremena fermentacije na položaj i rasprostranjenje stanica u kuglicama gela te morfologija stanica kvasaca. Skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) proučavale su se imobilizirane stanice kvasaca u različitim dijelovima kuglice kapa-karaginanskog gela i to u četiri različita vremena: 1) odmah nakon stvaranja kuglice; 2) nakon dva dana šaržne fermentacije; 3) nakon dva mjeseca kontinuirane fermentacije u probnom mjerilu gas lift bioreaktora; 4) šest mjeseci nakon kontinuirane fermentacije u probnom mjerilu gas lift bioreaktora. Također su promatrane vijabilnost i koncentracija imobiliziranih stanica kvasaca i slobodnih stanica u tekućoj fazi. Proučavan je i relativan postotak respiratornog deficijenta kvasaca (u imobiliziranim i slobodno suspendiranim stanicama) nakon pet mjeseci kontinuirane fermentacije u gas lift bioreaktoru te uspoređen sa postotcima nađenim kod tradicionalne šaržne fermentacije piva. U istraživanju je korišten soj kvasaca koji se koristi u proizvodnji lager piva.

6.1. Metode istraživanja

Tvorba kuglica kapa-karaginanskog gela: kapa-karaginanski gel X-0909 je velikodušan dar Copenhagen Pectin A/S-a. Kuglice kapa-karaginanskog gela koje sadrže zarobljene stanice lager kvasaca napravljene su korištenjem postupka statične miješalice sa početnom koncentracijom stanica 2.6x107 stanica/mL u gelu (Patent application 2133789) (Neufeld i sur., 1996) i promjerom kuglice 0.5 do 2.00 mm.

Fermentacijski medij: Labatt Breweries of Canada dala je sladovinu specifične težine 17.5°P, što je detaljnije opisano u odjeljku ''Materijali i metode''.

Dio A: Ponavljana šaržna kinetika imobiliziranih kvasaca u kuglicama kapa-karaginanskog gela

Fermentacija se provodila u Erlenmeyerovim bocama volumena 2L na 21°C, uz miješanje od 150 rpm. Punjenje nosača bilo je 40% (v/v) kuglica gela sa imobiliziranim stanicama i ukupan volumen fermentacije bio je 1L. Svaka fermentacija trajala je sedam dana. R1 sviježe kuglice gela sa imobiliziranim stanicama su ubačene u sladovinu, a na kraju fermentacije ove kuglice su izdvojene procjeđivanjem fermentirajuće tekućine preko sterilne rešetke od nehrđajućeg čelika (promjer pora 500 μm). Kuglice su potom prebačene u sviježu, sterilnu sladovinu za drugu (R2) i treću (R3) šaržnu fermentaciju. Uzorkovanje se provodilo dva puta dnevno prva tri dana, a onda jednom dnevno slijedeća četiri ili pet dana svake fermentacije. Svaka fermentacija izvodila se paralelno u dvije ili tri boce. Kontrola svake fermentacije provodila se u istim uvjetima, ali sa slobodno suspendiranim stanicama početne koncentracije 4 g/L. Napravljene su analize vijabilnosti i koncentracije slobodnih i imobiliziranih stanica u uzorcima, te koncentracije ugljikohidrata i etanola u tekućoj fazi.

Faktori produkta, YP/S, etanola dobivenog iz glukoze, su zbrajani tako da se koristila jednadžba 3.20 za sva tri fermentacijska ciklusa imobiliziranih stanica i kontrolnih slobodnih stanica. Faktori produkata svih fermentacija su zbrajani od početka fermentacije do vremena potpune potrošnje maltoze.

Produktivnost etanola, Vetanol, količina etanola proizvedenog u volumenu ukupnog rada bioreaktora po vremenu fermentacije, je zbrajana tako da se koristila jednadžba 3.25 za R1, R2 i R3 i cikluse kontrolnih slobodnih stanica, i to od početka fermentacije do vremena potpune potrošnje maltoze. Što se tiče faktora produkata i produktiviteta etanola, prinosi imobiliziranih i slobodno suspendiranih stanica nisu međusobno odijeljeni.

Najveća lokalna specifična brzina rasta, μmax, i vrijeme udvostručenja stanica su se računali kao prosjek kontrole sa slobodnim stanicama, koristeći jednadžbe 3.3 i 3.4.

Dio B: Vijabilnost i morfološke karakteristike imobiliziranih kvasaca u uvjetima vremenski produljene šaržne fermentacije: Šaržne fermentacije provođene su u Erlenmeyerovim bocama volumena 2L na 21°C, uz miješanje od 150 rpm. Punjenje nosača bilo je 40% (v/v) s ukupnim volumenom fermentacije 1L.

Uvjeti kontinuirane fermentacije: Za kontinuiranu fermantaciju korištena su probna mjerila gas lift draft tube bioreaktora. Svi podaci skupljeni su iz bioreaktora radnog volumena 8L te bioreaktora volumena 50L, gdje su dva mjeseca rađene skenirajuće elektronske mikrografije i gdje se koristio isti fermentacijski medij i metode imobilizacije. 40% (v/v) kuglica gela sa imobiliziranim stanicama su u bioreaktorima prevođene u tekuće stanje i pri tom se koristila mješavina zraka i ugljikovog dioksida. Bioreaktori su radili pod različitim uvjetima, temperatura fermentacije održavala se na 12, 17 i 22°C, a vrijeme trajanja bilo je održavano na 0.9 do 1.8 dana. Maksimalna koncentracija etanola u gas lift reaktoru dosegla je 73 kg/m3 tijekom šest mjeseci pokusa, s prosječnom koncentracijom 58 kg/m3.

Mikrobiološka analiza: Uzorci su uzimani iz tekuće faze gas lift bioreaktora barem jednom tjedno kako bi se utvrdila eventualna kontaminacija divljim kvascima, kvascima koji nisu lager kvasci, te aerobnim i anaerobnim bakterijama koje kvare pivo. Nakon pet mjeseci proučavane su mutacije respiratornog deficijenta stanica kvasaca iz tekuće faze u duplikatu.

Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM): Za SEM su uzorkovane kuglice kapa-karaginanskog gela (promjera 1.0 – 1.5 mm) sa imobiliziranim stanicama lager kvasaca i to u četiri različita vremena: 1) odmah nakon stvaranja kuglice sa imobiliziranim stanicama, a prije inokulacije u fermentacijskom mediju; 2) nakon dva dana šaržne fermentacije; 3) nakon dva mjeseca kontinuirane fermentacije u probnom mjerilu gas lift draft tube bioreaktora; 4) nakon šest mjeseci kontinuirane fermentacije u probnom mjerilu gas lift draft tube bioreaktora. U sekciji 4.7 opisana je metodologija rada sa SEM-om i priprema uzoraka.

Koristeći metode opisane u odjeljku 4.6, koncentracija i vijabilnost stanica kvasaca (imobiliziranih i slobodnih) procjenjeni su isto kad i koncentracija i vijabilnost određeni SEM-om.

6.2. Rezultati i rasprava

Dio A: Kinetika ponovljene šarže imobiliziranih kvasaca u kuglicama kapa-karaginanskog gela

Kad god bi se imobilizirane stanice prebacile u svježu sladovinu, fermentacijsko vrijeme bi se znatno smanjilo, što je prikazano na slikama 6.4. (a, b, c) odnosom maltoze, maltotrioze, glukoze, fruktoze i etanola i fermentacijskog vremena kroz tri ciklusa ponavljane šaržne fermentacije. Ukupno vrijeme potrošnje šećera je bilo 64 sata za R1, 44 sata za R2 i 26 sati za R3. Vrijeme potrošnje šećera kod kontrole sa slobodnim stanicama, bez kuglica gela, prikazana na slici 6.5, iznosilo je 82 sata. Grafički prikaz na slici 6.4 pokazuje da su konačne koncentracije etanola bile najviše u trećoj od tri ponavljane šaržne fermentacije. Malo etanola je preneseno kuglicama u svježe mlado nehmeljeno pivo, zato što je kapa-karaginanski gel hidro-gel. Zbog toga je etanol bio prisutan već na samom početku u fermentacijskoj tekućini uzoraka R2 i R3, pa su početne koncentracije glukoze, maltoze, maltotrioze i fruktoze kod fermentacije imobiliziranih stanica bile niže (slika 6.4) u odnosu na kontrolu (slika 6.5). Prema tome, faktori produkata računati su tako da se produkti, proizvodnja etanola (g) po potrošnji šećera (g), mogu uspoređivati.

[image]

Slika 6.4.a) R1, koncentracije maltoze, maltotrioze, glukoze, fruktoze i etanola u odnosu na vrijeme fermentacije ponavljanih šaržnih fermentacija, kod imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginana.

[image]

Slika 6.4.b) R2, koncentracije maltoze, maltotrioze, glukoze, fruktoze i etanola u odnosu na vrijeme fermentacije ponavljanih šaržnih fermentacija, kod imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginana.

[image]

Slika 6.4.c) R3, koncentracije maltoze, maltotrioze, glukoze, fruktoze i etanola u odnosu na vrijeme fermentacije ponavljanih šaržnih fermentacija, kod imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginana.

[image]

Slika 6.5. Koncentracije maltoze, maltotrioze, glukoze, fruktoze i etanola u odnosu na vrijeme fermentacije slobodno suspendiranih lager kvasaca (kontrole).

Slike 6.6 (a) i (b), pokazuju usporedbu koncentracija maltoze i etanola u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3. Tijekom ponavljanja R1, stanice kvasaca su uzimale maltozu odmah nakon prebacivanja u sviježe mlado nehmeljeno pivo. Koncentracije etanola dostigle su svoj pik ranije u ponovljenoj R1, a također su dostignute i više koncentracije nego u prve dvije šaržne fermentacije. Slika 6.6 (b) pokazuje da je početna lag-faza u proizvodnji etanola u R1 drastično pala kad su imobilizirane stanice bile prebačene u R2, a još više nakon prebacivanja u R3.

[image]

Slika 6.6. a) Koncentracija maltoze u odnosu na vrijeme fermentacije ponavljanih šaržnih fermentacija, R1, R2 i R3, kod imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginana.

[image]

Slika 6.6. b) Koncentracija etanola u odnosu na vrijeme fermentacije ponavljanih šaržnih fermentacija, R1, R2 i R3, kod imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginana.

Slika 6.7 (a) prikazuje koncentraciju imobiliziranih stanica po ukupnom volumenu bioreaktora u odnosu na crijeme fermentacije R1, R2 i R3. Odnos slobodnih stanica otpuštenih iz kuglica gela u tekuću fazu i vremena pokazuje slika 6.7 (b). Slika 6.7 (c) prikazuje ukupnu koncentraciju imobiliziranih i slobodnih stanica kvasaca po ukupnom volumenu reaktora za tri šarže. Koncentracija stanica imobiliziranih u kapa-karaginanskom gelu, prikazano slikom 6.7 (a), se povećava u odnosu na početnu koncentraciju u R1. Kad su kuglice gela bile prebačene u svježe mlado nehmeljeno pivo ponovljenog R2, rast stanica se nastavio u kuglicama. Rast koncentracije imobiliziranih stanica se usporio nakon trećeg prebacivanja inkapsuliranih stanica u svježe mlado nehmeljeno pivo. Slika 6.8 prikazuje koncentracijski profil stanica otpuštenih iz gela u tekuću fazu, koncentraciju imobiliziranih stanica i ukupnog broj stanica, u R1.

[image]

Slika 6.7. a) Koncentracija imobiliziranih stanica lager kvasaca po ukupnom volumenu bioreaktora u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3. Intervali pogreške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 6.7. b) Koncentracija stanica lager kvasaca otpuštenih u tekuću fazu po ukupnom volumenu bioreaktora u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3. Intervali pogreške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 6.7. c) Ukupna koncentracija stanica lager kvasaca otpuštenih (imobiliziranih i slobodnih) po ukupnom volumenu bioreaktora u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3. Intervali pogreške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 6.8. Koncentracijski profil stanica otpuštenih iz gela u tekuću fazu, imobiliziranih stanica i ukupnog broj stanica u odnosu na vrijeme fermentacije u R1, prvom od tri uzorka ponavljanih šaržnih fermentacija sa stanicama imobiliziranim u kuglicama kapa-karagininskog gela.

Koncentracija stanica imobiliziranih u kuglicama kapa-karagininskog gela, u R1, je rasla istim intenzitetom kao i u konroli koja je sadržavala samo stanice u tekućoj fazi. Ovo je potvrđeno usporedbom krivulja prosječnog rasta stanica kontrole (slika 6.9) i stanica imobiliziranih u kuglicama kapa-karagininskog gela u R1 (slika 6.10). Tijekom fermentacije R1, kuglice gela nisu potouno kolonizirane niti se čini da gel ima inhibitorni utjecaj na rast stanica kvasaca unutar kuglica gela. U R2 se čini da kalup ograničava rast stanica unutar kuglica gela, na što ukazuje i smanjen rast broja stanica tijekom ovog fermentacijskog ciklusa. Ova pojava može biti posljedica same prirode gela, grupiranja stanica kvasaca unutar kuglice gela ili nedovoljne opskrbe stanica hranjivim tvarima.

[image]

Slika 6.9. Prosječna koncentracija slobodnih stanica lager kvasaca (n=3) po ukupnom volumenu bioreaktora u odnosu na vrijeme fermentacije. Tijekom fermentacija nisu bile prisutne imobilizirane stanice.

[image]

Slika 6.10. Koncentracija imobiliziranih stanica lager kvasaca po mL kuglica gela u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3. Intervali pogreške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

Tablica 6.1 prikazuje produkte etanola nastalog iz šećera iz podloge, YP/S, kao tri šaržne fermentacije, i kontrolu. U Tablici 6.2 su prikazane volumetrijske produktivnosti etanola u bioreaktoru, koje su izračunate iz podataka iz Tablice 6.1. Produkti etanola iz fermentirajućih šećera nisu se značajno razlikovali kako međusobno, tako i od kontrole. Produkti su premašivali 90% od teoretske pretpostavke (0.51) izvedene iz Guy-Lussac-ove jednadžbe. Kao što je i prije spomenuto, produkcija biomase i drugih nusprodukata stanica kvasaca spriječavaju da efikasnost naraste iznad 95% od teoretske vrijednosti (Hardwick, 1995). Volumetrijske produktivnosti etanola u bioreaktoru, u tri šaržne fermentacije, su značajno varirali kroz šaržne i ponavljajuće šaržne fermentacije. Produktivnost etanola je rasla kroz svaki ciklus ponavljajuće šaržne fermentacije tako da je do R3 produkcija imobiliziranih stanica bila veća od kontrolnih. Ukupna količina etanola proizvedenog u R2 nije bila značajno veća nego u R1, no vrijeme fermentacije je bilo dvostruko kraće nego kod R1 i kontrole. Postoje mnogi faktori koji pridonose povećanju fermentacije imobiliziranih stanica sa svakom ponovljenom šaržom, kao što je prilagodba stanica kvasaca uvjetima fermentacije pri čemu se povećava koncentracija stanica. Značajnije povećanje ukupnog broja stanica po volumenu bioreaktora, u odnosu na kontrolu, je kod R3. Na slici 6.7 (b) prikazana je koncentracija stanica kvasaca otpuštenih u tekuću fazu u odnosu na vrijeme fermentacije i vidljiv je rast broja stanica sa svakom novom šaržnom generacijom. Čim se kuglica gela prepuni stanicama, one bivaju sve više otpuštene u okolnu tekućinu. Hüsken i sur. (1996) su proučavali rast bakterijskih kolonija i njihovo otpuštanje iz tekućine kapa-karaginanskog gela. Vives i sur. (1993) su objavili da je maksimalna koncentracija stanica koju su uspjeli dobiti po kuglici kapa-karaginanskog gela iznosila 109 stanica/g gela, a to su dobili kod kuglica iz R2. Slične maksimalne koncentracije stanica nađene su tijekom fermentacija dijela B. No, ukupna maksimalna količina stanica u gelu ovisi o početnoj količini stanica, sastavu gela i drugim faktorima.

Tablica 6.1. Faktori, YP/S, produkta, P, etanola iz supstrata, glukoze (Glc), fruktoze (Frc), maltoze (Mal) i maltotrioze (DP3) za R1, R2, R3, i slobodne stanice kontrolne fermentacije.

[image]

* tf je vrijeme u stima potrebno za potrošnju maltose, a slovo f se odnosi na koncentraciju tvari u određenom vremenu, t = tf.

Tablica 6.2. Produktivnost etanola u bioreaktoru [Vethanol = (kg stvorenog etanola) / (m3 volumena bioreaktora ⋅ h)] za šaržne fermentacije imobiliziranih stanica (R1, R2, and R3) u usporedbi sa šaržnim fermentacijama slobodnih stanica.

[image]

* izračunato nakon potpune razgradnje maltoze

Prilagodba stanica kvasaca je još jedan faktor koji povećava volumetrijsku produktivnost bioreaktora koja se prati sa svakom ponovljenom šaržnom fermentacijom. Na kraju prve fermentacije, metabolizam stanica kvasaca se prilagodio uvjetima fermentacije. Ovo može rezultirati padom lag-faze na početku slijedeće šaržne fermentacije, povećavajući vrijeme fermentacije. Tijekom ovog pokusa sve kontrolne fermentacije su rađene sa svježim lager kvascima. Bilo bi zanimljivo prebaciti kontrolne slobodne stanice kvasaca paralelno sa imobiliziranim stanicama i promatrati ovaj efekt u odnosu na koncentraciju stanica.

Slika 6.11 pokazuje da je vijabilnost imobiliziranih stanica kvasaca, korištenjem metilenskog modrila kao indikatorom, bila niska (<50%) kad su imobilizirane stanice bile prebačene u sladovinu u R1, no narasla je iznad 90% nakon 48 sati fermentacije. Stanice kvasaca su vrlo brzo naseljavale kuglice gela, i vijabilnost je ostala visoka tijekom R3. Međutim, u ponovljenoj R3, vijabilnost je blago padala prema kraju fermentacije. No, kroz sve tri ponavljane šaržne fermentacije, slobodne stanice otpuštene u tekuću fazu imale su veću vijabilnost nego njihovi ''paralelni'' uzorci sa imobiliziranim stanicama. Medij za imobilizaciju može imati negativan utjecaj na vijabilnost stanica (ograničenje prijenosa mase i/ili prostorna), ili na njihovo otpuštanje u tekuću fazu.

Slika 6.12 prikazuje vrijednosti osi x kao ln (X/Xo), gdje su korišteni prosječni podaci iz tri različite kontrolne fermentacije sa slobodnim stanicama (Dodatak 1), u odnosu na vrijeme fermentacije. Nagib je jednak najveća lokalna specifična brzina rasta stanica na 21°C u pivskoj sladovini, sa miješanjem na 150 rpm. Najveća lokalna specifična brzina rasta kvasaca bio je 0.096 hr-1, a vrijeme udvostručenja broja stanica bilo je 7.22 sata. μmax u ovom postupku definiran je kao lokalni μmax jer, kako je spomenuto u sekciji 'Teorije', pravi μmax korišten u Monodovoj jednadžbi se može doseći samo kad je vrijednost S značajno veći od Monodove konstante, KS. Potrebna su daljnja istraživanja da bi se odredila Monodova konstanta, KS, supstrata koji je limitirajući u ovim fermentacijama. Ta konstanta potrebna je kako bi se potvrdilo da je izračunati lokalni μmax pravi maksimum, definiran Monodovom jednadžbom.

[image]

Slika 6.11. Vijabilnost imobiliziranih stanica lager kvasaca (metilensko modrilo) u odnosu na vrijeme fermentacije R1, R2 i R3.

[image]

Slika 6.12. Ln (X/Xo) u odnosu na vrijeme fermentacije tijekom faze eksponencijalnog rasta kontrolnih fermentacija sa slobodnim stanicama, gdje je X koncentracija stanica po vremenu t, a Xo koncentracija stanica po vremenu t=0 (n=3).

Dio B: Vijabilnost i morfološke karakteristike imobiliziranih stanica kvasaca kroz produljeno vrijeme fermentacije

Praćenjem produkcije imobiliziranih stanica u procesu statičnog miksera dobiveno je da je koncentracija stanica bila 2.6 x 107 stanica/ml po kuglici gela i prije nego su kuglice gela bile izložene fermentacijskom mediju (Tablica 6.3, gdje su prikazane prosječne vrijednosti dvaju uzoraka). SEM prikaz pokazuje da su stanice pojedinačno i uniformno raspoređene kroz kuglicu gela (Slika 24).

Tablica 6.3. Vijabilnost (metilensko modrilo) i koncentracija slobodno suspendiranih i imobiliziranih stanica lager kvasaca u kuglicama kapa-karaginanskog gela kroz vrijeme fermentacije.

[image] *Bazirano na jednom uzorku.

Vijabilnost je bila >90% nakon dva dana šaržne fermentacije, a koncentracija unutar kuglica gela se povećala deset puta (Tablica 6.3). Stanice (>90% vijabilne) su otpuštane iz kuglica u fermentacijsku tekućinu, i pri tom su dosegle koncentraciju od 107 stanica/mL tekućine. Slika 25. pokazuje stanice sa ožiljcima od pupova malih kolonija kvasaca unutar kuglice gela.

Vijabilnost imobiliziranih stanica kvasaca pala je nakon dva mjeseca neprekidne fermentacije u gas lift bioreaktoru (Tablica 6.3), no stanice u tekućoj fazi su ostale vrlo vijabilne (>90%), što je potvrđeno nizom različitih neprekidnih fermentacija u probnom mjerilu gas lift bioreaktora. Slika 26 pokazuje SEM prikaz dva mjeseca starih kolonija kvasaca koje su se razvile na rubu kuglice gela, što je potvrdilo istraživanja drugih znanstvenika (Bancel and Hu, 1996; Gòdia i sur., 1987; Wada i sur., 1979; Wang i sur., 1982). Korištenjem SEM prikaza više uzoraka napravljena je usporedba morfologije kvasaca na vanjskom rubu kuglice gela sa onima smještenim u središtu kuglice. Stanice sa ruba kuglice su bile ovalne i glatke, sa mnogo ožiljaka pupova (Slika 27), što je ukazivalo na razmnožavanje kvasaca (Smart, 1995). Stanice iz središta kuglice (Slika 28) su bile nepravilnog oblika I imale su malo ožiljaka od pupova. Nedostatak ožiljaka mogao bi ukazivati na moguć manjak nutrijenata, poput kisika, u središtu kuglice. Nepravilnosti na površini stanice kvasaca (Slika 28) također može ukazivati na starenje stanice (Barker and Smart, 1996; Smart, 1999).

Vijabilnost kvasaca imobiliziranih u karaginanskom gelu je pala ispod 50% nakon šest mjeseci kontinuirane fermentacije u gas lift bioreaktoru (Tablica 6.3). Potrebno je naglasiti da su podaci o koncentraciji imobiliziranih satnica i njihovoj vijabilnosti, uzeti u jednoj točki tijekom šest mjeseci, bili slični podacima jedne točke tijekom pet mjeseci. Koncentracija imobiliziranih stanica bila je 1.14 x 109 stanice/mL gela, a vijabilnost <50%. Postojao je postepeni pad vijabilnosti imobiliziranih stanica, dok je vijabilnost slobodnih stanica u tekućoj fazi bila i dalje relativno visoka. Iako je vijabilnost imobiliziranih stanica bila niska, bioreaktor je proizveo potpuno fermentirano pivo tijekom šest mjeseci rada. Smatra se da su tome uvelike pridonijele prilično vijabilne slobodne stanice kvasaca, kao i stanice na rubu kuglica gela. Na rubu kuglice gela postoje manje zapreke za prijenos mase, za razliku od većih prepreka u središtu kuglice gela. Nepoznato je da li su se stanice mogle same raspodijeliti kroz gel, ili su ostale tamo gdje su prvotno smještene. Najveća koncentracija stanica unutar kuglica gela, koja je dosegnuta tijekom šest mjeseci kontinuirane fermentacije iznosila je 109 stanica/mL.

Slika 29. pokazuje SEM prikaz cijele kuglice gela. Ova kuglica je imala šuplje središte, kao i polovica pregledanih kuglica. Šupljikavost bi mogla biti posljedica razgradnje strukture karaginanskog gela, dodatno potaknuta pripremom za promatranje SEM-om. Šupljikavost nije zapažena kod svježih kuglica gela. Prijašnji radovi (Bancel i sur., 1996) ukazali su da rast stanica utječe na propadanje strukture gela. Audet i sur. (1988) objavili su da dodatak gume lažne akacije karaginanu utječe na čvrstoću kuglica gela za imobilizaciju bakterija.

Tijekom svih šest mjeseci fermentacije piva, barem jednom tjedno se provjeravala kontaminacija u gas lift bioreaktoru. Ni u jednoj fazi pokusa nije nađena bakterijska kontaminacija. U zadnja dva mjeseca pokusa nađeni su kontaminantni kvasci u koncentraciji 1-5 CFU/mL. Ti kvasci su rasli na PYN mediju na 37°C, no nisu rasli ni aerobno ni anaerobno na DUBA mediju (selektivan za bakterije), nisu fermentirali dekstrine, niti rasli na CuSO4 mediju (selektivan za divlje kvasce).

Nakon pet mjeseci, prosječni postotak respiratornog deficijenta stanica kvasaca bio je 7%, što je više nego kod istog soja tijekom industrijske šaržne fermentacije (prosječno 2%). Drugi istraživači objavili su slične rezultate (Norton i D'Amore, 1995). Respiratorni deficijent kvasaca uzrokovan je mutacijom zbog koje stanice kvasaca ne mogu razgrađivati glukozu do ugljik-dioksida i vode. Mitohondriji ovih kvasaca su nefunkcionalni i to najčešće zbog mutacije u mitohondrijskoj DNA (Hardwick, 1995).

Pripreme za SEM analizu mogu uzrokovati greške. Tehnologije poput nuklearne magnetske rezonantne (NMR) spektroskopije (Fernandez, 1996) i konfokalne mikroskopije (Bancel i Hu, 1996) koristile su se za proučavanje imobiliziranih stanica, bez oštećenja stanica. NMR tehnike omogućile su istraživačima da prate transport, tijek i prostornu distribuciju stanica i biokemikalija u biofilmovima. Znanstvenici (Bancel i Hu, 1996) su također pokazali da se konfokalna skenirajuća mikroskopija može koristiti za promatranje stanica imobiliziranih u poroznim želatinoznim mikronosačima kroz seriju optičkih sekcija.

Iako se metilensko modrilo koristi kao standardni indikator vijabilnosti stanica u pivskoj industriji, metoda ima mnogo nedostataka (Mochaba et al, 1998). Njome se mjeri vijabilnost stanica kvasaca bazirano na njihovoj sposobnosti da oksidiraju boju do bezbojnog oblika. Stanice koje nisu vijabilne ne razgrađuju boju pa ostaju plave (O'Connor-Cox i sur., 1997). Tehnike sa ravnim i kosim podlogama bazirane su na sposobnosti stanica da rastu i stvaraju makrokolonije na agarnim podlogama ili mikrokolonije na mediju prekrivenom objektnim stakalcem mikroskopa (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Pivovare Labbat provode pokuse u kojima proučavaju vijabilnost stanica kvasaca u kalupima kroz duže vrijeme, i to ne samo sa metilenskim modrilom, nego i sa prije spomenutim metodama i konfokalnom mikroskopijom gdje se upotrebljava vitalno bojenje. Uz proučavanje vijabilnosti stanica, potrebno je istraživati i vitalnost stanica. Vijabilnost stanica se opisuje kao sposobnost stanica da rastu i razmnožavaju se, dok se vitalnost mjeri fermentacijom kvasaca, aktivnošću, ili sposobnošću kvasaca da se oporave od stresa (Smart i sur., 1999).

POGLAVLJE 7. PROIZVODNJA OKUSA U KONTINUIRANOM GAS-LIFT SUSTAVU FERMENTACIJE PIVA

7.1. Pokus

Metoda kontinuirane fermentacije u proizvodnji piva je dosta drugačija od metode sa imobiliziranim stanicama jer se krajnji produkt ne mjeri u obliku jedne komponente, na primjer etanola. Mjeri se ravnoteža različitih kemijskih komponenti koje moraju biti u posebnim odnosima kako bi se dobio kvalitetan krajnji proizvod. Proučavani su utjecaji kisika na kvaščeve metabolite koji daju okus, tijekom kontinuirane primarne fermentacije i vrijeme držanja sekundarne šaržne. Također su proučavani i utjecaji vremena zadržavanja na metabolite koji daju okus, i to na dvije razine. U sladovinu za kontinuiranu fermentaciju je ubačen enzim alfa-acetolaktat dekarboksilaza, pa je praćena ukupna koncentracija diacetila.

7.1.1. Utjecaj relativnih količina zraka u plinu bioreaktora na metabolite kvasaca tijekom primarne kontinuirane fermentacije

Količine zraka i kisika u plinu bioreaktora su varirale, dok su vrijeme zadržavanja, temperatura i sve ostale varijable bile konstantne. Ukupni volumetrijski protok plina je držan na konstantnoj vrijednosti od 472 mL/min kod STP (standardne temperature i tlaka, standard temperature and pressure), temperatura je bila 15°C, a korištene su kuglice gela kapa-karaginana sa imobiliziranim stanicama LCC 3021 kvasaca početne količine 108 stanica/mL gela. Četiri različita volumetrijska protoka zraka su određena za pokus (Tablica 7.1), a prosječno vrijeme zadržavanja bioreaktora, Rt, bilo je 1.18 dana.

Tablica 7.1. Volumetrijski protok zraka doveden u bioreaktor kroz raspršivač tijekom kontinuirane fermentacije. Ukupan volumetrijski protok u bioreaktoru je 472 mL/min kod STP. Ostatak plina je ugljik dioksid.

[image]

Slijedeće analize provodile su se ponavljano tijekom pokusa: slobodni amino-dušik (FAN), ukupni ugljikohidrati koji fermentiraju (npr. glukoza), etanol, ukupna količina diacetila, hlapive tvari iz piva (izabrani esteri i alkoholi), vijabilnost i koncentracija stanica kvasaca u tekućoj fazi. Bioreaktor je testiran na kontaminaciju barem jednom tjedno.

Koncentaracija kisika otopljenog u tekućoj fazi bioreaktora mjerena je kad se pretpostavilo da je kontinuirana fermentacija u pseudo-stalnom stanju za svaki volumetrijski protok zraka (minimalno tri ciklusa reaktora).

7.1.2. Vrijeme zadržavanja šarže nakon fermentacije: Utjecaj kisika na metabolite kvasaca

Čak i kad je količina kisika u fluidizirajućem plinu bioreaktora bila mala (34 mL/min kod STP), koncentracije acetaldehida i ukupnog diacetila iz pokusa opisanog u ovoj sekciji (7.1.2) su bile neprihvatljivo visoke za sjevernoameričko tržište piva. Zato je upotrebljen nov i neobičan način. Tekućina uzeta iz kontinuiranog primarnog bioreaktora držala se 48 sati u šarži na temperaturi 21°C kako bi se smanjila koncentracija te dvije komponente. Rezultati iz prijašnje sekcije pokazali su značajne utjecaje zraka u plinu na okus. Zato su proučavani utjecaji aerobnih i anaerobnih stanja nizvodno od primarne fermentacije, gdje se provodila sekundarno zadržavanje šarže, na kvaščeve metabolite koji daju okus.

Kontinuirana primarna fermentacija izvodila se u gas lift bioreaktoru volumena 50 L, sa visoko flokulentnom varijantom LCC3021 kvasaca, zato što je volumen uzorka ovog pokusa bio prevelik u odnosu na bioreaktor volumena 8 L. Uvjeti rada bili su 1180 mL/min CO2 i 189 mL/min zraka kod STP u fluidizirajućem plinu, prosječno vrijeme zadržavanja, Rt, bilo je 1.0 dan, temperature 15°C i sladovina visoke koncentracije 17.5ºP.

Radilo se sa četiri uzorka (100 mL naborane bočice), od kojih su dva držana u aerobnim, a druga dva u anaerobnim uvjetima.

Procedura kod anaerobnog uzorkovanja bila je slijedeća: dvije naburane bočice od 100 mL i šest od 25 mL su bile autoklavirane i onda stavljene u anaerobnu komoru (Labmaster 100, mbraun, USA) sa argonom kao plinom za čišćenje. Uzorci u bočicama od 100 mL su stajali po 45 minuta da se stabiliziraju, a potom su začepljene aluminijskim čepovima i Teflon® septama. Uzorak se izvlačio iz bioreaktora špricom volumena 50 mL, sa iglom dužine 3 inča, broj 16, steriliziranom 70%-tnom (v/v) otopinom etanola, punktiranjem septuma membrane poklopca uzorka, te se potom uštrcavao u sterilne anaerobne bočice volumena 100 mL.

Bilo je potrebno napraviti odušak na bočici, kroz dodatnu sterilnu iglu, kako se ne bi stvarao tlak prilikom punjenja. Aerobni uzorci su bili vađeni iz bioreaktora tako da se potpuno uklonila membrana poklopca uzorka, te su ubacivani u nezačepljene bočice od 100 mL, bez upotrebe pipete i igle.

Uzorci su ostavljeni dva sata na sobnoj temperaturi kako bi se kvasci istaložili, ostavljajući koncentraciju stanica u tekućini oko 106 stanica/mL. Nakon toga se tekućina iz svake bočice od 100 mL dekantirala u tri bočice od 25 mL. Anaerobni uzorci bili su smješteni u anaerobne komore kako bi se smanjilo primanje kisika, dok su aerobni uzorci bili izloženi strujanju zraka u laminaru. Svaki uzorak od 100 mL je podjeljen u tri manje bočice od 25 mL, tako da analiza uzoraka nije ometala proces fermentacije uzimanjem uzoraka. Aerobni uzorci su inkubirani odmah nakon dijeljenja u manje bočice, i to nepoklopljeni, na 21ºC. Nakon podijele u manje bočice, anaerobni uzorci su začepljeni aluminijskim čepovima i Teflon® septama. Da bi se izbjeglo povišenje tlaka zbog stvaranja ugljičnog dioksida unutar bočica, a opet spriječio ulazak zraka u uzorke, septa su probušene iglom. Kraj igle, izložen vanjskim uvjetima, uronjen je u etanol, da zrak ne bi ušao u bočice. Uzorci za analizu uzimani su nakon 2, 24, i 48 sati. Također se uzeo i odmah analizirao uzorak izravno iz bioreaktora kako bi se procijenio stupanj fermentacije na samom početku. Analize uzoraka obuhvaćale su ukupne ugljikohidrate koji fermentiraju (npr. glukoza), etanol, ukupna količina diacetila te hlapive tvari iz piva (izabrani esteri i alkoholi).

7.1.3 Utjecaj vremena zadržavanja na metabolite kvasaca tijekom kontinuirane primarne fermentacije piva

Kako bi se odredio utjecaj vremena zadržavanja na metaboličku aktivnost kvasaca, pokus se izvodio tako da se promatrala promjena u volumetrijskom protoku sladovine u bioreaktoru tijekom komtinuirane primarne fermentacije piva. Pri tom su se koristile stanice kvasaca LCC3021 imobilizirane u kuglicama kapa-karaginanskog gela.Temperatura reaktora održavana je konstantnom na 17ºC. Protok plina u bioreaktoru je bio konstantan, 472 mL/min kod STP. Plin je bio mješavina zraka (11 mL/min kod STP) i ugljikovog dioksida (461 mL/min kod STP). Početna koncentracija stanica kvasaca u kapa-karaginanskom gelu bila je 2.6 x 107 stanica/mL kuglica gela, a bioreaktor je sadržavao 40% (v/v) kuglica.

Slijedeće analize provodile su se ponavljano tijekom pokusa: ugljikohidrati, slobodni amino-dušik (FAN), ukupni ugljikohidrati koji fermentiraju (npr. glukoza), etanol, ukupna količina diacetila, hlapive tvari iz piva (izabrani esteri i alkoholi), vijabilnost i koncentracija stanica kvasaca u tekućoj fazi. Bioreaktor je testiran na kontaminaciju barem jednom tjedno.

7.1.4 Upotreba komercijalnog pripravka alfa-acetolaktat dekarboksilaze u snižavanju ukupne količine diacetila tijekom kontinuirane primarne fermentacije piva

Mnoge sjevernoameričke pivovare smatraju da visoke koncentracije diacetila smanjuju kvalitetu piva. Kroz kontinuirane primarne fermentacije piva, ukupna koncentracija diacetila je bila iznad početnih vrijednosti koje vrijede kod tradicionalne šaržne fermentacije (70 – 150 μg/L) u sjevernoameričkom lager pivu. Diacetil se reducira u kasnijim stadijima šaržne fermentacije, kad više nema kisika i kad se više ne dodaju šećeri. U kontinuiranom sustavu fermentacije, male količine kisika se dovode u bioreaktor kroz raspršivač, dok se svježa sladovina stalno dodaje u bioreaktor. Zbog toga se proučavala nova strategija gdje se koristi komercijalni enzim, pa je moguće pratiti i kontrolirati koncentraciju diacetila u kontinuiranom bioreaktoru.

Diacetil u fermentaciji sladovine nastaje kad se alfa-acetolaktat, međuprodukt sinteze valina, oksidativno dekarboksilira izvan stanice kvasca. Stanica reapsorbira diacetil i pretvara ga u acetoin koji manje utječe na okus piva. Ova oksidativna dekarboksilacija alfa-acetolaktata u diacetil je ograničavajući korak u šaržnim fermentacijama sladovine. Ukupna koncentracija diacetila koji se dobije u bioreaktoru na kraju kontinuirane fermentacije je neprihvatljivo visoka (300-400 μg/L). Komercijalni enzim alfa-acetolaktat dekarboksilaza (ALDC), iz Novo-Nordisk A/S, može pretvoriti alfa-acetolaktat izravno u acetoin, i tako izbjeći neželjeni međeprodukt diacetil (Slika 7.1) (Jepsen, 1993).

[image]

Slika 7.1 Djelovanje alfa-acetolaktat dekarboksilaze (ALDC).

Alfa-acetolaktat dekarboksilaza je dodana sladovini koja se stavlja u bioreaktor kako bi se proučio njen neto učinak na ukupnu koncentraciju diacetila. Istraživani su i drugi postupci za redukciju diacetila, poput toplog odležavanja šarže nakon fermentacije u periodu od 48 sati i sustava imobilizirane sekundarne fermentacije, koje koristi tehnologija Alpha-Laval (Anon, 1997). Sve ove strategije bile su uspješne u redukciji diacetila u postfermentacijskom stanju, no nijedna se ne odnosi na količinu diacetila na samom izvoru (odnosnoizlaznom otvoru bioreaktora). Korištenjem ALDC-a u sladovini za redukciju koncentracije diacetila u bioreaktoru, postfermentacijski periodi obrade bi se mogli smanjiti ili ukloniti.

Aktivnost ALDC-a je optimalna kod pH 6.0 i 10°C u lager sladovini. Industrijske sladovine imaju pH 5.0, pa je ALDC najaktivniji na temperaturi 35ºC (Anon, 1994). Kod uvjeta svojstvenih fermentaciji piva, gdje su temperatura i pH sniženi, aktivnost ALDC-a je smanjena.

Health Canada je 1997. godine donijelo je propis ''Canada’s Food and Drug Regulations'' (SOR/97-81) po kojem je dozvoljena upotreba ALDC-a u alkoholnim pićima. Vrsta Bacillus subtilis, u koju su ubačeni geni za stvaranje ALDC (E.C. 4.1.1.5) iz vrste Bacillus brevis, proizvodi enzim ALDC. S obzirom da se radi o genetski modificiranom organizmu (GMO) koji proizvodi ALDC, potrebno je riješiti pitanje percepcije javnosti prije nego li se taj enzim počne koristiti u komercijalne svrhe.

Lager kvasac, LCC3021, se koristio u ovim pokusima. Pivsku lager sladovinu visoke koncentracije, 17.5°P, dala je pivovara Labatt London. Promatrani su etanol, ukupni ugljikohidrati koji fermentiraju (npr. glukoza), ukupna količina diacetila i koncentracija stanica kvasaca u tekućoj fazi. Stanice kvasaca imobilizirane su u kuglicama kapa-karaginanskog gela, na način opisan u Poglavlju 4. Bioreaktor je prošao tri ciklusa, prije nego je pretpostavljeno da je dostignuto pseudo-ravnotežno stanje. Kao što je ranije spomenuto, metode diacetila odnosile su se na “ukupni diacetil” jer se metodama mjeri količina diacetila i njegovog prekursora, alfa-acetolaktata. Stoga bi promatrana redukcija ukupnog diacetila u ovom pokusu mogla biti uzrokovana kombiniranim utjecajem konverzije alfa-acetolaktata izravno u acetoin i, prema tome, sniženju koncentracije njegovog derivata diacetila. Alfa-acetolaktat dekarboksilaza (ALDC) je velikodušna donacija Novo Nordisk A/S, Denmark as Maturex® L. Aktivnost enzima bila je 1500 ADU/g, gdje je ADU količina enzima koji u standardnim uvjetima, dekarboksilacijom pomoću alfa-acetolaktata, stvara 1 μmol acetoina po minuti kao što je opisano u metodama AF27 tvrtke Novo Nordisk (Anon, 1994).

Uvjeti kontinuirane fermentacije: Kontinuirane fermentacije izvodile su se u gas lift draft tube bioreaktoru volumena 8 L, punjenom na 40% (v/v) sa kuglicama kapa-karaginanskog gela, imobiliziranim stanicama lager kvasaca. Kroz bioreaktor je strujila mješavina ugljičnog dioksida (438 mL/min kod STP) i zraka (34 mL/min kod STP). Temperatura fermentacije se održavala na 15°C tijekom pokusa, a vrijeme zadržavanja bioreaktora, Rt, je bilo 1.5 dana. Pod ovim uvjetima se pratila koncentracija ukupnog diacetila, i dosegnuto je prosječno pseudo-ravnotežno stanje kontrolne koncentracije diacetila. Nakon toga je sladovini dodan enzim ALDC koncentracije 72 μg/L (108 ADU/L) pa je praćena koncentracija ukupnog diacetila u bioreaktoru.

Pokus 1: Sladovina je sakupljana iz pivovare u posude od nehrđajućeg čelika volumena 20 L, te zagrijavana u autoklavu 45 minuta na 100°C. Prilikom punjenja bioreaktora, sladovina se držala na 2ºC u vodenoj kupelji. Čim je dostignuto pseudo-ravnotežno stanje koncentracije ukupnog diacetila u bioreaktoru, u 20 L sladovine ubačeno je 72 μg/L (108 ADU/L) enzima ALDC. Početna biomasa stanica u kuglicama kapa-karaginanskog gela bila je 3 x 107 stanica/mL gela.

Pokus 2: Kako bi se smanjio rizik od kontaminacije, izlazni otvor sustava je zatvoren i napravljena su još neka poboljšanja kako je opisano u Poglavlju 4. Kao i u pokusu 1, sladovina je sakupljana iz pivovare u posude od nehrđajućeg čelika volumena 20 L, i autoklavirana 45 minuta na 100°C. Kod punjenja bioreaktora, sladovina se držala na 2ºC u vodenoj kupelji. Početna biomasa stanica u kuglicama kapa-karaginanskog gela bila je 3 x 107 stanica/mL gela. 72 μg/L (108 ADU/L) enzima ALDC je ubačeno u 20 L sladovine čim je dostignuto pseudo-ravnotežno stanje koncentracije ukupnog diacetila u bioreaktoru.

Pokus 3: Neoksigenirana pivska saldovina (14 hL) visoke koncentracije 17.5°P je sakupljana u velike posude za skladištenje (T-1) u Pilot Plant-u. Nakon toga je kratkotrajno pasterizirana i skladištena, sa stalnim upuhivanjem (raspršivanjem) ugljičnog dioksida kako bi se održala konstantna koncentracija otopljenog kisika <0.10 mg/L (opisano u Poglavlju 5). Iz ovog tanka je sladovina dodavana u bioreaktor, sve dok se ne bi pseudo-ravnotežno stanje koncentracije ukupnog diacetila. ALDC (72 μg/L) je tada sterilno dodan u sladovinu. Količina enzima dodanog u sladovinu određena je tako da je izmjerena količina sladovine koja je ostala u posudi za skladištenje i prema tome količina enzima ALDC potrebnog da se njegova koncentracija podigne do željene koncentracije od 72 μg/L (108 ADU/L). Potrebna količina enzima je tada otopljena u 10 L sterilne sladovine. Ova otopina je prebačena u posudu pod tlakom, od nehrđajućeg čelika, volumena 20 L, koja je sterilnim cijevima povezana sa otvorom za uzimanje uzorka smještenom na spreminku za skladištenje melase. (T-1). Otopina sa enzimom ALDC je pomoću sterilnog tlaka ugljičnog dioksida dodana u posudu sa sladovinom. Protok ugljičnog dioksida u tanku je povećan na 4720 mL/min kod STP kroz jedan sat kako bi se omogućilo što bolje miješanje ALDC otopine i sladovine u posudi za stajanje, a kasnije je smanjen na normalan protok. Tank za skladištenje je tada sadržavao dovoljne doze enzima ALDC da se završi pokus. Početna biomasa u kuglicama kapa-karaginanskog gela bila je 108 stanica/mL gela.

7.2 Rezultati i rasprava

7.2.1 Utjecaj relativnih količina zraka u fluidizirajućem plinu bioreaktora na metabolite kvasaca tijekom primarne kontinuirane fermentacije

Slike 7.2 - 7.11 pokazuju vijabilnost i koncentraciju stanica u tekućini, slobodni amino-dušik (FAN), ukupni ugljikohidrati koji fermentiraju (npr. glukoza), etanol, ukupna količina diacetila, koncentracije acetaldehida, etil-acetata, 1-propanola, izobutanola, izoamil-acetata, izoamil-alkohola, etil-heksanoata, i etil-oktanoata u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije. Svi uvjeti rada bioreaktora održavani su konstantnim, osim postotka zraka u plinu bioreaktora, koji je označen na slikama. U Tablici 7.2 su zbrojeni prosjeci za svaku komponentu u pseudo-ravnotežnom stanju (nakon minimalno tri cuklusa reaktora).

Tablica 7.2. Sumarna tablica utjecaja volumetrijskog protoka zraka u bioreaktoru kroz raspršivač na stanice kvasaca u tekućini i ključne koncentracije metabolita kvasaca u bireaktoru kroz vrijeme zadržavanja, Rt, od 1.18 dana (prosjeci za pseudo-ravnotežno stanje).

[image]

Slike 7.2 i 7.3 pokazuju da populacija kvasaca u tekućini nije dostigla nultu fazu tijekom ovog pokusa. Proučavane komponente koje daju okus su proizvedene kombinacijom slobodnih i imobiliziranih stanica, no nije određeno koja grupa stanica je imala koliki utjecaj. Stanice u tekućini potjecale su iz dva izvora: rasta biomase i otpuštanja iz kuglica gela. Pokus je pokazao, zajedno sa modelima otpuštanja i rasta stanica, da je u izlaznoj tekućini, nakon otpuštanja iz biofilma, prisutna određena količina stanica, unatoč obilnom ispiranju bioreaktora (Karamanev, 1991).

[image]

Slika 7.2. Koncentracija stanica kvasaca u tekućini u donosu na vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod STP koji se dovodi u bioreaktor kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

[image]

Slika 7.3. Odnos vijabilnosti stanica u tekućini i vremena kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod STP koji se dovodi u bioreaktor kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

Slika 7.4 prikazuje koncentraciju slobodnog amino-dušika (FAN) u tekućini. Zanimljivo je istaknuti da je najmanja koncentracija FAN-a bila kod protoka zraka 34 mL/min kod STP. Ovo se nije poklapalo sa maksimalnom koncentracijom etanola ni minimalnom koncentracijom ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza).

Koncentracija etanola u tekućoj fazi bioreaktora se smanjila, dok se ukupna količina ugljikohidrata koji fermentiraju povećala kad je volumetrijski protok raspršivanog zraka u povećan sa 94 na 354 mL/min, kao što se vidi na slici 7.5. Ovo bi moglo značiti da se respiracija stanica, suprotno od fermentacije, odvijala sukladno sa povećanjem dostupnosti kisika. Kad je volumetrijski protok zraka ponovo smanjen sa 354 mL/min do 34 mL/min kod STP, koncentracija etanola se ponovo povećala, no nije dostigla vrijednost koju je imala kad je protok zraka bio 94 mL/min kod STP. Teško je precizno usporediti koncentracije etanola kod 34 mL/min sa onima kod 94 mL/min kod STP, jer postoje i drugi faktori koji su utjecali na sustav, što je rezultat starenja stanica, a to su utjecaji kontinuiranog izlaganja relativno visokim količinama kisika kroz neko vrijeme na 354 mL/min kod STP, i promjene u sastavu populacije imobiliziranih stanica. Slika 2.4 pokazuje koje su promjene zamijetili White and Portno (1978) u koncentracijama kvaščevih metabolita koji daju okus tijekom kontinuirane fermentacije u njihovom toranj fermentoru.

[image]

Slika 7.4. Koncentracija slobodnog amino-dušika zaostalog u sladovini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Volumetrijski protok zraka kod STP koji se dovodi kroz raspršivač je označen na grafikonu. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

[image]

Slika 7.5. Koncentracija etanola i ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju, u tekućoj fazi, u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Volumetrijski protok zraka kod STP koji se dovodi kroz raspršivač je označen na grafikonu. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

Na slici 7.6 se vidi izrazit utjecaj kisika na proizvodnju ukupnog diacetila. S obzirom da se diacetil smatra neželjenom supstancom u pivu, jedan od glavnih razloga za korištenje kisika u bioreaktoru jest kontroliranje količine ove tvari koja kvari okus piva. Nakon prozračivanja sa 354 mL/min zraka, protok zraka je pao na 34 mL/min kod STP i količina ukupnog diacetila se smanjila. Zna se da povišenje količine kisika, tijekom šaržne fermentacije, dovodi do povišenog stvaranja alfa-acetolaktata, prekursora diacetila (Kunze, 1996).

Slika 7.7 pokazuje vezu između količine zraka u raspršivanom plinu i koncentracije acetaldehida. Porastom postotka zraka u raspršivanom plinu, rasla je i količina acetaldehida. Acetaldehid daje blagi okus zelene jabuke pivu, i normalno je prisutan u komercijalnom pivu u koncentracijama manjim od 20 mg/L.

[image]

Slika 7.6. Koncentracija ukupnog diacetila u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

[image]

Slika 7.7. Koncentracija acetaldehida u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

Tablicom 7.2 i Slikama 7.8 - 7.9 prikazane su pseudo-ravnotežne koncentracije etil-acetata, izoamil-acetata, etil-heksanoata, i etil-oktanoata u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije. Kod svih proučavanih estera, promjena aeracije od 94 do 354 mL/min kod STP rezultirala je padom koncentracije. Kad se aeracija smanjila sa 354 mL/min na 34 mL/min kod STP, koncentracije izoamil-acetata etil-heksanoata, i etil-oktanoata su porasle. No, njihove koncentracije nisu narasle do vrijednosti koje su imale kod protoka 94 mL/min. Ponašanja ovih komponenti su bila vrlo slična, mada su etil-heksanoat i etil-oktanoat pokazivali više kolebanja od izoamil-acetata. Zapravo, koncentracija etil-acetata je dalje padala kad je volumetrijski protok zraka spušten na 34 mL/min kod STP. Koncentracija svih estera proučavanih u ovom pokusu se povećavala kad se zrak u potpunosti uklonio iz fluidizirajućeg plina. Koncentracija svakog estera je rasla i padala kako je koncentracija stanica u tekućini brzo padala u bioreaktoru.

[image]

Slika 7.8. Koncentracija etil-acetata u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

[image]

Slika 7.9. Koncentracije izoamil-acetata, etil-heksanoata i etil-oktanoata u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

Odnos viših alkohola (izoamil-alkohol, izobutanol, i 1-propanol) i relativnog vremena kontinuirane fermentacije prikazan je slikama 7.10 i 7.11. Koncentracija mjerenih alkohola je rasla s porastom aeracije sa 94 na 354 mL/min kod STP. Izobutanol je pokazivao najveće fluktuacije prilikom promjene aeracije. Koncentracije 1-propanola su bile ispod početnih vrijednosti od 600 – 800 mg/L. Međutim, tijekom kontinuirane fermentacije, koncentracija je bila iznad vrijednosti koje se nalaze u komercijalno šaržno proizvedenim pivima, gdje su koncentracije obično ispod 16 mg/L. Ovo se nije dogodilo kod izoamil-alkohola ni izobutanola, koji su bili unutar normalnih granica. No 1-propanol često naraste zbog redukcije kiselog propionata (Gee and Ramirez, 1994). Drugi (Hough i sur., 1982; Yamauchi i sur., 1995) su također povezali tvorbu 1-propanola sa metabolizmom aminokiselina: α-aminomaslačne kiseline i treonina, sa odgovarajućom okso-kiselinom i aldehidom, α-oksobutričnom kiselinom i propion aldehidom, respektivno.

[image]

Slika 7.10. Koncentracija izoamil-alkohola i izobutanola u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

[image]

Slika 7.11. Koncentracija 1-propanola u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije. Na grafikonu je označen volumetrijski protok zraka kod standardne temperature i tlaka, koji u bioreaktor dolazi kroz raspršivač. Ostatak plina je ugljični dioksid, a ukupni volumetrijski protok plina je bio stalan na 472 mL/min kod STP tijekom pokusa.

Zbog visokih koncentracija diacetila, acetaldehid i otopljeni alkoholi su nepoželjni u pivu, pa je važno ograničiti njihovu proizvodnju kontrolom kisika. Kao što se raspravljalo u pregledu literature, kad se smanji opskrba stanica kvasaca kisikom, povećava se metaboličko stvaranje aminokiselinskih prekursora, a tako i povećano gomilanje viših alkohola, okso-kiselina i diacetila. Koncentracija estera pada porastom koncentracije kisika zato što proizvodnju estera katalizira acetil transferaza. Acetil transferazu inhibiraju nezasićene masne kiseline i ergosterol, koje će in turn povećati koncentraciju kisika (Norton and D’Amore, 1994).

U uvjetima bioreaktora korištenog u ovim pokusima, pseudo-ravnotežne koncentracije (nakon najmanje tri ciklusa) kisika otopljenog u tekućini bioreaktora su bile blizu nuli (manje od .03 mg/L).

Pokus nije dozvoljavao izravnu usporedbu protoka zraka od 94 mL/min i 34 mL/min kod STP u fluidizirajućem plinu, jer su bili odvojeni najvišim protokom zraka (354 mL/min). Ovo je posljedica fiziološkog stanja kvasaca izloženih prijašnjim uvjetima bioreaktora. Na tvorbu okusa su utjecali i kalup za imobilizaciju i vrijeme kontinuirane fermentacije.

Ni u jednoj fazi pokusa nije došlo do kontaminacije u bioreaktoru.

Da bi se održao zahtjev kvasaca za kisikom i time njihova vijabilnost te smanjio kisik da se dobije željeni okus piva, potrebno je istražiti druge strategije poput dodatka hranjivih tvari (na primjer, cink, magnezij) ili nekih drugih egzogenih tvari potrebnih za održavanje vijabilnosti stanica kvasaca.Takvi dodaci bi omogućili daljnje smanjenje zahtjeva kvasaca za kisikom. Druga mogućnost je raditi cijeli pokus s vrlo niskom koncentracijom kisika, sa periodičkim pulsevima kisika (radi održavanja vijabilnosti stanica kvasaca).

7.2.2 Vrijeme zadržavanja šarže nakon fermentacije: Utjecaj kisika na metabolite kvasaca

Ukupni diacetil, nastao na kraju primarne fermentacije, nije bio unutar dopuštenih vrijednosti za komercijalno pivo i zato su poduzeti neki postupci kako bi se smanjila njegova koncentracija do granica dopuštenih vrijednosti. Jedan takav postupak jest toplo odležavanje šarže odmah nakon kontinuirane primarne fermentacije.

Slike 7.12 – 7.21 pokazuju koncentracije ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza), etanola, ukupnog diacetila, acetaldehida, etil-acetata, 1-propanola, izobutanola, izoamil-acetata, izoamil-alkohola, etil-heksanoata u tekućini u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije. Uzorci su uzimani iz kontinuiranog primarnog fermentora u pseudo-ravnotežnom stanju, gdje su bili držani u aerobnim ili anaerobnim uvjetima, što je označeno u legendi svake slike.

Na slici 7.12 je prikazan nagli pad koncentracije ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza) u prvih dva sata vremena zadržavanja, a kasnije nešto u oba uzorka, aerobnom i anaerobnom. Tijekom prva dva sata, prije dekantacije, bilo je više kvasaca i koncentracija šećera je bila viša na početku vremena zadržavanja, što su mogući razlozi ove pojave. Nije bilo značajne razlike u primanju fermentabilne glukoze između aerobnih i anaerobnih uzoraka, unatoč vrlo malim razlikama na samom početku.

Slika 7.13 pokazuje brzi rast koncentracije etanola na početku vremena zadržavanja, no kasnije u oba uzorka, aerobnom i anaerobnom, dolazi do pada koncentracije etanola, i krivulje idu gotovo paralelno. Početni rast etanola kod anaerobnog uzorka je odgovarao periodu kad je bilo najveće primanje šećera. Na kraju perioda zadržavanja, koncentracija etanola je bila viša u anaerobnim uzorcima.

[image]

Slika 7.12 Prosječna koncentracija fermentabilne glukoze u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.13. Prosječna koncentracija etanola u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

Na slici 7.14 je prikazan rani rast koncentracije acetaldehida kod aerobnih uzoraka nakon izlaganja aerobnim uvjetima izvan bioreaktora. Ovako bi mogla rezultirati kombinacija aerobnih uvjeta, sa potrošnjom šećera i proizvodnjom etanola. Nakon 48 sati zadržavanja koncentracija acetaldehida je pala sa 17 mg/L na 9 mg/L u aerobnom uzorku, što je koncentracija koja ulazi u specifikacije kvalitetnog sjevernoameričkog lager piva (manje od 10 mg/L).

Odnos koncentracije ukupnog diacetila i vremena zadržavanja prikazan je slikom 7.15. Rezultati pokazuju da uklanjanje kisika iz sustava tijekom vremena zadržavanja osigurava bolje uvjete za redukciju diacetila. Oblik krivulje ukupnog diacetila mogao bi biti povezan sa nestajanjem slobodnog amino-dušika i unutarstaničnom proizvodnjom valina, čiji je nusprodukt diacetil (Nakatani i sur., 1984a; Nakatani i sur., 1984b). Koncentracija ukupnog diacetila na kraju primarne kontinuirane fermentacije bila je 326 μg/L, a na kraju anaerobnog vremena fermentacije 33 μg/L, što je ispod okusnog praga u komercijalnim pivima.

[image]

Slika 7.14. Prosječna koncentracija acetaldehida u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.15. Prosječna koncentracija ukupnog diacetila u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

Na slikama 7.16 - 7.18 je prikazan odnos koncentracija estera etil-acetata, izoamil-acetata i etil-heksanoata i vremena zadržavanja nakon fermentacije, proučavan kod aerobnih i anaerobnih uzoraka. Na početku se koncentracije estera nisu razikovale između anaerobnih i aerobinih uzoraka, no kasnije, kad je koncentracija estera u aerobnim uzorcima pala, u anaerobnim uzorcima je rasla. S obzirom da je koncentracija estera u kontinuiranoj fermentaciji nešto niža nego u komercijalnom pivu, poželjno je izabrati uvjete koji pogoduju nastanku estera.

[image]

Slika 7.16. Prosječna koncentracija etil-acetata u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.17. Prosječna koncentracija izoamil-acetata u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.18. Prosječna koncentracija etil-heksanoata u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške) predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

Slika 7.19 - 7.21 pokazuje koncentracije izoamil-alkohola, 1-propanola i izobutanola u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije. Nakon 48 sati zadržavanja, nisu uočene značajne promjene ovih alkohola, ni kod aerobnih ni anaerobnih uzoraka. No aerobni uzorci sa 24-satnim zadržavanjem su pokazali više koncentracije svih ovih spojeva.

[image]

Slika 7.19. Prosječna koncentracija izoamil-alkohola u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.20. Prosječna koncentracija 1-propanola u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

[image]

Slika 7.21. Prosječna koncentracija izobutanola u odnosu na vrijeme zadržavanja nakon fermentacije kod aerobnih i anaerobnih uzoraka nakon kontinuirane primarne fermentacije u gas-lift bioreaktoru. Intervali greške predstavljaju gornju i donju granicu podataka pokusa (n=2).

Slika 7.22 prikazuje grafikon koji omogućuje usporedbu brojnih komponenti koje utječu na okus, iz uzoraka nakon 48 sati vremena zadržavanja u aerobnim i anaerobnim uvjetima i iz komercijalnog piva. Ovakvi radar-grafovi se često koriste u pivskoj industriji za proučavanje i usporedbu različitih karakteristika piva na jednom grafičkom prikazu (Sharpe, 1988). Slika pokazuje da je pivo dobiveno u anaerobnim uvjetima kontinuirane fermentacije najsličnije tipičnom pivu sa tržišta. Iz Dodatka 6 je vidljivo da je anaerobna tekućina bila u skladu sa vrijednostima koje ima pivo sa tržišta, osim u slučaju sa 1-propanolom, čija je koncentracija značajno viša nego kod piva dobivenog šaržnom fermentacijom. Ovakve visoke koncentracije 1-propanola su opažene u svim produktima kontinuirane fermentacije ovog projekta.

1-propanol se stvarao tijekom primarne kontinuirane fermentacije i njegova koncentracija se nije bitno smanjivala u periodu zadržavanja, bilo da su uvjeti bili aerobni ili anaerobni. Kunze (1996) tvrdi da će slijedeći faktori povećati koncentracije viših alkohola poput 1-propanola tijekom šaržne fermentacije: miješanje, intenzivna aeracija sladovine, i neprestano dodavanje svježe sladovine postojećim kvascima.

Bilo bi najpogodnije kad bi se optimalnim poboljšanjem uvjeta u primarnom kontinuiranom bioreaktoru potpuno uklonilo sekundarno vrijeme zadržavanja. Ipak, daljnji pokušaji su mogući korištenjem perioda zadržavanja, poboljšavanjem temperature tog perioda (uklanjanje diacetila pomoću kvasaca veoma ovisi o temperaturi), količine fermentabilnih šećera koji ostaju u tekućini na početku perioda, koncentracije prisutnih kvasaca, hidrodinamičkih karakteristika cijevi za zadržavanje (uklanjanje diacetila se može poboljšati boljim kontaktom između kvasaca i piva), i poduzimanjem daljnjih mjera za uklanjanje kisika iz ovog stadija.

U Dodatku 3 nalaze se izračuni volumetrijske proizvodnje piva. U ovom poglavlju opisan je proces koji obuhvaća kontinuirani bioreaktor sa vremenom zadržavanja 24 sata i šaržnim zadržavanjem od 48 sati. Taj proces je 1.8 puta produktivniji od trenutnih industrijskih šaržnih procesa. Relativno brz industrijski šaržni proces sa ciklusom od 7.5 dana ima volumetrijsku proizvodnju piva 0.093 m3 proizvedenog piva / (m3 volumen cijevi x dan), dok kontinuirani proces koji je ovdje opisan ima produktivnost 0.165 m3 proizvedenog piva / (m3 volumen cijevi x dan). Ako se u slijedećim istraživanjima vrijeme šaržnog zadržavanja uspije skratiti na 24 sata, proizvodnja piva bit će 2.3 puta produktivnija od standardne industrijske šarže. Ako se stvori idealni kontinuirani proces od 24 sata, bez šaržnog zadržavanja, volumetrijska proizvodnja piva bit će 7.5 times veća od standardne industrijske šarže. Kao dodatak povišenoj volumetrijskoj proizvodnji, potrebno je istaknuti dodatne prednosti zamjene šaržnog sa kontinuiranim procesom, a to su kraće vrijeme dolaska na tržište, smanjenje veličine pivovara i rjeđe nasađivanje kvasaca.

Drugi istraživači (Kronlöf and Virkajärvi, 1996; Nakanishi i sur., 1993; Yamauchi i sur., 1995) su se usredotočili na stvaranje kontinuirane fermentacije sa mnogo stupnjeva, gdje će prvi stupanj kontinuirane fermentacije (aeroban) rezultirati samo djelomičnom potrošnjom fermentabilnih šećera prisutnih u sladovini. Ova strategija je pokazala uspjeh u terminima stvaranja okusa, no veoma je kompleksna. Prvi aerobni stadij ovog sustava stvara okoliš koji je podložniji mikrobnoj kontaminaciji (zbog veće koncentracije šećera, temperature i kisika, i niske koncentracije etanola). U sustavu gas-lift bioreaktora, koji je opisan u ovom radu, bioreaktor sadrži niske koncentracije šećera i kisika, visoke koncentracije etanola, ima nizak pH, a to je nepoghodan okoliš za mnoge potencijalne zagađivače.

[image]

Slika 7.22. Radarski grafički prikaz normaliziranih podataka koncentracije dobivenih nakon kontinuirane fermentacije u gas-lift bioreaktoru i nakon 48 sati vremena zadržavanja u aerobnim i anaerobnim uvjetima. Normalizirani podaci temelje se na prosjecima dvostrukih uzoraka. Podaci o komercijalnom pivu uzeti su kao srednje vrijednosti iz podataka izloženih u Dodatku 6.

7.2.3 Utjecaj vremena zadržavanja tekućine na glavne metabolite kvasaca tijekom kontinuirane primarne fermentacije piva

Slike 7.23 - 7.28 pokazuju analitičke rezultate dobivenih iz tekućine bioreaktora. U Tablici 7.3 navedene su prosječne koncentracije i protoci mjerenih spojeva pseudo-stalnom stanju (minimalno tri ciklusa reaktora) u dva vremena zadržavanja tekućine korištena u ovom pokusu. Nakon povećanja protoka sladovine u bioreaktoru, vijabilnost kvasaca u tekućini se nije znatno promijenila, no promijenila se koncentracija stanica, kako je vidljivo na Slici 7.23.

Tablica 7.3. (a) Sumarna tablica utjecaja vremena zadržavanja bioreaktora na kvasce u tekućini i koncentracije glavnih metabolita, prosjeci kod pseudo-stalnog stanja; (b) Sumarna tablica utjecaja vremena zadržavanja bioreaktora na kvasce u tekućini i protok glavnih metabolita na izlazu iz bioreaktora, prosjeci kod pseudo-stalnog stanja.

[image] [image] [image]

Slika 7.23. Koncentracija stanica kvasaca u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

Na Slikama 7.24 i 7.25 je prikazan porast koncentracije supstrata sladovine, a to su slobodni amino-dušik (FAN) i ukupni ugljikohidrati koji fermentiraju (npr. glukoza), kad se vrijeme zadržavanja tekućine smanjilo sa 1.8 na 0.9 dana. Iz ravnoteže masa u Tablici 7.4 vidljiv je porast potrošnje ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza) dok se potrošnja slobodnog amino-dušika smanjila, sa smanjivanjem vremena zadržavanja u bioreaktoru. Faktor produkta, YP/S, etanola nastalog iz glukoze, porastao je sa 0.3 na 0.5 smanjenjem vremena zadržavanja tekućine. Postoje manji gubitci etanola u plinskoj fazi zato što je sustav bio aeriran zrakom i ugljičnim dioksidom. To je vjerojatno utjecalo na faktor produkta, YP/S, djelovanjem na ravnotežu etanola. Zajednički rad istraživača Budaca i Margaritisa (1999) kvalitativno je pokazao, korištenjem tehnike GC-masene spektroskopije (GC-MS), da su hlapive tvari koje daju okus pivu, uključujući etanol, acetaldehid, etil-acetat i izoamil-acetat, nađene u gornjem dijelu gas-lift bioreaktora tijekom kontinuirane fermentacije.

[image]

Slika 7.24. Koncentracija etanola i fermentabilne glukoze u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

[image]

Slika 7.25. Koncentracija slobodnog amino-dušika i 1-propanola u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

Tablica 7.4. Ravnoteža masa izračunata na temelju prosječnih vrijednosti iz Tablice 7.3 za slobodni amino-dušik i fermentabilne ugljikohidrate (npr. glukoza), uz utjecaj vremena zadržavanja.

[image]

Koncentracija etanola, produkta fermentacije, u tekućini, se smanjila promjenom vremena zadržavanja tekućine. No, sustav u cjelini je proizvodio više etanola na temelju brzine protoka mase pri vremenu zadržavanja brže tekućine. Kako cilj ovog rada nije bio samo proizvesti etanol u izolaciji, nego i pivo sa ravnotežom što više komponenti, povećanje proizvodnje etanola mora biti u ravnoteži sa drugim faktorima. Na kraju komercijalne primarne fermentacije piva, većina fermentabilne glukoze mora biti razgrađena.

Na Slici 7.26 su prikazane promjene koncentracije acetaldehida i ukupnog diacetila u odnosu na promjenu protoka sladovine. Koncentracija i proizvodnja oba spoja se povećala, kad se vrijeme zadržavanja tekućine smanjilo. Stanice kvasaca su izlučivale acetaldehid tijekom prvih par dana šaržnih fermentacija (Kunze, 1996).

[image]

Slika 7.26. Koncentracija ukupnog diacetila i acetaldehida u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

Slike 7.25 i 7.27 pokazuju utjecaj pada vremena zadržavanja bioreaktora na koncentracije viših alkohola (1-propanola, izobutanola i izoamil-alkohola) u tekućini. Koncentracije sva tri alkohola su se smanjivale kako se smanjivalo i vrijeme zadržavanja bioreaktora.

[image]

Slika 7.27. Koncentracija izobutanola i izoamil-alkohola u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

Protoci etil-acetata i izoamil-acetata (Tablica 7.3 (b)) su se povećali kao odgovor smanjenju vremena zadržavanja. Slika 7.28 pokazuje pad koncentracije etil-acetata u tekućini, dok koncentracija izoamil-acetata raste. U ovom pokusu je omogućen rast stanica kvasaca u tekućini bez povišenja kisika u sustavu, što je potaklo proizvodnju estera u bioreaktoru. Hough i sur. (1982) tvrde da povišenje rasta stanica i smanjenje koncentracije kisika potiču stvaranje estera.

[image]

Slika 7.28. Koncentracija etil-acetata i izoamil-acetata u tekućini u odnosu na relativno vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj vremena zadržavanja tekućine u bioreaktoru. Rt je vrijeme zadržavanja tekućine u bioreaktoru izraženo u danima.

7.2.4 Upotreba komercijalnog pripravka alfa-acetolaktat dekarboksilaze u snižavanju ukupne količine diacetila tijekom kontinuirane primarne fermentacije piva

Pokus 1: Bioreaktor je bio kontaminiran anaerobnim Gram pozitivnim kokima prije završetka pokusa. Ustanovljeno je da je sam bioreaktor bio kontaminiran, jer mikrobiološki testovi sladovine nisu pokazali nikakvu kontaminaciju. Zbog toga postoji potreba za nadogradnjom bioreaktora sigurnosnim dijelovima koji bi spriječili kontaminaciju. Međutim, prije nego li je sustav zatvoren, primjećen je pad koncentracije ukupnog diacetila kad je enzim ALDC odoan sladovini. No, na žalost, nije bilo moguće donijeti ikakve zaključke iz ovih podataka zbog utjecaja kontaminacije bioreaktora.

Pokus 2: Kao rezultat nadogradnje bioreaktora, tijekom pokusa 2 nije došlo do kontaminacije sustava. Podaci iz ovog pokusa prikazani su Slikama 7.29 – 7.31. U Tablici 7.5 su zbrojene prosječne pseudo-ravnotežne koncentracije ukupnog diacetila prije i poslije dodatka enzima ALDC u sladovinu. Koncentracija ukupnog diacetila je pala 47% dodatkom ALDC-a u sladovinu, stoga je upotreba tog enzima obećavajuća (prosjeci su uzeti za tri ciklusa bioreaktora). Kao što je prikazano Slikama 7.30 i 7.31, koncentracije stanica i ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza) su se blago mijenjale tijekom pokusa, što se može objasniti neznatnim promjenama u sladovini, koja je dodavana u reaktor prije i poslije dodatka enzima ALDC.

[image]

Slika 7.29. Koncentracija ukupnog diacetila u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 2.

[image]

Slika 7.30. Koncentracija fermentabilnih ugljikovodika (poput glukoze) i etanola u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 2.

[image]

Slika 7.31. Koncentracija stanica u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 2.

Za Pokus 3 je uzeta velika količina sladovine iz pivovare (14 hL) kako bi se uklonio zbunjujući njezine utjecaj promjenjivosti. ALDC je dodan izravno u sladovinu, zaostajući u posudi za zadržavanje, čim je dostignuto osnovno pseudo-ravnotežno stanje. Ovo je spriječilo svaku potencijalnu nepostojanost sladovine, koja bi mogla utjecati na fermentaciju u Pokusu 2. Posuda za skladištenje je također bila opremljena cijevima za upuhivanje ugljičnog dioksida, tako da su koncentracije otopljenog kisika u sladovini održavane na konstantnoj razini.

Pokus 3: Slike 7.32 – 7.34 pokazuju utjecaj dodatka ALDC-a sladovini na ukupni diacetil, ukupne ugljikohidrate koji fermentiraju (npr. glukoza), etanol i koncentraciju slobodno suspendiranih stanica tijekom kontinuirane fermentacije piva. Tablica 7.5 pokazuje prosječne pseudo-ravnotežne koncentracije diacetila prije i nakon dodatka enzima ALDC sladovini (prosjeci su uzeti nakon tri ciklusa bireaktora). Tijekom pokusa nije došlo do kontaminacije. Koncentracija ukupnog diacetila je pala 45% dodatkom ALDC-a u sladovinu. Nisu uočene nikakve promjene kod etanola, ukupnih ugljikohidrata koji fermentiraju (npr. glukoza), niti koncentracije slobodno suspendiranih stanica, što se slaže sa zapažanjima Aschengreena i Jepsena (1992).

[image]

Slika 7.32. Koncentracija ukupnog diacetila u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 3.

[image]

Slika 7.33. Koncentracija etanola i ukupnih fermentabilnih ugljikohidrata (glukoze) u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 3.

[image]

Slika 7.34. Koncentracija stanica u tekućini u odnosu na vrijeme kontinuirane fermentacije, uz utjecaj dodatka ALDC-a sladovini, Pokus 3.

Rezultati Pokusa 2 i 3 pokazuju da je ALDC imao značajan utjecaj na koncentraciju ukupnog diacetila tijekom kontinuirane fermentacije u gas-lift bioreaktorima, smanjujući prosječnu koncentraciju ukupnog diacetila 46%. Smatra se da bi se ukupni diacetil mogao još više smanjiti ili čak potpuno ukloniti u sustavima kontinuirane fermentacije u gas-lift bioreaktorima. U ovim pokusima se koristila relativno visoka koncentracija enzima ALDC. Ako se ALDC prihvati u proizvodnji piva, potrebno je naći optimalnu količinu, metodu i točno određeno vrijeme doziranja ALDC-a u sladovini. Daljnja prednost enzima bila bi kad bi se povećala njegova aktivnost u uvjetima fermentacije piva ili kad bi se on sam imobilizirao, i na taj način se mogao ponovno koristiti (Dulieu i sur., 1996). Također se mora uzeti u obzir prihvaćanje javnosti enzimskih aditiva stvorenih pomoću genetički modificiranih organizama.

S obzirom na količinu koju je predložio dobavljač, 2 kg/1000 hL, i sa cijenom komercijalnog pripravka enzima, $131.05/kg, bilo bi potrebno dodati $0.26 / hL za troškove fermentacije. U pokusima su se koristile koncentracije enzima 72 μg/L (108 ADU/L) ili 7.2 kg/1000 hL, što je dodatnih $0.94/hL. Ekonomičnost korištenja ALDC-a za smanjenje količine diacetila u gas-lift kontinuiranoj fermentaciji ovisit će o optimalnoj količini enzima u uvetima bioreaktora i vremenu koje se uštedi njegovom upotrebom.

Tablica 7.5. Prosječne pseudo-ravnotežne koncentracije diacetila tijekom kontinuirane fermentaciji piva u gas-lift bioeaktoru nakon dodatka enzima ALDC sladovini.

[image]

Sve dosad navedeno podupire tvrdnje da je kontinuirana fermentacija, gdje se koriste imobilizirane i slobodne stanice kvasaca u sustavu gas-lift draft tube bioreaktora, moguća alternativa šaržnoj fermentaciji u proizvodnji piva i to na temelju slijedećih kriterija:

- postignut je odgovarajući okus

- veća volumetrijska proizvodnja bioreaktora

- jednostavnost

- dugotrajano kontinuirano djelovanje

- kontrola zraka (kisika) u fluidizirajućem plinu za kontrolu okusa

- dodatak enzima α-acetolaktat dekarboksilaze za kontrolu diacetila, po izboru

- bez bakterijske kontaminacije

- financijska korist.

Još postoji mnogo stvari koje se trebaju istražiti, no tehnologija je spremna za testiranje. Gas-lift bioreaktori se već koriste u industriji za tretiranje otpadnih voda, što čini sustav kontinuirane fermentacije piva tehnički izvedivim u širim razmjerima. Pivovara Grolsch iz Nizozemske izvjestila je da koristi gas lift bioreaktor volumena 230 m3 za tretiranje njihovih otpadnih voda (Driessen i sur., 1997). Jedna od najvećih zapreka u korištenju kontinuirane fermentacije u komercijalnoj proizvodnji moglo bi biti neprihvaćanje novog procesa od strane pivara, s obzirom da se radi o industriji koja veoma zadire u tradiciju.

Podaci skupljeni o sekundarnim metabolitima kvasaca, stvorenih tijekom kontinuirane fermentacije piva u pokusima opisanim u ovom radu, naglasili su koliko je važno kontrolirati kisik u fluidizirajućem plinu kod stvaranja okusa piva. Otkrića su pokazala da povećanje zraka u fluidizirajućem plinu bioreaktora uzrokuje povišenje koncentracije acetaldehida, diacetila i viših alkohola (izoamil-alkohola i izobutanola), a smanjenje koncentracije estera (izoamil-acetata, etil-heksanoata, etil-oktanoata) i etanola. Podaci pokazuju da postoji mogućnost kontrole okusa piva pomoću sastava fluidizirajućeg plina u bioreaktoru, a to omogućuje proizvodnju jedinstvenih proizvoda.

Koncentracija slobodno suspendiranih stanica u tekućini bioreaktora održavala se iznad vrijednosti 108 stanica/mL, osim kad je zrak bio uklonjen iz fluidizirajućeg plina. Tako sustav sadrži više nego jednu populaciju stanica kvasaca, imobiliziranu i slobodno suspendiranu. Zbog velikih količina vijabilnih kvasaca koji rastu u tekućini bioreaktora, postoji mogućnost korištenja kontinuiranog bioreaktora kao mjesta razmnožavanja kvasaca.

Kad se kontinuiranoj primarnoj fermentaciji dodalo 48-satno vrijeme zadržavanja šarže, postignut je okus kakav imaju piva na tržištu. Temperatura ovog vremena zadržavanja bila je 21ºC. Pokusom je demonstrirano zašto je u stvaranju okusa važno smanjiti izloženost tekućine kisiku tijekom vremena zadržavanja. Proces sa vremenom zadržavanja traje dva dana duže i malo je složeniji, no još uvijek je brži od komercijalne šaržne fermentacije, koja traje između sedam i četrnaest dana.

Konačno, idealno bi bilo potpuno ukloniti sekundarno vrijeme zadržavanja optimiziranjem uvjeta u primarnom kontinuiranom bioreaktoru. Daljnje smanjenje sekundarnog vremena zadržavanja moglo bi se postići na kraće vrijeme optimiziranjem temperature zadržavanja (uklanjanje diacetila pomoću kvasaca veoma ovisi o temperaturi), količine fermentabilnih šećerakoji ostaju u tekućini nakon vremena zadržavanja, koncentracije prisutnih kvasaca, hidrodinamičkih karakteristika posuda za zadržavanje (uklanjanje diacetila bi se moglo poboljšati boljim kontaktom između kvasaca i piva), i poduzimanjem daljnjih mjera za uklanjanje kisika iz ovog stupnja.

Drugi istraživači (Kronlof and Virkajarvi, 1996; Nakanishi i sur., 1993; Yamauchi i sur., 1995) su se usredotočili na stvaranje kontinuirane fermentacije sa mnogo stupnjeva, gdje će prvi stupanj kontinuirane fermentacije (aeroban) rezultirati samo djelomičnom potrošnjom fermentabilnih šećera prisutnih u sladovini. Ova strategija je pokazala uspjeh u terminima stvaranja okusa, no veoma je kompleksna. Prvi aerobni stadij ovog sustava stvara okoliš koji je podložniji mikrobnoj kontaminaciji (zbog veće koncentracije šećera, temperature i kisika, i niske koncentracije etanola). U sustavu gas-lift bioreaktora, koji je opisan u ovom radu, bioreaktor sadrži niske koncentracije šećera i kisika, visoke koncentracije etanola, ima nizak pH, a to je nepoghodan okoliš za mnoge potencijalne zagađivače.

U slabije razvijenim pivovarama vrlo su poželjni procesi sa smanjenom mogućnošću kontaminacije i što jednostavniji način proizvodnje.

Dodatak komercijalnog pripravka alfa-acetolaktat dekarboksilaze (ALDC) sladovini koja se koristi za kontinuiranu fermentaciju pokazao je prosječno smanjenje diacetila za 46%.

S obzirom da se radi o genetski modificiranom organizmu (GMO) koji proizvodi ALDC, potrebno je riješiti pitanje percepcije javnosti prije nego li se taj enzim počne koristiti u komercijalne svrhe. Potrebno je naglasiti da komercijalno dostupni enzimi za kontrolu diacetila nemaju optimalnu aktivnost u uvjetima fermentacije. Nakon šest mjeseci kontinuirane fermentacije, gdje su se koristile imobilizirane kuglice kapa-karaginanskog gela, slobodno suspendirane stanice u tekućini održavale su vijabilnost veću od 90%, dok je vijabilnost imobiliziranih stanica pala ispod 60%. Skenirajuće elektronske mikrografije pokazale su nejednakost u rastu stanica, da stanice smještene na rubu kuglica gela imaju mnogobrojne ožiljke od pupova i pravilnu morfologiju, dok su one u središtu kuglice nepravilnog oblika i sa malo ožiljaka od pupova. Na mikrografijama se vidi da stanice u središtu kuglica pokazuju znakove starenja. U Sekciji 5 izložene su mnoge prednosti kapa-karaginanskog gela kao medija za imobilizaciju kvasaca. No, trenutno ne postoje industrijske metode za stvaranje ovakvih kuglica, a i da postoje to bi bilo vrlo složeno i skupo, budući da u stvaranju imobiliziranih kuglica sudjeluju kvasci. Trebalo bi istražiti i druge metode imobilizacije, poput samo-agregacije ili flokulacije. Ovo bi pomoglo ukloniti složenost rukovanja kuglicama u postrojenjima, i ako bi se flokule kvasaca mogle normalno razdvojiti, mogli bi biti sigurni da su ostarjele stanice uklonjene iz bioreaktora.

Claims

1. Proces proizvodnje alkoholnih pića, naznačen time da se koristi ‘gas-lift’ bioreaktor sa unutarnjim mješanjem za provedbu faze kontinuirane fermentacije da je se upotrebom flokulirajućih stanica kvasca imobiliziranih samo-agregacijom, uz ograničen pristup kisika, inicijalno fermentnira sladovina koja sadrži fermentabilne šećere, te se barem djelomično fermentirani otpust iz kontinuiranog procesa, radi dovršenja, doprema u stadij šaržnog procesiranja.

2. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je spomenuto alkoholno piće pivo.

3. Proces prema zahtjevu 2, naznačen time da je pivo svijetli tip piva.

4. Proces prema zahtjevu 3, naznačen time da je spomenuto pivo lager tipa.

5. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je spomenuto pivo sjevernoamerički tip piva.

6. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je spomenuti kvasac visoko flokulirajući ili superflokulirajući.

7. Proces prema zahtjevu, naznačen time 1 da je spomenuta fermentacija primarna fermentacija.

8. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je sladovina prije fermentacije iščišćena ugljičnim dioksidom.

9. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je se u bioreaktoru koristi raspršivani ugljični dioksid koji sadrži 3 % kisika.

10. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je se svršetak primarne fermentacije odvija u spomenutoj fazi držanja šarže.

11. Proces prema zahtjevu 10, naznačen time da je se provodi redukcija koncentracije diacetila.

12. Proces prema zahtjevu 10, naznačen time da je se provodi redukcija koncentracije acetaldehida.

13. Proces prema zahtjevu 10, naznačen time da je koncentracija hlapivih alkohola u biti ostaje nepromijenjena tijekom procesne faze držanja šarže.

14. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je se otpust iz faze kontinuirane fermentacjie distribuira kroz mnogo raznovrsnih posuda za držanje šarže u kojima se odvija spomenuti proces držanja šarže.

15. Proces prema zahtjevu 1, naznačen time da je je spomenuti kontinuirani proces proces za inokuliranje narednih šaržnih fermentacija u fazi držanja šarže.