BG66230B1 - Комбинирани непрекъснати/периодични ферментационни процеси - Google Patents

Abstract

При получаването на алкохолни напитки се използва непрекъснат ферментационен стадий за постигане на определена степен на ферментация и/или първоначална ферментация на пивна мъст, съдържаща ферментируеми захари. Примерен непрекъснат стадий включва използването на биореактор с газова подемна сила, като при ферментацията се използват свръхфлокулиращи пивни дрожди при контролирано ограничено съдържание на кислород. Поне частично ферментиралият продукт, получен през непрекъснатия стадий, може след това да се подаде към периодичен технологичен стадий за окончателно обработване.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до получаване на алкохолни напитки, по-специално пиво, като по-конкретно се използват комбинирани процеси, включващи непрекъснати и периодични ферментационни технологични стадии.

Предшестващо състояние на техниката

Обширният брой нови публикации в тази област илюстрира големия интерес на пивоварната индустрия към имобилизирането. В няколко обзора (Enari, 1995; Iserentant, 1995; Masschelein, 1997; Mensouret al., 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999) за общото състояние на пивоварната индустрия е изтъкната възможната революционна роля на имобилизирането в производството на пиво. В допълнение към групите, споменати в раздели 3.1 до 3.5, много други институции са включени в приложението на имобилизирани клетки R & D при варенето на пиво. Miller Brewing Company (Duncombe et al., 1996; Tata et al., 1999) от Съединените американски щати провежда някои предварителни оценки на изпитвателно устройство Meura Delta, както и на биореакгор с флуидизиран слой с дистрибутор Schott Engineering. Пивоварната Coors също така извършва предварителни експерименти със системата Meura Delta.

Словашкият технически университет в сътрудничество с Heineken е изследвал използването на гел от калциев пектат в система с въздушна подемна сила за производство на пиво (Domeny, 1996). Наскоро групата от Словашкия технически университет публикува няколко статии за текущите изследвания (Smogrovicova et al., 1997; Smogrovicova & Domeny, 1999). Guinness първоначално е изследвал използването на различни абсорбционни носители за имобилизиране и последваща ферментация в биореактор с флуидизиран слой (Donnelly, 1998). През 1999 г. Donnelly и колеги публикуваха доклад, в който се описва кинетиката на метаболизма на захари в биореактор с флуидизиран слой (Donnely et al., 1999). Тяхната експериментална схема включва използването на порьозни стък лени гранули Siran като имобилизационен носител за ферментиращи дрожди. Guinness е станал част от Immocon Consortium, което е описано в раздел 2.2.5.

Holsten Brauerei AG и Lurgi AG от Германия, са разработили съвместно и са пуснали в действие пилотна инсталация за непрекъснато производство на несъдържащо алкохол пиво (Dziondziak, 1995). Гранули от калциев алгинат са използвани във ферментатор с флуидизиран слой (130 L) в едностадиен контур, при това колона с решетъчни дъна (7 решетъчни дъна) са използвани за деалкохолизиране на пивото. Общото време за производство съгласно този процес е 8,5 h.

Група от Sapporo Breweries Ltd., Изследователска лаборатория за варене на бира, намираща се в Япония, изследва използването на имобилизирани клетки в реактор с флуидизиран слой за главната ферментация на бирата. Техните изследвания включват използването на гранули от гел от поливинилов алкохол (Shindo & Kamimur, 1990), гранули от калциев алгинат (Shindo et al., 1994а), двуслойни нишки от гел (Shindo et al., 1994) и гелни гранули от хитозан (Shindo et al., 1994c) в качеството на имобилизиращи матрици. В последното изследване биореактор с работен обем 11, съдържащ 25 обемни % гранули от Chitopearle®, тип II, (гранули от хитозан) работи в непрекъснат режим с неферментирало пиво, третирано с глюкоамилаза. Тази ензимна обработка осигурява образуването на ацетатен естер в системата на имобилизираната клетка, за да бъде подобна на тази от конвенционалната периодична ферментация, и по този начин по-близо до продукта, взет за мостра.

Изследователската група от Сапоро понастоящем фокусира вниманието си върху изследване с гранули от хитозан, използвани във ферментатор с флуидизиране на гранулите, работещ в повтарящ се периодичен режим. Системата е работила 75 дни без големи проблеми и полученото пиво е подобно по качество на търговски продукт. Показан е нефлокулиращ щам Anon като много по-ефективен в сравнение с флокулиращ щам (Maeba et al., 2000; Umemoto et al., 1998).

Два други подхода, предвиждащи намаляване на диацетила, са представени на ЕВС конгрес, състоял се в Маанстрийт през 1997 г.

66230 Bl

Изследователи от Франция (Dulieu et al., 1997) предвиждат използването на декарбоксилаза капсулован алфа-ацетолактат, за да превърнат бързо алфа-ацетолактата в ацетон. Meura Delta представя предварителни резултати от използването на алумосиликатен зеолит в качеството на катализатор за директно превръщане на студено на ацетолактат в ацетон (Andries et al., 1997). Ако такова третиране се окаже ефективно и приемливо за потребителя, алтернативи, свързани с по-ниски разходи при системите за отлежаване, предлагани от Cultor and Alfa Laval, могат да станат реалност.

Друго експериментално изследване в областта на имобилизирането за получаването на пиво е това на Института по стандарти и промишлени изследвания на Сингапур, при което е изследвано използването на нишковидни гелни частици от алгинат в реактор с уплътнен слой и е установено, че това е по-благоприятно в сравнение с алгинатни гранули (Que, 1993).

Mafra и колеги от Universidade do Minho от Португалия са дискутирали използването на суперфлокулиращ щам дрожди за непрекъснато отлежаване на пиво (Mafra et al., 1997). Тази изследователска група също така е публикувала работа, свързана с използването на техните флокулиращи дрожди в биореактор с въздушна подемна сила (от типа ерлифт) за производство на етанол (Vicente et al., 1999; Domingues et al., 2000).

Напоследък изследванията на различни академични институции също така са свързани с използването на имобилизирани клетки за производство на пиво (Argiriou et al., 1996; Bardi et al., 1996; Cashin, 1996; Moll & Duteurtre, 1996; Nedovic et al., 1996a; Nedovic et al., 1996b; Norton et al., 1995; Scott et al., 1995; Wackerbauer et al., 1996a; Wackerbauer et al., 1996b). Изследователски групи от Китай (Chao et al., 1990; Yuan, 1987; Zhang et al., 1988), Русия (Kolpachki et al., 1980; Sinitsyn et al., 1986) и Чехословакия (Chladek et al., 1989; Curin et al., 1987; Polednikova et al., 1981) също включват технология c използване на имобилизирани клетки и публикуваха резултатите през 1980 г.

Голям брой използвани източници са взети под внимание при подготвителната работа на изследването, на което се базира настоящото изобретение.

Кратко описание на същността на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на алкохолни напитки, включващ стадий за непрекъсната ферментация, който се използва за постигане на определена степен на ферментация и/или поне начална ферментация на пивна мъст, съдържаща ферментируеми захари.

По-специално е осигурен предпочитан метод, при който непрекъснатата ферментация се извършва в биореактор с газова подемна сила (от типа ерлифт), като се използват флокулиращи (и по-специално високофлокулиращи или свръхфлокулиращи) дрожди и прилагайки строг кислороден контрол.

В един особено предпочитан вариант на настоящото изобретение “поне частично ферментиралият” изходен продукт от непрекъснатия процес се подава към периодичен технологичен стадий за дообработване (който в контекста на патентните претенции на настоящото изобретение може да осигури завършването на ферментационния процес чрез превръщане на ферментируеми въглехидрати в алкохол, без този стадий да ограничава изобретението).

Настоящото изобретение се отнася до получаването на пиво (в частност включващо пиво от вида светло пиво, леко пиво и североамериканско пиво). В края виж например Essentials of Beer Style - E Eckhardt.

Методът съгласно претенция 1 се състои в това, че непрекъснатият стадий се извършва в биореактор с газова подемна сила.

При провеждането на непрекъснат стадий, който е ефективен в различни технологични процеси съгласно изобретението, се предпочита да се използват имобилизирани клетки (за разлика от само свободни клетки) и това може да се осъществи като се използва избран носител за имобилизиране или флокулиращи пивни дрожди. Въпреки това се предпочитала се използват флокулиращи пивни дрожди вместо имобилизирани клетки, при това за тази цел се предпочитат поспециално свръхфлокулиращи пивни дрожди.

Повече подробности, отнасящи се до предпочитани технологии и предимствата, свързани с непрекъснатите процеси, са дадени в хода на подробното описание на настоящото изобретение.

66230 Bl

To включва използването на регулируеми газови смесители и използване на азот, въглероден диоксид и кислород, както и на въздух.

В допълнение са дадени повече подробности, отнасящи се до технологичния стадии на периодичното задържане. Следва да се отбележи, че в някои дадени варианти на изпълнение на настоящото изобретение вниманието към периодичния процес на задържане надхвърля въпроса за “завършването” на превръщането на ферментируемите въглехидрати в алкохол (който във всички случаи може фактически да бъде завършен в непрекъснатия стадий на обработката). В тези варианти на изпълнение на технологичния етап на периодичното задържане главното внимание е насочено към постигане на вкусовите качества (или подобряването им) по-конкретно по отношение на диацетил и ацеталдехид.

Предпочитани варианти на изпълнение на настоящото изобретение включват разпределение на получената след непрекъснатия стадий ферментирала до определена степен и/или поне частично ферментирала пивна мъст през тръбопровод с разклонения (закрепен неподвижно тръбопровод с разклонения или чрез селективно свързване и изключване на тръби) към множество резервоари за периодично задържане. В процеса на разпределение един резервоар се пълни, последван от друг и т.н. При един особено предпочитан вариант на изпълнение пропускателната способност на реактора с непрекъснато действие и капацитетът при периодичното задържане се съгласуват по отношение на размери и брой на реактори/резервоари за периодично задържане така, че дебитът на получения продукт да съответства на капацитета. Идеалният случай е, когато от резервоар за периодичното задържане се източва крайният продукт точно навреме, за да бъде почистен, повторно съединен и след това отново напълнен с продукт, който се изпуска от стадия на непрекъснатата ферментация.

Съгласно друг аспект на настоящото изобретение някои варианти на изпълнение на изобретението конкретно са насочени към съдържанието на кислород в пивната мъст/пивото. Това се отнася както за непрекъснатите ферментации, така и за периодичните стадии на задържане при провеждането на процеса. По отношение на непрекъснатия стадий концентрацията на кислород има различно въздействие, но видимо е жела телно да се свежда до минимум неговото съдържание, за да се оптимизира превръщането на висшите алкохоли в активни естери, придаващи вкусовите качества. В тази връзка следва да се отбележи, че стадият на периодичното задържане може до голяма степен да не окаже влияние върху концентрациите на висши алкохоли, ако се прилага строг контрол за съдържанието на О₂, за да се управлява балансът по отношение съдържанието на вкусово активните фузелови естери. В тази връзка може да бъде полезно предварително продухване на пивната мъст с СО₂ преди провеждането на непрекъснатата ферментация.

При един вариант на изпълнение на изобретението главната цел на непрекъснатия стадий на обработка е да се осигури постигане на висока степен на ферментация при последващата периодична ферментация, която се извършва в процеса на периодичното задържане.

За по-голяма сигурност е приложено пълното съдържание на приоритетните документи като част от настоящото описание, макар и те да са изцяло репродуцирани в това описание.

Подробно описание на изобретението

Следва подробно описание в две части на аспектите на настоящото изобретение.

Описанието съдържа и/или се позовава на диаграми, формули, фигури и други подобни, всяка от които е обозначена с термина “Фигура”, следвана от конкретен идентификационен номер, а всяка от приложените към описанието фигури е описана и/или обозначена с “фиг.” и конкретен идентификационен номер. В тези фигури (ФИГ.) показаните елементи могат да не бъдат в точен мащаб.

Пояснения на приложените фигури

Фигура 1 представлява технологична схема на системата за непрекъсната ферментация в експериментален мащаб; показаните отделни елементи на технологичната екипировка са дадени в Таблица 5.1.

Фигура 2 - принципна схема на експериментален биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба (биореактор от типа ГПСТ) с вместимост 50 L.

Фигура 3 - изглед при напречен разрез на реактора от фигура 2, включващ местоположе

66230 Bl нието на вътрешната смукателна тръба и вътрешния сепаратор.

Фигура 4 - подробна схема на горния участък на биореактора от фигура 2.

Фигура 5 - подробна схема на корпуса на биореактора от фигура 2.

Фигура 6 - подробна схема на коничното дъно на биореактора от фигура 2.

Фигура 7 - подробна схема на газовия тръбен разпръсквател на биореактора от фигура 2. Общо 160 броя отвори (0.16 cm диаметър) са пробити в тръбния разпръсквател с диаметър 1.27 cm със стъпка по дължина 0.8 cm от център до център и стъпка по ширина 0.6 cm.

Фигура 8 - схема на непрекъснато получаване на гранули с използване на известни статични смесители (патентна заявка No. 2,133,789, Labatt).

Фигура 9 - изображение на щам® стъклени гранули, доставяни от Schott Engineering.

Фигура 10 - изображение на гранули от кизелгур Celite®, доставяни от World Minerals.

Фигура 11 - изображение на гелни гранули от капа-карагенан, произведени в лабораторията на Labatt Brewing Company Limited (“Labatt”).

Фигура 12 - изображения на нефлокулиращи дрожди; дрожди, образуващи вериги и флокулиращи дрожди. Тези изображения са направени с камера на микроскоп при увеличение 100 X.

Фигура 13 - снимка от микроскоп на средата на флокулиращи щам дроади LCC3021 при увеличение 100 X.

Фигура 14 - снимка от микроскоп на свръхфлокулиращи щам дрожди LCC290 при увеличение 100 X.

Фигура 15 - принципна схема на процеса с използване на статичен смесител за изготвяне на гелни гранули от капа-карагенан. В статичния смесител флуидът се движи през смесителя, осигурявайки смесване на флуидите, изпомпвани от тръбопровода.

Фигура 16 - друга схема на биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, използван за главна ферментация на пиво.

Фигура 17 - снимка на действащ биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, показан на фигура 15.

Фигура 18 - подробна схема на реактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, от фигура 16.

Фигура 19 - подробна схема на челен капак на биореактора, където: 1 е отвор за изтегляне на течност за кислородния сензор; 2 - гилза за температурен сензор, свързан с термостатичен контролен уред; 3 - температурен детектор; отвор за връщане на течността за кислородния сензор; 5 - отвор за инокулата; мембранен отвор за проби, снабден с капачка от неръждаема стомана.

Фигура 20 - схема на отвор за изтегляне на течност за кислородния сензор, който отвор е снабден с приспособление за пълнене, потопено в течната фаза на биореактора.

Фигура 21 - устройства и технологична схема на непрекъсната главна ферментация в система, използваща биореактор с газова подемна сила (виж Таблица 5.1, в която подробно са описани устройствата).

Фигура 22 - схематично представяне на механизма на образуване на гел от карагенан (приспособен от Rees, 1972).

Фигура 23 - схематично представяне на използването на гел ни гранули от капакарагенан, съдържащи имобилизирани пивни дрожди за леко пиво, използвани при главната ферментация.

Фигура 24 - изображение на гелни гранули от капа-карагенан, съдържащи имобилизирани пивни дрожди за леко пиво, при нулево време на ферментация.

Фигура 25 - изображение на пивни дрожди за леко пиво, захванати в гелни гранули от капа-карагенан, след двудневна периодична ферментация, на което са показани белези на пъпкуване върху отделни дрождени клетки.

Фигура 26 - изображение на външната повърхност на гелна гранула от капа-карагенан, показваща дрождени клетки за леко пиво след двумесечна непрекъсната ферментация.

Фигура 27 - изображение на дрождени клетки за леко пиво във външен участък от гелна гранула от капа-карагенан след двумесечна непрекъсната ферментация.

Фигура 28 - изображение на дрождени клетки за леко пиво в центъра на гелна гранула от капа-карагенан след двумесечна непрекъсната ферментация.

Фигура 29 - изображение на цяла гелна

66230 Bl гранула от капа-карагенан след шестмесечна непрекъсната ферментация.

Подробно описание - Част 1

Щам дрожди и получаване на инокулат

При провеждането на ферментационните процеси в този тезис е използван полиплоиден щам от вида Saccharomyces cerevisiae (също така отнасяни към вида Saccharomycesuval-uni и/ или Saccharotnyces carlsbergensis). Пивоварната общност обикновено отнася тези дрожди към долноферментиращите дрожди при производството на леко пиво. Тази характеристика се обяснява със способността на дрождите да се утаяват от течната среда в края на ферментацията. Пивни дрожди за вида английско пиво, за разлика от дрожди за леко пиво, се издига към горния край на ферментационния съд, поради което е известен като горноферментиращ щам. Способността на дрождите да се утаяват или издигат не е непременно зависеща от това, дали дрождите са за светло пиво или за пиво от вида английско пиво, но представляват видов щам. Дрожди за леко пиво обикновено не ферментират при температури над 34°С, докато дрожди за пиво от вида английско пиво не могат да ферментират мелибиоза. Изследователите използват тези характеристики, за да различат дрождите за леко пиво от тези за пиво от вида английско пиво (McCabe, 1999). Среда от флокулиращи щам дрожди Saccharomyces cerevisiae, регистриран под номер 3021 от Labatt Culture Collection, се използва както при ферментациите чрез самоагрегация, така и при ферментациите с имобилизиране в капа-карагенан. За провеждане на опити, включващи използване на имобилизирани свръхфлокулиращи дрожди, се използва вариант на щам LCC3021 с наименование СС290.

Чисти култури от дрожди се съхраняват при криогенни температури при -80°С в камера за замразяване, намираща се в Labatt Technology Development Department. Когато се изисква стерилност на дрождевата култура, тя предварително се култивира аеробно при 21 °C върху подложка от arap PYG (3,5 g пептон, 3,0 g екстракт от дрожди, 2,0 g КН₂РО₄,1,0 g MgSO₄.7H₂0,1,0 g (NH₄) SO₄, 20,0 g of глюкоза и 20,0 g arap, разтворен в дестилирана вода до обем от 11).

Изолираните колонии от дрожди след това се пренасят в епруветка, съдържаща 10 ml пастьоризирана пивна мъст, и се подлагат на инкубиране с разбъркване при температура 21 °C в продължение на 24 h. Обемът на този инокулат постепенно се увеличава до 51 чрез добавяне на предишната култура в подходящ обем от пивна мъст (10 ml в 190 ml, 200 ml в 800 ml и 1 1 в 4 1). Дрождевият инокулат след това се пренася в центрофуги и се подлага на центрофугиране при 10000 rpm и температура 4°С за 10 min. От получените влажни остатъци дрожди (30% вода) след сушене се получава желаната маса от дрожди за всички следващи ферментационни процеси.

Ферментационна среда

Технически чиста пивна мъст, произвеждана от Labatt London brewhouse, се използва като естествена среда за всички ферментационни процеси. В тези тезиси са дадени обяснения, отнасящи се до относителното тегло на пивната мъст, изразено като градуси на Плато (°Р). Формулата 4.1 описва зависимостта между относителното тегло и°Р.

°Р = 135,997 · SG³ - 630,272 · SG² + 1111,14 · SG - 616,868 (4.1)

Използваната в тези тезиси пивна мъст е със 17,5°Р, което съответства на относително тегло 1,072.

В Таблица 4.1 е дадена характеристика на въглехидратите в тази пивна мъст, измерени чрез метода на течната хроматография (HPLC), описан в раздел 4.7.2. Приблизително 73 % от въглехидратите в тази пивна мъст са ферментируеми, докато пивните дрожди, използвани в това изследване, не могат лесно да скъсяват 27 % от по-дългите вериги на въглехидратите.

Таблица 4.1. Състав на въглехидрати в пивната мъст, използвана във ферментационния процес. Пивната мъст е произведена от лондонската пивоварна Labatt и има относително тегло 17,5°Р.

66230 Bl

Таблица 4.1. Състав на въглехидрати в ливната мъст, използвана във ферментационния процес. Пивната мъст е произведена от лондонската пивоварна Labatt и има относително тегло 17,5 °Р.

	Средна стойност(g/L)	Степен на неравномерност (%)	ферментируеми (%)	неферментируеми (%)
Фруюоза	3,3	18,0	1,9
Глюкоза	16,5	4,3	9,3
Малтоза	87,7	10,1	47,8
Малтотриоза	25,2	10,8	14,2
Малтотвтроза	6,4	18,3		3,6
Полизахариди	41,1	9,1		23,2
Общо	177,2		73,2	26,8

Коефициентът на неравномерност за повечето анализирани субстанции се движи в границите от 10 до 20 %. Тази неравномерност се дължи до голяма степен на използвания метод за получаване на промишлена продукция, както и на неравномерността на суровината при различните варки.

Имобилизационни видове

При това изследване са изпитвани три вида имобилизиране - захващане, адсорбция и самоагрегация. За промишлените носители на първо място трябва да присъстват данни, предоставени от доставчика, а след това да се допълнят чрез лабораторен анализ. Изображенията и разпределението на размерите на изследваните носители (когато са в наличност) са представени в други части в описанието.

Изпитани са два вида адсорбционни матрици в експерименталния биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба (съкратено - биореактор от типа ГПСТ). Изображенията на тези носители са представени към описанието. Schott Engineering осигурява носител от синтеровани стъклени гранули Siran®. Избраните частици са с диаметър 1-2 mm, имат отворени пори за имобилизиране на пивните дрожди, като обемът на порите е 55-60 %, а разпределението на размера на порите е между 60 и 300 microm, което е подходящ размер за дрождевите клетки. За този вид носител се дават сведения, че е биологично и химически стабилен, лесно се чисти, може да се използва повторно, поддава се на стерилизация с пара, не е плътен и е неутрален на вкус, поради което спада към одобрените продукти за хранителната промишленост.

World Minerals от Калифорния доставя зърнист носител, съставен от пръст от кизелгур. Носителят има предимства като топлинна и химическа стабилност, механична якост и стабилност. Кизелгурът, базисния суровинен материал, обикновено се използва в пивоварната промишленост за филтруване на пиво. Носителят Celiez R-632 е създаден специално за имобилизиране на клетки.

Техническите показатели на доставчика са както следва:

Фракционен състав: от 0,595 mm до 1,41 mm (14/30 mesh)

Среден диаметър на порите: 7,0 microm Общ обем на порите: 1,19 cm³/g

66230 Bl

Плътност на компактен слой: 0,334 kg/m³. Гелни гранули от капа-карагенан, които са носител на базата на захващане, се произвеждат в лабораториите на Labatt Brewing Company Ltd. Производственият процес е описан в Раздел 5.2, а резултатите от производствения процес са представени в Раздел 6.2.1.

Най-простият метод за имобилизиране чрез самоагрегиране е възможен чрез селекция на щам дрожди, които са флокулиращи. Промишлените дрожди LCC3021 за производство на леко пиво притежават естествена способност към флокулация и се считат, че са щам със средна флокулираща способност. С напредването на ферментацията се образуват малки колонии от дрожди с размери от 0,5 mm до 1,0 mm. Дрождите LCC290, вариант на дрождите LCC3021 за леко пиво, образуват много по-големи флокулати (от 1,0 до 5,0 mm в зависимост от степента на разбъркване) и поради това се класифицират като свръхфлокулиращи дрожди. Представени са изображения на различни флокулати от дрожди.

Протокол за вземане на проби

В хода на ферментациите е необходимо да се вземат проби от ферментиращата течност на множество интервали. За изпълнение на тази задача от Scandi-brew® са набавени стерилни вентили за вземане на проби. Тези вентили са изработени от неръждаема стомана и са снабдени с камера, в която може да се съхранява етанол, за да се поддържа асептична околна среда. Преди вземането на проба етанолът се изпуска от камерата чрез отстраняване на предпазна капачка от изпускателния отвор в долния край. Свеж етанол (75 об. %) се вкарва в камерата и след това капачката се поставя в отвора в горния край на крана. След това лостът на вентила се изтегля и приблизително 50 ml течна проба се събира в стерилен контейнер. Взема се втората проба, съдържаща свръхфлокулиращи дрожди така, че да може да се извърши подходяща дефлокулация преди преброяването на клетките. След като завърши вземането на проби, камерата на вентила се промива с гореща вода, пероцетна киселина и накрая с етанол. Предпазната капачка се поставя на изпускателния отвор и камерата се напълва с етанол, за да се подготви за вземането на следващите проби.

Микробиологичен непрекъснат контрол

Преброяване на свободните дрождеви клетки и жизнеспособността им чрез метод с използване на метиленово синьо

Течните проби, съдържащи свободно суспендирани дрождеви клетки, най-напред се вземат от ферментационната среда чрез описаната по-горе процедура за вземане на проби. За изброяването на клетките се използва хемоцитометьр на Hauser Scientific Company с обем К)·⁴ ml в съчетание с оптичен микроскоп. Течните проби се разреждат с дестилирана вода, за да се достигне общо количество дрождеви клетки в полето за преброяване от 150 до 200. Heggart et al. (1999) описват всичките фактори, които въздействат върху характеристиките за жизнеспособността на дрождите.

За да се направи преценка на степента на жизнеспособност в пробата, се използва метода на оцветяване с метиленово синьо, описан от American Society of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Живите клетки могат да обезцветят метиленово синьото багрило, като го окислят. От друга страна, мъртвите клетки се оцветяват в синьо. Използват се следните реагенти за приготвяне на метиленово синьо, използвано за оценка на жизнеспособността:

Разтвор А: 0,1 g метиленово синьо в 500 ml дестилирана вода

Разтвор В: 13,6 g КН₂РО₄ в 500 ml дестилирана вода

Разтвор С: 2,4 gNa₂HPO₄.12H₂O в 100 ml дестилирана вода

След това се приготвя буферен разтвор от метиленово синьо чрез смесване на 500 ml от разтвора А с 498,75 ml от разтвор В и 1,25 ml от разтвора С, за да се получи крайна смес с pH 4,6.

Смес от разредената клетъчна суспензия и метиленово синьо се приготвя в епруветка чрез щателно смесване. След като сместа се остави да престои няколко минути (осигурява се контакт между клетките и багрилото), капка течност се поставя между стъклото за преброяване на хемоцитометьра и покривното стъкло (с определен обем). Количеството на жизнеспособните клетки се определя чрез преброяване както на живите, така и на мъртвите клетки в полето за преброяване, след което количеството на живите клетки се изважда от общото количест66230 Bl во клетки.

4.5.2. Преброяване на имобилизираните дрождеви клетки - Самоагрегиране

Когато се използват дрождеви клетки със склонност да образуват флокулати, става трудно да се направи точна оценка на числото на клетките, присъстващи в течната проба, тъй като клетките проявяват склонност към утаяване в стъкленицата. За да се получи представителна проба, се използва дефлокулиращ агент. При тези опити се използва 0,5 об. % разтвор на сярна киселина за дестабилизиране на флокулиращите дрождеви клетки, за да се осигури представително преброяване на дрождевите клетки. Същата процедура за преброяване и определяне на жизнеспособността, описана в Раздел 4.5.1, се използва със сярната киселина, заместваща дестилираната вода в качеството на средство за разреждане.

Преброяване на имобилизираните дрождеви клетки - гелни гранули

Преди да бъде проведено преброяването на захванатите в гела клетки, е необходимо да се разруши гелната матрица, като за целта се използва апарат Politron® (Brinkmann Instruments). Най-напред проби от гранули преминават през стерилно сито (500 microm mesh) и след това се промиват със стерилна вода. Един милилитър от гранулите със захванатите в гела клетки и 19 ml дестилирана вода се прибавят към 50-милилитров съд. След това апаратът Politron® се използва за физическо разрушаване на гела, като по този начин се разтваря в течността. След това се провеждат описаните в Раздел 5.5.1 методи за преброяване и определяне на жизнеспособността в пробите от разрушения гел.

Непрекъснат контрол за наличие на замърсявания

Всички ферментационни процеси, които са проведени по време на това изследване, са подлагани на непрекъснат контрол за замърсявания. Програмата за непрекъснат контрол включва поне една проверка на седмица на течността в 50-литровите ферментатори за непрекъсната ферментация, както и на пивната мъст в резервоарите. Течните проби се вземат при спазване на изискванията за стерилност и след това се разстилат върху културална чашка в универсален агар за пиво (UBA, Difco Laboratories) и 10 mg/1 циклохексимид. Тези проби за изпитва не след това се инкубират при температура 28°С за време до 10 дни при аеробни и анаеробни условия. Избраните чашки се поставят в съдове, съдържащи таблетка от AnaeroGen®, с която се отстранява всичкият останал в съда кислород и се създава желаната среда за анаеробно развитие. Използването на индикаторна лента (променя розовия цвят, ако се съдържа кислород) ни позволява да проверим, че околната среда е анаеробна. Бактериални замърсявания, ако присъстват в течната проба, би трябвало да се установят чрез този метод.

Установяването на диви или непивни дрожди изисква отделна среда за растеж, която не би трябвало да благоприятства бактериалния и/или растежа на пивните дрожди. Порьозни пластинки, изготвени със среда от пивни дрожди (YM, Difco Laboratories), към които е прибавен 0,4 g/в CuSO₄, се използват за селективен растеж на всички възможни диви дрожди (култивиране при температура 25°С за 7 дни). Култивирането на течните проби, нанесени върху arap PYN (пептонна среда дрожди-екстракт, лаборатории на Difco), за време 7 дни при температура 37°С осигурява установяването на пивни дрожди, които не са за производство на леко пиво. Растежът на пивни дрожди за леко пиво се инхибира при температура над 34°С, като с това при растежа върху тези пластини би се установило замърсяване с дрожди за английско пиво.

Аналитични методи

Провеждат се съответни измервания на цялата техническа екипировка, свързана с експериментите, според изискванията на стандартните работни процедури.

Етанол

Провеждат се анализи за концентрацията на етанол в пивото и пробите от ферментацията, като за целта се използва метода на газова хроматография, описан от Technical Committee и Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Дегазирана проба от течност се смесва с 5 об. % изопропанол, последвано от впръскване на 0,2 microl от тази смес в газов хроматограф Perkin Elmer 8500. Следващото описание показва детайлите, отнасящи се до точното настройване на газовия хроматограф:

Детектор за пламъчна йонизация (FID)

66230 Bl

Уред за автоматично взимане на проби

Пречистен кизелгур захроматографски цели 102, 80-100 mesh, херметична опаковка.

Хелиев газов носител, изтичащ с дебит 20 ml/min

Температура на инжектора - 175°С, температура на детектора - 250°С и температура на колоната 185°С изотермично.

Въглехидрати

Измерват се концентрациите на глюкоза, фруктоза, малтоза, малтотриоза, малтотетроза, полизахариди и глицерин, като се използва течна хроматография с високи технически характеристики (Spectra-Physics SP8100XR HPLC). Използва се катионообменна колона (Bio-Rad Aminex НРХ-87К) с калиев фосфат (двуосновен) като мобилна фаза, за да се отделят тези въглехидрати при елуирането им през системата. След това се определя количеството на веществата, като за целта се използва детектор за коефициента на пречупване, за да определи съответния пик на веществото. HPLC работи при противоналягане от 800 psi, температурата в колоната е 85°С, а температурата на детектора е 40°С. Пробите се дегазират и разреждат до необходимото ниво. След това в системата се впръсква 10 microl с дебит 0,6 ml/min.

В пивоварната промишленост обикновено се използва друго измерване, за да се определи нивото на течните въглехидрати. Относителното тегло на течността, изразено чрез градусите на Плато, се измерва с помощта на денсиметър Anton Paar DMA-58.

Филтруваните и дегазирани проби се пренасят в стъклена U-образна епруветка, която след това се подлага на електронни трептения. Честотата на трептенията през течността се измерва и след това се извършва корелация с течност с определена плътност (g/100 g или°Р). Следва да се отбележи, че това измерване е приближение по отношение на общата концентрация (или относителното тегло) на въглехидрати в пробата, тъй като измерванията са извършени на водни разтвори на захароза при температура 20°С, чието относително тегло е същото, както на пивната мъст.

Вицинални дикетони

Общата концентрация на диацетил (2,3бутандион) и 2,3-пентандион се определя, като се използва газов хроматограф Perking Elmer

8310, снабден с детектор с електронен захват. Газов носител от аргон, съдържащ 5 % метан, изтича с дебит 1,0 ml/min, а пробите преминават през колона J & W DB-Wax. Температурата на впръскване се поддържа на 105°С, а температурата на детектора се установява на 120°С. Уред за автоматично вземане на проби Hewlett Packard 7694Е улеснява извършването на анализите. Количественото съдържание се изчислява въз основа на определяне на областта на пика на избрания компонент в пробата, след което се сравнява със стандартна калибрирана величина.

За да се определи “общата” концентрация на тези вещества, на първо място е необходимо тези проби да се приведат в равновесие при температура 65 °C, и след това да се задържат при тази температура в продължение на 30 min. Третирането на тази проба за предварителен анализ осигурява превръщането на алфа-ацетолактат и алфа-хидроксибутарат в съответните техни дикетони, диацетил и 2,3-бутандион.

Естери и висши алкохоли

Някои от най-важните ароматни съединения, намерени в пивото, се определят, като се използва хроматографски метод. Ацеталдехид, етил ацетат, изобутанол, 1-пропанол, изоамилацетат, изоамилалкохол, етилхексаноат и етилоктаноат се определят, като за целта се използва n-бутанол като вътрешен стандарт. Използва се газов хроматограф Hewlett Packard 5890, снабден с пламъчен йонизационен детектор, уред за автоматично вземане на проби и капилярна колона J & W DB-Wax. Температурата на впръскване се установява на 200°С, а температурата на детектора е 220°С. Профилът на температурата на нагревателната камера е както следва: 40°С за 5 min, повишаване на температурата от 40°С до 200°С със скорост 10°C/min, повишаване на температурата от 200°С до 220°С със скорост 50°C/min и накрая задържане при 220°С за 5 min. Хелиев газ с дебит 30 ml/min (28 psig), поток от водород с 50 ml/min (25 psig) и въздушен поток с 300 ml/min (35 psig) се добавят към потока от хелиевия газов носител с дебит 6,0 ml/min. Времетраенето на целия цикъл за проба от 1 ml е 40 min.

Други анализи

Проведени са няколко други аналитични измервания на ферментационната течност, която

66230 Bl е подложена на отлежаване и опаковане. Крайният продукт се подлага на анализ, който се провежда от отдела на Labatt по контрол на качеството, както по стандартите за крайния продукт пиво. Описаните стандарти на Technical 5

Committee и Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992) бяха базата за провеждане на тези измервания. Списък на анализите, както и кратко описание на съответните измервания, са дадени в Таблица 4.2.

Таблица 4.2 Анализи от контрола по качеството и нормативи

Показатели	Описание
Въздух	Общо количество въздух, пренесен по време на запълването; нормативът е по-малко от 1 mL.
Въглероден диоксид	Ниво на насищане с въглероден диоксид, въведен в продукта; изразява се в %, като нормативът е 2,75 %.
Серен диоксид	Количеството на серен диоксид в пивото се измерва с газов хроматограф; нормативът е <10 mg/L.
Диметилов сулфид	Количеството на диметиловия сулфид в пивото (аромат на сварената зърнена маса), измерван с газов хроматограф; нормативът е <70 цд/L
Горчивина	Степен на горчивина, дължаща се на хмела в пивото; измервана на база алфа-киселини в пивото; 1 единица горчивина (BU| е еквивалентна на ~1 mg/L алфа-киселина.
Цвят	Цветът на пивото се определя спектрофотометрично; абсорбция на проба при 430 nm при път на светлинните лъчи 0,5 inch.
pH	Измерва с с калибриран pH-метър; pH =-юд10[Н+]
Привиден екстракт	Количеството на наличната разтворима маса в течността без компенсиране на въздействието на алкохола върху относителната плътност на течността; измерва се с аерометър и се представя като °Р; ПЕ

66230 Bl

Действителен	Същият, както привидния екстракт, с изключение на
екстракт	алкохола, който е отчетен при това измерване; ДЕ
Изчислен изходен	На базата на експеримент на Balling, при който от 2,0665 g
екстракт	екстракт, се получава 1,000 g алкохол; ИИЕ =100*[ (2,0665*(% тегл./тегл. алкохол) + ПЕ)/ (100 + 1,0665 * (% тегл./тегл. алкохол))]
Мътност	Мътност на пивото при стайна температура (21 °C) без разпределение на утайката; определя се чрез нефелометричен анализ на базата на разсейване на светлина и се измерва в единици (FTU); нормативът е < 200 FTU
Начална бистрота	Бистротата на пивото, когато е охладено от стайна
при охлаждане	температура (21 °C) до 0°С, без да се разпределя утайката; измервателният метод е както по-горе; нормативът е < 100 пи
Пенливост	Измерване на пенливостта на пивото, като е възможно използването на апарата NIBEM; пенливостта се създава в контролирания обект и се отчита степента на спадане на пяната; нормативът е > 170 секунди

Протокол за утаяване на дрождите LCC290 Приготвяне на проба за изпитване на дрождите

Свръхфлокулиращите дрожди (LCC290) растат в пивна мъст, както е описано в Раздел 4.1. Тази посевна култура след това се подлага на центрофугиране при температура 4°С и 10000 rpm за 15 min, за да се получи утайка от дрожди за последващо инокулиране. Пивна мъст, описана в Раздел 4.2, се пастьоризира при температура 100°С за време 60 min и след това един литър се прехвърля стерилно в 6 х 21 колби. Всяка колба се инокулира с 4 g от центрофугираните дрожди. Колбите се поставят във вибратор, ра40 ботещ при 135 rpm (21 °C температура на околната среда) и се оставят да ферментират. Една колба се изважда на следните интервали: 24 h, 40 h, 48 h, 64 h, 71 h и 192 h. Ha всеки интервал се взема малка проба от течност за анализ на въглехидрати, концентрация на дрожди и жизнеспособност (методите са описани в Глава 4). Останалата смес течност/дрожди се подлага на изпитване за утаяване на дрождите, описан в раздел 4.7.2.

Протокол за утаяване на дрождите

Скоростта на утаяване на свръхфлокулиращи щам дрожди LCC290 се измерва съгласно следния метод: Всяка проба се подлага на

66230 Bl ферментация за определен интервал от време, както е описано в Раздел 4.7.1. При зададено време съответната колба се изважда. Пробите се разбъркват, за да се осигури суспендирането на всички частици. Съдържанието на колбите след това незабавно се пренася в 1000 ml градуирани

Скорост на утаяване » ΔΗ At

Като се използва стандартният метод на Kynch (1952), може да се определи кривата на скоростта на утаяване в зависимост от концентрацията по диаграма, в която са нанесени кривите за всеки ферментационен интервал.

Методи за изчисляване параметрите на циркулация и смесване

За да се определи времето за смесване и скоростта на циркулация в трифазов биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба (биореактор ГПСТ) се използва система за впръскване на киселина, свързана със система за получаване на данни. Чрез използване на силна киселина в импулсен режим е възможно да се изчисли както скоростта на циркулация, така и времето за смесване, чрез постоянно наблюдение на промяната на pH през цялото време и след това да се използва уравнението, представено в раздел 3.2.2.

Системата за получаване на данни се състои от:

Детектор на pH-метър (Cole-Parmer, cat. # Р-05990-90), свързан към микропроцесор на базата на pH-предавател (модел 2300)

Предавател на данни DT2805 Персонален компютър 386DX и Програма за бързо получаване на данни (написана от С. Hudson and J. Beltrano през 1994 и изменена от N. Mensour през 1998).

ml 10N солна киселина се впръскват в пръстеновидния участък на биореактора ГПСТ (диаграмата е дадена на фигура 5.5) точно под мястото, където е разположен детекторът за pH. Това разстояние съответства на височина от 26 cm под главната плоча. Детекторът за pH е калибриран на две места с проверени съгласно стандартни изисквания буфери (Beckman pH 7.0 зелен буфер и Beckman pH 4.0 червен буфер), като калибрирането е извършено преди експериментите за смесване. Ток от 4-20 mA, полуцилиндри. При утаяване на флокулати разстоянието между повърхността на течността и границата флокулати-течност се измерва на интервали от 30 s. Скоростта на утаяване се изчислява, като се използва следната формула:

Н_я-Ни (5.1) (t-tf) чен от pH-метъра, е свързан към клемно табло, където данните за електрическия ток се трансформират в напрежение, които след това се измерват с помощта на схемата за получаване на данни, разположена до компютъра. Програмата за получаване на данни стартира едновременно с впръскването на киселината. Продължителността на събиране на данни е 5 min при честота 50 Hz. Системата в програмата се настройва на 3750 точки (избрани от общо 15000 събрани точки).

Събраните данни се предават от лабораторията към по-мощен компютър (микропроцесор Pentium II) за следващи анализи. Таблица на кривите 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Канада) се използва широко за анализ на данните поради нейния капацитет да разпределя голям брой група данни, както и заради много функции по отношение на въведените данни (плавност на работа с данните, начертаване на криви по зададени точки и т.н.) Алгоритъмът на Savitzky-Golay се използва за обработване на действителните данни, за да се елиминира шума, като за целта се използва изравняване на временната област на базата на полиномно изравняване по метода на най-малките квадрати през движещ се прозорец. След това изравнените данни се регулират, за да отрази промяна на стойността на pH в сравнение с първоначално измереното pH. Намаляваща синусоидална функция се нагажда към регулираните данни. Времетраенето на смесването и скоростта на циркулация след това се изчисляват от изравнените параметри.

Тези експерименти по смесването са проведени в съществуващи ферментационни процеси, като са използвани 50-L биореактори с газова подемна сила с един от трите имобилизирани носители (или свръхфлокулиращи дрожди LCC290, или среда от флокулиращи дрожди

66230 Bl

LCC3021, или гелни гранули от капа-карагенан). Течната фаза е ферментирало пиво с относително тегло 2,5°Р, а газовата фаза представлява разпръснат газ от въглероден диоксид. Температурата на ферментация се контролира на 15°С. Повърхностните скорости на разпръснатия газ варират между 2,0 и 6,0 mm/s. При даден дебит на газа системата се оставя за уравновесяване за 10 min. След това изпитването с впръскване на киселина може да започне и се повтаря 3 пъти. Избира се следващият дебит на газа и pH на сместа в реактора се регулира наново до изходното ниво.

Конструкция на експериментална система от биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба

Ферментационна система, включваща биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба

Системи с флуидизиран слой и използване на смукателни тръби са показали предимствата си при използването им в трифазни системи. Конструирани са два експериментални биореактора, снабдени със смукателни тръби, при които се използва газова подемна сила (биореактори ГПСТ), които са изработени и инсталирани в експериментална пивоварна на Labatt Brewing Company Ltd., за да се проведе експерименталната работа за това изследване. Няколко съществуващи съдове бяха реконструирани за съхранение на пивната мъст и за събиране на пивото. Технологичната схема, представена на фиг. 1, показва целия процес, използван в експериментите по непрекъснатата ферментация, а в Таблица 5.1 е направено описание на екипировката, представена на фиг. 1.

Пивната мъст се доставя от инсталацията на London Brewing през тръбопровод от 5,08 cm неръждаема стомана и се пренася в резервоари за съхранение на пивна мъст (WT1 & WT2) с работен обем 1600 L. С наличието на два резервоара е възможно да се осигури непрекъснато подаване на хранителна среда до експерименталните ферментатори (R1 и R2) с непрекъснато действие. Всеки резервоар е снабден със система за разпръскване на кислород и регулиране на хомогенизацията, както и с гликолен охлаждащ кожух за регулиране на температурата. Този централен източник на хранителна среда зарежда 3 независими един от друг ферментатори през раз пределителна камера, снабдена с вентили (V7, V8 и V9). Перисталтични помпи Masterflex (Pl и Р2) се използват за пренасяне на потока от пивната мъст до експерименталните биореактори (R1 и R2).

Таблица 5.1. Описание на отделните устройства и детайли на технологичната линия, представени на фигура 5.1

Позиция Характеристика

Въздух 100 psig въздух, доставян от инсталация в Лондон

СО₂ 100 psig въглероден диоксид, доставян от инсталация в Лондон

F1 Стерилен филтър на входящия отвор за въглероден диоксид

F2 Стерилен филтър на входящия отвор за въглероден диоксид

F3 Стерилен филтър на изпуск. отвор на вентилац. канал на WT1

F4 Стерилен филтър на изпускателния отвор на вентилационния канал на WT2

F5 Стерилен филтър на входящия отвор за разпръскване на газ

F6 Стерилен филтър на входящия отвор за разпръскване на газ

F7 Стерилен филтър на изпускателния отвор HaWBTl

GLR Линия за връщане на гликола;

psig

GLS Линия за доставяне на гликол;

psig

NV 1 Иглен вентил за въглероден диоксид

NV2 Иглен вентил за въглероден диоксид

NV3 Иглен вентил на входящия отвор за въздух

NV4 Иглен вентил на входящия отвор за въглероден диоксид

NV5 Иглен вентил на входящия отвор за въздух

NV6 Иглен вентил на входящия отвор за въглероден диоксид

Р1 Перисталтична помпа Masterflex за Р1

Р2 Перисталтична помпа Masterflex за Р2

PR1 Регулатор на налягането на въглеродния диоксид

PR2 Регулатор на налягането на въг66230 Bl леродния диоксид

PR3 Регулатор на налягането на въздуха

PR4 Регулатор на налягането на въглеродния диоксид

PR5 Регулатор на налягането на въздуха

PR6 Регулатор на налягането на въглеродния диоксид

R1 Експериментален биореактор;

501 работен обем

R2 Експериментален биореактор;

501 работен обем

RM1 Ротаметър за измерване дебита на СО₂; 0 до 20 scfh скала

RM2 Ротаметър за измерване дебита на СО₂; 0 до 20 scfh скала

RM3 Ротаметър за измерване на дебита на въздуха; 0 до 2,5 scfh скала

RM4 Ротаметър за измерване дебита на СО₂; 0 до 10 scfh скала

RM5 Ротаметър за измерване на дебита на въздуха; 0 до 2,5 scfh скала

RM6 Ротаметър за измерване дебита на СО₂; 0 до 10 scfh скала

V1 ,V2,V3 Дроселни клапи на входящия/изпускателния отвор на WT1

V4,V5, V6 Дроселни клапи на входящия/изпускателния отвор на WT2

V7, V8, V9 Сачмени вентили на разпределителната камера за пивна мъст

V10, V11 Сачмени вентили за входния отвор за пивна мъст

V12 Бързодействащ спирателен кран на входящия отвор за разпр. на газ

VI3 Дроселен клапан на изпускателния отвор на R1

V14, V15 Сачмен вентил на входящия отвор за пивна мъст на R1

V16 Бързодействащ спирателен кран на входящия отвор за разпр. на газ

V17 Дроселен клапан на изпускателния отвор на R2

VI8 Дроселен клапан на изпускателния отвор на WBT1

WBT1 Резервоар за младо пиво; 200 1 работен обем

WT1 Резервоар за съхранение на ливната мъст, снабден с гликолни ризи и приспособления за разпръскване; работен обем 1600 L

WT2 Резервоар за съхранение на ливната мъст, снабден с гликолни ризи и приспособления за разпръскване; работен обем 1600 L

Въглеродният диоксид и въздухът се разпръскват в системата с газова подемна сила през разпръсквател, представляващ тръба от неръждаема стомана (фиг. 7). Ротаметрите (RM3, RM4, RM5 & RM6) се използват, за да се контролират дебитите на потоците, разпръсквани в системата. На тръбите за газ са монтирани стерилни филтри (0.2 microm mesh), за да не попадат замърсявания в биореактора. Продуктът изтича от реактора през преливна система (фиг. 4). Чрез захранващата помпа се контролира времето за престой. Двата реактора (R1 и R2) са свързани с резервоара за младо пиво (WBT1), в който се събира прелялата течност. Специални събирателни резервоари от 501 се използват за събиране и обработка на продукта, ако е необходимо.

По-подробна схема и точните размери на 50-L експериментален биореактор са дадени в раздел 5.1.1. Данните за обработване и съхранение на пивната мъст са представени в раздел 5.1.2, докато пречистването и стерилизирането на системата за непрекъснато ферментиране се обсъжда в раздел 5.1.3. В раздел 5.1.4 е описан ферментационния процес, до който се отнася това изследване.

Конструкция на реактора и показатели

Биореакторът с работен обем 50-L, конструиран за това изследване, е изработен изцяло от 304 1 неръждаема стомана с 4 наблюдателни прозореца от плексиглас, разположени в корпуса на реактора така, че да може да се наблюдава движението на частиците и флуида. Материалът за конструкцията е избран заради устойчивостта му срещу санитарните химични вещества (каустик и киселина), както и поради издръжливостта си при санитарна обработка с пара. Друг важен аспект от конструкцията е сведеният до минимум директен контакт на приспособления с резба с ферментационната среда. Отворите са заварени, а когато е необходимо се използват фитинги. Реакторът е конструиран с разширен главен участък, за да се увеличи степента на отделяне на газ и по този начин да се осигури подобър пренос на течно-твърдата маса (Chisti & Moo-Young, 1993). Дънната част на реактора е конична с ъгъл на конуса 90°, за да се сведе до минимум събирането на твърди частици на

66230 Bl дъното.

Ha фиг. 2 са показани схематично експериментални системи с вместимост 50-L, които са инсталирани в експерименталната пивоварна на Labatt. Тази схема показва местоположението на входящия отвор за разпръскване на газ, входящия отвор за течност, гликолната охлаждаща риза, изпускателния отвор за продукта, сензорна и контролна система за температурата, както и местоположението на отворите за вземане на проби за санитарни цели.

На фиг. 3 е показан същият биореактор ГПСТ с дименсии в cm.

Фиг. 4 до фиг. 6 представляват подробни схеми на биореактор ГПСТ с вместимост 50 L, а фиг. 7 - схема на приспособлението за разпръскване на газ, използвано при тези експерименти.

Вътрешната смукателна тръба и сепараторът на частици са показани на фиг. 3. Съотношението на диаметъра на смукателната тръба към диаметъра на реактора е 2/3 и е избрано въз основа на литературни данни (Chisti, 1991). Сепараторът на частици е оразмерен така, че да осигурява по-добра сепарация на газа от твърдо-течната смес. Чрез увеличаване на диаметъра на сепаратора за частици (20,32 cm в сравнение с диаметъра на засмукващата тръба 10,16 cm) е възможно да се постигне по-голяма разлика между скоростта на издигане на мехурчетата и скоростта на спускане на течно-твърдия флуид. Ще се намали засмукването на газ в пръстена, разположен между цилиндричната и конична част на смукателната тръба на системата, в резултат на което ще се реализира по-добър пренос на твърдо-течната маса.

Конструиран е тръбен разпръсквател (фиг. 7) за газова смес от въглероден диоксид в участъка на смукателната тръба. Общо 160 отвори с диаметър 0,16 cm са пробити в тръбния разпръсквател с диаметър 1,27 cm. Отворите са разположени на разстояние в надлъжна посока 0,8 cm един от друг - от център до център, и в напречна посока, от център до център - 0,6 cm (8 реда от по 20 отвора). Тъй като смесването е първостепенна функция от разпръсквания газ, е избран диаметър на отворите 0,16 cm.

Протокол за обработване и съхраняване на пивнатамъст

При общоприетите методи за ферментация ливната мъст не се държи за голям период от време, без да се закваси с дрожди. Наситена с кислород пивна мъст е отлична среда за растеж на много организми, включително пивни дрожди. Тъй като изследването, свързано с непрекъсната ферментация в системи с газова подемна сила изисква да се държат големи количества дрожди, беше необходимо да се изследва пренасянето на пивна мъст и съхранението й. Мнение на изследователите е, че ненаситена с кислород студена пивна мъст би следвало да се съхранява до две седмици без да се замърси, ако пивната мъст се пренася до резервоарите за съхраняване по подходящ начин.

Необходимо е също така да се осигури подходящ контрол на температурата на пивната мъст в резервоара за съхраняване. Освен резервоарите за пивна мъст, бяха конструирани подходящи резервоари за експерименталната пивоварна, които да се използват за ферментационните процеси. Извършено е изпитване за възможността тези резервоари да поддържат необходимата температура. На фиг. 2 ясно е илюстрирано, че тези резервоари не могат да се използват без разбъркване, ако не се поддържа константна температура от 4°С. В началото пивната мъст се въвежда в тези съдове при температура 4°С. Измерванията на температурата се извършват в няколко точки на резервоара, за да се получи по-добра картина на действителната температура. Когато течността се остави в съда за 24 h без разбъркване, температурата на течността в близост до горната част се покачва приблизително до 24°С. В средата на резервоара температурата на течността също леко расте (□Т ~3°С), докато в конуса на съда остава близка до първоначалната температура от 4°С.

Чрез прилагане на леко разбъркване по време на впръскването на въглеродния диоксид с дебит 0,133 cm²/h в събирателния резервоар е възможно да се поддържа температура на пивната мъст 4°С. За целта в конусните дъна на двата резервоара за съхранение на пивна мъст са монтирани тръби с диаметър 2,54 cm за разбъркване на пивната мъст.

През тръбопровод от неръждаема стомана с диаметър 5.08 cm се пренася неаерирана пивна мъст от инсталацията Labatt, Лондон до буферен съд. От този съд пивната мъст преминава през пастьоризатор и се подава в резервоарите WT1 или WT2, където пивната мъст се

66230 Bl съхранява при температура 4°С за не повече от 2 седмици. Етапът на пастьоризиране се провежда на място като предохранителна мярка, осигуряваща елиминирането на нежелани микроорганизми в ливната мъст през целия период на съхранение. Чрез използване на ненаситена с кислород пивна мъст развалянето на топлата ливна мъст от кислорода (образуван от нечисти алдехиди), се свежда до минимум. В допълнение на това, с внасянето на въздух с разпръсквания газ може стриктно да се осъществява контрол на кислорода при непрекъснатата ферментация.

Измерванията за разтворен кислород в ливната мъст в резервоара за съхраняване се извършват един път. На фиг. 5.9 е показана зависимостта на концентрацията на разтворения в ливната мъст кислород в зависимост от продължителността на задържане. В първия пример пивната мъст е пренесена в резервоара и е започнало разпръскването на въглероден диоксид 0,085 m³/h), за да се осигури необходимото регулиране на температурата. Концентрацията на кислород в пивната мъст се увеличава до първия ден и достига стойност приблизително 1,3 mg/1, като впоследствие намалява приблизително до 0,1 mg/1. При втория случай преди напълването с пивна мъст резервоарът се продухва предварително с 0,85 m³/h въглероден диоксид за време 3 h. Началната висока концентрация на кислород рязко намалява и желаното съдържание на кислород в пивната мъст (< 0,1 mg/1) достига за 2 дни.

При последния опит резервоарът предварително се продухва, както е описано по-горе, и по време на пълненето на съда се извършва непрекъснато продухване (0,085 m³/h), както и през периода на съхранението на пивната мъст. Разтвореният кислород се поддържа на минимално ниво (< 0,1 mg/1) през цялото време на съхранение на пивната мъст. Този метод се възприема при всички изследвания, свързани със съхраняването на пивната мъст.

66230 Bl

---А---▲-------------------------
	• с разбъркване ▲ без разбъркване
▲ А
• · · ·	t *

I , ,. - . [—' — —τι --, - I I I

01234 5678

Място на измерването

I фигура 5.8 Ефект от разбъркването чрез разпръскване на газ в зависимост от температурата в цилиндрично-коничен резервоар за съхранение на пивна мъст. Пивната мъст се подава в съда при температура 4^АС. Измерванията са извършени 24 часа след напълване на съда. Въглеродният диоксид се разпръсква воъдасдябит 0.113cm3/h Тямпературата на _________________ обкръжаващата среда е 19,8*0. Местоположение на измерванията: (1) Горна част на резервоара при стената; (2) Горна част на резервоара в центъра; (3) Средата на резервоара-при стената; (4) Средата на резервоара в центъра;

(5) Горна част на конуса при стената; (6) Горна част на конуса в центъра; (7) Долна част на конуса.

66230 Bl

'****' Пивна мъст, в която се разпръсква 0,085 тЗ/h въглероден диоксид след напълван· на резервоара

Резервоар за пивна мъст, предварително продухан за 3 h е 0,85 тЗ/h газ

Резервоар за пивна мъст, продухван предварително и по време на пълненото

Фигура 5.9 Контролиране на разтворения кислород в пивната мъст по време на пренасянето й от инсталация в Лондон. Направена е оценка на три метода за пълнене, като третият е комбинация от първите два метода. Температурата на пивната мъст се поддържа на 4 и.

66230 Bl

5.1.2. Пречистване и стерилизация

Резервоарите за съхраняване на пивна мъст се подлагат на почистване, състоящо се от предварително промиване с гореща вода (85°C), промиване със сода каустик (40 % сода каустик при 60°С, последвано от промиване с гореща вода (85°С). Почистването на тези съдове се съпровожда от контактуването на стените с разтвор на пероцетна киселина (2 % (тегл/об)). Тръбопреносната система на пивната мъст се подлага на същия режим на почистване.

Биореакторите с вместимост 50-L се подлагат на различни пречиствания и стерилизации. Системите се промиват с гореща вода (60°С) и след това се напълват до върха с топла вода (40°С). След това към тази вода се прибавя почистващ агент Diversol СХ/А (DiverseyLever, Канада), за да се образува 2 % разтвор (тегл/ об). Откъм дъното на реактора се разпръсква въздух с повърхностна скорост 5 mm/s, за да се осигури добро разтваряне и необходимия контакт в обема на реактора. След 1 h време за контактуване реакторът се изпразва и се промива със силна струя свежа вода. Тези процедури по почистването се повтарят шест пъти, завършвайки с два последни цикъла пълнене със студена водаизпразване.

Резервоарът за младо пиво се почиства, като се използва 2 % (тегл./об.) разтвор на Diversol СХ/А. За разлика от биореакторите, не се използва разпръскване, тъй като WBT не е приспособен за разпръсквател. Прилага се механично разбъркване чрез търкаляне на съда. Цикълът се повтаря два пъти, последван от двукратно пълнене с вода-изпразване.

Преди стерилизирането с пара 50-L биореактори се свързват с резервоара за младо пиво, а захранващата тръба за пивна мъст се прекъсва, както и тръбата за разпръскване на газ. Вентилите, съответно клапаните V10, VII, V12, V13, V14, V15, V16, V17 и V18 са отворени, а филтрите F5, F6 и F7 са отстранени. Тръбата за газ и тези филтри се подлагат на стерилизиране под налягане поотделно за време 15 min при 21 °C. Парата се подава чрез крановете V12 и V16. Те се отварят бавно, за да се сведе до минимум възможността за повреда на екипировката, а температурата в реактора се наблюдава стриктно. Провежда се едночасова стерилизация, като вътре в реактора се достига температура 100°С. Клапаните, съответ но вентилите, V10, VI I, V14, V15 и V18 се затварят най-напред. След това подаването на пара се прекратява и стерилизираният филтър F7 се свързва. Стерилизираните филтри F5 и F6 незабавно се свързват към тръбата за подаване на газ и започва подаването на въглероден диоксид с повърхностна скорост от 3 mm/s. Този газов поток не само предпазва реактора от възникване на авария по време на охлаждане, но също така измества въздуха, присъстващ в 5 Οι биореактори с газова подемна сила.

Захранващата тръба за пивна мъст се свързва към биореактора след като се достигне вътрешна температура от 20°С. Чрез клапаните V2, V5, V10 и V14, които са в затворено положение, и клапаните V6, V7, V8, V9, VI1 и VI5, които са в отворено положение, подаването на пара се извършва или от V3, или V6, в зависимост от това, откъде се захранва пивната мъст. Цикълът на обработка с пара продължава 1 h, след което клапаните V9, VI1 и VI5 се затварят едновременно с подаването на пара. След като тръбите достигнат стайна температура (20°С), клапаните V3 и V6 се затварят и подаването на пара се преустановява. В този момент цялата система за непрекъсната ферментация, включваща резервоара за пивни дрожди, биореакторите с вместимост 50 1 и резервоара за младо пиво, са стерилизирани и са готови за провеждане на ферментацията.

5.1.3. Протокол за ферментацията

Експерименталните биореактори с газова подемна сила, снабдени със смукателна тръба (биореактори от типа ГПСТ) са с обем 50-L и се използват за ферментация на пивната мъст. Гликолна термична риза осигурява регулиране на температурата, като при всичките ферментационни експерименти се поддържа температура на течността 15°С. Всеки реактор е снабден с температурни детектори за измервателни цели и термодвойки, както и с автоматичен вентил с електромагнитно задвижване за регулиране на подаването на гликол към реактора. Ферментаторите с газова подемна сила също така са снабдени със средства за подаване на основен смесителен газ (въглероден диоксид или водород), както и със средства за захранване с въздух с цел дозиране на кислорода. Желаната газова смес се подбира чрез регулиране на комбинацията ротаметър/иглен вентил, след което газо

66230 Bl вата смес преминава през стерилен филтър (Millipore, Millex®, -FG₅₀,0,2 microm) и оттам в смукателната тръба на биореактора. В реактора се впръсква въздух с повърхностна скорост 0,39 mm/s (0.4 scfh) при всичките ферментации, докато дебитът на основния смесителен газ се регулира така, че да е подходящ за вида на конкретната имобилизация.

Преди да стартира непрекъснатият режим на работа биореакторът е газова подемна сила и обем 50-L се пуска в действие по установения начин за работа в периодичен режим. След почистването и стерилизацията, както е описано в раздел 5.1.2, биореакторът се напълва с 501 пивна мъст от резервоарите за съхранение на пивна мъст (WT1 или WT2), след което през стерилния отвор за пивни дрожди Scandi-BreW® в нея се инжектират 200 g пивни дрожди (4 g/Ι). Когато се използват гелни гранули от капа-карагенан, в реактора се инжектират 201 гелни гранули, е което се осигурява 4 g/Ι начална концентрация на средата от флокулиращи пивни дрожди LCC3021, с което се счита, че системата е регулирана за работа в непрекъснат режим.

Ферментационната среда (пивна мъст) се зарежда в непрекъснат режим през дъното на реактора, докато “зеленото пиво” се излива през фуниеобразен отвор, разположен в горната част на реактора. Тъй като работният обем на реактора е константна величина, с определянето на дебита на подаваната в реактора свежа пивна мъст, се регулира средното време на престой на течността в реактора. През изпускателния отвор и с помощта на стерилен клапан (Scandi-Brew®) ежедневно от реактора се източват проби от течността за химични и микробиологични анализи (използват се методи, описани в Глава 4).

На определени периоди от време продуктът, получен в резултат на непрекъснатата ферментация, се отвежда от биореактора с обем 501, където се провежда главната ферментация, събира се в 40 1 стерилни бидони от неръждаема стомана и се подлага на следферментационна обработка за получаване на крайния продукт - продаваемо пиво, което се подлага на оценка и се сравнява с контрола от промишлено произведено пиво.

Избраният 50-L биореактор се изключва от резервоара за младо пиво и незабавно се свързва със събирателния съд за пиво. След ка то желаното количество пиво се събере, биореакторът се свързва отново с резервоара за младо пиво. Събраното “зелено” пиво се подлага на следферментационен период на задържане, за да се намали нивото на течния диацетил под 30 microg/Ι. Пренесените с течността пивни дрожди се утаяват и течността (концентрация на клетки 1-5 милиона клетки/ml) се прехвърля в студен съд за отлежаване (7 дни при 2°С). След периода на отлежаване течността се филтрува, разрежда се до съдържание на алкохол 5 об. % и се подлага на карбонизация преди изливането й в бутилки от 341 ml. Бутилираната течност се подлага на пастьоризиране в инсталация на Labatt.

5.2. Непрекъснат метод за получаване на гранулиран гел

Обект на този раздел е експериментална работа, въз основа на която да се направи оценка на непрекъснат процес за получаване на гранулиран гел с инокулирани пивни дрожди с цел подаване на имобилизирани клетки от дрожди LCC3021 към тръбните биореактори с газова подемна сила и обем 50 1, описани в раздел 5.1 и работещи в непрекъснат режим.

Производственият процес (фиг. 8) включва образуване на емулсия от неводна еднородна фаза (растително масло) и диспергирана във вода фаза (разтвор на гел от капа-карагенан, смесен с дрождеви клетки), при което се използват статични смесители. След този етап се прилага рязко охлаждане, за да се предизвика образуване на гел от полимера. Образувалите се гранули след това се поставят в разтвор на калиев хлорид, който способства за втвърдяването на гранулите и отделянето им от маслената фаза.

Образуването на емулсия от гранулиран гел от капа-карагенан се извършва при температура 37°С, която се поддържа на водна баня, за да се предотврати преждевременното желиране на гела от карагенан. Стерилизираният полимер се държи при температура 37°С с помощта на водна баня с регулируема температура, а дрождевият инокулат се държи при температура 20°С преди имобилизирането. С помощта на перисталтични помпи Masterflex (Cole Parmer Company, САЩ), гелът и пивните дрожди се нагнетяват през 24 елемента с диаметър 6,4 mm в статичен смесител, където клетките се диспергират равномерно в гела. С помощта на перисталтич66230 Bl на помпа Masterflex стерилизираното масло, съхранявано при стайна температура, се прехвърля в съд с гореща водна баня, за да достигне температура 37°С.

Инокулираният полимер (водна фаза) след 5 това се смесва с маслото (еднородна фаза) чрез друга група статични смесители, за да се получи желаната емулсия. Тази емулсия се охлажда рязко до 5°С в баня от вода/лед, в резултат на което полимерните капки желират в гранули. След това гранулите се поставят в разтвор на калиев хлорид с концентрация 22 g/Ι, който увеличава здравината им и осигурява отделянето им от маслената фаза. Това масло рециркулира обратно към резервоара за масло, а водната фаза (гранулите и разтвора на калиев хлорид) се прехвърлят в отделен съд за извършване на класификация по размери, след което се подават към биореакторите с обем 501.

5.2.1. Статични смесители от типа Kenics В основата на този нов процес за получаване на гранули са статичните смесители от типа Kenics (Cole Parmer Instrument Company, Niles, Илиноис, САЩ). Те са конструирани от серия разположени в тръба стационарни елементи с вътрешен диаметър, еквивалентен на диаметъра на статичния смесител. Тези елементи оформят напречни канали, които спомагат за разделянето и повторното смесване на течния поток, преминаващ през статичния смесител. С тази система на смесване се постига напречно разкъсване на тези фини струйки и превръщането им във все по-хомогенна емулсия. В Таблица 5.2 са дадени три вида статични смесители, които се използват в това изследване.

Таблица 5.2 Показатели на използваните статични смесители (доставяни от Cole Parmer)

Модел	Диаметър D (mm) на статичния смесител	Число на елементите (Nr)
G-04667-04	6,4	12
G-04667-06	9,5	12
G-04667-08	12,7	12

5.2.2. Материали за производство на гел

Двата основни материала при производството на гранулиран гел са масло и полимер, ка па-карагенан (от вида Х-0909, lot 330360, Copenhagen Pectin, Дания), който е полизахари ден полимер, екстрахиран от червени водорасли, ни беше предоставен от Copenhagen Pectin A/S. Този полимер притежава уникални свойства термо-желиране, при което неговата температура на желиране зависи от концентрацията на капа-карагенан и на калиевия хлорид [КС1].

Полимерът се разтваря при температура 80°С в дестилирана вода, съдържаща 2,0 g/1 of КС1 до достигане на концентрация 30 g/Ι. Полученият разтвор на гел има температура на желиране 28°С. Телът се подлага на обработване в автоклав за време 1 h при 121 °C, след което се поставя на водна баня с температура 40°С, за да не се втвърди. Царевично масло, промишлено производство (Pasquale Bros. Inc., Канада), също така се стерилизира за 1 h при 12ГС, след което се съхранява при стайна температура 20°С докато влезе в употреба. Пивните дрожди се приготвят, както е описано в раздел 4.1.

5.2.3. Измерване на диаметъра на гранулите

Проби от гранулите се поставят в колби, съдържащи 100 ml разтвор на КС1 с концентрация 22 g/Ι. Гранулите се остават потопени в този разтвор за време 2 h, за да се повиши тяхната твърдост. Маслото се отстранява от водната фаза чрез промиване с разтвор на калиев хлорид. След това пробите се съхраняват при температура 4°С, за да се предотврати микробно замър50

66230 Bl сяване преди провеждането на анализите.

Измерването на диаметъра на гранулите се извършва, като за целта се използва софтуер за образен анализ Optimas (Version 4.02, BioScan, Inc. САЩ), снабден с видеокамера Optimas (Version 4.02, BioScan, Inc, USA). Проба от гранули се поставя в блюдо на Петри, покрито с фин воден филм (използван за отделяне на гранулите една от друга), след което блюдото се поставя под камерата. При използването на тази система се измерват общо 300 до 400 гранули. Възможностите на софтуера Optimas са от 100 microm до няколко mm при максимална абсолютна грешка 30 microm. Получените от Optimas данни се анализират, като за целта се използва Microsoft Excel. Полученото разпределение по размери на пробите се характеризира чрез среден диаметър на пробата (D_B) и коефициента на неравномерност (COV).

5.2.4. Оценка на гранулите - експериментален план

Сравнявани са статични смесители с три диаметъра (D_s = 6,4 mm, 9,5 mm и 12,7 mm), за да се определи какъв вид съвкупност от гранули би трябвало да се получи като се измерва средният диаметър на гранулите на пробите и коефициентът на неравномерност по отношение разпределението по размери. Броят на елементите (Ν_}) на статичните смесители се изменя от 12 до 120, докато обемът на полимерната фракция (Ос) е между 8,3 % (об/об) и 50 % (об/об) гел в масления разтвор. При епсилон, над 50 % диспергираната фаза (гел) и еднородна фаза (масло) стават инверсионни, т.е. включения от маслени капчици в полимерната матрица вместо гелни капчици в маслената матрица. Повърхностната скорост на течността на емулсията масло/гел през участъка на емулсията се регулира в границите от 3,6 cm/s до 17,8 cm/s. Повърхностната скорост на течността (V_SL) през статичния смесител се изчислява по следното уравнение:

^v._5LW ⁺ QJ/s, където S е площта на напречното сечение на тръбичките, които са разположени в статичния смесител, Q_oil е обемната скорост на потока от маслена фаза и Q_car е обемната скорост на разтвора от гелния карагенан.

Резултати и обсъждане: ферментации и динамика на смесване в биореактори с газова подемна сила и вместимост 501

Използването на имобилизирани клетки за производството на етанол е публикувано. През последните две десетилетия изследванията са насочени към оптимизиране на производството на етанол чрез съчетаване на технологията на имобилизираните клетки с непрекъснатото производство (Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella, 1983). Много от тях имат големи успехи и използването на непрекъснатите системи с използването на имобилизирани клетки в производството на етанол стана промишлен процес. Но реализирането на такъв непрекъснат процес в главната ферментация на пивото в пивоварната промишленост не е така просто. Пивото не се състои само от етанол, но също така и от голям брой ароматни съединения, които създават усложнения. В следващата глава са описани получените от автора резултати при производството на пиво в експериментален ферментатор от типа ГПСТ.

6.1. Периодични ферментации в експерименталната система от типа ГПСТ

Периодичните ферментации, при които се използват свободно суспендирани дрождеви клетки, се провеждат в експериментален тръбен биореактор с газова подемна сила и обем 50 1. Тези експерименти осигуряват благоприятна възможност за определяне на осъществимостта при използването на такава система за ферментация с пивни дрожди до получаване на пиво. В допълнение на това, тези експерименти служат за база за сравнение с непрекъснатите ферментационни процеси на течности. Две периодични ферментации са проведени в биореактор с обем 50 1, при което е използван щам за получаване на пиво от типа лека бира от културалната колекция на Labatt (LCC3021). През цялото време на ферментациите са наблюдавани скоростта на растеж на пивните дрожди, както и консумация на хранителна среда.

На фигури 6.1 и 6.2 са представени концентрацията на пивни дрожди и жизнеспособността при ферментацията съответно на партида 1 и партида 2. И в двата случая растежа на дрождите съответства на известните скорости на растеж, посочени в литературата. Жизнеспособността, измерена с помощта на метиленово синьо, остава през цялото време висока и е със стойности, близки до 90 %. Концентрацията на въглехидрати за партида 1 и партида 2 са представени на фигури 6.3 и 6.4. На първо място от

66230 Bl дрождите са поети монозахариди, глюкоза и фруктоза, последвани от изразходването на малтоза и малтотриоза. Нивото на малтотетрозата, както и на полизахаридите, остава непроменено по време на ферментацията.

Етанолът е един от най-важните вторични продукти при метаболизма на дрождите. Анаеробна ферментация при оптимални условия произвежда около 48 g етанол и 47 g въглероден диоксид на 100 g метаболизирала глюкоза. Също така ще се получат малки количества глицерин (3,3 g на 100 g глюкоза), като този вторичен продукт участва в поддържането на редокси баланса във ферментиращите дрожди, както и поддържането в клетките на осмотичния баланс, по-специално в хипертонична среда. Фигура 6.5 и фигура 6.6 илюстрират изменението на концентрацията на етанол и глицерин в зависимост от продължителността на ферментацията. Нивата на съдържание на етанол нарастват много бавно при започването на ферментационния процес поради присъствието на кислород във ферментационната среда, тъй като дрождевите клетки са във фазата на аеробен растеж. След като кислородът се изчерпи, нивата на етанола нарастват експоненциално, докато ферментируемите захари се изразходват, и в тази точка концентрационните нива започват да падат.

Висшите дикетони също са много важни вторични продукти при метаболизма на дрождите. Концентрациите общо на диацетил и пентандионите за партидите 1 и 2 са дадени на фигури 6.7 и 6.8. Тези вещества нарастват приблизително до 40 h във ферментационната среда, като съответстват на пиковите нива на концентрациите на дрожди, и са резултат от синтеза на аминокиселини, които дрождите произвеждат по време на фазата на растеж. По време на последната порция за ферментация диацетил, пентандион и техните прекурсори алфа-ацетолактат и алфа-кетобутарат се превръщат съответно в техните по-малко ароматни активни диоли.

От представените в този раздел резултати е ясно, че двете периодични ферментации са протекли нормално в биореактора с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Растежът на дрождите и повишаването на въглехидратите протичат по очакван начин, както и на вторичните продукти, етанол, диацетил и пентандион. Сравняването на показателите на партидите показва, че двете ферментации са протекли по подобен начин. На фигура 6.9 е направено сравнение на концентрацията на етанол за партидите 1 и 2. Конкретните криви за съответните партиди имат един и същи профил в много от точките, при това отчасти се покриват една с друга, като по този начин показват степента на повторяемост. Въпреки че последователността на консумация на субстратите и последващия добив на продукти не се променя в системата с газова подемна сила, скоростта на ферментация е различна. Завършването на главната ферментация, представено чрез пиковата концентрация на етанол, се достига и при двете партиди за около 80 - 85 h.

Редукцията на диацетил под 30 microg/1 се достига допълнително за 20 h. Тези резултати подсказват, че главната ферментация на пивна мъст с високо качество би могла да завърши за около 100 h, като за сравнение класическата периодична главна ферментация за получаване на леко пиво е 120 - 168 h. Разбъркването, което се извършва в биореактора от типа ГПСТ допринася за намаляване на времето за ферментация поради увеличаването на преноса на маса, което се осигурява от такива системи. С помощта на тази информация са проведени бъдещите ферментационни експерименти с увереност, че биореакторът от типа ГПСТ не променя съществено метаболизма при ферментацията на дрождите и че ферментирането със свободно суспендирани дрожди в системата би могло да намали продължителността на периодичната ферментация с поне 20 h.

Π Λ

66230 Bl

З.ООЕ+Ов гвоЕ*ов Σοοε+οβ

1.60Е+ОВ tooe+fle β.οοε+ΰζ Ο,ΟΟΕ+ΟΟ

Предължипетают на ферментацията (h) ]-А- кяицентищия на клеткиЖщиеопвер<ни8т|

Фигура 6.1 Обща концентрация на клетките и жизнеспособност в зависимост ет продължителността на ферментацията е дрожди LCC3021 на партида 1, проведена в експериментален бивроактор от типа ГПСТ.

ιοοε+οβ

2.60ЕМИ

5^ 2.00Е-НИ I 1.60Е40В g Б.ООЕ-НУ?

O.OOE+OQ

Концентрация

Продължителност нв ферментацията (h)

фигура 6.2 Обща концентрация на клетките и жизнеспособност в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида 2, проведена а експериментален биореактор от типа ГПСТ.

66230 Bl

-е-	Полизахариди	а	Малтатриоза
малтотпроза
-е-	Малтоза	—А— Фруктова	—Ф— Глюкоза

Фигура 6.3 Концентрация на въглехидрати в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида 1, проведена в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

Полизахариди-в- Малтоготроза Малтотрйой

Мангова - фруктоза Ό Глюкоза

Фигура 6.4 Концентрация на въглехидрати в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3O21 на партида

2, проведена в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

66230 Bl

Фигура 6.5 Концентрация на етанол и глицерин в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида 1, в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

проведена

Етанол --О Глицерин фигура 6.6 Концентрация на етанол и глицерин в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида проведена в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

66230 Bl

Дивилия-·- Пентандион фигура 6.7 Концентрация на диацетил и пентандион в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида 1, проведена в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

-В— Дшнртл-В— ПвтандиоиФигура 6.8 Концентрация на диацетил и пентандион в зависимост от продължителността на ферментация с дрожди LCC3021 на партида 2, проведена в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

6( Bl

♦ rtapnualO Партмдаг фигура 6.9 Сравнени· между партида 1 и партида 2 по отношение на концентрацията на етанол в зависимост от продължителността на ферментацията. Дрожди LCC3O21 са използвани в експериментален биореактор от типа ГПСТ.

6.2. Имобилизирани носители

По време на изследването бяха изследвани няколко носители, за да се определят най-добрите алтернативи за бъдеща изследователска работа. Изследвани са три различни начини за имобилизиране в биореактор от типа ГПСТ с обем 501. Направена е оценка на два адсорбиращи носители, които са достъпни търговски продукти и имат размери между 1 и 2 mm. Siran®, стъклен гранулиран носител, доставян от Schott Engineering (фиг. 9), и Celite®, гранули от диатомит (кизелгур), доставяни от World Minerals (фиг. 10), са изследвани поради лесното им съхраняване и достъпност като търговски продукти. Носителите на базата на адсорбция осигуряват подходяща възможност за повече асептични операции, тъй като реакторът най-напред може да се зареди с носителя, след което да се извърши стерилизация на място и накрая дрождите да се инокулират директно в реактора. От гледна точка на промишленото използване тази опция е много атрактивна, тъй като носителят не изисква специално съхраняване и инсталацията няма да има съществена промяна в начините на инокулиране.

Първоначалните резултати от ферментацията в биореактора от вида ГПСТ с обем 50 1 с използване на тези два носителя бяха неблагоприятни. Възникналите проблеми се дължаха главно на високите плътности на частиците на Siran® и Celiez® в сравнение с течната среда. Системите с участие на три фази в смукателната тръба и използване на газова подемна сила работят по-добре, когато съотношението между плътностите на носителя и течността се поддържа близко до единица. В случая, когато се използва Siran®, това съотношение е 1,34, а при използването на Celiez® тази стойност е 1,31. Резултатът от такива високи разлики в плътностите на твърдата и течната фази е значително увеличаване на минималната стойност на скоростта на газовото флуидизиране, която е необходима за работата на биореактор от типа ГПСТ с обем 50 1. За 4 1 носител от Siran® (8 % (об/об) зареждане на твърди частици), за да се постигне циркулация се изисква скорост на газа от 21,5 mm/s (на базата на диаметъра на смукателната тръба). Тази по-висока скорост на газа не е съ50

66230 Bl ществен проблем, когато изпитването се провежда във воден разтвор, но щом като течната среда е пивна мъст, в системата от типа ГПСТ настъпва повреда с катастрофални последици. Необходимата скорост на газа причинява прекомерно разпенване в реактора, което в крайна сметка намалява нивото на течността под смукателната тръба, като по този начин спира циркулацията на течната и твърдата фази. Неизправност, подобна на описаната по-горе при използването на Siran®, се наблюдава и когато се използва Celiez® в качеството на материал за имобилизиране. Поради тези резултати при следващите опити за ферментация с използване на газова подемна сила се отказахме от тези два носители на базата на адсорбция. Използването на носител на базата на захващане, като например капакарагенан, позволява системата да се зарежда с твърди частици на 40 % (об/об), като са необходими около 0,17 стандартни кубични метри на час газ (5,8 mm/s повърхностна скорост на газа) за осъществяване на флуидизирането и последващата циркулация. Положителните резултати се обясняват с работата на системата с гранули от захванати в карагенан дрождеви клетки, при които в резултат на по-ниската плътност на носителя (около 1100 kg/m³) флуидизирането е по-лесно. Също така се постига желаното подаване на твърди частици от самоагрегиращ щам LCC 3021 (със средна флокулираща способност) и LCC290 (свръхфлокулант) и използване на скорости на газа за флуидизиране приблизително 3 mm/s, които са необходими за осигуряване на циркулация. В раздел 6.2.1 е описан по-подробно гелния носител от капа-карагенан, а в раздел 6.2.2 - самоагрегиращите се флокулати от пивни дрожди LCC3021 и LCC290, които са оценявани като имобилизирани матрици за непрекъсната главна ферментация във ферментатор от типа ГПСТ с обем 501.

6.2.1. Гелни гранули от капа-карагенан

Методите за имобилизиране на базата на захващане изискват включване на дрождевите клетки в матрицата преди въвеждането им във ферментационния съд. Тъй като инокулирането in-situ в реактора не беше осъществимо, беше необходимо гелните гранули да се получат преди започването на ферментацията. Все още не е ясно какъв ефект е оказал дългият период на съхраняване на гелните гранули върху инокулирането.

За да се сведат до минимум потенциални негативни ефекти вследствие съхраняването на гранулите, беше решено да се произведат големи количества гелни гранули в рамките на кратък период от време (8 h). За тази цел беше използван метода за получаване на гранули с използване на статичен смесител, описан в раздел 5.2. Идеалните гранули биха били с диаметър на частиците (D_B) между 0,8 mm and 1,4 mm и минимален коефициент на неравномерност (COV) на разпределението по размери. Необходимо е да се регулират няколко параметри при изготвянето на гранулите, за да се получи желаното количество и стабилност на гранулите. В следващия раздел е представено кратко описание на избора на параметри при получаването на гранули, а в раздел 6.2.1.2 са описани гранулите, които са използвани при опитите за непрекъсната ферментация.

6.2.1.1. Метод за производство на гранули: избор на параметри

Охарактеризирането на метода за изготвяне на гранули се предприема съвместно с други изследвания, като се придава особено значение на следните параметри на процеса: диаметър на стационарния смесител (D_s), брой на елементите на стационарния смесител (Ns), повърхностна скорост на потока от течност (V_SL) и обем на полимерната фракция (епсилон_с). На фигури 6.12 до 6.21 са показани резултатите, получени в резултат на експериментите.

На фиг. 6.12 е показано типичното разпределение по размери, което е получено при използването на статичен смесител за имобилизиране на дрожди в гел от карагенан. В този пример се използват следните параметри: диаметър на стационарния смесител 12,7 mm, брой на елементите на стационарния смесител - 60, повърхностна скорост на потока от течност 10,5 cm/s и обем на полимерната фракция - 0,25. Средният диаметър на гранулите е 701 microm с коефициент на неравномерност 45 %. Кумулативното разпределение по размери е илюстрирано на фигура 6.13, което отговаря на нормалното кумулативно разпределение по размери, изчислено чрез средната стойност на пробите и стандартното отклонение. Методът на Смирнов (Scheaffer et McClave, 1990) е използван за изпитване на нормалното състояние. Максималната разлика между експериментал

66230 Bl ните данни и подходящите за целта данни беше изчислено на 0,0274. Изменената стойност за D съответства на данните, следвайки нормално разпределение, което трябва да е под 0,895 при 95 % граница на достоверност. В нашия случай стойността на измененото D е изчислена на 0,174, което е под лимита от 0,895, и от това може да се направи заключение, че нашите показатели съответстват на едно нормално разпределение. Всички събрани данни от този метод за изготвяне на гранули показва разпределение по размери само с един пик. Ponce let et al. (1992) обаче показват появата на съпътстващи пикове и/или вторични пикове, които съответстват на гранули с диаметри, по-малки от 200 microm, за алгинатни гранули, получени чрез диспергиране в съд чрез разбъркване. Възможно е по-малките гранули, получени в резултат на нашия метод, да се изгубят по време на промиването на гранулите, и следователно да не присъстват в данните за разпределението по размери.

Въздействието на повърхностната скорост на течността и диаметъра на статичния смесител върху средния диаметър на гранулите и върху коефициента на неравномерност са показани съответно на фигури 6.14 и 6.15. Средният диаметър на гранулите намалява с увеличаването на повърхностната скорост на течността и за трите размера на диаметрите на статичния смесители с по-ясно изразен ефект при статичния смесител с диаметър 12,7 mm. Гранули със среден диаметър, по-голям от 700 microm, не могат да се получат в статичните смесители с по-малък диаметър (6.4 mm и 9.5 mm) при всички изпитвани скорости, докато в статичния смесител с диаметър 12,7 mm се получават гранули, по-големи от 700 microm при скорост на течността под 11 cm/s. И в трите статични смесители се получават гранули с коефициент на неравномерност между 38 % and 58 %. Вижда се също, че когато скоростта се увеличава, коефициентът на неравномерност намалява и при трите случая. Коефициентът на неравномерност се изменя с изменението на диаметъра на статичните смесители, като най-ниските стойности се получават при статичния смесител с най-малък диаметър.

При повърхностна скорост на течността от 3.5 cm/s обемът на полимерната фракция оказва влияние върху средния диаметър на гранулите, докато при скорост над 7 cm/s няма разлики в експерименталните стойности на епсилон_с и те варират между 0,083 и 0,5 (Фигура 6.16). Вижда се, че има малък ефект или няма такъв върху коефициента на неравномерност в зависимост от обемната фракция на полимера с увеличаването на повърхностните скорости (Фигура 6.17).

Фигури 6.18 и 6.19 илюстрират въздействието на повърхностната скорост на течността и броя на елементите на статичния смесител върху средния диаметър на гранулите. При увеличаване на скоростта на течността средният диаметър на гранулите намалява при всички статични смесители с различен брой елементи (Фигура 6.18). Средният диаметър на гранулите при дадена скорост на течността е подобен при брой на елементите от 24 до 120 елемента, докато при конфигурацията от 12 елемента получените диаметри на гранулите са по-големи в сравнение с останалите пет конфигурации. Фигура 6.19 показва също така, че средният диаметър на гранулите се достига при статичен смесител с минимум 24 елемента.

фигура 6.20 показва въздействието на повърхностната скорост на течността върху коефициента на неравномерност за няколко статични смесители с различен брой елементи. Вижда се, че скоростта на течността не оказва влияние върху коефициента на неравномерност за всички изпитвани конфигурации. Влиянието на броя на елементите на статичния смесител върху коефициента на неравномерност е по-ясно изразен (фигура 6.21). Коефициентът на неравномерност намалява с увеличаването на елементите на статичния смесител и достига минимум 45 % при 60 и повече елемента. Тези резултати са консистентни за повърхностни скорости в границите от 3,6 cm/s до 17,8 cm/s.

Може да се предположи, че едно увеличение на диаметъра (D_;) на статичния смесител ще създаде хетерогенност на силата на срязване в смесителя, което ще доведе до увеличаване на размерната дисперсност, което се измерва чрез коефициента на неравномерност. Едновременно с това, увеличаването на D_s би намалило интензивността на силата на срязване, като с това ще се увеличи средният диаметър на гранулите. Тези два ефекта се наблюдават при провеждането на експерименти със статичния смесител с най-малкия размер, с който се получават гранули с наймалък среден диаметър (400 microm - 500

66230 Bl microm) и най-малкия коефициент на неравномерност (приблизително 40 %) или най-малката размерна дисперсност.

Необходимата енергия за получаване на емулсия е пропорционална на площта на разделителната повърхност между полимера и маслената фаза. При по-малки размери на гранулите се изисква по-голяма енергия за образуване на емулсия. Berkman и Calabrese (1988) са посочили, че увеличаването на средната повърхностна скорост (V) на течността води до увеличаване на енергията на разсейване на единица маса от флуида, като по този начин се благоприятства намаляването на размера на гранулите. Увеличаването на средната повърхностна скорост на течността (изпитвана между 3.6 cm/s и 17.8 cm/s) води до намаляване на средния размер на гранулите. Такава скорост увеличава разликата в налягането между входящия и изходящия отвор на статичния смесител. Разликата в налягането е пропорционална на енергията на разсейване на единица маса от течността. Поради това с увеличаване на скоростта се увеличава и енергията на разсейване в системата, което благоприятства намаляването на размера на гранулите. Намаляването на диаметъра на гранулите D_B се наблюдава с увеличаването на повърхностните скорости на течността. Taweel и Walker (1983) са показали, че се установява динамично равновесие между формирането на гранули и коалесценцията между гранулите при големите скорости, които отговарят на значителни турбулентни нива. За константни стойности на диаметъра (D_s) на статични смесители и броя на елементите (N_s) повърхностната скорост има малък ефект върху коефициента на неравномерност. Поради това скоростта е параметър, който позволява управление и избор на средния диаметър на гранулите, без да се модифицира съществено размерната дисперсия.

В обхвата на това изследване е установено, че обемната гелна фракция от карагенан (епсилон.) има малък ефект върху средния диаметър на гранулите или върху коефициента на неравномерност с изключение на най-ниската изпитвана скорост от 3,6 cm/s, при която средният диаметър на гранулите намалява с намаляването на (епсилон,). Audet и Lacroix (1989) изследват този параметър при производството на гранули от карагенан в двуфазна дисперсна система (съд с разбъркване и периодично действие, не се използва статичен смесител с непрекъснато действие) и те правят заключение, че епсилон_с не оказва влияние върху средния диаметър на гранулите при полимерен разтвор с концентрация на карагенан 3 % (тегл/об). Конкретният ефект от концентрацията на гела от капа-карагенан върху разпределението по размери на гранулите е изпитан от Audet и Lacroix (1989), които посочват, че този параметър оказва силно влияние върху разпределението по размери. Увеличаването на концентрацията на гела води до увеличаване на средния диаметър на гранулите (D_B) и коефициента на неравномерност (COV). Посоченият ефект се обяснява с увеличаване на вискозитета на гела при по-високите концентрации, което има за резултат по-малки сили на срязване в емулсията, а с това и поголеми гранули. Въпреки че влиянието на концентрацията на гела върху размера на гранулите не е изследвана в тези тезиси, биха могли да се използват други средства за регулиране на размера на гранулите, ако това е необходимо.

При увеличаване на броя на елементите (Ns) се увеличава средното време на престой на флуида в статичния смесител, в резултат на което се постига по-хомогенна смес, а с това и образуване на по-малки и по-добре диспергирани гранули. При експерименталната работа равновесно състояние в дисперсията (измервано чрез коефициента на неравномерност) се достига при около 60 до 72 елемента. Middleman (1974) посочва, че 10 елемента са достатъчни за постигане на равновесно състояние при емулсия с нисък вискозитет (0,6 to 1,0 cP). Разтворът на карагенан, използван при тези експерименти [3 % (тегл/об)] има среден вискозитет 200 cP, а вискозитетът на маслото е 25 cP. В резултат този по-висок вискозитет изисква по-дълго време за престой в смесителя, за да се постигне псевдо-хомогенност.

66230 Bl

фигура 6.12 Разпределени· по размери ни гранули, получени при използването на статичен смесител. Технологичните параметри в ТОЗИ експеримент са: Of = 12,7 mm, « ¢0, ^c 10,5 em/e и CC· 0,25.

| ♦ EwiwwinMHii дамин 0 Chwmiiewp p—npenwnwiw j

Фигура 6.13 Кумулативно разпределение по размери на гранули, получени при използването на статичен смесител. Технологичните параметри в тми експеримент са: Of 12,7 mm, N_f 60, V*. = 10,5 crti/s и = 0,25.

66230 Bl

|e оизд,7 м

Фигура 6.14 Повърхностна скорост на точността (cm/в) а зависимост от средния диаметър на гранулите (pm). Направена е оценка на три различни оптични смесители (D 12,7 mm, 9,6 mm и 6,4 mm). Броят на елементите на статичните смесители (Nj) е постоянна величина 40, а полимерната фракция (£,. ) се поддържа на стойност 0,25.

|» Оема.7 а θίέ.6 аРтбл] фигура 6.15 Повърхностна скорост на течността (cm/β) в зввиоимост от коефициента на меравномерност на диаметъра на гранулите (%). Направена е оценка на три различни статични смесители (0^ 12,7 mm, 9,5 mm и 6,4 mm). Броят на елементите на статичните смесители (N/) е постоянна величина - 46, а полимерната фракция (έ*) се поддържа на стойност 0,25.

66230 Bl

Фигура 6.16 Повърхностна скорост на течността (сш/а) в зависимост от средния диаметър ма гранулите (pm) Направена е оценкана четири полимерни фракции ( f_e в 0,5, 0,25, 0,125 и 0,083). Броят на елементите на статичните смесители (Nf) е постоянна величина - 48, и диаметърът на статичните смесители (Dj) е 12,7 mm.

[•fOJ ВНИД AecOLffl **чниз

Фигура 6.17 Повърхностна скорост на течността (οιη/а) в зависимост от коефициента на неравномерност на диаметъра на гранулите (%),Направена е оценка на четири полимерни фракции ( ξ, = од 0,25, 0,125 и 0,083).

Броят на елементите на статичните смесители (N0 е постоянна величина 46, а диаметърът на статичните смесители (□$.) е 12,7 mm.

66230 Bl

♦N»«12 N»=24 Д №*48 Д №60 □ N»«72 Ο N»*120 фигура 5.18 Повърхностна скорост на течността (cm/a) в зависимост or диаметъра на гранулите (pm). Броят на моментите на статичните смесители (N$) » изменя на 12, 24, 4В, 60, 72 и 120 броя. Полимерната фракция (ф) се поддържа константна - 0,25. а диаметърът (D_ff) на статичните смесители е 12,7 mm.

[♦ NmH2 е НИ34 A NrMQ 4 Ο №-72 e МеМИ) | фигура 6Л9 Повърхностна скорост на течността (cm/а) в зависимост от коефициента на неравномерност на диаметъра на гранулите (pm). Броят на елементите на статичните смесители (N$) се изменя на 12, 24, 48, 60, и 120 броя. Полимерната фракция (^?) се поддържа константна 0,25, а диаметърът (Dgj на статичните смесители е 12,7 mm.

66230 Bl

1V8L-7J aVBL^10.0 « Wt>113 QVeiM7.S фигура 6.20 Среден диаметър на гранулите (pm) в зависимост от броя на елементите на сташчните смесители (Ν$·). Повърхностна скорост на течността (сщ/а) се изменя на 3,6, 7,0, 10,в, 13,2 и 17,8. Полимерната фракция (£,) се поддържа константна - 0,25, а диаметърът (D_s) на статичните смесители е 12,7 mm.

♦У8Ь^е«№дХ0 ДУ86*1М #ж>112 a VSL-17.a | фигура 6.21 Коефициент на неравномерност на диаметъра на гранулите (%) в зависимост от броя на елементите на статичните смесители (N_s). Повърхностна скорост на тешостта (cm/s) се изменя ма 3,6 и 17,8. Полимерната фракция (Q) се поддържа константна - 0,25, а диаметърът (D?) на статичните смесители е 12,7 mm,

66230 Bl

6.2.1.2. Метод за производство на гранули: характеристики на гранулите от капа-карагенан

От представените в предидущия раздел данни е възможно да се направи избор на параметрите на процеса за производство на гранули 5 с оглед получаване на гранули с желани характеристики за провеждане на ферментационните опити. За свеждане на коефициента на неравномерност до минимална стойност за конкретен диаметър на статичния смесител са избрани 60 сме- 10 сителни елемента за получаване на дисперсия масло/гел.

Избрани са гранули със среден диаметър приблизително 1 mm, за да се сведе до минимум външния пренос на маса и за да се улесни 15 сепарацията от ферментиращата течност чрез механични средства. За постигане на това е изпитан най-големият стационарен смесител (12.7 mm) и е избрана най-ниската изпитвана скорост (3,6 cm/s). Тъй като полимерната фракция оказ- 20 ва малък ефект върху коефициента на неравномерност, беше използвано съотношение на гел към масло 50/50 (епсилон = 0.5), за да се увеличи производителността до възможния максимум.

В лабораторията бяха произведени няколко партиди гелни гранули от захванати дрожди LCC3021, като за целта е използван методът, описан в раздел 5.2, със следните параметри: D = 12,7 mm, Ns = 60, V_SL = 3,9 cm/s и епсилон. = 0,5. Получените гранули (фиг. 11) преминават през серия от сита, за да се отстранят гранулите с диаметър, по-голям от 2,0 mm и по-малък от 0.5 mm. Разпределението по размери на получените частици е представено на Фигура 6.23. Фигура 6.24 илюстрира кумулативното разпределение по размери на тези гранули. Това е типично разпределение, което се използва при всичките опити на ферментация в реактори с газова подемна сила и обем 501.

Фигура 6.23 Разпределение по размери на гелни гранули от к-карагенан в опитите за непрекъсната ферментация в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба.

66230 Bl

фигура 6.24 Кумулативно разпределение по размери на гелни гранули от к-карагенан в опитите за непрекъсната ферментация в 50-L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба.

6.2.1.3. Оптимизиране на метода за получаване на гранули с оглед използването му в промишлен мащаб

Изследван е и е осъществен в експериментален мащаб метод за производство на 101 гранули на час с помощта на статичен смесител. Няколко аспекта на този процес изискват по-нататъшни изследвания и/или оптимизиране преди да се счита, че може да се използва в промишлен мащаб. Необходимо е да се увеличи обемната производителност, за да може експерименталният биореактор да се зареди с определения обем имобилизирани клетки. Например за биореактор от типа ГПСТ с вместимост 2000 hl са необходими приблизително 800 hl гранули. За да се осигурят тези обеми, е необходимо да се увеличат потоците от гел и масло. Данните подсказват, че увеличената скорост при използването на статични смесители с диаметри от 6,4 mm до 12,7 mm ще доведе до формирането на твърде малки гранули, които да се използват във ферментационната система. От това следва, че е необходимо да се увеличи диаметърът на статичния смесител, като по този начин се увеличи и средният диаметър на гранулите. Но използването на статичен смесител с по-голям диаметър ще увеличи също и размерната дисперсност на гранулите, като по този начин ще е по-голям процентът на гранулите извън желания обхват.

Друга алтернатива е реализирането на системата, използвайки статични смесители със среден размер (12,7 mm), свързани паралелно. Със система от десет статични смесители производителността евентуално ще достигне 1001/h. За 2000 hl за промишлено изпълнение процесът трябва да се осъществява непрекъснато за 800 h или приблизително 34 дни, за да се произведе необходимия обем от гранули. Могат да се използват няколко системи, за да се намали производственото време, но това би довело до други усложнения. Производственото време би могло да стане по-кратко, ако беше възможно гранулите да се съхраняват за по-голям период от време, при което да се запази жизнеспособността. Това е възможно, ако би могъл да се изследва процесът, свързан със сушенето на гранулите или съхраняването на гранулите във вакуумен контейнер.

Poncelet и сътрудници (1993) са публикували работа, в която би трябвало да се вземе под внимание видът на статичния смесител, използван за получаването на дисперсията. С тази предлагана система, като се използва друг тип статичен смесител, за разлика от този на

66230 Bl

Kenics, използван в настоящото изследване, би било възможно да се употребява смесител с поголям диаметър, без да се компроментира разпределението по размери на гранулите (поддържайки нисък коефициент на неравномерност).

Допълнителни проблеми при съществуващия експериментален процес са свързани с работата на системата при температура 40°С и използването на растително масло и разтвор на калиев хлорид за производството на гранули. Поради високата температура на производствения процес са необходими както нагряваща, така и охлаждаща система. Възможният термичен шок, на който са подложени дрождевите клетки, изискват допълнителни изследвания, за да може да се направи оценка за възможни негативни последици. В тази разработка са получени гранули с имобилизирани клетки с висока жизнеспособност на дрождите (над 90 %), но не са изследвани други въздействия върху популацията на дрождите, които могат да са следствие от процеса.

Тъй като се използва масло за получаването на желаната емулсия и последващо образуване на гранули, а маслото действа като повърхностно активно вещество и с това задържа пенообразуването, има остатъци от масло върху повърхността на гранулите. Въпреки че тези остатъци биха оказали помощ през ферментационния стадий, всякакви остатъци, пренесени в крайния продукт от пиво, биха били вредни, тъй като пяната е желана в крайния продукт. Големи обеми от разтвор на калиев хлорид, използван за отделяне на твърдата фаза (гранулите) от маслото и методът за отделяне на този солен разтвор от гранулите преди въвеждането им в биореактора изисква внимание. В противен случай може би е необходимо да се очисти този разтвор от реактора, след което в него да се заредят гранулите.

Тъй като гранулите с имобилизирани клетки се произвеждат извън реактора, по време на образуването на гранули се прилагат стерилизации и се поддържа стерилност до въвеждането на гранулите в биореактора. В различни точки по пътя на пренасянето на гранулите между резервоарите се създава възможност за тяхното замърсяване, което изисква постоянно наблюдение, тъй като присъствието на замърсители може да има за резултат ко-имобилизира нето им в гранулите. В резултат на старанието в лабораторията беше възможно да се произведат стерилни гранули. Но околната среда, в която е разположена инсталацията, може да не е подходяща в сравнение с лабораторните условия, поради което се изисква по-голям стриктен контрол.

6.2.2. Флокулиращи дрождеви клетки

Една от най-естествените форми за имобилизиране е самоагрегиране на микроорганизмите в агрегати от клетки. Calleja и Johnson (1977) имат предположения затри причини клетките да контактуват една с друга и да образуват агрегати с всички характерни за това свързващи свойства. Първото включва клетки от различен пол, които се притеглят един към друг чрез освобождаване на феромони (пи а-фактори). Този вид свързване е временно и представлява връзка протеин-протеин между □ и а-аглутинини, закрепени за стените на клетките.

Клетките могат също така да се групират, като не се отделят от матерните клетки по време на пъпкуването. Това неотделяне може да е присъщо на конкретен вид дрождев щам или може да е причинено от изчерпване на хранителна среда, или мутираме на определен брой гени. Това явление се отнася до образуване на вериги, а не към флокулация. Връзките между тези клетки могат необратимо да се разкъсат чрез механично срязване (Stratford, 1996). Stewart и Russell (1981) са дефинирали флокулирането като обратимо “явление, при което дрождевите клетки прилепват и образуват по-едри частици и/или седиментират бързо от средата, в която са суспендирали, или се издигат на повърхността на средата”. Много факти доказват, че флокулирането е генетично контролируемо и механизмът на флокулирането се базира на избрани молекули, които действат като мостове между стените на разположени една до друга клетки. Поконкретно, счита се, че отделни лектини се свързват към п-манани на допиращите се клетки в присъствие на Са²⁺ йони (Calleja and Johnson, 1977). Установено е, че тази връзка протеин/ въглехидрат може обратимо да се инхибира чрез желиращи агенти или чрез конкретни захари.

На фиг. 12 са показани три възможни конфигурации на дрождеви клетки, а именно нефлокуриращи дрожди, образуващи вериги дрожди и флокуриращи дрожди. В случая на дрожди, образуващи вериги, въпреки че клетките са се

66230 Bl групирали, не се счита, че това е вид флокулация, тъй като тези клетки преди всичко никога не са единични, а флокулирането предполага единични клетки, които заедно образуват множество поради благоприятна околна среда (Са²⁺ йони и ниско ниво на инхибиращи захари). При флокулиращите клетки конкретният размер на блоковете може да зависи от генетиката на клетките, както и от хидродинамичните условия, на които е изложена клетката (среда на срязване).

На фиг. 13 и фиг. 14 са показани два вида щам дрожди на Labatt за леко пиво с различна степен на флокулиране. Щамът дрожди LCC3021 със средна степен на флокулиране е представен на фиг. 13. В присъствие на калциеви йони този щам образува групи с размери от 0,5 mm to 1,0 mm, ако от течната среда е била изчерпана глюкозата. На фиг. 14 е показано изображението на свръхфлокулиращ щам дрожди LCC290, който образува блокове с размери, по-дълги от 1 mm и при ниска среда на срязване агрегира до групи с диаметър до 5 mm. При условия на умерено разбъркване диаметърът на частиците на флокулати от LCC290 е между 1 и 2 mm. Предложени са няколко метода за определяне размерите при флокулирането на дрождите (Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki et al., 1997; Teixera et al., 1991; Stewart & Russell, 2000). B “Brewer’s Yeast” (Stewart & Russell, 2000) е предложено методите за определяне флокулацията на дрождите да се сведе до три категории, а именно седиментационни методи, методи на стационарна ферментация и директно наблюдение на образуването на флокулати в средата, в която се извършва растежа.

Седиментационните методи най-напред са описани от Bums през 1937 г. и са видоизменени от Helm и сътрудници през 1953 г. Понастоящем те са част от стандартните методи за анализ и са признати от Technical Committee и Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Този метод се отнася към in vitro методите, тъй като характеристиките на утаяването на дрождите се определят в буфер от калциев сулфат, а не в действителна ферментационна среда. Методът на стационарна ферментация включва растеж на дрождите в охмелена пивна мъст, като флокулационните характеристики се измерват in vivo. И двата метода включват измерване на абсорбцията на проби от утаени дрож ди в сравнение с проби от дрожди, които са били дефлокулирани, като за целта се използва спектрофотометьр UV във видимата част на спектъра. Stewart и Russell (2000) представят метод за измерване на флокулацията на дрожди чрез визуално описване на степента на флокулация, която се наблюдава в проби при растеж на дрожди в стъклени бутилки, затворени със завинтващи се капачки. За да се изрази степента на флокулация, те използват субективни мерки. Например: 5 - много силен флокулант, 4 - силен флокулант, 3 - умерено силен флокулант, 2 - слаб флокулант, 1 - лош флокулант и 0 - нефлокулант. Свръхфлокулиращият щам дрожди LCC290 е получил характеристика 4 силен флокулант, докато щам дрожди LCC3021 е класиран с оценка 3 - умерен флокулант.

Флокулиращата способност е важна характеристика в пивоварната промишленост, тъй като тенденцията за използване на природни дрожди, които или се утаяват, или изплуват на повърхността, често се използва като метод за сепарация на тези дрожди от ферментационната течност. Но щам дрожди, който флокулира преди ферментацията да е завършила, е нежелателен, тъй като течността няма да достигне идеалното алкохолно съдържание и нивото на остатъчната захар. При непрекъснатата ферментация и в частност непрекъсната ферментация в биореактор, снабден със смукателна тръба, и с използване на газова подемна сила флокулиращите дрожди действат като имобилизирана матрица. Техният стремеж към утаяване се компенсира чрез инжектирането на разпръскващ се газ, които ги поддържа в суспендирано състояние. При такава система опасността от недоферментиране на течната среда се елиминира, тъй като твърдите частици непрекъснато циркулират и се поддържат в интимен контакт с ферментиращата течност.

В раздел 6.2.2.1 е дадена характеристика на параметрите на утаяване и ферментационните показатели на свръхфлокулиращите дрожди LCC290. Интересът е към идентифициране на началото на флокулацията за този конкретен щам дрожди. В допълнение към това, се определя скоростта на утаяване на дрождите, за да се осигури ценна информация, която би могла да се използва в бъдеще за конструиране на резервоари за утаяване.

66230 Bl

6.2.2.1. Характеристика на свръхфлокулиращите дрожди LCC290

Преди провеждането на непрекъсната ферментация със свръхфлокулиращи дрожди LCC290 в биореактор от типа ГПСТ беше решено да се направи характеристика на дрождите в лабораторен мащаб - ферментация в колба с разклащане. На фигура 6.28 е показано развитието на популацията на дрождите в зависимост от времето. Както се очакваше, концентрацията рязко се увеличава през първите 48 h, когато има достатъчно хранителна среда и присъствие на кислород в пивната мъст, за да се осигури растежа на дрождите. Но когато дрождите продължават да консумират въглехидрати в отсъствие на въздух, те не се репродуцират и навлизат в анаеробната фаза на ферментация. След като захранването с въглехидрати свърши, малки популации от дрожди започват да измират. Това явление е показано на фигура 6.29, където жизнеспособността на клетките намалява от приблизително 97 % до малко над 90 %.

На фигура 6.30 е показано изразходването на въглехидрати в зависимост от продължителността на ферментацията. Дрождевите клетки най-напред консумират монозахаридите, глюкозата и фруктозата, след това следват малтозата и малтотриозата. Пивните дрожди обаче не могат да метаболизират както малтотетрозата, така и полизахаридите с дълги вериги (поли-1 и 2). С намаляването на концентрацията на въглехидрати (представена чрез кривата на относителното тегло на фигура 6.31) концентрацията на етанол се увеличава пропорционално. След приблизително 37 h ферментация концентрациите на етанол и въглехидрати са равни.

Като се вземе под внимание картината на растежа и метаболизма на въглехидратите, може да се предположи, че свръхфлокулиращият щам LCC290 се проявява като промишления щам дрожди LCC3021. Ферментацията достига крайната фаза на завършване на процеса, когато относителното тегло на течността достигне приблизително 2,7°Р. За флокулиращите щамове дрожди е обичайно да образуват големи групи (блокове) и да се утаяват от разтвора преди края на ферментацията; това явление е известно в пивоварната промишленост като “задържане” на ферментацията. При нашите опити за периодична ферментация ние бяхме в състояние да завършим ферментацията, тъй като колбите се разбъркваха и по този начин дрождите се поддържаха в суспендирано състояние и в близък контакт с хранителната среда.

Друга важна характеристика е изследването на способността на дрождите да флокулират. По-специално ние се интересувахме от установяването на скоростта, с която дрождите биха се утаили, както и получаването на индикация кога този конкретен щам дрожди започва да флокулира. Тези две характеристики са от важно значение за опитите по непрекъснатата ферментация, тъй като те играят роля при поддържането на популация на дрождите във ферментатора с използване на газова подемна сила. На фиг. 6.32 са показани кривите на утаяване на дрождите в проби, изследвани в продължение на 24 h по време на ферментацията. Флокулирането се инхибира от присъствието на определени захари; глюкозата е известен инхибитор, от което следва, че флокулацията ще започне само, ако този инхибитор се изчерпи. В пробата при 40 часова периодична ферментация клетките започват да флокулират и да се утаяват от разтвора, когато се изпитват чрез метода, описан в раздел 4.7. Утаяването е много бързо за всички изпитвани интервали с изключение на 24часовия, при който не се наблюдава утаяване. По време на опита с най-бавно утаяване, проведен за 40 h, дрождите се утаяват напълно в апарата за изпитване за 90 s. При 71 h за утаяване са необходими по-малко от 50 s.

66230 Bl

фигура 6.28 Обща концентрация на дрождеви клетки от LCC290 при периодична ферментация с разбъркване в зависимост от продължителността на ферментацията, ферментационната температура се поддържа на 15½.

66230 Bl

Фигура 6.29 Жизнеспособност на дрождевите клетки, измерени с помощта на метиленово синьо, в зависимост от продължителността на ферментацията.

Полизахариди

Малтоаа

-S— Малтотатроза -·*- Глюкоза

Малтслриоза

Фруктоза

Фигура 6.30 Концентрация на въглехидрати в зависимост от продължителността на периодичната ферментация с LCC290

66230 Bl

[-O—Глииор»*-^— Enmon Опюапшлио ттло |

Фигура 6.31 Концентрации на етанол и глицерин и относително тегло на течността в завибиМост от продължителността на периодичната ферментация с LCC290.

-4-24 h -е-40 h -*-48 h -β-64 h -*-71 h

Фигура 6.32 Височина на разделителната повърхност на суспензия от дрожди в зависимост от продължителността на утаяване. Стойностите за тази графика са определени на базата на няколко ферментационни интервала.

66230 Bl

040hm A 48 hn · «4 In д71 In W2 In фигура 6.33 Скорост на утаяване на суспензия от дрожди в зависимост от концентрацията на клетки. Стойностите за тази графика са определени на базата на няколко ферментационни интервала.

Изследователите предполагат, че скоростта на утаяване е функция от концентрацията на твърди частици (Сое и Clevenger, 1916). На фигура 6.33 е показана скоростта на утаяване на твърдата фаза за дадена концентрация на дрождевите клетки. Показаните данни на тази графика са получени чрез метод, предлаган от Lynch (1952), като данните за утаяването са получавани на всеки ферментационен интервал. Точките са на приблизително една линия, като с това се потвърждава същото явление, което са наблюдавали Сое и Clevenger (1916).

Резултатите, събрани по време на изпитването на утаителния процес показва, че свръхфлокулиращият щам дрожди LCC290 флокулира при относително тегло на течността 6°Р и пониско. Тази стойност би могла да се използва като ориентир за непрекъснатата ферментация, за да показва кога относителното тегло на течността в псевдо-устойчиво състояние би трябвало да се поддържа, ако е желателно клетките да се оставят да флокулират. Работа на реактора над 6°Р крие риск от дестабилизиране на флокулиращите клетки и е възможно да води до неуспех при популацията на имобилизираните клетки.

Характеристиките на утаяването на свръхфлокулиращи дрожди показват, че популацията на дрождите ще спре твърде бързо, ако се оставят в застой. В биореактор от типа ГПСТ, който работи с три фази, е възможно поддържането на тези клетки в циркулация, но в случай на повреда в системата за подаване на газ, популацията на клетките ще спре бързо и е възможно да се наложи да се подаде допълнително разпръскващ газ за ресуспендиране на твърдите частици. За след ферментационното обработване тези характеристики на утаяването са важни, тъй като апаратите за сепарация на твърдите частици, като например гравитационни сепаратори, могат да се използват за периодично отстраняване на твърдите частици. В пивоварната промишленост това би намалило натоварването на центрофугите с твърди частици, което ще позволи по-продължителна работа на центрофугите. Биха могли да се очакват по-малки загуби на пиво и степента отклонение от вкусовите качества, дължащо се на центрофугирането (въпреки че е минимално) ще се сведе до минимум поради по-ниските нива на дрождевата биомаса, преминаваща през центрофугата.

66230 Bl

6.3. Оценка на технологията за непрекъсната ферментация на пиво с използване на газова подемна сила

Първата и най-важна цел на тези тезиси е да се направи оценка за осъществимостта на работата на експерименталния биореактор от типа ГПСТ при непрекъснато действие, като за целта се използват гранули от гел на капа-карагенан за захващане на клетки от Saccharomyces carlsbergensis (описани в раздел 6.2.1). В допълнение на това, нашето желание беше да изследваме дали пиво от типа североамериканско леко пиво с добри вкусови качества може да се произвежда в такава система. Ние също си поставихме за цел да определим минималното време за престой, което е необходимо за пълното разреждане на пивна мъст с голямо относително тегло (17,5°Р), както и да се установят работните граници на съдържанието на кислород в системата за непрекъсната ферментация.

Минималното време за престой, при което се изразходва цялото количество захари в пивната мъст, е 24 h. Тези данни могат да се сравнят с продължителността на класическата периодична ферментация, която е от пет до седем дни. Концентрацията на разтворения кислород, измервана чрез детектор за кислород Ingold, разположен на определено място в биореактора, клони към нула, независимо от добавянето на кислород в разпръсквания газ (в границите от 0 до 20 % (об/об)). Това показва, че подаденият в пивната мъст кислород или е изконсумиран бързо от дрождевите клетки, или просто е излязъл заедно с изпускания газ. Нивото на свободни клетки в преливника за пиво е в порядъка от 108 клетки на 1 ml зелена бира. Нивата на висшите дикетони, диацетил и 2,3-пентандион, както и нивото на ацеталдехид, намаляват пропорционално с намалението на кислород в разпръснатия газ. (фигури 6.34 и 6.35). Измерените естери (етилацетат и изоамилацетат) и по-висшите алкохоли (пропанол, изобутанол, изомилалкохол) не е установено да се влияят от промяната на подаването на кислород (фигура 6.36).

На фигура 6.37 са сравнени различни ароматни съединения в два вида изпитвани продукти от пиво, получени в система с непрекъснато действие и използване на имобилизпрани клетки, като сравнението е направено с контролно пиво, получено промишлено (периодична ферментация без използване на клетки). По отношение подаването на кислород са наблюдавани няколко разлики при естерите (етилацетат, изоамилацетат) и по-висшите алкохоли (пропанол) при сравняване на пиво, получено чрез непрекъсната ферментация, и контролното пиво, получена в промишлени условия. Изпитанията на крайния продукт от пиво, произведено с 2 % кислород, бяха оценявани чрез установен вкусов набор, за да бъдат сравнително близки до контролното пиво (промишлен продукт). Но пивото, получено с 20 % кислород, беше оценявано по неприемлив начин чрез признаците окисление на ароматни съединения и “хартиено” и “винено” изпитване.

При псевдо-устойчиво състояние експерименталният биореактор работи при продължителност на престой 24 h за период от 6 седмици. “Зелената бира” има добри вкусови качества и не се наблюдават големи дефекти (сяра не е наблюдавана). Количеството на кислород в разпръсквания газ е важен елемент при тези експерименти. Пиво, произведено с 2 до 5 % кислород в разпръсквания газ, дава най-добрите резултати при изпитване. Този важен контрол изисква внимание, като следва да се обърне внимание на по-точни апарати за измерване на кислорода и измерванията да се провеждат върху по-голяма група проби за анализи преди и след ферментацията. При традиционната периодична главна ферментация пивната мъст се дозира с кислород преди пренасянето й във ферментатора. След инокулирането на средата концентрацията на разтворения кислород рязко намалява, тъй като дрождевите клетки го изразходват (през първите 24 h на ферментацията става растежа на дрождите). Поради това останалата част от ферментацията протича главно при анаеробни условия. Използването на непрекъсната хомогенна система за главната ферментация не позволява изменение на концентрацията на кислород през цялото време на процеса. Поради тази причина вероятно е много трудно да се постигне пълна съвместимост по отношение на вкусовите качества на пиво, произведено с използване на непрекъснат и прекъснат процес на ферментация.

Поради тези различия с биореактора, използван при тези начални оценки, се произвежда пиво с добри вкусови качества и профил на анализите. Чрез използване на биореактор с га

66230 Bl зова подемна сила и относително малък размер на гранулите (~1 mm) е възможно да се увеличи обемната производителност на биореактора чрез намаляване на времето за главната ферментация с няколко дни. Нивото на биомасата в пивото на изхода показва, че степента на растеж на дрождите в биореактора с използване на имобилизирани клетки е еквивалентно на това при периодичната ферментация с използване на свободни клетки, като процесите са провеждани при подобни условия. Тези наблюдения потвърждават връзката между вкусовите качества и степента на растежа на дрождите. С това може да се обясни неуспехът на предишни опити да се произведе добро пиво в системи с ограничен растеж на клетките. Контролираното подаване на газова смес може да бъде силно средство при прецизното регулиране на органолептичните свойства при непрекъснатите ферментации с използване на имобилизирани клетки.

Високото ниво на диацетил в крайната течност също е наблюдавано от други изследователи (Virkajarvi & Pohjala, 1999; Kronlof et al., 2000). В североамериканската лека бира измереното ниво на диацетил е 30 microg/Ι в сравнение с ниво от 400-800 microg/Ι в крайната течност, получена при непрекъснатата ферментация. Използването на традиционната технология на отлежаване (отлежаване на студено при 2°С за време 14 дни) намалява диацетила до желани граници, но е във вреда на общата производителност на процеса. Използването на бърза спомагателна ферментация, описана в Глава 2, би спомогнала за намаляване на диацетила без съществено намаляване на производителността (двучасов процес). Допълнителните разходи обаче могат да са високи и всички пивовари може да не желаят да подлагат пивото на високи температури (80 до 90°С).

66230 Bl

Диацггил *♦“ Пктщдион I

Фигура 6.34 Концентрация на висши дикетони в зависимост от процентното съдържание на кислород в разпръсквания газ. ферментацията е проведена в 50 L апарат с газова подемна сила, запълнен с гелни гранули от к-карагенан в количество 40 % (об/об). Общата скорост на разпръсквания газ се поддържа константна и е 6,4 acfh. Времето за престой е 24 часа.

фигура 6.35 Концентрация на ацеталдехид в зависимост от процентното съдържание на кислород в разпръсквания газ. Ферментацията е проведена в

L апарат с газова подемна сила, запълнен с гелни гранули от к-карагенан в количество 40 % (об/об). Общата скорост на разпръсквания газ се поддържа константна и е 6,4 scfh. Времето за престой е 24 часа.

66230 Bl

“♦'Етипвцижт-— Препикал Имбумншь^- Ижминмц1твг'6^*^м*^мм*'*^|0квл

Фигура 6,36 Концентрация на естери и фузелови алкохоли в зависимост от процентното съдържание на кислород в разпръсквания газ. Ферментацията е проведена в 50 L апарат с газова подемна сила, запълнен с гелни гранули от к^карагенан в количество 40 % (об/об). Общата скорост на разпръсквания газ се поддържа константна и е 6,4 edh, Времето за престой а 24 часа.

Фигура 6,37 Сравнение между крайния продукт, произведен с 2 % кислород и 20 % кислород в разпръсквания газ, съпоставени с промишлено произведено пиво И вкусовите граници. За продуктите, получени чрез непрекъсната ферментация, процесът е проведен в 50 L апарат с газова подемна сила, запълнен с гелни гранули от к-карагенан в количество 40 % (об/об). Общата скорост на разпръсквания газ се поддържа константна и е

6,4 ecftl. Времето за престой е 24 часа,

66230 Bl

6.4. Скорости на смесване и циркулация при ферментация с участие на три фази, провеждана в биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба

Експериментите по смесването са проведени при използване на метода на инжектиране на киселина, описан в раздел 4.8. Целите на тази експериментална фаза бяха две. На първо място ние искахме да направим оценка дали системата с използване на газова подемна сила е добре смесена, като за целта се изчислява скоростта на циркулация на течността и времето за смесване за няколко имобилизирани носители при различна повърхностна скорост на флуидизиращия газ. Разликата между тези опити и публикуваните в литературата се състои в това, че външното експериментиране е извършено в реална ферментационна среда с активни дрождеви клетки, а не с образци - разтвори (вода-твърди частици-газ). Тези експерименти по смесването също така включват изчисляване на повърхностната скорост на течността, която би могла да се използва за увеличаване мащаба на експерименталната система.

6.4.1. Калибриране на апарата.

pH-метърът, използван в изследванията за смесването, се калибрира, като за целта се използва методът, описан в раздел 4.8. Сигнал от 4-20 mA, излъчен от pH-метъра, преминава през резистор от 250 Ohm и се трансформира в 1-5 волтов сигнал, който би могъл да се регистрира на карта за получаване на данни. pH-метърът след това се потопява в няколко буферни разтвора както следва: буферен разтвор с pH 4,6, буферен разтвор с pH 4,0, буферен разтвор с pH 5,0, буферен разтвор с pH 6,0 и накрая в буферен разтвор с pH 7,0 (Beckman certified standards, Cole Parmer). Ha фигура 6.38 са представени данните от регистриращата система за pH-метри Ingold, които съответстват на 5 стандартни pH разтвори. Фигура 6.39 представлява калибриране на рНметър, като диаграмата показва стойността на 5 действителното pH в зависимост от измереното напрежение на сигнала. Най-подходящата линия на калибриране за тази система (коефициент на корелация 0,9996) се определя от следното уравнение:

pH = 3,68 *напрежение - 3,53 (6.1)

Събраните данни за смесването се трансформират, като се използва уравнението 6.1, за да се получат действителните стойности на pH, както са измерени в биореактора с газова подемна сила.

Също така се измерва съответстващото време, за което pH-метърът отразява изменението на стойностите на pH. На фигури 6.40 до 6.43 е показано типичното време за реагиране на рНметъра за четири различни стъпала на промяна на стойността на pH, а именно 0.6,1.2,2.3 и 3.4 единици. Действителните данни са пригодени към импулсна функция, като за целта е използвана въведени в измервателната система данни от Таблица на криви 2D (Jandel Scientific) и софтуер за анализ. Полученото изравняване на кривите има коефициент на корелация 0,994. Чрез тези графики се изчислява времето за реагиране на прибора при изменение на стойностите на pH, което да съответства на 98 % от изменението, след което се нанасят съответните точки в диаграмата в зависимост от стъпката на изменение на стойността на pH (фигура 6.44). Времето за реагиране деклинира с изменение на стойността на pH в изпитваните граници. За най-малки стойности на изменение от 0,6 времето за реагиране на рНметъра е 6,4 s. Времето за реагиране намалява до около 4,2 s при промяна на pH на 3,4.

66230 Bl

фигура 6.38 Характерни данни, отчетени чрез системата за получаване на данни към pH-метър Ingold за различни буферни разтвори в зависимост от времето. Честотата е 50 Hz общо за 15000 точки.

Действителни данни ---- Смдинителна линия

Фигура 6.39 Калибрираща крива на pH-метър за стойностите на pH в зависимост от измереното напрежение (V). Линията на най-доброто съответствие или карибриращата крива съответства на следното уравнение: pH « 3,68 Напрежение - 3,53, при коефициент на корелация 0,9996. (п=2500)

66230 Bl

Време за рмп1|М№ (а) фигура 6.40 Характерни данни зя времето за реагиране ма pH-метър в зависимост от изменението на pH със стъпка ~0,6. Чувствителността е регулиране с помощта на софтуер, съдържащ таблица на кривита.Най доброто съответствие на импулсната функция има коефициент на корелация 0,995.

фигура 6.41 Характерни данни за времето за реагиране На рН-метър в зависимост от изменението на pH със стъпка ~1,2. Чувствителността е регулирана с помощта на софтуер, съдържащ таблица на кривите. Най доброто съответствие на импулсната функция има коефициент на корелация 0,999.

66230 Bl

Време M рмгиранн (в) фигура 6.42 Характерни данни за времето за реагиране на pH-метър в зависимост от изменението на pH със стъпка ^2,3. Чувствителността е регулирана с помощта на софтуер, съдържащ таблица на кривите. Най доброто съответствие на импулсната функция има коефициент на корелация 0.999.

Фигура 6.43 Типични данни за времето за реагиране на pH-метър в зависимост от изменението на pH със стъпка *3,4. Чувствителността е регулирана с помощта на софтуер, съдържащ таблица на кривите. Най доброто съответствие на импулсната функция има коефициент на корелация 0,999.

66230 Bl

Фигура 6.44 Враме за реагиране на pH-метър Ingold в зависимост от промяната на стъпката. (N 3). Приборите са потопени в буферни разтвори с по-голяма стойност на pH, след което незабавно са потопени в буферен разтвор с pH 4,0. Линията на най-доброто съответствие за всяка крива се използва за изчисляване на времето, което е необходимо приборът Да достигне 98 % от промяната на стъпката.

Характеристиките нададен вид рН-метьр са много важни, по-специално когато системата се използва за оценка на времето за смесване и скоростта на циркулация. Приборът трябва да има ниски стойности на времето за реагиране, за да отразява промените в средата, които той измерва. В частност времето за реагиране на рН-метъра трябва да бъде по-ниско в сравнение със скоростта на циркулация в реактора, ако трябва да се използва за точно измерване. Квазимигновено реагиране обаче не е желателно, тъй като леко забавяне при реакцията просто ще рефлектира върху измерването на скоростта на циркулация и ще я сведе до нула.

6.4.2. Продължителност на смесването и изчисляване на скоростите

Експериментите, свързани с продължителността на смесване и изчисляване на скоростите, са проведени при три вида ферментации с имобилизирани клетки. Опитите са проведени в експериментален биореактор с обем 501, снабден със смукателна тръба, като за ферментация са използвани воден разтвор, несъдържащ твърда фаза, и след това ферментационна течна среда с относително тегло 2,7°Р, съдържаща или гелни гранули от капа-карагенан или свръхфлокулиращи дрожди LCC290 или дрожди LCC3021 със средна флокулираща способност. На фигури 6.45 и 6.46 са показани примерни изображения на данни, които са събрани с използване на рНметър след импулсно инжектиране на киселина във водния разтвор (описаният в раздел 4.8 метод). На фигура 6.45 е показана чувствителността на pH-метър към инжектирането на киселина във воден разтвор, който не съдържа твърда фаза. На фигура 6.46 е показана чувствителността към инжектирането на киселина във ферментационна течна среда, съдържаща флокулиращи дрожди LCC290 с висока флокулираща способност. Сигналите се напасват към декрементната синусоидална крива, като коефициентът на корелация е съответно 0,96 и 0,90 и е изчислен за съответното уравнение. Параметрите “Ь” и “с” на диаграмата съответстват на стойностите на “а” и от декрементното синусоидално уравнение (3.1). Тези числени стойности се използват в уравнение 3.2 и 3.3, за да се изчисли скоростта на циркулация и продължителността на смесването за дадена система. В Приложение В се съдържат останалите данни за смес

66230 Bl ването и построените криви за всички експерименти.

На фигури 6.47 и 6.48 са показани диаграми на продължителността на смесване в зависимост от скоростта на циркулация при инжектиране на киселина във воден разтвор, несъдържащ твърда фаза. На фигури 6.49 и 6.50 са показани съответните диаграми, отразяващи експериментите по смесването, с използване на дрожди LCC290 с висока флокулираща способност, а на фигури 6.51 и 6.52 са представени резултатите от изпитването на смесителния процес с участието на капа-карагенан. Продължителността на смесване и продължителността на циркулация на среда от флокулиращи дрожди LCC3021 е показана на фигури 6.53 и 6.54. В зависимост от вида на твърдата фаза продължителността на смесване и скоростта на циркулация намаляват със съответното увеличаване на повърхностната скорост на газа. Зависимостта между скоростта на циркулация и повърхностната скорост на течността отговарят на уравнението 3.11, предложено от Kennard и Janekah (1991), при всичките четири изпитвани системи. Продължителността на смесване отговаря на зависимостта съгласно уравнение 3.11 за системата воден разтвор без твърда фаза и за системата с гелни гранули от капа-карагенан. Двете системи с флокулиращи дрожди в имобилизирана матрица не показва ясно съответствие с теоретичния модел на Kennard и Janekah. Системите с LCC290 и LCC3021 имат начална продължителност на смесване (докато повърхностната скорост на газа превиши 4 mm/s), която е пониска от предвидената в модела. Но степента на намаляване на продължителността на смесване се понижава при повърхностна скорост на газа, по-голяма от 4 mm/s, докато при модела стойностите са по-ниски. В Таблица 6.1 са дадени изведените уравнения за продължителността на циркулация и продължителността на смесване в зависимост от повърхностната скорост на газа.

На фигура 6.55 е показана продължителността на смесване в зависимост от повърхностната скорост на газа за всички четири системи. При системата от воден разтвор без твърда фаза се наблюдава най-дълга продължителност за 98 % смесване (—220 s при V_sg 3 mm/s), а системата с LCC290 показва по-добра способност за свеждане до минимум на ефекта от инжектирането на киселина в системата (-110 s при V_sg 3 mm/s). Стойностите за LCC3021 и системата с капа-карагенан са между тези на системите с воден разтвор без твърда фаза и с LCC290. Твърдата фаза в биореактора с газова подемна сила спомага за диспергирането на флуидните елементи в течната фаза чрез стимулиране на образуването на турбулентни движения, осигурявайки коаксиално смесване. Свръхфлокулиращите дрожди LCC290 обаче при същото зареждане с твърда фаза (16 % (тегл/об)), както и при среда от дрождите LCC3021 със средна флокулираща способност, осигуряват по-кратка продължителност на смесване при всички изпитвани повърхностни скорости на газа.

На фигура 6.56 е показана продължителността на циркулация в зависимост от повърхностната скорост на газа за всичките четири изпитвани системи. При повърхностна скорост на газа от 2 mm/s продължителността на циркулация варира между 28 s и 35 s съответно при системата без твърда фаза във водния разтвор, която е с най-кратка продължителност на смесване и системата с LCC290, показваща най-малка скорост на циркулация. При по-големи скорости на газа разликата между четирите системи намалява приблизително на 3 s. При всички изпитвани скорости обаче системата с LCC290 показва леко по-ниски скорости на циркулация, докато системата без твърда фаза е с най-високи скорости на циркулация.

На фигура 6.57 е показана зависимостта между повърхностната скорост на газа и повърхностната скорост на течността. Уравнението 3.7, предложено от Livingston и Zhang (1993), е използвано за изчисляване на повърхностната скорост на течността за дадена продължителност на циркулация и вида на твърдата фаза. Повърхностната скорост на течността се увеличава при съответното увеличаване на повърхностната скорост на газа. Системата с LCC3021 и тази без твърда фаза имат подобни поведения, докато системите с LCC290 и с ксантогенат показват известно сходство. Уравнението, предложено от Kennard и Jenekah, е използвано за построяване на кривите на фигура 6.57, показващи зависимостта на повърхностната скорост на течността от повърхностната скорост на газа. На фигура 6.58 е показана диаграма на експеримен

66230 Bl тално изчислена повърхностна скорост на течността в зависимост от теоретично изчислената повърхностна скорост на течността, като за целта е използвано уравнението 3.10. За всичките четири системи предлаганото уравнение е под- 5 ходящо за използване и се изразява чрез линейна функция с наклон от 1 и изходна точка при у = 0. В Таблица 6.1 са посочени корелациите между системите, които са изпитвани в рамките на тази изследователска работа.

Rank 1 Еф 8001 [UDF 1]у»«пв09сайаДс,(1)

1МЛМ043П DFMiMjBMQMM ПММЛ»МВ1«в »*73121412 446210072 64416274400

фигура 6.45 Инерционно време на pH-метър в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във водния разтвор, който не съдържа твърда фаза. Повърхностната Скорост на газа се установява на 1,94 mm/s. На базата на данните е построена затихваща синусоидална крива. Коефициентът на корелация е 0,96.

66230 Bl

Rankl ΕφίΜΟΙ [U№ t)y»8lnejtoatfаДс,4) |ЧШв!В «ΑήιΜΜΜηβ ЯВЙЙММИСЗ«14 RMtf(U&221 «fUBfelttff MMM011ШЗ симтизмемланма

Фигура 6.46 Инерционно време на pH-метър в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща LCC290 с висока флокурираща способмост.Повърхностната скорост на газа се установява на 1,94 mm/g, На базата на данните е построена затихваща синусоиддлна крива. Коефициентът на корелация е 0,90.

66230 Bl

♦ brerwpmwwranHA T*op*rtiu>rt]

Фигура 6.47 Продължителност на смесван· в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във водния рмтаор, който не съдържа твърда фаза. Продължителността на смесване съответства на времето, което е необходимо за 98 % от стълалообразното изменение, която трябва да е сведено до нула (N«*3).

♦£кдп«рим«кплщ>— Т*ориичш| фигура 6.48 Продължителност на циркулацията в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във водния разтвор, който не съдържа твърда фаза. (N=3).

66230 Bl

!♦ Еквпвримнишн* Тедрмммна~|

Фигура 6.40 Продължителност на смесваме в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща LCC29D с висока флокурмраща способност (размер на флок. >1,0 mm). Продължителността на смесване съответства на времето, което е необходимо за 98 % от стъпалообразното изменение, което трябва да е сведено до нула (N=3),

фигура 6.50 Продължителност на циркулацията в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща LCC290 с висока флокурираща способност (размер на флок. > 1,0 mm).

66230 Bl

фигура 6.51 Продължителност на смесване в зависимост от повърхностната скорост ма газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща Дрожди LCC3021, имобилизирани с гелнм гранули от к-карагенан (размер на гранулите 1-2 mm). Продължителността на смесване съответства на времето, което е необходимо за 9В % от сгьпалообразното изменение, което трябва да е

| QEicatwpmMwninH·^^ Тмриичн*

Фигура 6,52 Продължителност на циркулацията в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във

Ферментационна среда, съдържаща дрожди LCC3021, имобилизирани с гелни гранули от к-карагеиан (размер на гранулите 1-2 mm). (N-3).

66230 Bl

♦ Експеримоишлий Ткрвшч1м

Фигура 6.53 Продължителност на омесване в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща дрожди LCC3021 (размер на гранулите 1-2 mm). Продължителността на смесване съответства на времето, което · необходимо за 98 % от стъпалообразното изменение, което трябва да е сведено до нула (N-3).

ЕрЕапчжмвитллмг“- Тмрвтичж*

Фигура 6.54 Продължителност на циркулацията вЧвависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина се инжектирани във ферментационна среда, съдържаща дрожди UCC3O21 (размер на флок, < 0,5 mm). (N=3),

66230 Bl

♦ LCO8M1 D LCC2W A'K*imraKW * 6w твърд· фм| фигура 6.55 Продължителност на смесване в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща твърда фаза от различни частици. Продължителността на смесван» съответства на времето, което е необходимо за 98 % от стьпалообразното изменение, което трябва да е сведено до нула (N=3).

	Hl ... . . ..
S чл,	W Λ ..... .......
Г „ W’ У « Q
X « 3 S ОД ,	1 И | -
Eg Е S’ 4я _
в 9 έ & 4rt a
gs.10 е 5 5 . rt. _
1	0	2 4 6 6 Повърхностна скорост на газв (mm/в)
		0 LCO3D21 □ LCC290 Δ Кдртнен * ЧОДи

фигура 6.56 Продължителност на циркулацията в зависимост от повърхностната скорост на газа в 50 L биореактор с газена подемна сила, снабден със смукателна тръба, Порции от киселина са инжектирани във ферментационна среда, съдържаща твърда фаза от различни частици. (N»3).

66230 Bl

♦ LCC3021 0 1ССЙМ Δ К^ютиш ТЕ*рд1 фигура 6,57 Повърхностна скорост на течността (mm/з) в зависимост от скоростта на газа (mm/a) за четирите изпитвани системи - дрожди от LCC3021, дрожди от LCC290, галнм гранули от карагенан и система от воден разтвор без твърда фаза.Изпитанията са проведени в експериментален биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба.

Фигура 6.58 Теоретична повърхностна скорост на течността (mm/е) в сравнение с експерименталната повърхностна скорост на течността (mm/s) за четирите изпитвани системи. Теоретичните стойности са изчислени, като се използвана следната зависимост, предложена от Kennard и Jenekah (1991): VSL ос VSGM, Линията е е наклон 1, а Y-отсечката е равна на 0.

66230 Bl

Таблица 6.1 Описание на изчислените корелации за продължителността на смесване, скоростта на циркулация и повърхностната скорост на течността за четирите изпитвани системи

	Продължителност на смесване	Скорост на циркулация	Повърхностна скорост на течността
Воден р-р без	tm=336,04VSG°·'	U = 37,94 Vsq·0'4	VSL=189,06 VSG 0 283
твърда фаза
Дрожди от LCC290	^-181,557,»«	tc= 44,67 Vsq·0’4	VSL=134,75 VSG 0419
Гел от к-карагенан	tm« 254,68 Vsa0,4	tc = 41,73 Vsq·0·4	Vsl=171,92 Vsq0 283
Дрожди от LCC3021	tm= 322,07 Vs0	tc = 37,90 Vsq A4	Vsl=156, 12Vsg 2'

За корелацията на повърхностната скорост на течността Kennard и Janekah (1991) предлагат степенен показател 0,41 в дестилираната вода и 0,64, когато разтворът съдържа карбоксиметилцелулоза и етанол. Системите с LCC290 и LCC3021 имат степенни показатели съответно 0,419 и 0,427, докато системата с капа-карагенан и системата от воден разтвор без твърда фаза имат степенен показател 0,283.

Основно положение при технологията, при която се използва газова подемна сила и смукателна тръба, е, че системата осигурява смесване по такъв начин, че флуидният елемент, напускащ реактора, е напълно хомогенен. При работа на експерименталните системи с обем 501 като ферментатори с непрекъснат режим на работа откъм дъното на реактора с общ обем 50 1 се инжектира свежа хранителна среда със скорост 36 ml за минута. Това представлява приблизително 1000-кратно разреждане на подаваните компоненти. С помощта на показателите за смесване, изчислени за системата с дрожди LCC290, флуидните елементи се смесват в циркулационен контур от около 3 реактора, докато за системата с воден разтвор без твърда фаза е необходим циркулационен контур с 10 реактора. 45 В допълнение към казаното, времето за престой (24 h) е приблизително 100 пъти по-голямо в сравнение с продължителността на смесване (180 s). Бързото смесване, съчетано с разреж дането на хранителната среда в системата, и голямата разлика в продължителността на смесване в зависимост от времето за престой ясно говорят за добра система на смесване. Действителната предпоставка за използване на биореактор с газова подемна сила беше фактът, че той осигурява идеална среда за смесване при ферментацията на пиво. Резултатите от изследването на процеса на смесване са получени за всичките три ферментационни носители.

6.5. Оценка на няколко метода на имобилизиране за използване при непрекъсната главна ферментация в система с газова подемна сила

Непрекъснатата ферментация се провежда в експериментален 50 1 биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, като за целта се използват три вида носители за имобилизиране: гелни гранули от капа-карагенан, свръхфлокулиращи дрожди LCC290 и дрожди LCC3021 със средна флокулираща способност. Всички ферментации се провеждат с едно и също ниво на дрождев инокулат (4 g/Ι), а за хранителна среда се използва промишлена пивна мъст за производство на леко пиво. Ферментациите започват в периодичен режим, за да се осигури бързо намаляване на захарите в пивната мъст и за да се подпомогне растежа на дрождите във ферментатора. При флокулиращите дрожди периодичната фаза осигурява фор50

66230 Bl мирането на флокулати от дрожди, които биха могли да останат в биореактора след започването на непрекъснатата ферментация. След като нивото надиацетил във ферментационната течност спадне под 30 microg/Ι, започва непрекъснато подаване на пивна мъст. Следващите раздели описват по-подробно резултатите от ферментационните анализи за тези три вида имобилизирани матрици.

6.5.1. Използване на гелни гранули от капа-карагенан: Захващане

Използването на гелни гранули от капа-карагенан като матрица за имобилизиране спомага за преценка на осъществимостта на технологията за непрекъсната главна ферментация на пиво, при която се използва газова подемна сила (раздел 6.3). Необходимо е също така да се оцени дали такава система би могла да работи за подълъг период от време (до 2 месеца) без да възникнат големи технологични трудности, включващи нестабилност при ферментацията и замърсявания. Работните параметри за тези ферментационни опити са представени на фигура 6.59. Повърхностната скорост на газа от въглероден диоксид се установява на 5,5 mm/s, като с този разпръскван газ в реактора се въвежда въздух със скорост 0,9 mm/s. От това следва, че степента на окисление се регулира на 3 % от общото количество разпръскван газ, което съответства на резултатите, посочени в раздел 6.3, и което свидетелства за производство на предпочитаното пиво, когато в системата се въвежда 25 % кислород. Температурата на ферментация се регулира на 15°С. Известна нестабилност може да бъде забелязана в данните и тя се дължи на вида на контура за регулиране на процеса схема, която се използва.

На фигура 6.60 е представено количественото определение на популацията на свободни дрождеви клетки и тяхната жизнеспособност в зависимост от продължителността на ферментацията. Жизнеспособността остава сравнително висока през двумесечната ферментация с временно намаляване, измерено около двустотния час. Това съответства на точката, която е точно преди започването на непрекъснатото подаване на пивна мъст. При периодична ферментация обикновено жизнеспособността намалява в края на ферментацията, тъй като има недостиг на хранителна среда за клетките. След като за почне непрекъснатото подаване на пивна мъст, жизнеспособността се връща обратно на 90 %. Популацията на свободните дрождеви клетки е ниска по време на първите 400 h на ферментацията, а след това през следващите 300 h тя се увеличава около 10 пъти - от -100 милиона клетки на 1 ml на - 1,5 билиона клетки на 1 ml. Щом като се достигне тази максимална концентрация, популацията на дрождите от свободни клетки под държа псевдо-устойчиво състояние за останалата част от ферментационния период.

Внезапното увеличаване на концентрацията на свободни клетки вероятно се свързва с популацията на имобилизирани дрождеви клетки. В началото на ферментацията дрождите, захванати в гела, растат в гела докато се заеме цялото разполагаемо пространство. След като гелните гранули се запълнят с дрожди, увеличаващата се популация ще премине в течната среда. Нашите резултати показват, че през първите 400 h имобилизираните дрожди растат вътре в гела и след 700 h дрождите вече нямат пространство да растат в гела, поради което започва отделяне на по-големи количества клетки във ферментационната течна среда.

Тази неустойчивост при популацията на дрожди се отразява на показателите за етанол и относителното тегло (фигура 6.61). По време на началните 200 h на ферментация може да се очаква, че съдържанието на етанол ще се увеличи прекомерно много, а относителното тегло ще се намали, следвайки традиционната кинетика на периодичната ферментация. Между 200 и 600 h етанолът достига тази част от кривата на диаграмата, която е паралелна на абцисната ос и отговаря на 45 g/Ι и относително тегло от около 6°Р. Този резултат не е очакван, както и ферментиралата течност в края на ферментационния процес да е с относително тегло от 2,5 до 2,7°Р. При около 600-ния час, когато популацията на свободни клетки от дрожди току-що е достигнала около максимума, нивото на етанола се увеличавало около 70 g/Ι и относителното тегло пада до около 2,2°Р. По-близък поглед по отношение на съдържанието на конкретни въглехидрати в зависимост от продължителността на ферментацията (фигура 6.62) показва, че концентрацията на малтоза не достига равновесие приблизително до 600-ния час на процеса. Както

У Z66230 Bl се очакваше, другите захари намаляват. Други два ключови анализи са под непрекъснато наблюдение през целия двумесечен период на непрекъснатия процес - на диацетил и на 2,3-пентандион (фигура 6.63). Ниските точки приблизително при 180 h съответстват на края на периодичната фаза. Със започването на непрекъснатото подаване на материал съдържанието на диацетил и 2,3-пентандион рязко се увеличава съответно на около 500 microg/1 and 400 microg/1. Това първоначално увеличение е очаквано, тъй като подаването на свежа хранителна среда стимулира растежа на дрождите, от което следва, че се повишават нивата на излишък от метаболити, което води до получаване на диацетил и 2,3-пентандион. По време на ферментаци5 ята нивата на 2,3 -пентандйона остават над 400 microg/Ι, докато концентрацията на диацетил се понижава от 500 microg/Ι до 275 microg/1 по средата на провеждането на ферментационния процес. Тази точка също съвпада с нивото на 10 диацетил, падайки под нивото на 2,3пентандиона, което е наблюдавано при оценяване на осъществимостта, посочено в раздел 6.3.

Температура

Въглродан диоксид

Въздух фигура 6.59 Работни параметри на ферментацията с «мобилизирани в карагенан дрожди в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

3.00Е-Ю8

2.60E+06

2.006*09

1.506+09

1.00Ε+09

5.00Ε+08

Ο.ΟΟΕ+ΟΟ

100%

86% 70%

55% 40%

25% 10%

Ο 200 400 600 800 1000 1200

Продължителност на ферментацията (h)

Жизнеспособност фигура 6.60 Обща концентрация на дрождеви клетки и жизнеспособност на имобялизирани дрожди в к-карагенан в зависимост от продължителността на ферментацията.

Етанол

Жизнеспособност

Фигура 6.61 Концентрация на етанол и относително тегло при непрекъсната ферментация с имобилизиранй дрожди в к-карагенан в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

-0— Полимхариди -6- Малтотггром Малтотриом

Малтоза~θ~ Глицерин

Фигура 6.62 Съдържание на въглехидрати при непрекъсната ферментация с имобилизирани дрожди в к-карагенан в зависимост от продължителността на ферментацията.

~*-Диацетил -Ό— Пентадион

Фигура 6.63 Концентрация на висши дикетони при непрекъсната ферментация с имобилизирани дрожди в к-карагенан в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

6.5.2. Използване на свръхфлокулиращ щам пивни дрожди:

Самофлокуриране

Непрекъснатата ферментация в експериментален 50 1 биореактор от типа ГПСТ се проведе със свръхфлокулиращи пивни дрожди LCC290 в течение на 3 месеца. Разпръскващ газ СО₂ се инжектира със скорост —2,5 mm/s, а въздухът се подава със скорост —0,4 mm/s, за да се осигури растежа на пивните дрожди (това съответства на общо 1,51 газ на минута, от които 3 % са кислород). Ферментационната температура в реактора се регулира на-15°С през целия ход на процеса. Спирането на подаването на енергия ни принуди да намалим температурата във ферментатора на 4°С за период от три дни (около 1700 h) (Фигура 6.64). Охлаждането на реактора се проведе, за да се забави метаболизма на дрождите и да се поддържа тяхната жизнеспособност по време на спирането на електрозахранването. Този неочакван случай ни даде подходяща възможност да направим преценка за гъвкавостта на системата по отношение на ситуации, които обикновено могат да настъпят при промишлено производство. След като захранването беше възстановено, температурата в реактора отново се регулира на 15 °C и ферментацията продължи още 30 дни.

След завършването на началната периодична фаза (-180 h) започна непрекъснатото подаване на пивна мъст към системата с дебит 2,161 на час, като с това се осигурява време на престой 24 h, определено на базата на работния обем на реактора от 501. След началната периодична фаза концентрацията на клетките се увеличава, достигайки 3 билиона клетки на ml за около 750 h ферментация. (Фигура 6.65). След това дрождевата маса намалява приблизително до 1 билион клетки на ml за около 1000 h и остава на това ниво до края на ферментацията. Жизнеспособността на пивните дрожди е 90 % през целия ход на ферментацията (Фигура 6.65).

Концентрацията на етанол и относителното тегло на течната среда достигат псевдо-устойчива стойност малко след като започне непрекъснатото зареждане (Фигура 6.66). Концентрацията на етанол расте до около 70 g/1, а относителното тегло на течността е -2,3 °Р през останалото време на ферментацията. Данните за концентрацията на въглехидрати, показани на фигура 6.67, потвърждават това псевдо-устойчиво състояние приблизително 270 h в хода на непрекъснатия ферментационен процес. Концентрацията на полизахариди пада от -42 g/ 1 на -33 g/Ι около 1400-ния час от ферментацията. Този резултат се обяснява с разликите в партидите от пивна мъст. Тъй като пивните дрожди за леко пиво не могат да изразходват тези полизахариди, тази аномалия в хранителната среда от пивна мъст няма забележим ефект върху производителността на апарата за главна ферментация. Това различие по отношение на частта от неферментируема захар би трябвало да се установи от членовете на експертна комисия за опитните изпитания, които би трябвало да отбележат, че продуктът има “слаба” консистентност.

Концентрациите на диацетил и 2,3-пентандион през цялото време на процеса са представени на фигура 6.68. Както при непрекъснатата ферментация с използване на капа-карагенан, нивата на диацетил и 2,3-пентандион нарастват още със започването на непрекъснатото подаване на пивна мъст. Диацетилът достига около 375 microg/1 докато концентрацията на 2,3-пентандиона е около 600 microg/1. Тези концентрационни нива се поддържат през целия ход на ферментацията до прекъсване на електричеството на -1700-ния час. Тъй като течността остава за 3 дни без метаболизъм на пивните дрожди (не се подава хранителна среда), нивата на висши дикетони намаляват. След като подаването на пивна мъст се възстанови, диацетилът и 2,3-пентандионът се връщат към нивата си в псевдо-устойчиво състояние.

66230 Bl

I Тсмпориура

Въглродсн диоксид-*- Въздух]

Фигура 6.64 Работни параметри на ферментация с LC290 в зависимост от продължителността на ферментацията.

6J0OE4O9

S t 5.00Е+09

100%

4.00Е-Ю9

ЗЛОБИ»

2.00Е+08

1Л0Е-Ю9

О.ООЕ-ЮО

70%

55%

40%

10%

85%

X ю о с

м

S X 25% “I ’ I ....... ' I

1500 2000 2500 3000

Продължителност на ферментацията (h)

Клотки-е- Жизнеспособност

Фигура 6.65 Обща концентрация на дрождевите клетки и жизнеспособност на дрожди LC290 в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

I-А Емнал Отосяталмо тегло tL

O o

£

S o

X §

Фигура 6.66 Концентрация на етанол и относително тегло на дрожди LC290 при непрекъсната ферментация в зависимост от продължителността на Ферментацията.

Полншхариди-В ивлтмлроп Ф* Малтмряма -е-мллтрч глицлрии

Фигура 6.67 Съдържание на въглехидрат при непрекъсната ферментация с дрожди LC290 в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

Диацггмл

Пентадион фигура 6.68 Концентрация на висши дикетони при непрекъснатата ферментация с дрожди LC290 в зависимост от продължителността на ферментацията.

6.5.3. Използване на средно флокулиращи пивни дрожди: самофлокуриране

Проведена е ферментация при няколко режима на работа с използване на средно флокуриращ щам пивни дрожди LLC3021 като матрица за имобилизиране. Ферментацията е проведена в експериментален 50 1 биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба. Както и при двата предишни метода на имобилизиране, началната концентрация на пивни дрожди се установява на 4 g/1. С тези пивни дрожди се заквасва пивна мъст за промишлено производство на лека бира (описано в раздел 4.2) и осигурява ферментиране на партидата докато се изразходва цялото количество ферментируеми захари и нивото на диацетила падне под 30 microg/1. Температурата на ферментацията се регулира на 15°С и скоростта на разпръсквания газ се регулира на същото ниво, както при фер- 45 ментацията с LCC290 (повърхностна скорост на въглеродния диоксид ~2,5 mm/s и ~0,4 mm/s въздух, осигуряващ приблизително 3 % кислород в общото количество разпръскван газ) (фигура 6.69).

Този първоначален периодичен стадий дава възможност за флокулация на дрождевите клетки и поради това по-лесно се задържат в системата, в която се използва газова подемна сила. В края на периодичната ферментация скоростта на подаване на пивна мъст се регулира на 2,161 на час, което съответства на време на престой 24 h, като се вземе предвид работният обем на реактора - 501. Популацията на пивните дрожди (фигура 6.70) се увеличава на около 1 билион клетки на милилитър и остава на това ниво в продължение на 1000 h (между 500-ния и 1500ния час в хода на непрекъснатата ферментация. Популацията на пивните дрожди изведнъж се увеличава около ~1500-ния час от ферментацията и след това се стабилизира на 2 билиона клетки/ml. Тази промяна в популацията на пивните дрожди беше неочаквана. Жизнеспособността на пивните дровди през целия ход на ферментацията се поддържаше на 90 % (Фигура 6.70).

66230 Bl

Ha фигура 6.71 са представени данните за концентрацията на етанол и относителното тегло на ферментационната течна среда по време на тримесечната непрекъсната ферментация. Малко след започването на периодичния стадий (180 h) 5 концентрацията на етанол се стабилизира на 70 g/1, а относителното тегло достига минимум ~2,2°Р. Предполага се, че внезапното увеличаване на популацията на пивните дрожди би рефлектирало върху намаляването на концентраци- 10 ята на етанол. Най-логичното обяснение за увеличаване на популацията на пивните дрожди е, че по-голяма част от популацията навлиза във фазата на растеж, в резултат на което тяхната концентрация се удвоява. Би могло да се очаква на- 15 маляване на концентрацията на етанол във връзка с увеличаването на концентрацията на пивни дрожди, но това не е така, тъй като етанолът остава в псевдо-устойчиво състояние и неговата стойност е 70 g/Ι през целия ход на процеса. Концентрацията на въглехидрати в зависимост от продължителност на ферментацията (фигура 6.72) показва същите резултати, както характеристиките на етанол и относителното тегло. При този ход на ферментацията се достига псевдоустойчиво състояние приблизително 250 h непрекъсната ферментация.

На фигура 6.73 са показани концентрационните характеристики на диацетил и 2,3-пентандион в зависимост от продължителността на ферментацията. Както при резултатите за висшите дикетони при използване на гел от капакарагенан и LCC290, концентрациите на диацетил и 2,3-пентандион се увеличават след започването на фазата на периодичната ферментация и достига псевдо-устойчиво състояние при стойност съответно от ~225 microg/1 и 400 microg/1.

Фигура 6.69 Работни параметри на ферментацията с LCC3021 в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

β.οοε+09 ^б.оое«)9

J |4,00Ε+Οβ

Ϊ 53.00Е-Ю9 g '*^-Γ | |100Е«® * ® ЮТ4О9

O.OOE+OO

жк -

100%

05%

70%

56%

40%

28%

10%

Продължителност на ферментацията (h) фигура 6.70 Обща концентрация на клетки от пивни дрожди м жизнеспособност на LCC3021 е зависимост от продължителността на ферментацията.

фигура 6.71 Концентрация на етанол и относително тегло при ферментация с LCC3021 в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

Фигура 6.72 Концентрация на въглехидрати при непрекъсната ферментация с пивни дрожди LCC3021 в зависимост от продължителността на ферментацията.

-в—Диацвтил-О— Пвнтадион

Фигура 6.73 Концентрация на висши дикетони при ферментация с

LCC3021 в зависимост от продължителността на ферментацията.

66230 Bl

6.5.4. Съпоставяне на различните носители

В раздели 6.5.1 до 6.5.3 бяха представени ферментационните характеристики на гелни гранули от капа-карагенан, свръхфлокулиращи дрожди LCC290 и средно флокулиращи дрожди LCC3021 като матрици за имобилизиране. Всичките три носители се считат като подходящи за провеждане на непрекъсната главна ферментация в експериментален биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба и с обем 50 1.

Времето за престой за всичките три случая е 24 h. Ферментацията с използване на свръхфлокулиращите дрожди LCC290 достига псевдо-устойчиво състояние много по-бързо в сравнение с използването на системите със средно флокулиращите дрожди LCC3021 и имобилизираните клетки в капа-карагенан. При ферментацията с LCC290 се достига максимална концентрация на етанол от 70 g/Ι за около 250 h. При използване на LCC3021 се постига устойчиво състояние на концентрацията на етанол от 70 g/1 за около 600 h. По време на непрекъснатата ферментация с капа-карагенан етанольт постига равновесие в две отделни точки в хода на процеса. Най-напред етанольт достига 45 g/Ι между 200 и 500 h и след това нараства до 70 g/Ι след около 757 h и остава при тази концентрация до края на експеримента.

Трите ферментационни системи изглежда достигат максимална концентрация на свободни клетки - 1 билион клетки на милилитър. Променливостта на концентрацията на пивни дрожди влияе на получаването на етанол в системата с капа-карагенан (по-ниска начална псевдо-устоичива концентрация на етанол в сравнение със системата с дрожди LCC290). Концентрацията на пивни дрожди достига връхна точка в различни интервали от време при всяка система. За непрекъснатата ферментация с LCC290 етанольт достига своя максимум между 500-ния и 1000-ния час, докато при ферментацията с LCC3021 изчислената максимална стойност е между 1500-ния и 2000-ния час. Системата с имобилизиране с капа-карагенан достига максимална концентрация на клетки между 700-ния и 1000-ния час на непрекъснатия процес.

Псевдо-стабилните стойности на концент рациите на диацетил и 2,3-пентандион в трите вида ферментации с имобилизирани клетки свръхфлокулиращи дрожди LCC290, средно флокулиращи дрожди LCC3021 и имобилизирани в капа-карагенан дрожди, са различни. За ферментацията с LCC290 стабилизирането се постига при около 375 microg/1, докато при ферментацията с LCC3021 нивото на стабилизиране е при около 225 microg/1. При ферментацията с капа-карагенан концентрацията на диацетил достига 500 microg/Ι и по средата на хода на ферментационния процес нивото намалява постепенно до около 200 microg/Ι в рамките на 500 h. Концентрацията на 2,3-пентандион отразява концентрацията на диацетил при всичките три хода на ферментацията, като концентрациите на 2,3пентандион са по-високи в сравнение с тези на диацетил през цялото време на ферментациите с LCC290 и LCC3021. Ферментацията с капа-карагенан показва различна тенденция - с нива на диацетил, по-високи от тези на 2,3-пентандиона по време на неговото първо псевдо-устойчиво състояние, след което концентрацията на диацетил пада под тази на 2,3-пентандиона. Данните за концентрацията на пивните дроади и на получения етанол също показват, че по време на ферментацията с капа-карагенан се наблюдават две отделни и уникални псевдо-устойчиви състояния.

Работата по сравняването на различните ферментационни системи и оценката коя от тях работи по-добре, може да е комплексна, когато качествата на системите се оценяват въз основа на повече от един критерий. Например, ако за измерване на постигнатия успех се използва само общата производителност на етанол, всичките три изпитвани системи биха били равностойни, тъй като получаването на 70 g/Ι етанол за обем на реактора от 501 при време на престой 24 h се постига при всичките системи.

Към производството на пиво, което се търси на пазара, се предявяват повече изисквания освен получаването на етанол. Предлаганата ферментационна система би могла да се оцени по отношение на нейната способност да произвежда качествено пиво (сред другите показатели и производителност на етанол и нива на диацетила), като се вземат под внимание възможното постепенно нарастване на разходите за носители, наличност на носителите, лекотата при работа със

66230 Bl системата, опазване на околната среда при депонирането на носителите, стабилността на носителите, както и гъвкавост на работата, осигурявана от носителите. За да се направи оценка на един многоаспектен проблем, бизнес-средите използват бездименсионен метод на анализ, наричан “Съпоставителна карта за отбелязване на резултатите” (Kaplan и Norton, 1996). Първият етап включва идентификация на критериите, по които системата трябва да се оценява. След това на всеки критерий се дава оценка по скала от 1 до 5, като 1 означава най-малко одобрение, а 5 най-голямо одобрение. В края на анализа резултатът от всяка опция се изчислява и алтернативата с най-голям резултат е най-добрият избор.

В Таблица 6.2 са представени резултатите от анализа съгласно “Съпоставителна карта за отбелязване на резултатите”, проведена за носителите за имобилизиране, които се разглеждат като възможни алтернативи за използване в експерименталния биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, и обем 501 за извършване на ферментацията. Бяха подложени на оценка общо 6 носители, като главната цел беше приложимостта им за производство на пиво, което е търсено на пазара. Тези носители са както следва: Chitopearl®, гранули от хитозан Celite®, кизелгур, стъклени гранули от Siran®, гелни гранули от капа-карагенан, средно флокулиращи дрожди LCC3021 и свръхфлокулиращи дрожди

LCC290. Всеки носител беше подложен на оценка съгласно посочената по-горе скала. Свръхфлокулиращите дрожди LCC290 се представят най-добре, следвани близко от средно 5 флокупиращите дрожди LCC3021. Останалите четири носители получиха резултати между 16 и 20. Трета преференция беше дадена на системата с капа-карагенан, тъй като в експерименталното устройство беше произведено пиво, ко10 ето е продаваемо на пазара. Оценката на носителите ясно показва, че бъдещата работа по изследване на системите за непрекъсната ферментация би трябвало да се насочи към самоагрегирането като начин на имобилизиране. 15 Достъпност (лесно достъпен), разходи (ниски разходи поради това, че не е необходима допълнителна екипировка за работа), удобство при работата (съгласуваност в рамките на съществуващите операции на инсталацията), следва да се 20 осигуряват от такава алтернатива, която да надделява над възможна нестабилност на флокулатите от дрожди в система с използване на разбъркване. Възможно е да се използва склонността към разрязване на самоагрегиралите се 25 частици, за да се регулира размера на флокулатите по време на ферментационния процес и е възможно да се достигне по-голям пренос на маса, което води до по-нататъшно увеличение на обемната производителност.

Таблица 6.2 Съпоставяне на няколко носители за имобилизиране при провеждане на главна ферментация на пиво в система на биоректор с газова подемна сила

Chitopearl® Celite® Siran® Карагенан LCC3021 LCC290

Доброкачес- 3 твено пиво

Разходи 2

Достъпност 1

Удобство при 3 работа

66230 Bl

Депониране/околна среда	4	3	4	2	3	3
Устойчивост	4	1	1	3	2	3
Гъвкавост	3	3	3	1	2	5
Общо	20	17	16	18	26	30

6.6. Производство на пиво от вида североамериканско леко пиво по технологията, при която се използва газова подемна сила и смукателна тръба

Производството на леко пиво тип североамериканско (СА) поставя много препятствия пред пивоварите. Леко пиво от типа СА се характеризира със светъл цвят и с ниска степен на горчивина, ниска остатъчна захар, няма доминиращ аромат, от което следва, че няма остатъчен вкус. Поради тези присъщи свойства пивоварите могат да замаскират много малко недостатъци, свързани с вкуса. Високо ниво на диацетил (горчивина), ацеталдехид (зелена ябълка), както и липса на вкус на серни съединения (изгоряла гума, мирис на скункс, развалени яйца, сварени зеленчуци), са най-обикновени проблеми, свързани с вкуса, които тормозят пивоварите. Въпреки че бактериалните замърсявания на ферментационната среда също могат да са причина ароматът на пивото да не е на необходимото ниво, неправилен контрол на ферментационния процес по-често довежда до повисоки от очакваните нива на несъответствие на изискванията за аромат.

По време на опитите по непрекъснатата ферментация, проведени като част от тези тезиси, нивата на замърсяванията в пивната мъст и във ферментационните съдове се контролираше чрез стриктно установени процедури на асептичните методи. Ферментационните опити с всичките три вида носители, които продължиха няколко месеца, показаха, че няма забележими нива на замърсители (наблюденията са извършени чрез методи, описани в Глава 4). По-високи от желаните нива на диацетил (целта е да е под 30 microg/ 1) и ацеталдехид (целта е да е под 10 mg/1) създават проблем пред продукта, получен чрез непрекъсната главна ферментация, но тези нива не се дължат на бактериално заразяване. Тези зак15 лючения не са по-различни от посочените в литературата (Pajunen et al., 2000; Kronlof et al., 2000). Белгийски пивовар обяснява високите нива на ацеталдехид, получен в процеса на непрекъснатата ферментация, с показатели, свързани с продажбите, и маркира продукта като бира с вкус на ябълка (Andries et al., 1996).

Високите нива на диацетил, съпътстващи главната ферментация, също са нормално явление в пивоварната промишленост. Някои пивовари са възприели практиката, наричана “свободно увеличение на температурата”, след завършването на главната ферментация, за да се помогне за намаляването на съдържанието на диацетил. Други просто избират задържане на продуктите за по-дълъг период по време на отлежаване, за да се постигне намаляване на висшите дикетони (диацетил и 2,3-пентандиона) до желаните нива. При друг подход няколко изследователски групи изследват технология на скоростно отлежаване, дискутирана в Глава 2, за да се намалят нивата на диацетил. Въпреки че този подход е ефективен, той добавя друга степен на сложност към целия пивоварен процес, който някои считат, че е трудно да се приеме.

Икономиите от процеса на скоростно отлежаване са много ясни, но в началото на използване на непрекъснато производство в пивоварната индустрия може би е препоръчително да се свеждат до минимум технологичните трудности, за да се спомогне преминаването от традиционната периодична ферментация към непрекъснато производство. По тази причина беше решено да се изследва периодично задържане (задържане на партиди) след непрекъсната главна ферментация в експериментални реактори с газова подемна сила и обем 50 1, за да се контролират високите нива на диацетил в крайния продукт от пиво. Този допълнителен технологичен етап не беше предвиден при започването на тази

66230 Bl

Ph. D. програма, но беше необходимо да се предприеме такава мярка, за да се сравни пивото, получено при непрекъснат режим, с контроли от пиво, получено при периодичен процес.

6.6.1. Периодичен процес на задържане на продукта след непрекъснатата главна ферментация

Важен параметър за определяне завършването на главната ферментация е нивото на диацетил в крайната ферментирала течност. Превръщането на диацетиловия прекурсор - алфа-ацетолактат, в диацетил е лимитиращ етап по отношение на диацетила (Фигура 3.5). Тази първа реакция е химична и зависи в голяма степен от температурата. Ако се подаде “зелена” бира към процеса на отлежаване на студено преди химичното превръщане на алфа-ацетолактата в диацетил, полученото пиво може да има нива на съдържание на диацетил над предела от 20 microg/Ι, свързан с вкусовите качества, освен ако се използват продължителни периоди на отлежаване на студено, за да се осигури бавно превръщане на прекурсора. При всичките три непрекъснати ферментации, описани в раздел 6.5, нивото на диацетил на изхода на реактора беше над желаните стойности от 30 microg/Ι в неразреденото пиво. Ако течността се филтрира на този стадий, за да се отстранят пивните дрожди, диацетилът ще остане висок, от което следва, че трябва да се използва периодичен период при по-високи температури, за да се намали съдържанието на диацетил до необходимото ниво.

Полученото чрез непрекъсната ферментация пиво се събира и задържа в съдове от неръждаема стомана с обем 40 1 при температура 21 °C. Малки проби от течността (100 ml) се източват регулярно и се анализират за диацетил, етанол, относително тегло, естери и фузелови алкохоли. На фигура 6.74 е показано намалението на диацетил в зависимост от времето на задържане на продукта в затоплено състояние за една партида от пиво, ферментирала в непрекъснат процес с пивни дрожди LCC290 в качеството на имобилизирана матрица. Периодът на задържане в затоплено състояние дава резултат по отношение намаляването на диацетила от —600 microg/Ι до по-малко от 30 microg/Ι, което се смята в пивоварната промишленост като “предварително спадане” на нивото.

При друг опит е изследван ефектът от раз бъркване върху намаляването на съдържанието на диацетил по време на периода на задържане. Разпръскван газ от въглероден диоксид (0,14 m³/h) се подава откъм дъното на събирателния съд през система от тръби от неръждаема стомана с диаметър 1,27 cm, за да разбърква течността по време на задържането. На фигура 6.75 са представени резултатите от експеримента. Вижда се, че разбъркването чрез разпръскване на СО₂ има много малко влияние върху скоростта на намаляване на съдържанието на диацетил в съда за задържане. Този резултат може да бъде показателен по отношение незадоволителните резултати от смесването с въглероден диоксид и следователно не се наблюдава увеличение на реакционната скорост на първата химична реакция (превръщане на алфа-ацетолактат в диацетил) или не се увеличава скоростта на пренос на маса за втората реакция, за да се извърши по-бързо (превръщане на диацетила в ацетон е помощта на пивните дрожди). Може също така да е възможно суспензията в съда, която не се подлага на разбъркване, да съдържа достатъчно клетки, с помощта на които се намалява съдържанието на диацетил чрез превръщането му в ацетон, който не е активен по отношение на аромата, когато е настъпило ограниченото по отношение на скоростта химично превръщане (първият етап).

Ефектите от периодичното задържане на партиди в загрято състояние след непрекъснатата главна ферментация върху концентрацията на естери и фузелови алкохоли, а така също върху концентрацията на етанол и относителното тегло, са представени съответно на фигури 6.76 и 6.77. Тези резултати показват, че задържането в загрято състояние оказва малък ефект върху концентрациите на ацеталдехид, етилацетат, пропанол, изобутанол, изоамилалкохол и изоамилацетат (фигура 6.76) Относителното тегло на течността в съда за задържане намалява от 2,7°Р на 2,0°Р през първите 12 h на задържане и след това се стабилизира на тази по-ниска стойност. Концентрацията на етанол беше стабилизирана на 70 mg/в през целия 65-часов период на изпитване. Тези резултати показват, че периодът на задържане оказва влияние главно на концентрацията на диацетил и 2,3пентандиона, докато влиянието му върху съдържанието на естери, фузелови алкохоли и етанол

66230 Bl е минимално.

Периодичното задържане беше проведено с течност, получена при непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила и обем 50 1, като са използвани свръхфлокулиращи пивни дрожди LCC290, средно флокулиращи пивни дрожди LCC3021 или имобилизирани пивни дрожди в капа-карагенан. Данните за намаляване на съдържанието на диацетил на тези три изпитвани системи са представени на фигура 6.78. Съдържанието на диацетил намалява до зададената стойност от 30 microg/1 при всички системи. Но времето, което е необходимо за достигане на това намаление, варира и при трите случая. При случая с LCC290 намалението от 600 microg/1 на 30 microg/1 се постига приблизително за 48 h, а при ферментациите с LCC3021 и с капа-карагенан са необходими само -24 h и -40 h, за да се достигне зададената стойност. Беше прието, че това несъответствие се дължи на изходните стойности на диацетила, а не на вида на използваната имобилизирана матрица.

На фигура 6.79 са илюстрирани същите резултати за диацетила от фигура 6.78, като е регулирано времето на задържане на базата на резултатите от ферментациите с LCC3021 и капакарагенан. Графиките на действителното намаление на диацетила за последните две ферментации са изместени така, че техните начални стойности попадат на графиката за намаляване съдържанието на диацетил, получена при използването на свръхфлокулиращите пивни дрожди LCC290. С тази трансформация намалението на съдържанието на диацетил за трите системи попада върху една и съща линия. Като се използва софтуерът с таблица на кривите (Table Curve 2D), тези резултати, изразени графично, представляват крива, съответстваща на кинетичното уравнение (Levenspiel, 1972) на първия ред на графиката, показана на фигура 6.80. Беше изчислено, че установено, че експерименталните данни от фигура 6.79 съответстват на следното равенство:

[Diacetyl] = 648,54 е<-°-⁰⁴²⁶ '> (6.1) с коефициент на корелация 0,96. Тези резултати потвърждават решително теорията, че всичките три имобилизирани системи показват един и същи потенциал на редукция на диацетила. Резултатите не са изненадващи, тъй като намаляването на диацетила често е свързан с щама пивни дрожди (Nakatani et al., 1984). Системата с капа-карагенан имобилизира пивните дрожди LCC3021 в своята гелна структура, а пивните дрожди LCC290 е избран вариант на щама LCC3021.

След като нивото на диацетил беше под зададената стойност от 30 microg/Ι, полученото пиво отново се задържа на хладно (2°С) за време от 7 дни преди да се пристъпи към крайните етапи на производство (филтриране, разреждане, карбонизиране и разливане в опаковки). В Таблица 6.3 е даден накратко анализ на пивото, получено в експериментална система с използване на пивни дрожди LCC290, пивни дрожди LCC3021 или имобилизирани пивни дрожди в капа-карагенан в качеството на имобилизирани матрици. Фигура 6.81 представлява радарна графика на естери и фузелови алкохоли в три вида пиво, получено в непрекъснат режим и едно контролно пиво промишлено производство, получено с използване на периодичен режим. Като се направи сравнение с промишлено произведеното пиво в периодичен режим (контролата), течностите, получени в непрекъснат режим, имат по-ниско съдържание на естери (етилацетат, изоамилацетат), по-високо съдържание на пропанол и по-ниско на изобутанол, първичен амилалкохол и изоамилалкохол. Нивата на ацеталдехид в продуктите, получени чрез непрекъсната ферментация, са по-високи в сравнение с контролната течност. Нивата на пенливостта, началното помътняване на студено, помътняването на топло, диметилсулфид, серен диоксид, въглероден диоксид и на въздух са в рамките на нормативите.

Няколко други параметри (привиден екстракт, действителен екстракт, изчислен начален екстракт, цвят, горчивина), които тясно се влияят от разреждането на продукта и от изходната концентрация на етанол до крайните стойности на този показател - 5,0 % (об/об), са различни от контролата, тъй като продуктите, получени в непрекъснат режим, изискват по-голяма степен на разреждане с вода, за да се достигнат желаните стойности за съдържание на етанол поради по-високите начални стойности на концентрацията на етанол (70 g/Ι срещу 60 g/Ι при периодичен процес).

На фигура 6.82 е представена радарна графика за алкохол, pH, цвят, горчивина на същите

66230 Bl течности, описани по-горе. Нивата на алкохол, диацетил и pH са добри и са в рамките на зададените, докато цветът и горчивината са извън нормативите. По-светлият цвят е във връзка с поголямата степен на разреждане, което изискват 5 течностите, получени в непрекъснат режим, и това може да се регулира чрез увеличаване на степента на оцветеност на подаваната хранителна среда от пивна мъст. Стойностите за горчивина също зависят от разреждането и също биха могли да се регулират чрез подаваната пивна мъст.

Период на задържан· в затоплено състояние (h)

Диацетил · Понтадион ““ Зададана стойност на диацетил

Фигура 6.74 Концентрация на висши дикетони в зависимост от продължителността на задържане на партиди в затоплено състояние след непрекъснатата главна ферментация с пивни дрожди LCC290 в реактор с газова подемна сила.

|» Боа разбъркване · С раабъркан^· Падддана стойност на диацетил|

Фигура 6.75 Концентрация на диацетил в зависимост от продължителността на задържане на партиди в затоплено състояние след непрекъснатата главна ферментация с пивни дрожди LCC290 в реактор с газова подемна сила. Една проба е разбърквана чрез разпръскване на въглероден диоксид, а другата проба е оставена в статично положение.

66230 Bl

Период на «държане в затоплено оъотоянив (h)

Фигура 6.76 Концентрации на естери и фуаелови алкохоли в зависимост от продължителността на задържане на партиди в затоплено състояние след непрекъснатата главна ферментация с пивни дрожди LCC290 в реактор с газова подемна сипа.

лепнал Отмосинлш тегла

Фигура 6.76 Концентрации на естери и фузелови алкохоли в зависимост от продължителността на задържане на партиди а затоплено състояние . след непрекъснатата главна ферментация с пивни дрожди LCC290 а реактор с газова подемна сила.

66230 Bl § а ί §

Продължителност и· периодичното «адържан· (h) фигура 6.76 Концентрация на диацетил в зависимост от времето на задържаме на партиди в затоплено състояние след непрекъсната главна ферментация С ПИВНИ ДрОЖДИ LCC290, пИВНИ дрожди LC3021 и «мобилизирани пивни дрожди в гел от к-карагенан в системи с газова

Прбдължителиоог не периодичното мдържеМ (h) * LCC2&0 в LOC3021-регулирам· • Кирвгеийн-регулиранв —Праде. грачтм м mmwuwmm

Фигура 6.79 Концентрация на диацетил в зависимост от времето на задържане на партиди в затоплено състояние след непрекъсната главна ферментация С ливни дрожди LCC260, пивни дрожди LC3021 и имобилизиранв ливни дрожди в гел от к-карагенан в система с газова подемна сила. Стойностите за ферментацията с LC3021 и к-карагенан са регулирани, за да имат същата начална точка, както ферментацията с LCC2M.

п л

66230 Bl

фигура 6.80 Концентрация на диацетил в зависимост от времето на задържане на партиди в затоплено състояние след непрекъсната главна ферментация с пивни дрожди LCC290, ливни дрожди LC3021 и имобилизирани пивни дрожди в гел от к-карагенан в система с газова подемна сила. Стойностите за ферментацията с LC3021 и к-карагенан са регулирани, за да имат същата начална точка, както ферментацията с LCC280.

66230 Bl

Таблица 6.3 Кратко описание на анализите на пиво, произведено в система с газова подемна сила.

Показатели	Течност, получена чрез промишлена периодична ферментация	Течност, получена чрез непрекъсната ферментацияс LCC290	Течност, получена чрез непрекъсната ферментация . с LCC3D21	Течност, получена чрез непрекъсната ферментация с карагенан
Въздух (тЦ	<1	0,40	0,35	0,35
Въглероден диоксид (%)	2,75	2.90	2,81	2,73
Серен диоксид (mg/L)	<10	0	0	0
Диметилсулфид (мо/Ц	<70	59	30	30
Горчивина (BU)	12,00	11.30	13,74	13.18
Цвят (SRM)	3,20	2,20	2,10	2,30
pH	4,10	4,15	4,10	4.09
Диацетмл (дд/Ц	<20	12	12	9
Алкохол %. (об/об)	5,00	4,99	5,03	5,04
Алкохол %, (тегл/тегл)	3.93	3,93	3,96	3,96
Привиден екстракт (°Р)	1,55	1,02	1.40	1,44
Действителен екстракт (°Р)	3,35	2,84	3,24	3,27
Начален екстракт fp)	11.00	10.5	11,0	11.0
Помътняване на топло (FTU)	<200	45	50	47
Начално помътняване на студено (FTU)	<100	43	51	54
Пенливост	>170	167	187	175
Ацеталдехид (mg/L)	4,4 ±1 ,3	10,0	21,9	11.5
Пропвнол	12,8 ±6,8	57.6	51,7	84,3

(mg/L)

66230 Bl

Етилацетат	32,4 + 4,3	11.0	10,6	8,7
(mg/L)
Изобутанол	21,6 ± 3,4	10,6	8,3	8,9
(mg/L)
Изходен	20,00 ± 2,3	15,2	9,4	6,4

амилалкохол (mg/L)

Изоамилалкохол	60,9 ± 8,6	48,0	40,9	46,5
(mg/L)
Изоамилацетат	2,5 ±0,7	0,32	0,25	0,18

(mg/L)

Фигура 6.81 Радарна графика на пиво, получено чрез непрекъсната ферментации в система с използване на газова подемна сила и с пивни дрожди LCC290, ливни дрожди LCC3D21 или пивни дрожди LCC3021, имобилизирани в гелни гранули от к*карагенан. Естерите и фузеловиге алкохоли на крайния продукт от пиво са отразени на тази графика. След непрекъснатата главна ферментация всички продукти са подлагани на периодично задържане на партиди в затоплено състояние.

66230 Bl

Цвят (SRM) ^{1 111} Конграпв· 6 LCC2B0 —i LCC3021 Клрагеиан

Фигура 6.82 Радарна графика на пиво, получено чрез непрекъсната ферментация е система с използване на газова подемна сила и с пивни дрожди LCC290, ливни дрожди LCC3021 или пивни дрожди LCC3021, имобилизирани в гелни гранули от к-карагенан. Естерите и фузеловите алкохоли на крайния продукт от пиво са отразени на тази графика. След непрекъснатата главна ферментация всички продукти са подлагани на периодично задържане на партиди в затоплено състояние.

66230 Bl

6.6.2. Избор на най-подходящия газ за разпръскване

Въглеродният диоксид е подходящ за ловенето пивоварни, тъй като той е естествен страничен продукт от ферментацията с дрожди. Отделеният въглероден диоксид се събира в пивоварните и след това газовият поток се подлага на очистване, за да се отстранят незначителните онечиствания, които могат да се пренасят с потока (обикновено серни съединения). Този очистен поток след това се компримира и съхранява в течна форма за следващо използване в пивоварната (чистота 99,95 %). Използването на въглеродния диоксид като газ за разпръскване в непрекъснатата ферментация изглежда да е логичен избор от гледна точка на изпълнение. Инсталацията би могла да използва събирателната система и да извлича СО₂, напускащ непрекъснатата ферментация. Използването на други газове само би добавил други затруднения при изпълнение на съществуващите операции.

Но за да стане непрекъснатата ферментация надеждна алтернатива на сега действащите периодични операции, е необходимо да се произвежда продукт, който е подобен на съществуващите търговски фабрични марки. Разчита се на това, че при намаляване на биологичните/биохимичните въздействия, на които пивните дрожди са подложени по време на непрекъснатата ферментация, би било възможно да се постигне подобен продукт. Въглеродният диоксид е известен с това, че оказва неблагоприятно въздействие на метаболизма на пивните дрожди по време на главната ферментация. Този ефект се усилва при използването на високите цилиндричноконични апарати, където нагнетателното налягане, което е присъщо на системата, затруднява свободното отделяне на СО₂ от течната среда. При тези условия произведените пивни продукти имат по-ниско съдържание на естери и по-високо на фузелови алкохоли. Направени са успешни опити за отстраняване на известна част от СО₂ от ферментацията чрез периодично инжектиране на допълнителен газов поток откъм дъното на цилиндрично-коничния апарат. Може да се допусне, че ефектите от инхибирането на СО₂ се изразяват в намаляване на фузеловите алкохоли и повишаване на нивата на естерите в крайния продукт.

Като се имат предвид тези факти, беше изследвано използването на азот вместо въглероден диоксид като газ за разпръскване в системата с газова подемна сила. Бяха използвани няколко течности, ферментирали в реактори с обем 501 и използване на газова подемна сила, получени в експерименталната пивоварна на Labatt, като се прилагаха следните стадий: След 14 h от събирането на течностите от реактора (24 h време на престой) “зелената” бира се отделя от пивните дрожди. След това тази течност се задържа в продължение на 48 h при стайна температура (21 °C), което осигурява диацетилът и ацеталдехидът да постигнат нормативите на Labatt (диацетил <30 microg/1 и ацеталдехид < 10 mg/ 1).Тази течност след това се остава за отлежаване на студено за време 7 дни, след което се обработва съгласно промишлената практика.

В Таблица 6.4 са съпоставени показателите на крайните пивни продукти, получени чрез непрекъсната ферментация с пивни дрожди LCC290 и разпръскван газ СО₂ и N₂, сравнени със стандартна промишлено произведена течност (контрола). Направена е равностойна оценка на течността, получена при разпръскване на азот, сравнена с промишлено произведената течност. Анализите показват, че има два пъти повече 1пропанол в течността, докато концентрацията на диметилсулфид е приблизително три пъти пониска. Показателите за цвят и горчивина са повисоки от промишлено произведената течност, както и потенциала за пенообразуване, измерен чрез теста NIBEM. Пивото, получено чрез разпръскване на СО₂, има по-ниско съдържание на естери (етилацетат, изомилацетат) и по-високо съдържание на 1-пропанол в сравнение с течността, получена с разпръскван газ азот. Съотношенията на естери (етилацетат, изоамилацетат, етилхексанат, етилоктанат, етилдеканат) към фузеловите алкохоли (1-пропанол, изобутанол, изомилалкохол) се изчислява за контролната течност и за течностите, получени при разпръскване на въглероден диоксид и на азот и са съответно 0,30,0,27 и 0,15.

66230 Bl

Таблица 6.4 Химични анализи за няколко продукта, получени чрез непрекъсната ферментация в система с газова подемна сила и с използване на свръхфлокулиращи дрожди LCC290.

Анализ	Течност от промишлена периодична ферментация	Течност от непрекъсната ферментация и разпръскване на азот	Течност от непрекъсната ферментация и разпръскв. на СО2
Ацеталдехид (mg/L)	2,53	3,68	4,80
Етилацетат (mg/L)	28,08	30,90	14,14
1-пропанол (mg/L)	13,03	28,45	40,03
Изобутанол (mg/L)	17,15	17,89	7,01
Изоамилацетат (mg/L)	2,57	2,06	0,69
Изоамилалкохол (mg/L)	74,54	78,45	51,35
Етилхексаноат (mg/L)	0,140	0,180	0,074
Етилоктаноат (mg/L)	0,110	0,280	0,059
Етилдеканоат (mg/L)	0,0079	0,0630	0,0081
Диацетил (цд/L)	6	9	10
2,3-пентандион (pg/L)	4	5	14
Серен диоксид (mg/L)	1.3	1	0
Диметилсулфид (mg/L)	79	24	64
Горчивина(BU)	11.5	20,6	15,5
Цвят (SRM)	3,1	4,1	3,7
Пяна	176	210	195
CAA (mg/L)		92	84
pH	4,13	4,10	4,19
Действ. екстракт (°Р)	3,38	4,08	3,601
Начален екстракт (°Р)	10,97	12,77	11,50
Алкохол (об/об %)	4,93	5,74	5,17

66230 Bl

Фигура 6.83 представлява радарна графика, на която са представени концентрациите на естери, фузелови алкохоли и ацеталдехид за трите течности. Профилът на течността, получена при разпръскване на азот, следва близко про- 5 фила на контролното пиво с изключение на повисоко съдържание на пропанол. Ферментацията с разпръскване на СО₂ показва много по-ниско съдържание на естери и фузелов алкохол, които не са подобни на контролата. При двете течности, 10 получени чрез непрекъсната ферментация, нивата на диацетил и ацеталдехид са под нормативите на Labatt.

Получените данни показват, че при разпръскването на азот се увеличава получаването 15 на естери до нива, подобни на тези за търговските пивни продукти, докато при разпръскването на въглероден диоксид се получават течности с относително по-ниска концентрация на естери. Тези резултати показват, че в среда от разпръснат СО₂ се променя метаболизмът на пивните дрожди. Нивата на пропанол, независимо от вида на разпръсквания газ, са много по-високи при пивото, получено при непрекъсната ферментация, в сравнение с измерените стойности на контролното пиво, получено при промишлена ферментация. Въпреки че концентрациите на пропанол са под границата от 100 mg/1, отбелязаните различия могат да са индикатор за лека промяна на метаболизма при непрекъснатата ферментация в сравнение с периодичната ферментация. Възможно е също повисокото ниво на пропанол да се дължи на непрекъснатото подаване на аминокиселина треонин, от която чрез разпадане на оксикиселината ще се получи пропанол.

Фигура 6.83 Радарна графика, на която са съпоставяни естерите и фузеловите алкохоли на течности, получени чрез непрекъсната ферментация с разпръскване на газове азот и СО2, с тези на течността, получена чрез промишлена периодична ферментация.

66230 Bl

Глава 7. Изводи

В резултат на изследванията, проведени в рамките на тези тезиси, могат да бъдат направени следните изводи. Качествено пиво без големи вкусови дефекти може да бъде произведено в експериментален биореактор с газова подемна сила, снабден със смукателна тръба, и с обем 501, като се използва непрекъсната главна ферментация, последвана от двудневно периодично задържане, за да се регулира съдържанието на диацетил. Постигнато е минимално време на престой от 24 h или 1 оборот на обема на реактора на ден при ферментацията на пивна мъст с високо относително тегло (17,5°Р), в резултат на което се получава ферментирала течност (2,5°Р). Свръхфлокулиращи дрожди LCC290, средно флокулиращи дрожди LCC3021 и имобилизирани дрожди в капа-карагенан са приложими носители за системата с газова подемна сила. Използването на по-плътни предварително формовани носители като стъклени гранули от Silan® и гранули от кизелгур Celite® не е практическа алтернатива за използване в устройството със смукателна тръба и газова подемна сила. Постигната е минимум 2 месеца ферментация при непрекъснат режим и използване на гелни гранули от капа-карагенан и минимум 3 месеца ферментация при непрекъснат режим с използване на LCC290 и LCC3021, без да се установят микробни замърсявания или нестабилност на работните характеристики на реактора. В допълнение на това, системата, работеща в непрекъснат режим, е способна да работи при възможни и допустими различия в промишлената пивна мъст по време на по-дълъг режим на работа.

При непрекъсната ферментация с използване на свръхфлокулиращи дрожди LCC290 и азот като разпръскващ газ, последвана от двудневно периодично задържане, полученият продукт по вкусови качества отговаря най-близко на промишленото пиво, взето за контрола. Двудневното периодично задържане, осигуряващо намаляване на концентрацията на диацетил в продукта, напускащ реактора за непрекъсната главна ферментация, е резултатно, но не е оптимален регулиращ механизъм. Намалението на диацетила в трите изпитвани системи за непрекъсната ферментация е много сходно и, както предварително се допускаше, тази особеност би могла да се дължи на вида на щама. Продължител ността на периодичното задържане не оказва влияние върху концентрациите на естери и фузелови алкохоли в пивото по време на стадия на задържане.

Използването на 3 % кислород в разпръсквания газ осигурява подходящи нива на кислород в средата от пивна мъст, в резултат на което се поддържа популацията на жизнеспособните пивни дрожди (над 90 %) през целия ход на ферментацията за получаване на пиво с добри вкусови качества. Непрекъснатите ферментации с пивни дрожди LCC290 и LCC3021 като имобилизирани матрици достигат псевдо-устойчиво състояние много по-бързо в сравнение със системата, използваща гелни гранули от капакарагенан. Нестабилността при ферментацията с капа-карагенан за имобилизиране вероятно е резултат от увеличаването на популацията на имобилизираните пивни дрожди, причиняваща ферментация на продукта под зададените нива. За идеално непрекъснато производство това явление е твърде нежелано и е свързано с удължено време за пускане в ход, увеличавайки времето, което е необходимо за взаимодействие и започване отначало, последвано от тежки повреди. Подълга фаза на пускане в ход също така изисква по-дълга фаза на непрекъснат режим на работа, за да стане притегателна за приложение.

Процесът за непрекъснато получаване на гелни гранули осигурява необходимите качества на гранулите за провеждане на изпитания в експерименталните апарати. Необходимо е обаче понататъшно оптимизиране на процеса за производство на гранули, за да се получат гранули с тесен интервал на разпределение по размери. Процесът също така изисква следващи изследвания, за да се определи неговата пригодност за използване в промишлен мащаб. Освен изследването от типа на Kenics, може да се осигури статичен смесител в увеличен мащаб чрез увеличаване на диаметъра, а не само увеличаване на броя на статичните смесители, и тази опция следва да се изпробва, за да стане приемлива за използване.

Индикаторният уред с използване на импулси от киселина, използван в тези тезиси, ни позволи да определим продължителността на смесване и скоростта на циркулация в експерименталния биореактор с обем 50 1 по време на действителна ферментация в среда от свръхфло

66230 Bl кулиращи дрожди LCC290, среднофлокулиращи дрожди LCC3021 и имобилизирани дрожди в капа-карагенан. Данните по смесването съответстват на затихваща синусоидална функция, от която са изчислени продължителността на смесване и скоростта на циркулация.

Осигурено е скоростно смесване в апарата със смукателна тръба и газова подемна сила, като времето за смесване е изчислено на по-малко от 200 s за трите вида имобилизирани носители. Времето за смесване леко намалява с увеличаването на повърхностната скорост на газа и при трите случая. При всички изследвани повърхностни скорости на газа (2 mm/s до 6 mm/ s), системата с LCC290 показва най-бързо време за смесване (между 100 s и 120 s). Продължителността на циркулация е подобна при трите вида носители независимо от повърхностната скорост на газа. Продължителността на циркулация също така намалява линейно при съответното увеличение на скоростта на газа. Пълно смесване в течността (98 % чувствителност на импулс) става в рамките на три до шест циркулационни цикли в реактора за всички изпитвани носители за имобилизиране. Тези резултати потвърждават, че изпитваната експериментална система с обем 50 1 осигурява необходимото смесване за протичане на непрекъсната ферментация. Неподходящите продължителности на смесване са признак за възможни мъртви зони, които не са желани при провеждане на ферментацията на пиво.

Тази изследователска работа ясно показва изпълнимостга на последващо увеличаване на мащабите на производствена система, проектирана, конструирана и работеща в експерименталната пивоварна на Labatt. Използването на биореактор със смукателна тръба и газова подемна сила, като се използват свръхфлокулиращи пивни дрожди LCC290 и разпръскващ газ азот, последвано от двудневно периодично задържане (задържане на порции) при 21 °C, се препоръчва като предпочитана система.

Подробно описание - Част 2 Глава 4. Материали и методи 4.1. Щам дрожди и характеристики В тази експериментална работа се използва щам Saccharomyces cerevisiae за леко пиво от културалната колекция на Labatt (LCC) 3021. Saccharomyces cerevisiae е синоним на Saccha romyces uvarum Beijerinck var. carlsbergensis Kudryavtsev, 1960 (Kurtzman, 1998). При температура 37°C LCC 3021 не се развива. Това спомага за разграничаването на дрождите за леко пиво LCC 3021 от повечето дрожди за английска бира. LCC 3021 е щам, принадлежащ към долноферментиращите пивни дрожди, каквито са повечето щамове за лека бира, но има и изключения. Също така този щам ферментира глюкоза, галакгоза, захароза, малтоза, рафиноза и мелибиоза, но не нишесте. Способността да ферментира мелибиоза е един инструмент, използван от таксономистите за различаване на този щам от дрождите за английско пиво.

Както повечето пивни дрожди, LCC 3021 е полиплоид и се репродуцира чрез митозно делене. При нормални условия дрождите за леко пиво не се репродуцират чрез мейозно делене. Това е свързано с предимството, че щам пивните дрожди са генетично стабилни, тъй като кръстосването на генетичен материал е помалко вероятно (Kreger-van Rij, 1984).

4.2. Приготвяне надрождевия инокулат

Дрождите се взимат от флакони, съхранявани във фризер при криогенна температура от -80°С, и се прави посев на пептон хранителна среда от дрождев екстракт (PYN) агар ((пептон 3,5 g/Ι; дрождев екстракт - 3,0 g/Ι; КН₂РО₄ 2,0 g/1; MgSO₄.7H₂O -1,0 g/1; (NH₄)₂SO₄ -1,0 g/ 1; глюкоза - 20,0 g/1; arap - 20,0 g/1 в dH₂O), за да се получат добре разделени колонии. От развиващи се в продължение на 3-4 дни пивни дрожди се взема стерилен материал, състоящ се от няколко колонии, и с тях се инокулира 10 ml пивна мъст, налята в епруветка. Остава се да се развива при температура 21 °C за една нощ и след това този материал се добавя към пивна мъст с по-голям обем, обикновено 200 ml, за да се увеличи дрождевата биомаса. През следващите дни тази смес се прибавя към друг поголям обем пивна мъст и т.н., докато се получи желаното количество дрождева биомаса. Обикновено се очаква да се получат приблизително 20 g на литър пивна мъст. Културата се подлага на центрофугиране при температура 4°С и 1,0 XI0⁴ rpm (радиус = 0,06 т) за време 10 min. В резултат на центрофугирането течността се отделя, а получената утайка от пивни дрожди с подходяща влажност се използва при ферментацията.

66230 Bl

4.3. Ферментационна среда от пивна мъст В пивоварните на Labatt, Канада се подава пивна мъст с относително тегло 17,7°Р. Концентрацията на ферментируемите въглехидрати, относителното тегло и свободен аминен азот в пивната мъст, използвана за ферментацията през цялата експериментална работа, са дадени в Приложение А2.1. Допълнителни подробности за състава на пивната мъст са представени от Dale et al., 1986, Hoekstra, 1975, Hough et al., 1982, Klopper, 1974, и Taylor, 1989.

Периодични ферментации: Пивната мъст се загрява в автоклави до температура 100°С за време 45 min, след което се охлажда преди да се инокулира с гранули от имобилизирани клетки или свободно суспендирани пивни дрожди.

Непрекъснати ферментации: Използваната пивна мъст за непрекъснати ферментации се пастьоризира с използване на водна пара (използва се топлообменник Fisher, комбиниран поток, тип Eurocal 5FH) преди да се подаде в биореактора с газова подемна сила и тази пивна мъст се наблюдава непрекъснато за микробни замърсявания, както е описано в раздел 4.6. Ако се установят замърсявания в пивната мъст, тя незабавно се източва и инсталацията се зарежда с нова пивна мъст.

Парният пастьоризатор работи с обемна скорост от 0,8 m³/hr. Устройството е снабдено с тръбообразен участък за задържане, където пивната мъст се държи при средна температура 85°С, като минималната температура е 80°С. Обемът на участъка за задържане е 1,13 х 10 ’² т³, който осигурява време на престой в този участък 51 s. След етапа на нагряване пивната мъст се подлага на рязко охлаждане до температура 2°С при изхода на устройството.

4.4. Метод на имобилизиране

Гел от капа-карагенан Х-0909 ни беше предоставен от Copenhagen Pectin А/S. Гелните гранули от капа-карагенан, съдържащи захванати клетки от дрожди за леко пиво, се получават в статичен смесител, както е описано подробно от Neufeld et al. (1996), при начална концентрация на клетки 10⁷ -10’ клетки на 1 ml гел, която се определят точно за всеки експеримент. Както е показано на фиг. 15, процесът в статичния смесител се базира на образуване на емулсия между неводна непрекъсната фаза (еднородна фаза), растително масло (царевично масло Mazola) и водно-диспергирана фаза, разтвор на капа-карагенан (3% (тегл/об)) в КС1, инокулиран с пивни дрожди, като за целта се използват редови полиацетапни статични смесители (Cole-Parmer Instrument Co., САЩ). На схемата в участъка за нагряване, където пивните дрожди бързо се смесват с разтвора на карагенан, в резултат на което се образува емулсия, температурата е 37°С. Желирането на капчиците от капа-карагенан в емулсията се предизвиква от рязкото охлаждане в среда от лед и последващо втвърдяване в разтвор на калиев хлорид (22 g/Ι). Статичен смесител с диаметър 12,7 mm и 24 елемента се използва, за да се получи смес от пивни дрожди и карагенан. Втори смесител с 42 елемента и диаметър 12,7 mm се използва за образуване на емулсията. Използваните в експериментите гранули са 0.5 mm < (диаметър на гранулите) < 2.0 mm.

4.5. Кумулативно разпределение по размери на гелните гранули от капа-карагенан, съдържащи имобилизирани дрождеви клетки

На всеки 301 продукция от гелни гранули се взема произволна проба от гранулите, за да се изчисли разпределението по размери на частиците на базата на утежнена с влага маса. Всяка проба е с тегло във влажно състояние приблизително 500 g. Използва се пресяване на масата, за да се определи разпределението на гранулираните частици по размери. Гранулите преминават през серия от сита с размери на отворите: 2,0, 1,7, 1,4 1,18, 1,0 и 0,5 mm. 4,5 1 разтвор на КС1 (22 g/Ι) се използва за улесняване на пресяването на всяка проба гранули. Приемат се гелни гранули от капа-карагенан, които са с правилна сферична форма, така че диаметърът на ситата да се вземе за диаметър на частиците. Допуска се също, че плътността на частиците е еднаква и не зависи от размера на частиците.

4.6. Изброяване на дрождевите клетки и жизнеспособност

Жизнеспособност на свободно суспендирани пивни дрожди и концентрация на клетките: За определяне на жизнеспособността на дрождевите клетки е използван метода на Американската асоциация на химиците-пивовари, при който се използва оцветяване с метиленово синьо (Technical Committee and Editorial Committee oftheASBC, 1992). Щамът се оценява, като се определя дали развитието на пивни дрож

66230 Bl ди е жизнеспособно или не е, като това определяне се извършва на базата на способността на живите клетки да окисляват оцветителя до безцветна форма. Мъртвите клетки нямат способността да окисляват оцветителя, включително оцветител в синьо. Буфериращият разтвор на метиленово синьо се приготвя чрез смесване на 500 ml от Разтвор А (0,1 g метиленово синьо/500 ml dH₂O) с 500 ml от Разтвор В (498.65 ml от 13.6 g КН₂Р0₄/500 ml dH₂O, смесена с 1.25 ml от 2.5 g Na₂HP0₄.12H₂0/100 ml dH₂O), за да се получи крайният буфериращ разтвор на метиленово синьо с pH 4,6. Разреденият дрождев разтвор се смесва с разтвора от метиленово синьо в епруветка до суспендиране приблизително на 100 дрождеви клетки в микроскопично поле. Малка капка от добре смесената суспензия се поставя на предметното стъкло на микроскоп. След 1 до 5 min контактуване с щама се изброяват оцветените в синьо клетки и клетките, останали безцветни. Процентното определяне на живите клетки се извършва на базата на общото количество изброени клетки. Концентрацията на клетки се определя, като се използва оптичен микроскоп и хемацитометър (Hauser Scientific Company).

Жизнеспособност на имобилизирани клетки и концентрация на клетки: Гелните гранули се сепарират от ферментната течност чрез преминаване на сместа през стерилно сито (500 microm размер на отворите) и промиване с 10 ml дестилирана вода. 1 ml гелни гранули, съдържащи захванати пивни дрожди, се прибавят към стерилен контейнер за с обем 50 ml, в който се съдържат 19 ml дестилирана вода. След това гранулите се разрушават, като за целта се използва апарат Poltron® (Brinkmann Instruments), за да се освободят клетките от гела. Жизнеспособността на клетките и тяхната концентрация след това се определят, както беше описано по-горе за свободно суспендираните клетки.

4.6. Микробиологични анализи

Анализи на течната фаза: Поне веднъж на седмица се вземат проби от непрекъснатите ферментации за провеждане на микробиологични анализи. Използваната в непрекъснатите ферментации пивна мъст също се изпитва за замърсявания преди да се подаде към биореактора. За изпитване присъствието на аеробни и анаеробни бактерии пробите се нанасят върху универсален агар за пивна мъст (UBA, Difco Laboratories), като се добавя 10 mg/1 циклохексимид и се инкубира при температура 28°С за време 10 дни. Пластините, които се изпитват за анаеробни бактериални замърсявания, се поставят в анаеробна стъкленица с AnaeroGen® (оксосъединение), който поглъща останалия в стъкленицата кислород, създавайки анаеробна среда. Анаеробен индикатор (оксосъединение), което се оцветява в розово в присъствие на кислород, се използва за проверка на анаеробните условия в стъкленицата. Замърсявания от диви дрожди се изпитват чрез поставяне на проби в дрождева среда (arap YM, Difco Laboratories) плюс CuSO₄ (0,4 g/1), инкубирани при 25°С за време 7 дни. Пептон, дрождев екстракт, хранителна среда агар, описана по-горе, се използва за проверка за дрождеви замърсявания, които не са за леко пиво, като изпитването се провежда при температура 37°С за време 7 дни. Отсъствието на дрождево развитие в средата от пептон-агар при 37°С показва, че няма пивни дрожди за получаване на пиво тип английска бира, които се развиват при 37°С.

Анализи на гелната фаза: Беше извършен анализ в нашата лаборатория, за да се потвърди, че имобилизираните клетки в гранулите, които ще се използват при ферментациите, не съдържат бактериални замърсявания преди да се подадат в биореактора. Основната грижа беше да се избегне замърсяването с организми, които развалят пивото, като например Pediococcus sp. и Lactobacillus sp. или диви дрожди. 3 ml гелни гранули от карагенан се инокулират в 100 ml от няколко различни течни среди, описани по-долу, поставят се в 250 ml колби при температура 25°С и се разклащат при 100 rpm в инкубаторна клатачка. Течна среда от NBB (Nachweis von Bierschadlichen Bacterien) (BBL cat. # 98139, на базата на течна среда от NBB, съдържаща 0,02 g/Ι циклохексамид) е полуселективна среда, която се използва за установяване на бактерии, които развалят пивото, като например Pediococcus sp. и Lactobacillus sp. Течна среда, съдържаща меден сулфат (16 g/1 YM течна среда Difco; 0,4 g/1 CuSO₄) е полуселективна среда за изпитване за замърсявания от диви дрожди. Накрая стандартни методи (STA) + течна среда от циклохексамид (16 g/Ι течна среда “Standard Methods”, Difco; 0,02 g/1 cycloheximide) се използва за изпитване на бактериални замърсява

66230 Bl ния във водата, отпадната вода, млечните продукти и хранителните среди (Power и McCuen, 1988). Конкретната среда се избира така, че да се открият и идентифицират възможни организми, които могат да повредят пивото в рамките на три дни. Замърсените проби се измерват чрез определяне на помътняването в пробата и се прави предполагаема идентификация на замърсяванията.

Методология за установяване на респираторна недостатъчност на дрождевите клетки: Метод на наслояване с трифенилтетразолиев хлорид (ТТХ): Този метод се използва за определяне на респираторната недостатъчност на пивните дрожди от прекъсване на популацията и се основава на принципа, че ТТХ е безцветна сол, която образува червен преципитат при редукция. Когато ТТХ се наслоява върху дрождевите колонии, развиващи се върху дрожди-пептондекстроза-агар (дрождев екстракт - 10 10 g/1; пептон - 20 g/Ι; декстроза - 20 g/1; arap - 20 g/1 в dH₂O), респираторните повърхностни дрожди ще редуцират ТГХ и тези колонии ще станат тъмно розови до червени. Но дрождите с респираторна недостатъчност няма да редуцират оцветителя и той ще остане с оригиналния си цвят.

Културалната среда периодично се разрежда до подходяща концентрация на микроорганизмите - -100 клетки/0,2 ml. Пластинката от пивни дрожди-пептон-декстроза след това се инкубира приблизително за 3 дни при температура 21 °C докато дрождевите колонии са видими в аеробна среда. Всяка пластинка след това се наслоява с 20 ml ТТХ с температура 50°С. След охлаждане на конкретните разтвори на 50°С горния слой от ТТХ-агар се нанася чрез смесване на Разтвор А (12,6 g/1 NaH₂PO₄; 11,6 g/1 Na₂HPO₄; 30,0 g/1 arap в dH₂O, обработен в автоклав при 121°С, 15 min) с разтвор В (2,0 g/Ι 2,3,5-трифенилтетразолиев хлорид в dH₂O, обработен в автоклав при 121°С, 15 min). Пластинките се изучават след 3 h инкубиране при стайна температура. Процентът на респираторната недостатъчност се представя като процент на неоцветените колонии спрямо общото наблюдавано количество.

4.8. Сканираща електронна микроскопия на пивни дрожди, имобилизирани в гелни гранули от карагенан.

Гелни гранули от капа-карагенан, съдър жащи имобилизирани пивни дрожди, се отвеждат от биореактора през отвор за вземане на проби и се поставят в стъклен флакон със завинтваща се капачка, като гранулите са потопени в малко количество ферментационна течна среда. Флаконът незабавно се покрива с лед и се пренася в изолиращ контейнер до сканиращия оптичен микроскоп. Гелните гранули от капа-карагенан, съдържащи имобилизирани пивни дрожди, се фиксират в 2 % (об/об) глутаралдехид, приготвен от фосфатен разтвор на Sorensen, 0,07 М, pH 6,8 (Hayat, 1972). След това се провежда следващо фиксиране в 1 % (об/об) осмиев четириоксид, приготвен в същия буфер, и дехидратиране чрез серия алкохолни разтвори с различно съдържание на алкохол - 50, 70, 80, 90, 95, 100 % (об/об) за 15 min във всеки разтвор и след това 3 смени в 100 %. Преди критичната точка на изсушаване (Ladd Research Industries, Burlington, VT) чрез въглероден диоксид гранулите се замразяват в течен азот, разрушават се и се поставят в 100 % алкохол. Разрушаването в замразено състояние осигурява откриване на вътрешната повърхност с минимални разрушения. След изсушаване до критичната точка върху пробите се нанася покритие чрез разпрашаване (машина за нанасяне на покрития чрез разпрашаване Polaron SC500, Fison Instruments, Англия) с 30 nm злато/паладий, и след това се сканират с Hitachi S-4500 автоелектронна емисия Hitachi S-4500 на електронния микроскоп Nissei Sangyo, Токио, Япония.

4.9. Протокол за вземане на проби от биореактора

Резервоарът за вземане на проби от биореактора има отвор, снабден с мембранен вентил (Scandi-Brew Type Т). Резервоарът е напълнен с разтвор на етанол - 70 % (об/об), за да се поддържат асептични условия около отвора между вземанията на проби. За да се вземе проба, се отстранява пробката, разположена в основата на резервоара с етанол, подсушава се и се промива старателно с етанол преди да се открие отвора. Пробите се поставят във флакон или стъкленица със завинтваща се капачка, като обемът варира от 5 до 60 ml в зависимост от изискванията на анализа. За да се проведат изпитания за микробиологични замърсявания, 10 ml от ферментационната течност преминава през мембранен филтър с помощта на вакуумна помпа.

66230 Bl

Мембраната c размери на отворите 0,45 microm се поставя в подходящо избрана среда, както е описано в раздел 4.6.

За провеждане на химически анализи през септума на флакон от 100 ml се източва проба от 5 60 ml и се филтрува през филтър, снабден със спринцовка, FP-050, Schleicher and Schull, двус лойна система за филтруване с помощта на спринцовка. Необходимият обем на пробата след това се налива във флакон с обем 10 ml и се покрива със септум от тефлон и алуминиева капачка. Необходимите обеми на пробите са посочени в Таблица 4.1.

Таблица 4.1 Изисквания към обема на пробите за различни химични анализи

Проба	Обем (mL)
етанол	5
диоли с къси вериги	10
летливи в-ва в пивото	12
висши дикетони	5
въглехидрати/относително тегло/	12
свободен аминен азот/протеин	12

4.10. Измерване на разтворения кислород Анализаторът Digox 5 на Dr. Thiedig измерва разтворения във ферментиращата пивна мъст кислород в обхвата 0,001 - 19,99 mg/1 (Anon, 1998). Vilacha и Uhlig, (1985) изпитват много апарати за измерване на разтворения кислород в пивото и намират, че анализаторът Digox осигурява верни и прецизни измервания.

Електрохимичният метод, използван в Digox 5, е на базата на триелектродна схема с потенциометър. Измервателната клетка се състои от измервателен електрод (катод) и електрод-брояч (анод). Тези електроди са потопени в течността, на която трябва да се измери концентрацията на кислород. Наблюдава се реакция на измервателния електрод след фиксиране на определен измервателен потенциал. На големия сребърен измервателен електрод кислородните молекули се редуцират до хидроксилни йони. Две молекули вода реагират с една молекула кислород и абсорбирани четири електрони, в резултат на което се получават четири хидроксилни йони (реакция 4.1)

О₂ + 2Н₂С + 4е 40Н- (4.1)

Анодът от неръждаема стомана абсорбира четирите електрони, освободени на катода, за да се осигури потокът от електрически ток.

В уравнението 4.2 измерената сила на тока I е правопропорционална на концентрацията на кислород C_L0:

I = KxC_L0 (4.2) където константата К се влияе от константата на Фарадей, броя на конвертиралите електрони за молекула, площта на катодната повърхност и широчината на граничния слой на повърхността на измервателния електрод.

Константен измервателен потенциал е важен за селективността (по отношение на кислорода) и прецизността на измерването. Измерваното напрежение се стабилизира чрез сравнителен електрод, който не е натоварен с електрически ток. Това, заедно със стабилизатор на напрежението, който осигурява електронна обратна връзка, осигурява и константен измервателен потенциал. Повърхността на измервателния електрод е свързана електролитично със

66230 Bl сравнителния електрод чрез диафрагма.

Грешката, която е на база измерван обхват на крайната стойност на разтворения кислород, е 3 % (Anon, 1998).

Анализаторът за разтворен кислород се калибрира, като за целта се използва активно калибриране, при което Digox 5 произвежда определено количество кислород по закона на Фарадей (0,500 mg/1) и след това прави двойна проверка с измерените стойности в матрицата. Това позволява апаратът да се калибрира в условия на налягане, температура и движение на потока, съответстващи на тези от измерването, в продължение на 1 min. Тъй като обменът на молекули в сензора е дифузионен процес, той се влияе от температурата, получена в резултат на по-големите реакционни скорости и увеличава измервания ток. Поради това Digox 5 е снабден също така със сензор, който измерва температурата и автоматично компенсира колебанията.

Digox 5 има и някои други предимства. Тъй като Digox 5 не използва електролит, загубата на чувствителност е относително малки и се наблюдават само малки отлагания върху измервателния електрод. Освен това чувствителността може да бъде определена по всяко време чрез провеждане на активно калибриране. Това е проста процедура за очистване на електрода и рекалибриране на апарата. При повечето мембрани-сензори на катода се отлага сребърен хлорид и електролитният разтвор се променя, в резултат на което се отчита прогресивно намаляване на стойностите. По тази причина се препоръчва мембраните и електролитите да се сменят на няколко седмици и след това да се извърши рекалибриране, една дълга и мудна работа. Калибрирането на мембранните сензори обикновено се извършва в лабораторията при нива на насищане с кислород, които могат да причинят значителни отклонения по-специално в пивната мъст и пивната матрица при много ниски нива на кислорода. Температурата има трикратно влияние върху кислородните сензори на базата на мембрана: пропускливостта на мембраната ще се промени, парциалното налягане на кислорода ще се промени и разтворимостта на кислорода в електролита ще се промени. Температурната компенсация за тези три фактора в мембранните сензори е затруднена.

Измерване на разтворения кислород в пив ната мъст в периода на съхранение: Гъвкава тръба Tygon® (вътрешен диаметър j inch), отговаряща по качество на изискванията за хранителни продукти, се свързва асептично към отвора за вземане на проби, разположен в близост до горния край на конусните основи на резервоарите за съхраняване на пивна мъст Т-1 и Т-2 (виж раздел 4.2.1). Перисталтична помпа с променлива скорост осигурява обемен дебит от 11 L/hr през блока на анализатора за разтворен кислород. ((Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, ColeParmer cat. # P-07523-50)). Измерването на разтворения кислород в пивната мъст след това се отчита след 4-5 min.

Измерване на разтворения кислород в биореактора: Преди да се извършат измерванията за разтворен кислород в биореактора анализаторът Digox 5 се почиства. Входният отвор на сензора се свързва към стерилна тръба Tygon® (вътрешен диаметър j inch), отговаряща по качество на изискванията за хранителни продукти. 70 % (об/об) етанолов разтвор се нагнетява през анализатора с обемен дебит приблизително 101/ hr за 15 min. Анализаторът на разтворен кислород се свързва към кран за вода в лабораторията и в продължение на минимум два h през сензора преминава гореща вода (70°С). Този метод се използва вместо стерилизиране с водна пара, тъй като материалите, от които са изготвени детайлите на анализатора, не могат да се подлагат на температура над 70°С. През следващия двучасов санитарен период тръбата и входния и изходния отвор на апарата се затягат, за да се поддържа стерилност в анализатора. Към входния и изходящия отвор на анализатора се свързва току-що стерилизирана тръба на смукателен чадър за ламинарен поток. Свободните краища на тръбата след това асептично се свързват към отворите от неръждаема стомана с вътрешен диаметър j“ на дъното на биореактора и се прави измерването. Когато отворите на биореактора не се използват, те се затварят херметично, като за целта се използва къса стерилизирана тръба Tygon®.

Разтвореният кислород в биореактора се измерва в режим он-лайн чрез източване на ферментационна течност през отвор, разположен в дъното на биореактора. Течността се отвежда от биореактора и преминава през филтър от неръждаема стомана (виж раздел 4.1.2), свързан с j

66230 Bl инчов тръбообразен елемент, който преминава през дъното на биореактора. След това течността преминава през гъвкава тръба Tygon® (вътрешен диаметър] inch), отговаряща по качество на изискванията за хранителни продукти, която е свързана с перисталтична помпа с променлива скорост, осигуряваща на анализатора за разтворен кислород обемен дебит от 111/hr (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat. # P-07523-50). След това ферментационната течност рециклира през втора тръба от неръждаема стомана с вътрешен диаметър j inch, която преминава през дъното на биореактора. За свързване на сензора с биореактора се използва тръба Tygon®, отговаряща по качество на изискванията за хранителни продукти (Cole-Parmer, 1999), поради нейната ниска кислородна пропускливост от 30 cm³ mm/(s-cm²-cmHg)xlO¹⁰. Измерването се прави след 4-5 min циркулация.

4.11.2. Химични анализи

Калибрирането се извършва, като се използват подходящи стандартни реагенти. Всички използвани за анализ реагенти са с чистота >99%. Когато е необходимо, се извършва допълнително пречистване.

4.11.1. Етанол

Концентрацията на етанол се определя, като се използва газова хроматография по вътрешен стандартизиран метод на Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Дегазираните проби се обработват директно с разтвор на изопропанол, 5 % (об/об) и се инжектират в газов хроматограф Perkin Elmer 8500, снабден с детектор на принципа на пламъчна йонизация и автоматичен пробовземател Dynatech. Използва се колона с пречистен кизелгур за хроматографски цели, 80-100 mesh, като в качеството на газов носител се използва хелий. Условия на хроматографския анализ: дебит 20 ml/min, температура на инжектора 175°С, температура на детектора 250°С и температура в колоната 185°С.

4.11.2. Кратко описание на въглехидратите

Определят се концентрациите на глюкоза, фруктоза, малтоза, малтотриоза, малтотетроза, поли-1 (пик 1 на полизахарид) и глицерин, като за целта се използва спектрофизичен (SP8100XR) течен хроматограф, снабден с колона за катионен обмен (Bio-Rad Aminex, НРХ-87К) и детектор с рефракционен индекс (Spectra-Physics, SP6040XR). Преносимата фаза е двуосновен калиев фосфат 0,01 Ми системата е снабдена с автоматичен спектрофизичен пробовземател (SP8110). Приспособлението работи при противоналягане от 800 psi. Дебитът на пробата и елуиращият агент през колоната е 0,6 ml/min, температурата в колоната е 85°С и температурата в детектора е 40°С. Инжектираният обем е microl.

4.11.3. Относително тегло

Относителното тегло на пивната мъст и на ферментационната среда в това изследване е описано по отношение на действителния екстракт (степен на Плато,°Р), която е приета единица, използвана в пивоварната промишленост. Ферментационните проби се филтрират, както е описано в раздел 4.8, и се анализират в уред за измерване на плътност (Anton Paar DMA-58), за да се определи относителното тегло на пивната мъст (степен на Плато). Ферментационните проби се поставят в стъклена U-образна тръбичка и се подлагат на електронно осцилиране за определяне на относителното тегло, като по този начин се определя степента на Плато индиректно. Степента на Плато е цифрова стойност, изразена в проценти (тегл/об), на разтвор на захароза във вода при 20°С, чието относително тегло е същото, както на въпросната пивна мъст. Тъй като скалата на степента на Плато и получените таблици, отнасящи се до относителното тегло на разтвора, в който са разтворени веществата, се базират на воден разтвор на захароза, той е приблизително еднакъв с екстракта. Екстрактът се определя по отношение на общото количество разтворима маса в пивния материал, “каквото е” и/или потенциално по време на обработката (Hardwick, 1995), като например въглехидрати, протеини, танини. Понастоящем в пивоварната промишленост относителното тегло на екстракта се изразява като степен на Плато, тъй като няма по-подходяща и по-добра мярка, която се отнася до промените в състава на пивна мъст с различен произход.

4.11.4. Общо съдържание на диацетил

Общият диацетил (2,3-бутандион) в пивото и ферментационните проби се измерва, като за целта се използва капилярна сепарация (HewlettPackard 5890) и откриване присъствието на даден елемент чрез електронно захващане на базата на метода на Technical Committee and

66230 Bl

Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Методът се прилага за определяне на общото количество диацетил, тъй като той прави измерване на количеството на диацетил и неговия прекурсор алфа-ацетолактат. Газовият носител е съставен от 5 % метан в аргон при 1,0 ml/min и се използва колона от вида J & W DB-Wax. Разделителното съотношение е 2:1, а допълнителният газ е хелий при 60 ml/min. Температурата на инжектиране е 105°С, а температурата на детектора е 120°С.

Системата е снабдена с автоматично пробовземащо устройство Hewlett Packard 7694Е и като вътрешен стандарт се използва 2,3хександион. Продължителността на цикъла е 40 min с време за достигане на равновесно състояние на флакона 30 min при 65°С, време за компримиране - 2 min при 4.8 psig, време за запълване на контура - 0,2 min, време за достигане на равновесно състояние в контура - 0,1 min и продължителност на инжектиране - 0,27 min. Налягането на газовия носител е 18,8 psig, температурата в тръбата за подаване на течността е 95°С, а температурата в контура е 65°С.

4.11.5. Летливи вещества в пивото

Летливите вещества в пивото са ацеталдехид, етилацетат, изобутанол, 1-пропанол, изоамилацетат, изоамилалкохол, етилхексаноат и етилоктаноат и се измерват като се използват вътрешен стандарт с използване на газов хроматограф (Hewlett Packard 5890) и пламъчно-йонизационен детектор. Газовият носител е хелий с дебит 6,0 ml/min, а газовият хроматограф е снабден с автоматичен пробовземател Hewlett Packard 7694.

Температурата на инжектиране в газовия хроматограф е 200°С, а температурата в детектора е 220°С. Профил на температурата в нагревателната камера: 40°С (5 min), 40-200°С (10°С/ min), 200-220°С (50°C/min), 220°С (5 min). Газовете за пламъчно-йонизационния детектор включват: носител с дебит 6,0 ml/min, добавка от хелий - 30 ml/min и 28 psig, Н₂ - 50 ml/min и 25 psig и въздух - 300 ml/min и 35 psig. Септумът се продухва с дебит 0,8 ml/min. Нагнетателното налягане е 4,0 psig. Когато автоматичният пробовземател е свързан чрез индикатор, разположен в отвора за инжектиране, налягането във флакона е 15,9 psig, налягането на газовия носител е 7,1 psig, нагнетателното налягане в ко лоната е 4 psig, дебитът на разклонения поток е 18 ml/min и дебитът на потока в колоната е 6 ml/ min. Температурна зона: флаконът при 70°С, контурът при 80°С, преносимата тръба - при 150°С.

Продължителността на цикъла на газовата хроматография е 40 min, като времето за привеждане в равновесно състояние във флакона е 35 min; време за създаване на налягане - 0,25 min, продължителност на пълнене на контура 0,1 min, време за привеждане в равновесно състояние в контура - 0,1 min, продължителност на инжектиране - 3 min и обем на пробата в контура - 1 ml.

4.11.6. Свободен аминен азот (САА)

Определянето на концентрацията на свободния аминен азот във ферментационната проба се извършва съгласно метода на Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992), при който се използва спектрофотометър Perkin Elmer LS50B. Този спекгрофотометричен метод показва цветна реакция между нинхидрин и присъстващия в пробата азот. Абсорбираното количество директно зависи от присъствието на свободен аминен азот.

а) Цветен реагент: 19,83 g динатриев хидрогенфосфат (Na₂HPO₄)

30,00 g калиев дихидрогенфосфат (КН₂РО₄)

2,78 g нинхидрин монохидрат

1,50 g фруктоза

б) Реагент за разреждане: 2,00 g калиев йодат (К1О₃)

596 ml дестилирана дейонизирана вода

404 ml 95 % (об/об) етанол

Съхраняват се в хладилник и се използват при стайна температура.

в) Изходен глицинов разтвор: 0,1072 g/100 ml дестилирана дейонизирана вода

г) Глицинов стандартен разтвор: изходният глицинов разтвор се разрежда 1:100 (об/об) с дестилирана дейонизирана вода. Този стандартен разтвор съдържа 2 mg/1 свободен аминен азот.

Пробите се разреждат в съотношение 100:1 с дестилирана вода и по 2 ml от разредената проба се въвеждат в три епруветки. Контролната проба се приготвя чрез поставяне на 2 ml дестилирана дейонидирана вода във всяка от трите епруветки. Приготвят се също три

66230 Bl епруветки, всяка от които съдържа по 2 ml стандартен глицинов разтвор.

Към всички проби се прибавя по 1 ml цветен реагент и след това те се поставят на водна баня с температура 100°С точно за 16 min. След това епруветките се охлаждат на водна баня с температура 20°С за време 20 min. По 5 ml от реагента за разреждане се добавят към всяка от епруветките и се смесва старателно. След това пробите се оставят да престоят 10-15 min. Измерва се абсорбцията при 570 nm, като за целта се използва спектрофотометър, и количеството свободен аминен азот се изчислява по формулата 4.3:

САА (mg/1) = (A_p-A_B-A_p)2d/A (4.3), където САА е количеството свободен аминен азот в пробата в mg/1, А_р е средната стойност на съдържание на абсорбирано вещество от изпитвания разтвор, А_в - средната стойност на абсорбираното вещество в контролната проба; А_р е средната стойност на абсорбираните вещества за коригиране вследствие помътняване на пивната мъст и пивото; 2 е количеството САА в стандартния глицинов разтвор; d - коефициент на разреждане на пробата; A_s е средната стойност на абсорбираното вещество за стандартния глицинов разтвор.

Глава 5. Непрекъсната ферментация в система от биореактор с газова подемна сила

За непрекъсната ферментация на пиво е избран биореактор, снабден със смукателна тръба, в който се използва газова подемна сила за осъществяване на непрекъсната циркулация на средата (биореактор от типа ГПСТ). Този тип биореактор е избран поради отличния масообмен (течност-твърда фаза) и високите показатели на смесителния процес. Масообменът течност-твърда фаза е особено важен, тъй като той включва пренос на хранителна среда от течната фаза към твърдата, представляваща биокатализатор от имобилизирани клетки, осигурявайки субстрати за капсулованите пивни дрожди. Тези биореактори също така осигуряват добро аериране, нисък разход на енергия и са с опростена конструкция. Това прави биореакторните системи с газова подемна сила много атрактивни за работа в големи мащаби като тези, които се използват в промишлен мащаб за обработване на отпадъчни води (Driessen et al., 1997; Heijnen, 1993).

5.1. Описание на биореактор, снабден със смукателна тръба, в който се използва газова подемна сила

В този раздел подробно е описан биореакторът с газова подемна сила, използван в тази изследователска работа.

5.1.1. Корпус на биореактора

Биореакторът с обем 13 1 (8 1 работен обем), снабден със смукателна тръба, в който се използва газова подемна сила (биореактор от типа ГПСТ), конструиран за целите на тази изследователска работа, работи с флуидизиран слой, съставен от три фази (течна/твърда/ газова), при който имобилизираните клетки се поддържат в суспендирано състояние чрез въглероден диоксид, осигуряващ вътрешна циркулация на течността (Heijnen, 1996), както е показано на фиг. 16. Снимка на биореактора е показана на фиг. 17, а подробен чертеж е даден на фиг. 18. Въглеродният диоксид и въздухът се подават откъм конусното дъно на биореактора през разпръсквателно устройство от синтерована неръждаема стомана (дюза за разпръскване на СО₂ Part # 9222, Hagedorn & Gannon, USA), която е с дължина 0,11 m и външен диаметър 0,013 т. В качеството на флуидизиращ газ се използва въглероден диоксид, а въздухът се използва за доставяне на кислород на дрождевите клетки.

В колонкообразния биореактор е разположена концентрично смукателна тръба, която функционира като възходяща тръба (подемник) в тази флуидизирана система, докато външният пръстен действа като тръба за низходящ поток. Вътрешната смукателна тръба е окачена към цилиндричен сепаратор за твърдите частици, като е монтирана с помощта на три броя окачващи приспособления от неръждаема стомана в горния разширен участък на биореактора. Разполагането на смукателната тръба и сепаратора за твърди частици във вътрешността на биореактора свежда до минимум риска от микробни замърсявания от външната околна среда.

Обикновено биореакторът е снабден с решетка с отвори, за да се сепарират имобилизираните клетки от течността на изхода на биореактора. Но решетката има склонност да се запушва, поради което се използва цилиндър от неръждаема стомана за отделяне на гранулите от имобилизирани клетки от течната фаза, както се движат над горния край на смукателната тръба и се придвижват надолу в пръстена. Частиците

66230 Bl по-скоро биха могли да се удрят в цилиндъра и да попаднат обратно в обема на течната фаза, отколкото да напуснат биореактора през отвора за изливане. Поради това в близост до изходящия отвор на биореактора има малък участък, в който липсват частици от имобилизирани клетки. Горният разширен участък на биореактора също така увеличава повърхностната площ за отделяне на газови мехури.

5.1.2. Челен капак на биореактора

На фиг. 19 е показан схематично челният капак на биореактора. Отворите в челния капак на биореактора са оформени така, че да се намали до минимум риска от замърсявания. Отворите са или заварени директно към челния капак, или са използвани уплътнени фитинги (Swagelok®). В челния капак са монтирани отвор за инокулата, гилза за температурен сензор, термоизмервателен прибор, септум за газови проби и отвори за източване на течни проби за измерване на разтворения кислород и за връщане на пробите. В гилзата е монтиран температурен сензор, който има обратна връзка с контролна система за измерване на температурата. Тази контролна система дава обратен сигнал към соленоиден вентил, който отваря и затваря подаването на гликол към термичната риза на биореактора. Температурата се наблюдава непрекъснато, като за целта се използва термометър (водонепропусклив термометър, снабден с термоелемент Cole-Parmer #90610-20) и вид Т-сонда, заварена към челния капак на биореактора. Разтвореният кислород се измерва, като за целта се използва анализатор (Dr. Theidig, Digox 5), изискващ дебит на потока от течна среда 9-11 Ι/hr, преминаващ през анализатора, за да се отчита прецизно съдържанието на кислород. Течността се източва от биореактора през тръба с вътрешен диаметър j “, която преминава през корпуса на челния капак и достига течността. Както е показано на фиг. 20, в края на тръбата е монтиран филтър за отстраняване на по-големи частици от течността, която се нагнетява в анализатора за разтворен кислород. След това течността се връща обратно в биореактора през друга тръба с вътрешен диаметър) “, разположена в челния капак.

5.1.3. Санитарни вентили за вземане на асептични проби

Биореакторът е снабден с мембранен вен тил за вземане на проби (Scandi-Brew®), заварен към стената на биореактора. Вентилът е конструиран за вземане на проби при асептични условия. Мембраната затваря директно към страната на ферментационната течност, което позволява подлагането на вентила на пълна стерилизация с водна пара и алкохол чрез два отвора (фиг. 18). Малък външен резервоар с етанол обхваща мембраната, за да поддържа стерилност между вземанията на проби. Този вентил се използва за вземане на всички проби и се приема, че съставът на течността в мястото на вземане на проба не е съществено различен в сравнение със състава на течността, изтичаща през изходящия отвор на биореактора. Както беше отбелязано в главата “Материали и методи” на тази изследователска работа, пробите от биореактора се вземат чрез вентил, разположен на външната стена на биореактора. За да се потвърди предположението, че съставът на течността, изтичаща през изходящия отвор на биореактора, е същият в сравнение с този на течността в пробите, взети от вътрешността на биореактора, е проведено изследване за продължителността на смесване.

За определяне на продължителността на смесване в биореактор с газова подемна сила е използван импулсен индикатор (Chistie, 1989). 1 ml от 10 N НС1 се инжектира бързо в пръстена на биореактора и се регистрира промяната на стойностите на pH. Чрез инжектиране на 10 N NaOH. pH се връща към началната си стойност. pH-електродът (Cole-Parmer, cat. #Р-05990-90) е дълъг 277 mm и е с диаметър 3,5 mm. За наблюдение на стойностите на pH се използва датчик за pH Ingold, модел 2300. Извършва се калибриране в две точки с конкретни стандартни буфери - зелен буфер с pH 7,0 на Beckman, Part#566002, и червен буфер с pH 4,0 на Beckman, Part#566000. Данните се регистрират при честота 3750 Hz за 300 s, като за целта се използва софтуерна програма на Cheryl Hudson и John Beltrano, създадена през 1999 г. (University of Western Ontairo, London, Ontario).

След това данните за стойностите на pH с помощта на алгоритъм Savitsky-Golay се обработват в Таблица на кривите 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Guelph, Ontario). Алгоритъмът на Savitsky-Golay е метод за изравняване на временната област на базата на поли

66230 Bl номно изравняване по метода на най-малките квадрати през движещ се прозорец в рН-метъра (Anon, 1996). След това изравнените данни се нормализират и се създава графика на ДелтарН в зависимост от времето. Продължителността на смесване се взема до най-близката минута, когато pH достигне ~95 % от равновесните стойности.

Продължителността на смесване се измерва при използване натри различни обемни дебита на въглеродния диоксид: 283 cmVmin, 472 cm³/ min (в тази изследователска работа навсякъде се използва обемен дебит) и 661 cm³/min. И при трите случая стойностите на pH в биореактора достигат равновесие (~95 %) за по-малко от 2 min, както е показано в Приложение 1. Приема се, че продължителността на смесване е твърде кратка и доказва нашето първоначално предположение, че системата в биореактора е добре смесена. Това ни позволява да предположим, че съставът на пробите от течност, взети от биореактора, нямат съществено различие от състава на течността, която изтича от изпускателния отвор при средно време на престой в биореактора 24 h. От приложените фигури се вижда, че към смесването чрез диспергиране се наслагва и смесване чрез определена циркулация на течността, което е типично за биореакторите с използване на газова подемна сила (Chisti, 1989).

5.2. Технологична схема на системата за непрекъсната ферментация

Технологична схема на системата за непрекъсната ферментация, която се намира в експерименталната малка пивоварна на Labatt Brewing Company Limited, London, Ontario, е дадена на фиг. 21. В Таблица 5.1 са описани отделните части на системата. Накратко, пивната мъст се получава от инсталацията на Labatt в Лондон, подлага се на стерилизация, като за целта се използва пастьоризатор с използване на мигновено изпаряване (топлообменник от листов материал Fisher, комбиниран поток, тип Eurocal 5FH), и се съхранява в големи събирателни резервоари (Т-1 и Т-2). По време на непрекъснатата ферментация пивната мъст се пренася при регулиран дебит до биореактора (BR-1), съдържащ имобилизирани дрождеви клетки. Ферментиралата течност напуска биореактора, като прелива, и се събира в събирателен съд Т-3. В следващите раздели е описана подробно работата на системата за непрекъсната ферментация, дадена на фиг. 21.

5.2.1. Получаване и съхраняване на пивна мъст

Пивна мъст, която не е обогатена на кислород, използвана за непрекъснатата ферментация, се получава по тръбопровод от инсталацията на Labatt в Лондон и се подава към цилиндрично-коничен резервоар за съхраняване с обем 16001, в който предварително е разпръскван въглероден диоксид, за да се сведе до минимум повишаването на кислород в пивната мъст. Преди да се използват, всички съдове в тази схема, включително събирателните резервоари Т-1 и Т-2, се почистват и подлагат на санитарни процедури съгласно установените правила на Labatt. След това пивната мъст се подлага на пастьоризиране с използване на водна пара и се подава при температура 2°С към събирателния резервоар Т-1 или Т-2 (също предварително обработени чрез разпръскване на въглероден диоксид). Пивната мъст се държи до 2 седмици в тези резервоари при температура 2°С, като от тях се подава течност към биореактора BR-1 за непрекъсната ферментация. В края на двуседмичния период захранването на биореактора се променя така, че пивната мъст се подава от втория резервоар, който съдържа свежа пивна мъст. Двата еднакви събирателни резервоара за пивна мъст Т-1 и Т-2 се използват, за да се сведе до минимум на престоя по време на превключването към свежата пивна мъст. Във всички случаи пивната мъст се изпитва за замърсявания минимум 2 дни преди да бъде подадена към биореактора (BR-1). Ако пивната мъст е замърсена, тя се извежда и незабавно се подава свежа пивна мъст, която се подлага на пастьоризиране.

Минимизиране на разтворения кислород в пивната мъст по време на съхранението: Целта е пивната мъст да се съхранява с минимално константно съдържание на кислород и при ниска температура, без да се изстудява. Това изискване е свързано с предотвратяване на нежелани реакции с участие на кислород, които развалят пивната мъст (Narzip et al., 1993), за да се осигури консистентно подаване на пивна мъст към биореактора и се сведе до минимум риска от микробно замърсяване на пивната мъст по време на съхранението. Големите цилиндричноконични съдове (Т-1 и Т-2) с обем 16001 (нето),

66230 Bl използвани за съхранение на пивната мъст за последващите непрекъснати ферментации, първоначално са проектирани за периодични ферментации, а не като резервоари за съхранение на пивна мъст. Поради това охлаждането на тези съдове не е подходящо за поддържане на температура 2°С. След три дни съхранение на пивната мъст температурната разлика от един участък в друг варираше с 15°С (Таблица 5.2).

Тези топли участъци в резервоара увеличават риска от развитие на микроби. Поради това беше необходимо разбъркване в резервоарите, за да се осигури равномерно ниска температура във всички участъци.

По тези причини в конусната основа на всеки от резервоарите за съхранение на пивна мъст Т-1 и Т-2 беше монтиран тръбен разпръсквател. Експериментите са проведени, за да се определи най-добрият режим за запълване на резервоара с пивна мъст и под държане на константно ниско ниво на разтворения кислород. При първия експеримент резервоарът се пълни с пивна мъст, която се подава без обогатяване с кислород и пастьоризиране. След като резервоарът за съхранение е напълнен с 1600 1 пивна мъст, откъм основата му се разпръсква 0,113 m³/hr въглероден диоксид. При втория експеримент пивната мъст също се подава без обогатяване с кислород и пастьоризиране. Преди пълненето в резервоара се разпръсква въглероден диоксид (0,85 m³/hr) в продължение на 3 h и малки количества СО₂ (0,113 m³/hr) се разпръскват в резервоара при пълненето му. Този поток от въглероден диоксид с нисък дебит непрекъснато барботира в пивната мъст, съхранявана в резервоара, докато се подаде към непрекъснатата ферментация. И при двата експеримента по време на седмичното съхранение концентрацията на кислород в пивната мъст постоянно се наблюдава.

На фигура 5.7 е представена концентрацията на разтворения кислород в зависимост от продължителността на съхранение. Когато резервоарът за съхранение не е предварително продухай с въглероден диоксид, въздухът в обема на съда повишава кислорода в пивната мъст. Без предварително разпръскване в съда е необходим значително по-дълъг период от време за достигане на минимално и константно ниво на разтворения кислород в пивната мъст. Когато резерво арът е продухай предварително, концентрацията на разтворения кислород в пивната мъст остава на константно минимално ниво през цялото време на съхранение. Поради това за провеждане на непрекъснатите ферментации се възприема предварително разпръскване на въглероден диоксид в резервоарите за съхранение на пивна мъст (Т-1 и Т-2) и продухване с поток от въглероден диоксид с малък дебит по време на съхранението на пивната мъст, за да се поддържа минимално положително налягане в резервоара.

Температурният профил в съдовете за съхранение също така се сравнява при разпръскване на 0,113 m³/hr въглероден диоксид и без разпръскване. Освен в пивна мъст, това се прави и във вода, като за целта се използва сонда за измерване на температурата, свързана с термометър (водонепропусклив термометър, снабден с термоелемент Cole-Parmer #90610-20). Вода от градската водопроводна мрежа (16001) се подава в резервоара за съхранение на пивна мъст, оставя се да се приведе в равновесие за време от три дни и температурата на водата се отчита в различни участъци на резервоара. След това водата от резервоара се разпръсква за време 24 h с 0,113 m³/hr въглероден диоксид и температурата отново се отчита. Отчетена е температура на околната среда във всички случаи и температурата в зададена контролна точка в обема на резервоара е 2,0°С.

Както се вижда от Таблица 5.2, при разпръскване на въглероден диоксид температурата в резервоара за съхранение на пивна мъст е поравномерна - в обхвата между 0,1 и 4,1 °C в измервания участък, и съдържанието в резервоара не се подлага на изстудяване. Тази по-ниска температура спомага за предотвратяването на развитие на микроби в пивната мъст по време на съхраняването й.

Отделеният от пивната мъст газ преминава през стерилен газов филтър, разположен в горната част на резервоара. След това пивната мъст се пренася с помощта на перисталтична помпа с променлива скорост (P-1) (Masterflex® L/S™ Digital Standard Drive, Cole-Parmer cat. #P07523-50) до входния отвор на биореактор (BR1) с обем 8 1, като за целта се използва гъвкав тръбопровод Norprene® L/S 16, отговарящ на изискванията за хранителни продукти.

5.2.2. Непрекъсната ферментация в сис

66230 Bl тема от биореактор със смукателна тръба и използване на газова подемна сила

Пивната мъст се подава в биореактора през отвор от j “, разположен в конусното дъно на биореактора BR-1. Смес от въздух, стерилизиран през филтър (Millipore, Millex®-FG_J0,0.2 microm) и въглероден диоксид (99,99% чистота) се подава в биореактора чрез разпръсквател от синтерована неръждаема стомана. Използват се ротаметър (R-З) за контролиране на дебита на въглеродния диоксид при нормална температура и налягане и регулатор за прекалибриране на масата на потока (М-1) за регулиране на дебита на въздуха при нормална температура и налягане. Ферментиралата течност се отвежда от биореактора, като прелива през изходящия отвор, и чрез армирана тръба от PVC с вътрешен диаметър 1” се подава в събирателен съд (Т-3), който се охлажда с външна охлаждаща спирала, през която преминава гликол, като по този начин се под държа температура от 4°С.

5.2.3. Събиране на продукта

Съдът за събиране на продукта (Т-3) е снабден с дълъг входен отвор (вътрешен диаметър 1), който е проектиран така, че ферментиралата течност да тече надолу по стените на съда, за да се сведе до минимум образуването на пяна. Този съд е снабден със стерилен газов филтър (Millipore, Millex®-FG₅₀,0.2 microm) за отделяне на газ от биореактора (BR-1). Събирателният съд периодично се изпразва с помощта на 1/4 вентил (V-12), разположен над основата на съда.

5.2.4. Гликолен охлаждащ контур

Гликолът се пренася от пивоварната в Лондон до експерименталната инсталация при температура -23°С и налягане 45 psig. Той циркулира през охлаждащите ризи на резервоарите за съхранение на пивна мъст (Т-1 и Т-2), биореактора с газова подемна сила (BR-1) и събирателния съд за продукта (Т-3). Двата резервоара за съхранение на пивната мъст и биореакторът са снабдени с температурни датчици, които осигуряват обратна връзка с терморегулаторите, които от своя страна регулират потока от охлаждащия гликол към охлаждащите ризи. Резервоарите съхраняват пивната мъст при температура 2°С, докато температурата в биореактора се регулира в границите от 12 до 22°С в зависимост от спецификата на експеримента. Съдът за събиране на продукта не разполага с автоматичен контрол на температурата, но се контролира ръчно потокът от гликол, за да се под държа температура в съда приблизително 4°С. Не е необходим прецизен контрол на температурата в съда за събиране на продукта (Т-3), тъй като течността в този съд се отвежда и не се подлага на анализи или по-нататъшни процедури.

Гликолът също така се използва за изолиране и охлаждане на тръбите за пренасяне на пивната мъст от резервоарите за пивна мъст (ΤΙ и Т-2) до биореактора (BR-1). След като гликолът циркулира през дадена риза, той се връща в главната тръба, разположена в експерименталната малка пивоварна, след което се връща към инсталацията в Лондон обикновено при температура 15 °C и налягане 40 psig.

5.2.5. Стерилизиране на биореактора

Биореакторът (BR-1) се напълва с 2 % (об/об) разтвор Diversol® СХ/А (Diversey Lever, Canada), който е детергент и през цялата нощ в него се разпръсква газ. След това течността се източва от реактора и той се промива със студена вода. Този цикъл на обработване с пречистващ препарат и промиване с вода се повтаря два пъти. За да се подготви биореакторът за стерилизиране с пара, тръбите за пивна мъст и за подаване на газ се изключват. Тръбата за подаване на пара се свързва към входния отвор на биореактора и се отварят следните вентили, съответно клапани: вентилите на тръбата за подаване на газ за разпръскване (V-7, V-6), вентилът (V-17) за подаване на газ, клапаните (V-9, V-11) на изходящата тръба за продукта, мембранните вентили (V-8, V-10) за вземане на проби и вентилът (V12) на отводнителния отвор на събирателния съд за продукта. След това вентилът за парата на инсталацията бавно се отваря и вентилите на биореактора се регулират така, че малка струя от пара може да се наблюдава на изхода на всеки външен отвор. След обработване с пара в продължение на 60 min всички външни вентили на биореактора се затварят (V17, V-8, V-10, V-12) с изключение на вентила на отклонителната тръба за пивна мъст (V-6). Когато вентилът за подаване на пара се затвори, вентилът на отклонителната тръба за пивна мъст (V6) се затваря и стерилният филтър се свързва към събирателния резервоар, за да се предотврати замърсяването от нестерилен въздух, който навлиза в системата, когато тя се охлажда.

66230 Bl

Когато тръбата на инсталацията за пара се затвори, за да се установи свръхатмосферно налягане докато системата се охлажда, тръбата за подаване на газ към биореактора също се изключва чрез V-17.

5.4. Пускане в ход на ферментационната система

Пивната мъст се подава от инсталацията към съд под налягане, изработен от неръждаема стомана, с обем 20 1 и се нагрява в автоклав за време 45 min при температура 100°С. Имобилизираните клетки се пренасят асептично в охладената пивна мъст (40 % (об/об)). Херметично затвореният съд се транспортира до експериментална инсталация на малката пивоварна, където е разположена системата на биореактора. Съдът с обем 20 1 се свързва към бързодействащо приспособление (Cornelius Anoka, MN, USA), което е скачено към армиран тръбопровод от PVC, 3/8 (Cole-Parmer, USA). Другият край на тръбопровода от PVC е свързан с мембранния вентил (V-8) за вземане на проби на стената на биореактора. Към съда с обем 20 1 се подава с 10 psig стерилизиран чрез филтър въглероден диоксид и мембранният отвор за взимане на проби се отваря така, че сместа от имобилизирани клетки се пренася от съда в биореактора, без инокулата да се излага на външната въздушна среда. Вътрешните компоненти на “бьрзодействащото” приспособление на съда с обем 20 1 се отстраняват, за да се предотврати запушването с имобилизирани клетки по време на пренасянето в биореактора. Кумулативното разпределение на размера на частиците (по-малки от зададен размер) за гелни гранули от капа-карагенан е показано на Фигура 5.8. Средноаритметичният размер на частиците D_pn е изчислен на 1,252 mm, а средният диаметър по Sauter D_psm е 1,17 mm. Средният диаметър на частиците е 1,255 mm. Експерименталните данни и изчисленията за средния диаметър на частиците са дадени в Приложение 1.

След инокулиране с имобилизирани клетки биореакторът работи в периодичен режим, докато концентрациите на захари и диацетил дос тигнат зададените стойности - по-малко от 3°Плато по отношение на относителното тегло и по-малко от 1000 microg/1 диацетил. След това системата се подготвя за непрекъсната работа. За да се промие с гореща вода и се стерилизира с водна пара, тръбата за пренасяне на пивна мъст, клапаните, съответно вентилите V-2 (или V-4 за Т-2), V-5, и V-6 се отварят, a V-1 (или V-3 за Т2) и V-7 се затварят, като се изолира тръбата за подаване на пивна мъст. Тръбата за подаване на пивна мъст се промива с гореща вода при температура приблизително 80°С, която се подава чрез V-2 (или V-4 за Т-2). След цикъла на промиване с гореща вода тръбата за водна пара на инсталацията се свързва на същото място и се провежда стерилизиране с водна пара на тръбата за подаване на пивна мъст за време минимум 30 min. В същото време, когато тръбата за пара е изключена, вентилът (V-6) на обходната тръба също е затворен. След като системата се охлади, V-2 (или V-4 за Т-2) се затварят и тръбата за подаване на водна пара се изключва. Клапанът V-1 (или V-3 за Т-2) на резервоара за пивна мъст се отварят и чрез помпата (Р-1) започва подаването на пивна мъст. Пивната мъст се изпраща към изпускателен канал чрез вентила (V-6) на обходната тръба докато кондензатът в тръбата се замени със свежа студена пивна мъст. След това вентилът на обходната тръба се затваря и се отваря вентилът (V-6) на входния отвор на биореактора, с което се слага началото на непрекъснатата ферментация.

На всеки две седмици резервоарът, от който се подава пивна мъст, се редува с единия от резервоарите за съхранение на пивна мъст (Т-1 и Т-2). След подаване на пивна мъст от Т-1 в продължение надве седмици захранващата помпа Р-1 се спира и вентилът (V-5) на входа на биореактора се затваря. След това тръбата за пренасяне на пивна мъст се свързва към втория резервоар за съхранение на пивна мъст (Т-2) и тръбата се промива и стерилизира, както е описано в предидущия параграф. След това непрекъснатата ферментация продължава само след кратко прекъсване за по-малко от 1 h.

66230 В1

Таблица 5.1 Описание на елементите оттехнологичната схема, показана на Фигура 5.6; ПТфЕ - политетрафлуоретилен;

X	X	r	X	X	&
CD	CD	CD	CD	c; Λ	0
V		**	T	X
co	ο	«	M	u.	z

	<σ	ti	ta	o	e		eg
Q. g	D &	Cl &	n &	s & c	2 n	2 S	S
X Л	£	£	£		1		a
a g uo	Q. Ш « CD 0,	a (U Cl CD CL	a (D Cl ID 0.	s 3 o 1=	s c 4 X	§ e	e c s Θ

F-S Филтър за газ на изходящия отвор на Т-3 <2 bar гьолипропилен, ПТФЕ мембрана,

0.2 микрометра

66230 В1

М-1 Регулатор на масовия дебит на въздух към BR-1 <500 seem 316 НСт. полиамид, Viton*, ограден в кръг

R-1 Ротаметър за въглероден диоксид към Т-1 clOscfh 31S НСт, акрилен блок

R-2 Ротаметър за въглероден диоксид към Т-2 <10scfh 316 НСт, акрилен блок

R-З Ротаметър за въглероден диоксид към BR-1 <2,5sc№ 316 НСт, акрилен блок

с;

а

0

о

U

Ш

и

|нг и

б

б

б

б

б

б

б

б

б

б

б

F' и

X

X

X

I

I

X

X

X

X

I

I

X

X

ф

Ф

<□

CD

co

10

Ф

ф

ω

<0

CD

ф

Ф

Гг·

Т“

Т“

1—

W

Б

rt

rt»

«

и

(П

rt

<т>

rt

М

б х ф

	к а	<д а
8	8	S
V	V	v i- ξ_ i_

Е Е <N са О I

Е

Е CU г.

ОС ш

S

й X л

д>

ш £ № X

S

S

X е х

&

£

й_ О

X CD

S

Е £ ф X g S X я X

Και

γ М rt п:сЕ(£т^смет,1’^,п(а·⁴-®® a.a.cLSiisiSSiSziS·

66230В1

V-12 Вентил (сачмен) за изливане на течността от Т-3 1/4” 316 НСт, силиконово легло о о о Е Е Е ф ф ф

с;	с	с
0	Ο	о
co	ш	co
0	о	о
X	X	X
0	о	0
ж	*	*
X	X	X
ς		с;
X	X	X
о	о	о
X*	д	χ
О X	о X	Q X
со	CD	СО
co	co	co

о с	о	о F
U Ф	1— ф	<Б
q	с:	tz
О	о	0
CD	co	to
0	о	ο
X	X	X
о	Q	0
*		X
X	X с; X	X
о	о	ο
X*		χ*
О X	0 X	0 X
<0	<0	CD
т·	Т“
ео	co	co

66230 Bl

Използвани символи във ФИГ. 21

Гъвкав съединител и нипел

Газов филтър

Регулатор на налягането

Помпа

X Клапан

100Х % твпи/тегл.

Диаметър на чмпимм D mm

Фигура 5.8 Кумулативно разпределение по размери на годните гранули от капа-карагаман, съдържащи имобилизирани дрождови клетки (п = 5)

66230 Bl

Таблица 5.2 Температурен профил на водата в резервоара за съхранение на пивна мъст (Т-1 или Т-2) след привеждане в равновесие в продължение на 3 дни без разпръскване на въглероден диоксид и след часово разпръскване на въглероден диоксид с дебит 0,113 m³/h

Местоположение на измерването в цилиндричноконичния съд	Температура (°C)
Без разпр. на СОг	С разпр. на СО2
На 10 cm под повърхността на течността и наЮ cm от стената на съда	20,6	0,4
На 10 cm под повърхността на течността и в центъра на съда	20,1	0,1
На дъното на цилиндричната част и на 10 cm от стената на съда	3,8	3,7
На дъното на цилиндричната част и в центъра на съда	3,7	4,1
Околна среда на експерименталната инсталация	21,4	19.8

66230 Bl

Концентрация на ратгворен кислород (mg/L)

Фигура 5.7 Концентрация на разтворения кислород в пивната мъст в зависимост от продължителността на задържано и резервоарите за съхранение на пивна мъст (Т-1 и Т-2) и при различни условия на пълнено на резервоарите.

Продължителност ма задържане ма лианата иъст (d)

66230 Bl

Глава 6. Имобилизиране на пивни дрожди в гел от капа-карагенан за получаване на пиво от вида лека бира (Изложението от глава 6.0 е публикувано (Pilkington et al., 1999))

Изследователите са изучавали различни матрици за физическо захващане на здрави клетки, включително калциев апгинат (Bejar et al., 1992; Curin et al., 1987; Masschelein and RamosJeunehomme, 1985; Nedovic et al., 1996; Shindo et al., 1994; White and Portno, 1978), arapoca (Hooijmansetal., 1990; Lundberg and Kuchel, 1997) и гелове от карагенан (Norton et al., 1995; Wang et al„ 1982). Карагенанът е материал, отговарящ по качество на изискванията за хранителни продукти, и той е предпочитан за капсуловането на клетките поради много добрата си здравина в сравнение с другите гелове (Biiyukgiingor, 1992).

В първата част на тази глава е описано наблюдението на три цикъла от повтаряща се периодична ферментация с дрождеви клетки, имобилизирани в гелни гранули от капа-карагенан. Изследвани са жизнеспособността на имобилизираните клетки и отделянето на клетки в течната фаза. Параметрите на ферментационния процес, включващи етанол, малтоза, малтотриоза, фруктоза и глюкоза, са наблюдавани през целия процес на периодичните ферментации и след това са сравнени с параметрите на контролни ферментации, при които са използвани само свободно суспендирани дрождеви клетки при едни и същи условия по отношение на хранителната среда.

Има малко публикувана информация за физичните въздействия върху клетките след дълъг период на имобилизиране (Virkajarvi и Kronlof, 1998) и продължително подлагане на въздействието на външни напрежения и на ферментационните продукти. Във втората част на тази глава са изследвани жизнеспособността, разпределението на клетъчната популация и външния вид на дрождевите клетки, имобилизирани в гелни гранули от карагенан, за един по-дълъг период на непрекъсната ферментация в биореактор с газо ва подемна сила. Също така са изследвани за продължителен период от време относителното процентно съдържание на дрождите с респираторна недостатъчност при популацията на имобилизираните и свободно суспендирани клетки в биореактора.

Карагенанът се приготвя от повтарящи се 3-6 анхидрогалактозни единици и подбрани карагенани, различни по число и позиция на групите на сулфатни естери в повтарящите се галактозни единици. На фиг. 22 може да се види схематично механизмът на желиране на карагенан. Когато карагенанът е в золно състояние, полизахаридните му вериги представляват спирали с произволна конфигурация. Когато се образуват достатъчно спирали за осигуряване на напречни връзки за непрекъсната верига, се наблюдава гелиране. Колкото повече спирали се образуват или когато спиралите образуват агрегати, гелът става по-здрав и по-устойчив (Rees, 1972).

Трите разпространени вида карагенан са ламбда, йота и капа. Както е илюстрирано на Фигура 6.2, те се различават по съдържанието на сулфатни естери и количеството на сулфатки естери оказва влияние върху разтворимостта на полизахаридната верига. Ламбда-карагенан е с високо сулфатно съдържание и няма склоннрст към образуване на гел (Marrs, 1998). Йота-карагенан образува високоеластичен разреден гел в присъствие на калциеви йони и не показва съществен синерезис. Синерезис се наблюдава, когато склонността на гела към образуване на спирали или агрегати е толкова силна, че веригата се уплътнява, в резултат на което на повърхността излизат капки от течността (Rees, 1972). Капа-карагенанът е с умерено съдържание на сулфатни групи, поради което образува по-здрав и по-устойчив гел в присъствие на калиеви йони, и се подлага на известен синерезис. Увеличаването на здравината на гела, което се осигурява от капа-карагенана, го прави подходящ за имобилизиране на здравите дрождеви клетки.

66230 Bl

Фиг. 6.2. Химическа структура на ламбда, йота и капа карагенан

Важна характеристика на карагенана е свойството му за реверсивно терможелиране. При охлаждане на разтвора от карагенан вискозитетът се увеличава и се наблюдава желиране. При нагряване на разтвора вискозитетът намалява и карагенанът се връща обратно в золното си състояние. Чрез регулиране на композицията от желиращи катиони в разтвора може да се променя температурата, при която карагенанът се превръща от зол в гел. Температурата на желиране на капа-карагенана се увеличава с увеличаването на концентрацията на калиев хлорид в разтвора. Тази зависимост се използва за проектиране на процеса на имобилизиране на клетки, тъй като могат да бъдат избегнати строгите изисквания по отношение на температурни колебания (Neufeld et al., 1996). Температурата на желиране на карагенана може да се регулира по такъв начин, че тя да е достатъчно висока, за може карагенанът да е под формата на гел при ферментационните условия, и достатъчно ниска, че дрождевите клетки да могат да се смесват с карагенана, когато са в золно състояние, без да има вредни ефекти върху жизнеспособността на клетките преди желирането на гранулите.

Въпреки това има много фактори, които налагат необходимостта от по-нататъшно изучаване на ефектите от имобилизирането в гелните матрици върху метаболизма и физиологията на дрождевите клетки. Имобилизираните клетки не са изложени на същата микросреда, както свободните клетки в течната фаза, тъй като има допълнителни бариери от гелната матрица и други захванати дрождеви клетки, които трябва да се преодолеят преди субстратите да могат да се придвижат до техните повърхности (фиг. 23). Има много изследвания относно скоростите на масопренасяне в гелните матрици (Estape et al., 1992; Hannoun и Stephanopoulos, 1986; Korgel et al., 1992; Kurosawa et al., 1989; Merchant et al., 1987; Qyaas et al., 1995; Venancio и Tiexiera, 1997), c цел да се изяснят възможните негативни въздействия, които може да има ограничението на хранителната среда върху имобилизираните клетки при провеждането на ферментацията. Действителните коефициенти на дифузия на малките молекули в гела от карагенан са сравними с коефициентите на дифузия на същите молекули във вода, поради което гелът дава възможност за молекулна дифузия на малки молекули, като например тези на глюкозата и етанола. Но в типичната ферментация с използване на имобилизирани клетки хранителните вещества бързо се пренасят до гранулите с имобилизирани клетки главно чрез конвективно пренасяне в допълнение на молекулната дифузия (Hannoun and Stephanopoulos, 1986). След като хранителните вещества навлезат в гранулите, придвижването е относително бавно, тъй като доминира молекулната дифузия. Това означава, че дрождевите клетки в периферията на гелните гранули могат да имат явно предимство по отношение доставянето на хранителни вещества в сравнение с тези, които са в центъра на гранулите.

Стареенето на имобилизираните дрожди също трябвала се вземе под внимание. Захванатите клетки стареят по време на протичането на непрекъснатата ферментация за период от месеци и те ферментират при дефинирани условия на псевдо-устойчиво състояние. Но по време на периодичната ферментация дрождевите клетки са изложени на въздействието на външната среда, която се променя с времето, и клетките се използват повторно само за ограничен брой ферментации преди да се депонират. Повече изследвания са необходими, за да се изучи продължителното въздействие на непрекъснатата ферментация върху жизнеността на дрождевите клетки

66230 Bl по отношение на показателите на ферментацията.

В част А на тази глава са изследвани кинетиките на заселване на дрождите в гелните гранули от капа-карагенан по време на три цикъла на повтаряща се периодична ферментация. Наблюдавани са жизнеспособността и концентрациите на клетки в имобилизирани и свободно суспендирани дрожди, заедно с концентрацията на етанол и захари, както и градусите на Плато. В част Б са изследвани въздействието на продължителността на ферментацията върху местоположението на клетките и тяхното разпределение в гранулите и морфологията на дрождевите клетки. Използван е сканиращ електронен микроскоп за изследване на имобилизирани дрожди в различни участъци на гранулата от капа-карагенан при четири различни състояния: 1) веднага след производството на гранули; 2) след двудневна периодична ферментация; 3) след тримесечна непрекъсната ферментация в експериментален биореактор с използване на газова подемна сила; 4) след шестмесечна непрекъсната ферментация в експериментален биореактор с използване на газова подемна сила. Измервани са също живите дрожди и тяхната концентрация както при имобилизираните клетки, така и свободните клетки в течната фаза. Също така е изследвано относителното процентно съдържание на дрождите с респираторна недостатъчност (имобилизирани и свободни клетки в течната фаза) след четири месеца непрекъсната ферментация в биореактор с използване на газова подемна сила. Получените данни са сравнени с тези от традиционната периодична ферментация на пиво. При всички изследвания е използван щам дрожди за производство на пиво от вида лека бира.

6.1. Експериментална методика

Получаване на гелни гранули от капакараеенан: гел от капа-карагенан Х-0909 ни беше предоставен от Copenhagen Pectin А/S. Гелни гранули от капа-карагенан, съдържащи имобилизирани дрождеви клетки за производство на леко пиво, бяха произведени с използване на статичен смесител с начално зареждане с клетки 2,6 х 10⁷ клетки/ml гел (Патентна заявка 2133789 (Neufeld et al., 1996) и диаметър на гранулите от 0,5 до 2,0 mm.

Ферментационна среда: От пивоварните на Labatt, Канада се доставяше пивна мъст с относително тегло 17,5°Р, както е описано подробно в раздела Материали и методи.

Част А. Кинетика на процеса при повтарящи се партиди с използване на имобилизирани дрожди в гелни гранули от капа-карагенан

Ферментациите се проведоха в ерленмайерови колби с обем 21 при температура 21 °C с разклащане при 150 rpm. Зареждането с носител е 40 % (об/об) гранули с имобилизирани клетки, а общият ферментационен обем ell. Продължителността на всяка ферментация е седем дни. При ферментацията R1 пивната мъст се заквасва със свежи гранули с имобилизирани клетки и в края на ферментацията тези гранули се отделят от ферментационната течност чрез преминаване на сместа през стерилно сито от неръждаема стомана (размер на отворите 500 microm). След това с гранулите се заквасва свежа стерилна пивна мъст при същите пропорции във втора (R2) и след това в трета (R3) периодична ферментация. Вземат се проби два пъти на ден през първите три дни, след това веднъж на ден през четвъртия и петия ден за всяка ферментация. Ферментациите се извършват с две или три паралелни проби. Всички ферментации се провеждат с паралелни контролни ферментации, при които се използват свободно суспендирани клетки, като условията са едни и същи с изключение на заквасването със свободни клетки в количество 4 g/Ι. Пробите се анализират за жизнеспособност на свободните и имобилизирани клетки, тяхната концентрация, както и концентрация на въглехидрати и етанол в течната фаза.

Коефициентите на производителност Y_p/s на етанол и общото количество на ферментируема глюкоза се изчисляват с помощта на уравнението 3.20 за трите ферментационни цикъла с имобилизирани клетки и трите контролни ферментации със свободни клетки. За всички ферментации коефициентите на производителност се изчисляват със започването на ферментацията до времето, когато е завършило изразходването на малтозата.

Продуктивността на етанол У_етанот, т.е. количеството етанол, произведено в общия работен обем на биореактора за единица ферментационно време, се изчислява с помощта на уравнение 3.25 за Rl, R2 и R3 и за контролите със свободни клетки за период от започването на ферментацията до времето, когато е завършило

66230 Bl изразходването на малтозата. При коефициентите на производителност и продуктивността на етанол приносът на имобилизирани и свободно суспендирани дрождеви клетки не се различава.

Локалната максимална специфична скорост на растеж micro_max и времето за удвояване на клетките е изчислено за контролата със свободни клетки, като са използвани уравненията 3.3 и 3.4.

Част Б. Жизнеспособност и морфологични характеристики на имобилизираните дрожди в зависимост от удължаване на времето за ферментация

Условия на периодичната ферментация: Периодичната ферментация е проведена в ерленмайерови колби с обем 21 при температура 21 °C при разклащане със 150 rpm. Зареждането с носител е 40 % (об/об), а общият ферментационен обем е 1 1.

Условия на непрекъснатата ферментация: За провеждане на непрекъснатата ферментация се използват експериментални биореактори с газова подемна сила. Всички събрани показатели са от биореактор с работен обем 8 1 с изключение на микроснимките от сканиращ електронен микроскоп на проби от двумесечна ферментация, взети от биореактор с обем 501, като е използвана същата ферментационна среда и метод на имобилизиране. Гранулите с имобилизирани клетки (40 % (об/об)) се флуидизират в обема на реакторите, като за целта се използва смес от въздух и въглероден диоксид. Реакторите работят при различни условия - ферментационните температури се регулират при 12, 17 и 22°С, а времето на престой е между 0,9 и 1,8 дни. Реакторът с газова подемна сила достига максимална концентрация на етанол от 73 kg/m³ през шестмесечния експеримент със средна концентрация от 58 kg/m³.

Микробиологични анализи: Пробите се вземат от течната фаза на биореактора с газова подемна сила поне веднъж на седмица, за да се изследват за замърсявания, включително за диви дрожди, дрожди, които не са за ферментация на леко пиво, и аеробни и анаеробни развалени пивни бактерии. След четири месеца дрождевите клетки от течната фаза се подлагат на анализ за промяна в респираторната недостатъчност.

Сканиращ електронен микроскоп (СЕМ): Гелни гранули от капа-карагенан (диаметър 1,Ο

Ι,5 mm), съдържащи имобилизирани дрождеви клетки за ферментация на леко пиво, се вземат за анализ със СЕМ при четири различни момента: 1) след получаването на гранули с имобилизирани клетки и преди инокулирането на гранулите във ферментационната среда; 2) след два дни периодична ферментация; 3) след 2 месеца непрекъсната ферментация в експериментален биореактор, снабден със смукателна тръба и с използване на газова подемна сила; 4) след 6 месеца непрекъсната ферментация в експериментален биореактор, снабден със смукателна тръба и с използване на газова подемна сила. Методиката за анализ със СЕМ и приготвянето на съответните проби е описано в раздел 4.7. Използвайки методите, описани в раздел 4.6, са определени концентрацията на дрождеви клетки и тяхната жизнеспособност (имобилизирани и свободно суспендирани) по едно и също време с анализите на СЕМ.

6.2. Резултати и обсъждане

Част А. Кинетика на процеса при многократно използване на дрожди, имобилизирани в капа-карагенан

Ферментационното време значително се намалява всеки път, когато към свежа пивна мъст се подават вече използвани имобилизирани клетки, което се вижда от фигури 6.4 (а), (Ь) и (с), показващи съдържанието на малтоза, малтотриоза, глюкоза, фруктоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията за три повтарящи се периодични ферментационни цикъла. От тези фигури може да се види, че времето за пълното изразходване на захарите е 64 h за R1, 44 h за R2 и 26 h за R3. Свободно суспендираните клетки при контролната ферментация, която не съдържа гранули с имобилизирани клетки, показана на фигура 6.5, изискват 82 h за пълното изразходване на захарите. От графиката, представена на фигура 6.4, може също да се види, че крайните концентрации на етанол са най-високи в третата от трите повтарящи се периодични ферментации с имобилизирани клетки. Тъй като капа-карагенанът е хидрогел, известни количества етанол се пренасят с гранулите, когато те повторно се подават към свежа пивна мъст. Поради това при време нула за R2 и R3 във ферментационната течност присъства известно количество етанол и началната концентрация на глюкоза, малтоза, малтот

11/

66230 Bl риоза и фруктоза е по-ниска при ферментациите с имобилизирани клетки (фигура 6.4) в сравнение с контролната ферментация със свободни клетки (фигура 6.5). Коефициентите на производителност са изчислени за ферментациите така, че добивът g на етанол на g изразходвана захар може да се установи на базата на сравняване.

На фигури 6.6 (а) и (Ь) са сравнени концентрациите на малтоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията за R1, R2 и R3. По време на R1 малтозата се повишава чрез дрождевите клетки почти веднага след като те се въведат в свежите пивни дрожди. Концентрациите на етанол достигат пикови стойности по-рани в R1, а също така достига по-високи концентрации в сравнение с първите две периодични ферментации. Както е показано на фигура 6.6 (Ь), началното забавяне при получаването на етанол при R1 драстично се намалява, когато тези имобилизирани клетки отново се въведат в R2, и намалява още повече при използването на същите клетки в R3.

На фигура 6.7 (а) е показана концентрацията на имобилизирани клетки на единица от общия обем на биореактора в зависимост от продължителността на ферментацията за R1, R2 и R3. Свободните клетки, които са се отделили от матрицата на имобилизираните клетки и са преминали в течната фаза при тези ферментации, в зависимост от продължителността са показани на фигура 6.7 (Ь). На фигура 6.7 (с) е показано общото количество на имобилизираните и свободни дрождеви клетки на единица от общия обем на реактора за трите периодични ферментации. Данните от фигура 6.7 (а) показват, че концентрацията на имобилизирани клетки в гела от капакарагенан продължава да се увеличава след началната си инокулация в пивните дрожди при R1. Когато същите гранули се въведат в свежа пивна мъст за ферментация в R2, развитието в гелните гранули продължава. При третата продължителност, при която капсулованите клетки отново се въвеждат в свежа пивна мъст, скоростта на увеличаване на концентрацията на имобилизирани клетки се забавя. Концентрационният профил на свободните клетки, които се отделят от гелната матрица от капа-карагенан и преминават в течната фаза, имобилизираните клетки и общото количество клетки във ферментацията R1 е показана на фигура 6.8.

При R1 концентрацията на имобилизирани клетки в гелни гранули от капа-карагенан се увеличава със скорост, подобна на тази при контролната ферментация, в която се съдържат клетки само в течната фаза. Това се потвърждава при сравняването на кривата на средно нарастване на свободните клетки при контролната ферментация от фигура 6.9 със същата крива на нарастване на имобилизирани в гелни гранули от капа-карагенан клетки при R1 на фигура 6.10. По време на провеждането на R1 гелните гранули все още не са постигнали пълна колонизация и гелната матрица не показва инхибиторен ефект върху растежа на дрождевите клетки вътре в гранулите. При R2 матрицата ограничава растежа на клетките в обема на гранулите, за което свидетелства по-малкото увеличаване на броя на клетките по време на този ферментационен цикъл. Това би могло да се дължи на вида на гела или на натрупването на дрождеви клетки в гранулите, или липса на подаване на хранителни вещества към клетките.

В Таблица 6.1 са показани добивът на етанол от ферментируемите захари на субстрата и Yp/s за трите периодични ферментации и за контролната ферментация. В Таблица 6.2 са показани обемната продуктивност на етанол, която е изчислена на базата на данните от Таблица 6.1. Добивите на етанол от захари при ферментациите не се различават съществено един от друг или от контролата. Всички добиви са над 90 % от теоретичния добив от 0,51, прогнозиран от уравнението на Guy-Lussac. Както беше отбелязано по-рано, получаването на биомаса и други вторични продукти, образувани от дрождевиге клетки, възпрепятстват производителности над 95 % от теоретичните (Hardwick, 1995). Обемната продуктивност на етанол в биореактора в трите повтарящи се периодични ферментации се различава съществено една от друга. Продуктивността на етанол се увеличава с всеки цикъл от повтарящата се периодична ферментация и при R3 имобилизираните клетки са попродуктивни в сравнение с контролната ферментация. Общото количество етанол, получено в R2, не е много по-голямо от това, което е получено в R1, но продължителността на ферментацията е по-малка от половината на R1 и от контролната ферментация. Има много фактори, които могат да способстват за това увеличение

66230 Bl на скоростта на ферментацията с имобилизирани клетки с всяко повторение на използването им, като например адаптирането на дрождевите клетки към условията на ферментация и прогресивното увеличаване на концентрацията на 5 клетки. Общото количество клетки на единица обем от биореакгора при R3 става значително поголямо в сравнение с това на контролата. На фигура 6.7 (Ь) кривата на концентрацията на свободно суспендираните клетки (отделени от гелната матрица) в течната фаза в зависимост от продължителността на ферментацията показва, че броят на клетките, отделени от гелните гранули, се увеличава с всеки периодичен стадий. След като гранулите се запълнят в по-голяма степен с дрождеви клетки, се наблюдава отделяне на по вече клетки в течната фаза. Hiisken et al. (1996) са провели изследвания, при които са изпитвали разширяването на колониите от бактериални клетки и ерупция/отделяне на клетки от гела от капа-карагенан. Vives и др. (1993 г.) съобщават, че максималната концентрация на дрождеви клетки, които те са достигнали в гелните гранули от капа-карагенан, е 10’ клетки на един грам гел, което отговаря на концентрацията, която се постига в гелните частици при R2. Подобна максимална концентрация на клетки е установена при непрекъснатите ферментации, описани в част В. Но максимално натоварване с клетки на гелната матрица ще зависи от началното натоварване с клетки, съставът на гела и от други фактори.

Продължителност ш ферментация (h)

Фигура 6.4. a) R1, концентрация на малтоза, малтотриоад, глюкоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията при повтарящи се периодични ферментации с използвано на дрождеви клетки за леко пиво, имобилизирани в хяла-каригвнан.

66230 Bl

Концентрация на малтоза, малтотр глкмюп, фруктова, етанол (kg/m*)

Продължителност не ферментация (hj

Фигура 6.4. Ь) R2, концентрация на малтоза, малготрмоза, глюкоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията при повтарящи са периодични ферментации с използване на дрождвви клетки за леко пиво, имобилизираии в капа-карагенан.

66230 Bl

фигура 6.4. c) R3, концентрация на малтаза, малтотриоза, глюкоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията при повтарящи се периодични ферментации с използване на дрождеви клетки за леко пиво, имобилизирани в капа-карагенан.

66230 В1

Концентрация на молтазо, мшпртри глюком, фруктова, етанол (kg/пт⁷)

Фигура 6.5, Концентрация на малтоза, мапготриоза, глюкоза и етанол в зависимост от продължителността на ферментацията при контролните ферментации, при които се използват свободно суспендирани пивни дрожди за леко пиво (няма имобилизирани клетки).

66230 Bl

Концентрвцнл На мвлгом (kg/m

Продължителност м ферментацията (h)

Фигура 6·β. а) Концентрация на малтоза в зависимост от продължителността на ферментацията при повтарящи се периодични ферментации R1, R2 и R3, при които се използват дрождеви клетки, «мобилизирани в гелни гранули от капа-карагенан.

66230 В1

Концентрация на етанол

Продължителност ш ферментацията (h)

Фигура 6.6. Ь) Концентрация на етанол в зависимост от продължителността на ферментацията при повтарящи се периодични ферментации R1, R2 и R3, при които ое използват дрождеви клетки, имобилизирани в гелни гранули от капа-карагенан.

66230В1

Концентрация на имобилизирани клетия на единица общия обем на биореактора (клетки/mL)

фигура 6.7. а) Средна концентрация на имобилизирани дрождеви клетки за леко пиво на единица от общия обем на реактора в зависимост от продължителността на ферментациите при R1, R2 и

R3. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници не експерименталните данни (η·2).

66230 Bl

Концентрация

Продължителност на ферментацията (h)

Фигура 6.7. Ь) Концентрация на дрождеви клетки за леко пиво, които са се отделили в основната маса на течна фаза, на единица от общия обем на реактора в зависимост от продължителността на ферментациите при R1, R2 и R3. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п-2).

66230 Bl

Фигура 6.7. o) Обща концентрация на дрождеви клетки за леко пиво (имобилизирани и в течната фаза) на единица от общия обем на реактора в зависимост от продължителността на ферментациите при

HL R2 и R3. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (л=2).

66230 В1

Профил на концентрацията на дрождеви единица от общия обем на бмореакюре(

Фигура 6.8. Концентрация на клетките - имобилизирани, в течната фаза и общо количество, в зависимост от продължителността на ферментацията за R1 - първата от трите повтарящи се периодични ферментации, при която се използват дрожди за леко пиво, имобилизирани е гелни гранули от капа-карагенан.

66230 Bl

Фигура 6.9 Средна концентрация на свободно суспендирани дрождеви клетки за леко пиво в контролната ферментация (п«3) на единица общ обем на реактора в зависимост от продължителността на ферментацията. По време на тези ферментации не присъстват имобилизирани клетки.

66230 В1

Котадеитрация на имобилизирани клетки единица от общия обем ма биореактора

•е-м

Продължителност (h) фигура В. 10 Концентрация на имобилизирани дрождеви клетки за леко пиво на 1 mL гелни гранули в зависимост от продължителността не ферментациите при Rl, R2, и R3. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п*=2).

66230 Bl <л

Λ «Л ю d o’ ο

& fc £

r

I φ

α.

D Ρ

CL

4J· Ν- φ

Ν· ΙΠ (0

CO

Ο (Μ

Й Ο)

Ο Ο <0 «3 οι λΓ λ)' σί

ο ν- Φ σΓ φ ιη № СП

·*	Γ-	(Μ	(4
<4	η	οί	4
φ	CD	ο	φ
d	сГ	ο	<ί

ο е> φ ο d ο' φ d

Φ ο ο o' d d

α.

φ οο • RJе» οο

Й si

Л/Λ

66230 Bl ментации с имобилизирани клетки (Rl, R2 и R3), сравнена с периодични ферментации със свободно суспендирани клетки.

Таблица 6.2. Продуктивност на етанол в биореактора = (kg произведен етанол) / (т³ обем на биореактора. h)] за периодични фер-

ферментация	Vexanon (kg / m3hr)*
R1	0,470
R2	0,668
R3	1,246
Контрола със свободни клетки	0,805

* Стойността а изчислена, когато малтозата е изразходвана напълно.

Друг фактор, който въздейства на увеличаването на обемната продуктивност в биореактора, наблюдавана при всяка повтаряща се периодична ферментация, е адаптирането на дрождевите клетки. В края на първата ферментация дрождевите клетки са адаптирали своя метаболитен механизъм към дадените ферментационни условия. Това може да има за резултат намаляване на периода на закъснение при започването на следващите периодични ферментации, като с това се повишават скоростите на ферментацията. По време на тези изследвания всички контролни ферментации бяха извършени със свежо приготвени дрожди за леко пиво. Би било интересно свободно суспендираните дрожди от контролата да се внесат отново заедно с повторно използвани имобилизирани клетки за по-нататъшно изследване на този ефект по отношение на въздействието върху концентрацията на клетки.

Фигура 6.11 показва, че жизнеспособността на имобилизираните клетки (за целта се използва метода с метиленово синьо като индикатор) е ниска (< 50%), когато в началото имобилизираните клетки са въведени в пивната мъст при ферментацията R1, но жизнеспособността на имобилизираните клетки е над 90 % след 48 h ферментация. Дрождевите клетки бързо се заселват в гранулите и жизнеспособността им остава висока през целия период на провеждане на ферментацията R3. Но при R3 жизнеспособността леко намалява към края на ферментацията. По време на трите повтарящи се периодични ферментации свободните клетки, които преминават в течната среда, имат по-висока жизнеспособност в сравнение с имобилизираните. Матрицата за имобилизиране може да има негативен ефект върху жизнеспособността на дрождевите клетки (ограничения на масопреноса и/или пространствени ограничения) или живите дрождеви клетки могат преференциално да се отделят от имобилизационната матрица в течната среда в сравнение с мъртвите клетки. Като се използват средните данни за три отделни контролни ферментации със свободно суспендирани дрожди, съдържащи се в Приложение 1, е построена диаграма на Ln(X/Xo) в зависимост от продължителността на ферментацията, която е представена на фигура 6.12. Наклонът е равен на локалната максимална специфична скорост на растеж на клетките при температура 21 °C в пивна мъст с разклащане при 150 грш. Установена е локална максимална специфична скорост на растеж на дрождите 0,096 hr¹, а времето за удвояване на клетките е 7,22 h.micro_max, която е намерена в това изследване, е дефинирана като локална rnicro_max, тъй като, както е отбелязано в теоретичната част, действителната rnicro_max, използвана в уравнението на Monod, се достига само когато S има значително по-голяма стойност в сравнение с константата на Monod К. Необходими са повече изследвания за изчисляване на константата на Monod К за

S определен субстрат при тези ферментации, за да

66230 Bl се потвърди, че изчислената локална micro_max е действителната максимална стойност, както е дефинирана от уравнението на Monod.

Фигура 6.11 Жизнеспособност на имсбилизирани дрождеви клетки за леко пиво (метиленово синьо) в зависимост от продължителността на ферментациите R1, R2 и R3.

66230 Bl

Продъяжитеноот (h) фигура 6.12 Ln(X/Xo) в зависимост от продължителността на периодичната ферментация по време на фазата на експоненциалния растеж на свободно суспендираните дрожди при контролните ферментации; X е концентрацията на клетки при време t, а Хо е концентрацията на клетки при t»O (п=3).

66230 Bl

Част В. Жизнеспособност и морфологични характеристики на имобилизираните дрожди в зависимост от удължената продължителност на ферментацията

След получаването на гранули с имобили- 5 зирани клетки, при което се използват статични смесители, и преди гелните гранули да бъдат изложени на въздействието на ферментационната среда концентрацията на клетки е 2,6 х 10⁷ клетки/ ml гелни гранули (Таблица 6.3, в която стойнос- 10 тите са осреднени от две проби). Изображението от сканиращ електронен микроскоп показва, че клетките са отделно една от друга и са разпределени равномерно в обема на гелните гранули (фиг. 24).

Таблица 6.3. Жизнеспособност (метиленово синьо) и концентрация на свободно суспендирани и имобилизирани клетки от дрожди за леко пиво, захванати в гелни гранули от капа-карагенан, в зависимост от продължителността на ферментацията

Продължи телност	Метод на фермента ция	Свободно суспендирани дрожди в течната фаза	Имобилизирани дрожди в гелната фаза
Жизнесп. (%)	Конц. на кл. (клетки/mL течност)	Жизнесп. (%)	Конц. на кл. (клетки/mL гел)
0	-	-	-	-	2.6Е+07
2 дни	Период.	98	5.5Е+07	92	2.35Е+08
2 месеца	Непрек.	93	2.35Е+08	76	8.60Е+08
6 месеца	Непрек.	92	2.11Е+08	<50*	1.40Е+09*

*На базата на една проба.

Жизнеспособността е >90% след 2 дни периодична ферментация, а концентрацията на клетки в обема на гелните гранули се е увеличила десет пъти (Таблица 6.3). Клетките (> 90% жизнеспособни) също така започват да се отделят от гела и да преминават в основния обем на течна фаза на ферментационния процес, като се осигурява концентрация от 10⁷ клетки/ml от течността. В обема на гелните гранули се образуват малки колонии от дрожди, които са с много белези върху всяка клетка, което се вижда на фиг. 25.

Жизнеспособността на имобилизираните клетки намалява след 2 месеца непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила (Таблица 6.3), но клетките в основния обем на течна фаза остават с висока жизнеспособност (> 90%) и тази констатация важи за няколко различни непрекъснати ферментации в експериментални биореактори с газова подемна сила. Снимката на фиг. 26 от сканиращ електронен микроскоп показва, че след два месеца в близост до периферната част на гранулите се образуват големи колонии от дрожди, потвърждавайки резултатите на други изследователи (Bancel and Hu, 1996; Gdia et al., 1987; Wada et al., 1979; Wang et al., 1982). Направено е сравнение на морфологията на дрождите, намиращи се към външния край на гранулите с имобилизирани клетки, с морфологията на клетките, разположени в центъра на гелните гранули, като това сравнение е направено за няколко проби и са използвани снимки от сканиращ електронен микроскоп. Разположените в периферната част на гранулите клетки са с яйцевидна форма и гладки с много белези на пъпки (фиг. 27), което е показател за размножаване на дрождите (Smart, 1995). Клетките, които са изобразени в центъра на гранулата (фиг. 28) се виждат деформирани и проявяват малка склонност към образуване на белези от пъпкуване. Липсата на белези от пъпкуване може да бъде индикация за възможно ограничение на хранителни вещества в центъра на

66230 Bl гранулите, като например кислород. Повърхностните неравности, наблюдавани на повърхността на дрождите на фиг. 28, може също да са индикатор за стареенето на клетките (Barker и Smart, 1996; Smart, 1999).

Жизнеспособността на дрождите, имобилизирани в обема на гел от карагенан, пада под 50 % след шест месеца непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила (Таблица 6.3). Би следвало да се отбележи, че за шестия месец са събрани данни за концентрацията на имобилизирани клетки и жизнеспособност само в една точка, а отбелязаните данни за четвъртия месец са подобни -концентрация на имобилизираните клетки 1,14 х 10’ клетки/ml гел и жизнеспособност <50%. Докато постепенното намаляване на жизнеспособността на имобилизираните клетки се наблюдава за по-дълго време, жизнеспособността на клетките в основната течна фаза остава сравнително висока. В допълнение към казаното, дори като цяло жизнеспособността на имобилизираните клетки в гранулите да е ниска, за шест месеца непрекъсната работа в биореактора се произвежда напълно ферментирало пиво. Възможни причини за това са същественият принос за ферментационния процес на свободно суспендираните дрождеви клетки, които са с висока жизнеспособност. Също така имат потенциален принос и жизнеспособните имобилизирани клетки, разположени в периферията на гелните гранули, където има по-малки бариери за масопренасяне в сравнение с клетките, разположени в центъра на гранулите. Не е ясно дали имобилизираните клетки имат склонност към преразпределение в обема на гелната матрица или остават в статично положение, където първоначално са разположени. През шестмесечния период на ферментация в обема на тези гранули се достига максимална концентрация от 10’ клетки/ml гелни гранули.

На фиг. 29 е дадено изображение на цяла гранула, направено на сканиращ електронен микроскоп. Тази гранула има кух център и при много изследвани гранули приблизително половина показват такава структура. Тази кухина може да е резултат от структурно разграждане, за което по-нататък е спомогнало и приготвянето на образци за СЕМ. Тази кухина не е наблюдавана при приготвянето на свежи гранули. Предишни изследвания, направени от други из следователи (Bancel et al., 1996), са показали, че растежът на клетките индуцира отслабване на гелната мрежа. Audet et al. (1988) съобщават, че добавянето на лепило от плод на рожков към капа-карагенана изменя механичната здравина на гелните гранули за имобилизиране на бактерии.

През целия шестмесечен експеримент за ферментация на пиво биореакторът с газова подемна сила се тестуваше минимум веднъж на седмица за замърсявания. Не са открити бактериални замърсявания по време на целия експеримент. През последните два месеца на опита са открити замърсяващи дрожди в концентрация между 1 и 5 единици, образуващи колонии, на 1 ml. Тези дрожди могат да растат в среда от PYN при температура 37°С, но не могат да растат аеробно или анаеробно в среда от DUBA, не ферментират декстрин и не показват растеж в среда от CuSO₄ (селективна за диви дрожди).

След петмесечен експеримент за ферментация на пиво средният процент респираторна недостатъчност на дрождевите клетки е 7 %, който е по-висок от този, който обикновено е установен при използване на щам по време на промишлена периодична ферментация (средно 2 %). Други изследователи съобщават подобни данни (Norton и D’Amore, 1995 г.). Респираторната недостатъчност на дрождите е резултат от промяната, която е причина дрождите да не са способни да преработват глюкоза до въглероден диоксид и вода. Тези дрожди имат митохондрия с перманентно понижаване на активността, която обикновено възниква поради изменение в митохондрията на ДНК (Hardwick, 1995 г.).

Артефактите (структурите, които са получени вследствие на обработка) при приготвяне на проби за СЕМ могат да доведат до недоразумения. Технологии, като например ядрен магнитен резонанс (ЯМР), спектроскопия (Fernandez, 1996 г.) и конфокална микроскопия (Bancel и Ни, 1996 г.) са използвани за изпитване на липсата на инвазия. Изображенията от ЯМР позволиха да се проведат изследвания за изучаване на преноса, движението и пространственото разпределение на клетките и биохимията в биослоевете. Изследванията (Bancel и Ни, 1996 г.) показват също, че за наблюдение на клетки, имобилизирани в пористи желатинови микроносители, може да се използва конфокална лазерна сканира

66230 Bl ща микроскопия чрез серийно оптично секциониране.

Въпреки че в пивоварната промишленост се използва метиленово синьо като стандартен индикатор за жизнеспособността на клетките, този метод има много недостатъци (Mochaba et al., 1998 г.). Чрез него се измерва дали дрождевата популация е жизнеспособна или не на базата на способността на живите клетки да окисляват оцветителя и го превръщат в безцветна форма. Мъртвите клетки нямат способността да окисляват оцветителя и той остава син (O’Connor-Cox et al., 1997 г.). Методите на определяне на количеството на микроорганизмите чрез посявка в блюдо на Петри и култура на предметно стъкло се базират на способността на клетките да растат и произвеждат макроколонии върху пластинки от агар или микроколонии върху предметно стъкло на микроскоп (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). При текущата работа по изследване на жизнеспособността на дрождите, имобилизирани в матрици, за по-големи периоди от време понастоящем в Labatt се използва не само методът с метиленово синьо, но също и споменатите по-горе методи, както и изследването с конфокална микроскопия с използване на витално оцветяване. В допълнение към темата за определяне на жизнеспособността на клетките следва да се отбележи, че проблемът с “жизнеспособността” на имобилизираните клетки трябва също да се изследва в бъдеща работа. Когато се използва жизнеспособността, за да се разкрие способността на клетките да растат и се репродуцират, жизнеността определя параметрите на ферментацията, активността или способността на дрождите да се възстановяват от стрес (Smart et al., 1999 г.).

Глава 7. Вкусови качества на пиво, получено чрез непрекъсната ферментация в система с газова подемна сила

7.1. Експериментална процедура

Използването на непрекъсната ферментация за производство на пиво е много различно от други методи с използване на имобилизирани клетки, тъй като полученият продукт не се из мерва само по отношение на един компонент, който представлява интерес, например съдържание на етанол. По-скоро трябва да има баланс на няколко химични съединения, за да може да се получи качествен краен продукт. Изследвано е въздействието на кислорода върху дрождите за получаване на метаболити, придаващи вкусовите качества, по време на непрекъснатата ферментация и по време на спомагателния периодичен стадий на съхраняване. Ефектът от продължителността на престой върху вкусовите метаболити също е изследван на две нива. Накрая, при непрекъснатата ферментация към пивната мъст е добавен промишлено получен ензим - декарбоксилаза алфаацетолактат, и е наблюдавана общата концентрация на диацетил в течната фаза.

7.1.1. Влияние на относителното съдържание на въздух в подавания към биореактора флуидизиращ газ върху дрождевите метаболити по време на главната непрекъсната ферментация

Количеството на въздух, а следователно и на кислород във флуидизиращия газ, подаван в биореактора, се изменя, докато времето за престой, температурата и всички други параметри, регулиращи процеса, остават константни. Общият обемен дебит на газа се поддържа константна величина и е 472 ml/min при нормална температура и налягане, температурата е 15 °C, а гелните гранули от капа-карагенан съдържат имобилизирани дрожди LCC 3021, които се използват през целия период на провеждане на опита с начална концентрация на клетки lxl 0⁸ клетки/ml гел. По време на опита в системата са използвани четири различни обемни дебити на въздуха (Таблица 7.1), а средната продължителност на престой R₍ в биореактора е 1,18 дни.

Таблица 7.1. Обемен дебит на въздуха, подаван към биореактора по време на разпръскването на газ при непрекъсната ферментация. Общият обемен дебит, подаван към биореактора, е 472 ml/min при нормални температура и налягане, а останалата част от газа е въглероден диоксид.

1ПГ

66230 Bl

Обемен дебит на въздуха (mLymin)	Процентно съдържание на въздух във флуидизира щия газ (%(об/об))	Начало (дни)	Край (дни)	Общо време (дни)
94	19,9	10	26	17
354	75,0	27	40	14
34	7,2	41	58	18
0	0	59	66	8

По време на експеримента са извършени многократно следните анализи: свободен аминен азот, общо количество на ферментируем въглехидрат (като глюкоза), етанол, общо количество диацетил, летливи вещества в пивото (избрани естери и алкохоли), концентрация на дрождевите клетки в течната фаза и жизнеспособност. Биореакторът също така се изпитва за замърсявания минимум веднъж на седмица.

Измерва се концентрацията на разтворен кислород в основния обем на течната фаза, когато непрекъснатата ферментация се приеме, че е в псевдо-устойчиво състояние за всеки обемен дебит на въздуха (минимум три оборота на биореактора).

7.1.2. Период на съхранение на продукта на партиди след непрекъснатата ферментация: Ефекти от въздействието на кислорода върху дрождевите метаболити.

Дори когато количеството на кислород във флуидизиращия газ, подаван в реактора, е относително ниско (34 ml/min при нормално налягане и температура), концентрациите на ацеталдехид и общ диацетил, установени по време на експеримента и проведени, както е описано в раздел 7.1.2, са неприемливо високи за пазара на пиво от вида североамериканска лека бира. Поради това е приложен нов подход, при който след непрекъснатата главна ферментация в биореактора течността се съхранява на партиди за 48 h при леко повишена температура от 21 °C, за да се намали концентрацията на тези две вещества. Също резултатите в предидущия раздел 7.1.2 сочат значителен ефект, състоящ се в това, че количеството въздух във флуидизиращия газ оказва влияние на измерените количества съединения, придаващи вкусовите качества. Поради това е изследвано въздействието на дрождевите вкусови метаболити при аеробни в сравнение с анаеробни условия при допълнителното периодично задържане, провеждано след главната ферментация.

Непрекъснатата главна ферментация се проведе в биореактор с газова подемна сила и обем 501, като за целта в опита е използван високофлокулиращ вариант на дрождев щам LCC3021, тъй като изискванията за обема на пробите за изследване са твърде големи в сравнение с биореактор с обем от 81. Работните условия са следните: 1180 ml/min СО₂ и 189 ml/min въздух във флуидизиращия газ при нормални температура и налягане, средна продължителност на престой R_t в биореактора -1,0 ден, температура 15°С и пивна мъст с високо относително тегло от 17,5°Р.

Взети са общо 4 проби (флакони от 100 ml), като две от тях се държат в анаеробни условия, а другите две се излагат на въздействието на аеробна среда.

Процедурата с анаеробните проби е както следва: два флакона с обем 100 ml и 6 флакона с обем 25 ml се подлагат на обработка в автоклав и след това се поставят в анаеробен шкаф (Labmaster 100, mbraun, USA) с разпръскващ /чяч

66230 Bl газ аргон. Флаконите от 100 ml се оставят за 45 min за привеждане в равновесие и след това се запечатват с алуминиеви капачки и преградки от Teflon®. Спринцовка от 50 ml, снабдена с игла от 3 inch, калибър 16, и стерилизирана с разтвор на етанол - 70 % (об/об), се използва за вземане на проби от биореактора чрез пробождане на преградката на мембраната на клапана за проби. След това пробата се инжектира в предварително продухай анаеробен флакон с обем 100 ml. Необходимо е да се осигури канал във флакона чрез допълнителна стерилна игла със спринцовка, за да може да се освободи налягането в обема на флакона по време на пълненето му. След като се вземат от биореактора аеробните проби се излагат на атмосферата чрез пълно отваряне на мембранния вентил за вземане на проби и наливане в незатворен флакон за проби с обем 100 ml, без да се използват спринцовка и игла.

Течността на пробите се остава да престои 2 h при стайна температура, за утаяване на клетките от разтвора, като в основната течна фаза остават клетки с концентрация приблизително 10⁶ клетки/ml. След утаяване течността от всеки флакон с обем 100 ml се отдекантира в три флакона от по 25 ml, за да може да се проведат анализите без да се променя хода на ферментационния процес поради вземането на проби. След като аеробните проби се пренесат в по-малки флакони, те се инкубират при температура 21 °C без да им се поставят капачки. Анаеробните проби се пренасят в три по-малки флакона и се затворят с алуминиеви капачки и преградки от Teflon®. За да се избегне създаване на налягане поради отделяне на въглероден диоксид в обема на флаконите, докато се предотвратява излагането на пробите на въздействието на аеробната околна среда, преградката се пробива с игла. Краят на иглата, изложен на външната среда, се потапя в етанол (помалко от 1 cm от притискащата глава), като с това се предотвратява обратното навлизане на въздух в пробите. Пробите за анализ се вземат на 2,24 и 48 h: Също се взема проба директно от биореактора и незабавно се анализира, за да се определи състоянието на ферментационния процес в обема на биореактора за съответната продължителност. Пробите се анализират за общо съдържание на ферментируеми въглехидрати (като глюкоза), етанол, общо съдържание на ди ацетил и летливи вещества в пивото (избрани естери и алкохоли).

7.1.3. Влияние на продължителността на престой на течността върху дрождевите метаболити по време на непрекъсната главна ферментация

За да се изследва влиянието на продължителността на престой на течността върху метаболитната активност на дрождите, е проведен експеримент, при който по време на непрекъснатата главна ферментация се прилага стъпаловидна промяна на обемния дебит на пивната мъст, подавана към биореактора. При ферментацията се използват дрождеви клетки LCC3021, имобилизирани в гелни гранули от капа-карагенан. Температурата в биореактора се поддържа константна, 17°С, през целия опит. Обемният дебит на газа, подаван към биореактора, също е константна величина и е 472 ml/min при нормално налягане и температура. Газът е смес от въздух (11 ml/min при нормална температура и налягане) и въглероден диоксид (461 ml/min при нормална температура и налягане). Началната концентрация на дрождеви клетки в гела от капа-карагенан е 2.6 х 10⁷ клетки/ml гелни гранули и биореакторът съдържа 40 % (об/об) гранули.

По време на опита са проведени многократно следните анализи: въглехидрати, свободен аминен азот, общо количество на ферментируеми въглехидрати (като глюкоза), етанол, общо количество диацетил, летливи вещества в пивото (избрани естери и алкохоли) и концентрация на дрождеви клетки в течната фаза и жизнеспособност. Също така биореакторът е изследван за замърсявания минимум веднъж на седмица.

7.1.4. Използване на промишлено приготвена декарбоксилаза алфа-ацетолактат за намаляване на общото количество диацетил по време на непрекъснатата главна ферментация на пиво

От повечето пивовари от Северна Америка се счита, че високи концентрации на диацетил са нежелан вкусов дефект на пивото. При провежданите досега непрекъснати главни ферментации общите концентрации на диацетил по принцип са над пределните нива за традиционните периодични ферментации (70-150 microg/1) в североамериканската лека бира. По време на пе

66230 Bl риодичната ферментация диацетилът намалява през по-късните етапи на ферментацията, когато кислородът не е в големи количества и не са въведени допълнителни захари. При непрекъсната ферментация по време на разпръскването 5 на газ в биореактора в непрекъснат режим се подава константно ниско ниво кислород, както и свежа пивна мъст. Поради това е изследвана нова стратегия, при която се използва промишлено приготвен ензим, за да се регулира концентрацията на диацетил в биореактора с непрекъснато действие.

При ферментацията на пивна мъст диацетилът се образува, когато алфа-ацетолактат, междинен продукт при синтеза на валин, окислител но декарбоксилира извън дрождевата клетка. Дрождевата клетка след това реабсорбира диацетила и го превръща в по-малко вкусово активен ацетоин. Това окислително декарбоксилиране на алфа-ацетолактата до диацетил е с ограничена скорост при периодичните ферментации на пивна мъст. При непрекъснатите ферментации общият диацетил на изхода на биореактора е с неприемливи концентрации (300-400 microg/1). Промишлено приготвеният ензим - декарбоксилаза алфа-ацетолактат на фирмата Novo-Nordisk А/S може да се превърне директно в ацетоин, като по този начин се избегне нежеланото междинно съединение диацетил (Фигура 7.1) (Jepsen, 1993 г.).

он он н II о о

О \А

II

Ацетоин

Фигура 7.1 Влияние на докарбоксилазата алфа-ацетолактат

66230 Bl

Декарбоксилаза алфа-ацетолактат се добавя в биореактора, за да се изследва неговото сумарно въздействие (краен ефект) върху общата концентрация на диацетил. Изследвани са и други стратегии за намаляването на диацетила, които включват периодично задържане в загрято състояние за период от 48 h след ферментацията и системи с втори стадии на ферментация с имобилизирани клетки, технологии от Alpha-Laval (Anon, 1997 г.). Тези две стратегии са показали успех по отношение намаляването на нивото на диацетила на изхода на биореактора. Чрез използване на декарбоксилаза алфа-ацетолактат (ДКАА) в пивната мъст, за да се намали съдържанието на диацетил в продукта, отвеждан от биореактора, могат да се сведат до минимум или да се елиминират периодите на след ферментационната обработка.

Активността на декарбоксилазата алфаацетолактат е оптимална при стойност на pH 6,0 при температура 10°С за пивна мъст за производство на лека бира, което е типично за промишлената пивна мъст. Активността на алфа-ацетолактата се повишава в максимална степен при 35°С (Anon, 1994 г.). При типичните условия за ферментация, при които температурата и pH са по-ниски, активността на алфа-ацетолактата е помалка от оптималната.

През 1997 г. Health Canada направи промяна на нормативните актове на Канада (SOR/9781) за хранителни продукти и лекарства, за да позволи използването на декарбоксилаза алфаацетолактат в алкохолните напитки, което е отворена врата за неговото използване в пивоварните на Канада. Bacillus subtilis, носещ генния код на декарбоксилаза алфа-ацетолактат от Bacillus brevis, произвежда този ензим. Тъй като алфаацетолактата е ензим, получен чрез генетично модифициран организъм, има публично схващане, че е необходимо да се изследва неговото поведение преди този ензим да се използва като търговски продукт.

За провеждане на експериментите се използват дрожди LCC3021 за получаване на лека бира. От Labatt в Лондон се доставя пивна мъст с високо относително тегло - 17,5°Р. Измерват се концентрациите на етанол, общото количество на ферментируеми въглехидрати (като глюкоза), общ диацетил и концентрацията на клетки в течната фаза. Дрождевите клетки са имобилизира ни в гелни гранули от капа-карагенан, както беше описано в Глава 4. Биореакторът прави три оборота преди да се приеме, че е достигнал псевдо-устойчиво състояние. Както беше отбелязано по-рано, диацетилния метод, използван в тази разработка, се отнася до “общия диацетил”, тъй като при този метод се измерва количеството на диацетил и неговият прекурсор алфа-ацетолактат. Така, наблюдаваното намаление на общия диацетил по време на експеримента би могло да се дължи на комбинирания ефект от превръщането на ензима алфа-ацетолактат директно в ацетоин и последващо понижаване на концентрацията на неговото производно съединение диацетил.

Декарбоксилаза алфа-ацетолактат е предоставена за лабораторни цели от Novo Nordisk A/S, Denmark като Matures® L. Активността на ензима е 1500 ADU/g, където ADU е количеството ензим, от което при стандартни условия, чрез декарбоксилиране на алфа-ацетолактат се получават 1 micromol ацетоин на минута, което е описано в Метод AF27 на Novo Nordisk (Anon, 1994 г.).

Условия на непрекъснатата ферментация: Непрекъснатата ферментация се провежда в биореактор с обем 8 1, снабден със смукателна тръба, при който се използва газова подемна сила. В него се подават гелни гранули от капакарагенан, в които са имобилизирани дрождеви клетки за производство на лека бира в количество 40 % (об/об). В биореактора се разпръсква газова смес от въглероден диоксид (438 ml/ min при нормални температура и налягане) и въздух (34 ml/min при нормални температура и налягане). Температурата на ферментацията се регулира на 15°С през целия период на опитите, а времето на престой R_t в биореактора е 1,5 дни. При тези условия се наблюдава общата концентрация на диацетил и се достига средна стойност на концентрацията на диацетил при псевдо-устойчиво състояние. След това към пивната мъст се прибавя декарбоксилазата алфа-ацетолактат с концентрация 72 microg/1 (108 ADU/L) и се наблюдава концентрацията на диацетил в биореактора.

Експеримент 1: Пивната мъст се взема от пивоварната в съдове от неръждаема стомана с обем 20 1 и се нагрява в автоклав за време 45 min при 100°С. Пивната мъст се държи при тем

66230 Bl пература 2°C на водна баня с контролирана температура, докато се подаде към биорекатора. Когато в биореактора се достигне концентрация на диацетил в условия на псевдо-устойчиво състояние, към пивна мъст в съда с обем 201 се добавят 72 microg/1 (108 ADU/L) от ДКАА. Началната концентрация на биомаса в гелните гранули от капа-карагенан еЗ х 10’ клетки/ml гел.

Експеримент 2: За да се сведе до минимум рискът от замърсявания, системата е в затворен контур при изходящия отвор, а също така към системата са предвидени и други предпазни средства, както е описано в Глава 4. Както при Експеримент 1, пивната мъст се взема от пивоварната в съдове от неръждаема стомана с обем 201 и се нагрява в автоклав за време 45 min при 100°С. Пивната мъст се държи при температура 2°С на водна баня с контролирана температура, докато се подаде към биорекатора. Началната концентрация на биомаса в гелните гранули от капа-карагенан е 3 х 10⁷ клетки/ml гел. Когато в биореактора се достигне концентрация на диацетил в условия на псевдо-устойчиво състояние, към пивна мъст в съда с обем 201 се добавят 72 microg/1 (108 ADU/L) от ДКАА.

Експеримент 3: Необогатена с кислород пивна мъст със 17,5°Р (14 hL) се подава в голям съд за съхранение на пивна мъст (Т-1) в експерименталната инсталация. След това пивната мъст се пастьоризира с използване на пара и се съхранява, като в нея се разпръсква въглероден диоксид, за да се поддържа константна концентрация на разтворения кислород, <0.10 mg/1, както е описано в Глава 5. От този резервоар пивната мъст се подава в биореактора до достигне на обща концентрация на диацетил в условия на псевдо-устойчиво състояние. След това при асептични условия към пивната мъст се добавя алфа-ацетолактат в количество 72 microg/Ι за провеждане на останалата част от опита. Добавянето на алфа-ацетолактат се осъществява чрез измерване на количеството пивна мъст, останала в резервоара за съхранение, и като се изчисли количеството на алфаацетолактата, което е необходимо за достигане на концентрацията на ензима до зададената стойност от 72 microg/1 (108 ADU/L). Съответното количество ензим след това се разтваря в 10 1 стерилна пивна мъст. Този разтвор се пренася в

1 съд под налягане от неръждаема стомана, който е свързан чрез стерилна тръба с отвора за взимане на проби на резервоара за съхранение на пивна мъст (Т-1). След това разтворът на алфа-ацетолактат се вкарва под налягане в резервоара за съхранение на пивна мъст, като за целта се използва стерилен въглероден диоксид. За да се осигури необходимото смесване на алфаацетолактатния разтвор с пивната мъст в резервоара, дебитът на въглеродния диоксид, разпръскван в съда, се повишава до 4720 ml/min при нормална температура и налягане за време 1 h, след което се връща нормалният дебит. В резервоара за съхранение се съдържа пивна мъст, към която е добавено достатъчно количество алфаацетолактат, за да се завърши опита. Началната биомаса в гелните гранули от капа-карагенан е 10^s клетки/ml гел.

7.2. Резултати и дискусия

7.2.1. Ефект от относителното количество въздух във флуидизиращия газ, подаван в биореактора, върху дрождевите метаболити по време на главната непрекъсната ферментация

На фигури 7.2 - 7.11 са изобразени графично жизнеспособността на дрождите в течната фаза и концентрацията на клетки, както и концентрациите на свободния аминен азот (САА), общо ферментируеми въглехидрати (като глюкоза), етанол, общ диацетил, ацеталдехид, етилацетат, 1-пропанол, изобутанол, изоамилацетат, изоамилалкохол, етилхексаноат и етилоктаноат в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Всички работни параметри на биореактора се поддържат константни по време на опита с изключение на процентното съдържание на въздух в разпръсквания в биореактора газ, което е отбелязано директно на фигурите. В Таблица 7.2 са дадени средните стойности за всеки анализ при псевдо-устойчиво състояние (след минимум три оборота на реактора).

Таблица 7.2 Сумарна таблица, отразяваща въздействието на дебита на въздуха, подаван през разпръсквателя в биореактора, върху концентрациите на дрождите в течната фаза и ключовите дрождеви метаболити в биореактора при продължителност на престой R_t 1,18 дни, като са дадени средните стойности при псевдо-устойчиво състояние.

66230 Bl

Средна* концентрация	Обемен дебит на въздуха (mL/min)
94	354	34
Конц. на клетки (клетки/mL)	3.87Е+08	2.98Е+08	4.73Е+08
Общо ферм. глюкоза (g/100 mL)	1,36	1,25	2,07
САА (mg/L)	196,9	171,7	162,8
Етанол (g/100 mL)	6,14	5,46	5,74
Общо диацетил (ug/L)	346	1417	389
Ацеталдехид (mg/L)	75,62	329,48	28,63
Етилацетат (mg/L)	22,38	21,13	18,01
1-пропанол	44,74	50,89	53,04
Изобутанол (mg/L)	8,73	16,09	8,05
Изоамилацетат (mg/L)	0,38	0,21	0,30
Изоамилалкохол (mg/L)	58,62	61,64	59,16
Етилхексаноат (mg/L)	0,060	0,030	0,053
Бугилоктаноат (mg/L)	0,031	0,013	0,025

*Средна стойност за крайните четири дни при всеки работен параметър

Фигури 7.2 и 7.3 показват, че при този експеримент дрождевата популация в течната фаза не достига нула. Съединенията, придаващи вкусови качества, които са изследвани в тази разработка, се получават чрез комбиниране на свободни и имобилизирани дрождеви клетки и не е определян относителния принос на всеки източник. Има повече от един източник на свободно суспендирани дрождеви клетки: растежа на биомасата и клетките, които са се отделили от гелните гранули и са преминали в основната течна среда. Изследването със съставни модели от отделени и култивирани клетки е показало, че когато клетките са отделени от повърхностните слоеве на биомасата, дори ако биореакторът работи 45 с висока степен на разреждане, все още има популация на клетки в течността (Karamanev, 1991).

На фигура 7.4 е посочена концентрацията на свободен аминен азот (САА) в течната фаза.

Интересно е да се отбележи, че минималната концентрация на свободния аминен азот се наблюдава при дебит на въздуха 34 ml/min при нормална температура и налягане. Това не съвпада с максималната концентрация на етанол или минималните концентрации на общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза).

Концентрацията на етанол в течната фаза в реактора намалява, докато общият ферментируем карбохидрат (като глюкоза) се увеличава, когато обемният дебит на въздуха в разпръсквания газ се увеличи от 94 на 354 ml/min, което се вижда от фигура 7.5. Това може да показва, че има дишане на клетките в по-голяма степен, а не ферментация, поради увеличаването на наличния кислород. Когато обемният дебит отново се намали от 354 ml/min до 34 ml/min при нормална температура и налягане, концентрацията на етанол отново се увеличава, но не дости50

66230 Bl га концентрацията, наблюдавана при обемен дебит от 94 ml/min, тъй като други фактори оказват влияние върху системата, което има за резултат стареене на клетките, ефекти от продължителното въздействие на относително високо 5 количество кислород по времето, когато дебитът е 354 ml/min и промени в популацията на имобилизираните клетки. На фигура 2.4 White и Portno (1978 г.) са отбелязали промени в концентрациите на дрождевите метаболити, свързани с вкусовите качества, в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, провеждана в техния вертикален ферментатор.

На фигура 7.6 е показано ясно изразеното въздействие на кислорода върху получаването на общ диацетил. Тъй като обикновено диацетилът се счита за нежелано вкусово вещество в пивото, една от главните причини за оптимизиране на количеството кислород в биореактора е да се регулират нивата на вкусовите вещества. След периода на продухване на въздух с дебит 354 ml/min дебитът пада на 34 ml/min при нормална температура и налягане и общият диацетил намалява. Известно е, че по време на периодична ферментация увеличаването на кислород води до образуване на алфа-ацетолактат, който е прекурсор на диацетила (Kunze, 1996).

На фигура 7.7 е показана ясно изразена зависимост между количеството на въздух в разпръсквания газ и концентрацията на ацеталдехид. Когато процентното съдържание на въздух в разпръсквания газ се увеличи, количеството на аце15 талдехид също се увеличава. Ацеталдехидът придава на пивото вкус на зелена ябълка и обикновено присъства в промишлено произвежданото пиво на нива, по-малки от 20 mg/1.

1.00Е+1Д

1.1

<0

X

S 10 15 2025»8β4θ4ββ05880β5 70

Продължителност на непрекъснатата ферментация (h)

Фигура 7.2 Концентрация на дрождеви клетки в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

66230 Bl

Фигура 7.3 Жизнеспособност на дрождите в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

66230 Bl

810 15 »»»»««« «Μ

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни) фигура 7.4 Концентрация ка останалия в пивната мъст свободен аминен азот в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента обшият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

66230 Bl

Концентрация на етанол и фермемтируема глюкоза (g/100mL)

е 10(баа»Л««50БЮ6«75

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.5 Концентрация на етанол и общ ферментируем въглехидрат {като глюкоза) в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит ка газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

66230 Bl

ο 5 10 1ί 2025Χ8Β40«β06ββ06«70

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.6 Обща концентрация на диацетил в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. . Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпрьсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/mln при нормална температура и налягане.

66230 Bl

Концентрация на ацеталдехид (mg/L)

Продължителност на непрекъснатите ферментация (дни)

Фигура 7.7 Концентрация на ацеталдехид в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа а въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

66230 Bl

В Таблица 7.2 и фигури 7.8 - 7.9 са дадени концентрациите на етилацетат, изоамилацетат, етилхексаноат и етилоктаноат при псевдо-устойчиво състояние на системата в зависимост от прод ължителността на непрекъснатата ферментация. За всички измервани естери стъпаловидната промяна на дебита на аерацията от 94 на 354 ml/min при нормална температура и налягане води до намаляване на концентрацията. Когато аерационният дебит се намали от 354 ml/min на 34 ml/min при нормална температура и налягане, концентрациите на изоамилацетат, етилхексаноат и етилоктаноат се увеличават. Но те не се увеличават до стойностите, наблюдавани при аерационен дебит от 94 ml/min. Диаграмите на характеристиките на тези съединения са много близко една до друга, като етилхексаноатьт и етилоктаноатът показват в по-голяма степен относително изменение в сравнение с изоамилацетата. Концентрацията на етилацетата намалява, когато обемният дебит на въздуха се понижи на 34 ml/min при нормална температура и налягане.

При всички тези естери, измервани по време на изследването, концентрацията им се увеличава, когато въздухът се елиминира напълно от флуидизиращия газ. Концентрацията на всеки естер нараства и след това кривата на диаграмата придобива конусообразна форма, когато концентрацията на клетки в течната фаза на биореактора намалее рязко.

На фигури 7.10 и 7.11 са дадени съдържанията на висши алкохоли, изоамилалкохол, изобутанол и 1-пропанол в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. За измерените алкохоли концентрацията се увеличава в резултат на стъпалообразното увеличение на аерацията от 94 на 354 ml/min при нормална температура и налягане. Изобутанолът показва найголямо относително изменение при промяната на аерационния дебит. Концентрациите на 1-пропанол са много под стойностите на пределните граници за вещества, определящи вкусовите качества на продукта, които са 600-800 mg/1, но по време на експерименталната непрекъсната ферментация, концентрацията беше доста над тази, която е установена за обикновеното промишлено получено пиво чрез периодична ферментация, при което концентрацията обикновено е под 16 mg/1. Това не се отнася за изоамилалкохола или изобутанола, които са в нормални граници. Съединението 1-пропанол се предполага, че се получава при редукцията на кисел пропионат. (Gee и Ramirez, 1994 г.). Други изследователи (Hough et al., 1982 г.; Yamauchi et al., 1995 г.) също отнасят образуването на 1-пропанол на метаболизма на амино киселините алфа-аминомаслена киселина и треонин със съответната оксикиселина и алдехид, съответно алфа-бутанова киселина и проприоналдехид.

Тъй като излишъци на диацетил, ацеталдехид и фузелови алкохоли не са желани в пивото, за да се ограничи тяхното получаване, е важно да се регулира кислородът. Както се дискутира в литературата, когато подаването на кислород към дрождевите клетки се увеличи, се увеличава анаболното образуване на прекурсори на аминокиселини и по този начин се наблюдава по-високо съдържание на алкохоли, окси-киселини и диацетил. Известно е, че концентрацията на естери намалява с увеличаването на количеството на кислорода, тъй като образуването на естери се катализира от пренасянето на ацетил. Това пренасяне на ацетил се инхибира от ненаситени мастни киселини и ергостерин, които на свой ред се увеличават от присъствието на кислород (Norton и D’Amore, 1994 г.).

За условията на биореактора, използван в този експеримент, при псевдо-устойчивото състояние (след минимум три оборота на биореактора) измерените концентрации на разтворен кислород в течната фаза в биореактора са по-близко до нула (по-малко от 0,03 mg/1).

Този експеримент не дава възможност за директно сравняване на данните от 94 ml/min и 34 ml/min дебит на въздуха във флуидизиращия газ при нормална температура и налягане, тъй като те са отделени от дебита с най-висока стойност (354 ml/min). Това е така поради физиологичното състояние на дрождите в резултат на излагането им на въздействие на предишните условия в биореактора. Имобилизиращата матрица и непрекъснатата ферментация могат също да доведат до други промени във вкусовите качества на продукта.

Не са установени замърсявания в която и да е точка на биореактора по време на експеримента.

За да се балансират изискванията към определено количество кислород за поддържане жизнеспособността на дрождите и необходимос

66230 Bl тта от свеждане до минимум на количеството кислород, за да се получи пиво с необходимите вкусови качества, би могло да се проучат други стратегии, като например добавянето на хранителни вещества като цинк, магнезий или осигу- 5 ряване на други екзогенни вещества, които са необходими за дрождевите клетки за поддържане на тяхната жизнеспособност. Добавянето на такива вещества дава възможност за намаляване на изискванията за съдържание на кислород за дрождите. Друга възможност е да се работи с много ниски концентрации на кислород през по-голямата част от времето, като периодично в определени участъци се подава кислород на импулси, за да се под държа жизнеспособността на клетките.

6 Ю15 2оизозв40««вбвоов70

Продължителност на непрекъснатата ферммпация (дни) фигура 7.8 Концентрация ма етилацетат в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. . Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпрьсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/mfn при нормална температура и налягане.

66230 Bl

Концентрация на иаоамилаиетат fmg/L}

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.9 Концентрация на изоамилацетат, етилхексаноат и етилоктаноат в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. . Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, е посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min при нормална температура и налягане.

*+· Иеоамшицепт Епииишювг Ешдоктмнмт

66230 Bl

Концентрация на мзоаммлапкохол (mg/L)

Продължителност но непрекъснатата ферментация (дни)

Ижммалалкокел * Имбутинсл фигура 7.10 Концентрация на изоамилалкохол и изобутанол в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха лри нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпрмжвателно устройство, е посочен не графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време на експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/min лри нормална температура и налягане.

66230 Bl

Μ

»

1«

ο

Ο * 1О19 30»ЯМ4)4ва)Я(Ю1б?О

Продължителност не непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.11 Концентрация на 1-пропанол в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация. Обемният дебит на въздуха при нормална температура и налягане, подаван в биореактора чрез разпръсквателно устройство, а посочен на графиката. Останалата част от газа е въглероден диоксид и по време ка експеримента общият обемен дебит на газа е константна величина, равняваща се на 472 mL/mln при нормална температура и налягане.

66230 Bl

7.2.2. Следферментационен период на задържане на продукта на партиди: Ефекти от въздействието на кислорода върху дрождевите метаболити.

Тъй като в края на периодичната ферментация общият диацетил не е в необходимите граници за промишлено произведено пиво, се използват няколко подхода, за да се намали концентрацията на това съединение до приемливи граници. Един такъв подход е използването на период на задържане в затоплено състояние веднага след непрекъснатата главна ферментация.

На фигури 7.12-7.21 са изобразени графично концентрациите на общ ферментируем въглехидрат (като глюкоза), етанол, общ диацетил, ацеталдехид, етилацетат, 1-пропанол, изобутанол, изоамилацетат, изоамилалкохол и етилхексаноат в течната фаза в зависимост от продължителността на следферментационното задържане. Взетите проби от ферментатора за непрекъсната ферментация при псевдо-устойчиво състояние се държат в аеробно или анаеробно състояние, както е показано на легендата на всяка от фигурите.

На фигура 7.12 концентрацията на общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза) спада бързо през първите 2 h, а след това през останалото време на периода на задържане намалява с по-малка скорост както при аеробните, така и при анаеробните проби. Възможна причина за това наблюдение е, че през първите 2 h преди декантацията присъстват повече дрожди и концентрацията на захари е по-висока в началото на периода на зад ържане. Няма съществена разлика между аеробните и анаеробни проби по отношение намаляването на ферментируемата глюкоза, въпреки че в началото могат да се установят известни различия.

Концентрацията на етанол на фигура 7.13 нараства бързо при започването на периода на задържане и след това аеробните и анаеробни проби увеличават концентрацията на етанол over time паралелно. Началното увеличение на концентрацията на етанол за анаеробната проба съвпада с периода, в който най-много намалява съдържанието на захари. В края на периода на задържане концентрацията на етанол е по-висока в анаеробно обработените проби.

От фигура 7.14 се вижда, че аеробните проби показват още в началото увеличение на ацеталдехида при въздействието на аеробни усло вия извън биореактора. Комбинацията от аеробни условия с изразходване на захари и получаване на етанол би могла да обясни този резултат. В края на 48-часовия период на задържане концентрацията на ацеталдехид пада от 17 mg/1 на 9 mg/1 при анаеробната проба, което осигурява концентрация в границите на нормативите за качествена североамериканска лека бира (по-малко от 10 mg/1).

Концентрацията на общ диацетил в зависимост от продължителността на задържане е дадена на фигура 7.15. Резултатите показват, че елиминирането на кислород от системата по време на този период на задържане осигурява поблагоприятни условия за намаляването на диацетил. Формата на кривата на общия диацетил може да се обясни с изчерпване на свободния аминен азот и последващото междуклетъчно получаване на валин, на който диацетилът е страничен продукт (Nakatani et al., 1984а; Nakatani et al., 1984b). Общата концентрация на диацетил в края на главната непрекъсната ферментация е 326 microg/1, а в края на анаеробния период на задържане е 33 microg/Ι, което е доста под границата за промишлено произведено пиво.

На фигури 7.16 - 7.18 са представени диаграмите на концентрациите на естерите етилацетат, изоамилацетат и етилхексаноат в зависимост от продължителността на следферментационното задържане. Същите образци за аеробни и анаеробни проби са наблюдавани за всички естери. Концентрацията на естери в аеробните и анаеробните проби не се различава, докато по-късно през периода на задържане концентрацията на естери в аеробните проби намалява, а на анаеробните се повишава. Тъй като концентрацията на естери при непрекъснатата ферментация до известна степен е ниска в сравнение с концентрацията на естери, установена в промишлено полученото пиво, е желателно да се подберат условия, които благоприятстват получаването на естери.

На фигури 7.19-7.21 са показани концентрациите на изоамилалкохол, 1-пропанол и изобутанол в зависимост от продължителността на следферментационното задържане. В края на 48-часовия период на задържане няма съществена разлика при тези алкохоли за аеробно и анаеробно обработените проби. Но на 24-тия час г л

66230 Bl аеробно обработените проби при всички случаи показват по-висока концентрация.

На фигура 7.22 е представена радарна графика, която позволява сравнение на няколко вещества, придаващи вкусови качества, след 48-часов аеробен и анаеробен период на задържане с промишлено получено пиво. Радарните графики обикновено се използват в пивоварната промишленост, тъй като дават възможност за сравняване на различни характеристики на пивото, данните за които са нанесени на една графика (Sharpe, 1988). На тази фигура може да се види, че пивото, получено при непрекъсната ферментация и след това задържано при анаеробни условия, е най-близко до обикновеното пазарно пиво. От Приложение 6 може да се види, че анаеробната течност е в нормалните граници, характерни за пазарно пиво с изключение на съдържанието на 1-пропанол, което е значително повисоко в сравнение с периодично ферментирало пиво. Това по-високо от нормалното съдържание на 1-пропанол се наблюдава при всички продукти, получени при непрекъсната ферментация в рамките на това изследване.

Образуването на 1-пропанол се наблюдава в етапа на главната непрекъсната ферментация и неговото съдържание не намалява съществено по време на периода на задържане, където условията са аеробни и анаеробни. Kunze (1996 г.) установява, че по време на периодичната ферментация следните фактори увеличават висшите алкохоли като 1-пропанол: смесване, интензивно аериране на пивната мъст и повторно прибавяне на свежа пивна мъст към наличните дрожди.

В крайна сметка идеалният случай би бил напълно да се елиминира вторичният период на задържане чрез оптимизиране на условията в биоректора при главната непрекъсната ферментация. Но друга изгода би могла да се получи като се използва периода на задържане чрез оптимизиране на температурата при задържането (отстраняване на диацетила чрез дрождите е силно зависимо от температурата), количеството на ферментируемите захари, които са останали в течността при започването на периода на задържане, оптимизиране на концентрацията на присъстващите дрожди, хидродинамичните характеристики на съда за задържане (отстраняването на диацетил би могло да се подобри чрез подобряване на контакта между дрождите и пивото) и предприемане на мерки за елиминиране на кислорода в този етап.

Изчисленията за обемната производителност на пиво са дадени в Приложение 3. Описаният в този раздел процес, включващ непрекъсната работа на биореактора с 24-часово време на престой и последващо периодично задържане за време 48 h, е 1,8 пъти по-продуктивно в сравнение с общоприетия промишлен периодичен процес. Относително бързият промишлен периодичен процес с цикъл от 7,5 дни има обемна производителност на пиво 0,093 т³ (обемът на съда в ш³ х ден), докато описаният тук непрекъснат процес има производителност на пиво 0,165 т³ (обемът на съда в ш³ х ден). Ако понататъшни изследвания позволят периодът на задържане да бъде съкратен на 24 h, производителността на пиво ще стане 2,3 пъти по-висока в сравнение с промишления норматив за периодична работа. Ако се постигне идеалният случай от 24 h непрекъснат процес без последващо задържане на партиди, обемната производителност на пиво ще бъде 7,5 пъти по-висока от промишления норматив за периодична работа. Освен увеличаване на обемната производителност, се постигат и допълнителни изгоди при преминаване от периодичен към непрекъснат процес, като например по-кратко време до пазара, намаляване на размерите на пивоварното помещение и помалка честота на размножаване на дрождите, което би трябвало да се балансира с внимателни анализи на относителните разходи за работа.

Други изследователи (Kronlof и Virkajarvi, 1996 г.; Nakanishi et al., 1993 г.; Yamauchi et al., 1995 г.) насочват вниманието си към изследване на многостадийни непрекъснати ферментации, при които първият стадий на непрекъснатата ферментация (аеробна) има за резултат само частично изразходване на ферментируемите захари в пивната мъст. Докато този подход е показал известен успех по отношение на получаването на вкусови качества, тези системи са сложни. През първия аеробен стадий от такава система се създава среда, която е по-податлива на микробни замърсявания (т.е. висока концентрация на захари, температура и кислород с ниска концентрация на етанол). В системата от биореактор с газова подемна сила, която се използва в това изследване, в биореактора има ниска концентрация на ферментируеми захари, ниска стойност

66230 Bl на pH, висока концентрация на етанол и ниска концентрация на кислород, което прави средата неподходяща за възможни замърсявания.

Продължително» на задържане след ферментацията (h)

Аеробно Анаеробно фигура 7.12 Средна концентрация на фермвнтируема глюкоза в зависимост от продължителността на задържаме на аеробно и анаеробно обработени проби след непрекъсната главна ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на

Продължителност на задържане след ферментвцияте ф) “* Аеробно -*- Анаеробно фигура 7.13 Средна концентрация на етанол в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след непрекъсната главна ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п^2).

66230 Bl

**» Аеробно ”·“ Анаеробно

Фигура 7.14 Средна концентрация на ацеталдехид в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след непрекъсната главна ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п=2).

66230 Bl

Продължителност на задържам след ферментацията (h)

Фигура 7.15 Средна концентрация на диацетил в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след непрекъсната главна ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п«2).

66230 Bl

Продължителност м аадържянв след фермвнтацията (h)

Фигура 7.16. Средна концентрация на етилацетат в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след главната непрекъсната ферментация в биореактор е газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на лълтмвпимлнтаниитА пайми /п=Р1

Продължителност ни задържане след ферментацията (h)

Фигура 7.17. Срцдна концентрация на изоамилацетат в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след главната непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила, Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п-2).

66230 Bl

фигура 7.18. Средна концентрация на етилхексаноат в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след главната непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п=2).

66230 Bl

Продължителност на задържат след ферментацията (h) фигура 7,19. Средна концентрация на изммилалкохол в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след главната непрекъсната ферментация в биореактор с тазова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п*2).

Продължителност на задържане «мд фермвнтнцияте (h)

Фигура 7.20, Средна концентрация на 1-пропанол в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби След главната непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п«2).

66230 Bl

Продължителност на задържане след ферментацията (h)

Фигура 7.21. Средна концентрация на изобутанол в зависимост от продължителността на задържане на аеробно и анаеробно обработени проби след главната непрекъсната ферментация в биореактор с газова подемна сила. Отклоненията по линиите, пресичащи кривите, представляват горната и долната граници на експерименталните данни (п=2).

66230 Bl

Фигура 7.22. Радарна графика на данните за нормални концентрации, получени след 48 часа аеробно и анаеробно задържане след непрекъснатата главна ферментация в биореактор с газова подемна сила. Данните за нормалните концентрации са на базата на средните стойности на удвоени проби, а данните за промишлено произведеното пиво са взети като средна стойност от данните, дадени в Приложение 6.

66230 Bl

7.2.3. Въздействие на продължителността на престой на течността върху ключовите дрождеви метаболити по време на непрекъснатата главна ферментация

На фигури 7.23 - 7.28 са представени ре- 5 зултатите от анализите на течната фаза, получена в биореактора. В Таблица 7.3 са посочени средните концентрации и дебитите при псевдо-устойчиво състояние (след минимум три оборота на биореактора). При експеримента са използ- 10 вани две продължителности на престой. Докато жизнеспособността на дрождите в течната фаза не се променя съществено при увеличаване на дебита на подаваната към биореактора пивна мъст, концентрацията на дрождеви клетки се променя, което се вижда от фигура 7.23.

Таблица 7.3 (а) Въздействие на продължителността на престой в биореактора върху дрождите в течната фаза и концентрациите на ключовите дрождеви метаболити, представени като средни стойности при псевдо-устойчиво състояние; (Ь) Въздействие на продължителността на престой в биореактора върху дрождите в течната фаза и концентрациите на ключовите дрождеви метаболити на изхода на биореактора, представени като средни стойности при псевдо-устойчиво състояние.

(а) Средна концентрация Продължителност на престой в биореактора

1,8 дни 0,9 дни

Конц. на клетки (клетки/mL)	2.38E+08	1.32E+08
Общо ферм. глюкоза (g/100 mL)	0,29	6,09
CAA (mg/L)	106,3	246,4
Етанол (g/100 mL)	5,16	4,80
Общо диацетил (ug/L)	292	460
Ацеталдехид (mg/L)	19,47	37,07
Етилацетат (mg/L)		38,29

66230 Bl

1-пропанол (mg/L)	44,95	13,53
Изобутанол (mg/L)	22,78	9,13
Изоамилацетат (mg/L)	0,90	1,28
Изоамилалкохол (mg/L)	76,67	51,39
(b) Среден дебит	Продължителност на престой ι биореактора
	1,8 дни	0,9 дни
Конц. на клетки (клетки/min)	7,30Е+О8	8,22Е+08
Общо ферм. глюкоза (g/100 min)	8.93Е-03	3.72Е-01
САА (g/min)	З.ббЕ-04	1,50ΕΌ3
Етанол (д/100 min)	L60E-01	2.93Е-01
Общо диацетил (g/min)	9.06Е-07	2,81 Е-06
Ацеталдехид (g/min)	6.04Е-05	2.26Е-04
Етилацетат (g/min)	1.27Е-04	2.34Е-04
1-пропанол (g/min)	L39E-04	8.25Е-05
Изобутанол (g/min)	7,О6Е-О5	5.57Е-05
Изоамилацетат (g/min)	2.80Е-06	7,30Е-06
Изоймилалкохол (g/min)	2.38Е-04	3.13Е-04

Ha фигури 7.24 и 7.25 са представени концентрациите на свободния аминен азот (САА) в субстратите от пивна мъст и общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза), като и двете концентрации се увеличават, когато времето на престой се намали от 1,8 на 0,9 дни. От масовия баланс, представен в Таблица 7.4, се вижда, че скоростта на изчерпване на общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза) се увеличава, докато скоростта на изразходването на свободния аминен азот намалява с намаляването на времето на престой в биореактора. Коефициентът на производителност Y_p/s на ферментационния продукт етанол от ферментируемия глюкозен субстрат се увеличава от 0,3 до 0,5 с намаляването на времето на престой. Тъй като в системата се разпръсква въздух и въглероден диоксид, вероятно има минимални загуби на етанол в газовата фаза, което би имало въздействие върху коефициента на производителност Y_p/s чрез въздействие върху баланса на етанола. Изследването, извършено в сътрудничество с Budac и Margaritis (1999), доказва, че летливите вещества, придаващи вкусовите качества на пивото, включващи етанол, ацеталдехид, етилацетат и изоамилацетат, са установени в главното пространство на биореактора с газова подемна сила по време на непрекъснатата ферментация За целта е използвана хроматограф-масова спектроскопия.

66230 Bl

Таблица 7.4. Масов баланс на свободния аминен азот и общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза), като са използвани средните данни от Таблица 7.3, въздействие на времето за престой.

Време на престой 1,8 дни 0,9 дни 1,8 дни 0,9 дни

Свободен аминен азот Общо ферм.глюкоза (g/min)_______________________(g/min)_____________

Входен отвор*	8.84Е-04	1.74Е-03	4,71 Е-01	9.26Е-01
Изходящ отвор	3.65Е-04	1.50Е-03	8.93Е-03	3.72Е-01
Разход (AS)	5.18Е-04	2.3Е-04	4.62Е-01	5.54Е-01
Коеф. на произв.			0,3	0,5
(Yp/s)

* Концентрацията на входния отвор е от Приложение 1.

Концентрацията на ферментационния продукт етанол в течната фаза намалява с промяната на времето на престой. Но системата като цяло произвежда повече етанол на базата на масов де- 30 бит при по-краткото време на престой на течността. Тъй като целта на тази изследователска работа е да се получи не само етанол, но пиво, в което има баланс на много компоненти, като при това трябва да се максимизира продуктив- 35 ността на етанол в баланс с други фактори. В края на главната ферментация на търговско пиво поголямата част от ферментируемия глюкозен субстрат трябва да бъде изразходвана.

На фигура 7.26 е представено изменени- 40 ето на концентрацията на ацеталдехида и общия диацетил в зависимост от промяната на дебита на ливната мъст. И при двата анализа концентрацията при съответния дебит се увеличава, когато времето на престой на течността намалява.. По 45 време на периодичните ферментации на пиво през първите дни от дрождите се отделя ацеталдехид (Kunze, 1996).

На фигури 7.25 и 7.27 е показан ефектът от намаляване на времето за престой върху концентрациите на висшите алкохоли, 1-пропанол, изобутанол и изоамилалкохол в течната фаза в биореактора. Концентрациите на трите висши алкохоли намаляват, когато намалява времето на престой в биореактора.

Дадените в Таблица 7.3 (Ь) масови дебити на етилацетат и изоамилацетат се увеличават в съответствие с намаляването на времето на престой на течната фаза. От фигура 7.28 се вижда, че концентрацията на етилацетат в течната фаза намалява, докато концентрацията на изомилацетат се увеличава. Тъй като този експеримент осигурява увеличаване на растежа на клетките в течната фаза без да се увеличава подаването на кислород към системата, условията в биореактора способстват за получаването на естери. Hough et al. (1982) изказват мнение, че в условия на увеличаване на растежа на клетките и намаляването на кислорода водят до образуване на естери.

66230 Bl

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.23. Концентрация на дрождеви клетки в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. Rt е продължителността на престой на течната фаза в биореактора, изразена в дни.

* К0НЦВ№ГраЦ|1Я MB

XIWTKH

Жианеспособнсст MB КЛВПШ1В

66230 Bl

♦ Етанол

Фарм. глюкоза

Продължителност ма непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 7.24. Концентрация на етанол и ферментируема глюкоза в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. Rt е продължителността на престой на течната фаза в биореактора, изразена в дни.

66230 Bl

Концентрация на свободен аминен азот (mg/L)

Фигура 7.25. Концентрация на свободен аминен азот и 1-пропанол в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. Rt е продължителността на престой на течната фаза в биореактора, изразена в дни.

♦ CM

1-пропмюл

66230 Bl

Концентрация на диацетил ^dtg/L)

* Дишнтил Ащпищтаид

Продължителност на непрекъснатата ферментация (дни)

Фигура 726. Концентрация на общ диацетил и ацеталдехид в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. Rt е продължителността на престой на течната фаза в биореактора, изразена в дни.

66230 Bl

Продължителност на непрекъснатите ферментация (дни)

е Иаобуганал №оамил1лкахол

Фигура 7.27. Концентрация на изобутанол и изоамилалкохол в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. Rt е продължителността на престой на течната фаза в биореактора. изразена в дни.

66230 Bl (mg/L)

Фигура 7.28. Концентрация на етилацетат и изомилацетат в течната фаза в зависимост от относителната продължителност на непрекъснатата ферментация, ефект от продължителността на престой на течността в биореактора. fit е продължителността на престой на течната фаза в биореактора, изразена в дни.

* Бгилацотат

Изммилацош

66230 Bl

7.2.4. Използване на промишлено произведена декарбоксилаза алфа-ацетолактат за намаляване на общия диацетил по време на непрекъсната главна ферментация на пиво

Експеримент 1. Биореакторът беше замърсен с аеробно развиващи се грам позитивни коки преди завършването на опита. Установи се, че самият биореактор е замърсен, тъй като микробиологичните изпитания на подаваната пивна мъст не показаха замърсявания. Това показва необходимостта от подобряване на предпазните мерки срещу замърсявания на биореактора. Преди системата да прекрати работа, се наблюдава намаляване на концентрацията на диацетил, когато към подаваната пивна мъст се добави декарбоксилаза алфа-ацетолактат (ДКАА). За съжаление, не беше възможно да се направят каквито и да било заключения от тези данни поради объркващите ефекти вследствие замърсяването на биореактора.

Експеримент 2. В резултат на няколко предпазни мерки по отношение на биореактора системата работи без замърсявания през време на провеждането на Експеримент 2. Данните за този експеримент са дадени на фигури 7.29 - 7.31. В Таблица 7.5 са обобщени концентрациите при псевдо-устойчиво състояние на общ диацетил преди и след добавянето на ДКАА към пивната мъст. Концентрацията на общ диацетил пада с 47 % с прибавянето на ДКАА към пивната мъст, което прави обещаващо използването на този ензим за в бъдеще (средни стойности, взети след три оборота). Както се виада от фигури 7.30 и 7.31, общият ферментируем карбонитрат (като глюкоза) и концентрацията на клетки имат слабо отклонение по време на този опит, което би могло да се дължи на малките разлики в пивната мъст, подавана към биореактора преди и след добавянето на ДКАА.

66230 Bl

ОМ сй

X к 5 £ S I о х

' в % 'I 1-
		J* *	и
D.	*	Добавяне на ДКАА
0-----------1-----

WU0 1№«Q»3tnso

Продължителност нв напракъонаТАТй ферментация (h) фигура 7.29. Концентрация на общ диацетил в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект от добавянето ма ПКАА във Ферментационната сх»ла на пивната мъст. Експеримент 2.

е&

в

7.

е & е·

ш 1	1----- 1	“ ж . е и	Ж- е
а Ч	1	1 » » Добавяне на ДКАА >---------►	4 *
		1	А

Впнм ^Ж ф«рм. ГЛМка··

Я Ш 1№ 30 №» МО 990

Продължителност нв непрекъснатата ферментация (h)

Фигура 7.30. Концентрация на ферментируем въглехидрат (като глюкоза) и етанол в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект ат добавянето на ДКАА във ферментационната среда на ливната мъст,

Експеримент 2.

п л

66230 Bl

1.О0ЕИ0

t.oc&Hii ι,οβε+от

1.00ЕЧИ

(.КЙ*Ов·

1.006*04

1-оое+оз

1.006*02

ι.οοε*οι

ι.«6*οι· <» ♦ ♦♦ ♦ ♦♦ ♦

t.00£+00

1OQ ♦·

Добавяне на ДКАА

----►

Τ'

200 2Μ

ОМ 380

Продължителност на непрекъснатата ферментация (h)

Фигура 7.31. Концентрация на клетки в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект от добавянето на ДКАА във ферментационната среда на пивната мъст, Експеримент 2.

66230 Bl

За да се избегне възможно объркване, свързано с различията в пивната мъст, по време на Експеримент 3, от пивоварната е взето голямо количество пивна мъст (14 hL) и ДКАА е добавен директно към пивната мъст, останала в то- 5 зи съд за съхранение, след като се достигне началната фаза на псевдо-устойчиво състояние. С това се избягват възможни различия в пивната мъст, които биха могли да окажат въздействие на провеждането на ферментацията съгласно Експеримент 2. Този съд за съхранение на пивната мъст също е снабден с устройство за разпръскване на въглероден диоксид, за да може да се поддържа на консистентно ниско ниво разтвореният кислород в подаваната пивна мъст. На фигури 7.32 - 7.34 е илюстриран ефектът от добавянето на ДКАА към пивната мъст върху кон центрациите на общия диацетил, общия ферментируем въглехидрат (като глюкоза), етанола и свободно суспендираните клетки по време на непрекъснатата ферментация.

В Таблица 7.6 също е дадена средната стойност на концентрацията на общ диацетил преди и след добавянето на ДКАА към подаваната пивна мъст (средни стойности, взети след три оборота).

Не е установено замърсяване по време на целия експеримент. Концентрацията на общ диацетил намалява с 45 % при добавянето на ДКАА. Не се наблюдават съществени разлики при концентрациите на етанола, ферментируемия въглехидрат (като глюкоза) и свободно суспендираните клетки, което съответства на констатациите на Aschengreen и Jepsen (1992).

-j

500-1 450 <	♦ ♦ ♦ *
400-	♦ ♦
850	-	е
300-		е
200		* ♦ ♦
		♦
200-		♦
100
100		Добавяне на
50		ДКАА
0-		—----->*> --1 -----------

⁰ “ 100 Ιβο 200 260 300 350

Продължителност на непрекъснатата ферментация ф)

Фигура 7.32. Концентрация на диацетил в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект от добавянето на ДКАА във ферментационната среда на пивната мъст.

Експеримент 3.

66230 Bl β·

β'

6·

4·

1;. а

04о

Τ’

100

----►

Добавяне на ДКАА

----►

Етанол а Форм. глюкоза

А

I

100 200 200 300 350

Продължителност на непрекъснатата ферментация (h)

Фигура 7.33. Концентрация на етанол и обща ферментируема захар (като глюкоза) в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект от добавянето на ДКАА във ферментационната среда на пивната мъст, Експеримент 3.

Продължителност на непрекъснатата ферментация (h)

Фигура 7.34. Концентрация на клетки в течната фаза в зависимост от продължителността на непрекъснатата ферментация, ефект от добавянето на ДКАА във ферментационната среда на пивната мъст, Експеримент 3.

66230 Bl

Резултатите от Експерименти 2 и 3 показват, че ДКАА има съществен ефект върху концентрацията на общия диацетил по време на непрекъснатата ферментация в биореактори с газова подемна сила, като спомага за намаляване 5 на средната концентрация на диацетил с 46 %. Това дава възможност за намаляване или елиминиране на вторичното третиране, провеждано с цел намаляване на диацетил в непрекъснатите системи с газова подемна сила. В тези начални експерименти се използва относително висока дозировка на ДКАА и това е необходимо, за да се оптимизира количеството, методът и времето на дозиране в пивната мъст, ако се възприеме този ензим да се използва в процеса. Могат да се реализират допълнителни икономии, ако се използва ензим, който е достъпен и с по-високи нива на активност в условията на ферментацията на пиво, или самият ензим е имобилизиран, като по този начин се осигурява неговото пов торно използване (Dulieu et al., 1996). Друго съображение ще бъде свързано с публично приемане на ензимни добавки, които са произведени с използване на генетично модифицирани организми.

Препоръчвана от доставчика дозировка е 2 kg/1000 hL и при цена на промишлено получен ензим от $ 131,05/kg към материалните разходи за ферментацията ще се добавят $ 0,26/hL. Използваната дозировка при провеждането на експериментите е 72 microg/1 (108 ADU/L) или 7,2 kg/1000 hL ДКАА, което представлява допълнителни разходи от $ 0,94/hL. Икономиите от използването на ДКАА за намаляване на диацетила по време на непрекъснатите ферментации с използване на газова подемна сила ще зависят от оптималната дозировка на ензима в условията на биореактора и времето, което се икономисва от неговото използване.

Таблица 7.5 Ефект от добавянето на ДКАА в условия на псевдо-устойчиво състояние на ферментационната среда от пивната мъст върху концентрацията на общия диацетил по време на непрекъснатата ферментация на пиво в биореактор с газова подемна

сила
Експеримент на	Средна обща концентрация на диацетил (pg/L)	Процентно намаление диацетил
(Без ДКАА)	(ДКАА, 60 pg/L)
Експеримент II	495	260	47
Експеримент III	445	245	45

* средни стойности при псевдо-устойчиво състояние след три оборота.

66230 Bl

Казаното по-горе подкрепя твърдението, че непрекъснатата ферментация с използване на имобилизирани дрожди и съпътстващите ги свободни клетки в биореактор със смукателна тръба и използване на газова подемна сила е възможна алтернатива на периодичната ферментация на пиво, която се базира на следните критерии:

- постигане на съответните вкусови качества

- по-висока обемна производителност на биореактора

- минимални усложнения

- демонстриране на непрекъсната работа за дълъг период от време

- регулиране на въздуха (кислорода) във флуидизиращия газ, за да се регулират вкусовите качества

- добавка на ензим декарбоксилаза алфаацетолактат за контролиране съдържанието на диацетил

- липсва бактериално замърсяване

- икономически предимства.

Все още има въпроси, които изискват допълнителни изследвания, но технологията е готова за изпитване в по-големи мащаби. Биореакторите с газова подемна сила вече се използват в промишлен мащаб за обработка на отпадъчни води, което увеличава перспективите за техническа осъществимост на системите за непрекъсната ферментация. Пивоварната Grolsch в Холандия съобщава за използване на биореактор с газова подемна сила и обем 230 т³ за обработване на отпадъчни води от пивоварната (Driessen et al., 1997). Едно от най-големите препятствия за използване на непрекъснатата ферментация в промишлен мащаб в пивоварната индустрия може да бъде приемането на новия процес от пивоварите в индустрия, която е дълбоко привързана към традициите.

В това изследване са събрани данни за вторични дрождени метаболити, получени по време на непрекъснатата ферментация, което е направено, за да се подчертае важността от регулирането на кислорода във флуидизиращия газ за формиране на вкусовите качества на пивото. Констатациите показват, че при дадени работни условия увеличаването на въздуха във флуидизиращия газ в биореактора води до увеличение на ацеталдехида, диацетила и висшите алкохоли (изоамилалкохол и изобутанол), докато концент рациите на естерите (изоамилацетат, етилхексаноат, етилоктаноат) и етанола намаляват. Тези данни потвърждават, че има възможност за контролиране на вкусовите качества на пивото чрез състава на флуидизиращия газ в биореактора, което позволява получаването на уникални продукти.

С изключение на случая, когато се елиминира присъствието на въздух във флуидизиращия газ, в течната фаза на биореактора се регулира концентрация на свободно суспендирани клетки да е по-голяма от 10⁸ клетки/ml. По този начин системата има повече от една популация на дрождени клетки, съвместно съществуващи в биореактора - имобилизирани дрожди и суспендирани в течната фаза дрожди. Поради голямата степен на растеж на жизнеспособни клетки в течната фаза на биореактора, съществува възможност за използване на непрекъснатия процес в биореактора като култиватор на дрожди.

Когато вторичният 48-часов период на задържане на продукта на партиди се добави допълнително към непрекъснатата главна ферментация, се осигурява вкусовият профил в границите на търговските видове пиво. Температурата на този период на задържане е 21 °C и е демонстрирана експериментално важността от минимално излагане на течността на въздействието на кислород по време на периода на задържане върху формирането на вкусовите качества. Периодът на задържане добавя два дни към процеса, както и допълнителни усложнения, но той е значително по-бърз в сравнение с промишлено използваните периодични ферментации, които са с продължителност между седем и четиринадесет дни.

В крайна сметка идеалният случай е да се елиминира вторичният период на задържане чрез оптимизиране на условията през първия непрекъснат процес в биореактора. Но допълнително намаляване на времето на вторичното задържане може да се постигне за кратък период чрез оптимизиране на температурата на задържане (отстраняването на диацетила чрез дрождите е силно зависимо от температурата), количеството на ферментируемите захари, останали в течността в началото на периода на задържане, концентрацията на присъстващи дрожди, хидродинамичните характеристики на съда за задържа

66230 Bl не (отстраняването на диацетил може да се подобри чрез подобряване на контакта между дрождите и пивото) и като се вземат други мерки за елиминиране на кислорода от този стадий.

Други изследователи (Kronlof и Virkajarvi, 1996;Nakanishietal., 1993;Yamauchietal., 1995) са се насочили към изследване на многостадийни непрекъснати ферментации, при които първият стадий на непрекъсната ферментация (аеробна) има за резултат само частично изразходване на ферментируемите захари, присъстващи в пивната мъст. Докато този подход показва известен успех по отношение на вкусовите качества, тези системи са сложни. Първият аеробен стадий при такива системи създава среда, която е по-податлива на микробно замърсяване (т.е. висока концентрация на захари, температура и кислород при ниска концентрация на етанол). В биореактора с газова подемна сила, използван в тази изследователска работа, има ниска концентрация на ферментируеми захари при псевдо-устойчиво състояние, ниска стойност на pH, висока концентрация на етанол и ниска концентрация на кислород, което прави средата неблагоприятна за възможни замърсявания. За помалки пивоварни минимални усложнения и разработване на стабилен и устойчив на замърсявания процес е важен фактор за успех.

Добавянето на промишлено получена декарбоксилаза алфа-ацетолактат (ДКАА) към пивната мъст, подавана за непрекъсната ферментация, показва средно намаление на диацетил от 46 %. Но тъй като ДКАА е ензим, който се получава от генетично модифициран организъм, има публично схващане, че са необходими изследвания преди използването на такъв ензим в търговски продукт. В допълнение към казаното, наличните търговски ензими за регулиране на диацетила нямат оптимална активност при ферментационните условия.

При повече от шестмесечна непрекъсната ферментация, при която е използван капа-карагенан за имобилизиране на клетки, повече от 90 % от свободно суспендираните клетки в течната фаза остават жизнеспособни, докато жизнеспособността на имобилизираните клетки намалява до по-малко от 60 %. Микроснимки от сканиращ електронен микроскоп показват, че клетките, разположени в близост до периферията на гелните гранули, имат множество белези на пъпки и правилна морфология, докато тези, които са близко до сърцевината на гранулите, имат неправилна форма и по-малки белези на пъпки, доказващо намаляване на растежа. Микрофотографиите показват също, че дрождите, които са разположени в близост до сърцевината на гранулите, показват белези на стареене. Както беше дискутирано в Глава 5, капа-карагенанът има много характеристики, които го правят желан за използване като матрица за имобилизиране. Но понастоящем няма промишлен метод за производство на гранули, тъй като задържането на дрождите в матрицата е част от процеса на производство на гранулите и манипулациите с гранулите в една промишлена инсталация увеличават усложненията и разходите. Други методи за имобилизиране като самоагрегиране или флокулация биха могли да се изследват в бъдеще. Това би отстранило усложненията при манипулирането с гранулите в условията на инсталациите и, ако дрождевите флокулати се разрушават регулярно, може да се осигури редовно отстраняване на възрастните клетки от биореактора.

Claims (15)

1. Патентни претенции

   1. Метод за получаване на алкохолни напитки, при който се използва биореактор с вътрешна циркулация, за да се проведе непрекъснат ферментационен стадий, при който пивна мъст, съдържаща ферментируеми захари, първоначално ферментира, използвайки имобилизирани чрез самоагрегиране флокулиращи дрождеви клетки и подаване на ограничено количество кислород, след което поне частично ферментиралият продукт, който се изпуска от непрекъснатия процес, се подава към периодичен технологичен стадий за дообработване.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че алкохолната напитка е бира.
3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че пивото е от вида светла бира.
4. 4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че пивото е от вида лагер бира.
5. 5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че пивото е от вида североамериканса бира.
6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че дрождите са високофлокуриращи или свръхфлокулиращи дрожди.

   66230 Bl
7. 7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата ферментация е първична ферментация.
8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че преди ферментацията пивната мъст се продухва с въглероден диоксид.
9. 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че в реактора се разпръсква въглероден диоксид, съдържащ около 3 % кислород.
10. 10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че завършването на първичната ферментация се извършва през периодичния стадий на престой.
11. 11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че се осъществява намаляване на концентрацията на диацетил.
12. 12. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че се осъществява намаляване на концентрацията на ацеталдехид.
13. 13. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че през периодичния технологичен стадий на задържане концентрацията на висши фузелови алкохоли по същество остава непроменена.
14. 14. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че продуктът, който се изпуска от непрекъснатия процес, се разпределя чрез тръбопровод с разклонения към един от множеството съдове за престой на продукта на партиди, в които се извършва периодичния процес на престой.
15. 15. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че непрекъснатият процес е процес за постигане на определена степен на ферментация за провеждане на последващите периодични ферментации в периодичния стадий на престой.