PT973791E - Processo para a preparação de um composto epoxi - Google Patents

Description

ΡΕ0973791 1 DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO EPOXI"

Esta invenção relaciona-se com novos processos de preparação de um composto epoxi, especialmente os da série 20-espiroxano e seus análogos. Muito particularmente, a invenção é orientada para um método novo e vantajoso para a preparação de 9, lla-epoxi-17a-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona (eplerenona; epoximexrenona). Métodos de preparação de compostos da série 20- espiroxano são descritos na Patente U.S. n° 4 559 332. Os compostos produzidos segundo o processo da patente '332 possuem um anel aberto contendo oxigénio, E, da fórmula geral:

IA na qual -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, R1 representa um radical alcoxicarbonilo inferior ou hidroxicarbonilo com orientação a. 2 ΡΕ0973791 -B-B- representa ο grupo -CH2-CH2- ou um grupo com orientação α ou β * \ /

CM-CH

I I -CH —CHj-CH-

III sendo R6 e R7 hidrogénio X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam a ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo inferior ou, se X representar H2, representa também alcanoiloxilo inferior, e sais de tais compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo, isto é dos ácidos 17β -hidroxi-21-carboxílicos correspondentes. 0 aparecimento de utilizações clinicas novas e alargadas para a epoximexrenona gera uma necessidade de processos melhorados para o fabrico deste e de outros esteróides relacionados.

Resumo da Invenção 0 objectivo principal da presente invenção é proporcionar um processo melhorado de preparação de epoximexrenona, bem como de outros 20-espiroxanos e outros esteróides possuindo particularidades estruturais comuns. Entre os objectivos particulares da invenção encontram-se: 3 ΡΕ0973791 proporcionar um processo melhorado que produza produtos de Fórmula IA e outros compostos relacionados com um rendimento elevado; proporcionar um tal processo que envolva um número minimo de passos de isolamento; e proporcionar um tal processo que possa ser implementado com um dispêndio de capital razoável e posto a funcionar com um custo de conversão razoável.

Por conseguinte, a presente invenção é dirigida para (1) Um processo de preparação de um composto epoxi compreendendo fazer contactar um composto substrato possuindo uma ligação dupla olefínica com um composto peróxido na presença de um activador de peróxido, em que o referido activador de peróxido corresponde à fórmula:

O em que R° é um substituinte possuindo uma força atractora de electrões não inferior à do monoclorometilo, na presença de um tampão apropriado, e em que a reacção é realizada a um pH na gama de cerca de 3 até cerca de 7. (2) 0 processo de acordo com o item (1) acima, em que o referido activador de peróxido corresponde à fórmula X1 o

I ,11 M —C—Fr-C—HHj *

X i x 4 ΡΕ0973791 em que X1, X2 e X3 são seleccionados do grupo consistindo de halo, hidrogénio, alquilo, haloalquilo, ciano e cianoalquilo, Rp é seleccionado do grupo consistindo de arileno e -(CX4X5)rw e n é 0 ou 1, em que pelo menos um de X1, X2, X3, X4 e X5 é halo ou per-haloalquilo. (3) 0 processo de acordo com o item (2) acima, em que n é 0 e pelo menos dois de x1, X2 e X3 são halo ou per-haloalquilo . (4) 0 processo de acordo com o item (2) acima, em que todos de X1, X2, X3, X4 e X5 são halo ou per- haloalquilo . (5) 0 processo de acordo com o item (1) acima, em que o referido activador de peróxido é uma tri-haloacetamida. (6) 0 processo de acordo com o item (5) acima, em que o referido activador de peróxido é tricloroacetamida. (7) 0 processo de acordo com o item (1) acima, em que o referido composto substrato corresponde à fórmula:

II 5 ΡΕ0973791 em que -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-R3, R4 e R5 são seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halogéneo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano, ariloxilo R1 representa um radical (alcoxi C1-C7) carbonilo ou hidroxicarbonilo com orientação alfa, -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo "\ /“· -CH-CH,-CH- 111 com orientação alfa ou beta, onde R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo e R1 e R2 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo ou R1 e R2 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterociclicos, ou R1 ou R2 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentaciclico D. 1 0 processo de acordo com o item (1) acima, em que o referido composto substrato é seleccionado do grupo 2 consistindo de: 6 ΡΕ0973791

e o produto da reacção de grupo consistindo de: epoxidação é seleccionado do

O

8 7 ΡΕ0973791

Outras formas de realização preferidas da presente invenção são matéria objecto das reivindicações independentes 9 até 27. 0 novo processo é descrito em pormenor na Descrição de Formas de Realização Preferidas.

Um composto de Fórmula IV corresponde à estru tura :

em que: -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5- ΡΕ0973791 R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo C1-C2, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicar-bonilo, ciano, ariloxilo, R1 representa um radical (alcoxi Ci-C2) carbonilo ou hi-droxicarbonilo com orientação alfa, R2 é um alquilsul-foniloxilo ou aciloxilo C1-C7 ou um halogeneto; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo

C h I

C H j

CH

I •CH — com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, haloalcoxilo C1-C7, acilo, hidroxalquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, haloalcoxilo C1-C7, acilo, hidroxalquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterocíclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterocíclicos fundida com o anel pentacíclico D. 9 ΡΕ0973791

Um composto de Fórmula IVA corresponde à Fórmula IV em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endocíclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: i Y*

Ϋ\ / I

C( 1 7 ) mm ( C H J ) , · 0= X

/ \ XXXIV em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula IVB corresponde à Fórmula IVA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII:

Os compostos de Fórmulas IVC, IVD e IVE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula IV, IVA, ou IVB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, e R1 é alcoxicarbonilo, preferencialmente metoxicarbonilo. Os compostos no âmbito da Fórmula IV podem ser preparados fazendo reagir um reagente de alquilsulfo-nilação inferior ou acilação, ou um agente de geração de halogeneto, com um composto correspondente no âmbito da Fórmula V.

Um composto de Fórmula V corresponde à estrutura: 10 ΡΕ0973791

em que -A-A-, -B-B-, R1, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula VA corresponde à Fórmula V em que R8 e R9 com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam em conjunto a estrutura: Y*

Y * I

1 7) timf CH») , - C * X

/ ' XXXIV em que x, Y1, Y2 e C (17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula VB corresponde à Fórmula VA em que R8 e R9 formam em conjunto a estrutura de Fórmula XXXIII: o

ô 1

Os compostos de Fórmulas VC, VD e VE, respectivamente, correspondem a qualquer um da Fórmula V, VA, ou VB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, e R1 é alcoxicarbonilo, preferencialmente 11 ΡΕ0973791 metoxicarbonilo. Os compostos no âmbito da Fórmula V podem ser preparados fazendo reagir um alcóxido de metal alcalino com um composto de Fórmula VI correspondente.

Um composto de Fórmula VI corresponde à estrutura :

em que -A-A-, -B-B-, R3, r8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula VIA corresponde à Fórmula VI em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura:

γ1 I

XXX XV

SC< t ?j GHt) J * C » X em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula VIB corresponde à Fórmula VIA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII: XXXIIIΡΕ0973791 12 ά

Os compostos de Fórmulas VIC, VID e VIE, respectivamente, correspondem a qualquer um da Fórmula VI, VIA, ou VIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos de Fórmula VI, VIA, VIB e VIC são preparados hidrolisando um composto correspondente à Fórmula VII, VIIA, VIIB ou VIIC, respectivamente.

Um composto de Fórmula VII corresponde à estrutura:

VII em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula VIIA corresponde à Fórmula VII em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endocíclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: 13 ΡΕ0973791 NC< 1 7} CH«) * -/ \ V* í c - x

XXX XV em que X, Y1 , Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula VIIB corresponde à Fórmula VIIA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII: o

XXXIIX

Os compostos de Fórmulas VIIC, VIID e VIIE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula VII, VIIA, ou VIIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Um composto no âmbito da Fórmula VII pode ser preparado por cianetação de um composto no âmbito da Fórmula VIII.

Um composto de Fórmula VIII corresponde à

em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV. 14 ΡΕ0973791

Um composto de Fórmula VIIIA corresponde à Fórmula VIII em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endocíclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: Y v < xxxxv

C( 1 7) IHÍ!( CH«) 2 - C - X / \ em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula VIIIB corresponde à Fórmula VIIIA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII:

XXXIII

Os compostos de Fórmulas VIIIC, VIIID e VIIIE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula VIII, VIIIA, ou VIIIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é —CH2—CH2—, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula VIII são preparados oxidando um substrato compreendendo um composto de Fórmula XIII como descrito a seguir por fermentação eficaz para introduzir um grupo 11-hidroxilo no substrato em orientação a.

Um composto de Fórmula XIV corresponde à estrutura: 15 ΡΕ0973791

íl ο

AXIV em que -A-A-, -Β-Β-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula XIVA corresponde à Fórmula XIV em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: V NC( 17) / \ ííiíi( GHj) j *

y* ! C * X XXX rv em que X, Y1, Y2 e C (17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula XIV corresponde à Fórmula XIVA em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura de Fórmula XXXIII:

XXXIII 16 ΡΕ0973791

Os compostos de Fórmulas XIVC, XIVD e XIVE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula XIV, XIVA, ou XIVB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula XIV podem ser preparados por hidrólise de um composto correspondente no âmbito da Fórmula XV.

Um composto de Fórmula XV corresponde à estrutura:

NH,

AXV em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R3 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula XVA corresponde à Fórmula XV em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: Y* c< 1 7) / \

ç - X

XXXIV em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima. 17 ΡΕ0973791

Um composto de Fórmula XVB corresponde à Fórmula XVA em que R6 e R9 em conjunto com o carbono endocíclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura de Fórmula XXXIII: o

XXXIII

Os compostos de Fórmulas XVC, XVD e XVE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula XV, XVA, ou XVB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula XV podem ser preparados por cianetação de um composto correspondente no âmbito da Fórmula XVI.

Um composto de Fórmula XXI corresponde à estrutura :

em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV. ΡΕ0973791 18

Um composto de Fórmula XXIA corresponde à Fórmula XXI em que R e R em conjunto com o carbono endocíclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura:

xxxxv em que X, Y , Y e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula XXIB corresponde à Fórmula XXIA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII: o

XXXIII

Os compostos de Fórmulas XXIC, XXID e XXIE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula XXI, XXIA, ou XXIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula XXI podem ser preparados hidrolisando um composto correspondente no âmbito da Fórmula XXII.

Um composto de Fórmula XXII corresponde à estru tura: ΡΕ0973791 19

νη2

XXII em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula XXIIA corresponde à Fórmula XXII em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: a

Y γ 17) / \ !!!!({ CHj } i

C - X

XXXIV em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula XXIIB corresponde à Fórmula XXIIA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII: 0

1 I um

XXXIII 0 20 ΡΕ0973791

Os compostos de Fórmulas XXIIC, XXIID e XXIIE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula XXII, XXIIA, ou XXIIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula XXII podem ser preparados por cianetação de um composto no âmbito da Fórmula XXIII.

Um composto de Fórmula XXIII corresponde à estrutura:

XXIII em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos na Fórmula IV.

Um composto de Fórmula XXIIIA corresponde à Fórmula XXIII em que R8 e R9 em conjunto com o carbono endociclico ao qual eles estão ligados formam a estrutura: y í xxxiv VC{ 1 7) imif CM*) * · C * X / \ em que X, Y1, Y2 e C(17) são como definidos acima.

Um composto de Fórmula XXIIIB corresponde à 21 ΡΕ0973791 Fórmula XXII IA em que R8 e R9 em conjunto formam a estrutura de Fórmula XXXIII: o

XXXIII

Os compostos de Fórmulas XXIIIC, XXIIID e XXIIIE, respectivamente, correspondem a qualquer um de Fórmula XXIII, XXIIIA, ou XXIIIB em que cada um de -A-A- e -B-B- é —CH2—CH2—, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula XXIII podem ser preparados por oxidação de um composto de Fórmula XXIV, como se descreve abaixo.

Um composto de Fórmula 104 corresponde à estrutura: 0

104 em que -A-A-, -B-B-, e R3 são como definidos na Fórmula IV, e R11 é alquilo C4 até C4.

Um composto de Fórmula 104A corresponde à Fórmula 104 em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula 104 podem ser 22 ΡΕ0973791 preparados por decomposição térmica de um composto de Fórmula 103.

tura: em que -A-A-, -B-B-, R3 e R11 são como definidos na Fórmula 104, e R12 é alquilo inferior C1-C4.

Um composto de Fórmula 103A corresponde à Fórmula 103 em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula 103 podem ser preparados por reacção de um composto correspondente de Fórmula 102 com um malonato de dialquilo na presença de uma base tal como um alcóxido de metal alcalino.

Um composto de Fórmula 102 corresponde à estrutura:

102 23 ΡΕ0973791 em que -A-A-, -B-B-, R3 e R11 são como definidos na Fórmula 104 .

Um composto de Fórmula 102A corresponde à Fórmula 102 em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula 102 podem ser preparados por reacção de um composto correspondente de Fórmula 101 com um composto de trialquilsulfónio na presença de uma base.

Um composto de Fórmula 101 corresponde à estrutura :

em que -A-A-, -B-B-, R3 e R11 são como definidos na Fórmula 104.

Um composto de Fórmula 101A corresponde à Fórmula 101 em que cada um de -A-A- e -B-B- é -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio. Os compostos no âmbito da Fórmula 101 podem ser preparados por reacção de lla-hidroxiandrosteno-3,17-diona ou outro composto de Fórmula XXXVI com um ortoformato de trialquilo na presença de um ácido.

Com base na descrição do esquema reaccional como definido a seguir, tornar-se-á evidente quais destes compostos têm a maior utilidade. 24 ΡΕ0973791

Outros objectos e particularidades serão em parte evidentes e em parte indicados a seguir.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 é um diagrama de fluxos esquemático de um processo de bioconversão de canrenona ou um derivado de canrenona no composto lla-hidroxilo correspondente; A Fig. 2 é um diagrama de fluxos esquemático de um processo preferido de bioconversão de 11-a-hidroxilação de canrenona e derivados de canrenona; A Fig. 3 é um diagrama de fluxos esquemático de um processo particularmente preferido de bioconversão de 11-a-hidroxilação de canrenona e derivados de canrenona; A Fig. 4 mostra a distribuição de tamanho de partícula para a canrenona preparada segundo o processo da Fig. 2; e A Fig. 5 mostra a distribuição de tamanho de partícula para a canrenona como esterilizada no fermentador de transformação segundo o processo da Fig. 3.

Os caracteres de referência correspondentes indicam as partes correspondentes nas figuras.

Descrição de Formas de Realização Preferidas

De acordo com a presente invenção foi inventado um novo esquema de processo de preparação de epoximexrenona e outros compostos correspondentes à Fórmula I: 25 ΡΕ0973791

em que: -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo inferior, alcoxilo inferior, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano, ariloxilo, R1 representa um radical alcoxicarbonilo inferior ou hidroxialquilo com orientação alfa, -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo l\ <SH- -cít i -ÔH-

III com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis car- 26 ΡΕ0973791 bocíclicos ou heterocíclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbocíclicos ou heterocíclicos fundida com o anel pentacíclico D. A menos que indicado de outro modo, os radicais orgânicos referidos como "inferior" na presente descrição contêm no máximo 7, e preferencialmente desde 1 até 4, átomos de carbono.

Um radical alcoxicarbonilo inferior é preferencialmente um derivado de um radical alquilo possuindo desde 1 até 4 átomos de carbono, tais como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo e terc.-butilo; são especialmente preferidos o metoxicarbonilo, etoxicarbonilo e isopropoxicarbonilo. Um radical alcoxilo inferior é preferencialmente um derivado de um dos radicais alquilo C1-C4 supramencionados, especialmente de um radical alquilo C1-C4 primário; é especialmente preferido o meto-xilo. Um radical alcanoilo inferior é um derivado de um alquilo de cadeia linear possuindo desde 1 até 7 átomos de carbono; são especialmente preferidos o formilo e o acetilo.

Uma ponte metileno na posição 15,16 está preferencialmente com orientação β.

Uma classe preferida de compostos que pode ser produzida segundo o método da invenção são os compostos de 20-espiroxano descritos na patente U.S. 4 559 332, i.e., os correspondentes à Fórmula IA: 27 ΡΕ0973791

em que: -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo de Fórmula IIIA:

I I -CH— CH,-CH —

IIIA com orientação alfa ou beta, R1 representa um radical alcoxicarbonilo inferior ou hidro-xicarbonilo com orientação alfa,

X representa dois átomos de hidrogénio, oxo ou =S Y1 e Y2 em conjunto representam a ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo inferior ou, se X representar H2, representa também alcanoiloxilo inferior,

Preferencialmente, os compostos de 20-espiroxano produzidos pelo novo método da invenção são aqueles de Fórmula I nos quais Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-.

Os compostos da fórmula I especialmente preferidos são aqueles nos quais X representa oxo. 28 ΡΕ0973791

Dos compostos de 20-espiroxano de Fórmula IA nos quais X representa oxo são muito especialmente preferidos aqueles nos quais Y1 em conjunto com Y2 representam uma ponte de oxigénio -0-.

Como já foi mencionado, o ácido 17β -hidroxi-21-carboxílico também pode estar na forma dos seus sais. Há que ter em consideração em especial os sais de metal e amónio, tais como os sais de metal alcalinos e alcalino-terrosos, por exemplo os sais de sódio, cálcio, magnésio e, preferencialmente, potássio, e os sais de amónio derivados de amoníaco ou uma base orgânica contendo azoto adequada, de um modo preferido, fisiologicamente tolerável. As bases a ter em consideração são não só as aminas, por exemplo alquilaminas inferiores (tal como trietilamina), hidroxi-alquilaminas inferiores [tal como 2-hidroxi-etilamina, di-(2-hidroxietil)-amina ou tri-(2-hidroxietil)-amina], cicloalquilaminas (tal como diciclo-hexilamina) ou benzilaminas (tal como benzilamina e N,N'-dibenzil-etilenodiamina), mas também os compostos heterocíclicos contendo azoto, por exemplo aqueles de carácter aromático (tal como piridina ou quinolina) ou aqueles que possuem um anel heterocíclico pelo menos parcialmente saturado (tal como N-etilpiperidina, morfolina, piperazina ou N,N'-dimetilpiperazina).

Estão também incluídos entre os compostos preferidos os sais de metal alcalino, especialmente os sais de 29 ΡΕ0973791 potássio, de compostos da fórmula IA nos quais R1 representa alcoxicarbonilo, com X a representar oxo e cada um de Y1 e Y2 a representar hidroxilo.

Os compostos da fórmula I e IA especialmente preferidos são, por exemplo, os seguintes: 9a,lla-epoxi-7a-metoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona, 9a,lla-epoxi-7a-etoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3, 21-diona, 9a,lla-epoxi-7a-isopropoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3, 21-diona, e o análogo 1,2-desidro de cada um dos compostos, 9a,lla-epoxi-6a,7a-metileno-20-espirox-4-eno-3, 21-diona, 9a,lla-epoxi-ββ,7p-metileno-20-espirox-4-eno-3,21-diona, 9a,a-epoxi-ββ,7β;15β, lββ-bismetileno-20-espirox-4-eno-3,21-diona, e o análogo 1,2-desidro de cada um destes compostos, ácido 9α, 11α-βροχί-7α-ΐΐ^οχία3ηόοηί1-17β-Μάηοχί-3-οχο- pregn-4-eno-21-carboxílico, ácido 9α, 11α-βροχί-7α-βόοχίθ3ηόοηί1-17β-Μάηοχί-3-οχο- pregn-4-eno-21-carboxílico, ácido 9α, 11α-οροχί-7α-ί5ορΓοροχίθ3Γόοηί1-17β-ίιίάΓθχί-3- oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico, ácido 9α, 11α-οροχί-17β-1ιίόΓθχί-6α, 7β-ιηοόί1βηο-3-οχο-ρΓβρη-4-eno-21-carboxilico, 30 ΡΕ0973791 ácido 9α,lla-epoxi-17p-hidroxi-6p,7p-metileno-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico, ácido 9a,lla-epoxi-17p-hidroxi-6p,7β;15β, 16β-όί5ΐηβΡί1βηο-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxilico, e sais de metal alcalino, especialmente o sal de potássio ou amónio de cada um destes ácidos, e também um análogo 1,2-desidro correspondente de cada um dos ácidos carboxilicos mencionados ou de um seu sal. éster metilico, éster etilico e éster isopropilico do ácido 9α, 11α-θροχί-15β, 16β-ιηθΡί1θηο-3,21-dioxo-20-espirox-4-eno-7a-carboxilico, éster metilico, éster etilico e éster isopropilico do ácido 9α, 11α-θροχί-15β, 16β-ιηβΡί1βηο-3,21-dioxo-20-espiroxa-l, 4-dieno-7a-carboxilico, e também o éster metilico, éster etilico e éster isopropilico do ácido 9a,lla-epoxi-3-oxo-20-espirox-4-eno-7a-carboxilico, 9a, lla-epoxi-ββ, 6β-ιηβΡί1θηο-20-θ3ρ^οχ-4-θη-3-οηβ, 9a,lla-epoxi-ββ,7β;15 β,16β-Μ3ΐΐΐθΡϊ1βηο-20-β3ρΪΓθχ-4-βη-3-ona, e também o éster metilico, éster etilico e éster isopropilico do ácido 9α, 11α-βροχϊ-17β-ΜάΓθχϊ-17α (3-hidroxi-propil)-3-oxo-androst-4-eno-7a-carboxílico, 9a, 11α-θροχί-17β-1ιίό^χί-17α- (3-hidroxipropil) -6a, 7a-metileno-androst-4-en-3-ona, 9a, 11α-βροχϊ-17β-ΜάΓθχϊ-17α- (3-hidroxipropil) -6β, 7β-metileno-androst-4-en-3-ona, 31 ΡΕ0973791 9α,lla-epoxi-17p-hidroxi-17a-(3-hidroxipropil)-6β,7β;15β,16β-όϊ3ΐηβίϊ1βηο-3ηά^3ί-4-βη-3-οη3, incluindo os análogos 17α-(3-acetoxipropil) e 17a-(3-for-miloxipropil) dos compostos de androstano mencionados, e também os análogos 1,2-desidro de todos os compostos da série androst-4-en-3-ona e 20-espirox-4-en-3-ona mencionados .

Os nomes químicos dos compostos das Fórmulas I e IA, e de compostos análogos possuindo as mesmas particularidades estruturais características, são derivados de acordo com a nomenclatura corrente do seguinte modo: para os compostos nos quais Y1 em conjunto com Y2 representa -0-, a partir de 20-espiroxano (por exemplo um composto da fórmula IA no qual X representa oxo e Y1 em conjunto com Y2 representa -0- é derivado de 20-espiroxan-21-ona); para aqueles nos quais cada um de Y1 e Y2 representa hidroxilo e X representa oxo, a partir de ácido 17β -hidroxi-17a-pregneno-21-carboxílico; e para aqueles nos quais cada um de Y1 e Y2 representa hidroxilo e X representa dois átomos de hidrogénio, a partir de 17β-1ιίά^χί-17α- (3-hidroxipro-pil)-androstano. Uma vez que as formas cíclica e de cadeia aberta, isto é as lactonas e os ácidos 17β-1ιίάΓ0χί-21-03Γ-boxílico e seus sais, respectivamente, estão relacionados de muito perto uma com o outra, a última pode ser considerada simplesmente como uma forma hidratada da primeira, sendo para ser compreendido acima e abaixo, a menos que especificamente indicado de outro modo, tanto nos produtos finais da fórmula I como nos materiais de partida e inter- 32 ΡΕ0973791 mediários de estrutura análoga, em cada caso todas as formas mencionadas em conjunto.

De acordo com a invenção foi imaginado o seguinte processo de preparação de compostos de Fórmula I com rendimento elevado e a um custo razoável. Este esquema de síntese ocorre através da preparação de uma série de intermediários.

Esquema 1 (A partir de Canrenona ou Material Relacionado)

Um esquema de processo preferido de preparação de compostos de Fórmula I começa vantajosamente com canrenona ou um material de partida relacionado correspondente à Fórmula XIII

em que -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5- R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo inferior, alcoxilo inferior, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano, ariloxilo, -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo 33 ΡΕ0973791 \ CH- -CH — CH, -CH I -CH- com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-ciclicos ou heterociclicos, ou R8 e R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentaciclico D.

Utilizando um processo de bioconversão do tipo ilustrado nas Figuras 1 e 2, introduz-se um grupo 11-hidroxilo com orientação a no composto de Fórmula XIII, produzindo desse modo um composto de Fórmula VIII:

VIII 34 ΡΕ0973791 em que -A-A-, -B-B-, R3, R8 e R9 são como definidos acima.

Preferencialmente, o composto de Fórmula XIII tem a estrutura

XII IA e o produto lla-hidroxilo tem a estrutura

VIIIA em cada uma das quais -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo

ΠΙΑ com orientação alfa ou beta, X representa dois átomos de hidrogénio, oxo ou =S, 35 ΡΕ0973791 Y1 e Υ2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo inferior ou, se X representar h2, representa também alcanoiloxilo inferior, e os sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxi-, e o composto de Fórmula VIII produzido na reacção corresponde à Fórmula viiia

VXIXA em que -A-A-, -B-B-, Y1, Y2, e X são como definidos na Fórmula XIIIA. Mais preferencialmente, R8 e R9 formam em conjunto a estrutura 20-espiroxano: (j

XXXIIX -A-A- e -B-B- são cada um -CH2-CH2-, e R3 é hidrogénio.

Entre os organismos preferidos que podem ser utilizados neste passo de hidroxilação estão os Aspergillus ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500,

Aspergillus niqer ATCC 16888 e ATCC 26693, Aspergillus 36 ΡΕ0973791 nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Streptomyces fradiae ATCC 10745, Bacillus meqaterium ATCC 14945, Pseudomonas cruciviae ATCC 13262, e Trichothecium roseum ATCC 12543. Outros organismos preferidos incluem Fusarium oxisporum f.sp.cepae ATCC 11171 e Rhizopus arrhizus ATCC 11145.

Outros organismos que exibiram actividade para esta reacção incluem Absidia coerula ATCC 6647, Absidia glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 e ATCC 13144,

Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora ATCC 14767, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia clavata ATCC 22921,

Curvularia lunata ACTT 12071, Cilindrocarpon radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722, Gongronella butleri ATCC 22822, Hypomyces chrysospermus, Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor griseo-cyanus ATCC 1207A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina, Paecilomyces carneus ATCC 46579,

Penicillum patulum ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium sp. ATCC 12231, Saccharopolispora erythrae ATCC 11635, Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachilidium bicolor ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438,

Streptomyces purpurascens ATCC 25489, Syncephalastrum 37 ΡΕ0973791 racemosum ATCC 18192, Thamnostilum piriforme ATCC 8992, Thielavia terricola ATCC 13807 e Verticillium theobromae ATCC 12474.

Outros organismos que podem apresentar actividade para a lla-hidroxilação incluem Cephalosporium aphidicola (Phytochemistry (1996), 42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas (J. Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150), Tieqhemella orchidis (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Tieqhemella hyalospora (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876), Monosporium olivaceum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Aspergillus ustus (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Fusarium graminaarum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Verticillium glaucum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110) e Rhizopus niqricans (J. Steroid Biochem. (1987), 28(2), 197-201).

Previamente à fermentação à escala industrial para a hidroxilação de canrenona ou outros substratos de Fórmula XIII prepara-se um inoculo de células num sistema de fermentação de inoculação compreendendo um fermentador de inoculação, ou uma série de dois ou mais fermentadores de inoculação. Introduz-se uma suspensão mãe de esporos no primeiro fermentador de inoculação, em conjunto com uma solução nutriente de crescimento de células. Se o volume de inoculo pretendido ou necessário para produção exceder o produzido no primeiro fermentador de inoculação, o volume de inoculo pode ser progressiva e geometricamente amplifi- 38 ΡΕ0973791 cado por progressão através dos restantes fermentadores na sequência de fermentação de inoculação. Preferencialmente, o inoculo produzido no sistema de fermentação de inoculação é de volume e células viáveis suficientes para conseguir uma iniciação de reacção rápida no fermentador de produção, ciclos de lotes de produção relativamente curtos e actividade elevada do fermentador de produção. Qualquer que seja o número de vasos na sequência de fermentadores de inoculação, o segundo e fermentadores de inoculação seguintes são preferencialmente dimensionados para que a extensão de diluição de cada passo na sequência seja essencialmente a mesma. A diluição inicial de inoculo em cada fermentador de inoculação pode ser aproximadamente a mesma que a diluição no fermentador de produção. Adiciona-se canrenona ou outro substrato de Fórmula XIII ao fermentador de produção conjuntamente com o inoculo e a solução nutriente, e a reacção de hidroxilação é ali realizada. A suspensão de esporos adicionada ao sistema de fermentação de inoculação é de um frasco de suspensão mãe de esporos retirada de uma multiplicidade de frascos que constituem um banco de células mães de trabalho que é conservado em condições criogénicas antes de ser utilizado. 0 banco de células mães de trabalho é por sua vez derivado de um banco mestre de células mães que foi preparado do seguinte modo. Uma amostra de esporos obtida de uma fonte apropriada, e.g., ATCC, é inicialmente suspendida num meio aquoso tal como, por exemplo, soro fisiológico, solução 39 ΡΕ0973791 nutriente ou uma solução de tensioactivo, (e.g., um tensioactivo não iónico tal como Tween 20 a uma concentração de cerca de 0, 001% em peso), e a suspensão é distribuída entre placas de cultura, em que cada placa contém uma mistura nutriente sólida, tipicamente com base num polissacárido não digestível tal como agar, na qual são propagados os esporos. A mistura nutriente sólida contém preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose, entre cerca de 0,05% e cerca de 5% em peso de uma fonte de azoto, e.g., peptona, entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de uma fonte de fósforo, e.g., um fosfato de amónio ou de metal alcalino tal como hidrogenofosfato de dipotássio, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% em peso de lisado ou extracto de levedura (ou outra fonte de aminoácido tal como extracto de carne ou infusão de cérebro e coração), entre cerca de 1% e cerca de 2% em peso de agar ou outro polissacárido não digestível. Opcionalmente, a mistura nutriente sólida pode compreender e/ou conter ainda entre cerca de 0,1% e cerca de 5% em peso de extracto de malte. O pH da mistura nutriente sólida está preferencialmente entre cerca de 5,0 e cerca de 7,0, ajustado, consoante necessário, com hidróxido de metal alcalino ou ácido ortofosfórico. Entre os meios de crescimento sólidos úteis estão os seguintes: 1. Meio Sólido #1: 1% de glucose, 0,25% de extracto de levedura, 0,3% de K2HPO4 e 2% de agar (Bacto); pH ajustado até 6,5 com NaOH a 20%. 40 ΡΕ0973791 2. Meio Sólido #2: 2% de peptona (Bacto), 1% de extracto de levedura (Bacto), 2% de glucose e 2% de agar (Bacto); pH ajustado até 5 com H3PO4 a 10%. 3. Meio Sólido #3: 0,1% de peptona (Bacto), 2% de extracto de malte (Bacto), 2% de glucose e 2% de agar (Bacto); pH é de 5,3. 4. Meio Sólido #4: 5% de melaço final, 0,5% de água de maceração do milho, 0,25% de glucose, 0,25% de NaCl e 0,5% de kh2P04; pH ajustado até 5,8. 5. Agar micológico Difco (pH baixo). O número de placas de agar utilizadas no alargamento de um banco mestre de células mães pode ser seleccionado tendo em perspectiva as necessidades futuras de células mães, mas tipicamente são preparadas desse modo cerca de 15 até cerca de 30 placas. Após um período de crescimento adequado, e.g., 7 até 10 dias, as placas são raspadas na presença de um veículo aquoso, tipicamente soro fisiológico ou tampão, para colher os esporos, e a suspensão mãe mestre resultante é dividida por frascos pequenos, e.g., um ml. em cada um de uma multiplicidade de frascos de 1,5 ml. Para preparar uma suspensão mãe de esporos de trabalho para ser utilizada em investigação ou em operações de fermentação de produção, o conteúdo de um ou mais destes frascos mestres podem ser distribuídos pelas placas de agar e incubados do modo descrito acima para a 41 ΡΕ0973791 preparação de suspensões mestres de esporos. Quando são contempladas operações de fabrico em rotina pode utilizar-se tantas quantas 100 até 400 placas para gerar uma suspensão de trabalho de segunda geração. Cada placa é raspada para um frasco de suspensão de trabalho, contendo cada frasco tipicamente um ml do inoculo produzido. Para conservação permanente, tanto a suspensão mestre como o inoculo de produção de segunda geração são vantajosamente conservados no espaço de vapor de um recipiente de armazenagem criogénico contendo N2 liquido ou outro líquido criogénico.

No processo ilustrado na Fig. 1 prepara-se meio de crescimento aquoso que inclui uma fonte de azoto tal como peptona, um derivado de levedura ou equivalente, glucose e uma fonte de fósforo como um sal de fosfato. Os esporos do microrganismo são cultivados neste meio no sistema de fermentação de inoculação. O microrganismo preferido é Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500) . A cultura mãe assim produzida é depois introduzida no fermentador de produção em conjunto com o substrato de Fórmula XIII. O caldo de fermentação é agitado e arejado durante um período de tempo suficiente para que a reacção prossiga até ao grau de conclusão desejado. O meio para o fermentador de inoculação compreende preferencialmente uma mistura aquosa a qual contém: entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose, entre cerca de 0,05% e cerca de 5% em peso de uma 42 ΡΕ0973791 fonte de azoto, e.g., peptona, entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de uma fonte de fósforo, e.g., um fosfato de amónio ou de metal alcalino tal como fosfato de amónio monobásico ou hidrogenofosfato de dipotássio, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% em peso de lisado ou extracto de levedura (ou outra fonte de aminoácido tal como materiais solúveis de destilação), entre cerca de 1% e cerca de 2% em peso de agar ou outro polissacárido não digestível. Um meio de crescimento de cultura de inoculação particularmente preferido contém cerca de 0,05% e cerca de 5% em peso de uma fonte de azoto tal como peptona, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% em peso de levedura autolisada ou extracto de levedura, entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose e entre cerca de 0,05% em peso e cerca de 0,5% em peso de uma fonte de fósforo tal como fosfato de amónio monobásico. As operações de processo especialmente económicas são proporcionadas através da utilização de uma outra cultura preferida que contém entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de água de maceração de milho, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% de levedura autolisada ou extracto de levedura, entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose e cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de fosfato de amónio monobásico. A água de maceração de milho é uma fonte particularmente económica de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, ácidos orgânicos, vitaminas, iões metálicos, matérias vestigiais e fosfatos. Pode utilizar-se licores de trituração de outros grãos no lugar, ou para além, da água de maceração de milho. O pH do meio é preferencialmente ajustado na gama entre cerca de 5,0 e 43 ΡΕ0973791 cerca de 7,0, e.g., através da adição de um hidróxido de metal alcalino ou ácido ortofosfórico. Quando a água de maceração de milho serve como fonte de azoto e carbono, o pH é preferencialmente ajustado na gama de cerca de 6,2 até cerca de 6,8. O meio compreendendo peptona e glucose é preferencialmente ajustado a um pH entre cerca de 5,4 e cerca de 6,2. Entre os meios de crescimento úteis para serem utilizados na fermentação de inoculação: 1. Meio #1: 2% de peptona, 2% de levedura autolisada (ou extracto de levedura) e 2% de glucose; pH ajustado até 5,8 com NaOH a 20%. 2. Meio #2: 3% de água de maceração de milho, 1,5% de extracto de levedura 0,3% de fosfato de amónio monobásico e 3% de glucose; pH ajustado até 6,5 com NaOH a 20%.

Introduz-se esporos do microrganismo neste meio a partir de um frasco contendo tipicamente cerca de 109 esporos por ml, de suspensão. A produtividade óptima da geração de inoculação é obtida quando a diluição com o meio de crescimento no inicio de uma cultura de inoculação não reduzir a densidade da população de esporos para um valor inferior a cerca de 107 por ml. Preferencialmente, os esporos são cultivados no sistema de fermentação de inoculação até o volume micelial comprimido (PMV) no fermentador de inoculação ser pelo menos cerca de 20%, preferencialmente 35% até 45% . Uma vez que o ciclo no recipiente de fermentação de cultura de inoculação (ou qualquer recipiente de uma multiplicidade que compreende 44 ΡΕ0973791 uma sequência de fermentação de cultura de inoculação) depende da concentração inicial nesse recipiente, pode ser desejável proporcionar duas ou mais etapas de fermentação à cultura de inoculação para acelerar o processo global. No entanto é preferível evitar a utilização de significativamente mais do que três fermentadores de inoculação em série, já que a actividade pode ficar comprometida se a fermentação da cultura de inoculação for realizada através de um número excessivo de etapas. A fermentação da cultura de inoculação é realizada sob agitação a uma temperatura na gama de cerca de 23° até cerca de 37°C, preferencialmente na gama entre cerca de 24° e cerca de 28°C. A cultura do sistema de fermentação de inoculação é introduzida num fermentador de produção, em conjunto com um meio de crescimento industrial. Numa forma de realização da invenção, a canrenona ou outro substrato de Fórmula XIII não estéril serve como substrato para a reacção. Preferencialmente, o substrato é adicionado ao fermentador de produção na forma de uma suspensão a 10% até 30% em peso no meio de crescimento. Para aumentar a área superficial disponível para a reacção de lla-hidroxilação, o tamanho de partícula do substrato de Fórmula XIII é reduzido passando o substrato através de um micronizador isolado antes da introdução no fermentador. Introduz-se também separadamente uma solução mãe nutriente estéril contendo glucose, e uma segunda solução nutriente estéril contendo um derivado de levedura tal como levedura autolisada (ou formulação de aminoácido equivalente com base em fontes 45 ΡΕ0973791 alternativas tal como materiais solúveis de destilação). 0 meio compreende uma mistura aquosa contendo: entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose, entre cerca de 0,05% e cerca de 5% em peso de uma fonte de azoto, e.g., peptona, entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de uma fonte de fósforo, e.g., um fosfato de amónio ou de metal alcalino tal como hidrogenofosfato de dipotássio, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% em peso de lisado ou extracto de levedura (ou outra fonte de aminoácido tais como materiais solúveis de destilação), entre cerca de 1% e cerca de 2% em peso de agar ou outro polissacárido não digestivel. Um meio de crescimento industrial particularmente preferido contém cerca de 0,05% até cerca de 5% em peso de uma fonte de azoto tal como peptona, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% em peso de levedura autolisada ou extracto de levedura, entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose, e entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de uma fonte de fósforo tal como fosfato de amónio monobásico. Um outro meio de produção preferido contém entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de água de maceração de milho, entre cerca de 0,25% e cerca de 2,5% de levedura autolisada ou extracto de levedura, entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de glucose e cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de fosfato de amónio monobásico. O pH do meio de fermentação de produção é preferencialmente ajustado do modo descrito acima para o meio de fermentação da cultura de inoculação, com as mesmas gamas preferidas para o pH dos meios à base de peptona/glucose e meios à base de água de maceração de milho, respectivamente. Os meios de crescimento de bioconversão úteis são descritos abaixo: -46 - ΡΕ0973791 1. Meio #1: 2% de peptona, 2% de levedura autolisada (ou extracto de levedura) e 2% de glucose; pH ajustado até 5,8 com NaOH a 20%. 2. Meio #2: 1% de peptona, 1% de levedura autolisada (ou extracto de levedura) e 2% de glucose; pH ajustado até 5,8 com NaOH a 20%. 3. Meio #3: 0,5% de peptona, 0,5% de levedura autolisada (ou extracto de levedura) e 0,5% de glucose; pH ajustado até 5,8 com NaOH a 20%. 4. Meio #4: 3% de água de maceração de milho, 1,5% de extracto de levedura, 0,3% de fosfato de amónio monobásico e 3% de glucose; pH ajustado até 6,5 com NaOH a 20%. 5. Meio #5: 2,55% de água de maceração de milho, 1,275% de extracto de levedura, 0,255% de fosfato de amónio monobásico e 3% de glucose; pH ajustado até 6,5 com NaOH a 20%. 6. Meio #6: 2,1% de água de maceração de milho, 1,05% de extracto de levedura, 0,21% de fosfato de amónio monobásico e 3% de glucose; pH ajustado até 6,5 com NaOH a 20%. A canrenona não estéril e a solução estéril de nutrientes são fornecidas em cadeia ao fermentador de produção em cinco até vinte, preferencialmente dez até quinze, porções de um modo preferido substancialmente iguais, cada uma delas ao longo do ciclo de produção do lote. Vantajosamente, o substrato é inicialmente introduzido numa quantidade suficiente para estabelecer uma concentração entre cerca de 0,1% em peso e cerca de 3% em 47 ΡΕ0973791 peso, preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 2% em peso, antes da inoculação com o caldo de fermentação da cultura de inoculação, e depois adicionado periodicamente, de modo conveniente cada 8 até 24 horas, até uma proporção acumulativa entre cerca de 1% e cerca de 8% em peso. Quando se adiciona mais substrato em cada turno de 8 horas, a adição total pode ser ligeiramente inferior, e.g., 0,25% até 2,5% em peso, do que no caso em que o substrato é adicionado apenas numa base diária. No último caso a adição acumulativa de canrenona pode ter de estar na gama de 2% até cerca de 8% em peso. A alimentação de mistura nutriente suplementar durante a reacção de fermentação é preferencialmente um concentrado, por exemplo, uma mistura contendo entre cerca de 40% e cerca de 60% em peso de glucose estéril, e entre cerca de 16% e cerca de 32% em peso de extracto de levedura estéril ou outra fonte estéril de derivado de levedura (ou outra fonte de aminoácido). Uma vez que o substrato fornecido ao fermentador de produção da Fig. 1 é não estéril, adiciona-se periodicamente antibióticos ao caldo de fermentação para controlar o crescimento de organismos indesejados. Pode adicionar-se antibióticos tais como canamicina, tetraciclina, e cefalexina sem afectar desvantajosamente o crescimento e bioconversão. Preferencialmente, estes são introduzidos no caldo de fermentação numa concentração, e.g., entre cerca de 0,0004% e cerca de 0,002% com base na quantidade total de caldo, compreendendo, e.g., entre cerca de 0,0002% e cerca de 0,0006% de sulfato de canamicina, entre cerca de 0,0002% e cerca de 0, 006% de tetraciclina HC1 e/ou entre cerca de 48 ΡΕ0973791 0,001% e cerca de 0,003% de cefalexina, novamente com base na quantidade total de caldo.

Tipicamente, o ciclo de produção do lote de fermentação é da ordem das 80-160 horas. Assim, tipicamente, adiciona-se porções de cada substrato da Fórmula XIII e da solução de nutrientes cada 2 até 10 horas, preferencialmente cada 4 até 6 horas. Vantajosamente, incorpora-se também um antiespumante no sistema de fermentação de inoculação e no fermentador de produção.

Preferencialmente, no processo da Fig. 1, a carga de inoculo para o fermentador de produção é cerca de 0,5 até cerca de 7%, mais preferencialmente cerca de 1 até cerca de 2%, em volume com base na mistura total no fermentador, e a concentração de glucose é mantida entre cerca de 0,01% e cerca de 1,0%, preferencialmente entre cerca de 0,025% e cerca de 0,5%, mais preferencialmente entre cerca de 0,05% e cerca de 0,25% em peso com adições periódicas que são preferencialmente em porções de cerca de 0,05% até cerca de 0,25% em peso, com base na carga total do lote. A temperatura de fermentação é convenientemente controlada numa gama de cerca de 20° até cerca de 37°C, preferencialmente cerca de 24°C até cerca de 28°C, mas pode ser desejável reduzir a temperatura durante a reacção, e.g., em incrementos de 2°C, para manter o volume micelial comprimido (PMV) inferior a cerca de 60%, mais preferencialmente inferior a cerca de 50%, e desse modo impedir que a viscosidade do caldo de fermentação interfira 49 ΡΕ0973791 com uma mistura satisfatória. Se o crescimento da biomassa se prolongar para cima da superfície do líquido, o substrato retido dentro da biomassa pode ser levado para fora da zona de reacção e tornar-se indisponível para a reacção de hidroxilação. Para efeitos de produtividade é desejável atingir um PMV na gama de 30 até 50%, preferencialmente 35% até 45%, dentro das primeiras 24 horas da reacção de fermentação, mas daí em diante as condições são preferencialmente geridas de modo a controlar qualquer crescimento adicional dentro dos limites indicados acima. Durante a reacção, o pH do meio de fermentação é controlado entre cerca de 5,0 e cerca de 6,5, preferencialmente entre cerca de 5,2 e cerca de 5,8, e o fermen-tador é agitado a uma velocidade entre cerca de 400 e cerca de 800 rpm. Um nível de oxigénio dissolvido de pelo menos cerca de 10% de saturação é conseguido por arejamento do lote entre cerca de 0,2 e cerca de 1,0 vvm, e mantendo a pressão no espaço de cabeça do fermentador entre cerca da pressão atmosférica e cerca de 1,0 bar positivo, muito preferencialmente na vizinhança de cerca de 0,7 bar positivos. A velocidade de agitação também pode ser aumentada consoante necessário para manter níveis mínimos de oxigénio dissolvido. Vantajosamente, o oxigénio dissolvido é mantido bem acima de 10%, na realidade tão elevado quanto 50% para promover a conversão de substrato. Manter o pH na gama de 5,5±0,2 é também óptimo para bioconversão. A formação de espuma é controlada, consoante necessário, através da adição de um agente antiespuma comum. Depois de ter sido adicionado todo o substrato, a 50 ΡΕ0973791 reacção é preferencialmente prosseguida até a proporção molar do produto de Fórmula VIII em relação ao substrato de Fórmula XIII por reagir remanescente ser de pelo menos cerca de 9 para 1. Uma tal conversão pode ser conseguida dentro do ciclo de 80-160 horas do lote, indicado acima.

Constatou-se que conversões elevadas estão associadas a uma redução dos niveis iniciais de nutrientes abaixo do nivel inicial de carga, e pelo controlo da taxa de arejamento e velocidade de agitação para evitar a saida em salpicos do substrato para fora do caldo liquido. No processo da Fig. 1, o nivel de nutriente foi reduzido e depois mantido a um valor não superior a cerca de 60%, preferencialmente cerca de 50%, do nivel inicial de carga; enquanto nos processos das Figuras 2 e 3, o nível de nutriente foi reduzido e mantido a um valor não superior a cerca de 80%, preferencialmente cerca de 70%, do nível inicial de carga. A taxa de arejamento é preferencialmente não superior a um vvm, mais preferencialmente na gama de cerca de 0,5 vvm; enquanto a velocidade de agitação é preferencialmente não superior a 600 rpm.

Um processo particularmente preferido de preparação de um composto de Fórmula VIII é ilustrado na Fig. 2. Mais uma vez o microrganismo preferido é Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). Neste processo, o meio de crescimento compreende preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em peso de água de maceração de milho, entre cerca de 0,5% e cerca de 5% em 51 ΡΕ0973791 peso de glucose, entre cerca de 0,1% e cerca de 3% em peso de extracto de levedura, e entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% em peso de fosfato de amónio. No entanto também se pode utilizar outros meios de crescimento para produção como aqui descritos. A cultura de inoculação é preparada essencialmente do modo descrito para o processo da Fig. 1, utilizando qualquer um dos meios de fermentação aqui descritos. Prepara-se assepticamente num misturador uma suspensão de canrenona ou outro substrato de Fórmula XIII não micronizado mo meio de crescimento, preferencialmente a uma concentração relativamente elevada entre cerca de 10% e cerca de 30% em peso de substrato. Preferencialmente, a preparação asséptica pode compreender esterilização ou pasteurização da suspensão após mistura. A quantidade total de suspensão de substrato estéril necessária para um lote de produção é introduzida no fermentador de produção no inicio do lote ou por fornecimento periódico em cadeia. O tamanho de partícula do substrato é reduzido por moagem húmida numa bomba de corte em linha que transfere a suspensão do fermentador de produção, evitando desse modo a necessidade para utilizar um micronizador fora de linha. Quando as condições assépticas são conseguidas por pasteurização em vez de esterilização, o grau de aglomeração pode ser insignificante, mas a utilização de uma bomba de corte pode ser benéfica para proporcionar um controlo positivo do tamanho de partícula. O meio de crescimento estéril e a solução de glucose são introduzidos no fermentador de produção essencialmente do mesmo modo que descrito acima. Todos os componentes de alimentação para o 52 ΡΕ0973791 fermentador de produção são esterilizados antes da introdução, pelo que não são necessários antibióticos.

Preferencialmente, ao realizar o processo da Fig. 2, o inoculo é introduzido no fermentador de produção numa proporção entre cerca de 0,5% e cerca de 7%, a temperatura de fermentação é entre cerca de 20° e cerca de 37°C, preferencialmente entre cerca de 24°C e cerca de 28°C, e o pH é controlado entre cerca de 4,4 e cerca de 6,5, preferencialmente entre cerca de 5,3 e cerca de 5,5, e.g., através da introdução de amoníaco gasoso, hidróxido de amónio aquoso, hidróxido de metal alcalino aquoso ou ácido ortofosfórico. Como no processo da Fig. 1, a temperatura é preferencialmente ajustada para controlar o crescimento da biomassa de modo a que o PMV não exceda 55-60%. A carga inicial de glucose situa-se preferencialmente entre cerca de 1% e cerca de 4% em peso, muito preferencialmente 2,5% até 3,5% em peso, mas deixa-se preferencialmente descer abaixo de cerca de 1,0% em peso durante a fermentação. Fornece-se periodicamente glucose adicional em porções entre cerca de 0,2% e cerca de 1,0% em peso com base na carga total do lote de modo a manter a concentração de glucose na zona de fermentação numa gama entre cerca de 0,1% e cerca de 1,5% em peso, preferencialmente entre cerca de 0,25% e cerca de 0,5% em peso. Opcionalmente pode adicionar-se fontes de azoto e fósforo juntamente com a glucose. No entanto, porque a carga de canrenona total é feita no início do ciclo do lote, o fornecimento necessário de nutrientes contendo azoto e fósforo também pode ser introduzido nessa altura, permitindo utilizar apenas uma 53 ΡΕ0973791 solução de glucose para suplementação durante a reacção. A velocidade e natureza da agitação é uma variável significativa. Uma agitação moderadamente vigorosa promove a transferência de massa entre o substrato sólido e a fase aquosa. No entanto deverá ser utilizado um rotor de baixo esforço de corte para evitar a degradação da mielina dos microrganismos. A velocidade de agitação óptima varia na gama de 200 até 800 rpm, dependendo da viscosidade do caldo de cultura, concentração de oxigénio e condições de mistura como influenciadas pela configuração do recipiente, reflec-tor e rotor. Normalmente, uma velocidade de agitação preferida situa-se na gama de 350-600 rpm. Preferencialmente, o rotor de agitação proporciona uma função de bombeamento axial descendente de modo a ajudar a uma boa mistura da biomassa fermentada. 0 lote é preferencialmente arejado a uma taxa entre cerca de 0,3 e cerca de 1,0 vvm, preferencialmente 0,4 até 0,8 vvm, e a pressão no espaço de cabeça do fermentador situa-se preferencialmente entre cerca de 0,5 e cerca de 1,0 bar positivo. As temperatura, agitação, arejamento e contrapressão são preferencialmente controladas para manter o oxigénio dissolvido na gama de pelo menos cerca de 10% em volume durante a bioconversão. O ciclo total de lote situa-se tipicamente entre cerca de 100 e cerca de 140 horas.

Embora o principio de funcionamento do processo da Fig. 2 se baseie na introdução inicial de praticamente toda a carga de canrenona, entender-se-á que o crescimento do caldo de fermentação pode ser realizado antes de se 54 ΡΕ0973791 adicionar a maior parte da canrenona. Opcionalmente também se pode adicionar mais tarde uma certa porção da canrenona ao lote. No entanto, em geral, pelo menos cerca de 75% da carga de canrenona estéril deverá ser introduzida no fermentador de transformação dentro de 48 horas após início da fermentação. Além disso é desejável introduzir pelo menos cerca de 25% em peso de canrenona no início da fermentação ou pelo menos dentro das primeiras 24 horas para promover a geração da(s) enzima(s) de bioconversão.

Num outro processo preferido como ilustrado na Fig. 3, a carga total do lote e a solução nutriente são esterilizadas no recipiente de fermentação de produção antes da introdução de inoculo. As soluções de nutrientes que podem ser utilizadas, assim como as preferidas entre elas, são essencialmente as mesmas que no processo da Fig. 2. Nesta forma de realização da invenção, a acção de corte do rotor agitador quebra os aglomerados de substrato que de outro modo tendem a formar-se durante a esterilização. Constatou-se que a reacção prossegue satisfatoriamente se o tamanho de partícula médio da canrenona for menor do que cerca de 200 μ e pelo menos 75% em peso das partículas forem menores do que 240 μ. Constatou-se que a utilização de um rotor adequado, e.g., um rotor de disco de turbina, a uma velocidade adequada na gama de 200 até 800 rpm, com uma velocidade periférica de pelo menos cerca de 400 cm/s, proporciona uma taxa de corte suficiente para manter tais caracteristicas de tamanho de partícula apesar da aglomeração que tende a ocorrer durante a esterilização no 55 ΡΕ0973791 fermentador de produção. A realização do remanescente do processo da Fig. 3 é essencialmente a mesma do processo da Fig. 2. Os processos das Figuras 2 e 3 oferecem várias vantagens distintas em relação ao processo da Fig. 1. Uma vantagem particular é a adequabilidade para utilizar uma base nutriente de baixo custo tal como água de maceração de milho. Mas podem ser perspectivadas outras vantagens ao eliminar a necessidade de antibióticos, simplificar os procedimentos de alimentação e permitir a esterilização do lote de canrenona ou outro substrato de Fórmula XIII. Uma outra vantagem particular é a capacidade para utilizar uma solução de glucose simples em vez de uma solução nutriente complexa para suplementação durante o ciclo da reacção.

Nos processos representados nas Figuras 1 até 3, o produto de Fórmula VIII é um sólido cristalino o qual, em conjunto com a biomassa, pode ser separado do caldo reaccional por filtração ou centrifugação de velocidade baixa. Alternativamente, o produto pode ser extraído do caldo reaccional completo com solventes orgânicos. 0 produto de Fórmula VIII é recuperado por extracção com solvente. Para recuperação máxima, tanto o filtrado de fase líquida como o filtro de biomassa ou bolo de centrifugação são tratados com solvente de extracção, já que geralmente > 95% do produto está associado à biomassa. Tipicamente pode utilizar-se solventes do tipo hidrocarboneto, éster, hidrocarboneto clorado e cetona para extracção. Um solvente preferido é acetato de etilo. Outros solventes tipicamente adequados incluem tolueno e metilisobutilcetona. Para 56 ΡΕ0973791 extracção a partir da fase líquida pode ser conveniente utilizar um volume de solvente aproximadamente igual ao volume da solução reaccional com a qual ele contacta. Para recuperar o produto da biomassa, a última é suspendida no solvente, preferencialmente num grande excesso em relação à carga inicial de substrato, e.g., 50 até 100 ml. de solvente por grama de carga inicial de canrenona, e a suspensão resultante foi preferencialmente aquecida a refluxo durante um período de 20 minutos até várias horas para garantir a transferência do produto das reentrâncias e poros da biomassa para a fase de solvente. Subsequentemente, a biomassa é retirada por filtração ou centrifugação, e o bolo de filtração preferencialmente lavado com solvente fresco e água desionizada. As lavagens aquosas e de solvente são depois reunidas e deixa-se as fases separar. O produto de Fórmula VIII é recuperado por cristalização da solução. Para maximizar o rendimento, o micélio é posto em contacto duas vezes com solvente fresco. Depois de repousar para permitir a separação completa da fase aquosa, o produto é recuperado da fase de solvente. Muito preferencialmente, o solvente é eliminado sob vácuo até começar a cristalização, em seguida o extracto concentrado é arrefecido até uma temperatura de 0o até 20°C, preferencialmente cerca de 10° até cerca de 15°C durante um período de tempo suficiente para precipitação e crescimento dos cristais, tipicamente 8 até 12 horas.

Os processos da Fig. 2, e especialmente o da Fig. 3, são particularmente preferidos. Estes processos funcio- 57 ΡΕ0973791 nam a viscosidade baixa e são adequados para um controlo rigoroso de parâmetros de processo tais como pH, temperatura e oxigénio dissolvido. Além do mais são facilmente mantidas condições estéreis sem o recurso a antibióticos. 0 processo de bioconversão é exotérmico, pelo que o calor deverá ser eliminado, utilizando um fermentador encamisado ou uma espiral de arrefecimento no fermentador de produção. Alternativamente, o caldo reaccional pode ser circulado através de um permutador de calor externo. 0 oxigénio dissolvido é preferencialmente mantido a um nível de pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 10%, em volume, suficiente para proporcionar energia para a reacção e garantir conversão da glucose em CO2 e H2O, regulando a taxa de ar introduzida no reactor em resposta à medição do potencial de oxigénio no caldo. O pH é preferencialmente controlado entre cerca de 4,5 e cerca de 6,5.

Em cada um dos processos alternativos para 11-hidroxilação do substrato de Fórmula XIII, a produtividade é limitada pela transferência de massa do substrato sólido para a fase aquosa, ou para a interface entre as fases, onde parece ocorrer a reacção. Como indicada acima, a produtividade não é significativamente limitada pelas velocidades de transferência de massa desde que o tamanho de partícula médio do substrato seja reduzido a menos do que cerca de 300 μ, e pelo menos 75% em peso das partículas sejam menores do que 240 μ. No entanto, a produtividade 58 ΡΕ0973791 destes processos pode ser ainda aumentada em determinadas formas de realização alternativas que proporcionam uma carga substancial de canrenona ou outro substrato de Fórmula XIII ao fermentador de produção num solvente orgânico. De acordo com uma opção, o substrato é dissolvido num solvente imiscível com água e misturado com o inoculo de meio de crescimento aquoso e um tensioactivo. Os solventes imiscíveis com água úteis incluem, por exemplo, DMF, DMSO, ácidos gordos C6-C12, n-alcanos C6-C12, óleos vegetais, sorbitanos e soluções aquosas de tensioactivos. A agitação desta carga gera um sistema reaccional em emulsão possuindo uma área interfacial alargada para transferência de massa de substrato da fase liquida orgânica para os sitios de reacção.

Uma segunda opção consiste em dissolver inicialmente o substrato num solvente miscivel em água tal como acetona, metiletilcetona, metanol, etanol ou glicerol numa concentração substancialmente maior do que a sua solubilidade em água. Ao preparar a solução inicial de substrato a temperatura elevada aumenta-se a solubilidade, aumentando-se assim ainda mais a quantidade de solução de substrato introduzida no reactor e aumentando-se, em última análise, a carga do reactor. A solução de substrato quente é transferida para o reactor de fermentação de produção juntamente com a carga aquosa relativamente fria compreendendo o meio de crescimento e inoculo. Quando a solução de substrato é misturada com o meio aquoso, ocorre precipitação do substrato. No entanto, em condições de 59 ΡΕ0973791 sobressaturação considerável e agitação moderadamente vigorosa, a nucleação é favorecida em relação ao crescimento de cristais, e formam-se partículas muito finas de elevada área superficial. A elevada área superficial promove a transferência de massa entre a fase líquida e o substrato sólido. Além do mais, a concentração de equilíbrio de substrato na fase líquida aquosa é também aumentada na presença de um solvente miscível com água. Por conseguinte, a produtividade é promovida.

Embora o microrganismo possa não necessariamente tolerar uma concentração elevada de solvente orgânico na fase aquosa pode utilizar-se vantajosamente uma concentração de etanol, e.g., na gama de cerca de 3% até cerca de 5% em peso.

Uma terceira opção consiste em solubilizar o substrato numa solução aquosa de ciclodextrina. As ciclo-dextrinas ilustrativas incluem hidroxipropil-P-ciclodex-trina e metil-P-ciclodextrina. A proporção molar de substrato:ciclodextrina pode ser de cerca de 1:1 até cerca de 1:1,5, substrato:ciclodextrina. A mistura substrato:ciclodextrina pode ser depois adicionada assepticamente ao reactor de bioconversão. A lla-hidroxicanrenona e outros produtos do processo de lla-hidroxilação (Fórmulas VIII e viiia) podem ser isolados filtrando o meio reaccional e extraindo o produto da biomassa recolhida no meio de filtração. Pode 60 ΡΕ0973791 utilizar-se solventes orgânicos convencionais, e.g., acetato de etilo, acetona, tolueno, hidrocarbonetos clorados e metilisobutilcetona para a extracção. O produto de Fórmula VIII pode ser depois recristalizado de um solvente orgânico do mesmo tipo. Os compostos de Fórmula VIII têm um valor considerável como intermediários para a preparação de compostos de Fórmula I, e especialmente de Fórmula IA.

Preferencialmente, os compostos de Fórmula VIII correspondem à Fórmula VIIIA na qual -A-A- e -B-B- são —CH2—CH2—, R3 é hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxilo inferior, e R8 e R9 em conjunto formam o anel de 20-espiroxano: o

XXXIII

Além disso de acordo com o processo do esquema 1, o composto de Fórmula VIII é feito reagir em condições alcalinas com uma fonte de ião cianeto para produzir um composto enamina de Fórmula vil

G

VII 61 ΡΕ0973791

em que -A-A-, R3, -B-B-, R8 e R9 são como definidos acima. Quando o substrato corresponde à Fórmula VIIIA, o produto é de Fórmula VIIA

VI IA em que -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 e X são como definidos na Fórmula XIII. A cianetação do substrato lla-hidroxilo de Fórmula VIII pode ser realizada fazendo-o reagir com uma fonte de ião cianeto tal como uma cetona ciano-hidrina, muito preferencialmente acetona ciano-hidrina, na presença de uma base e um sal de metal alcalino, muito preferencialmente LiCl. Alternativamente, a cianetação pode ser realizada sem uma ciano-hidrina mas utilizando um cianeto de metal alcalino na presença de um ácido.

No processo de cetona ciano-hidrina, a reacção é realizada em solução, utilizando preferencialmente um solvente polar aprótico tal como dimetilformamida ou sulfóxido de dimetilo. A formação da enamina requer pelo menos duas moles de fonte de ião cianeto por mole de 62 ΡΕ0973791 substrato, utilizando-se preferencialmente um ligeiro excesso da fonte de cianeto. A base é preferencialmente uma base de azoto tal como uma dialquilamina, trialquilamina, alcanolamina, piridina ou semelhantes. No entanto também podem ser utilizadas bases inorgânicas tais como carbonatos de metais alcalinos ou hidróxidos de metais alcalinos. Preferencialmente, o substrato de Fórmula VIII está inicialmente presente numa proporção entre cerca de 20 e cerca de 50% em peso e a base está presente numa proporção entre 0,5 até dois equivalentes por equivalente de substrato. A temperatura da reacção não é critica mas a produtividade é aumentada operando a temperatura elevada. Assim, por exemplo, quando se utiliza trietilamina como base, a reacção é vantajosamente realizada na gama de cerca de 80°C até cerca de 90°C. A estas temperaturas, a reacção está concluída em cerca de 5 até cerca de 20 horas. Quando se utiliza diisopropiletilamina como base e a reacção é realizada a 105°C, a reacção está concluída em 8 horas. No final de um período reaccional, o solvente é eliminado sob vácuo e o óleo residual dissolvido em água e neutralizado até pH 7 com ácido diluído, preferencialmente ácido clorídrico. O produto precipita desta solução e é depois lavado com água destilada e seco ao ar. O HCN libertado pode ser eliminado com um gás inerte e desactivado numa solução alcalina. O precipitado seco é refeito em clorofórmio ou outro solvente adequado, extraído em seguida com ácido concentrado, e.g., HC1 6N. O extracto é neutralizado até pH 7 através da adição de uma base inorgânica, preferencialmente um hidróxido de metal alcalino e arrefecida a 63 ΡΕ0973791 uma temperatura na gama de 0°C. 0 precipitado resultante é lavado e seco, depois recristalizado de um solvente adequado, e.g., acetona, para produzir um produto de Fórmula VII adequado para ser utilizado no passo seguinte do processo.

Alternativamente, a reacção pode ser realizada num sistema solvente aquoso compreendendo um solvente orgânico miscivel com água tal como metanol ou num sistema bifásico compreendendo água e um solvente orgânico tal como acetato de etilo. Nesta alternativa, o produto pode ser recuperado diluindo a solução reaccional com água, e extraindo subsequentemente o produto utilizando um solvente orgânico tal como cloreto de metileno ou clorofórmio, e extraindo de novo em seguida do extracto orgânico utilizando ácido mineral concentrado, e.g., HC1 2N. Ver patente U.S. 3 200 113.

Ainda de acordo com uma outra alternativa, a reacção pode ser realizada num solvente miscivel com água tal como dimetilformamida, dimetilacetamida, N-metil-pirrolidona ou sulfóxido de dimetilo, após o que a solução do produto reaccional é diluída com água e tornada alcalina, e.g., através da adição de um carbonato de metal alcalino, depois arrefecida a 0o até 10°C, provocando desse modo a precipitação do produto. Preferencialmente, o sistema é desactivado com um hipo-halogeneto de metal alcalino ou outro reagente eficaz para impedir a libertação de cianeto. Após filtração e lavagem com água, o produto 64 ΡΕ0973791 precipitado é adequado para ser utilizado no passo seguinte do processo.

Ainda de acordo com uma outra alternativa, o produto enamina de Fórmula VII pode ser produzido pela reacção de um substrato de Fórmula VIII na presença de uma fonte de protões, com um excesso de cianeto de metal alcalino, preferencialmente NaCN, num solvente aquoso compreendendo um solvente polar aprótico miscivel com água tal como dimetilformamida ou dimetilacetamida. A fonte de protões é preferencialmente um ácido mineral ou ácido carboxilico Ci até C5, sendo particularmente preferido o ácido sulfúrico. Anomalamente não foi necessário adicionar nenhuma fonte discreta de protões quando o reagente de cianetação era LiCN comercial em DMF. 0 ião cianeto é preferencialmente transferido para o reactor numa proporção entre cerca de 2,05 e cerca de 5 molar equivalentes por equivalente de substrato. Julga-se que o ácido mineral ou outra fonte de protões promova a adição de HCN às ligações duplas 4,5 e 6,7, e está preferencialmente presente numa proporção de pelo menos um equivalente molar por equivalente molar de substrato; mas o sistema reaccional deverá permanecer básico mantendo um excesso de cianeto de metal alcalino em relação ao ácido presente. A reacção é preferencialmente realizada a uma temperatura de pelo menos cerca de 75°C, tipicamente 60°C até 100°C, durante um período de cerca de 1 até cerca de 8 horas, preferencialmente cerca de 1,5 até 65 ΡΕ0973791 cerca de 3 horas. No final do período reaccional, a mistura reaccional é arrefecida, preferencialmente até cerca da temperatura ambiente; e o produto enamina é precipitado acidificando a mistura reaccional e misturando-a com água fria, preferencialmente a cerca da temperatura do banho de gelo. Julga-se gue a acidificação fecha a 17-lactona, a gual tende a abrir nas condições básicas vigentes na ciane-tação. A mistura reaccional é convenientemente acidificada utilizando o mesmo ácido gue está presente durante a reacção, preferencialmente ácido sulfúrico. Adiciona-se preferencialmente água numa proporção entre cerca de 10 e cerca de 50 eguivalente molares por mole de produto.

Os compostos de Fórmula VII são consideravelmente valiosos como intermediários para a preparação de compostos de Fórmula I, e especialmente de Fórmula IA. Preferencialmente, os compostos de Fórmula Vil correspondem à Fórmula VIIA nos quais -A-A- e -B-B- são -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxilo inferior, e R8 e R9 em conjunto formam o anel 20-espiroxano:

Muito preferencialmente o composto de Fórmula VII é 5'R(5'a),7'β—2 0'-Amino-hexadeca-hidro-11'β-hidroxi- 10 ' a, 13 ' a-dimetil-3 ', 5-dioxoespiro [furan-2 (3Η),17'α(5Ή)-[7,4]meteno[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo. -66 - ΡΕ0973791

No passo seguinte da síntese do Esquema 1, a enamina de Fórmula VII é hidrolisada para produzir um composto dicetona de Fórmula VI

em que -A-A-, R3, -B-B-, R8 e R9 são como definidos na Fórmula VIII. Pode utilizar-se qualquer ácido orgânico ou mineral aquoso para a hidrólise. É preferido o ácido clorídrico. Para aumentar a produtividade é preferencialmente utilizado um solvente orgânico miscível com água, tal como um alcanol inferior, como um co-solvente. 0 ácido deverá estar presente na proporção de pelo menos um equivalente por equivalente de substrato de Fórmula VII. Num sistema aquoso, o substrato de enamina VII pode ser substancialmente convertido à dicetona de Fórmula VII num período de cerca de 5 horas a cerca de 80°C. A operação a temperatura elevada aumenta a produtividade, mas a temperatura não é crítica. As temperaturas adequadas são seleccio-nadas com base na volatilidade do sistema solvente e ácido.

Preferencialmente, o substrato enamina de Fórmula

VII corresponde à Fórmula VIIA 67 ΡΕ0973791

e o produto dicetona corresponde à Fórmula VIA

em cada uma das quais -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 e X são como definidos na Fórmula VIIIA.

No final do período reaccional, a solução é arrefecida até 0o e 25°C para cristalizar o produto. Os cristais de produto podem ser recristalizados de um solvente adequado tal como isopropanol ou metanol para produzir um produto de Fórmula VI adequado para ser utilizado no passo seguinte do processo; mas a recristalização não é geralmente necessária. Os produtos de Fórmula VI são 68 ΡΕ0973791 consideravelmente valiosos como intermediários para a preparação de compostos de Fórmula I, e especialmente de Fórmula IA. Preferencialmente, os compostos de Fórmula VI correspondem à Fórmula VIA na qual -A-A- e - B-B- são -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxilo inferior, e R8 e R9 em conjunto formam o anel 20-espiroxano: 0

XXXIII

Muito preferencialmente, o composto de Fórmula VI é 4's(4'a),7'a-Hexadeca-hidro-11'a-hidroxi-10'β,13'β-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'β—[4,7]metano[17H]-ciclopenta[a]fenantreno]-51β(2 Ή)-carbonitrilo.

Prefere-se que o produto enamina de Fórmula VII seja produzido a partir do composto de Fórmula VIII do modo descrito acima e convertido in situ à dicetona de Fórmula VI. Neste passo, um substrato de fórmula VIII é feito reagir com um excesso de cianeto de metal alcalino num solvente aquoso contendo uma fonte de protões, ou opcionalmente um excesso de cetona ciano-hidrina na presença de uma base e LiCl, como descrito acima. No entanto, em vez de arrefecer a mistura reaccional, acidificar e adicionar água em proporções calculadas para provocar a precipitação da enamina, o arrefecimento substancial da mistura reaccional é preferencialmente evitado. Água e um ácido, preferencialmente um ácido mineral tal como ácido sulfúrico, são de 69 ΡΕ0973791 facto adicionados à mistura no final da reacção de cianetação, e a proporção de ácido adicionado é suficiente para neutralizar o cianeto de metal alcalino em excesso, o qual requer normalmente a introdução de pelo menos um equivalente molar de ácido por mole de substrato de Fórmula VIII, preferencialmente entre cerca de 2 e cerca de 5 equivalente molares por equivalente de substrato. No entanto, a temperatura é mantida suficientemente elevada, e a diluição suficientemente qrande, para impedir uma precipitação considerável e para que a hidrólise da enamina à dicetona prossiga na fase liquida. Deste modo, o processo prossegue com uma interrupção minima e produtividade elevada. A hidrólise é preferencialmente realizada a uma temperatura de pelo menos 80°C, mais preferencialmente na gama de cerca de 90°C até cerca de 100°C, durante um periodo de tipicamente cerca de 1 até cerca de 10 horas, mais preferencialmente cerca de 2 até cerca de 5 horas. Em seguida a mistura reaccional é arrefecida, preferencialmente até uma temperatura entre cerca de 0°C e cerca de 15°C, vantajosamente num banho de gelo a cerca de 5°C até cerca de 10°C, para precipitação do produto dicetona de Fórmula VI. O produto sólido pode ser recuperado, tal como por filtração, e as impurezas eliminadas lavando com água.

No passo seguinte da síntese do Esquema 1, o composto dicetona de Fórmula VI é feito reagir com um alcóxido de metal para abrir a ponte de cetona entre as posições 4 e 7, clivando a ligação entre o grupo carbonilo e o carbono 4, e formando um substituinte alcanoiloxicar- 70 ΡΕ0973791

bonilo com orientação α na posição 7 e eliminando cianeto no carbono 5. O produto desta reacção é um composto hidro-xiéster correspondente à Fórmula V

em que -A-A-, R3, -B-B-, R8 e R9 são como definidos na Fórmula VIII, e R1 é alcoxicarbonilo inferior ou hidroxi-carbonilo. 0 alcóxido de metal utilizado na reacção corresponde à fórmula R10OM em que M é metal alcalino e R10O- corresponde ao substituinte alcoxilo de R1. Os rendimentos desta reacção são muito satisfatórios quando o alcóxido de metal é metóxido de potássio ou sódio, mas podem ser utilizados outros alcóxidos inferiores. É particularmente preferido um alcóxido de potássio. Também podem ser utilizados fenóxidos, outros arilóxidos, bem como arilsulfuretos. A reacção é convenientemente realizada na presença de um álcool correspondente à fórmula R10OH em que R10 é como definido acima. Pode utilizar-se outros solventes convencionais. Preferencialmente, o substrato de Fórmula VI está presente numa proporção entre cerca de 2% e cerca de 12% em peso, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 6% em peso e R10OM está presente numa proporção entre cerca de 0,5 e cerca de 4 moles por mole de substrato. A temperatura não é critica mas uma temperatura 71 ΡΕ0973791 elevada melhora a produtividade. 0 tempo de reacção é tipicamente entre cerca de 4 e cerca de 24 horas, preferencialmente cerca de 4 até 16 horas. Convenientemente, a reacção é realizada à temperatura de refluxo atmosférico dependendo do solvente utilizado.

Na conversão da dicetona de Fórmula VI ao hidro-xiéster de Fórmula VI, o produto secundário ião cianeto pode ser feito reagir com o produto para formar 5-ciano-éster. Uma vez que o equilíbrio é mais favorável a concentrações baixas, a reacção é preferencialmente realizada a uma diluição bastante elevada, e.g., tão elevada quanto 40:1 para a reacção com metóxido de Na. Constatou-se que pode ser conseguida uma produtividade significativamente mais elevada utilizando metóxido de potássio em vez de metóxido de sódio, porque uma diluição na gama de cerca de 20:1 é geralmente suficiente para minimizar o grau de cianetação inversa quando o reagente é metóxido de potássio.

Constatou-se ainda que a reacção de cianetação inversa pode ser inibida tomando as medidas químicas ou físicas apropriadas para eliminar o produto secundário ião cianeto da zona reaccional. Assim, a reacção da dicetona com o alcóxido de metal alcalino pode ser realizada na presença de um agente de precipitação para o ião cianeto tal como, por exemplo, um sal compreendendo um catião que forma um composto cianeto insolúvel. Tais sais podem incluir, por exemplo, iodeto de zinco, sulfato férrico ou 72 ΡΕ0973791 essencialmente qualquer halogeneto, sulfato ou outro sal de um metal alcalino-terroso ou de transição que seja mais solúvel do que o cianeto correspondente. Se o iodeto de zinco estiver presente em proporções na gama de cerca de um equivalente por equivalente de substrato dicetona, observa-se que a produtividade da reacção é aumentada consideravelmente em relação ao processo realizado na ausência de um halogeneto de metal alcalino.

Até mesmo quando é utilizado um agente de precipitação para remoção do ião cianeto continua a ser preferível realizá-la a uma diluição razoavelmente elevada, mas ao utilizar um agente de precipitação a proporção molar de solvente em relação ao substrato de dicetona pode ser significativamente reduzido em comparação com as reacções na ausência de um tal agente. A recuperação do hidroxiéster de Fórmula V pode ser realizada segundo o procedimento extractivo ou não extractivo descrito abaixo.

Preferencialmente, o substrato dicetona de Fórmula VI corresponde à Fórmula VIA

O Π

VIA 73 ΡΕ0973791

e o produto hidroxiéster corresponde à Fórmula VA

VA em cada uma das quais -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 e X são como definidos na Fórmula XIIIA e R1 é como definido na Fórmula V.

Os produtos de Fórmula V são consideravelmente valiosos como intermediários para a preparação de compostos de Fórmula I, e especialmente de Fórmula IA. Preferencialmente, os compostos de Fórmula V correspondem à Fórmula VA na qual -A-A- e -B-B- são -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxilo inferior, e R8 e R9 em conjunto formam o anel 20-espiroxano: o

0

Muito preferencialmente, o composto de Fórmula V é 11a,17a-Di-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona. 74 ΡΕ0973791 0 composto de Fórmula V pode ser isolado acidificando a solução reaccional, e.g., com HC1 concentrado, arrefecendo até à temperatura ambiente, e extraindo o produto com um solvente orgânico tal como cloreto de metileno ou acetato de etilo. 0 extracto é lavado com uma solução de lavagem aquosa alcalina, seco e filtrado, após o que o solvente é eliminado. Alternativamente, a solução reaccional contendo o produto de Fórmula V pode ser desactivada com ácido concentrado. A solução do produto é concentrada, arrefecida a 0o até 25°C e o produto sólido é isolado por filtração.

De acordo com um modo de recuperação preferido do produto de Fórmula V, o metanol e HCN são removidos por destilação após o final do periodo reaccional, adicionando-se água e ácido antes ou durante a destilação. A adição de água antes da destilação simplifica as operações, mas a adição progressiva durante a destilação permite manter essencialmente constante o volume no aparelho de destilação. O produto de Fórmula V cristaliza a partir dos resíduos de destilação à medida que prossegue a destilação. Este modo de recuperação proporciona um produto cristalino de alta qualidade sem operações de extracção.

De acordo com uma outra alternativa, a solução reaccional contendo o produto de Fórmula V pode ser desactivado com ácido mineral, e.g., HC1 4N, após o que o solvente é eliminado por destilação. A remoção do solvente é também eficaz para eliminar o HCN residual de um produto 75 ΡΕ0973791 reaccional. Constatou-se que não são necessárias extracções múltiplas com solvente para purificar o composto de Fórmula V quando o composto de Fórmula V serve como um intermediário num processo para a preparação de epoximexrenona, como aqui descrito. Na realidade, tais extracções podem ser muitas vezes totalmente eliminadas. Quando se utiliza extracção com solvente para purificação do produto, torna-se desejável suplementar as lavagens com solvente com lavagens com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e cáustica. Mas quando as extracções com solvente são eliminadas, as lavagens com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e cáustica também o são. A eliminação das extracções e lavagens aumenta significativamente a produtividade do processo, sem sacrificar o rendimento ou qualidade do produto, e elimina também a necessidade de secagem da solução lavada com um dessecante tal como sulfato de sódio. 0 produto lla-hidroxi-7a-alcoxicarbonilo em bruto é refeito novamente no solvente para o passo reaccional seguinte do processo, o qual é a conversão do grupo 11-hidroxilo num bom grupo de saída na posição 11 produzindo desse modo um composto de Fórmula IV:

IV

em que -A-A R3, -B-B-, R8 e R9 são como definidos na 76 ΡΕ0973791 Fórmula VIII, R1 é como definido na Fórmula V, e R2 é arilsulfoniloxilo, alquilsulfoniloxilo, aciloxilo ou halo-geneto inferior. Preferencialmente, o lla-hidroxilo é esterificado por reacção com um halogeneto de alquilsul-fonilo inferior, um halogeneto de acilo ou um anidrido ácido o qual é adicionado à solução contendo o produto intermediário de Fórmula V. São preferidos os halogenetos de alquilsulfonilo inferior, e especialmente cloreto de metanossulfonilo. Alternativamente, o grupo 11-a-hidroxilo poderia ser convertido num halogeneto por reacção com um reagente adequado tal como brometo de tionilo, cloreto de tionilo, cloreto de sulfurilo ou cloreto de oxalilo. Outros reagentes para formar os ésteres de ácido lla-sulfónico incluem cloreto de tosilo, cloreto de benzenossulfonilo e anidrido trifluorometanossulfónico. A reacção é realizada num solvente contendo uma armadilha de halogeneto de hidrogénio tal como trietilamina ou piridina. Também podem ser utilizadas bases inorgânicas tais como carbonato de K ou Na. A concentração inicial do hidroxiéster de Fórmula V situa-se preferencialmente entre cerca de 5% e cerca de 50% em peso. O reagente de esterificação está preferencialmente presente num ligeiro excesso. O cloreto de metileno é um solvente particularmente adequado para a reacção, mas também podem ser utilizados outros solventes tais como dicloroetano, piridina, clorofórmio, metiletilcetona, dime-toxietano, metilisobutilcetona, acetona, outras cetonas, éteres, acetonitrilo, tolueno e tetra-hidrofurano. A temperatura da reacção é principalmente governada pela volatilidade do solvente. Em cloreto de metileno, a temperatura 77 ΡΕ0973791 da reacção situa-se preferencialmente na gama entre cerca de —100C e cerca de 10°C.

Preferencialmente, o substrato hidroxiéster de Fórmula V corresponde à Fórmula VA

VA

e o produto corresponde a Fórmula IVA

em cada uma das quais -a-a-, definidos na Fórmula XIII, inferior ou hidroxicarbonilo Fórmula IV. na ^ j

IVA -B-B-, γ1, Y2 e x são como R1 é alcanoiloxicarbonilo e R2 é como definido na

Os produtos de Fórmula IV são consideravelmente valiosos como intermediários para a preparação de compostos de Fórmula I, e especialmente de Fórmula IA. Preferencialmente, os compostos de Fórmula IV correspondem à 78 ΡΕ0973791 Fórmula IVA na qual -A-A- e -B-B- são -CH2-CH2-, R3 é hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxilo inferior, e R8 e R9 em conjunto formam o anel 20-espiroxano: \

XXXIII

Muito preferencialmente, o composto de Fórmula IV é 17a-Hidroxi-lla-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Se desejado, o composto de Fórmula IV pode ser isolado por remoção do solvente. Preferencialmente, a solução reaccional é primeiramente lavada com uma solução de lavagem aquosa alcalina, e.g., NaOH 0,5-2N, seguida de uma lavagem ácida, e.g., HC1 0,5-2N. Após remoção do solvente reaccional, o produto é recristalizado, e.g., refazendo o produto em cloreto de metileno e adicionando em seguida um outro solvente tal como éter etilico o qual diminui a solubilidade do produto de Fórmula IV, provocando a sua precipitação na forma cristalina.

Na recuperação do produto de Fórmula IV, ou na preparação da solução reaccional para conversão do intermediário de Fórmula IV no intermediário de Fórmula II como se descreve mais abaixo, todas as extracções e/ou passos de lavagem podem ser dispensados se a solução for alternativamente tratado com resinas de troca iónica para 79 ΡΕ0973791 remoção de impurezas ácidas e básicas. A solução é tratada em primeiro lugar com uma resina de troca aniónica, e depois com uma resina de troca catiónica. Alternativamente, a solução reaccional pode ser primeiramente tratada com adsorventes inorgânicos tais como alumina básica ou sílica básica, seguida de uma lavagem com ácido diluído. A sílica básica ou alumina básica pode ser tipicamente misturada com a solução reaccional numa proporção entre cerca de 5 e cerca de 50 g por kg de produto, preferencialmente entre cerca de 15 e cerca de 20 g por kg de produto. Quer sejam utilizadas resinas de troca iónica ou adsorventes inorgânicos, o tratamento pode ser realizado suspendendo simplesmente a resina ou adsorvente inorgânico com a solução reaccional sob agitação à temperatura ambiente, e eliminando em seguida a resina ou adsorvente inorgânico por filtração.

Alternativamente, o produto de Fórmula IV é recuperado na forma em bruto como uma solução concentrada eliminando uma parte do solvente. Esta solução concentrada é utilizada directamente no passo seguinte do processo, o qual é a remoção do grupo de saida em 11a do composto de Fórmula IV, produzindo desse modo um enéster de Fórmula II:

II 80 ΡΕ0973791 em que -A-A-, R3, -B-B-, R8 e R9 são como definidos na Fórmula VIII, e R1 é como definido na Fórmula V. Para efeitos desta reacção, o substituinte R2 do composto de Fórmula IV pode ser qualquer grupo de saida cuja abstracção seja eficaz para produzir uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 11. Preferencialmente, o grupo de saida é um substituinte alquilsulfoniloxilo ou aciloxilo inferior o qual é removido por reacção com um ácido e um sal de metal alcalino. Pode utilizar-se ácidos minerais, mas são preferidos os ácidos alcanóicos inferiores. Vantajosamente, o reagente para a reacção inclui ainda um sal de metal alcalino do ácido alcanóico utilizado. É particularmente preferido que o grupo de saida compreenda mesiloxilo e o reagente para a reacção compreenda ácido fórmico ou ácido acético e um sal de metal alcalino de um destes ácidos ou outro ácido alcanóico inferior. Quando o grupo de saida é mesiloxilo e o reagente de remoção é ácido fórmico e formato de potássio observa-se uma proporção relativamente elevada da olefina 9,11 em relação à olefina 11,12. Se estiver presente água livre durante a remoção do grupo de saida tende a formar-se impurezas, em particular uma 7,9-lactona

81 ΡΕ0973791 a qual é difícil de remover do produto final. Por isso utiliza-se anidrido acético ou outro agente de secagem para eliminar a água presente no ácido fórmico. 0 teor de água livre da mistura reaccional antes da reacção deveria ser mantido a um nível inferior a cerca de 0,5%, preferencialmente inferior a cerca de 0,1% em peso, como medido por análise de Karl Fischer para a água, com base na solução reaccional total. Embora se prefira que a mistura reaccional seja mantida tão seca quanto exequível foram obtidos resultados satisfatórios com 0,3% em peso de água. Preferencialmente, a mistura da carga reaccional contém entre cerca de 4% e cerca de 50% em peso do substrato de Fórmula IV no ácido alcanóico. É preferencialmente incluído entre cerca de 4% e cerca de 20% em peso do sal de metal alcalino do ácido. Quando se utiliza anidrido acético como agente de secagem, ele está preferencialmente presente numa proporção entre cerca de 0,05 moles e cerca de 0,2 moles por mole de ácido alcanóico.

Constatou-se que as proporções do produto secundário 7,9-lactona e 11,12-olefina na mistura reaccional é relativamente baixo quando o reagente de eliminação compreende uma combinação de ácido trifluoroacético, anidrido trifluoroacético e acetato de potássio como reagente para eliminação do grupo de saída e formação do enéster (9,11-olefina). O anidrido trifluoroacético serve como agente de secagem e deverá estar presente numa proporção de pelo menos cerca de 3% em peso, mais preferencialmente pelo 82 ΡΕ0973791 menos cerca de 15% em peso, muito preferencialmente cerca de 20% em peso, com base no reagente de eliminação ácido trifluoroacético.

Alternativamente, os grupos de saída em 11a do composto de Fórmula IV podem ser eliminados para produzir um enéster de Fórmula II aquecendo uma solução de Fórmula IV num solvente orgânico tal como DMSO, DMF ou DMA.

Além disso, o composto de Fórmula IV é feito inicialmente reagir com um alcanoato de alcenilo tal como acetato de isopropenilo na presença de um ácido tal como ácido toluenossulfónico ou um ácido mineral anidro tal como ácido sulfúrico para formar o 3-enol-éster:

IV{2) do composto de Fórmula IV. Alternativamente, o 3-enol-éster pode ser preparado por tratamento com um anidrido ácido e base tal como ácido acético e acetato de sódio. Outras alternativas incluem tratamento com ceteno na presença de um ácido para produzir iv(Z). O intermediário de Fórmula IV(Z) é depois feito reagir com um formato ou acetato de metal alcalino na presença de ácido fórmico ou acético para produzir ο Δ-9,11-enol-acetato de Fórmula IV (Y): ΡΕ0973791 83

Ac Ο

fí » IV (Y) o qual pode ser depois convertido no enéster de Fórmula II num solvente orgânico, preferencialmente um álcool tal como metanol, quer por decomposição térmica do enol-acetato quer por reacção deste com um alcóxido de metal alcalino. A reacção de eliminação é extremamente selectiva para o enéster de Fórmula II em relação à 11,12-olefina e 7,9-lactona, e esta selectividade é conservada ao longo da conversão do enol-acetato à enona.

Preferencialmente, o substrato de Fórmula IV corresponde à Fórmula IVA

IVA

e o produto enéster corresponde à Fórmula IIA

γ8

IIA 84 ΡΕ0973791 em cada uma das quais -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 e X são como definidos na Fórmula XIII e R1 é como definido na Fórmula V.

Se desejado, o composto de Fórmula II pode ser isolado eliminando o solvente, refazendo o produto sólido em água fria e extraindo com um solvente orgânico, tal como acetato de etilo. Após passos de lavagem e secagem apropriados, o produto é recuperado eliminando o solvente de extracção. 0 enéster é depois dissolvido num solvente apropriado para conversão ao produto de Fórmula I. Alternativamente, o enéster pode ser isolado adicionando água à solução do produto concentrado e filtrando o produto sólido, eliminando preferencialmente desse modo a 7,9-lactona.

Alternativamente, o hidroxiéster de Fórmula V pode ser convertido no enéster de Fórmula II sem isolamento do composto intermediário de Fórmula IV. Neste método, o hidroxiéster é refeito num solvente orgânico, tal como cloreto de metileno; e adiciona-se à solução um agente de acilação, e.g., cloreto de metanossulfonilo, ou reagente de halogenação, e.g., cloreto de sulfurilo. Agita-se a mistura e, quando está envolvida halogenação, adiciona-se uma armadilha de HC1 tal como imidazole. A mistura de base com a solução é extremamente exotérmica, e deverá por conseguinte ser realizada a uma velocidade controlada com arrefecimento ininterrupto. Após a adição da base, aquece-se a 85 ΡΕ0973791 mistura resultante até temperatura moderada, e.g., 0°C até à temperatura ambiente ou ligeiramente superior, e faz-se reagir durante um período de tipicamente 1 até 4 horas. Uma vez concluída a reacção, elimina-se o solvente, preferencialmente sob condições de alto vácuo (e.g., 24" até 28" Hg) a -10° até +15°C, mais preferencialmente cerca de 0o até cerca de 5°C, para concentrar a solução e eliminar o excesso de base. O substrato é depois redissolvido num solvente orgânico, preferencialmente um solvente halogenado tal como cloreto de metileno para conversão no enéster.

O reagente de eliminação do grupo de saída é preferencialmente preparado misturando um ácido orgânico, um sal de ácido orgânico e um agente de secagem, preferencialmente ácido fórmico, formato de metal alcalino e anidrido acético, respectivamente, num reactor seco. A adição de anidrido acético é exotérmica e resulta na libertação de CO, pelo qu8e a velocidade de adição tem de ser controlada em conformidade. Para promover a remoção de água, a temperatura desta reacção é preferencialmente mantida na gama de 60° até 90°C, muito preferencialmente cerca de 65° até cerca de 75°C. Este reagente é depois adicionado à solução do produto do composto de Fórmula IV para efectuar a reacção de eliminação. Após 4-8 horas, a mistura reaccional é preferencialmente aquecida até uma temperatura de pelo menos cerca de 85°C, mas não acima de cerca de 95°C até se ter eliminado todo o destilado volátil, e depois durante um período adicional para completar a reacção, tipicamente cerca de 1 até 4 horas. A 86 ΡΕ0973791 mistura reaccional é arrefecida, e após recuperação por técnicas de extracção correntes, o enéster pode ser recuperado, consoante desejado, por evaporação do solvente.

Constatou-se ainda que o enéster de Fórmula II pode ser recuperado da solução reaccional por um procedimento alternativo que evita os passos de extracção após a reacção de eliminação, proporcionando desse modo reduções no custo, melhoramento do rendimento e/ou melhoramento da produtividade. Neste processo, o produto enéster é precipitado por diluição de uma mistura reaccional com água após remoção do ácido fórmico. 0 produto é depois isolado por filtração. Não são necessárias extracções.

Segundo uma outra alternativa para conversão do hidroxiéster de Fórmula V no enéster de Fórmula II sem isolamento do composto de Fórmula IV, o grupo 11a-hidroxilo do hidroxiéster de Fórmula V é substituído por halogéneo, e o enéster de Fórmula II é depois preparado in situ por desidro-halogenação térmica. A substituição do grupo hidroxilo por halogéneo é efectuada por reacção com halogeneto de sulfurilo, preferencialmente cloreto de sul-furilo, no frio na presença de uma armadilha de halogeneto de hidrogénio tal como imidazole. 0 hidroxiéster é dissolvido num solvente tal como tetra-hidrofurano e arrefecido a 0°C até -70°C. 0 halogeneto de sulfurilo é adicionado e a mistura reaccional é aquecida até temperatura moderada, e.g., temperatura ambiente, durante um período de tempo suficiente para completar a reacção de eliminação, tipicamente 1 até 4 horas. 0 processo desta forma de realização 87 ΡΕ0973791 não só combina dois passos num único, como elimina a utilização de: um solvente reaccional halogenado; um ácido (tal como acético); e um agente de secagem (anidrido acético ou sulfato de sódio). Além disso, a reacção não requer condições de refluxo, e evita a produção do produto secundário CO resultante quando se utiliza ácido acético como reagente de secagem.

Segundo uma forma de realização particularmente preferida do Esquema 1, o composto dicetona de Fórmula VI pode ser convertido em epoximexrenona ou outro composto de Fórmula I sem isolar qualquer intermediário na forma purificada. Segundo este processo preferido, a solução reaccional contendo o hidroxiéster é desactivada com uma solução de ácido forte, arrefecida até à temperatura ambiente e depois extraída com um solvente de extracção apropriado. Vantajosamente, adiciona-se uma solução aquosa de sal inorgânico, e.g., soro fisiológico a 10% em peso, à mistura reaccional antes da extracção. Lava-se o extracto e seca-se por destilação azeotrópica para remoção do solvente metanol remanescente da reacção de clivagem da cetona. A solução concentrada resultante contendo entre cerca de 5% e cerca de 50% em peso do composto de Fórmula V é depois posta em contacto no frio com um reagente de acilação ou alquilsulfonilação para formar o éster sulfó-nico ou éster de ácido dicarboxílico. Uma vez concluída a reacção de alquilsulfonação ou carboxilação passa-se a solução reaccional sobre uma coluna de resina de troca ácida e depois básica para remover as impurezas básicas e 88 ΡΕ0973791 ácidas. Após cada passagem, lava-se a coluna com um solvente apropriado, e.g., cloreto de metileno, para recuperação do éster sulfónico ou dicarboxílico residual a partir daquela. Reúne-se as fracções de eluato combinadas e de lavagem e reduz-se, preferencialmente sob vácuo, para produzir uma solução concentrada contendo o éster sulfónico éster ou éster dicarboxílico de Fórmula IV. Esta solução concentrada é depois posta em contacto com um reagente seco compreendendo um agente eficaz para remoção do grupo de saída lla-éster e abstracção de hidrogénio para formar uma ligação dupla 9,11. Preferencialmente, o reagente para remoção do o grupo de saída compreende a solução reagente seca de ácido fórmico/formato de metal alcalino/anidrido acético descrita cima. Uma vez concluída a reacção; arrefece-se a mistura reaccional e elimina-se o ácido fórmico e/ou outros componentes voláteis sob vácuo. Arrefece-se o resíduo até à temperatura ambiente, submete-se a passos de lavagem apropriados e seca-se em seguida para dar uma solução concentrada contendo o enéster de Fórmula II.

Numa forma de realização especialmente preferida do Esquema 1, elimina-se o solvente da solução reaccional sob vácuo, e partilha-se o produto de Fórmula IV entre água e um solvente orgânico apropriado, e.g., acetato de etilo. A camada aquosa é depois extraída de novo com o solvente orgânico, e o extracto novo lavado com uma solução alcalina, preferencialmente uma solução de um hidróxido de metal alcalino contendo um halogeneto de metal alcalino. A fase orgânica é concentrada, preferencialmente sob vácuo, 89 ΡΕ0973791 para produzir o produto enéster de Fórmula II. 0 produto de Fórmula II pode ser depois refeito num solvente orgânico, e.g., cloreto de metileno, e feito ainda reagir do modo descrito abaixo para produzir o produto de Fórmula I.

De acordo com a presente invenção, constatou-se que podem ser feitos muito melhoramentos na síntese de epoximexrenona utilizando uma tri-haloacetamida em vez de um tri-haloacetonitrilo como um activador de peróxido para a reacção de epoxidação. De acordo com um processo particularmente preferido, a epoxidação é realizada por reacção do substrato de Fórmula IIA com peróxido de hidrogénio na presença de tricloroacetamida e um tampão apropriado, em que a reacção é realizada a um pH na gama de cerca de 3 até cerca de 7, muito preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 7. No entanto, apesar destas considerações, foram realizadas reacções com sucesso fora das gamas preferidas de pH.

Obtêm-se resultados especialmente favoráveis com um tampão compreendendo hidrogenofosfato de dipotássio, e/ou com um tampão compreendendo uma combinação de hidrogenofosfato de dipotássio e di-hidrogenofosf ato de potássio em proporções relativas entre cerca de 1:4 e cerca de 2:1, muito preferencialmente na gama de cerca de 2:3. Também se pode utilizar tampões de borato, mas duma maneira geral eles originam conversões mais lentas do que o fosfato de dipotássio ou K2HPO4 ou misturas de K2HPO4/KH2PO4. Qualquer que seja a composição do tampão, ele deverá proporcionar um pH na gama indicada acima. Além da 90 ΡΕ0973791 composição global do tampão ou do pH exacto que ele possa conferir, observou-se que a reacção prossegue muito mais eficientemente se pelo menos uma parte do tampão for constituída pelo ião hidrogenofosfato dibásico. Julga-se que este ião possa participar essencialmente como um catalisador homogéneo na formação de um produto de adição ou complexo compreendendo o promotor e o ião hidroperóxido, cuja preparação pode, por sua vez, ser essencial ao mecanismo global da reacção de epoxidação. Deste modo, o requisito quantitativo de hidrogenofosfato dibásico (preferencialmente de K2HP04) pode ser apenas uma pequena concentração catalítica. Duma maneira geral prefere-se que ο HPO4 esteja presente numa proporção de pelo menos cerca de 0,1 equivalentes, e.g., entre cerca de 0,1 e cerca de 0,3 equivalentes, por equivalente de substrato. A reacção é realizada num solvente adequado, preferencialmente cloreto de metileno, mas pode utilizar-se alternativamente outros solventes halogenados tais como clorobenzeno ou dicloroetano. O tolueno e misturas de tolueno e acetonitrilo também foram consideradas satisfatórias. Sem se ficar preso a uma teoria particular, postula-se que a reacção prossegue mais eficientemente num sistema de duas fases no qual se forma um intermediário hidroperóxido que se distribui para a fase orgânica com baixo teor de água e reage com o substrato nessa fase orgânica. Deste modo, os solventes preferidos são aqueles nos quais a solubilidade da água é baixa. A recuperação eficaz a partir do tolueno é promovida pela inclusão de um outro solvente tal como acetonitrilo. 91 ΡΕ0973791

Na conversão de substratos de Fórmula II em produtos de Fórmula I, o tolueno proporciona uma vantagem de processo uma vez que os substratos são livremente solúveis em tolueno e os produtos não. Deste modo, o produto precipita durante a reacção quando as conversões atingem a gama dos 40-50%, produzindo uma mistura de três fases a partir da qual o produto pode ser convenientemente separado por filtração. O metanol, acetato de etilo, acetonitrilo sozinho, THF e THF/água não mostraram ser tão eficazes quanto os solventes halogenados ou tolueno na realização da conversão deste passo do processo.

Embora a tricloroacetamida seja um reagente extremamente preferido também se pode utilizar outras tri-haloacetamidas tais como trifluoroacetamida. A tri-halome-tilbenzamida, e outros compostos possuindo uma unidade arileno entre o grupo tri-halometilo atractor de electrões e o carbonilo da amida, também podem ser úteis. Também se pode utilizar 3,3,3-tri-halopropionamidas, mas com resultados menos favoráveis. Genericamente, o activador de peróxido pode corresponder à fórmula: R°C (O)NH2 em que R° é um grupo possuindo uma força atractora de electrões (como medida pela constante sigma) pelo menos tão elevada quanto a do grupo monoclorometilo. Mais particularmente, o activador de peróxido pode corresponder à fórmula: 92 ΡΕ0973791

X ι X

X i 0

NHt em que X1, X2 e X3 são independentemente seleccionados de entre halo, hidrogénio, alquilo, haloalquilo e ciano e cianoalquilo, e Rp é seleccionado de entre arileno e -(CX4X5)n-, em que n é 0 ou 1, sendo pelo menos um de X1, X2, X3, X4 e X5 halo ou per-haloalquilo. Quando qualquer um de X1, X2, X3, X4 ou X5 não é halo, ele é preferencialmente haloalquilo, muito preferencialmente per-haloalquilo. Os activadores particularmente preferidos incluem aqueles nos quais n é 0 e pelo menos dois de X1, x2 e X3 são halo; ou nos quais todos de X1, x2, x3, x4 e x5 são halo ou per- haloalquilo. Cada um de X1, X2 x\ x4 e X5 é preferencial- mente Cl ou F, muito preferencialmente Cl, embora também possam ser adequados os halogenetos mistos, assim como o podem o percloralquilo ou perbromoalquilo e as combinações destes.

Preferencialmente, o activador de peróxido está presente numa proporção de pelo menos cerca de 1 equivalente, mais preferencialmente entre cerca de 1,5 e cerca de 2 equivalentes, por equivalente de substrato inicialmente presente. 0 peróxido de hidrogénio deverá ser adicionado à reacção pelo menos num excesso modesto, ou adicionado progressivamente à medida que a reacção de epoxidação prossegue. Embora a reacção consuma apenas um até dois equivalentes de peróxido de hidrogénio por mole de substrato, o peróxido de hidrogénio é preferencialmente 93 ΡΕ0973791 adicionado num excesso substancial em relação ao substrato e activator inicialmente presentes. Sem restringir a invenção a uma teoria particular, julga-se que o mecanismo reaccional envolve a formação de um produto de adição do activator e 00H“, que a formação desta reacção é reversível com o equilíbrio que favorece a reacção inversa e que é por conseguinte necessário um excesso inicial substancial de peróxido de hidrogénio para levar a reacção na direcção directa. A temperatura da reacção não é rigorosamente crítica e pode ser realizada eficazmente na gama de 0o até 100°C. A temperatura óptima depende da selecção do solvente. Duma maneira geral, a temperatura preferida é entre cerca de 20°C e 30°C, mas em determinados solventes, e.g., tolueno a reacção pode ser vantajosamente realizada na gama de 60°-70°C. A 25°C, a reacção requer tipicamente menos do que 10 horas, tipicamente 3 até 6 horas. Se necessário pode adicionar-se mais activador e peróxido de hidrogénio no final do ciclo reaccional para se conseguir conversão completa do substrato.

No final do ciclo reaccional, a fase aquosa é eliminada, a solução reaccional orgânica é preferencialmente lavada para eliminar impurezas solúveis em água, após o que o produto pode ser recuperado por remoção do solvente. Antes da remoção do solvente, a solução reaccional deveria ser lavada, com pelo menos uma lavagem de suave a moderadamente alcalina, e.g., carbonato de sódio. Preferencialmente, a mistura reaccional é lavada sucessivamente com: uma solução redutora suave tal como uma solução fraca 94 ΡΕ0973791 (e.g. 3% em peso) de sulfito de sódio em água; uma solução alcalina, e.g., NaOH ou KOH (preferencialmente cerca de 0,5N); uma solução ácida tal como HC1 (preferencialmente cerca de IN); e uma lavagem final neutra compreendendo água ou solução aquosa saturada de cloreto de sódio, preferencialmente solução aquosa saturada de cloreto de sódio para minimizar a perda de produto. Antes da remoção do solvente reaccional pode adicionar-se vantajosamente um outro solvente tal como um solvente orgânico, preferencialmente etanol, para que o produto possa ser recuperado por cristalização após destilação para eliminação do solvente reaccional mais volátil.

Entender-se-á que o novo método de epoxidação utilizando tricloroacetamida ou outro activador de peróxido novo tem aplicação muito além dos vários esquemas de preparação de epoximexrenona, e na realidade pode ser utilizado para a formação de epóxidos ao longo de ligações duplas olefinicas numa grande variedade de substratos submetidos a reacção na fase liquida. A reacção é particularmente eficaz em compostos insaturados nos quais os carbonos olefinicos estão tetrassubstituidos e trissubstituidos, i.e., RaRbC=CRcRd e RaRbC=CRcH em que Ra até Rd representam substituintes que não hidrogénio. A reacção prossegue mais rapidamente e de modo mais completo quando o substrato é um composto ciclico com uma ligação dupla trissubstituida, ou um composto ciclico ou aciclico com ligações duplas tetrassubstituidas. Substratos ilustrativos para esta reacção incluem Δ-9,11-canrenona e 95 ΡΕ0973791

Uma vez que a reacção decorre mais rapidamente e de modo mais completo com ligações duplas trissubstituidas e te-trassubstituidas, ela é especialmente eficaz para epoxidação selectiva ao longo de tais ligações duplas em compostos que podem incluir outras ligações duplas onde os carbonos olefi-nicos estão monossubstituidos, ou até mesmo dissubstituidos.

Entender-se-á ainda que a reacção pode ser utilizada com vantagem na epoxidação de ligações duplas monossubstituidas ou até mesmo dissubstituidas, tal como a 11,12-olefina em vários substratos esteróides. No entanto, 96 ΡΕ0973791 porque ela epoxida preferencialmente as ligações duplas mais substituídas, e.g., a 9,11-olefina, com elevada selec-tividade, o processo desta invenção é especialmente eficaz para atingir rendimentos e produtividade elevados nos passos de epoxidação dos vários esquemas reaccionais aqui descritos em qualquer outra parte.

Demonstrou-se que o processo melhorado tem uma aplicação particularmente vantajosa na preparação de:

por epoxidação de:

97 ΡΕ0973791

Foram demonstradas inúmeras vantagens para o processo da invenção no qual se utiliza tricloroacetamida em vez de tricloroacetonitrilo como reagente de transferência de oxigénio para a reacção de epoxidação. 0 sistema reagente de tricloroacetamida proporciona um regiocontrolo apertado para epoxidação ao longo de duplas trissubsti-tuídas com olefinas dissubstituidas e α,β-ceto na mesma estrutura molecular. Deste modo, o rendimento da reacção, perfil do produto e pureza final são consideravelmente melhorados. Constatou-se ainda que a geração substancial de excesso de oxigénio observada com a utilização de tri-haloacetonitrilo não ocorre com a tricloroacetamida, conferindo uma maior segurança ao processo de epoxidação. Além disso ao contrário da reacção promovida pelo tricloroacetonitrilo, a reacção com tricloroacetamida exibe efeitos exotérmicos mínimos, facilitando desse modo o controlo do perfil térmico da reacção. Observou-se que os efeitos da agitação são mínimos e que o desempenho do reactor é mais coerente, uma outra vantagem sobre o processo com tricloroacetonitrilo. A reacção é mais apropriada para aumento de escala do que a reacção promovida pelo tricloroacetonitrilo. 0 isolamento e purificação do produto 98 ΡΕ0973791 é simples, não há qualquer oxidação de Bayer-Villager da função carbonilo (o peróxido promovia a conversão da cetona em éster) conforme observado, e.g., com o ácido m-clorope-roxibenzóico ou outros perácidos e o reagente é económico, prontamente disponível e facilmente manuseado. 0 novo método de epoxidação da invenção é extremamente útil como passo finalizador da sintese do Esquema 1. Numa forma de realização particularmente preferida, o processo global do Esquema 1 decorre como se segue:

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Exemplo 1

Preparou-se meios inclinados com um meio de crescimento como descrito no Quadro 1 QUADRO 1 - Y P D A (meio para meios inclinados e placas) extracto de levedura 20 g Peptona 20 g glucose 20 g agar 20 g água destilada, q.b. para -pH tal qual 6,7 -ajustar a pH 5 com H3PO4 a 10% p/v 1000 ml Distribuir -para meios inclinados: 7,5 ml em tubos de 180 x 18 mm -para placas (10 cm de φ) 25 ml em tubos de 200 x 20 mm -esterilizar a 120°C durante 20 minutos -pH após esterilização: 5

Para produzir culturas de primeira geração, suspendeu-se uma colónia de Aspergillus ochraceus em água destilada (2 ml) num tubo de ensaio; e aplicou-se aliquotas de 0,15 ml desta suspensão a cada um dos meios inclinados que foram preparadas como descrito acima. Incubou-se os meios inclinados durante sete dias a 25°C, após o que o aspecto da cultura superficial era a de um micélio felpudo 100 ΡΕ0973791 branco. O lado oposto estava pigmentado de laranja na parte inferior e em amarelo-alaranjado na parte superior.

Suspendeu-se as culturas em meio inclinado de primeira geração numa solução estéril (4 ml) contendo o tensioactivo não iónico Tween 80 (3% em peso) e utilizou-se aliquotas de 0,15 ml desta suspensão para inocular meios inclinados de segunda geração que foram preparadas com o meio de crescimento indicado no Quadro 2 QUADRO 2 (para meios inclinados de segunda geração e de rotina) extracto de malte 20 g Peptona i g glucose 20 g agar 20 g água destilada q.b. para -pH tal qual 5,3 -distribuir em tubos (180 x 18 mm) ml 7,5 -esterilizar a 120°C durante 20 minutos 1000 ml

Incubou-se os meios inclinados de segunda geração durante 10 dias a 25°C, produzindo uma massa compacta de esporos dourados; pigmentado do lado oposto em castanho-alaranjado .

Preparou-se um meio protector possuindo a composição indicada no Quadro 3. 101 ΡΕ0973791 QUADRO 3 - MEIO PROTECTOR Leite desnatado 10 g água destilada 100 ml Num balão de 250 ml contendo 100 ml de água destilada a 50°C, adicionar leite desnatado. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. Arrefecer a 33°C e utilizar antes de terminar o dia.

Suspendeu-se culturas de cinco dos meios inclinados de segunda geração na solução protectora (15 ml) num balão de 100 ml. Distribuiu-se a suspensão em aliquotas (0,5 ml cada) para tubos de 100x10 mm para liofilização. Pré-congelou-se estes a -70° até -80°C num banho de acetona/gelo seco durante 20 minutos, transferiu-se em seguida imediatamente para uma sala de secagem pré-arrefecida a -40° até -50°C. Liofilizou-se as aliquotas pré-congeladas a uma pressão residual de 50 μ Hg e <- 30°C. No final da liofilização adicionou-se dois a três grânulos de silica gel estéril a cada tubo com indicador de humidade e selou-se à chama.

Para se obter meios inclinados de cultura mãe adequados para fermentação à escala industrial preparou-se uma única aliquota de cultura liofilizada, que foi preparada do modo descrito acima, suspendeu-se em água destilada (1 ml) e utilizou-se aliquotas de 0,15 ml da suspensão para inocular meios inclinados que foram proporcionados com um meio de crescimento possuindo a composição indicada no Quadro 2. Incubou-se os meios inclinados de cultura mãe durante sete dias a 25°C. No final da incubação conservou-se a 4°C a cultura desenvolvida nos meios inclinados. 102 ΡΕ0973791

Para preparar um meio inclinado de cultura de rotina, suspendeu-se a cultura em meio inclinado mãe numa solução estéril (4 ml) contendo Tween 80 (3% em peso) e distribuiu-se a suspensão resultante em alíquotas de 0,15 ml para meios inclinados que tinham sido revestidos com o meio de crescimento descrito no Quadro 2. As culturas de rotina em meios inclinados podem ser utilizadas para inocular os balões da cultura de inoculação primária para fermentações à escala laboratorial ou industrial.

Para preparar um balão de cultura de inoculação primária, retirou-se a cultura em meio inclinado de rotina, que foi preparada como descrito acima, e suspendeu-se numa solução (10 ml) contendo Tween 80 (3% em peso). Introduziu-se uma aliquota de 0,1 ml da suspensão resultante num balão com deflector de 500 ml contendo um meio de crescimento com a composição indicada no Quadro 4. QUADRO 4 (para cultura primária e em balão de transformação e balão de fundo redondo) glucose 20 g peptona 20 g autolisado de levedura 20 g água destilada q.b. para -pH tal qual 5,2 -ajustar a pH 5,8 com NaOH a 20% -distribuir para balões de 500 ml com deflector 100 ml -distribuir para balões de fundo redondo de 2000 ml (3 deflectores) 500 ml -esterilizar a 120°C x 20 min. -pH após esterilização cerca de 5,7 103 ΡΕ0973791

Incubou-se o balão da cultura de inoculação num agitador rotativo (200 rpm, 5 cm de deslocamento) durante 24 horas a 28°C, produzindo-se desse modo uma cultura na forma de micélios tipo pastilha possuindo diâmetros de 3 até 4 mm. Na observação microscópica, a cultura de inoculação foi determinada como sendo uma cultura pura, com crescimento cinemático, com filamentos grandes e bem enrolados. O pH da suspensão era de 5,4 até 5,6. O PMV era de 5 até 8% como determinado por centrifugação (3000 rpm x 5 min.) .

Preparou-se uma cultura em balão de transformação inoculando um meio de crescimento (100 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 4 num segundo balão agitador de 500 ml com biomassa (1 ml) do balão de cultura de inoculação. Incubou-se a mistura resultante num agitador rotativo (200 rpm, 5 cm de deslocamento) durante 18 horas a 28°C. Examinou-se a cultura e determinou-se compreender micélios de tipo pastilha com um diâmetro de 3-4 mm. Na observação microscópica, determinou-se que a cultura era uma cultura pura, com crescimento cinemático e filamentoso no qual as células apicais estavam cheias de citoplasma e as células envelhecidas estavam um pouco vacuoladas. O pH da suspensão da cultura era de 5 até 5,2 e o PMV foi determinado por centrifugação como estando entre 10% e 15%. Consequentemente, a cultura foi considerada adequada para transformação de canrenona em lla-hidroxicanrenona. 104 ΡΕ0973791

Micronizou-se a canrenona (1 g) até cerca de 5 μ e suspendeu-se em água estéril (20 ml) . A esta suspensão adicionou-se: uma solução estéril de glucose a 40% (p/v); uma solução estéril de levedura autolisada a 16% (p/v); e uma solução antibiótica estéril; todas nas proporções indicadas para as 0 horas de tempo de reacção no Quadro 5. A solução antibiótica foi preparada dissolvendo sulfato de canamicina (40 mg), tetraciclina HC1 (40 mg) e cefalexina (200 mg) em água (100 ml) . Adicionou-se gradualmente a suspensão de esteróide, solução de glucose e solução de levedura autolisada à cultura contida no balão agitador. QUADRO 5 Adições Indicativas de Esteróide e Soluções (aditivos e antibióticos) no Decurso da Bioconversão de Canrenona em Balão Agitado Tempo de reacção horas Suspensão de Esteróide solução glucose ml sol. leved. autolisada ml Solução antibiótica ml ml mg aprox. 0 1 50 1 LO O 1 8 2 100 2 1 24 2 100 1 0,5 1 32 5 250 2 1 48 2 100 1 LO O 1 56 5 250 2 1 72 3 150 1 LO O 1 90 À medida que a reacção prosseguia, analisou-se periodicamente a mistura reaccional para determinar o teor de glucose, e por cromatografia em camada fina para determinar a conversão em lla-hidroxicanrenona. Adicionou-se mais substrato canrenona e nutrientes à mistura reac- 105 ΡΕ0973791 cional de fermentação durante a reacção a velocidades controladas para manter o teor de glucose na gama de cerca de 0,1% em peso. O plano de adição da suspensão de este-róide, solução de glucose, solução de levedura autolisada e solução antibiótica é indicada no Quadro 5. A reacção de transformação prosseguiu durante 96 horas a 25°C num agitador rotativo (200 rpm e 5 cm de deslocamento) . O pH variou entre 4,5 e 6 durante a fermentação. Sempre que o PMV subiu até ou acima de 60%, retirou-se uma porção de 10 ml de caldo de cultura e substituiu-se por 10 ml de água destilada. Monitorizou-se o desaparecimento de canrenona e o aparecimento de lla-hidroxicanrenona durante a reacção amostrando o caldo em intervalos de 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 e 96 horas após o inicio do ciclo de fermentação e analisando a amostra por TLC. O progresso da reacção como determinado a partir destas amostras é indicado no Quadro 6 QUADRO 6 Curso de Bioconversão de Canrenona ao Longo do Tempo num Balão Agitado Tempo horas Proporção de Transformação Canrenona RF. = 0,81 lla-hidroxicanrenona RF. = 0,29 0 100 O O 4 50 50 7 20 80 23 20 80 31 30 70 47 20 80 55 30 70 71 25 75 80 15 85 96 -10 -90 106 ΡΕ0973791

Exemplo 2

Preparou-se uma cultura de inoculação primária do modo descrito no Exemplo 1. Preparou-se uma mistura nutriente possuindo a composição indicada no Quadro 7 QUADRO 7 Para Cultura de Transformação em fermentador de 10 1 em vidro Quantidade g/1 glucose tJl O 00 20 peptona 00 o 20 autolisado de levedura 80 g 20 antiespumante SAG471 0,5 g água destilada q.b. para -esterilizar o fermentador vazio durante 30 minutos a 130°C -carregá-lo com 3 1 de água desionizada, aquecer a 40°C -adicionar sob agitação os componentes do meio -agitar durante 15 minutos, trazer ao volume de 3,9 1 -pH tal qual 5,1 -ajustar a 5,8 com NaOH a 20% p/v -esterilizar a 120°C x 20 minutos -pH após esterilização 5,5 -5,7 4 1

Introduziu-se uma carga inicial desta mistura nutriente (4L) num fermentador de transformação de volume geométrico de 10 L. O fermentador era de configuração cilíndrica com uma proporção de altura em relação ao 107 ΡΕ0973791 diâmetro de 2,58. Foi munido com uma agitador de turbina a 400 rpm possuindo duas rodas de disco N° 2 com 6 lâminas cada. O diâmetro externo dos rotores era de 80 mm, cada uma das lâminas tinha 25 mm de dimensão radial e 30 mm de altura, a roda superior estava posicionada 280 mm abaixo do topo do recipiente, a roda inferior estava 365 mm abaixo do topo, e os deflectores do recipiente tinham 210 mm de altura e prolongavam-se radialmente 25 mm para o interior a partir da parede vertical interna do recipiente.

Misturou-se cultura de inoculação (40 ml) com a carga nutriente no fermentador, e estabeleceu-se uma cultura de transformação por incubação durante 22 horas a 28°C, e uma taxa de arejamento de 0,5 1/1-min. a uma pressão de 0,5 kg/cm2. Às 22 horas, o PMV da cultura era de 20-25% e o de pH 5 até 5,2.

Preparou-se uma suspensão compreendendo canrenona (80 g) em água estéril (400 ml) e adicionou-se uma porção de 10 ml à mistura no fermentador de transformação. Na mesma altura adicionou-se uma solução estéril de glucose a 40% (p/v), uma solução estéril de levedura autolisada a 16% (p/v) e uma solução estéril de antibiótico nas proporções indicadas no Quadro 8 ao tempo de reacção de 0 horas. A solução antibiótica foi preparada do modo descrito no Exemplo 1. 108 ΡΕ0973791 QUADRO 8 Adições Indicativas de Esteróide e Soluções (aditivos e antibióticos) no Decurso da Bioconversão de Canrenona no Fermentador de 10 1 em Vidro Tempo de reacção horas Suspensão de Esteróide solução glucose ml sol. leved. autolisada ml Solução antibiótica ml ml mg aprox. 0 10 4 25 12,5 40 4 25 12,5 8 10 4 25 12,5 12 25 12,5 16 10 4 25 12,5 20 25 12,5 24 10 4 25 12,5 40 28 10 4 25 12,5 32 12,5 5 25 12,5 36 12,5 5 25 12,5 40 12, 5 5 25 12,5 44 12, 5 5 25 12,5 48 12, 5 5 25 12,5 40 52 12, 5 5 25 12,5 56 12, 5 5 25 12,5 60 12, 5 5 25 12,5 64 12, 5 5 25 12,5 68 12, 5 5 25 12,5 72 12, 5 5 25 12,5 40 76 12, 5 5 25 12,5 80 84 88 A medida que a reacção prosseguia analisou-se periodicamente a mistura reaccional para determinar o teor de glucose e por cromatografia em camada fina para determinar a conversão em lla-hidroxicanrenona. Com base na análise por TLC de amostras do caldo reaccional como se descreve abaixo, adicionou-se mais canrenona à mistura 109 ΡΕ0973791 reaccional à medida que o substrato canrenona era consumido. Seguiu-se também os niveis de glucose e, sempre que a concentração de glucose caiu até cerca de 0,05% em peso ou menos, adicionou-se mais solução de glucose para trazer a concentração até cerca de 0,25% em peso. Adicionou-se também nutrientes e antibióticos em tempos discretos durante o ciclo reaccional. O plano de adição da suspensão de esteróide, solução de glucose, solução de levedura autolisada e solução antibiótica é indicada no Quadro 8. A reacção de transformação prosseguiu durante 90 horas a uma taxa de arejamento de 0,5 vol. de ar por vol. liquido por minuto (vvm) a uma pressão positiva de 0,3 kg/cm2. A temperatura foi mantida a 28°C até o PVM atingir 45%, depois diminuída até 26°C e mantida a essa temperatura à medida que o PVM aumento desde 45% até 60%, e daí em diante controlada a 24°C. A velocidade de agitação inicial foi de 400 rpm, aumentando para 700 rpm após 40 horas. O pH foi mantido entre 4,7 e 5,3 através de adições de ácido ortofosfórico 2M ou NaOH 2M, consoante indicado. A formação de espuma foi controlada adicionando algumas gotas de Antiespumante SAG 471 assim que se formou espuma. O desaparecimento de canrenona e o aparecimento de 11a-hidroxicanrenona foram seguidos em intervalos de 4 horas durante a reacção através de análise por TLC de amostras do caldo. Quando a maior parte da canrenona tinha desaparecido do caldo, adicionou-se incrementos daquela.

Depois de terem sido feitas todas as adições de canrenona, terminou-se a reacção quando a análise por TLC 110 ΡΕ0973791 mostrou que a concentração do substrato canrenona em relação ao produto lla-hidroxicanrenona tinha caído até cerca de 5%.

No final do ciclo reaccional, filtrou-se o caldo de fermentação através de um pano para queijo para separar o micélio do caldo líquido. Ressuspendeu-se a fracção de micélios em acetato de etilo utilizando cerca de 65 volumes (5,2 litros) por grama de canrenona adicionada ao longo do curso da reacção. Aqueceu-se a suspensão de micélios em acetato de etilo a refluxo durante uma hora sob agitação, arrefeceu-se até cerca de 20°C e filtrou-se num Buchner. Lavou-se sequencialmente o bolo de micélios com acetato de etilo (5 vol. por g de carga de canrenona; 0,4 L) e água desionizada (500 ml) para eliminar o extracto de acetato de etilo do bolo. Rejeitou-se o bolo de filtração. Recolheu-se o extracto enriquecido, a lavagem de solvente e a lavagem aquosa num separador e deixou-se em seguida repousar durante 2 horas para a separação de fases.

Rejeitou-se então a fase aquosa e concentrou-se a fase orgânica sob vácuo até um volume residual de 350 ml. Arrefeceu-se os resíduos de destilação até 15°C e manteve-se sob agitação durante cerca de uma hora. Filtrou-se a suspensão resultante para retirar o produto cristalino, e lavou-se o bolo de filtração com acetato de etilo (40 ml). Depois de secar, o rendimento de lla-hidroxicanrenona foi determinado como sendo de 60 g. 111 ΡΕ0973791

Exemplo 3

Preparou-se uma suspensão de esporos a partir de uma cultura de rotina em meio inclinado do modo descrito no Exemplo 1. Num balão de fundo redondo com deflectores (3 deflectores, cada um com 50 mm x 30 mm) de 2000 ml, intro-duziu-se uma aliquota (0,5 ml) da suspensão de esporos numa solução nutriente (500 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 4. Incubou-se a mistura resultante no balão durante 24 horas a 25°C num agitador de movimento alternativo (120 batidas por min.; deslocamento 5 cm), produzindo-se desse modo uma cultura que ao observar-se ao microscópio surgia como uma cultura pura com filamentos bem enrolados. O pH da cultura era entre cerca de 5,3 e 5,5, e o PMV (como determinado por centrifugação a 3000 rpm durante 5 min.) era de 8 até 10%.

Utilizando a cultura assim preparada, preparou-se uma cultura de inoculação num fermentador em aço inoxidável de configuração cilíndrica vertical, possuindo um volume geométrico de 160 L e uma relação de forma de 2,31 (altura = 985 mm; diâmetro = 425 mm). Muniu-se o fermentador com um agitador de tipo turbina de disco possuindo duas rodas, cada roda com seis lâminas com um diâmetro externo de 240 mm, em que cada lâmina possui uma dimensão radial de 80 mm e uma altura de 50 mm. A roda superior estava posicionado a uma profundidade de 780 mm do topo do fermentador, e a segunda a uma profundidade de 995 mm. Deflectores verticais com uma altura de 890 mm prolongavam-se radialmente 40 mm 112 ΡΕ0973791 para o interior a partir da parede vertical interna do fermentador. 0 agitador foi operado a 170 rpm. Introduziu-se no fermentador uma mistura nutriente (100 L) possuindo a composição indicada no Quadro 9, seguida de uma porção de pré-inóculo (1 L) preparado como descrito acima e possuindo um pH de 5,7.

QUADRO 9 Para Cultura Vegetativa em Fermentador de 160 L são necessários Cerca de 8 L para inocular o Fermentador Produtivo Quantidade g/L glucose 2 kg 20 peptona 2 kg 20 autolisado de levedura 2 kg 20 antiespumante SAG 471 0,010 kg vestígios água destilada q.b. para -esterilizar o fermentador vazio durante 1 hora a 130°C -carregá-lo com 6 L de água desionizada; aquecer a 40°C -adicionar sob agitação os componentes do meio -agitar durante 15 minutos, trazer ao volume de 95 L -esterilização a 121°C durante 30 minutos -pH pós-esterilização é 5, 7 -adicionar água estéril desionizada até 100 L 100 L incubou-se a mistura inoculada durante 22 horas a uma taxa de arejamento de 0,5 L/L-min. a uma pressão de 0,5 kg/cm2. Controlou-se a temperatura a 28°C até o PMV atingir 113 ΡΕ0973791 25% e reduziu-se em seguida até 25°C. 0 pH foi controlado na gama de 5,1 até 5,3. 0 crescimento do volume de micélio é mostrado no Quadro 10, juntamente com os perfis de pH e oxigénio dissolvido da reacção da cultura de inoculação. QUADRO 10 Crescimento Micelial ao Longo do Tempo na Fermentação da Cultura de Inoculação Período de fermentação h pH volume micelial comprimido (pmv)% (3000 rpmx5min) % de oxigénio dissolvido 0 5,7 ± 0,1 100 4 5,7 ± 0,1 100 8 5,7 ± 0,1 12 ± 3 85 ± 5 12 5,7 ± 0,1 15 ± 3 72 ± 5 16 5,5 ± 0,1 25 ± 5 40 ± 5 20 5,4 ± 0,1 30 ± 5 35 ± 5 22 5,3 ± 0,1 33 ± 5 30 ± 5 24 5,2 ± 0,1 35 ± 5 25 ± 5

Utilizando a cultura de inoculação assim produzida, efectuou-se uma corrida de fermentação de transformação num fermentador cilíndrico vertical em aço inoxidável possuindo um diâmetro de 1,02 m, uma altura de 1,5 m e um volume geométrico de 1,4 m3. Muniu-se o fermentador com um agitador de turbina possuindo dois rotores, um posicionado 867 cm abaixo do topo do reactor e o outro posicionado a 1435 cm do topo. Muniu-se cada roda com seis lâminas, cada uma com 95 cm de dimensão radial e 75 cm de altura. Deflectores verticais com 1440 cm de 114 ΡΕ0973791 altura prolongavam-se radialmente 100 cm para o interior a partir da parede vertical interna do reactor. Preparou-se uma mistura nutriente possuindo a composição indicada no Quadro 11

QUADRO 11 Para Cultura de Bioconversão em Fermentador de 1000 L Quantidade g/L glucose 16 kg 23 peptona 16 kg 23 autolisado de levedura 16 kg 23 antiespumante SAG 471 0,080 kg vestígios água desionizada q.b. para -esterilizar o fermentador vazio durante 1 hora a 130°C -carregá-lo com 600 L de água desionizada; aquecer a 40°C -adicionar sob agitação os componentes do meio -agitar durante 15 minutos, trazer ao volume de 650 L -esterilização a 121°C durante 30 minutos -pH pós-esterilização é 5,7 -adicionar água estéril desionizada até 700 L 700 L

Introduziu-se uma carga inicial (700 L) desta mistura nutriente (pH = 5,7) no fermentador, seguida do inoculo de cultura pura deste exemplo (7 L) preparado como descrito acima. incubou-se a mistura nutriente contendo inoculo 115 ΡΕ0973791 durante 24 horas a uma taxa de arejamento de 0,5L/L-min a uma pressão de 0,5 kg/cm2. Controlou-se a temperatura a 28°C e a velocidade de agitação foi de 110 rpm. O crescimento do volume de micélio é mostrado no Quadro 12, juntamente com os perfis de pH e oxigénio dissolvido da reacção de cultura de inoculação. QUADRO 12 Crescimento Micelial ao Longo do Tempo no Fermentador da Cultura de Transformação Periodo de fermentação h pH volume micelial comprimido (pmv)% (3000 rpmx5min) % de oxigénio dissolvido 0 5,6 ± 0,2 100 4 5,5 ± 0,2 100 8 5,5 ± 0,2 12 ± 3 95 ± 5 12 15 ± 3 90 ± 5 16 5,4 ± 0,1 20 ± 5 75 ± 5 20 5,3 ± 0,1 25 ± 5 60 ± 5 22 5,2 ± 0,1 30 ± 5 40 ± 5

No final da incubação observou-se a transformação dos micélios em pastilhas, mas as pastilhas eram geralmente pequenas e compactadas de modo relativamente folgado. Suspendeu-se o micélio difuso no caldo. O pH final foi de 5,1 até 5,3. À cultura de transformação assim produzida adicionou-se uma suspensão de canrenona (1,250 kg; micronizada até 5 μ) em água estéril (5 L) . Adicionou-se solução 116 ΡΕ0973791 aditiva estéril e solução antibiótica nas proporções indicadas para o tempo de reacção 0 no Quadro 14. A composição da solução aditiva é indicada no Quadro 13. QUADRO 13 SSOLUÇÃO ADITIVA (para a cultura de transformação) quantidade dextrose 40 kg autolisado de levedura 8 kg Antiespumante SAG 471 0,010 kg água desionizada q.b. para -esterilizar um fermentador de 150 1 vazio durante 1 hora a 130°C -carregá-lo com 70 1 de água desionizada; aquecer a 40°C -adicionar sob agitação os componentes da "solução aditiva" -agitar durante 30 minutos, trazer ao volume de 95 1 -pH tal qual 4,9 -esterilizar a 120°C x 20 minutos -pH após esterilização cerca de 5 100 1

Realizou-se a bioconversão durante cerca de 96 horas com arejamento a 0,5 L/L-min. a uma pressão de 0,5 kg/cm2 e um pH na gama entre 4,7 e 5,3, ajustado consoante necessário através de adições de NaOH 7,5 M ou H3PO4 4 Μ. A velocidade de agitação foi inicialmente de 100 rpm, aumentou-se para 165 rpm às 40 horas e 250 rpm às 64 horas. A temperatura inicial foi de 28°C, diminuiu-se para 26°C quando o pmv atingiu 45% e diminuiu-se para 24°C quando 0 PMV subiu para 60%. Adicionou-se SAG 471 em gotas finas 117 ΡΕ0973791 consoante necessário para controlar a formação de espuma. Os níveis de glucose na fermentação foram seguidos em intervalos de 4 horas e, sempre que a concentração de glucose desceu abaixo de 1 gpl, adicionou-se um incremento de solução aditiva estéril (10 L) ao lote. O desaparecimento de canrenona e o aparecimento de lla-hidroxicanre-nona foram também seguidos durante a reacção por HPLC. Quando pelo menos 90% da carga inicial de canrenona tinha sido convertida em lla-hidroxicanrenona, adicionou-se um incremento de 1,250 kg de canrenona. Quando se verificou que 90% da canrenona desse incremento tinha sido convertida, introduziu-se outro incremento de 1,250 kg. Utilizando o mesmo critério adicionou-se outros incrementos (1,250 kg cada um) até se ter introduzido a carga total do reactor (20 kg). Depois de se ter fornecido toda a carga de canrenona ao reactor, terminou-se a reacção quando a concentração de canrenona por reagir era de 5% relativamente à quantidade de lla-hidroxicanrenona produzida. O plano de adição de canrenona, solução aditiva estéril e solução antibiótica é como se mostra no Quadro 14. QUADRO 14 Adições de Esteróide e Soluções (aditivos e antibióticos) no Decurso da Bioconversão de Canrenona no Fermentador Tempo de reacção horas CANRENONA em suspensão Sol. aditiva estéril litros Solução antibiótica litros Volume litros aprox. kg kg acumulativo 0 1,250 1, 25 10 8 700 4 10 8 1,250 2, 5 10 12 10 16 1,250 10 118 ΡΕ0973791 (continuação) QUADRO 14 Adições de Esteróide e Soluções (aditivos e antibióticos) no Decurso da Bioconversão de Canrenona no Fermentador Tempo de reacção horas CANRENONA em suspensão Sol. aditiva estéril litros Solução antibiótica litros Volume litros aprox. kg kg acumulativo 20 10 24 1,250 5 10 8 800 28 1,250 10 32 1,250 10 36 1,250 10 40 1,250 10 44 1,250 10 48 1,250 12,5 10 8 900 52 1,250 10 56 1,250 10 60 1,250 10 64 1,250 10 68 1,250 10 72 1,250 20 10 8 1050 76 0 80 84 88 92 Total

Uma vez concluída a bioconversão, separou-se os micélios do caldo por centrifugação numa centrífuga de cesto. Analisou-se o filtrado por HPLC para conter apenas 2% da quantidade total de lla-hidroxicanrenona no caldo de colheita, e eliminou-se em seguida. Suspendeu-se os micélios em acetato de etilo (1000 L) num tanque de extracção com 2 m3 de capacidade. Aqueceu-se esta suspensão durante uma hora sob agitação e em condições de refluxo de acetato 119 ΡΕ0973791 de etilo, arrefeceu-se em seguida e centrifugou-se numa centrífuga de cesto. Lavou-se o bolo de micélios com acetato de etilo (200 L) e rejeitou-se subsequentemente. Deixou-se o extracto de solvente rico em esteróide repousar durante uma hora para separação da fase aquosa. Extraiu-se a fase aquosa com uma quantidade adicional de solvente acetato de etilo (200 L) e rejeitou-se em seguida. Clarificou-se as fases de solvente combinadas por centrifugação e colocou-se num concentrador (500 L de volume geométrico) e concentrou-se sob vácuo até um volume residual de 100 L. Ao realizar a evaporação, a carga inicial do concentrado dos extractos e das soluções de lavagem reunidos foi de 100 L, e manteve-se este volume constante por adições contínuas ou periódicas de solução combinada à medida que o solvente era evaporado. Uma vez concluído o passo de evaporação, arrefeceu-se os resíduos de destilação até 20°C e agitou-se durante duas horas, filtrou-se então num filtro de Buchner. Lavou-se o recipiente concentrador com acetato de etilo (20 L) e utilizou-se então esta solução de lavagem para lavar o bolo no filtro. Secou-se o produto sob vácuo durante 16 horas a 50°C. O rendimento de lla-hidroxicanrenona foi de 14 kg.

Exemplo 4

Suspendeu-se esporos liofilizados de Aspergillus ochraceus NRRL 405 num meio de crescimento de água de maceração de milho (2 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 15: 120 ΡΕ0973791 QUADRO 15 (Meio de Crescimento para Cultura de Inoculação Primária) Água de maceração de milho 30 g Extracto de levedura 15 g Fosfato de amónio monobásico 3 g Glucose (carregada após esterilização) água destilada, q.b. para 1000 ml pH tal qual: 4,6, ajustar até pH 6,5 com NaOH a 20%, distribuir 50 ml para balões Erlenmeyer de 250 ml esterilizar a 121°C durante 20 minutos. 30 g

Utilizou-se a suspensão resultante num inoculo para a propagação de esporos em placas de agar. Preparou-se dez placas de agar, cada uma possuindo um meio de crescimento sólido de glucose/extracto de levedura/fosfato/agar com a composição indicada no Quadro 16: QUADRO 16 - GYPA (Agar de Glucose/Extracto de Levedura/Fosfato para Placas) Glucose (carregada após esterilização) 10 g Extracto de levedura 2,5 g K2HP04 3 g Agar água destilada q.b. para 1000 ml ajustar pH até 6,5 esterilizar a 121°C durante 30 minutos 20 g

Transferiu-se uma alíquota de 0,2 ml da suspensão para a superfície de cada placa. Incubou-se as placas a 25°C durante dez dias, após o que os esporos de todas as 121 ΡΕ0973791 placas foram recolhidos para um meio protector criogénico estéril possuindo a composição indicada no Quadro 17: QUADRO 17 - GYP/Glicerol (Meio de Glucose/Extracto de Levedura/Fosfato/Glicerol para frascos de abastecimento) Glucose (carregada após esterilização) 10 g Extracto de levedura 2,5 g k2hpo4 3 g Glicerol Água destilada, q.b. para 1000 mL Esterilizar a 121°C durante 30 minutos 20 g

Dividiu-se a suspensão resultante para vinte frascos, transferindo-se um ml para cada frasco. Estes frascos constituem um banco de células mestre a partir do qual se pode produzir bancos de células de trabalho para serem utilizados na geração de inóculos para a bioconversão de canrenona em lla-hidroxicanrenona. Os frascos compreendendo o banco de células mestre foram conservados na fase de vapor de um congelador de azoto liquido a -130°C.

Para iniciar a preparação de um banco de células de trabalho, ressuspendeu-se os esporos de um único frasco do banco de células mestre num meio de crescimento estéril (1 ml) com a composição indicada no Quadro 15. Dividiu-se esta suspensão em dez aliquotas de 0,2 ml e utilizou-se cada aliquota para inocular uma placa de agar possuindo um meio de crescimento sólido com a composição indicada no Quadro 16. Incubou-se estas placas durante dez dias a 25°C. 122 ΡΕ0973791

Pelo terceiro dia de incubação, a parte inferior do meio de crescimento estava castanha-alaranjada. No final da incubação havia uma produção densa de esporos dourados. Colheu-se os esporos de cada placa pelo procedimento aqui descrito para a preparação do banco de células mestre. Preparou-se um total de cem frascos, contendo cada um 1 ml de suspensão. Estes frascos constituíram o banco de células de trabalho. Os frascos do banco de células de trabalho também foram conservados por armazenamento na fase de vapor de um congelador de azoto líquido a -130°C.

Transferiu-se meio de crescimento (50 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 15 para um balão Erlenmeyer de 250 ml. Introduziu-se uma alíquota (0,5 ml) de suspensão de células de trabalho no balão e misturou-se com o meio de crescimento. Incubou-se a mistura inoculada durante 24 horas a 25°C para produzir uma cultura de inoculação primária possuindo uma percentagem de volume micelial comprimido de aproximadamente 45%. Na inspecção visual constatou-se que a cultura compreendia micélios de tipo pastilha de 1 até 2 mm de diâmetro; e na observação microscópica ela surgia como uma cultura pura.

Iniciou-se a cultura de uma cultura de inoculação secundária introduzindo um meio de crescimento com a composição indicada no Quadro 15 num balão de Fernbach com 2,8 L, e inoculando o meio com uma parte (10 ml) da cultura de inoculação primária deste exemplo, cuja preparação foi descrita acima. Incubou-se a mistura inoculada a 25°C 123 ΡΕ0973791 durante 24 horas num agitador rotativo (200 rpm, 5 cm de deslocamento). No final da incubação, a cultura apresentou as mesmas propriedades que as descritas acima para a cultura de inoculação primária e era adequada para ser utilizada numa fermentação de transformação na qual a canrenona era bioconvertida em lla-hidroxicanrenona. A transformação foi realizada num fermentador Braun E Biostat configurado como se segue:

Capacidade: 15 litros com fundo redondo Altura: 53 cm Diâmetro: 20 cm H/D: 2,65

Rotores: 7,46 cm de diâmetro, seis pás 2,2 x 1,4 cm cada Afastamento do rotor: 65,5, 14,5 e 25,5 cm do fundo do tanque

Deflectores: quatro 1,9 x 48 cm

Aspersor: 10,1 cm de diâmetro, 21 orifícios - 1 mm de diâmetro

Controlo de temperatura: proporcionado por meio de uma camisa externa

Suspendeu-se canrenona a uma concentração de 20 g/L em água desionizada (4 L) e adicionou-se uma porção (2 L) de meio de crescimento com a composição indicada no Quadro 18 enquanto se agitava a mistura no fermentador a 300 rpm. 124 ΡΕ0973791 QUADRO 18 (Meio de crescimento para a cultura de bioconversão em fermentador de 10 L) Quantidade Quantidade/1 Glucose (carregada após esterilização) 160 g 20 g peptona 160 g 20 g extracto de levedura 160 g 20 g antiespumante SAF471 4,1 g 0, 5 ml Canrenona água desionizada q.b. para 7,5L esterilizar a 121°C durante 30 minutos 160 g 20 g

Agitou-se a suspensão resultante durante 15 minutos, após o que se fez o volume até 7,5 L com mais água desionizada. Nesta altura ajustou-se o pH da suspensão de 5,2 para 6,5 através da adição de uma solução de NaOH a 20% em peso, e esterilizou-se então a suspensão aquecendo a 121°C durante 30 minutos no fermentador Braun E. O pH após esterilização era de 6,3±0,2, e o volume final era de 7,0 L. Inoculou-se a suspensão esterilizada com uma porção (0,5 L) da cultura de inoculação secundária deste exemplo que foi preparada como descrito acima, e fez-se o volume até 8,0 L através da adição de solução estéril de glucose a 50%. A fermentação foi realizada a uma temperatura de 28°C até o PMV atingir 50%, diminuiu-se então até 26°C e diminuiu-se ainda mais até 24°C quando o PMV excedeu 50% para manter um PMV consistente inferior a cerca de 60%. Introduziu-se ar através do aspersor a uma taxa de 0,5 vvm com base no volume liquido inicial e manteve-se a pressão no fermentador a 700 milibar positivos. A agitação começou 125 ΡΕ0973791 a 600 rpm e foi aumentada em degrau até 1000 rpm consoante necessário para manter o teor de oxigénio dissolvido acima de 30% em volume. Seguiu-se a concentração de glucose. Depois da concentração inicial elevada de glucose ter descido abaixo de 1% devido ao consumo pela reacção de fermentação forneceu-se mais glucose via uma solução estéril de glucose a 50% em peso para manter a concentração na gama de 0,05% até 1% ao longo da parte restante do ciclo do lote. Antes da inoculação o pH era de 6,3±0,2. Depois de o pH ter caido até cerca de 5,3 durante o período inicial de fermentação, ele foi mantido na gama de 5,5±0,2 na parte restante do ciclo pela adição de hidróxido de amónio. A espuma foi controlada adicionando um agente antiespumante de polietileno glicol vendido sob a designação comercial SAG 471 pela OSI Specialties, Inc. O crescimento da cultura ocorreu principalmente durante as primeiras 24 horas do ciclo, altura em que o PMV era cerca de 40%, o pH era cerca de 5,6 e o teor de oxigénio dissolvido era cerca de 50% em volume. A conversão de canrenona começou mesmo quando a cultura estava em crescimento. As concentrações de canrenona e lla-hidroxicanre-nona foram seguidas durante a bioconversão analisando amostras diariamente. Extraiu-se as amostras com acetato de etilo quente e analisou-se a solução de amostra resultante por TLC e HPLC. A bioconversão foi considerada completa quando a concentração de canrenona residual era de cerca de 10% da concentração inicial. O tempo de conversão aproximado foi de 110 até 130 horas. 126 ΡΕ0973791

Uma vez concluída a bioconversão, separou-se a biomassa micelial do caldo por centrifugação. Extraiu-se o sobrenadante com um volume igual de acetato de etilo e rejeitou-se a camada aquosa. Ressuspendeu-se a fracção micelial em acetato de etilo utilizando aproximadamente 65 volumes por g de canrenona transferida para o reactor de fermentação. Aqueceu-se a suspensão micelial a refluxo durante uma hora sob agitação, arrefeceu-se até cerca de 20°C e filtrou-se num funil de Buchner. Lavou-se o bolo de filtração de micélios duas vezes com 5 volumes de acetato de etilo por g de canrenona transferida para o fermentador, e lavou-se então com água desionizada (1 L) para eliminar o acetato de etilo residual. Combinou-se o extracto aquoso, solvente enriquecido, lavagem com solvente e lavagem aquosa. 0 bolo micelial esgotado remanescente foi rejeitado ou novamente extraído, dependendo da análise dos esteróides residuais ali contidos. Deixou-se as fases líquidas combinadas repousar durante duas horas. Subsequentemente, separou-se e rejeitou-se a fase aquosa, e concentrou-se a fase orgânica sob vácuo até o volume residual ser aproximadamente 500 ml. Arrefeceu-se em seguida os resíduos de destilação até cerca de 15°C sob agitação lenta durante cerca de uma hora. Recuperou-se o produto cristalino por filtração, e lavou-se com acetato de etilo gelado (100 ml) . Eliminou-se o solvente dos cristais por evaporação, e secou-se o produto cristalino sob vácuo a 50°C. 127 ΡΕ0973791

Exemplo 5

Suspendeu-se esporos liofilizados de Asperqillus ochraceus ATCC 18500 num meio de crescimento de água de maceração de milho (2 ml) como descrito no Exemplo 4. Preparou-se dez placas de agar, também do modo descrito no Exemplo 4. Incubou-se as placas e colheu-se como descrito no Exemplo 4 para proporcionar um banco de células mestre. Os frascos compreendendo o banco de células mestre foram conservados na fase de vapor de um congelador de azoto liquido a -130°C. A partir de um frasco do banco de células mestre, preparou-se um banco de células de trabalho como descrito no Exemplo 4 e conservou-se no congelador de azoto a -130°C.

Transferiu-se meio de crescimento (300 mL) com a composição indicada no Quadro 19 para um balão de 2 L com deflector. Introduziu-se no balão uma aliquota (3 mL) de suspensão de células de trabalho. Incubou-se a mistura inoculada durante 20 até 24 horas a 28°C num agitador rotativo (200 rpm, 5 cm de deslocamento) para produzir uma cultura de inoculação primária possuindo uma percentagem de volume micelial comprimido de aproximadamente 45%. Na inspecção visual constatou-se que a cultura compreendia micélios de tipo pastilha de 1 até 2 mm de diâmetro; e na observação microscópica ela surgia como uma cultura pura. 128 ΡΕ0973791 QUADRO 19 Meio de crescimento para a cultura de inoculação primária e secundária Quantidade/L Glucose (carregada após esterilização) 20 g peptona 20 g extracto de levedura 20 g água destilada q.b. para 1000 mL esterilizar a 121°C durante 30 minutos A cultura de uma cultura de inoculação secundária foi iniciada introduzindo 8L de meio de crescimento com a composição indicada no Quadro 19 num fermentador de 14L em vidro. Inoculou-se o fermentador com 160 mL até 200 mL da cultura de inoculação primária deste exemplo, cuja preparação foi descrita cima.

Cultivou-se a mistura inoculada a 28°C durante 18-20 horas, agitação a 200 rmp, taxa de arejamento foi de 0,5 vvm. No final da propagação, a cultura apresentava as mesmas propriedades que as descritas acima para a cultura de inoculação primária. A transformação foi realizada num fermentador de 60L, essencialmente do modo descrito no Exemplo 4, excepto que o meio de crescimento tinha a composição indicada no Quadro 20, e a carga inicial da cultura de inoculação secundária era de 350 mL até 700 mL. A velocidade de agitação era inicialmente de 200 rpm, mas era aumentada para 500 rpm consoante necessário para manter o oxigénio dissolvido acima de 10% em volume. O tempo de bioconversão 129 ΡΕ0973791 aproximado para 20 g/L de canrenona foi de 80 até 160 horas. QUADRO 20 Meio de crescimento para a Cultura de Bioconversão em fermentador de 60 L Quantidade Quantidade/L Glucose (carregada após esterilização) 17,5 g 0,5 g peptona 17,5 g 0,5 g extracto de levedura 17,5 g 0,5 g Canrenona (carregada como uma suspensão a 20% em água estéril) 700 g 20 g água desionizada q.b. para 35 L esterilizar a 121°C durante 30 minutos

Exemplo 6

Utilizando uma suspensão de esporos do banco de células de trabalho produzido segundo o método descrito no Exemplo 4, preparou-se culturas de inoculação primária e secundária, também essencialmente do modo descrito no Exemplo 4. Utilizando a cultura de inoculação secundária produzida deste modo, fez-se dois ensaios de bioconversão segundo um processo modificado do tipo ilustrado na Fig. 1, e fez-se dois ensaios com o processo ilustrado na Fig. 2. O meio de crescimento de transformação, momentos de adição de canrenona, momentos de colheita e graus de conversão destes ensaios são indicados no Quadro 21. O ensaio R2A utilizou um esquema de adição de canrenona com base no mesmo principio do Exemplo 3, enquanto o ensaio R2C modificou o esquema do Exemplo 3 ao fazer apenas duas adições de 130 ΡΕ0973791 canrenona, uma no início do lote e outra após 24 horas. Nos ensaios R2B e R2D, introduziu-se a carga total de canrenona no início do lote, tendo o processo sido realizado em geral do modo descrito no Exemplo 4, à excepção da carga de canrenona ter sido esterilizada num recipiente separado antes de ser adicionada ao fermentador e a glucose ter sido adicionada à medida que o lote progredia. Utilizou-se um misturador Waring para reduzir os aglomerados produzidos durante a esterilização. Nos ensaios R2A e R2B, a canrenona foi introduzida no lote em solução metanólica, a cujo respeito estes ensaios também diferem dos ensaios dos Exemplos 3 e 4, respectivamente.

Quadro 21 - Descrições dos Processos Iniciais de Bioconversão da Canrenona Número do ensaio R2A R2B R2C R2D Meio (g/L) Agua de maceração de milho 30 igual ao ensaio R2A 30 igual ao ensaio R2C extracto de levedura 15 15 NH4H2P04 3 3 Glucose 15 30 OSA 0,5 ml 0,5 ml pH ajustado a pH 6,0 com NaOH 2,5 N ajustado a pH 6,5 com NaOH 2,5 N Canrenona 10g/80 ml Me OH adicionada às 0, 18, 24, 30, 36, 42, 50, 56, 62 e 68 h. 80 g/640 ml MeOH adicionada às 0 h toda de uma vez Esterilizada e misturada; adicionada às: 0 h: 25 g, 24 h: 200 g Esterilizada e misturada; adicionada às: 0 h: 200 g Momento da colheita 143 h 166 h 125 h 104 h Bioconversão 45, 9% 95, 6% 98, 1% 95, 1% 131 ΡΕ0973791

Nos ensaios R2A e R2B, a concentração de metanol acumulou até cerca de 6,0% no barril de fermentação, o que se constatou ser inibidor para o crescimento da cultura e para a bioconversão. No entanto, com base nos resultados destes ensaios, concluiu-se que o metanol ou outro solvente miscivel com água poderia servir eficazmente a concentrações baixas para aumentar a carga de canrenona e proporcionar canrenona como um precipitado de partículas finas que proporciona uma grande área interfacial para fornecer a canrenona à reacção. A canrenona mostrou ser estável à temperatura de esterilização (121°C) mas agregava-se em aglomerados. Utilizou-se um misturador Waring para triturar os grumos em partículas finas, as quais eram convertidas com sucesso no produto.

Exemplo 7

Utilizando uma suspensão de esporos do banco de células de trabalho produzido segundo o método descrito no Exemplo 4, preparou-se culturas de inoculação primária e secundária, também essencialmente do modo descrito no Exemplo 4. A descrição e resultados do Exemplo 7 são mostrados no Quadro 22. Utilizando uma cultura de inoculação secundária produzida deste modo, efectuou-se uma bioconversão (R3C) essencialmente como descrito no Exemplo 3 e realizou-se três bioconversões segundo o processo geralmente descrito no Exemplo 5. Nos últimos três ensaios (R3A, R3B e R3D), esterilizou-se a canrenona num tanque 132 ΡΕ0973791 portátil, em conjunto com o meio de crescimento à excepção da glucose. A glucose foi fornecida assepticamente a partir de um outro tanque. Introduziu-se a suspensão esterilizada de canrenona no fermentador antes da inoculação ou durante a fase inicial da bioconversão. No ensaio R3B, introduziu-se mais canrenona estéril e meio de crescimento às 46,5. Os grupos de canrenona formados durante a esterilização foram triturados utilizando um misturador Waring produzindo-se desse modo uma suspensão de partículas finas à entrada do fermentador. Os meios de crescimento de transformação, momentos de adição de canrenona, momentos de adição de nutriente, momentos de colheita e graus de conversão destes ensaios são indicados nos Quadros 22 e 23.

Quadro 22 - Descrições de Processo para Bioconversão da Canrenona Número do ensaio R3A R3B R3C R3D Meio (g/L) Água de 30 igual ao Peptona: 20 igual ao maceração de milho ensaio R3A Ext. Lev.: 20 ensaio R3A extracto de 15 Glucose: 20 levedura OSA: 3 ml nh4h2po4 3 Glucose 15 OSA 0,5 ml pH ajustado a pH ajustado a pH 6,5 com NaOH 6,5 com NaOH 2,5 N 2,5 N Canrenona a canrenona igual ao Canrenona não igual ao carregada às foi ensaio R3A estéril: ensaio R3A esterilizada e misturada. BI: 50 g carregada segundo o BI: 50 g, 16,5 h: 110 g 16.5 h: 110 g 46.5 h: 80 g plano listado no Quadro 23 BI: 50 g 16,5 h: 110 g Fornecimentos ver Quadro 23 ver Quadro 23 ver Quadro 23 ver Quadro 23 Momento da colheita 118,5 h 118,5 h 118,5 h 73,5 h Bioconversão 93, 7% 94, 7% 60,0% 68,0% 133 ΡΕ0973791 QUADRO 23 - Plano de Fornecimento de Canrenona, Glucose e Meio de Crescimento na Experiência Desenvolvida Tempo de Adição h R3C R3A R3B R3D Canrenona 22 0g/2L Dl estéril Solução glucose a 50% Peptona e extr. Levedura 20g cada em 1L de agua Antibióticos 2 0 mg canamicina 2 0 mg tetraciclina 10 0 mg cefalexina 50 ml Canrenona /Meio de cresc. ver Quadro 22 Canrenona /Meio de cresc. ver Quadro 22 Canrenona /Meio de cresc. ver Quadro 22 g g g g/L g/L g/L 0 — — — — 50g/0,4L 50g/0,4L 50g/0,4L 14,5 16 100 25 5 0 ml — — — 16,5 — — — — 110g/1,2L 110g/l,2L 110g/l,2L 20,5 16 140 25 — — — — 28,5 16 140 25 — — — — 34,5 16 150 25 — — — — 40,5 16 150 25 5 0 ml — — — 46,5 880 130 25 — — 80g/0,8L — 52,5 160 120 25 — — — — 58,5 160 150 25 — — — — 64,5 160 180 25 5 0 ml — — — 70,5 160 140 25 — — — —

Devido ao crescimento filamentoso observou-se um caldo de fermentação extremamente viscoso em todos os quatro ensaios deste Exemplo. Para ultrapassar os obstáculos criados pela viscosidade elevada relativamente aos arejamento, mistura, controlo de pH e controlo de temperatura, aumentou-se a taxa de arejamento e a velocidade de agitação durante estes ensaios. As conversões prosseguiram satisfatoriamente nas condições mais rigorosas, mas formou-se um bolo denso por cima da superfície do caldo liquido. Este bolo retirou alguma canrenona por reagir do caldo.

Exemplo 8 A descrição e os resultados do Exemplo 8 são resumidos no Quadro 24. Realizou-se quatro ensaios de 134 ΡΕ0973791 fermentação nos quais se produziu lla-hidroxicanrenona por bioconversão de canrenona. Em dois destes ensaios (R4A e R4D), a bioconversão foi realizada essencialmente do mesmo modo que os ensaios R3A e R3D do Exemplo 6. No ensaio R4C, a canrenona foi convertida em lla-hidroxicanrenona duma maneira geral do modo descrito no Exemplo 3. No ensaio R4B, o processo foi realizado duma maneira geral como descrito no Exemplo 4, i.e., com esterilização de canrenona e meio de crescimento no fermentador imediatamente antes da inoculação, todos os nutrientes de azoto e fósforo foram introduzidos no início do lote, e forneceu-se apenas uma solução suplementar contendo glucose ao fermentador para manter o nivel de glucose à medida que o lote prosseguia. No último processo (ensaio R4B), seguiu-se a concentração de glucose cada 6 horas e adicionou-se solução de glucose conforme indicado para controlar os níveis de glucose na gama de 0,5 até 1%. As momentos de adição de canrenona nestes ensaios são indicadas no Quadro 25.

Quadro 24 - Descrições do Processo Experiência de Desenvolvimento de Bioconversões de Canrenona Número do ensaio R4A R4B R4C R4D Meio (g/L) Agua de maceração de milho 30 igual ao ensaio R4A Peptona: 20 Ext. Lev.: 20 igual ao ensaio R4A extracto de 15 Glucose: 20 levedura OSA: 3 ml nh4h2po4 3 Glucose 15 OSA 0,5 ml pH ajustado a pH 6,5 com NaOH ajustado a pH 6,5 com NaOH 2,5 N 2,5 N ΡΕ0973791 135 (continuação)

Quadro 24 - Descrições do Processo Experiência de Desenvolvimento de Bioconversões de Canrenona Número do ensaio R4A R4B R4C R4D Canrenona carregada às A canrenona foi esterilizada e misturada. BI: 40 g, 23,5 h: 120 g 160 g de canrenona é esterilizada no fermentador Canrenona não estéril: carregada segundo o plano listado no Quadro 25 A canrenona foi esterilizada e misturada. BI: 40 g, 23,5 h: 120 g Fornecimentos ver Quadro 25 ver Quadro 25 ver Quadro 25 ver Quadro 25 Momento da colheita 122 h 122 h 122 h 122 h Bioconversão 95, 6% 97,6% 95,4% 96, 7% QUADRO 25 - Plano de Fornecimento de Canrenona, Glucose e Meio de Crescimento na Experiência Desenvolvida Tempo de Adição h R3C R3A R3B R3D Canrenona 200g/2L água estéril g Solução glucose a 50% g Peptona e extr. Levedura 20g cada em 1L de água g Antibióticos 20 mg canamicina 20 mg tetraciclina 100 mg cefalexina 50 ml (adicionados na suspensão de canrenona) Meio de cresc. ver Quadro 24 Meio de cresc. ver Quadro 24 Meio de cresc. ver Quadro 24 14 600 135 25 50 ml — — — 20 — 100 — — — — — 23 — — — — 120g/l,2L — 120g/l,2L 26 — 100 25 — — — — 32 — 135 25 — — — — 38 500 120 25 50 ml — — — 44 — 100 25 — — — — 50 — 100 25 — — — — 56 — 150 25 — — — — 62 500 150 25 50 ml — — — 68 — 200 25 — — — — 74 — 300 25 — — — — 80 — 100 25 — — — — 86 — 125 25 — — — — 92 — 175 25 — — — — 98 — 150 — — — — — 104 — 175 — — — — — 110 — 175 — — — — — 116 — 200 — — — — — 136 ΡΕ0973791

Todos os fermentadores foram utilizados sob agitação e arejamento elevados durante a maior parte do ciclo de fermentação porque o barril de fermentação ficou extremamente viscoso em mais ou menos um dia após inoculação.

Exemplo 9

Os meios de crescimento de transformação, momentos de adição de canrenona, momentos de colheita e graus de conversão para os ensaios deste Exemplo são indicados no Quadro 26.

Efectuou-se quatro ensaios de bioconversão essencialmente do modo descrito para o ensaio R4B do Exemplo 8, à excepção do descrito a seguir. No ensaio R5B, o rotor de disco da turbina utilizado na agitação dos outros ensaios foi substituído por um rotor em hélice de bombeamento descendente. A acção de bombeamento descendente trazia axialmente o caldo para o centro do fermentador, reduzindo a formação de bolo. No ensaio R5D adicionou-se metanol (200 ml) imediatamente após inoculação. Uma vez que a canrenona era esterilizada no fermentador, todos os nutrientes à excepção da glucose foram adicionados no início do lote, obviando a necessidade de fornecimento contínuo de fontes de azoto, fontes de fósforo ou antibióticos . 137 ΡΕ0973791

Quadro 26 - Descrição do Processo Experiência de Desenvolvimento de Bioconversões à Escala de 10 L Numero do ensaio R5A R5B R5C R5D Meio (g/L) Água de 30 igual ao Peptona: 20 igual ao maceração de milho ensaio R5A Ext. Lev.: 20 ensaio R5A Extracto de 15 Glucose: 20 levedura OSA: 3 ml nh4h2po4 3 Glucose 15 OSA 0,5 ml pH ajustado a pH ajustado a pH 6,5 com NaOH 6,5 com NaOH 2,5 N 2,5 N Canrenona 160 g de 160 g de 160 g de 160 g de carregada às canrenona canrenona canrenona canrenona esterilizada esterilizada esterilizada esterilizada no no no no fermentador fermentador fermentador fermentador Fornecimento ao alimentação alimentação alimentação alimentação meio de glucose de glucose de glucose de glucose Momento da colheita 119,5 h 119,5 h 106 h 119,5 h Bioconversão 96% 94,1% 88, 5% 92, 4%

Para manter a imersão da fase sólida e impedir o seu crescimento acima da superfície líquida, o meio de crescimento (2 L) foi adicionado a cada fermentador 96 horas após o início do lote. Os problemas de mistura não foram completamente ultrapassados quer pela adição de meio de crescimento quer pela utilização de um rotor de bom-beamento descendente (ensaio R5B) mas os resultados dos ensaios demonstraram a exequibilidade e as vantagens do processo, e indicaram que podia ser proporcionada uma mistura satisfatória utilizando práticas convencionais. 138 ΡΕ0973791

Exemplo 10

Efectuou-se três ensaios de bioconversão essencialmente do modo descrito no Exemplo 9. Os meios de crescimento de transformação, plano de adição de canrenona, tempos de colheita e graus de conversão para os ensaios deste Exemplo são indicados no Quadro 27:

Quadro 27 - Descrição do Processo da Experiência de Bioconversões à Escala de 10 L Numero do ensaio R6A R6B R6C Meio (g/L) Água de 30 igual ao ensaio Peptona: 20 maceração de R6A Ext. Lev.: 20 milho Glucose: 20 Extracto de 15 levedura OSA: 0,5 ml nh4h2po4 3 Glucose 15 OSA 0,5 ml pH ajustado a pH 6,5 ajustado a pH 6,5 com NaOH 2,5 N com NaOH 2,5 N Canrenona 160 g de canrenona 160 g de canrenona 160 g de canrenona carregada às esterilizada no esterilizada no esterilizada no fermentador fermentador fermentador Fornecimento de alimentação de alimentação de alimentação de meio glucose; 1,3 L glucose; 0,5 L glucose; sem outra meio e 0,8 L de meio e 0,5 L de adição água estéril às água estéril às 71 h 95 h Momento da 120 h 120 h 120 h colheita Bioconversão 95% 96% 90% Balanço de Massa 59% 54% 80%

Adicionou-se meio de crescimento (1,3 L) e água estéril (0,8 L) após 71 horas no ensaio R6A para submergir o bolo micelial que tinha crescido acima da superfície do caldo líquido. Para o mesmo efeito, adicionou-se meio de 139 ΡΕ0973791 crescimento (0,5 L) e água estéril (0,5 L) após 95 horas no ensaio R6B. Os dados de balanço de massa mostraram que podia ser determinado um melhor balanço de massa quando se minimizava a acumulação de bolo acima da superfície líquida.

Exemplo 11

Efectuou-se ensaios de fermentação para comparar a pré-esterilização de canrenona com a esterilização de canrenona e meio de crescimento no fermentador de transformação. No ensaio R7A, o processo foi realizado como ilustrado na Fig. 2, em condições comparáveis com as dos ensaios R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A e R4D. O ensaio R7B foi como ilustrado na Fig. 3 em condições comparáveis às dos Exemplos 4, 9 e 10, e ensaio R4B. O meio de crescimento de transformação, plano de adição de canrenona, tempos de colheita e graus de conversão para os ensaios deste Exemplo são indicados no Quadro 28:

Quadro 28 - Descrição do Processo da Experiência de Bioconversões à Escala de 10 L Numero do ensaio R7A R7B Meio (g/L) Água de 30 igual ao ensaio R7A maceração de milho Extracto de 15 levedura nh4h2po4 3 Glucose 15 OSA 0,5 ml pH ajustado a pH 6,5 com NaOH 2,5 N 140 ΡΕ0973791 (continuação)

Quadro 28 - Descrição do Processo da Experiência de Bioconversões à Escala de 10 L Numero do ensaio R7A R7B Carga de Canrenona 160 g de canrenona foi esterilizada e misturada fora do fermentador 160 g de canrenona foi esterilizada no fermentador Fornecimento de meio alimentação de glucose; adicionou-se canrenona com 1,6 L de meio de crescimento alimentação de glucose; sem outra adição Momento da colheita 118,5 h 118,5 h Bioconversão 93% 89%

Um balanço de massa com base na amostra final retirada do ensaio R7B foi de 89,5%, indicando que não ocorreu qualquer perda significativa de substrato ou degradação na bioconversão. Determinou-se que a mistura era adequada em ambos os ensaios. A concentração residual de glucose estava acima da gama de controlo, 5-10 gpl, desejada durante as 80 horas iniciais. O desempenho do ensaio não foi aparentemente afectado por um bolo leve que se acumulou no espaço de cabeça de ambos os fermentadores.

Exemplo 12 A eficiência de extracção foi determinada numa série de ensaios de extracção de 1 L como resumido no Quadro 29. Em cada um destes ensaios, os esteróides foram extraídos do micélio utilizando acetato de etilo (1 L/L de volume de fermentação). Realizou-se duas extracções 141 ΡΕ0973791 sequenciais em cada ensaio. Com base na RP-HPLC, recuperou-se cerca de 80% do esteróide total na primeira extracção; e a recuperação foi aumentada para 95% pela segunda extracção. Uma terceira extracção teria recuperado mais 3% de esteróide. Os restantes 2% são perdidos na fase aquosa sobrenadante. Levou-se o extracto à secura utilizando vácuo mas não se lavou com qualquer solvente adicional. A repulsão com solvente melhoraria a recuperação da extracção inicial se justificada pela economia do processo. QUADRO 29 - Recuperação de lla-Hidroxicanrenona na Extracção de 1 Litro (% do total) Número do 1° 2o 3o Sobrenadante ensaio Extracto Extracto Extracto R5A 79% 16% 2% 2% R5A 84% 12% 2% 2% R4A 72% 20% 4% 4% R4A 79% 14% 2% 5% R4B 76% 19% 4% 1% R4B 79% 16% 3% 2% R4B 82% 15% 2% 1% Média 79% 16% 3% 2%

Avaliou-se a metilisobutilcetona (MIBK) e o tolu-eno como solventes de extracção/cristalização para a 11a-hidroxicanrenona à escala de 1 L de caldo. Utilizando o protocolo de extracção descrito acima, a MIBK e o tolueno foram comparáveis ao acetato de etilo tanto em termos de eficiência de extracção como em desempenho da cristalização . 142 ΡΕ0973791

Exemplo 13

Como parte da avaliação dos processos das Figuras 2 e 3, realizou-se estudos sobre o tamanho de partícula do substrato canrenona fornecido no início do ciclo de fermentação em cada um destes processos. Como se descreveu acima, a canrenona fornecida ao processo da Fig. 1 foi micronizada antes de ser introduzida no fermentador. Neste processa, a canrenona não é esterilizada, sendo o crescimento de microrganismos indesejados controlado pela adição de antibióticos. Os processos das Figuras 2 e 3 esterilizam a canrenona antes da reacção. No processo da Fig. 2, isto é conseguido num misturador antes de introduzir a canrenona no fermentador. No processo da Fig. 3, a suspensão de canrenona em meio de crescimento é esterilizada no fermentador no início do lote. Como se discutiu acima, a esterilização tende a provocar a aglomeração das partículas de canrenona. Devido à solubilidade limitada da canrenona no meio de crescimento aquoso, a produtividade do processo depende da transferência de massa da fase sólida, e é assim expectável que dependa da área interfacial apresentada pelo substrato sólido em partículas, a qual por sua vez depende da distribuição do tamanho de partícula. Estas considerações serviram inicialmente como dissuasoras para os processos das Figuras 2 e 3.

No entanto constatou-se que a agitação no misturador da Fig. 2 e no tanque de fermentação da Fig. 3, em conjunto com a acção da bomba de corte utilizada para transferir o lote na Fig. 2, destruíam os aglomerados até 143 ΡΕ0973791 uma gama de tamanho de partícula razoavelmente próxima da canrenona não esterilizada e micronizada fornecida ao processo da Fig. 1. Isto é ilustrado pelas distribuições de tamanho de partícula para a canrenona como disponível na origem do ciclo reaccional em cada um dos três processos. Ver Quadro 30 e Figuras 4 e 5. QUADRO 30 - Distribuições de Partículas de Três Amostras Diferentes de Canrenona Amostra 45-125 μ <180 μ Tamanho médio μ # ensaio: % de Bioconversão Lote de canrenona 75% 95% R3C: 93,1% (120 h) R4C: 96,3% (120 h) Amostra misturada 31,2% 77,2% 139,5 R3A: 94,6% (120 h) R3B: 95,2% (120 h) Amostra esterilizada 24, 7% 65,1% 157, 4 R4B: 97,6% (120 h) R5B: 93,8% (120 h) A partir dos dados no Quadro 30, notar-se-á que os agitadores e a bomba de corte foram eficazes para reduzir o tamanho de partícula médio da canrenona esterilizada à mesma ordem de magnitude do substrato não esterilizado, mas permaneceu uma diferença de tamanho significativo em favor do substrato não esterilizado. Apesar desta diferença, os dados de desempenho da reacção mostram que os processos de pré-esterilização foram pelo menos tão produtivos quanto o processo da Fig. 1. Outras vantagens podem ser conseguidas no processo da Fig. 2 através de deter- 144 ΡΕ0973791 minados passos para reduzir e controlar ainda mais o tamanho de partícula, e.g., moagem a húmido de canrenona esterilizada, e/ou por pasteurização em vez de esterilização.

Exemplo 14

Preparou-se uma cultura de inoculação do modo descrito no Exemplo 5. Às 20 horas, os micélios no fermentador de inoculo estavam polpudos com um PMV de 40%. O seu pH era de 5,4 e permaneciam inutilizadas 14,8 gpl de glucose.

Preparou-se um meio de crescimento de transformação (35 L) com a composição apresentada no Quadro 20. Na preparação do meio de alimentação, a glucose e o extracto de levedura foram esterilizados separadamente e misturados como uma única alimentação a uma concentração inicial de 30% em peso de glucose e 10% em peso de extracto de levedura. O pH da alimentação foi ajustado até 5,7.

Utilizando este meio, (Quadro 20), efectuou-se dois ensaios de bioconversão para a conversão de canrenona em lla-hidroxicanrenona. Cada um dos ensaios foi realizado num fermentador de 60 L munido com um agitador compreendendo um rotor de turbina Rushton e dois rotores Lightnin' A315. A carga inicial do meio de crescimento ao fermentador foi de 35 L. A canrenona micronizada e não 145 ΡΕ0973791 esterilizada foi adicionada a uma concentração inicial de 0,5%. O meio no fermentador foi inoculado com uma cultura de inoculação preparada do modo descrito no Exemplo 5 a uma taxa de inoculação inicial de 2,5%. A fermentação foi realizada a uma temperatura de 28°C, uma velocidade de agitação de 200 até 500 rpm, uma taxa de arejamento de 0,5 vvm e uma contrapressão suficiente para manter um nível de oxigénio dissolvido de pelo menos 20% em volume. A cultura de transformação desenvolvida durante o ensaio de produção encontrava-se na forma de pastilhas ovais muito pequenas (cerca de 1-2 mm). A canrenona e os nutrientes suplementares foram fornecidos continuamente ao fermentador duma maneira geral do modo descrito no Exemplo 1. As adições de nutrientes foram efectuadas cada quatro horas numa proporção de 3,4 g de glucose e 0,6 g de extracto de levedura por litro de caldo no fermentador.

No Quadro 31 estão indicados a taxa de arejamento, velocidade de agitação, oxigénio dissolvido, PMV e pH dominante aos intervalos indicados durante cada um dos ensaios deste Exemplo, assim como as adições de glucose feitas durante o lote. O Quadro 32 mostra o perfil de conversão de canrenona. O ensaio RllA foi terminado após 46 horas; O ensaio RllB prosseguiu durante 96 horas. No último ensaio, atingiu-se 93% de conversão às 81 horas; fez-se mais uma adição de alimentação às 84 horas; e parou-se então a alimentação. Assinale-se que ocorreu uma alteração significativa na viscosidade entre a altura em que se parou a alimentação e o final do ensaio. 146 ΡΕ0973791 QUADRO 31 Fermentação RllA Tempo ar (lpm) rpm %DO Contra- pressão PMV(%) pH Cone. glucose (g/D 0,1 20 200 93 0 2 6,17 5, 8 7 20 200 85,1 0 5 6,03 5,5 12, 4 20 300 50,2 0 5,43 21, 8 20 400 25,5 0 38 6,98 0 29 20 500 17 0 35 5,22 30, 2 20 500 18,8 10 5,01 31 20 500 79 10 4,81 1 35, 7 20 500 100 10 45 5,57 0 46,2 20 500 23 6 45 5,8 1 Glucose total: 27,5 g/1 Extracto de levedura total: 8,75 g/1 Fermentação RllB Tempo ar (lpm) rpm %DO Contra- pressão PMV(%) pH Cone. glucose (g/D 0,1 20 200 92,9 0 2 5,98 5,4 7 20 200 82,3 0 5 5,9 5 12, 4 20 300 49,5 0 5,48 21, 8 20 400 18 0 40 7,12 0 29 20 500 36,8 0 35 5,1 3 35, 7 20 500 94,5 10 4,74 0 46,2 20 500 14,5 6 45 5,32 2 55 20 500 16,7 10 5,31 0,5 58, 6 20 500 19,4 15 5,32 1 61, 9 20 500 13 15 40 5,36 2 71, 7 20 500 13 15 42 5,37 0 81, 1 20 500 22,9 15 5,42 2,5 85, 6 20 500 22 15 45 5,48 1 97, 5 20 500 108 15 45 6,47 0 117, 7 20 500 15 7,38 0 Glucose total: 63 g/1 Extracto de levedura total: 14,5 g/1 147 ΡΕ0973791 QUADRO 32 Fermentação R11A: Conversão de canrenona Concentrações (g/1) Conversão OH-can calc. Taxas de conversão (g/l/h) Amostra Tempo OH-can Caren. Total (%) (g/1) Calc. Medido R11A-0 0,10 0,00 5, 41 5,41 R11A-7 7, 00 0,18 4, 89 5,07 3, 58 0,18 0,03 0,03 R11A-22 21,80 2,02 2,12 4,14 48, 75 2,44 0,15 0,12 R11A-29 29, 00 3,67 4,14 7, 81 47, 03 4, 48 0,28 0,23 R11A-36 35, 70 6,68 1,44 8,12 82, 27 7,74 0,49 0,45 R11A-46 46,20 7,09 0,41 7,51 94, 48 8,59 0,08 0,04 Fermentação R11B: Conversão de canrenona Concentrações (g/1) Conversão OH-can calc. Taxas de conversão (g/l/h) Amostra Tempo OH-can Caren. Total (%) (g/1) Calc. Medido R11B-0 0,1 0,00 5,60 5,60 R11B-7 7,0 0,20 4,98 5,18 3, 78 0,19 0,03 0,03 R11B-22 21,8 2,51 2,46 4,97 50, 49 2,52 0,16 0,16 R11B-29 29,0 4,48 16,99 21,47 20, 87 4,69 0,30 0,27 R11B-36 35, 7 8,18 10,35 18,53 44, 16 9,70 0, 75 0,55 R11B-55 55,0 17, 03 13,20 30,23 56,33 19,50 0,32 0,36 R11B-59 58,6 20,80 11, 73 32,53 63, 95 21,97 0,69 1,05 R11B-62 61,9 22,19 8,62 30,81 72, 02 24,50 0, 77 0,42 R11B-72 71, 7 26,62 3,61 30,23 88, 06 29,46 0,51 0,45 R11B-81 81,1 27,13 2,05 29,18 92, 97 30,32 0,09 0,05 R11B-86 85,6 26,87 2,02 28,88 93, 02 30,11 -0,04 -0,06 R11B-97 97,5 23,95 1, 71 25,66 93,34 30,22 0,01 -0,25 R11B-118 117, 7 24,10 1,68 25, 79 93, 47 30,26 0,00 0,01

Exemplo 15

Testou-se várias culturas quanto à eficácia na bioconversão de canrenona em lla-hidroxicanrenona segundo os métodos duma maneira geral descritos acima.

Preparou-se um banco de células de trabalho de cada um de Aspergillus niger ATCC 11394, Rhizopus arrhizus 148 ΡΕ0973791 ATCC 11145 e Rhizopus stolonifer ATCC 6227b do modo descrito no Exemplo 5. Inoculou-se o meio de crescimento (50 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 18 com uma suspensão de esporos (1 ml) do banco de células de trabalho e colocou-se numa incubadora. Preparou-se uma cultura de inoculação na incubadora por fermentação a 26°C durante cerca de 20 horas. Agitou-se a incubadora a uma velocidade de 200 rpm.

Utilizou-se aliquotas (2 ml) da cultura de inoculação de cada microrganismo para inocular balões de transformação contendo o meio de crescimento (30 ml) do Quadro 18. Cada cultura foi utilizada para inoculação de dois balões, num total de seis. Dissolveu-se a canrenona (200 mg) em metanol (4 ml) a 36°C, e introduziu-se uma aliquota de 0,5 ml desta solução em cada um dos balões. A bioconversão foi realizada em geral nas condições descritas no Exemplo 5 com adições de solução de glucose a 50% em peso (1 ml) cada dia. Após as primeiras 72 horas fez-se as seguintes observações no desenvolvimento de micélios nos respectivos balões de fermentação de transformação: ATCC 11394 - bom crescimento homogéneo ATCC 11145 - bom crescimento nas primeiras 48 horas, mas os micélios aglomeraram-se numa bola; nenhum crescimento evidente nas últimas 24 horas; ATCC 6227b - bom crescimento; a massa micelial formou uma bola aglomerada. 149 ΡΕ0973791

Retirou-se amostras do caldo para analisar o grau de bio-conversão. Após três dias, a fermentação utilizando ATCC 11394 proporcionou uma conversão em lla-hidroxicanrenona de 80 até 90%; o ATCC 11145 proporcionou uma conversão de 50%; e o ATCC 6227b proporcionou uma conversão de 80 até 90%.

Exemplo 16

Utilizando essencialmente o método descrito no Exemplo 15, testou-se mais microrganismos quanto à eficácia na conversão de canrenona em lla-hidroxicanrenona. Os organismos testados e os resultados dos testes são indicados no Quadro 33: QUADRO 33 - Culturas avaliadas quanto à Bioconversao de canrenona em llalfa- hidroxicanrenona Cultura ATTC# 1 meios resultados conversão aproximada Rhizopus.oryzae 1145 CSL + 50% - Rhizopus.stolonifer 6227b CSL + 80-90% - Aspergillus nidulans 11267 CSL + 50% 80% Aspergillus niger 11394 CSL + 80-90% - Aspergillus ochraceus NRRL 405 + 90% Aspergillus ochraceus 18500 CSL + 90% Bacillus subtilis 31028 P&CSL - 0% 0% Bacillus subtilis 31028 CSL - 0% 0% Bacillus sp. 31029 P&CSL - 0% 0% Bacillus sp. 31029 CSL - 0% * Bacillus megaterium 14945 P&CSL + 5% 80%* Bacillus megaterium 14945 CSL + 5% 10%* Trichothecium roseum 12519 CSL + 80%* 90%* Trichothecium roseum 8685 CSL + 80%* 90%* Streptomyces fradiae 10745 CSL + <5% <10% Streptomyces fradiae 10745 TSB - * •k Streptomyces lavendulae 13664 CSL - 0% k Streptomyces lavendulae 13664 TSB - 0% 0% Nocardiodes simplex 6946 BP - 0% 0% ΡΕ0973791 150 (continuação) QUADRO 33 - Culturas avaliadas quanto à Bioconversao de canrenona em llalfa- hidroxicanrenona Cultura ATTC# meios1 resultados conversão aproximada Nocardiodes simplex 13260 BP - * k Pseudomonas sp. 14696 BP - * k Pseudomonas sp. 14696 CSL + <5% <10% Pseudomonas sp. 14696 TSB - 0% •k Pseudomonas sp. 13261 BP + * <10% Pseudomonas cruciviae 13262 # <10% Pseudomonas putida 15175 - 0% 0% *formação de outros produtos não identificados ^eios: CSL - água de maceração de milho; TSB - caldo de soja tripsínica; P & CSL - peptona e água de maceração de milho; BP - extracto de carne de vaca e peptona.

Exemplo 17

Testou-se vários microrganismos quanto à eficácia canrenona em 9a-hidroxicanrenona. Os meios de fermentação para os ensaios deste Exemplo foram preparados como indicado no Quadro 34: QUADRO 34 Soja triturada: dextrose 20 g soja triturada 5 g NaCl 5 g extracto de levedura 5 g KH2P04 5 g água até 1 L pH 7, 0 ΡΕ0973791 151

Peptona/extracto de levedura/glucose:

glucose 40 g bactopeptona 10 g extracto de levedura 5 g água até 1 L

Mueller-Hinton:

infusão de carne de vaca 300 g casaminoácidos 17,5 g amido 1,5 g água até 1 L

Multiplicou-se os fungos em meio de soja triturada e em peptona/extracto de levedura/glucose; multiplicou-se os actinomicetos e eubactérias em caldo de soja triturada (com 0,9% em peso de formato de Na para as bio-transformações) e em caldo de Mueller-Hinton.

Inoculou-se culturas de arranque com culturas-mães de esporos congelados (20 ml de soja triturada num Erlenmeyer de 250 ml). Cobriu-se os balões com um passador de leite e escudo biológico. Utilizou-se as culturas de arranque (com 24 ou 48 horas) para inocular culturas de metabolismo (também 20 ml em Erlenmeyer de 250 ml) - com um volume de passagem de 10% até 15% - e incubou-se as últimas 152 ΡΕ0973791 durante 24 até 48 horas antes da adição de substrato esteróide para a reacção de transformação.

Dissolveu-se/suspendeu-se canrenona em metanol (20 mg/ml), esterilizou-se por filtração e adicionou-se às culturas até uma concentração final de 0,1 mg/ml. Todos os balões de fermentação de transformação foram agitados a 250 rpm (curso do êmbolo: 2") numa sala de temperatura controlada a 26°C e 60% de humidade.

Colheu-se as biotransformações às 5 e 48 horas, ou às 24 horas, após adição do substrato. A colheita começou com a adição de acetato de etilo (23 ml) ou cloreto de metileno ao balão de fermentação. Sacudiu-se então os balões durante dois minutos e verteu-se o conteúdo de cada frasco para um tubo cónico de 50 ml. Para separar as fases, centrifugou-se os tubos a 4000 rpm durante 20 minutos numa unidade à temperatura ambiente. Transferiu-se a camada orgânica de cada tubo para um frasco de 20 ml em vidro de borossilicato e evaporou-se num speed vac. Tapou-se os frascos e conservou-se a -20°C.

Para se obter material para determinação da estrutura, procedeu-se ao aumento de escala das biotransformações até 500 ml aumentando o número de fermentações em balão de agitação para 25. Na altura da colheita (24 ou 48 horas após a adição de substrato), adicionou-se acetato de etilo a cada balão individualmente, e tapou-se os balões e 153 ΡΕ0973791 colocou-se de novo no agitador durante 20 minutos. Verteu-se então o conteúdo dos balões para frascos em polipro-pileno e centrifugou-se para separar as fases ou para uma ampola de decantação na qual se deixa separar as fases por gravidade. Secou-se a fase orgânica, produzindo um extracto bruto de esteróides contidos na mistura reaccional.

Analisou-se o produto reaccional primeiro por cromatografia em camada fina em placas de silica gel (250 μιη) de fundo fluorescente (254 nm) . Adicionou-se acetato de etilo (500 μύ a cada frasco contendo extracto de acetato de etilo seco da mistura reaccional. Efectuou-se análises adicionais por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massa. As placas foram desenvolvidas num meio de clorofórmio/metanol 95:5 v/v.

Efectuou-se análises adicionais por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massa. Utilizou-se um HPLC Waters com suporte lógico Millennium, detector de matriz de fotodíodos e amostrador automático. A HPLC de fase inversa utilizou um cartucho NovaPak C-18 (4 pm de tamanho de partícula) RadialPak 4 mm da Waters. O gradiente linear de solvente de 25 minutos começou com a coluna iniciada em água:acetonitrilo (75:25) e finalizada em água:acetonitrilo (25:75). Este foi seguido de um gradiente de três minutos até 100% de acetonitrilo e 4 minutos de lavagem isocrática antes da regeneração da coluna nas condições iniciais. 154 ΡΕ0973791

Para LC/MS, adicionou-se acetato de amónio às fases de acetonitrilo e água a uma concentração de 2 nM. A cromatografia não foi afectada de modo significativo. 0 eluato da coluna foi dividido a 22:1, com a maior parte do material enviado para o detector de PDA. Os restantes 4,5% do material foram enviados para a câmara de ionização por electropulverização de um espectrómetro de massa Sciex API III. A espectrometria de massa foi realizada no modo positivo. Uma linha de dados analógica do detector de PDA no HPLC transferiu um cromatograma de comprimento de onda único para o espectrómetro de massa para co-análise dos dados de UV e MS.

Os padrões de fragmentação de espectrometria de massa mostraram-se úteis para distinguir entre os substratos hidroxilados. As duas canrenonas hidroxiladas esperadas, lla-hidroxi- e 9a-hidroxi-, perdiam água a frequências diferentes de um modo consistente o que podia ser utilizado como diagnóstico. Além disso, a 9a-hidroxicanrenona originava um produto de adição de amónio mais facilmente do que a lla-hidroxicanrenona. No Quadro 35 está um resumo dos dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as fermentações de canrenona, mostrando quais dos microrganismos testados foram eficazes na bioconversão de canrenona em 9a-hidroxicanrenona. Destes, o microrganismo preferido foi o Corynespora cassiicola ATCC 16718. 155 ΡΕ0973791 QUADRO 35 - Resumo dos Dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as Fermentações de Canrenona Evidência para a 9aOH-canrenona Cultura mancha à 9aQH-AD na TLC pico de HPLC à 9aOH-canrenona p/UV MS: 357 (Μ + H), 339 (-H20) e 375 (+NH4) Absidia coerula ATCC n y y/n 6647 Absidia glauca ATCC n 22752 Actinomucor elegans tr y tr ATCC 6476 Aspergillus flavipes tr ATCC 1030 Aspergillus fumigatus tr y n ATCC 26934 Aspergillus nidulans tr y y ATCC 11267 Aspergillus niger ATCC 16888 n y y Aspergillus niger ATCC 26693 n y n Aspergillus ochraceus n y n ATCC 18500 Bacterium cyclo- n tr n oxydans (Searle) ATCC 12673 Beauveria bassiana tr y y ATCC 7159 Beauveria bassiana y y y ATCC 13144 Botryosphaeria obtusa y tr tr IMI 038560 Calonectria decora n tr y ATCC 14767 Chaetomium cochliodes tr tr y/n ATCC 10195 Comomonas testosteroni tr tr n (Searle) ATCC 11996 Corynespora cassiicola y y y ATCC 16718 Cunninghamella blakesleana ATCC 8688a y y y Cunninghamella echinulata ATCC 3655 y y y ΡΕ0973791 156 (continuação) QUADRO 35 - Resumo dos Dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as Fermentações de Canrenona Evidência para a 9aOH-canrenona Cultura mancha à 9aQH-AD na TLC pico de HPLC à 9aOH-canrenona p/UV MS: 357 (Μ + H), 339 (-H20) e 375 (+NH4) Cunninghamella elegans ATCC 9245 y y y Curcularia clavata ATCC 22921 n y y/n Curvularia lunata ATCC 12071 y n n Cilindrocarpon radicicola (Searle) ATCC 11011 tr n n Epicoccum humucola ATCC 12722 y y y Epicoccum oryzae ATCC 12724 tr tr tr Fusarium oxysporum ATCC 7601 tr Fusarium oxysporum f.sp. cepae ATCC 11171 n Gibberella fujikuroi ATCC 14842 tr y y Gliocladium deliquescens ATCC 10097 y tr tr Gongronella butieri ATCC 22822 y y UV? y Hypomyces chrysospermus Tul. IMI 109891 y y y Lipomyces lipofer ATCC 10792 n Melanospora ornata ATCC 26180 tr n n Mortierella isabellinay ATCC 42613 y y n Mucor grisco-cyanus ATCC 1207a n Mucor mucedo ATCC 4605 tr y y Mycobacterium fortuitumn ATCC 6842 ΡΕ0973791 157 (continuação) QUADRO 35 - Resumo dos Dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as Fermentações de Canrenona Evidência para a 9aOH-canrenona Cultura mancha à 9aQH-AD na TLC pico de HPLC à 9aOH-canrenona p/UV MS: 357 (Μ + H), 339 (-H20) e 375 (+NH4) Myrothecium verrucaria ATCC 9095 tr tr y Nocardia aurentia (Searle) ATCC 12674 n tr n Nocardia cancicruria (Searle) Y Y n Nocardia corallina ATCC 19070 n Paecilomyces carneus ATCC 46579 n y n Penicillium chrysoqenum ATCC 9480 n Penicillium patulum ATCC 24550 y y y/n Penicillium purpurogenum ATCC 46581 tr y y Pithomyces atro-olivaceus ATCC 6651 tr y tr Pithomyces cynodontis ATCC 26150 n tr tr Phycomyces blakesleeanus y y y/n Phycnosporium sp. ATCC 12231 y y y/n Rhizopogon sp. Rhizopus arrhizus ATCC 11145 tr y n Rhizopus stolonifer ATCC 6227b n Rhodococcus equi ATCC 14887 n tr n Rhodococcus equi ATCC 21329 tr tr n Rhodococcus sp. n n n Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150 n tr n ΡΕ0973791 158 (continuação) QUADRO 35 - Resumo dos Dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as Fermentações de Canrenona Evidência para a 9aOH-canrenona Cultura mancha à 9aQH-AD na TLC pico de HPLC à 9aOH-canrenona p/UV MS: 357 (Μ + H), 339 (-H20) e 375 (+NH4) Saccharopolispora erythaea ATCC 11635 y y y Sepedonium ampullosporum IMI 203033 n n n Sepedonium chrysospermum ATCC 13378 n Septomyxa affinis ATCC 6737 n y UV? y/n Stachilidium bicolor ATCC 12672 y y y/n Streptomyces californicus ATCC 15436 n Streptomyces cinereocrocatus ATCC 3443 n Streptomyces coelicolor ATCC 10147 n Streptomyces flocculus ATCC 25453 Streptomyces fradiae ATCC 10745 n Streptomyces griseus subsp. griseus ATCC 13968 n Streptomyces griseus ATCC 11984 n Streptomyces hydrogenans ATCC 19631 n Streptomyces 27438 hygroscopicus ATCC 27438 y y y Streptomyces lavendulae Panlab 105 n Streptomyces paucisporogenes ATCC 25489 n 159 ΡΕ0973791 (continuação) QUADRO 35 - Resumo dos Dados de TLC, HPLC/UV e LC/MS para as Fermentações de Canrenona Evidência para a 9aOH-canrenona Cultura mancha à 9aQH-AD na TLC pico de HPLC à 9aOH-canrenona p/UV MS: 357 (Μ + H), 339 (-H20) e 375 (+NH4) Streptomyces purpurascens ATCC 25489 n tr tr Streptomyces roseochromogenes ATCC 13400 Streptomyces spectabilis ATCC 27465 n Stysanus microsporus ATCC 2833 Syncephalastrum racemosum ATCC 18192 n Thamnidium elegans ATCC 18191 Thamnostilum piriforme ATCC 8992 y tr y Thielavia terricolan ATCC 13807 n Trichoderma viride ATCC 26802 n Trichothecium roseum ATCC 12543 tr y y/n Verticillium theobromae ATCC 12474 y tr tr

Exemplo 18

Testou-se várias culturas quanto à eficácia na bioconversão de androstenodiona em lla-hidroxiandrosteno-diona segundo os métodos geralmente descritos acima.

Preparou-se uma banco de células de trabalho de cada um de Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500); 160 ΡΕ0973791

Asperqlllus niqer ATCC 11394; Asperqillus nidulans ATCC 11267; Rhizopus oryzae ATCC 11145; Rhizopus stolonifer ATCC 6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 e ATCC 8685 essencialmente do modo descrito no Exemplo 4. Inoculou-se um meio de crescimento (50 ml) possuindo a composição indicada no Quadro 18 com uma suspensão de esporos (1 ml) do banco de células de trabalho e colocou-se num incubador. Preparou-se uma cultura de inoculação no incubador por fermentação a 26°C durante cerca de 20 horas. Aqitou-se o incubador a uma velocidade de 200 rpm.

Utilizou-se aliquotas (2 ml) da cultura de inoculação de cada microrqanismo para inocular balões de transformação contendo o meio de crescimento (30 ml) do Quadro 15. Cada cultura foi utilizada para inoculação de dois balões, num total de 16. Dissolveu-se a androstenodiona (300 mg) em metanol (6 ml) a 36°C, e introduziu-se uma aliquota de 0,5 ml desta solução em cada um dos balões. A bioconversão foi geralmente realizada nas condições descritas no Exemplo 6 durante 48 horas. Após 48 horas combinou-se amostras do caldo e extraiu-se com acetato de etilo como no Exemplo 17. Concentrou-se o acetato de etilo por evaporação, e analisou-se amostras por cromatografia em camada fina para determinar se estava presente um produto com uma mobilidade cromatográfica semelhante à do padrão de 11a-hidroxi-androstenodiona (Sigma Chemical Co., St. Louis). Os resultados são mostrados no Quadro 36. Os resultados positivos são indicados como "+". 161 ΡΕ0973791 QUADRO 36 Bioconversão de androstenodiona em llalfa-hidroxi- androstenodiona Cultura ATTC# meio resultados TLC Rhizopus oryzae 11145 CSL + Rhizopus stolonifer 6227b CSL + Aspergillus nidulans 11267 CSL + Aspergillus niger 11394 CSL + Aspergillus ochraceus NRRL 405 CSL + Aspergillus ochraceus 18500 CSL + Trichothecium roseum 12519 CSL + Trichothecium roseum 8685 CSL +

Os dados no Quadro 36 demonstram que cada uma das culturas enumeradas foi capaz de produzir um composto de androstenodiona possuindo o mesmo valor de Rf que o padrão de lla-hidroxiandrostenodiona. 0 Asperqillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500) foi novamente testado pelo mesmo procedimento descrito acima, e os produtos da cultura foram isolados e purificados por cromatografia em coluna de silica gel de fase normal utilizando metanol como solvente. Analisou-se as fracções por cromatografia em camada fina. As placas de TLC foram Whatman K6F silica gel 60Á, 10x20 de tamanho, 250μ de espessura. O sistema solvente foi metanol:clorofórmio, 5:95, v/v. O produto cristalizado e o padrão de lla-hidroxiandrostenodiona foram ambos analisados por LC-MS e espectroscopia de RMN. Ambos os compostos originaram perfis e pesos moleculares semelhantes. 162 ΡΕ0973791

Exemplo 19

Testou-se vários microrganismos quanto à eficácia na conversão de mexrenona em lla-hidroximexrenona. Os meios de fermentação para este exemplo foram preparados como descrito no Quadro 34.

As condições de fermentação e métodos analíticos foram iguais aos do Exemplo 17. As placas de TLC e o sistema solvente foram como descrito no Exemplo 18. A base lógica para a análise cromatográfica é como se segue: a lla-hidroximexrenona e a lla-hidroxicanrenona têm a mesma mobilidade cromatográfica. A lla-hidroxicanrenona e a 9a-hidroxicanrenona têm o mesmo padrão de mobilidade das 11a-hidroxiandrostenodiona e Ιΐβ-hidroxiandrostenodiona. Por conseguinte, a Ιΐβ-hidroximexrenona deveria ter a mesma mobilidade que a 9a-hidroxicanrenona. Consequentemente, os compostos extraídos dos meios de crescimento foram analisados contra 9a-hidroxicanrenona como padrão. Os resultados são mostrados no Quadro 36. QUADRO 37 Resumo dos dados de TLC para a Formação de 11β-hidroximexrenona a partir da Mexrenona Microrganismo Meio1 Carácter da mancha2 Absidia coerula ATCC 6647 M, S forte Aspergillus niger ATCC 16888 S,p fraca (S)?(P) Beauveria bassiana ATCC 7159 P forte Beauveria bassiana ATCC 13144 S,P 9 9 • r · 163 ΡΕ0973791 (continuação) QUADRO 37 Resumo dos dados de TLC hidroximexrenona a para a Formação de 11β— partir da Mexrenona Microrganismo Meio1 Carácter da mancha2 Botryosphaeria obtusa IMI 038560 fraca Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a S,p forte echinulata ATCC 3655 S,p forte elegans ATCC 9245 S,p forte Curvularia lunata ATCC s forte 12017 Gongronella butleri ATCC 22822 S,P forte Penicillium patulum ATCC S,P forte 24550 Penicillium purpurogenum S,P forte ATCC 46581 Pithomyces atro-olivaceus S,p fraca IFO 6651 Rhodococcus equi ATCC 14887 M fraca Saccharopolispora erythaea M, SF fraca ATCC 11635 Streptomyces hygroscopicus M, SF forte ATCC 27438 Streptomyces purpurascens M, SF fraca ATCC 25489 Thamnidium elegans ATCC 18191 S,P fraca Thamnostilum piriforme ATCC 8992 S,P fraca Trichothecium roseum ATCC 12543 P,S fraca (P)?(S) 1 M = Mueller-Hinton P = PYG (peptona/extracto de levedura/glucose) S = soja triturada SF = soja triturada com formato 2 ? = diferença duvidosa substrato por falta de controlo de 164 ΡΕ0973791

Estes dados sugerem que a maior parte dos organismos enumerados neste quadro produzem um produto semelhante ou idêntico à lla-hidroximexrenona a partir da mexrenona.

Exemplo 20

Esquema 1: Passo 1: Preparação de 5'R (5'α), 7'β-20'-Amino-hexadeca-hidro-11'β-hidroxi-lO'a,13'a-dimetil-3 ', 5-dioxoespiro [furano-2 (3Η),17'α(5Ή)-[7, 4] meteno [4H [ci-clopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo.

Num reactor revestido a vidro de 50 galões carregou-se 61,2 L (57,8 kg) de DMF seguido de 23,5 kg de 11-hidroxicanrenona 1 sob agitação. À mistura adicionou-se 7,1 kg de cloreto de litio. Agitou-se a mistura durante 20 minutos e carregou-se 16,9 kg de acetona ciano-hidrina seguido de 5,1 kg de trietilamina. Aqueceu-se a mistura até 85°C e manteve-se a esta temperatura durante 13-18 horas. Após a reacção adicionou-se 353 L de água seguida de 5,6 kg de bicarbonato de sódio. Arrefeceu-se a mistura até 0°C, transferiu-se para um reactor revestido de vidro de 200 galões e desactivou-se lentamente com 130 kg de solução de hipoclorito de sódio a 6,7%. Filtrou-se o produto e lavou-se com porções 3 x 40 L de água para dar 21,4 kg do produto enamina. 165 ΡΕ0973791

Exemplo 21

Esquema 1: Passo 2: Preparação de 4'S(4'a),7'a-Hexadeca-hidro-11'a-hidroxi-10'β,13'P-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furano-2(3Η),17'β-[4,7]metano[17H]ciclo-penta[a]fenantreno]-51β(2 Ή)-carbonitrilo.

Num reactor revestido de vidro de 200 galões carregou-se 50 kg de enamina 2, aproximadamente 445 L de ácido clorídrico diluido 0,8 N e 75L de metanol. Aqueceu-se a mistura até 80°C durante 5 horas, arrefeceu-se até 0°C durante 2 horas. Filtrou-se o produto sólido para dar 36,5 kg de produto dicetona seco.

166 ΡΕ0973791

Exemplo 22

Esquema 1: Passo 3A: Preparação de lla,17a-Di-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Muniu-se um balão de fundo redondo de 4 tubuladuras de 5 L com agitador mecânico, funil de carga equalizador de pressão com tubo de entrada de azoto, termómetro e condensador com borbulhador. 0 borbulhador foi conectado através de um tubo em tygon a duas armadilhas de 2-L, a primeira das quais estava vazia e foi colocada para evitar a retorno do material na segunda armadilha (1 L de solução concentrada de hipoclorito de sódio) para o recipiente reaccional. Adicionou-se a dicetona 3 (79,50 g; [peso não corrigido para a pureza, a qual era de 85%]) ao balão em 3 L de metanol. Colocou-se uma solução metanólica de metóxido de sódio a 25% (64, 83 g) no funil e adicionou-se gota a gota, com agitação sob azoto, ao longo de um período de 10 minutos. Uma vez concluída a adição, aqueceu-se a mistura reaccional amarela-alaranjada até refluxo durante 20 horas. Após este período, adicionou-se 167 mL de HC1 4 N (Atenção: libertação de HCN nesta altura!) gota a gota através do funil de carga à mistura reaccional ainda em refluxo. A mistura reaccional mudou de cor para um laranja dourado pálido. Substituiu-se então o condensador por um "take-off" e eliminou-se 1,5 L de metanol por destilação enquanto se adicionava simultaneamente 1,5 L de água ao balão através do funil, de acordo coma velocidade de destilação. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura 167 ΡΕ0973791 ambiente e extraiu-se duas vezes com aliquotas de 2,25 L de cloreto de metileno. Lavou-se sucessivamente os extractos reunidos com aliquotas de 750 mL de solução saturada de NaCl fria, NaOH IN e novamente com NaCl saturado. Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de sódio dum dia para o outro, filtrou-se e reduziu-se em volume até -250 mL in vacuo. Adicionou-se tolueno (300 mL) e eliminou-se o cloreto de metileno remanescente sob pressão reduzida, no decurso do qual o produto começou a surgir nas paredes do balão como um sólido branco. Arrefeceu-se o conteúdo do balão dum dia para o outro e retirou-se o sólido por filtração. Lavou-se com 250 mL de tolueno e duas vezes com aliquotas de 250 mL de éter e secou-se num funil de vácuo para dar 58,49 g de sólido branco que estava 97,3% puro por HPLC. Ao concentrar as águas-mães, obteve-se mais 6,76 g de produto com 77,1% de pureza. O rendimento total, ajustado para a pureza, foi de 78%.

Exemplo 23

Esquema 1: Passo 3B: Conversão de 12cc,17a-Di-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona em 17a-Hidroxi-lla-(metilsulfonil)-oxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hi- drogénio, γ-Lactona. Muniu-se um balão de quatro tubuladuras de 5 L como no exemplo anterior, à excepção de não se ter instalado qualquer sistema de armadilhas para além do borbulhador. Adicionou-se uma quantidade de 138, 70 g de 168 ΡΕ0973791 hidroxiéster ao balão, seguido de 1425 mL de cloreto de metileno, com agitação sob azoto. Arrefeceu-se a mistura reaccional até -5°C utilizando um banho de sal/gelo. Adicionou-se rapidamente cloreto de metanossulfonilo (51,15 g, 0, 447 mole) seguido de adição lenta gota a gota de trietilamina (54,37 g) em 225 mL de cloreto de metileno. A adição, que requereu ~30 minutos, foi ajustada para que a temperatura da reacção nunca subisse acima de cerca de 5°C. Prosseguiu-se a agitação durante 1 hora após adição e transferiu-se o conteúdo da reacção para uma ampola de decantação de 12 L, à qual se adicionou 2100 mL de cloreto de metileno. Lavou-se sucessivamente a solução com aliquotas de 700 mL de cada um de HC1 IN frio, NaOH IN e solução aquosa saturada de NaCl. Reuniu-se as lavagens aquosas e reextraiu-se com 3500 mL de cloreto de metileno. Reuniu-se todas as lavagens orgânicas num jarro de 9 L, ao qual se adicionou 500 g de alumina neutra, grau de actividade II, e 500 g de sulfato de sódio anidro. Misturou-se bem o conteúdo do jarro durante 30 minutos e filtrou-se. Levou-se o filtrado à secura in vacuo para dar uma espuma amarela gomosa. Dissolveu-se esta em 350 mL de cloreto de metileno e adicionou-se, gota a gota, 1800 mL de éter sob agitação. A velocidade de adição foi ajustada para que se adicionasse cerca de metade do éter ao longo de 30 minutos. Depois de se ter adicionado cerca de 750 mL, o produto começou a separar-se como um sólido cristalino. Adicionou-se o éter remanescente em 10 minutos. Retirou-se o sólido por filtração e lavou-se o bolo de filtração com 2 L de éter e secou-se numa estufa de vácuo a 50°C dum dia para o outro, para dar 144,61 g (88%) de um sólido quase 169 ΡΕ0973791 branco, p.f. 149°-150°C. O material preparado deste modo é tipicamente 98-99% puro por HPLC (% de área) . Num ensaio obteve-se material possuindo um ponto de fusão de 153o-153,5°C, com uma pureza, como determinada pela área de HPLC, de 99,5%.

Exemplo 24

Esquema 1: Passo 3C: Método A: Preparação de 17a-Hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Muniu-se um balão de quatro tubuladuras de 1 L como no segundo exemplo. Adicionou-se ácido fórmico (250 mL) e anidrido acético (62mL) ao balão com agitação sob azoto. Adicionou-se formato de potássio (6,17 g) e aqueceu-se a mistura reaccional com um banho de óleo até uma temperatura interna de 40°C (isto foi posteriormente repetido a 70°C com resultados melhores) durante 16 horas. Após 16 horas, adicionou-se o mesilato _5 e aumentou-se a temperatura interna para 100°C. Prosseguiu-se o aquecimento e agitação durante 2 horas, após o que o solvente foi eliminado in vacuo numa evaporador rotativo. Agitou-se o resíduo com 500 mL de água gelada durante quinze minutos, extraiu-se então duas vezes com alíquotas de 500 mL de acetato de etilo. Reuniu-se as fase orgânicas e lavou-se sucessivamente com alíquotas de 250 mL de solução saturada de cloreto de sódio fria (duas vezes), solução de hidróxido de sódio IN e novamente com cloreto de sódio saturado. Secou-se então a fase orgânica sobre sulfato de sódio, 170 ΡΕ0973791 filtrou-se e levou-se à secura in vacuo para dar uma espuma branca amarelada, que se pulverizava numa forma vítrea quando tocada com a espátula. O pó que se formou, 14,65 g, foi analisado como uma mistura de 82,1% de 6 7,4% de 8 e 5,7% de 9 (% de área por HPLC).

Exemplo 25

Esquema 1: Passo 3C: Método B: Preparação de 17a-Hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Muniu-se um balão de quatro tubuladuras de 5 L como no exemplo anterior e adicionou-se 228,26 g de ácido acético e 41,37 g de acetato de sódio com agitação sob azoto. Utilizando um banho de óleo, aqueceu-se a mistura até uma temperatura interna de 100°C. Adicionou-se o mesilato (123,65 g) e prosseguiu-se o aquecimento durante trinta. No final deste período, parou-se o aquecimento e adicionou-se 200 mL de água gelada. A temperatura desceu até 40°C e prosseguiu-se a agitação durante 1 hora, após o que a mistura reaccional foi vertida lentamente para 1,5 L de água fria num, balão de 5 L mantido sob agitação. O produto separou-se como um óleo gomoso. Dissolveu-se o óleo em 1 L de acetato de etilo e lavou-se com 1 L de cada de solução saturada de cloreto de sódio fria, hidróxido de sódio 1 N e finalmente, mais uma vez, cloreto de sódio saturado. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e filtrou-se. Levou-se o filtrado à secura in vacuo para dar 171 ΡΕ0973791 uma espuma que colapsou num óleo gomoso. Triturou-se este com éter durante algum tempo e eventualmente solidificou. Filtrou-se o sólido e lavou-se com mais éter para proporcionar 79,59 g de um sólido branco amarelado. Este consistia de 70,4% do Δ9'11 enéster 6 desejado, 12,3% do Δ11'12 enéster _8, 10,8% da 7-a, 9-a-lactona 9 e 5,7% de 5 por reagir.

Exemplo 26

Esquema 1: Passo 3D: Síntese de 9,lla-Epoxi-17a-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Muniu-se um reactor encamisado de 4 tubuladuras de 500 mL com agitador mecânico, condensador/borbulhador, termómetro e funil de carga com tubo de entrada de azoto. Carregou-se o reactor com 8,32 g do enéster em bruto em 83 mL de cloreto de metileno, com agitação sob azoto. A este adicionou-se 4,02 g de fosfato de potássio dibásico, seguido de 12 mL de tricloroacetonitrilo. Passou-se água de arrefecimento externo através da camisa do reactor e arrefeceu-se a mistura reaccional até co o O > O funil de carga adicionou -se 36 mL de peróxido de hidrogénio a 30% ao longo de um período de 10 minutos. A mistura reaccional inicialmente amarela pálida ficou praticamente incolor no final da adição. A mistura reaccional permaneceu a 9±1°C ao longo da adição e durante a agitação contínua dum dia para o outro (23 horas no total). Adicionou-se Cloreto de 172 ΡΕ0973791 metileno (150 mL) à mistura reaccional e adicionou-se o conteúdo total a -250 mL de água gelada. Extraiu-se este três vezes com aliquotas de 150 mL de cloreto de metileno. Lavou-se os extractos de cloreto de metileno reunidos com 400 mL de solução de sulfito de sódio a 3% fria para decompor qualquer peróxido residual. Esta foi seguida de uma lavagem de 330 mL com hidróxido de sódio 1 N frio, uma lavagem de 400 mL com ácido clorídrico 1 N frio e finalmente uma lavagem com 400 mL de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, filtrou-se e lavou-se o bolo de filtração com 80 mL de cloreto de metileno. Eliminou-se o solvente in vacuo para dar 9,10 g de produto em bruto como um sólido amarelo pálido. Este foi recristalizado de -25 mL de 2-butanona para dar 5,52 g de cristais quase brancos. Uma recristalização final de acetona (-50 mL) deu 3,16 g de cristais aciculares, compridos, p.f. 241-243°C.

Exemplo 27

Esquema 1: Passo 3: Opção 1: De 4'S(4'a),7'a-Hexadeca-hidro-11'a-hidroxi-10'β,13'P-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furano-2(3Η),17'β-[4,7]metano[17H]ciclopen-ta[a]fenantreno]-5'β(2'H)-carbonitrilo para 9,lla-Epoxi-17a-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona.

Carregou-se a dicetona (20 g) para um reactor limpo e seco seguida da adição de 820 ml de MeOH e 17,6 ml 173 ΡΕ0973791 de solução de NaOMe a 25%/MeOH. Aqueceu-se a mistura reaccional até refluxo (-67°C) durante 16-20 horas. Desactivou-se o produto com 40 mL de HC1 4N. Eliminou-se o solvente à pressão atmosférica por destilação. Adicionou-se 100 mL de tolueno e eliminou-se o metanol residual por destilação azeotrópica com tolueno. Após concentração, dissolveu-se o hidroxiéster _4 em bruto em 206 mL de cloreto de metileno e arrefeceu-se até 0°C. Adicionou-se cloreto de metanossulfonilo (5 mL) seguido de uma adição lenta de 10,8 ml de trietilamina. Agitou-se o produto durante 45 minutos. Eliminou-se o solvente por destilação sob vácuo para dar o mesilato _5 em bruto.

Num reactor seco separado adicionou-se 5,93 g de formato de potássio, 240 mL de ácido fórmico e seguido de 118 mL de anidrido acético. Aqueceu-se a mistura até 70°C durante 4 horas.

Adicionou-se a mistura de ácido fórmico à solução concentrada de mesilato _5 preparada acima. Aqueceu-se a mistura até 95-105°C durante 2 horas. Arrefeceu-se a mistura do produto até 50°C e eliminou-se os componentes voláteis por destilação sob vácuo a 50°C. Partilhou-se o produto entre 275 ml de acetato de etilo e 275 ml de água. Reextraiu-se a camada aquosa com 137 ml de acetato de etilo, lavou-se com 240 ml de solução de hidróxido de sódio 1 N fria e depois 120 ml de NaCl saturado. Após separação das fases, concentrou-se a camada orgânica por destilação sob vácuo para dar o enéster em bruto. 174 ΡΕ0973791

Dissolveu-se o produto em 180 ml de cloreto de metileno e arrefeceu-se a 0 até 15°C. Adicionou-se 8,68 g de hidrogenofosfato de dipotássio seguido de 2,9 ml de tricloroacetonitrilo. Adicionou-se 78 mL de uma solução de peróxido de hidrogénio a 30% à mistura ao longo de um periodo de 3 minutos. Agitou-se a mistura reaccional a 0-15°C durante 6-24 horas. Após a reacção, separou-se a mistura de duas fases. Lavou-se a camada orgânica com 126 ml de solução de sulfito de sódio a 3%, 126 ml de solução de sódio hidróxido 0,5 N, 126 ml de ácido clorídrico 1 N e 126 ml de solução aquosa de cloreto de sódio a 10%. Secou-se o produto sobre sulfato de magnésio anidro ou filtrou-se sobre Celite e eliminou-se o solvente cloreto de metileno por destilação à pressão atmosférica. O produto foi cristalizado duas vezes de metiletilcetona para dar 7,2 g de eplerenona.

Dicetona

175 ΡΕ0973791

Exemplo 28

Esquema 1: Passo 3: Opção 2: Conversão de 1' S(4 ' a), 7'a-Hexadeca-hidro-11'a-hidroxi-10'β,13'β-dimetil-3', 5,20'-trioxoespiro[furano-2(3Η),17'β-[4,7]metano[17H]ci-clopenta [a]fenantreno]-5'β(2Ή)-carbonitrilo em 9,11a-Epoxi-17a-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona sem intermediário.

Muniu-se um balão de fundo redondo de 4 tubuladuras de 5 L com agitador mecânico, funil de carga com tubo de entrada de azoto, termómetro e condensador com borbulhador conectado a um filtro com hipoclorito de sódio. Adicionou-se a dicetona (83,20 g) ao balão em 3,05 L de metanol. Carregou-se o funil de carga com 67,85 g de uma solução de metóxido de sódio a 25% (p:p) em metanol. Com agitação sob azoto, adicionou-se gota a gota o metóxido ao balão ao longo de um período de 15 minutos. Formou-se uma suspensão laranja/amarela escura. Aqueceu-se a mistura reaccional até refluxo durante 20 horas e adicionou-se, gota a gota, 175 mL de ácido clorídrico 4 N enquanto se prosseguia o refluxo. (Atenção: libertação de HCN durante esta operação!) Substituiu-se o condensador de refluxo por um "take-off" e eliminou-se 1,6 L de metanol por destilação ao mesmo tempo que se adicionava, gota a gota, 1,6 L de solução aquosa de cloreto de sódio a 10% através do funil, a uma velocidade de modo a igualar a velocidade de destilação. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e extraiu-se duas vezes com 2,25 L de alíquotas de cloreto de metileno. Lavou-se os extractos 176 ΡΕ0973791 reunidos com alíquotas de 750 mL de hidróxido de sódio 1 N frio e solução saturada de cloreto de sódio. Secou-se a camada orgânica por destilação azeotrópica do metanol a uma atmosfera, até um volume final de 1 L (retirou-se 0,5% do total para análise).

Adicionou-se a solução orgânica concentrada (hidroxiéster) de novo para o balão reaccional original munido como atrás, mas sem a armadilha de HCN. Arrefeceu-se o balão até 0°C e adicionou-se 30,7 g cloreto de metanos-sulfonilo com agitação sob azoto. Carregou-se o funil de carga com 32,65 g de trietilamina, que foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 15 minutos, mantendo a temperatura a 5°C. Prosseguiu-se a agitação durante 2 horas, enquanto a mistura reaccional aquecia até à temperatura ambiente. Preparou-se uma coluna consistindo de 250 g de resina de troca iónica ácida Dowex 50 w x 8-100 e lavou-se antes de ser utilizada com 250 mL de água, 250 mL de metanol e 500 mL de cloreto de metileno. Correu-se a mistura reaccional ao longo desta coluna e recolheu-se. Preparou-se uma nova coluna e repetiu-se o processo acima. Preparou-se uma terceira coluna de 250 g, consistindo de resina de troca iónica Dowex 1 x 8-200 básica e pré-tratou-se como no tratamento da resina ácida descrito acima. Correu-se a mistura reaccional ao longo desta coluna e recolheu-se. Preparou-se uma quarta coluna da resina básica e correu-se novamente a mistura reaccional ao longo da coluna e recolheu-se. Cada passagem pela coluna foi seguida de duas lavagens com 250 mL de cloreto de metileno, e cada passagem requereu ~10 minutos. Reuniu-se as lavagens de 177 ΡΕ0973791 solvente com a mistura reaccional e reduziu-se o volume em vacuo até -500 mL e retirou-se 2% desta para qc. O remanescente foi reduzido ainda mais até um volume final de 150 mL (solução de mesilato em bruto). À montagem reaccional de 5 L original adicionou-se 960 mL de ácido fórmico, 472 mL de anidrido acético e 23,70 g de formato de potássio. Aqueceu-se esta mistura com agitação sob azoto até 70°C durante 16 horas. Aumentou-se em seguida a temperatura até 100°C e adicionou-se a solução de mesilato em bruto ao longo de um período de trinta minutos via o funil de carga. A temperatura desceu para 85°C à medida que o cloreto de metileno destilava da mistura reaccional. Depois de ter sido todo removido, a temperatura subiu de novo para 100°C e manteve-se ali durante 2,5 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até 40°C e eliminou-se o ácido fórmico sob pressão até ter sido atingido o volume mínimo de agitação (-150 mL) . Arrefeceu-se o resíduo até à temperatura ambiente e adicionou-se 375 mL de cloreto de metileno. Lavou-se o resíduo diluído com porções de 1 L de solução saturada de cloreto de sódio fria, carbonato de sódio 1 N e novamente com solução de cloreto de sódio. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio (150 g) e filtrou-se para dar uma solução castanha-avermelhada escura (solução de enéster em bruto).

Muniu-se um reactor encamisado de 4 tubuladuras de 1 L com agitador mecânico, condensador/borbulhador, termómetro e funil de carga com tubo de entrada de azoto. Carregou-se o reactor com a solução de enéster em bruto 178 ΡΕ0973791 (estimado: 60 g) em 600 mL de cloreto de metileno, com agitação sob azoto. A esta adicionou-se 24,0 g de fosfato de potássio dibásico, seguido de 87 mL de tricloroacetoni-trilo. Passou-se água de arrefecimento externo através da camisa do reactor e arrefeceu-se a mistura reaccional até 10°C. Através do funil de carga adicionou-se 147 mL de mistura de 30% peróxido de hidrogénio ao longo de um período de 30 minutos. A mistura reaccional inicialmente castanha avermelhada escura ficou amarela pálida no final da adição. A mistura reaccional permaneceu a 10±1°C ao longo da adição e durante a agitação contínua dum dia para 0 outro (23 horas no total). Separou-se as fases e extraiu-se a parte aquosa duas vezes com porções de 120 mL de cloreto de metileno. Lavou-se então as fases orgânicas reunidas com 210 mL de solução de sulfito de sódio a 3%. Repetiu-se uma segunda vez, após o que as partes orgânica e aquosa deram negativas quanto à presença de peróxido pelo papel indicador de amido/iodeto. Lavou-se sucessivamente a fase orgânica com alíquotas de 210 mL de hidróxido de sódio 1 N frio, ácido clorídrico 1 N e finalmente duas lavagens com solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Secou-se azeotropicamente a fase orgânica até um volume de -100 mL, adicionou-se solvente fresco (250 mL e destilou-se azeotropicamente até aos mesmos 100 mL e eliminou-se o solvente remanescente in vacuo para dar 57,05 g de produto em bruto como uma espuma amarela gomosa. Secou-se ainda mais uma porção (51,01 g) até um peso constante de 44,3 g e analisou-se quantitativamente por HPLC. Foi doseado a 27,1% de epx . 179 ΡΕ0973791

Exemplo 29

Carregou-se lla-hidroxiandrostenodiona (429,5 g) e hidrato do ácido toluenossulfónico (7,1) ao balão reaccional sob azoto. Adicionou-se etanol (2,58 L) ao reactor, e arrefeceu-se a solução resultante até 5°C. Adicionou-se ortoformato de trietilo (334,5 g) à solução ao longo de um período de 15 minutos a 0o até 15°C. Uma vez concluída a adição de ortoformato de trietilo aqueceu-se a mistura reaccional até 40°C e fez-se reagir a essa temperatura durante 2 horas, após o que a temperatura foi aumentada até refluxo e prosseguiu-se a reacção sob refluxo durante mais 3 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional sob vácuo e eliminou-se o solvente sob vácuo para produzir 3-etoxiandrosta-3,5-dieno-17-ona.

Exemplo 30 - Formação de Enamina a partir de lla-hidroxi-canrenona O o

Colocou-se cianeto de sódio (1,72 g) num balão de 3 tubuladuras de 25 mL com um agitador mecânico. Adicionou- 180 ΡΕ0973791 se água (2,1 mL) e agitou-se a mistura sob aquecimento até os sólidos se dissolverem. Adicionou-se dimetilformamida (15 mL) seguida de lla-hidroxicanrenona (5,0 g) . Adicionou-se uma mistura de água (0,4 mL) e ácido sulfúrico (1,49 g) à mistura. Aqueceu-se a mistura até 85°C durante 2,5 horas altura em que a análise por HPLC mostrou uma conversão completa no produto. Arrefeceu-se a mistura reaccional até temperatura ambiente. Adicionou-se ácido sulfúrico (0,83 g) e agitou-se a mistura durante meia hora. Adicionou-se a mistura reaccional a 60 mL de água arrefecida num banho de gelo. Lavou-se o balão com 3 mL de dmf e 5 mL água. Agitou-se a suspensão durante 40 min. e filtrou-se. Lavou-se o bolo de filtração duas vezes com 40 mL de água e secou-se numa estufa de vácuo a 60°C dum dia para o outro para produzir a lla-hidroxi-enamina, i.e., 5'R(5'a),7'β- 20'-amino-hexadeca-hidro-11'β-hidroxi-lO'a,13'a-dimetil-3 ', 5-dioxoespiro [f urano-2 (3 Η), 17'ot(5'H)-[7, 4] meteno [4H] - ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo (4,9 g).

Exemplo 31 - Conversão de lla-hidroxicanrenona em Dicetona

181 ΡΕ0973791

Adicionou-se cianeto de sódio (1,03 g) a um balão de 3 tubuladuras de 50 mL munido com um agitador mecânico. Adicionou-se água (1,26 mL) e aqueceu-se ligeiramente o balão para dissolver o sólido. Adicionou-se dimetilacetamida [ou dimetilformamida] (9 mL) seguido de lla-hidroxicanre-nona (3,0 g) . Adicionou-se uma mistura de ácido sulfúrico (0,47 mL) e água (0,25 mL) ao balão reaccional enquanto se agitava. Aqueceu-se a mistura até 95°C durante 2 horas. A análise por HPLC indicou que a reacção estava concluída. Adicionou-se ácido sulfúrico (0,27 mL) e agitou-se a mistura durante 30 min. Introduziu-se mais água (25 mL) e ácido sulfúrico (0,90 mL) e agitou-se a mistura reaccional durante 16 horas. Arrefeceu-se então a mistura num banho de gelo até 5-10°C. Isolou-se o sólido por filtração através de um filtro de vidro sinterizado seguido de duas lavagens com água (20 mL). Secou-se a dicetona sólida, i.e., 4 ' S(4 ' a), 7'a-Hexadeca-hidro-lla-hidroxi-10'β,13'β-dimetil-3', 5,20'-trioxoespiro[furano-2(3H),17'β-[4,7]metano[17H]ci-clopenta[a]fenantreno]-5'β(2'H)-carbonitrilo numa estufa de vácuo para produzir 3,0 g de um sólido.

Exemplo 32

Aqueceu-se uma suspensão de 5,0 g da dicetona produzida do modo descrito no Exemplo 31 em metanol (100 mL) até refluxo e adicionou-se uma solução de metóxido de potássio em metanol a 25% (5,8 mL) ao longo de 1 min. A mistura ficou homogénea. Após 15 min. estava presente um precipitado. Aqueceu-se a mistura a refluxo e ficou 182 ΡΕ0973791 novamente homogénea após cerca de 4 horas. Prosseguiu-se o aquecimento a refluxo durante um total de 23,5 horas e adicionou-se HC1 4,0 N (10 mL) . Eliminou-se um total de 60 ml de uma solução de cianeto de hidrogénio em metanol por destilação. Adicionou-se água (57 mL) ao residuo de destilação ao longo de 15 min. Aumentou-se a temperatura da solução até 81,5°C durante a adição de água e eliminou-se mais 4 ml de solução de cianeto de hidrogénio/metanol por destilação. Uma vez concluída a adição de água, a mistura ficou turva e retirou-se a fonte de aquecimento. Agitou-se a mistura durante 3,5 horas e o produto cristalizou lentamente. Filtrou-se a suspensão e lavou-se o sólido recolhido com água, secou-se numa corrente de ar no funil, e secou-se a 92°C (26 polegadas de Hg) durante 16 horas para dar 2,98 g de um sólido esbranquiçado. O sólido era 91,4% do hidroxiéster, i.e., 11a, 17a-di-hidroxi-3-oxo- pregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona, em peso. O rendimento foi de 56,1%.

Exemplo 33

Carregou-se dicetona preparada do modo descrito no Exemplo 31 num balão reaccional de 3 tubuladuras limpo e seco munido com um termómetro, uma armadilha de Dean Stark e um agitador mecânico. Carregou-se metanol (24 mL) no reactor à temperatura ambiente (22°C) e agitou-se a suspensão resultante durante 5 min. Carregou-se uma solução de metóxido de sódio em metanol a 25% em peso (52,8 mL) no reactor e agitou-se a mistura durante 10 min. à temperatura 183 ΡΕ0973791 ambiente no decurso do que a mistura reaccional ficou uma solução transparente castanha clara e observou-se uma ligeira exotérmica (2-3°C). Controlou-se a velocidade de adição para evitar que a temperatura do recipiente ultrapasse os 30°C. Subsequentemente aqueceu-se a mistura até refluxo (cerca de 67°C) e prosseguiu-se sob refluxo durante 16 h. Retirou-se uma amostra e analisou-se por HPLC quanto à conversão. Prosseguiu-se a reacção sob refluxo até a dicetona residual não ser superior a 3% da carga de dicetona. Durante o refluxo adicionou-se HC1 4 N (120 mL) ao recipiente reaccional originando a produção de hcn que foi desactivado num filtro.

Uma vez concluída a reacção, destilou-se 90-95% do solvente metanol da mistura reaccional à pressão atmosférica. A temperatura de cabeça durante a destilação variou de 67-75°C e o destilado que continha HCN foi tratado com soda cáustica e lixívia antes de ser rejeitado. Após a remoção de metanol arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente, tendo começado a precipitar um produto sólido à medida que a mistura arrefecia na gama de 40-45°C. Adicionou-se uma solução aquosa contendo opcionalmente bicarbonato de sódio a 5% em peso (1200 mL) a 25°C à suspensão arrefecida e arrefeceu-se em seguida a mistura resultante até 0°C em cerca de 1 h. O tratamento com bicarbonato de sódio foi eficaz para eliminar a dicetona residual por reagir da mistura reaccional. Agitou-se a solução a 0°C durante 2 h. para completar a precipitação e cristalização após o que se recuperou o 184 ΡΕ0973791 produto sólido por filtração e se lavou o bolo de filtração com água (100 mL). Secou-se o produto a 80-90°C sob 26" de mercúrio até peso constante. O teor de água após secagem foi menor do que 0,25% em peso. O rendimento molar ajustado foi de cerca de 77-80% em peso.

Exemplo 34

Fez-se reagir dicetona preparada segundo o Exemplo 31 (1 eq.) com metóxido de sódio (4,8 eq.) num solvente de metanol na presença de iodeto de zinco (1 eq.). O processamento do produto reaccional pode ser segundo o processo extractivo aqui descrito ou por um processo não extractivo no qual são eliminadas as extracções com cloreto de metileno, as lavagens com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e soda cáustica e os passos de secagem com sulfato de sódio. Também no processo não extractivo, o tolueno foi substituído por solução de bicarbonato de sódio a 5% em peso.

Exemplo 35

Combinou-se o hidroxiéster preparado como no Exemplo 34 (1,97 g) com tetra-hidrofurano (20 mL) e arrefeceu-se a mistura resultante até -70°C. Adicionou-se cloreto de sulfurilo (0,8 mL) e agitou-se a mistura durante 30 min., após o que se adicionou imidazole (1,3 g). Aqueceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e agitou-se durante mais 2 h. Diluiu-se então a mistura com 185 ΡΕ0973791 cloreto de metileno e extraiu-se com água. Concentrou-se a camada orgânica para produzir enéster em bruto (1,97 g) . Uma pequena amostra do produto em bruto foi analisada por HPLC. A análise mostrou que a proporção de 9,11- olefina:11,12-olefina: 7,9-lactona era de 75,5:7,2:17,3. Quando realizada a 0°C mas nas restantes condições descritas acima, a reacção produziu um produto no qual a distribuição 9,11-olefina: 11,12-olefina: 7,9-lactona era de 77,6:6,7:15,7. Este procedimento combina num único passo a introdução de um grupo de saida e a eliminação deste para introduzir a estrutura 9,11-olefina do enéster, i.e., a reacção com cloreto de sulfurilo leva à substituição do grupo lla-hidroxilo do hidroxiéster de Fórmula V por halogeneto e esta é seguida de desidro-halogenação à estrutura Δ-9,11. Deste modo, a formação do enéster é efectuada sem se utilizar um ácido forte (tal como ácido fórmico) ou um agente de secagem tal como anidrido acético. É também eliminado o passo de refluxo do processo alternativo que produz monóxido de carbono.

Exemplo 36

Adicionou-se o hidroxiéster (20 g) preparado como no Exemplo 34 e cloreto de metileno (400 mL) a um balão de fundo redondo de três tubuladuras limpo e seco munido com um agitador mecânico, funil de carga e termopar. Agitou-se a mistura resultante à temperatura ambiente até se obter uma solução completa. Arrefeceu-se a solução até 5°C utilizando um banho de gelo. Adicionou-se cloreto de metanos- 186 ΡΕ0973791 sulfonilo (5 mL) à solução de CH2CI2 contendo o hidroxi-éster, rapidamente seguido da adição lenta, gota a gota, de trietilamina (10,8 mL). A velocidade de adição foi ajustada para que a temperatura da reacção não excedesse os 5°C. A reacção era muito exotérmica; pelo que foi necessário arrefecer. Agitou-se a mistura reaccional a cerca de 5°C durante 1 h. Uma vez concluída a reacção (análise por HPLC e TLC), concentrou-se a mistura a cerca de 0°C sob 26 polegadas de Hg formando-se uma suspensão espessa. Diluiu-se a suspensão resultante com CH2C12 (160 mL), e concentrou-se a mistura a cerca de 0°C sob 26 polegadas de Hg para se obter um concentrado. A pureza do concentrado (produto mesilato de Fórmula IV em que R3=H e -A-A- e -B-B- são ambos -CH2-CH2-, i.e., 11a,17a-di-hidroxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona para 17a-hidroxi-lla-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona foi determinada como sendo de 82% (% de área de HPLC). Este material foi utilizado na reacção seguinte sem ser isolado.

Adicionou-se formato de potássio (4,7 g), ácido fórmico (16 mL) e anidrido acético (8 mL, 0, 084 mol) a um reactor limpo, seco munido com um agitador mecânico, condensador, termopar e manta de aquecimento. Aqueceu-se a solução resultante até 70°C e agitou-se durante cerca de 4-8 horas. A adição de anidrido acético é exotérmica e produz gás (CO), pelo que a velocidade de adição tem de ser ajustada para controlar a temperatura e a produção de gás (pressão). O tempo de reacção para preparar o reagente de 187 ΡΕ0973791 eliminação activo dependia da quantidade de água presente na reacção (os ácido fórmico e formato de potássio continham cerca de 3-5% de água). A reacção de eliminação é sensível à quantidade de água presente; se existir >0,1% de água (KF), o nível da impureza 7,9-lactona pode ser aumentada. Este produto secundário é difícil de eliminar do produto final. Quando o KF mostrou <0,1% de água, transferiu-se o agente de eliminação activo para o concentrado de mesilato (0,070 mol) preparado no passo anterior. Aqueceu-se a solução resultante até 95°C e destilou-se o material volátil e recolheu-se numa armadilha de Dean Stark. Quando parou a libertação de material volátil, substituiu-se a armadilha de Dean Stark pelo condensador e aqueceu-se a mistura reaccional durante mais lha 95°C. Após conclusão (análises por TLC e HPLC; <0,1% de material de partida) arrefeceu-se o conteúdo até 50°C e começou-se a destilação sob vácuo (26 polegadas de Hg/50°C). Concentrou-se a mistura até uma suspensão espessa e arrefeceu-se em seguida até à temperatura ambiente. Diluiu-se a suspensão resultante com acetato de etilo (137 mL) e agitou-se a solução durante 15 min. e diluiu-se com água (137 mL) . Separou-se as camadas e reextraiu-se a camada inferior aquosa com acetato de etilo (70 mL). Lavou-se uma vez a solução combinada de acetato de etilo com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (120 mL) e duas vezes com solução de NaOH IN gelada (120 mL cada). Mediu-se o pH da fase aquosa e lavou-se novamente a camada orgânica se o pH das águas de lavagem usadas fosse <8. Quando o pH da lavagem foi >8, lavou-se a camada de acetato de etilo 188 ΡΕ0973791 uma vez com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (120 mL) e concentrou-se até à secura por evaporação rotativa utilizando um banho-maria a 50°C. O produto sólido enéster resultante, i.e., 17a-hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7a,21-dicarboxilato de metilo e hidrogénio, γ-Lactona pesava 92 g (rendimento molar de 77%).

Exemplo 37

Introduziu-se o hidroxiéster (100 g; 0,22 mol) preparado como no Exemplo 34 num balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 2 L munido com agitador mecânico, funil de carga e termopar. Utilizou-se um banho de arrefecimento de circulação com controlo automático de temperatura. Secou-se o balão antes da reacção devido à sensibilidade do cloreto de metanossulfonilo à água.

Carregou-se cloreto de metileno (1 L) no balão e dissolveu-se ali o hidroxiéster sob agitação. Arrefeceu-se a solução até 0°C e adicionou-se cloreto de metanossul-fonilo (25 mL; 0,32 mol) ao balão através do funil de carga. Adicionou-se trietilamina (50 mL; 0,59 mol) ao reactor através do funil de carga e lavou-se o funil com mais cloreto de metileno (34 mL) . A adição de trietilamina foi extremamente exotérmica. O tempo de adição foi de cerca de 10 min. sob agitação e arrefecimento. Arrefeceu-se a mistura da carga até 0°C e manteve-se a esta temperatura sob agitação durante mais 45 min. durante os quais o espaço de cabeça do balão reaccional foi purgado com azoto. 189 ΡΕ0973791

Analisou-se então uma amostra da mistura reaccional por cromatografia em camada fina e cromatografia liquida de alta eficiência para verificar a conversão da reacção. Subsequentemente agitou-se a mistura a 0°C durante mais 30 min. e verificou-se novamente a conversão da reacção. A análise mostrou que a reacção estava essencialmente concluída nesta altura; eliminou-se o solvente cloreto de metileno a 0°C sob vácuo a 26" de mercúrio. A análise por cromatografia em fase gasosa do destilado indicou a presença de cloreto de metanossulfonilo e trietilamina. O cloreto de metileno (800 mL) foi subsequentemente transferido para o reactor e a mistura resultante foi agitada durante 5 min. a uma temperatura na gama de 0-15°C. Eliminou-se novamente o solvente a 0-5°C sob vácuo a 26" de mercúrio para proporcionar o mesilato de Fórmula IV em que R3 é H, -A-A- e -B-B- são -CH2-CH2- e R1 é metoxicarbonilo. A pureza do produto foi de cerca de 90-95% em área.

Para preparar um reagente de eliminação, misturou-se formato de potássio (23,5 g; 0,28 mol), ácido fórmico (80 mL) e anidrido acético (40 mL) num reactor separado, seco. O ácido fórmico e o anidrido acético foram bombeados para o reactor e manteve-se a temperatura não superior a 40°C durante a adição de anidrido acético. Aqueceu-se a mistura do reagente de eliminação até 70°C para purgar a água do sistema reaccional. Prosseguiu-se esta reacção até o teor de água ser inferior a 0,3% em peso como medido através de análise por Karl Fisher. Transferiu-se então a solução do reagente de eliminação para o reactor 190 ΡΕ0973791 contendo solução concentrada de mesilato em bruto preparada como descrito acima. Aqueceu-se a mistura resultante até à temperatura máxima de 95°C e recolheu-se o destilado volátil até não se gerar mais destilado. A destilação parou a cerca de 90°C. Uma vez concluída a destilação, agitou-se a mistura reaccional a 95°C durante mais 2 h. e verificou-se o grau de conclusão da reacção por cromatografia em camada fina. Quando a reacção estava concluída, arrefeceu-se o reactor até 50°C e eliminou-se o ácido fórmico e o solvente da mistura reaccional sob vácuo a 26" de mercúrio a 50°C. Arrefeceu-se o concentrado até à temperatura ambiente e introduziu-se subsequentemente acetato de etilo (688 mL) e agitou-se a mistura de acetato de etilo e concentrado durante 15 min. Nesta altura, introduziu-se uma solução aquosa de cloreto de sódio a 12% (688 mL) para ajudar a eliminar as impurezas solúveis em água da fase orgânica. Deixou-se então que as fases repousassem durante 20 min. Transferiu-se a camada aquosa para outro recipiente ao qual se adicionou uma quantidade adicional de acetato de etilo (350 mL) . Esta reextracção da camada aquosa foi realizada durante 30 min. após o que se deixou as fases repousar e reuniu as camadas de acetato de etilo. Às camadas de acetato de etilo combinadas, adicionou-se solução saturada de cloreto de sódio (600 mL) e agitou-se durante 30 min. Deixou-se então que as fases repousassem. Eliminou-se a camada aquosa. Efectuou-se uma lavagem adicional com cloreto de sódio (600 mL) . Separou-se a fase orgânica da segunda água de lavagem. Lavou-se então a fase orgânica com hidróxido de sódio 1 N (600 mL) sob agitação durante 30 min. Deixou-se as fases repousar durante 30 min. 191 ΡΕ0973791 para eliminar a camada aquosa. Verificou-se o pH da camada aquosa e determinou-se ser >7. Realizou-se mais uma lavagem com cloreto de sódio saturado (600 mL) durante 15 min. Concentrou-se finalmente a fase orgânica sob vácuo a 26" de mercúrio a 50°C e recuperou-se o produto por filtração. O produto final era um sólido castanho espumoso quando seco. A secagem adicional a 45°C sob pressão reduzida durante 24 h. produziu 95,4 g do produto enéster com uma pureza de 68,8%. O rendimento molar foi de 74,4% corrigido para o hidroxiéster de partida e o enéster final.

Exemplo 38

Repetiu-se o procedimento do Exemplo 37 à excepção de se ter evitado os passos de lavagem múltiplos tratando a solução reaccional com uma resina de troca iónica. Alumina básica ou sílica básica. As condições para tratamento com sílica básica são indicadas no Quadro 38. Cada um destes tratamentos foi determinado ser eficaz na eliminação de impurezas sem as lavagens múltiplas do Exemplo 44. QUADRO 38 Factor Referência Objectivo da Experiência Resultados chave Alumina básica 2g/125g de produto Tratar a mistura reaccional com alumina básica para eliminar o sal Et3N.HCl e para eliminar as lavagens com NaOH IN e HC1 IN 0 rendimento foi de 93% Sílica básica 2g/125g de produto Tratar a mistura reaccional com sílica básica, a qual é mais barata, para eliminar o sal Et3N.HCl e para eliminar as lavagens com NaOH IN e HC1 IN 0 rendimento foi de 95% 192 ΡΕ0973791

Exemplo 39

Misturou-se acetato de potássio (4 g) e ácido trif luoroacético (42,5 mL) num reactor de 100 mL. Adicionou-se anidrido trifluoroacético (9,5 mL) à mistura a uma velocidade controlada para manter a temperatura durante a adição inferior a 30°C. Aqueceu-se então a solução até 30°C durante 30 min. para proporcionar um reagente de eliminação útil para converter o mesilato de Fórmula IV no enéster de Fórmula II.

Adicionou-se o reagente de eliminação à base de TFA/anidrido TFA pré-peparado a uma solução previamente preparada do mesilato de Fórmula IV. Aqueceu-se a mistura resultante a 40°C durante 4 h., verificando-se periodicamente o grau de conversão por TLC ou HPLC. Uma vez concluída a reacção, transferiu-se a mistura para um balão de 1 tubuladura e concentrou-se até à secura sob pressão reduzida à temperatura ambiente (22°C) . Adicionou-se acetato de etilo (137 mL) à mistura para se obter dissolução completa do material em fase sólida após o que se adicionou uma mistura de água/solução aquosa saturada de cloreto de sódio (137 mL) e agitou a mistura de duas fases resultante durante 10 min. Deixou-se então que as fases se separassem durante 20 min. A concentração da solução aquosa saturada de cloreto de sódio era de 24% em peso. Fez-se contactar a fase aquosa com uma quantidade adicional de acetato de etilo (68 mL) e agitou-se a mistura de duas fases assim separada durante 10 min. após o que se deixou 193 ΡΕ0973791 em repouso durante 15 min para separação das fases. Reuniu-se as camadas de acetato de etilo das duas extracções e lavou-se com solução aquosa saturada de cloreto de sódio a 24% em peso (120 mL), uma outra alíquota de solução aquosa saturada de cloreto de sódio a 24% em peso (60 mL), solução de hidróxido de sódio IN (150 mL) e uma outra porção de solução aquosa saturada de cloreto de sódio (60 mL). Após cada adição de fase aquosa, aqitou-se a mistura durante 10 min. e deixou-se repousar durante 15 min. para separação. Concentrou-se a solução resultante até à secura sob pressão reduzida a 45°C utilizando uma trompa de água. Analisou-se o produto sólido (8,09 g) por HPLC e determinou-se incluir 83,4% de área do enéster, 2,45% de área da 11,12-olefina, 1,5% da 7,9-lactona e 1,1% de mesilato por reagir.

Exemplo 40

Colocou-se o mesilato possuindo a estrutura preparada pelo Exemplo 23 (1,0 g), acetato de isopropenilo (10 g) e ácido p-toluenossulfónico (5 mg) num balão de 50 ml e aqueceu-se até 90 °C sob agitação. Após 5 horas arrefeceu-se a mistura até 25 °C e concentrou-se in vacuo a 10 mm de Hg. Dissolveu-se o residuo em CH2C12 (20 ml) e lavou-se com NaHCCh aquoso a 5%. Concentrou-se a camada de CH2C12 in vacuo para dar 1,47 g de um óleo castanho-amarelado. Este produto foi recristalizado de CH2C12/Et20 para dar 0,50 g de enol acetato de Fórmula IV(Z). 194 ΡΕ0973791

Adicionou-se este material a uma mistura de acetato de sódio (0,12 g) e ácido acético (2,0 ml) que foi previamente aquecida até 100 °C sob agitação. Após 60 minutos arrefeceu-se a mistura até 25 °C e diluiu-se com CH2CI2 (20 ml) . Lavou-se a solução com água (20 ml) e secou-se sobre MgS04. Eliminou-se o agente de secagem por filtração e concentrou-se o filtrado in vacuo para dar 0,4 g da 9,11-olefina desejada, IV(Y). O produto em bruto continha menos do que 2% da impureza 7,9-lactona.

Exemplo 41 - Eliminação térmica de Mesilato em DMSO.

Aqueceu-se uma mistura de 2 g de mesilato e 5 ml de DMSO num balão a 80 °C durante 22,4 horas. A análise por HPLC da mistura reaccional indicou que não havia material de partida. À reacção adicionou-se água (10 ml) e extraiu-se o precipitado três vezes com cloreto de metileno. Lavou-se as camadas de cloreto de metileno reunidas com água, secou-se sobre sulfato de magnésio e concentrou-se para dar o enéster. 195 ΡΕ0973791

Exemplo 42

Num balão de 50 ml em forma de pêra misturou-se sob agitação o enéster de Fórmula IIA (1,07 g com 74,4% de enéster), tricloroacetamida (0,32 g), hidrogenofosfato de dipotássio (0,70 g) na forma de sólido com cloreto de metileno (15,0 mL) . Obteve-se uma solução transparente. Adicionou-se peróxido de hidrogénio (30% em peso; 5,0 mL) via uma pipeta ao longo de um periodo de 1 min.. Agitou-se a mistura resultante durante 6 h. à temperatura ambiente altura em que a análise por hplc mostrou que a proporção de epoximexrenona em relação ao enéster na mistura reaccional era aproximadamente 1:1. Adicionou-se mais tricloroacetamida (0,32 g) à mistura reaccional e prosseguiu-se a reacção sob agitação durante mais 8 horas após o que a proporção remanescente de enéster tinha sido reduzida para 10%. Adicionou-se mais tricloroacetamida (0,08 g) e deixou-se a mistura reaccional repousar dum dia para o outro altura em que restava apenas 5% de enéster por reagir em relação à epoximexrenona na mistura.

Exemplo 43

Adicionou-se o enéster de Fórmula IIA (5,4 g, pureza: 74,4% de enéster) a um reactor de 100 mL.

Adicionou-se tricloroacetamida (4,9 g) e hidrogenofosfato de dipotássio (3,5 g), ambos na forma sólida, ao enéster seguido de cloreto de metileno (50 mL) . Arrefeceu-se a mistura até 15°C e adicionou-se peróxido de hidrogénio a 196 ΡΕ0973791 30% (25 g) ao longo de um período de dez min.. Deixou-se a mistura reaccional chegar até 20°C e agitou-se a essa temperatura durante 6 h., altura em que a conversão foi verificada por HPLC. Determinou-se que o enéster remanescente era inferior a 1% em peso.

Adicionou-se a mistura reaccional a água (100 mL), deixou-se as fases separarem-se, e retirou-se a camada de cloreto de metileno. Adicionou-se hidróxido de sódio (0,5 N; 5 0 mL) à camada de cloreto de metileno. Após 20 min. deixou-se as fases separarem-se, adicionou-se HC1 (0,5 N; 50 mL) à camada de cloreto de metileno após o que se deixou separar as fases e lavou a fase orgânica com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). Secou-se a camada de cloreto de metileno sobre sulfato de magnésio anidro e eliminou-se o solvente. Obteve-se um sólido branco (5,7 g). Acidificou-se a camada aquosa de hidróxido de sódio e extraiu-se, e processou-se o extracto para produzir mais 0,2 g de produto. O rendimento de epoximexrenona foi de 90,2%.

Exemplo 44

Converteu-se o enéster de Fórmula IIA em epoximexrenona do modo descrito no Exemplo 43 com as diferenças seguintes: a carga inicial era constituída por enéster (5,4 g com 74,4% de enéster), tricloroacetamida (3,3 g) e hidrogenofosfato de dipotássio (3,5 g). Adicionou-se solução de peróxido de hidrogénio (12,5 mL) . A reacção foi 197 ΡΕ0973791 realizada dum dia para o outro a 20°C após o que o HPLC mostrou uma conversão de 90% do enéster em epoximexrenona. Adicionou-se mais tricloroacetamida (3,3 g) e peróxido de hidrogénio a 30% (5,0 mL) e realizou-se a reacção durante mais 6 h. altura em que o enéster residual era apenas de 2% com base na carga de enéster. Após processamento como descrito no Exemplo 43, obteve-se 5,71 g de epoximexrenona.

Exemplo 45

Converteu-se o enéster de Fórmula IIA em epoximexrenona do modo geralmente descrito no Exemplo 43. Na reacção deste Exemplo, a carga de enéster foi de 5,4 g (pureza: 74,4% de enéster), a carga de tricloroacetamida foi de 4,9 g, a carga de peróxido de hidrogénio foi de 25 g, a carga de hidrogenofosfato de dipotássio foi de 3,5 g. A reacção foi realizada a 20°C durante 18 h. O enéster residual era menor do que 2%. Após processamento, obteve-se 5,71 g de epoximexrenona.

Exemplo 46

Converteu-se o enéster de Fórmula IIA em epoximexrenona do modo descrito no Exemplo 43 excepto que a temperatura da reacção neste Exemplo era de 28°C. Os materiais carregados no reactor incluíam enéster (2,7 g), tricloroacetamida (2,5 g), hidrogenofosfato de dipotássio (1,7 g), peróxido de hidrogénio (17,0 g) e cloreto de metileno (50 mL) . Após 4 h. de reacção, o enéster por 198 ΡΕ0973791 reagir era apenas de 2% com base na carga de enéster. Após processamento como descrito no Exemplo 43, obteve-se 3,0 g de epoximexrenona.

Exemplo 47

Dissolveu-se o enéster de Fórmula IIA (17 g com 72% de enéster) em cloreto de metileno (150 mL) após o que se adicionou tricloroacetamida (14,9 g) sob agitação lenta. Ajustou-se a temperatura da mistura até 25°C e agitou-se a solução de hidrogenofosfato de dipotássio (10,6 g) em água (10,6 mL) na solução de substrato enéster sob agitação a 400 rpm. Adicionou-se peróxido de hidrogénio (solução a 30% em peso; 69,4 mL) à solução de substrato/fosfato/ tricloroacetamida ao longo de um período de 3-5 min.. Não se observou nenhuma exotérmica ou libertação de oxigénio. Agitou-se a mistura reaccional assim preparada a 400 rpm e 25°C durante 18,5 h. Não se observou nenhuma libertação de oxigénio ao longo do curso da reacção. Diluiu-se a mistura reaccional com água (69,4 mL) e agitou-se a mistura a cerca de 250 rpm durante 15 min. Não foi necessário qualquer controlo de temperatura nesta operação e efectuou-se essencialmente à temperatura ambiente (sendo aceitável qualquer temperatura na gama de 5-25°C). Deixou-se separar as camadas aquosa e orgânica e eliminou-se a camada inferior de cloreto de metileno.

Reextraiu-se a camada aquosa com cloreto de metileno (69,4 mL) durante 15 min. sob agitação a 250 rpm. 199 ΡΕ0973791

Deixou-se separar as camadas e retirou-se a camada inferior de cloreto de metileno. Submeteu-se a camada aquosa (177 g; pH = 7) à determinação de peróxido de hidrogénio. 0 resultado (12,2%) indicando que apenas 0,0434 mol de peróxido de hidrogénio tinham sido consumidas na reacção era de 0,0307 mol de olefina. A reextracção com uma pequena quantidade de cloreto de metileno foi suficiente para garantir que não havia qualquer perda de epoximexrenona na camada aquosa. Este resultado foi confirmado com a aplicação de uma segunda grande extracção de cloreto de metileno na qual apenas foi recuperada tricloroacetamida.

Reuniu-se as soluções de cloreto de metileno combinadas das extracções descritas acima e lavou-se com solução de sulfito de sódio a 3% em peso (122 mL) durante pelo menos 15 min. a cerca de 250 rpm. Observou-se um teste de iodeto de amido negativo (papel Kl; não se observou nenhuma cor; num teste positivo uma coloração púrpura indica a presença de peróxido) no final do período de agitação.

Deixou-se separar as camadas aquosa e orgânica e retirou-se a camada inferior de cloreto de metileno. Rejeitou-se a camada aquosa (pH = 6). Refira-se que a adição de solução de sulfito de sódio pode provocar uma ligeira exotérmica pelo que essa adição deveria ser realizada sob controlo de temperatura.

Lavou-se a fase de cloreto de metileno com 200 ΡΕ0973791 hidróxido de sódio 0,5 N (61 mL) durante 45 min. a cerca de 250 rpm e uma temperatura na gama de 15-25°C (pH = 12-13). Neste processo eliminou-se as impurezas derivadas de tricloroacetamida. A acidificação da fracção aquosa alcalina seguida de extracção do cloreto de metileno confirmou que se perdeu muito pouca epoximexrenona nesta operação.

Lavou-se a fase de cloreto de metileno uma vez com ácido clorídrico 0,1 N (61 mL) durante 15 min. sob agitação a 250 rpm a uma temperatura na gama 15-25°C. Deixou-se em seguida separar as camadas e retirou-se a camada inferior de cloreto de metileno e lavou-se novamente com cloreto de sódio aquoso a 10% em peso (61 mL) durante 15 min a 250 rpm a uma temperatura na gama de 15-25°C. Deixou-se novamente separar as camadas e retirou-se a camada orgânica. Filtrou-se a camada orgânica através de um tampão de Solkafloc e evaporou-se em seguida até à secura sob pressão reduzida. A secagem foi concluída com uma temperatura do banho-maria de 65°C. Obteve-se um sólido esbranquiçado (17,95 g) e submeteu-se a análise por HPLC. O doseamento de epoximexrenona foi de 66,05%. O rendimento molar ajustado para a reacção foi de 93,1%.

Dissolveu-se o produto em metiletilcetona quente (189 mL) e destilou-se a solução resultante à pressão atmosférica até se ter eliminado 95 ml do solvente cetona. Diminuiu-se a temperatura até 50°C à medida que o produto cristalizava. Prosseguiu-se a agitação a 50°C durante 1 h. 201 ΡΕ0973791

Reduziu-se então a temperatura até 20-25°C e prosseguiu-se a agitação durante mais 2 h. Filtrou-se o sólido e lavou-se com MEK (24 mL) e secou-se o sólido até um peso constante de 9,98 g, o qual continha por HPLC 93, 63% de epoximexre-nona. Redissolveu-se este produto em MEK quente (106 mL) e filtrou-se a solução quente através de um filtro de 10 micron sob pressão. Aplicou-se mais 18 ml de MEK como uma lavagem e destilou-se a solução de MEK filtrada à pressão atmosférica até terem sido eliminados 53 ml de solvente. Baixou-se a temperatura até 50°C à medida que o produto cristalizava; e prosseguiu-se a agitação a 50°C durante 1 h. Baixou-se então a temperatura até 20-25°C e manteve-se a esta temperatura enquanto se prosseguia a agitação durante mais 2 h. Filtrou-se o produto sólido e lavou-se com MEK (18 mL). Secou-se o produto sólido até um peso constante de 8,32 g que continha 99,6% de epoximexrenona por HPLC quantitativa. A perda final na secagem foi inferior a 1,0%. 0 rendimento global de epoximexrenona segundo a reacção e processamento deste Exemplo é de 65,8%. Este rendimento global reflecte um rendimento da reacção de 93%, uma recuperação da cristalização inicial de 78,9% e uma recuperação da recristalização de 89,5%.

Exemplo 48 - Epoxidação de Fórmula IIA utilizando tolueno

Converteu-se o enéster de Fórmula IIA em eplere-nona pelo método geralmente descrito no Exemplo 46 excepto que se utilizou tolueno como solvente. Os materiais carregados no reactor incluíam enéster (2,7 g) tricloroacetamida 202 ΡΕ0973791 (2,5 g), hidrogenofosfato de dipotássio (1,7 g), peróxido de hidrogénio (17,0 g) e tolueno (50 ml). Deixou-se a reacção prosseguir em exotérmica a 28 °C e estava concluída em 4 horas. Arrefeceu-se a mistura de três fases resultante até 15 °C, filtrou-se, lavou-se com água e secou-se in vacuo para produzir 2,5 g de produto.

Exemplo 49 - Epoxidação de 9,11-Dienona

Dissolveu-se um composto designado XVI IA (composto XVII em que -A-A- e -B-B- são ambos -CH2-CH2-) (40,67 g) em cloreto de metileno (250 mL) num balão de 3 tubuladuras de um litro e arrefeceu-se externamente com uma mistura de gelo e sal. Adicionou-se fosfato de dipotássio (22,5 g) e tricloroacetonitrilo (83,5 g) e arrefeceu-se a mistura até 2°C após o que se adicionou lentamente peróxido de hidrogénio a 30% (200 g) ao longo de um período de 1 hora. Agitou-se a mistura reaccional a 12° durante 8 horas e 14 horas à temperatura ambiente. Retirou-se uma gota da camada orgânica e verificou-se quanto à presença de enona de partida e constatou-se ser <0,5%. Adicionou-se água (400 mL), agitou-se durante 15 min. e separou-se as camadas. Lavou-se a camada orgânica sucessivamente com 200 ml de iodeto de potássio (10%), 200 ml de tiossulfato de sódio (10%) e 100 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio, separando-se as camadas de cada vez. Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de magnésio anidro e concentrou-se para produzir epóxido em bruto (41 g). O produto 203 ΡΕ0973791 cristalizou de acetato de etilo:cloreto de metileno para dar 14,9 g de material puro.

Exemplo 50 - Epoxidação do Composto XVIIA utilizando ácido m-cloroperbenzóico (apenas para referência).

Dissolveu-se o composto XVIIA (18,0 g) em 250 ml de cloreto de metileno e arrefeceu-se até 10°C. Adicionou-se sob agitação ácido m-cloroperbenzóico sólido, (50-60% puro, 21,86 g) durante 15 min. Não se observou qualquer aumento na temperatura. Agitou-se a mistura reaccional durante 3 horas e verificou-se quanto à presença de dienona. Tratou-se a mistura reaccional sucessivamente com solução de sulfito de sódio (10%), solução de hidróxido de sódio (0,5N), solução de ácido clorídrico (5%) e finalmente com 50 ml de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Depois de secar com sulfato de magnésio anidro e evaporar, obteve-se 17,64 g do epóxido e utilizou-se directamente no passo seguinte. O produto continha produto de oxidação de Baeyer-Villiger que teve de ser eliminado por trituração de acetato de etilo seguido de cristalização de cloreto de metileno. Numa escala de 500 g, filtrou-se o ácido m-clorobenzóico precipitado seguido do processamento usual.

Exemplo 51 - Epoxidação do Composto XVIIA utilizando tricloroacetamida

Dissolveu-se o composto XVIIA (2 g) em 25 ml de cloreto de metileno. Adicionou-se tricloroacetamida (2 g) e 204 ΡΕ0973791 fosfato de dipotássio (2 g) . Adicionou-se, sob agitação à temperatura ambiente, peróxido de hidrogénio a 30% (10 mL) e prosseguiu-se a agitação durante 18 horas para produzir o epóxido (1,63 g). Não se formou o produto de Baeyer-Villiger.

Exemplo 52 (apenas para referência).

Carregou-se hidróxido de potássio (56,39 g; 1005,03 mmol; 3,00 eq.) num balão de 2000 mL e suspendeu-se com dimetilsulfóxido (750,0 mL) à temperatura ambiente. Adicionou-se ao balão a trienona correspondente à Fórmula XX (em que R3 é H e -A-A- e -B-B- são cada um -CH2-CH2-) (100, 00 g; 335,01 mmol; 1,00 eq.) em conjunto com THF (956,0 mL) . Adicionou-se ao balão metilsulfato de trimetilsulfónio (126,14 g; 670,02 mmol; 2,00 eq.) e aqueceu-se a mistura resultante a refluxo, 80 a 85°C durante 1 h. A conversão em 17-espiroximetileno foi verificada por HPLC. Eliminou-se aproximadamente 1 L de THF da mistura reaccional sob vácuo após o que se adicionou água (460 mL) ao longo de um período de 30 min. enquanto se arrefecia a mistura reaccional até 15°C. Filtrou-se a mistura resultante e lavou-se o produto oxirano sólido duas vezes com alíquotas de 200 mL de água. Verificou-se que o produto era altamente cristalino e efectuou-se facilmente a sua filtração. Secou-se subsequentemente o produto sob vácuo a 40°C. isolou-se 104,6 g do produto esteróide 3-metilenol éter de Δ-5,6,9,11,-17-oxirano. 205 ΡΕ0973791

Exemplo 53 (apenas para referência)

Carregou-se etóxido de sódio (41,94 g; 616,25 mmol; 1,90 eq.) num reactor de 500 mL seco sob um manto de azoto. Adicionou-se etanol (270,9 mL) ao reactor e suspendeu-se o metóxido de sódio em etanol. Adicionou-se malonato de dietilo (103,90 g; 648,68 mmol; 2,00 eq.) à suspensão após o que se adicionou o esteróide de oxirano preparado do modo descrito no Exemplo 52 (104,60 g; 324,34 mmol; 1,00 eq.) e se aqueceu a mistura resultante até refluxo, í.e., 80 até 85°C. Prosseguiu-se o aquecimento durante 4 h. após o que o grau de conversão da reacção foi verificado por HPLC. Adicionou-se água (337,86 mL) à mistura reaccional ao longo de um período de 30 min. enquanto se arrefecia a mistura até 15°C. Prosseguiu-se a agitação durante 30 min. e filtrou-se em seguida a suspensão reaccional produzindo um bolo de filtração compreendendo um pó amorfo fino. Lavou-se o bolo de filtração duas vezes com água (200 mL cada) e secou-se subsequentemente à temperatura ambiente sob vácuo. Isolou-se 133,8 g do intermediário 3-metilenoléter-A5,6,9,11,-17-espirolac-tona-21-metoxicarbonilo.

Exemplo 54 (apenas para referência)

Carregou-se o intermediário 3-metilenoléter-Δ5, 6,9,11, -17-espirolactona-21-metoxicarbonilo (Fórmula XVIII em que R3 é H e -A-A- e -B-B- são cada um -CH2-CH2-; 133,80 g; 313,68 mmol; 1,00 eq., como produzido no Exemplo 53), em conjunto com cloreto de sódio (27,50 g; 470,52 206 ΡΕ0973791 mmol; 1,50 eq.) dimetilformamida (709 mL) e água (5 mL) num reactor de 2000 mL sob agitação. Aqueceu-se a mistura resultante até refluxo, 138 até 142°C durante 3 h. após o que se verificou a mistura reaccional quanto à conclusão da reacção por HPLC. Adicionou-se subsequentemente água à mistura ao longo de um período de 30 min. enquanto se arrefecia a mistura até 15°C. Prosseguiu-se a agitação durante 30 min. após o que se filtrou a suspensão reaccional recuperando um produto reaccional sólido amorfo como um bolo de filtração. Lavou-se o bolo de filtração duas vezes (alíquotas de 200 mL de água) após o que se secou. Secou-se o produto 3-metilenoléter-17-espirolactona produzindo 91,6 g (82,3% de rendimento; doseamento, 96% em área).

Exemplo 55 (apenas para referência)

Carregou-se o enol éter produzido segundo o Exemplo 54 (91,60 g; 258,36 mmol; 1,00 eq.), etanol (250 mL), ácido acético (250 mL) e água (250 mL) num reactor de 2000 mL e aqueceu-se a suspensão resultante até refluxo durante 2 h. Adicionou-se água (600 mL) ao longo de um período de 30 min. enquanto se arrefecia a mistura até 15°C. Filtrou-se subsequentemente a suspensão reaccional e lavou-se o bolo de filtração duas vezes com água (alíquotas de 200 mL). Secou-se então o bolo de filtração; isolou-se 84,4 g de produto 3-ceto-A4,5,9,11,-17-espirolactona (composto de Fórmula XVII em que R3 é H e -A-A- e -B-B- são -CH2-CH2-; 95,9% de rendimento) . 207 ΡΕ0973791

Exemplo 56 (apenas para referência)

Carregou-se o composto XVIIA (1 kg; 2,81 moles) em conjunto com tetracloreto de carbono (3,2 L) num balão de 4 tubuladuras de 22 L. Adicionou-se N-bromo-succinamida (538 g) à mistura seguida de acetonitrilo (3,2 L). Aqueceu-se a mistura resultante até refluxo e manteve-se à temperatura de refluxo, 68°C, durante aproximadamente 3 h. produzindo uma solução laranja transparente. Após 5 h. de aquecimento, a solução ficou escura. Após 6 h. retirou-se o aquecimento e recolheu-se uma amostra da mistura reaccional. Eliminou-se o solvente sob vácuo e adicionou-se acetato de etilo (6 L) ao residuo no fundo do balão.

Agitou-se a mistura resultante após o que se adicionou uma solução de bicarbonato de sódio a 5% (4 L) e se agitou a mistura durante 15 min. após os quais se deixou as fases separarem-se. Retirou-se a camada aquosa e introduziu-se solução aquosa saturada de cloreto de sódio (4 L) na mistura a qual foi em seguida agitada durante 15 min.

Separou-se novamente as fases e eliminou-se a camada orgânica sob vácuo originando uma suspensão espessa.

Adicionou-se então dimetilformamida (4 L) e prosseguiu-se a eliminação até uma temperatura do recipiente de 55°C.

Deixou-se os resíduos de destilação repousar dum dia para o outro e adicionou-se DABCO (330 g) e brometo de lítio (243 g) . Aqueceu-se então a mistura até 70°C. Após uma hora e uma hora e meia de aquecimento, retirou-se uma amostra para cromatografia líquida e após 3,50 h. de aquecimento adicionou-se mais DABCO (40 g). Após 4,5 h. de aquecimento, introduziu-se água (4 L) e arrefeceu-se a mistura 208 ΡΕ0973791 resultante até 15°C. Filtrou-se a suspensão e lavou-se o bolo com água (3 L) e secou-se no filtro dum dia para o outro. Carregou-se o bolo húmido (978 g) novamente no balão de 22 L e adicionou-se dimetilformamida (7 L). Aqueceu-se a mistura assim produzida até 105°C altura em que o bolo ficou totalmente em solução. Retirou-se o aquecimento e agitou-se e arrefeceu-se a mistura no balão. Aplicou-se água gelada à camisa do reactor e arrefeceu-se a mistura no reactor até 14°C e manteve-se durante duas horas. Filtrou-se a suspensão resultante e lavou-se duas vezes com aliquotas de 2,5 L de água. Secou-se o bolo de filtração sob vácuo dum dia para o outro. Obteve-se um produto sólido castanho claro, 510 g.

Exemplo 57 (apenas para referência).

Num balão de 4 tubuladuras de 2 L carregou-se: 9,11-epoxicanrenona como produzida no Exemplo 56 (100,00 g; 282,1 mmol; 1,00 eq.), dimetilformamida (650,0 mL), cloreto de litio (30,00 g; 707,7 mmol; 2,51 eq.) e acetona ciano-hidrina (72,04 g; 77,3 mL; 846,4 mmol; 3,00 eq.). Agitou-se mecanicamente a suspensão resultante e tratou-se com tetrametilguanidina (45,49 g; 49,6 mL; 395,0 mmol; 1,40 eq.). Filtrou-se então o sistema com um condensador arrefecido com água e um condensador de gelo seco (cheio com gelo seco em acetona) para impedir a saida de HCN. A linha de escape do condensador de gelo seco passava por um filtro cheio com uma grande quantidade de lixívia. Aqueceu-se a mistura até 80 °C. 209 ΡΕ0973791

Após 18 h. obteve-se uma solução castanha-aver-melhada escura que se arrefeceu até temperatura ambiente sob agitação. Durante o processo de arrefecimento, borbulhou-se azoto na solução para eliminar HCN residual passando a linha de escape por lixívia num filtro. Após duas h. tratou-se a solução com ácido acético (72 g) e agitou-se durante 30 min. Verteu-se então a mistura em bruto para água gelada (2 L) sob agitação. Tratou-se ainda a suspensão mantida sob agitação com HC1 aquoso a 10% (400 mL) e agitou-se durante 1 h. Filtrou-se então a mistura para dar um sólido vermelho-tijolo escuro (73 g) . Colocou-se o filtrado numa ampola de decantação de 4 L e extraiu-se com cloreto de metileno (3 x 800 mL) ; e reuniu-se as camadas orgânicas e extraiu-se de novo com água (2 x 2 L) . Concentrou-se a solução de cloreto de metileno in vacuo para dar 61 g de um óleo vermelho escuro.

Depois de se deixar as fracções de lavagem aquosas repousar dum dia para o outro desenvolveu-se um precipitado considerável. Recolheu-se este precipitado por filtração e determinou-se ser o produto enamina puro (14,8 g).

Depois de secar, o sólido vermelho original (73 g) foi analisado por HPLC e determinou-se que o componente principal era a 9,11-epoxienamina. A HPLC mostrou ainda que a enamina era o componente principal do óleo vermelho obtido no processamento com cloreto de metileno. O rendimento molar calculado de enamina era de 46%. 210 ΡΕ0973791

Exemplo 58 (apenas para referência)

Introduziu-se 9,11-epoxienamina (4,600 g; 0,011261 mol; 1,00 eq.) como preparada segundo o Exemplo 57 num balão de fundo redondo de 1000 mL. Adicionou-se metanol (300 mL) e HC1 aquoso a 0,5% em peso (192 mL) à mistura que foi depois aquecida a refluxo durante 17 h. Eliminou-se subsequentemente o metanol sob vácuo reduzindo a quantidade de material no recipiente de destilação para 50 mL e provocando a formação de um precipitado branco. Adicionou-se água (100 mL) à suspensão que foi depois filtrada produzindo um bolo sólido branco que se lavou três vezes com água. O rendimento do produto 9,11-epoxidicetona sólido foi de 3,747 g (81,3%).

Exemplo 59 (apenas para referência).

Preparou-se a epoxidicetona segundo o Exemplo 58 (200 mg; 0,49 mmol), suspendeu-se em metanol (3 mL) e adicionou-se 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno(DBU) à mistura. Ao aquecer sob refluxo durante 24 h., a mistura ficou homogénea. Concentrou-se em seguida até à secura a 30°C num evaporador rotativo e partilhou-se o residuo entre cloreto de metileno e HC1 3,0 N. A concentração da fase orgânica produziu um sólido amarelo (193 mg) que se determinou ser 22% em peso de epoximexrenona. O rendimento foi de 20%. ΡΕ0973791 211

eplerenona

Exemplo 60 (apenas para referência) A 100 mg da dicetona suspendida em 1,5 ml de metanol adicionou-se 10 microlitros (0,18 eq) de uma solução a 25% (p/p) de metóxido de sódio em metanol.

Aqueceu-se a solução até refluxo. Após 30 min. não havia dicetona remanescente e estava presente o 5-cianoéster. À mistura adicionou-se 46 microlitros de uma solução metanó-lica de sódio a 25% (p/p) em metanol. Aqueceu-se a mistura a refluxo durante 23 horas altura em que o produto principal era a eplerenona como avaliado por HPLC.

212 ΡΕ0973791

Exemplo 61 (apenas para referência) A 2 g da dicetona suspendida em 30 ml de metanol seco adicionou-se 0,34 ml de trietilamina. Aqueceu-se a suspensão a refluxo durante 4,5 horas. Agitou-se a mistura a 25 °C durante 16 horas. Filtrou-se a suspensão resultante para dar 1,3 g do 5-cianoéster como um sólido branco. A 6,6 g da dicetona suspendida em 80 ml de metanol adicionou-se 2,8 ml de trietilamina. Aqueceu-se a mistura a refluxo durante 4 horas e agitou-se a 25x durante 88 horas no decurso das quais o produto cristalizou a partir da solução. A filtração seguida de uma lavagem com metanol deu 5,8 g do cianoéster como um pó branco. O material foi recristalizado de clorofórmio/metanol para dar 3,1 g de produto cristalino que estava homogéneo por HPLC.

Tendo em consideração o anterior constatar-se-á que são atingidos os vários objectos da invenção e obtidos outros resultados vantajosos.

Lisboa, 13 de Setembro de 2007

Claims (25)

1. ΡΕ0973791 1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de preparação de um composto epoxi compreendendo fazer contactar um composto substrato possuindo uma ligação dupla olefinica com um composto peróxido na presença de um activador de peróxido, em que o referido activador de peróxido corresponde à fórmula: ,,L, em que R° é um substituinte possuindo uma força atractora de electrões não inferior à do monoclorometilo, na presença de um tampão apropriado, e em que a reacção é realizada a um pH na gama de cerca de 3 até cerca de 7.
2. 2. Processo da reivindicação 1, em que o referido activador de peróxido corresponde à fórmula X1 o X1— C—Hp-i— NH, X* em que X1, X2 e X3 são seleccionados do grupo consistindo de halo, hidrogénio, alquilo, haloalquilo, ciano e ciano-alquilo, Rp é seleccionado do grupo consistindo de arileno e - (CX4X5)n-, e n é 0 ou 1, sendo pelo menos um de X1, X2, X3, X4 e X5 halo ou per-haloalquilo. 2 ΡΕ0973791
3. 3. Processo da reivindicação 2, em que n é 0 e pelo menos dois de X1, X2 e X3 são halo ou per-haloalquilo.
4. 4. Processo da reivindicação 2, em que todos de X1, X2, X3, X4 e X5 são halo ou per-haloalquilo.
5. 5. Processo da reivindicação 1, em que o referido activador de peróxido é a tri-haloacetamida.
6. 6. Processo da reivindicação 5, em que o referido activador de peróxido é tricloroacetamida.
7. 7. Processo da reivindicação 1, em que o referido composto substrato corresponde à fórmula:

   em que -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-R3, R4 e R5 são seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halogéneo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano, ariloxilo, R1 representa um radical (alcoxi C1-C7)carbonilo ou hidroxicarbonilo com orientação alfa, -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo IIIΡΕ0973791 3

   ‘Cft——CK)* y com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, e R1 e R2 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo, ou R1 e R2 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carboci-clicos ou heterociclicos, ou R1 ou R2 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentacíclico D. o

   1 Processo da reivindicação 1, em que o refe 2 rido composto substrato é seleccionado do grupo consistindo de: 4 ΡΕ0973791

   e o produto da reacção de epoxidação é seleccionado do grupo consistindo de:

   5 ΡΕ0973791 Ο
8. 9. Processo da reivindicação 7, em que o referido composto de Fórmula li é preparado eliminando um grupo de saída em 11a de um composto de Fórmula IV:

   em que: R1 representa um radical (alcoxi C1-C7) carbonilo ou hidro-xialquilo com orientação alfa; R2 é um alquilsulf oniloxilo ou aciloxilo C1-C7 ou um halogeneto; -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; R3, R9 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicar-bonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo IIIΡΕ0973791 6 R Rv -CH-CH2-CH- com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterocíclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterocíclicos fundida com o anel pentaciclico D.
9. 10. Processo da reivindicação 9, em que o referido composto de Fórmula IV é preparado fazendo reagir um reagente de alquilsulfonilação Ci-C7 ou acilação ou um agente gerador de halogeneto e, se estiver presente um agente gerador de halogeneto, uma armadilha de halogeneto de hidrogénio com um composto de Fórmula V: ΡΕ0973791 7 Ο

   v em que: R1 representa um radical (alcoxi C1-C7) carbonilo ou hidroxi-alquilo com orientação alfa; -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo Ci-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxi-carbonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo

   CH-CH2-CH UI com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo Ci-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo Ci-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo- 8 ΡΕ0973791 cíclicos ou heterocíclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem estrutura de anéis carbocíclicos ou heterocíclicos fundida com o anel pentacíclico D.
10. 11. Processo da reivindicação 10, em que o composto de Fórmula V é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VI com um alcóxido de metal alcalino correspondente à fórmula R10OM em que M é um metal alcalino e R10O- corresponde ao substituinte alcoxilo de R1, em que o referido composto de Fórmula VI tem a estrutura:

    em que: -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo Ci-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxi-carbonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo 9 ΡΕ0973791 com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterociclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentaciclico D.
11. 12. Processo da reivindicação 11, em que o composto de Fórmula VI é preparado hidrolisando um composto correspondente à Fórmula VII: 0

    c

    VII em que: -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; 10 ΡΕ0973791 R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxi-carbonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo

    com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterociclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentaciclico D.
12. 13. Processo da reivindicação 12, em que 0 composto de Fórmula VII é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VIII com uma fonte de ião cianeto na presença de um sal de metal alcalino, em que o referido composto de Fórmula VIII tem a estrutura: 11 ΡΕ0973791 ο

    VIII em que : -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo C1-C7, alcoxilo C1-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxi-carbonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo

    III CH-CH2-CH- com orientação alfa ou beta, em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis car- 12 ΡΕ0973791 bocíclicos ou heterocíclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbocíclicos ou heterocíclicos fundida com o anel pentacíclico D.
13. 14. Processo da reivindicação 13, em que o composto de Fórmula VIII é preparado oxidando um composto substrato correspondente à Fórmula XIII por fermentação na presença de um microrganismo eficaz para introduzir um grupo 11-hidroxilo no referido substrato em orientação a, em que o referido composto substrato corresponde à fórmula:

    em que: -A-A- representa o grupo -CHR4-CHR5- ou -CR4=CR5-; R3, R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, hidroxilo, alquilo Ci-C7, alcoxilo Ci-C7, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicar-bonilo, ciano, ariloxilo; -B-B- representa o grupo -CHR6-CHR7- ou um grupo

    com orientação alfa ou beta, 13 ΡΕ0973791 em que R6 e R7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano, ariloxilo; e R8 e R9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, halo, alcoxilo C1-C7, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano e ariloxilo, ou R8 e R9 em conjunto compreendem uma estrutura de anéis carbo-cíclicos ou heterociclicos, ou R8 ou R9 em conjunto com R6 ou R7 compreendem uma estrutura de anéis carbociclicos ou heterociclicos fundida com o anel pentaciclico D.
14. 15. Processo da reivindicação 1, em que o referido composto substrato corresponde à Fórmula IIA:

    em que -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo IHA -Ctf-CHi-CH com orientação alfa ou beta, 14 ΡΕ0973791 R1 representa um radical (alcoxi C1-C7)carbonilo ou hidroxicarbonilo com orientação alfa, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -O-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais dos compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
15. 16. Processo da reivindicação 15, em que o referido composto de Fórmula IIA é preparado eliminando um grupo de saída em 11a de um composto de Fórmula IVA:

    em que: -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo

    com orientação alfa ou beta, 15 ΡΕ0973791 R1 representa um radical (alcoxi C1-C7) carbonilo ou hidroxicarbonilo com orientação alfa, R2 é alquilsulfonilo C1-C7 ou aciloxilo, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
16. 17. Processo da reivindicação 16, em que o referido composto de Fórmula IVA é preparado fazendo reagir um reagente de alquilsulfonilação C1-C7 ou acilação ou um agente gerador de halogeneto e, se estiver presente um agente gerador de halogeneto, uma armadilha de halogeneto de hidrogénio com um composto de Fórmula VA:

    em que -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo 16 ΡΕ0973791 -CH-CH2-CH- 1IIA com orientação alfa ou beta, R1 representa um radical (alcoxi C1-C7) carbonilo ou hidroxicarbonilo com orientação alfa, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
17. 18. Processo da reivindicação 17, em que o composto de Fórmula VA é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VIA com um alcóxido de metal alcalino correspondente à fórmula R10OM em que M é um metal alcalino e R10O corresponde ao substituinte alcoxilo de R1, em que o referido composto de Fórmula VIA tem a estrutura:

    17 ΡΕ0973791 em que -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo -CH-CHj-ÍH- com orientação alfa ou beta, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
18. 19. Processo da reivindicação 18, em que o composto de Fórmula VIA é preparado hidrolisando um composto correspondente à Fórmula VIIA:

    em que 18 ΡΕ0973791 -A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH-, -B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo -CH-CHj,-(¾- Í»A com orientação alfa ou beta, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -0-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
19. 20. Processo da reivindicação 19, em que o composto de Fórmula VI IA é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VIIIA com uma fonte de ião cianeto na presença de um sal de metal alcalino, em que o referido composto de Fórmula VIIIA tem a estrutura:

    em que 19 ΡΕ0973791 A-A- representa o grupo -CH2-CH2- ou -CH=CH--B-B- representa o grupo -CH2-CH2- ou um grupo

    II1A com orientação alfa ou beta, X representa dois átomos de hidrogénio ou oxo, Y1 e Y2 em conjunto representam uma ponte de oxigénio -O-, ou Y1 representa hidroxilo, e Y2 representa hidroxilo, alcoxilo C1-C7, ou, se X representar H2, também representa alcanoiloxilo C1-C7, e sais de compostos nos quais X representa oxo e Y2 representa hidroxilo.
20. 21. Processo da reivindicação 1, em que o referido composto substrato corresponde à Fórmula IIB:

    O IIB. 0 20 ΡΕ0973791
21. 22. Processo da reivindicação 21, em que o referido composto de Fórmula IIB é preparado eliminando um grupo 11-metilsulfoniloxilo de um composto de Fórmula IVB:
22. 23. Processo da reivindicação 22, em que o referido composto de Fórmula IVB é preparado fazendo reagir um agente de metilsulfonilação Ci-C7 com um composto de Fórmula VB:
23. 24. Processo da reivindicação 23, em que o composto de Fórmula VB é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VIB com um metóxido de metal alcalino, em que o referido composto de Fórmula VIB tem a estrutura: ΡΕ0973791 21

    VIB.
24. 25. Processo da reivindicação 24, em que o composto de Fórmula vib é preparado hidrolisando um composto correspondente à Fórmula VIIB:

    VIIB.
25. 26. Processo da reivindicação 25, em que o composto de Fórmula VIIB é preparado fazendo reagir um composto de Fórmula VIIIB com uma fonte de ião cianeto na presença de um sal de metal alcalino, em que o referido composto de Fórmula VIIIB tem a estrutura: ΡΕ0973791 22

    VIITB. 7 até 26, acetamida. 7. Processo de qualquer uma das reivindicações em que o activador de peróxido é tricloro- Lisboa, 13 de Setembro de 2007