ES2293944T3 - Procedimiento de epoxidacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la formación de un compuesto epoxi que comprende poner en contacto un compuesto de sustrato que tiene un doble enlace olefínico con un compuesto de peróxido en presencia de un activador de peróxido, en donde dicho activador de peróxido corresponde a un compuesto que tiene la fórmula en donde Rp es -(CX4X5)2-; X1, X2, X3, X4 y X5 se eligen independientemente entre halo, hidrógeno, alquilo, haloalquilo, ciano y cianoalquilo; y siempre que al menos uno de X4 y X5 sea halo.
Description
Procedimiento de epoxidación.
Esta invención se relaciona con un nuevo
procedimiento para la preparación de un compuesto epoxi. Dicho
procedimiento es útil para la preparación de compuestos de
9,11-epoxi esteroides, particularmente aquellos de
la serie 20-espiroxano y sus análogos.
En la Patente US 4.559.332 se describen métodos
para la preparación de compuestos de la serie
20-espiroxano. Los compuestos producidos según el
procedimiento de la Patente '332 tienen un anillo abierto E
conteniendo oxígeno de fórmula general:
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-;
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxicarbonilo
\alpha-orientado;
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo \alpha- o
\beta-orientado;
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R^{6} y R^{7} son hidrógeno;
X representa dos átomos de hidrógeno u oxo;
Y^{1} e Y^{2} representan conjuntamente el
puente de oxígeno -O- o
Y^{1} representa hidroxi y
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior;
y sales de tales compuestos en donde X
representa oxo e Y^{2} representa hidroxi, es decir de los
correspondientes ácidos
17\beta-hidroxi-21-carboxílicos.
La Patente US 4.559.332 describe varios métodos
para la preparación de epoximexrenona y compuestos relacionados de
fórmula IA. La llegada de nuevos y más amplios usos clínicos de
epoximexrenona ha creado la necesidad de disponer de procedimientos
mejorados para la preparación de dicho compuesto y de otros
esteroides relacionados.
El objeto principal de la presente invención
consiste es proporcionar un procedimiento mejorado para la
preparación de epoximexrenona, otros 20-espiroxanos
y otros esteroides que tienen características estructurales comunes.
El objeto particular de la invención consiste en proporcionar:
Los esquemas de síntesis, en donde se puede
emplear el nuevo procedimiento de la presente invención se describen
con detalle en la Descripción de Modalidades Preferidas para poder
entender mejor la presente invención.
(1) Un procedimiento para la formación de un
compuesto epoxi que comprende poner en contacto un compuesto de
sustrato que tiene un doble enlace olefínico con un compuesto
peróxido en presencia de un activador de peróxido, en donde dicho
activador de peróxido corresponde a un compuesto que tiene la
fórmula
en
donde
R^{p} se elige del grupo consistente del grupo
consistente en alquenilo, alquinilo y
-(CX^{4}X^{5})_{2}-;
X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5} se
eligen independientemente entre halo, hidrógeno, alquilo,
haloalquilo, ciano y cianoalquilo;
y
siempre que al menos uno de X^{4} y X^{5}
sea halo.
(2) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde al menos dos de X^{1}, X^{2} y X^{3}
son halo o perhaloalquilo.
(3) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde todos los X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}
y X^{5} son halo o perhaloalquilo.
(4) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde dicho activador de peróxido es
heptafluorbutiramida.
(5) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde dicho compuesto de sustrato corresponde a
la fórmula:
en
donde:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3} se elige del grupo consistente en
hidrógeno, halo, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior,
hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y
ariloxi;
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxialquilo
alfa-orientado; y
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo alfa- o
beta-orientado:
en donde R^{6} y R^{7} se
eligen independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
alcoxi inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y
ariloxi;
y
R^{8} y R^{9} se eligen independientemente
del grupo consistente en hidrógeno, hidroxi, halo, alcoxi inferior,
acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo,
alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o bien R^{8} y
R^{9} juntos comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico, o bien R^{8} o R^{9} juntos con R^{6} o
R^{7} comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico condensado al anillo pentacíclico D.
(6) Un procedimiento según (5) anteriormente, en
donde R^{3} es hidrógeno, A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}, -B-B-
representa el grupo -CHR^{6}-CHR^{7} y R^{4},
R^{5}, R^{6} y R^{7} son cada uno hidrógeno.
(7) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde dicho compuesto de sustrato se elige del
grupo consistente en:
y un producto de la reacción de
epoxidación se elige del grupo consistente
en
(8) Un procedimiento como se indica en (1)
anteriormente, en donde dicho compuesto de sustrato se elige del
grupo consistente en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y un producto de la reacción de
epoxidación se elige del grupo consistente
en:
entre los compuestos intermedios
que se pueden utilizar en el procedimiento de esta invención se
encuentran aquellos descritos inmediatamente a
continuación.
Un compuesto de fórmula IV corresponde a la
estructura:
en
donde:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se eligen
independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxicarbonilo
alfa-orientado;
R^{2} es un grupo
11\alpha-saliente cuya abstracción es eficaz para
generar un doble enlace entre los átomos de carbono 9 y 11;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo alfa- o
beta-orientado:
en donde R^{6} y R^{7} se
eligen independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
alcoxi inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y
ariloxi;
y
R^{8} y R^{9} se eligen independientemente
del grupo consistente en hidrógeno, hidroxi, halo, alcoxi inferior,
acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo,
alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o bien R^{8} y
R^{9} juntos comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico, o bien R^{8} o R^{9} juntos con R^{6} o
R^{7} comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico condensado al anillo pentacíclico D.
Un compuesto de fórmula IVA corresponde a la
fórmula IV en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula IVB corresponde a la
fórmula IV en donde R^{8} y R^{9} juntos forman la estructura
de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas IVC, IVD y IVE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas IV, IVA
o IVB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno y R^{1} es alcoxicarbonilo, con preferencia
metoxicarbonilo. Los compuestos dentro del alcance de la fórmula IV
se pueden preparar por reacción de un reactivo
alquil(inferior)sulfonilante o acilante o un reactivo
generador de haluro, con el correspondiente compuesto dentro del
alcance de la fórmula V. Un compuesto de fórmula V corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{1}, R^{3}, R^{8} y R^{9} se
definen como en la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula VA corresponde a la
fórmula V en donde R^{8} y R^{9} con el carbono del anillo al
cual están unidos forman juntos la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula VB corresponde a la
fórmula V en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura de
fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmula VC, VD y VE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas V, VA o
VB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}, R^{3}
es hidrógeno y R^{1} es alcoxicarbonilo, con preferencia
metoxicarbonilo. Los compuestos dentro del alcance de la fórmula V
se pueden preparar por reacción de un alcóxido de metal alcalino
con el correspondiente compuesto de fórmula VI.
Un compuesto de fórmula VI corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula VIA corresponde a la
fórmula VI en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula VIB corresponde a la
fórmula VI en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura de
fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas VIC, VID y VIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas VI, VIA
o VIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos de fórmulas VI, VIA, VIB y VIC
se preparan por hidrólisis de un compuesto correspondiente a la
fórmula VII, VIIA, VIIB o VIIC, respectivamente.
Un compuesto de fórmula VII corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula VIIA corresponde a la
fórmula VII en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula VIIB corresponde a la
fórmula VII en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas VIIC, VIID y VIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas VII,
VIIA o VIIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Un compuesto dentro del alcance de la fórmula
VII se puede preparar por cianación de un compuesto dentro del
alcance de la fórmula VIII.
Un compuesto de fórmula VIII corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula VIIIA corresponde a la
fórmula VIII en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula VIIIB corresponde a la
fórmula VIII en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas VIIIC, VIIID y VIIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas VIII,
VIIIA u VIIIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula VIII se preparan por oxidación de un sustrato que comprende
un compuesto de fórmula XXX como más adelante se describe por
fermentación efectiva para introducir un grupo
11-hidroxi en el sustrato en orientación
\alpha.
Un compuesto de fórmula IX corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula IV y R^{1} se define como en la fórmula
V.
Un compuesto de fórmula IXA corresponde a la
fórmula IX en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula IXB corresponde a la
fórmula IX en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura de fórmula
XXXIII:
Los compuestos de fórmulas IXC, IXD y IXE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas IX, IXA
o IXB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula IX se preparan por bioconversión del correspondiente
compuesto dentro del alcance de la fórmula X.
Un compuesto de fórmula XIV corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XIVA corresponde a la
fórmula XIV en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XIVB corresponde a la
fórmula XIV en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura de fórmula
XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmulas XIVC, XIVD y XIVE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas XIV,
XIVA o XIVB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XIV se pueden preparar por hidrólisis del correspondiente
compuesto dentro del alcance de la fórmula XV.
Un compuesto de fórmula XV corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XVA corresponde a la
fórmula XV en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XVB corresponde a la
fórmula XV en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura de fórmula
XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmulas XVC, XVD y XVE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas XV, XVA
o XVB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XV se pueden preparar por cianación del correspondiente
compuesto dentro del alcance de la fórmula XXI.
\newpage
Un compuesto de fórmula XXI corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XXIA corresponde a la
fórmula XXI en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XXIB corresponde a la
fórmula XXI en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de fórmula XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmulas XXIC, XXID y XXIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas XXI,
XXIA o XXIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XXI se pueden preparar por hidrólisis del correspondiente
compuesto dentro del alcance de la fórmula XXII.
Un compuesto de fórmula XXII corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XXIIA corresponde a la
fórmula XXII en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XXIIB corresponde a la
fórmula XXII en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la estructura
de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas XXIIC, XXIID y XXIIE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas XXII,
XXIIA o XXIIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XXII se pueden preparar por cianación de un compuesto dentro
del alcance de la fórmula XXIII.
Un compuesto de fórmula XXIII corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XXIIIA corresponde a la
fórmula XXIII en donde R^{8} y R^{9} junto con el carbono del
anillo al cual están unidos forman la estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XXIIIB corresponde a la
fórmula XXIII en donde R^{8} y R^{9} forman juntos la
estructura de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas XXIIIC, XXIIID y
XXIIIE, respectivamente, corresponden a cualquiera de las fórmulas
XXIII, XXIIIA o XXIIIB en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XXII se pueden preparar por oxidación de un compuesto dentro
del alcance de la fórmula XXIV, como más adelante se describe.
Un compuesto de fórmula XXVI corresponde a la
estructura:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XXVIA corresponde a la
fórmula XXVI en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XXVI se pueden preparar por oxidación de un compuesto de
fórmula XXVII.
Un compuesto de fórmula XXV corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula XXVA corresponde a la
fórmula XXV en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XXV se pueden preparar por cianación de un compuesto de
fórmula XXVI.
Un compuesto de fórmula 104 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula IV y
R^{11} es alquilo C_{1} a
C_{4}.
Un compuesto de fórmula 104A corresponde a la
fórmula 104 en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula 104 se pueden preparar por descomposición térmica de un
compuesto de fórmula 103.
Un compuesto de fórmula 103 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{11} se definen como en la fórmula 104 y
R^{12} es alquilo C_{1} a
C_{4}.
Un compuesto de fórmula 103A corresponde a la
fórmula 103 en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula 103 se pueden preparar por reacción del correspondiente
compuesto de fórmula 102 con un malonato de dialquilo en presencia
de una base tal como un alcóxido de metal alcalino.
Un compuesto de fórmula 102 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{11} se definen como en la fórmula
104.
Un compuesto de fórmula 102A corresponde a la
fórmula 102 en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula 102 se pueden preparar por reacción del correspondiente
compuesto de fórmula 101 con un compuesto de trialquilsulfonio en
presencia de una base.
Un compuesto de fórmula 101 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{11} se definen como en la fórmula
104.
Un compuesto de fórmula 101A corresponde a la
fórmula 101 en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2} y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula 101 se pueden preparar por reacción de
11\alpha-hidroxiandrosteno-3,17-diona
u otro compuesto de fórmula XXXVI con un ortoformato de trialquilo
en presencia de un ácido.
\newpage
Un compuesto de fórmula XL corresponde a la
fórmula:
en donde -E-E- se
elige
entre:
\vskip1.000000\baselineskip
R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, alquilo, halo, nitro y ciano;
R^{24} se elige entre hidrógeno y alquilo inferior; R^{80} y
R^{90} se eligen independientemente entre ceto y los
sustituyentes que pueden constituir R^{8} y R^{9} (como se han
definido anteriormente con referencia a la fórmula IV); y
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula IV.
Un compuesto de fórmula XLA corresponde a la
fórmula XL en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo
inferior.
Un compuesto de fórmula XLB corresponde a la
fórmula XLA en donde -E-E- corresponde a la fórmula
XLIII, XLIV, XLV o XLVII. Un compuesto de fórmula XLC corresponde a
la fórmula XLB en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLV. Un compuesto de fórmula XLD corresponde a la fórmula
XLB en donde -E-E- corresponde a la fórmula
XLVII.
Un compuesto de fórmula XLE corresponde a la
fórmula XL en donde R^{80} y R^{90} junto con el átomo de
carbono del anillo al cual están enlazados comprenden ceto o
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como anteriormente
o
Los compuestos de fórmula XLIE corresponden a la
fórmula XL en donde R^{80} y R^{90} juntos forman un grupo
ceto.
Los compuestos de fórmulas XLF, XLG, XLH, XLJ,
XLM y XLN corresponden a las fórmulas XL, XLA, XLB, XLC, XLD y XLE,
respectivamente, en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente.
Un compuesto de fórmula XLI corresponde a la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -E-E- se
elige
entre:
R^{18} es alquilo C_{1} a C_{4} y los
grupos R^{18}O- forman conjuntamente un puente
O,O-oxialquileno; R^{21}, R^{22} y R^{23} se
eligen independientemente entre hidrógeno, alquilo, halo, nitro y
ciano; R^{24} se elige entre hidrógeno y alquilo inferior;
R^{80} y R^{90} se eligen independientemente entre ceto y los
sustituyentes que pueden constituir R^{8} y R^{9}; y
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula IV.
Un compuesto de fórmula XLIA corresponde a la
fórmula XLI en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula XLIB corresponde a la
fórmula XLIA en donde -E-E- corresponde a la fórmula
XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Un compuesto de fórmula XLIC corresponde a la
fórmula XLI en donde R^{80} y R^{90} junto con el átomo de
carbono del anillo al cual están enlazados comprende ceto o:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula XLID corresponden a la
fórmula XLI en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII
Los compuestos de fórmula XLIE corresponden a la
fórmula XL en donde R^{80} y R^{90} forman conjuntamente
ceto.
Los compuestos de fórmulas XLIF, XLIG, XLIH,
XLIJ, XLIM y XLIN corresponden a las fórmulas XLI, XLIA, XLIB,
XLIC, XLID y XLIE, respectivamente, en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula XLI se preparan por
hidrólisis de los correspondientes compuestos de fórmula XL como
más adelante se definen.
Un compuesto de fórmula XLII corresponde a la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -E-E- se
elige
entre:
\vskip1.000000\baselineskip
R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, alquilo, halo, nitro y ciano;
R^{24} se elige entre hidrógeno y alquilo inferior; R^{80} y
R^{90} se eligen independientemente entre ceto y los
sustituyentes que pueden constituir R^{8} y R^{9}; y
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula IV.
Un compuesto de fórmula XLIIA corresponde a la
fórmula XLII en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula XLIIB corresponde a la
fórmula XLIIA en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Un compuesto de fórmula XLIIC corresponde a la
fórmula XLII en donde R^{80} y R^{90} junto con el átomo de
carbono del anillo al cual están enlazados comprenden ceto o:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula XLIID corresponden a
la fórmula XLII en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII
Los compuestos de fórmula XLIIE corresponden a
la fórmula XLII en donde R^{80} y R^{90} forman juntos un grupo
ceto. Los compuestos de fórmulas XLIIF, XLIIG, XLIIH, XLIIJ, XLIIM y
XLIIN corresponden a las fórmulas XLII, XLIIA, XLIIB, XLIIC, XLIID
y XLIIE, respectivamente, en donde -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula XLII se preparan mediante desprotección del correspondiente
compuesto de fórmula XLI.
Un compuesto de fórmula XLIX corresponde a la
estructura:
en donde -E-E- se
define como en la fórmula XL y -A-A-,
-B-B-, R^{1}, R^{3}, R^{8} y R^{9} se
definen como en la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula XLIXA corresponde a la
fórmula XLIX en donde R^{8} y R^{9} junto con el átomo de
carbono del anillo al cual están enlazados forman conjuntamente la
estructura:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula XLIXB corresponden a
la fórmula XLIX en donde R^{8} y R^{9} forman conjuntamente la
estructura de fórmula XXXIII:
Los compuestos de fórmulas XLIXC, XLIXD, XLIXE,
respectivamente, corresponden a cualquiera de los compuestos de
fórmula XLIX, XLIXA o XLIXB en donde cada uno de
-A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno y R^{1}
es alcoxicarbonilo, preferentemente metoxicarbonilo. Los compuestos
dentro del alcance de la fórmula XLIX se pueden preparar haciendo
reaccionar un disolvente alcohólico o acuoso con el correspondiente
compuesto de fórmula VI en presencia de una base adecuada.
Un compuesto de fórmula A203 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -E-E- se
elige
entre:
R^{18} se elige entre alquilo C_{1} a
C_{4}; R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen independientemente
entre hidrógeno, alquilo, halo, nitro y ciano; R^{24} se elige
entre hidrógeno y alquilo inferior; y -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula A203A corresponde a la
fórmula A203 en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula A203B corresponde a la
fórmula A203A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Los compuestos de fórmulas A203C, A203d y A203E
corresponden respectivamente a las fórmulas A203, A203A y A203B en
donde cada uno de -A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A203 se preparan
reduciendo un compuesto de fórmula A202 como más abajo se
define.
Un compuesto de fórmula A204 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{19} es alquilo
C_{1} a C_{4} y -E-E-, -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula
203.
Un compuesto de fórmula A204A corresponde a la
fórmula A204 en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula A204B corresponde a la
fórmula A204A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Los compuestos de fórmulas A204C, A204D y A204E
corresponden respectivamente a las fórmulas A204, A204A y A204B en
donde cada uno de -A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A204 se preparan por
hidrólisis de los correspondientes compuestos de fórmula A203.
Un compuesto de fórmula A205 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{20} es alquilo
C_{1} a C_{4} y -E-E-, R^{19},
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula
204.
Un compuesto de la fórmula A205A corresponde a
la fórmula A205 en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula A205B corresponde a la
fórmula A205A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Los compuestos de fórmulas A205C, A205d y A205E
corresponden respectivamente a las fórmulas A205, A205A y A205B en
donde cada uno de -A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A205 se pueden preparar
haciendo reaccionar el correspondiente compuesto de fórmula A204 con
un alcanol y un ácido.
\newpage
Un compuesto de fórmula A206 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{19}, R^{20},
-E-E-, -A-A-, -B-B-
y R^{3} se definen como en la fórmula
205.
Un compuesto de fórmula A206A corresponde a la
fórmula A206 en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula A206B corresponde a la
fórmula A206A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Los compuestos de fórmulas A206C, A206D y A206E
corresponden respectivamente a las fórmulas A206, A206A y A206B en
donde cada uno de -A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A206 se pueden preparar
haciendo reaccionar el correspondiente compuesto dentro del alcance
de la fórmula A205 con un haluro de trialquilsulfonio.
Un compuesto de fórmula A207 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{25} es alquilo
C_{1} a C_{4} y -E-E-, R^{19}, R^{20},
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula
A205.
Un compuesto de fórmula A207A corresponde a la
fórmula A207 en donde R^{21}, R^{22} y R^{23} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo inferior.
Un compuesto de fórmula A207B corresponde a la
fórmula A207A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Los compuestos de fórmulas A207C, A207D y A207E
corresponden respectivamente a las fórmulas A207, A207A y A207B en
donde cada uno de -A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A207 se pueden preparar
por reacción de compuestos de fórmula A206 con un malonato de
dialquilo.
dialquilo.
\newpage
Un compuesto de fórmula A208 corresponde a la
estructura:
en donde -E-E-,
R^{80} y R^{90} se definen como en la fórmula XLII;
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula 104; y R^{19}, R^{20}, -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula
205.
Un compuesto de fórmula A208A corresponde a la
fórmula A208 en donde R^{21} y R^{22} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo
inferior.
Un compuesto de fórmula A208B corresponde a la
fórmula A208A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Un compuesto de fórmula A208C corresponde a la
fórmula A208 en donde R^{80} y R^{90} junto con el carbono del
anillo al cual están enlazados comprenden ceto o:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula 208D corresponden a la
fórmula 208C en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII:
Los compuestos de fórmulas A208E, A208F, A208G,
A208H y A208J corresponden respectivamente a las fórmulas A208,
A208A, A208B, A208C y A208D en donde cada uno de
-A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A208 se pueden preparar
por descomposición térmica de los correspondientes compuestos de
fórmula A207.
Un compuesto de fórmula A209 corresponde a la
estructura:
en donde R^{80} y R^{90} se
definen como en la fórmula XLI, y -E-E- y
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula
205.
Un compuesto de fórmula A209A corresponde a la
fórmula A209 en donde R^{21} y R^{22} se eligen
independientemente entre hidrógeno, halógeno y alquilo
inferior.
Un compuesto de fórmula A209B corresponde a la
fórmula A209A en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIII, XLIV, XLV o XLVII.
Un compuesto de fórmula A209C corresponde a la
fórmula A209B en donde -E-E- corresponde a la
fórmula XLIV.
Un compuesto de fórmula A209D corresponde a la
fórmula A209 en donde R^{80} y R^{90} junto con el carbono del
anillo al cual están enlazados comprenden ceto o:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula 209E corresponden a la
fórmula A209D en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmulas A209F, A209G, A209H,
A209J, A209L y A209M corresponden respectivamente a las fórmulas
A209, A209A, A209B, A209C, A209D y A209E en donde cada uno de
-A-A- y -B-B- es
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno. Los
compuestos dentro del alcance de la fórmula A209 se pueden preparar
por hidrólisis del correspondiente compuesto de fórmula A208.
Un compuesto de fórmula A210 corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{80} y R^{90} se
definen como en la fórmula XLI y los sustituyentes
-A-A-, -B-B- y R^{3} se definen
como en la fórmula
IV.
Un compuesto de fórmula A210A corresponde a la
fórmula A210 en donde R^{80} y R^{90} junto con el carbono del
anillo al cual están enlazados comprenden ceto o:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula A210B corresponden a
la fórmula A210A en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII:
Los compuestos de fórmulas A210C corresponden a
la fórmula A210A en donde R^{80} y R^{90} juntos forman
ceto.
Los compuestos de fórmulas A210D, A210E, A210F y
A210G corresponden respectivamente a las fórmulas A210, A210A,
A210B y A210C en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula 210 se pueden preparar por epoxidación de un compuesto de
fórmula 209 en donde -E-E- es
1000 .
Un compuesto de fórmula A211 corresponde a la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se describen como
anteriormente.
Un compuesto de fórmula A211A corresponde a la
fórmula A211 en donde R^{80} y R^{90} juntos comprenden ceto
o:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula A211B corresponden a
la fórmula A211A en donde el sustituyente XXXIV corresponde a la
estructura XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula A211C corresponden a
la fórmula A210A en donde R^{80} y R^{90} juntos forman
ceto.
Los compuestos de fórmulas A211D, A211E, A211F y
A211G corresponden respectivamente a las fórmulas A211, A211A,
A211B y A211C en donde cada uno de -A-A- y
-B-B- es -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno. Los compuestos dentro del alcance de la
fórmula A211 se pueden preparar por oxidación del correspondiente
compuesto de fórmula A210 o en el transcurso de la epoxidación del
correspondiente compuesto de fórmula A209 en donde
-E-E- es 1000 . Los compuestos de
fórmula A211 se pueden convertir a los compuestos de fórmula I del
modo descrito más adelante.
\newpage
Un compuesto de fórmula L corresponde a la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{11} es alquilo
C_{1} a C_{4} y -A-A-, -B-B-,
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula LA corresponden a la
fórmula L en donde R^{8} y R^{9} junto con el átomo de carbono
al cual están enlazados comprenden:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1} e Y^{2} se
definen como
anteriormente.
Los compuestos de fórmula LB corresponden a la
fórmula L en donde R^{8} y R^{9} corresponden a la fórmula
XXXIII:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula LC, LD, LE
corresponden a las fórmulas L, LA y LB respectivamente en donde
-A-A- y -B-B- son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno.
Tomando como base la descripción de los esquemas
de reacción específicos ofrecidos más adelante, será evidente cual
de dichos compuestos tiene la mayor utilidad con respecto a un
esquema de reacción en particular. Los compuestos de esta invención
son útiles como compuestos intermediarios para epoximexrenona y
otros esteroides, preparados usando el procedimiento de la
invención.
Otros objetos y características serán en parte
evidentes y en parte surgirán en lo descrito a continuación.
La Figura 1 es un diagrama de flujos esquemático
de un procedimiento para la bioconversión de canrenona o un
derivado de canrenona al correspondiente compuesto
11\alpha-hidroxi.
La Figura 2 es un diagrama de flujos esquemático
de un procedimiento preferido para la
bioconversión/11-\alpha-hidroxilación
de canrenona y derivados de canrenona.
La Figura 3 es un diagrama de flujos esquemático
de un procedimiento particularmente preferido para la
bioconversión/11-\alpha-hidroxilación
de canrenona y derivados de canrenona.
La Figura 4 muestra la distribución de tamaños
de partícula para canrenona tal y como es preparada según el
procedimiento de la Figura 2.
La Figura 5 muestra la distribución de tamaños
de partícula para canrenona tal como se esteriliza en el fermentador
de transformación según el procedimiento de la Figura 3.
Los correspondientes caracteres de referencia
indican las correspondientes partes en todos los dibujos.
De acuerdo con la presente invención, se ha
desarrollado un nuevo procedimiento para la preparación de
epoximexrenona y otros compuestos correspondientes a la fórmula
I:
en
donde:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se eligen
independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxialquilo
alfa-orientado; y
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo alfa- o
beta-orientado:
en donde R^{6} y R^{7} se
eligen independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
alcoxi inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y
ariloxi;
y
R^{8} y R^{9} se eligen independientemente
del grupo consistente en hidrógeno, hidroxi, halo, alcoxi inferior,
acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo,
alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o bien R^{8} y
R^{9} juntos comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico, o bien R^{8} o R^{9} juntos con R^{6} o
R^{7} comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico condensado al anillo pentacíclico D.
Salvo que se indique lo contrario, los radicales
orgánicos referidos como "inferiores" en la presente
descripción contienen como máximo 7 y preferentemente de 1 a 4
átomos de carbono.
Un radical
alcoxi(inferior)carbonilo es preferentemente un
radical derivado de un radical alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de
carbono, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
isobutilo, sec-butilo y terc-butilo;
siendo especialmente preferidos los radicales metoxicarbonilo,
etoxicarbonilo e isopropoxicarbonilo. Un radical alcoxi inferior es
preferentemente un radical derivado de uno de los radicales alquilo
C_{1}-C_{4} antes mencionados, especialmente de
un radical alquilo primario C_{1}-C_{4};
especialmente preferido es el radical metoxi. Un radical alcanoilo
inferior es preferentemente un radical derivado de un alquilo de
cadena lineal que tiene de 1 a 7 átomos de carbono; especialmente
preferidos son formilo y acetilo.
Un puente metileno en la posición 15,16 está
preferentemente \beta-orientado.
Una clase preferida de compuestos que se pueden
obtener de acuerdo con los métodos de la invención son los
compuestos de 20-espiroxano descritos en la Patente
US 4.559.332, es decir, aquellos correspondientes a la
\hbox{fórmula IA:}
\newpage
en
donde:
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-;
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo alfa- o
beta-orientado de fórmula IIIA:
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxicarbonilo
alfa-orientado;
X representa dos átomos de hidrógeno, oxo o
=S;
Y^{1} e Y^{2} juntos representan el puente
oxígeno -O-, o
Y^{1} representa hidroxi y
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior.
Preferentemente, los compuestos de
20-espiroxano producidos por los nuevos métodos de
la invención son aquellos de fórmula I en donde Y^{1} e Y^{2}
juntos representan el puente oxígeno -O-.
Compuestos especialmente preferidos de fórmula
I son aquellos en donde X representa oxo. Entre los compuestos de
20-espiroxano de fórmula IA en donde X representa
oxo, los más especialmente preferidos son aquellos en donde Y^{1}
junto con Y^{2} representa el puente oxígeno -O-.
Como ya se ha mencionado, el ácido
17\beta-hidroxi-21-carboxílico
puede encontrarse también en forma de sus sales. Entran en
consideración especialmente las sales de metales y de amonio, tales
como sales de metales alcalinos y de metales alcalinotérreos, por
ejemplo sales de sodio, calcio, magnesio y, preferentemente,
potasio, y sales amónicas derivadas de amoniaco o de una base
nitrogenada orgánica preferentemente tolerable desde el punto de
vista fisiológico. Como bases entran en consideración no solo las
aminas, por ejemplo, alquil(inferior)aminas (tal como
trietilamina),
hidroxi-alquil(inferior)aminas (tales
como 2-hidroxietilamina,
di-(2-hidroxietil)-amina o
tri-(2-hidroxietil)-amina),
cicloalquilaminas (tal como diciclohexilamina) o bencilaminas (tal
como bencilamina y N,N'-dibenciletilendiamina), sino
también los compuestos heterocíclicos nitrogenados, por ejemplo
aquellos de carácter aromático (tal como piridina o quinolina) o
aquellos que tienen un anillo heterocíclico al menos parcialmente
saturado (tales como N-etilpiperidina, morfolina,
piperazina o N,N'-dimetilpiperazina).
También se incluyen entre los compuestos
preferidos las sales de metales alcalinos, en especial las sales de
potasio, de compuestos de fórmula IA en donde R^{1} representa
alcoxicarbonilo, X representa oxo y cada uno de Y^{1} e Y^{2}
representan hidroxi.
Compuestos especialmente preferidos de fórmulas
I y IA son, por ejemplo, los siguientes:
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-etoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-metoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-isopropoxicarbonil-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
y los
1,2-dehidro-análogos de cada uno de
los compuestos;
9\alpha,11\alpha-epoxi-6\alpha,7\alpha-metileno-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,7\beta-metileno-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,7\beta;
15\beta,16\beta-bismetileno-20-espirox-4-eno-3,21-diona,
y los
1,2-dehidro-análogos de cada uno de
estos compuestos;
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-metoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-etoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-7\alpha-isopropoxicarbonil-17\beta-hidroxi-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\alpha,7\alpha-metileno-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\beta,7\beta-metileno-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetileno-3-oxo-pregn-4-eno-21-carboxílico,
y sales de metales alcalinos, en especial la sal
potásica, o amónicas de cada uno de estos ácidos, y también el
correspondiente 1,2-dehidro-análogo
de cada uno de los ácidos carboxílicos citados o de una sal de los
mismos;
éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-15\beta,16\beta-metileno-3,21-dioxo-20-espirox-4-eno-7\alpha-carboxílico,
éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-15\beta,16\beta-metileno-3,21-dioxo-20-espirox-1,4-dieno-7\alpha-carboxílico,
éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-3-oxo-20-espirox-4-eno-7\alpha-carboxílico,
9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,6\beta-metileno-20-espirox-4-en-3-ona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetileno-3,21-dioxo-20-espirox-4-en-3-ona,
éster metílico, éster etílico y éster
isopropílico de ácido
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha(3-hidroxipropil)-3-oxo-androst-4-eno-7\alpha-carboxílico,
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\alpha,7\alpha-metileno-androst-4-en-3-ona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\beta,7\beta-metileno-androst-4-en-3-ona,
9\alpha,11\alpha-epoxi-17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-6\beta,7\beta;15\beta,16\beta-bismetileno-androst-4-en-3-ona,
incluyendo los análogos de
17\alpha-(3-acetoxipropilo) y
17\alpha-(3-formiloxipropilo) de dichos compuestos
de androstano,
y también los 1,2-dehidro
análogos de todos los compuestos mencionados de las series
androst-4-en-3-ona
y
20-espirox-4-en-3-ona.
Los nombres químicos de los compuestos de
fórmulas I y IA y de los compuestos análogos que tienen los mismos
aspectos estructurales característicos, se derivan según la
nomenclatura corriente de la siguiente manera: para compuestos en
donde Y^{1} junto con Y^{2} representa -O-, de
20-espiroxano (por ejemplo, un compuesto de fórmula
IA en donde X representa oxo e Y^{1} junto con Y^{2} representa
-O- se deriva de
20-espiroxan-21-ona);
para aquellos en donde cada uno de Y^{1} e Y^{2} representa
hidroxi y X representa oxo, de ácido
17\beta-hidroxi-17\alpha-pregneno-21-carboxílico;
y para aquellos en donde cada uno de Y^{1} e Y^{2} representa
hidroxi y X representa dos átomos de hidrógeno, de
17\beta-hidroxi-17\alpha-(3-hidroxipropil)-androstano.
Dado que las formas cíclicas y de cadena abierta, es decir,
lactonas y ácidos
17\beta-hidroxi-21-carboxílicos
y sus sales, respectivamente, están tan estrechamente relacionadas
entre sí que las últimas pueden ser consideradas meramente como una
forma hidratada de las primeras, ha de entenderse tanto
anteriormente como a continuación, salvo que se indique
específicamente lo contrario, tanto en los productos finales de
fórmula I como en los materiales de partida y compuestos intermedios
de estructura análoga, en cada caso todas las formas mencionadas de
manera conjunta.
Se han desarrollado varios esquemas de
procedimientos separados empleando el procedimiento de la invención
para la preparación de compuestos de fórmula I en alto rendimiento
y a un coste razonable. Cada uno de los esquemas de síntesis procede
a través de la preparación de una serie de compuestos
intermedios.
Esquema
1
(A partir de canrenona o de un
material
relacionado)
Uno de los esquemas de procedimiento preferidos
para la preparación de compuestos de fórmula I comienza
convenientemente con canrenona o un material de partida relacionado
correspondiente a la fórmula XIII (o, alternativamente, el
procedimiento puede comenzar con androstendiona o un material de
partida relacionado)
en
donde:
-A-A- representa en grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3}, R^{4} y R^{5} se eligen
independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxialquilo,
alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y ariloxi;
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo alfa- o
beta-orientado:
en donde R^{6} y R^{7} se
eligen independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
alcoxi inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y
ariloxi;
y
R^{8} y R^{9} se eligen independientemente
del grupo consistente en hidrógeno, hidroxi, halo, alcoxi inferior,
acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo,
alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o bien R^{8} y
R^{9} juntos comprenden ceto, una estructura de anillo
carbocíclico o heterocíclico, o bien R^{8} o R^{9} juntos con
R^{6} o R^{7} comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico condensado al anillo pentacíclico D.
Empleando un procedimiento de bioconversión del
tipo ilustrado en las Figuras 1 y 2, se introduce un grupo
11-hidroxi de orientación \alpha en el compuesto
de fórmula XIII, para producir así un compuesto de fórmula VIII:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. Preferentemente, el compuesto de fórmula XIII
tiene la
estructura
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto
11\alpha-hidroxi tiene la
estructura
en cada una de las
cuales:
-A-A- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o -CH=CH-;
-B-B- representa el grupo
-CH_{2}-CH_{2}- o un grupo
alfa-o beta-orientado:
R^{3} es hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi
inferior;
X representa dos átomos de hidrógeno, oxo o
=S;
Y^{1} e Y^{2} juntos representan el puente
oxígeno -O-, o bien
Y^{1} representa hidroxi y
Y^{2} representa hidroxi, alcoxi inferior o,
si X representa H_{2}, también alcanoiloxi inferior;
y sales de los compuestos en donde X representa
oxo e Y^{2} representa hidroxi. Más preferentemente, el compuesto
de fórmula VIIIA producido en la reacción corresponde a un compuesto
de fórmula VIIIA en donde -A-A- y
-B-B- son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}-; R^{3} es hidrógeno; Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en al fórmula XIIIA; y R^{8} y
R^{9} juntos forman la estructura
20-espiroxano:
Entre los organismos preferidos que pueden ser
usados en esta etapa de hidroxilación se encuentran Aspergillus
ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500,
Aspergillus niger ATCC 16888 y ATCC 26693, Aspergillus
nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145,
Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Streptomyces fradiae
ATCC 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas
cruciviae ATCC 13262, y Trichothecium roseum ATCC 12543.
Otros organismos preferidos incluyen Fusarium oxysporum ATCC
11171 y Rhizopus arrhizus ATCC 11145.
Otros organismos que han exhibido actividad en
esta reacción incluyen Absidia coerula ATCC 6647, Absidia
glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476,
Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus
ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 y ATCC 13144,
Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora
ATCC 14767, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora
cassiicola ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC
8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655,
Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia clavata
ATCC 22921, Curvularia lunata ACTT 12017, Cylindrocarpon
radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722,
Gongronella butleri ATCC 22822, Hypomyces
chrysospermus ATCC IMI 109891, Mortierella isabellina
ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor
griseo-cyanus ATCC 1207A, Myrothecium
verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina ATCC 19070,
Paecilomyces carneus ATCC 46579, Penicillum patulum
ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFa
6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium
sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635,
Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachylidium bicolor
ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438,
Streptomyces purpurascens ATCC 25489, Syncephalastrum
racemosum ATCC 18192, Thamnostylum piriforme ATCC 8992,
Thielavia terricola ATCC 13807, y Verticillium
theobromae ATCC 12474.
Otros organismos que cabe esperar muestren
actividad para la 11\alpha-hidroxilación incluyen
Cephalosporium aphidicola (Phytochemistry (1996),
42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas
(J. Biotechno1. (1995), 42(2), 145-150),
Tieghemella orchidis (Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7),
871-876), Tieghemella hyalospora
(Khim.-Farm.Zh. (1986), 20(7), 871-876),
Monosporium olivaceum (Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973),
5(2), 103-110), Aspergillus ustus
(Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110), Fusarium graminearum (Acta
Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110), Verticillium glaucum (Acta
Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2),
103-110), y Rhizopus nigricans (J. Steroid
Biochem. (1987), 28 (2), 197-201).
Los derivados 11\beta-hidroxi
de androstendiona y mexrenona se pueden preparar de acuerdo con los
procedimientos de bioconversión indicados en los ejemplos 19A y
19B, respectivamente. Los inventores han llegado a la hipótesis por
analogía de que el correspondiente isómero
\beta-hidroxi del compuesto de fórmula VIII que
tiene un sustituyente C11 \beta-hidroxi en lugar
de un sustituyente C11 \alpha-hidroxi, puede
prepararse también usando un procedimiento de bioconversión similar
utilizando microorganismos adecuados capaces de realizar la
11\beta-hidroxilación, tal como uno o más de los
microorganismos aquí descritos.
Como preparación a la fermentación a escala de
producción para la hidroxilación de canrenona o de otros sustratos
de fórmula XIII, se prepara un inóculo de células en un sistema de
fermentación seminal que comprende un fermentador seminal o una
serie de dos o más fermentadores seminales. Se introduce una
suspensión madre de esporas de trabajo en el primer fermentador
seminal, junto con una solución nutriente para el crecimiento de
células. Si el volumen de inóculo deseado o necesario para la
producción excede del producido en el primer fermentador seminal, el
volumen de inóculo se puede ampliar progresiva y geométricamente
mediante progresión a través de los restantes fermentadores del tren
de fermentación seminal. Preferentemente, el inóculo producido en
el sistema de fermentación seminal es suficiente en cuanto a
volumen y células viables para conseguir el inicio rápido de la
reacción en el fermentador de producción, ciclos de producción
discontinua relativamente cortos y alta actividad en el fermentador
de producción. Independientemente del número de recipientes
empleados en un tren de fermentadores seminales, el segundo
fermentador seminal y los posteriores son de un tamaño
preferentemente tal que el grado de dilución en cada etapa del tren
es esencialmente el mismo. La dilución inicial del inóculo en cada
fermentador seminal puede ser aproximadamente la misma que la
dilución en el fermentador de producción. Se carga canrenona u otro
sustrato de fórmula XIII
en el fermentador de producción junto con inóculo y solución nutriente y se realiza allí la reacción de hidroxilación.
en el fermentador de producción junto con inóculo y solución nutriente y se realiza allí la reacción de hidroxilación.
La suspensión de esporas cargada en el sistema
de fermentación seminal procede de un vial de suspensión madre de
esporas de trabajo tomada de varios viales que constituyente un
banco de células de trabajo guardado bajo condiciones criogénicas
antes de su uso. El banco de células de trabajo se deriva a su vez
de un banco de células cebadas que ha sido preparado del siguiente
modo. Una muestra de esporas obtenida de una fuente adecuada, por
ejemplo, ATCC, se suspende inicialmente en un medio acuoso tal como,
por ejemplo, solución de salina, solución nutriente o una solución
surfactante (por ejemplo, un surfactante no iónico tal como Tween 20
a una concentración de alrededor de 0,001% en peso) y la suspensión
se distribuye entre placas de cultivo, portando cada placa una
mezcla nutriente sólida, basada normalmente en un polisacárido no
digerible tal como agar, en donde se propagan las esporas. La
mezcla nutriente sólida contiene preferentemente entre 0,5 y 5% en
peso aproximadamente de glucosa, entre 0,05 y 5% en peso
aproximadamente de una fuente de nitrógeno, por ejemplo peptona,
entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de una fuente de fósforo,
por ejemplo, un fosfato amónico o de metal alcalino tal como
hidrogenofosfato dipotásico, entre 0,25 y 2,5% en peso
aproximadamente de lisado o extracto de levadura (u otra fuente de
aminoácidos, tal como extracto de carne o infusión de
cerebro-corazón), entre 1 y 2% en peso
aproximadamente de agar u otro polisacárido no digerible.
Opcionalmente, la mezcla nutriente sólida puede comprender y/o
contener además entre 0,1 y 5% en peso aproximadamente de extracto
de malta. El pH de la mezcla nutriente sólida se encuentra
preferentemente entre 5 y 7 aproximadamente, ajustado según se
requiera mediante hidróxido de metal alcalino o ácido
orto-fosfórico. Entre los medios de crecimiento
sólidos útiles se encuentran los siguientes:
- 1. Medio sólido #1:
- 1% glucosa, 0,25% extracto de levadura, 0,3% K_{2}HPO_{4} y 2% agar (Bacto); pH ajustado a 6,5 con 20% NaOH.
- 2. Medio sólido #2:
- 2% peptona (Bacto), 1% extracto de levadura (Bacto), 2% glucosa y 2% agar (Bacto); pH ajustado a 5 con 10% H_{3}PO_{4}.
- 3. Medio sólido #3:
- 0,1% peptona (Bacto), 2% extracto de malta (Bacto), 2% glucosa y 2% agar (Bacto); pH 5,3.
- 4. Medio líquido:
- 5% mezclas residuales, 0,5% licor de maceración de maíz, 0,25% glucosa, 0,25% NaCl y 0,5% KH_{2}PO_{4}, pH ajustado a 5,8.
5. Agar Micológico Difco (pH
bajo).
El número de placas de agar usadas en el
desarrollo de un banco de células cebadas se puede seleccionar con
vistas a futuras demandas de material cebado, pero normalmente se
preparan de este modo de 15 a 30 placas aproximadamente. Después de
un periodo de crecimiento adecuado, por ejemplo 7 a 10 días, las
placas se rascan en presencia de un vehículo acuoso, normalmente
salina o tampón, para recoger las esporas, y la suspensión de
material cebado resultante se divide entre diales pequeños, por
ejemplo 1 ml, en cada uno de una pluralidad de viales de 1,5 ml.
Para preparar una suspensión de esporas de trabajo de utilidad en
operaciones de investigación o de fermentación productiva, el
contenido de uno o más de estos viales de material cebado de segunda
generación se puede distribuir entre placas de agar e incubarse
sobre estas últimas del modo anteriormente descrito para la
preparación de la suspensión de esporas de material cebado. Cuando
se contemplan operaciones de producción rutinarias, se puede
emplear tantas como de 100 a 400 placas para generar material de
trabajo de segunda generación. Cada una de las placas es rasgada al
interior de un vial de material de trabajo separado, conteniendo
normalmente cada vial 1 ml del inóculo producido. Para una
conservación permanente, tanto la suspensión de material cebado
como el inóculo de producción de segunda generación se guardan
convenientemente en el espacio de vapor de un recipiente de
almacenamiento criogénico que contiene N_{2} líquido u otro
líquido criogénico.
En el proceso ilustrado en la Figura 1, se
prepara medio de crecimiento acuoso que incluye una fuente de
nitrógeno tal como peptona, un derivado de levadura o equivalente,
glucosa y una fuente de fósforo tal como una sal fosfato. Las
esporas del microorganismo se cultivan en este medio en el sistema
de fermentación seminal. El microorganismo preferido es
Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). El material
seminal así producido se introduce entonces en el fermentador de
producción junto con el sustrato de fórmula XIII. El caldo de
fermentación se agita y se airea durante un tiempo suficiente para
que la reacción proceda hasta el grado deseado de término de la
misma.
El medio para el fermentador seminal comprende
preferentemente una mezcla acuosa que contiene: entre 0,5 y 5% en
peso aproximadamente de glucosa, entre 0,05 y 5% en peso
aproximadamente de una fuente de nitrógeno, por ejemplo peptona,
entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de una fuente de fósforo,
por ejemplo un fosfato amónico o de metal alcalino tal como fosfato
monobásico de amonio o hidrogenofosfato dipotásico, entre 0,25 y
2,5% en peso aproximadamente de lisado o extracto de levadura (u
otra fuente de aminoácidos tal como solubles de destilador), entre
1 y 2% en peso aproximadamente de agar u otro polisacárido no
digerible. Un medio de crecimiento seminal particularmente
preferido contiene entre 0,05 y 5% en peso aproximadamente de una
fuente de nitrógeno tal como peptona, entre 0,25 y 2,5% en peso
aproximadamente de levadura autolisada o extracto de levadura,
entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de glucosa y entre 0,05 y
0,5% en peso aproximadamente de una fuente de fósforo tal como
fosfato monobásico de amonio. Se consiguen operaciones en el proceso
especialmente económicas mediante el uso de otro cultivo seminal
preferido que contiene entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de
licor de maceración de maíz, entre 0,25 y 2,5% en peso
aproximadamente de levadura autolisada o extracto de levadura,
entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de glucosa y entre 0,05 y
0,5% en peso aproximadamente de fosfato monobásico de amonio. El
licor de maceración de maíz es una fuente particularmente económica
de proteínas, péptidos, carbohidratos, ácidos orgánicos, vitaminas,
iones metálicos, trazas de materias y fosfatos. Se pueden emplear
licores de maceración procedentes de otros granos en lugar del licor
de maceración de maíz o además de este último. El pH del medio se
ajusta preferentemente dentro de la gama de alrededor de 5 a 7, por
ejemplo, por adición de un hidróxido de metal alcalino o ácido
orto-fosfórico. Cuando se emplea el licor de
maceración de maíz como la fuente de nitrógeno y carbono, el pH se
ajusta preferentemente dentro de la gama de alrededor de 6,2 a 6,8.
El medio que comprende peptona y glucosa se ajusta preferentemente a
un pH entre 5,4 y 6,2 aproximadamente. Entre los medios de
crecimiento útiles para utilizarse en la fermentación seminal se
encuentran:
- 1. Medio #1:
- 2% peptona, 2% levadura autolisada (o extracto de levadura) y 2% glucosa; pH ajustado a 5,8 con 20% NaOH.
- 2. Medio #2:
- 3% licor de maceración de maíz, 1,5% extracto de levadura, 0,3% fosfato monobásico de amonio y 3% glucosa; pH ajustado a 6,5 con 20% NaOH.
Las esporas del microorganismo se introducen en
este medio desde un vial que contiene generalmente cerca de
10^{9} esporas por ml de suspensión. Se consigue la producción
óptima de generación seminal cuando la dilución con medio de
crecimiento al comienzo de un cultivo seminal no reduce la densidad
de población de esporas por debajo de alrededor de 10^{7} por ml.
Con preferencia, las esporas se cultivan en el sistema de
fermentación seminal hasta que el volumen micelial empacado (PMV)
en el fermentador seminal es de al menos 20% aproximadamente, con
preferencia de alrededor de 35 a 45%. Puesto que el ciclo en el
recipiente de fermentación seminal (o en cualquier recipiente de
una pluralidad que comprenden un tren de fermentación seminal)
depende de la concentración inicial en dicho recipiente, puede ser
conveniente proporcionar dos o tres etapas de fermentación seminal
para acelerar todo el proceso. Sin embargo, es preferible evitar el
uso de más de tres fermentadores seminales en serie, puesto que la
actividad puede verse comprometida en el caso de que la fermentación
seminal se efectúe a través de un número excesivo de etapas. La
fermentación de cultivo seminal se efectúa bajo agitación a una
temperatura de alrededor de 23 a 37ºC, con preferencia entre 24 y
28ºC aproximadamente.
El cultivo del sistema de fermentación seminal
se introduce en un fermentador de producción, junto con un medio de
crecimiento productivo. En una modalidad de la invención, la
canrenona no estéril u otro sustrato de fórmula XIII sirve como
sustrato para la reacción. Preferentemente, el sustrato se añade al
fermentador de producción en forma de una suspensión al
10-30% en peso en medio de crecimiento. Para
aumentar el área superficial disponible para la reacción de
11\alpha-hidroxilación, el tamaño de partícula del
sustrato de fórmula XIII se reduce pasando el sustrato a través de
un micronizador fuera de línea antes de introducirse en el
fermentador. Un material de alimentación nutriente estéril que
contiene glucosa, y una segunda solución nutriente estéril que
contiene un derivado de levadura tal como levadura autolisada (o
formulación equivalente de aminoácidos basada en fuentes
alternativas tales como solubles de destilador), se introducen
también por separado. El medio comprende una mezcla acuosa que
contiene: entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de glucosa, entre
0,05 y 5% en peso aproximadamente de una fuente de nitrógeno, por
ejemplo, peptona, entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de una
fuente de fósforo, por ejemplo, un fosfato amónico o de metal
alcalino tal como hidrogenofosfato dipotásico, entre 0,25 y 2,5% en
peso aproximadamente de lisado o extracto de levadura (u otra fuente
de aminoácidos tal como solubles de destilador), entre 1 y 2% en
peso aproximadamente de agar u otro polisacárido no digerible. Un
medio de crecimiento productivo particularmente preferido contiene
entre 0,05 y 5% en peso aproximadamente de una fuente de nitrógeno
tal como peptona, entre 0,25 y 2,5% en peso aproximadamente de
levadura autolisada o extracto de levadura, entre 0,5 y 5% en peso
aproximadamente de glucosa y entre 0,05 y 0,5% en peso
aproximadamente de una fuente de fósforo tal como fosfato
monobásico de amonio. Otro medio de producción preferido contiene
entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de licor de maceración de
maíz, entre 0,25 y 2,5% en peso aproximadamente de levadura
autolisada o extracto de levadura, entre 0,5 y 5% en peso
aproximadamente de glucosa y entre 0,05 y 0,5% en peso
aproximadamente de fosfato monobásico de amonio. El pH del medio de
fermentación productiva se ajusta preferentemente del modo antes
descrito para el medio de fermentación seminal, con las mismas gamas
preferidas para el pH del medio basado en peptona/glucosa y del
medio basado en licor de maceración de maíz, respectivamente. A
continuación se indican medios de crecimiento por bioconversión
útiles:
- 1. Medio #1:
- 2% peptona, 2% levadura autolisada (o extracto de levadura) y 2% glucosa; pH ajustado a 5,8 con 20% NaOH.
- 2. Medio #2:
- 1% peptona, 1% levadura autolisada (o extracto de levadura) y 2% glucosa; pH ajustado a 5,8 con 20% NaOH.
- 3. Medio #3:
- 0,5% peptona; 0,5% levadura autolisada (o extracto de levadura) y 2% glucosa; pH ajustado a 5,8 con 20% NaOH.
- 4. Medio #4:
- 3% licor de maceración de maíz, 1,5% extracto de levadura, 0,3% fosfato monobásico de amonio y 3% glucosa; pH ajustado a 6,5 con 20%.
- 5. Medio #5:
- 2,55% licor de maceración de maíz, 1,275% extracto de levadura, 0,255% fosfato monobásico de amonio y 3% glucosa; pH ajustado a 6,5 con 20%.
- 6. Medio #6:
- 2,1% licor de maceración de maíz, 1,05% extracto de levadura, 0,21% fosfato monobásico de amonio y 3% glucosa; pH ajustado a 6,5 con 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
La canrenona no estéril y las soluciones
nutrientes estériles se alimentan en cadena al fermentador de
producción en aproximadamente cinco a veinte, con preferencia diez
a quince porciones, con preferencia sustancialmente iguales, cada
una de ellas durante el ciclo discontinuo de producción.
Convenientemente, el sustrato se introduce inicialmente en una
cantidad suficiente para establecer una concentración entre 0,1 y 3%
en peso aproximadamente, con preferencia entre 0,5 y 2% en peso
aproximadamente, antes de la inoculación con el caldo de
fermentación seminal, añadiéndose entonces periódicamente, de forma
conveniente cada 8-24 horas, a una proporción
acumulativa del orden de 1 a 8% en peso aproximadamente. Cuando se
añade sustrato adicional en cada turno de 8 horas, la adición total
puede ser ligeramente inferior, por ejemplo 0,25 a 2,5% en peso, que
en el caso en donde el sustrato se añade solo diariamente. En este
último caso, puede ser necesario que la adición acumulativa de
canrenona sea de 2 a 8% en peso aproximadamente. La mezcla nutriente
suplementaria, alimentada durante la reacción de fermentación, es
con preferencia un concentrado, por ejemplo, una mezcla que contiene
entre 40 y 60% en peso aproximadamente de glucosa estéril y entre
16 y 32% en peso aproximadamente de extracto de levadura estéril u
otra fuente estéril de derivado de levadura (u otra fuente de
aminoácidos). Dado que el sustrato alimentado al fermentador de
producción de la Figura 1 es no estéril, periódicamente se añaden
antibióticos al caldo de fermentación para controlar el crecimiento
de organismos indeseados. Los antibióticos tales como kanamicina,
tetraciclina y cefalexina se pueden añadir sin afectar de manera
desventajosa al crecimiento y la bioconversión. Con preferencia,
estos antibióticos se introducen en el caldo de fermentación en una
concentración, por ejemplo, entre 0,0004 y 0,002% en peso
aproximadamente basado en la cantidad total del caldo,
comprendiendo, por ejemplo, entre 0,0002 y 0,0006% aproximadamente
de sulfato de kanamicina, entre 0,0002 y 0,006% aproximadamente de
hidrocloruro de tetraciclina y/o entre 0,001 y 0,003%
aproximadamente de cefalexina, de nuevo basado en la cantidad total
de caldo.
Normalmente, el ciclo discontinuo de
fermentación productiva se encuentra próximo a
80-160 horas aproximadamente. De este modo, se
añaden normalmente porciones de cada uno de los sustratos de
fórmula XIII y de las soluciones nutrientes cada
2-10 horas aproximadamente, con preferencia cada
4-6 horas aproximadamente. De manera conveniente,
se incorpora también un antiespumante en el sistema de fermentación
seminal y en el fermentador de producción.
Preferentemente, en el procedimiento de la
Figura 1, la carga de inóculo al fermentador de producción es de
alrededor de 0,5 a 7%, más preferentemente de alrededor de 1 a 2%,
en volumen basado en la mezcla total del fermentador, y la
concentración de glucosa se mantiene entre 0,01 y 1%
aproximadamente, con preferencia entre 0,025 y 0,5% aproximadamente,
más preferentemente entre 0,05 y 0,25% en peso aproximadamente con
adiciones periódicas que preferentemente consisten en porciones de
alrededor de 0,05 a 0,25% en peso, basado en la carga total del
lote. La temperatura de fermentación se controla convenientemente
dentro de la gama de 20 a 37ºC aproximadamente, con preferencia en
alrededor de 24 a 28ºC, pero puede ser deseable reducir la
temperatura durante la reacción, por ejemplo, en incrementos de 2ºC,
para mantener el volumen micelial empacado (PMV) por debajo del 60%
aproximadamente, más preferentemente por debajo de alrededor de
50%, y evitar con ello que la viscosidad del caldo de fermentación
interfiera con una operación de mezcla satisfactoria. Si el
crecimiento de biomasas se extiende por encima de la superficie del
líquido, el sustrato retenido dentro de la biomasa puede salir de
la zona de reacción y de este modo no queda disponible para la
reacción de hidroxilación. Con vistas a la productividad, es
conveniente alcanzar un PMV del orden de 30 a 50%, con preferencia
de 35 a 45%, dentro de las primeras 24 horas de la reacción de
fermentación, pero a continuación las condiciones se controlan
preferentemente para regular el crecimiento adicional dentro de los
límites antes indicados. Durante la reacción, el pH del medio de
fermentación se controla entre 5 y 6,5 aproximadamente, con
preferencia entre 5,2 y 5,8 aproximadamente, y el fermentador se
agita a una velocidad entre 400 y 800 rpm aproximadamente. Se
consigue un nivel de oxígeno disuelto de al menos 10% de la
saturación aproximadamente mediante aireado del lote entre 0,2 y 1
vvm aproximadamente, y manteniendo la presión en el espacio de
cabeza del fermentador entre la presión atmosférica y 1 bar
manométrico aproximadamente, más preferentemente cerca de 0,7 bares
manométricos aproximadamente. La velocidad de agitación también se
puede aumentar según sea necesario para mantener niveles mínimos de
oxígeno disuelto. Convenientemente, el oxígeno disuelto se mantiene
muy por encima de alrededor de 10%, de hecho en valores tan
elevados como del 50% aproximadamente, para promover la conversión
del sustrato. El mantenimiento del pH en la gama de 5,5 \pm 0,2
resulta también óptimo para la bioconversión. El espumado se
controla en la forma necesaria mediante adición de un agente
antiespumante común. Una vez añadido todo el sustrato, la reacción
se continúa preferentemente hasta que la relación molar del
producto de fórmula VIII al sustrato de fórmula XIII que queda sin
reaccionar es de al menos 9:1 aproximadamente. Dicha conversión se
puede conseguir dentro del ciclo discontinuo de
80-160 horas anteriormente indicado.
Se ha comprobado que las altas conversiones
están asociadas con el agotamiento de los niveles de nutriente
iniciales por debajo del nivel de carga inicial y mediante el
control de la velocidad de aireación y velocidad de agitación para
evitar el salpicado del sustrato fuera del caldo de líquido. En el
proceso de la Figura 1, el nivel de nutrientes se agotó y luego se
mantuvo a un nivel no mayor de alrededor de 60%, con preferencia
alrededor de 50%, del nivel de carga inicial; mientras que en los
procesos de las Figuras 2 y 3, el nivel de nutriente se redujo y se
mantuvo en no más de alrededor de 80%, con preferencia de alrededor
del 70%, del nivel de carga inicial. La velocidad de aireación
preferentemente no es mayor de 1 vvm, más preferentemente del orden
de alrededor de 0,5 vvm; mientras que la velocidad de agitación
preferentemente no es mayor de 600 rpm.
Un proceso particularmente preferido para la
preparación de un compuesto de fórmula VIII se ilustra en la Figura
2. Un microorganismo preferido para la
11\alpha-hidroxilación de un compuesto de fórmula
XIII (por ejemplo, canrenona) es Aspergillus ochraceus NRRL
405 (ATCC 18500). En este proceso, el medio de crecimiento
comprende con preferencia entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente de
licor de maceración de maíz, entre 0,5 y 5% en peso aproximadamente
de glucosa, entre 0,1 y 3% en peso aproximadamente de extracto de
levadura y entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de fosfato
amónico. Sin embargo, también se pueden emplear otros medios de
crecimiento productivo como aquí se han descrito. El cultivo seminal
se prepara esencialmente del modo descrito para el proceso de la
Figura 1, usando cualquiera de los medios de fermentación seminal
aquí descritos. Se prepara asépticamente, en un mezclador, una
suspensión de canrenona no micronizada o de otro sustrato de
fórmula XIII en el medio de crecimiento, con preferencia a una
concentración relativamente alta comprendida entre 10 y 30% en peso
aproximadamente de sustrato. Con preferencia, la preparación
aséptica puede comprender la esterilización o pasteurización de la
suspensión después de la mezcla. La cantidad entera de la
suspensión de sustrato estéril requerida para un lote de producción
se introduce en el fermentador de producción al comienzo de la
preparación del lote o mediante alimentación periódica en cadena. El
tamaño de partícula del sustrato se reduce mediante molienda en
húmedo en una bomba de esfuerzo cortante, en línea, que transfiere
la suspensión al fermentador de producción, evitando así la
necesidad de utilizar un micronizador fuera de línea. Cuando las
condiciones asépticas se consiguen mediante pasteurización en lugar
de esterilización, el grado de aglomeración puede ser
insignificante, pero el uso de una bomba de esfuerzo cortante puede
ser conveniente para proporcionar un control positivo del tamaño de
partícula. Se introducen medio de crecimiento estéril y solución de
glucosa en el fermentador de producción esencialmente de la misma
manera que la descrita anteriormente. Todos los componentes de
alimentación al fermentador de producción son esterilizados antes de
introducirse, de manera que no se requieren antibióticos.
Preferentemente, en la realización del proceso
de la Figura 2, el inóculo se introduce en el fermentador de
producción en una proporción comprendida entre 0,5 y 7%
aproximadamente, la temperatura de fermentación es de alrededor de
20 a 37ºC, con preferencia de alrededor de 24 a 28ºC, y el pH se
controla entre 4,4 y 6,5 aproximadamente, con preferencia entre 5,3
y 5,5 aproximadamente, por ejemplo, mediante introducción de
amoniaco gaseoso, hidróxido amónico acuoso, hidróxido de metal
alcalino acuoso o ácido orto-fosfórico. Como en el
proceso de la Figura 1, la temperatura se ajusta preferentemente
para controlar el crecimiento de la biomasa de manera que el PMV no
exceda de 55-60%. La carga de glucosa inicial es
con preferencia de 1 a 4% en peso aproximadamente, más
preferentemente de 2,5 a 3,5% en peso, pero con preferencia se
permite que descienda por debajo de 1% en peso aproximadamente
durante la fermentación. La glucosa suplementaria se alimenta
periódicamente en porciones de 0,2 a 1% en peso aproximadamente,
basado en la carga total del lote, con el fin de mantener la
concentración de glucosa en la zona de fermentación dentro de la
gama de 0,1 a 1,5% en peso aproximadamente, con preferencia entre
0,25 y 0,5% en peso aproximadamente. Opcionalmente, junto con la
glucosa se pueden suplementar fuentes de nitrógeno y fósforo. Sin
embargo, debido a que toda la carga de canrenona se efectúa al
comienzo del ciclo de producción del lote, en ese momento se puede
introducir también el suministro requerido de nutrientes portadores
de nitrógeno y fósforo, permitiendo ello el uso de solo una
solución de glucosa para la suplementación durante la reacción. La
velocidad y naturaleza de la agitación es una variable importante.
Una agitación moderadamente vigorosa promueve la transferencia de
masa entre el sustrato sólido y la fase acuosa. Sin embargo, deberá
utilizarse un impulsor de bajo esfuerzo cortante para evitar la
degradación de la mielina de los microorganismos. La velocidad de
agitación óptima varía dentro de la gama de 200 a 800 rpm,
dependiendo de la viscosidad del caldo de cultivo, concentración de
oxígeno y condiciones de mezcla, resultando también afectada por la
configuración del recipiente, deflectores e impulsor. Normalmente,
una velocidad de agitación preferida es de 350-600
rpm. Con preferencia, el impulsor agitador proporciona una función
de bombeo axialmente descendente con el fin de ayudar a realizar una
buena mezcla de la biomasa fermentada. El lote es aireado
preferentemente a una velocidad entre 0,3 y 1 vvm aproximadamente,
con preferencia entre 0,4 y 0,8 vvm, y la presión en el espacio de
cabeza del fermentador se encuentra preferentemente entre 0,5 y 1
bar manométrico aproximadamente. La temperatura, la agitación, la
aireación y la retro-presión se controlan
preferentemente para mantener el oxígeno disuelto en la gama de por
lo menos 10% en volumen aproximadamente durante la bioconversión.
El ciclo total de producción del lote es normalmente de 100 a 140
horas aproximadamente.
Aunque el principio operativo del proceso de la
Figura 2 está basado en la introducción inicial de prácticamente
toda la carga de canrenona, se entenderá que el crecimiento del
caldo de fermentación se puede realizar antes de cargar el grueso
de la canrenona. Opcionalmente, también se puede añadir
posteriormente, en el lote, cierta porción de la canrenona. Sin
embargo, generalmente, al menos el 75% aproximadamente de la carga
estéril de canrenona deberá introducirse en el fermentador de
transformación en el plazo de 48 horas desde la iniciación de la
fermentación. Además, es conveniente introducir al menos un 25% en
peso aproximadamente de canrenona al comienzo de la fermentación o
al menos en el plazo de las primeras 24 horas, con el fin de
promover la generación de la enzima o enzimas de bioconversión.
En otro proceso preferido como el ilustrado en
la Figura 3, la totalidad de la carga del lote y la solución
nutriente se esterilizan en el recipiente de fermentación de
producción antes de introducir el inóculo. Las soluciones nutrientes
que pueden ser usadas, así como las preferencias entre ellas, son
esencialmente las mismas que en el proceso de la Figura 2. En esta
modalidad de la invención, la acción de esfuerzo cortante del
impulsor agitador rompe los aglomerados de sustrato que de otro
modo tienden a formarse tras la esterilización. Se ha comprobado que
la reacción procede satisfactoriamente si el tamaño medio de
partícula de la canrenona es menor de alrededor de 300 \mu y al
menos el 75% en peso de las partículas son más pequeñas que 240
\mu. Se ha comprobado que el uso de un impulsor adecuado, por
ejemplo, un turbo-impulsor de disco, a una velocidad
adecuada del orden de 200 a 800 rpm, con una velocidad en la punta
de al menos 400 cm/seg, proporciona una velocidad de esfuerzo
cortante suficiente para mantener dichas características de tamaño
de partícula a pesar de la aglomeración que tiende a presentarse
tras la esterilización dentro del fermentador de producción. El
resto del proceso de la Figura 3 es esencialmente el mismo que en
el caso del proceso de la Figura 2. Los procesos de las Figuras 2 y
3 ofrecen varias ventajas distintivas con respecto al proceso de la
Figura 1. Una ventaja particular es la posibilidad de utilizar una
base nutriente económica tal como licor de maceración de maíz. Sin
embargo, se consiguen otras ventajas como son la eliminación de la
necesidad de usar antibióticos, la simplificación de los
procedimientos de alimentación y el hecho de poder esterilizar la
canrenona u otro sustrato de fórmula XIII de forma discontinua. Otra
ventaja particular es la posibilidad de utilizar una simple
solución de glucosa en lugar de una solución nutriente compleja
para la suplementación durante el ciclo de
reacción.
reacción.
En los procesos mostrados en las Figuras 1 a 3,
el producto de fórmula VIII es un sólido cristalino que, junto con
la biomasa, se puede separar del caldo de reacción por filtración o
centrifugado a baja velocidad. Alternativamente, el producto puede
ser extraído de todo el caldo de reacción con disolventes
orgánicos. El producto de fórmula VIII se recupera mediante
extracción con disolvente. Para una recuperación máxima, tanto el
filtrado de la fase líquida como la torta de biomasa del filtro o
centrífuga, se tratan con disolvente de extracción, pero normalmente
\geq95% del producto queda asociado con la biomasa. Generalmente,
para la extracción se pueden emplear disolventes a base de
hidrocarburos, ésteres, hidrocarburos clorados y cetona. Un
disolvente preferido es acetato de etilo. Otros disolventes
habitualmente adecuados incluyen tolueno y metilisobutilcetona.
Para la extracción de la fase líquida, puede ser conveniente
utilizar un volumen de disolvente aproximadamente igual al volumen
de solución de reacción con la que entra en contacto. Para
recuperar producto de la biomasa, esta última se suspende en el
disolvente, preferentemente en un exceso grande con respecto a la
carga inicial de sustrato, por ejemplo, 50 a 100 ml de disolvente
por gramo de carga inicial de canrenona, y la suspensión resultante
se refluye preferentemente durante un periodo de alrededor de 20
minutos a varias horas para asegurar la transferencia de producto a
la fase disolvente desde los rebajos y poros de la biomasa. A
continuación, la biomasa se separa por filtración o centrifugado y
la torta del filtro se lava preferentemente con disolvente nuevo y
con agua desionizada. Los lavados acuosos y de disolvente se
combinan entonces y se dejan separar las fases. El producto de
fórmula VIII se recupera por cristalización en la solución. Para
lograr el máximo rendimiento, el micelio se pone en contacto dos
veces con disolvente nuevo. Después de sedimentar, para permitir la
separación completa de la fase acuosa, el producto se recupera de
la fase disolvente. Más preferentemente, el disolvente se separa
bajo vacío hasta que comienza la cristalización, tras lo cual el
extracto concentrado se enfría a una temperatura de alrededor de 0 a
20ºC, con preferencia alrededor de 10 a 15ºC, durante un tiempo
suficiente para que ocurra la precipitación y crecimiento de
cristales, normalmente durante un tiempo de alrededor de
8 a 12 horas.
8 a 12 horas.
Los procesos de la Figura 2 y en especial el
proceso de la Figura 3, son particularmente preferidos. Estos
procesos operan a baja viscosidad y son propensos a un control
estrecho de los parámetros de proceso, tales como pH, temperatura y
oxígeno disuelto. Además, las condiciones estériles se conservan
fácilmente sin tener que recurrir a antibióticos.
El proceso de bioconversión es exotérmico, de
manera que deberá disiparse el calor, usando un fermentador
encamisado o un serpentín de enfriamiento dentro del fermentador de
producción. Alternativamente, el caldo de reacción se puede hacer
circular a través de un intercambiador de calor externo. El oxígeno
disuelto se mantiene preferentemente a un nivel de por lo menos 5%
aproximadamente, con preferencia al menos 10% aproximadamente, en
volumen, suficiente para proporcionar energía para la reacción y
asegurar la conversión de la glucosa a CO_{2} y H_{2}O,
mediante regulación de la velocidad de aire introducido en el
reactor en respuesta a la medición del potencial de oxígeno en el
caldo. El pH se controla preferentemente entre 4,5 y 6,5
aproximadamente.
En cada uno de los procesos alternativos para la
11-hidroxilación del sustrato de fórmula XIII, la
productividad es limitada por la transferencia de masa desde el
sustrato sólido a la fase acuosa, o la interfase, en donde se
entiende que ocurre la reacción. Como se ha indicado anteriormente,
la productividad no es limitada de manera importante por las
velocidades de transferencia de masa en tanto en cuanto que el
tamaño medio de partícula del sustrato se reduzca a menos de 300
\mu aproximadamente y al menos el 75% en peso de las partículas
sean más pequeñas que 240 \mu. Sin embargo, la productividad de
estos procesos se puede mejorar aún más en ciertas modalidades
alternativas que proporcionan una carga sustancial de canrenona o de
otro sustrato de fórmula XIII al fermentador de producción en un
disolvente orgánico. De acuerdo con una de las opciones, el sustrato
se disuelve en un disolvente inmiscible en agua y se mezcla con el
medio de crecimiento acuoso, el inóculo y un surfactante.
Disolventes inmiscibles en agua adecuados incluyen, por ejemplo,
DMF, DMSO, ácidos grasos C_{6}-C_{12},
n-alcanos C_{6}-C_{12}, aceites
vegetales, sorbitanes y soluciones surfactantes acuosas. La
agitación de esta carga genera un sistema de reacción en emulsión
que tiene un área interfacial amplia para la transferencia de masa
de sustrato desde la fase líquida orgánica hacia los puntos de
reacción.
Una segunda opción consiste en disolver
inicialmente el sustrato en un disolvente miscible en agua tal como
acetona, metiletilcetona, metanol, etanol o glicerol, en una
concentración sustancialmente mayor que su solubilidad en agua.
Mediante la preparación de la solución de sustrato inicial a
temperatura elevada, se aumenta la solubilidad, aumentado con ello
adicionalmente la cantidad de sustrato en forma de solución
introducido en el reactor y mejorando finalmente la carga útil del
reactor. La solución de sustrato caliente se carga en el reactor de
fermentación de producción junto con la carga acuosa relativamente
fría que comprende medio de crecimiento e inóculo. Cuando la
solución de sustrato se mezcla con el medio acuoso, se presenta la
precipitación del sustrato. Sin embargo, bajo condiciones de
supersaturación sustancial y agitación moderadamente vigorosa, la
nucleación se ve favorecida con respecto al crecimiento de cristales
y se forman partículas muy finas de elevada área superficial. La
elevada área superficial promueve la transferencia de masa entre la
fase líquida y el sustrato sólido. Además, en presencia de un
disolvente miscible en agua se mejora también la concentración en
equilibrio de sustrato en la fase líquida acuosa. Por lo tanto, se
promueve la productividad.
Aunque el microorganismo puede no tolerar
necesariamente una elevada concentración de disolvente orgánico en
la fase acuosa, se puede emplear convenientemente una concentración
de etanol, por ejemplo, del orden de 3 a 5% en peso
aproximadamente.
Una tercera opción consiste en solubilizar el
sustrato en una solución acuosa de ciclodextrina. Ejemplos de
ciclodextrinas incluyen
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
y metil-\beta-ciclodextrina. La
relación molar de sustrato:ciclodextrina puede ser de alrededor de
1:0,5 a 1:1,5, más preferentemente de alrededor de 1:0,8 a 1:1. La
mezcla de sustrato:ciclodextrina se puede añadir entonces
asépticamente al reactor de bioconversión.
La 11\alpha-hidroxicanrenona y
otros productos del proceso de
11\alpha-hidroxilación (fórmulas VIII y VIIIA)
son compuestos nuevos que pueden ser aislados por filtración del
medio de reacción y extracción del producto de la biomasa recogida
en el medio de filtración. Para la extracción se pueden emplear
disolventes orgánicos convencionales, por ejemplo, acetato de
etilo, acetona, tolueno, hidrocarburos clorados y
metilisobutilcetona. El producto de fórmula VIII no se puede
recristalizar entonces en un disolvente orgánico del mismo tipo. Los
compuestos de fórmula VIII tienen un valor importante como
compuestos intermedios para la preparación de compuestos de fórmula
I y especialmente de fórmula IA.
Preferentemente, los compuestos de fórmula VIII
corresponden a la fórmula VIIIA en donde -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior, y R^{8}
y R^{9} juntos constituyen el anillo
20-espiroxano:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además, de acuerdo con el proceso del Esquema 1,
el compuesto de fórmula VIII se hace reaccionar, bajo condiciones
alcalinas, con una fuente de ión cianuro para producir un compuesto
de enamina de fórmula VII
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como
anteriormente. Cuando el sustrato corresponde a la fórmula VIIIA,
el producto es de fórmula
VIIA
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, Y^{1}, Y^{2} y X se definen como
en la fórmula XIIIA. Preferentemente, R^{3} es
hidrógeno.
La cianuración del sustrato
11\alpha-hidroxilo de fórmula VIII se puede
realizar haciendo reaccionar el mismo con una fuente de ión cianuro
tal como cianohidrina de cetona, más preferentemente cianohidrina de
acetona, en presencia de una base y una sal de metal alcalino, más
preferentemente LiCl. Alternativamente, la cianuración se puede
efectuar sin cianohidrina utilizando un cianuro de metal alcalino en
presencia de un ácido.
En el proceso con cianohidrina de cetona, la
reacción se efectúa en solución, preferentemente usando un
disolvente polar aprótico tal como dimetilformamida o
dimetilsulfóxido. La formación de la enamina requiere al menos dos
moles de fuente de ión cianuro por mol de sustrato y preferentemente
se emplea un ligero exceso de al fuente de cianuro. La base es con
preferencia una base nitrogenada tal como una dialquilamina,
trialquilamina, alcanolamina, piridina o similar. Sin embargo,
también se pueden emplear bases inorgánicas tales como carbonatos
de metales alcalinos o hidróxidos de metales alcalinos.
Preferentemente, el sustrato de fórmula VIII está presente
inicialmente en una proporción entre 20 y 50% en peso
aproximadamente y la base está presente en una proporción entre 0,5
y 2 equivalentes por equivalente de sustrato. La temperatura de la
reacción no es crítica, pero la productividad se mejora trabajando
a temperatura elevada. Así, por ejemplo, cuando se emplea
trietilamina como la base, la reacción se efectúa convenientemente a
una temperatura de alrededor de 80 a 90ºC. A dichas temperaturas,
la reacción procede hasta su término en aproximadamente
5-20 horas. Cuando se utiliza diisopropiletilamina
como base y la reacción se efectúa a 105ºC, la reacción se completa
en 8 horas. Al término del periodo de reacción, el disolvente se
separa bajo vacío y el aceite residual se disuelve en agua y se
neutraliza a pH 7 con ácido diluido, preferentemente ácido
clorhídrico. El producto precipita de esta solución y luego se lava
con agua destilada y se seca al aire. El HCN liberado puede ser
separado con un gas inerte y enfriado rápidamente en una solución
alcalina. El precipitado seco se recibe en cloroformo o en otro
disolvente adecuado y luego se extrae con ácido concentrado, por
ejemplo, 6N HCl. El extracto se neutraliza a pH 7 por adición de
una base inorgánica, preferentemente un hidróxido de metal alcalino,
y se enfría a una temperatura del orden de 0ºC. El precipitado
resultante se lava y se seca y luego se recristaliza en un
disolvente adecuado, por ejemplo, acetona, para producir un producto
de fórmula VII adecuado para utilizarse en la siguiente etapa del
proceso.
Alternativamente, la reacción se puede efectuar
en un sistema disolvente acuoso que comprende disolvente orgánico
miscible en agua tal como metanol o en un sistema bifásico que
comprende agua y un disolvente orgánico tal como acetato de etilo.
En esta alternativa, el producto se puede recuperar diluyendo la
solución de reacción con agua y extrayendo a continuación el
producto por medio de un disolvente orgánico tal como cloruro de
metileno o cloroformo, y realizando entonces una nueva extracción
del extracto orgánico usando un ácido mineral concentrado, por
ejemplo, 2N HCl. Véase la Patente US 3.200.113.
De acuerdo con otra alternativa más, la
reacción se puede efectuar en un disolvente miscible en agua, tal
como dimetilformamida, dimetilacetamida,
N-metilpirrolidona o dimetilsulfóxido, tras lo cual
la solución de producto de reacción se diluye con agua y se
alcaliniza, por ejemplo, por adición de un carbonato de metal
alcalino, se enfría a 0-10ºC, causando con ello la
precipitación del producto. Preferentemente, el sistema se enfría
rápidamente con un hipohalito de metal alcalino o con otro reactivo
eficaz para prevenir el desprendimiento de cianuro. Después de la
filtración y lavado con agua, el producto precipitado es adecuado
para utilizarse en la siguiente etapa del proceso.
De acuerdo con una alternativa más, el producto
de enamina de fórmula VII se puede obtener por reacción de un
sustrato de fórmula VIII en presencia de una fuente de protones, con
un exceso de cianuro de metal alcalino, preferentemente NaCN, en un
disolvente acuoso que comprende un disolvente polar aprótico
miscible en agua tal como dimetilformamida o dimetilacetamida. La
fuente de protones es preferentemente un ácido mineral o ácido
carboxílico C_{1} a C_{5}, siendo particularmente preferido el
ácido sulfúrico. De manera anómala, no es necesario añadir una
fuente de protones por separado cuando el reactivo de cianuración
consiste en LiCN comercial en DMF.
En el reactor se carga preferentemente una
fuente de ión cianuro tal como una sal de metal alcalino, en una
proporción entre 2,05 y 5 equivalentes molares aproximadamente por
equivalente de sustrato. Se cree que el ácido mineral u otra fuente
de protones promueve la adición de HCN a través de los dobles
enlaces 4,5 y 6,7, y preferentemente está presente en una proporción
de al menos un equivalente molar por equivalente molar de sustrato;
sin embargo, el sistema de reacción deberá permanecer básico
manteniendo un exceso de cianuro de metal alcalino con respecto al
ácido presente. La reacción se efectúa preferentemente a una
temperatura de al menos 75ºC aproximadamente, en general de 60 a
100ºC, durante un periodo de alrededor de 1 a 8 horas, con
preferencia de alrededor de 1,5 a 3 horas. Al término del periodo de
reacción, la mezcla de reacción se enfría, preferentemente a
temperatura ambiente aproximadamente, y la enamina producto se
precipita por acidificación de la mezcla de reacción y mezcla de la
misma con agua fría, preferentemente a la temperatura del baño de
hielo aproximadamente. Se cree que la acidificación cierra la
17-lactona, la cual tiende a abrirse bajo las
condiciones básicas que prevalecen en la cianuración. La mezcla de
reacción se acidifica convenientemente usando el mismo ácido que
aquel que está presente durante la reacción, preferentemente ácido
sulfúrico. Preferentemente, se añade agua en una proporción entre
10 y 50 equivalentes molares aproximadamente por mol de
producto.
Los compuestos de fórmula VII son compuestos
nuevos y tienen un valor importante como compuestos intermedios para
la preparación de compuestos de fórmula I y especialmente de
fórmula IA. Preferentemente, los compuestos de fórmula VII
corresponden a la fórmula VIIA en donde -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior, y R^{8}
y R^{9} juntos constituyen el anillo
20-espiroxano:
Más preferentemente, el compuesto de fórmula VII
es 5'R(5'\alpha),
7'\beta-20'-aminohexadecahidro-11'\beta-hidroxi-10'\alpha,
13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furano-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo.
13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furano-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo.
En la conversión del compuesto de fórmula VIII a
la enamina de fórmula VII, se ha observado, por cromatografía en el
producto en bruto, el derivado 7-ciano del compuesto
de fórmula VIII. Se ha formulado la hipótesis de que el compuesto
7-ciano es un compuesto intermedio en el proceso de
conversión. También se ha formulado la hipótesis de que el propio
compuesto intermedio 7-ciano reacciona para formar
un segundo compuesto intermedio, el derivado
7,7-diciano del compuesto de fórmula VIII, el cual a
su vez reacciona para formar el enester. Véase, por ejemplo, R.
Christiansen et al., The Reaction of Steroidal
4,6-dien-3-ones with
Cyanide, Steroids, Vol. 1, Junio 1963, cuya publicación se
incorpora aquí solo con fines de referencia. Estos nuevos compuestos
tienen también utilidad como marcadores cromatográficos y también
como compuestos intermedios sintéticos. En una modalidad preferida
de esta etapa del proceso de síntesis general del Esquema 1, estos
compuestos intermedios son \gamma-lactona de
ácido
7\alpha-ciano-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-21-dicarboxílico
y \gamma-lactona de ácido
5\beta,7\alpha-diciano-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-21-dicarboxílico.
En la siguiente etapa de la síntesis del esquema
1, la enamina de fórmula VII se hidroliza para producir un
compuesto de dicetona de fórmula VI
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. Para la hidrólisis se puede emplear cualquier
ácido orgánico o minera acuoso. Se prefiere el ácido clorhídrico.
Para mejorar la productividad, se emplea preferentemente, como
codisolvente, un disolvente orgánico miscible en agua, tal como
dimetilacetamida o un alcanol inferior. Más preferentemente, el
disolvente es dimetilacetamida. El ácido deberá estar presente en
una proporción de por lo menos un equivalente por equivalente de
sustrato de fórmula VII. En un sistema acuoso, la enamina sustrato
de fórmula VII se puede convertir sustancialmente a la dicetona de
fórmula VI en un periodo de alrededor de 5 horas a 80ºC
aproximadamente. La operación a temperatura elevada aumenta la
productividad, pero la temperatura no es un factor crítico. Las
temperaturas adecuadas se eligen en base a la volatilidad del
sistema disolvente y del
ácido.
Preferentemente, el sustrato de enamina de
fórmula VII corresponde a la fórmula VIIA
y el producto de dicetona
corresponde a la fórmula
VIA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA. Preferentemente,
R^{3} es
hidrógeno.
Al término del periodo de reacción, la solución
se enfría a una temperatura entre 0 y 25ºC aproximadamente para
cristalizar el producto. Los cristales de producto se pueden
recristalizar en un disolvente adecuado tal como isopropanol o
metanol para producir un producto de fórmula VI adecuado para
utilizarse en la siguiente etapa del proceso; sin embargo, la
recristalización no es normalmente necesaria. Los productos de
fórmula VI son compuestos nuevos y tienen un valor importante como
compuestos intermedios para la preparación de compuestos de fórmula
I y en especial de fórmula IA. Preferentemente, los compuestos de
fórmula VI corresponden a la fórmula VIA en donde
-A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno, alquilo
inferior o alcoxi inferior, y R^{8} y R^{9} juntos constituyen
el anillo 20-espiroxano:
Más preferentemente, el compuesto de fórmula VI
es
4'S(4'\alpha),7'\alpha-hexadecahidro-11'\alpha-hidroxi-10'\beta,13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]ciclopenta[a]-fenantreno]-5'\beta(2'H)-carbonitrilo.
En una modalidad particularmente preferida de la
invención, la enamina producto de fórmula VII se obtiene a partir
del compuesto de fórmula VIII del modo antes descrito y se convierte
in situ a la dicetona de fórmula VI. En esta modalidad de la
invención, se hace reaccionar un sustrato de fórmula VIII con un
exceso de cianuro de metal alcalino en un disolvente acuoso que
contiene una fuente de protones u, opcionalmente, un exceso de
cianohidrina de cetona en presencia de una base y LiCl, como antes
se ha descrito. Sin embargo, en lugar de enfriar la mezcla de
reacción, acidificar y añadir agua en proporciones calculadas para
causar la precipitación de la enamina, se evita preferentemente un
enfriamiento importante de la mezcla de reacción. Al término de la
reacción de cianuración se añaden a la mezcla, en su lugar, agua y
un ácido, preferentemente un ácido mineral tal como sulfúrico. La
proporción añadida de ácido es suficiente para neutralizar el exceso
de cianuro de metal alcalino, lo cual requiere normalmente la
introducción de al menos un equivalente molar de ácido por mol de
sustrato de fórmula VIII, preferentemente entre 2 y 5 equivalentes
molares aproximadamente por equivalente de sustrato. Sin embargo,
la temperatura se mantiene suficientemente alta y la dilución es
también suficientemente grande, de manera que se evita la
precipitación sustancial y se deja que proceda, en fase líquida, la
hidrólisis de la enamina a la dicetona. De este modo, el proceso
procede con una interrupción mínima y con alta productividad. La
hidrólisis se efectúa preferentemente a una temperatura de por lo
menos 80ºC, más preferentemente de alrededor de 90 a 100ºC, durante
un periodo normalmente de 1 a 10 horas aproximadamente, más
preferentemente de alrededor de 2 a 5 horas. Se enfría entonces la
mezcla de reacción, preferentemente a una temperatura entre 0 y 15ºC
aproximadamente, convenientemente en un baño de hielo a
5-10ºC aproximadamente, para la precipitación de la
dicetona producto de fórmula VI. El producto sólido puede ser
recuperado, tal como por filtración, y las impurezas se reducen
mediante lavado con agua.
En la siguiente etapa de la síntesis del Esquema
1, se hace reaccionar el compuesto de dicetona de fórmula VI con un
alcóxido metálico para abrir el puente cetona entre las posiciones
4 y 7 por medio de la escisión del enlace entre el grupo carbonilo y
el carbono 4, formar un sustituyente alcoxicarbonilo
\alpha-orientado en la posición 7 y eliminar
cianuro en el carbono 5. El producto de esta reacción es un
compuesto de hidroxiéster correspondiente a la fórmula V
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII y R^{1} es alcoxi(inferior)carbonilo
o hidroxicarbonilo. El alcóxido metálico usado en la reacción
corresponde a la fórmula R^{10}OM en donde M es metal alcalino y
R^{10}O- corresponde al sustituyente alcoxi de R^{1}. Los
rendimientos de esta reacción son los más satisfactorios cuando el
alcóxido metálico es metóxido potásico o metóxido sódico, pero se
pueden emplear otros alcóxidos inferiores. Particularmente
preferido es un alcóxido potásico. También se pueden emplear
fenóxidos, otros arilóxidos, así como arilsulfuros. La reacción se
efectúa convenientemente en presencia de un alcohol correspondiente
a la fórmula R^{10}OH en donde R^{10} se define como
anteriormente. Se pueden emplear otros disolventes convencionales.
Con preferencia, el sustrato de fórmula VI está presente en una
proporción entre 2 y 12% en peso aproximadamente, más
preferentemente de al menos 6% en peso aproximadamente. Con
preferencia, el R^{10}OM está presente en una proporción
aproximada entre 0,5 y 4 moles por mol de sustrato, más
preferentemente entre 1 y 2 moles aproximadamente por mol de
sustrato y todavía más preferentemente en una proporción de
alrededor de 1,6 moles por mol de sustrato. La temperatura no es un
factor crítico pero el uso de una temperatura elevada mejora la
productividad. El tiempo de reacción es normalmente de 4 a 24 horas
aproximadamente, con preferencia de alrededor de 4 a 16 horas.
Convenientemente, la reacción se efectúa a la temperatura de
reflujo atmosférico dependiendo del disolvente
usado.
El tiempo requerido para que la reacción alcance
el equilibrio está influenciado por la cantidad de alcóxido que se
añade a la mezcla de reacción y por la forma en la cual se añade el
alcóxido. El alcóxido se puede añadir en una sola porción o en
varias porciones o se puede añadir de forma continua. Cuando el
alcóxido se añade en varias porciones, es preferible añadir, en dos
etapas, aproximadamente 1,6 equivalentes de metóxido potásico. En
esta adición en dos etapas, inicialmente se añade 1 equivalente de
metóxido potásico a la mezcla de reacción seguido por la adición de
0,6 equivalentes de metóxido potásico aproximadamente 90 minutos
después. Esta adición en dos etapas acorta el tiempo para alcanzar
el equilibrio con respecto a la adición de una sola porción de 1,6
equivalentes de metóxido potásico.
Debido a que el equilibrio es más favorable para
la producción del hidroxiéster a bajas concentraciones de la
dicetona, la reacción se efectúa preferentemente a una dilución
bastante elevada, por ejemplo, tan elevada como de 40:1 para la
reacción con metóxido sódico. Se ha comprobado que puede
conseguirse una productividad significativamente mayor mediante el
uso de metóxido potásico en lugar de metóxido sódico, debido a que
una dilución del orden de 20:1 aproximadamente es en general
suficiente para reducir al mínimo el grado de cianuración inversa
cuando el reactivo es metóxido potásico.
De acuerdo con la invención, se ha descubierto
además que la reacción de cianuración inversa puede ser inhibida
tomando medidas químicas o físicas adecuadas para separar el ión
cianuro subproducto de la zona de reacción. De este modo, en otra
modalidad de la invención, la reacción de la dicetona con el
alcóxido de metal alcalino puede efectuarse en presencia de un
agente de precipitación para el ión cianuro tal como, por ejemplo,
una sal que comprende un catión que forma un compuesto de cianuro
insoluble. Dichas sales pueden incluir, por ejemplo, yoduro de
zinc, sulfato férrico o esencialmente cualquier haluro, sulfato u
otra sal de un metal alcalinotérreo o metal de transición que es
más soluble que el correspondiente cianuro. En el caso de que esté
presente yoduro de zinc en proporciones del orden de 1 equivalente
por equivalente de sustrato de dicetona aproximadamente, se ha
observado que la productividad de la reacción aumenta
sustancialmente en comparación con el proceso realizado en ausencia
de un haluro de metal alcalino.
Incluso cuando se emplea un agente de
precipitación para la separación del ión cianuro, sigue siendo
preferible realizar una dilución relativamente alta, pero mediante
el uso de un agente de precipitación la relación molar de
disolvente a sustrato dicetónico puede reducirse de manera
importante en comparación con las reacciones en ausencia de dicho
agente. La recuperación del hidroxiéster de fórmula V se puede
efectuar de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de
extracción o de no extracción descritos más adelante.
El equilibrio de la reacción también puede ser
controlado para favorecer la producción del hidroxiéster de fórmula
V mediante la separación de este hidroxiéster de la mezcla de
reacción una vez que se ha sintetizado. La separación del
hidroxiéster puede proceder bien por etapas o bien de forma continua
a través de un medio tal como filtración. La separación del
hidroxiéster se puede emplear para controlar el equilibrio bien
únicamente o bien en combinación con la separación química o física
de cianuro de la mezcla de reacción. El calentamiento del filtrado
resultante impulsa entonces el equilibrio de reacción en favor de
la conversión de la dicetona restante de fórmula VI al hidroxiéster
de fórmula V.
En la conversión de la dicetona de fórmula VI
al hidroxiéster de fórmula V, se ha observado el
5-ciano-hidroxiéster en el producto
en bruto en pequeñas cantidades, normalmente menores de alrededor de
5% en peso. Se ha planteado la hipótesis de que el
5-ciano-hidroxiéster es un compuesto
intermedio del equilibrio entre la dicetona de fórmula VI y el
hidroxiéster de fórmula V. También se ha llegado a la hipótesis de
que este compuesto intermedio del equilibrio se forma a partir de
la dicetona a través del ataque con metóxido en el grupo
5-7-oxo y protonación del enolato,
y a partir del hidroxiéster a través de una adición de Michael del
ión cianuro subproducto a la función
3-ceto-\Delta^{4,5} del
hidroxiéster.
Además, se han observado el
5-ciano-7-ácido y el
17-alcóxido del hidroxiéster de fórmula V por
cromatografía en el producto en bruto. Se ha llegado a la hipótesis
de que el compuesto intermedio de
5-ciano-hidroxiéster reaccionar con
el ión cianuro subproducto (presente como resultado de la
descianuración que introduce el doble enlace \Delta^{4,5}) para
producir el 5-ciano-7-ácido. También
se ha llegado a la hipótesis de que la acción del ión cianuro
realiza la desalquilación del grupo 7-éster del
5-ciano-hidroxiéster para dar el
5-ciano-7-ácido y el correspondiente
alquilnitrilo.
Por otro lado, se ha planteado la hipótesis de
que el compuesto intermedio transitorio 17-alcóxido
se forma a partir del ataque del metóxido sobre la
17-espirolactona del hidroxiéster (o un compuesto
intermedio precedente que posteriormente se convierte al
hidroxiéster). El 17-alcóxido se convierte
fácilmente en el hidroxiéster tras el tratamiento con un ácido. Por
tanto, en general no se observa en la matriz de producto.
El
5-ciano-hidroxiéster, el
5-ciano-7-ácido y el
17-alcóxido son compuestos nuevos de utilidad como
marcadores cromatográficos y como compuestos intermedios en la
preparación del hidroxiéster. Los mismos se pueden aislar a partir
del producto en bruto de esta etapa del Esquema de síntesis 1.
Alternativamente, se pueden sintetizar directamente para utilizarse
como marcadores o como compuestos intermedios. El
5-ciano-hidroxiéster se puede
sintetizar por reacción de una solución de la dicetona aislada de
fórmula VI con una base, tal como un alcóxido o una amina, y
aislamiento del precipitado resultante. El compuesto preparado es
preferentemente
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
El ácido
5-ciano-7-carboxílico
se puede sintetizar directamente por reacción de la dicetona de
fórmula VI con una base acuosa débil, tal como acetato sódico o
bicarbonato sódico, y aislamiento del precipitado resultante. El
compuesto preparado es preferentemente ácido
5-\beta-ciano-11-\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxílico,
\gamma-lactona.
El 17-alcóxido se puede
sintetizar directamente por reacción de una solución del
hidroxiéster de fórmula V con un alcóxido para dar una mezcla del
17-alcóxido y del correspondiente hidroxiéster. El
compuesto preparado es preferentemente
dimetil-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Con preferencia, el sustrato dicetónico de
fórmula VI corresponde a la fórmula VIA
y el producto de hidroxiéster
corresponde a la fórmula
VA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada uno de
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA y R^{1} se define
como en la fórmula V. Preferentemente, R^{3} es
hidrógeno.
Los productos de fórmula V son compuestos nuevos
que tienen un valor importante como compuestos intermedios en la
preparación de compuestos de fórmula I y en especial de fórmula IA.
Con preferencia, los compuestos de fórmula V corresponden a la
fórmula VA en donde -A-A- y -B-B-
son -CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno,
alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} juntos
constituyen el anillo 20-espiroxano:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferentemente, el compuesto de fórmula V
es
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
El compuesto de fórmula V puede ser aislado por
filtración o acidificación de la solución de reacción, por ejemplo,
con un ácido mineral tal como HCl o ácido sulfúrico acuoso,
enfriamiento a temperatura ambiente y extracción del producto con
un disolvente orgánico tal como cloruro de metileno o acetato de
etilo. El extracto se lava con una solución de lavado acuosa
alcalina, se seca y se filtra, tras lo cual se separa el disolvente.
Alternativamente, la solución de reacción que contiene el producto
de fórmula V se puede enfriar rápidamente con ácido concentrado. La
solución de producto se concentra, se enfría a una temperatura entre
0 y 25ºC aproximadamente y el producto sólido se aísla por
filtración.
En una modalidad preferida, se separan metanol y
HCN por destilación después de concluido el periodo de reacción,
añadiéndose un ácido mineral (tal como ácido clorhídrico o
sulfúrico) antes de la destilación y añadiéndose agua después de la
destilación. El ácido mineral se puede añadir en una sola etapa, en
varias etapas o de forma continua. En una modalidad preferida, el
ácido mineral se añade de forma continua durante un periodo de
alrededor de 10 a 40 minutos, más preferentemente de alrededor de
15 a 30 minutos. Similarmente, el agua se puede añadir al producto
de cola de la destilación en una sola etapa, en varias etapas o de
forma continua. En una modalidad preferida, la mezcla de reacción
concentrada se enfría a partir de la temperatura de reflujo antes
de añadir el agua. Preferentemente, la mezcla se enfría a una
temperatura entre 50 y 70ºC aproximadamente, con preferencia entre
60 y 70ºC aproximadamente y más preferentemente a 65ºC
aproximadamente, antes de añadir el agua. se añade entonces agua,
preferentemente de forma continua durante un periodo de alrededor
de 15 minutos a 3 horas y más preferentemente de alrededor de 60 a
90 minutos, al tiempo que se mantiene la temperatura
aproximadamente constante. El producto de fórmula V comienza a
cristalizar en el producto de cola de la destilación a medida que
se realiza la adición de agua. Una vez añadida el agua a la mezcla,
la mezcla de reacción diluida se mantiene aproximadamente a la misma
temperatura durante alrededor de 1 hora y luego se enfría a 15ºC
aproximadamente durante un periodo adicional de alrededor de 4 a 5
horas. La mezcla se mantiene a 15ºC aproximadamente durante un
periodo de alrededor de 1 a 2 horas. Un periodo de retención más
prolongado a 15ºC aumenta el rendimiento del cianoéster en la
mezcla. Este modo de recuperación proporciona un producto
cristalino de alta calidad sin operaciones de extracción.
Según otro modo preferido de recuperación del
producto de fórmula V, el metanol y el HCN se separan por
destilación después de terminado el periodo de reacción, con agua,
y se añade ácido antes o durante la destilación. La adición de agua
antes de la destilación simplifica las operaciones, pero la adición
progresiva durante la destilación permite mantener prácticamente
constante el volumen en la destilación. El producto de fórmula V
cristaliza en la fracción de cola de la destilación a medida que
procede esta última. Este modo de recuperación proporciona un
producto cristalino de alta calidad sin operaciones de
extracción.
De acuerdo con otra alternativa más, la solución
de reacción que contiene el producto de fórmula V puede ser
enfriada rápidamente con ácido mineral, por ejemplo, 4N HCl,
tras lo cual el disolvente se separa por destilación. La separación
del disolvente también es eficaz para separar el HCN residual del
producto de reacción. Se ha comprobado que la realización de varias
extracciones con disolvente para la purificación del compuesto de
fórmula V no son necesarias cuando el compuesto de fórmula V sirve
como un compuesto intermedio en un proceso para la preparación de
epoximexrenona, tal como aquí se describe. De hecho, dichas
extracciones pueden ser eliminadas con frecuencia en su totalidad.
Cuando se emplea extracción con disolvente para la purificación del
producto, es conveniente suplementar los lavados con disolvente con
lavados de salmuera y cáustico. Sin embargo, cuando se eliminan las
extracciones con disolvente, también puede suprimirse los lavados
con salmuera y cáustico. La eliminación de las extracciones y
lavados mejora de manera importante la productividad del proceso,
sin sacrificar el rendimiento o calidad del producto, y también
elimina la necesidad de secar la solución lavada con un desecante
tal como sulfato
sódico.
sódico.
El producto
11\alpha-hidroxi-7\alpha-alcoxicarbonilo
en bruto se recibe de nuevo en el disolvente para la siguiente
etapa de reacción del proceso, consistente en la conversión del
grupo 11-hidroxi a un grupo saliente en la
posición 11, para producir con ello un compuesto de fórmula IV:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII, R^{1} se define como en la fórmula V y R^{2}
es arilsulfoniloxi, alquil(inferior)sulfoniloxi,
aciloxi o haluro. Preferentemente, el
11\alpha-hidroxi se esterifica por reacción con un
haluro de alquil(inferior)sulfonilo, un haluro de
acilo o un anhídrido de ácido que se añade a la solución que
contiene el producto intermedio de fórmula V. Para preparar los
grupos aciloxi salientes adecuados se pueden emplear anhídridos de
ácidos inferiores tal como anhídrido acético y anhídridos de ácidos
trihalogenados tal como anhídrido trifluoracético. Se prefieren los
haluros de alquil(inferior)sulfonilo y en especial el
cloruro de metanosulfonilo. Alternativamente, el grupo
11\alpha-hidroxi podría convertirse a un haluro
por reacción de un reactivo adecuado tal como bromuro de tionilo,
cloruro de tionilo, cloruro de sulfurilo o cloruro de oxalilo. Otros
reactivos para la formación de los ésteres de ácidos
11\alpha-sulfónicos incluyen cloruro de tosilo,
cloruro de bencenosulfonilo y anhídrido trifluormetanosulfónico. La
reacción se efectúa en un disolvente que contiene un barredor de
haluro de hidrógeno tal como trietilamina o piridina. También
pueden utilizarse bases inorgánicas tal como carbonato potásico o
carbonato sódico. La concentración inicial del hidroxiéster de
fórmula V está comprendida preferentemente entre 5 y 50% en peso
aproximadamente. El reactivo de esterificación está presente
preferentemente en un ligero exceso. El cloruro de metileno es un
disolvente particularmente adecuado para la reacción, pero pueden
emplearse también otros disolventes tales como dicloroetano,
piridina, cloroformo, metiletilcetona, dimetoxietano,
metilisobutilcetona, acetona, otras cetonas, éteres, acetonitrilo,
tolueno y tetrahidrofurano. La temperatura de reacción viene
gobernada principalmente por la volatilidad del disolvente. En
cloruro de metileno, la temperatura de reacción es con preferencia
del orden de -10ºC a 10ºC
aproximadamente.
Preferentemente, el sustrato de hidroxiéster de
fórmula V corresponde a la fórmula VA
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y el producto corresponde a la
fórmula
IVA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA, R^{1} es
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxicarbonilo y R^{2}
se define como en la fórmula IV. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
Los productos de fórmula IV son compuestos
nuevos que tienen un valor importante como compuestos intermedios
para la preparación de compuestos de fórmula I y en especial de
fórmula IA. Con preferencia, los compuestos de fórmula IVA
corresponden a la fórmula VA en donde -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}-,
R^{3} es hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8}
y R^{9} juntos constituyen el anillo
20-espiroxano:
Más preferentemente, el compuesto de fórmula IV
es
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-11\alpha-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. Cuando se desea un grupo aciloxi
saliente, el compuesto de fórmula IV es con preferencia
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-11\alpha-(2,2,2-trifluor-1-oxoetoxi)-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona; o
7-metil-11\alpha-(acetiloxi)-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\hbox{ \gamma -lactona.}
Si se desea, el compuesto de fórmula IV puede
ser aislado por separación del disolvente. Con preferencia, la
solución de reacción se lava en primer lugar con una solución de
lavado acuosa alcalina, por ejemplo, 0,1-2N NaOH,
seguido por un lavado ácido, por ejemplo, 0,5-2N
HCl. Una vez separado el disolvente de reacción, el producto se
recristaliza, por ejemplo, recibiendo el producto en cloruro de
metileno y luego añadiendo otro disolvente tal como éter etílico
que disminuye la solubilidad del producto de fórmula IV, causando su
precipitación en forma cristalina.
En la recuperación del producto de fórmula IV o
en la preparación de la solución de reacción para la conversión del
compuesto intermedio de fórmula IV al compuesto intermedio de
fórmula II como más adelante se describirá adicionalmente, puede
prescindirse de la totalidad de las etapas de extracción y/o lavado
en el caso de que la solución se trate en su lugar con resinas de
intercambio iónico para la separación de impurezas ácidas y
básicas. La solución se trata primeramente con una resina de
intercambio aniónico y luego con una resina de intercambio
catiónico. Alternativamente, la solución de reacción se puede tratar
en primer lugar con adsorbentes inorgánicos tal como alúmina básica
o sílice básica, seguido por un lavado con ácido diluido. La sílice
básica o la alúmina básica se puede mezclar normalmente con la
solución de reacción en una proporción entre 5 y 50 g
aproximadamente por kg de producto, con preferencia entre 15 y 20 g
aproximadamente por kg de producto. Independientemente de que se
utilicen resinas de intercambio iónico o adsorbentes inorgánicos,
el tratamiento se puede realizar suspendiendo simplemente la resina
o adsorbente inorgánico con la solución de reacción bajo agitación
a temperatura ambiente y luego separando la resina o adsorbente
inorgánico por filtración.
Alternativamente, el compuesto producto de
fórmula IV se recupera en forma en bruto como una solución
concentrada por separación de una porción del disolvente. Esta
solución concentrada se usa directamente en la siguiente etapa del
proceso, consistente en la separación del grupo
11\alpha-saliente del compuesto de fórmula IV,
para producir con ello un enéster de fórmula II:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII y R^{1} se define como en la fórmula V. Al objeto
de esta reacción, el sustituyente R^{2} del compuesto de fórmula
IV puede ser cualquier grupo saliente cuya abstracción sea eficaz
para generar un doble enlace entre los carbonos 9 y 11.
Preferentemente, el grupo saliente es un sustituyente
alquil(inferior)sulfoniloxi o aciloxi que se separa
por reacción con un ácido y una sal de metal alcalino. Se pueden
emplear ácidos minerales, pero se prefieren los ácidos alcanoicos
inferiores. Convenientemente, el reactivo para la reacción incluye
además una sal de metal alcalino del ácido alcanoico usado. Es
particularmente preferible que el grupo saliente comprenda mesiloxi
y que el reactivo para la reacción comprenda ácido fórmico o ácido
acético y una sal de metal alcalino de uno de estos ácidos o de
otro ácido alcanoico inferior. Cuando el grupo saliente es mesiloxi
y el reactivo usado en la separación es ácido acético y acetato
sódico o ácido fórmico y formato potásico, se observa una relación
relativamente alta de 9,11-olefina a
11,12-olefina. Si está presente agua libre durante
la separación del grupo saliente, tienden a formarse impurezas, en
particular una
7,9-lactona
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
R^{3}, -B-B-, R^{8} y R^{9} se definen como
en la fórmula XIII, la cual es difícil de separar del producto
final. Por tanto, para separar el agua presente en ácido fórmico se
utiliza anhídrido acético u otro agente de secado. El contenido en
agua libre de la mezcla de reacción antes de la reacción deberá
mantenerse en un nivel por debajo de alrededor de 0,5%, con
preferencia por debajo de alrededor de 0,1% en peso, medido
mediante el análisis Karl Fischer respecto al agua, basado en la
solución de reacción total. Aunque es preferible que la mezcla de
reacción se mantenga lo más seca posible, se han conseguido
resultados satisfactorios con 0,3% en peso de agua.
Preferentemente, la mezcla de carga de reacción contiene entre 4 y
50% en peso aproximadamente del sustrato de fórmula IV en el ácido
alcanoico. Se incluye preferentemente entre 4 y 20% en peso
aproximadamente de la sal de metal alcalino del ácido. Cuando se
emplea anhídrido acético como el agente de secado, este está
presente preferentemente en una proporción entre 0,05 y 0,2 moles
aproximadamente por mol de ácido
alcanoico.
Se ha comprobado que las proporciones de
subproducto 7,9-lactona y
11,12-olefina en la mezcla de reacción son
relativamente bajas cuando el reactivo de eliminación comprende una
combinación de ácido trifluoracético, anhídrido trifluoracético y
acetato potásico como el reactivo para la eliminación del grupo
saliente y formación del enéster (9,11-olefina). El
anhídrido trifluoracético sirve como el agente de secado y deberá
estar presente en una proporción de por lo menos 3% en peso
aproximadamente, más preferentemente de por lo menos 15% en peso
aproximadamente y muy particularmente 20% en peso aproximadamente,
basado en el ácido trifluoracético usado como reactivo de
eliminación.
eliminación.
Además de la 7,9-lactona, se han
observado otras impurezas y subproductos que son útiles como
compuestos intermedios sintéticos y como marcadores cromatográficos,
en esta etapa de síntesis del Esquema 1. El nuevo
4,9,13-trieno del enéster de fórmula II (por
ejemplo,
7-metil-hidrógeno-17-metil-3-oxo-18-norpregna-4,9(11),13-trieno-7\alpha,21-dicarboxilato)
ha sido aislado cromatográfica-mente de la solución
de producto. La cantidad de este compuesto producido parece
aumentar con el incremento del tiempo de reacción en esta etapa de
la síntesis. Se ha planteado la hipótesis de que el compuesto se
forma cuando la lactona es protonada y el ión carbonio C17
resultante facilita la migración del grupo metilo angular a partir
de la posición C13. La desprotonación de este compuesto intermedio
proporciona el 4,9,13-trieno.
A partir del producto en bruto se ha aislado
también cromatográficamente el nuevo
5-ciano-\Delta^{11,12} del
enéster de fórmula II (por ejemplo,
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-11-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona) y el nuevo
5-ciano del enéster de fórmula II (por ejemplo,
7-metil-hidrógeno-5-ciano-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-11-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona). Se ha llegado a la hipótesis de
que estos compuestos se forman por deshidratación del
5-ciano-7-ácido y
5-ciano-hidroxiéster residuales,
respectivamente, que están presentes en la solución de producto en
bruto como resultado de la tercera etapa de la síntesis del Esquema
1.
El nuevo epímero C17 del enéster de fórmula II
(por ejemplo,
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona) también ha sido aislado
cromatográficamente del producto en bruto. Se ha llegado a la
hipótesis de que las condiciones ácidas de la reacción de
eliminación pueden dar lugar a la racemización del centro quiral C17
para proporcionar el 17-epímero del enéster. El
17-epímero puede ser sintetizado directamente por
reacción de un compuesto de fórmula IV con una solución de formato
potásico, ácido fórmico y anhídrido acético y aislamiento del
17-epímero.
Aunque no se ha observado como una impureza en
la solución de producto en bruto, la 11-cetona del
hidroxiéster de fórmula V se puede preparar por oxidación del
11-hidroxi del correspondiente hidroxiéster con un
agente oxidante adecuado tal como un reactivo de Jones. La
11-cetona preparada es preferentemente
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3,11-dioxo-17\alpha-pregna-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Alternativamente, los grupos
11\alpha-salientes del compuesto de fórmula IV se
pueden eliminar para producir un enéster de fórmula II por
calentamiento de una solución de fórmula IV en un disolvente
orgánico tal como DMSO, DMF o DMA.
Además, de acuerdo con la invención, el
compuesto de fórmula IV se hace reaccionar inicialmente con un
alcanoato de alquenilo tal como acetato de isopropenilo en presencia
de un ácido tal como ácido toluenosulfónico o un ácido mineral
anhidro tal como ácido sulfúrico, para formar el
3-enol éster:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
del compuesto de fórmula IV.
Alternativamente, el 3-enol éster se puede formar
por tratamiento del compuesto de fórmula IV con anhídrido de ácido
y una base tal como ácido acético y acetato sódico. Otras
alternativas incluyen en tratamiento del compuesto de fórmula IV
con ceteno en presencia de un ácido para producir el compuesto de
fórmula IV(Z). El compuesto intermedio de fórmula
IV(Z) se hace reaccionar entonces con un formato o acetato
de metal alcalino en presencia de ácido fórmico o acético para
producir el \Delta^{9,11} enol acetato de fórmula
IV(Y):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
el cual se puede convertir entonces
al enéster de fórmula II en un disolvente orgánico, preferentemente
un alcohol tal como metanol, bien por descomposición térmica del
enol acetato o bien por reacción del mismo con un alcóxido de metal
alcalino. La reacción de eliminación es altamente selectiva al
enéster de fórmula II en relación preferentemente a la
11,12-olefina y 7,9-lactona, y esta
selectividad se mantiene durante la conversión del enol acetato a la
enona.
Preferentemente, el sustrato de fórmula IV
corresponde a la fórmula IVA
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y el producto enéster corresponde a
la fórmula
IIA
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA y R^{1} se define
como en la fórmula V. Preferentemente, R^{3} es
hidrógeno.
Si se desea, el compuesto de fórmula II se puede
aislar separando el disolvente, recibiendo el producto sólido en
agua fría y extrayendo con un disolvente orgánico tal como acetato
de etilo. Después de las etapas adecuadas de lavado y secado, el
producto se recupera por separación del disolvente de extracción. El
enéster se disuelve entonces en el disolvente adecuado para la
conversión al producto de fórmula I. Alternativamente, el enéster
se puede aislar añadiendo agua a la solución concentrada de producto
y filtrando el producto sólido, con lo que se separa
preferentemente la 7,9-lactona. La conversión del
sustrato de fórmula II al producto de fórmula IA se puede realizar
del modo descrito en la Patente US 4.559.332 la cual se incorpora
aquí solo con fines de referencia, o más preferentemente mediante
la reacción nueva utilizando un promotor de haloacetamida como más
adelante se describe.
El hidroxiéster de fórmula V se puede convertir
al enéster de fórmula II sin aislamiento del compuesto intermedio
de fórmula IV. En este método, el hidroxiéster se recibe en un
disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno; y a la solución
se añade un agente acilante, por ejemplo cloruro de metanosulfonilo,
o un reactivo de halogenación, por ejemplo cloruro de sulfurilo. La
mezcla se agita y, cuando esté implicada una halogenación, se añade
un barredor de HCl tal como imidazol. Esta reacción es altamente
exotérmica y, por tanto, deberá realizarse a una velocidad
controlada con enfriamiento total. Después de la adición de una
base, la mezcla resultante se calienta a temperatura moderada, por
ejemplo a una temperatura comprendida entre 0ºC y la temperatura
ambiente o ligeramente por encima, aproximadamente, y se hace
reaccionar durante un periodo normalmente 1 a 4 horas
aproximadamente. Terminada la reacción, se separa el disolvente,
preferentemente bajo un alto vacío (por ejemplo, alrededor de 24''
a 28'' Hg) a una temperatura de alrededor de -10º a +15ºC, más
preferentemente de alrededor de 0 a 5ºC, para concentrar la solución
y separar el exceso de base. El sustrato se vuelve a disolver
entonces en un disolvente orgánico, preferentemente un disolvente
halogenado, tal como cloruro de metileno, para la conversión al
enéster.
El reactivo de eliminación del grupo saliente
se prepara preferentemente mezclando un ácido orgánico, una sal de
ácido orgánico y un agente de secado, preferentemente ácido
fórmico, formato de metal alcalino y anhídrido acético,
respectivamente, en un reactor seco. La adición de anhídrido
acético es exotérmica y se traduce en la liberación de CO, de manera
que la velocidad de adición debe ser controlada consecuentemente.
Para promover la separación de agua, la temperatura de esta reacción
se mantiene preferentemente en la gama de alrededor de 60 a 90ºC,
más preferentemente de alrededor de 65 a 75ºC. Se añade entonces
este reactivo a la solución de producto del compuesto de fórmula IV
para efectuar la reacción de eliminación. Transcurridas
4-8 horas aproximadamente, la mezcla de reacción se
calienta preferentemente a una temperatura de por lo menos 85ºC
aproximadamente, pero con preferencia no mayor de 95ºC
aproximadamente, hasta que se ha separado la totalidad del
destilado volátil y luego durante un periodo adicional para
completar la reacción, normalmente de alrededor de 1 a 4 horas. La
mezcla de reacción se enfría y una vez recuperado mediante técnicas
de extracción convencionales, el enéster se puede recuperar según se
desee por evaporación del disolvente.
Se ha comprobado además que el enéster de
fórmula II se puede recuperar de la solución de reacción mediante
un procedimiento alternativo que evita la necesidad de realizar
etapas de extracción después de la reacción de eliminación,
consiguiéndose así ahorros en los costes, una mejora en el
rendimiento y/o una mejora en la productividad. En este proceso, el
producto enéster se precipita por dilución de la mezcla de reacción
con agua después de separar el ácido fórmico. El producto se aísla
entonces por filtración. No se requieren extracciones.
De acuerdo con una alternativa más para la
conversión del hidroxiéster de fórmula V al enéster de fórmula II
sin aislamiento del compuesto de fórmula IV, el grupo
11\alpha-hidroxi del hidroxiéster de fórmula V se
reemplaza por halógeno y se forma entonces el enéster de fórmula II
in situ por deshidrohalogenación térmica. La sustitución del
grupo hidroxi por halógeno se efectúa mediante reacción con haluro
de sulfurilo, preferentemente cloruro de sulfurilo, en frío y en
presencia de un barredor de haluro de hidrógeno tal como imidazol.
El hidroxiéster se disuelve en un disolvente tal como
tetrahidrofurano y se enfría a una temperatura de alrededor de 0 a
-70ºC. Se añade el haluro de sulfurilo y la mezcla de reacción se
calienta a temperatura moderada, por ejemplo, a temperatura
ambiente, durante un tiempo suficiente para completar la reacción de
eliminación, normalmente de 1 a 4 horas aproximadamente. El proceso
de esta modalidad no solo combina dos etapas en una, sino que
elimina el uso de: un disolvente de reacción halogenado; un ácido
(tal como ácido acético); y un reactivo de secado (tal como
anhídrido acético o sulfato sódico). Además, la reacción no requiere
condiciones de reflujo y evita la generación del CO subproducto que
resulta cuando se utiliza ácido acético como reactivo de
secado.
La dicetona de fórmula VI se puede convertir a
epoximexrenona o a otro compuesto de fórmula I sin el aislamiento
de cualesquiera compuestos intermedios en forma pura. De acuerdo con
este proceso preferido, la solución de reacción que contiene el
hidroxiéster se enfría rápidamente con una solución ácida fuerte,
se enfría a temperatura ambiente y luego se extrae con un disolvente
de extracción adecuado. Convenientemente, antes de la extracción,
se añade a la mezcla de reacción una solución acuosa de sal
inorgánica, por ejemplo, una solución de salina al 10% en peso
aproximadamente. El extracto se lava y se seca por destilación
azeotrópica para la separación del metanol disolvente que queda de
la reacción de escisión de la cetona.
La solución concentrada resultante que contiene
entre 5 y 50% en peso aproximadamente de compuesto de fórmula V, se
pone entonces en contacto en frío con un reactivo de acilación o
alquilsulfonilación, para formar el éster sulfónico o el éster de
ácido dicarboxílico. Terminada la reacción de alquilsulfonación o
carboxilación, la solución de reacción se pasa por una columna de
resina intercambiadora ácida y luego básica para la eliminación de
impurezas básicas y ácidas. Después de cada pasada, la columna se
lava con un disolvente adecuado, por ejemplo, cloruro de metileno,
para la recuperación de la misma del éster sulfónico o dicarboxílico
residual. Las fracciones combinadas de eluato de lavado se combinan
y se reducen, preferentemente bajo vacío, para producir una
solución concentrada que contiene el éster sulfónico o dicarboxílico
de fórmula IV. Esta solución concentrada se pone entonces en
contacto con un reactivo de secado que comprende un agente eficaz
para la separación del grupo saliente 11\alpha-éster y para la
abstracción de hidrógeno para formar un doble enlace 9,11.
Preferentemente, el reactivo para la separación del grupo saliente
comprende la solución reactiva secante de ácido fórmico, formato de
metal alcalino, anhídrido acético descrito anteriormente. Terminada
la reacción, la mezcla de reacción se enfría y se separa bajo vacío
el ácido fórmico y/u otros componentes volátiles. El residuo se
enfría a temperatura ambiente, se somete a las etapas de lavado
adecuadas y luego se seca para obtener una solución concentrada que
contiene el enéster de fórmula II. Este enéster se puede convertir
entonces a epoximexrenona o a otro compuesto de fórmula I usando el
procedimiento de la
invención.
invención.
El disolvente se separa de la solución de
reacción bajo vacío y el producto de fórmula IV se distribuye entre
agua y un disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, acetato de
etilo. La capa acuosa se extrae entonces de nuevo con el disolvente
orgánico y el extracto nuevo se lava con una solución alcalina,
preferentemente una solución de un hidróxido de metal alcalino que
contiene un haluro de metal alcalino. La fase orgánica se concentra,
preferentemente bajo vacío, para obtener el enéster producto de
fórmula II. El producto de fórmula II puede ser recibido entonces en
un disolvente orgánico, por ejemplo, cloruro de metileno, y se hace
reaccionar adicionalmente del modo descrito en la Patente '332 para
producir el producto de fórmula I.
De acuerdo con la presente invención se ha
descubierto que pueden conseguirse numerosas mejoras en la síntesis
de epoximexrenona mediante el uso de un activador de peróxido para
la reacción de epoxidación correspondiente a la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{p} es
-(CX^{4}X^{5})_{n}-; X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4}
y X^{5} se eligen independientemente entre halo, hidrógeno,
alquilo, haloalquilo y ciano y cianoalquilo; y n es 2; siempre que
al menos uno de X^{4} y X^{5} sea halo. Cuando cualquiera de
X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} o X^{5} no es halo,
preferentemente es haloalquilo, con suma preferencia perhaloalquilo.
Activadores particularmente preferidos incluyen aquellos en donde
R^{p} es -(CX^{4}X^{5})_{n}-, n es 2, al menos uno
de X^{4} y X^{5} es halo, el otro de X^{4} y X^{5} es halo
o perhaloalquilo y X^{1}, X^{2} y X^{3} son halo o
perhaloalquilo. Cada uno de X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} es preferentemente Cl o F, con suma preferencia Cl, aunque
también pueden ser adecuados los haluros mixtos, al igual que
percloroalquilo o perbromoalquilo y combinaciones de los mismos
siempre que el carbono enlazado directamente al carbonilo amídico
esté sustituido con al menos un grupo halo. De acuerdo con un
proceso particularmente preferido, la epoxidación se efectúa por
reacción del sustrato de fórmula IIA con peróxido de hidrógeno en
presencia de tricloroacetamida y un de un tampón adecuado. Con
preferencia, la reacción se efectúa a un pH de alrededor de 3 a 7,
más preferentemente de alrededor de 5 a 7. Sin embargo, a pesar de
estas consideraciones, se ha realizado una reacción con éxito fuera
de las gamas de pH
preferidas.
Resultados especialmente favorables se obtienen
con un tampón que comprende hidrogenofosfato dipotásico y/o con un
tampón que comprende una combinación de hidrogenofosfato dipotásico
y dihidrogenofosfato potásico en proporciones relativas entre 1:4 y
1:1 aproximadamente, más preferentemente en la gama de alrededor de
2:3. También se pueden emplear tampones de borato, pero en general
los mismos proporcionan conversiones más lentas que el fosfato
dipotásico o las mezclas de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}.
Cualquiera que sea la composición del tampón, el mismo deberá
proporcionar un pH en la gama antes indicada. Además de la
composición global del tampón o del pH preciso que el mismo pueda
impartir, se ha observado que la reacción procede mucho más
eficazmente en el caso de que una parte del tampón esté constituida
por el ión hidrogenofosfato dibásico. Se cree que este ión puede
participar esencialmente como un catalizador homogéneo en la
formación de un aducto o complejo que comprende el promotor e ión
hidroperóxido, cuya generación puede a su vez ser esencial para el
mecanismo global de la reacción de epoxidación. De este modo, la
necesidad cuantitativa para el hidrogenofosfato dibásico
(preferentemente de K_{2}HPO_{4}) puede ser de solo una pequeña
concentración catalítica. En general, es preferible que el
K_{2}HPO_{4} esté presente en una proporción de por lo menos 0,1
equivalentes aproximadamente, por ejemplo, entre 0,1 y 0,3
equivalentes aproximadamente, por equivalente de sustrato.
La reacción se efectúa en un disolvente
adecuado, preferentemente cloruro de metileno, pero también se
pueden emplear otros disolventes halogenados tal como clorobenceno
o dicloroetano. Igualmente, ha resultado ser satisfactorio el uso
de tolueno y mezclas de tolueno y acetonitrilo. Sin confiar en una
teoría particular, se puede afirmar que la reacción procede del
modo más eficaz en un sistema de dos fases en donde un compuesto
intermedio de hidroperóxido se forma y se distribuye en la fase
orgánica de bajo contenido en agua y reacciona con el sustrato en
la fase orgánica. De este modo, los disolventes preferidos son
aquellos en donde la solubilidad en agua es baja. La recuperación
eficaz a partir de tolueno se promueve mediante la inclusión de otro
disolvente tal como acetonitrilo.
En la conversión de sustratos de fórmula II a
productos de fórmula I, el tolueno proporciona una ventaja en el
procedimiento puesto que los sustratos son libremente solubles en
tolueno y los productos no lo son. Por tanto, el producto precipita
durante la reacción cuando las conversiones alcanzan el grado de
40-50%, produciendo una mezcla de tres fases de la
cual se puede separar el producto convenientemente por filtración.
El uso de metanol, acetato de etilo, acetonitrilo solo, THF y
THF/agua no ha resultado ser tan eficaz como el uso de los
disolventes halogenados o tolueno en la realización de la conversión
de esta etapa del proceso.
Preferentemente, el peróxido activador está
presente en una proporción de al menos 1 equivalente
aproximadamente, más preferentemente entre 1,5 y 2 equivalentes
aproximadamente, por equivalente de sustrato inicialmente presente.
El peróxido de hidrógeno deberá cargarse en la reacción en un exceso
al menos moderado o añadido progresivamente a medida que procede la
reacción de epoxidación. Aunque la reacción consume solo
1-2 equivalentes de peróxido de hidrógeno por mol de
sustrato, el peróxido de hidrógeno se carga preferentemente en un
exceso sustancial con respecto al sustrato y activador inicialmente
presentes. Sin que ello suponga limitar la invención a una teoría
en particular, se cree que el mecanismo de reacción implica la
formación de un aducto del activador y del anión peróxido, que la
formación de esta reacción es reversible favoreciendo el equilibrio
la reacción inversa y que por tanto es necesario un exceso inicial
sustancial de peróxido de hidrógeno con el fin de impulsar la
reacción en la dirección de avance. La temperatura de reacción no es
estrechamente crítica y puede realizarse eficazmente dentro de la
gama de alrededor de 0 a 100ºC. La temperatura óptima depende de la
selección del disolvente. En general, la temperatura preferida es de
alrededor de 20 a 30ºC, pero en ciertos disolventes, por ejemplo
tolueno, la reacción puede efectuarse convenientemente a una
temperatura de alrededor de 60 a 70ºC. A 25ºC aproximadamente, la
reacción requiere normalmente menos de 10 horas aproximadamente, en
general de alrededor de 3 a 6 horas. Si es necesario, se puede
añadir más activador y peróxido de hidrógeno al término del ciclo
de reacción para conseguir la conversión completa del
sustrato.
sustrato.
Al término del ciclo de reacción, la fase
acuosa se separa, la solución de reacción orgánica se lava
preferentemente para separar las impurezas solubles en agua, tras
lo cual el producto puede ser recuperado por separación del
disolvente. Después de separar el disolvente, la solución de
reacción deberá lavarse con al menos un lavado suave a moderadamente
alcalino, por ejemplo, carbonato sódico. Con preferencia, la mezcla
de reacción se lava de manera sucesiva con: una solución reductora
suave tal como una solución débil (por ejemplo, al 3% en peso
aproximadamente) de sulfito sódico en agua; una solución alcalina,
por ejemplo, NaOH o KOH (con preferencia de alrededor de 0,5 N);
una solución ácida tal como HCl (con preferencia alrededor de 1 N);
y un lavado neutro final que comprende agua o salmuera,
preferentemente salmuera saturada para reducir al mínimo las
pérdidas de producto. Antes de separar el disolvente de reacción,
puede añadirse convenientemente otro disolvente tal como un
disolvente orgánico, con preferencia etanol, de manera que el
producto pueda ser recuperado por cristalización después de la
destilación para la separación del disolvente de reacción más
volátil.
Ha de entenderse que el nuevo método de
epoxidación que utiliza tricloroacetamida u otro peróxido activador
nuevo tiene aplicación también más allá de los diversos esquemas de
preparación de epoximexrenona y, de hecho, se puede emplear para la
formación de epóxidos a través de dobles enlaces olefínicos en una
amplia variedad de sustratos sometidos a reacción en fase líquida.
La reacción resulta particularmente eficaz en compuestos insaturados
en donde las olefinas están tetra-sustituidas y
tri-sustituidas, es decir,
R^{a}R^{b}C=CR^{c}R^{d} y R^{a}R^{b}C=CR^{c}H en
donde R^{a} a R^{d} representan sustituyentes distintos de
hidrógeno. La reacción procede de la forma más rápida y completa
cuando el sustrato es un compuesto cíclico con un doble enlace
trisustituido o un compuesto cíclico o acíclico con un doble enlace
tetrasustituido. Ejemplos de sustratos para la reacción de
epoxidación incluyen \Delta^{9,11}-canrenona y
los siguientes sustratos:
Debido a que la reacción procede más rápida y
completamente con dobles enlaces trisustituidos y tetrasustituidos,
la misma es especialmente eficaz para la oxidación selectiva a
través de dichos dobles enlaces en compuestos que pueden incluir
otros dobles enlaces en donde los carbonos olefínicos están
monosustituidos o incluso disustituidos.
Otros ejemplos no limitativos que ilustran la
reacción de epoxidación genérica incluyen las siguientes reacciones
de epoxidación:
\vskip1.000000\baselineskip
Además, deberá entenderse que la reacción se
puede utilizar con ventaja en la epoxidación de dobles enlaces
monosustituidos o incluso disustituidos, tal como la
11,12-olefina en diversos sustratos de esteroides.
Sin embargo, debido a que preferentemente se epoxidan los dobles
enlaces altamente sustituidos, por ejemplo la
9,11-olefina, con alta selectividad, el
procedimiento de esta invención resulta especialmente eficaz para
conseguir altos rendimientos y una elevada productividad en las
etapas de epoxidación de los diversos esquemas de reacción
aquí
descritos.
descritos.
Se ha comprobado que el procedimiento mejorado
puede aplicarse de un modo particularmente ventajoso a la
preparación de:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
por epoxidación
de:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
a la preparación
de:
\vskip1.000000\baselineskip
por epoxidación
de:
Han podido demostrarse múltiples ventajas en el
procedimiento de la invención en donde se emplea dicho activador de
peróxido en lugar de tricloroacetonitrilo como reactivo de
transferencia de oxígeno para la reacción de epoxidación. Se ha
observado que los efectos de la agitación son mínimos y que el
comportamiento del reactor es más consistente, lo cual constituye
otra ventaja con respecto al proceso con tricloroacetonitrilo. La
reacción es más propensa al incremento de escala en comparación con
la reacción promovida con tricloroacetonitrilo. El aislamiento y la
purificación del producto son simples. No se observa ninguna
oxidación Bayer-Villager de la función carbonilo
(conversión de cetona a éster promovida por peróxido) tal como se
experimenta cuando se utiliza ácido
m-cloroperoxibenzoico u otros perácidos. El reactivo
es barato, fácilmente disponible y de sencilla manipulación.
Además, se han observado los siguientes
compuestos mediante cromatografía en el producto en bruto
procedente de la etapa del Esquema de síntesis 1 en donde el enéster
de fórmula II se convierte a compuesto de fórmula I:
(1) el
11\alpha,12\alpha-epóxido del enéster de fórmula
II, por ejemplo
7-metil-hidrógeno-4\alpha,5\alpha:9\alpha,11\alpha-diepoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona;
(2) el 4,5:9,11-diepóxido del
enéster de fórmula II, por ejemplo
7-metil-hidrógeno-4\alpha,5\alpha:9\alpha,11\alpha-diepoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona;
(3) la 12-cetona del enéster de
fórmula II, por ejemplo
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3,12-dioxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona;
(4) el 9,11-dihidroxi del
enéster de fórmula II, por ejemplo
7-metil-hidrógeno-9\alpha,11\beta,17-trihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona;
(5) el
12-hidroxi-análogo del enéster de
fórmula II, por ejemplo
7-metil-hidrógeno-12\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona; y
(6) el 7-ácido del compuesto de fórmula I, por
ejemplo ácido
9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxílico,
\gamma-lactona.
Estos compuestos tienen utilidad como compuestos
intermedios sintéticos y/o marcadores cromatográficos en la
preparación del compuesto de fórmula I, en particular
epoximexrenona.
Se ha llegado a la hipótesis de que el
11\alpha,12\alpha-epóxido del enéster de fórmula
II se forma por vía de una impureza producida durante la etapa
previa en donde un compuesto de fórmula IV se convierte al enéster
de fórmula II. Esta impureza fue aislada cromatográficamente y es
el \Delta^{11,12}-enéster. Normalmente se
produce con el \Delta^{9,11}-enéster en una
relación de alrededor de 90:10
(\Delta^{9,11}-enéster:\Delta^{11,12}-enéster),
aunque esta relación puede variar. La oxidación del
\Delta^{11,12}-enéster durante la conversión del
enéster de fórmula II al compuesto de fórmula I proporciona el
11\alpha,12\alpha-epóxido.
El 4,5:9,11-diepóxido del
enéster de fórmula I fue aislado cromatográficamente. Se llegó a la
hipótesis de que el mismo se derivaba de la
sobre-epoxidación del enéster. Normalmente se
observa en el producto en bruto a niveles de alrededor de 5% en peso
o menos, aunque esta cantidad puede variar.
La 12-cetona del enéster de
fórmula II fue aislada cromatográficamente. Se llegó a la hipótesis
de que la misma se derivaba de la oxidación alílica del enéster.
Normalmente se observa en el producto en bruto a niveles de
alrededor de 5% en peso o menos, aunque esta cantidad puede variar.
El nivel de 12-cetona detectada en el producto en
bruto cuando se utilizó tricloroacetonitrilo como el peróxido de
hidrógeno activador fue mayor que el nivel detectado cuando se
utilizó tricloroacetamida como activador.
El 9,11-dihidroxi del enéster de
fórmula II se aisló cromatográficamente. Normalmente se observa en
el producto en bruto a niveles de alrededor de 5% en peso o menos,
aunque esta cantidad puede variar. Se llegó a la hipótesis de que
el mismo se derivaba de la hidrólisis del epóxido de fórmula I.
El 12-hidroxi del enéster de
fórmula II se aisló cromatográficamente. Normalmente se observa en
el producto en bruto a niveles de alrededor de 5% en peso o menos,
aunque esta cantidad puede variar. Se llegó a la hipótesis de que el
mismo se derivaba de la hidrólisis del
11,12-epóxido con posterior eliminación del
11\beta-hidroxi.
Además, los compuestos de fórmula I preparados
según esta invención pueden ser modificados adicionalmente para
proporcionar un metabolito, derivado, profármaco o similar con
propiedades mejoradas (tales como solubilidad y absorción mejoradas)
lo cual facilita la administración y/o eficacia de epoximexrenona.
El 6-hidroxi del compuesto de fórmula I (por
ejemplo,
7-metil-hidrógeno-16\beta,17-dihidroxi-9,11\alpha-epoxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxi-lato,
\gamma-lactona) es un compuesto nuevo que ha sido
identificado como un posible metabolito en la rata. El metabolito
6-hidroxi se puede preparar a partir del
correspondiente etil enol éter (por ejemplo,
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-3-etoxi-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona). El etil enol éter del compuesto
de fórmula I se puede preparar según el procedimiento descrito por
R. M. Weier y L. M. Hofmann (J. Med Chem 1977, 1304) cuya
publicación se incorpora aquí solo con fines de referencia. El etil
enol éter se hace reaccionar entonces con ácido
m-cloroperbenzoico para producir el
correspondiente 6-hidroxi del compuesto de fórmula
I.
Por otro lado, se ha planteado la hipótesis de
que las sales monocarboxílicas de epoximexrenona, en particular las
sales de potasio y sodio, son alternativas adecuadas para facilitar
la administración de un compuesto de fórmula I a un individuo para
quien está indicada la administración de un antagonista de
aldosterona. Bajo condiciones básicas suaves es posible abrir
selectivamente la espirolactona de los compuestos de fórmula I sin
hidrolizar el sustituyente C7 éster para proporcionar el
correspondiente análogo de
17\beta-hidroxi-17\alpha-(ácido
3-propiónico). Estos análogos de cadena abierta son
más polares que sus contrapartidas lactónicas y tienen tiempos de
retención más cortos cuando se analizan por HPLC de fase inversa.
Las condiciones ácidas causan generalmente la regeneración del
anillo
lactona.
lactona.
Bajo condiciones más rigurosas, la espirolactona
se abre y el C7 éster se hidroliza para dar los correspondientes
subproductos, análogos 7-ácidos de
17\beta-hidroxi-17\alpha-(ácido
3-propiónico) de los compuestos de fórmula I. Estos
ácidos dicarboxílicos presentan tiempos de retención más cortos que
los ácidos monocarboxílicos cuando son analizados por HPLC de fase
inversa. Las condiciones ácidas (por ejemplo, tratamiento con un
ácido diluido tal como ácido clorhídrico 0,1-4 M)
causan generalmente la regeneración del anillo lactona del ácido
dicarboxílico.
El nuevo método de epoxidación de la invención
resulta altamente útil como la etapa concluyente del Esquema de
síntesis 1. En una modalidad particularmente preferida, el proceso
global del Esquema 1 procede como sigue:
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
2
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El segundo de los esquemas de reacción (Esquema
2) de esta invención comienza con canrenona u otro sustrato
correspondiente a la fórmula XIII
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. En la primera etapa de este proceso, el sustrato
de fórmula XIII se convierte a un producto de fórmula
XII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
usando un esquema de reacción de
cianuración sustancialmente como el descrito anteriormente para la
conversión del sustrato de fórmula VIII al compuesto intermedio de
fórmula VII. Con preferencia, el sustrato de fórmula XIII
corresponde a la fórmula
XIIIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto de enamina
corresponde a la fórmula
XIIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA. Con preferencia,
R^{3} es
hidrógeno.
\newpage
En la segunda etapa del Esquema 2, la enamina de
fórmula XII se hidroliza a un producto intermedio de dicetona de
fórmula XI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII, usando un esquema de reacción sustancialmente como
el descrito anteriormente para la conversión del sustrato de fórmula
VIII al compuesto intermedio de fórmula VII. Con preferencia, el
sustrato de fórmula XII corresponde a la fórmula
XIIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto de dicetona
corresponde a la fórmula
XIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA. Con preferencia,
R^{3} es
hidrógeno.
\newpage
Además, de acuerdo con el Esquema de reacción 2,
la dicetona de fórmula XI se hace reaccionar con un alcóxido de
metal alcalino para formar mexrenona u otro producto correspondiente
a la fórmula X
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII y R^{1} se define como en la fórmula V. El
proceso se efectúa usando sustancialmente el mismo esquema de
reacción que el descrito anteriormente para la conversión de los
compuestos de fórmula VI a compuestos de fórmula V. Con preferencia,
el sustrato de fórmula XI corresponde a la fórmula
XIA
y el producto intermedio
corresponde a la fórmula
XA
\vskip1.000000\baselineskip
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA y R^{1} se define
como en la fórmula V. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
El compuesto mexrenona y otros compuestos de
fórmula X son a continuación 9\alpha-hidroxilados
mediante un nuevo proceso de bioconversión para producir productos
de fórmula IX
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII y R^{1} se define como en la fórmula V. Entre los
organismos que pueden ser usados en la etapa de hidroxilación se
encuentran Nocardia conicruria ATCC 31548, Nocardia
aurentia ATCC 12674, Corynespora cassiicola ATCC 16718,
Streptomyces hydroscopicus ATCC 27438, Mortierella
isabellina ATCC 42613, Beauvria bassiana ATCC 7519,
Penicillum purpurogenum ATCC 46581, Hypomices
chrysospermus IMI 1 09891, Thamnostylum piriforme ATCC
8992, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a,
Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella
elegans ATCC 9245, Trichothecium roseum ATCC 12543,
Epicoccum humicola ATCC 12722, Saccharopolyspora
eythrae ATCC 11635, Beauvria bassiaria ATCC 13144,
Arthrobacter simplex, Bacterium cyclooxydans ATCC
12673, Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011, Nocardia
aurentia ATCC 12674, Norcardia restrictus ATCC 14887,
Pseudomonas testosteroni ATCC 11996, Rhodococcus equi
ATCC 21329, Mycobacterium fortuitum NRRL B8119, y
Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150. La reacción se efectúa
sustancialmente como se ha descrito anteriormente en conexión con
las Figuras 1 y 2. En particular se prefiere el proceso de la Figura
1.
Los medios de crecimiento útiles en las
bioconversiones contienen preferentemente de alrededor de 0,05 a 5%
en peso de nitrógeno disponible; de alrededor de 0,5 a 5% en peso de
glucosa; de alrededor de 0,25 a 2,5% en peso de un derivado de
levadura; y de alrededor de 0,05 a 0,5% en peso de fósforo
disponible. Medios de crecimiento particularmente preferidos
incluyen los siguientes: harina de soja: entre 0,5 y 3% en peso
aproximadamente de glucosa; entre 0,1 y 1% en peso aproximadamente
de harina de soja; entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de
haluro de metal alcalino; entre 0,05 y 0,5% en peso de un derivado
de levadura tal como levadura autolisada o extracto de levadura;
entre 0,05 y 0,5% en peso aproximadamente de una sal de fosfato tal
como K_{2}HPO_{4}; pH = 7;
peptona-extracto de
levadura-glucosa: entre 0,2 y 2% en peso
aproximadamente de peptona; entre 0,05 y 0,5% en peso
aproximadamente de extracto de levadura; y entre 2 y 5% en peso
aproximadamente de glucosa;
Mueller-Hinton: entre 10 y 40%
en peso aproximadamente de infusión de carne de vaca; entre 0,35 y
8,75% en peso aproximadamente de casamino ácidos; entre 0,15 y 0,7%
en peso aproximadamente de almidón.
Los hongos se pueden hacer crecer en nutrientes
de harina de soja o peptona, mientras que los actinomicetos y las
eubacterias se pueden desarrollar en harina de soja (más 0,5%-1% en
peso de sal de ácido carboxílico tal como formato sódico, para las
biotransformaciones) o en caldo Mueller-Hinton.
La producción de
11\beta-hidroximexrenona a partir de mexrenona
por fermentación se indica en el ejemplo 19B. Se pueden emplear
procesos de bioconversión similares para preparar otros materiales
de partida y compuestos intermedios. El ejemplo 19A describe la
bioconversión de androstendiona a
11\beta-hidroxiandrostendiona. El ejemplo 19C
describe la bioconversión de mexrenona a
11\alpha-hidroximexrenona,
\Delta^{1,2}-mexrenona,
6\beta-hidroximexrenona,
12\beta-hidroximexrenona y
9\alpha-hidroximexrenona. El ejemplo 19D describe
la bioconversión de canrenona a
\Delta^{9,11}-canrenona.
Los productos de fórmula IX son compuestos
nuevos que pueden ser separados por filtración, lavados con un
disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, acetato de etilo, y
recristalizados en el mismo o similar disolvente. Los mismos
presentan un valor importante como compuestos intermedios para la
preparación de compuestos de fórmula I y en especial de fórmula IA.
Con preferencia, los compuestos de fórmula IX corresponden a la
fórmula IXA en donde -A-A- y -B-B-
son -CH_{2}-CH_{2}-, R^{3} es hidrógeno,
alquilo inferior o alcoxi inferior y R^{8} y R^{9} juntos
constituyen el anillo 20-espiroxano:
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente etapa del Esquema de síntesis 2,
el producto de fórmula IX se hace reaccionar con un reactivo
deshidratante (los reactivos deshidratantes adecuados tales como
PhSOCl o ClSO_{3}H son ya conocidos para los expertos en la
materia) para producir un compuesto de fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII y R^{1} se define como en la fórmula V.
Preferentemente, el sustrato de fórmula IX corresponde a la fórmula
IXA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el producto intermedio
corresponde a la fórmula
IIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en cada una de las cuales
-A-A-, -B-B-, R^{3}, Y^{1},
Y^{2} y X se definen como en la fórmula XIIIA y R^{1} se define
como en la fórmula V. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
En la etapa final de este esquema de síntesis,
el producto de fórmula II se convierte al producto de fórmula I por
epoxidación según el método descrito en la Patente US 4.559.332; o
preferentemente mediante el nuevo método de epoxidación de la
invención anteriormente descrito.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 2 procede como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
3
La síntesis en este caso comienza con un
sustrato correspondiente a la fórmula XX
en donde -A-A- y
R^{3} se definen como en la fórmula XIII, -B-B- se
define como en la fórmula XIII excepto que ni R^{6} ni R^{7}
forma parte de un anillo condensado al anillo D en las posiciones
16, 17, y R^{26} es alquilo inferior, con preferencia metilo.
Preferentemente, R^{3} es hidrógeno. La reacción del sustrato de
fórmula XX con un iluro de sulfonio produce el epóxido intermedio de
fórmula
XIX
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3} y R^{26} se definen como en la
fórmula XX. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
En la siguiente etapa del Esquema de síntesis 3,
el compuesto intermedio de fórmula XIX se convierte a otro
compuesto intermedio de fórmula XVIII
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Con preferencia, R^{3} es hidrógeno. En esta etapa, el sustrato
de fórmula XIX se convierte al compuesto intermedio de fórmula XVIII
por reacción con NaCH(COOEt)_{2} en presencia de
una base en un
disolvente.
La exposición del compuesto de fórmula XVIII a
calor, agua y un haluro alcalino produce un compuesto intermedio
descarboxilado de fórmula XVII
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Con preferencia, R^{3} es hidrógeno. El proceso de conversión del
compuesto de fórmula XX al compuesto de fórmula XVII corresponde
esencialmente al descrito en las Patentes US 3.897.417, 3.413.288 y
3.300.489, las cuales se incorporan aquí solo con fines de
referencia. Si bien el sustrato es diferente, los reactivos,
mecanismos y condiciones para la introducción de la mitad de
17-espirolactona son esencialmente
iguales.
La reacción del compuesto intermedio de fórmula
XVII con un reactivo de deshidrogenación proporciona el otro
compuesto intermedio de fórmula XVI
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
Reactivos de deshidrogenación generalmente
útiles incluyen diclorodicianobenzoquinona (DDQ) y cloranilo
(2,3,
5,6-tetracloro-p-benzoquinona). Alternativamente, la deshidrogenación podría conseguirse mediante una halogenación secuencial en el carbono de la posición 6 seguido por una reacción de deshidrohalogenación.
5,6-tetracloro-p-benzoquinona). Alternativamente, la deshidrogenación podría conseguirse mediante una halogenación secuencial en el carbono de la posición 6 seguido por una reacción de deshidrohalogenación.
El compuesto intermedio de fórmula XVI se
convierte a continuación en la enamina de fórmula XVB
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Con preferencia R^{3} es hidrógeno. La conversión se efectúa por
cianuración esencialmente del mismo modo descrito anteriormente para
la conversión del compuesto 11\alpha-hidroxi de
fórmula VIII a la enamina de fórmula VII. Normalmente, la fuente de
ión cianuro puede ser un cianuro de metal alcalino. La base es con
preferencia pirrolidina y/o tetrametilguanidina. Se puede emplear
metanol como
disolvente.
Los productos de fórmula XVB son compuestos
nuevos, los cuales pueden ser aislados por cromatografía. Estos y
otros compuestos nuevos de fórmula XV tienen un valor sustancial
como compuestos intermedios para la preparación de compuestos de
fórmula I y en especial de fórmula IA. Los compuestos de fórmula XV
corresponden a la estructura
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. Los compuestos más preferidos de fórmulas XV y
XVB, -A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es
hidrógeno.
De acuerdo con la hidrólisis descrita
anteriormente para la producción de los compuestos dicetónicos de
fórmula VI, las enaminas de fórmula XVB se pueden convertir a las
dicetonas de fórmula XIVB
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Con preferencia R^{3} es hidrógeno. Particularmente preferidos
para la síntesis de epoximexrenona son aquellos compuestos de
fórmula XIV que también caen dentro del alcance de la fórmula XIVB
como más abajo se
define.
Los productos de fórmula XIVB son compuestos
nuevos que pueden ser aislados por precipitación. Estos y otros
compuestos nuevos de fórmula XIV tienen un valor sustancial como
compuestos intermedios para la preparación de compuestos de fórmula
I y en especial de fórmula IA. Los compuestos de fórmula XIV
corresponden a la estructura
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. Los compuestos de fórmulas XIV y XIVB más
preferidos, -A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es
hidrógeno.
Los compuestos de fórmula XIVB se convierten
además a compuestos de fórmula XXXI, usando esencialmente el
proceso descrito anteriormente para convertir la dicetona de fórmula
VI al hidroxiéster de fórmula V. En este caso, es necesario aislar
el compuesto intermedio de fórmula XXXI
antes de la conversión adicional a
un producto de fórmula
XXXII
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX y
R^{1}se define como en la fórmula V. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno. Los compuestos preferidos de fórmula XXXI son aquellos
que caen dentro de la fórmula IIA. Los compuestos de fórmula XXXI
se convierten a compuestos de fórmula XXXII usando el método
descrito anteriormente o en la Patente US
4.559.332.
Con preferencia, el compuesto de fórmula XIV es
4'S(4'\alpha),7'\alpha-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-hexadecahidro-10\beta-,
13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]-ciclopenta[a]fenantre-
no]5'-carbonitrilo; y el compuesto de fórmula XV es 5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-amino-1',2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',
16'-tetradecahidro-10'\alpha,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]-ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo. En una modalidad particularmente preferida, el proceso global del Esquema 3 procede como sigue:
no]5'-carbonitrilo; y el compuesto de fórmula XV es 5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-amino-1',2',3',4,5,6',7',8',10',12',13',14',15',
16'-tetradecahidro-10'\alpha,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]-ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo. En una modalidad particularmente preferida, el proceso global del Esquema 3 procede como sigue:
Esquema
4
Las tres primeras etapas del Esquema 4 son
iguales que aquellas del Esquema 3, es decir, preparación de un
compuesto intermedio de fórmula XVII a partir de un compuesto
correspondiente a la fórmula XX.
A continuación, el compuesto intermedio de
fórmula XVII se epoxida, por ejemplo, usando el proceso de la
Patente US 4.559.332 para producir el compuesto de fórmula XXIV
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Sin embargo, en una modalidad particularmente preferida de la
invención, el sustrato de fórmula XVII se epoxida a través del doble
enlace 9,11 usando un reactivo de oxidación que comprende un
peróxido activador de tipo amídico, más preferentemente
tricloroacetamida, de acuerdo con el proceso descrito anteriormente
en el Esquema 1 para la conversión del enéster de fórmula II al
producto de fórmula I. Las condiciones y proporciones de reactivos
para esta reacción son prácticamente como las descritas para la
conversión del enéster de fórmula II a epoximexrenona. Compuestos de
fórmula XXIV particularmente preferidos son aquellos en donde
-A-A- y -B-B- se definen como en la
fórmula XIII y R^{3} es
hidrógeno.
El compuesto epoxi de fórmula XXIV se
deshidrogena para producir un doble enlace entre los carbonos 6 y 7
por reacción con un agente de deshidrogenación (oxidante) tal como
DDQ o cloranilo, o usando la secuencia de
bromación/deshidrobromación (u otra
halogenación/deshidrohalogenación), para producir otro nuevo
compuesto intermedio de fórmula XXIII
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XX. Compuestos particularmente preferidos de fórmula
XXIII son aquellos en donde -A-A- y
-B-B- se definen como en la fórmula XIII y R^{3}
es
hidrógeno.
Aunque la oxidación directa es eficaz para la
formación del producto de fórmula XXIII, los rendimientos son en
general bajos. Preferentemente, por tanto, la oxidación se efectúa
en dos etapas, halogenando primeramente el sustrato de fórmula XXIV
en la posición C-6 y luego deshidrohalogenando a la
6,7-olefina. La halogenación se efectúa
preferentemente con un reactivo N-halo orgánico tal
como, por ejemplo, N-bromosuccinimida. La bromación
se efectúa en un disolvente adecuado tal como, por ejemplo,
acetonitrilo, en presencia de un promotor de la halogenación tal
como peróxido de benzoilo. La reacción procede de un modo eficaz a
una temperatura de alrededor de 50 a 100ºC, convenientemente a la
temperatura de reflujo atmosférica en un disolvente tal como
tetracloruro de carbono, acetonitrilo o mezclas de los mismos. Sin
embargo, se requiere normalmente una reacción durante
4-10 horas para el término de la misma. El
disolvente de reacción se separa por destilación y el residuo se
recibe en un disolvente inmiscible en agua, por ejemplo, acetato de
etilo. La solución resultante se lava en secuencia con una solución
alcalina suave (tal como un bicarbonato de metal alcalino) y agua o
preferentemente salmuera saturada para reducir al mínimo las
pérdidas de producto, tras lo cual el disolvente se separa por
destilación y el residuo se recibe en otro disolvente (tal como
dimetilformamida) que sea adecuado para la reacción de
deshidrohalogenación.
A la solución se añade un reactivo de
deshidrohalogenación adecuado, por ejemplo,
1,4-diazabiciclo[2,2,2]octano
(DABCO), junto con un haluro de metal alcalino tal como LiBr, se
calienta la solución a una temperatura de reacción adecuada, por
ejemplo, 60 a 80ºC, y se continúa la reacción durante varias horas,
normalmente 4-15 horas, para completar así la
deshidrobromación. Se puede añadir más reactivo de deshidrobromación
según sea necesario durante el ciclo de reacción, para impulsar la
reacción hacia su término. El producto de fórmula XXIIII puede ser
recuperado entonces, por ejemplo, añadiendo agua para precipitar el
producto el cual se separa entonces por filtración y se lava
preferentemente con cantidades adicionales de agua. el producto se
recristaliza preferentemente, por ejemplo, en dimetilformamida.
Los productos de fórmula XXIII, tal como
9,11-epoxicanrenona, son compuestos nuevos, los
cuales se pueden aislar mediante extracción/cristalización. Los
mismos presentan un valor importante como compuestos intermedios
para la preparación de compuestos de fórmula I y en especial de
fórmula IA. Por ejemplo, se pueden emplear como sustratos para la
preparación de compuestos de fórmula XXII.
Usando sustancialmente el proceso descrito
anteriormente para la preparación de compuestos de fórmula VII, los
compuestos de fórmula XXIII se hacen reaccionar con ión cianuro para
producir nuevos compuestos de epoxienamina correspondientes a la
fórmula XXII
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XX. Compuestos de fórmula XXII particularmente
preferidos son aquellos en donde -A-A- y
-B-B- se definen como en la fórmula XIII y R^{3}
es
hidrógeno.
Los productos de fórmula XXII son compuestos
nuevos, los cuales pueden ser aislados por precipitación y
filtración. Los mismos tienen un valor importante como compuestos
intermedios para la preparación de compuestos de fórmula I y en
especial de fórmula IA. En los compuestos de fórmula XXII más
preferidos, -A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno.
Usando sustancialmente el proceso descrito
anteriormente para la preparación de compuestos de fórmula VI, los
compuestos de epoxienamina de fórmula XXII se convierten a nuevos
compuestos de epoxidicetona de fórmula
XXI
XXI
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{8} y R^{9} se definen como en
la fórmula XIII. En los compuestos de fórmula XXI más preferidos,
-A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es
hidrógeno.
Los productos de fórmula XXI son compuestos
nuevos, los cuales pueden ser aislados por precipitación y
filtración. Los mismos tienen un valor sustancial como compuestos
intermedios para la preparación de compuestos de fórmula I y en
especial de fórmula IA. Compuestos de fórmula XXI particularmente
preferidos son aquellos en donde -A-A- y
-B-B- se definen como en la fórmula XIII. En los
compuestos de fórmula XXI más preferidos, -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno.
Usando sustancialmente el proceso descrito
anteriormente para la preparación de los compuestos de hidroxiéster
de fórmula V a partir de los compuestos dicetónicos de fórmula VI,
los compuestos de epoxidicetona de fórmula XXI se convierten a
compuestos de fórmula XXXII
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX y
R^{1} se define como en la fórmula
V.
Como en la conversión de la dicetona de fórmula
V al hidroxiéster de fórmula VI, se forma también un compuesto
intermedio de
5-\beta-ciano-7-éster
en la conversión de la epoxidicetona de fórmula XXI a compuestos de
fórmula XXXII. Los compuestos intermedios de
5-\beta-ciano-7-éster
de ambas series pueden ser aislados por tratamiento de la
correspondiente dicetona con un alcohol tal como metanol en
presencia de una base tal como trietilamina. Con preferencia, los
compuestos intermedios se preparan refluyendo una mezcla de la
dicetona en un alcohol tal como metanol que contiene alrededor de
0,1 a 2 equivalentes de trietilamina por mol de dicetona durante
4-16 horas aproximadamente. Los productos se aíslan
en forma pura por enfriamiento de la mezcla a 25ºC aproximadamente
seguido por filtración. Los compuestos intermedios aislados se
pueden convertir a los compuestos de fórmula XXXII por tratamiento
con una base tal como un alcóxido de metal alcalino en un
disolvente, preferentemente un alcohol tal como metanol. El uso de
un alcóxido en un alcohol establece una mezcla en equilibrio
similar a la formada cuando se trata la correspondiente cetona de
fórmula XXI en las mismas condiciones.
Además, el 7\beta-éster del compuesto de
fórmula XXXII (por ejemplo
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\beta,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona) ha sido observado por
cromatografía en el producto en bruto de la etapa final del proceso
del esquema IV. El alcóxido y/o cianuro en la solución reacciona y
convierte el 7\alpha-éster a la mezcla epímera del
7\alpha-éster y su epímero 7\beta-éster. El 7\beta-éster puro
puede ser aislado de la mezcla epímera por cristalización
selectiva.
Con preferencia, el compuesto de fórmula XXI es
4'S(4'\alpha),7'\alpha-9',11\alpha-epoxihexadecahidro-10\beta-,13'\beta-dimetil-3'5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]-ciclopenta[a]fenantreno-5'-carbonitrilo;
el compuesto de
fórmula XXII es 5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-amino-9,11\beta-epoxihexadecahidro-10',13'-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),
17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]ciclopenta[a]fenantreno-5'-carbonitrilo; y el compuesto de fórmula XXIII es ácido 9,11\alpha-epoxi-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,6-dieno-21-carboxílico, \gamma-lactona.
fórmula XXII es 5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-amino-9,11\beta-epoxihexadecahidro-10',13'-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),
17'\alpha(5'H)-[7,4]metano[4H]ciclopenta[a]fenantreno-5'-carbonitrilo; y el compuesto de fórmula XXIII es ácido 9,11\alpha-epoxi-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,6-dieno-21-carboxílico, \gamma-lactona.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 4 procede como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso del Esquema 5 comienza con un
sustrato correspondiente a la fórmula XXIX
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Los siguientes microorganismos son capaces de realizar la
9\alpha-hidroxilación de un compuesto de fórmula
XXXV (tal como
androstendiona)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XIII,
a un compuesto de fórmula XXIX bajo condiciones similares a las
descritas en el ejemplo
19B:
Asperigillus niger ATCC 16888 y 26693,
Corynespora cassiicola ATCC 16718, Curvularia clavata
ATCC 22921, Mycobacterium fortuitum NRRL 38119, Nocardia
canicruria ATCC 31548, Pycnosporium spp. ATCC 12231,
Stysanus microsporus ATCC 2833, Syncephalastrum
racemosum ATCC 18192 y Thamnostylum piriforme ATCC
8992.
El sustrato correspondiente a la fórmula XXIX se
convierte a un producto de fórmula XXVIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
por reacción con ortoformato de
trimetilo, en donde -A-A-, -B-B- y
R^{3} se definen como en la fórmula XX. Después de la formación
de los compuestos de fórmula XXVIII, aquellos compuestos se
convierten a los compuestos de fórmula XXVII usando el método
descrito anteriormente para la conversión del sustrato de fórmula XX
a la fórmula XVII. Los compuestos de fórmula XXVII tienen la
estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX y
R^{x} es cualquiera de los grupos
hidroxi-protectores comunes. Alternativamente, el
grupo \alpha-hidroxi C9 puede ser protegido en una
etapa anterior en este esquema de síntesis en el caso de que se
desee realizar la protección en esa etapa, es decir, el hidroxi C9
del compuesto de fórmula XXVIII o el hidroxi C9 del compuesto de
fórmula XXIX pueden ser protegidos con cualquiera de los grupos
hidroxi-protectores
comunes.
\newpage
Usando el método descrito anteriormente para la
preparación de compuestos de fórmula XVI, los compuestos de fórmula
XXVII se oxidan para proporcionar nuevos compuestos correspondientes
a la fórmula XXVI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XX.
Compuestos de fórmulas XXIX, XXVIII, XXVII y XXVI particularmente
preferidos son aquellos en donde en donde -A-A- y
-B-B- se definen como en la fórmula XIII y R^{3}
es
hidrógeno.
Los productos de fórmula XXVI son compuestos
nuevos, los cuales pueden ser aislados por precipitación/filtración.
Los mismos tienen un valor importante como compuestos intermedios
para la preparación de compuestos de fórmula I y en especial de
fórmula IA. Compuestos particularmente preferidos de fórmula XXVI
son aquellos en donde -A-A- y -B-B-
se definen como en la fórmula XIII y R^{3} es hidrógeno. En los
compuestos de fórmula XXVI más preferidos, -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno.
Usando el método antes definido para la
cianuración de compuestos de fórmula VIII, los nuevos compuestos
intermedios de fórmula XXVI se convierten a los nuevos compuestos
intermedios de 9-hidroxienamina de fórmula XXV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula
XX.
Los productos de fórmula XXV son compuestos
nuevos que pueden ser aislados por precipitación/filtración. Los
mismos tienen un valor importante como compuestos intermedios en la
preparación de compuestos de fórmula I y en especial de fórmula IA.
Compuestos particularmente preferidos de fórmula XXV son aquellos en
donde -A-A- y -B-B- se definen como
en la fórmula XIII y R^{3} es hidrógeno. En los compuestos de
fórmula XXVI más preferidos, -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}- y
R^{3} es hidrógeno.
Usando esencialmente las condiciones descritas
anteriormente para la preparación de los compuestos dicetónicos de
fórmula VI, los compuestos intermedios de
9-hidroxienamina de fórmula XXV se convierten a los
compuestos dicetónicos de fórmula XIVB. Ha de apreciarse que, en
este caso, la reacción es eficaz para realizar simultáneamente la
hidrólisis de la estructura enamina y la deshidratación en las
posiciones 9,11 para introducir el doble enlace 9,11. El compuesto
de fórmula XIV se convierte entonces al compuesto de fórmula XXXI y
desde aquí al compuesto de fórmula XIII, usando las mismas etapas
descritas anteriormente en el Esquema 3.
\newpage
Con preferencia, el compuesto de fórmula XIV es
4'S(40\alpha),7'\alpha-1',2',3',4,4',5,5',6',7',8',10',12',13',14',15',16'-hexadecahidro-10\beta-13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]-ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo;
el compuesto de fórmula XXV es
5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-aminohexadecahidro-9'\beta-hidroxi-10'a,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]meteno[4H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo;
el compuesto de fórmula XXVI es ácido
9\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregna-4,6-dieno-21-carboxílico,
\gamma-lactona; y el compuesto de fórmula XXVII
es ácido
9\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-21-carboxílico,
\gamma-lactona.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 5 procede como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El Esquema 6 proporciona un método ventajoso
para la preparación de epoximexrenona y de otros compuestos
correspondientes a la fórmula I, partiendo de la 11\alpha o
11\beta-hidroxilación de androstendiona u otro
compuesto de fórmula XXXV
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XIII,
para producir un compuesto intermedio correspondiente a la fórmula
XXXVI o su correspondiente isómero
11\beta-hidroxi
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XIII.
Salvo en la selección del sustrato, el proceso para realizar la
11\alpha-hidroxilación es esencialmente como se ha
descrito anteriormente para el Esquema 1. Los siguientes
microorganismos son capaces de realizar la
11\alpha-hidroxilación de androstendiona u otro
compuesto de fórmula
XXXV:
Absidia g1auca ATCC 22752, Aspergillus
flavipes ATCC 1030, Aspergillus foetidus ATCC 10254,
Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus
ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500), Aspergillus niger ATCC
11394, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Beauveria
bassiana ATCC 7159, Fusarium oxysporum ATCC 7601,
Fusarium oxysporum cepae ATCC 11171, Fusarium lini
ATCC IFO 7156, Gibberella fujikori ATCC 14842, Hypomyces
chyrsospermus IMI 109891, Mycobaterium fortuitum NRRL
B8119, Penicillum patulum ATCC 24550, Pycnosporium
spp. ATCC 12231, Rhizopus arrhizus ATCC 11145,
Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635, Thamnostyluml
piriforme ATCC 8992, Rhizopus oryzae ATCC 11145,
Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, y Trichothecium roseum
ATCC 12519 y ATCC 8685.
Los siguientes microorganismos son capaces de
efectuar la 11\beta-hidroxilación de
androstendiona u otro compuesto de fórmula XXXV:
Aspergillus fumigatus ATCC 26934,
Aspergillus niger ATCC 16888 y ATCC 26693, Epicoccum
oryzae ATCC 7156, Curvularia lunata ATCC 12017,
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, y Phitomyces
atro-olivaceous IFO 6651.
La
11\alpha-hidroxiandrost-4-eno-3,17-diona,
u otro compuesto de fórmula XXXVI, se convierte a continuación a
11\alpha-hidroxi-3,4-enol
éter de fórmula (101):
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como en la fórmula XIII
y R^{11} es metilo u otro alquilo inferior (C_{1} a C_{4}),
por reacción con un reactivo eterificante tal como ortoformato de
trialquilo en presencia de un catalizador ácido. Para efectuar esta
conversión, el sustrato 11\alpha-hidroxi se
acidifica mezclándolo con un ácido tal como, por ejemplo, ácido
bencenosulfónico hidratado o ácido toluenosulfónico hidratado, y se
disuelve en un disolvente de alcohol inferior, preferentemente
etanol. Se introduce gradualmente, durante un periodo de 5 a 40
minutos, un ortoformato de trialquilo, con preferencia ortoformato
de trietilo, al tiempo que se mantiene la mezcla en frío,
preferentemente a una temperatura de alrededor de 0 a 15ºC. Se
calienta luego la mezcla y la reacción se efectúa a una temperatura
entre 20 y 60ºC aproximadamente. Con preferencia, la reacción se
efectúa a una temperatura de 30 a 50ºC durante 1-3
horas, tras lo cual se calienta a reflujo durante un periodo
adicional, normalmente 2 a 6 horas, para completar la reacción. La
mezcla de reacción se enfría, preferentemente a
0-15ºC, con preferencia alrededor de 5ºC, y el
disolvente se separa bajo
vacío.
Usando el mismo esquema de reacción como el
descrito en el Esquema 3 anterior para la conversión del compuesto
de fórmula XX al compuesto de fórmula XVII, se introduce una mitad
17-espirolactona de fórmula XXXIII en el compuesto
de fórmula 101. Por ejemplo, el sustrato de fórmula 101 se puede
hacer reaccionar con un iluro de sulfonio en presencia de una base
tal como un hidróxido de metal alcalino en un disolvente adecuado
tal como DMSO, para producir un compuesto intermedio
correspondiente a la fórmula 102:
en donde -A-A-,
R^{3}, R^{11} y -B-B- se definen como en la
fórmula 101. El compuesto intermedio de fórmula 102 se hace
reaccionar entonces con un diéster de ácido malónico en presencia de
un alcóxido de metal alcalino para formar el anillo de
espirolactona de cinco miembros y producir el compuesto intermedio
de fórmula
103
en donde -A-A-,
R^{3}, R^{11} y -B-B- se definen como en la
fórmula 102 y R^{12} es un alquilo C_{1} a C_{4},
preferentemente etilo. Por último, el compuesto de fórmula 103 en un
disolvente adecuado, tal como dimetilformamida, se somete a calor
en presencia de un haluro de metal alcalino, se escinde la mitad
alcoxicarbonilo y se obtiene el compuesto intermedio de fórmula
104:
en donde de nuevo
-A-A-, R^{3}, R^{11} y -B-B- se
definen como en la fórmula
102.
El compuesto de 3,4-enol éter
104 se convierte entonces al compuesto de fórmula XXIII, es decir,
el compuesto de fórmula VIII en donde R^{8} y R^{9} juntos
forman la mitad de fórmula XXXIII. Esta etapa de oxidación se
efectúa esencialmente de la misma manera que la etapa de oxidación
para la conversión del compuesto de fórmula XXIV al compuesto
intermedio de fórmula XXXIII en la síntesis del Esquema 4. La
oxidación directa se puede efectuar usando un reactivo tal como
2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
(DDQ) o tetraclorobenzoquinona (cloranilo) o con preferencia se
efectúa una oxidación en dos etapas bromando primeramente, por
ejemplo, con un agente de bromación N-halo tal como
N-bromosuccinimida (NBS) o
1,3-dibromo-5,5-dimetilhidantoina
(DBDMH) y luego dehidrobromando con una base, por ejemplo con DABCO
en presencia de LiBr y calor. Cuando se emplea NMS para la
bromación, debe usarse también un ácido para convertir el
3-enol éter a la enona. La DBDMH, un reactivo de
bromación iónico más que de radicales libres, resulta eficaz por sí
misma para la bromación y conversión del enol éter a la enona.
El compuesto de fórmula VIII se convierte
entonces a epoximexrenona o a otro compuesto de fórmula I mediante
las etapas descritas anteriormente para el Esquema 1.
Cada uno de los compuestos intermedios de
fórmulas 101, 102, 103 y 104 es un compuesto nuevo que tiene un
valor importante como compuesto intermedio a epoximexrenona o a
otros compuestos de fórmulas IA y I. En cada uno de los compuestos
de fórmulas 101, 102, 103 y 104, -A-A- y
-B-B- son preferentemente
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno, alquilo
inferior o alcoxi inferior. Con preferencia, R^{3} es hidrógeno.
Más preferentemente, el compuesto de fórmula 101 es
3-etoxi-11\alpha-hidroxiandrost-3,5-dien-17-ona,
el compuesto de fórmula 102 es
3-etoxiespiro[androst-3,5-dieno-17\beta,2'-oxiran]-11\alpha-ol,
el compuesto de fórmula 103 es
etil-hidrógeno-3-etoxi-11\alpha,17\alpha-dihidroxipregna-3,5-dieno-21,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, y el compuesto de fórmula 104 es
ácido
3-etoxi-11\alpha-17\alpha-dihidroxipregna-3,5-dieno-21-carboxílico,
\gamma-lactona.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 6 procede como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha llegado a la hipótesis de que de manera
similar se pueden preparar epoximexrenona y otros compuestos
correspondientes a la fórmula I a partir de
11\beta-hidroxiandrostendiona u otros compuestos
de fórmula XXXV que han sido
11\beta-hidroxilados. En otras palabras, se pueden
preparar epoximexrenona y otros compuestos correspondientes a la
fórmula I de acuerdo con el proceso general indicado en el Esquema 6
usando un sustrato \alpha-hidroxilado de fórmula
XXXV o el correspondiente sustrato
\beta-hidroxilado.
Esquema
7
El Esquema 7 proporciona la síntesis de
epoximexrenona y de otros compuestos de fórmula I usando un sustrato
de partida que comprende \beta-sitosterol,
colesterol, estigmasterol u otro compuesto de fórmula XXXVII
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
R^{3} y -B-B- se definen como en la fórmula XIII;
D-D es -CH_{2}-CH_{2}- o
-CH=CH-; y cada uno de R^{13}, R^{14}, R^{15} y R^{16} se
elige independientemente entre hidrógeno o alquilo C_{1} a
C_{4}. Con preferencia, R^{3} es
hidrógeno.
En la primera etapa de la síntesis, se prepara
11\alpha-hidroxiandrostendiona u otro compuestos
de fórmula XXXVI por bioconversión del compuesto de fórmula XXXVII.
El proceso de bioconversión se efectúa prácticamente de acuerdo con
el método descrito anteriormente para la
11\alpha-hidroxilación de canrenona (u otro
sustrato de fórmula XIII).
En la síntesis de
11\alpha-hidroxiandrostendiona, se prepara
inicialmente
4-androsteno-3,17-diona
por bioconversión del compuesto de fórmula XXXVII. Esta
bioconversión inicial se puede efectuar del modo descrito en la
Patente US 3.759.791, la cual se incorpora aquí solo con fines de
referencia. A continuación, la
4-androsteno-3,17-diona
se convierte a 11\alpha-hidroxiandrostendiona
sustancialmente de acuerdo con el método descrito anteriormente
para la 11\alpha-hidroxilación de canrenona (u
otro sustrato de fórmula XIII).
El resto de la síntesis del Esquema 7 es
idéntico al Esquema 6. En una modalidad particularmente preferida,
el proceso global del Esquema 7 procede como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha planteado la hipótesis de que de manera
similar se pueden preparar epoximexrenona y otros compuestos
correspondientes a la fórmula I de acuerdo con el proceso general
indicado en el Esquema 7 cuando el producto de la bioconversión de
\beta-sitosterol o de otros compuestos de fórmula
XXXVIII es 11\beta-hidroxiandrostendiona u otros
compuestos de fórmula XXXV que han sido
11\beta-hidroxilados. En otras palabras, se pueden
preparar epoximexrenona y otros compuestos correspondientes a la
fórmula I de acuerdo con el proceso general indicado en el esquema
7 cuando la bioconversión de \beta-sitosterol o de
otros compuestos de fórmula XXXVIII da como resultado la
preparación de un sustrato \alpha-hidroxilado de
fórmula XXXV o el correspondiente sustrato
\beta-hidroxilado.
Esquema
8
Una complicación importante en la síntesis de
epoximexrenona y de compuestos relacionados es la necesidad de
introducir esteroselectivamente un sustituyente
\alpha-alcoxicarbonilo en el carbono 7, sin
modificaciones indeseadas en otros puntos de la estructura
esteroidal. De acuerdo con la invención, se ha descubierto que un
camino de síntesis eficaz para la introducción de un sustituyente
7\alpha-alcoxicarbonilo implica las siguientes
etapas: (i) cianuración inicial en el carbono 7 del esteroide, (ii)
hidrólisis del 7-ciano esteroide para formar una
mezcla de esteroides de ácido 7\alpha-carboxílico
y ácido 7\beta-carboxílico, (iii) formación de un
esteroide 5,7-lactona a partir del esteroide de
ácido 7\alpha-carboxílico y (iv) separación del
esteroide de ácido 7\beta-carboxílico del
esteroide de 5,7-lactona. Una reacción de apertura,
mediada por una base, del esteroide de 5,7-lactona
con un reactivo alquilante produce el
7\alpha-alcoxicarbonil esteroide deseado.
Por tanto, el proceso del esquema 8 está
dirigido generalmente a un proceso para la preparación de un
\Delta^{4,5}-esteroide
3-ceto-7\alpha-alcoxicarbonil-sustituido
que comprende hacer reaccionar un reactivo alquilante con un
sustrato esteroidal de
3-ceto-4,5-dihidro-5,7-lactona
en presencia de una base. El sustrato de lactona está sustituido
con ceto en el carbono 3 y además comprende la mitad:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde C(5) representa el
carbono 5 y C(7) representa el carbono 7 de la estructura
esteroidal del sustrato. La conversión de la
5,7-lactona al
7\alpha-alcoxicarbonilo se efectúa preferentemente
por reacción con un haluro de alquilo en presencia de la base. El
reactivo de haluro de alquilo es preferentemente un yoduro, muy
particularmente yoduro de
metilo.
En un proceso para la preparación del compuesto
esteroidal de
4,5-dihidro-5,7-lactona
descrito anteriormente, un sustrato esteroidal
3-ceto-\Delta^{4,5}-7\alpha-ciano-sustituido
se convierte al ácido 7-carboxílico y el ácido
reacciona a su vez con el ortoformato de trialquilo en un alcohol
inferior acidificado como disolvente, para dar la
5,7-lactona. La reacción con ésteres de ortoformato
convierte también el grupo 3-ceto a la cetal
5,7-lactona 3-acíclica o cíclica (se
entiende que primero se forma la lactona). Con preferencia, la
3-cetal 5,7-lactona es una
3-dialquil cetal 5,7-lactona. Más
preferentemente, la mitad alquilo del alcohol disolvente es la
misma mitad alquilo de los grupos alcoxi del ortoformato (y más
preferentemente todas ellas son metilo) debido a que: las mitades
alcoxi del cetal se pueden derivar del ortoformato o del alcohol; no
se prefieren cetales mixtos; y se prefiere
3-dimetoxi. Cuando el cetal es un etilencetal, no es
necesario que la mitad alquilo del alcohol disolvente sea la misma
que la mitad alquilo de los grupos alcoxi del ortoformato. La
3-cetal-5,7-lactona
se hidroliza fácilmente a la
3-ceto-5,7-lactona,
un compuesto cristalino que puede ser purificado fácilmente. Puesto
que solo el ácido 7\alpha-carboxílico experimenta
la relación de lactonización, se consigue una estereoespecificidad
completa. El 7\beta-ácido puede ser entonces separado de la mezcla
de reacción en forma de su sal, por ejemplo, por tratamiento del
7\beta-ácido con una base suave tal como bicarbonato
sódico.
sódico.
El sustrato 7-ciano para la
formación de la 5,7-lactona se puede preparar de
manera conocida. Por ejemplo, un sustrato insustituido en el
carbono 7 se puede hacer reaccionar con un ligero exceso de ión
cianuro, con preferencia alrededor de 1,05 a 1,25 equivalentes por
equivalente de sustrato, en una solución débilmente ácida que
comprende una mezcla disolvente de agua/DMSO. Con preferencia, la
mezcla de reacción comprende un ácido carboxílico, por ejemplo,
alrededor de un equivalente de ácido acético por equivalente de
sustrato. Se forman ambos isómeros 7\alpha- y
7\beta-CN siendo el isómero 7\alpha el isómero
principal. El 7\alpha-ciano esteroide se puede
recuperar de manera convencional. En esta preparación auxiliar son
de utilidad otros métodos conocidos en la técnica.
Generalmente, de acuerdo con el Esquema 8, la
5,7-lactona se puede formar a partir de un compuesto
intermedio 7-carboxi (el cual se prepara por
hidrólisis de un compuesto intermedio 7-ciano) que
está sustituido en la posición 17 con ceto, R^{8} o R^{9}, en
donde R^{8} y R^{9} se describen como anteriormente, y que
tiene una configuración alifática, olefínica, epoxídica o
hidroxi-sustituida en C-9 y
C-11, es decir,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente,
R^{80} y R^{90} son iguales que R^{8} y R^{9}, o bien
R^{80} y R^{90} juntos constituyen ceto, y R^{18} se define
como a continuación con referencia al Esquema 9, y
-E-E- se elige
entre
El compuesto de fórmula XLII se convierte
entonces al
7\alpha-alcoxi-carbonilo:
En cada una de las fórmulas XL, XLI, XLII y
XLVIII, R^{80} y R^{90} juntos comprenden preferentemente ceto
o
en donde Y^{1}, Y^{2}, X y
C(17) se definen como anteriormente y muy preferentemente
R^{80} y R^{90} juntos
comprenden
R^{3} es preferentemente H, R^{1} es
preferentemente metoxicarbonilo y -A-A- y
-B-B- son cada uno preferentemente
-CH_{2}-CH_{2}-. Ha de entenderse que las
reacciones se pueden efectuar también con el grupo
3-ceto protegido convirtiéndolo, y manteniéndolo,
en cada una de las formas éter o cetal durante toda la secuencia de
reacción. Procesos alternativos del Esquema 8 comprenden el uso de
varios compuestos intermedios dentro del alcance de las fórmulas
XLI y XLII como se ha indicado anteriormente.
Indicando que el reactivo para la formación de
la 5,7-lactona a partir del ácido
3-ceto-\Delta^{4,5}-7-carboxílico
según el Esquema 8 es el ortoformato de trialquilo, el mismo
reactivo usado en la conversión de la
11\alpha-hidroxiandrostendiona al compuesto
intermedio de 3-enol
éter-3,5-dieno-11\alpha-hidroxi
101 del Esquema 6, se cree que el camino de la reacción del Esquema
8 depende de la sustitución en C-7. La reacción con
ortoformato en presencia de H^{+} forma un ión carbonio
intermedio que tiene un carboxilo en C-7 y su carga
positiva en equilibrio entre C-3 y
C-5. Tras la pérdida del protón, el ión carbonio
C-3 proporciona el compuesto de fórmula 101,
mientras que el ión carbonio C-5 proporciona la
lactona. Con hidrógeno en C-7, se cree que se ve
favorecido el
3,5-cieno-3-alcoxi
(enol éter) debido a la conjugación del doble enlace. Con el
sustituyente 7\alpha-CO_{2} en
C-7, el ión carbonio C-5 es
capturado por el carboxi y se forma la 5,7-lactona.
En este momento, el grupo 3-ceto se convierte
preferentemente al cetal, impulsando con ello la reacción hacia su
término.
Modalidades preferidas del Esquema 8 se
describen en los Esquemas 9 y 10, infra.
Esquema
9
El Esquema 9 comienza con el mismo sustrato que
el Esquema 4, es decir, el compuesto de fórmula XX. Este sustrato
se oxida primeramente al compuesto de fórmula B:
en donde -A-A-,
R^{3} y -B-B- se definen como en la fórmula XIII.
La reacción de oxidación se efectúa según cualquiera de los
esquemas de reacción antes descritos para la conversión del
compuesto de fórmula XXIV al compuesto intermedio de fórmula XXIII
en la síntesis del Esquema 4. Usando los métodos descritos para el
Esquema 8, el compuesto de fórmula B se convierte al compuesto
intermedio 7-ciano de fórmula
C:
en donde -A-A-,
R^{3} y -B-B- se definen como en la fórmula XIII.
El compuesto de fórmula C se convierte entonces a la
5,7-lactona de fórmula
D:
en donde -A-A-,
R^{3} y -B-B- se definen como en la fórmula XIII y
R^{17} es alquilo C_{1}-C_{4}, usando el
reactivo de ortoformato de trialquilo empleado previamente en el
Esquema 6. La 5,7-lactona de fórmula D se separa
fácilmente del 7-\beta-COOH sin
reaccionar, por ejemplo, por separación del ácido por medio de un
lavado con bicarbonato, estableciendo con ello la estereoquímica
C-7 deseada e impidiendo la epimerización en
posteriores reacciones que se efectúan bajo condiciones básicas. La
esterificación de la lactona por reacción con haluro de alquilo,
como se describe en el Esquema 8, proporciona el enéster intermedio
de fórmula
II.
Continuando la síntesis del Esquema 9, el
compuesto de fórmula D se convierte a un compuesto de fórmula II.
Con el grupo 3-ceto protegido al haber sido
convertido al cetal, se introduce selectivamente un grupo
20-espiroxano de fórmula XXXIII en la posición 17
de acuerdo con el Esquema de reacción descrito anteriormente para
los Esquemas 3 y 6, supra, produciendo con ello un compuesto de
fórmula E
Debido a que la 3-cetona está
protegida, se pueden seleccionar las condiciones de hidrólisis que
sean óptimas para el ataque de la 17-cetona sin
preocupar la formación de subproductos a través de la reacción en la
posición 3. Después de la hidrólisis del compuesto
3-cetálico de fórmula E a la estructura del grupo
3-ceto de fórmula F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
este último compuesto intermedio se
hace reaccionar con yoduro de alquilo en presencia de una base, por
la conversión del Esquema 8, para producir el enéster intermedio de
fórmula II. Finalmente, este último compuesto intermedio se
convierte a epoximexrenona o a otro compuesto de fórmula I, usando
cualquiera de los métodos descritos anteriormente para el Esquema
1.
Las ventajas del Esquema 9 no solo se derivan
del control de la estereoquímica proporcionada por la
5,7-lactona intermedia, sino que presentan también
la ventaja adicional de permitir una gama más amplia de condiciones
de hidrólisis sin interferencia de la
17-espirolactona.
Al igual que las reacciones para otros esquemas
de síntesis de esta invención, las reacciones del Esquema 9 se
pueden emplear para la conversión de sustratos distintos de los
descritos particularmente con anterioridad. Así, por ejemplo, la
conversión de 3-ceto- o
3-cetal-7-ciano
esteroides a 3-ceto- o
3-cetal-5,7-lactona,
o la conversión de la 3-ceto- o
3-cetal-5,7-lactona
a 7\alpha-alcoxicarbonilo, se puede efectuar en
compuestos sustituidos en el carbono 17 por R^{8} y R^{9} como
se han definido anteriormente o, más particularmente, por un
sustituyente de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde X, Y^{1} e Y^{2} se
definen como anteriormente y C(17) representa el carbono 17.
Sin embargo, se consiguen ventajas importantes, especialmente en
cuanto a la economía del proceso, mediante el uso de la secuencia
de reacción específica que utiliza sustratos 17-ceto
y siguiendo el esquema de reacción específico descrito
anteriormente para la introducción de
17-espirolactona y
7\alpha-alcoxicarbonilo en un
3-ceto-\Delta^{9,11}esteroide.
Las lactonas de fórmulas D, E y F son compuestos
nuevos útiles en la preparación de epoximexrenona y de otros
compuestos de fórmulas I y IA de acuerdo con la síntesis del Esquema
9. En estos compuestos, -A-A- y
-B-B- son preferentemente
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{3} es hidrógeno, alquilo
inferior o alcoxi inferior. Más preferentemente, el compuesto de
fórmula D es aquel en donde R^{17} es metoxi.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 9 procede como sigue:
\newpage
\global\parskip0.800000\baselineskip
Esquema
10
\vskip1.000000\baselineskip
El Esquema 10 es el mismo que el Esquema 9 a
través de la formación del 7-ciano intermedio de
fórmula C. En la siguiente etapa del Esquema 10, el
7-ciano esteroide se hace reaccionar con ortoformato
de trialquilo en un alcanol disolvente, preferentemente ortoformato
de trimetilo en metanol, para proteger simultáneamente los grupos
3-ceto y 17-ceto, por conversión del
primero al enol éter y del segundo al cetal. A continuación, el
grupo 7-ciano se reduce a 7-formilo,
por ejemplo, por reacción con un hidruro de
dialquil-aluminio, con preferencia hidruro de
diisobutil-aluminio para producir así un compuesto
de fórmula 203:
en donde -A-A-,
R^{3} y -B-B- se definen como en la fórmula XIII y
R^{18} es alquilo C_{1}-C_{4}. La protección
previa de los grupos ceto, como antes se ha descrito, impide su
reducción por el hidruro de dialquil-aluminio. El
compuesto intermedio de fórmula 203 se hace reaccionar entonces con
ácido acuoso diluido para hidrolizar selectivamente el
17-cetal, en presencia de un exceso de alcohol
(R^{19}OH), produciendo con ello el compuesto intermedio de
fórmula
204:
en donde R^{19} se elige entre
alquilo inferior (preferentemente C_{1} a C_{4}) o formando los
grupos R^{19} en la posición 3 un sustituyente
O,O-oxialquilenoxicíclico en el carbono 3. El
hemiacetal [204] se protege además por tratamiento con un alcanol
(R^{20}OH) en presencia de un ácido no acuoso para producir el
compuesto intermedio de fórmula
205:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3} y R^{19} se definen como
anteriormente y R^{20} es alquilo C_{1} a C_{4}. La mitad
17-espirolactona se puede introducir entonces de
acuerdo con las etapas de reacción descritas anteriormente para los
Esquemas 3 y 6, procediendo así a través de la secuencia indicada a
continuación:
en donde -A-A-,
-B-B-, R^{3}, R^{19} y R^{20} se definen como
anteriormente y R^{25} es alquilo C_{1} a
C_{4}.
\global\parskip1.000000\baselineskip
A continuación, la posición 3 se desprotege por
hidrólisis convencional para volver a introducir el grupo
3-ceto y el 5,7-hemiacetal,
produciendo el otro compuesto intermedio correspondiente a la
fórmula 209:
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente. Se
introduce entonces una mitad 9,11-epóxido de
acuerdo con cualquiera de los métodos antes descritos para la
conversión de los compuestos de fórmula II a los compuestos de
fórmula I. Bajo las condiciones oxidantes de la reacción de
epoxidación, el hemiacetal se convierte parcialmente a la
5,7-lactona, produciendo con ello otro compuesto
intermedio correspondiente a la fórmula
211
211
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente.
Cualquier producto de reacción intermedio de
9,11-epoxi-5,7-hemiacetal
que permanezca de fórmula
210:
\vskip1.000000\baselineskip
en donde -A-A-,
-B-B- y R^{3} se definen como anteriormente, se
oxida fácilmente por medios convencionales al compuesto de fórmula
211. Finalmente, el compuesto intermedio de fórmula 211 se convierte
a epoximexrenona o a otro compuesto de fórmula I usando el método
descrito en el Esquema 8 para la conversión de la
5,7-lactona al compuesto
7\alpha-alcoxicarbonilo. Así, en general, el
Esquema 10 procede como sigue, entendiéndose que al menos las
siguientes etapas pueden ser realizadas in situ sin
recuperación del compuesto intermedio. En general, la síntesis del
Esquema 10 procede como
sigue:
Como en el caso del Esquema 9, las reacciones
antes descritas para el Esquema 10 ofrecen importantes ventajas,
especialmente con respecto a la economía del proceso; sin embargo,
las nuevas reacciones del Esquema 10 tienen también una aplicación
más genérica a sustratos distintos de los descritos particularmente
hasta ahora. Por ejemplo, la introducción del grupo
7-formilo en un 3-enol éter
esteroide, la protección del
7-formil-\Delta-5,6-3,4-enol
éter resultante, la hidrólisis al 5,7-hemiacetal y
la posterior desprotección, se pueden realizar en esteroides
sustituidos en la posición 17 por R^{8} y R^{9} como se han
definido anteriormente, o más particularmente por un sustituyente de
fórmula:
en donde X, Y^{1}, Y^{2} y
C(17) se definen como
anteriormente.
Procesos alternativos del Esquema 10 comprenden
el uso de los diversos compuestos intermedios dentro del alcance de
las fórmulas A203 a A210, respectivamente, antes indicadas. Cada uno
de los compuestos intermedios de fórmulas A203 a A211 es un
compuesto nuevo de utilidad en la preparación de epoximexrenona y de
otros compuestos de fórmulas I y IA de acuerdo con la síntesis del
Esquema 10.
En una modalidad particularmente preferida, el
proceso global del Esquema 10 procede como sigue:
A partir de los diversos esquemas ilustrados
anteriormente, se entenderá que las etapas de reacción seleccionadas
para utilizarse en los procedimientos de la invención proporcionan
una flexibilidad importante a la hora de producir epoximexrenona y
compuestos relacionados. Las características clave incluyen,
inter alia: (a) bioconversión de un sustrato tal como
canrenona, androstendiona o \beta-sitosterol a un
derivado 11\alpha- o 9\alpha-hidroxi (con
conversión simultánea de \beta-sitosterol a una
estructura 17-ceto; (b) introducción del doble
enlace 9,11 por deshidratación de un compuesto que contiene un
grupo 11\alpha- o 9\alpha-hidroxi, seguido por
introducción del grupo epoxi mediante oxidación del doble enlace
9,11; (c) unión de un 7\alpha-alcoxicarbonilo por
formación de la enamina, hidrólisis de la enamina a la dicetona y
reacción de la dicetona con un alcóxido de metal alcalino; (d)
formación del anillo 20-espiroxano en la posición
17; (e) formación de la 5,7-lactona y
esterificación de la lactona al 7-alcoxicarbonilo;
(f) protección de la 3-cetona por conversión al
3-enol éter o 3-cetal durante
varias de las conversiones en otras posiciones (incluyendo la
formación del anillo 20-espiroxano en la posición
17). Salvo pequeñas limitaciones, estos cuatro elementos componentes
del proceso (b) a (d) se pueden realizar casi en cualquier
secuencia. Los elementos (e) y (f) del proceso ofrecen una
flexibilidad comparable. Los mismos proporcionan una vía a
epoximexrenona y otros compuestos de fórmula I que es mucho más
simple en comparación con el procedimiento de la Patente US
4.559.332. Además, proporcionan ventajas importantes en cuanto a
productividad y rendimiento.
En las descripciones de los esquemas de reacción
indicados anteriormente, la recuperación, el aislamiento y la
purificación de los productos de reacción se puede efectuar en
general por métodos ya bien conocidos para el experto en la
materia. Salvo cuando se indique lo contrario, las condiciones, los
disolventes y los reactivos son convencionales, no son
estrechamente críticos o bien tienen ambas características. Sin
embargo, algunos de los procedimientos específicos como los
descritos particularmente con anterioridad proporcionan ventajas
que contribuyen al rendimiento y/o productividad general favorables
de las diversas etapas y esquemas de los procedimientos y/o a una
elevada calidad de los compuestos intermedios y de los productos de
9,11-epoxi esteroides finales.
La utilidad de los compuestos de
20-espiroxano producidos de acuerdo con la invención
se describe en la Patente US 4.559.332 de Grob, la cual se
incorpora aquí solo con fines de referencia.
Los compuestos de 20-espiroxano
producidos según la invención se distinguen por propiedades
biológicas favorables y, por tanto, son ingredientes
farmacéuticamente activos valiosos. Por ejemplo, los mismos tienen
una fuerte acción antagonista de aldosterona ya que reducen y
normalizan la retención de sodio y la excreción de potasio
indebidamente altas causadas por la aldosterona. Por tanto,
presentan, como diuréticos economizadores de potasio, una
impor-
tante aplicación terapéutica, por ejemplo en el tratamiento de hipertensión, insuficiencia cardíaca o cirrosis hepática.
tante aplicación terapéutica, por ejemplo en el tratamiento de hipertensión, insuficiencia cardíaca o cirrosis hepática.
Los derivados de 20-espiroxano
que tienen una acción antagonista de aldosterona son ya conocidos,
véase, por ejemplo, Fieser y Fieser: Steroids; página 708 (Reinhold
Publ. Corp., New York, 1959) y la Patente británica No. 1.041.534;
también se conocen ácidos
17\beta-hidroxi-21-carboxílicos
y sus sales, análogamente activos, véase, por ejemplo, la Patente
US No. 3.849.404. Sin embargo, los compuestos de este tipo que han
sido utilizados hasta ahora en terapia presentan un inconveniente
considerable ya que los mismos poseen siempre una cierta actividad
específica a la sexualidad lo cual presenta consecuencias
inoportunas más pronto o más tarde en la terapia usual a largo
plazo. Especialmente indeseables son los efectos molestos que pueden
ser atribuidos a la actividad anti-androgénica de
los preparados anti-aldosterona conocidos.
El proceso de la invención y los métodos,
procesos y composiciones que se emplean en la preparación de
compuestos útiles en el proceso de la invención y las condiciones y
reactivos que allí se emplean, se describen adicionalmente en los
siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos marcados con asteriscos
son solo con fines de referencia.
Ejemplo
1*
Se prepararon tubos inclinados con un medio de
crecimiento como se indica en la Tabla 1.
Para producir cultivos de primera generación, se
suspendió una colonia de Aspergillus ochraceus en agua
destilada (2 ml) en un tubo de ensayo; y se aplicaron partes
alícuotas de 0,15 ml de esta suspensión a cada uno de los tubos
inclinados que habían sido preparados como se ha descrito
anteriormente. Los tubos inclinados se incubaron durante 7 días a
25ºC, tras lo cual la apariencia del cultivo de superficie fue la de
un micelio algodonoso blanco. El reverso estaba pigmentado de color
naranja en la parte inferior y de color amarillo anaranjado en la
parte superior.
Los cultivos en tubo inclinado de primera
generación se suspendieron en una solución estéril (4 ml)
conteniendo surfactante no iónico Tween 80 (3% en peso) y se
emplearon partes alícuotas de 0,15 ml de esta suspensión para
inocular tubos inclinados de segunda generación que habían sido
preparados con el medio de crecimiento indicado en la Tabla 2.
Los tubos inclinados de segunda generación se
incubaron durante 10 días a 25ºC, para producir una masa pesada de
esporas de color dorado; con el reverso pigmentado en color marrón
anaranjado.
Se preparó un medio de protección que tiene la
composición indicada en la Tabla 3.
En la solución protectora (15 ml), en un matraz
de 100 ml, se suspendieron cultivos de cinco de los tubos
inclinados de segunda generación. La suspensión fue distribuida en
partes alícuotas (0,5 ml cada una) entre tubos de 100 x 10 mm para
la liofilización. Estos fueron congelados previamente a una
temperatura de -70º a -80ºC en un baño de acetona/hielo seco durante
20 minutos y luego transferidos inmediatamente a una sala de secado
previamente enfriada a una temperatura de -40º a -50ºC. Las partes
alícuotas previamente congeladas se liofilizaron a una presión
residual de 50 \mu Hg y \leq -30ºC. Al término de la
liofilización, se añadieron de dos a tres gránulos de gel de sílice
estéril a cada tubo con indicador de la humedad y sellado a la
llama.
Para obtener tubos inclinados de cultivo madre
adecuados para la fermentación a escala industrial, una sola parte
alícuota de cultivo liofilizado, que se había preparado del modo
antes descrito, se suspendió en agua destilada (1 ml) y se
emplearon partes alícuotas de 0,15 ml de la suspensión para inocular
tubos inclinados que habían sido proporcionados con un medio de
crecimiento que tiene la composición indicada en la Tabla 2. Los
tubos madre se incubaron durante 7 días a 25ºC. Al término de la
incubación, el cultivo desarrollado en los tubos se conservó a
4ºC.
Para preparar un cultivo en tubo inclinado de
rutina, se suspendió el cultivo de un tubo inclinado madre en una
solución estéril (4 ml) conteniendo Tween 80 (3% en peso) y la
suspensión resultante se distribuyó en partes alícuotas de 0,15 ml
entre tubos inclinados que habían sido revestidos con el medio de
crecimiento descrito en la Tabla 2. Los cultivos inclinados de
rutina pueden ser usados para inocular los matraces seminales
primarios para fermentaciones a escala de laboratorio o escala
industrial.
Para preparar un cultivo en matraz seminal
primario, el cultivo procedente de un tubo inclinado de rutina, que
había sido preparado como antes de ha descrito, fue separado y
suspendido en una solución (10 ml) conteniendo Tween 80 (3% en
peso). Una parte alícuota de 0,1 ml de la suspensión resultante se
introdujo en un matraz provisto de deflector y de 500 ml
conteniendo un medio de crecimiento que tiene la composición
indicada en la Tabla 4.
El matraz seminal se incubó en un sacudidor
rotativo (200 rpm, desplazamiento 5 cm) durante 24 horas a 28ºC,
para producir así un cultivo en forma de micelios de tipo pellet que
tienen diámetros de 3 a 4 mm. Tras la observación microscópica, se
observó que el cultivo seminal era un cultivo puro, con crecimiento
sinemático, con grandes hifas y bien torsionado. El pH de la
suspensión fue de 5,4 a 5,6. El valor PMV fue de 5 a 8% determinado
por centrifugado (3.000 rpm x 5 minutos).
Se preparó un cultivo de transformación en
matraz inoculando un medio de crecimiento (100 ml) que tiene la
composición indicada en la Tabla 4 en un segundo matraz sacudidor de
500 ml con biomasa (1 ml) procedente del matraz de cultivo seminal.
La mezcla resultante se incubó en un sacudidor rotativo (200 rpm,
desplazamiento 5 cm) durante 18 horas a 28ºC. El cultivo fue
examinado y se comprobó que comprendía micelios de tipo pellet con
un diámetro de 3-4 mm. Tras el examen microscópico,
se determinó que el cultivo era un cultivo puro con crecimiento
sinemático y filamentoso en donde las células apicales estaban
llenas de citoplasma y las células antiguas tenían pocas vacuolas.
El pH de la suspensión de cultivo fue de 5 a 5,2 y se determinó que
el valor PMV por centrifugado, estaba comprendido entre 10 y 15%.
Por tanto, el cultivo fue considerado como adecuado para la
transformación de canrenona a
11\alpha-hidroxicanrenona.
Se micronizó canrenona (1 g) a 5 \mu
aproximadamente y se suspendió en agua estéril (20 ml). A esta
suspensión se añadieron: una solución estéril de glucosa al 40%
(p/v); una solución estéril al 16% (p/v) de levadura autolisada; y
una solución estéril de antibiótico; todas ellas en las proporciones
indicadas en la Tabla 5 para el tiempo de reacción de 0 horas. La
solución de antibiótico había sido preparada disolviendo sulfato de
kanamicina (40 mg), hidrocloruro de tetraciclina (40 mg) y
cefalexina (200 mg) en agua (100 ml). La suspensión de esteroide,
la suspensión de glucosa y la solución de levadura autolisada se
añadieron gradualmente al cultivo contenido en el matraz
sacudidor.
A medida que procedía la reacción, la mezcla de
reacción fue analizada periódicamente para determinar el contenido
en glucosa y por cromatografía de capa delgada para determinar la
conversión a 11\alpha-hidroxicanrenona. Se
añadieron más sustrato de canrenona y nutrientes a la mezcla de
reacción de fermentación durante la reacción a velocidades
controladas para mantener el contenido en glucosa en la gama de
alrededor de 0,1% en peso. El programa de adición de la suspensión
de esteroide, solución de glucosa, solución de levadura autolisada y
solución de antibiótico, se indica en la Tabla 5. La reacción de
transformación continuó durante 96 horas a 25ºC en un sacudidor
rotativo (200 rpm y 5 cm de desplazamiento). Durante la
fermentación, el pH osciló entre 4,5 y 6. Cada vez que el valor PMV
subió a 60% o por encima de 60%, se extrajo una porción de 10 ml de
caldo de cultivo y se reemplazó por 10 ml de agua destilada. La
desaparición de canrenona y la aparición de
11\alpha-hidroxicanrenona se controlaron durante
la reacción mediante muestreo del caldo a intervalos de 4, 7, 23,
31, 47, 55, 71, 80 y 96 horas después del comienzo del ciclo de
fermentación y analizando la muestra mediante TLC. El progreso de
la reacción, determinado a partir de estas muestras, se ofrece en la
Tabla 6.
Se preparó un cultivo primario en matraz seminal
del modo descrito en el Ejemplo 1. Se preparó una mezcla nutriente
que tiene la composición indicada en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujo una carga inicial de esta mezcla
nutriente (4 litros) en un fermentador de transformación de 10
litros de volumen geométrico. El fermentador era de configuración
cilíndrica con una relación de altura a diámetro de 2,58. Estaba
provisto de un agitador de turbina a 400 rpm que tiene dos ruedas de
disco del No. 2 con 6 paletas cada una de ellas. El diámetro
exterior de los impulsores era de 80 mm, teniendo cada una de las
paletas 25 mm de dimensión radial y 30 mm de altura, estando situada
la rueda superior a 280 mm por debajo de la parte superior del
recipiente, estando situada la rueda inferior a 365 mm por debajo de
la parte superior y siendo los deflectores del recipiente de 210 mm
de altura y extendiéndose radialmente hacia el interior en 25 mm
desde la pared vertical interior del
recipiente.
recipiente.
Se mezcló cultivo seminal (40 ml) con la carga
de nutrientes en el fermentador y se estableció un cultivo de
transformación por incubación durante 22 horas a 28ºC, con una
velocidad de aireación de 0,5 l/l-min. y a una
presión de 0,5 kg/cm^{2}. A las 22 horas, el valor PMV del cultivo
fue de 20-25% y el pH de 5 a 5,2.
Se preparó una suspensión que comprende
canrenona (80 g) en agua estéril (400 ml) y se añadió una porción
de 10 ml a la mezcla del fermentador de transformación. Al mismo
tiempo, se añadieron una solución de glucosa estéril al 40% (p/v),
una solución estéril de levadura autolisada al 16% (p/v) y una
solución estéril de antibiótico en las proporciones indicadas en la
Tabla 8 en el tiempo de reacción de 0 horas. La solución de
antibiótico se preparó del modo descrito en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
A medida que avanzaba la reacción, la mezcla de
reacción se analizó periódicamente para determinar el contenido en
glucosa y luego por cromatografía de capa delgada para determinar la
conversión a 11\alpha-hidroxicanrenona. Basado en
el análisis TLC de muestras del caldo de reacción como a
continuación se describe, se añadió más canrenona a la mezcla de
reacción a medida que se consumía el sustrato de canrenona. Los
niveles de glucosa fueron también controlados y, siempre que la
concentración de glucosa descendiera a 0,05% en peso o menos
aproximadamente, se añadió suplemento de solución de glucosa para
llevar la concentración hasta 0,25% en peso aproximadamente.
También se añadieron nutrientes y antibióticos en tiempos separados
durante el ciclo de reacción. En la Tabla 8 se muestra el programa
de adición de suspensión de esteroide, solución de glucosa, solución
de levadura autolisada y solución de antibiótico. La reacción de
transformación continuó durante 90 horas a una velocidad de
aireación de 0,5 volúmenes de aire por volumen de líquido por minuto
(vvm) a una presión de carga positiva de 0,3 kg/cm^{2}. La
temperatura se mantuvo en 28ºC hasta que el valor PVM excedió de
45%, tras lo cual se disminuyó a 26ºC y se mantuvo a esa temperatura
a medida que el valor PVM crecía desde 45% a 60%, y a continuación
se controló en 24ºC. La velocidad de agitación inicial fue de 400
rpm, aumentando a 700 rpm después de 40 horas. El pH se mantuvo
entre 4,7 y 5,3 por adiciones de ácido
orto-fosfórico 2 M o NaOH 2 M, según resulte más
indicado. El espumado se controló añadiendo unas pocas gotas de
Antifoam SAG 471 a medida que se desarrollaba la espuma. La
desaparición de canrenona y la aparición de
11\alpha-hidroxicanrenona se controlaron a
intervalos de 4 horas durante la reacción por análisis TLC de
muestras de caldo. Una vez desaparecida la mayor parte de la
canrenona del caldo, se añadieron otros incrementos.
Una vez realizadas todas las adiciones de
canrenona, la reacción se terminó cuando el análisis TLC reveló que
la concentración de sustrato de canrenona con respecto a
11\alpha-hidroxicanrenona producto había
descendido a 5% aproximadamente.
Al término del ciclo de reacción, el caldo de
fermentación se filtró a través de gasa para separar el micelio del
caldo líquido. La fracción de micelio se resuspendió en acetato de
etilo usando alrededor de 65 volúmenes (5,2 litros) por gramo de
canrenona cargado en el transcurso de la reacción. La suspensión se
micelio en acetato de etilo se sometió a reflujo durante una hora
bajo agitación, se enfrió a 20ºC aproximadamente y se filtró en un
Buchner. La torta de micelio se lavó secuencialmente con acetato de
etilo (5 volúmenes por gramo de carga de canrenona; 0,4 litros) y
agua desionizada (500 ml) para desplazar de la torta el extracto de
acetato de etilo. La torta de filtración se desechó. El extracto
rico, el lavado con disolvente y el lavado con agua se recogieron
en un separador y luego se dejaron reposar durante 2 horas para la
separación de las fases.
La fase acuosa se desechó y la fase orgánica se
concentró bajo vacío a un volumen residual de 350 ml. Las colas de
destilación se enfriaron a 15ºC y se mantuvieron bajo agitación
durante alrededor de una hora. La suspensión resultante se filtró
para separar el producto cristalino y la torta de filtración se lavó
con acetato de etilo (40 ml). Después del secado, se determinó que
el rendimiento en 11\alpha-hidroxicanrenona era de
60 g.
Se preparó una suspensión de esporas a partir de
un cultivo en tubo inclinado usual del modo descrito en el Ejemplo
1. En un matraz de fondo redondo provisto de deflectores y de 2.000
ml (3 deflectores, cada uno de ellos de 50 mm x 30 mm), se
introdujo una parte alícuota (0,5 ml) de la suspensión de esporas en
una solución nutriente (500 ml) que tiene la composición indicada
en la Tabla 4. La mezcla resultante se incubó en el matraz durante
24 horas a 25ºC en un sacudidor de movimiento alternativo (120
carreras por minuto; desplazamiento 5 cm), para producir así un
cultivo que, tras el examen microscópico, se observó que aparecía
como un cultivo puro con hifas bien torsionadas. El pH del cultivo
estaba entre 5,3 y 5,5 aproximadamente y el valor PMV (determinado
por centrifugado a 3.000 rpm durante 5 min.) fue de 8 a 10%.
Usando el cultivo así preparado, se preparó un
cultivo seminal en un fermentador de acero inoxidable de
configuración cilíndrica vertical, que tiene un volumen geométrico
de 160 litros y una relación de aspecto de 2,31 (altura = 985 mm;
diámetro = 425 mm). El fermentador se proporcionó con un agitador
del tipo de turbina de disco que tiene dos ruedas, teniendo cada
rueda seis paletas con un diámetro exterior de 240 mm, teniendo cada
paleta una dimensión radial de 80 mm y una altura de 50 mm. La
rueda superior se situó a una profundidad de 780 mm desde la parte
superior del fermentador y la segunda a una profundidad de 995 mm.
Los deflectores verticales que tienen una altura de 890 mm se
extendían radialmente hacia el interior a 40 mm desde la pared
vertical interior del fermentador. El agitador se accionó a 170
rpm. En el fermentador se introdujo una mezcla nutriente (100
litros) que tiene la composición indicada en la Tabla 9, seguido por
una porción del preinóculo (1 litro) preparado como se ha descrito
anteriormente y que tiene un pH de 5,7.
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La mezcla inoculada se incubó durante 22 horas a
una velocidad de aireación de 0, 5 l/min. a una presión de carga de
0,5 kg/cm^{2}. La temperatura se controló a 28ºC hasta que el
valor PMV alcanzó 25% y luego se disminuyó a 25ºC. El pH se
controló en la gama de 5,1 a 5,3. El crecimiento del volumen de
micelio se muestra en la Tabla 10 junto con el pH y los perfiles de
oxígeno disuelto de la reacción de cultivo seminal.
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Usando el cultivo seminal así producido, se
llevó a cabo un experimento de fermentación de transformación en un
fermentador de acero inoxidable cilíndrico vertical que tiene un
diámetro de 1,02 m, una altura de 1,5 m y un volumen geométrico de
1,4 m^{3}. El fermentador estaba provisto de un agitador de
turbina que tiene dos impulsores, uno de ellos situado a 867 cm por
debajo de la parte superior del reactor y el otro situado a 1.435
cm de la parte superior. Cada rueda estaba provista de seis paletas,
cada una de ellas de 95 cm de dimensión radial y 75 cm de altura.
Los deflectores verticales de 1.440 cm de altura se extendían
radialmente hacia el interior a 100 cm de la pared vertical
interior del reactor. Se preparó una mezcla nutriente que tiene la
composición indicada en la Tabla 11.
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En el fermentador se introdujo una carga inicial
(700 litros) de esta mezcla nutriente (pH = 5,7) seguido por el
inóculo seminal de este ejemplo (7 litros) preparado como se ha
descrito anteriormente.
La mezcla nutriente que contiene inóculo se
incubó durante 24 horas a una velocidad de aireación de 0,5 l/min.
a una presión de carga de 0,5 kg/cm^{2}. La temperatura se
controló en 28ºC y la velocidad de agitación fue de 110 rpm. El
crecimiento del volumen de micelio se muestra en la Tabla 12 junto
con el pH y los perfiles de oxígeno disuelto de la reacción de
cultivo seminal.
Al término de la incubación, se observó la
pelletización del micelio, pero los pellets eran en general pequeños
y estaban empacados de un modo relativamente suelto. El micelio
difuso se suspendió en el caldo. El pH final fue de 5,1 a 5,3.
Al cultivo de transformación así obtenido se
añadió una suspensión de canrenona (1,250 kg; micronizada a 5
\mu) en agua estéril (5 litros). Se añadieron una solución estéril
de aditivos y una solución de antibiótico en las proporciones
indicadas, en el tiempo de reacción 0, en la Tabla 14. La
composición de la solución de aditivos se indica en la Tabla
13.
La bioconversión se llevó a cabo durante
alrededor de 96 horas con aireación a una velocidad de 0,5 l/min. y
a una presión de carga de 0,5 kg/cm^{2} y a un pH entre 4,7 y 5,3,
ajustado, según sea necesario, por adiciones de 7,5 M NaOH o 4 M
H_{3}PO_{4}. La velocidad de agitación fue inicialmente de 100
rpm y se aumentó a 165 rpm a las 40 horas y a 250 rpm a las 64
horas. La temperatura inicial fue de 28ºC, se disminuyó a 26ºC
cuando el valor PMV alcanzó 45% y se disminuyó a 24ºC cuando el
valor PMV subió a 60%. Se añadió SAG 471 en gotas finas, según
fuese necesario, para controlar el espumado. Los niveles de glucosa
en la fermentación se controlaron a intervalos de 4 horas y,
siempre que la concentración de glucosa descendiera por debajo de 1
gpl, se añadió al lote un incremento de solución aditiva estéril (10
litros). La desaparición de canrenona y la aparición de
11\alpha-hidroxicanrenona se controlaron también
durante la reacción mediante HPLC. Cuando al menos el 90% de la
carga inicial de canrenona se había convertido a
11\alpha-hidroxicanrenona, se añadió un
incremento de 1,250 kg de canrenona. Cuando se comprobó que el 90%
de la canrenona de dicho incremento se había convertido, se
introdujo otro incremento de 1,250 kg. Usando los mismos criterios,
se añadieron otros incrementos (cada uno de 1,250 kg) hasta que se
introdujo la carga total del reactor (20 kg). Una vez suministrada
al reactor toda la carga de canrenona, se terminó la reacción cuando
la concentración de canrenona sin reaccionar fue de 5% con respecto
a la cantidad de 11\alpha-hidroxicanrenona
producida. El programa de adición de canrenona, solución aditiva
estéril y solución de antibiótico se muestra en la Tabla 14.
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Terminada la bioconversión, los micelios fueron
separados del caldo por centrifugado en una centrífuga de cesta.
Por HPLC se determinó que el filtrado solo contenía 2% de la
cantidad total de 11\alpha-hidroxicanrenona en el
caldo recogido y, por tanto, se eliminó. Los micelios se
suspendieron en acetato de etilo (1.000 litros) en un tanque de
extracción de 2 m^{3} de capacidad. Esta suspensión se calentó
durante una hora bajo agitación y en condiciones de reflujo con
acetato de etilo y luego se enfrió y se centrífugo en una centrífuga
en cesta. La torta micelial se lavó con acetato de etilo (200
litros) y luego se descargó. El extracto disolvente rico en
esteroides se dejó reposar durante una hora para la separación de la
fase acuosa. La fase acuosa fue extraída con una cantidad adicional
de acetato de etilo disolvente (200 litros) y luego se desechó. Las
fases de disolvente combinadas fueron clarificadas por centrifugado
y se colocaron en un concentrador (volumen geométrico, 500 litros)
y se concentraron bajo vacío a un volumen residual de 100 litros.
Para realizar la evaporación, la carga inicial al concentrador de
extracto y soluciones de lavado en combinación fue de 100 litros y
este volumen se mantuvo constante por adiciones continuas o
periódicas de solución combinada a medida que se separaba el
disolvente. Terminada la etapa de evaporación, el producto de cola
de la destilación se enfrió a 20ºC y se agitó durante 2 horas, tras
lo cual se filtró en un embudo Buchner. El calderín del concentrador
se lavó con acetato de etilo (20 litros) y esta solución de lavado
se utilizó entonces para lavar la torta en el filtro. El producto
se secó bajo vacío durante 16 horas a 50ºC. El rendimiento en
11\alpha-hidroxicanrenona fue de
14 kg.
14 kg.
\newpage
Se suspendieron esporas liofilizadas de
Aspergillus ochraceus NRRL 405 en un medio de crecimiento a
base de licor de maceración de maíz (2 ml) que tiene la composición
indicada en la Tabla 15.
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La suspensión resultante se utilizó en un
inóculo para la propagación de esporas sobre placas de agar. Se
prepararon 10 placas de agar cada una de ellas portando un medio de
crecimiento sólido de glucosa/extracto de levadura/fosfato/agar que
tiene la composición indicada en la Tabla 16.
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Una parte alícuota de 0,2 ml de la suspensión
fue transferida sobre la superficie de cada placa. Las placas se
incubaron a 25ºC durante 10 días, tras lo cual se recogieron las
esporas de todas las placas en un medio protector criogénico
estéril que tiene la composición indicada en la Tabla 17.
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La suspensión resultante se dividió entre 20
viales, transfiriéndose 1 ml a cada vial. Estos viales constituyen
un banco de células cebadas que se puede utilizar para producir
bancos de células de trabajo de utilidad en la generación del
inóculo para la bioconversión de canrenona a
11\alpha-hidroxicanrenona. Los viales que
comprenden el banco de células cebadas se almacenaron en fase vapor
en un congelador de nitrógeno líquido a -130ºC.
Para iniciar la preparación de un banco de
células de trabajo, las esporas de un solo vial de un banco de
células cebadas se resuspendieron en un medio de crecimiento estéril
(1 ml) que tiene la composición indicada en la Tabla 15. Esta
suspensión se dividió en 10 partes alícuotas de 0,2 ml y cada parte
alícuota se utilizó para inocular una placa de agar que lleva un
medio de crecimiento sólido con la composición indicada en la Tabla
16. Estas placas fueron incubadas durante 10 días a 25ºC. En el
tercer día de incubación, el lado inferior del medio de crecimiento
tenía un color naranja amarronado. Al término de la incubación se
comprobó una producción fuerte de esporas de color dorado. Las
esporas de cada placa se recogieron por el procedimiento descrito
anteriormente para la preparación del banco de células cebadas. Se
preparó un total de 100 viales, cada uno de ellos conteniendo 1 ml
de suspensión. Estos viales constituyeron el banco de células de
trabajo. Los viales del banco de células de trabajo se conservaron
también por almacenamiento en fase vapor en un congelador de
nitrógeno líquido a -130ºC.
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml se cargó un
medio de crecimiento (50 ml) que tiene la composición indicada en
la Tabla 15. Se introdujo una parte alícuota (0,5 ml) de suspensión
de células de trabajo en el matraz y se mezcló con el medio de
crecimiento. La mezcla inoculada se incubó durante 24 horas a 25ºC
para producir un cultivo seminal primario que tiene un porcentaje
de volumen micelial empacado de alrededor de 45%. Tras la
inspección visual, se comprobó que el cultivo comprendía micelios de
tipo pellets de 1 a 2 mm de diámetro y, tras la observación
microscópica, aparecía como un cultivo puro.
Se inició la cultivación de un cultivo seminal
secundario introduciendo un medio de crecimiento que tiene la
composición indicada en la Tabla 15 en un matraz Fernbach de 2,8
litros e inoculando el medio con una porción (10 ml) del cultivo
seminal primario de este ejemplo, cuya preparación ha sido descrita
anteriormente. La mezcla inoculada se incubó a 25ºC durante 24
horas en un sacudidor rotativo (200 rpm, 5 cm de desplazamiento).
Al término de la incubación, el cultivo exhibía las mismas
propiedades descritas anteriormente para el cultivo seminal
primario y resultó ser adecuado para utilizarse en una fermentación
de transformación en donde la canrenona se bioconvirtió a
11\alpha-hidroxicanrenona.
La transformación se llevó a cabo en un
fermentador Braun E Biostat configurado como sigue:
- Capacidad:
- 15 litros con fondo redondo
- Altura:
- 53 cm
- Diámetro:
- 20 cm
- H/D:
- 2,65
- Impulsores:
- 7,46 diámetro, seis paletas 2,2 x 1,4 cm cada una
- Separación de los impulsores:
- 65,5, 14,5 y 25,5 cm desde el fondo del tanque
- Deflectores:
- cuatro 1,9 x 48 cm
- Pulverizador:
- 10,1 cm diámetro, 21 orificios \sim1 mm diámetro
- Control de temperatura:
- proporcionado por medio de una camisa externa en el recipiente.
Se suspendió canrenona en una concentración de
20 g/l en agua desionizada (4 litros) y se añadió una porción (2
litros) de medio de crecimiento que tiene la composición indicada en
la Tabla 18 al tiempo que la mezcla del fermentador fue agitada a
300 rpm.
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La suspensión resultante se agitó durante 15
minutos, tras lo cual el volumen se llevó a 7,5 litros con más agua
desionizada. En este momento, el pH de la suspensión se ajustó de
5,2 a 6,5 por adición de una solución al 20% en peso de NaOH y la
suspensión se esterilizó entonces por calentamiento a 121ºC durante
30 minutos en el fermentador Braun E. El pH después de la
esterilización fue de 6,3 \pm 0,2 y el volumen final fue de 7
litros. La suspensión esterilizada fue inoculada con una porción
(0,5 litros) del cultivo seminal secundario de este ejemplo que
había sido preparado como antes se ha descrito, y el volumen se
llevó a 8 litros por adición de una solución estéril de glucosa al
50%. La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de 28ºC hasta
que el valor PMV alcanzó 50%, se bajó entonces a 26ºC y luego se
bajó adicionalmente a 24ºC cuando el valor PMV excedió del 50% con
el fin de mantener un valor PMV consistente por debajo de 60%
aproximadamente. Se introdujo aire a través del pulverizador a una
velocidad de 0,5 vvm basado en el volumen de líquido inicial y la
presión en el fermentador se mantuvo en 700 milibares manométricos.
La agitación se inició a 600 rpm y se aumentó gradualmente a 1.000
rpm según fuese necesario para mantener el contenido en oxígeno
disuelto por encima del 30% en volumen. Se controló la
concentración de glucosa. Una vez que la elevada concentración
inicial de glucosa descendió por debajo del 1% debido al consumo por
la reacción de fermentación, se proporcionó más glucosa por medio
de una solución estéril de glucosa al 50% en peso para mantener la
concentración en la gama de 0,05 a 1% durante todo el resto del
ciclo discontinuo. Antes de la inoculación, el pH era de 6,3 \pm
0,2. Una vez que el pH descendió a 5,3 aproximadamente durante el
periodo de fermentación inicial, se mantuvo en la gama de 5,5 \pm
0,2 durante el resto del ciclo por adición de hidróxido amónico. La
espuma se controló añadiendo un agente antiespumante de
polietilenglicol vendido con la designación comercial SAG 471 por
OSI Specialties, Inc.
El crecimiento del cultivo tuvo lugar
principalmente durante las primeras 24 horas del ciclo, en cuyo
tiempo el valor PMV fue de 40% aproximadamente, el pH fue de
alrededor de 5,6 y el contenido en oxígeno disuelto fue de
alrededor de 50% en volumen. La conversión de canrenona comenzó de
manera uniforme a medida que crecía el cultivo. Las concentraciones
de canrenona y 11\alpha-hidroxicanrenona se
controlaron durante la bioconversión analizando muestras
diariamente. Las muestras fueron extraídas con acetato de etilo y la
solución de muestras resultantes se analizó por TLC y HPLC. La
bioconversión se consideró terminada cuando la concentración
residual de canrenona fue de alrededor de 10% de la concentración
inicial. El tiempo de conversión aproximado fue de 110 a 130
horas.
Terminada la bioconversión, se separó la biomasa
micelial del caldo por centrifugado. El sobrenadante fue extraído
con un volumen igual de acetato de etilo y se desechó la capa
acuosa. La fracción micelial se resuspendió en acetato de etilo
usando aproximadamente 65 volúmenes por gramo de canrenona cargado
en el reactor de fermentación. La suspensión micelial se sometió a
reflujo durante 1 hora bajo agitación, se enfrió a 20ºC
aproximadamente y se filtró en un embudo Buchner. La torta de
filtración micelial se lavó dos veces con 5 volúmenes de acetato de
etilo por gramo de canrenona cargado en el fermentador y luego se
lavó con agua desionizada (1 litro) para desplazar el acetato de
etilo residual. Se combinaron el extracto acuoso, rico en
disolvente, el lavado con disolvente y el lavado con agua. el resto
de la torta micelial agotada se desechó o se sometió de nuevo a
extracción, dependiendo del análisis de los esteroides residuales
existentes. Las fases líquidas combinadas se dejaron sedimentar
durante 2 horas. A continuación, la fase acuosa se separó y se
desechó y la fase orgánica se concentró bajo vacío hasta que el
volumen residual fue de alrededor de 500 ml. La botella de
fraccionamiento se enfrió entonces a 5ºC aproximadamente con
agitación lenta durante alrededor de 1 hora. El producto cristalino
se recuperó por filtración y se lavó con acetato de etilo frío (100
ml). El disolvente se separó de los cristales por evaporación y el
producto cristalino se secó bajo vacío a 50ºC.
Se suspendieron esporas liofilizadas de
Aspergillus ochraceus ATCC 18500 en un medio de crecimiento
de licor de maceración de maíz (2 ml) como se ha descrito en el
Ejemplo 4. Se prepararon 10 placas de agar, igualmente del modo
descrito en el Ejemplo 4. Las placas se incubaron y se recolectaron
en la forma descrita en el Ejemplo 4 para proporcionar un banco de
células cebadas. Los viales que comprenden el banco de células
cebadas se guardaron en la fase vapor de un congelador de nitrógeno
líquido a -130ºC.
A partir de un vial del banco de células
cebadas, se preparó un banco de células de trabajo en la forma
descrita en el Ejemplo 4 y se guardó en el congelador de nitrógeno
a -130ºC.
En un matraz de 2 litros provisto de deflectores
se cargó el medio de crecimiento (300 ml) que tiene la composición
indicada en la Tabla 19. En el matraz se introdujo una parte
alícuota (3 ml) de suspensión de células de trabajo. La mezcla
inoculada se incubó durante 20 a 24 horas a una temperatura de 28ºC
en un sacudidor rotativo (200 rpm, desplazamiento 5 cm) para
producir un cultivo seminal primario que tiene un porcentaje en
volumen de micelio empacado de alrededor de 45%. Tras la
inspección visual, se comprobó que el cultivo comprendía micelio de
tipo pellets de 1 a 2 mm de diámetro; y tras la observación
microscópica apareció como un cultivo puro.
El cultivo seminal secundario se inició
introduciendo 8 litros de medio de crecimiento que tiene la
composición indicada en la Tabla 19 en un fermentador de cristal de
14 litros. Se inoculó el fermentador con 160 a 200 ml del cultivo
seminal primario de este ejemplo, cuya preparación ha sido descrita
anteriormente.
La mezcla inoculada se cultivó a 28ºC durante
18-20 horas, agitación 200 rpm, velocidad de
aireación 0,5 vvm. Al término de la propagación, el cultivo exhibió
las mismas propiedades descritas anteriormente para el cultivo
seminal primario.
La transformación se realizó en un fermentador
de 60 litros, prácticamente del modo descrito en el Ejemplo 4,
excepto que el medio de crecimiento tenía la composición indicada en
la Tabla 20 y la carga inicial de cultivo seminal secundario fue de
350 a 700 ml. La velocidad de agitación fue inicialmente de 200 rpm,
pero se aumentó a 500 rpm, según fuese necesario, para mantener el
oxígeno disuelto por encima de 10% en volumen. El tiempo de
bioconversión aproximado para 20 g/l de canrenona fue de 80 a 160
horas.
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Usando una suspensión de esporas del banco de
células de trabajo producido según el método descrito en el Ejemplo
4, se prepararon cultivos seminales primarios y secundarios,
prácticamente del modo descrito en el Ejemplo 4. Usando el cultivo
seminal secundario producido de esta manera, se realizaron dos
experimentos de bioconversión de acuerdo con un proceso modificado
del tipo ilustrado en la Figura 1 y se realizaron dos experimentos
de acuerdo con el proceso ilustrado en la Figura 2. El medio de
crecimiento de transformación, los programas de adición de
canrenona, los tiempos de recogida y los grados de conversión para
estos experimentos se ofrecen en la Tabla 21. El experimento R2A
utilizó un programa de adición de canrenona basado en el mismo
principio que en el Ejemplo 3, mientras que el experimento R2C
modificó el esquema del Ejemplo 3 al realizar solo dos adiciones de
canrenona, una de ellas al comienzo del experimento y la otra
después de 24 horas. En los experimentos R2B y R2D, se introdujo
toda la carga de canrenona al comienzo de los mismos y el proceso se
realizó en general del modo descrito en el Ejemplo 4, excepto que
la carga de canrenona se esterilizó en un recipiente separado antes
de introducirse en el fermentador y se añadió glucosa a medida que
avanzaban los experimentos. Se utilizó un mezclador Waring para
reducir los trozos pequeños producidos tras la esterilización. En
los experimentos R2A y R2B, la canrenona se introdujo como una
solución en metanol, en cuyo aspecto estos experimentos se
diferenciaban adicionalmente de los experimentos de los Ejemplos 3
y 4, respectivamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En los experimentos R2A y R2B, la concentración
de metanol se acumuló a 6% aproximadamente en el caldo de
fermentación, lo cual se comprobó que inhibía el crecimiento del
cultivo y la bioconversión. Sin embargo, en base a los resultados
de estos experimentos, se llegó a la conclusión de que el metanol y
otro disolvente miscible en agua podrían servir eficazmente a
concentraciones más bajas para aumentar la carga de canrenona y
proporcionar canrenona como un precipitado en partículas finas que
proporciona un área interfacial grande para el suministro de
canrenona para someterla a la reacción.
La canrenona resultó ser estable a la
temperatura de esterilización (121ºC) pero se agrego en forma de
trozos pequeños. Se utilizó un mezclador Waring para triturar los
trozos a partículas finas, las cuales se convirtieron entonces con
éxito al producto deseado.
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Usando una suspensión de esporas del banco de
células de trabajo producido según el método descrito en el Ejemplo
4, se prepararon cultivos seminales primarios y secundarios,
prácticamente de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 4. La
descripción y resultados del Ejemplo 7 se ofrecen en la Tabla 22.
Usando el cultivo seminal secundario así producido, se realizó una
bioconversión (R3C) sustancialmente como se ha descrito en el
Ejemplo 3 y se realizaron tres bioconversiones de acuerdo con el
proceso en general en el Ejemplo 5. En los tres últimos
experimentos (R3A, R3B y R3D), la canrenona se esterilizó en un
tanque portátil, junto con el medio de crecimiento excepto la
glucosa. La glucosa se alimentó asépticamente desde otro tanque. La
suspensión esterilizada de canrenona se introdujo en el fermentador
bien antes de la inoculación o bien durante la primera fase de la
bioconversión. En el experimento R3B, se introdujo, a las 46,5
horas, un suplemento de canrenona estéril y de medio de
crecimiento. Los trozos pequeños de canrenona formados tras la
esterilización fueron triturados por medio de un mezclador Waring,
para producir así una suspensión de partículas finas que se
introdujo en el fermentador. El medio de crecimiento de
transformación, los programas de adición de canrenona, los programas
de adición de nutrientes, los tiempos de recogida y los grados de
conversión para estos experimentos se ofrecen en las Tablas 22 y
23.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Debido a crecimiento filamentoso, se observó un
caldo altamente viscoso en el fermentador en los cuatro experimentos
de este ejemplo. Para solucionar los obstáculos creados por la alta
viscosidad con respecto a la aireación, operación de mezcla,
control del pH y control de la temperatura, durante estos
experimentos se aumentaron la velocidad de aireación y la velocidad
de agitación. Las conversiones procedieron de manera satisfactoria
bajo las condiciones más severas, pero se formó una torta densa por
encima de la superficie del caldo líquido. Algo de canrenona sin
reaccionar salió fuera del caldo junto con dicha torta.
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La descripción y resultados del Ejemplo 8 se
resumen en la Tabla 24. Se realizaron cuatro experimentos de
fermentación en donde se produjo
11\alpha-hidroxicanrenona por bioconversión de
canrenona. En dos de estos experimentos (R4A y R4D), la
bioconversión se realizó prácticamente del mismo modo que en los
experimentos R3A y R3D del Ejemplo 6. En el experimento R4C, la
canrenona se convirtió a 11\alpha-hidroxicanrenona
generalmente del modo descrito en el Ejemplo 3. En el experimento
R4B, el proceso se realizó en general en la forma descrita en el
Ejemplo 4, es decir, con esterilización de canrenona y medio de
crecimiento en el fermentador justo antes de la inoculación; todos
los nutrientes de nitrógeno y fósforo se introdujeron al comienzo
del experimento; y una solución suplementaria que contiene glucosa
se alimentó solo en el fermentador para mantener el nivel de
glucosa a medida que avanzaba el experimento. En este último proceso
(experimento R4B), la concentración de glucosa se controló cada 6
horas y se añadió solución de glucosa, según fuese necesario, para
controlar los niveles de glucosa en la gama de 0,5 a 1%. Los
programas de adición de canrenona para estos experimentos se indican
en la Tabla 25.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Todos los fermentadores operaron bajo agitación
y aireación durante la mayor parte del ciclo de fermentación debido
a que el caldo de fermentación había llegado a ser altamente viscoso
en el espacio de un día o así después de la inoculación.
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El medio de crecimiento de transformación, los
programas de adición de canrenona, los tiempos de recogida y los
grados de conversión para los experimentos de este ejemplo se
ofrecen en la Tabla 26.
Se realizaron cuatro experimentos de
bioconversión prácticamente del modo descrito para el experimento
R4B del Ejemplo 8, a excepción de lo que se describe a
continuación. En el experimento R5B, el impulsor de disco de
turbina superior usado para la agitación en los otros experimentos
fue sustituido por un impulsor marino de bombeo descendente. La
acción de bombeo descendente hizo que el caldo se dirigiera
axialmente hacia el centro del fermentador y redujo la formación de
torta. Se añadió metanol (200 ml) inmediatamente después de la
inoculación en el experimento R5D. Dado que la canrenona se
esterilizó en el fermentador, todos los nutrientes, a excepción de
la glucosa, se añadieron al comienzo del experimento, evitando así
la necesidad de alimentar en cadena las fuentes de nitrógeno, las
fuentes de fósforo o los antibióticos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Con el fin de mantener la inmersión de la fase
sólida que crece por encima de la superficie del líquido, se añadió
medio de crecimiento (2 litros) a cada fermentador 96 horas después
del inicio del experimento. Los problemas de mezcla no se
resolvieron en su totalidad por la adición de medio de crecimiento o
por el uso de un impulsor de bombeo descendente (experimento R5B)
pero los resultados de los experimentos demostraron la posibilidad
de realización y las ventajas del proceso e indicaron que podía
conseguirse un mezclado satisfactorio según las prácticas
convencionales.
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Se realizaron tres experimentos de bioconversión
prácticamente del modo descrito en el Ejemplo 9. El medio de
crecimiento de transformación, los programas de adición de
canrenona, los tiempos de recogida y los grados de conversión para
los experimentos de este ejemplo se ofrecen en la Tabla 27.
Se añadieron medio de crecimiento (1,3 litros) y
agua estéril (0,8 litros) después de 71 horas en el experimento R6A
para sumergir la torta micelial que se había desarrollado por encima
de la superficie del caldo líquido. Para el mismo fin, se añadieron
medio de crecimiento (0,5 litros) y agua estéril (0,5 litros)
después de 95 horas en el experimento R6B. Los datos del balance de
materiales demuestran que podía determinarse un mejor balance de
materiales cuando se redujo al mínimo la acumulación de torta por
encima de la superficie del líquido.
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Se realizaron experimentos de fermentación para
comparar la pre-esterilización de canrenona con la
esterilización de canrenona y medio de crecimiento en el
fermentador de transformación. En el experimento R7A, el proceso se
realizó en la forma ilustrada en la Figura 2, bajo condiciones
comparables a las de los experimentos R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A
y R4D. El experimento R7B fue como el ilustrado en la Figura 3 bajo
condiciones comparables a las de los Ejemplos 4, 9 y 10 y
experimento R4B. El medio de crecimiento de transformación, los
programas de adición de canrenona, los tiempos de recogida y los
grados de conversión para los experimentos de este ejemplo se
ofrecen en la Tabla 28.
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El balance de materiales en base a la muestra
final tomada del experimento R7B fue de 89,5%, indicando ello que
no se produjo una pérdida importante de sustrato ni degradación en
la bioconversión. En ambos experimentos se consideró adecuada la
operación de mezcla.
La concentración residual de glucosa se
encontraba por encima de la gama de control deseada de
5-10 g por litro durante las 80 horas iniciales. La
realización de los experimentos no resultó aparentemente afectada
por una ligera torta que se acumuló en el espacio de cabeza de ambos
fermentadores.
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Se determinó la eficacia de extracción en una
serie de experimentos de extracción de 1 litro como se resume en la
Tabla 29. En cada uno de estos experimentos, los esteroides fueron
extraídos del micelio usando acetato de etilo (1 l/l volumen de
fermentación). Se realizaron dos extracciones en secuencia en cada
experimento. En base a RP-HPLC, en la primera
extracción se recuperó alrededor de 80% del esteroide total; y la
recuperación aumentó a 95% a través de la segunda extracción. Una
tercera extracción recuperaría otro 3% de esteroide. El 2% restante
se pierde en la fase acuosa sobrenadante. El extracto se llevó a
sequedad usando vacío pero no se lavó con ningún disolvente
adicional. El lavado con disolvente mejoraría la recuperación de la
extracción inicial si lo justificara la economía del
proceso.
proceso.
Se evaluaron metilisobutilcetona (MIBK) y
tolueno como disolventes de extracción/cristalización para
11\alpha-hidroxicanrenona en una escala de caldo
de 1 litro. Usando el protocolo de extracción descrito
anteriormente, ambos disolventes MIBK y tolueno fueron comparables
al acetato de etilo tanto en la eficacia de extracción como en el
comportamiento en la cristalización.
Como parte de la evaluación de los procesos de
las Figuras 2 y 3, se llevaron a cabo estudios del tamaño de
partícula sobre el sustrato de canrenona proporcionado al comienzo
del ciclo de fermentación en cada uno de estos procesos. Como se ha
descrito anteriormente, la canrenona alimentada al proceso de la
Figura 1 fue micronizada antes de introducirse en el fermentador.
En este proceso, la canrenona no es esterilizada, controlándose el
crecimiento de microorganismos indeseados por adición de
antibióticos. Los procesos de las Figuras 2 y 3 esterilizan la
canrenona antes de la reacción. En el proceso de la Figura 2, esto
se efectúa en un mezclador antes de introducir la canrenona en el
fermentador. En el proceso de la Figura 3, una suspensión de
canrenona en medio de crecimiento se esteriliza en el fermentador
al comienzo del experimento. Como se ha indicado anteriormente, la
esterilización tiende a causar la aglomeración de las partículas de
canrenona. Debido a la solubilidad limitada de la canrenona en el
medio de crecimiento acuoso, la productividad del proceso depende de
la transferencia de masa desde la fase sólida y, de este modo, cabe
esperar que dependa del área interfacial presentada por el sustrato
sólido en partículas la cual a su vez depende de la distribución del
tamaño de partículas. Estas consideraciones sirvieron inicialmente
como hechos retardadores de los procesos de las Figuras 2 y 3.
Sin embargo, se comprobó que la agitación en el
mezclador de la Figura 2 y en el tanque de fermentación de la
Figura 3, junto con la acción de la bomba de esfuerzo cortante usada
para transferir la masa en la Figura 2, se traducía en la
degradación de los aglomerados a una gama de tamaños de partícula
que se aproxima razonablemente a la de la canrenona sin esterilizar
y micronizada alimentada al proceso de la Figura 1. Esto se ilustra
por las distribuciones de tamaños de partícula para la canrenona
tal como son disponibles al comienzo del ciclo de reacción en cada
uno de los tres procesos. Véase Tabla 30 y Figuras 4 y 5.
A partir de los datos de la Tabla 30, se
observará que los agitadores y la bomba de esfuerzo cortante
resultaron ser eficaces para reducir el tamaño medio de partícula
de la canrenona esterilizada a un valor del mismo orden de magnitud
que el del sustrato no esterilizado, pero siguió existiendo una
diferencia de tamaño importante en favor del sustrato no
esterilizado. A pesar de esta diferencia, los datos de rendimiento
de la reacción demostraron que los procesos de
pre-esterilización fueron al menos tan productivos
como el proceso de la Figura 1. Pueden conseguirse otras ventajas
en el proceso de la Figura 2 a través de ciertas etapas para reducir
aún más y controlar el tamaño de partícula, por ejemplo, molienda
en húmedo de la canrenona esterilizada, y/o mediante pasteurización
en lugar de esterilización.
Se preparó un cultivo seminal del mismo modo que
en el Ejemplo 5. A las 20 horas, el micelio en el fermentador de
inóculo era de naturaleza pulposa con un 40% de PMV. Su pH fue de
5,4 y permanecieron sin utilizar 14,8 g/l de glucosa.
Se preparó un medio de crecimiento de
transformación (35 litros) que tiene la composición mostrada en la
Tabla 20. En la preparación del medio de alimentación, la glucosa y
el extracto de levadura se esterilizaron por separado y se
mezclaron como una sola alimentación a una concentración inicial de
30% en peso de glucosa y 10% en peso de extracto de levadura. El pH
de la alimentación se ajustó a 5,7.
Usando este medio (Tabla 20) se realizaron dos
experimentos de bioconversión para la conversión de canrenona a
11\alpha-hidroxicanrenona. Cada uno de los
experimentos se realizó en un fermentador de 60 litros provisto de
un agitador que comprende un impulsor de turbina Rushton y dos
impulsores Lightnin' A315 impellers.
La carga inicial del medio de crecimiento al
fermentador fue de 35 litros. La canrenona micronizada y no
esterilizada se añadió a una concentración inicial de 0,5%. El
medio en el fermentador se inoculó con un cultivo seminal preparado
del modo descrito en el Ejemplo 5 en una relación de inoculación
inicial de 2,5%. La fermentación se realizó a una temperatura de
18ºC, una velocidad de agitación de 200 a 500 rpm, una velocidad de
aireación de 0,5 vvm y una retro-presión suficiente
para mantener un nivel de oxígeno disuelto de al menos 20% en
volumen. El cultivo de transformación desarrollado durante el
experimento de producción se encontraba en forma de pellets
ovalados muy pequeños (alrededor de 1-2 mm). Se
alimentaron en cadena canrenona y nutrientes suplementarios al
fermentador, generalmente del modo descrito en el Ejemplo 1. Las
adiciones de nutrientes se efectuaron cada 4 horas en una relación
de 3,4 g de glucosa y 0,6 g de extracto de levadura por litro de
caldo en el fermentador.
En la Tabla 31 se indican la velocidad de
aireación, la velocidad de agitación, el nivel de oxígeno disuelto,
el valor PMV y el pH prevaleciente en intervalos establecidos
durante cada uno de los experimentos de este ejemplo, así como las
adiciones de glucosa efectuadas durante el experimento. La Tabla 32
muestra el perfil de conversión de canrenona. El experimento R11A
se terminó después de 48 horas; el experimento R11B continuó
durante 96 horas. En este último experimento, se alcanzó una
conversión del 93% a las 81 horas; se realizó otra adición de
alimentación a las 84 horas; y la alimentación se terminó entonces.
Debe apreciarse que se presentó un cambio importante de viscosidad
entre el momento en el cual se detuvo la alimentación y el final del
experimento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se ensayaron varios cultivos respecto a la
eficacia en la bioconversión de canrenona a
11\alpha-hidroxicanrenona de acuerdo con los
métodos descritos en general anteriormente.
Del modo descrito en el Ejemplo 5 se preparó un
banco de células de trabajo de cada uno de Aspergillus Níger
ATCC 11394, Rhizopus arrhizus ATCC 11145 y Rhizopus
stolonifer ATCC 6227b. Se inoculó medio de crecimiento (50 ml)
que tiene la composición indicada en la Tabla 18 con una suspensión
de esporas (1 ml) del banco de células de trabajo y se colocó en
una incubadora. Se preparó un cultivo seminal en la incubadora por
fermentación a 26ºC durante 20 horas aproximadamente. La incubadora
se agitó a una velocidad de 200 rpm.
Se emplearon partes alícuotas (2 ml) del cultivo
seminal de cada microorganismo para inocular matraces de
transformación que contienen el medio de crecimiento (30 ml) de la
Tabla 18. Cada cultivo se utilizó para la inoculación de dos
matraces, un total de seis. Se disolvió canrenona (200 mg) en
metanol (4 ml) a 36ºC y una parte alícuota de 0,5 ml de esta
solución se introdujo en cada uno de los matraces. La bioconversión
se realizó generalmente en las condiciones descritas en el Ejemplo 5
con adiciones, cada día, de solución al 50% en peso de glucosa (1
ml). Después de las primeras 72 horas, se efectuaron las siguientes
observaciones en cuanto al desarrollo de micelios en los
respectivos matraces de fermentación con transformación:
ATCC 11394 - crecimiento bueno y uniforme
ATCC 11145 - crecimiento bueno en las primeras
48 horas, pero el micelio se aglomeró en forma de una bola; ningún
crecimiento evidente en las últimas 24 horas;
ATCC 6227b - crecimiento bueno; la masa micelial
formó una bola aglomerada.
Se tomaron muestras del caldo para realizar el
análisis respecto al grado de la bioconversión. Después de tres
días, la fermentación usando ATCC 11394 proporcionó una conversión a
11\alpha-hidroxicanrenona de 80 a 90%; ATCC 11145
proporcionó una conversión de 50%; y ATCC 6227b proporcionó una
conversión de 80 a 90%.
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Usando sustancialmente el método descrito en el
Ejemplo 15, se ensayaron otros microorganismos respecto a la
eficacia en la conversión de canrenona a
11\alpha-hidroxicanrenona. Los organismos
ensayados y los resultados de los ensayos se indican en la Tabla
33:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se ensayaron varios microorganismos con respecto
a la eficacia en la conversión de canrenona a
9\alpha-hidroxicanrenona. Se prepararon medios de
fermentación para los experimentos de este ejemplo como se indica en
la Tabla 34:
Los hongos se hicieron crecer en un medio de
harina de soja y en peptona/extracto de levadura/glucosa; los
atinomicetos y las eubacterias se hicieron crecer en harina de soja
(más 0,9% en peso de formato Na para las biotransformaciones) y en
caldo Mueller-Hinton.
Los cultivos iniciales se inocularon con
material de esporas congeladas (20 ml de harina de soja en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml). Los matraces se cubrieron con un filtro de
leche y se bio-protegieron. Se utilizaron los
cultivos iniciales (24 o 48 horas de antigüedad) para inocular
cultivos de metabolismo (también 20 ml en matraz Erlenmeyer de 250
ml) - con un volumen de cruce de 10% a 15% - y estos últimos se
incubaron durante 24-48 horas antes de la adición
del sustrato esteroidal para la reacción de transformación.
Se disolvió/suspendió canrenona en metanol (20
mg/ml), se filtró en condiciones estériles y se añadió a los
cultivos a una concentración final de 0,1 mg/ml. Todos los matraces
de fermentación con transformación se sacudieron a 250 rpm
(desplazamiento 5 cm) en una sala de temperatura controlada a 26ºC y
una humedad del 60%.
Las biotransformaciones se recogieron a las 5 y
48 horas, o bien a las 24 horas después de la adición de sustrato.
La recogida se inició con la adición de acetato de etilo (23 ml) o
cloruro de metileno al matraz de fermentación. Los matraces se
sacudieron entonces durante 2 minutos y el contenido de cada matraz
se vertió en un tubo cónico de 50 ml. Para separar las fases, los
tubos se centrifugaron a 4.000 rpm durante 20 minutos en una unidad
a temperatura ambiente. La capa orgánica de cada tubo fue
transferida a un vial de cristal de borosilicato de 20 ml y se
evaporó en un vac. de velocidad. Los viales se taparon y se
guardaron a -20ºC.
Para obtener material destinado a la
determinación de la estructura, las biotransformaciones se
aumentaron a una escala de 500 ml incrementando a 25 el número de
fermentaciones en matraz sacudido. En el momento de la recogida (24
o 48 horas después de la adición de sustrato), se añadió acetato de
etilo a cada matraz individualmente y los matraces se taparon y se
pusieron de nuevo en el sacudidor durante 20 minutos. Los contenidos
de los matraces se vertieron entonces en frascos de polipropileno y
se centrifugaron para separar las fases, o bien en un embudo
separador en donde se deja que las fases se separen por gravedad. La
fase orgánica se secó para proporcionar un extracto en bruto de
esteroides contenidos en la mezcla de reacción.
El producto de reacción se analizó primero por
cromatografía de capa delgada sobre placas de gel de sílice (250
\mum) con soporte fluorescente (254 nm). Se añadió acetato de
etilo (500 \mul) a cada vial que contiene el extracto seco de
acetato de etilo de la mezcla de reacción. Se realizaron otros
análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento y por
espectrometría de masas. Las placas de TLC fueron desarrolladas en
una mezcla disolvente de cloroformo/metanol 95:5 v/v.
Se realizó otro análisis por cromatografía
líquida de alto rendimiento y por espectrometría de masas. Se
utilizó una HPLC de Waters con software de Millennium, detector de
fotodiodo y auto-muestreador. La HPLC de fase
inversa utilizó un cartucho RadialPak de Waters NovaPak
C-18 (tamaño de partícula 4 \mum) de 4 mm. Se
comenzó el gradiente de disolvente lineal de 25 minutos con la
columna iniciada en agua:acetonitrilo (75:25) y se finalizó con
agua:acetonitrilo (25:75). Se realizó entonces un gradiente de 3
minutos a 100% de acetonitrilo y de 4 minutos de lavado isocrático
antes de la regeneración de la columna en las condiciones
generales.
Para LC/MS, se añadió acetato amónico a ambas
fases de acetonitrilo y de agua a una concentración de 2 nM. La
cromatografía no resultó afectada de manera importante. El eluyente
de la columna se dividió 22:1, dirigiéndose la mayor parte del
material hacia el detector PDA. El restante 4,5% del material se
dirigió a la cámara de ionización por
electro-pulverización de un espectrómetro de masas
Sciex API III. Se llevó a cabo la espectrometría de masas en el
modo positivo. Una línea de datos analógicos procedente del detector
PDA sobre la HPLC transfirió un cromatograma de una sola longitud
de onda al espectrómetro de masas para el coanálisis de los datos UV
y MS.
Los modelos de fragmentación por espectrometría
de masas resultaron ser útiles a la hora de realizar la
clasificación entre los sustratos hidroxilados. Las dos canrenonas
hidroxiladas esperadas, 11\alpha-hidroxi- y
9\alpha-hidroxi, perdieron agua en diferentes
frecuencias de una manera consistente que podría ser utilizada como
diagnóstico. Igualmente, la
9\alpha-hidroxicanrenona formó un aducto amónico
más fácilmente que la 11\alpha-hidroxicanrenona.
En la Tabla 35 se ofrece un resumen de los datos TLC, HPLC/UV y
LC/MS para las fermentaciones de canrenona, mostrando cuales de los
microorganismos ensayados fueron eficaces en la bioconversión de
canrenona a 9\alpha-hidroxicanrenona. Entre
estos, el microorganismo preferido fue Corynespora cassiicola
ATCC 16718.
Se ensayaron varios cultivos respecto a la
eficacia en la bioconversión de androstendiona a
11\alpha-hidroxiandrostendiona de acuerdo con los
métodos en general descritos anteriormente.
De la misma manera esencialmente que la descrita
en el Ejemplo 4 se preparó un banco de células de trabajo de cada
uno de Aspergillus ochraceus RRL 405 (ATCC 18500);
Aspergillus Níger ATCC 11394; Apergillus nigulans
ATCC 11267; Rhizopus oryzae ATCC 11145; Rhizopus
stolonifer ATCC 6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 y
ATCC 8685. Se inoculó medio de crecimiento (50 ml) que tiene la
composición indicada en la Tabla 18 con una suspensión de esporas
(1 ml) del banco de células de trabajo y se colocó en una
incubadora. Se preparó un cultivo seminal en la incubadora por
fermentación a 26ºC durante 20 horas aproximadamente. La incubadora
se agitó a una velocidad de 200 rpm.
Se emplearon partes alícuotas (2 ml) del cultivo
seminal de cada microorganismo para inocular matraces de
transformación que contienen el medio de crecimiento (30 ml) de la
Tabla 15. Cada cultivo se utilizó para la inoculación de dos
matraces, un total de 16. Se disolvió androstendiona (300 mg) en
metanol (6 ml) a 36ºC y se introdujo una parte alícuota de 0,5 ml de
esta solución en cada uno de los matraces. La bioconversión se
realizó generalmente bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6
durante 48 horas. Después de 48 horas, se reunieron muestras del
caldo y se extrajeron con acetato de etilo como en el Ejemplo 17. El
acetato de etilo se concentró por evaporación y las muestras fueron
analizadas por cromatografía de capa delgada para determinar si
estaba presente o no un producto que tiene una movilidad
cromatográfica similar a la de la referencia de
11\alpha-hidroxiandrostendiona (Sigma Chemical
Co., St. Louis). Los resultados se muestran en la Tabla 36. Los
resultados positivos vienen indicados como "+".
Los datos de la Tabla 36 demuestran que cada uno
de los cultivos indicados fue capaz de producir un compuesto a
partir de androstendiona que tiene el mismo valor Rf que aquel de la
referencia de 11\alpha-hidroxiandrostendiona.
Se volvió a ensayar Aspergillus ochraceus
NRRL 405 (ATCC 18500) por el mismo procedimiento antes descrito y
los productos de cultivo fueron aislados y purificados mediante
cromatografía en columna de gel de sílice de fase normal usando
metanol como disolvente. Las fracciones fueron analizadas por
cromatografía de capa fina. Las placas TLC fueron de gel de sílice
Whatman K6F 60\ring{A}, con un tamaño de 10 x 20 y un espesor de
250 \mu. La mezcla disolvente fue cloroformo:metanol, 95:5 v/v. El
producto cristalizado y la referencia de
11\alpha-hidroxiandrostendiona se analizaron por
LC-MS y espectroscopía NMR. Ambos compuestos
proporcionaron perfiles y pesos moleculares similares.
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Se ensayaron varios microorganismos respecto a
la eficacia en la bioconversión de androstendiona a
11\beta-hidroxiandrostendiona esencialmente por
los métodos descritos anteriormente en los Ejemplos 17 y 18.
De la misma manera esencialmente que la descrita
en el Ejemplo 17 se hicieron crecer cultivos de cada uno de
Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus niger
ATCC 16888 y ATCC 26693, Epicoccum oryzae ATCC 7156,
Curvularia lunata ATCC 12017, Cunninghamella
blakesleeana ATCC 8688a y Phitomyces
atro-olivaceus IFO 6651. El medio de
crecimiento y de fermentación (30 ml) tenía la composición mostrada
en la Tabla 34.
La 11\beta-hidroxilación de
androstendiona por los microorganismos antes indicados se analizó
utilizando esencialmente los mismos métodos de identificación de
productos como los descritos en los Ejemplos 17 y 18. Los
resultados se ofrecen en la Tabla 19A-1.
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En la Tabla 19A-1, un "+"
indica un resultado positivo, es decir, un valor R_{f} como cabía
esperar en la cromatografía de capa delgada y un peso molecular
aproximadamente correcto tras LC/MS.
Estos resultados demuestran que los
microorganismos indicados son capaces de realizar la
11\beta-hidroxilación de androstendiona.
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Se ensayaron varios microorganismos respecto a
la eficacia en la conversión de mexrenona a
11\beta-hidroximexrenona. Los medios de
fermentación para este ejemplo se prepararon como se describe en la
Tabla 34.
Las condiciones de fermentación y los métodos
analíticos fueron como en el Ejemplo 17. Las placas TLC y el
sistema disolvente fueron como se describe en el Ejemplo 18. La
exposición razonada para el análisis cromatográfico es como sigue:
11\alpha-hidroximexrenona y
11\alpha-hidroxicanrenona tienen la misma
movilidad cromatográfica. La
11\alpha-hidroxicanrenona y la
9\alpha-hidroxicanrenona exhiben el mismo modelo
de movilidad que 11\alpha-hidroxiandrostendiona y
11\beta-hidroxiandrostendiona. Por tanto, la
11\beta-hidroximexrenona deberá tener la misma
movilidad que la 9\alpha-hidroxicanrenona. De
este modo, los compuestos extraídos del medio de crecimiento se
pasaron contra 9\alpha-hidroxicanrenona como
referencia. Los resultados se indican en la Tabla 36.
Estos datos sugieren que la mayoría de los
organismos indicados en esta tabla producen un producto similar o
idéntico a 11\beta-hidroximexrenona a partir de
mexrenona.
Se ensayaron varios microorganismos con respecto
a la eficacia en la conversión de mexrenona a
11\alpha-hidroximexrenona,
\Delta^{1,2}-mexrenona,
6\beta-hidroximexrenona,
12\beta-hidroximexrenona y
9\alpha-hidroximexrenona. La mexrenona se puede
preparar del modo indicado en la Patente US No. 3.787.396 de Weier y
en R.M. Weier et al., J. Med. Chem., Vol. 18, pp.
817-821 (1975), cuyos documentos se incorporan aquí
solo con fines de referencia. Los medios de fermentación se
prepararon en la forma descrita en el Ejemplo 17, excepto que se
incluyó mexrenona. Las condiciones de fermentación fueron
esencialmente las mismas que las del Ejemplo 17; los métodos
analíticos fueron también los mismos que los de los Ejemplos 17 y
18. Las placas TLC y el sistema disolvente fueron como se han
descrito en los Ejemplos 17 y 18.
Los microorganismos ensayados y los resultados
obtenidos con los mismos se muestran en la Tabla
19C-1.
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En la Tabla 19C-1, un "+"
indica el resultado positivo, es decir, un valor R_{f} como cabía
esperar en la cromatografía de capa delgada y un tiempo de
retención como cabía esperar en HPLC. m/z 417:399 indica la relación
de altura del pico de la molécula 417 (hidroximexrenona) y de la
molécula 399 (mexrenona). La referencia tenía una relación 10:1 de
altura de pico para m/z 417 a m/z 399.
El producto obtenido a partir de Beauveria
bassiana ATCC 13144 fue aislado de la mezcla de incubación y
analizado por NMR y se confirmó que su perfil estructural era el de
11\alpha-hidroximexrenona. Por analogía, los
productos obtenidos a partir de los otros microorganismos indicados
en la Tabla 19C-1 fueron presuntamente también
11\alpha-hidroximexrenona.
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En la Tabla 19C-2, un "+"
indica un resultado positivo, por ejemplo, un valor R_{f} como el
esperado en cromatografía de capa delgada y un tiempo de retención
como el esperado en HPLC, etc.
El producto obtenido a partir de Bacterium
cyclo-oxidans ATCC 12673 se aisló de la mezcla
de incubación y se analizó por NMR y con ello se confirmó que su
perfil estructural era el de
\Delta^{1,2}-mexrenona. Por analogía, los
productos obtenidos a partir de los otros microorganismos indicados
en la Tabla 19C-2 fueron también presuntamente
\Delta^{1,2}-mexrenona.
Se hizo crecer Mortierella isabella ATCC
42613 como en el Ejemplo 17 en presencia de mexrenona. Los productos
de fermentación fueron aislados y purificados por cromatografía
instantánea. Los productos purificados se analizaron por LC/MS como
en los Ejemplos 17 y 18 y por NMR protónica y NMR de
carbono-13. Los datos indicaron que los productos
incluían 6\beta- y 12\beta-hidroximexrenona.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los microorganismos indicados en la Tabla
19C-3 se hicieron crecer bajo las mismas condiciones
que en el Ejemplo 17, en presencia de mexrenona. Los productos de
fermentación fueron analizados por TLC y LC/MS como en los Ejemplos
17 y 18. Un "+" indica un resultado positivo, por ejemplo, un
valor R_{f} como el esperado en cromatografía de capa delgada y
un tiempo de retención como el esperado en HPLC, etc. Los datos
sugieren que los productos incluyen
9\alpha-hidroximexrenona.
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Se ensayaron varios microorganismos con respecto
a la eficacia en la conversión de canrenona a
\Delta^{9,11}-canrenona. Los medios de
fermentación y las condiciones de crecimiento fueron esencialmente
como en el Ejemplo 17, excepto que se incluyó canrenona en el
medio. Los métodos analíticos fueron como los descritos en los
Ejemplos 17 y 18. Los microorganismos y resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 19D-1 siguiente.
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Los productos de fermentación fueron analizados
por TLC y LC/MS como en los Ejemplos 17 y 18. Un "+" indica un
resultado positivo, por ejemplo, un valor R_{f} como el esperado
en cromatografía de capa delgada, un tiempo de retención como el
esperado en HPLC, etc.
El producto obtenido a partir de Comomonas
testosteroni ATCC 11996 fue aislado del medio de crecimiento y
analizado por espectroscopía UV. El perfil espectroscópico confirmó
la presencia de \Delta^{9,11}-canrenona. Por
analogía, los productos obtenidos a partir de los otros
microorganismos indicados en la Tabla 19D-1 fueron
también presuntamente
\Delta^{9,11}-canrenona.
Esquema 1: Etapa 1: Método
A
En un reactor revestido de cristal y de 50
galones de capacidad se cargaron 61,2 litros (57,8 kg) de DMF
seguido por 23,5 kg de 11-hidroxicanrenona 1 con
agitación. A la mezcla se añadieron 7,1 kg de cloruro de litio. La
mezcla se agitó durante 20 minutos y se cargaron 16,9 kg de
cianohidrina de acetona seguido por 5,1 kg de trietilamina. La
mezcla se calentó a 85ºC y se mantuvo a esa temperatura durante
13-18 horas. Después de la reacción, se añadieron
353 litros de agua seguido por 5,6 kg de bicarbonato sódico. La
mezcla se enfrió a 0ºC, se transfirió a un reactor revestido de
cristal de 200 galones de capacidad y se enfrió lentamente con 130
kg de solución de hipoclorito sódico al 6,7%. El producto fue
filtrado y lavado con 3 porciones de 40 litros cada una de ellas de
agua para dar 21,4 kg de la enamina producto.
H^{1} NNR (DMSO-d_{6}): 7,6
(2H, bd), 4,53 (1H, d, J=5,9), 3,71 (1H, m), 3,0-1,3
(17H, m), 1,20 (5H, m), 0,86 (3H, s), 0,51 (1H, t, J=10).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 50 g de
11-hidroxicanrenona y 150 ml de dimetilacetamida a
un matraz de tres cuellos, seco, limpio, equipado con un agitador
mecánico, condensador, termopar y manto de calentamiento. A esta
mezcla se añadieron 16 ml de una solución de ácido sulfúrico
(preparada mezclando 50 ml de ácido sulfúrico (calidad 98,7% Baker)
con 50 ml de agua). Se añadió entonces una solución de cianuro
sódico que comprende 15,6 g de cianuro sódico y 27 ml de agua.
La mezcla resultante se calentó a 80ºC durante 7
horas, comprobándose periódicamente el grado de conversión mediante
TLC o HPLC. Después de alrededor de 7 horas, la HPLC de la mezcla
indicó la presencia del compuesto 7-ciano. La
mezcla se agitó entonces durante la noche y dejó enfriar a
temperatura ambiente (alrededor de 22ºC) se añadieron 200 ml de
agua a la mezcla seguido por 200 ml de cloruro de metileno y la
mezcla bifásica resultante se agitó y las fases se dejaron entonces
separar. La capa acuosa era un gel. Se añadieron 100 ml de solución
de bicarbonato sódico a la capa acuosa en un intento carente de
éxito de romper el gel. La capa acuosa se desechó entonces.
La capa de cloruro de metileno separada se lavó
con 100 ml de agua y la mezcla bifásica resultante se agitó. Se
dejaron separar las fases y la capa de cloruro de metileno separada
se filtró a través de 200 g de gel de sílice (Aldrich malla
200-400, 60\ring{A}). El filtrado se concentró
hasta sequedad bajo presión reducida a 45ºC usando un aspirador de
agua para proporcionar alrededor de 53,9 g de un producto sólido en
bruto. El producto sólido en bruto se disolvió entonces en 50 ml de
cloruro de metileno y se trató con 40 ml de ácido clorhídrico 4 N
en un embudo separador y se permitió la separación de la mezcla
bifásica. La capa de cloruro de metileno se lavó con 50 ml de agua.
Las capas acuosas combinadas fueron extraídas con 50 ml de cloruro
de metileno. Las capas combinadas de cloruro de metileno se secaron
entonces sobre sulfato sódico para proporcionar 45 g de un sólido
consistente en una mezcla de
11\alpha-hidroxicanrenona y del producto, ácido
7\alpha-ciano-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-21-carboxílico,
\gamma-lactona.
\gamma-lactona.
Una muestra del producto fue analizada por HPLC
(columna: 25 cm x 4,6 mm, 5 \mu Altima C_{18}LL); gradiente de
disolvente: disolvente A = agua/ácido trifluoracético = 99,9/0,1,
disolvente B = acetonitrilo/ácido trifluoracético =
99,9/0,1, velocidad de flujo = 1 ml/min., gradiente = 65,3 (v/v) (A:B-inicial), 35:65 (v/v) (A:B-después de 20 minutos), 10:90 (v/v) (A:B-después de 25 minutos); detector con disposición de diodo) la cual reveló un \lambda_{max} de
238 nm.
99,9/0,1, velocidad de flujo = 1 ml/min., gradiente = 65,3 (v/v) (A:B-inicial), 35:65 (v/v) (A:B-después de 20 minutos), 10:90 (v/v) (A:B-después de 25 minutos); detector con disposición de diodo) la cual reveló un \lambda_{max} de
238 nm.
La mezcla de reacción se analizó por HPLC -NMR
usando las siguientes condiciones: columna HPLC: Zorbax
RX-C8 (25 cm x 4,6 mm, 5 \mu) usando un gradiente
de disolvente de 75% de D_{2}O, 25% de acetonitrilo a 25% de
D_{2}O, 75% de acetonitrilo durante 25 minutos con una velocidad
de flujo de 1 ml/min.; ^{1}H NMR (obtenido usando supresión de
disolvente WET): 5,84 (s, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,2 (m, 1H),
2,9-1,4 (m, integral no significativo debido a la
supresión de disolvente de acetonitrilo), 0,93-0,86
(s, 3H superposición, y t, 2H).
Se preparó una suspensión espesa de 102 g (0,3
mol) de ácido
17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,6-dieno-21-carboxílico,
\gamma-lactona (canrenona) con 46,8 g (0,72 mol)
de cianuro potásico, 78,6 ml (1,356 moles) de ácido acético y 600
ml de metanol en un matraz de fondo redondo y de tres cuellos con
una capacidad de 3 litros. A la mezcla se añadieron 64,8 ml (0,78
mol) de pirrolidina y la suspensión combinada se calentó a reflujo
(64ºC) y se mantuvo durante alrededor de 1,5 horas. La temperatura
de la suspensión se bajó entonces a 25-30ºC durante
un periodo de 10 minutos con un baño de enfriamiento. Se añadieron
lentamente 120 ml de ácido clorhídrico concentrado durante el
enfriamiento a medida que precipitaba un sólido de color canela.
La mezcla se agitó a 25-30ºC
durante 1,5 horas y luego se añadieron 500 ml más de agua en 30
minutos. La mezcla se enfrió a 5ºC con un baño de hielo y el pH se
ajustó a 3-5,5 (controlado usando tiras de pH) con
la adición de 100 ml de hidróxido sódico acuoso 9,5 M (0,95 mol). El
exceso de cianuro se destruyó por adición de lejía de uso
doméstico. Se añadieron 25 ml (0,020 moles) para conseguir un ensayo
negativo con almidón-yoduro. La mezcla enfriada
(10ºC) se filtró y el sólido se lavó con agua hasta que el líquido
de enjuagado exhibió un pH neutro (tiras de pH). El sólido se secó
a 60ºC hasta un peso constante de 111,4 g.
El sólido aislado fundió a
244-246ºC en un bloque Fisher Johns. Una solución en
metanol conteniendo el sólido no exhibió absorción en toda la
región UV de 210 a 240 nm. IR (CHCl_{3}) cm^{-1}2222 (cianuro),
1775 (lactona), 1732 (3-ceto). ^{1}H NMR
(piridina d_{5}) ppm 0,94 (s, 3H), 1,23 (s, 3H).
Esquema 1: Etapa
2
En un reactor de 200 galones, revestido de
cristal, se cargaron 50 kg de enamina 2, aproximadamente 445 litros
de ácido clorhídrico diluido 0,8 N y 75 litros de metanol. La mezcla
se calentó a 80ºC durante 5 horas, tras lo cual se enfrió a 0ºC
durante 2 horas. El producto sólido se filtró para proporcionar 36,5
kg de dicetona producto seca.
^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 4,53
(1H, d, J=6), 3,74 (2H, m), 2,73 (1H, dd, J=14,7)
2,65-2,14 (8H, m), 2,05 (1H, e,
J=11),1,98-1,71 (4H,m), 1,64 (1H, m), 1,55 (1H, dd,
J=13,5), 1,45-1,20 (7H, m), 0,86 (3H, s).
Esquema 1: Etapas 1 y
2
En un reactor equipado con condensador de
enfriamiento, agitador mecánico, manta de calentamiento y
controlador, y embudo, se cargaron 100 g (280,54 mmol) de
11-hidroxicanrenona preparada como en el Ejemplo 1
seguido por 300 ml de dimetilacetamida (Aldrich). La mezcla se
agitó hasta la disolución de la 11-hidroxicanrenona.
A esta mezcla se añadieron 31,5 ml de ácido sulfúrico al 50%
(Fisher) lo cual hizo que la temperatura de la mezcla resultante
subiera 10-15ºC aproximadamente. Durante un periodo
de 2 a 3 minutos se añadió entonces a la
11\alpha-hidroxicanrenona, una solución de cianuro
sódico preparada disolviendo 31,18 g (617,20 mmol) (Aldrich) de
cianuro sódico en 54 ml de agua desionizada. La temperatura de la
mezcla resultante subió 20-25º C aproximadamente
después de la adición de la solución de cianuro sódico.
La mezcla se calentó a 80ºC y se mantuvo a esa
temperatura durante 2-3 horas. Una vez que el
análisis HPLC indicó que se había completado sustancialmente la
reacción de conversión de la
11\alpha-hidroxicanrenona a la enamina
(conversión superior al 98%), se retiró la fuente de calor. Sin
aislar la enamina contenida en la mezcla, se añadieron 148 ml más
de ácido sulfúrico al 50% a la mezcla durante un periodo de
3-5 minutos. Durante un periodo de 10 minutos se
añadieron entonces a la mezcla 497 ml de agua desionizada.
La mezcla se calentó a 102ºC y se mantuvo a esa
temperatura hasta que se habían separado de la mezcla alrededor de
500 g de destilado. Durante la reacción/destilación, se añadieron a
la mezcla 500 ml de agua desionizada en cuatro porciones separadas
de 125 ml. Cada porción se añadió a la mezcla después de haberse
retirado una cantidad equivalente de destilado (alrededor de 125
ml). La reacción continuó durante más de 2 horas. Cuando el
análisis HPLC indicó que se había completado sustancialmente la
reacción de hidrólisis de la enamina a la dicetona (conversión
mayor del 98%), la mezcla se enfrió a 80ºC aproximadamente durante
un periodo de 20 minutos.
La mezcla se filtró a través de un embudo de
cristal. El reactor fue enjuagado con 1,2 litros de agua desionizada
para separar producto residual. El sólido del filtro se lavó tres
veces usando porciones aproximadamente iguales (alrededor de 0,4
litros) del agua de enjuagado. Se preparó en el reactor 1 litro de
solución de metanol y agua desionizada (1:1 v/v) y el filtrado se
lavó con 500 ml de esta solución. El filtrado se lavó entonces por
segunda vez con los restantes 500 ml de la solución de metanol/agua.
Se aplicó vacío al embudo para secar el filtrado lo suficiente para
su transferencia. El filtrado fue transferido a un horno de secado
en donde se secó bajo vacío durante 16 horas para proporcionar 84 g
de la dicetona producto seca,
4'S(4'\alpha),7'\alpha-hexadecahidro-11'\alpha-hidroxi-10'\beta,13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano-[17H]ciclopenta[a]fenantreno]-5'\beta(2'H)-carbonitrilo
a partir de 11\alpha-hidroxicanrenona. El
análisis HPLC indicó 94% de la dicetona deseada.
Esquema 1: Etapa 3A: Método
A
Un matraz de fondo redondo y de cuatro cuellos
con una capacidad de 5 litros se equipó con agitador mecánico,
embudo de adición compensador de la presión con tubo de entrada de
nitrógeno, termómetro y condensador con burbujeador. El burbujeador
se conectó por medio de un tubo tygon a dos trampas de 2 litros, la
primera de las cuales se vació y se colocó para evitar la
retro-succión del material en la segunda trampa (1
litro de solución concentrada de hipoclorito sódico) en el
recipiente de reacción. La dicetona 3 (79,50 g; (peso no corregido
respecto a la pureza, la cual fue de 85%)) se añadió al matraz en 3
litros de metanol. Se colocó en el embudo una solución metanólica
al 25% de metóxido sódico (64,83 g) y se añadió gota a gota con
agitación bajo nitrógeno, durante 10 minutos. Terminada la adición,
la mezcla de reacción de color amarillo anaranjado se calentó a
reflujo durante 20 horas. Después de este periodo, se añadieron 167
ml de 4 N HCl (precaución: desprendimiento de HCN en este punto!)
gota a gota a través del embudo de adición a la mezcla de reacción
que refluye en el alambique. La mezcla de reacción asumió un color
más claro para presentar un color naranja dorado pálido. El
condensador fue sustituido entonces por una cabeza de recogida y se
separaron 1,5 litros de metanol por destilación al tiempo que se
añadían simultáneamente 1,5 litros de agua al matraz a través del
embudo, en concierto con la velocidad de destilación. La mezcla de
reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo dos veces
con partes alícuotas de 2,25 litros de cloruro de metileno. Los
extractos combinados se lavaron sucesivamente con partes alícuotas
de 750 ml de solución saturada fría de NaCl, 1 N NaOH y de nuevo
con NaCl saturado. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico
durante la noche, se filtró y se redujo de volumen a 250 ml
aproximadamente bajo vacío. Se añadió tolueno (300 ml) y el cloruro
de metileno restante se separó bajo presión reducida, durante lo
cual el producto comenzó a formarse sobre las paredes del matraz
como un sólido blanco. El contenido del matraz se enfrió durante la
noche y el sólido se separó por filtración. Se lavó con 250 ml de
tolueno y dos veces con partes alícuotas de 250 ml de éter y se secó
en un embudo de vacío para proporcionar 58,49 g de sólido blanco
con una pureza de 97,35 según HPLC. Tras concentrar el licor madre,
se obtuvieron 6,76 g más de producto con una pureza de 77,1%. El
rendimiento total, ajustado respecto a la pureza, fue de 78%.
H^{1} NMR (CDCl_{3}): 5,70 (1H, s), 4,08
(1H, s), 3,67 (2H, s), 2,9-1,6 (19H, m),
1,5-1,2 (5H, m), 1,03 (3H, s).
Esquema 1: Etapa
3B
Un matraz de cuatro cuellos y de 5 litros de
capacidad se equipó como en el ejemplo anterior, excepto que más
allá del burbujeador no se instaló ningún sistema de trampa. Se
añadió al matraz una cantidad de 138,70 g del hidroxiéster, seguido
por 1.425 ml de cloruro de metileno, con agitación bajo nitrógeno.
La mezcla de reacción se enfrió a -5ºC usando un baño de sal/hielo.
Se añadió rápidamente cloruro de metanosulfonilo (51,15 g, 0,447
moles) seguido por la adición lenta gota a gota de trietilamina
(54,37 g) en 225 ml de cloruro de metileno. La adición, que
necesitó alrededor de 30 minutos, se ajustó de manera que la
temperatura de la reacción nunca subiera 5ºC aproximadamente. Se
continuó la agitación durante 1 hora después de la adición y el
contenido de la reacción fue transferido a un embudo separador de
12 litros al cual se añadieron 2.100 ml de cloruro de metileno. La
solución se lavó sucesivamente con partes alícuotas de 700 ml cada
una de ellas de 1 N HCl frío, 1 N NaOH y solución acuosa saturada
de NaCl. Los lavados acuosos se combinaron y se extrajeron de nuevo
con 3.500 ml de cloruro de metileno. Se combinaron todos los lavados
orgánicos en un jarro de 9 litros, al cual se añadieron 500 g de
alúmina neutra, grado de actividad II, y 500 g de sulfato sódico
anhidro. El contenido del jarro se mezcló bien durante 30 minutos y
se filtró. El filtrado se llevó hasta sequedad bajo vacío para
proporcionar una espuma amarilla gomosa. Esta se disolvió en 350 ml
de cloruro de metileno y se añadieron gota a gota 1.800 ml de éter
con agitación. La velocidad de adición se ajustó de manera que
aproximadamente la mitad del éter se añadió en 30 minutos. Después
de añadirse 750 ml aproximadamente, el producto comenzó a separarse
como un sólido cristalino. El resto del éter se añadió en 10
minutos. El sólido se separó por filtración y la torta de
filtración se lavó con 2 litros de éter y se secó en un horno de
vacío a 50ºC durante la noche, para proporcionar 144,61 g (88%) de
sólido casi blanco, p.f. 149-150ºC. El material
preparado de este modo tiene normalmente una pureza de
98-99% según HPLC (% área). En una operación, se
obtuvo material que tiene un punto de fusión de
153-153,5ºC con una pureza, determinada por el área
HPLC, de 99,5%.
H^{1} NMR (CDCl_{3}): 5,76 (1H, s), 5,18
(1H, dt), 3,68 (3H, s), 3,06 (3H, s), 2,85 (1H, m),
2,75-1,6 (19H, m), 1,43 (3H, s), 1,07 (3H, s).
Esquema 1: Etapa 3C: Método
A
Un matraz de 4 cuellos y de 1 litro de capacidad
se equipó como en el segundo ejemplo. Al matraz se añadieron, con
agitación, bajo nitrógeno, ácido fórmico (250 ml) y anhídrido
acético (62 ml). Se añadió formato potásico (6,17 g) y la mezcla de
reacción se calentó en un baño de aceite a una temperatura interna
de 40ºC (esto se repitió después a 70ºC con mejores resultados)
durante 16 horas. Después de 16 horas, se añadió el mesilato y la
temperatura interna se aumentó a 100ºC. Se continuaron el
calentamiento y la agitación durante 2 horas, tras lo cual el
disolvente se separó bajo vacío en un rotavap. El residuo se agitó
con 500 ml de agua de hielo durante 15 minutos, tras lo cual se
extrajo dos veces con partes alícuotas de 500 ml de acetato de
etilo. Las fases orgánicas se combinaron y lavaron sucesivamente
con partes alícuotas frías de 250 ml de solución saturada de
cloruro sódico (dos veces), solución de hidróxido sódico 1 N y de
nuevo con cloruro sódico saturado. La fase orgánica se secó
entonces sobre sulfato sódico, se filtró y se llevó hasta sequedad
bajo vacío para proporcionar una espuma blanca amarillenta, la cual
se pulverizó a un cristal cuando fue tocada con una espátula. El
polvo formado, 14,65 g, fue analizado (por el porcentaje de área
HPLC) como una mezcla de
7-metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona; 7,4%
7-metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,11-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona; y 5,7% ácido
9\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxílico,
bis(\gamma-lactona).
H^{1} NMR (CDCl_{3}): 5,74 (1H, s), 5,67
(1H, m), 3,61 (3H, s), 3,00 (1H, m), 2,84 (1H, ddd, J=2, 6,15),
2,65-2,42 (6H, m), 2,3-2,12 (5H, m),
2,05-1,72 (4H, m), 1,55-1,45 (2H,
m), 1,42 (3H, s), 0,97 (3H, s).
Esquema 1: Etapa 3C: Método
B
Un matraz de cuatro cuellos y de 5 litros se
equipó como en el ejemplo anterior y se añadieron con agitación,
bajo nitrógeno, 228,26 g de ácido acético y 41,37 g de acetato
sódico. Usando un baño de aceite, la mezcla se calentó a una
temperatura interna de 100ºC. Se añadió el mesilato (123,65 g) y se
continuó el calentamiento durante 30 minutos. Al término de este
periodo, se detuvo el calentamiento y se añadieron 200 ml de agua de
hielo. La temperatura descendió a 40ºC y se continuó la agitación
durante 1 hora, tras lo cual la mezcla de reacción se vertió
lentamente en 1,5 litros de agua fría en un matraz agitado de 5
litros. El producto se separó como un aceite gomoso. El aceite se
disolvió en 1 litro de acetato de etilo y se lavó con 1 litro,
respectivamente, de solución saturada fría de cloruro sódico,
hidróxido sódico 1 N y por último de nuevo con cloruro sódico
saturado. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico y se filtró.
El filtrado se llevó hasta sequedad bajo vacío para proporcionar
una espuma que se derrumbó a un aceite gomoso. Este se trituró con
éter durante cierto tiempo y solidificó eventualmente. El sólido
fue filtrado y lavado con más éter para proporcionar 79,59 g de un
sólido blanco amarillento. Este consistía en 70,4% del
\Delta^{9,11} enéster 6 deseado, 12,3% del \Delta^{11,12}
enéster 8, 10,8% de la
7-\alpha,9-\alpha-lactona
9 y 5,7% de 5 sin reaccionar.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
A
Un reactor de cuatro cuellos, encamisado, con
una capacidad de 500 ml, se equipó con agitador mecánico,
condensador/burbujeador, termómetro y embudo de adición con tubo de
entrada de nitrógeno. El reactor se cargó con 8,32 g del enéster en
bruto en 83 ml de cloruro de metileno, con agitación bajo nitrógeno.
Se añadieron entonces 4,02 g de fosfato dibásico de potasio,
seguido por 12 ml de tricloroacetonitrilo. Se pasó agua de
enfriamiento externo a través de la camisa del reactor y la mezcla
de reacción se enfrió a 8ºC. Al embudo de adición se añadieron 36 ml
de peróxido de hidrógeno al 30% durante 10 minutos. La mezcla de
reacción inicialmente de color amarillo pálido viró a casi incolora
después de terminada la adición. La mezcla de reacción permaneció en
9\pm1ºC durante toda la adición y durante la noche con agitación
continua (23 horas en total). Se añadió cloruro de metileno (150
ml) a la mezcla de reacción y todo el contenido se añadió a 250 ml
aproximadamente de agua de hielo. Esta se extrajo tres veces con
partes alícuotas de 150 ml de cloruro de metileno. Los extractos
combinados de cloruro de metileno se lavaron con 400 ml de solución
fría de sulfito sódico al 3% para descomponer cualquier peróxido
residual. Esto vino seguido por un lavado con 330 ml de hidróxido
sódico 1 N frío, por un lavado con 400 ml de ácido clorhídrico 1 N
frío y por último por un lavado con 400 ml de salmuera. La fase
orgánica se secó sobre sulfato sódico, se filtró y la torta de
filtración se lavó con 80 ml de cloruro de metileno. El disolvente
se separó bajo vacío para dar 9,10 g de producto en bruto como un
sólido amarillo pálido. Este se recristalizó en alrededor de 25 ml
de 2-butanona para dar 5,52 g de cristales casi
blancos. Una recristalización final en acetona (alrededor de 50 ml)
proporcionó 3,16 g de cristales aciculares largos, p.f.
241-243ºC.
H^{1} NMR (CDCl_{3}): 5,92 (1H, s), 3,67
(3H, s), 3,13 (1H, d, J=5), 2,89 (1H, m), 2,81-2,69
(15H, m), 1,72 (1H, dd, J=5,15), 1,52-1,22 (5H, m),
1,04 (3H, s).
Esquema 1: Etapa 3: Opción
1
Se cargó dicetona (20 g) en un reactor limpio y
seco seguido por la adición de 820 ml de MeOH y 17,6 ml de solución
al 25% de NaOMe/MeOH. La mezcla de reacción se calentó a reflujo
(alrededor de 67ºC) durante 16-20 horas. El
producto se enfrió rápidamente con 40 ml de 4 N HCl. El disolvente
se separó a presión atmosférica por destilación. Se añadieron 100
ml de tolueno y el metanol residual se separó por destilación
azeotrópica con tolueno. Después de la concentración, el
hidroxiéster 4 en bruto se disolvió en 206 ml de cloruro de metileno
y se enfrió a 0ºC. Se añadió cloruro de metanosulfonilo (5 ml)
seguido por la adición lenta de 10,8 ml de trietilamina. El
producto se agitó durante 45 minutos. El disolvente se separó por
destilación en vacío para proporcionar el mesilato 5 en bruto.
En un reactor seco separado se añadieron 5,93 g
de formato potásico, 240 ml de ácido fórmico y 118 ml de anhídrido
acético. La mezcla se calentó a 70ºC durante 4 horas.
La mezcla de ácido fórmico se añadió a la
solución de mesilato concentrada 5 preparada anteriormente. La
mezcla se calentó a 95-105ºC durante 2 horas. La
mezcla de producto se enfrió a 50ºC y los componentes volátiles se
separaron por destilaciones en vacío a 50ºC. El producto se
distribuyó entre 275 ml de acetato de etilo y 275 ml de agua. La
capa acuosa se extrajo de nuevo con 137 ml de acetato de etilo, se
lavó con 240 ml de solución fría de hidróxido sódico 1 N y luego
con 120 ml de NaCl saturado. Después de la separación de fases, la
capa orgánica se concentró por destilación bajo vacío para
proporcionar el enéster en bruto.
El producto se disolvió en 180 ml de cloruro de
metileno y se enfrió a 0-15ºC. Se añadieron 8,68 g
de hidrogenofosfato dipotásico seguido por 2,9 ml de
tricloroacetonitrilo. A la mezcla se añadió, durante 3 minutos, una
solución (78 ml) de peróxido de hidrógeno al 30%. La mezcla de
reacción se agitó a 0-15ºC durante
6-24 horas. Después de la reacción, se separó la
mezcla de dos fases. La capa orgánica se lavó con 126 ml de solución
de sulfito sódico al 3%, 126 ml de solución de hidróxido sódico 0,5
N, 126 ml de ácido clorhídrico 1 N y 126 ml de salmuera al 10%. El
producto se secó sobre sulfato de magnesio anhidro o se filtró sobre
Celite y el cloruro de metileno disolvente se separó por
destilación a presión atmosférica. El producto fue cristalizado en
metiletilcetona dos veces para dar 7,2 g de epoximexrenona.
Esquema 1: Etapa 3: Opción
2
Un matraz de fondo redondo y de cuatro cuellos,
con una capacidad de 5 litros, se equipó con agitador mecánico,
embudo de adición con tubo de entrada de nitrógeno, termómetro y
condensador con burbujeador unido a un lavador con hipoclorito
sódico. La dicetona (83,20 g) se añadió al matraz en 3,05 litros de
metanol. El embudo de adición se cargó con 67,85 g de una solución
al 25% (p:p) de metóxido sódico en metanol. Con agitación bajo
nitrógeno, el metóxido se añadió gota a gota al matraz durante 15
minutos. Se formó una suspensión de color naranja/amarillo oscura.
La mezcla de reacción se calentó al reflujo durante 20 horas y se
añadieron gota a gota 175 ml de ácido clorhídrico 4 N mientras se
continuaba el reflujo. (Atención: desprendimiento de HCN durante
esta operación !). El condensador de reflujo fue sustituido por una
cabeza de recogida y se separaron 1,6 litros de metanol por
destilación mientras se añadían gota a gota, a través del embudo,
1,6 litros de solución acuosa al 10% de cloruro sódico, a una
velocidad compaginada con la velocidad de destilación. La mezcla de
reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo dos veces con
2,25 litros de partes alícuotas de cloruro de metileno. Los
extractos combinados se lavaron con partes alícuotas frías de 750 ml
de solución de hidróxido sódico 1 N y solución saturada de cloruro
sódico. La capa orgánica se secó por destilación azeotrópica del
metanol a una atmósfera, hasta un volumen final de 1 litro (se
separó 0,5% del total para análisis).
La solución orgánica concentrada (hidroxiéster)
se añadió de nuevo al matraz de reacción original equipado como
anteriormente, pero sin la trampa de HCN. El matraz de enfrió a 0ºC
y se añadieron 30,7 g de cloruro de metanosulfonilo con agitación
bajo nitrógeno. El embudo de adición se cargó con 32,75 g de
trietilamina, la cual se añadió gota a gota durante 15 minutos,
manteniendo la temperatura en 5ºC. Se continuó la agitación durante
2 horas, mientras se calentaba la mezcla de reacción a temperatura
ambiente. Se preparó una columna consistente en 250 g de resina de
intercambio iónico ácida Dowex 50 W x 8-100 y se
lavó antes de utilizarse con 250 ml de agua, 250 ml de metanol y
500 ml de cloruro de metileno. La mezcla de reacción se pasó
descendentemente por esta columna y se recogió. Se preparó una
nueva columna y se repitió el proceso anterior. Se preparó una
tercera columna de 250 g consistente en resina de intercambio iónico
básica Dowex 1 x 8-200 y se trató previamente como
en el tratamiento con resina ácida descrita anteriormente. La mezcla
de reacción se pasó descendentemente por esta columna y se recogió.
Se preparó una cuarta columna de la resina básica y la mezcla de
reacción se pasó de nuevo descendentemente por la columna y se
recogió. Cada pasada por las columnas vino seguida por dos lavados
con 250 ml de cloruro de metileno descendentemente por la columna y
cada pasada requirió aproximadamente 10 minutos. Los lavados con
disolvente se combinaron con la mezcla de reacción y el volumen se
redujo en vacío a 500 ml aproximadamente y se separó un 2% para
proceder a qc. El resto se redujo aún más a un volumen final de 150
ml (solución de mesilato en bruto).
Al matraz de reacción original de 5 litros se
añadieron 960 ml de ácido fórmico, 472 ml de anhídrido acético y
23,70 g de formato potásico. Esta mezcla se calentó con agitación
bajo nitrógeno a 70ºC durante 16 horas. La temperatura se aumentó
luego a 100ºC y se añadió la solución de mesilato en bruto durante
30 minutos por medio del embudo de adición. La temperatura
descendió a 85ºC a medida que el cloruro de metileno se separaba
por destilación de la mezcla de reacción. Una vez separado
totalmente, la temperatura subió de nuevo a 100ºC y se mantuvo en
ese valor durante 2,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió a 40ºC
y el ácido fórmico se separó bajo presión hasta alcanzarse el
volumen de agitación mínimo (alrededor de 150 ml). El residuo se
enfrió a temperatura ambiente y se añadieron 375 ml de cloruro de
metileno. El residuo diluido se lavó con porciones frías de 1 litro
de solución saturada de cloruro sódico, carbonato sódico 1 N y de
nuevo con solución de cloruro sódico. La fase orgánica se secó
sobre sulfato de magnesio (150 g) y se filtró para obtener una
solución de color marrón rojizo oscuro (solución de enéster en
bruto).
Un reactor de cuatro cuellos, encamisado, con
una capacidad de 1 litro, se equipó con agitador mecánico,
condensador/burbujeador, termómetro y embudo de adición con tubo de
entrada de nitrógeno. El reactor se cargó con la solución de enéster
en bruto (estimada en 60 g) en 600 ml de cloruro de metileno con
agitación bajo nitrógeno. Se añadieron entonces 24 g de fosfato
dibásico de potasio, seguido por 87 ml de tricloroacetonitrilo. Se
pasó agua de enfriamiento externa a través de la camisa del reactor
y la mezcla de reacción se enfrió a 10ºC. Al embudo de adición se
añadieron 147 ml de peróxido de hidrógeno al 30% durante 30 minutos.
La mezcla de reacción inicialmente de color marrón rojizo oscuro
viró a color amarillo pálido una vez terminada la adición. La mezcla
de reacción permaneció en 10\pm1ºC durante toda la adición y
durante la noche con agitación continua (23 horas en total). Se
separaron las fases y la porción acuosa se extrajo dos veces con
porciones de 120 ml de cloruro de metileno. Las fases orgánicas
combinadas se lavaron entonces con 210 ml de solución de sulfito
sódico al 3%. Esto se repitió por segunda vez, tras lo cual ambas
partes, orgánica y acuosa, fueron negativas a peróxido mediante
papel de ensayo de almidón/yoduro. La fase orgánica se lavó
sucesivamente con partes alícuotas de 210 ml de hidróxido sódico 1
N frío, ácido clorhídrico 1 N y por último dos lavados con salmuera.
La fase orgánica se secó azeotrópicamente a un volumen de alrededor
de 100 ml, se añadió disolvente nuevo (250 ml) y se destiló
azeotrópicamente a los mismos 100 ml y el resto del disolvente se
separó bajo vacío para proporcionar 57,05 g de producto en bruto
como una espuma amarilla gomosa. Una porción (51,01 g) fue secada
adicionalmente hasta un peso constante de 44,3 g ya analizada
cuantitativamente por HPLC. Mostró un análisis de 27,1% de
epoximexrenona.
En un matraz de reacción se cargaron, bajo
nitrógeno, 11\alpha-hidroxiandrostendiona (429,5
g) y ácido toluenosulfónico hidratado (7,1 litros). Al reactor se
añadió etanol (2,58 litros) y la solución resultante se enfrió a
5ºC. Se añadió ortoformato de trietilo (334,5 g) a la solución
durante 15 minutos a una temperatura de 0 a 15ºC. Terminada la
adición del ortoformato de trietilo, la mezcla de reacción se
calentó a 40ºC y se hizo reaccionar a esa temperatura durante 2
horas, tras lo cual la temperatura se aumentó a reflujo y se
continuó la reacción bajo reflujo durante 3 horas más. La mezcla de
reacción se enfrió bajo vacío y el disolvente se separó en vacío
para proporcionar
3-etoxi-11\alpha-hidroxi-androsta-3,5-dieno-17-ona.
Esquema 1: Etapa 1: Método
B
Se colocó cianuro sódico (1,72 g) en un matraz
de tres cuellos y de 25 ml equipado con agitador mecánico. Se
añadió agua (2,1 ml) y la mezcla se agitó con calentamiento hasta
disolverse los sólidos. Se añadió dimetilformamida (15 ml) seguido
por 11\alpha-hidroxicanrenona (5 g). A la mezcla
se añadió una mezcla de agua (0,4 ml) y ácido sulfúrico (1,49 g).
La mezcla se calentó a 85ºC durante 2,5 horas en cuyo momento el
análisis HPLC reveló una conversión completa a producto. La mezcla
de reacción se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió ácido
sulfúrico (0,83 g) y la mezcla se agitó durante media hora. La
mezcla de reacción se añadió a 60 ml de agua enfriada en un baño de
hielo. El matraz se lavó con 3 ml de DMF y 5 ml de agua. La
suspensión espesa se agitó durante 40 minutos y se filtró. La torta
de filtración se lavó dos veces con 40 ml de agua y se secó en un
horno de vacío a 60ºC durante la noche para proporcionar la
11\alpha-hidroxienamina, es decir,
5'R(5'\alpha),7'\beta-20'-aminohexadecahidro-11'\beta-hidroxi-10'a,13'\alpha-dimetil-3',5-dioxoespiro[furan-2(3H),17'\alpha(5'H)-[7,4]meteno[4H[ciclopenta[a]fenantreno]-5'-carbonitrilo
(4,9 g).
Se añadió cianuro sódico (1,03 g) a un matraz de
tres cuellos y de 50 ml equipado con agitador mecánico. Se añadió
agua (1,26 ml) y el matraz se calentó ligeramente para disolver el
sólido. Se añadió dimetilacetamida (o dimetilformamida) (9 ml)
seguido por 11\alpha-hidroxicanrenona (3 g). Al
matraz de reacción se añadió, con agitación, una mezcla de ácido
sulfúrico (0,47 ml) y agua (0,25 ml). La mezcla se calentó a 95ºC
durante 2 horas. El análisis HPLC indicó que la reacción se había
completado. Se añadió ácido sulfúrico (0,27 ml) y la mezcla se
agitó durante 30 minutos. Se introdujeron más agua (25 ml) y ácido
sulfúrico (0,90 ml) y la mezcla se reacción se agitó durante 16
horas. La mezcla se enfrió entonces en un baño de hielo a
5-10ºC. El sólido fue aislado por filtración a
través de un filtro de vidrio sinterizado seguido por lavado dos
veces con agua (20 ml). La dicetona sólida, es decir,
4'S(4'\alpha),7'\alpha-hexadecahidro-11'\alpha-hidroxi-10'\beta,13'\beta-dimetil-3',5,20'-trioxoespiro[furan-2(3H),17'\beta-[4,7]metano[17H]ciclo-penta[a]fenantreno]-5'\beta(2'H)-carbonitrilo
se secó en un horno de vacío para dar 3 g de un sólido.
Esquema 1: Etapa 3A: Método
B
Una suspensión de 5 g de la dicetona producida
del modo descrito en el ejemplo 31 en metanol (100 ml) se calentó a
reflujo y se añadió, durante 1 minuto, una solución al 25% de
metóxido potásico en metanol (5,8 ml). La mezcla se hizo homogénea.
Después de 15 minutos, estaba presente un precipitado. La mezcla se
calentó a reflujo y de nuevo se hizo homogénea después de alrededor
de 4 horas. Se continuó el calentamiento a reflujo durante un total
de 23,5 horas y se añadió 4 N HCl (10 ml). Por destilación se separó
un total de 60 ml de una solución de cianuro de hidrógeno en
metanol. Se añadió agua (57 ml) al residuo de destilación durante 15
minutos. La temperatura de la solución se elevó a 81,5ºC durante la
adición de agua y por destilación se separaron 4 ml más de solución
de cianuro de hidrógeno/metanol. Terminada la adición de agua, la
mezcla se hizo turbia y se retiró la fuente de calor. La mezcla se
agitó durante 3,5 horas y el producto cristalizó lentamente. La
suspensión se filtró y el sólido recogido se lavó con agua, se secó
en una corriente de aire en el embudo y se secó a 92º (26 pulgadas
de Hg) durante 16 horas para dar 2,98 g de un sólido blanquecino. El
sólido consistía en 91,4% del hidroxiéster, es decir,
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en peso. El rendimiento fue de
56,1%.
La dicetona (40 g) producida del modo descrito
en el ejemplo 31 se cargó en un reactor limpio, seco, encamisado,
con una capacidad de 1 litro, con un desagüe en el fondo,
condensador, sonda RTD y receptor de recogida de fracciones. Se
cargó entonces metanol (800 ml) en el reactor y la mezcla se agitó.
La suspensión resultante se calentó a 60-65ºC
aproximadamente y se añadió una solución al 25% de metóxido potásico
(27,8 ml). La mezcla se hizo homogénea.
La mezcla se calienta a reflujo. Después de
alrededor de 1,5 horas a reflujo se añaden a la mezcla, mientras se
mantiene en reflujo, 16,7 ml más de solución de metóxido potásico al
25%. La mezcla se mantiene a reflujo durante 6 horas más. La
conversión de dicetona a hidroxiéster se analiza por HPLC. Una vez
la HPLC indica que la relación de dicetona a hidroxiéster es menor
de alrededor de 10%, se añade a la mezcla, durante alrededor de 15
minutos, al tiempo que se continúa el reflujo, una carga de 77 ml de
4 M HCl (en lugar de ácido clorhídrico podría utilizarse una
cantidad comparable de ácido sulfúrico 1,5 M a 3 M).
La mezcla se destila entonces y se recogen y
desechan alrededor de 520 ml de destilado de metanol/HCN. La mezcla
concentrada se enfría a 65ºC aproximadamente. A la mezcla se añaden
alrededor de 520 ml de agua durante 90 minutos aproximadamente y la
temperatura se mantiene en 65ºC aproximadamente durante la adición.
La mezcla se enfría gradualmente a 15ºC aproximadamente durante un
periodo de alrededor de 4 horas y luego se agita y se mantiene a
15ºC aproximadamente durante 2 horas más. La mezcla se filtra y el
producto filtrado se lava dos veces con alrededor de 200 ml de agua
cada vez. El producto filtrado se seca bajo vacío (90ºC, 25 mm Hg).
Se obtienen alrededor de 25 a 27 g de un sólido blanquecino que
comprende principalmente
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Un matraz de reacción se cargó con 4,1 g de la
dicetona producida del modo descrito en el ejemplo 31, 75 ml de
metanol y 1 ml de hidróxido sódico metanólico 1 N. La suspensión se
agitó a temperatura ambiente. En el espacio de unos minutos se
obtuvo una solución homogénea y se observó un precipitado después de
alrededor de 20 minutos. La agitación se continuó durante 70
minutos a temperatura ambiente. Al término de este tiempo, el
sólido se filtró y se lavó con metanol. El sólido se secó en un
armario de vapor de agua para obtener 3,6 g de
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 0,95 (s, 3H), 1,4
(s, 3H), 3,03 (d, 1H, J15), 3,69 (s, 3H), 4,1 (m, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 14,6, 19,8, 22,6,
29,0, 31,0, 33,9, 35,17, 35,20, 36,3, 37,7, 38,0, 38,9, 40,8, 42,8,
43,1, 45,3, 45,7, 47,5, 52,0, 68,0, 95,0, 121,6, 174,5, 176,4,
207,0.
A 2 g (4,88 mmol) de la
9,11-epoxidicetona de fórmula 21 suspendida en 30 ml
de metanol anhidro, se añadieron 0,34 ml (2,4 mmol) de
trietilamina. La suspensión se calentó a reflujo y, después de 4,5
horas, no permanecía material de partida según se estimó por HPLC
(Zorbax SB-C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/min., gradiente
lineal 35:65 A:B a 45:55 A:B durante 15 min., A =
acetonitrilo/metanol 1:1, B = agua/0,1% ácido trifluoracético,
detección a 210 nm). La mezcla se dejó enfriar y se mantuvo a 25º
aproximadamente durante alrededor de 16 horas. La suspensión
resultante se filtró para dar 1,3 g de
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona como un sólido blanco. El filtrado
se concentró hasta sequedad en un evaporador rotativo y el residuo
se trituró con 3-5 ml de metanol. La filtración
proporcionó 260 mg más de
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. El rendimiento fue de 74,3%.
^{1}H-NMR (400 MHz,
deuterocloroformo) d 1,00 (s, 3H), 1,45 (m, 1H), 1,50 (s, 3H), 1,65
(m, 2H), 2,10 (m, 2H), 2,15-2,65 (m, 8H), 2,80 (m,
1H), 2,96 (m, 1H), 3,12 (d, J=13, 1H), 3,35, (d, J=7, 1H), 3,67 (s,
3H).
Se cargó un matraz de reacción con 6,8 g de la
dicetona (preparada del modo descrito en el ejemplo 31), 68 ml de
acetonitrilo, 6 g de acetato sódico y 60 ml de agua. La mezcla se
calentó y se agitó a reflujo. Después de alrededor de 1,5 horas, la
mezcla era casi homogénea. Al término de 3 horas, se añadieron 100
ml de agua a medida que se destilaban 50 ml de acetonitrilo. La
mezcla se enfrió y el sólido precipitado (1,7 g) se separó por
filtración. El filtrado (pH = 5,5) se trató con ácido clorhídrico
para reducir el pH a 4,5 aproximadamente y precipitó un sólido. El
sólido fue aislado, lavado con agua y secado para dar 4,5 g de ácido
5\beta-ciano-11-\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxílico,
\gamma-lactona.
^{1}H NMR (DMSO) ppm 0,8 (s, 3H), 1,28 (s,
3H), 3,82 (m, 1H).
^{13}C NMR (DMSO) ppm 14,5, 19,5, 22,0, 28,6,
30,2, 33,0, 34,1, 34,4, 36,0, 37,5, 37,7, 38,5, 42,4, 42,6, 45,08,
45,14, 47,6, 94,6, 122,3, 176,08, 176,24, 207,5.
Esquema 1: Etapa 3A: Método
C
La dicetona (30 g) preparada del modo descrito
en el ejemplo 31 se cargó en un matraz de reacción de tres cuellos
limpio y seco equipado con termómetro, trampa Dean Stark y agitador
mecánico. En el matraz se cargó metanol (24 ml) a temperatura
ambiente (22ºC) y la suspensión resultante se agitó durante 5
minutos. Se cargó en el reactor una solución al 25% en peso de
metóxido sódico en metanol (52,8 ml) y la mezcla se agitó durante
10 minutos a temperatura ambiente en cuyo tiempo la mezcla de
reacción viró a una solución limpia de color marrón claro y se
observó una ligera exotermia (2-3ºC). Se controló la
velocidad de adición para evitar que la temperatura en el calderín
excediera de 30ºC. La mezcla se calentó entonces en condiciones de
reflujo (alrededor de 67ºC) y se continuó el reflujo durante 16
horas. Se tomó entonces una muestra y se analizó por HPLC respecto
a la conversión. La reacción se continuó bajo reflujo hasta que la
cantidad de dicetona residual no fue mayor del 3% de la carga de
dicetona. Durante el reflujo se cargó en el calderín de reacción 4
N HCl (120 ml) dando ello como resultado la generación de HCN el
cual se enfrió rápidamente en un lavador.
Terminada la reacción, se separó por destilación
90-95% del metanol disolvente de la mezcla de
reacción a presión atmosférica. La temperatura en cabeza durante la
destilación varió de 67 a 75ºC y el destilado que contenía HCN se
trató con cáustico y lejía antes de su distribución. Una vez
separado el metanol, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura
ambiente, comenzando a precipitar un producto sólido a medida que la
mezcla se enfriaba en el intervalo de 40-45ºC. En
la suspensión fría se cargó una solución acuosa conteniendo
opcionalmente 5% en peso de bicarbonato sódico (1.200 ml) a 25ºC y
la mezcla resultante se enfrió entonces a 0ºC en 1 hora
aproximadamente. El tratamiento con bicarbonato sódico resultó ser
eficaz para eliminar la dicetona residual sin reaccionar de la
mezcla de reacción. La suspensión se agitó a 0ºC durante 2 horas
para completar la precipitación y cristalización, tras lo cual el
producto sólido,
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona se recuperó por filtración y la
torta de filtración se lavó con agua (100 ml). El producto se secó
a 80-90ºC bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio
hasta peso constante. El contenido en agua después de secar fue
menor de 0,25% en peso. El rendimiento molar ajustado fue de
alrededor de 77-80% en peso.
Esquema 1: Etapa 3A: Método
D
La dicetona preparada según el ejemplo 31 (1
equivalente) se hizo reaccionar con metóxido sódico (4,8
equivalentes) en metanol disolvente en presencia de yoduro de zinc
(1 equivalente). El tratamiento del producto de reacción se puede
realizar de acuerdo con el proceso de extracción aquí descrito, o
bien mediante un proceso no extractivo en donde se eliminan las
extracciones con cloruro de metileno, los lavados con salmuera y
cáustico y el secado con sulfato sódico. Igualmente, en el proceso
no extractivo, el tolueno fue sustituido por una solución al 5% en
peso de bicarbonato sódico. Como producto se aisló
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
C
El hidroxiéster preparado como en el ejemplo 34
(1,97 g) se combinó con tetrahidrofurano (20 ml) y la mezcla
resultante se enfrió a -70ºC. Se añadió cloruro de sulfurilo (0,8
ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos, tras lo cual se añadió
imidazol (1,3 g). La mezcla de reacción se calentó a temperatura
ambiente y se agitó durante 2 horas más. La mezcla fue diluida
entonces con cloruro de metileno y extraída con agua. La capa
orgánica se concentró para dar producto en bruto,
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona (1,97 g). Se analizó una pequeña
muestra del producto en bruto por HPLC. El análisis mostró que la
relación de
9,11-olefina:11,12-olefina:7,9-lactona
fue de 75,5:7,2:17,3. Cuando se realizó a 0ºC, pero por otro lado
en la forma antes descrita, la reacción proporcionó un producto en
donde la distribución de
9,11-olefina:11,12-olefina:7,9-lactona
era de 77,6:6,7:15,7. Este procedimiento combina en una sola etapa
la introducción de un grupo saliente y la eliminación del mismo para
la introducción de la estructura 9,11-olefina del
enéster, es decir, la reacción con cloruro de sulfurilo causa el
reemplazamiento del grupo 11\alpha-hidroxi del
hidroxiéster de fórmula V por haluro y esto viene seguido por la
deshidrohalogenación a la estructura \Delta^{9,11}. Por tanto,
la formación del enéster se efectúa sin el uso de un ácido fuerte
(tal como fórmico) o de un agente de secado tal como anhídrido
acético. También se elimina la etapa de reflujo del proceso
alternativo que genera monóxido de carbono.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
D
El hidroxiéster (20 g) preparado como en el
ejemplo 34 y cloruro de metileno (400 ml) se añadieron a un matraz
de fondo redondo y de tres cuellos, limpio, seco, equipado con
agitador mecánico, embudo de adición y termopar. La mezcla
resultante se agitó a temperatura ambiente hasta obtener la solución
completa. La solución se enfrió a 5ºC usando un baño de hielo. Se
añadió cloruro de metanosulfonilo (5 ml) a la solución de
CH_{2}Cl_{2} que contiene el hidroxiéster, seguido rápidamente
por la adición lenta gota a gota de trietilamina (10,8 ml). La
velocidad de adición se ajustó de modo que la temperatura de la
reacción no excediera de 5ºC. La reacción fue muy exotérmica y, por
tanto, fue necesario enfriarla. La mezcla de reacción se agitó a 5ºC
aproximadamente durante 1 hora. Terminada la reacción (análisis
HPLC y TLC), la mezcla se concentró a 0ºC aproximadamente bajo un
vacío de 26 pulgadas de mercurio hasta que se convirtió en una
suspensión espesa. La suspensión resultante fue diluida con
CH_{2}Cl_{2} (160 ml) y la mezcla se concentró a 0ºC
aproximadamente bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio para
obtener un concentrado. La pureza del concentrado (producto mesilato
de fórmula IV en donde R^{2}=H y -A-A- y
-B-B- son ambos -CH_{2}-CH_{2}-,
es decir,
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona a
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-11\alpha-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona resultó ser de 82% (porcentaje
área HPLC). Este material se utilizó en la siguiente reacción sin
aislamiento.
A un reactor limpio y seco, equipado con
agitador mecánico, condensador, termopar y manto de calentamiento,
se añadieron formato potásico (4,7 g), ácido fórmico (16 ml) y
anhídrido acético (8 ml, 0,084 mol). La solución resultante se
calentó a 70ºC y se agitó durante alrededor de 4-8
horas. La adición de anhídrido acético es exotérmica y se generó
gas (CO), de modo que la velocidad de adición tuvo que ser ajustada
para controlar tanto la temperatura como la generación de gas
(presión). El tiempo de reacción para preparar el reactivo de
eliminación activo dependió de la cantidad de agua presente en la
reacción (el ácido fórmico y el formato potásico contenían cada uno
de ellos alrededor de 3-5% de agua). La reacción de
eliminación es sensible a la cantidad de agua presente; si existe
>0,1% de agua (KF), puede aumentar el nivel de la impureza de
7,9-lactona. Este subproducto es difícil de separar
del producto final. Cuando la KF mostró menos de 0,1% de agua, el
agente de eliminación activo fue transferido al concentrado de
mesilato (0,07 moles) preparado en la etapa anterior. La solución
resultante se calentó a 95ºC y el material volátil se separó por
destilación y se recogió en una trampa Dean Stark. Cuando cesó el
desprendimiento de material volátil, la trampa Dean Stark fue
reemplazada por el condensador y la mezcla de reacción se calentó
durante 1 hora más a 95ºC. Terminada la reacción (análisis TLC y
HPLC; menos de 0,1% de material de partida), el contenido se enfrió
a 50ºC y se inició la destilación en vacío (26'' Hg/50ºC). La
mezcla se concentró a una suspensión espesa y luego se enfrió a
temperatura ambiente. La suspensión resultante fue diluida con
acetato de etilo (137 ml) y la solución se agitó durante 15 minutos
y se diluyó con agua (137 ml). Las capas se separaron y la capa
acuosa inferior se volvió a extraer con acetato de etilo (70 ml).
La solución de acetato de etilo combinada se lavó una vez con
solución de salmuera (120 ml) y dos veces con solución de 1 N NaOH
enfriada con hielo (120 ml cada vez). El pH de la capa acuosa se
midió y la capa orgánica se volvió a lavar en el caso de que el pH
del licor del lavado agotado fuese menor de 8. Cuando el pH del
lavado agotado resultó ser mayor de 8, la capa de acetato de etilo
se lavó una vez con solución de salmuera (120 ml) y se concentró
hasta sequedad mediante evaporación rotativa usando un baño de agua
a 50ºC. El enéster resultante, producto sólido, es decir,
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona pesó 92 g (rendimiento 77
moles%).
A un matraz de fondo redondo y de tres cuellos,
limpio, seco, 250 ml de capacidad, equipado con agitador mecánico,
embudo de adición y termopar, se añadieron 25 g (53,12 mmol) del
hidroxiéster
metil-hidrógeno-11\alpha,17\alpha-dihidroxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, preparado como en el ejemplo 34,
seguido por 150 ml de cloruro de metileno (Burdick & Johnson).
La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente hasta que se
obtuvo una suspensión ligera. La solución se enfrió a -5ºC usando
un baño de hielo. A la solución de cloruro de metileno que contiene
el hidroxiéster se añadió cloruro de metanosulfonilo (7,92 g, 69,06
mmol) (Aldrich), seguido rápidamente por la adición lenta gota a
gota de trietilamina (7,53 g) (Aldrich). La velocidad de adición se
ajustó de modo que la temperatura de la reacción no excediera de
0ºC. La reacción fue muy exotérmica; por tanto, se necesitó
enfriamiento. El tiempo de adición fue de 35 minutos. La mezcla de
reacción se agitó a 0ºC aproximadamente durante 45 minutos más.
Cuando se terminó la reacción (permanecía menos de 1% del
hidroxiéster según análisis HPLC y TLC), la mezcla se concentró
destilando alrededor de 110 a 125 ml del cloruro de metileno
disolvente a presión atmosférica. La temperatura del reactor
alcanzó un valor de 40-45ºC aproximadamente durante
la destilación. Cuando la reacción no se termina después de 45
minutos más, puede cargar en el reactor 0,1 equivalentes más de
cloruro de metanosulfonilo y 0,1 equivalentes más de trietilamina y
la mezcla de reacción se comprueba respecto a su término. La mezcla
resultante contenía el producto en bruto
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-11\alpha-(metilsulfonil)oxi-3-oxopregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. Este material se utilizó en la
siguiente reacción sin aislamiento.
A un segundo reactor limpio y seco de 250 ml,
equipado con agitador mecánico, condensador, termopar y manto de
calentamiento, se añadieron acetato sódico anhidro (8,7 g)
(Mallinkrodt), ácido acético glacial (42,5 ml) (Fisher) y anhídrido
acético (0,5 ml) (Fisher). La solución resultante se calentó a 90ºC
y se agitó durante alrededor de 30 minutos. La adición de anhídrido
acético es exotérmica, de modo que la velocidad de adición tuvo que
ajustarse para controlar tanto la temperatura como la presión. Se
añadió anhídrido acético para reducir el contenido en agua de la
solución a un nivel aceptable (menos de alrededor de 0,1%). Cuando
la KF mostró menos de 0,1% de agua, la solución de ácido acético
fue transferida al concentrado de mesilato preparado como se ha
indicado en el primer párrafo de este ejemplo. La temperatura de la
mezcla resultante fue de 55 a 60ºC aproximadamente después de la
transferencia. Mediante el uso de ácido acético y acetato sódico en
lugar de ácido fórmico y formato potásico como en el ejemplo 36A,
se redujo la generación de gas.
La mezcla se calentó a 135ºC y se mantuvo a esa
temperatura durante alrededor de 60-90 minutos hasta
que cesó el desprendimiento de material volátil. El material
volátil destilado de la mezcla se recogió en una trampa Dean Stark.
Terminada la reacción (análisis TLC y HPLC; menos de 0,1% de
material de partida), se retiró la fuente de calor. Cuando la
temperatura de la mezcla alcanzó 80ºC, se añadieron lentamente a la
mezcla 150 ml de agua durante 60-90 minutos. Al
término de la adición de agua, la mezcla se había enfriado a una
temperatura de alrededor de 35-45ºC y comenzó a
formarse una suspensión. La mezcla se enfrió adicionalmente a 15ºC
y se mantuvo a esa temperatura durante 30-60 minutos
aproximadamente.
La mezcla se filtró a través de un embudo de
cristal. El filtrado se enjuagó con 100 ml de agua. El filtrado se
lavó entonces por segunda vez con 100 ml más de agua. El filtrado
resultante se secó a 70ºC bajo vacío para proporcionar 25 g del
enéster producto seco,
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. El análisis HPLC indicó 70% de la
9,11-olefina deseada, 15% de la
11,12-olefina y 5% de la
7,0-lactona.
Este método presentó las ventajas (con respecto
a procesos similares) de (i) reducir los volúmenes de disolvente,
(ii) reducir el número de etapas operativas separadas necesarias
para producir el enéster a partir del hidroxiéster, (iii) reducir
los lavados necesarios, (iv) reemplazar la extracción por la
precipitación en agua a la hora de aislar el producto final y (v)
eliminar problemas de seguridad anteriormente asociados con la
formación de anhídrido y generación de gas cuando se utiliza ácido
fórmico en lugar de ácido acético.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
E
El hidroxiéster (100 g; 0,22 mol) preparado como
en el ejemplo 34 se cargó en un matraz de fondo redondo y de tres
cuellos, capacidad 2 litros, equipado con agitador mecánico, embudo
de adición y termopar. Se utilizó un baño de enfriamiento en
circulación con control automático de la temperatura. El matraz se
secó antes de la reacción debido a la sensibilidad al agua del
cloruro de metanosulfonilo.
Se cargó cloruro de metileno (1 litro) en el
matraz y el hidroxiéster se disolvió en el mismo bajo agitación. La
solución se enfrió a 0ºC y se cargó en el matraz, por medio del
embudo de adición, cloruro de metanosulfonilo (25 ml; 0,32 mol). Se
cargó trietilamina (50 ml; 0,59 mol) en el reactor por medio del
embudo de adición y el embudo se enjuagó con más cloruro de
metileno (34 ml). La adición de la trietilamina fue altamente
exotérmica. El tiempo de adición fue de alrededor de 10 minutos
bajo agitación y enfriamiento. La mezcla de carga se enfrió a 0ºC y
se mantuvo a esa temperatura bajo agitación durante 45 minutos más,
en cuyo tiempo el espacio de cabeza del matraz de reacción se
inundó con nitrógeno. Se analizó entonces una muestra de la mezcla
de reacción por cromatografía de capa delgada y cromatografía
líquida de alta resolución para comprobar el término de la
reacción. La mezcla se agitó entonces a 0ºC durante 30 minutos más y
se verificó de nuevo respecto al término de la reacción. El
análisis mostró que la reacción se había terminado sustancialmente
en este momento; el cloruro de metileno disolvente se separó a 0ºC
bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio. El análisis por
cromatografía de gases del destilado indicó la presencia tanto de
cloruro de metanosulfonilo como de trietilamina. Se cargó entonces
cloruro de metileno (800 ml) en el reactor y la mezcla resultante se
agitó durante 5 minutos a una temperatura de
0-15ºC. El disolvente se separó de nuevo a
0-5ºC bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio para
proporcionar el mesilato de fórmula IV en donde R^{3} es H,
-A-A- y -B-B- son
-CH_{2}-CH_{2}- y R^{1} es metoxicarbonilo.
La pureza del producto fue de alrededor de 90-95% de
área.
Para preparar un reactivo de eliminación, en un
reactor seco separado, se mezclaron formato potásico (23,5 g; 0,28
mol), ácido fórmico (80 ml) y anhídrido acético (40 ml). Se
bombearon ácido fórmico y anhídrido acético al interior del reactor
y la temperatura se mantuvo en no más de 40ºC durante la adición del
anhídrido acético. La mezcla de reactivo de eliminación se calentó
a 70ºC para barrer el agua del sistema de reacción. Esta reacción
se continuó hasta que el contenido en agua fue menor de 0,3% en peso
medido por análisis Karl Fisher. La solución de reactivo de
eliminación fue transferida entonces al reactor que contiene la
solución concentrada de mesilato en bruto preparada como antes se
ha descrito. La mezcla resultante se calentó a una temperatura
máxima de 95ºC y se recogió destilado volátil hasta que no se generó
más destilado. La destilación cesó a 90ºC aproximadamente.
Terminada la destilación, la mezcla de reacción se agitó a 95ºC
durante 2 horas más y el término de la reacción se comprobó por
cromatografía de capa delgada. Terminada la reacción, el reactor se
enfrió a 50ºC y el ácido fórmico y el disolvente se separaron de la
mezcla de reacción bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio a 50ºC.
El concentrado se enfrió a temperatura ambiente y luego se introdujo
acetato de etilo (688 ml) y la mezcla de acetato de etilo y
concentrado se agitó durante 15 minutos. En este momento, se
introdujo una solución de salmuera al 12% (688 ml) para ayudar a
separar las impurezas solubles en agua de la fase orgánica. Las
fases se dejaron entonces sedimentar durante 20 minutos. La capa
acuosa fue transferida a otro recipiente al cual se añadió una
cantidad adicional de acetato de etilo (350 ml). Esta
re-extracción de la capa acuosa se efectuó durante
30 minutos, tras lo cual se dejaron sedimentar las fases y se
combinaron las capas de acetato de etilo. A las capas combinadas de
acetato de etilo, se añadió solución saturada de cloruro sódico
(600 ml) y se agitó durante 30 minutos. Se dejaron sedimentar las
fases. Se separó la capa acuosa. Se realizó un lavado adicional con
cloruro sódico (600 ml). La fase orgánica se separó del segundo
licor de lavado agotado. La fase orgánica se lavó entonces con
hidróxido sódico 1 N (600 ml) bajo agitación durante 30 minutos.
Las fases se dejaron sedimentar durante 30 minutos para separar la
capa acuosa. El pH de la capa acuosa se comprobó y resultó ser de
>7. Se efectuó otro lavado con solución saturada de cloruro
sódico (600 ml) durante 15 minutos. La fase orgánica se concentró
finalmente bajo un vacío de 26 pulgadas de mercurio a 50ºC y el
producto se recuperó por filtración. El producto final consistía en
un sólido marrón espumoso cuando se secó. El secado adicional a
45ºC bajo presión reducida durante 24 horas proporcionó 95,4 g del
enéster producto
metil-hidrógeno-17\alpha-hidroxi-3-oxopregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona con un análisis de 68,8%. El
rendimiento molar fue de 74,4% corregido tanto respecto al
hidroxiéster de partida como respecto al enéster final.
Se cargó un matraz de reacción con 5,5 g del
mesilato preparado como en el ejemplo 23, 55 ml de ácido fórmico al
94,3% y 1,38 g de formato potásico. La mezcla se calentó y agitó a
reflujo (104ºC) durante 2 horas. Al término del periodo de 2 horas,
el ácido fórmico se destiló bajo presión reducida. El residuo se
disolvió en acetato de etilo y se lavó con carbonato potásico al
10% (50 ml). La porción acuosa recuperada era de color amarillo. El
acetato de etilo se lavó con hidróxido sódico al 5% (50 ml). Las
porciones acuosas fueron combinadas y acidificadas con ácido
clorhídrico diluido y el material insoluble se extrajo con acetato
de etilo. El acetato de etilo se evaporó hasta sequedad bajo
presión reducida para proporcionar 1 g de un residuo,
7-metil-hidrógeno-17-metil-3-oxo-18-norpregna-4,9(11),13-trieno-7\alpha,21-dicarboxilato.
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,5 (s, 3H), 1,4
(s, 3H), 3,53 (s, 3H), 5,72 (m, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 25,1 y 25,4 (18
CH_{3} y 19 CH_{3}), 40,9 (10 C), 48,5 (17 C), 51,4
(OCH_{3}), 118,4 (11 CH), 125,4 (4 CH), 132,4 (9 C), 138,5 y
139,7 (13 C y 14 C), 168,2 (5 C), 172,4 (7 CO), 179,6 (22 CO),
198,9 (3 CO).
Un matraz de reacción se cargó con 5,5 g del
mesilato preparado como en el ejemplo 23, 55 ml de ácido fórmico al
94,3% y 1,38 g de formato potásico. La mezcla se calentó y agitó a
reflujo (104ºC) durante 2 horas. Al término del periodo de 2 horas,
el ácido fórmico se destiló bajo presión reducida. El residuo se
disolvió en acetato de etilo y se lavó con carbonato potásico al
10% (50 ml). La porción acuosa recuperada era de color amarillo. El
acetato de etilo se lavó con hidróxido sódico al 5% (50 ml). El
acetato de etilo se evaporó hasta sequedad bajo presión reducida
para proporcionar 3,7 g de un residuo. Una porción de 3,4 g del
residuo se cromatografió sobre 267 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu). El producto se recuperó con un
programa de elución de acetato de etilo y tolueno 37:63 (v/v).
Después del secado de este producto, se obtuvieron 0,0698 g de un
residuo,
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-11-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
^{1}H NNR (CDCl_{3}) ppm 1,03 (s, 3H), 1,22
(s, 3H), 3,70 (s, 3H), 5,60 (d, 1H, J10) 5,98 (d, 1H, J10).
MIR cm^{-1} 2229 (CN) , 1768 (1actona) , 1710
(éster).
El ácido
9\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxílico,
bis(\gamma-lactona) es un subproducto de
la eliminación de 11-mesilato. Se aisló una muestra
pura de la mezcla de reacción del ejemplo 37A por cromatografía
líquida preparativa seguido por HPLC preparativa en fase inversa. De
este modo, se cromatografió un residuo de 73 g sobre 2,41 kg de gel
de sílice Merck (40-63 \mu) con un programa de
elución en gradiente de acetato de etilo y tolueno (20:80, 30:70;
40:60; 60:40, v/v). En las fracciones 60:40 se obtuvo una mezcla
enriquecida (10,5 g) de la enamina y 7,9-lactona. El
progreso de la purificación fue observado mediante TLC sobre placas
EMF con un eluyente de acetato de etilo/tolueno 60:40 (v/v) y
visualización por medio de ácido sulfúrico, SWUV. Una porción (10,4
g) de la mezcla fue purificada adicionalmente por HPLC de fase
inversa sobre Kromasil C8 (7 \mu) y una fase móvil de agua y
acetonitrilo 30:70 (v/v) milliQ. La 7,9-lactona
(2,27 g) fue aislada como cristales a partir de la fase móvil.
MIR cm^{-1} 1762 (7,9-lactona
y 17-lactona), 1677, 1622
(3-ceto-\Delta^{4,5})
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1.00 (s, 3H), 1.4
(s, 3H),2.05 (d, 1H), 2.78 (d, 1H), 5.87 (s, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 13,2, 19,0, 22,2,
23,2, 26,8, 28,8, 29,5, 30,8, 33,1, 34,4, 35,1, 42,5, 43,6, 43,9,
45,0, 45,3, 89,9, 94,7, 129,1, 161,5, 176,0, 176,4, 196,9.
Teoría C, 71,85 y H, 7,34; Encontrado C, 71,68 y
H, 7,30.
El compuesto
7-metil-hidrógeno-5\beta-ciano-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-11-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona fue aislado después de una
múltiple cromatografía líquida preparativa sobre la mezcla de
reacción obtenida después de la eliminación del grupo
11-mesiloxi (ejemplo 24). Formaba parte de un racimo
de impurezas menos polares tal como se observó por medio de TLC
sobre placas EMF con un sistema de elución con acetato de etilo y
cloruro de metileno 30:70 (v/v) y visualización por medio de ácido
sulfúrico. SWUV. En general, estas impurezas menos polares se
separaron de la enamina en bruto por medio de cromatografía líquida
preparativa. Concretamente, se cromatografiaron 9,6 g de la solución
de la enamina en bruto sobre 534 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu) usando un programa de elución en
gradiente con acetato de etilo y tolueno (20:80, 30:70, 40:60,
60:40, v/v). Las impurezas menos polares se concentraron en las
fracciones 30:70. De este modo, se recogió un depósito de 12,5 g de
las impurezas menos polares. Este material fue cromatografiado
adicionalmente sobre 550 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu) usando un programa de elución en
gradiente con acetato de etilo y cloruro de metileno (5:95, 10:90,
20:80, 30:70, v/v). Una porción enriquecida de las fracciones 20:80
proporcionó 1,2 g de residuo. La cromatografía adicional de los 1,2
g de residuo sobre 53 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu) usando un gradiente de acetona y
cloruro de metileno (3:97, 6:94, 10:90, 15:85, v/v) proporcionó
0,27 g de
7-metil-hidrógeno-5-ciano-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-11-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona a partir de una porción
enriquecida de las fracciones 10:90.
MS M+425, calculado para
C_{25}H_{31}NO_{5} (425,52).
MIR 2222 cm^{-1} (nitrilo), 1767 cm^{-1}
(lactona) 1727 cm^{-1} (éster y 3-cetona).
^{1}H NNR (CDCl_{3}) ppm 0.92 (s, 3H), 1.47
(s,3H), 2.95 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 5.90 (m, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 14.0 (18
CH_{3}), 23.5 (15 CH_{2}), 27.0 (19 CH_{3}), 37.8, 38.5 y 40.9
(7, 8 y 14 CH), 52.0 (OCH_{3}), 95.0 (17 C), 121.5 (23 CN), 123.5
(11 CH), 135.3 (9 C), 174.2 y 176.2 (22 y 24 CO), 206 (3 CO).
El hidroxiéster (2 g, 4,8 mmoles) preparado como
en el ejemplo 34 se añadió a 40 ml de cloruro de metileno en un
matraz de fondo redondo y tres cuellos limpio, seco, equipado con un
agitador mecánico. A la solución se añadieron entonces trietilamina
(0,61 g, 6,10 mmoles) y anhídrido trifluoracético (1,47 g, 7
mmoles). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la
noche.
La mezcla fue entonces diluida con 40 ml más de
cloruro de metileno. La mezcla se lavó luego sucesivamente con 40
ml de agua, 40 ml de 1 N HCl y 40 ml de solución de NaOH 1 M. La
solución resultante se secó entonces sobre sulfato de magnesio y se
concentró hasta sequedad para proporcionar 3,2 g de un sólido de
color marrón claro,
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-11\alpha-(2,2,2-trifluor-1-oxoetoxi)-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato.
El residuo fue analizado y purificado
adicionalmente por cromatografía. Condiciones HPLC:
columna-Waters Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.,
tamaño de partícula 5 micrómetros); temperatura columna -ambiente;
fase móvil-acetonitrilo/agua, 30/70 en volumen;
velocidad de flujo-1 ml/min; volumen de
inyección-20 microlitros; concentración de
muestra-1 mg/ml; detección-UV a 210
nm; presión-1.500 psi; y tiempo de
pasada-45 minutos. Condiciones TLC:
absorbente-gel de sílice Merck 60 F_{254}; sistema
disolvente-acetato de etilo/tolueno, 65/35 en
volumen; técnica de visualización-shortwave; y
cantidad de aplicación-100 microgramos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El hidroxiéster (2,86 g, 6,87 mmoles) preparado
como en el ejemplo 34 se añadió a 15 ml de cloruro de metileno en
un matraz de fondo redondo y de tres cuellos, limpio, seco, equipado
con agitador mecánico. A la solución se añadieron entonces
trietilamina (1,39 g, 13,7 mmoles), dimetilaminopiridina (0,08 g,
0,6 mmoles) y anhídrido acético (1,05 g, 10,3 mmoles). Esta mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
La mezcla fue diluida luego con 150 ml de
acetato de etilo y 25 ml de agua. Esta solución de acetato de etilo
se lavó entonces con 25 ml de solución de ácido cítrico. La solución
se secó entonces sobre sulfato de magnesio y se concentró hasta
sequedad para proporcionar 3,33 g de un sólido de color marrón
claro,
7-metil-hidrógeno-11\alpha-(acetiloxi)-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
El residuo fue analizado y purificado
adicionalmente por cromatografía. Condiciones HPLC:
columna-Waters Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.,
tamaño de partícula 5 micrómetros); temperatura columna -ambiente;
fase móvil-acetonitrilo/agua, 30/70 en volumen;
velocidad de flujo-1 ml/min; volumen de
inyección-20 microlitros; concentración de
muestra-1 mg/ml; detección-UV a 210
nm; presión-1.500 psi; y tiempo de
pasada-45 minutos. Condiciones TLC:
absorbente-gel de sílice Merck 60 F_{254}; sistema
disolvente-cloruro de metileno/metanol, 95/5 en
volumen; técnica de visualización-shortwave; y
cantidad de aplicación-100 microgramos.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
F
\vskip1.000000\baselineskip
A un reactor limpio y seco de 250 ml, equipado
con agitador mecánico, condensador, termopar y manto de
calentamiento, se añadieron formato potásico (1,5 g, 0,018 mol),
ácido fórmico (60 ml, 1,6 mol) y anhídrido acético (29,5 ml, 0,31
mol). La solución se agitó entonces a 70ºC durante 4 horas y se
enfrió a temperatura ambiente para proporcionar un reactivo de
eliminación útil en la conversión del mesilato de fórmula IV al
producto de este ejemplo.
El reactivo de eliminación preformado de
TFA/anhídrido TFA se añadió a 70 g (0,142 mol) del mesilato
preparado como en el ejemplo 23. La mezcla resultante se calentó a
95-105ºC durante 2,5 horas. El grado de conversión
se verificó periódicamente mediante TLC o HPLC. El residuo
resultante se enfrió a 50ºC, se diluyó con agua de hielo (1,4
litros) y se agitó durante 1 hora. La mezcla se dejó en reposo
durante la noche a temperatura ambiente. Las capas se separaron y
la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (75 ml). La
solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente con una mezcla
de agua/salmuera (70 ml), con otra mezcla de agua/salmuera (60 ml),
con hidróxido sódico 1 M (60 ml) y con una tercera mezcla de
agua/salmuera (60 ml). La concentración de salmuera fue de 12% en
peso. La solución de acetato de etilo se secó entonces sobre sulfato
sódico, se filtró y se concentró hasta sequedad por evaporación
rotativa para proporcionar 4,5 g de una mezcla tanto del producto
deseado como de una impureza desconocida. La relación de
impureza/producto según el área HPLC fue de alrededor de 50/15
respectivamente. El producto principal de esta reacción fue la
impureza identificada como
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
La mezcla fue purificada por cromatografía en
columna para dar 1,9 g de
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, producto analíticamente puro.
El residuo fue analizado y purificado
adicionalmente por cromatografía. Condiciones HPLC:
columna-Waters Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.,
tamaño de partícula 5 micrómetros); temperatura columna -ambiente;
fase móvil-acetonitrilo/agua, 30/70 en volumen;
velocidad de flujo-1 ml/min; volumen de
inyección-20 microlitros; concentración de
muestra-1 mg/ml; detección-UV a 210
nm; presión-1.500 psi; y tiempo de
pasada-45 minutos. Condiciones TLC:
absorbente-gel de sílice Merck 60 F_{254}; sistema
disolvente-cloroformo/metil-t-butiléter/isopropanol,
70/28/2 en volumen; técnica de visualización-50% en
volumen H_{2}SO_{4} acuoso/LWUV y 50% en volumen
H_{2}SO_{4}/ácido fosfomolíbdico; y cantidad de
aplicación-100 microgramos.
Se preparó un reactivo de Jones disolviendo 6,7
g de anhídrido crómico (CrO_{3}) en 6 ml de ácido sulfúrico
concentrado y diluyendo cuidadosamente dicha mezcla con agua
destilada a 50 ml. Es suficiente 1 ml de este reactivo para oxidar
2 mmol de un alcohol secundario a una cetona.
El hidroxiéster (10 g, 24 mmoles) preparado como
en el ejemplo 34 se disolvió/suspendió en 1.200 ml de acetona. A
esta mezcla se añadieron 8,992 ml del reactivo de Jones y la mezcla
combinada se agitó durante 10 minutos. Una parte alícuota de la
mezcla de reacción, después de tratarse con agua y extraerse con
cloruro de metileno, fue analizada por HPLC (columna: Beckman
Ultrasphere ODS C18, 4,6 mm x 250 mm, 5 micrómetros; gradiente de
disolvente: acetonitrilo/agua = 1/99 a 100/0 en 20 minutos a una
velocidad de flujo de 1,5 ml/min; detector: UV 210 nm). La reacción
se completo como se puso de manifiesto por la ausencia de cualquier
cantidad importante del material de partida en la mezcla de
reacción. El tiempo de retención HPLC para el material de partida
(hidroxiéster) es de 13,37 minutos y para la cetona producto fue de
14,56 minutos.
La mezcla de reacción se trató por adición de
200 ml de agua y 300 ml de cloruro de metileno. La capa orgánica se
separó de la capa acuosa y se lavó de nuevo con 200 ml de agua. La
capa orgánica se separó de la capa acuosa y se secó sobre sulfato
de magnesio. El disolvente se evaporó para proporcionar 9,52 g de un
sólido blanquecino (rendimiento 95,6% en bruto) de
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3,11-dioxo-17\alpha-pregn-4-eno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
La asignación de la estructura estuvo basada en
el espectro de masas (m/e 414), HMNR (DMF-d7) y CNMR
(DMF-d7). En MNR, estaba ausente el pico
característico del 11-H (4,51 ppm, doblete, j=5,8
Hz) encontrado en el hidroxiéster. En CNMR, apareció un pico en
208,97 ppm como cabía esperar para el carbono
11-ceto.
CNMR (400 MHz, DMF-d7) 208,97
(11-ceto), 197,70 (3-ceto) 176,00
(22-lactona), 173,34 (7-COOMe),
167,21 (C5), 125,33 (C4), 93,63 (C17), y otros picos en la región
de 15 a 57 ppm.
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Una solución de 3,5 g (8,4 mmoles) del
hidroxiéster preparado como en el ejemplo 34 en 42 ml de metanol se
mezcló con 4 ml de hidróxido potásico metanólico 4 N (8 mmoles). La
suspensión se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se
calentó a reflujo durante 1 hora. El metanol se evaporó bajo vacío y
el residuo se mezcló con 50 ml de acetato de etilo. El acetato de
etilo se evaporó bajo vacío y el resido fue digerido con 50 ml de
acetato de etilo. El sólido seco se combinó con 50 ml de acetona y 2
ml de yoduro de metilo (32,1 mmoles). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 18 horas. Durante este tiempo se
disolvió la mayor parte de los sólidos. La mezcla se filtró y el
filtrado se evaporó hasta sequedad bajo vacío. El residuo fue
digerido con acetato de etilo, tras lo cual se separaron los
sólidos por filtración y el disolvente se separó por destilación en
vacío. Se determinó que el resido consistía en una mezcla 78:22
(v/v) de
dimetil-11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona y del material de partida de
hidroxiéster por medio de H^{1} NMR. Esta mezcla resultó ser
adecuada para utilizarse como un marcador HPLC sin purificación
adicional.
La ^{1}H NMR (CDCl_{3}) indicó las
siguientes características: ppm 0,93 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 3,64 (s,
3H), 3,69 (s, 3H).
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A 11,86 g (28,5 mmol) del hidroxiéster preparado
como en el ejemplo 34 se añadieron 50 ml de metanol y 20 ml de 2,5
M NaOH. La suspensión se calentó a reflujo. Después de 25 minutos,
una porción del éster de partida permaneció sin reaccionar tal como
se verificó por HPLC (Zorbax SB-C8 150 x 4,6 mm, 2
ml/min., gradiente lineal 35:65 A:B a 45:55 A:B durante 15 min., A
= acetonitrilo/metanol 1:1, B = agua/0,1% ácido trifluoracético,
detección a 210 nm) y se añadieron 10 ml de 10 M NaOH. Después de
1,5 horas, permanecía sin reaccionar una traza del éster tal como
se comprobó por HPLC. La mezcla de reacción se dejó en reposo a 25º
aproximadamente durante 64 horas.
La mezcla fue diluida con 100 ml de agua y luego
se acidificó fuertemente con 20 ml de HCl concentrado. El
precipitado gomoso resultante se agitó hasta que el precipitado se
convirtió en una suspensión. El sólido fue aislado por filtración,
resuspendido en metanol y filtrado para dar 3,75 g de un sólido
marrón. El material se disolvió en 8 ml de DMF caliente y la mezcla
se diluyó con 40 ml de metanol. El ácido cristalizó y se aisló por
filtración para dar 1,7 g de un sólido blanco esponjoso,
11\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
^{1}H NMR (400 MHz, deuterodimetilsulfóxido) d
0,80 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 1,2-2,7 (m, 20H), 3,8
(brs, 1H), 4,45 (m, 1H), 5,50 (s, 1H). No se observó el protón
carboxilo debido a la presencia de un pico HOD en 3,4 ppm.
\newpage
Esquema 1: Etapa 3C: Método
G
Se repitió el procedimiento del ejemplo 37A
excepto que se evitaron las múltiples etapas de lavado por
tratamiento de la solución de reacción con una resina de
intercambio iónico, alúmina básica o sílice básica. Las condiciones
para el tratamiento con alúmina básica o sílice básica se indican en
la Tabla 38. Cada uno de estos tratamientos resultó ser eficaz para
la separación de impurezas sin los múltiples lavados del ejemplo 44,
para producir
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
H
En un reactor de 100 ml se mezclaron acetato
potásico (4 g) y ácido trifluoracético (42,5 ml). A la mezcla se
añadió anhídrido trifluoracético (9,5 ml) a una velocidad controlada
para mantener la temperatura durante la adición por debajo de 30ºC.
La solución se calentó entonces a 30ºC durante 30 minutos para
proporcionar un reactivo de eliminación útil en la conversión del
mesilato de fórmula IV al enéster de fórmula II.
El reactivo de eliminación preformado de
TFA/anhídrido TFA se añadió a una solución del mesilato de fórmula
IV previamente preparado como en el ejemplo 37A. La mezcla
resultante se calentó a 40ºC durante 4 horas y media, comprobándose
periódicamente el grado de conversión mediante TLC o HPLC. Terminada
la reacción, la mezcla fue transferida a un matraz de un cuello y
se concentró hasta sequedad bajo presión reducida a temperatura
ambiente (22ºC). Se añadió acetato de etilo (137 ml) a la mezcla
para obtener la disolución completa de material en fase sólida,
tras lo cual se añadió una mezcla de agua/salmuera (137 ml) y la
mezcla bifásica resultante se agitó durante 10 minutos. Se permitió
entonces la separación de las fases durante 20 minutos. La
concentración de salmuera fue de 24% en peso. La fase acuosa se
puso en contacto con una cantidad adicional de acetato de etilo (68
ml) y la mezcla bifásica así preparada se agitó durante 10 minutos,
tras lo cual se dejó en reposo durante 15 minutos para la
separación de las fases. Las capas de acetato de etilo de las dos
extracciones se combinaron y lavaron con 24% en peso de salmuera
(120 ml), con otra parte alícuota de salmuera al 24% en peso (60
ml), con solución de hidróxido sódico 1 N (150 ml) y con otra
porción de salmuera (60 ml). Después de cada adición a la fase
acuosa, la mezcla se agitó durante 10 minutos y se dejó en reposo
durante 15 minutos para efectuar la separación. La solución
resultante se concentró hasta sequedad bajo presión reducida a 45º
C empleando un aspirador de agua. El producto sólido (8,09 g) fue
analizado por HPLC y se comprobó que incluía 83,4% de área del
enéster
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona; 2,45% de área de la
11,12-olefina; 1,5% de la
7,9-lactona; y 1,1% de mesilato sin reaccionar.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
I
El mesilato que tiene la estructura preparada
según el ejemplo 23 (1 g), acetato de isopropenilo (10 g) y ácido
p-toluenosulfónico (5 mg) se colocaron en un matraz
de 50 ml y se calentó a 90ºC con agitación. Después de 5 horas, la
mezcla se enfrió a 25ºC y se concentró bajo vacío a 10 mm de Hg. El
residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y se lavó con
NaHCO_{3} acuoso al 5%. La capa de CH_{2}Cl_{2} se concentró
bajo vacío para dar 1,47 g de un aceite de color canela. Este
material se recristalizó en CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O para dar
0,50 g del enol acetato de fórmula IV (Z).
Este material se añadió a una mezcla de acetato
sódico (0,12 g) y ácido acético (2 ml) que había sido calentada
previamente a 100ºC con agitación. Después de 60 minutos, la mezcla
se enfrió a 25ºC y se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (20 ml). La
solución se lavó con agua (20 ml) y se secó sobre sulfato de
magnesio. El agente de secado fue separado por filtración y el
filtrado se concentró bajo vacío para dar 0,4 g de la
9,11-olefina deseada,
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. El producto en bruto contenía
menos de 2% de la impureza de 7,9-lactona.
Esquema 1: Etapa 3C: Método
J
Una mezcla de 2 g de mesilato y 5 ml de DMSO en
un matraz se calentó a 80ºC durante 22,4 horas. El análisis HPLC de
la mezcla de reacción indicó que no se detectó material de partida.
A la mezcla de reacción se añadió agua (10 ml) y el precipitado se
extrajo con cloruro de metileno tres veces. Las capas de cloruro de
metileno combinadas se lavaron con agua, tras lo cual se secó sobre
sulfato de magnesio y se concentró para dar el enéster
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
B
En un matraz en forma de pera de 50 ml, con
agitación, se mezclaron con cloruro de metileno (15 ml) el enéster
de fórmula IIA (1,07 g, 74,4% de enéster según análisis),
tricloroacetamida (0,32 g), hidrogenofosfato dipotásico (0,70 g)
como un sólido. Por medio de una pipeta se añadió, durante 1 minuto,
peróxido de hidrógeno (30% en peso; 5 ml). La mezcla resultante se
agitó durante 6 horas a temperatura ambiente en cuyo momento el
análisis HPLC reveló que la relación de epoximexrenona a enéster en
la mezcla de reacción era de alrededor de 1:1. Se añadió más
tricloroacetamida (0,32 g) a la mezcla de reacción y la reacción se
continuó bajo agitación durante 8 horas más tras lo cual se
demostró que la restante proporción de enéster se había reducido a
10%. Se añadió más tricloroacetamida (0,08 g) y la mezcla de
reacción se dejó en reposo durante la noche tras lo cual solo el 5%
del enéster sin reaccionar, respecto a la epoximexrenona, permaneció
en la mezcla.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
C
El enéster de fórmula IIA (5,4 g, 74,4% según
análisis) se añadió a un reactor de 100 ml. Al enéster se añadieron
tricloroacetamida (4,9 g) e hidrogenofosfato dipotásico (3,5 g),
ambos compuestos en forma sólida, seguido por cloruro de metileno
(50 ml). La mezcla se enfrió a 15ºC y se añadió peróxido de
hidrógeno al 30% (25 g) durante 10 minutos. Se dejó que la mezcla
de reacción llegara a 20ºC y se agitó a esa temperatura durante 6
horas, en cuyo momento la conversión fue comprobada por HPLC. Se
determinó que el resto del enéster constituía menos de 1% en
peso.
La mezcla de reacción se añadió a agua (100 ml),
se dejaron separar las fases y se separó la capa de cloruro de
metileno. Se añadió hidróxido sódico (0,5 N; 50 ml) a la capa de
cloruro de metileno. Después de 20 minutos, se dejaron separar las
fases, se añadió HCl (0,5 N; 50 ml) a la capa de cloruro de
metileno, tras lo cual se dejaron separar las fases y la fase
orgánica se lavó con salmuera saturada (50 ml). La capa de cloruro
de metileno se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se separó el
disolvente. Se obtuvo un sólido blanco (5,7 g). La capa acuosa de
hidróxido sódico fue acidificada y extraída y el extracto se procesó
para proporcionar 0,2 g más de producto. El rendimiento en
epoximexrenona fue de 90,2%.
Esquema 1: Etapa
3D
El enéster de fórmula IIA se convirtió a
epoximexrenona del modo descrito en el ejemplo 43 con las siguientes
diferencias: la carga inicial comprendía el enéster (5,4 g, 74,4%
de enéster según análisis), tricloroacetamida (3,3 g) e
hidrogenofosfato dipotásico (3,5 g). Se añadió solución de peróxido
de hidrógeno (12,5 ml). La reacción se efectuó durante la noche a
20ºC tras lo cual la HPLC reveló una conversión del 90% del enéster
a epoximexrenona. Se añadió más tricloroacetamida (3,3 g) y
peróxido de hidrógeno al 30% (5 ml) y la reacción se efectuó durante
6 horas más, en cuyo momento el enéster residual fue solo de 2%
basado en la carga de enéster. Después del procesado como se ha
descrito en el ejemplo 43, se obtuvieron 5,71 g de
epoximexrenona.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
E
El enéster de fórmula IIA se convirtió a
epoximexrenona del modo descrito en general en el ejemplo 43. En la
reacción de este ejemplo, la carga de enéster fue de 5,4 g (74,4% de
enéster según análisis), la carga de tricloroacetamida fue de 4,9
g, la carga de peróxido de hidrógeno fue de 25 g y la carga de
hidrogenofosfato dipotásico fue de 3,5 g. La reacción se efectuó a
20ºC durante 18 horas. El enéster residual fue menor de 2%. Después
del procesado, se obtuvieron 5,71 g de epoximexrenona.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
F
El enéster de fórmula IIA se convirtió a
epoximexrenona del modo descrito en el ejemplo 43 excepto que la
temperatura de reacción en este ejemplo fue de 28ºC. Los materiales
cargados en el reactor incluían enéster (2,7 g), tricloroacetamida
(2,5 g), hidrogenofosfato dipotásico (1,7 g), peróxido de hidrógeno
(17 g) y cloruro de metileno (50 ml). Después de 4 horas de
reacción, el enéster sin reaccionar fue de solo 2% basado en la
carga de enéster. Después del procesado como se ha descrito en el
ejemplo 43, se obtuvieron 3 g de epoximexrenona.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
G
El enéster de fórmula IIA (40 g, 68,4% de
enéster según análisis) se cargó en un reactor encamisado de 1.000
ml y se disolvió en 175 ml de cloruro de metileno. La solución se
agitó a medida que se añadían, en forma de sólidos,
tricloroacetamida (22,3 g) e hidrogenofosfato dipotásico (6 g). La
mezcla se agitó a 400 rpm y la temperatura se ajustó a 27ºC con un
baño de temperatura constante para controlar el líquido de circula
a través de la camisa del reactor. Durante un periodo de
3-5 minutos se añadió peróxido de hidrógeno (72,8
ml, al 30% según análisis). Después de la adición de peróxido de
hidrógeno, la mezcla se agitó a 400 rpm y 27ºC. El análisis HPLC
indicó que la reacción se había completado en un 99% en el espacio
de 5 horas. Al término de 6 horas, se añadieron 72,8 ml de agua. El
peróxido de hidrógeno acuoso se separó y se extrajo de nuevo una
vez con 50 ml de cloruro de metileno. El cloruro de metileno
combinado se lavó con sulfito sódico al 6% (62,3 ml) para destruir
cualquier peróxido allí contenido. La separación de cloruro de
metileno se inició con destilación atmosférica y se terminó bajo
vacío. Se obtuvo un residuo amarillento (48,7 g, 55,4% según
análisis). Esto correspondía a un rendimiento molar ajustado de
94,8% según análisis.
Una porción (47,8 g) del residuo se combinó con
498 ml de etanol 3A (etanol al 95% desnaturalizado con metanol al
5%). La mezcla se calentó a reflujo y se separaron 249 ml de
destilado a presión atmosférica. La mezcla se enfrió a 25ºC y se
filtró. Se utilizó un enjuagado con etanol 3A (53 ml) para facilitar
la transferencia. El sólido seco pesaba 27,6 g (87% según análisis)
lo cual correspondía a una recuperación de 91%. Una porción del
sólido (27 g) se disolvió en 292 ml de metiletilcetona a reflujo. La
solución caliente se filtró a través de un lecho de solka floc
(celulosa en polvo) con otros 48,6 ml de metiletilcetona para
facilitar la transferencia. Por destilación atmosférica se separó
una porción de 146 ml de la metiletilcetona. La solución se enfrió a
50ºC y se agitó durante 1 hora a medida que cristalizaba el
producto. Después de 1 hora, la mezcla se enfrió a 25ºC. Se
continuó la agitación durante 1 hora y el sólido se filtró empleando
48,6 ml de metiletilcetona como enjuagado. El sólido se secó a un
peso constante de 20,5 g lo cual representaba una recuperación por
recristalización de 87,2%. El rendimiento de la reacción y las
recuperaciones de etanol y metiletilcetona proporcionaron un
rendimiento combinado total de 75%.
El licor madre de metiletilcetona resultó ser
adecuado para su reciclo con una solución de alimentación de
cloruro de metileno procedente de una reacción posterior. La mezcla
combinada de cloruro de metileno y metiletilcetona se evaporó hasta
sequedad con destilación atmosférica y bajo vacío. El residuo se
combinó con 19 volúmenes de etanol 3A basado en el contenido en
epoximexrenona. Se separó la mitad del disolvente por destilación
atmosférica. Después de enfriar a 25ºC, el sólido se filtró y se
secó. El sólido seco se disolvió en 12 volúmenes de metiletilcetona
a reflujo. La solución caliente se filtró a través de un lecho de
solka floc añadiéndose 2 volúmenes de metiletilcetona como
enjuagado. El filtrado se concentró por destilación atmosférica de 6
volúmenes de metiletilcetona. La solución se enfrió a 50ºC y se
agitó durante 1 hora a medida que cristalizaba el producto. Después
de 1 hora, la mezcla se enfrió a 25ºC. Se continuó la agitación
durante 1 hora y el sólido se filtró empleándose dos volúmenes de
metiletilcetona como enjuagado. El sólido se secó a un peso
constante. La incorporación del licor madre de metiletilcetona
elevó el rendimiento total a 80-85%.
Este método parece ser particularmente adecuado
para realizarse a mayor escala puesto que da lugar a una producción
máxima y reduce al mínimo los volúmenes de lavado y de residuo.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
H
El enéster de fórmula IIA (17 g, 72% de enéster
según análisis) se disolvió en cloruro de metileno (150 ml) tras lo
cual se añadió, bajo agitación lenta, tricloroacetamida (14,9 g). La
temperatura de la mezcla se ajustó a 25ºC y en la solución de
sustrato de enéster se agitó a 400 rpm una solución de
hidrogenofosfato dipotásico (10,6 g) en agua (10,6 ml). Se añadió
peróxido de hidrógeno (solución al 30% en peso; 69,4 ml) a la mezcla
de sustrato/fosfato/tricloroacetamida durante un periodo de
3-5 minutos. No se observó exotermia o
desprendimiento de oxígeno. La mezcla de reacción así preparada se
agitó a 400 rpm y 25ºC durante 18,5 horas. No se observó
desprendimiento de oxígeno durante todo el curso de la reacción,
pero el análisis del consumo de peróxido de hidrógeno indicó que
durante la reacción se formó algo de oxígeno. La mezcla de reacción
fue diluida con agua (69,4 ml) y la mezcla se agitó a 250 rpm
aproximadamente durante 15 minutos. No fue necesario controlar la
temperatura durante esta operación y la misma fue realizada
esencialmente a temperatura ambiente (siendo aceptable cualquier
temperatura en la gama de 5-25ºC). Se dejaron
separar las capas acuosa y orgánica y se separó la capa inferior de
cloruro de metileno.
La capa acuosa se extrajo de nuevo con cloruro
de metileno (69,4 ml) durante 15 minutos bajo una agitación a 250
rpm. Se dejaron separar las capas y se separó la capa inferior de
cloruro de metileno. La capa acuosa (177 g; pH = 7) se sometió a
determinación de peróxido de hidrógeno. El resultado (12,2%) indicó
que se consumieron 0,0434 moles de peróxido de hidrógeno en la
reacción de 0,0307 moles de olefina. El consumo en exceso de
peróxido de hidrógeno fue una medida de la generación de oxígeno de
la reacción. La re-extracción con una pequeña
cantidad de cloruro de metileno fue suficiente para asegurar la
ausencia de pérdida de epoximexrenona en la capa acuosa. Este
resultado se confirmó por medio de la aplicación de una segunda
extracción grande con cloruro de metileno en donde solo se recuperó
tricloroacetamida.
Las soluciones combinadas de cloruro de metileno
procedentes de las extracciones antes descritas se combinaron y
lavaron con solución al 3% en peso de sulfito sódico (122 ml)
durante al menos 15 minutos a 250 rpm aproximadamente. Al término
del periodo de agitación se observó un ensayo negativo a
almidón-yoduro (papel KI; no se observó color; en
un ensayo positivo un color púrpura indica la presencia de
peróxido).
Se dejaron separar las capas acuosa y orgánica y
se separó la capa inferior de cloruro de metileno. La capa acuosa
(pH = 6) se desechó. Ha de observarse que la adición de solución de
sulfito sódico puede causar una ligera exotermia de manera que
dicha adición deberá efectuarse bajo control de la temperatura.
La fase de cloruro de metileno se lavó con
hidróxido sódico 0,5 N (61 ml) durante 45 minutos a 250 rpm
aproximadamente y a una temperatura del orden de
15-25ºC (pH = 12-13). En este
proceso se separaron las impurezas derivadas de la
tricloroacetamida. La acidificación de la fracción acuosa alcalina
seguido por la extracción del cloruro de metileno confirmó que en
esta operación se perdió muy poca cantidad de epoximexrenona.
La fase de cloruro de metileno se lavó una vez
con ácido clorhídrico 0,1 N (61 ml) durante 15 minutos con
agitación a 250 rpm a una temperatura de 15-25ºC. Se
dejaron separar entonces las capas y la capa inferior de cloruro de
metileno se separó y se lavó de nuevo con cloruro sódico acuoso al
10% en peso (61 ml) durante 15 minutos a 250 rpm y a una
temperatura de 15-25ºC. Se dejaron separar de nuevo
las capas y se separó la capa orgánica. La capa orgánica se filtró
a través de un lecho de Solkafloc y luego se evaporó hasta sequedad
bajo presión reducida. El secado se completó con una temperatura del
baño de agua de 65ºC. Se obtuvo un sólido blanquecino (17,95 g) el
cual se sometió a análisis HPLC. El análisis de epoximexrenona fue
de 66,05%. El rendimiento molar ajustado para la reacción fue de
93,1%.
El producto se disolvió en metiletilcetona
caliente (189 ml) y la solución resultante se destiló a presión
atmosférica hasta que se separaron 95 ml de la cetona disolvente. La
temperatura se bajó a 50ºC a medida que cristalizaba el producto.
Se continuó la agitación a 50ºC durante 1 hora. La temperatura se
hizo descender entonces a 20-25ºC y se continuó la
agitación durante otras 2 horas. El sólido se filtró y se enjuagó
con MEC (24 ml) y el sólido se secó a un peso constante de 9,98 g,
el cual por análisis HPLC contenía 93,63% de epoximexrenona. Este
producto se redisolvió en MEC caliente (106 ml) y la solución
caliente se filtró a través de un filtro lineal de 10 micrómetros
bajo presión. Se aplicaron otros 18 ml de MEC como enjuagado y la
solución de MEC filtrada se destiló a presión atmosférica hasta que
se separaron 53 ml de disolvente. La temperatura se hizo descender
a 50ºC a medida que cristalizaba el producto y se continuó la
agitación a 50ºC durante 1 hora. La temperatura se hizo descender
entonces a 20-25ºC y se mantuvo en ese valor
mientras se continuaba la agitación durante otras 2 horas. El
producto sólido se filtró y se enjuagó con MEC (18 ml). El producto
sólido se secó a un peso constante de 8,32 g que contenía 99,6% de
epoximexrenona según análisis HPLC cuantitativo. La pérdida final
tras el secado fue menor de 1%. El rendimiento total en
epoximexrenona de acuerdo con la reacción y procesado de este
ejemplo fue de 65,8%. Este rendimiento total reflejó un rendimiento
de reacción de 93%, una recuperación por cristalización inicial de
78,9% y una recuperación por recristalización de 89,5%.
La \Delta^{11,12} olefina del enéster es un
subproducto de la eliminación de 11-mesilato. Se
aisló una muestra pura a partir de una mezcla de reacción preparada
del modo descrito en el ejemplo 37A por medio de cromatografía
líquida preparativa repetitiva. Así, se cromatografió un residuo de
73 g (preparado como se ha descrito en el ejemplo 37A) sobre 2,41
kg de gel de sílice Merck (40-63 \mu) con un
programa de elución en gradiente de acetato de etilo, tolueno
(20:80, 30:70, 40:60, 60:40, v/v). Entre las fracciones 30:70
seleccionadas se combinaron porciones enriquecidas en
\Delta^{11,12} olefina. La TLC sobre placas EMF usando acetato
de etilo/tolueno 60:40 (v/v) con visualización con ácido sulfúrico
SWUV sirvió como guía para seleccionar las fracciones adecuadas.
Los 7,9 g de la \Delta^{11,12} olefina en bruto (80% de área
según HPLC) obtenidos después de la separación del disolvente se
cromatografiaron sobre 531 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu) con un programa de elución en
gradiente de acetato de etilo/cloruro de metileno (10:90, 20:80,
35:65, v/v). A partir de las fracciones 20:80 seleccionadas se
obtuvo
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,11-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona (3,72 g) en forma pura. La
selección de fracciones estuvo basada en la evaluación TLC como en
la situación anterior.
MIR cm^{-1} 1767 (lactona) , 1727 (éster),
1668 y 1616
(3-ceto-\Delta^{4,5}).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,05 (s, 3H) , 1,15
(s, 3H) 3,66 (s, 3H), 5,58 (dd, 1H), 5,80 (s, 1H), 5,88 (dd,
1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 17,41, 18,58,
21,73, 28,61, 32,28, 33,63, 34,91, 35,64, 35,90, 38,79, 42,07,
44,12, 48,99, 49,18, 51,52, 93,81, 126,43, 126,69, 133,76, 166,24,
172,91, 176,64, 198,56.
Una solución de 1,6 g (3,9 mmoles) de
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,11-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en 6 ml de cloruro de metileno se
mezcló con 2,2 ml de tricloroacetonitrilo (22,4 mmoles) y 0,75 g de
fosfato dipotásico (4,3 mmoles). La mezcla se agitó y se combinó con
6,7 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (66 mmoles). La agitación se
continuó a 25ºC durante 45 horas. Al término de este tiempo, se
añadieron 28 ml de cloruro de metileno y 39 ml de agua. La porción
orgánica fue aislada y lavada sucesivamente con a) 74 ml de sulfito
sódico al 3%, b) 62 ml de hidróxido sódico 1 N, c) 74 ml de ácido
clorhídrico 1 N y d) 31 ml de salmuera al 10%. La porción orgánica
se separó de nuevo, se secó sobre sulfato de magnesio y se evaporó
hasta sequedad bajo vacío. El residuo (1,25 g) se cromatografió
sobre 138,2 g de gel de sílice Merck (40-63 \mu)
usando un sistema de elución en gradiente de
metil-t-butiléter y tolueno (40:60,
60:40, 75:25, v/v). Las porciones adecuadas de las fracciones 60:40
y 75:25 se combinaron después de la evaluación TLC para dar 0,66 g
de
7-metil-hidrógeno-11\alpha,12\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en forma pura. El sistema TLC
utilizó placas EMF y un programa de elución de
metil-t-butiléter y tolueno 75:25
(v/v) con ácido sulfúrico y SWUV para la visualización.
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,09 (s, 3H), 1,30
(s, 3H), 3,05 (AB^{11,12} 2H for), 3,67 (s, 3H), 5,80 (s,
1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 14,2, 18,0, 21,2,
28,8, 31,9, 33,5, 34,6, 34,7, 35,1, 35,5, 37,4, 38,3, 41,8, 46,0,
47,2, 50,4, 51,7, 56,7, 94,0, 126,7, 165,2, 172,5, 176,7, 198,1.
Teoría: C, 69,54 y H, 7,30; Encontrado: C, 69,29
y H, 7,17.
La epoximexrenona en bruto (157 g) preparada a
partir de 200 g del enéster del modo descrito en el ejemplo 26 se
sometió a cromatografía sobre 4,4 kg de gel de sílice Merck
(40-63 \mu). Se recuperó una porción de 88,1 g
con un programa de elución con acetonitrilo y tolueno 10:90 (v/v).
El sólido aislado se disolvió en 880 ml de metiletilcetona caliente
y se filtró a través de un lecho de solka floc. Como enjuagado se
aplicaron otros 88 ml de metiletilcetona. El filtrado se concentró
a través de la separación de 643 ml de disolvente y la mezcla se
enfrió a temperatura ambiente. Los sólidos fueron filtrados y
enjuagados con metiletilcetona. Después de secar, se obtuvieron
62,2 g de epoximexrenona con un análisis de 96,8% según HPLC. El
filtrado se concentró hasta sequedad bajo presión reducida. El
residuo (9,3 g) se recristalizó en 99 ml de metiletilcetona para
dar 2,4 g de sólido seco. Una porción de 400 mg del sólido se
sometió a HPLC preparativa de fase inversa en una columna YMC ODS
AQ. Se aisló
7-metil-hidrógeno-4\alpha,5\alpha:9\alpha,11\alpha-diepoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregnano-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona (103 mg) en forma pura con un
programa de elución de acetonitrilo (24%), metanol (4%) y agua
(72%).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 0,98 (s, 3H), 1,32
(s, 3H), 2,89 (m, 1H), 3,07 (s, d, 2H), 3,73 (s, 3H).
MS, M + 430, calculado para
C_{24}H_{30}O_{7}(430,50).
Un licor madre de metiletilcetona obtenido como
en el ejemplo 26 se evaporó hasta sequedad bajo presión reducida.
Una porción de 4,4 g del residuo se sometió a cromatografía sobre
58,4 g de BTR Zorbax LP (40 \mu). La elución con un gradiente de
metiletilcetona y cloruro de metileno (25:75 a 50:50, v/v)
proporcionó 1,38 g de material. Una porción de 1,3 g de este
material se purificó adicionalmente por HPLC preparativa de fase
inversa usando acetonitrilo (30%), metanol (5%) y agua (65%) como
la fase móvil y una columna YMC ODS AQ (10 \mu). El producto se
obtuvo a partir de las fracciones enriquecidas por medio de
extracción con cloruro de metileno. El cloruro de metileno se
evaporó hasta sequedad y el residuo (175 mg) se volvió a purificar
por HPLC preparativa de fase inversa usando acetonitrilo (24%),
metanol (4%) y agua (72%) como la fase móvil y una columna YMC ODS
AQ. La extracción con cloruro de metileno de las fracciones
enriquecidas proporcionó 30,6 mg de
7-metil-hidrógeno-17-hidroxi-3,12-dioxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en forma pura.
^{1}H NNR (CDCl_{3}) ppm 1,17 (s, 3H), 1,49
(s, 3H), 3,13 (m, 1H), 3,62 (s, 3H), 5,77 (s, 1H), 5,96 (s,
1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 13,1, 21,0, 28,0,
29,4, 33,1, 33,4, 33,9, 35,5, 36,7, 40,3, 41,5, 43,0, 43,4, 52,0,
55,0, 91,0, 123,7, 126,7, 163,2, 167,9, 171,8, 176,8, 197,4,
201,0.
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Se preparó una suspensión conteniendo 2 g (4,8
mmol) de epoximexrenona preparada como en el ejemplo 43, 10 ml de
agua, 3 ml de dioxano y 9,3 ml de hidróxido potásico acuoso 1,04 N
(9,7 mmol). La mezcla se agitó a 25ºC durante 3 horas. Durante las
dos primeras horas se formó una solución homogénea, amarilla. La
temperatura se elevó a 70ºC y se continuó la agitación durante 3
horas más. El disolvente se separó por destilación en vacío y el
residuo se purificó por cromatografía de fase inversa sobre 90 g de
gel de sílice C18 usando agua como eluyente. Las fracciones
deseadas se combinaron después de su comprobación por TLC sobre
placas EMF usando cloruro de metileno, metanol (7:3) como eluyente
y SWUV para la visualización. Las fracciones combinadas se
concentraron hasta sequedad bajo vacío y el residuo se sometió a
purificación de fase inversa como anteriormente se ha descrito. Las
fracciones deseadas se concentraron hasta sequedad bajo presión
reducida y el residuo se disolvió en etanol. Se añadió acetato de
etilo hasta el punto de turbidez, tras lo cual se añadió heptano
para completar la precipitación. Se aislaron 0,55 g del producto,
sal dipotásica dihidratada de ácido
9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxílico
como un sólido amarillo. El análisis de carbono correspondía a la
estructura hidratada C_{23}H_{28}O_{7}K_{2}\cdot1,75
H_{2}O: Teoría C, 52,50 vs. 55,85 para la forma anhidra;
encontrado C, 52,49. Después de la TLC sobre placas EMF con cloruro
de metileno, metanol, agua (6:3:0,5, v/v) como eluyente y
visualización por SWUV, se observó un valor R_{f} de 0,29.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendieron alrededor de 5 mg (0,01 mmol) de
la epoximexrenona preparada como en el ejemplo 43 en alrededor de
200 \mul de metanol en un vial de 4 ml y se diluyó con alrededor
de 200 \mul de 2,5 N NaOH. La mezcla resultante era amarilla y
homogénea. La mezcla se calentó entonces en un baño de aceite a
70ºC. Después de 10 minutos, se analizó una muestra de 1 \mum de
la mezcla por HPLC (Zorbax SB-C8 150 x 4,6 nn, 2
ml/minuto, gradiente = 35:65 (v/v) A:B, A = acetonitrilo/metanol
(1:1), B = agua/0,1% ácido trifluoracético, detección a 210 nm)
encontrándose dos materiales en los tiempos de retención de 4,86 y
2,93 minutos consistentes con el hidroxiácido (lactona abierta) y
con el ácido 7-carboxílico de la lactona abierta,
respectivamente. Después de 30 minutos, se separó una segunda
muestra (0,05 ml) y se acidificó con 0,05 ml de 3 N HCl seguido por
neutralización con alrededor de 0,5 ml de bicarbonato sódico. El
análisis HPLC como anteriormente reveló los esteroides de anillo
cerrado esperados con tiempos de retención de 6,59 y 10,71 minutos.
La relación de
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona (10,71 minutos) al correspondiente
ácido 7-carboxílico fue de 7:89.
Bajo condiciones suaves fue posible la
hidrólisis selectiva de la lactona. Se preparó un segundo vial de 4
ml como anteriormente pero no se calentó. La mezcla fue sometida a
sonicación durante 5 minutos. Una muestra de 0,05 ml se diluyó en
0,5 ml de una mezcla 1:1 (v/v) de metanol/acetonitrilo y se analizó
por HPLC sin acidificación previa. El 7-éster de ácido carboxílico
de la lactona abierta resultante tenía un tiempo de retención de
4,85 minutos observado como anteriormente y estaba sin contaminar
por el ácido 7-carboxílico.
y
Los compuestos
7-metil-hidrógeno-9\alpha,11\beta,17-trihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona y
7-metil-hidrógeno-12\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona se aislaron después de la
cromatografía líquida preparativa del licor madre de
2-butanona recuperado de la epoxidación del enéster
como se ha descrito en el ejemplo 26 (protocolo con
tricloroacetonitrilo). Así, la primera cristalización se realizó
usando 2-butanona como se ha indicado. Sin embargo,
la recristalización utilizó 2-butanona (10
volúmenes por gramo) en lugar de acetona. Se obtuvo un residuo de
2,8 g de este modo el cual se purificó por HPLC preparativa de fase
inversa. Se utilizó Cromasil C8 (10 \mu) como fase estacionaria y
una fase móvil constituida por milliQ agua y acetonitrilo en una
relación de 70:30 (v/v). En una de las fracciones enriquecidas se
observó cristalización. El sólido (46,7 mg) fue aislado e
identificado como
7-metil-hidrógeno-9\alpha,11\beta,17-trihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. El licor madre se evaporó hasta
sequedad bajo presión reducida y el residuo (123 mg) fue
identificado como
7-metil-hidrógeno-12\alpha,17-dihidroxi-3-oxo-17\alpha-pregna-4,9(11)-dieno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona.
\vskip1.000000\baselineskip
MS M + 432, calculado para
C_{24}H_{32}O_{5} (432,51).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,23 (s, 3H), 1,54
(s, 3H), 3,00 (m, 1H), 3,14 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 5,14 (s, 1H,
lentamente intercambiable), 5,79 (s, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 16,8, 22,7, 24,8,
29,0, 29,3, 32,1, 34,1, 34,7, 35,2, 35,7, 36,8, 40,7, 43,0, 45,0,
45,9, 52,9, 72,8, 77,4, 95,9, 127,4, 163,7, 176,7, 177,3, 199,4.
\vskip1.000000\baselineskip
MS M + 441, calculado para
C_{24}H_{30}O_{6} (414,50).
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 0,87 (s, 1H), 1,40
(s, 1H), 3,05 (m, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,99 (m, 1H), 5,72 (s, 1H),
5,96 (m, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 14,8, 24,0, 26,1,
29,7, 33,6, 33,8, 34,0, 36,3, 37,0, 37,4, 40,7, 40,9, 43,8, 48,1,
51,9, 69,1, 95,5, 122,7, 126,3, 145,9, 164,5, 173,2, 177,6,
198,2.
y
Se preparó
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-3-etoxi-17-hidroxi-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona de acuerdo con el método de R. M.
Weier y L. M. Hofmann (J. Med Chem 1977, 1304), incorporado aquí
solo con fines de referencia. Se combinaron 148 g (357 mmoles) del
compuesto
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-3-etoxi-17-hidroxi-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, preparado como en el ejemplo 43,
con 311 ml de etanol absoluto y 155 ml (932 mmoles) de ortoformato
de trietilo. La suspensión se agitó a temperatura ambiente y, como
catalizador, se añadieron 10,4 g (54,7 mmoles) de ácido
toluenosulfónico (monohidratado). Se continuó la agitación durante
30 minutos y la mezcla de reacción se enriqueció por la adición de
41,4 g (505 mmoles) de acetato sódico en polvo y 20,7 ml (256
mmoles) de piridina. Los sólidos (70,2 g) fueron separados por
filtración y el filtrado se concentró hasta sequedad bajo vacío. El
residuo fue digerido con 300 ml de acetato de etilo y por filtración
se separaron 9,8 g de sólidos.
El filtrado se concentró hasta sequedad y el
residuo fue digerido con 100 ml de metanol conteniendo 2 ml de
piridina. Por filtración se separaron 29,7 g de sólidos. Se observó
una precipitación adicional en el filtrado. Por tanto, el filtrado
se volvió a filtrar para separar 21,9 g más de sólidos. El filtrado
se concentró hasta sequedad y el residuo fue digerido con 50 ml de
metanol conteniendo 1 ml de piridina. Por filtración se aislaron
33,8 g de sólidos. La HPLC cualitativa indicó que esta última
porción de sólidos era suficientemente pura (90% de área de
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-3-etoxi-17-hidroxi-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona) para utilizarse en la siguiente
etapa de la reacción.
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,02 (s, 3H), 1,27
(s, 3H), 1,30 (t, 3H), 3,12 (m, 1H), 3,28 (m, 1H), 3,66 (s, 3H),
3,78 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 5,29 (d, 1H).
Una porción de 8 g del enol éter
(7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-3-etoxi-17-hidroxi-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona) (18 mmoles) preparado en la etapa
anterior se disolvió en 120 ml de 1,4-dioxano. La
solución se combinó con una mezcla de 6,8 g de ácido
m-cloroperbenzoico al 53% (20,9 mmoles), 18,5 ml de
hidróxido sódico 1 N (18,5 mmoles) y 46 ml de dioxano/agua (9:1).
La temperatura se mantuvo en -3ºC y la mezcla se agitó durante 2
horas. La temperatura se elevó a 25ºC y se continuó la agitación
durante otras 20 horas. La mezcla se combinó con 400 ml de agua
fría (10ºC) y 23,5 ml de hidróxido sódico 1 N (23,5 mmoles). La
mezcla se extrajo cuatro veces con porciones de 100 ml de cloruro
de metileno cada vez. Las porciones combinadas de cloruro de
metileno se secaron sobre sulfato de magnesio y el disolvente
sobrenadante se separó por destilación bajo vacío. El residuo (13,9
g) se trituró con 50 ml de éter etílico para dar 2,9 g de un sólido
blanco. Una porción de 2,4 g del sólido se cromatografió sobre 100
g de gel de sílice Merck (60 \mu). Después de un lavado inicial
con 1 litro de acetato de etilo/heptano 1:1, el producto fue eluído
con una relación 7:3 de acetato de etilo/heptano. Las fracciones
enriquecidas se combinaron en base a la evaluación TLC (placas EMF;
eluyente acetato de etilo/heptano 7:3 (v/v); visualización SWUV). De
este modo, se obtuvieron 0,85 g de material enriquecido que se
recristalizó en 10 ml de isopropanol para dar 0,7 g de
7-metil-hidrógeno-6\beta,17-dihidroxi-9,11\alpha-epoxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona. Se combinaron las fracciones más
contaminadas y se obtuvieron 0,87 g de
7-metil-hidrógeno-6\beta,17-dihidroxi-9,11\alpha-epoxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en bruto. Este material fue
cromatografiado sobre 67,8 g de gel de sílice Merck
(40-63 \mu). Se recuperaron 0,69 g más de
producto con tolueno conteniendo de 0,5 a 2,5% de metanol.
Teoría: C, 66,96 y H, 7,02: Encontrado: C, 66,68
y H, 7,16.
^{1}H NMR (CDCl_{3}) ppm 1,06 (s, 3H), 1,36
(dm, 1H), 1,63 (s, 3H), 2,92 (m, 1H), 3,02 (dd, 1H), 3,12 (d, 1H),
3,64 (s, 3H), 4,61 (d, 1H), 5,96 (s, 1H).
^{13}C NMR (CDCl_{3}) ppm 16,17, 21,32,
21,79, 24,36, 27,99, 28,94, 30,86, 31,09, 32,75, 33,19, 34,92,
36,77, 39,16, 43,98, 47,74, 51,56, 51,66, 65,36, 72,23, 94,79,
165,10, 171,36, 176,41, 199,59.
A 2 g (4,8 mmol) del compuesto
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, preparado como en el ejemplo 43
se añadieron 3,3 ml (14,4 mmol) de metóxido sódico al 25% en
metanol. La suspensión amarilla resultante se calentó a 50ºC. El
sólido no se disolvió. A la mezcla se añadieron 3,3 ml de metanol
(Aldrich anhidro). La mezcla se calentó en condiciones de reflujo
(65ºC) y se hizo homogénea. Después de 30 minutos, la precipitación
de un sólido impidió la agitación.
Se añadieron alrededor de 25 ml de metanol
anhidro y la mezcla fue transferida a un matraz de 100 ml. La mezcla
se calentó en condiciones de reflujo durante 16 horas en cuyo
momento la mezcla se hizo oscura y homogénea. La mezcla se enfrió a
25ºC y se añadieron 70 ml de 3 N HCl (exotermia). Se añadieron
varios gramos de hielo para enfriar la mezcla y la solución fue
extraída con dos porciones sucesivas de 25 ml de cloruro de
metileno. La solución oscura se secó sobre sulfato sódico y se
filtró a través de un lecho de 2,5 cm de gel de sílice E. Merck,
malla 70-230, tamaño de poros 60\ring{A}). La
sílice fue eluída con 100 ml de cloruro de metileno. El cloruro de
metileno eluído se concentró entonces bajo vacío para dar 1 g de una
espuma marrón que cristalizó tras la adición de acetato de etilo.
El lecho de sílice fue eluído por segunda vez con 100 ml de 10%
acetato de etilo/cloruro de metileno y la solución eluída se
concentró para dar 650 mg de una espuma de color marrón.
La cromatografía de capa delgada (gel de sílice
E. Merck 60 F-254, 0,25 mm, tolueno/acetato de etilo
(1:1, v/v)) reveló la presencia de
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona y
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\beta,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona en ambas muestras, aunque en la
primera muestra estaba presente una cantidad muy pequeña del
epímero 7\alpha-carboxi. La primera muestra fue
triturada con acetato de etilo caliente (77ºC) y se dejó enfriar a
25ºC. La mezcla se filtró entonces para dar 400 mg de un sólido
blanquecino, p.f. 254-258ºC. Los análisis H,
^{13}C y ^{13}C-APT estaban de acuerdo con la
estructura asignada. En la muestra permaneció una pequeña cantidad
de acetato de etilo pero no se evidenció material de partida según
(Zorbax SB-C8 150 x 4,6 nn, 2 ml/minuto, elución
isocrática con A:B 40:60 (v/v), A = acetonitrilo/metanol (1:1), B =
agua/0,1% ácido trifluoracético, detección a 210 nm) (la HPLC
mostró un 98,6% de área) y por TLC (tolueno/acetato de etilo 1:1,
v/v).
La FAB-MS confirmó un peso
molecular de 414 con M_{+}H a 415,2.
^{1}H NMR (400 MHz, deuterocloroformo)
\delta 0,95 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,45 (m, 3H),
1,55-2,7 (m, 15H), 2,85 (t, J=13, 1H), 3,25 (d,
J=6, 1H), 3,65 (s, 3H), 5,78 (s, 1H).
A 774 mg (1,82 mmol) del compuesto
7-metil-hidrógeno-9,11\alpha-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17\alpha-pregn-4-eno-7\alpha,21-dicarboxilato,
\gamma-lactona, preparado como en el ejemplo 43 y
suspendido en 3 ml de acetonitrilo, se añadieron 3 ml (7,5 mmol, 2
equivalentes) de hidróxido sódico 2,5 M. Esta mezcla se hizo de
color amarillo y, después de 10 minutos era homogénea.
Para controlar el progreso de la reacción, se
enfriaron partes alícuotas (0,1 ml) de la mezcla en 0,01 ml de
ácido sulfúrico 3 M y se realizó la extracción en un vial de cristal
de 4 ml con acetato de etilo (0,2 ml). Las fases se separaron por
separación de la fase acuosa inferior por medio de una pipeta. La
fase orgánica se separó y el residuo se analizó por HPLC usando el
método descrito en el ejemplo 47H. Después de 50 minutos a 25ºC, la
composición de la mezcla experimentó pocos cambios.
La mezcla se calentó en condiciones de reflujo
(alrededor de 90ºC) durante 50 minutos. El análisis HPLC de la
mezcla mostró que permanecía un 6% de área del material de partida.
La mezcla se agitó a 25ºC durante 65 horas. La acidificación, la
extracción y el análisis HPLC de una parte alícuota como antes se ha
descrito confirmaron que no permanecía material de partida.
La mezcla se acidificó fuertemente por adición
de alrededor de 4 ml de ácido sulfúrico 3 M y se extrajo con dos
porciones (alrededor de 10 ml) de cloruro de metileno. Las fases
orgánicas se combinaron y se secaron sobre sulfato sódico. La
concentración en un evaporador rotativo proporcionó 780 g de un
sólido. El sólido se recristalizó en dimetilformamida/metanol para
dar 503 mg (67%) de un sólido cristalino de color canela. La
muestra fundió con desprendimiento de gas a una temperatura próxima
a 260ºC cuando se calentó rápidamente. La mezcla oscureció
lentamente pero permaneció sólida cuando se calentó lentamente a
285ºC.
^{1}H NMR (dimetilsulfóxido
d-6, 400 MHz) \delta 0,85 (s, 3H), 1,4 (s, 3H),
1,3-2,9 (m, 19H), 3,15 (m, 1H), 5,55 (s, 1H), 11,8
(br, 1H).
Esquema 1: Etapa 3D: Método
I
Una solución 0,2 M del enéster de fórmula IIA en
cloruro de metileno se combinó con 2 equivalentes de fosfato
dipotásico disuelto en un peso igual de agua (solución acuosa al 50%
p/p), 3 equivalentes de clorodifluoracetamida y 22 equivalentes de
peróxido de hidrógeno (añadido como una solución acuosa al 30%). La
mezcla se agitó a 25ºC durante 3 horas. La mezcla de reacción fue
diluida con una cantidad de agua igual a la carga de peróxido de
hidrógeno y se separó el cloruro de metileno. La porción de cloruro
de metileno se lavó una vez con solución de sulfito sódico al 3%
(volumen igual a 1,75 veces la carga de peróxido de hidrógeno). La
porción de cloruro de metileno se separó y se secó sobre sulfato
sódico. La solución se concentró por destilación atmosférica hasta
conseguir una temperatura en cabeza de 70ºC. El residuo fue evaluado
por medio de HPLC, _{1}H y ^{23}C NMR (CDCl_{3}). El
rendimiento en epoximexrenona fue de 54,2% de área según HPLC.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
J
Se repitió el procedimiento del ejemplo 47K
usando heptafluorbutilamida (CF_{3}CF_{2}CF_{2}CONH_{2}) en
lugar de clorodifluoracetamida. El rendimiento en epoximexrenona fue
de 58,4% de área según HPLC.
Esquema 1: Etapa 3D: Método
K
El enéster de formula IIA se convirtió a
epoximexrenona según el método descrito en general en el ejemplo 46
excepto que se utilizó tolueno como disolvente. Los materiales
cargados en el reactor incluían enéster (2,7 g), tricloroacetamida
(2,5 g), hidrogenofosfato dipotásico (1,7 g), peróxido de hidrógeno
(17 g) y tolueno (50 ml). Se dejó que la reacción experimentara una
exotermia a 28ºC y se completó en 4 horas. La mezcla trifásica
resultante se enfrió a 15ºC, se filtró, se lavó con agua y se secó
bajo vacío para dar 2,5 g de producto.
Esquema 4: Método
A
Un compuesto designado como XVIIA (compuesto
XVII en donde -A-A- y -B-B- son
ambos -CH_{2}-CH_{2}-) (40,67 g) se disolvió en
cloruro de metileno (250 ml) en un matraz de 3 cuellos y de un litro
de capacidad y se enfrió exteriormente mediante una mezcla de
hielo-sal. Se añadieron fosfato dipotásico (22,5 g)
y tricloroacetonitrilo (83,5 g) y la mezcla se enfrió a 2ºC tras lo
cual se añadió lentamente, durante 1 hora, peróxido de hidrógeno al
30% (200 g). La mezcla de reacción se agitó a 12º durante 8 horas y
a temperatura ambiente durante 14 horas. Se tomó la gota de la capa
orgánica y se comprobó respecto a cualquier enona de partida,
encontrándose una cantidad de <0,5%. Se añadió agua (400 ml), se
agitó durante 15 minutos y las capas se separaron. La capa orgánica
se lavó sucesivamente con 200 ml de yoduro potásico (10%), 200 ml de
tiosulfato sódico (10%) y 100 ml de solución saturada de
bicarbonato sódico, separando las capas cada vez. La capa orgánica
se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró para
proporcionar epóxido en bruto (41 g). El producto cristalizó en
acetato de etilo/cloruro de metileno para dar 14,9 g de material
puro.
Esquema 4: Método
B
Se disolvió el compuesto XVIIA (18 g) en 250 ml
de cloruro de metileno y se enfrió a 10ºC. Bajo agitación, se
añadió, durante 15 minutos, ácido m-cloroperbenzoico
sólido (pureza 50-60%, 21,86 g). No se observó
subida de la temperatura. La mezcla de reacción se agitó durante 3
horas y se comprobó respecto a la presencia de la diona. La mezcla
de reacción se trató sucesivamente con solución de sulfito sódico
(10%), solución de hidróxido sódico (0,5 N), solución de ácido
clorhídrico (5%) y por último con 50 ml de solución saturada de
salmuera. Después de secar con sulfato de magnesio anhidro y
evaporar, se obtuvieron 17,64 g del epóxido que se utilizó
directamente en la siguiente etapa. El producto resultó contener
producto de oxidación Baeyer-Villiger que no había
sido separado por trituración en acetato de etilo seguido por
cristalización en cloruro de metileno. A una escala de 500 g, el
ácido m-clorobenzoico precipitado se filtró y luego
se procesó del modo usual.
Esquema 4: Método
C
Se disolvió el compuesto XVIIA (2 g) en 25 ml de
cloruro de metileno. Se añadieron tricloroacetamida (2 g) y fosfato
dipotásico (2 g). Bajo agitación a temperatura ambiente, se añadió
peróxido de hidrógeno al 30% (10 ml) y se continuó la agitación
durante 18 horas para dar el epóxido (1,63 g). No se observó
producto Baeyer-Villiger.
Se cargó hidróxido potásico (56,39 g; 1.005,03
mmol; 3 eq.) en un matraz de 2.000 ml y se formó una suspensión con
dimetilsulfóxido (750 ml) a temperatura ambiente. En el matraz se
cargó, junto con THF (956 ml) una trienona correspondiente a la
fórmula XX (en donde R^{3} es H y -A-A- y
-B-B- son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}-) (100 g, 335,01 mmol; 1 eq.).
Se cargó en el matraz metilsulfato de trimetilsulfonio (126,14 g;
670,02 mmol; 2 eq.) y la mezcla resultante se calentó a reflujo,
80-85ºC, durante 1 hora. La conversión al
17-espirooximetileno se verificó por HPLC. Se
separó aproximadamente un litro de THF de la mezcla de reacción bajo
vacío, tras lo cual se cargó agua (460 ml) durante 30 minutos
mientras se enfriaba la mezcla de reacción a 15ºC. La mezcla
resultante se filtró y el oxirano producto sólido se lavó dos veces
con partes alícuotas de 200 ml de agua. Se observó que el producto
era altamente cristalino y la filtración se llevó a cabo fácilmente.
El producto fue secado entonces bajo vacío a 40ºC. Se aislaron
104,6 g del producto esteroidal 3-metil enol éter
\Delta-5,6,9,11,-17-oxirano.
Se añadió etóxido sódico (41,94 g; 616,25 mmol;
1,90 eq.) a un reactor seco de 500 ml bajo un manto de nitrógeno.
Se añadió etanol (270,9 ml) al reactor y el etóxido sódico formó una
suspensión en el etanol. Se añadió a la suspensión malonato de
dietilo (103,90 g; 648,68 mmol; 2 eq.) tras lo cual se añadió el
esteroide de oxirano preparado como en el ejemplo 52 (104,60 g;
324,34 mmol; 1 eq.) y la mezcla resultante se calentó a reflujo, es
decir, a 80-85ºC. El calentamiento se continuó
durante 4 horas tras lo cual se verificó por HPLC el término de la
reacción. Se añadió agua (337,86 ml) a la mezcla de reacción durante
30 minutos mientras se enfriaba la mezcla a 15ºC. Se continuó la
agitación durante 30 minutos y luego la suspensión de reacción se
filtró para obtener una torta de filtración que comprende un polvo
amorfo fino. La torta de filtración se lavó dos veces con agua (200
ml cada vez) y luego se secó a temperatura ambiente bajo vacío. Se
aislaron 133,8 g del compuesto intermedio 3-metil
enol
éter-\Delta5,6,9,11,-17-espirolactona-21-etoxocarbonilo.
El compuesto intermedio 3-metil
enol
éter-\Delta5,6,9,11,-17-espirolactona-21-etoxocarbonilo
(fórmula XVIII en donde R^{3} es H y -A-A- y
-B-B- son cada uno
-CH_{2}-CH_{2}-; 133,80 g; 313,68 mmol; 1 eq.)
producido como en el ejemplo 53 se añadió a un reactor de 2.000 ml,
bajo agitación, junto con cloruro sódico (27,50 g; 470,52 mmol;
1,50 eq.), dimetilformamida (709 ml) y agua (5 ml). La mezcla
resultante se calentó a reflujo, 138-142ºC, durante
3 horas, tras lo cual la mezcla de reacción fue verificada respecto
al término de la reacción por HPLC. Se añadió agua a la mezcla
durante 30 minutos mientras la mezcla se enfriaba a 15ºC. La
agitación se continuó durante 30 minutos, tras lo cual la
suspensión de reacción se filtró para recuperar un producto de
reacción sólido amorfo como una torta de filtración. La torta de
filtración se lavó dos veces (partes alícuotas de 200 ml de agua)
tras lo cual se secó. El producto
3-metileneter-17-espirolactona
se secó para proporcionar 91,6 g (rendimiento 82,3%; 96% de área
según análisis).
El enoléter producido según el ejemplo 54 (91,60
g; 258,36 mmol; 1 eq.), etanol (250 ml), ácido acético (250 ml) y
agua (250 ml) se añadieron a un reactor de 2.000 ml y la suspensión
resultante se calentó a reflujo durante 2 horas. Se añadió agua
(600 ml) durante 30 minutos mientras se enfriaba la mezcla de
reacción a 15ºC. La suspensión de reacción se filtró entonces y la
torta de filtración se lavó dos veces con agua (partes alícuotas de
200 ml). La torta de filtración se secó luego; se aislaron 84,4 g
del producto 3-ceto
\Delta4,5,9,11,-17-espirolactona (compuesto de
fórmula XVII en donde R^{3} es H y -A-A- y
-B-B- son -CH_{2}-CH_{2}-;
rendimiento 95,9%).
En un matraz de cuatro cuellos y de 22 litros se
añadió el compuesto XVIIA (1 kg; 2,81 mmoles) junto con tetracloruro
de carbono (3,2 litros). A la mezcla se añadió
N-bromosuccinimida (538 g) seguido por acetonitrilo.
(3,2 litros). La mezcla resultante se calentó a reflujo y se
mantuvo a la temperatura de reflujo de 68ºC durante alrededor de 3
horas, para producir una solución limpia de color naranja. Después
de 5 horas de calentamiento, la solución se volvió oscura. Después
de 6 horas, se disipó el calor y se tomaron muestras de la mezcla de
reacción. El disolvente se separó bajo vacío y se añadió acetato de
etilo (6 litros) al residuo de la cola del alambique. La mezcla
resultante se agitó tras lo cual se añadió una solución de
bicarbonato sódico al 5% (4 litros) y la mezcla se agitó durante 15
minutos, tras lo cual se dejó que las fases sedimentaran. Se separó
la capa acuosa y se introdujo solución saturada de salmuera (4
litros) en la mezcla, la cual se agitó entonces durante 15 minutos.
Las fases se separaron de nuevo y la capa orgánica se separó bajo
vacío para producir una suspensión espesa. Se añadió entones
dimetilformamida (4 litros) y se continuó la separación a una
temperatura en el calderín de 55ºC. El producto de cola del
alambique se dejó reposar durante la noche y se añadió DABCO (330
g) y bromuro de litio (243 g). La mezcla se calentó entonces a 70ºC.
Después de 1 hora y media de calentamiento, se tomó una muestra
para cromatografía líquida y, después de 3,5 horas de calentamiento,
se añadió más DABCO (40 g). Después de 4,5 horas de calentamiento,
se introdujo agua (4 litros) y la mezcla resultante se enfrió a
15ºC. La suspensión se filtró y la torta de filtración se lavó con
agua (3 litros) y se secó en el filtro durante la noche. La torta
húmeda (978 g) se introdujo de nuevo en el matraz de 22 litros y se
añadió dimetilformamida (7 litros). La mezcla así obtenida se
calentó a 105ºC en cuyo momento la torta se puso completamente en
solución. Se disipó el calor y la mezcla del matraz se agitó y
enfrió. Se aplicó agua de hielo a la camisa del reactor y la mezcla
del reactor se enfrió a 14ºC y se mantuvo durante 2 horas. La
lechada resultante se filtró y se lavó dos veces con partes
alícuotas de 2,5 litros de agua. La torta de filtración se secó bajo
vacío durante la noche. Se obtuvo un producto sólido de color
marrón claro (510 g).
En un matraz de 4 cuellos y de 2 litros se
cargaron: 9,11-epoxicanrenona producida en el
ejemplo 56 (100 g; 282,1 mmol; 1 eq.), dimetilformamida (650 ml),
cloruro de litio (30 g; 707,7 mmol; 2,51 eq.) y acetona cianohidrina
(72,04 g; 77,3 ml; 846,4 mmol; 3 eq.). La suspensión resultante se
agitó mecánicamente y se trató con tetrametilguanidina (45,49 g;
49,6 ml; 395 mmol; 1,40 eq.). El sistema se filtró entonces con un
condensador refrigerado por agua y un condensador de hielo seco
(cargado con hielo seco en acetona) para impedir el escape de HCN.
La línea de ventilación procedente del condensador de hielo seco
comunicaba con un lavador cargado con un exceso grande de lejía de
cloro. La mezcla se calentó a 80ºC.
Después de 18 horas, se obtuvo una solución de
color marrón rojizo oscuro la cual se enfrió a temperatura ambiente
con agitación. Durante el proceso de enfriamiento, se pulverizó
nitrógeno en la solución para separar el HCN residual, pasando la
línea de ventilación a la lejía presente en el lavador. Después de 2
horas, la solución se trató con ácido acético (72 g) y se agitó
durante 30 minutos. La mezcla en bruto se vertió entonces en agua
de hielo (2 litros) con agitación. La suspensión agitada se trató
además con ácido clorhídrico acuoso al 10% (400 ml) y se agitó
durante 1 hora. La mezcla se filtró entonces para obtener un sólido
de color rojo ladrillo oscuro (73 g). El filtrado se colocó en un
embudo separador de 4 litros y se extrajo con cloruro de metileno
(3 x 800 ml); y las capas orgánicas se combinaron y se extrajeron de
nuevo con agua (2 x 2 litros). La solución de cloruro de metileno
se concentró bajo vacío para proporcionar 61 g de un aceite de color
rojo oscuro.
Después de dejar en reposo durante la noche las
fracciones de lavado acuosas, se desarrolló un precipitado
abundante. Este precipitado se recogió por filtración y se determinó
que consistía en la enamina producto pura (14,8 g).
Después del secado, el sólido rojo original (73
g) fue analizado por HPLC y se determinó que el componente
principal era la 9,11-epoxienamina. La HPLC reveló
además que la enamina era el componente principal del aceite rojo
obtenido a partir de la elaboración con cloruro de metileno. El
rendimiento molar calculado de enamina fue de 46%.
La 9,11-epoxienamina (4,600 g;
0,011261 mol; 1 eq.) preparada según el ejemplo 57 se introdujo en
un matraz de fondo redondo y de 1.000 ml. A la mezcla se añadieron
metanol (300 ml) y ácido clorhídrico acuoso al 0,5% en peso (192
ml) y la mezcla se sometió entonces a reflujo durante 17 horas. Se
separó entonces el metanol bajo vacío reduciendo la cantidad de
material en el calderín del alambique a 50 ml causando con ello la
formación de un precipitado blanco. Se añadió agua (100 ml) a la
suspensión la cual se filtró entonces para producir una torta
sólida blanca que se lavó tres veces con agua. El rendimiento en la
9,11-epoxidicetona producto sólida fue de 3,747 g
(81,3%).
La epoxidicetona preparada según el ejemplo 58
(200 mg; 0,49 mmol) se suspendió en metanol (3 ml) y a la mezcla se
añadió
1,8-dicazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU). Tras el calentamiento a reflujo durante 24 horas, la mezcla
se hizo homogénea. Se concentró entonces hasta sequedad a 30ºC en un
evaporador rotativo y el residuo se distribuyó entre cloruro de
metileno y 3 N HCl. La concentración de la fase orgánica proporcionó
un sólido amarillo (193 mg) que según se determinó consistía en 22%
en peso de epoximexrenona. El rendimiento fue de 20%.
A 100 mg de dicetona (preparadas según el
ejemplo 58) suspendida en 1,5 ml de metanol se añadieron 10
microlitros (0,18 eq.) de solución al 25% p/p de metóxido sódico en
metanol. La solución se calentó a reflujo. Después de 30 minutos,
no existía dicetona y estaba presente el
5-cianoéster. A la mezcla se añadieron 46
microlitros de solución al 25% p/p de metóxido sódico en metanol.
La mezcla se calentó a reflujo durante 23 horas en cuyo momento el
producto principal fue epoximexrenona según se determinó por
HPLC.
A 2 g de dicetona (preparada según el ejemplo
58) suspendida en 30 ml de metanol seco se añadieron 0,34 ml de
trietilamina. La suspensión se calentó a reflujo durante 4,5 horas.
La mezcla se agitó a 25ºC durante 16 horas. La suspensión
resultante se filtró para dar 1,3 g del 5-cianoéster
como un sólido blanco.
A 6,6 g de la dicetona suspendida en 80 ml de
metanol se añadieron 2,8 ml de trietilamina. La mezcla se calentó a
reflujo durante 4 horas y se agitó a 25 rpm durante 88 horas durante
cuyo tiempo el producto cristalizó en la solución. La filtración
seguido por un lavado con metanol proporcionó 5,8 g del cianoéster
como un polvo blanco. El material fue recristalizado en
cloroformo/metanol para dar 3,1 g de material cristalino que era
homogéneo según HPLC.
A la vista de lo anterior, podrá apreciarse que
se consiguen los diversos objetos de la invención y que se alcanzan
otros resultados ventajosos.
Dado que podrían efectuarse varios cambios en
las composiciones y procedimientos anteriores sin desviarse por
ello del alcance de la invención, ha de entenderse que toda la
materia contenida en la descripción anterior y mostrada en los
dibujos adjuntos deberá ser interpretada como ilustrativa y no en un
sentido limitativo.
Claims (8)
1. Procedimiento para la formación de un
compuesto epoxi que comprende poner en contacto un compuesto de
sustrato que tiene un doble enlace olefínico con un compuesto de
peróxido en presencia de un activador de peróxido, en donde dicho
activador de peróxido corresponde a un compuesto que tiene la
fórmula
en
donde
R^{p} es -(CX^{4}X^{5})_{2}-;
X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5} se
eligen independientemente entre halo, hidrógeno, alquilo,
haloalquilo, ciano y cianoalquilo; y
siempre que al menos uno de X^{4} y X^{5}
sea halo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde al menos dos de X^{1}, X^{2} y X^{3} son halo o
perhaloalquilo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde todos los X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y X^{5} son
halo o perhaloalquilo.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde dicho activador de peróxido es heptafluorbutiramida.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde dicho compuesto de sustrato corresponde a la fórmula:
en
donde:
-A-A- representa el grupo
-CHR^{4}-CHR^{5}- o -CR^{4}=CR^{5}-;
R^{3} se elige del grupo consistente en
hidrógeno, halo, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior,
hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, ciano y
ariloxi;
R^{1} representa un radical
alcoxi(inferior)carbonilo o hidroxicarbonilo
alfa-orientado; y
-B-B- representa el grupo
-CHR^{6}-CHR^{7}- o un grupo alfa- o
beta-orientado:
en donde R^{6} y R^{7} se
eligen independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halo,
alcoxi inferior, acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo,
hidroxicarbonilo, alquilo, alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y
ariloxi;
y
R^{8} y R^{9} se eligen independientemente
del grupo consistente en hidrógeno, hidroxi, halo, alcoxi inferior,
acilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, hidroxicarbonilo, alquilo,
alcoxicarbonilo, aciloxialquilo, ciano y ariloxi, o bien R^{8} y
R^{9} juntos comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico, o bien R^{8} o R^{9} juntos con R^{6} o
R^{7} comprenden una estructura de anillo carbocíclico o
heterocíclico condensado al anillo pentacíclico D.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
donde R^{3} es hidrógeno, -A-A- representa el
grupo -CHR^{4}-CHR^{5}-, -B-B-
representa el grupo -CHR^{6}-CHR^{7}- y R^{4},
R^{5}, R^{6} y R^{7} son cada uno hidrógeno.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde dicho compuesto de sustrato se elige del grupo consistente
en:
y un producto de la reacción de
epoxidación se elige del grupo consistente
en
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde dicho compuesto de sustrato se elige del grupo consistente
en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
y un producto de la reacción de
epoxidación se elige del grupo consistente
en:
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|---|---|---|---|
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