KR100523227B1 - 7α-카르복실9,11-에폭시스테로이드의제조방법및여기에유용한중간체및올레핀계이중결합의에폭시화를위한일반방법 - Google Patents
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Abstract
(화학식 I)
(화학식 III)
여러 신규한 반응식, 신규한 공정단계 및 신규한 중간체가 에폭시멕스레논 및 화학식 I의 다른 화합물의 합성에 제공되고, -A-A-는 기 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5-를 나타내고, R3, R4 및 R5는 수소, 할로, 히드록시, 저급알킬, 저급알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노 및 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, R1은 α-배향 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 라디칼을 나타내고, -B-B-는 기 -CHR6-CHR7- 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고, R6 및 R7은 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, R8 및 R9는 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노 및 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, 또는 R8 및 R9는 함께 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 또는 R8 또는 R9는 R6 또는 R7과 함께 5환 D고리로 축합된 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이룬다.
Description
본 발명은 9,11-에폭시 스테로이드 화합물, 특히 20-스피록산 계열 및 그 유사체의 신규한 제조방법, 스테로이드 화합물의 제조에 유용한 신규한 중간체, 및 그러한 신규한 중간체의 제조방법에 관한 것이다. 가장 구체적으로, 본 발명은 메틸 수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤(에플러레논; 에폭시멕스레논)의 신규하고 유리한 제조방법에 관한 것이다.
20-스피록산 계열 화합물의 제조방법이 미국특허 제 4,559,332호에 기재되어 있다. '332 특허의 방법에 따라 제조된 화합물은 화학식 IA
[상기 화학식에서
-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,
R1은 α-배향 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 라디칼을 나타내고,
-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고
R6 및 R7은 수소이고
X는 2개의 수소원자 또는 옥소를 나타내고,
Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-을 나타내고, 또는
Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고
Y2는 히드록시, 저급 알콕시 또는 X가 H2이면 저급 알칸오일옥시를 나타낸다]의 개방산소 함유 고리 E 및 X가 옥소, Y2가 히드록시인 그러한 화합물의 염, 즉 대응하는 17β-히드록시-21-카르복실산을 갖는다.
미국특허 제 4,559,332호에는 에폭시멕스레논 및 화학식 IA의 관련 화합물의 각종 제조방법이 기재되어 있다. 에폭시멕스레논에 대한 새롭고 확장된 임상적 사용의 접근은 여러 관련 스테로이드의 개선된 제조방법을 필요로 하고 있다.
발명의 개요
본 발명의 주목적은 에폭시멕스레논, 다른 20-스피록산 및 통상의 구조 특징을 갖는 다른 스테로이드의 개선된 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 구체적 목적은: 화학식 IA 및 다른 관련 화합물의 생성물을 고수율로 제조하는 개선된 방법을 제공하는 것이고; 최소의 분리단계를 포함하는 그러한 방법을 제공하는 것이고; 합리적인 가격비용을 만족시킬 수 있고 합리적인 전환비용으로 조작할 수 있는 그러한 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 일련의 에폭시멕스레논의 합성 반응식, 에플러레논의 제조에 유용한 중간체; 및 그러한 신규한 중간체의 합성에 관한 것이다.
신규한 합성반응식은 바람직한 구체예의 설명에 상세하게 기재되어 있다. 본 발명의 신규한 중간체는 바로 후기하는 것이다.
화학식 IV의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서:
-A-A-는 기 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5-를 나타내고
R3, R4 및 R5는 수소, 할로, 히드록시, 저급알킬, 저급알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시 카르보닐, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,
R1은 α-배향 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 라디칼을 나타내고,
R2는 11α-이탈기이며 그 제거는 9- 및 11- 탄소원자사이의 이중결합을 생성하는데 유효하고;
-B-B-는 기 -CHR6-CHR7- 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:
(화학식 III)
R6 및 R7은 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록스알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,
R8 및 R9는 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록스알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, 또는 R8 및 R9는 함께 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 또는 R8 또는 R9는 R6 또는 R7과 함께 5환 D고리로 축합된 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이룬다.
화학식 IVA의 화합물은 화학식 IV에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)은 상기한 바와같다.
화학식 IVB의 화합물은 화학식 IVA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
화학식 IVC, 화학식 IVD 및 화학식 IVE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소, R1은 알콕시카르보닐, 바람직하게는 메톡시카르보닐인 화학식 IV, 화학식 IVA 또는 화학식 IVB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 IV의 범위내의 화합물은 저급 알킬술포닐화 또는 아실화시약 또는 할라이드 생성제와, 화학식 V의 범위내의 대응화합물을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
화학식 V의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R1, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 VA의 화합물은 화학식 V에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 VB의 화합물은 화학식 VA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 VC, 화학식 VD 및 화학식 VE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소, R1은 알콕시카르보닐, 바람직하게는 메톡시카르보닐인 화학식 V, 화학식 VA 또는 화학식 VB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 V의 범위내의 화합물은 알칼리금속 알콕시드와 화학식 VI의 대응화합물을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
화학식 VI의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 VIA의 화합물은 화학식 VI에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 VIB의 화합물은 화학식 VIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 VIC, 화학식 VID 및 화학식 VIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 VI, 화학식 VIA 또는 화학식 VIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 VI, 화학식 VIA, 화학식 VIB 및 화학식 VIC의 화합물은 각각 화학식 VII, 화학식 VIIA, 화학식 VIIB 또는 화학식 VIIC에 대응하는 화합물을 가수분해함으로써 제조된다.
화학식 VII의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 VIIA의 화합물은 화학식 VII에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 VIIB의 화합물은 화학식 VIIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 VIIC, 화학식 VIID 및 화학식 VIIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 VII, 화학식 VIIA 또는 화학식 VIIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 VII의 범위내의 화합물은 화학식 VIII의 범위내의 화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
화학식 VIII의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 VIIIA의 화합물은 화학식 VIII에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 VIIIB의 화합물은 화학식 VIIIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 VIIIC, 화학식 VIIID 및 화학식 VIIIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 VIII, 화학식 VIIIA 또는 화학식 VIIIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 VIII의 범위내의 화합물은 11-히드록시기를 α-배향의 기질에 도입하는데 유효한 발효에 의해 하기한 화학식 XXX의 화합물로 이루어지는 기질을 산화시킴으로써 제조된다.
화학식 XIV의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 XIVA의 화합물은 화학식 XIV에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 XIV의 화합물은 화학식 XIVA에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 XIVC, 화학식 XIVD 및 화학식 XIVE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 XIV, 화학식 XIVA 또는 화학식 XIVB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 XIV의 범위내의 화합물은 화학식 XV의 범위내의 대응화합물을 가수분해하여 제조될 수 있다.
화학식 XV의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 XVA의 화합물은 화학식 XV에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 XVB의 화합물은 화학식 XVA에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 XVC, 화학식 XVD 및 화학식 XVE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 XV, 화학식 XVA 또는 화학식 XVB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 XV의 범위내의 화합물은 화학식 XVI의 범위내의 대응화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
화학식 XXI의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 XXIA의 화합물은 화학식 XXI에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 XXIB의 화합물은 화학식 XXIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 XXIC, 화학식 XXID 및 화학식 XXIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 XXI, 화학식 XXIA 또는 화학식 XXIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 XXI의 범위내의 화합물은 화학식 XXII의 범위내의 대응화합물을 가수분해함으로써 제조될 수 있다.
화학식 XXII의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 XXIIA의 화합물은 화학식 XXII에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 XXIIB의 화합물은 화학식 XXIIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 XXIIC, 화학식 XXIID 및 화학식 XXIIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 XXII, 화학식 XXIIA 또는 화학식 XXIIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 XXII의 범위내의 화합물은 화학식 XXIII의 범위내의 대응화합물을 시안화함으로써 제조될 수 있다.
화학식 XXIII의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 XXIIIA의 화합물은 화학식 XXIII에 대응하고, R8 및 R9는 부착되는 고리탄소와 함께 다음 화학식 XXXIV의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIV)
상기 화학식에서 X, Y1, Y2 및 C(17)는 상기한 바와같다.
화학식 XXIIIB의 화합물은 화학식 XXIIIA에 대응하고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
화학식 XXIIIC, 화학식 XXIIID 및 화학식 XXIIIE의 화합물은 각각, -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 XXIII, 화학식 XXIIIA 또는 화학식 XXIIIB중의 어떤 것에 대응한다. 화학식 XXIII의 범위내의 화합물은 하기한 화학식 XXIV의 화합물을 산화시켜 제조될 수 있다.
화학식 104의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서, -A-A-, -B-B-, R3은 화학식 IV에서 정의된 바와같고, R11은 C1 내지 C4 알킬이다.
화학식 104A의 화합물은 각각 -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 104에 대응한다. 화학식 104의 범위내의 화합물은 화학식 103의 화합물을 열분해시켜 제조될 수 있다.
화학식 103의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3 및 R11은 화학식 104에서 정의된 바와같다.
화학식 103A의 화합물은 각각 -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 103에 대응한다. 화학식 103의 범위내의 화합물은 알칼리금속 알콕시드와 같은 염기의 존재하에서 디알킬말로네이트와 화학식 102의 대응화합물을 반응시켜 제조될 수 있다.
화학식 102의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3 및 R11은 화학식 104에서 정의된 바와같다.
화학식 102A의 화합물은 각각 -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-, R3은 수소인 화학식 102에 대응한다. 화학식 102의 범위내의 화합물은 염기의 존재하에서 트리알킬술포늄 화합물과 화학식 101의 대응화합물을 반응시켜 제조될 수 있다.
화학식 101의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3 및 R11은 화학식 104에서 정의된 바와같다.
화학식 101A의 화합물은 각각 -A-A- 및 -B-B-가 -CH2-CH2-이고, R3은 수소인 화학식 101에 대응한다. 화학식 101의 범위내의 화합물은 산의 존재하에서 트리알킬오르토포르메이트와 11α-히드록시안드로스텐-3,17-디온 또는 화학식 XXXVI의 다른 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.
후기하는 특정 반응식의 개시에 기초하여, 이들 화합물은 특정 반응식에 대해 최대한의 이용성을 갖는 것이 명백할 것이다. 본 발명의 화합물의 사용은 에폭시멕스레논 및 다른 스테로이드에 대한 중간체로서 유용하다.
다른 목적 및 특징은 후기에서 일부 명백해지고 일부 지적될 것이다.
도 1은 칸레논 또는 칸레논 유도체를 대응하는 11α-히드록시 화합물로 생물변환(bioconversion)시키는 공정의 개략적 흐름도이다.
도 2는 칸레논 및 칸레논 유도체를 11α-히드록실화에 의해 생물변환시키는 바람직한 공정의 개략적 흐름도이다.
도 3은 칸레논 및 칸레논 유도체를 11α-히드록실화에 의해 생물변환시키는 특히 바람직한 공정의 개략적 흐름도이다.
도 4는 도 2의 공정에 따라 제조한 칸레논의 입경분포를 나타낸다.
도 5는 도 3의 공정에 따라 형질전환 발효조에서 살균된 칸레논의 입경분포를 나타낸다.
대응하는 참고 특성은 도면을 통해 대응하는 부분을 가리킨다.
본 발명에 따르면, 에폭시멕스레논 및 화학식 I에 대응하는 다른 화합물의 제조를 위한 각종 신규한 방법이 연구되었다:
상기 화학식에서,
-A-A-는 기 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5-를 나타내고
R3, R4 및 R5는 수소, 할로, 히드록시, 저급알킬, 저급알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,
R1은 α-배향 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시알킬 라디칼을 나타내고,
-B-B-는 기 -CHR6-CHR7- 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:
(화학식 III)
R6 및 R7은 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,
R8 및 R9는 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, 또는 R8 및 R9는 함께 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 또는 R6 또는 R7과 함께 R8 또는 R9는 5환 D고리로 축합된 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이룬다.
다르게 언급되지 않으면, 본 명세서에서의 "저급"이란 탄소원자수 7 이하, 바람직하게는 1 내지 4를 함유하는 것으로 언급된다.
저급 알콕시카르보닐 라디칼은 바람직하게는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸과 같은 탄소원자수 1 내지 4의 알킬라디칼에서 유도된 것이고; 특히 바람직하게는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 이소프로폭시카르보닐이다. 저급 알콕시 라디칼은 바람직하게는 상기한 C1-C4 알킬 라디칼, 특히 1차 C1-C4 알킬 라디칼의 것에서 유도된 것이고; 특히 바람직하게는 메톡시이다. 저급 알칸오일 라디칼은 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 7의 직쇄 알킬에서 유도된 것이고; 특히 바람직하게는 포르밀 및 아세틸이다.
15,16-위치에서의 메틸렌 다리결합은 바람직하게는 β-배향이다.
본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있는 바람직한 화합물 부류는 미국특허 제 4,559,332호에 기재된 20-스피록산 화합물, 즉 다음 화학식 IA에 대응하는 것이다:
(화학식 IA)
상기 화학식에서
-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,
-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 IIIA의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:
(화학식 IIIA)
R1은 α-배향 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 라디칼을 나타내고,
X는 2개의 수소원자, 옥소 또는 =S를 나타내고
Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-을 나타내고, 또는
Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고
Y2는 히드록시, 저급 알콕시 또는 X가 H2이면 저급 알칸오일옥시를 나타내고,
바람직하게는, 본 발명의 신규한 방법에 의해 제조된 20-스피록산 화합물은 Y1 및 Y2가 함께 산소다리결합 -O-을 나타내는 화학식 I의 것이다.
특히 바람직한 화학식 I의 화합물은 X가 옥소인 것이다.
X가 옥소인 화학식 IA의 20-스피록산 화합물중에서 특히 Y2와 함께 Y1이 산소다리결합 -O-을 나타내는 것이 가장 바람직하다.
상기한 바와같이, 17β-히드록시-21-카르복실산이 그 염의 형태일 수도 있다. 알칼리금속 및 알칼리토류 금속염과 같은 특히 금속 및 암모늄염, 예를들면 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및, 바람직하게는 칼륨, 염, 및 암모니아 또는 적당한, 바람직하게는 생리적으로 내성인 유기질소 함유 염기에서 유도된 암모늄염이 고려될 수 있다. 염기로서 아민, 예를들면 저급 알킬아민(예, 트리에틸아민), 히드록시-저급 알킬아민[예, 2-히드록시에틸아민, 디-(2-히드록시에틸)-아민 또는 트리-(2-히드록시에틸)-아민], 시클로알킬아민(예, 디시클로헥실아민) 또는 벤질아민(예, 벤질아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민) 뿐만 아니라 질소함유 헤테로고리 화합물, 예를들면 방향족 특성을 갖는 것(예, 피리딘 또는 퀴놀린) 또는 적어도 부분 포화된 헤테로고리환을 갖는 것(예, N-에틸피페리딘, 모르폴린, 피페라진 또는 N,N'-디메틸피페라진)도 고려될 수 있다.
또한 포함되는 것중 바람직한 화합물은 알칼리금속염, 특히 칼륨염이고, 화학식 IA의 화합물에서, R1은 알콕시카르보닐, X는 옥소, Y1 및 Y2 각각은 히드록시를 나타낸다.
특히 바람직한 화학식 I 및 화학식 IA 화합물은, 예를들면 다음과 같다:
9α,11α-에폭시-7α-메톡시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-7α-에톡시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-7α-이소프로폭시카르보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-디온, 및
각 화합물의 1,2-데히드로 유사체,
9α,11α-에폭시-6α,7α-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-6β,7β-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온,
9α,11α-에폭시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-20-스피록스-4-엔-3,21-디온, 및
이들 각 화합물의 1,2-데히드로 유사체,
9α,11α-에폭시-7α-메톡시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-7α-에톡시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-7α-이소프로폭시카르보닐-17β-히드록시-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6α,7α-메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6β,7β-메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산,
9α,11α-에폭시-17β-히드록시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-3-옥소-프레근-4-엔-21-카르복실산, 및 이들 각 산의 알칼리금속염, 특히 칼륨염 또는 암모늄, 및 언급된 카르복실산 또는 그 염 각각의 1,2-데히드로 유사체.
9α,11α-에폭시-15β,16β-메틸렌-3,21-디옥소-20-스피록스-4-엔-7α-카르복실산 메틸에스테르, 에틸에스테르 및 이소프로필에스테르,
9α,11α-에폭시-1565β,16β-메틸렌-3,21-디옥소-20-스피록사-1,4-디엔-7α-카르복실산 메틸에스테르, 에틸에스테르 및 이소프로필에스테르, 및
9α,11α-에폭시-3-옥소-20-스피록스-4-엔-7α-카르복실산 메틸에스테르, 에틸에스테르 및 이소프로필에스테르,
9α,11α-에폭시-6β,6β-메틸렌-20-스피록스-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-20-스피록스-4-엔-3-온, 및
또한 9α,11α-에폭시,17β-히드록시-17α(3-히드록시-프로필)-3-옥소-안드로스트-4-엔-7α-카르복실산 메틸에스테르, 에틸에스테르 및 이소프로필에스테르,
9α,11α-에폭시,17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6α,7α-메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시,17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6β,7β-메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온,
9α,11α-에폭시,17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-6β,7β;15β,16β-비스메틸렌-안드로스트-4-엔-3-온,
언급된 안드로스탄 화합물중 17α-(3-아세톡시프로필) 및 17α-(3-포르밀옥시프로필)유사체,
안드로스트-4-엔-3-온 및 20-스피록스-4-엔-3-온 계열중 언급된 모든 화합물의 1,2-데히드로 유사체를 포함한다.
화학식 I 및 화학식 IA의 화합물, 및 동일 특성의 구조적 특징을 갖는 유사체 화합물의 화학명은 다음 방식의 통상 명명법에 따라: Y2와 함께 Y1이 -O-를 나타내는 화합물은 20-스피록산으로부터(예를들면, X는 옥소, Y2와 함께 Y1이 -O-를 나타내는 화학식 IA의 화합물은 20-스피록산-21-온에서 유도된다); Y1 및 Y2 각각이 히드록시를, X는 옥소를 나타내는 것은 17β-히드록시-17α-프레근엔-21-카르복실산으로부터; Y1 및 Y2 각각이 히드록시를, X는 2개의 수소원자를 나타내는 것은 17β-히드록시-17α-(3-히드록시프로필)-안드로스탄으로부터 유도된다. 고리 및 개방 사슬형, 즉 락톤 및 17β-히드록시-21-카르복실산 및 그 염 각각은 후자가 단지 전자의 수화형으로서만 생각될 수 있게 서로 밀접하게 관련되어 있기 때문에 상기와 하기에서 이해되는 바와같이, 구체적으로 다르게 언급되지 않으면, 화학식 I의 최종 생성물 및 출발물질과 유사구조의 중간체 둘다는 각각의 경우에 모두 함께 언급된 형태일 수 있다.
본 발명에 따르면, 몇 가지의 별도의 공정이 고수율과 합리적인 비용으로 화학식 I의 화합물 제조에 제공되었다. 각각의 합성 반응식은 일련의 중간체 제조를 통해 진행된다. 많은 이들 중간체는 신규한 화합물이고 이들 중간체의 제조방법은 신규한 방법이다.
반응식 1(칸레논 또는 관련 물질로 출발)
화학식 I의 화합물의 제조를 위한 한 바람직한 방법은 칸레논 또는 다음 화학식 XIII에 대응하는 관련 출발물질로 개시한다:
상기 화학식에서
-A-A-는 기 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5-를 나타내고
R3, R4 및 R5는 수소, 할로, 히드록시, 저급알킬, 저급알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,
-B-B-는 기 -CHR6-CHR7 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:
(화학식 III)
R6 및 R7은 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, 그리고
R8 및 R9는 수소, 할로, 저급알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고 또는 R8 및 R9는 함께 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 또는 R6 또는 R7과 함께 R8 및 R9는 5환 D고리로 축합된 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이룬다. 도 1 및 도 2에 도시된 유형의 생물변환 공정을 사용하여 α-배향의 11-히드록시기를 화학식 XIII의 화합물에 도입하여 화학식 VIII의 화합물을 제조한다:
(화학식 VIII)
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, R8 및 R9는 상기한 바와같다. 바람직하게는, 화학식 XIII의 화합물은 다음 구조
(화학식 XXXA)
11α-히드록시 생성물은 다음 구조
(화학식 VIIIA)
[각각의 화학식에서
-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,
-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 IIIA의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:
(화학식 IIIA)
X는 2개의 수소원자, 옥소 또는 =S를 나타내고,
Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-를 나타내고, 또는
Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고
Y2는 히드록시, 저급알콕시 또는 X가 H2이면 저급 알칸오일옥시를 나타낸다] 및 X가 옥소, Y2가 히드록시인 화합물의 염을 갖고, 반응에서 생성한 화학식 VIII의 화합물은 화학식 VIIIA에 대응한다:
(화학식 VIIIA)
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XXXA에서 정의된 바와같다. 보다 바람직하게는, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 구조를 형성한다:
(화학식 XXXIII)
상기 화학식에서 -A-A- 및 -B-B-는 각각 -CH2-CH2-이고, R3은 수소이다.
본 히드록실화 단계에서 사용될 수 있는 바람직한 유기체들은 Aspergillus ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC 18500, Aspergillus niger ATCC 16888 및 ATCC 26693, Aspergillus nidulans ATCC 11267, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6227b, Streptomyces fradiae ATCC 10745, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas cruciviae ATCC 13262, 및 Trichothecium roseum ATCC 12543이다. 다른 바람직한 유기체로는 Fusarium oxysporum f.sp.cepae ATCC 11171 및 Rhizopus arrhizus ATCC 11145를 들 수 있다.
이 반응에 대한 활성을 나타낸 다른 유기체로는 Absidia coerula ATCC 6647, Absidia glauca ATCC 22752, Actinomucor elegans ATCC 6476, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 7159 및 ATCC 13144, Botryosphaeria obtusa IMI 038560, Calonectria decora ATCC 14767, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia clavata ATCC 22921, Curvularia lunata ATCC 12071, Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12722, Gongronella butleri ATCC 22822, Hypomyces chrysospermus, Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor griseo-cyanus ATCC 1207A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina, Paecilomyces carneus ATCC 46579, Penicillum patulum ATCC 24550, Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635, Sepedonium chrysospermum ATCC 13378, Stachylidium bicolor ATCC 12672, Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438, Streptomyces purpurascens ATCC 25489, Syncephalastrum racemosum ATCC 18192, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Thielavia terricola ATCC 13807, 및 Verticillium theobromae ATCC 12474를 들 수 있다.
11α-히드록실화를 위해 활성을 나타내는 것을 기대할 수 있는 추가의 유기체로는 Cephalosporium aphidicola(Phytochemistry (1996), 42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas(J. Biotechnol. (1995), 42(2), 145-150), Tieghemella orchidis(Khim.-Farm. Zh. (1986), 20(7), 871-876), Tieghemella hyalospora(Khim.-Farm. Zh. (1986), 20(7), 871-876), Monosporium olivaceum (Acta Microbiol. Pol. Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Aspergillus ustus(Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Fusarium graminearum(Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), Verticillium glaucum(Acta Microbiol. Pol., Ser. B. (1973), 5(2), 103-110), 및 Rhizopus nigricans(J. Steroid Biochem. (1987), 28(2), 197-201)을 들 수 있다.
칸레논 또는 화학식 XIII의 다른 기질의 히드록실화를 위한 규모 발효생산을 하기 전에, 세포의 접종원을 종균발효조, 또는 일련의 두 개 이상의 종균발효조로 이루어지는 종균발효시스템에서 생산한다. 작업저장포자 현탁액을 세포성장을 위해 배양액과 함께 제1종균발효조에 도입한다. 생산에 필요하거나 또는 원하는 접종원의 부피가 제1종균발효조에서 생산된 것을 초과하면, 접종원 부피는 종균발효열중 잔류 발효조를 통해 연쇄적으로 점진적이고 기하학적으로 증폭될 수 있다. 바람직하게는, 종균발효시스템에서 생산된 접종원은 생산발효조, 비교적 짧은 생산배치순환, 및 고생산발효조 활성에서 반응의 개시를 신속하게 이루기 위한 충분한 부피의 생육세포이다. 일련의 종균발효조의 용기수가 얼마이더라도, 제2 및 후속의 종균발효조는 바람직하게는 이 열의 각 단계에서 희석도가 본질적으로 동일하게 되는 크기이다. 각 종균발효조에서의 접종원의 초기 희석은 생산발효조에서의 희석과 대체로 동일할 수 있다. 칸레논 또는 다른 화학식 XIII 기질을 접종원 및 배양액과 함께 생산발효조에 넣고, 히드록실화 반응을 여기서 수행한다.
종균발효시스템에 넣은 포자현탁액은 사용하기 전에 극저온 상태하에서 저장되는 작업저장세포 뱅크를 구성하는 복수의 바이알에서 취한 작업저장포자 현탁액의 바이알에서 유래한다. 다음에는 작업저장세포 뱅크를 다음 방식으로 제조한 주 저장세포 뱅크에서 유래한다. 적당한 공급원, 예를들면, ATCC에서 얻은 포자표본을 수성 배지, 예를들면 염수 용액, 배양액 또는 계면활성제 용액(예, 약 0.001중량%의 농도에서 Tween 20과 같은 비이온성 계면활성제)에서 초기 현탁하고, 현탁액을 배양 플레이트중에 분배하고, 각각의 플레이트는 전형적으로 포자가 번식하는 한천과 같은 비분해성 다당류에 기초한 고체 배양 혼합물을 포함하고 있다. 고체 배양혼합물은 바람직하게는 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스, 약 0.05중량% 내지 약 5중량%의 질소공급원, 예를들면 펩톤, 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인공급원, 예를들면 인산수소이칼륨과 같은 알칼리금속인산염 또는 암모늄인산염, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 효모 리세이트 또는 추출물(또는 육 추출물과 같은 다른 아미노산 공급원 또는 뇌심장 배양액), 약 1중량% 내지 약 2중량%의 한천 또는 다른 비분해성 다당류를 함유한다. 임의로, 고체 배양혼합물은 약 0.1중량% 내지 약 5중량%의 맥아 추출물을 더 포함하고 또는 함유할 수 있다. 고체 배양혼합물의 pH는 바람직하게는 약 5.0 내지 약 7.0이고, 알칼리금속 수산화물 또는 오르토인산에 의해 필요한 만큼 조정한다. 유용한 고체 성장배지들은 다음과 같다:
1. 고체 배지 #1: 1% 글루코스, 0.25% 효모추출물, 0.3% K2HPO4 및 2% 한천(Bacto); pH를 20% NaOH로 6.5로 조정.
2. 고체 배지 #2: 2% 펩톤(Bacto), 1% 효모추출물(Bacto), 2% 글루코스 및 2% 한천(Bacto); pH를 10% H3PO4로 5로 조정.
3. 고체 배지 #3: 0.1% 펩톤(Bacto), 2% 맥아추출물(Bacto), 2% 글루코스 및 2% 한천(Bacto); pH 5.3.
4. 액체 배지: 5% 블랙스트랩 당밀, 0.5% 콘스팁액(cornsteep liquor), 0.25% 글루코스, 0.25% NaCl 및 0.5% KH2PO4, pH를 5.8로 조정.
5. Difco Mycological 한천(저 pH).
주 저장세포 뱅크의 전개(development)에 사용된 한천 플레이트수는 장래 주 저장에 필요한 만큼 선택할 수 있지만, 전형적으로 약 15 내지 30개의 플레이트를 이렇게 제조한다. 적당한 성장기간, 예를들면 7 내지 10일 후에 플레이트를 수성 부형제, 전형적으로 염수 또는 완충액의 존재하에서 포자를 수확하기 위해 긁어 모으고 얻은 주 저장현탁액을 복수의 1.5ml 바이알 각각에 소량, 예를들면 1ml씩 분배한다. 연구 또는 생산 발효조작에 사용하기 위한 작업저장포자 현탁액을 제조하기 위해, 한 개 이상의 이들 제2발생 주 저장 바이알의 함량은 주 저장포자 현탁액의 제조를 위해 상기한 방법으로 한천 플레이트상에 분배하고 여기서 배양할 수 있다. 일정한 제조조작을 생각할 때, 100 내지 400개만큼 많은 플레이트가 제2발생 작업저장을 발생하는데 사용될 수 있다. 각 플레이트를 별도의 작업저장 바이알로 긁어 모으고 전형적으로 1ml의 접종원을 함유하는 각각의 바이알을 제조하였다. 영구보존을 위해, 주 저장현탁액 및 제2발생 생산접종원 둘다를 액체 N2 또는 다른 극저온액체를 함유하는 극저온 저장용기의 증기공간에 유리하게 저장한다.
도 1에 도시된 공정에서, 수성 성장배지를 펩톤, 효모 유도체 또는 대등물, 글루코스와 같은 질소 공급원 및 인산염과 같은 인 공급원을 포함하도록 제조한다. 미생물의 포자를 종균 발효시스템에서 이 배지중에서 배양한다. 바람직한 미생물은 Aspergillus ochraceus NRRL 405(ATCC 18500)이다. 다음에 이렇게 제조한 종균저장을 화학식 XIII의 기질과 함께 생산발효조에 도입한다. 발효 배양액을 교반하고 반응시키는데 충분한 시간동안 통기시켜 원하는 정도에서 종료시킨다.
종균 발효조를 위한 배지는 바람직하게는, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스, 약 0.05중량% 내지 5중량%의 질소공급원, 예를들면 펩톤, 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인공급원, 예를들면 인산암모늄 일염기 또는 인산수소이칼륨과 같은 암모늄 또는 알칼리금속 인산염, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 효모 리세이트 또는 추출물(또는 증류기에서 용해될 수 있는 다른 아미노산 공급원), 약 1중량% 내지 약 2중량%의 한천 또는 다른 비분해성 다당류를 함유하는 수성혼합물로 이루어진다. 특히 바람직한 종균성장배지는 약 0.05중량% 내지 약 5중량%의 펩톤과 같은 질소공급원, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 자기분해된 효모 또는 효모추출물, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스, 및 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인산암모늄 일염기와 같은 인공급원을 함유한다. 특히 경제적인 공정조작은 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 콘스팁액, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 자기분해된 효모 또는 효모추출물, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스 및 약 0.05중량% 내지 0.5중량%의 인산암모늄 일염기를 함유하는 다른 바람직한 종균배양물을 사용하여 얻는다. 콘스팁액은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 유기산, 비타민, 금속이온, 미량물질 및 인산염의 특히 바람직한 경제적인 공급원이다. 다른 곡물로부터의 매시액은 콘스팁액 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 알칼리금속 수산화물 또는 오르토인산의 첨가로 약 5.0 내지 약 7.0의 범위내에서 조정된다. 콘스팁액이 질소 및 탄소 공급원으로서 사용되면, pH는 바람직하게는 약 6.2 내지 약 6.8의 범위내에서 조정된다. 펩톤 및 글루코스로 이루어지는 배지는 바람직하게는 약 5.4 내지 약 6.2의 pH로 조정된다. 종균발효에 사용하는데 유용한 성장배지는 다음과 같다:
1. 배지 #1: 2% 펩톤, 2% 자기분해된 효모(또는 효모 추출물) 및 2% 글루코스; pH를 20% NaOH로 5.8로 조정.
2. 배지 #2: 3% 콘스팁액, 1.5% 효모 추출물, 0.3% 인산암모늄 일염기 및 3% 글루코스; pH를 20% NaOH로 6.5로 조정.
미생물 포자를 전형적으로 현탁액의 ml당 약 109포자를 함유하는 바이알로부터 이 배지에 도입한다. 종균발생의 최적의 생산성은 종균배양을 개시할 때 ml당 약 107 미만으로 포자 상태밀도를 감소시키지 않고 성장배지를 희석하여 실현된다. 바람직하게는, 종균발효조에서의 충전균사부피(PMV)가 적어도 약 20%, 바람직하게는 35% 내지 45%가 될 때까지 포자를 종균발효시스템에서 배양한다. 종균발효 용기(또는 종균발효열로 이루어지는 복수의 어떤 용기)에서의 순환은 그 용기의 초기 농도에 의존하기 때문에 전체 공정을 가속화하기 위해 2 또는 3의 종균발효 단계를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 종균발효가 과도한 단계수를 거쳐 시행된다면 활성이 저하될 수 있기 때문에 3개보다 현저하게 많은 일련의 종균발효조를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 종균배양 발효는 약 23℃ 내지 약 37℃의 범위, 바람직하게는 약 24℃ 내지 약 28℃의 범위의 온도에서 교반하에서 시행한다.
종균발효 시스템으로부터의 배양물을 생산성장배지와 함께 생산발효조에 도입한다. 본 발명의 한 구체예에서, 비살균 칸레논 또는 화학식 XIII의 다른 기질 이 반응 기질로서 사용된다. 바람직하게는, 성장배지에 10중량% 내지 30중량%의 슬러리 형태로 기질을 생산발효조에 가한다. 11α-히드록실화 반응에 유효한 표면적을 증가시키기 위해, 화학식 XIII 기질의 입경을 발효조에 도입하기 전에 오프라인 미분화기에 기질을 통과시킴으로써 감소시킨다. 글루코스 함유 살균 배양물 저장 및 자기분해된 효모와 같은 효모 유도체 함유 제2의 살균 배양액(또는 증류기에서 용해될 수 있는 다른 공급원에 기초한 대등한 아미노산 제조물)을 또한 별도로 도입한다. 배지는 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스, 약 0.05중량% 내지 약 5중량%의 질소공급원, 예를들면 펩톤, 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인공급원, 예를들면 인산수소이칼륨과 같은 알칼리금속인산염 또는 암모늄인산염, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 효모 리세이트 또는 추출물(또는 증류기에서 용해될 수 있는 다른 아미노산 공급원), 약 1중량% 내지 약 2중량%의 한천 또는 다른 비분해성 다당류를 함유하는 수성혼합물로 이루어진다. 특히 바람직한 생산성장배지는 약 0.05중량% 내지 약 5중량%의 펩톤과 같은 질소공급원, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 자기분해된 효모 또는 효모추출물, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스 및 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인산암모늄 일염기와 같은 인공급원을 함유한다. 다른 바람직한 생산배지는 약 0.5중량% 내지 5중량%의 콘스팁액, 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 자기분해된 효모 또는 효모 추출물, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스 및 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인산암모늄 일염기를 함유한다. 생산발효배지의 pH는 바람직하게는 각각 펩톤/글루코스계 배지 및 콘스팁액계 배지의 pH와 동일한 바람직한 범위에서 종균 발효배지에 대한 상기한 방식으로 조정된다. 유용한 생물변환 성장배지는 하기와 같다:
1. 배지 #1: 2% 펩톤, 2% 자기분해된 효모(또는 효모 추출물) 및 2% 글루코스; pH를 20% NaOH로 5.8로 조정.
2. 배지 #2: 1% 펩톤, 1% 자기분해된 효모(또는 효모 추출물) 및 2% 글루코스; pH를 20% NaOH로 5.8로 조정.
3. 배지 #3: 0.5% 펩톤, 0.5% 자기분해된 효모(또는 효모 추출물) 및 0.5% 글루코스; pH를 20% NaOH로 5.8로 조정.
4. 배지 #4: 3% 콘스팁액, 1.5% 효모 추출물, 0.3% 인산암모늄 일염기 및 3% 글루코스; pH를 20% NaOH로 6.5로 조정.
5. 배지 #5: 2.55% 콘스팁액, 1.275% 효모 추출물, 0.255% 인산암모늄 일염기 및 3% 글루코스; pH를 20% NaOH로 6.5로 조정.
6. 배지 #6: 2.1% 콘스팁액, 1.05% 효모 추출물, 0.21% 인산암모늄 일염기 및 3% 글루코스; pH를 20% NaOH로 6.5로 조정.
비살균 칸레논 및 살균 배양액을 생산배치순환에 대해 각각 5 내지 20부, 바람직하게는 10 내지 15부, 바람직하게는 실질적으로 동일한 부분을 생산발효조에 연속 공급한다. 유리하게, 종균발효배양액으로 배양하기 전에 약 0.1중량% 내지 약 3중량%, 바람직하게는 약 0.5중량% 내지 약 2중량%의 농도를 확정하는데 충분한 양으로 기질을 초기에 도입하고, 다음에 약 1중량% 내지 약 8중량%의 누적율로 용이하게 매 8 내지 24시간마다 주기적으로 가한다. 추가의 기질을 매 8시간 교대로 가하고, 총 첨가는 기질을 1일 기준으로만 가하는 경우보다 약간 낮을 수 있는데, 예를들면 0.25중량% 내지 2.5중량%이다. 후자의 실례에서 누적 칸레논 첨가는 2중량% 내지 약 8중량%의 범위를 필요로 할 수 있다. 발효반응동안 공급된 보충 배양혼합물은 바람직하게는 농축물, 예를들면 약 40중량% 내지 약 60중량%의 살균글루코스, 약 16중량% 내지 약 32중량%의 살균 효모 추출물 또는 다른 효모 유도체의 살균공급원(또는 다른 아미노산 공급원)을 함유하는 혼합물이다. 도 1의 생산발효조에 공급된 기질이 비살균이기 때문에, 항생물질을 주기적으로 발효배양액에 가하여 원하지 않는 유기체의 성장을 제어한다. 카나마이신, 테트라시클린 및 세팔렉신과 같은 항생물질을 성장 및 생물변환에 불리하게 영향을 끼치지 않으면서 가할 수 있다. 바람직하게는, 이것을 발효배양액에 예를들면 배양액의 총량을 기준으로 약 0.0004% 내지 약 0.002%의 농도로, 예를들면 다시 배양액의 총량을 기준으로 약 0.0002% 내지 약 0.0006% 카나마이신 술페이트, 약 0.0002% 내지 약 0.006% 테트라시클린 HCl 및/또는 약 0.001% 내지 0.003% 세팔렉신으로 이루어지는 농도로 도입한다.
전형적으로, 생산발효 배치순환은 약 80-160시간이다. 따라서, 화학식 XIII 기질 및 배양액 일부를 각각 전형적으로 매 2 내지 10시간, 바람직하게는 매 4 내지 6시간으로 가한다. 유리하게, 기포방지 또한 종균발효시스템 및 생산발효조에 포함된다.
바람직하게는, 도 1의 공정에서, 생산발효조에 충전한 접종원은 발효조내의 총 혼합물을 기준으로 약 0.5 내지 약 7부피%, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 2부피%이고, 글루코스 농도는 총 배치충전을 기준으로 바람직하게는 약 0.05중량% 내지 약 0.25중량%씩의 주기적 첨가로 약 0.01중량% 내지 약 1.0중량%, 바람직하게는 약 0.025중량% 내지 약 0.5중량%, 보다 바람직하게는 약 0.05중량% 내지 약 0.25중량%에서 유지된다. 발효온도는 용이하게 약 20℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 약 24℃ 내지 약 28℃의 범위내에서 제어되지만, 충전균사부피(PMV)를 약 60% 미만, 보다 바람직하게는 약 50% 미만으로 유지하여 발효배양액의 점도가 충분한 혼합으로 방해되는 것을 방지하기 위해 반응동안에 단계적으로 감소하는 온도, 예를들면 2℃ 증분량이 바람직할 수 있다. 생물량(biomass) 성장이 액체 표면위로 신장되면, 생물량내로 유지된 기질은 반응대(reaction zone) 중에서 시행될 수 있고 히드록실화 반응에 무효해진다. 생산성을 위해, 발효반응의 처음 24시간내에서 30 내지 50%, 바람직하게는 35% 내지 45% 범위의 PMV에 도달하는 것이 바람직하지만, 바람직하게는 이후의 조건을 상기한 한계내에서 추가 성장을 어떻게든 제어하도록 한다. 반응동안 발효배지의 pH는 약 5.0 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.2 내지 약 5.8로 제어되고, 발효조는 약 400 내지 약 800rpm의 속도에서 교반된다. 적어도 약 10% 포화의 용존산소량 수준은, 약 0.2 내지 약 1.0vvm에서 배치를 통기하고, 대기압 근처 내지 약 1.0바아 게이지, 가장 바람직하게는 약 0.7바아 게이지 근처에서 발효조의 헤드공간의 압력을 유지함으로써 달성된다. 교반속도는 최소의 용존산소량 수준을 유지하는데 필요한 만큼 증가시킬 수 있다. 유리하게, 용존산소량을 기질의 전환을 촉진하기 위해 10% 이상, 사실 50%만큼 높게 유지한다. 최적의 생물변환을 하기 위해 pH를 5.5±0.2의 범위에서 유지한다. 기포화는 통상의 기포방지제를 필요한 만큼 가하여 제어한다. 모든 기질을 가한 후에, 바람직하게는 화학식 VIII 생성물 대 잔류하는 미반응 화학식 XIII 기질의 몰비가 적어도 약 9 대 1이 될 때까지 반응을 계속한다. 그러한 전환은 80-160시간의 상기한 배치순환내에서 달성될 수 있다.
고 전환율은 기질이 액체 배양액밖으로 튕겨 나가는 것을 방지하기 위해 통기속도 및 교반속도를 제어함으로써 초기 배양수준을 초기 충전수준으로 감소시키는데 관련된다는 것을 알았다. 도 1의 공정에서, 배양수준을 초기 충전수준의 약 60%이하, 바람직하게는 약 50%로 감소시킨 다음에 유지하고; 반면 도 2 및 도 3의 공정에서, 배양수준을 초기 충전수준의 약 80%이하, 바람직하게는 약 70%로 감소시킨 다음에 유지하였다. 통기속도는 바람직하게는 1vvm이하, 보다 바람직하게는 약 0.5vvm의 범위이고; 반면 교반속도는 바람직하게는 600rpm이하이다.
화학식 VIII의 화합물 제조에 특히 바람직한 방법을 도 2에 도시한다. 다시 바람직한 미생물은 Aspergillus ochraceus NRRL 405(ATCC 18500)이다. 이 방법에서, 성장배지는 바람직하게는 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 콘스팁액, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스, 약 0.1중량% 내지 약 3중량%의 효모 추출물, 및 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 인산암모늄으로 이루어진다. 그러나, 본문에 기재된 다른 생산성장배지도 사용될 수 있다. 종균배양은 본문에 기재된 어떤 종균발효배지를 사용하여 도 1의 공정에 대해 기재된 방식으로 본질적으로 생산된다. 성장배지에서의 비 미분화 칸레논 또는 다른 화학식 XIII의 기질 현탁액을 바람직하게는 약 10중량% 내지 약 30중량% 기질의 비교적 고농도로 블렌더에서 무균으로 제조한다. 바람직하게는, 무균제조는 혼합후에 현탁액의 살균 또는 저온살균을 포함할 수 있다. 생산배치에 필요한 살균 기질현탁액의 전체양을 배치의 개시에서 또는 주기적인 연속공급으로 생산발효조에 도입한다. 기질의 입경은 슬러리를 생산발효조로 운반하는 온라인 시어펌프에서 습식 분쇄하여 오프라인 미분화기의 사용에 대한 필요를 제거함으로써 감소시킨다. 무균조건을 살균보다 저온살균으로 할 때, 응집도는 중요하지 않을 수 있지만 시어펌프의 사용은 입경의 확실한 제어를 제공하기 위해 바람직할 수 있다. 살균성장배지 및 글루코스 용액을 상기와 동일한 방식으로 본질적으로 생산발효조에 도입한다. 생산 발효조로의 모든 공급 성분을 도입하기 전에 살균하여 항생물질을 필요하지 않게 한다.
바람직하게는, 도 2의 공정 조작에서, 약 0.5% 내지 약 7%의 농도로 접종원을 생산발효조에 도입하고, 발효 온도는 약 20℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 약 24℃ 내지 약 28℃이고, pH는 약 4.4 내지 약 6.5, 바람직하게는 예를들면 기체 암모니아, 수성 수산화암모늄, 수성 알칼리금속 수산화물, 또는 오르토인산의 도입으로 약 5.3 내지 약 5.5로 제어한다. 도 1의 방법에서와 같이, 온도는 바람직하게는 생물량의 성장을 제어하기 위해 조절되어 PMV가 55-60%를 초과하지 않는다. 초기 글루코스 충전은 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 4중량%, 가장 바람직하게는 2.5중량% 내지 3.5중량%이지만, 바람직하게는 발효동안에 약 1.0중량% 미만으로 벗어나게 된다. 보충 글루코스를 전체 배치 충전을 기준으로 하여 약 0.2중량% 내지 약 1.0중량%의 부분을 주기적으로 공급하여 약 0.1중량% 내지 약 1.5중량%, 바람직하게는 약 0.25중량% 내지 약 0.5중량% 범위내의 발효대에서 글루코스 농도를 유지한다. 임의로, 질소 및 인 공급원은 글루코스와 함께 보충될 수 있다. 그러나, 전체 칸레논 충전이 배치순환의 개시에서 제조되기 때문에, 질소 및 인 함유 배양물의 필수적인 공급을, 반응도중에 보충용의 글루코스 용액만을 사용하는 때에 도입할 수 있다. 교반 속도 및 성질은 현저하게 다양할 수 있다. 적당히 격렬한 교반은 고체기질과 수상 사이의 질량이동을 용이하게 한다. 그러나, 저 시어 임펠러는 미생물의 미엘린의 감성을 방지하는데 사용된다. 최적의 교반속도는, 배양액 점도, 산소농도, 및 용기, 배플 및 임펠러 구성에 의해 영향받는 혼합상태에 의존하여 200 내지 800rpm 범위내에서 다양해진다. 통상, 바람직한 교반속도는 350-600rpm 범위이다. 바람직하게는 교반 임펠러는 하향 축의 펌프기능을 제공하여 발효 생물량의 양호한 혼합에 조력한다. 배치는 바람직하게는 약 0.3 내지 1.0vvm, 바람직하게는 0.4 내지 0.8vvm의 속도로 통기하고, 발효조의 헤드공간에서의 압력은 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1.0바아 게이지이다. 온도, 교반, 통기 및 배압은 바람직하게는 생물변환동안 적어도 약 10부피% 범위에서 용존산소량을 유지하기 위해 제어된다. 총 배치순환은 전형적으로 약 100 내지 약 140 시간이다.
도 2의 공정의 조작원리는 실질적으로 전체 칸레논 충전의 초기 도입에 의존하지만, 대부분의 칸레논을 충전하기 전에 발효 배양액의 성장을 시행할 수 있는 것이 이해될 것이다. 임의로, 소량의 칸레논을 배치에 나중에 가할 수도 있다. 그러나, 일반적으로 적어도 약 75%의 살균 칸레논 충전은 발효 개시후에 48시간내에 형질전환 발효조에 도입해야 한다. 더욱이, 발효의 개시에서 적어도 약 25중량% 칸레논, 또는 생물변환 효소(들)의 발생을 촉진하기 위해 적어도 처음 24시간내에서 도입하는 것이 바람직하다.
도 3에 도시된 다른 바람직한 공정에서, 전체 배치충전 및 배양액은 접종원을 도입하기 전에 생산발효 용기에서 살균한다. 이들 중에서 바람직한 것 뿐만 아니라 사용될 수 있는 배양액은 본질적으로 도 2의 공정에서와 동일하다. 본 발명의 구체예에서, 기질 응집은 교반기 임펠러의 시어작용으로 되지 않고 다른 것은 살균시 형성되는 경향이 있다. 칸레논의 평균 입경이 약 200μ 미만이고 입자의 적어도 75중량%가 240μ보다 작으면 반응이 충분히 진행된다는 것을 알았다. 적어도 약 400cm/s의 선단속도로 200 내지 800rpm 범위의 적당한 속도에서 적당한 임펠러, 예를들면 디스크 터빈 임펠러의 사용이 생산발효조 내에서 살균시에 발생하는 경향이 있는 응집에도 불구하고 그러한 입경 특성을 유지하는데 충분한 시어속도를 제공한다는 것을 알았다. 도 3의 공정중 잔류 조작은 도 2의 공정에서와 본질적으로 동일하다. 도 2 및 도 3의 공정은 도 1의 공정보다 몇가지 분명한 이점을 제공한다. 특정 이점은 콘스팁액과 같은 저가의 배양염기의 사용에 따른다. 그러나 다른 이점은 항생물질의 불필요, 공급과정의 단순화 및 칸레논 또는 다른 화학식 XIII 기질의 배치 살균을 함으로써 실현된다. 다른 특정 이점은 반응순환중의 보충용 복합 배양액보다 단순한 글루코스 용액을 사용하는 데 있다.
도 1 내지 도 3에 도시된 공정에서, 도 VIII의 생성물은 여과 또는 저속 원심분리에 의한 반응액으로부터 분리될 수 있는 생물량과 함께 결정성 고체이다. 대안으로, 생성물은 유기용매로 전체 반응액으로부터 추출될 수 있다. 화학식 VIII의 생성물은 용매추출로 회수한다. 최대로 회수하기 위해, 액상 여액과 생물량 필터 또는 원심분리 케이크 둘다를 추출용매로 처리하지만, 통상 ≥95%의 생성물이 생물량과 관련된다. 전형적으로, 탄화수소, 에스테르, 염소화 탄화수소 및 케톤 용매를 추출에 사용할 수 있다. 바람직한 용매는 에틸아세테이트이다. 전형적으로 다른 적당한 용매로는 톨루엔 및 메틸이소부틸케톤을 들 수 있다. 액상으로부터 추출하기 위해, 접촉하는 반응용액의 부피와 대략 동일한 용매의 부피를 사용하는 것이 용이할 수 있다. 생물량으로부터 생성물을 회수하기 위해, 후자를 용매, 바람직하게는 기질의 초기 충전에 대해 다량, 예를들면 초기 칸레논 충전의 g당 50 내지 100ml 용매에 현탁하고, 얻어진 현탁액은 바람직하게는 생물량의 세공 및 리세스로부터 용매상으로 생성물을 운반하기 위해 20분 내지 몇 시간동안 환류한다. 다음에, 생물량을 여과 또는 원심분리로 제거하고 필터 케이크를 바람직하게는 새로운 용매 및 탈이온수 둘다로 세척한다. 수성 및 용매 세척액을 합하고 상들을 분리시킨다. 화학식 VIII의 생성물을 용액으로부터 결정화로 회수한다. 수율을 최대로 하기 위해, 균사를 새로운 용매와 2회 접촉시킨다. 방치하여 수상의 분리를 완료시킨 후에 생성물을 용매상으로부터 회수한다. 가장 바람직하게는, 용매를 결정화가 개시될 때까지 진공하에서 제거하고, 다음에 농축된 추출물을 결정 침전 및 성장에 충분한 시간, 전형적으로 8 내지 12시간동안 0℃ 내지 20℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 15℃의 온도로 냉각시킨다.
도 2의 공정 및 특히 도 3의 공정이 특히 바람직하다. 이들 공정을 저점도에서 조작하고 pH, 온도 및 용존산소량과 같은 공정척도에 밀접한 제어에 따른다. 더욱이, 살균상태는 항생물질에 의존하지 않고 쉽게 유지된다.
생물변환 공정은 발열이므로, 생산발효조내의 재킷이 있는 발효조 또는 냉각코일을 사용하여 열을 제거해야만 한다. 대안으로, 반응 배양액을 외부열 교환기를 통해 순환시킬 수 있다. 배양액중의 산소 퍼텐셜을 측정하기 위해 반응기로 도입하는 공기의 속도를 조절함으로써 확실하게 글루코스를 CO2 및 H2O로 전환시키고 반응물에 에너지를 제공하는데 충분한 적어도 약 5부피%, 바람직하게는 적어도 약 10부피%의 수준에서 용존산소량을 바람직하게는 유지시킨다. pH는 바람직하게는 약 4.5 내지 약 6.5에서 조정된다.
화학식 XIII의 기질의 11-히드록실화를 위한 각각 다른 방법에서, 생산성은 고체 기질에서 수상 또는 반응이 발생하는 것으로 이해되는 상계면으로 질량이동에 의해 제한된다. 상기한 바와같이, 기질의 입자 평균입경이 약 300μ미만으로 감소되고, 입자의 적어도 75중량%가 240μ미만인 한에서는 생산성이 질량이동율로 현저하게 제한되지 않는다. 그러나, 이들 공정의 생산성은 생산발효조로 유기용매중의 칸레논 또는 다른 화학식 XIII 기질의 실질적 충전을 제공하는 어떤 다른 구체예에서 더 증가될 수 있다. 한 옵션에 따르면, 기질을 수불혼화성 용매에 용해하고 수성 성장배지 접종원 및 계면활성제와 혼합한다. 유용한 수불혼화성 용매로는, 예를들면 DMF, DMSO, C6-C12 지방산, C6-C12 n-알칸, 식물성 기름, 소르비탄 및 계면활성제 수용액을 들 수 있다. 이 충전물의 교반으로 유기액상에서 반응 부위로의 기질의 질량이동을 위한 확장된 계면적을 갖는 에멀션 반응 시스템을 발생한다.
제2의 옵션은 물에의 용해성보다 실질적으로 큰 농도로 아세톤, 메틸에틸케톤, 메탄올, 에탄올 또는 글리세롤과 같은 수혼화성 용매에 초기에 용해시키는 것이다. 상승 온도에서 초기 기질용액을 제조함으로써 용해성을 증가시키고, 이로써 용액의 양을 증가하여 반응기에 도입된 기질을 형성하고 결국 반응기 페이로드를 증가시킨다. 가온한 기질용액을 성장배지 및 접종원을 포함하는 비교적 냉 수성 충전물과 함께 생산발효조 반응기에 넣는다. 기질용액을 수성배지와 혼합할 때, 기질이 침전된다. 그러나, 실질적 과포화 및 적당히 격렬한 교반의 조건하에서, 핵형성으로 결정성장을 지향하고 표면적이 높은 미립자를 형성한다. 높은 표면적은 액상과 고체기질 사이의 질량이동을 용이하게 한다. 더욱이, 수성액상에서의 기질의 평형농도를 수혼화성 용매의 존재하에서 증가시킨다. 따라서, 생산성이 가속화된다.
미생물이 수상중 고농도의 유기용매에 반드시 내성이 있을 수 없지만, 에탄올의 농도, 예를들면 약 3중량% 내지 약 5중량% 범위가 유리하게 사용될 수 있다.
제3의 옵션은 시클로덱스트린 수용액에 기질을 용해하는 것이다. 시클로덱스트린의 예로는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 메틸-β-시클로덱스트린을 들 수 있다. 기질:시클로덱스트린의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:1.5 기질:시클로덱스트린일 수 있다. 다음에 기질:시클로덱스트린 혼합물을 생물변환 반응기에 무균으로 가할 수 있다.
11α-히드록실화 공정중 11α-히드록시칸레논 및 다른 생성물(화학식 VIII 및 화학식 VIIIA)은 신규한 화합물이고, 이것은 반응배지를 여과하고, 여과 배지상에서 수집한 생물량으로부터 생성물을 추출함으로써 분리할 수 있다. 종래의 유기용매, 예를들면 에틸아세테이트, 아세톤, 톨루엔, 염소화 탄화수소 및 메틸이소부틸케톤을 추출에 사용할 수 있다. 다음에 화학식 VIII의 생성물을 동일한 유형의 유기용매로부터 재결정할 수 있다. 화학식 VIII의 화합물은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다.
바람직하게는, 화학식 VIII의 화합물은 화학식 VIIIA에 대응하는데, 여기서 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이고, R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다:
(화학식 XXXIII)
또한 반응식 1의 공정에 따르면, 화학식 VIII의 화합물을 시안화물 이온의 공급원과 알칼리성 조건하에서 반응시켜 다음 화학식 VII의 엔아민 화합물을 생성한다:
(화학식 VII)
상기 화학식에서 -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 상기한 바와같다.
기질이 화학식 VIIIA에 대응할 때, 생성물은 화학식 VIIA의 것이다:
상기 화학식에서 -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다.
화학식 VIII의 11α-히드록실 기질의 시안화는 염기와 알칼리금속염, 가장 바람직하게는 LiCl의 존재하에서 케톤 시아노히드린, 가장 바람직하게는 아세톤 시아노히드린과 같은 시안화물 이온 공급원과 반응시킴으로써 시행할 수 있다. 대안으로, 시안화는 산의 존재하에서 알칼리금속 시안화물을 사용함으로써 시아노히드린이 없어도 시행할 수 있다.
케톤 시아노히드린 공정에서, 반응은 용액, 바람직하게는 디메틸포름아미드 또는 디메틸술폭시드와 같은 비양성자성 극성용매를 사용하여 시행한다. 엔아민의 형성은 기질의 몰당 적어도 2몰의 시안화물 이온 공급원을 필요로 하고, 바람직하게는 약간 과잉량의 시안화물 공급원을 사용한다. 염기는 바람직하게는 디알킬아민, 트리알킬아민, 알칸올아민, 피리딘등과 같은 질소성 염기이다. 그러나, 알칼리금속 탄산염 또는 알칼리금속 수산화물과 같은 무기염기도 사용될 수 있다. 바람직하게는 화학식 VIII의 기질은 초기에 약 20중량% 내지 약 50중량%의 농도로 제공되고 염기는 기질의 당량당 0.5 내지 2당량의 비율로 제공된다. 반응 온도는 제한되지 않지만 생산성은 상승온도에서 조작에 의해 증가된다. 따라서, 예를들면 트리에틸아민을 염기로서 사용할 때, 반응은 유리하게 약 80℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도에서 시행한다. 그러한 온도에서, 약 5 내지 약 20시간내에 반응을 완료시키기 위해 진행시킨다. 디이소프로필에틸아민이 염기로서 사용되고 반응이 105℃에서 시행될 때, 반응은 8시간에서 완료된다. 반응시간이 완료될 때에, 용매를 진공하에서 제거하고 잔류 오일을 물에 용해하고 희석산, 바람직하게는 염산으로 pH 7로 중화시킨다. 생성물을 이 용액으로부터 침전시키고, 다음에 희석수로 세척하고 공기로 건조시킨다. 유리 HCN을 불활성 기체로 스트리핑하고 알칼리성 용액으로 퀀칭시킨다. 건조 침전을 클로로포름 또는 다른 적당한 용매에 흡수시킨 다음에 농 산, 예를들면 6N HCl로 추출한다. 추출물을 무기 염기, 바람직하게는 알칼리금속 수산화물의 첨가로 pH 7로 중화시키고, 0℃ 범위의 온도로 냉각시킨다. 얻은 침전을 세척하고 건조시킨 다음에 적당한 용매, 예를들면 아세톤에서 재결정하여 공정의 다음 단계에 사용하는데 적당한 화학식 VII의 생성물을 제조한다.
대안으로, 반응은 메탄올과 같은 수혼화성 유기용매로 이루어지는 수성 용매 시스템에서 또는 에틸아세테이트와 같은 물 및 유기용매로 이루어지는 2상 시스템에서 시행시킬 수 있다. 이 대안으로, 반응용액을 물로 희석하고 염화메틸렌 또는 클로로포름과 같은 유기용매를 사용하여 생성물을 추출한 다음에 농 무기산, 예를들면 2N HCl을 사용하여 유기 추출물에서 다시 추출함으로써 생성물을 회수할 수 있다. 미국특허 제 3,200,113호 참조.
또 다른 대안에 따르면, 반응은 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸, 피롤리돈 또는 디메틸술폭시드와 같은 수혼화성 용매에서 시행한 후에 반응 생성물 용액을 물로 희석하고 알칼리금속 탄산염의 첨가로 알칼리성이 되게 하고, 다음에 0℃ 내지 10℃로 냉각시켜 생성물을 침전시킬 수 있다. 바람직하게는, 시스템을 시안화물의 증발을 방지하는데 효과적인 하이포할라이트 또는 다른 시약으로 퀀칭시킨다. 여과하고 물로 세척한 후에, 침전 생성물은 공정의 다음 단계에 사용하는데 적당하다.
또 다른 대안에 따르면, 화학식 VII의 엔아민 생성물은 디메틸포름아미드 또는 디메틸아세트아미드와 같은 비양성자성 수혼화성 극성 용매로 이루어지는 수성 용매에서 과잉량의 알칼리금속 시안화물, 바람직하게는 NaCN으로 양성자 공급원의 존재하에서 화학식 VIII의 기질의 반응으로 제조될 수 있다. 양성자 공급원은 바람직하게는 무기산 또는 C1 내지 C5의 카르복실산이고, 황산이 특히 바람직하다. 이례적으로, 시안화 시약이 통상 DMF 중의 LiCN일 때 별도의 양성자 공급원을 가할 필요는 없다.
시안화물 이온을 바람직하게는 기질의 당량당 약 2.05 내지 약 5몰당량의 비율로 반응기에 넣는다. 무기산 또는 다른 양성자 공급원은 4,5 및 6,7의 이중결합을 통해 HCN의 첨가로 촉진된다고 생각되며 바람직하게는 기질의 몰당량당 적어도 1몰당량의 비율로 제공되고; 그러나 반응시스템은 존재하는 산보다 알칼리금속 시안화물을 과잉량으로 유지함으로써 염기성으로 한다. 반응은 바람직하게는 약 1 내지 8시간, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3시간동안 적어도 약 75℃, 전형적으로 60℃ 내지 100℃의 온도에서 시행한다. 반응이 완료될 때에, 반응혼합물을 바람직하게는 실온 근처로 냉각시키고; 생성 엔아민을, 반응 혼합물을 산성화하고 냉수, 바람직하게는 얼음욕 온도 근처에서 혼합함으로써 침전시킨다. 산성화는 17-락톤으로 근접해진다고 생각되고, 이것은 시안화를 행하는 염기성 조건하에서 개방되는 경향이 있다. 반응 혼합물을 반응중에 존재하는 동일한 산, 바람직하게는 황산을 사용하여 용이하게 산성화시킨다. 물을 바람직하게는 생성물의 몰당 약 10 내지 약 50몰당량의 비율로 가한다.
화학식 VII의 화합물은 신규한 화합물이고 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 바람직하게는, 화학식 VII의 화합물은 화학식 VIIA에 대응하는데, 여기서 -A-A- 및 -B-B-는 CH2-CH2이고, R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이고, R8 및 R9는 함께 화학식 다음 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직하게는 화학식 VII의 화합물은 5'R(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'α,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카르보니트릴이다.
반응식 1 합성의 다음 단계에서, 화학식 VII의 엔아민을 가수분해하여 다음 화학식 VI의 디케톤 화합물을 생성한다:
(화학식 VI)
상기 화학식에서 -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같다. 어떤 유기 또는 무기산을 가수분해에 사용할 수 있다. 염산이 바람직하다. 생산성을 증가시키기 위해, 저급 알칸올과 같은 수혼화성 유기용매가 바람직하게는 공용매로서 사용된다. 산은 화학식 VII 기질의 당량당 적어도 1 당량의 비율로 제공되어야 한다. 수성 시스템에서, 엔아민 기질 VII은 약 80℃에서 약 5시간동안 화학식 VII의 디케톤으로 실질적으로 전환될 수 있다. 상승온도에서의 조작은 생산성을 증가시키지만, 온도는 제한되지 않는다. 적당한 온도는 용매 시스템 및 산의 휘발성에 기초하여 선택한다.
바람직하게는, 화학식 VII의 엔아민 기질은 다음 화학식 VIIA에 대응하고
(화학식 VIIA)
디케톤 생성물은 다음 화학식 VIA에 대응한다:
(화학식 VIA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 VIIIA에서 정의된 바와같다.
반응 종료시, 용액을 0℃ 내지 25℃로 냉각시켜 생성물을 결정화시킨다. 생성물 결정을 이소프로판올 또는 메탄올과 같은 적당한 용매로부터 재결정하여 공정의 다음 단계에 사용하는데 적당한 화학식 VI의 생성물을 얻을 수 있으나 재결정은 통상 필요하지 않다. 화학식 VI의 생성물은 신규한 화합물이고, 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 바람직하게는 화학식 VI의 화합물은 화학식 VIA에 대응하고, 여기서 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2-이고, R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직하게는, 화학식 VI의 화합물은 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카르보니트릴이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 화학식 VII의 엔아민 생성물은 상기한 방식으로 화학식 VIII의 화합물로부터 제조되고, 원위치에서 화학식 VI의 디케톤으로 전환하였다. 본 발명의 구체예에서, 화학식 VIII 기질을 양성자 공급원 함유 수성용매에서 과잉량의 알칼리금속 시안화물과, 또는 상기한 염기 및 LiCl의 존재하에서 임의로 과잉량의 케톤 시아노히드린과 반응시킨다. 그러나, 반응 혼합물을 냉각시키는 대신에, 산성화하고 엔아민의 침전을 일으키기 위해 계산한 농도로 물을 가하고, 반응 혼합물의 실질적 냉각은 바람직하게는 생략한다. 물 및 산, 바람직하게는 황산과 같은 무기산을 시안화 반응 종료시에 혼합물에 가하고, 가한 산의 농도는 과잉량의 알칼리금속 시안화물을 중화시키는데 충분하고, 화학식 VIII 기질의 몰당 적어도 1몰당량 산, 바람직하게는 기질 당량당 약 2 내지 약 5 몰당량의 도입을 통상 필요로 한다. 그러나, 온도는 충분히 높게 유지하고 희석은 충분히 크게 하여 실질적 침전을 피하고 엔아민의 디케톤으로의 가수분해를 액상에서 진행시킨다. 따라서, 최소의 간섭 및 고 생산성의 공정을 진행시킨다. 가수분해는 전형적으로 약 1 내지 약 10시간, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 5시간동안 바람직하게는 적어도 80℃, 보다 바람직하게는 약 90℃ 내지 100℃ 범위의 온도에서 시행한다. 다음에 반응 혼합물을 화학식 VI의 디케톤 생성물의 침전을 위해 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 15℃로, 유리하게는 약 5℃ 내지 약 10℃의 얼음욕 온도에서 냉각시킨다. 고체 생성물을 여과로 회수하고 불순물은 물로 세척하여 제거할 수 있다.
반응식 1 합성의 다음 단계에서, 화학식 VI의 디케톤 화합물을 금속알콕시드와 반응시켜 4와 7위치 사이의 결합을 개방하고 카르보닐기와 4-탄소 사이의 결합을 절단하여 7위치에서 α-배향 알칸오일카르보닐 치환기를 형성하고 5-탄소에서 시안화물을 제거한다. 이 반응의 생성물은 다음 화학식 V에 대응하는 히드록시에스테르 화합물이다:
(화학식 V)
상기 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R1은 저급 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐이다. 반응에 사용된 금속알콕시드는, M이 알칼리금속이고 R10이 R1의 알콕시 치환기에 대응하는 식 R10OM에 대응한다. 이 반응의 수율은 금속알콕시드가 K 또는 Na 메톡시드일 때 가장 만족스럽지만, 다른 저급 알콕시드가 사용될 수 있다. K 알콕시드가 특히 바람직하다. 또한 페녹시드, 다른 아릴옥시드 뿐만 아니라 아릴술피드도 사용될 수 있다. 반응은 R10이 상기한 바와같은 식 R10OH에 대응하는 알코올의 존재하에서 용이하게 시행된다. 다른 종래의 용매가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 VI 기질은 약 2중량% 내지 약 12중량%, 보다 바람직하게는 적어도 약 6중량%의 농도로 제공되고 R10OM은 기질의 몰당 약 0.5 내지 약 4몰의 비율로 제공된다. 온도는 제한되지 않지만 상승온도는 생산성을 증가시킨다. 반응시간은 전형적으로 약 4 내지 약 24시간, 바람직하게는 약 4 내지 16시간이다. 용이하게, 반응은 사용 용매에 의존하여 분위기 환류온도에서 시행한다.
화학식 VI의 디케톤을 화학식 VI의 히드록시에스테르로 전환시키는데 있어서, 부산물 시안화물 이온을 생성물과 반응시켜 5-시아노에스테르를 형성할 수 있다. 저온에서 평형시키는 것이 보다 바람직하기 때문에, 반응은 Na 메톡시드와의 반응을 위해 오히려 높은 희석도, 예를들면 40:1만큼 높게 하는 것이 바람직하다. K 메톡시드가 시약일 때 약 20:1 범위의 희석도가 역 시안화도를 최소화하는데 통상 충분하기 때문에, 현저하게 높은 생산성은 Na 메톡시드보다 K 메톡시드의 사용으로 실현될 수 있다는 것을 알았다.
본 발명에 따르면, 역 시안화 반응은 적당한 화학적 또는 물리적 측정을 하여 반응대로부터 부산물인 시안화물 이온을 제거함으로써 억제될 수 있다는 것을 추가로 알았다. 따라서, 본 발명의 추가의 구체예에서, 디케톤과 알칼리금속 알콕시드와의 반응이 불용성 시안화물 화합물을 형성하는 양이온으로 이루어지는 염과 같은 시안화물 이온에 대한 침전제의 존재하에서 시행될 수 있다. 그러한 염으로는, 예를들면 요오드화아연, 황산제2철, 또는 대응 시안화물보다 더 용해성인 알칼리토류 또는 전이금속을 필수로 하는 어떤 할라이드, 술페이트 또는 다른 염을 들 수 있다. 요오드화아연이 디케톤 기질 당량당 약 1당량 범위의 비율로 제공된다면, 반응의 생산성은 알칼리금속 할라이드의 부재하에서 시행한 공정에 비해 실질적으로 증가한다.
침전제가 시안화물 이온의 제거에 사용될 때조차, 상당히 높게 희석시키는 것이 바람직하지만, 침전제의 사용으로 용매 대 디케톤 기질 몰비가 그러한 침전제의 부재하의 반응에 비해 현저하게 감소될 수 있다. 화학식 V의 히드록시에스테르의 회수는 하기한 추출 또는 비추출 과정 중 어느 하나에 따라 시행될 수 있다.
바람직하게는, 화학식 VI의 디케톤 기질은 다음 화학식 VIA에 대응하고
(화학식 VIA)
히드록시에스테르 생성물은 다음 화학식 VA에 대응한다:
(화학식 VA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고 R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다.
화학식 V의 화합물은 신규한 화합물이고, 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 바람직하게는, 화학식 V의 화합물은 화학식 VA에 대응하고, 여기서 -A-A-, -B-B-는 -CH2-CH2-이고, R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직하게는, 화학식 V의 화합물은 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
화학식 V의 화합물은 반응용액을, 예를들면 농 HCl로 산성화하고, 주위온도로 냉각시키고 염화메틸렌 또는 에틸아세테이트와 같은 유기용매로 생성물을 추출함으로써 분리시킬 수 있다. 추출물을 알칼리성 세척 수용액으로 세척하고 건조여과시키고, 그 후에 용매를 제거한다. 대안으로, 화학식 V의 생성물 함유 반응용액을 농 산으로 퀀칭할 수 있다. 생성물 용액을 농축시키고, 0℃ 내지 25℃로 냉각시키고 생성 고체를 여과로 분리한다.
화학식 V의 생성물 회수의 바람직한 방식에 따르면, 메탄올 및 HCN을 증류 전 또는 동안에 가한 물 및 산으로 증류후 반응 종료에 의해 제거한다. 증류전 물의 첨가는 조작을 간단하게 하지만, 증류 동안의 진행성 첨가는 증류기의 부피를 실질적으로 일정하게 유지시킨다. 화학식 V의 생성물은 증류가 진행될 때 증류기 바닥에서 결정화된다. 이 방식의 회수는 추출 조작을 하지 않는 고 품질의 결정 생성물을 제공한다.
다른 대안에 따르면, 화학식 V의 생성물을 함유하는 반응용액을 무기산, 예를들면 4N HCl로 퀀칭한 후 용매를 증류로 제거한다. 또한 용매의 제거는 반응 생성물로부터 잔류 HCN을 제거하는데 유효하다. 화학식 V의 화합물이 본문에 기재된 에폭시멕스레논의 제조방법에서 중간체로서 사용될 때 화학식 V의 화합물 정제를 위한 복합 용매 추출이 필요하지 않다는 것을 알았다. 사실, 그러한 추출은 종종 완전히 생략될 수 있다. 용매 추출을 생성물 정제에 사용할 때, 용매를 염수 및 가성 세척액으로 세척하여 보조하는 것이 바람직하다. 그러나 용매 추출을 생략할 때, 염수 및 가성 세척액도 생략한다. 추출 및 세척의 생략은 수율 또는 생성물 품질을 희생하지 않고서 공정의 생산성을 현저하게 증가시키며 또한 황산나트륨과 같은 데시칸트로 세척 용액의 건조에 대한 필요를 없앤다. 미정제 11α-히드록시-7α-알칸오일옥시카르보닐 생성물을 공정의 다음 반응단계를 위해 다시 용매에 흡수시키고, 11위치에서 11-히드록시기를 양호한 이탈기로 전환하여 다음 화학식 IV의 화합물을 생성한다:
(화학식 IV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R1은 화학식 V에서 정의된 바와같고, R2는 저급 아릴술포닐옥시, 알킬술포닐옥시, 아실옥시 또는 할라이드이다. 바람직하게는, 11α-히드록실을 저급 아릴술포닐 할라이드, 아실 할라이드 또는 산 무수물과의 반응으로 에스테르화하여 화학식 V의 중간체 생성물을 함유하는 용액에 가한다. 저급 알킬술포닐 할라이드, 특히 메탄술포닐 할라이드가 바람직하다. 대안으로, 11α-히드록시기를 브롬화티오닐, 염화티오닐, 염화술푸릴 또는 염화옥살릴과 같은 적당한 시약의 반응에 의해 할라이드로 전환시킬 수 있었다. 11α-술폰산 에스테르를 형성하기 위한 다른 시약으로는 염화토실, 염화벤젠술포닐 및 무수 트리플루오로메탄술폰산을 들 수 있다. 반응을 트리에틸아민 또는 피리딘과 같은 수소할라이드 스캐빈저를 함유하는 용매에서 시행한다. 또한 K 또는 Na 탄산염과 같은 무기염기도 사용할 수 있다. 화학식 V의 히드록시에스테르의 초기 농도는 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 50중량%이다. 에스테르화 시약은 바람직하게는 약간 과잉량으로 제공된다. 염화메틸렌이 반응에 특히 적당한 용매이지만, 디클로로에탄, 피리딘, 클로로포름, 메틸에틸케톤, 디메톡시에탄, 메틸이소부틸케톤, 아세톤, 다른 케톤, 에테르, 아세토니트릴, 톨루엔 및 테트라히드로푸란과 같은 다른 용매도 사용할 수 있다. 반응온도는 용매의 휘발성에 의해 주로 결정된다. 염화메틸렌에 있어서, 반응온도는 바람직하게는 약 -10℃ 내지 약 10℃ 범위이다.
바람직하게는, 화학식 V의 히드록시에스테르 기질은 다음 화학식 VA에 대응하고
(화학식 VA)
생성물은 다음 화학식 IVA에 대응한다:
(화학식 IVA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고, R1은 저급 알칸오일옥시카르보닐 또는 히드록시카르보닐이고, R2는 화학식 IV에서 정의된 바와같다.
화학식 IV의 생성물은 신규한 화합물이고, 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 바람직하게는, 화학식 IV의 화합물은 화학식 VA에 대응하고, 여기서 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2-이고, R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다:
(화학식 XXXIII)
가장 바람직하게는, 화학식 IV의 화합물은 메틸 수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이다.
원한다면, 화학식 IV의 화합물은 용매의 제거로 분리될 수 있다. 바람직하게는 반응용액을 알칼리성 세척 수용액, 예를들면 0.5-2N NaoH로 먼저 세척한 다음에 0.5-2N HCl로 산 세척한다. 반응용매의 제거후에 생성물을 재결정화하는데, 예를들면 생성물을 염화메틸렌에 흡수시킨 다음에 화학식 IV의 생성물의 용해성을 저하시키는 에틸에테르와 같은 다른 용매를 가하여 결정형으로 침전시킨다. 화학식 IV의 생성물의 회수에 있어서 또는 화학식 IV 중간체의 이하 더 기재되는 화학식 II의 중간체로의 전환을 위한 반응용액의 제조에 있어서, 모든 추출 및/또는 세척 단계는, 만일 용액이 산 및 염기 불순물의 제거를 위해 이온교환수지로 대신 처리된다면 생략할 수 있다. 용액을 음이온교환수지로 먼저 처리한 다음에 양이온교환수지로 처리한다. 대안으로, 반응용액을 염기성 알루미나 또는 염기성 실리카와 같은 무기 흡착제로 처리한 다음에 희석산 세척액으로 처리할 수 있다. 염기성 실리카 또는 염기성 알루미나는 전형적으로 생성물의 kg당 약 5 내지 약 50g, 바람직하게는 생성물의 kg당 약 15 내지 약 20g의 비율로 반응용액과 혼합할 수 있다. 이온교환수지 또는 무기흡착제를 사용한다면, 처리는 주위온도에서 교반하에서 반응용액과 수지 또는 무기흡착제를 간단히 슬러리화한 다음에 수지 또는 무기 흡착제를 여과로 제거함으로써 시행할 수 있다.
본 발명의 대안 및 바람직한 구체예에 있어서, 화학식 IV의 생성 화합물은 일부 용매의 제거로 농축 용액과 같은 미정제 형태로 회수된다. 이 농축 용액은 공정의 다음 단계에서 바로 사용하고, 화학식 IV의 화합물로부터 11α-이탈기를 제거하여 다음 화학식 II의 엔에스테르를 생성한다:
(화학식 II)
상기 화학식에서 -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다. 이 반응의 목적으로, 화학식 IV의 화합물중 R2 치환기는 어떤 이탈기일 수 있고 9-와 11-탄소 사이의 이중결합을 생성하는데 유효하다고 생각한다. 바람직하게는, 이탈기는 저급 알킬술포닐옥시 또는 아실옥시 치환기이고 이것은 산 및 알칼리금속 염과의 반응으로 제거된다. 무기산이 사용될 수 있지만, 저급 알칸산이 바람직하다. 유리하게는, 반응용 시약으로 사용되는 알칸산의 알칼리금속염을 더 들 수 있다. 이탈기가 메실옥시이고 제거시약이 포름산 및 포름산칼륨이고 9,11 대 11,12-올레핀의 비교적 높은 비가 관찰된다. 자유수가 이탈기의 제거동안 존재한다면, 불순물이 형성되는 경향이 있고, 특히 7,9-락톤
은 최종 생성물로부터 제거되기가 어렵다.
따라서, 무수 아세트산 또는 다른 건조제가 포름산에 존재하는 물을 제거하는데 사용된다. 반응전 반응 혼합물중 자유수 함량은 전체 반응용액을 기준으로 하여 물에 대한 칼 피셔(Karl Fisher) 분석으로 측정한 바와같이 약 0.5중량% 미만, 바람직하게는 약 0.1중량% 미만으로 유지되어야 한다. 반응 혼합물을 실행할 수 있는 한 건조시켜 유지하는 것이 바람직하지만, 만족스런 결과는 0.3중량% 물로 실현되었다. 바람직하게는, 반응 충전 혼합물은 알칸산에서 화학식 IV의 기질 약 4중량% 내지 약 50중량%를 함유한다. 산의 알칼리금속염 약 4중량% 내지 약 20중량%가 바람직하게는 포함된다. 무수 아세트산이 건조제로서 사용될 때, 알칸산의 몰당 약 0.05몰 내지 약 0.2몰의 비율로 바람직하게는 제공된다.
반응 혼합물중 부산물 7,9-락톤 및 11,12-올레핀의 농도는 이탈기의 제거 및 엔에스테르(9,11-올레핀)의 형성을 위한 시약으로서 제거제가 트리플루오로아세트산, 무수 트리플루오로아세트산 및 아세트산칼륨의 조합으로 이루어질 때, 비교적 낮다. 무수 트리플루오로아세트산이 건조제로서 사용되고 트리플루오로아세트산 제거제를 기준으로 하여 적어도 약 3중량%, 보다 바람직하게는 적어도 약 15중량%, 가장 바람직하게는 약 20중량%의 농도로 제공되어야 한다.
대안으로, 화학식 IV의 화합물로부터의 11α-이탈기를 제거하여 DMSO, DMF, DMA와 같은 유기용매에서 화학식 IV의 용액을 가열함으로써 화학식 II의 엔에스테르를 제조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 화학식 IV의 화합물을 황산과 같은 무수 무기산 또는 톨루엔 술폰산과 같은 산의 존재하에서 이소프로펜일 아세테이트와 같은 알켄일 알칸오에이트와 초기에 반응시켜 화학식 IV의 화합물의 3-엔올 에스테르를 형성한다:
대안으로, 3엔올 에스테르를 아세트산 및 아세트산나트륨과 같은 염기 및 산 무수물로 처리하여 형성시킬 수 있다. 다른 대안으로는 산의 존재하에서 케텐으로 처리하여 화학식 IV(Z)를 제조하는 것을 들 수 있다. 다음에 화학식 IV(Z)의 중간체를 포름산 또는 아세트산의 존재하에서 알칼리금속 포르메이트 또는 아세테이트와 반응시켜 다음 화학식 IV(Y)의 Δ-9,11 엔올 아세테이트를 생성한다:
이것은 다음에 엔올 아세테이트의 열분해 또는 알칼리금속 알콕시드와의 반응 중 어느 하나에 의해 유기용매, 바람직하게는 메탄올과 같은 알코올에서 화학식 II의 엔에스테르로 전환될 수 있다. 제거반응은 11,12-올레핀 및 7,9-락톤보다 화학식 II의 엔에스테르에 대해 높은 선택성이 있으며 이 선택성은 엔올 아세테이트의 엔온으로의 전환을 통해 유지된다.
바람직하게는, 화학식 IV의 기질은 다음 화학식 IVA에 대응하고
(화학식 IVA)
엔에스테르 생성물은 다음 화학식 IIA에 대응한다:
(화학식 IIA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고 R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다.
원한다면, 화학식 II의 화합물은 용매를 제거하고 냉수에 고체 생성물을 흡수시키고 에틸아세테이트와 같은 유기용매로 추출함으로써 분리시킬 수 있다. 적당한 세척 및 건조 단계후에, 추출 용매를 제거함으로써 생성물을 회수한다. 다음에 화학식 I의 생성물로 전환시키는데 적당한 용매에 엔에스테르를 용해한다. 대안으로, 물을 농축 생성물 용액에 가하고 고체 생성물을 여과하여 우선적으로 7,9-락톤을 제거함으로써 엔에스테르를 분리할 수 있다. 화학식 II의 기질을 화학식 IA의 생성물로 전환시키는 것은 본문에 참고로 포함되는 미국특허 제 4,559,332호에 기재된 방법으로 또는 보다 바람직하게는 하기한 할로아세트아미드 프로모터를 사용하는 신규한 반응으로 시행할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 화학식 V의 히드록시에스테르는 화학식 IV의 중간체 화합물을 분리하지 않고 화학식 II의 엔에스테르로 전환시킬 수 있다. 이 방법에서, 히드록시에스테르를 염화메틸렌과 같은 유기용매에 흡수시키고; 아실화제, 예를들면 염화메탄술포닐, 또는 할로겐화시약, 예를들면 염화술푸릴중 어느 하나를 용액에 가한다. 혼합물을 교반하고 할로겐화를 포함할 때 이미다졸과 같은 HCl 스캐빈저를 가한다. 염기와 용액의 혼합은 매우 발열이므로 완전히 냉각시키면서 제어된 속도에서 시행되어야 한다. 염기 첨가후에, 얻어진 혼합물을 적당한 온도, 예를들면 0℃ 내지 실온 또는 약간 높게 가온하고 전형적으로 1 내지 4시간동안 반응시킨다. 반응 종료후 용매를 바람직하게는 -10℃ 내지 +15℃, 보다 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 5℃에서 고압(예, 24″ 내지 28″Hg)조건하에서 스트리핑하여 용액을 농축하고 과잉량의 염기를 제거한다. 다음에 엔에스테르로 전환시키기 위해 기질을 유기용매, 바람직하게는 염화메틸렌과 같은 할로겐화 용매에 재용해한다.
이탈기 제거제는, 건조 반응기에 유기산, 유기산염 및 건조제, 바람직하게는 포름산, 알칼리금속 포름산염 및 무수 아세트산 각각을 혼합함으로써 바람직하게 제조된다. 무수 아세트산의 첨가는 발열이어서 CO를 방출시키므로 첨가율을 제어해야 한다. 물의 제거를 촉진하기 위해, 이 반응온도는 바람직하게는 60℃ 내지 90℃, 가장 바람직하게는 약 65℃ 내지 약 75℃ 범위에서 유지한다. 다음에 이 시약을 화학식 IV의 화합물의 생성물 용액에 가하여 제거반응을 시행한다. 4-8시간 후에, 모든 휘발성 증류액을 제거할 때까지 반응 혼합물을 바람직하게는 적어도 약 85℃이나 약 95℃를 초과하지 않는 온도로 가열하고, 추가의 시간, 전형적으로 약 1 내지 4시간동안에 반응을 종료시킨다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 표준 추출기술로 회수한 후에 용매를 증발시킴으로써 원하는 대로 엔에스테르를 회수할 수 있다.
제거반응후에 추출 단계를 필요로 하지 않는 다른 방법으로 화학식 II의 엔에스테르를 반응용액으로부터 회수할 수 있어 비용이 절약되고 수율의 개선 및/또는 생산성의 개선을 제공한다는 것을 알았다. 이 방법에서, 엔에스테르 생성물을 포름산의 제거후에 물로 반응 혼합물을 희석하여 침전시킨다. 다음에 생성물을 여과로 분리한다. 추출은 하지 않는다.
화학식 IV의 화합물을 분리하지 않고 화학식 V의 히드록시에스테르를 화학식 II의 엔에스테르로 전환시키기 위한 다른 대안에 따르면, 화학식 V의 히드록시에스테르중 11α-히드록시기를 할로겐으로 치환하고, 다음에 화학식 II의 엔에스테르를 열 탈할로겐화수소에 의해 원위치에서 형성시킨다. 할로겐에 의한 히드록시기의 치환은 이미다졸과 같은 수소할라이드 스캐빈저의 존재하에서 냉각시 술푸릴할라이드, 바람직하게는 염화술푸릴과의 반응으로 시행한다. 히드록시에스테르를 테트라히드로푸란과 같은 용매에 용해하고 0℃ 내지 -70℃로 냉각시킨다. 술푸릴할라이드를 가하고 반응 혼합물을 반응을 종료시키는데 충분한 시간, 전형적으로 1 내지 4시간동안 적당한 온도, 예를들면 실온으로 가온한다. 이 구체예의 방법은 두 단계를 하나로 합할 뿐만 아니라 할로겐화 반응용매; 산(아세트산과 같은); 및 건조제(무수 아세트산 또는 황산나트륨)를 사용하지 않게 한다. 더욱이, 반응은 환류조건을 필요로 하지 않고, 아세트산을 건조제로 사용할 때 얻어지는 부산물 CO의 발생을 억제한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 화학식 VI의 디케톤 화합물을 정제된 형태의 어떤 중간체를 분리하지 않고 화학식 I의 다른 화합물 또는 에폭시멕스레논으로 전환시킬 수 있다. 이 바람직한 방법에 따르면, 히드록시에스테르를 함유하는 반응용액을 강산 용액으로 퀀칭하고, 주위 온도로 냉각시킨 다음에 적당한 추출 용매로 추출한다. 유리하게는, 무기염의 수용액, 예를들면 10중량% 염수 용액을 추출하기 전에 반응 혼합물에 가한다. 추출물을 세척하고 케톤 절단반응으로부터 잔류하는 메탄올 용매를 제거하기 위해 공비 증류로 건조시킨다.
다음에 화학식 V의 약 5중량% 내지 약 50중량% 화합물을 함유하는 생성 농축용액을 아실화제 또는 알킬술포닐화제와 냉접촉시켜 술폰산 에스테르 또는 디카르복실산 에스테르를 형성한다. 알킬술폰화 또는 카르복실화 반응을 종료시킨 후에 염기성 및 산성 불순물을 제거하기 위해 반응용액을 산성 및 염기성 교환수지 컬럼에 통과시킨다. 각각의 통과후에 컬럼을 이로부터 잔류 술폰산 또는 디카르복실산 에스테르를 회수하기 위해 적당한 용매, 예를들면 염화메틸렌으로 세척한다. 합한 용출액 및 세척 분획을 합하고 바람직하게는 진공하에서 감소시켜 화학식 IV의 술폰산 에스테르 또는 디카르복실산 에스테르를 함유하는 농축 용액을 제조한다. 다음에 이 농축 용액을 11α-에스테르 이탈기의 제거 및 탈수소에 유효한 제제로 이루어지는 건조제로 접촉시켜 9,11 이중결합을 형성한다. 바람직하게는, 이탈기의 제거를 위한 시약은 상기한 포름산/알칼리금속 포름산염/무수 아세트산 건조제 용액으로 이루어진다. 반응의 종료후에, 반응 혼합물을 냉각시키고 포름산 및/또는 다른 휘발성 성분을 진공하에서 제거한다. 잔사를 주위 온도로 냉각시키고, 적당한 세척단계를 행한 다음에 건조시켜 화학식 II의 엔에스테르를 함유하는 농축 용액을 얻는다. 다음에 이 엔에스테르를 본문에 기재된 방법 또는 미국특허 제 4,559,332호에 기재된 방법을 사용하여 에폭시멕스레논 또는 화학식 I의 다른 화합물로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 용매를 진공하에서 반응용액으로부터 제거하고 화학식 IV의 생성물을 물과 적당한 유기용매, 예를들면 에틸아세테이트 사이에 분배한다. 다음에 수층을 유기용매로 다시 추출하고 알칼리성 용액, 바람직하게는 알칼리금속 할라이드를 함유하는 알칼리금속 수산화물의 용액으로 재추출물을 세척한다. 유기상을 바람직하게는 진공하에서 농축하여 화학식 II의 엔에스테르 생성물을 얻는다. 다음에 화학식 II의 생성물을 유기용매, 예를들면 염화메틸렌에 흡수시키고 '332 특허에 기재된 방법으로 더 반응시켜 화학식 I의 생성물을 제조한다.
트리할로아세토니트릴을 에폭시화 반응에 사용할 때, 할로겐화 용매가 매우 바람직하고 염화메틸렌이 특히 바람직하기 때문에 용매의 선택이 중요하다는 것을 알았다. 디클로로에탄 및 클로로벤젠과 같은 용매로 상당히 만족스런 수율을 얻지만, 통상 염화메틸렌 반응배지에서 더 양호하다. 통상 아세토니트릴 및 에틸아세테이트와 같은 용매로 불량한 수율을 얻고, 한편 메탄올 또는 물/테트라히드로푸란과 같은 용매에서의 반응으로는 원하는 생성물이 거의 없게 된다.
또한 본 발명에 따르면, 에폭시멕스레논의 합성에 있어 수많은 개선이 에폭시화 반응을 위한 퍼옥시드 활성화제로서 트리할로아세토니트릴보다 트리할로아세트아미드를 사용하여 실현될 수 있다는 것을 발견하였다. 특히 바람직한 방법에 있어서, 에폭시화는 트리클로로아세트아미드 및 적당한 완충액의 존재하에서 과산화수소와 화학식 IIA의 기질을 반응시켜 시행한다. 바람직하게는, 반응은 약 3 내지 약 7, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 7 범위의 pH에서 시행한다. 그러나, 이들 고려의 대상에도 불구하고, 성공적인 반응은 바람직한 pH 범위 밖에서 이루어졌다.
특히 바람직한 결과는 약 1:4 내지 약 2:1, 가장 바람직하게는 약 2:3의 범위의 상대비율로 인산이수소칼륨과 인산수소이칼륨의 조합으로 이루어지는 완충액 및/또는 인산수소이칼륨으로 이루어지는 완충액으로 얻어진다. 붕산염 완충액도 사용할 수 있지만, 통상 인산이칼륨 또는 K2HPO4 또는 K2HPO4/KH2PO4 혼합물보다 낮은 전환율을 얻는다. 완충액의 구성이 어떻든지, 상기한 범위에서 pH를 제공해야 한다. 제공될 수 있는 완충액의 전체 조성 또는 정확한 pH는 제외하고라도, 적어도 일부의 완충액이 인산수소이염기 이온으로 이루어진다면 반응이 보다 유효하게 진행될 것이라는 것이 관찰되었다. 이 이온이 프로모터 및 과산화수소 이온으로 이루어지는 착체 또는 부가물의 형성으로 균질한 촉매로서 필수적으로 침전될 수 있고, 이 발생은 이번에는 전체 에폭시화 반응 메카니즘에 대해 본질적일 수 있다는 것으로 생각된다. 따라서, 인산수소이염기(바람직하게는 K2HPO4)에 대한 정량적 필요조건은 단지 낮은 촉매농도일 수 있다. 일반적으로, HPO4가 기질 당량당 적어도 약 0.1당량, 예를들면 약 0.1 내지 약 0.3당량의 비율로 제공되는 것이 바람직하다.
반응은 적당한 용매, 바람직하게는 염화메틸렌에서 시행하나 대안으로 클로로벤젠 또는 디클로로에탄과 같은 다른 할로겐화 용매도 사용할 수 있다. 톨루엔 및 톨루엔과 아세토니트릴의 혼합물도 또한 충분하다는 것을 알았다. 특정 이론을 행하지 않고, 반응은 과산화수소 중간체를 형성하고 물 함량이 적은 유기상에 분포하고 유기상에서 기질과 반응시키는 2상 시스템에서 가장 효과적으로 진행시킬수 있다고 가정한다. 따라서 바람직한 용매는 수용성이 낮은 것이다. 톨루엔으로부터의 효과적인 회수는 아세토니트릴과 같은 다른 용매를 포함함으로써 촉진된다.
화학식 II의 기질을 화학식 I의 생성물로 전환시키는데 있어서, 기질이 톨루엔에 자유롭게 용해될 수 있고 생성물이 없기 때문에 톨루엔은 공정의 이점을 제공한다. 따라서, 전환율이 40-50% 범위에 이를 때의 반응동안에 생성물이 침전되고, 생성물이 여과로 용이하게 분리될 수 있는 3상 혼합물을 제조한다. 메탄올, 에틸아세테이트, 아세토니트릴 단독, THF 및 THF/물은 공정중 이 단계의 전환을 시행하는데 있어 할로겐화 용매 또는 톨루엔만큼 유효하다는 것을 입증하지 못했다.
한편 트리클로로아세트아미드는 매우 바람직한 시약이고, 트리플루오로아세트아미드와 같은 다른 트리할로아세트아미드도 사용할 수 있다. 트리할로메틸벤즈아미드, 및 전자이탈 트리할로메틸기와 아미드의 카르보닐 사이의 아릴렌 부분을 갖는 다른 화합물도 유용할 수 있다. 또한 3,3,3-트리할로프로피온아미드도 사용될 수 있지만, 결과는 바람직하지 않다. 일반적으로, 퍼옥시드 활성화제가 다음 식에 대응할 수 있다:
R0C(O)NH2
상기식에서 R0은 적어도 모노클로로메틸기만큼 높은 전자이탈강도(시그마항으로 측정)를 갖는 기이다. 보다 구체적으로, 퍼옥시드 활성화제는 다음 식에 대응할 수 있다:
상기식에서, X1, X2 및 X3은 할로, 수소, 알킬, 할로알킬 및 시아노 및 시아노알킬중에서 독립적으로 선택되고, RP는 아릴렌 및 -(CX4X5)n-중에서 선택하고, n은 0 또는 1이고, X1, X2, X3, X4 및 X5중 적어도 1개는 할로 또는 퍼할로알킬이다. X1, X2, X3, X4 또는 X5중 어떤 것이 할로가 아닐때, 바람직하게는 할로알킬, 가장 바람직하게는 퍼할로알킬이다. 특히 바람직한 활성화제로는 n이 0이고 X1, X2 및 X3중 적어도 2개는 할로이고; 또는 모든 X1, X2, X3, X4 및 X5는 할로 또는 퍼할로알킬인 것을 들 수 있다. X1, X2, X3, X4 및 X5 각각은 퍼클로르알킬 또는 퍼브로모알킬 및 그 조합일 수 있는 혼합 할라이드가 적당할 수 있지만, 바람직하게는 Cl 또는 F, 가장 바람직하게는 Cl이다.
바람직하게는, 퍼옥시드 활성화제는 초기에 제공되는 기질의 당량당 적어도 약 1당량, 보다 바람직하게는 약 1.5 내지 약 2당량의 비율로 제공된다. 과산화수소를 적어도 적당한 과잉량으로 반응에 넣고 또는 에폭시화 반응이 진행됨에 따라 연속적으로 가해야 한다. 반응이 기질의 몰당 1 내지 2당량의 과산화수소만을 소비하더라도 과산화수소는 바람직하게는 기질에 비해 실질적 과잉량으로 넣고 활성화제는 초기에 제공된다. 특정이론으로 본 발명을 정의하지 않고, 반응 메카니즘은 활성화제 및 OOH-의 부가물의 형성을 포함하고, 이 반응물의 형성으로 역반응을 유리하게 하는 평형으로 가역적이며, 정방향으로 반응시키기 위해 실질적 초기 과잉량의 과산화수소가 필요하다는 것이 생각된다. 반응온도는 매우 제한적이지 않고, 0℃ 내지 100℃ 범위내에서 유효하게 시행될 수 있다. 최적의 온도는 용매선택에 의존한다. 일반적으로, 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 30℃이지만, 어떤 용매, 예를들면 톨루엔에서는 반응이 유리하게 60℃-70℃ 범위에서 시행된다. 25℃에서, 반응은 전형적으로 10시간 미만, 전형적으로 3 내지 6시간을 필요로 한다. 활성화제 및 과산화수소가 필요하다면 기질을 완전하게 전환시키기 위해 반응순환의 종료시 가할 수 있다.
반응순환의 종료시, 수상을 제거하고 바람직하게는 유기반응용액을 세척하여 수용성 불순물을 제거하고, 이후에 용매를 제거하여 생성물을 회수할 수 있다. 용매를 제거하기 전에, 반응용액을 적당한 알칼리성 세척액, 예를들면 탄산나트륨으로 적어도 온화하게 세척해야 한다. 바람직하게는, 반응혼합물을 물중의 아황산나트륨의 약한(예를들면 3중량%) 용액과 같은 온화한 환원용액; 알칼리성 용액, 예를들면 NaOH 또는 KOH(바람직하게는 약 0.5N); HCl과 같은 산용액(바람직하게는 약 1N); 및 물 또는 염수, 바람직하게는 생성물 손실을 최소화하기 위한 포화 염수로 이루어지는 최종 중성 세척액으로 연속적으로 세척한다. 반응용매를 제거하기 전에, 유기용매, 바람직하게는 에탄올과 같은 다른 용매를 유리하게 가하여 보다 휘발성인 반응용매를 제거하기 위해 증류하고 나서 결정화함으로써 생성물을 회수할 수 있다.
트리클로로아세트아미드 또는 다른 신규한 퍼옥시드 활성화제를 사용하는 신규한 에폭시화 방법은 사실 액상에서 반응시키는 광범위한 기질중 올레핀계 이중결합을 통한 에폭시드의 형성에 사용될 수 있는 에폭시멕스레논을 제조하기 위해 여러 반응식을 적용하고 있다는 것을 이해한다. 반응은 불포화 화합물에서 특히 효과적인데, 올레핀계 탄소는 사치환 및 삼치환, 즉 RaRbC=CRcRd 및 RaRbC=CRcRH(Ra 내지 Rd는 수소이외의 치환기를 나타낸다)이다. 반응은 가장 신속하고 완전하게 진행되고 상기 화학식에서 기질은 삼치환 이중 있는 고리 화합물, 또는 사치환 이중결합이 있는 고리 또는 비고리 화합물중 어느 하나이다. 이 반응을 위한 기질 예로는 Δ-9,11-칸레논, 및
을 들 수 있다.
삼치환 및 사치환 이중결합으로 보다 신속하고 완전하게 반응시키기 때문에, 올레핀계 탄소가 일치환 또는 이치환인 다른 이중결합을 포함할 수 있는 화합물중에서 그러한 이중결합을 통한 선택적 에폭시화에 특히 유효하다.
각종 스테로이드 기질중 11,12-올레핀과 같은, 일치환 또는 이치환 이중결합의 에폭시화에 이 반응이 유리하게 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 그러나, 우선적으로 다치환 이중결합, 예를들면 9,11-올레핀을 고 선택성으로 에폭시화하기 때문에, 본 발명의 방법은 본문에 기재된 다양한 반응식의 에폭시화 단계에서 고 수율 및 생산성을 달성하는데 특히 유효하다.
개선방법은
의 에폭시화에 의해 화학식 IB 및 화학식 IC
를 제조하는데 특히 유리하게 적용한다는 것을 알았다.
에폭시화 반응에서 산소운반제로서 트리클로로아세토니트릴 대신에 트리클로로아세트아미드를 사용하여 본 발명의 방법에 대해 여러 이점을 입증하였다. 트리클로로아세트아미드 시약 시스템은 동일한 분자구조에서 α,β-케토 올레핀 및 이치환의 삼치환 이중결합을 통해 에폭시화에 대한 엄격한 레지오조절을 제공한다. 따라서, 반응수율, 생성물 프로파일 및 최종 순도는 실질적으로 증가한다. 트리할로아세토니트릴의 사용으로 관찰된 실질적 과잉량의 산소발생은 에폭시화 공정에 개선된 안정성을 부여하는 트리클로로아세트아미드로는 일어나지 않는다는 것을 추가로 알았다. 또한 트리클로로아세토니트릴 촉진된 반응에 비해 트리클로로아세트아미드 반응은 최소의 발열 효과를 나타내므로 반응열 프로파일의 조절을 용이하게 한다. 교반 효과는 최소이고 반응기 성능은 보다 일정하고 트리클로로아세토니트릴 공정에 대해 다른 이점으로 관찰된다. 반응은 트리클로로아세토니트릴 촉진된 반응보다 더 증가될 수 있다. 생성물 분리 및 정제는 간단하며 행한 바와같이, 예를들면 m-클로로퍼옥시벤조산 또는 다른 과산을 사용하고 시약은 저가이며, 용이하게 입수가능하고 용이하게 처리되는 카르보닐 기능의 바이에르-빌라거(Bayer-Villager) 산화는 관찰되지 않았다.
본 발명의 신규한 에폭시화 방법은 반응식 1의 합성중 최종단계로서 매우 유용하다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응식 1의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 2
본 발명의 제2의 신규한 반응식(반응식 2)은 칸레논 또는 다음 화학식 XIII에 대응하는 다른 기질로 개시한다:
(화학식 XIII)
상기 화학식에서 -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같다. 이 공정의 제1단계에서, 화학식 XIII의 기질을, 화학식 VIII의 기질의 화학식 VII의 중간체로의 전환에 대해 상기한 바와 실질적으로 동일한 시안화 반응식을 사용하여 화학식 XII의 생성물로 전환시킨다.
(화학식 XII)
바람직하게는, 화학식 XIII의 기질은 다음 화학식 XIIIA에 대응하고
(화학식 XIIIA)
엔아민 생성물은 다음 화학식 XIIA에 대응한다:
(화학식 XIIA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다.
반응식 2의 제2단계에서, 화학식 XII의 엔아민을, 화학식 VIII의 기질의 화학식 VII의 중간체로의 전환에 대해 상기한 바와 실질적으로 동일한 시안화 반응식을 사용하여 화학식 XI
(화학식 XI)
(상기 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같다)의 중간체 디케톤 생성물로 가수분해한다. 바람직하게는 화학식 XII의 기질은 다음 화학식 XIIA에 대응하고
(화학식 XIIA)
디케톤 생성물은 다음 화학식 XIA에 대응한다:
(화학식 XIA)
각각의 화학식에서, -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 VIIIA에 정의된 바와같다.
또한 반응식 2에 따르면, 화학식 XI의 디케톤을 알칼리금속 알콕시드와 반응시켜 멕스레논 또는 화학식 X에 대응하는 다른 생성물을 형성한다:
(화학식 X)
각각의 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같다. R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다. 방법은 화학식 VI의 화합물의 화학식 V의 것으로의 전환에 대해 상기한 바와 실질적으로 동일한 반응식을 사용하여 시행한다. 바람직하게는, 화학식 XI의 기질은 다음 화학식 XIA에 대응하고
(화학식 XIA)
중간체 생성물은 다음 화학식 XA에 대응한다:
(화학식 XA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다. R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다.
칸레논 또는 화학식 X의 다른 화합물은 신규한 생물변환 공정에 의해 다음 9α-히드록실화하여 다음 화학식 IX의 생성물을 얻는다:
(화학식 IX)
상기 화학식에서 -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다. 이 히드록실화 단계에서 사용될 수 있는 유기체는 Nocardia conicruria ATCC 31548, Nocardia aurentia ATCC 12674, Corynespora cassiicola ATCC 16718, Streptomyces hydroscopicus ATCC 27438, Mortierella isabellina ATCC 42613, Beauvria bassiana ATCC 7519, Penicillumm purpurogenum ATCC 46581, Hypomyces chrysospermus IMI 109891, Thamnostylum piriforme ATCC 8992, Cunnignhamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunningnhamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Trichothecium roseum ATCC 12543, Epicoccum humicola ATCC 12722, Saccharopolyspora eythrae ATCC 11635, Beauvria bassiana ATCC 13144, Arthrobacter simplex, Bacterium cyclooxydans ATCC 12673, Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011, Nocardia aurentia ATCC 12674, Nocardia canicruria, Norcardia restrictus ATCC 14887, Pseudomonas testosteroni ATCC 11996, Rhodococcus equi ATCC 21329, Mycobacterium fortuitum ATCC-6842, 및 Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150이다. 반응은 도 1 및 도 2와 관련하여 상기한 방법으로 실질적으로 시행한다. 도 1의 방법이 특히 바람직하다.
생물변환에 유용한 성장배지는 바람직하게는 약 0.05중량% 내지 5중량%의 유효성 질소; 약 0.5중량% 내지 약 5중량%의 글루코스; 약 0.25중량% 내지 약 2.5중량%의 효모유도체; 및 약 0.05중량%, 약 0.5중량%의 유효성 인을 함유한다. 특히 바람직한 성장배지는 다음을 포함한다:
대두밀: 약 0.5중량% 내지 약 3중량%의 글루코스; 약 0.1중량% 내지 약 1중량%의 대두밀; 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 알칼리금속할라이드; 약 0.05중량% 내지 약 560.5중량%의 자기분해된 효모 또는 효모 추출물과 같은 효모유도체; 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 K2HPO4와 같은 인산염; pH=7; 펩톤-효모 추출물-글루코스: 약 0.2중량% 내지 약 2중량%의 펩톤; 약 0.05중량% 내지 약 0.5중량%의 효모 추출물; 및 약 2중량% 내지 약 5중량%의 글루코스;
뮐러-힌톤(Mueller-Hinton): 약 10중량% 내지 약 40중량%의 비프 배양액 ; 약 0.35중량% 내지 약 8.75중량%의 카사미노산; 약 0.15중량% 내지 약 0.7중량%의 전분.
균류는 대두밀 또는 펩톤 영양소에서 성장시킬 수 있고, 반면 방사선균류 및 유박테리아는 대두밀(플러스 생물형질전환을 위한 Na 포름산염과 같은 0.5중량% 내지 1중량% 카르복실산) 또는 뮐러-힌톤 배양액에서 성장시킬 수 있다.
발효에 의해 멕스레논으로부터 11β-히드록시멕스레논의 제조는 실시예 19에서 논의된다.
화학식 IX의 생성물은 신규한 화합물이고, 이것은 여과에 의해 분리하고 적당한 유기용매, 예를들면 에틸아세테이트로 세척하고 동일 또는 유사한 용매에서 재결정할 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 바람직하게는, 화학식 IX의 화합물은 화학식 IX에 대응하는데, 상기 화학식에서 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2-이고, R3은 수소, 저급 알킬 또는 저급 알콕시이고, R8 및 R9는 함께 다음 화학식 XXXIII의 20-스피록산 고리를 구성한다.
(화학식 XXXIII)
합성 반응식 2의 다음 단계에서, 화학식 IX의 생성물을 탈수제와 반응시켜 화학식 II의 화합물을 생성하고
(화학식 II)
상기 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B-, R8 및 R9는 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다. 기질이 화학식 IXA에 대응할 때, 생성물은 화학식 IIA이고
(화학식 IXA)
(화학식 IIA)
각각의 화학식에서 -A-A-, -B-B-, Y1, Y2 및 X는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고 R1은 화학식 V에서 정의된 바와같다.
이 합성 반응식의 최종 단계에서, 화학식 II의 생성물을, 미국특허 제 4,559,332호에 기재된 방법에 따른 에폭시화에 의해 또는 바람직하게는 상기한 본 발명의 신규한 에폭시화 방법에 의해 화학식 I의 화합물로 전환시킨다.
특히 바람직한 구체예에서, 반응식 2의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 3
이 경우의 합성은 다음 화학식 XX에 대응하는 기질로 개시한다:
(화학식 XX)
상기 화학식에서 -A-A- 및 R3은 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, -B-B-는 R6 및 R7 둘다가 16,17 위치에서 D고리로 축합된 고리부분이 아닌 것만 제외하고 화학식 VIII에서 정의된 바와같고, R26은 저급 알힐, 바람직하게는 메틸이다. 화학식 XX의 기질과 술포늄일리드와의 반응으로 화학식 XIX에 대응하는 에폭시드 중간체를 생성한다:
상기 화학식에서, -A-A-, R3, -B-B- 및 R26은 화학식 XX에서 정의된 바와같다.
합성 반응식 3의 다음 단계에서, 화학식 XIX의 중간체는 화학식 XVIII의 중간체로 더 전환된다:
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 이 단계에서, 화학식 XIX 기질은 용매중의 염기의 존재하에서 NaCH(COOEt)2와 반응시켜 화학식 XVIII 중간체로 전환시킨다. 화학식 XVIII의 화합물을 열수 및 알칼리 할라이드에 노출하여 다음 화학식 XVII에 대응하는 탈카르복실화 중간체 화합물을 생성한다:
(화학식 XVII)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XX의 화합물을 화학식 XVII의 화합물로 전환시키는 공정은 참고로 본문에 포함되는 미국특허 제 3,897,417호, 제 3,413,288호 및 제 3,300,489호에 기재된 방법에 본질적으로 대응한다. 기질이 상이할 때, 17-스피로락톤 부분의 도입을 위한 시약, 메카니즘 및 조건은 본질적으로 동일하다.
화학식 XVII의 중간체와 탈수소 시약과의 반응으로 화학식 XVI의 중간체를 추가로 얻는다:
(화학식 XVI)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 상기한 바와같다.
전형적으로 유용한 탈수소 시약으로는 디클로로디시아노벤조퀴논(DDQ) 및 클로라닐(2,3,5,6-테트라클로로-p-벤조퀴논)을 들 수 있다. 대안으로, 탈수소는 일련의 탄소-6에서 할로겐화 다음에 탈할로겐화수소 반응으로 달성될 수 있었다.
화학식 XVI의 중간체를 다음 화학식 XV의 엔아민으로 전환시킨다:
(화학식 XV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 전환은 화학식 VIII의 11α-히드록시 화합물을 화학식 VII의 엔아민으로 전환시키는데 있어 상기한 방법으로 본질적으로 시안화에 의한다. 전형적으로, 시안화물 이온 공급원은 알칼리금속 시안화물일 수 있다. 염기는 바람직하게는 피롤리딘 및/또는 테트라메틸구아니딘이다. 메탄올 용매가 사용될 수 있다.
화학식 XV의 생성물은 신규한 화합물이고, 이것은 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 이들 및 화학식 AXV의 다른 신규한 화합물은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 AXV의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
(화학식 AXV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XV의 가장 바람직한 화합물에서, -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 VI의 디케톤 화합물을 제조하기 위해 상기한 가수분해에 따르면, 화학식 XV의 엔아민은 화학식 XIV의 디케톤으로 전환시킬수 있다:
(화학식 XIV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 에폭시멕스레논의 합성에 특히 바람직한 것은 화학식 VIA의 범위내에 있는 화학식 XIV의 화합물이다.
화학식 XIV의 생성물은 신규한 화합물이고, 이것은 침전에 의해 분리될 수 있다. 이들 및 화학식 AXIV의 다른 신규한 화합물은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 AXIV의 화합물은 다음 구조에 대응한다:
(화학식 AXIV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3, R8 및 R9는 상기한 바와같다. 화학식 AXIV 및 화학식 XIV의 가장 바람직한 화합물에서, -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 XIV의 화합물은 화학식 VI의 디케톤의, 화학식 V의 히드록시에스테르로의 전환에 대해 상기한 방법을 본질적으로 사용하여 화학식 XXXI의 화합물로 전환시킨다. 이 경우에, 화학식 XXXI
(화학식 XXXI)
의 중간체를 분리하고 나서 화학식 XXXII
(화학식 XXXII)
(상기 화학식에서, -A-A- 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다)의 생성물로 더 전환시키는 것이 필요하다. 화학식 XXXI의 바람직한 화합물은 화학식 IIA내에 있는 것들이다. 화학식 XXXI의 화합물을 미국특허 제 4,559,332호에 기재된 또는 상기한 방법을 사용하여 화학식 XXXII의 화합물로 전환시킨다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응식 3의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 4
반응식 4의 처음 세단계는 반응식 3의 것, 즉 화학식 XX에 대응하는 화합물로 출발하여 화학식 XVII의 중간체를 제조하는 것은 동일하다.
다음에, 화학식 XVII의 중간체를 미국특허 제 4,559,332호의 방법을 사용하여 에폭시화하여 다음 화학식 XXIV의 화합물을 생성한다:
(화학식 XXIV)
상기 화학식에서 -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 그러나, 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 화학식 II의 엔에스테르를 화학식 I의 생성물로 전환시키기 위해 반응식 1에서 상기한 방법에 따라 화학식 XVII의 기질을 아미드형 퍼옥시드 활성화제, 가장 바람직하게는 트리클로로아세트아미드로 이루어지는 산화제를 사용하여 9,11-이중결합을 통해 에폭시화한다.
또한 화학식 XVII의 기질의 에폭시화를 m-클로로퍼옥시벤조산과 같은 과산을 사용하여 매우 양호한 수율로 시행할 수 있다. 그러나, 트리클로로아세트아미드 시약은 부산물로 바이에르-빌라거 산화물 형성을 최소화하는 우수한 결과를 제공한다. 후자의 부산물은 제거될 수 있지만, 이것은 에틸아세테이트와 같은 용매로부터 분쇄한 다음에 염화메틸렌과 같은 다른 용매로부터 결정화해야 한다. 화학식 XXIV의 에폭시 화합물을 DDQ 또는 클로라닐과 같은 탈수소(산화)제와 반응시켜 탈수소시키고, 또는 브롬화/탈브롬화수소(또는 다른 할로겐화/탈할로겐화수소) 순으로 6-과 7-탄소사이에 이중결합을 형성하여 다음 화학식 XXIII의 다른 신규한 중간체를 생성한다:
(화학식 XXIII)
상기 화학식에서, -A-A- 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XXIII의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다.
직접 산화가 화학식 XXIII의 생성물 형성에 유효하나, 수율은 일반적으로 낮다. 따라서 바람직하게는, 산화는 두 단계, 처음에는 C-6위치에서 화학식 XXIV의 기질을 할로겐화하고, 다음에 6,7-올레핀에 대해 탈할로겐화수소하는 것으로 시행한다. 할로겐화는 바람직하게는 N-브로모숙신아미드와 같은 N-할로 유기시약으로 행한다. 브롬화는 벤조일퍼옥시드와 같은 할로겐화 프로모터의 존재하에서 아세토니트릴과 같은 적당한 용매에서 시행한다. 반응은 사염화탄소, 아세토니트릴 또는 그 혼합물과 같은 용매에서 분위기 환류온도에서 용이하게 약 50℃ 내지 100℃ 범위의 온도에서 효과적으로 진행한다. 그러나, 4 내지 10시간의 반응이 반응 종료에 전형적으로 필요하다. 반응용매를 스트리핑 제거하고, 잔사를 수불혼화성 용매, 예를들면 에틸아세테이트에 흡수시킨다. 얻은 용액을 온화한 알칼리성 용액(예, 알칼리금속 중탄산염) 및 물, 또는 바람직하게는 포화 염수로 연속적으로 세척하여 생성물 손실을 최소화하고, 그 후에 용매를 스트리핑하고 잔사를 탈할로겐화수소 반응에 적당한 다른 용매(예, 디메틸포름아미드)에 흡수시킨다.
적당한 탈할로겐화수소 시약, 예를들면 1,4-디아자비시클로[2,2,2]옥탄(DABCO)을 LiBr과 같은 알칼리금속 할라이드와 함께 용액에 가하고, 용액을 적당한 반응온도, 예를들면 60℃ 내지 80℃로 가열하고, 반응을 몇 시간, 전형적으로 4 내지 15시간동안 계속하여 탈수소브롬화를 완료하였다. 추가의 탈수소브롬화 시약을 반응 순환동안 필요한 만큼 가하여 반응을 완료시킬 수 있다. 화학식 XXIII의 생성물을, 예를들면 물을 가하여 생성물을 침전시키고 다음에 여과로 분리하고 바람직하게는 추가량의 물로 세척함으로써 회수한다. 생성물은 바람직하게는 디메틸포름아미드로부터 재결정한다.
9,11-에폭시칸레논과 같은 화학식 XXIII의 생성물은 신규한 화합물이고, 추출/결정화로 분리할 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 예를들면, 화학식 XXII의 화합물 제조를 위한 기질로서 사용될 수 있다. 화학식 XXIII의 가장 바람직한 화합물에서 및 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 VII의 화합물 제조를 위해 상기한 방법을 실질적으로 사용하여 화학식 XXIII의 화합물을 시안화물 이온과 반응시켜 대응 화학식 XXII에 대응하는 신규한 에폭시엔아민 화합물을 생성한다:
(화학식 XXII)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XXII의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다.
화학식 XXII의 생성물은 신규한 화합물이고, 침전 및 여과로 분리될 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 XXII의 가장 바람직한 화합물 및 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 VI의 화합물 제조를 위해 상기한 방법을 실질적으로 사용하여 화학식 XXII의 에폭시엔아민 화합물을 화학식 XXI의 신규한 에폭시디케톤 화합물로 전환시킨다.
화학식 XXI의 생성물은 신규한 화합물이고, 침전 및 여과로 분리할 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 XXI의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다. 화학식 XXI의 가장 바람직한 화합물 및 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 XXI의 화합물은 미국특허 제 4,559,332호의 방법 또는 상기한 에폭시화 방법을 사용하여 화학식 XXXII의 화합물로 전환시킨다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응식 4의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 5
반응식 5의 공정은 다음 화학식 XXIX에 대응하는 기질로 개시한다:
(화학식 XXIX)
상기 화학식에서 -A-A- 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 이 기질을 트리메틸오르토포르메이트와 반응시켜 화학식 XXVIII의 생성물로 전환시킨다:
(화학식 XXVIII)
상기 화학식에서 -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XXVIII의 형성후에, 화학식 XXIX의 화합물을 화학식 XX 기질의 화학식 XVII로의 전환에 대해 상기한 방법을 사용하여 화학식 XXVII의 화합물로 전환시킨다. 화학식 XXVII의 화합물은 다음 구조를 갖는다:
(화학식 XXVII)
상기 화학식에서 -A-A- 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같고, RX는 통상의 히드록실 보호기중 어떤 것이다.
화학식 XVI의 화합물 제조에 대해 상기한 방법을 사용하여 화학식 XXVII의 화합물을 산화하여 화학식 XXVI에 대응하는 신규한 화합물을 얻는다:
(화학식 XXVI)
상기 화학식에서 -A-A- 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다. 화학식 XXIX, 화학식 XXVIII, 화학식 XXVII 및 화학식 XXVI의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다.
화학식 XXVI의 생성물은 신규한 화합물이고, 침전/여과로 분리할 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 XXVI의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다. 화학식 XXVI의 가장 바람직한 화합물 및 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 VIII의 화합물을 시안화하기 위해 상기한 방법을 사용하여 화학식 XXVI의 신규한 중간체를 다음 화학식 XXV의 신규한 9-히드록시엔아민 중간체로 전환시킨다:
(화학식 XXV)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XX에서 정의된 바와같다.
화학식 XXV의 생성물은 신규한 화합물이고, 침전/여과로 분리할 수 있다. 이것은 화학식 I, 특히 화학식 IA의 화합물 제조를 위한 중간체로서 실질적 가치를 지닌다. 화학식 XXV의 특히 바람직한 화합물은 -A-A- 및 -B-B-가 화학식 XIII에서 정의된 바와같은 것이다. 화학식 XXVI의 가장 바람직한 화합물 및 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2이다.
화학식 VI의 디케톤 화합물 제조에 대해 상기한 조건을 필수적으로 사용하여 화학식 XXV의 9-히드록시엔아민 중간체를 화학식 XIV의 디케톤 화합물로 전환시킨다. 이 경우에 반응은 동시에 엔아민 구조를 가수분해하고 9,11 위치에서 탈수로 9,11 이중결합을 도입한다는 것을 주목한다. 화학식 XIV의 화합물을 화학식 XXXI의 화합물로, 다음에 반응식 3에서 상기한 동일한 단계를 사용하여 화학식 XIII의 화합물로 전환시킨다.
특히 바람직한 구체예에서, 반응식 5의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 6
반응식 6은 화학식 XXXV
(화학식 XXXV)
(-A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다)의 안드로스텐디온 또는 다른 화합물의 11α-히드록실화로 개시하여 화학식 XXXVI
(화학식 XXXVI)
(-A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다)에 대응하는 중간체를 제조하는, 에폭시멕스레논 및 화학식 I에 대응하는 다른 화합물 제조를 위한 유리한 방법을 제공한다. 기질의 선택성 이외에, 11α-히드록실화를 시행하기 위한 방법은 본질적으로 반응식 1에서 상기한 바와같다. 다음 미생물로 안드로스텐디온 또는 화학식 XXXV의 다른 화합물의 11α-히드록실화를 시행할 수 있다:
Aspergillus ochraceus NRRL 405(ATCC 18500);
Aspergillus niger ATCC 11394;
Aspergillus nidulans ATCC 11267;
Rhizopus oryzae ATCC 11145;
Rhizopus stolonifer ATCC 6227b;
Trichothecium roseum ATCC 12519 및 ATCC 8685.
11α-히드록시안드로스트-4-엔-3,17-디온, 또는 화학식 XXXVI의 다른 화합물을 산촉매의 존재하에서 트리알킬오르토포르메이트와 같은 에테르화제와 반응시켜 다음 화학식 101의 11α-히드록시-3,4-엔올 에테르로 전환시킨다:
(화학식 101)
상기 화학식에서 -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고 R11은 메틸 또는 다른 저급알킬(C1 내지 C4)이다. 이 전환을 시행하기 위해, 11α-히드록시 기질을, 예를들면 벤젠술폰산 수화물 또는 톨루엔술폰산 수화물과 같은 산과 혼합하여 산성화하고 저급 알코올용매, 바람직하게는 에탄올에 용해한다. 트리알킬오르토포르메이트, 바람직하게는 트리에틸오르토포르메이트를, 냉각 혼합물을 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 15℃로 유지하면서 5 내지 40분에 걸쳐 점진적으로 도입한다. 혼합물을 가온하고 반응을 20℃ 내지 약 60℃의 온도에서 시행한다. 바람직하게는 반응을 1 내지 3시간동안 30℃ 내지 50℃에서 시행하고, 다음에 추가시간, 전형적으로 2 내지 6시간동안 가열환류하여 반응을 완결시킨다. 반응 혼합물을 바람직하게는 0℃ 내지 15℃, 바람직하게는 약 5℃로 냉각시키고 용매를 진공하에서 제거한다.
화학식 XX의 화합물을 화학식 XVII의 화합물로 전환시키기 위한 상기 반응식 3에 기재된 바와 동일한 반응식을 사용하여 화학식 XXXIII의 17-스피로락톤 부분을 화학식 101의 화합물에 도입한다. 예를들면, 화학식 101 기질을 DMSO와 같은 적당한 용매중의 알칼리금속 수산화물과 같은 염기의 존재하에서 술포늄일리드와 반응시켜 다음 화학식 102에 대응하는 중간체를 제조할 수 있다:
상기 화학식에서, -A-A-, R3, R11 및 -B-B-는 화학식 101에서 정의된 바와같다. 다음에 화학식 102의 중간체를 알칼리금속 알콕시드의 존재하에서 말론산 디에스테르와 반응시켜 5원 스피로락톤 고리를 형성하고 다음 화학식 103의 중간체를 제조한다:
상기 화학식에서, -A-A-, R3, R11, R12 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다. 최종적으로, 디메틸포름아미드와 같은 적당한 용매중의 화학식 103의 화합물을 알칼리금속 할라이드의 존재하에서 가열하고, 알콕시카르보닐 부분을 분리하고 다음 화학식 104의 중간체를 제조한다:
(화학식 104)
상기 화학식에서, -A-A-, R3, R11 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같다.
다음에 3,4-엔올 에테르 화합물 104를 화학식 XXIII의 화합물, 즉 R8 및 R9는 함께 화학식 XXXIII의 부분을 형성하는 화학식 VIII의 화합물로 전환시킨다. 이 산화 단계는 합성 반응식 4에서 화학식 XXIV의 화합물을 화학식 XXIII의 중간체로 전환시키기 위한 산화단계와 본질적으로 동일한 방법으로 시행한다. 직접 산화는 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ) 또는 테트라클로로벤조퀴논(클로라닐)과 같은 시약을 사용하여 시행할 수 있고, 또는 바람직하게는 두 단계 산화는 먼저 N-브로모숙신아미드 또는 1,3-디브로모-5,5-디메틸 히단토인(DBDMH)과 같은 N-할로 브롬화제로 브롬화한 다음에 LiBr 및 열의 존재하에서 염기, 예를들면 DABCO로 탈수소브롬화함으로써 시행한다. NBS가 브롬화에 사용될 때, 산도 3-엔올 에테르를 엔온으로 전환시키는데 사용될 수 있다. 자유 라디칼 브롬화 시약 이외의 이온성인 DBDMH가 브롬화 그 자체 및 엔올 에테르의 엔온으로의 전환에 유효하다.
다음에 화학식 VIII의 화합물을 반응식 1에 대해 상기한 단계에 의해 에폭시멕스레논 또는 화학식 I의 다른 화합물로 전환시킨다.
화학식 101, 화학식 102, 화학식 103 및 화학식 104의 중간체 각각은 에폭시멕스레논 또는 화학식 IA 및 화학식 I의 다른 화합물을 위한 중간체로서 실질적 가치를 지니는 신규한 화합물이다. 화학식 101, 화학식 102, 화학식 103 및 화학식 104의 화합물 각각에서 -A-A- 및 -B-B-는 바람직하게는 -CH2-CH2-이고 R3은 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시이다. 가장 바람직하게는, 화학식 101의 화합물은 3-에톡시-11α-히드록시안드로스트-3,5-디엔-17-온이고, 화학식 102의 화합물은 3-에톡시스피로[안드로스트-3,5-디엔-17β,2'-옥시란]-11α-올이고, 화학식 103의 화합물은 에틸 수소 3-에톡시-11α-17α-디히드록시프레그나-3,5-디엔-21,21-디카르복실레이트, γ-락톤이고, 화학식 104의 화합물은 3-에톡시-11α-17α-디히드록시프레그나-3,5-디엔-21-카르복실산, γ-락톤이다.
특히 바람직한 구체예에서, 반응식 6의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
반응식 7
반응식 7에서 β-시토스테롤, 콜레스테롤, 스티그마스테롤 또는 다음 화학식 XXXVII의 다른 화합물로 이루어지는 출발 기질을 사용하여 에폭시멕스레논 및 화학식 I의 다른 화합물을 합성한다:
(화학식 XXXVII)
상기 화학식에서, -A-A-, R3 및 -B-B-는 화학식 XIII에서 정의된 바와같고, D-D는 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-이고, R13, R14, R15 및 R16 각각은 수소 C1, 내지 C4 알킬중에서 독립적으로 선택된다.
합성의 제1단계에서 11α-히드록시안드로스텐디온 또는 화학식 XXXV의 다른 화합물을 화학식 XXXVII의 화합물의 생물변환으로 제조한다. 생물변환 공정은 칸레논(또는 화학식 XIII의 다른 기질)의 11α-히드록실화에 대해 상기한 방법에 따라 실질적으로 시행한다.
11α-히드록시안드로스텐디온 합성에서, 초기에 4-안드로스텐-3,17-디온을 화학식 XXXVII의 화합물의 생물변환으로 제조한다. 이 초기변환은 본문에 참고로 포함되는 미국특허 제 3,759,791호에 기재된 방법으로 시행할 수 있다. 다음에 4-안드로스텐-3,17-디온을 칸레논(또는 화학식 XIII의 다른 기질)의 11α-히드록실화에 대해 상기한 방법에 따라 실질적으로 11α-히드록시안드로스텐디온으로 전환시킨다.
합성 반응식 7의 나머지는 반응식 6과 동일하다. 특히 바람직한 구체예에서, 반응식 7의 전체 공정은 다음과 같이 진행된다:
본 발명의 방법, 공정 및 조성물, 및 본문에 사용된 조건 및 시약을 다음 실시예에서 더 기재한다.
실시예 1
슬랜트를 표 1에서와 같은 성장배지로 제조하였다.
| Y P D A(슬랜트 및 플레이트를 위한 배지) | |
| 효모 추출물 | 20g |
| 펩톤 | 20g |
| 글루코스 | 20g |
| 한천 | 20g |
| 충분량의 증류수 -pH 6.7 -H3PO4 10% w/v로 pH 5로 조정 | 1000ml |
| 분배 -슬랜트: 180×18 mm 관에 7.5ml -플레이트(Φ중 10cm) 200×20 mm 관에 25ml -20분동안 120℃에서 살균 -살균후 pH: 5 | |
제1발생 배양물을 생산하기 위해, Aspergillus ochraceus의 콜로니를 시험관내의 증류수(2ml)에 현탁하고; 이 현탁액의 0.15ml 분액을 상기한대로 제조한 각 슬랜트에 도포하였다. 슬랜트를 25℃에서 7일간 배양한 후에 표면 배양물의 외관은 백색의 무명 균사였다. 리버스 하부는 오렌지색으로, 상부는 주황색으로 착색되었다.
제1발생 슬랜트 배양물을 Tween 80 비이온성 계면활성제(3중량%) 함유 살균용액(4ml)에 현탁하고, 이 현탁액의 0.15ml 분액을 표 2에서와 같은 성장배지를 제조한 제2발생 슬랜트를 접종하는데 사용하였다.
| (제2발생 및 루틴 슬랜트) | |
| 맥아 추출물 | 20g |
| 펩톤 | 1g |
| 글루코스 | 20g |
| 한천 | 20g |
| 충분량의 증류수 -pH 5.3 -관에 분배(180×18mm) 7.5ml -20분동안 120℃에서 살균 | 1000ml |
제2발생 슬랜트를 25℃에서 10일간 배양하여 고 질량의 금색-착색된 포자; 갈색 오렌지로 착색된 리버스를 제조하였다.
보호 배지는 표 3의 조성으로 제조하였다.
| 보호 배지 | |
| 탈지유 | 10g |
| 증류수 | 100ml |
| 50℃에서 증류수 100ml를 함유하는 250ml 플라스크에 탈지유를 가한다. 15분간 120℃에서 살균한다. 33℃로 냉각시키고 하루가 지나기 전에 사용한다. | |
5가지의 제2발생 슬랜트 배양물을 100ml 플라스크내의 보호용액(15ml)에 현탁하였다. 이 현탁액을 냉동건조를 위한 100×10mm 관중에 분액(각각 0.5ml)으로 분배하였다. 이들을 20분간 아세톤/건조 얼음욕에서 -70℃ 내지 -80℃로 미리 동결시킨 후에 -40℃ 내지 -50℃로 미리 냉각시킨 건조실로 바로 운반하였다. 미리 동결시킨 분액을 50μHg의 잔류 압력 및 ≤-30℃에서 냉동건조시켰다. 냉동건조의 종료시에 살균 실리카겔 2 내지 3개의 과립을 수분 지시제 및 플레임 시일과 각 관에 가하였다.
공업적 규모발효에 적당한 모 배양 슬랜트를 얻기 위해, 상기한 방법으로 제조한 단일 분액의 냉동건조시킨 배양물을 증류수(1ml)에 현탁하고 0.15ml 분액의 현탁액을 표 2의 조성을 갖는 성장배지를 제공한 슬랜트를 접종하는데 사용하였다. 모 슬랜트를 25℃에서 7일간 배양하였다. 배양 종료시에, 슬랜트에서 전개된 배양물을 4℃에서 보존하였다.
루틴 슬랜트 배양물을 제조하기 위해, 모 슬랜트로부터의 배양물을 Tween 80(3중량%)을 함유하는 살균용액(4ml)에 현탁하고 얻은 현탁액을 표 2에 기재된 성장배지로 코팅시킨 슬랜트중에 0.15ml 분액으로 분배하였다. 루틴 슬랜트 배양물을 실험 또는 공업적 발효를 위한 1차 종균플라스크를 접종하는데 사용하였다.
1차 종균 플라스크 배양물을 제조하기 위해, 상기한 대로 제조한 루틴 슬랜트로부터의 배양물을 제거하고 Tween 80(3중량%)을 함유하는 용액(10ml)에 현탁하였다. 얻은 현탁액의 0.1 분액을 표 4의 조성을 갖는 성장배지를 함유하는 500ml 배플 플라스크에 도입하였다.
| (1차 및 형질전환 플라스크 배양 및 둥근바닥 플라스크) | |
| 글루코스 | 20g |
| 펩톤 | 20g |
| 효모 자기분해물 | 20g |
| 충분량의 증류수 -pH 5.2 -20% NaOH로 pH 5.8로 조정 -500ml 배플 플라스크에 100ml 분배 -2000ml 둥근바닥 플라스크(3배플)에 500ml 분배 -120℃×20분 살균 -살균후 pH 약 5.7 | |
종균 플라스크를 28℃에서 24시간동안 회전 진탕기(200rpm, 5cm 이동)상에서 배양하고, 이로써 직경이 3 내지 4mm인 펠릿형 균사의 형태로 배양물을 생산하였다. 현미경으로 관찰하여 종균배양물이 시너머틱 성장(synnematic growth:현미경으로 관찰하여, 균류세포의 길고, 꼬여진, 로프형 배열을 기술하기 위해 사용된 용어임), 큰 균사 및 잘 꼬여진 순수한 배양물이라는 것을 알았다. 현탁액의 pH는 5.4 내지 5.6이었다. PMV는 원심분리(3000rpm×5분)로 측정하여 5 내지 8%였다.
형질전환 플라스크 배양물을 종균 배양물 플라스크로부터 생물량(1ml)과 제2의 500ml 진탕기 플라스크에서 표 4에 기재된 조성을 갖는 성장배지(100ml)를 접종함으로써 제조하였다. 얻은 혼합물을 28℃에서 18시간동안 회전 진탕기(200rpm, 5cm 이동)상에서 배양하였다. 배양물을 검사하고 3-4mm 직경인 펠릿형 균사로 이루어진다는 것을 알았다. 현미경으로 관찰하여 배양물이 시너머틱이고 섬유상 성장으로 순수한 배양물이라는 것을 결정하였고, 여기서 정점세포는 세포질로 채워져 있고 구세포는 거의 공포가 없었다. 배양 현탁액의 pH는 5 내지 5.2였고 PMV는 10%와 15% 사이에서 원심분리에 의해 측정하였다. 따라서, 배양물은 칸레논의 11α-히드록시칸레논으로의 형질전환에 적당하다고 생각되었다.
칸레논(1g)을 약 5μ로 미분화하고 살균수(20ml)에 현탁하였다. 이 현탁액에 40%(w/v) 글루코스 살균용액; 16%(w/v) 자기분해된 효모의 살균용액; 및 항생물질 살균용액을 가하고; 모든 농도는 표 5에서 0시간의 반응시간동안에 대해 나타내었다. 항생물질 용액을, 카나마이신 술페이트(40mg), 테트라시클린 HCl(40mg) 및 세팔렉신(200mg)을 물(100ml)에 용해함으로써 제조하였다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액 및 자기분해된 효모용액을 진탕기 플라스크내에 함유된 배양물에 서서히 가하였다.
| 진탕 플라스크내 칸레논의 생물변환 과정중 스테로이드 및 용액(첨가제 및 항생물질)의 지시첨가 | |||||
| 반응시간시간 | 스테로이드 현탁액 ml 약 mg. | 글루코스 용액 ml | 효모자기분해용액 ml. | 항생물질용액ml | |
| 0 | 1 | 50 | 1 | 0.5 | 1 |
| 8 | 2 | 100 | 2 | 1 | |
| 24 | 2 | 100 | 1 | 0.5 | 1 |
| 32 | 5 | 250 | 2 | 1 | |
| 48 | 2 | 100 | 1 | 0.5 | 1 |
| 56 | 5 | 250 | 2 | 1 | |
| 72 | 3 | 150 | 1 | 0.5 | 1 |
| 90 | |||||
반응을 진행시킴에 따라, 반응 혼합물을 주기적으로 분석하여 글루코스 함량을 측정하고 박층 크로마토그래피로 11α-히드록시칸레논으로의 전환율을 측정하였다. 추가의 칸레논 기질 및 영양소를 약 0.1중량% 범위에서 글루코스 함량을 유지하기 위해 제어된 속도에서 반응동안 발효 반응 혼합물에 가하였다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액, 자기분해된 효모 용액 및 항생물질 용액에 대한 첨가 스케쥴은 표 5에 기재되어 있다. 형질전환 반응은 회전 진탕기(200rpm 및 5cm 이동)상에서 25℃에서 96시간동안 계속하였다. 발효동안의 pH 범위는 4.5 내지 6이었다. PMV가 60%로 또는 그 이상으로 상승할 때마다 10ml 부분의 배양액을 회수하고 10ml 증류수로 교체하였다. 칸레논의 소실 및 11α-히드록시칸레논의 출현은 반응동안에 발효순환을 개시한지 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 및 96시간이 지난 후의 간격에서 배양액을 시료화하고, 시료를 TLC로 분석함으로써 모니터하였다. 이들 시료에서 측정한 반응 경과는 표 6에 기재한다.
| 진탕 플라스크내 칸레논의 생물변환과정 | ||
| 시간시간 | 형질전환 비 칸레논 Rf. 11α히드록시칸레논 RF. = 0.81 RF. = 0.29 | |
| 0 | 100 | 0.0 |
| 4 | 50 | 50 |
| 7 | 20 | 80 |
| 23 | 20 | 80 |
| 31 | 30 | 70 |
| 47 | 20 | 80 |
| 55 | 30 | 70 |
| 71 | 25 | 75 |
| 80 | 15 | 85 |
| 96 | ∼10 | ∼90 |
주) Rf 및 RF는 용매 프론트에 비해 화합물의 이동도를 기술하기 위해 박층크로마토그라피에서 사용되는 "용매프론트에 대하여"의 약어이다.
실시예 2
1차 종균 플라스크 배양물을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다. 배양 혼합물을 표 7에 기재된 조성으로 제조하였다.
| 10 l 유리발효조내 형질전환 배양 | ||
| 양 | g/l | |
| 글루코스 | 80g | 20 |
| 펩톤 | 80g | 20 |
| 자기분해된 효모 | 80g | 20 |
| 안티포옴 SAG 471 | 0.5g | |
| 충분량의 탈이온수- 130℃에서 30분간 빈 발효조 살균- 탈이온수 3l 충전 40℃에서 가열- 배지 성분을 교반 하면서 첨가- 15분간 교반, 3.9 l의 부피로 함- pH 5.1- NaOH 20% w/v로 5.8로 조정- 120℃×20분에서 살균- 살균후 pH 5.5 -5.7 | 4l | |
이 영양소 혼합물(4L)의 초기 충전을 10L 기하 부피의 형질전환 발효조에 넣었다. 발효조는 높이 대 직경 비가 2.58인 원통형 모양이었다. 각각 6개의 블레이드를 갖춘 두 개의 No. 2 디스크 휠을 갖는 400rpm 터빈 교반기를 구비하였다. 임펠러의 외직경은 80mm이었고, 각각의 블레이드는 반경치수 25mm, 높이 30mm이고 상부 휠은 용기 정상보다 280mm 아래에, 하부 휠은 정상보다 365mm 아래에 위치결정되고, 용기용 배플은 높이가 210mm이고 용기의 내부 수직벽으로부터 반경방향으로 25mm 안쪽으로 연장하였다.
종균 배양물(40ml)을 발효조내의 영양소 충전과 혼합하고, 형질전환 배양물은 0.5kg/cm2의 압력에서 0.5 l/l-분의 통기속도 및 28℃에서 22시간동안 배양시켜 정착시켰다. 22시간에서, 배양물의 PMV는 20-25%였고 pH는 5 내지 5.2였다.
현탁액을 살균수(400ml)중의 칸레논(80g)으로 제조하고 10ml 부분을 형질전환 발효조내의 혼합물에 가하였다. 이와 동시에 40%(w/v) 글루코스 살균용액, 16%(w/v) 자기분해된 효모의 살균용액 및 항생물질 살균용액을 0시간의 반응시간에서 표 8에 나타낸 비율로 가하였다. 항생물질 용액을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다.
| 10 l 유리발효조내 칸레논의 생물변환 과정중 스테로이드 및 용액(첨가제 및 항생물질)의 지시첨가 | |||||
| 반응시간시간 | 스테로이드 현탁액 ml 약 mg. | 글루코스 용액 ml | 효모자기분해용액 ml. | 항생물질용액ml | |
| 0 | 10 | 4 | 25 | 12.5 | 40 |
| 4 | 25 | 12.5 | |||
| 8 | 10 | 4 | 25 | 12.5 | |
| 12 | 25 | 12.5 | |||
| 16 | 10 | 4 | 25 | 12.5 | |
| 20 | 25 | 12.5 | |||
| 24 | 10 | 4 | 25 | 12.5 | 40 |
| 28 | 10 | 4 | 25 | 12.5 | |
| 32 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 36 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 40 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 44 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 48 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | 40 |
| 52 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 56 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 60 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 64 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 68 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 72 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | 40 |
| 76 | 12.5 | 5 | 25 | 12.5 | |
| 80 | |||||
| 84 | |||||
| 88 | |||||
반응을 진행시킴에 따라, 반응 혼합물을 주기적으로 분석하여 글루코스 함량을 측정하고 박층 크로마토그래피로 11α-히드록시칸레논으로의 전환율을 측정하였다. 하기한 반응 배양액 시료의 TLC 분석에 기초하여, 추가의 칸레논을 칸레논 기질이 소비되는 만큼 반응 혼합물에 가하였다. 글루코스 수준을 글루코스 농도가 약 0.05중량% 이하로 떨어질 때마다 모니터하고, 보충 글루코스 용액을 가하여 농도를 약 0.25중량%로 증가시켰다. 또한 영양소 및 항생물질을 반응 순환동안에 별도의 시간에서 가하였다. 스테로이드 현탁액, 글루코스 용액, 자기분해된 효모 용액 및 항생물질 용액에 대한 첨가 스케쥴은 표 8에 기재되어 있다. 형질전환 반응을 0.3kg/cm2의 포지티브 헤드압력에서 분당 액체부피당 공기부피 0.5(vvm)의 통기속도에서 90시간동안 계속하였다. 온도를 28℃에서 유지하고 나서 PMV는 45%에 이르렀고, 다음에 26℃로 저하시키고 그 온도에서 PMV를 45% 내지 60%가 되도록 유지한 다음에 24℃에서 조절하였다. 초기 교반속도는 400rpm이었고, 40시간이 지난 후에 700rpm으로 증가시켰다. pH를 나타낸 바와같은 2M 오르토인산 또는 2M NaOH를 첨가하여 4.7 내지 5.3으로 유지하였다. 기포 전개에 있어서 안티포옴 SAG 471 몇 방울을 가함으로써 기포화를 제어하였다. 칸레논의 소실 및 11α-히드록시칸레논의 출현을 배양액 시료의 TLC 분석에 의해 반응동안 4시간 간격으로 모니터하였다. 대부분의 칸레논이 배양액으로부터 소실되었을 때, 추가의 증분량을 가하였다.
모든 칸레논을 첨가한 후에, TLC 분석이 11α-히드록시칸레논 생성물에 대한 칸레논 기질의 농도가 약 5%로 감소되었음을 나타낼 때 반응을 종료시켰다.
반응순환의 종료시에, 발효 배양액을 액체 배양액으로부터 균사의 분리를 위해 무명을 통해 여과시켰다. 균사 분획을 반응과정에서 충전한 칸레논 그램당 약 65부피(5.2리터)를 사용하여 에틸아세테이트에 재현탁하였다. 에틸아세테이트중의 균사의 현탁액을 교반하에서 1시간동안 환류하고 약 20℃로 냉각시키고 부흐너에서 여과하였다. 균사 케이크를 에틸아세테이트(칸레논 충전 g당 5부피; 0.4L) 및 탈이온수(500ml)로 연속적으로 세척하여 케이크로부터 에틸아세테이트 추출물을 배출하였다. 필터 케이크를 따라내었다. 풍부한 추출물, 용매 세척액 및 물 세척액을 분리기에서 수집한 다음에 상 분리를 위해 2시간동안 방치하였다.
다음에 수상을 따라내고 유기상을 진공하에서 350ml의 잔류 부피로 농축하였다. 증류기 바닥을 15℃로 냉각시키고 약 1시간동안 교반하였다. 얻은 현탁액을 여과하여 결정성 생성물을 제거하고 필터 케이크를 에틸아세테이트(40ml)로 세척하였다. 건조후에, 11α-히드록시칸레논의 수득량은 60g으로 측정되었다.
실시예 3
포자 현탁액을 실시예 1에 기재된 방법으로 루틴 슬랜트로부터 제조하였다. 2000ml 배플 둥근바닥 플라스크(3배플, 각각 50mm×30mm)에서, 포자 현탁액의 분액(0.5ml)을 표 4의 조성을 갖는 배양용액(500ml)에 넣었다. 얻은 혼합물을 다른 진탕기(분당 120 스트로크; 5cm 이동)에서 25℃에서 24시간동안 플라스크에서 배양하여 현미경으로 관찰할 때 잘 꼬여진 균사가 있는 순수한 배양물로서 보여지는 배양물을 생산하였다. 배양물의 pH는 약 5.3 내지 5.5였고, PMV(5분동안 3000rpm에서 원심분리로 측정)는 8 내지 10%였다.
이렇게 제조한 배양물을 사용하여, 종균 배양물을 아스펙트비가 2.31이고 기하부피가 160L인, 수직 원통형 모양의 스테인레스강 발효조(높이=985mm; 직경=425mm)에서 제조하였다. 발효조는 두 개의 휠을 갖는 디스크 터빈형 교반기를 구비하였고, 각각의 휠은 외직경이 240mm인 6개의 블레이드를 갖고, 각각의 블레이드는 반경치수 80mm 및 높이 50mm이었다. 상부 휠은 발효조의 정상으로부터 780mm의 깊이에서, 두 번째는 995mm의 깊이에서 위치결정되었다. 높이가 890mm인 수직 배플은 발효조의 내부 수직벽으로부터 반경방향으로 40mm 안쪽으로 연장하였다. 교반기는 170rpm에서 작동하였다. 표 9의 조성을 갖는 영양소 혼합물(100L)을 발효조에 도입한 다음에 상기한 대로 제조하고 pH는 5.7인 일부의 예비접종원(1L)을 도입하였다.
| 160L 발효조에서 생장배양을 위해 약 8L가 종균 생산 발효조에 필요 | ||
| 양 | g/L | |
| 글루코스 | 2kg | 20 |
| 펩톤 | 2kg | 20 |
| 자기분해된 효모 | 2kg | 20 |
| 안티포옴 SAG 471 | 0.010kg | 미량 |
| 충분량의 탈이온수- 130℃에서 1시간 동안 빈 발효조 살균- 탈이온수 6L 충전; 40℃에서 가열- 배지 성분을 교반 하면서 첨가- 15분간 교반, 95L 의 부피로 함- 30분간 121℃에서 살균- 살균후 pH 5.7- 살균 탈이온수를 가해 100L로 함 | 100L | |
접종 혼합물을 0.5kg/cm2의 헤드압력에서 0.5L/L-분의 통기속도에서 22시간동안 배양하였다. 온도를 28℃로 조절하고 나서 PMV는 25%에 이르렀고, 그 다음에 25℃로 저하시켰다. pH는 5.1 내지 5.3 범위에서 조절하였다. 균사 부피의 성장은 종균 배양반응의 용존산소량 및 pH 프로파일과 함께 표 10에 나타낸다.
| 종균 배양 발효에서 균사성장과정 | |||
| 발효시간 시간 | pH | 충전균사부피(pmv)% (3000rpms 5분) | 용존산소량 % |
| 0 | 5.7±0.1 | 100 | |
| 4 | 5.7±0.1 | 100 | |
| 8 | 5.7±0.1 | 12±3 | 85±5 |
| 12 | 5.7±0.1 | 15±3 | 72±5 |
| 16 | 5.5±0.1 | 25±5 | 40±5 |
| 20 | 5.4±0.1 | 30±5 | 35±5 |
| 22 | 5.3±0.1 | 33±5 | 30±5 |
| 24 | 5.2±0.1 | 35±5 | 25±5 |
이렇게 생산한 종균 배양물을 사용하여, 형질전환 발효조작을 직경이 1.02m, 높이가 1.5m, 기하부피가 1.4m3인 수직원통형 스테인레스강 발효조에서 시행하였다. 발효조는 두 개의 임펠러, 이 중 하나는 반응기의 정상에서 867cm 아래에 위치결정되고, 다른 하나는 정상으로부터 1435cm 아래에 위치결정되는 터빈 교반기를 구비하였다. 각각의 휠은 6개의 블레이드를 구비하였고, 각각은 반경치수가 95cm이고 높이는 75cm였다. 1440cm 높이의 수직배플은 반응기의 내부 수직벽으로부터 반경방향으로 100cm 안쪽으로 연장하였다. 영양소 혼합물을 표 11의 조성으로 제조하였다.
| 1000L 발효조에서의 생물변환배양 | ||
| 양 | g/L | |
| 글루코스 | 16kg | 23 |
| 펩톤 | 16kg | 23 |
| 자기분해된 효모 | 16kg | 23 |
| 안티포옴 SAG 471 | 0.080kg | 미량 |
| 충분량의 탈이온수- 130℃에서 1시간 동안 빈 발효조 살균- 탈이온수 600L 충전; 40℃에서 가열- 배지성분을 교반하면서 첨가- 15분간 교반, 650L 부피로 함- 30분간 121℃에서 살균- 살균후 pH 5.7- 살균 탈이온수를 가해 700L로 함 | 700L | |
이 영양소 혼합물(pH=5.7)의 초기충전(700L)을 발효조에 넣은 다음에 상기한 대로 제조한 본 실시예의 종균 접종원(7L)을 넣었다.
접종원을 함유하는 영양소 혼합물을 0.5kg/cm2의 헤드압력에서 0.5L/L-분의 통기속도에서 24시간동안 배양하였다. 온도를 28℃로 조절하고 교반속도는 110rpm이었다. 균사부피의 성장은 종균 배양반응의 용존산소량 및 pH 프로파일과 함께 표 12에 나타낸다.
| 형질전환 배양의 발효조에서의 균사성장과정 | |||
| 발효시간시간 | pH | 충전균사부피(pmv)% (3000rpm×5분) | 용존산소량 % |
| 0 | 5.6±0.2 | 100 | |
| 4 | 5.5±0.2 | 100 | |
| 8 | 5.5±0.2 | 12±3 | 95±5 |
| 12 | 15±3 | 90±5 | |
| 16 | 5.4±0.1 | 20±5 | 75±5 |
| 20 | 5.3±0.1 | 25±5 | 60±5 |
| 22 | 5.2±0.1 | 30±5 | 40±5 |
배양 종료시에, 균사의 펠릿화를 관찰하였지만, 펠릿은 통상 작고 비교적 느슨하게 충전되었다. 분산 균사를 배양액에 현탁하였다. 최종 pH는 5.1 내지 5.3이었다.
이렇게 생산한 형질전환 배양물에 살균수(5L)중의 칸레논(1.250kg; 5μ로 미분화)의 현탁액을 가하였다. 첨가제 살균용액 및 항생물질용액을 표 14에서 반응시간 0에서 나타낸 비율로 가하였다. 첨가제 용액의 조성은 표 13에 기재되어 있다.
| 첨가제 용액 (형질전환 배양) | |
| 양 | |
| 덱스트로스 | 40kg |
| 효모 자기분해물 | 8kg |
| 안티포옴 SAG 471 | 0.010kg |
| 충분량의 탈이온수- 130℃에서 1시간 동안 150 l 빈 발효조 살균- 탈이온수 70 l 충전; 40℃에서 가열- "첨가제 용액"의 성분을 교반하면서 첨가- 30분간 교반, 95 l의 부피로 함- pH 4.9- 120℃×20분에서 살균- 살균후 pH 약 5 | 100 l |
생물변환은 0.5kg/cm2의 헤드압력, 및 7.5M NaOH 또는 4M H3PO4를 첨가하여 필요한 대로 조정한 4.7 내지 5.3 범위의 pH에서 0.5L/L-분으로 통기하면서 약 96시간동안 시행하였다. 교반속도는 초기에는 100rpm이었고, 40시간에서는 165rpm으로, 64시간에서는 250rpm으로 증가시켰다. 초기온도는 28℃였고, PMV가 45%에 이르렀을 때 26℃로 저하시키고, PMV가 60%로 상승하였을 때 24℃로 저하시켰다. 미적의 SAG 471을 기포화를 제어하는데 필요한 만큼 가하였다. 발효에서의 글루코스 수준을 4시간 간격에서 모니터하고 글루코스 농도가 1gpl 미만으로 떨어질때마다 첨가제 살균용액(10L)의 증가량을 배치에 가하였다. 칸레논의 소실 및 11α-히드록시칸레논의 출현도 반응동안에 HPLC로 모니터하였다. 적어도 90%의 초기 칸레논 충전을 11α-히드록시칸레논으로 전환시켰을 때 칸레논 1.250kg의 증가량을 가하였다. 그 증가량중의 칸레논중 90%가 전환되었음을 나타낼 때, 다른 1.250kg 증가량을 도입하였다. 동일한 기준을 사용하여 다른 증가량(각각 1.250kg)을 가하여 전체 반응기 충전(20kg)을 도입하였다. 전체 칸레논 충전을 반응기로 운반한 후에, 반응은 미반응 칸레논의 농도가 제조 11α-히드록시칸레논의 양에 대해 5%였을 때 종료시켰다. 칸레논의 첨가, 첨가제 살균용액, 항생물질 용액에 대한 스케쥴은 표 14에 나타낸 바와같다.
| 발효조내의 칸레논의 생물변환과정중 스테로이드 및 용액 (첨가제 및 항생물질)의 첨가 | |||||
| 반응시간시간 | 현탁액중의 칸레논kg 누적 kg | 첨가제 살균용액 리터 | 항생물질용액 리터 | 부피 리터약 | |
| 0 | 1.250 | 1.25 | 10 | 8 | 700 |
| 4 | 10 | ||||
| 8 | 1.250 | 2.5 | 10 | ||
| 12 | 10 | ||||
| 16 | 1.250 | 10 | |||
| 20 | 10 | ||||
| 24 | 1.250 | 5 | 10 | 8 | 800 |
| 28 | 1.250 | 10 | |||
| 32 | 1.250 | 10 | |||
| 36 | 1.250 | 10 | |||
| 40 | 1.250 | 10 | |||
| 44 | 1.250 | 10 | |||
| 48 | 1.250 | 12.5 | 10 | 8 | 900 |
| 52 | 1.250 | 10 | |||
| 56 | 1.250 | 10 | |||
| 60 | 1.250 | 10 | |||
| 64 | 1.250 | 10 | |||
| 68 | 1.250 | 10 | |||
| 72 | 1.250 | 20 | 10 | 8 | 1050 |
| 76 | 0 | ||||
| 80 | |||||
| 84 | |||||
| 88 | |||||
| 92 | |||||
| 총 | |||||
생물변환을 완료시켰을 때, 균사를 배스킷 원심분리기에서 원심분리하여 배양액으로부터 분리하였다. 여액을 HPLC로 측정하여 수확 배양액중에 11α-히드록시칸레논의 전체양중 단지 2%만을 함유하므로 제거하였다. 균사를 2m3 용량의 추출탱크에서 에틸아세테이트(1000L)에 현탁하였다. 이 현탁액을 교반 및 에틸아세테이트 환류 조건하에서 1시간동안 가열하고, 다음에 냉각시키고 배스킷 원심분리기에서 원심분리하였다. 균사 케이크를 에틸아세테이트(200L)로 세척한 다음에 배출하였다. 스테로이드 풍부한 용매 추출물을 1시간동안 방치시켜 수상을 분리하였다. 수상을 에틸아세테이트 용매(200L)의 추가량으로 추출한 다음에 배출하였다. 합한 용매상을 원심분리로 정화시키고 농축기(500L 기하부피)에 놓고 100L의 잔류부피로 진공하에서 농축하였다. 증발을 시행할 때, 합한 추출물 및 세척액의 농축기로의 초기 충전은 100L였고, 이 부피를 용매를 제거함에 따라 합한 용액의 연속 또는 주기적 첨가로 일정하게 유지하였다. 증발단계를 완료한 후에, 증류기 바닥을 20℃로 냉각시키고 2시간동안 교반한 다음에 부흐너 필터에서 여과하였다. 농축기 포트를 에틸아세테이트(20L)로 세척하고 이 세척액을 필터상의 케이크를 세척하는데 사용하였다. 생성물을 50℃에서 16시간동안 진공하에서 건조시켰다. 11α-히드록시칸레논의 수득량은 14kg이었다.
실시예 4
Aspergillus ochraceus NRRL 405의 냉동건조시킨 포자를 표 15의 조성을 갖는 콘스팁액 성장배지(2ml)에 현탁하였다.
| 콘스팁액 배지(1차 종균 배양을 위한 성장배지) | |
| 콘스팁액 | 30g |
| 효모 추출물 | 15g |
| 인산암모늄 일염기 | 3g |
| 글루코스(살균후 충전)충분량의 증류수 1000mlpH: 4.6, 20% NaOH로 pH 6.5로 조정250ml 삼각플라스크에 50ml 분배20분간 121℃에서 살균 | 30g |
얻은 현탁액을 한천 플레이트상에서 포자의 번식을 위한 접종원으로 사용하였다. 10개의 한천 플레이트를 제조하는데, 각각은 표 16에 기재된 조성을 갖는 고체 글루코스/효모 추출물/인산염/한천 성장배지를 포함하였다.
| GYPA(플레이트를 위한 글루코스/효모추출물/인산염 한천) | |
| 글루코스(살균후 충전) | 10g |
| 효모추출물 | 2.5g |
| K2HPO4 | 3g |
| 한천충분량의 증류수 1000mlpH 6.5로 조정 30분간 121℃에서 살균 | 20g |
현탁액의 0.2ml 분액을 각 플레이트의 표면으로 운반하였다. 플레이트를 10일간 25℃에서 배양한 후에, 모든 플레이트로부터의 포자를 표 17에 기재된 조성을 갖는 살균 극저온 보호배지에서 수확하였다.
| GYP/글리세롤(저장 바이알을 위한 글루코스/효모추출물/인산염/글리세롤 배지) | |
| 글루코스(살균후 충전) | 10g |
| 효모 추출물 | 2.5g |
| K2HPO4 | 3g |
| 한천충분량의 증류수 1000mL30분간 121℃에서 살균 | 20g |
얻은 현탁액을 각각의 바이알로 1ml를 운반하면서 20개의 바이알로 분할하 였다. 이들 바이알은 주 세포뱅크를 구성하며 이것은 칸레논의 11α-히드록시칸레논으로의 생물변환을 위한 접종원 발생에 사용하기 위한 작업 세포뱅크를 제조할 수 있다. 주 세포뱅크로 이루어지는 바이알을 -130℃에서 액체 질소 냉동기의 증기상에서 저장하였다.
작업세포 뱅크를 제조하기 위해, 단일 주 세포뱅크로부터의 포자를 표 15의 조성을 갖는 살균 성장배지(1ml)에 재현탁하였다. 이 현탁액을 10개의 0.2ml 분액으로 분할하고 각각의 분액을 표 16의 조성을 갖는 고체 성장배지를 포함하는 한천 플레이트를 접종하는데 사용하였다. 이들 플레이트를 25℃에서 10일간 배양하였다. 배양 3일째에 성장배지의 하면은 갈색-오렌지색이었다. 배양 종료시에 금색 포자가 많이 생산되어 있었다. 각 플레이트로부터의 포자를 주 세포뱅크의 제조에 대해 상기한 방법으로 수확하였다. 전체 100개의 바이알을 제조하고 각각은 1ml의 현탁액을 함유하였다. 이들 바이알은 작업세포 뱅크를 구성하였다. 작업세포 뱅크 바이알은 -130℃에서 액체 질소 냉동기의 증기상에서 저장하여 보존하였다.
표 15의 조성을 갖는 성장배지(50ml)를 250ml 삼각 플라스크에 넣었다. 작업세포 현탁액의 분액(0.5ml)을 플라스크에 넣고 성장배지와 혼합하였다. 접종한 혼합물을 25℃에서 24시간동안 배양하여 약 45%의 퍼센트 충전균사부피를 갖는 1차 종균 배양물을 생산하였다. 눈으로 관찰하여 배양물이 1 내지 2mm 직경의 펠릿형 균사로 이루어졌음을 알았고; 현미경으로 관찰하여 순수한 배양물임을 알았다.
2차 종균 배양물의 배양은, 표 15의 조성을 갖는 성장배지를 2.8L 펀바흐(Fernbach) 플라스크에 넣고 상기한 대로 제조한 본 실시예의 1차 종균 배양물 일부(10ml)로 배지를 접종함으로써 개시하였다. 접종 혼합물을 회전 진탕기(200rpm, 5cm 이동)에서 24시간동안 25℃에서 배양하였다. 배양 종료시에, 배양물은 1차 종균 배양물에 대해 상기한 바와 동일한 특성을 나타내었고, 칸레논을 11α-히드록시칸레논으로 생물변환시키는 형질전환 발효에 사용하는데 적당하였다.
형질전환은 다음과 같이 구성된 브라운 이 바이오스탓(Braun E Biostat) 발효조에서 시행하였다:
용량: 15리터의 둥근 바닥
높이: 53cm
직경: 20cm
H/D: 2.65
임펠러: 7.46cm 직경, 6개의 패들 각각 2.2×1.4cm
임펠러 간격: 탱크 바닥으로부터 65.5, 14.5 및 25.5cm
배플: 4개 1.9×48cm
스파저: 10.1cm 직경, 21개의 구멍 ∼1mm 직경
온도조절: 외부용기 재킷으로 제공
20g/L 농도의 칸레논을 탈이온수(4L)에 현탁하고 표 18의 조성을 갖는 성장배지 일부(2L)를 발효조내의 혼합물을 300rpm에서 교반하면서 가하였다.
| (10L 발효조내의 생물변환 배양을 위한 성장배지) | ||
| 양 | 양/L | |
| 글루코스(살균후 충전) | 160g | 20g |
| 펩톤 | 160g | 20g |
| 효모 추출물 | 160g | 20g |
| 안티포옴 SAF471 | 4.0ml | 0.5ml |
| 칸레논충분량의 탈이온수 7.5L 30분간 121℃에서 살균 | 160g | 20g |
얻은 현탁액을 15분동안 교반한 후에 부피를 추가의 탈이온수로 7.5L로 하였다. 이 시점에서 현탁액의 pH를 20중량%의 NaOH 용액을 가하여 5.2 내지 6.5로 조정하고, 다음에 현탁액을 브라운 이 발효조에서 30분간 121℃에서 가열함으로써 살균하였다. 살균후 pH는 6.3±0.2였고, 최종 부피는 7.0L였다. 살균 현탁액을 상기한 대로 제조한 본 실시예의 2차 종균 배양물 일부(0.5L)로 접종하고 부피를 50% 글루코스 살균용액을 가하여 8.0L로 하였다. 발효는 28℃의 온도에서 시행하여 PMV가 50%에 이르고, 다음에 26℃로 저하시키고 PMV가 50%를 초과할 때 24℃로 더 저하시켜 약 60% 미만의 PMV를 일정하게 유지하였다. 초기 액체 부피를 기초로 하여 0.5vvm의 속도에서 스파저를 통해 공기를 도입하고 발효조내의 압력은 700밀리바아 게이지에서 유지하였다. 교반을 600rpm에서 개시하고 30부피% 이상으로 용존산소량을 유지하는데 필요한 만큼 1000rpm으로 단계적으로 증가시켰다. 글루코스 농도를 모니터하였다. 초기 글루코스 고농도를 발효 반응에 의해 소비되기 때문에 1% 미만으로 저하시킨 후에, 보충 글루코스를 50중량%의 글루코스 살균용액을 통해 제공하여 배치순환의 잔사를 통해 0.05% 내지 1% 범위에서 농도를 유지하였다. 접종전의 pH는 6.3±0.2였다. pH를 초기 발효동안에 약 5.3으로 저하시킨 후에, 수산화암모늄을 가하여 순환의 잔사에 대해 5.5±0.2 범위에서 유지하였다. 기포를 OSI Specialties, Inc.에 의해 상표명 SAG 471로 판매된 폴리에틸렌 글리콜 기포방지제를 가함으로써 제어하였다.
배양물을 순환중 처음 24시간동안에 먼저 성장시키고, 이때 PMV는 약 40%였고, pH는 약 5.6이었고 용존산소량은 약 50부피%였다. 칸레논 전환은 배양물이 성장함에 따라 개시되었다. 칸레논 및 11α-히드록시칸레논의 농도를 매일 시료를 분석함으로써 생물변환동안 모니터하였다. 시료를 고온의 에틸아세테이트로 추출하고 얻은 시료 용액을 TLC 및 HPLC로 분석하였다. 생물변환은 잔류 칸레논 농도가 초기 농도의 약 10%였을 때 종료시켰다. 대략적인 전환시간은 110 내지 130시간이었다.
생물변환을 종료시켰을 때, 균사 생물량을 원심분리로 배양액으로부터 분리하였다. 상청액을 동일한 부피의 에틸아세테이트로 추출하고 수층을 따라내었다. 균사 분획을 발효 반응기에 충전한 칸레논 g당 약 65부피를 사용하여 에틸아세테이트에 재현탁하였다. 균사 현탁액을 교반하에서 1시간동안 환류하고 약 20℃로 냉각시키고 부흐너 깔때기에서 여과하였다. 균사 필터 케이크를 발효조에 충전한 칸레논 g당 5부피의 에틸아세테이트로 2회 세척하고, 다음에 탈이온수(1L)로 세척하여 잔류 에틸아세테이트를 배출하였다. 수성 추출물, 풍부한 용매, 용매 세척액 및 물 세척액을 합하였다. 균사 케이크를 제거한 잔류물을 잔류 스테로이드에 대한 분석에 의존하여 따라내거나 또는 다시 추출하였다. 합한 액상을 2시간동안 방치시켰다. 다음에, 수상을 분리하고 따라내고, 유기상을 진공하에서 농축하여 잔류 부피를 약 500ml로 하였다. 증류기 병을 약 1시간동안 서서히 교반하면서 약 15℃로 냉각시켰다. 결정성 생성물을 여과로 회수하고 냉 에틸아세테이트(100ml)로 세척하였다. 용매를 증발에 의해 결정으로부터 제거하고 결정성 생성물을 50℃에서 진공하에서 건조시켰다.
실시예 5
Aspergillus ochaceus ATCC 18500의 냉동건조시킨 포자를 실시예 4에 기재된 콘스팁액 성장배지(2ml)에 현탁하였다. 한천 플레이트를 실시예 4의 방법으로 제조하였다. 플레이트를 실시예 4에 기재된 대로 배양하고 수확하여 주 세포 뱅크를 얻었다. 주 세포 뱅크를 포함하는 바이알을 -130℃에서 액체 질소 냉동기의 증기상에서 저장하였다. 주 세포 뱅크의 바이알로부터, 작업 세포뱅크를 실시예 4에 기재된 대로 제조하고 -130℃에서 질소 냉동기에서 저장하였다.
표 19에 기재된 조성을 갖는 성장배지(300mL)를 2L 배플 플라스크에 넣었다. 작업 세포 현탁액의 분액(3mL)을 플라스크에 넣었다. 접종 혼합물을 회전 진탕기(200rpm, 5cm 이동)상에서 28℃에서 20 내지 24시간동안 배양하여 약 45%의 퍼센트 충전균사부피를 갖는 1차 종균 배양물을 생산하였다. 눈으로 관찰하여 배양물이 1 내지 2mm의 펠릿형 균사로 이루어진다는 것을 알았고; 현미경으로 관찰하여 순수한 배양물임을 알았다.
| 1차 및 2차 종균 배양을 위한 성장배지 | |
| 양/L | |
| 글루코스(살균후 충전) | 20g |
| 펩톤 | 20g |
| 효모추출물 | 20g |
| 충분량의 탈이온수 1000mL 30분간 121℃에서 살균 | |
2차 종균배양물의 배양을 표 19에 기재된 조성을 갖는 성장배지 8L를 14L 유리 발효조에 도입함으로써 개시하였다. 본 실시예의 1차 종균 배양물 160mL 내지 200mL로 발효조를 접종한다. 이것의 제조는 상기한 바와같다.
접종 혼합물을 200rmp 교반, 0.5vvm 통기속도에서 18-20시간동안 28℃에서 배양하였다. 번식 종료시에 배양물은 1차 종균에 대해 상기한 바와 동일한 특성을 나타내었다.
형질전환은 실질적으로 실시예 4에 기재된 방법으로 60L 발효조에서 시행하는데, 단 성장배지가 표 20에 기재된 조성을 갖고 2차 종균 배양물의 초기 충전이 350mL 내지 700mL인 것만 제외하였다. 교반속도는 초기에 200rpm 이나, 용존산소량을 10부피% 이상으로 유지하는데 필요한 만큼 500rpm으로 증가시켰다. 20 g/L 칸레논에 대해 대략적인 생물변환 시간은 80 내지 160시간이었다.
| 60L 발효조내의 생물변환 배양을 위한 성장배지 | ||
| 양 | 양/L | |
| 글루코스(살균후 충전) | 17.5g | 0.5g |
| 펩톤 | 17.5g | 0.5g |
| 효모 추출물 | 17.5g | 0.5g |
| 칸레논(살균수중의 20% 슬러리로서 충전) | 700g | 20g |
| 충분량의 탈이온수 35L 30분간 121℃에서 살균 | ||
실시예 6
실시예 4에 기재된 방법에 따라 제조한 작업 세포 뱅크로부터 포자 현탁액을 사용하여 1차 및 2차 종균 배양물을 실질적으로 실시예 4에 기재된 방법으로 제조하였다. 이 방법으로 제조한 2차 종균 배양물을 사용하여, 2가지의 생물변환 조작을 도 1에 도시한 유형의 변형 방법에 따라 하고, 2가지 조작을 도 2에 도시한 방법으로 하였다. 이들 조작을 위해 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 스케쥴, 수확시간 및 전환도를 표 21에 기재한다. 조작 R2A는 실시예 3과 동일한 원리에 기초하여 칸레논 첨가요강을 사용하고, 반면 조작 R2C는 칸레논을 단지 두 번, 이 중 한 번은 배치 개시에서, 다른 한 번은 24시간후에 첨가함으로써 실시예 3 요강을 변형하였다. 조작 R2B 및 R2D에서, 전체 칸레논 충전은 배치 개시에서 도입하고, 공정은 발효조에 충전하기 전에 별도의 용기에서 칸레논 충전을 살균하고 글루코스를 배치 공정할 때 가하는 것만 제외하고 실시예 4에 기재된 방법으로 통상 시행하였다. Waring 블렌더를 살균시 생산된 응집물을 감소시키는데 사용하였다. 조작 R2A 및 R2B에서, 칸레논을 메탄올 용액중의 배치에 도입하고, 이들 조작은 실시예 3 및 실시예 4의 조작과 각각 상이하였다.
| 초기 칸레논 생물변환 공정 설명 | ||||
| 조작번호 | R2A | R2B | R2C | R2D |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5NNaOH로 6.0으로 조정 | R2A와 동일하게 조작 | 30153300.5ml2.5NNaOH로6.5로 조정 | R2C와 동일하게 조작 |
| 칸레논 | 0, 18, 24, 30, 36, 42,50, 56, 62및 68시간에서 10g/80ml MEOH 첨가 | 동시에 0시간에서 80g/640ml MEOH 첨가 | 살균 및배합; 0시간:25g 24시간:200g 첨가 | 살균 및배합 0시간:200g첨가 |
| 수확시간 | 143시간 | 166시간 | 125시간 | 104시간 |
| 생물변환 | 45.9% | 95.6% | 98.1% | 95.1% |
주) OSA는 미국 웨스트 버지니아 시스터스빌 OSI 스페셜티스 컴파니가 제조한 거품방지제 SAG 471을 표시한 것이다.
조작 R2A 및 R2B에서, 메탄올 농도는 발효 비어에서 약 6.0%로 누적되었고, 이것은 배양물의 성장 및 생물변환을 저해한다는 것을 알았다. 그러나, 이들 조작의 결과에 기초하여 메탄올 또는 다른 수혼화성 용매를 보다 낮은 농도에서 유효하게 사용하여 칸레논 충전을 증가시킬 수 있고 미립자 침전으로서 칸레논을 제공하여 반응에 큰 계면적의 칸레논을 공급할 수 있다는 것을 알았다.
칸레논은 살균온도(121℃)에서 안정하지만 덩어리로 응집되었다. Waring 블렌더를 사용하여 덩어리를 미립자로 분쇄하고 이것을 성공적으로 생성물로 전환시켰다.
실시예 7
실시예 4에 기재된 방법에 따라 제조한 작업세포뱅크로부터 포자현탁액을 사용하여 1차 및 2차 종균 배양물을 실질적으로 실시예 4에 기재된 방법으로 제조하였다. 실시예 7의 설명 및 결과는 표 22에 나타낸다. 이 방법으로 생산한 2차 종균배양물을 사용하여, 한 생물변환(R3C)을 실질적으로 실시예 3에 기재된 대로 시행하고, 3가지의 생물변환을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 통상 시행하였다. 후자의 3가지 조작(R3A, R3B 및 R3D)에서, 칸레논을 글루코스를 제외한 성장배지와 함께 이동가능한 탱크에서 살균하였다. 글루코스를 다른 탱크로부터 무균공급하였다. 살균칸레논 현탁액을 생물변환의 초기단계동안 또는 접종전중 어느 하나에서 발효조에 넣었다. 조작 R3B에서, 보충살균 칸레논 및 성장배지를 46.5에서 도입하였다. 살균시 형성한 칸레논의 덩어리를 Waring 블렌더를 통해 분쇄하여 발효조에 넣는 미립자 현탁액을 제조하였다. 이들 조작을 위한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가스케쥴, 영양소 첨가스케쥴, 수확시간 및 전환도는 표 22 및 표 23에 기재한다.
| 칸레논 생물변환 공정 설명 | ||||
| 조작번호 | R3A | R3B | R3C | R3D |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5N NaOH로 6.5로 조정 | R3A와 동일하게 조작 | 펩톤: 20효모추출물: 20 글루코스:20OSA: 3ml2.5N NaOH로6.5로 조정 | R3A와 동일하게 조작 |
| 칸레논 충전 | 칸레논을 살균하고 배합함. BI: 50g16.5시간: 110g | R3A와 동일하게 조작BI: 50g16.5시간: 110g46.5시간:80g | 비살균 칸레논: 표 23에 나열된 스케쥴대로 충전 | R3A와 동일하게 조작BI: 50g16.5시간: 110g |
| 공급 | 표 23 참조 | 표 23 참조 | 표 23 참조 | 표 23 참조 |
| 수확시간 | 118.5시간 | 118.5시간 | 118.5시간 | 73.5시간 |
| 생물변환 | 93.7% | 94.7% | 60.0% | 68.0% |
| 전개 실험에서 칸레논, 글루코스 및 성장배지에 대한 공급 스케쥴 | |||||||
| 첨가시간시간 | R3C | R3A | R3B | R3D | |||
| 칸레논 200g/2L살균 DIg | 글루코스 50% 용액g | IL 물중의 펩톤 및 효모 추출물 각 20gg | 항생물질:50ml중의 20mg 카나마이신 20mg 테트라시클린 100mg 세팔렉신 | 칸레논/성장배지 표 22 참조g/L | 칸레논/성장배지표 22 참조g/L | 칸레논/성장배지표 22 참조g/L | |
| 0 | -- | -- | -- | -- | 50g/0.4L | 50g/0.4L | 50g/0.4L |
| 14.5 | 16 | 100 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 16.5 | -- | -- | -- | -- | 110g/1.2L | 110g/1.2L | 110g/1.2L |
| 20.5 | 16 | 140 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 28.5 | 16 | 140 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 34.5 | 16 | 150 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 40.5 | 16 | 150 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 46.5 | 880 | 130 | 25 | -- | -- | 80g/0.8L | -- |
| 52.5 | 160 | 120 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 58.5 | 160 | 150 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 64.5 | 160 | 180 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 70.5 | 160 | 140 | 25 | -- | -- | -- | -- |
섬유상 성장으로 인해 매우 점성인 발효조 배양액은 본 실시예의 4가지 조작 전부에 있었다. 고 점도가 통기, 혼합, pH 조절 및 온도 조절에 대해 발생한 문제점을 극복하기 위해, 통기속도 및 교반속도를 이들 조작중에서 증가시켰다. 전환은 보다 엄격한 조건하에서 충분히 진행되었지만, 조밀한 케이크가 액체 배양액 표면위에 형성되었다. 어떤 미반응 칸레논을 이 케이크에 의해 배양액 밖으로 운반하였다.
실시예 8
실시예 8의 설명 및 결과는 표 24에 요약된다. 4가지 발효조작을 하는데, 11α-히드록시칸레논을 칸레논의 생물변환으로 제조하였다. 이들 조작중 두 조작(R4A 및 R4D)에서, 생물변환을 실시예 6의 조작 R3A 및 R3D와 실질적으로 동일한 방법으로 시행하였다. 조작 R4C에서, 칸레논을 실시예 3에 기재된 방법으로 통상 11α-히드록시칸레논으로 전환시켰다. 조작 R4B에서, 공정을 실질적으로 실시예 4에 기재된 대로 시행하는데, 즉 접종하기 직전에 발효조내의 성장배지 및 칸레논을 살균하고, 모든 질소 및 인 영양소를 배치 개시에서 도입하고 글루코스만을 함유하는 보충 용액을 발효조에 공급하여 배치를 진행시킬 때 글루코스 수준을 유지하였다. 후자의 공정(조작 R4B)에서, 글루코스 농도를 매 6시간마다 모니터하고 글루코스 용액을 지시한 대로 가하여 0.5 내지 1% 범위에서 글루코스 수준을 제어하였다. 이들 조작을 위한 칸레논의 첨가 스케쥴은 표 25에 따른다.
| 칸레논 생물변환의 전개실험 공정 설명 | ||||
| 조작번호 | R4A | R4B | R4C | R4D |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5NNaOH로 6.5로 조정 | R4A와 동일하게 조작 | 펩톤:20효모 추출물: 20글루코스: 20OSA 3ml2.5NNaOH로 6.5로 조정 | R4A와 동일하게조작 |
| 칸레논 충전 | 칸레논을 살균하고 배합함.BI: 40g23.5시간: 120g | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 비살균 칸레논:표 25에 나열된 스케쥴대로 충전 | 칸레논을 살균하고 배합함. BI: 40g23.5시간: 120g |
| 배지 충전 | 표 25 참조 | 표 25 참조 | 표 25 참조 | 표 25 참조 |
| 수확시간 | 122시간 | 122시간 | 122시간 | 122시간 |
| 생물변환 | 95.6% | 97.6% | 95.4% | 96.7% |
| 전개실험에서 칸레논, 글루코스 및 성장배지의 공급 스케쥴 | |||||||
| 첨가시간시간 | R4C | R4A | R4B | R4D | |||
| 칸레논200g/2L살균수g | 글루코스50%용액g | 1L 물중의 펩톤 및 효모 추출물 각 20gg | 항생물질:50ml중의 20mg 카나마이신20mg 테트라시클린100mg 세팔렉신(칸레논 슬러리에 첨가) | 성장 배지표 24 참조 | 성장 배지표 24 참조 | 성장 배지표 24 참조 | |
| 14 | 600 | 135 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 20 | -- | 100 | -- | -- | -- | -- | -- |
| 23 | -- | -- | -- | -- | 120g/1.2L | -- | 120g/1.2L |
| 26 | - | 100 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 32 | -- | 135 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 38 | 500 | 120 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 44 | -- | 100 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 50 | -- | 100 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 56 | -- | 150 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 62 | 500 | 150 | 25 | 50ml | -- | -- | -- |
| 68 | -- | 200 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 74 | -- | 300 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 8- | -- | 100 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 86 | -- | 125 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 92 | -- | 175 | 25 | -- | -- | -- | -- |
| 98 | -- | 150 | -- | -- | -- | -- | -- |
| 104 | -- | 175 | -- | -- | -- | -- | -- |
| 110 | -- | 175 | -- | -- | -- | -- | -- |
| 116 | -- | 200 | -- | -- | -- | -- | -- |
발효 비어가 하루내 또는 접종후에 매우 점성이 되기 때문에 대부분의 발효 순환 동안 모든 발효조를 고 교반 및 통기하에서 조작하였다.
실시예 9
본 실시예의 조작을 위한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 스케쥴, 수확시간 및 전환도를 표 26에 기재한다.
4가지의 생물변환 조작을 하기한 것만 제외하고 실시예 8의 조작 R4B에 기재된 방법으로 실질적으로 시행하였다. 조작 R5B에서, 다른 조작에서 교반에 사용된 정상 터빈 디스크 임펠러(impeller:발효기의 교반축에 동심적으로 부착되어 있는 허브에 부착된 날들로 구성되는 기계장치)를 하향 펌프화 머린 임펠러(marine impeller:보트 프로펠러 같은 형상의 날들을 가지며 액체가 특정방향으로, 주로 위아래로 흐르도록 해준다)로 교체하였다. 하향 펌프화 작용은 발효조 중앙으로 배양액을 축방향으로 붓고 케이크 형성을 감소시켰다. 메탄올(200ml)을 조작 R5D에서 접종한 후에 바로 가하였다. 칸레논을 발효조에서 살균하기 때문에 글루코스를 제외한 모든 영양소를 배치의 개시에서 가하고, 질소 공급원, 인 공급원 또는 항생물질의 연속공급에 대한 필요를 제거하였다.
| 10L 규모 생물변환의 전개실험 공정 설명 | ||||
| 조작번호 | R5A | R5B | R5C | R5D |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5NNaOH로 6.5로 조정 | R5A와 동일하게조작 | 펩톤: 20효모 추출물: 20글루코스: 20OSA 3ml2.5NNaOH로 6.5로 조정 | R5A와 동일하게 조작 |
| 칸레논 충전 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 |
| 배지 공급 | 글루코스 공급 | 글루코스 공급 | 글루코스 공급 | 글루코스 공급 |
| 수확시간 | 119.5시간 | 119.5시간 | 106 | 119.5시간 |
| 생물변환 | 96% | 94.1% | 88.5% | 92.4% |
액 표면위로 성장시키는 고체상의 침지를 유지하기 위해, 성장배지(2L)를 각각의 발효조에 가하고 96시간이 지난 후에 배치를 개시하였다. 혼합 문제는 성장배지의 첨가 또는 하향 펌프화 임펠러(조작 R5B)의 사용중 어느 하나로 전부 극복하지 못하였지만 조작 결과는 공정의 실행성 및 이점을 입증하고 충분한 혼합은 종래의 시행에 따라 제공될 수 있었음을 나타내었다.
실시예 10
3가지의 생물변환 조작을 실시예 9에 기재된 방법으로 실질적으로 시행하였다. 본 실시예의 조작을 위한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 스케쥴, 수확시간 및 전환도를 표 27에 기재한다:
| 10L 규모 생물변환 실험 공정 설명 | |||
| 조작번호 | R6A | R6B | R6C |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5NNaOH로 6.5으로 조정 | R6A와 동일하게조작 | 펩톤: 20효모 추출물: 20글루코스: 20OSA 0.5ml2.5NNaOH로 6.5으로 조정 |
| 칸레논 충전 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 |
| 배지 공급 | 글루코스 공급; 71시간에서 1.3L 배지 및 0.8L 살균수 | 글루코스 공급; 95시간에서 0.5L 배지 및 0.5L 살균수 | 글루코스 공급;다른 첨가 없음 |
| 수확시간 | 120시간 | 120시간 | 120시간 |
| 생물변환 | 95% | 96% | 90% |
| 질량 평형 | 59% | 54% | 80% |
성장배지(1.3L) 및 살균수(0.8L)를 조작 R6A에서 71시간이 지난 후에 가하고 액체 배양액의 표면위에서 성장시킨 균사 케이크를 침지시켰다. 동일한 목적을 위해, 성장배지(0.5L) 및 살균수(0.5L)를 조작 R6B에서 95시간이 지난 후에 가하였다. 재료 밸런스 데이터는 액체표면위에서 증강된 케이크를 최소화할 때 더 양호한 질량 밸런스가 측정될 수 있었음을 나타내었다.
실시예 11
형질전환 발효조내의 성장배지 및 칸레논의 살균과 칸레논의 예비살균을 비교하여 발효 조작을 하였다. 조작 R7A에서, 공정을 조작 R2C, R2D, R3A, R3B, R3D, R4A 및 R4D와 비교할 수 있는 조건하에서 도 2에 도시된 대로 시행하였다. 조작 R7B를 실시예 4, 9 및 10, 및 조작 R4B와 비교할 수 있는 조건하에서 도 3에 도시된 대로 하였다. 본 실시예의 조작을 위한 형질전환 성장배지, 칸레논 첨가 스케쥴, 수확시간 및 전환도를 표 28에 기재한다:
| 10L 규모 생물변환 실험 공정 설명 | ||
| 조작번호 | R7A | R7B |
| 배지(g/L)콘스팁액효모추출물NH4H2PO4글루코스OSApH | 30153150.5ml2.5NNaOH로 6.5로 조정 | R7A와 동일하게조작 |
| 칸레논 충전 | 160g 칸레논을 발효조 밖에서 살균하고 배합함 | 160g 칸레논을 발효조내에서 살균함 |
| 배지 충전 | 글루코스 공급; 칸레논을 1.6L 성장배지로 가함 | 글루코스 공급;다른 첨가 없음 |
| 수확시간 | 118.5시간 | 118.5시간 |
| 생물변환 | 93% | 89% |
조작 R7B로부터 취한 최종 시료를 기준으로 한 질량 밸런스는 89.5%였고, 현저한 기질 소실 또는 생물변환 감소는 나타나지 않았다. 혼합은 두 조작에 적당하게 결정하였다.
잔류 글루코스 농도는 초기 80시간동안 원하는 5-10 gpl 제어범위이상이었다. 조작 성능은 두 발효조의 헤드공간에 누적된 라이트 케이크에 의해 명백하게 영향을 받지 않았다.
실시예 12
추출 효율은 표 29에 요약된 일련의 1L 추출 조작으로 측정하였다. 이들 각각의 조작에서, 스테로이드는 에틸아세테이트(1 L/L 발효부피)를 사용하는 균사로부터 추출하였다. 두 번의 연속 추출을 각 조작에서 수행하였다. RP-HPLC에 기초하여 약 80%의 전체 스테로이드를 제1추출에서 회수하고; 회수는 제2추출에 의해 95%로 증가하였다. 제3추출로 추가 3%의 스테로이드를 회수하였다. 잔류 2%는 상청액의 수상에서 소실한다. 추출물을 진공하에서 건조시키지만 어떤 추가의 용매로 세척하지 않았다. 경제적인 공정으로 판정한다면 용매를 체이싱하여 초기 추출로부터의 회수율을 개선할 것이다.
| 1리터 추출에서 11α-히드록시칸레논의 회수(총 %) | ||||
| 조작번호 | 제1추출 | 제2추출 | 제3추출 | 상청액 |
| R5A | 79% | 16% | 2% | 2% |
| R5A | 84% | 12% | 2% | 2% |
| R4A | 72% | 20% | 4% | 4% |
| R4A | 79% | 14% | 2% | 5% |
| R4B | 76% | 19% | 4% | 1% |
| R4B | 79% | 16% | 3% | 2% |
| R4B | 82% | 15% | 2% | 1% |
| 평균 | 79% | 16% | 3% | 2% |
메틸이소부틸케톤(MIBK) 및 톨루엔을 1L 배양액 규모에서 11α-히드록시칸레논용 추출/결정화 용매로서 평가하였다. 상기한 추출 프로토콜을 사용하여 두 MIBK 및 톨루엔을 두 추출 효율 및 결정화 성능에 있어서 에틸아세테이트와 비교하였다.
실시예 13
도 2 및 도 3의 공정중 평가의 일부로서, 이들 각각의 공정에서 발효순환의 출발시에 제공된 칸레논 기질상에서 입경 연구를 수행하였다. 상기한 바와같이, 도 1의 공정에 공급한 칸레논을 미분화하고 나서 발효조에 넣었다. 이 공정에서 칸레논은 살균하지 않고, 원하지 않는 미생물 성장은 항생물질을 첨가하여 제어한다. 도 2 및 도 3의 방법에서 반응시키기 전에 칸레논을 살균한다. 도 2의 방법에서, 이것은 칸레논을 발효조에 넣기 전에 블렌더에서 수행한다. 도 3의 방법에서, 성장배지중의 칸레논의 현탁액을 배치의 개시에서 발효조에서 살균한다. 상기한 바와같이, 살균은 칸레논 입자의 응집을 일으키는 경향이 있다. 수성 성장배지중의 칸레논의 제한된 용해성 때문에 공정의 생산성은 고체상으로부터 질량 이동에 의존하고, 따라서 고체 입자 기질에 의해 제공되는 계면적에 의존한다고 기대할 수 있고 입경 분포에 의존한다. 이들은 초기에 도 2 및 도 3의 방법에 대한 방해물로서 사용된다고 생각된다.
그러나, 도 2의 블렌더 및 도 3의 발효탱크에서의 교반은 도 2의 배치 이동에 사용된 시어펌프의 작용과 함께 도 1의 공정에 공급한 비살균이고 미분화한 칸레논에 합리적으로 근접한 입경 범위로 응집물을 감소시킨다는 것을 알았다. 이것은 3가지 공정 각각에서 반응순환의 윤곽에 이용가능한 칸레논에 대한 입경분포로 예시된다. 표 30 및 도 4 및 도 5를 참조한다.
| 3가지 상이한 칸레논 시료의 입자 분포 | ||||
| 시료 | 45-125μ | <180μ | 평균크기 μ | 조작 #: %생물변환 |
| 칸레논 충전 | 75% | 95% | -- | R3C:93.1% (120시간)R4C:96.3% (120시간) |
| 배합 시료 | 31.2% | 77.2% | 139.5 | R3A:94.6% (120시간)R3B:95.2% (120시간) |
| 살균 d 시료 | 24.7% | 65.1% | 157.4 | R4B:97.6% (120시간)R5B:93.8% (120시간) |
표 30의 데이터로부터, 비살균 기질과 동일한 크기정도로 살균 칸레논의 평균 입경을 감소시키는데 교반기 및 시어펌프가 유효하지만, 현저한 크기 차이가 비살균 기질쪽에 있다는 것을 주목해야 할 것이다. 이 차이에도 불구하고, 반응 성능 데이터는 예비살균 공정이 적어도 도 1의 공정에서와 같이 생산적이라는 것을 나타내었다. 추가 이점은 입경을 더 감소시키고 제어하기 위한 어떤 단계, 예를들면 살균 칸레논의 습식 분쇄 및/또는 살균보다 저온살균에 의해 도 2의 공정에서 실현될 수 있다.
실시예 14
종균 배양물을 실시예 5에 기재된 방법으로 제조하였다. 20시간에서, 접종 발효조내의 균사는 40% PMV의 펄프모양이었다. 그 pH는 5.4였고 14.8 gpl 글루코스는 사용하지 않은 채 잔류하였다.
형질전환 성장배지(35L)를 표 20에 나타낸 조성으로 제조하였다. 공급배지의 제조에 있어서, 글루코스 및 효모 추출물을 별도로 살균하고 30중량% 글루코스 및 10중량% 효모 추출물의 초기 농도에서 단일 공급하여 혼합하였다. 공급 pH를 5.7로 조정하였다.
이 배지를 사용하여, (표 20), 두 생물변환 조작을 칸레논의 11α-히드록시칸레논으로의 전환을 위해 하였다. 각 조작은 한 개의 러쉬톤(Rushton) 터빈 임펠러 및 두 개의 라이트닝(Lightnin)의 A315 임펠러로 이루어지는 교반기를 갖춘 60L 발효조에서 시행하였다.
성장배지의 발효조로의 초기 충전은 35L였다. 미분화 및 비살균 칸레논을 0.5%의 초기농도로 가하였다. 발효조내의 배지를 2.5%의 초기 접종비로 실시예 5에 기재된 방법으로 제조한 종균 배양물로 접종하였다. 발효는 적어도 20부피%의 용존산소량 수준을 유지하는데 충분한 온도 28℃, 교반속도 200 내지 500rpm, 통기속도 0.5vvm 및 배압에서 시행하였다. 생산동안 전개된 형질전환 배양물은 미세한 타원형 펠릿(약 1-2mm)의 형태였다. 칸레논 및 보충 영양소를 실시예 1에 기재된 방법으로 통상 발효조에 연속공급하였다. 영양소를 발효조내의 배양액의 리터당 3.4g 글루코스 및 0.6g 효모 추출물의 비율로 매 4시간마다 첨가하였다.
표 31에 기재한 것은 본 실시예의 각각의 조작동안 언급한 간격에서 우세한 통기속도, 교반속도, 용존산소량, PMV 및 pH 뿐만 아니라 배치동안의 글루코스 첨가이다. 표 32는 칸레논 전환 프로파일을 나타낸다. 조작 R11A는 46시간이 지난 후에 종료시켰고; 조작 R11B는 96시간동안 계속하였다. 후자의 조작에서 93% 전환율은 81시간에서 이루어졌고; 한번 이상의 공급첨가는 84시간에서 하였고; 다음에 공급을 종료시켰다. 점도에서의 현저한 변화는 공급시간의 중지와 조작의 종료 사이에서 발생한다는 것을 주목한다.
| 발효 R11A | |||||||
| 시간 | 공기 (lpm) | rpm | %DO | 배압 | PMV(%) | pH | Gluc cc (g/l) |
| 0.1 | 20 | 200 | 93 | 0 | 2 | 6.17 | 5.8 |
| 7 | 20 | 200 | 85.1 | 0 | 5 | 6.03 | 5.5 |
| 12.4 | 20 | 300 | 50.2 | 0 | 5.43 | ||
| 21.8 | 20 | 400 | 25.5 | 0 | 38 | 6.98 | 0 |
| 29 | 20 | 500 | 17 | 0 | 35 | 5.22 | |
| 30.2 | 20 | 500 | 18.8 | 10 | 5.01 | ||
| 31 | 20 | 500 | 79 | 10 | 4.81 | 1 | |
| 35.7 | 20 | 500 | 100 | 10 | 45 | 5.57 | 0 |
| 46.2 | 20 | 500 | 23 | 6 | 45 | 5.8 | 1 |
| 전체 글루코스: 27.5g/l전체 효모 추출물: 8.75g/l | |||||||
| 발효 R11B | |||||||
| 시간 | 공기(lpm) | rpm | %DO | 배압 | PMV(%) | pH | Gluc cc (g/l) |
| 0.1 | 20 | 200 | 92.9 | 0 | 2 | 5.98 | 5.4 |
| 7 | 20 | 200 | 82.3 | 0 | 5 | 5.9 | 5 |
| 12.4 | 20 | 300 | 49.5 | 0 | 5.48 | ||
| 21.8 | 20 | 400 | 18 | 0 | 40 | 7.12 | 0 |
| 29 | 20 | 500 | 36.8 | 0 | 35 | 5.1 | 3 |
| 35.7 | 20 | 500 | 94.5 | 10 | 4.74 | 0 | |
| 46.2 | 20 | 500 | 14.5 | 6 | 45 | 5.32 | 2 |
| 55 | 20 | 500 | 16.7 | 10 | 5.31 | 0.5 | |
| 58.6 | 20 | 500 | 19.4 | 15 | 5.32 | 1 | |
| 61.9 | 20 | 500 | 13 | 15 | 40 | 5.36 | 2 |
| 71.7 | 20 | 500 | 13 | 15 | 42 | 5.37 | 0 |
| 81.1 | 20 | 500 | 22.9 | 15 | 5.42 | 2.5 | |
| 85.6 | 20 | 500 | 22 | 15 | 45 | 5.48 | 1 |
| 97.5 | 20 | 500 | 108 | 15 | 45 | 6.47 | 0 |
| 117.7 | 20 | 500 | 7.38 | 0 | |||
| 전체 글루코스: 63g/l전체 효모 추출물: 14.5g/l | |||||||
| 발효 R11A: 칸레논 전환 | ||||||||
| 농도(g/l) | 전환율 | Calc OH-칸 | 전환 속도(g/l/h) | |||||
| 시료 | 시간 | OH-칸 | 칸레논 | 전체 | (%) | (g/l) | 이론치 | 측정치 |
| R11A-0 | 0.10 | 0.00 | 5.41 | 5.41 | ||||
| R11A-7 | 7.00 | 0.18 | 4.89 | 5.07 | 3.58 | 0.18 | 0.03 | 0.03 |
| R11A-22 | 21.80 | 2.02 | 2.12 | 4.14 | 48.75 | 2.44 | 0.15 | 0.12 |
| R11A-29 | 29.00 | 3.67 | 4.14 | 7.81 | 47.03 | 4.48 | 0.28 | 0.23 |
| R11A-36 | 35.70 | 6.68 | 1.44 | 8.12 | 82.27 | 7.74 | 0.49 | 0.45 |
| R11A-46 | 46.20 | 7.09 | 0.41 | 7.51 | 94.48 | 8.59 | 0.08 | 0.04 |
| 발효 R11B: 칸레논 전환 | ||||||||
| 농도(g/l) | 전환율 | Calc OH-칸 | 전환 속도(g/l/h) | |||||
| 시료 | 시간 | OH-칸 | 칸레논 | 전체 | (%) | (g/l) | 이론치 | 측정치 |
| R11B-0 | 0.1 | 0.00 | 5.60 | 5.60 | ||||
| R11B-7 | 7.0 | 0.20 | 4.98 | 5.18 | 3.78 | 0.19 | 0.03 | 0.03 |
| R11B-22 | 21.8 | 2.51 | 2.46 | 4.97 | 50.49 | 2.52 | 0.16 | 0.16 |
| R11B-29 | 29.0 | 4.48 | 16.99 | 21.47 | 20.87 | 4.69 | 0.30 | 0.27 |
| R11B-36 | 35.7 | 8.18 | 10.35 | 18.53 | 44.16 | 9.70 | 0.75 | 0.55 |
| R11B-55 | 55.0 | 17.03 | 13.20 | 30.23 | 56.33 | 19.50 | 0.32 | 0.36 |
| R11B-59 | 58.6 | 20.80 | 11.73 | 32.53 | 63.95 | 21.97 | 0.69 | 1.05 |
| R11B-62 | 61.9 | 22.19 | 8.62 | 30.81 | 72.02 | 24.50 | 0.77 | 0.42 |
| R11B-72 | 71.7 | 26.62 | 3.61 | 30.23 | 88.06 | 29.46 | 0.51 | 0.45 |
| R11B-81 | 81.1 | 27.13 | 2.05 | 29.18 | 92.97 | 30.32 | 0.09 | 0.05 |
| R11B-86 | 85.6 | 26.87 | 2.02 | 28.88 | 93.02 | 30.11 | -0.04 | -0.06 |
| R11B-97 | 97.5 | 23.95 | 1.71 | 25.66 | 93.34 | 30.22 | 0.01 | -0.25 |
| R11B-118 | 117.7 | 24.10 | 1.68 | 25.79 | 93.47 | 30.26 | 0.00 | 0.01 |
실시예 15
통상 상기한 방법에 따라 칸레논의 11α-칸레논으로의 생물변환에 있어서 유효성에 대해 다양한 배양물을 시험하였다.
Aspergillus niger ATCC 11394, Rhizopus arrhizus ATCC 11145 및 Rhizopus stolonifer ATCC 6227b중 각각의 작업 세포 뱅크를 실시예 5에 기재된 방법으로 제조하였다. 표 18에 기재된 조성물을 갖는 성장배지(50mL)를 작업 세포 뱅크로부터 포자 현탁액(1ml)으로 접종하고 배양기에 넣었다. 종균 배양물을 약 20시간동안 26℃에서 발효에 의해 배양기에서 제조하였다. 배양기를 200rpm의 속도에서 교반하였다.
각각의 미생물중 종균 배양물 분액(2ml)을 표 18의 성장배지(30ml)를 함유하는 형질전환 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 각각의 배양물을 2개의 플라스크, 전체 6개를 접종하는데 사용하였다. 칸레논(200mg)을 36℃에서 메탄올(4ml)에 용해하고 이 용액의 분액 0.5ml를 각 플라스크에 넣었다. 생물변환을 통상 매일 50중량% 글루코스 용액(1ml)을 첨가하면서 실시예 5에 기재된 조건하에서 시행하였다. 처음 72시간이 지난 후에 관찰하여 각각의 형질전환 발효 플라스크내의 균사가 전개되었음을 알았다:
ATCC 11394 - 양호한 성장
ATCC 11145 - 처음 48시간내에 양호한 성장, 그러나 볼로 응집된 균사; 최종 24시간내에 성장이 보이지 않음;
ATCC 6227b - 양호한 성장; 균사 덩어리가 응집된 볼을 형성.
배양액 시료를 취하여 생물변환 정도를 분석하였다. 3일 후에, ATCC 11394를 사용하는 발효는 11α-히드록시칸레논의 전환율이 80 내지 90%; ATCC 11145는 전환율이 50%; ATCC 6227b는 전환율이 80-90%이었다.
실시예 16
실질적으로 실시예 15에 기재된 방법을 사용하여, 칸레논의 11α-히드록시칸레논으로의 전환에 있어서 유효성에 대해 추가의 미생물을 시험하였다. 유기체를 시험하고 시험 결과는 표 33에 나타낸다.
| 칸레논의 11α-히드록시칸레논으로의 생물변환을 위해 시험한 배양물 | |||||
| 배양물 | ATTC# | 배지1 | 결과 | 대략적인 전환율 | |
| Rhizopus oryzae | 1145 | CSL | + | 50% | - |
| Rhizopus stolonifer | 6227b | CSL | + | 80-90% | - |
| Aspergillus nidulans | 11267 | CSL | + | 50% | 80% |
| Aspergillus niger | 11394 | CSL | + | 80-90% | - |
| Aspergillus ochraceus | NRRL 405 | CSL | + | 90% | |
| Aspergillus ochraceus | 18500 | CSL | + | 90% | |
| Bacillus subtilis | 31028 | P&CSL | - | 0% | 0% |
| Bacillus subtilis | 31028 | CSL | - | 0% | 0% |
| Bacillus sp. | 31029 | P&CSL | - | 0% | 0% |
| Bacillus sp. | 31029 | CSL | - | 0% | * |
| Bacillus megaterium | 14945 | P&CSL | + | 5% | 80%* |
| Bacillus megaterium | 14945 | CSL | + | 5% | 10%* |
| Trichothecium roseum | 12519 | CSL | + | 80%* | 90%* |
| Trichothecium roseum | 8685 | CSL | + | 80%* | 90%* |
| Streptomyces fradiae | 10745 | CSL | + | <5% | <10% |
| Streptomyces fradiae | 10745 | TSB | - | * | * |
| Streptomyces lavendulae | 13664 | CSL | - | 0% | * |
| Streptomyces lavendulae | 13664 | TSB | - | 0% | 0% |
| Nocardiodes simplex | 6946 | BP | - | 0% | 0% |
| Nocardiodes simplex | 13260 | BP | - | * | * |
| Pseudomonas sp. | 14696 | BP | - | * | * |
| Pseudomonas sp. | 14696 | CSL | + | <5% | <10% |
| Pseudomonas sp. | 14696 | TSB | - | 0% | * |
| Pseudomonas sp. | 13261 | BP | + | * | <10% |
| Pseudomonas cruciviae | 13262 | BP | # | <10% | |
| Pseudomonas putida* 다른 미확인 생성물 형성 | 15175 | BP | - | 0% | 0% |
| 배지1: CSL-콘스팁액; TSB-트립틱 대두 배양액; P&CSL-펩톤 및 콘스팁액; BP-비프 추출물 및 펩톤. | |||||
실시예 17
칸레논의 9α-히드록시칸레논으로의 전환에 있어서의 유효성에 대해 다양한 미생물을 시험하였다. 본 실시예의 조작을 위한 발효배지를 표 34에 기재된 대로 제조하였다.
| 대두 밀: | |
| 덱스트로스 | 20g |
| 대두 밀 | 5g |
| NaCl | 5g |
| 효모 추출물 | 5g |
| KH2PO4 | 5g |
| 물 | 1L까지 |
| pH | 7.0 |
| 펩톤/효모 추출물/글루코스: | |
| 글루코스 | 40g |
| 박토펩톤 | 10g |
| 효모 추출물 | 5g |
| 물 | 1L까지 |
| 뮐러-힌톤: | |
| 비프 배양액 | 300g |
| 카사미노산 | 17.5g |
| 전분 | 1.5g |
| 물 | 1L까지 |
균류를 대두 밀 배지 및 펩톤 효모추출물 글루코스에서 성장시키고; 방사선균류 및 유박테리아를 대두밀(플러스 생물형질전환을 위한 0.9중량% Na 포르메이트) 및 뮐러-힌톤 배양액에서 성장시켰다.
출발 배양물을 냉동시킨 포자 저장(250ml 삼각 플라스크내의 20ml 대두 밀)으로 접종하였다. 플라스크를 밀크 필터 및 생물체 차폐장치로 피복하였다. 출발 배양물(24 또는 48시간 후)을 10% 내지 15% 교차부피(crossing volume: 접종되는 배지의 부피에 대한 접종부피)로 물질대사 배양물(250ml 삼각 플라스크내의 20ml)을 접종하는데 사용하고 후자를 형질전환반응을 위한 스테로이드 기질을 첨가하기 전에 24 내지 48시간동안 배양하였다.
칸레논을 메탄올(20mg/ml)에 용해/현탁하고, 필터를 살균하고 0.1mg/ml의 최종 농도로 배양물에 가하였다. 모든 형질전환 발효 플라스크를 26℃의 조절된 실온 및 60% 습도에서 250rpm(2″드로우)에서 진탕시켰다.
생물형질전환은 기질을 첨가하고 나서 5 내지 48시간에서, 또는 24시간에서 수확하였다. 수확은 에틸아세테이트(23ml) 또는 염화메틸렌을 발효 플라스크에 가하면서 개시하였다. 다음에 플라스크를 2분동안 진탕시키고 각 플라스크의 내용물을 50ml 원심분리관에 부었다. 상들을 분리시키기 위해, 관을 실온 유닛에서 20분간 4000rpm에서 원심분리하였다. 각 관으로부터 유기층을 20ml 붕규산유리 바이알로 운반하고 속도 백(speed vac: 작은 샘플들로부터 용매를 제거하기 위해 사용되는 장치, 이 장치는 전형적으로 용매증발을 촉진시키기 위해 원심분리하면서 샘플에 진공을 가한다)에서 증발시켰다. 바이알을 캐핑하고 -20℃에서 보관하였다.
구조 측정용 물질을 얻기 위해, 생물형질전환을 발효 진탕플라스크수를 25로 증가시킴으로써 500ml로 규모증가시켰다. 수확시간(기질 첨가후 24 또는 48시간)에서 에틸아세테이트를 각각의 플라스크에 가하고 플라스크를 캐핑하고 20분간 진탕기상에 되돌려 놓았다. 다음에 플라스크의 내용물을 폴리프로필렌 병에 붓고 원심분리하여 상들을 분리시키거나 또는 분별 깔때기에 붓고 중력으로 상들을 분리시켰다. 유기상을 건조시켜 반응 혼합물에 함유된 스테로이드의 미정제 추출물을 얻었다.
반응 생성물을 형광물질로 뒤를 댄 플레이트(254nm) 및 실리카겔(250μm)상의 박층 크로마토그래피로 먼저 분석하였다. 에틸아세테이트(500μL)를 반응 혼합물로부터 추출한 건조 에틸아세테이트를 함유하는 각각의 바이알에 가하였다. 추가의 분석을 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량분광분석법으로 시행하였다. 플레이트를 95:5 v/v 클로로포름/메탄올 배지에서 전개하였다.
추가의 분석을 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량분광분석법으로 시행하였다. Millennium 소프트웨어, 광다이오드 배열 검출기 및 오토샘플러를 갖춘 와터스 HPLC를 사용하였다. 역상 HPLC는 와터스 NovaPak C-18(4μm 입경) RadialPak 4mm카트리지를 사용하였다. 25분 선형 용매 구배는 물:아세토니트릴(75:25)에서 개시하여 물:아세토니트릴(25:75)에서 종료하는 칼럼으로 시작하였다. 이것은 100% 아세토니트릴로의 3분 구배 및 4분 평형 세척액으로 시행한 후에 칼럼을 초기조건에서 재생성하였다.
LC/MS를 위해, 암모늄아세테이트를 2nM의 농도로 두 아세토니트릴 및 수상에 가하였다. 크로마토그래피는 현저하지 않았다. 칼럼으로부터의 용출액은 22:1로 분할하였고 대부분의 물질은 PDA 검출기로 향하게 하였다. 물질중 잔류 4.5%는 Sciex API III 질량 분광분석기의 전기분무 이온화 챔버로 향하게 하였다. 질량분광분석법은 포지티브 방식(positive mode: 화학적 이온화 양이온 모드로서 더 충분히 기술되는 질량분광분석이다)로 수행되었다. HPLC상의 PDA 검출기로부터의 아날로그 데이터 라인은 단일파장 크로마토그램을 UV 및 MS 데이터의 공동분석을 위해 질량분광분석기로 이동하였다.
질량분광분석의 분획 패턴은 히드록실화 기질중에서 분류하는데 유용하다는 것을 입증하였다. 두 개의 기대되는 히드록실화 칸레논, 11α-히드록시- 및 9α-히드록시는 진단용으로 사용할 수 있는 일관된 방법으로 상이한 주파수에서 물을 소실한다. 또한, 9α-히드록시칸레논은 11α-히드록시칸레논보다 용이하게 암모늄 부가물을 형성하였다. 표 35에 기재된 것은 칸레논 발효를 위한 TLC, HPLC/UV 및 LC/MS 데이터의 요약이고 시험한 미생물이 칸레논의 9α-히드록시칸레논으로의 생물변환에 유효하다는 것을 나타내었다. 이들 중에서, 바람직한 미생물은 Corynespora cassiicola ATCC 16718이었다.
| 칸레논 발효를 위한 TLC, HPLC/UV, 및 LC/MS 데이터 요약 | |||
| 9αOH-칸레논 증거 | |||
| 배양물 | 9αQH-AD에서의 TLC 스팟 | 9αOH-칸레논 w/UV에서의 HPLC-피크 | MS: 357(M+H),339(-H2O) & 375(+NH4) |
| Absidia coerula ATCC 6647 | n | y | y/n |
| Absidia glauca ATCC 22752 | n | ||
| Actinomucor elegans ATCC 6476 | tr | y | tr |
| Asperqillus flavipes ATCC 1030 | tr | ||
| Asperqillus fumigatus ATCC 26934 | tr | y | n |
| Asperqillus nidulans ATCC 11267 | tr | y | y |
| Asperqillus niqer ATCC 16888 | n | y | y |
| Asperqillus niqer ATCC 26693 | n | y | n |
| Asperqillus ochraceus ATCC 18500 | n | y | n |
| Bacterium cyclo-oxydans (Searle) ATCC 12673 | n | tr | n |
| Beauveria bassiana ATCC 7159 | tr | y | y |
| Beauveria bassiana ATCC 13144 | y | y | y |
| Botryosphaeria obtusa IMI 038560 | y | tr | tr |
| Calonectria decora ATCC 14767 | n | tr | y |
| Chaetomium cochliodes ATCC 10195 | tr | tr | y/n |
| Comomonas testosteroni (Searle) ATCC 11996 | tr | tr | n |
| Corynespora cassiicoal ATCC 16718 | y | y | y |
| Cunninghamella blakesleana ATCC 8688a | y | y | y |
| Cunninghamella echinulata ATCC 3655 | y | y | y |
| Cunninghamella elegans ATCC 9245 | y | y | y |
| Curcularia clavata ATCC 22921 | n | y | y/n |
| Curvularia lunata ATCC 12071 | y | n | n |
| Cylindrocarpon radicicola (Searle) ATCC 11011 | tr | n | n |
| Epicoccum humucola ATCC 12722 | y | y | y |
| Epicoccum oryzae ATCC 12724 | tr | tr | tr |
| Fusarium oxysporum ATCC 7601 | tr | ||
| Fusarium oxysporum f.sp.cepae ATCC 11171 | n | ||
| Gibberella fujikuroi ATCC 14842 | tr | y | y |
| Gliocladium deliguescens ATCC 10097 | y | tr | tr |
| Gonqronella butieri ATCC 22822 | y | y UV? | y |
| Hypomyces chrysospermus Tul. IMI 109891 | y | y | y |
| Lipomyces lipofer ATCC 10792 | n | ||
| Melanospora ornata ATCC 26180 | tr | n | n |
| Mortierella isabellinay ATCC 42613 | y | y | n |
| Mucor grisco-cyanus ATCC 1207a | n | ||
| Mucor mucedo ATCC 4605 | tr | y | y |
| Mycobacterium fortuitumn ATCC 6842 | |||
| Myrothecium verrucaria ATCC 9095 | tr | tr | y |
| Nocardia aurentia (Searle) ATCC 12674 | n | tr | n |
| Nocardia cancicruria (Searle) | y | y | n |
| Nocardia corallina ATCC 19070 | n | ||
| Paecilomyces carneus ATCC 46579 | n | y | n |
| Penicillium chrysogenum ATCC 9480 | n | ||
| Penicillium patulum ATCC 24550 | y | y | y/n |
| Penicillium purpurogenum ATCC 46581 | tr | y | y |
| Pithomyces atro-olivaceus ATCC 6651 | tr | y | tr |
| Pithomyces cynodontis ATCC 26150 | n | tr | tr |
| Phycomyces blakesleeanus | y | y | y/n |
| Pycnosporium sp. ATCC 12231 | y | y | y/n |
| Rhizopogon sp. | |||
| Rhizopus arrhizus ATCC 11145 | tr | y | n |
| Rhizopus stolonifer ATCC 6227b | n | ||
| Rhodococcus equi ATCC 14887 | n | tr | n |
| Rhodococcus equi ATCC 21329 | tr | tr | n |
| Rhodococcus sp. | n | n | n |
| Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150 | n | tr | n |
| Saccharopolyspora erythaea ATCC 11635 | y | y | y |
| Sepedonium ampullosporum IMI 203033 | n | n | n |
| Sepedonium chrysospermum ATCC 13378 | n | ||
| Septomyxa affinis ATCC 6737 | n | y UV? | y/n |
| Stachylidium bicolor ATCC 12672 | y | y | y/n |
| Streptomyces californicus ATCC 15436 | n | ||
| Streptomyces cinereocrocatus ATCC 3443 | n | ||
| Streptomyces coelicolor ATCC 10147 | n | ||
| Streptomyces flocculus ATCC 25453 | |||
| Streptomyces fradiae ATCC 10745 | n | ||
| Streptomyces griseus subsp. griseus ATCC 13968 | n | ||
| Streptomyces griseus ATCC 11984 | n | ||
| Streptomyces hydrogenans ATCC 19631 | n | ||
| Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438 | y | y | y |
| Streptomyces lavendulae Panlab 105 | n | ||
| Streptomyces paucisporogenes ATCC 25489 | n | ||
| Streptomyces purpurascens ATCC 25489 | n | tr | tr |
| Streptomyces roseochromogenes ATCC 13400 | |||
| Streptomyces spectabilis ATCC 27465 | n | ||
| Stysanus microsporus ATCC 2833 | |||
| Syncephalastrum racemosum ATCC 18192 | n | ||
| Thamnidium elegans ATCC 18191 | |||
| Thamnostylum piriforme ATCC 8992 | y | tr | y |
| Thielavia terricolan ATCC 13807 | n | ||
| Trichoderma viride ATCC 26802 | n | ||
| Trichothecium roseum ATCC 12543 | tr | y | y/n |
| Verticillium theobromae ATCC 12474 | y | tr | tr |
실시예 18
통상 상기한 방법에 따라 안드로스텐디온의 11α-히드록시안드로스텐디온으로의 생물변환에 있어서의 유효성에 대해 다양한 배양물을 시험하였다.
Aspergillus ochraceus NRRL 405(ATCC 18500); Aspergillus niger ATCC 11394; Aspergillus nidulans ATCC 11267; Rhizopus oryzae ATCC 11145; Rhizopus stolonifer ATCC 6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 및 ATCC 8685중 각각의 작업 세포 뱅크를 본질적으로 실시예 4에 기재된 방법으로 제조하였다. 표 18에 기재된 조성물을 갖는 성장배지(50ml)를 작업 세포 뱅크로부터의 포자 현탁액(1ml)으로 접종하고 배양기안에 놓았다. 종균 배양물을 약 20시간동안 26℃에서 발효에 의해 배양기안에서 생산하였다. 배양기를 200rpm의 속도에서 교반하였다.
각각의 미생물중 종균 배양물의 분액(2ml)을 표 15의 성장배지(30ml)를 함유하는 형질전환 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 각각의 배양물을 2개의 플라스크, 전체 16개를 접종하는데 사용하였다. 안드로스텐디온(300mg)을 36℃에서 메탄올(6ml)에 용해하고, 이 용액의 0.5ml 분액을 각각의 플라스크에 넣었다. 생물변환을 48시간동안 실시예 6에 기재된 조건하에서 통상 시행하였다. 48시간 후에 배양액의 시료를 실시예 17에서와 같이 푸울화하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트를 증발로 농축하고 시료를 박층 크로마토그래피로 분석하여 11α-히드록시 안드로스텐디온 표준(Sigma Chemical Co., St. Louis)의 이동도와 유사한 크로마토그래피 이동도를 갖는 생성물이 존재하는지를 측정하였다. 결과는 표 36에 나타낸다. 포지티브 결과는 "+"로 나타낸다.
| 안드로스텐디온의 11α-히드록시-안드로스텐디온으로의 생물변환 | |||
| 배양물 | ATTC# | 배지 | TLC 결과 |
| Rhizopus oryzae | 11145 | CSL | + |
| Rhizopus stolonifer | 6227b | CSL | + |
| Aspergillus nidulans | 11267 | CSL | + |
| Aspergillus niger | 11394 | CSL | + |
| Aspergillus ochraceus | NRRL 405 | CSL | + |
| Aspergillus ochraceus | 18500 | CSL | + |
| Trichothecium roseum | 12519 | CSL | + |
| Trichothecium roseum | 8685 | CSL | + |
표 36의 데이터는 각각 나열된 배양물이 11α-히드록시안드로스텐디온 표준과 동일한 Rf 값을 갖는 안드로스텐디온으로부터 화합물을 제조할 수 있다는 것을 입증한다.
Aspergillus ochraceus NRRL 405(ATCC 18500)를 상기와 동일한 방법으로 재시험하고 배양 생성물을 용매로서 메탄올을 사용하는 통상의 상 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 단리하고 정제하였다. 분획을 박층 크로마토그래피로 분석하였다. TLC 플레이트는 Whatman K6F 실리카겔 60Å, 10×20크기, 250μ두께였다. 용매 시스템은 메탄올:클로로포름, 5:95, v/v였다. 결정화한 생성물 및 11α-히드록시안드로스텐디온 표준을 둘다 LC-MS 및 NMR 분광분석법으로 분석하였다. 두 화합물은 유사한 프로파일 및 분자량을 얻었다.
실시예 19
멕스레논의 11β-히드록시멕스레논으로의 전환에 있어서의 유효성에 대해 다양한 미생물을 시험하였다. 본 실시예를 위한 발효배지를 표 34에 기재된 대로 제조하였다.
발효조건 및 분석방법은 실시예 17에서와 동일하였다. TLC 플레이트 및 용매 시스템은 실시예 18에 기재된 대로였다. 크로마토그래피 분석을 위한 비는 다음과 같다: 11α-히드록시멕스레논 및 11α-히드록시칸레논은 크로마토그래피 이동도가 동일하였다. 11α-히드록시칸레논 및 9α-히드록시칸레논은 11α-히드록시안드로스텐디온 및 11β-히드록시안드로스텐디온과 동일한 이동도 패턴을 나타내었다. 따라서, 11β-히드록시멕스레논은 9α-히드록시칸레논과 동일한 이동도를 가져야 한다. 따라서, 성장배지로부터 추출한 화합물은 표준으로서 9α-히드록시칸레논에 대해 조작하였다. 결과는 표 36에 나타낸다.
| 멕스레논으로부터 11β-히드록시멕스레논형성에 대한 TLC 데이터 요약 | ||
| 미생물 | 배지1 | 스팟 특성2 |
| Absidia coerula ATCC 6647 | M, S | 강 |
| Aspergillus niger ATCC 16888 | S, P | 약(S)? (P) |
| Beauveria bassiana ATCC 7159 | P | 강 |
| Beauveria bassiana ATCC 13144 | S, P | ?, ? |
| Botryosphaeria obtusa IMI 038560 | 약 | |
| Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a echinulata ATCC 3655 elegans ATCC 9245 | S, PS, PS, P | 강강강 |
| Curvularia lunata ATCC 12017 | S | 강 |
| Gongronella butleri ATCC 22822 | S, P | 강 |
| Penicillium patulum ATCC 24550 | S, P | 강 |
| Penicillium purpurogenum ATCC 46581 | S, P | 강 |
| Pithomyces atro-olivaceus IFO 6651 | S, P | 약 |
| Rhodococcus equi ATCC 14887 | M | 약 |
| Saccharopolyspora erythaea ATCC 11635 | M, SF | 약 |
| Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438 | M, SF | 강 |
| Streptomyces purpurascens ATCC 25489 | M, SF | 약 |
| Thamnidium elegans ATCC 18191 | S, P | 약 |
| Thamnostylum piriforme ATCC 8992 | S, P | 약 |
| Trichothecium roseum ATCC 12543 | P, S | 약(P)? (S) |
| 1 M=뮐러-힌톤 P=PYG(펩톤/효모 추출물/글루코스) S=대두 밀 SF=대두 밀 플러스 포르메이트2 ?=기질이 없는 콘트롤과 문제가 되는 차이 | ||
이들 데이터는 이 표에 나열된 대부분의 유기체가 멕스레논으로부터 11β-히드록시멕스레논과 유사 또는 동일한 생성물을 제조하는 것을 제안한다.
실시예 20
반응식 1: 단계 1: 5'R(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'a,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H[시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카르보니트릴의 제조.
50갤론 유리라인 반응기에 DMF 61.2L(57.8kg) 다음에 11-히드록시칸레논 1 23.5kg을 교반하면서 넣었다. 이 혼합물에 염화리튬 7.1kg을 가하였다. 혼합물을 20분간 교반하고 아세톤 시아노히드린 16.9kg 다음에 트리에틸아민 5.1kg을 넣었다. 혼합물을 85℃로 가열하고 13-18시간동안 이 온도에서 유지시켰다. 반응후에 물 353L를 가한 다음에 중탄산나트륨 5.6kg을 가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 6.7% 하이포아염소산나트륨 용액 130kg을 서서히 퀀칭하면서 200갤론 유리라인 반응기로 운반하였다. 생성물을 여과하고 일부의 물 3×40L로 세척하여 생성물 엔아민 21.4kg을 얻었다.
실시예 21
반응식 1: 단계 2: 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카르보니트릴의 제조.
200갤론 유리라인 반응기에 엔아민 2 50kg, 0.8N 희석 염산 약 445L 및 메탄올 75L을 넣었다. 혼합물을 5시간동안 80℃로 가열하고, 2시간동안 0℃로 냉각시켰다. 고체 생성물을 여과하여 건조 생성물 디케톤 36.5kg을 얻었다.
실시예 22
반응식 1: 단계 3A: 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α-21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조
4구 5L 바닥 플라스크에 기계적 교반기, 질소입구관이 있는 등압 첨가 깔때기, 온도계 및 버블러가 있는 냉각기를 장착하였다. 버블러를 두 개의 2L 트랩에 타이곤 튜빙을 통해 연결하고, 첫 번째 것은 비었고, 두 번째 트랩에서의 물질(농 하이포아염소산나트륨 용액 1L)의 역-흡입을 방지하기 위해 반응용기에 넣었다. 디케톤 3(79.50g; [순도를 위해 보정하지 않은 중량, 85%])을 3L 메탄올이 들어 있는 플라스크에 가하였다. 25% 메탄올성 나트륨메톡시드 용액(64.83g)을 깔때기 위에 놓고 10분에 걸쳐 질소하에서 교반하면서 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 주황색 반응 혼합물을 20시간동안 가열환류하였다. 그 후에, 4N HCl 167mL를 첨가 깔때기를 통해 증류기에 적가하고(주의: 이때 HCN 증발) 반응 혼합물을 환류하였다. 반응 혼합물은 엷은 황금 오렌지색으로 색이 엷게 되었다. 다음에 냉각기를 테이크 오프 헤드로 교체하고 메탄올 1.5L을 증류로 제거하는 한편, 이와 동시에 물 1.5L를 증류속도에 따라 깔때기를 통해 가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 염화메틸렌 2.25L 분액으로 2회 추출하였다. 합한 추출물을 냉 NaCl 포화용액 750mL 분액, 1N NaOH 및 다시 포화 NaCl로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 하룻밤 황산나트륨상에서 건조시키고 여과하고 진공하에서 ∼250mL로 부피감소시켰다. 톨루엔(300mL)을 가하고 잔류 염화메틸렌을 감압하에서 스트리핑하고, 이 동안에 생성물이 백색고체로서 플라스크의 벽에 형성되기 시작하였다. 플라스크의 함량을 하룻밤 냉각시키고 고체를 여과로 제거하였다. 톨루엔 250mL으로 세척하고 에테르 250mL 분액으로 2회 세척하고 진공 깔때기상에서 건조시켜 백색 고체 58.49g을 얻었고 HPLC로 순도는 97.3%였다. 모액을 농축시, 77.1% 순도의 생성물 6.76g을 추가로 얻었다. 순도를 위해 조정한 전체 수율은 78%였다.
실시예 23
반응식 1: 단계 3B: 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 메틸 수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤으로의 전환.
트래핑 시스템이 버블러 아래에 설치된 것만 제외하고 5L의 4구 플라스크에 상기 예와 같이 장착하였다. 다량의 히드록시에스테르 138.70g을 플라스크에 가한 다음에 질소하에서 교반하면서 염화메틸렌 1425mL를 가하였다. 반응 혼합물을 염/얼음욕을 사용하여 -5℃로 냉각시켰다. 염화메탄술포닐(51.15g, 0.447mol)을 신속하게 가한 다음에 염화메틸렌 225mL중의 트리에틸아민(54.37g)을 서서히 적가하였다. ∼30분이 걸리는 첨가는 반응온도가 약 5℃가 되지 않도록 조정하였다. 첨가후에 교반을 1시간동안 계속하고, 반응 내용물을 12L 분별 깔때기로 운반하고, 여기에 염화메틸렌 2100mL를 가하였다. 용액을 각각 냉 1N HCl, 1N NaOH, 및 NaCl 포화수용액 700mL 분액으로 연속적으로 세척하였다. 수성 세척액을 합하고 염화메틸렌 3500mL으로 다시 추출하였다. 모든 유기 세척액을 9L 저그(jug)에 합하고, 여기에 중성 알루미나 500g, 활성도 등급 II 및 무수 황산나트륨 500g을 가하였다. 저그의 내용물을 30분간 충분히 혼합하고 여과하였다. 여액을 진공하에서 건조시켜 점착성의 황색기포를 얻었다. 이것을 염화메틸렌 350mL에 용해하고 에테르 1800mL를 교반하면서 적가하였다. 첨가속도는 에테르가 30분에 걸쳐 약 절반이 되도록 조정하였다. 약 750mL를 가한 후에, 생성물은 결정고체로서 분리되기 시작하였다. 잔류 에테르를 10분내에 가하였다. 고체를 여과로 제거하고 필터 케이크를 에테르 2L로 세척하고 하룻밤 50℃에서 진공오븐안에서 건조시켜 거의 백색 고체 144.61g(88%)을 얻었다, m.p. 149℃-150℃. 이 방법으로 제조한 물질은 전형적으로 HPLC(면적%)로 98-99% 순도이다. 한 조작에서, 얻은 물질은 융점이 153℃-153.5℃였고, HPLC 면적으로 측정한 순도는 99.5%였다.
실시예 24
반응식 1: 단계 3C: 방법 A: 메틸 수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
1L 4구 플라스크에 두 번째 예와 같이 장착하였다. 포름산(250mL) 및 무수 아세트산(62mL)을 질소하에서 교반하면서 플라스크에 가하였다. 포름산칼륨(6.17g)을 가하고 반응혼합물을 오일욕에서 16시간동안 40℃의 내부온도(이것은 후에 더 양호한 결과를 얻기 위해 반복함)로 가열하였다. 16시간 후에, 메실레이트 5를 가하고 내부 온도를 100℃로 증가시켰다. 가열 및 교반을 2시간동안 계속하고, 그 후에 용매를 회전증발기에서 진공하에서 제거하였다. 잔사를 15분간 빙수 500mL로 교반하고, 다음에 에틸아세테이트 500mL 분액으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고 냉 염화나트륨 포화용액 250mL 분액(2회), 1N 수산화나트륨 용액, 및 다시 포화 염화나트륨으로 연속적으로 세척하였다. 다음에 유기상을 황산나트륨상에서 건조시키고 여과하고 진공하에서 건조시켜 황백색의 기포를 얻었고, 스파튤러로 두드려서 유리로 분쇄하였다. 이렇게 형성된 분말 14.65g을 82.1% 6 7.4% 8 및 5.7% 9의 혼합물로 분석하였다(HPLC 면적 %).
실시예 25
반응식 1: 단계 3C: 방법 B: 메틸 수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 제조.
5L 4구 플라스크에 상기 예와같이 장착하고 아세트산 228.26g 및 아세트산나트륨 41.37g을 질소하에서 교반하면서 가하였다. 오일욕을 사용하여 혼합물은 100℃의 내부온도로 가열하였다. 메실레이트(123.65g)를 가하고 가열을 30분간 계속하였다. 이 시간의 종료시에, 가열을 중지하고 빙수 200mL를 가하였다. 온도를 40℃로 강하시키고 교반을 1시간동안 계속하고, 그 후에 반응혼합물을 5L 교반 플라스크내의 빙수 1.5L에 서서히 부었다. 생성물을 점착성 오일로서 분리하였다. 오일을 1L 에틸아세테이트에 용해하고 냉 염화나트륨 포화용액, 1N 수산화나트륨 및 다시 최종적으로 포화 염화나트륨을 각각 1L로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨상에서 건조시키고 여과하였다. 여액을 진공하에서 건조시켜 점착성 오일로 붕괴한 기포를 얻었다. 이것을 얼마동안 에테르로 분쇄하고 최종적으로 고체화하였다. 고체를 여과하고 보다 많은 에테르로 세척하여 황백색 고체 79.59g을 얻었다. 이것은 원하는 Δ9,11 엔에스테르 6 70.4%, Δ11,12 엔에스테르 8 12.3%, 7α,9-α-락톤 9 10.8% 및 미반응 5 5.7%로 구성되었다.
실시예 26
반응식 1: 단계 3D: 메틸 수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤의 합성.
4구 재킷 500mL 반응기에 기계적 교반기, 냉각기/버블러, 온도계 및 질소입구관이 있는 첨가 깔때기를 장착하였다. 반응기에 염화메틸렌 83mL중의 미정제 엔에스테르 8.32g를 질소하에서 교반하면서 넣었다. 여기에 인산칼륨이염기 4.02g, 다음에 트리클로로아세토니트릴 12mL를 가하였다. 외부 냉각수를 반응기 재킷에 통과시키고 반응 혼합물을 8℃로 냉각시켰다. 30% 과산화수소 36mL를 10분에 걸쳐 첨가 깔때기에 가하였다. 초기의 담황색 반응 혼합물이 첨가가 완료된 후에 거의 무색으로 변하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 첨가 및 교반을 계속하여(전체 23시간) 9±1℃에서 유지하였다. 염화메틸렌(150mL)을 반응 혼합물에 가하고 전체 내용물을 ∼250mL 빙수에 가하였다. 이것을 염화메틸렌 150mL 분액으로 3회 추출하였다. 합한 염화메틸렌 추출물은 냉 3% 아황산나트륨 용액 400mL으로 세척하여 잔류 퍼옥시드를 분해하였다. 이것을 냉 1N 수산화나트륨 330mL, 냉 1N 염산 400mL, 최종적으로 염수 400mL로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨상에서 건조시키고 여과하고 필터 케이크를 염화메틸렌 80mL로 세척하였다. 용매를 진공하에서 제거하여 담황색 고체로서 미정제 생성물 9.10g을 얻었다. 이것을 2-부타논 ∼25mL로부터 재결정하여 거의 백색 결정 5.52g을 얻었다. 아세톤(∼50mL)으로부터 최종적으로 재결정하여 긴 침상 결정으로서 3.16g을 얻었다, mp 241-243℃.
실시예 27
반응식 1: 단계 3: 옵션 1: 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카르보니트릴 내지 메틸 수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤.
디케톤(20g)을 깨끗하게 건조시킨 반응기에 넣은 다음에 MeOH 820ml 및 25% NaOMe/MeOH 용액 17.6ml를 가하였다. 반응 혼합물을 16-20시간동안 환류조건(∼67℃)으로 가열하였다. 생성물을 4N HCl 40mL로 퀀칭하였다. 용매를 증류로 대기압에서 제거하였다. 톨루엔 100mL를 가하고 잔류 메탄올을 톨루엔에 의한 공비증류로 제거하였다. 농축후에, 미정제 히드록시에스테르 4를 염화메틸렌 206mL에 용해하고 0℃로 냉각시켰다. 염화메탄술포닐(5mL)을 가한 다음에 트리에틸아민 10.8ml를 서서히 가하였다. 생성물을 45분간 교반하였다. 용매를 진공증류로 제거하여 미정제 메실레이트 5를 얻었다.
별도로 건조시킨 반응기에 포름산칼륨 5.93g, 포름산 240mL 및 다음에 무수 아세트산 118mL를 가하였다. 혼합물을 4시간동안 70℃로 가열하였다.
포름산 혼합물을 상기 제조한 농 메실레이트 용액 5에 가하였다. 혼합물을 2시간동안 95-105℃로 가열하였다. 생성 혼합물을 50℃로 냉각시키고 휘발성 성분을 50℃에서 진공증류로 제거하였다. 생성물을 에틸아세테이트 275mL와 물 275mL 사이에 분배하였다. 수층을 에틸아세테이트 137mL로 역추출하고, 냉 1N 수산화나트륨 용액 240ml 및 포화 NaCl 120ml로 세척하였다. 상 분리후에 유기층을 진공증류하에서 농축하여 미정제 엔에스테르를 얻었다.
생성물을 염화메틸렌 180mL에 용해하고 0 내지 15℃로 냉각시켰다. 인산수소이칼륨 8.68g을 가한 다음에 트리클로로아세토니트릴 2.9mL를 가하였다. 30% 과산화수소 용액 78mL를 3분에 걸쳐 혼합물에 가하였다. 반응 혼합물을 6-24시간동안 0-15℃에서 교반하였다. 반응 후에 2상 혼합물을 분리하였다. 유기층을 3% 아황산나트륨 용액 126mL, 0.5N 수산화나트륨 용액 126mL, 1N 염산 126mL 및 10% 염수 126mL로 세척하였다. 생성물을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 또는 셀리트를 통해 여과하고 용매 염화메틸렌을 대기압에서 증류로 제거하였다. 생성물을 메틸에틸케톤에서 2회 결정화하여 에플러레논 7.2g을 얻었다.
실시예 28
반응식 1: 단계 3: 옵션 2: 1'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20'-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카르보니트릴의 메틸 수소 9,11α-에폭시-17α-히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤으로 중간체 없이 전환.
4구 5L 둥근바닥 플라스크에 기계적 교반기, 질소입구관이 있는 첨가 깔때기, 온도계 및 하이포아염소산나트륨 스크러버에 부착된 버블러가 있는 냉각기를 장착하였다. 디케톤(83.20g)을 3.05L 메탄올이 들어 있는 플라스크에 가하였다. 첨가 깔때기에 메탄올중의 나트륨메톡시드의 25%(w:w) 용액 67.85g을 넣었다. 질소하에서 교반하면서,메톡시드를 15분에 걸쳐 플라스크에 적가하였다. 어두운 오렌지/황색 슬러리가 전개되었다. 반응 혼합물을 20시간동안 가열환류하고 4N 염산 175mL를 환류를 계속하면서 적가하였다. (주의, 이 조작동안 HCN 증발) 환류 냉각기를 테이크오프 헤드로 교체하고 메탄올 1.6L를 증류로 제거하는 한편 10% 염화나트륨 수용액 1.6L를 증류속도를 만족하는 속도에서 깔때기를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위온도로 냉각시키고 염화메틸렌 2.25L 분액으로 2회 추출하였다. 합한 추출물을 냉 1N 수산화나트륨 분액 및 염화나트륨 포화용액 750mL로 세척하였다. 유기층을 1기압에서 메탄올의 공비증류로 1L의 최종부피(전체중 0.5%를 분석을 위해 제거함)로 건조시켰다.
농 유기용액(히드록시에스테르)을 상기와 같이 장착된 통상의 반응 플라스크에 다시 가하였으나, HCN 트랩은 없었다. 플라스크를 0℃로 냉각시키고 염화메탄술포닐 30.7g을 질소하에서 교반하면서 가하였다. 첨가 깔때기에 트리에틸아민 32.65g을 넣고, 이것을 5℃에서 온도를 유지하면서 15분에 걸쳐 적가하였다. 교반을 2시간동안 계속하는 한편, 반응 혼합물을 주위온도로 가온하였다. 250g Dowex 50W×8-100 산성 이온교환수지로 이루어지는 칼럼을 제조하고 사용하기 전에 물 250mL, 메탄올 250mL 및 염화메틸렌 500mL로 세척하였다. 반응 혼합물을 이 칼럼에서 운전하고 수집하였다. 새로운 칼럼을 제조하고 상기 공정을 반복하였다. Dowex 1×8-200 염기성 이온교환수지로 이루어지는 제3의 250g 칼럼을 제조하고 상기한 산성 수지처리와 같이 전처리하였다. 반응 혼합물을 이 칼럼에서 운전하고 수집하였다. 염기성 수지의 제4 칼럼을 제조하고 반응 혼합물을 다시 칼럼에서 운전하고 수집하였다. 각 칼럼을 통과시킨 다음에 염화메틸렌 250mL으로 2회 칼럼을 세척하고 각각 통과하는데 ∼10분이 소요되었다. 용매 세척액을 반응 혼합물과 합하고 부피를 진공하에서 ∼500mL로 감소시키고 이중 2%를 qc를 위해 제거하였다. 잔사를 150mL의 최종부피(미정제 메실레이트 용액)로 더 감소시켰다.
통상의 5L 반응기에 포름산 960mL, 무수 아세트산 472mL 및 포름산칼륨 23.70g을 넣었다. 이 혼합물을 16시간동안 70℃로 질소하에서 교반하면서 가열하였다. 다음에 온도를 100℃로 증가시키고 미정제 메실레이트 용액을 첨가 깔때기를 통해 30분에 걸쳐 가하였다. 온도를 85℃로 강하하고 염화메틸렌을 반응 혼합물에서 증류제거하였다. 모두 제거한 후에, 온도를 다시 100℃로 증가시키고 2.5시간동안 여기서 유지시켰다. 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고 포름산을 압력하에서 제거하여 최소의 교반부피에 이르렀다(∼150mL). 잔사를 주위온도로 냉각시키고 염화메틸렌 375mL를 가하였다. 희석시킨 잔사를 염화나트륨 포화용액, 1N 탄산나트륨, 다시 염화나트륨 용액의 냉 1L부분으로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘(150g)상에서 건조시키고 여과하여 어두운 적갈색 용액(미정제 엔에스테르 용액)을 얻었다.
4구 재킷 1L 반응기에 기계적 교반기, 냉각기/버블러, 온도계 및 질소입구관이 있는 첨가 깔때기를 장착하였다. 반응기에 염화메틸렌 600mL중의 미정제 엔에스테르 용액(60g으로 측정)을 질소하에서 교반하면서 가하였다. 여기에 인산칼륨이염기 24.0g 다음에 트리클로로아세토니트릴 87mL를 가하였다. 외부 냉각수를 반응기 재킷을 통과시키고 반응 혼합물을 10℃로 냉각시켰다. 첨가 깔때기를 통해 30% 과산화수소 147mL를 혼합물에 30분에 걸쳐 가하였다. 초기의 어두운 적갈색 반응 혼합물은 첨가가 완료된 후에 담황색으로 변하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 계속 첨가교반하여 10±1℃에서 유지시켰다(전체 23시간). 상들을 분리하고 수성 부분을 염화메틸렌 120mL 부분으로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 3% 아황산나트륨 210mL로 세척하고 가하였다. 이것을 2회 반복하고, 그 후에 유기부분 및 수성부분 둘다는 전분/요오다이드 시험지에 의해 퍼옥시드에 대해 네거티브였다. 유기상을 냉 1N 수산화나트륨, 1N 염산 210mL 분액으로 연속적으로 세척하고 최종적으로 염수로 2회 세척한다. 유기상을 ∼100mL 부피로 공비건조시키고, 새로운 용매(250mL)를 가하고 동일하게 100mL로 공비증류시키고 잔류 용매를 진공하에서 제거하여 점착성 황색 기포로서 미정제 생성물 57.05g을 얻었다. 부분(51.01g)을 44.3g의 일정한 중량으로 더 건조시키고 HPLC로 정량분석을 하였다. 27.1% EPX에서 평가하였다.
실시예 29
11α-히드록시안드로스텐디온(429.5g) 및 톨루엔 술폰산 수화물(7.1)을 질소하에서 반응 플라스크에 넣었다. 에탄올(2.58L)을 반응기에 넣고 얻은 용액을 5℃로 냉각시켰다. 트리에틸오르토포르메이트(334.5g)를 0℃ 내지 15℃에서 15분에 걸쳐 용액에 가하였다. 트리에틸오르토포르메이트 첨가를 완료한 후에 반응 혼합물을 40℃로 가온하고 이 온도에서 2시간동안 반응시키고, 그 후에 온도를 환류하로 증가시키고 반응을 추가의 3시간동안 환류하에서 계속하였다. 반응 혼합물을 진공하에서 냉각시키고 용매를 진공하에서 제거하여 3-에톡시안드로스타-3,5-디엔-17-온을 얻었다.
실시예 30
11α-히드록시칸레논으로부터 엔아민의 형성
시안화나트륨(1.72g)을 기계적 교반기가 장착된 25mL 3구 플라스크에 넣었다. 물(2.1mL)을 가하고 혼합물을 가열하면서 교반하여 고체를 용해하였다. 디메틸포름아미드(15mL)를 가한 다음에 11α-히드록시칸레논(5.0g)을 가하였다. 물(0.4mL) 및 황산(1.49g)의 혼합물을 혼합물에 가하였다. 혼합물을 2.5시간동안 85℃로 가열하고 이 때 HPLC분석은 생성물로의 전환이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 황산(0.83g)을 가하고 혼합물을 1시간반동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 60mL에 가하고 얼음욕에서 냉각시켰다. 플라스크를 DMF 3mL 및 물 5mL로 세척하였다. 슬러리를 40분간 교반하고 여과하였다. 필터 케이크를 물 40mL로 2회 세척하고 하룻밤 60℃에서 진공오븐안에서 건조시켜 11α-히드록시 엔아민, 즉 5'R(5'α),7'β-20'-아미노헥사데카히드로-11'β-히드록시-10'α,13'α-디메틸-3',5-디옥소스피로[푸란-2(3H),17'α(5'H)-[7,4]메테노[4H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'-카르보니트릴(4.9g)을 얻었다.
실시예 31
11α-히드록시칸레논의 디케톤으로의 전환
시안화나트륨(1.03g)을 기계적 교반기가 장착된 50mL 3구 플라스크에 넣었다. 물(1.26mL)을 가하고 플라스크를 약간 가열하여 고체를 용해하였다. 디메틸아세트아미드[또는 디메틸포름아미드](9mL)를 가한 다음에 11α-히드록시칸레논(3.0g)을 가하였다. 물(0.25mL) 및 황산(0.47mL)의 혼합물을 교반하면서 반응 플라스크에 가하였다. 혼합물을 2시간동안 95℃로 가열하였다. HPLC분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 황산(0.27mL)을 가하고 혼합물을 30분동안 교반하였다. 추가의 물(25mL) 및 황산(0.90mL)을 넣고 반응 혼합물을 16시간동안 교반하였다. 다음에 혼합물을 5-10℃로 얼음욕에서 냉각시켰다. 고체를 소결시킨 유리필터를 통해 여과하여 분리시킨 다음에 물(20mL)로 2회 세척하였다. 고체 디케톤, 즉 4'S(4'α),7'α-헥사데카히드로-11'α-히드록시-10'β,13'β-디메틸-3',5,20-트리옥소스피로[푸란-2(3H),17'β-[4,7]메타노[17H]시클로펜타[a]페난트렌]-5'β(2'H)-카르보니트릴을 진공오븐안에서 건조시켜 고체 3.0g을 얻었다.
실시예 32
메탄올(100mL)중의, 실시예 31에 기재된 방법으로 제조한 디케톤 5.0g의 현탁액을 가열환류하고 메탄올(5.8mL)중 칼륨메톡시드의 25% 용액을 1분에 걸쳐 가하였다. 혼합물을 균질하게 하였다. 15분 후에, 침전이 생겼다. 혼합물을 가열환류하고 다시 약 4시간후에 균질해졌다. 가열환류를 총 23.5시간동안 계속하고 4.0N HCl(10mL)을 가하였다. 메탄올중 시안화수소의 용액 60mL 전체를 증류로 제거하였다. 물(57mL)를 증류잔사에 15분에 걸쳐 가하였다. 용액 온도를 물 첨가동안 81.5°로 증가시키고 시안화수소/메탄올 용액의 추가 4mL를 증류제거하였다. 물 첨가를 완료한 후에, 혼합물은 탁해졌고 열 공급원을 제거하였다. 혼합물을 3.5시간동안 교반하고 생성물을 서서히 결정화하였다. 현탁액을 여과하고 수집한 고체를 물로 세척하고 깔때기상의 공기의 흐름으로 건조시키고 16시간동안 92°(26 in. Hg)에서 건조시켜 회백색 고체 2.98g을 얻었다. 고체는 히드록시에스테르, 즉 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 91.4중량%였다. 수율은 56.1%였다.
실시예 33
실시예 31에 기재된 방법으로 제조한 디케톤을 깨끗하게 건조시킨, 온도계, 딘스타크 트랩 및 기계적 교반기를 장착한 3구 반응 플라스크에 넣었다. 메탄올(24mL)을 실온(22℃)에서 반응기에 넣고 얻은 슬러리를 5분간 교반하였다. 메탄올(52.8mL)중 나트륨메톡시드의 용액 25중량%를 반응기에 넣고 혼합물을 실온에서 10분간 교반하고 이 동안에 반응 혼합물은 담갈색의 맑은 용액으로 변하였고 약간의 발열이 관찰되었다(2-3℃). 첨가속도를 제어하여 포트 온도가 30℃를 초과하는 것을 방지하였다. 다음에 혼합물을 환류조건(약 67℃)으로 가열하고 16시간동안 환류하에서 계속하였다. 다음에 시료를 취하고 전환을 HPLC로 분석하였다. 반응을 환류하에서 계속하여 잔류 케톤은 디케톤 충전의 3%이하였다. 환류동안 4N HCl(120mL)을 반응 포트에 넣고 HCN이 발생되고 이것을 스크러버로 퀀칭하였다.
반응 종료후에, 메탄올 용매 90-95%를 대기압하에서 반응 혼합물중에서 증류제거하였다. 증류동안의 헤드온도를 67-75℃로 변경하고 HCN을 함유한 증류액을 처리하기 전에 가성 표백제로 처리하였다. 메탄올을 제거한 후에 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체 생성물이 40-45℃ 범위에서 냉각시킨 혼합물로서 침전되기 시작하였다. 25℃에서 임의로 중탄산나트륨(1200mL) 5중량%를 함유하는 수용액을 냉각 슬러리에 넣고 얻은 혼합물을 약 1시간내에 0℃로 냉각시켰다. 중탄산나트륨 처리는 반응 혼합물로부터 잔류 미반응 디케톤을 제거하는데 효과적이다. 슬러리를 2시간동안 0℃에서 교반하여 침전 및 결정화를 완료하고 그 후에 고체 생성물을 여과로 회수하고 필터 케이크를 물(100mL)로 세척하였다. 생성물을 26″수은진공하에서 80-90℃에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 건조후 물 함량은 0.25중량% 미만이었다. 조정한 몰 수율은 약 77-80중량%였다.
실시예 34
실시예 31에 따라 제조한 디케톤(1당량)을 요오드화아연(1당량)의 존재하에서 메탄올 용매중 나트륨메톡시드(4.8당량)와 반응시켰다. 반응 생성물의 조작은 본문에 기재된 추출공정 또는 비추출 공정중 어느 하나에 따라 할 수 있고, 염화메틸렌 추출물, 염수와 가성 세척액 및 황산나트륨은 건조단계에서 제거된다. 또한 비추출 공정에서, 톨루엔을 중탄산나트륨 용액 5중량%로 교체하였다.
실시예 35
실시예 34에서 제조한 히드록시에스테르(1.97g)를 테트라히드로푸란(20mL)과 합하고 얻은 혼합물을 -70℃로 냉각시켰다. 염화술푸릴(0.8mL)을 가하고 혼합물을 30분간 교반하고, 그 후에 이미다졸(1.3g)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 추가 2시간동안 교반하였다. 다음에 혼합물을 염화메틸렌으로 희석하고 물로 추출하였다. 유기층을 농축하여 미정제 엔에스테르(1.97g)를 얻었다. 미정제 생성물중 소량의 시료를 HPLC로 분석하였다. 분석은 9,11-올레핀:11,12-올레핀:7,9-락톤의 비가 75.5:7.2:17.3임을 나타내었다. 상기한 바와 다르지 않으면 0℃에서 시행할 때, 반응으로 9,11-올레핀:11,12-올레핀:7,9-락톤 분포가 77.6:6.7:15.7인 생성물을 얻었다. 이 방법은 엔에스테르의 9,11-올레핀 구조의 도입을 위해 이탈기의 도입 및 그 제거를 한 단계로 합하고, 즉 반응은 염화술푸릴이 화학식 V의 히드록시 에스테르의 11α-히드록시기를 할라이드에 의해 치환하게 한 다음에 탈할로겐화수소로 Δ-9,11 구조가 되게 하는 것이었다. 따라서 엔에스테르의 형성은 무수 아세트산과 같은 건조제 또는 강산(포름산과 같은)을 사용하지 않고 시행한다. 또한 일산화탄소를 발생하는 다른 공정의 환류단계로 제거한다.
실시예 36
실시예 34에서 제조한 히드록시에스테르(20g), 염화메틸렌(400mL)을 깨끗하게 건조시킨, 기계적 교반기, 첨가 깔때기 및 열전쌍을 장착한 3구 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 얻은 혼합물을 주위 온도에서 교반하여 완전 용액을 얻었다. 용액을 얼음욕을 사용하여 5℃로 냉각시켰다. 염화메탄술포닐(5mL)을 히드록시에스테르 함유 CH2Cl2 용액에 가한 다음에 신속하게 트리에틸아민(10.8mL)을 서서히 적가하였다. 첨가속도를 조정하여 반응 온도는 5℃를 초과하지 않았다. 반응은 매우 발열이어서 냉각이 필요하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 약 5℃에서 교반하였다. 반응 종료시(HPLC 및 TLC 분석), 혼합물을 26 in Hg 진공하에서 약 0℃에서 농축하여 농 슬러리를 얻었다. 얻은 슬러리를 CH2Cl2(160mL)로 희석하고, 혼합물을 26 in Hg 진공하에서 약 0℃에서 농축하여 농축물을 얻었다. 농축물(화학식 IV의 메실레이트 생성물(R3=H, -A-A- 및 -B-B-는 둘다 -CH2-CH2-이다), 즉 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤 내지 메틸 수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤)의 순도는 82%(HPLC 면적%)임을 알았다. 이 물질은 분리하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
포름산칼륨(4.7g), 포름산(16mL) 및 무수 아세트산(8mL, 0.084mol)을 깨끗하게 건조시킨, 기계적 교반기, 냉각기, 열전쌍 및 가열맨틀을 장착한 반응기에 넣었다. 얻은 용액을 70℃로 가열하고 약 4-8시간동안 교반하였다. 무수 아세트산의 첨가는 발열이고 가스(CO)를 발생하므로 첨가 속도를 조정하여 온도 및 가스 발생(압력) 둘다를 제어하였다. 활성 제거제를 제조하기 위한 반응시간은 반응물(포름산 및 포름산칼륨은 각각 약 3-5% 물을 함유하였다)중에 존재하는 물 양에 의존하였다. 제거 반응은 존재하는 물 양에 민감하며; 만일 >0.1% 물(KF)이면, 7,9-락톤 불순물의 수준이 증가할 수 있다. 이 부산물은 최종 생성물로부터 제거하기가 어렵다. KF가 <0.1% 물을 나타내면, 활성 제거제를 이전 단계에서 제조한 메실레이트(0.070mol)의 농축물로 운반하였다. 얻은 용액을 95℃로 가열하고 휘발성 물질을 증류제거하고 딘 스타크 트랩에서 수집하였다. 휘발성 물질 증발을 중지할 때, 딘 스타크 트랩을 냉각기로 교체하고 반응 혼합물을 95℃에서 추가 1시간동안 가열하였다. 종료시(TLC 및 HPLC 분석; <0.1% 출발물질), 내용물을 50℃로 냉각시키고 진공증류(26 in Hg/50℃)를 개시하였다. 혼합물을 농 슬러리로 농축한 다음에 주위 온도로 냉각시켰다. 얻은 슬러리를 에틸아세테이트(137mL)로 희석하고 용액을 15분간 교반하고 물(137mL)로 희석하였다. 층들을 분리하고, 하부 수층을 에틸아세테이트(70mL)로 다시 추출하였다. 합한 에틸아세테이트 용액을 염수 용액(120mL)으로 1회, 빙냉 1N NaOH 용액(각각 120mL)으로 2회 세척하였다. 수성의 pH를 측정하고 사용한 세척액의 pH가 <8이면 유기층을 다시 세척하였다. 사용한 세척액의 pH가 >8로 관찰되면, 에틸아세테이트층을 염수 용액(120mL)으로 1회 세척하고 50℃ 수욕을 사용하여 회전증발에 의해 농축건조시켰다. 얻은 엔에스테르, 고체 생성물, 즉 메틸 수소 17α-히드록시-3-옥소프레그나-4,9(11)-디엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤을 92g(77% 몰수율)으로 칭량하였다.
실시예 37
실시예 34에서 제조한 히드록시에스테르(100g; 0.22mol)를 기계적 교반기, 첨가 깔때기 및 열전쌍을 장착한 2L 3구 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 순환 냉각욕을 자동온도조절하여 사용하였다. 염화메탄술포닐이 물에 민감하기 때문에 플라스크를 반응에 사용하기 전에 건조시켰다.
염화메틸렌(1L)을 플라스크에 넣고 교반하에서 히드록시에스테르를 여기에 용해하였다. 용액을 0℃로 냉각시키고 염화메탄술포닐(25mL; 0.32mol)을 첨가 깔때기를 통해 플라스크에 넣었다. 트리에틸아민(50mL; 0.59mol)을 첨가 깔때기를 통해 반응기에 넣고 깔때기를 추가의 염화메틸렌(34mL)으로 세정하였다. 트리에틸아민의 첨가는 매우 발열이었다. 첨가 시간은 교반 및 냉각하에서 약 10분이었다. 충전 혼합물을 0℃로 냉각시키고 추가의 45분동안 교반하에서 이 온도를 유지하고 그 동안 반응 플라스크의 헤드 공간을 질소로 채웠다. 다음에 반응 혼합물의 시료를 박층 크로마토그래피로 분석하고 반응 종료는 고성능 액체 크로마토그래피로 체크하였다. 혼합물을 추가 30분간 0℃에서 교반하고 다시 반응 종료를 체크하였다. 분석은 이 시점에서 실질적으로 반응이 종료되었음을 나타내었다; 용매 염화메틸렌을 26″수은진공하에서 0℃에서 스트리핑하였다. 증류액의 기체 크로마토그래피 분석은 염화메탄술포닐 및 트리에틸아민 둘다의 존재를 나타내었다. 염화메틸렌(800mL)을 반응기에 넣고 얻은 혼합물을 0-15℃ 범위의 온도에서 5분간 교반하였다. 다시 용매를 26″수은진공하에서 0-5℃에서 스트리핑하여, R3은 H이고, -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2-이고 R1은 메톡시카르보닐인 화학식 IV의 메실레이트를 얻었다. 생성물의 순도는 약 90-95면적%였다.
제거시약을 제조하기 위해, 포름산칼륨(23.5g; 0.28mol), 포름산(80mL) 및 무수 아세트산(40mL)을 별도의 건조시킨 반응기에서 혼합하였다. 포름산 및 무수 아세트산을 반응기에 넣고 온도를 무수 아세트산의 첨가동안 40℃ 이하로 유지하였다. 제거시약 혼합물을 70℃로 가열하여 반응 시스템으로부터 물을 배수하였다. 이 반응을 물 함량이 칼 피셔 분석으로 측정하여 0.3중량% 미만이 될 때까지 계속하였다. 다음에 제거시약 용액을 상기한 대로 제조한 미정제 메실레이트 농축용액이 들어 있는 반응기에 넣었다. 얻은 혼합물을 95℃의 최대 온도로 가열하고 더 이상 증류액이 생성되지 않을 때까지 휘발성 증류액을 수집하였다. 증류는 약 90℃에서 중지하였다. 증류를 완료한 후에, 반응 혼합물을 추가 2시간동안 95℃에서 교반하고 반응 종료를 박층 크로마토그래피로 체크하였다. 반응 종료시, 반응기를 50℃로 냉각시키고 포름산 및 용매를 26″ 수은진공하에서 50℃에서 반응 혼합물로부터 제거하였다. 농축물을 실온으로 냉각시키고 에틸아세테이트(688mL)를 도입하고 에틸아세테이트 및 농축물의 혼합물을 15분간 교반하였다. 이 시점에서, 12% 염수 용액(688mL)을 도입하여 유기상으로부터 수용성 불순물을 제거하였다. 다음에 상들을 20분동안 방치시켰다. 수층을 추가량의 에틸아세테이트(350mL)가 채워져 있는 다른 용기로 운반하였다. 수층의 이 역추출은 30분동안 시행하고 그 후에 상들을 방치시키고 에틸아세테이트층을 합하였다. 합한 에틸아세테이트층에 염화나트륨 포화용액(600mL)을 넣고 교반을 30분동안 시행하였다. `유기상을 두 번째로 사용한 세척액으로부터 분리하였다. 유기상을 다음에 30분동안 교반하에서 1N 수산화나트륨(600mL)로 세척하였다. 상들을 30분동안 방치시켜 수층을 제거하였다. 수층의 pH를 체크하고 >7임을 알았다. 추가의 세척을 15분간 포화 염화나트륨(600mL)으로 시행하였다. 최종적으로 유기상을 50℃에서 26″수은진공하에서 농축하고 생성물을 여과로 회수하였다. 최종 생성물은 건조하였을 때 거품이 이는 갈색 고체였다. 24시간동안 감압하에서 45℃에서 더 건조시켜 엔에스테르 생성물 95.4g을 얻었고 이것은 68.8%로 평가하였다. 몰 수율은 출발 히드록시에스테르 및 최종 엔에스테르 둘다에 대해 보정한 74.4%였다.
실시예 38
복합 세척단계는 반응용액을 이온교환수지로 처리함으로써 생략하는 것만 제외하고 실시예 37의 방법을 반복하였다. 염기성 알루미나 또는 염기성 실리카. 염기성 실리카로 처리하는 조건은 표 38에 나타낸다. 이들 각각의 처리는 실시예 44의 복합 세척을 하지 않고 불순물의 제거에 유효하다는 것을 알았다.
| 인자 | 셋 포인트 | 실험 목적 | 주요 결과 |
| 염기성 알루미나 | 2g/125g 생성물 | 반응 혼합물을 염기성 알루미나로 처리하여 Et3N.HCl염을 제거하고 1N NaOH 및 1N HCl 세척액을 제거함 | 수율 93% |
| 염기성 실리카 | 2g/125g 생성물 | 반응 혼합물을 보다 저가인 염기성 실리카로 처리하여 Et3N.HCl염을 제거하고 1N NaOH 및 1N HCl 세척액을 제거함 | 수율 95% |
실시예 39
아세트산칼륨(4g) 및 트리플루오로아세트산(42.5mL)을 100mL 반응기에서 혼합하였다. 무수 트리플루오로아세트산(9.5mL)을 첨가동안 30℃ 미만의 온도를 유지하도록 제어된 속도에서 혼합물에 가하였다. 다음에 용액을 30분동안 30℃에서 가열하여 화학식 IV의 메실레이트를 화학식 II의 엔에스테르로 전환시키는데 유용한 제거시약을 제공하였다.
미리 형성한 TFA/TFA 무수물 제거시약을 앞서 제조한 화학식 IV의 메실레이트 용액에 가하였다. 얻은 혼합물을 4½시간동안 40℃에서 가열하고, 전환도를 주기적으로 TLC 또는 HPLC로 체크하였다. 반응 종료시, 혼합물을 1구 플라스크에 넣고 실온(22℃)에서 감압하에서 농축건조시켰다. 에틸아세테이트(137mL)를 혼합물에 가하여 고체상 물질을 완전히 용해하고 그 후에 물/염수 혼합물(137mL)을 가하여 얻은 2상 혼합물을 10분간 교반하였다. 상들을 20분동안 분리시켰다. 염수 강도는 24중량%였다. 수상을 추가량의 에틸아세테이트(68mL)에 접촉시키고 이렇게 제조한 2상 혼합물을 10분동안 교반하고 나서 상분리를 위해 15분간 방치하였다. 2회 추출로부터 에틸아세테이트층을 합하고 24중량% 염수(120mL), 다른 분액의 24중량% 염수(60mL), 1N 수산화나트륨 용액(150mL) 및 다른 분액의 염수(60mL)로 세척하였다. 각각의 수상 첨가후에, 혼합물을 10분동안 교반하고 분리를 위해 15분간 방치하였다. 얻은 용액을 물 흡출기를 사용하여 45℃에서 감압하에서 농축건조시켰다. 고체 생성물(8.09g)을 HPLC로 분석하여 엔에스테르 83.4면적%, 11,12-올레핀 2.45면적%, 7,9-락톤 1.5% 및 미반응 메실레이트 1.1%를 포함한다는 것을 알았다.
실시예 40
실시예 23에서 제조한 구조를 갖는 메실레이트(1.0g), 이소프로페닐아세테이트(10g) 및 p-톨루엔술폰산(5mg)을 50mL 플라스크에 넣고 교반하면서 90℃로 가열하였다. 5시간 후에 혼합물을 25℃로 냉각시키고 10mm Hg에서 진공하에서 농축하였다. 잔사를 CH2Cl2(20mL)에 용해하고 5% 수성 NaHCO3으로 세척하였다. CH2Cl2층을 진공하에서 농축하여 황갈색 오일 1.47g을 얻었다. 이 물질을 CH2Cl2/Et2O에서 재결정하여 화학식 IV(Z)의 엔올 아세테이트 0.50g을 얻었다.
이 물질을 교반하면서 100℃로 미리 가열한 아세트산(2.0ml) 및 아세트산나트륨(0.12g)의 혼합물에 가하였다. 60분이 지난 후에, 혼합물을 25℃로 냉각시키고 CH2Cl2(20ml)로 희석하였다. 용액을 물(20ml)로 세척하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 건조제를 여과로 제거하고 여액을 진공하에서 농축하여 원하는 9,11-올레핀, IV(Y) 0.4g을 얻었다. 미정제 생성물은 7,9-락톤 불순물 2% 미만을 함유하였다.
실시예 41
DMSO 중의 메실레이트의 열제거
플라스크내의 메실레이트 2g 및 DMSO 5ml의 혼합물을 22.4시간동안 80℃에서 가열하였다. 반응 혼합물의 HPLC 분석은 출발물질이 검출되지 않음을 나타내었다. 반응물에 물(10ml)을 가하고 침전을 염화메틸렌으로 3회 추출하였다. 합한 염화메틸렌층을 물로 세척하고 황산마그네슘상에서 건조시키고 농축하여 엔에스테르를 얻었다.
실시예 42
50mL 서양배 모양의 플라스크에 화학식 IIA의 엔에스테르(1.07g 74.4%로 평가), 트리클로로아세트아미드(0.32g), 고체로서 인산수소이칼륨(0.70g)을 교반하에서 염화메틸렌(15.0mL)과 혼합하였다. 맑은 용액을 얻었다. 과산화수소(30중량%; 5.0mL)를 1분에 걸쳐 피펫을 통해 가하였다. 얻은 혼합물을 실온에서 6시간동안 교반하고 이 때 HPLC분석은 반응 혼합물중의 에폭시멕스레논 대 엔에스테르의 비가 약 1:1임을 나타냈다. 추가의 트리클로로아세트아미드(0.32g)를 반응 혼합물에 가하고 8시간 이상동안 교반하에서 반응을 계속하고 나서 엔에스테르의 잔류 비율이 10%로 감소되었음을 나타내었다. 추가의 트리클로로아세트아미드(0.08g)를 가하고 반응 혼합물을 하룻밤 방치하고 이 때 단지 5%의 미반응 엔에스테르가 혼합물중의 에폭시멕스레논에 비례하여 잔류하였다.
실시예 43
화학식 IIA의 엔에스테르(5.4g, 74.4% 엔에스테르 평가)를 100mL 반응기에 넣었다. 트리클로로아세트아미드(4.9g) 및 인산수소이칼륨(3.5g) 둘다 고체형으로 엔에스테르에 가하고 나서 염화메틸렌(50mL)을 가하였다. 혼합물을 15℃로 냉각시키고 30% 과산화수소(25g)를 10분에 걸쳐 가하였다. 반응 혼합물을 20℃로 하고 6시간동안 이 온도에서 교반하고 이 때 전환율은 HPLC로 체크하였다. 잔류 엔에스테르는 1중량% 미만으로 측정되었다.
반응 혼합물을 물(100mL)에 가하고, 상들을 분리하고 염화메틸렌층을 제거하였다. 수산화나트륨(0.5N; 50mL)을 염화메틸렌층에 가하였다. 20분 후에 상들을 분리시키고 HCl(0.5N; 50mL)을 염화메틸렌층에 가하고 나서 상들을 분리시키고 유기상을 포화 염수(50mL)로 세척하였다. 염화메틸렌층을 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고 용매를 제거하였다. 백색 고체(5.7g)를 얻었다. 수산화나트륨 수층을 산성화하고 추출하고 또 추출하여 생성물 0.2g을 추가로 얻었다. 에폭시멕스레논의 수율은 90.2%였다.
실시예 44
화학식 IIA의 엔에스테르를 다음 차이, 즉 초기 충전물이 엔에스테르(5.4g 74.4% 엔에스테르 평가), 트리클로로아세트아미드(3.3g) 및 인산수소이칼륨(3.5g)으로 이루어진 것만 제외하고 실시예 43에 기재된 방법에 따라 에폭시멕스레논으로 전환시켰다. 과산화수소 용액(12.5mL)을 가하였다. 반응을 20℃에서 하룻밤 시행하고 그 후에 HPLC는 엔에스테르가 에폭시멕스레논으로 90% 전환되었음을 나타내었다. 추가의 트리클로로아세트아미드(3.3g) 및 30% 과산화수소(5.0mL)를 가하고 반응을 추가 6시간동안 행하고 그 시점에서 잔류 엔에스테르는 엔에스테르 충전을 기준으로 단지 2%였다. 실시예 43에 기재된 대로 조작한 후에 에폭시멕스레논 5.71g을 얻었다.
실시예 45
화학식 IIA의 엔에스테르를 실시예 43에 통상 기재된 방법으로 에폭시멕스레논으로 전환시켰다. 본 실시예의 반응에서, 엔에스테르 충전은 5.4g(74.4% 엔에스테르 평가), 트리클로로아세트아미드 충전은 4.9g, 과산화수소 충전은 25g, 인산수소이칼륨 충전은 3.5g이었다. 반응을 18시간동안 20℃에서 진행시켰다. 잔류 엔에스테르는 2%미만이었다. 조작후에, 에폭시멕스레논 5.71g을 얻었다.
실시예 46
화학식 IIA의 엔에스테르를 본 실시예에서의 반응온도를 28℃로 한 것만 제외하고 실시예 43에 기재된 방법으로 에폭시멕스레논으로 전환시켰다. 반응기에 충전한 물질은 엔에스테르(2.7g), 트리클로로아세트아미드(2.5g), 인산수소이칼륨(1.7g), 과산화수소(17.0g) 및 염화메틸렌(50mL)을 포함하였다. 4시간의 반응후에, 미반응 엔에스테르는 엔에스테르 충전을 기준으로 단지 2%였다. 실시예 43에 기재된 대로 조작한 후에, 에폭시멕스레논 3.0g을 얻었다.
실시예 47
화학식 IIA의 엔에스테르(17g, 72% 엔에스테르로 평가)를 염화메틸렌(150mL)에 용해한 후에 트리클로로아세트아미드(14.9g)를 서서히 교반하면서 가하였다. 혼합물의 온도를 25℃로 조정하고 물(10.6mL)중의 인산수소이칼륨(10.6g) 용액을 400rpm 교반하에서 엔에스테르 기질용액에 교반하였다. 과산화수소(30중량% 용액; 69.4mL)를 기질/인산염/트리클로로아세트아미드 용액에 3-5분에 걸쳐 가하였다. 발열 또는 산소 증발은 관찰되지 않았다. 이렇게 제조한 반응혼합물을 18.5시간동안 25℃ 및 400rpm에서 교반하였다. 반응동안에 산소증발은 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 물(69.4mL)로 희석하고 혼합물을 15분동안 약 250rpm에서 교반하였다. 이 조작동안 온도조절을 필요하지 않았고 본질적으로 실온에서 시행하였다(5-25℃ 범위의 온도에서면 허용가능). 수층 및 유기층을 분리시키고 하부의 염화메틸렌층을 제거하였다.
수층을 15분동안 250rpm의 교반하에서 염화메틸렌(69.4mL)으로 역추출하였다. 층들을 분리시키고 하부의 염화메틸렌층을 제거하였다. 수층(177g; pH=7)을 과산화수소 측정을 하였다. 생성물(12.2%)은 반응에 소비된 단지 0.0434mol의 과산화수소가 0.0307mol의 올레핀이라는 것을 나타내었다. 소량의 염화메틸렌 부피의 역추출은 수층에서의 에폭시멕스레논의 손실이 없다는 것을 확인하기에 충분하였다. 이 결과로 다량의 제2의 염화메틸렌 추출을 사용하여 트리클로로아세트아미드만이 회수되었음을 확인하였다.
상기한 추출로부터 합한 염화메틸렌 용액을 합하고 약 250rpm에서 적어도 15분동안 3중량% 아황산나트륨 용액(122mL)으로 세척하였다. 네거티브 전분 요오다이드 시험(KI지; 색이 관찰되지 않음; 포지티브 시험에서 보라색 용액은 퍼옥시드의 존재를 나타냄)을 교반의 종료시에 관찰하였다.
수층 및 유기층을 분리시키고 하부의 염화메틸렌층을 제거하였다. 수층(pH=6)을 따라내었다. 아황산나트륨 용액의 첨가는 약간의 발열을 일으키므로 그러한 첨가는 온도조절하에서 시행해야 한다는 것을 주목한다.
염화메틸렌상을 15-25℃ 범위의 온도 및 약 250rpm에서 45분동안 0.5N 수산화나트륨(61mL)으로 세척하였다(pH=12-13). 트리클로로아세트아미드로부터 유래된 불순물을 이 공정으로 제거하였다. 알칼리성 수성분획의 산성화 다음에 염화메틸렌의 추출로 매우 적은 에폭시멕스레논이 이 조작에서 소실되었음을 알았다.
염화메틸렌상을 15-25℃ 범위의 온도에서 250rpm 교반하에서 15분동안 0.1N 염산(61mL)으로 1회 세척하였다. 다음에 층들을 분리시키고 하부의 염화메틸렌층을 제거하고 15-25℃ 범위의 온도 및 약 250rpm에서 15분동안 10중량% 수성 염화나트륨(61mL)으로 다시 세척하였다. 다시 층들을 분리시키고 유기층을 제거하였다. 유기층을 Solkafloc 패드를 통해 여과하고 감압하에서 증발건조시켰다. 건조는 65℃의 수욕온도로 완료하였다. 회백색 고체(17.95g)를 얻었고 HPLC 분석을 하였다. 에폭시멕스레논 분석은 66.05%였다. 반응물에 대해 조정한 몰수율은 93.1%였다.
생성물을 고온의 메틸에틸케톤(189mL)에 용해하고 얻은 용액을 대기압에서 증류하고 나서 케톤 용매 95mL를 제거하였다. 온도를 50℃로 저하시키고 생성물을 결정화하였다. 교반을 1시간동안 50℃에서 계속하였다. 다음에 온도를 20-25℃로 저하시키고 교반을 추가 2시간동안 계속하였다. 고체를 여과하고 MEK(24mL)로 세정하고 고체를 9.98g의 일정한 중량으로 건조시키고, 이것은 HPLC 분석으로 에폭시멕스레논 93.63%를 함유하였다. 이 생성물을 고온의 MEK(106mL)에 용해하고 고온의 용액을 압력하에서 10미크론 라인 필터를 통해 여과하였다. 추가의 MEK 18mL를 사용하여 세정하고 여과한 MEK 용액을 대기압에서 증류하고 용매 53mL를 제거하였다. 온도를 50℃로 저하시키고 생성물을 결정화하고; 교반을 1시간동안 50℃에서 계속하였다. 다음에 온도를 20-25℃로 저하시키고 교반을 추가 2시간동안 계속하면서 이 온도를 유지하였다. 고체 생성물을 여과하고 MEK(18mL)로 세정하였다. 고체 생성물을 8.32g의 일정한 중량으로 건조시키고 정량적 HPLC분석으로 99.6%의 에폭시멕스레논을 함유하였다. 건조시의 최종 손실은 1.0% 미만이었다. 본 실시예의 조작 및 반응에 따른 전체 에폭시멕스레논 수율은 65.8%였다. 이 전체 수율은 반응 수율 93%, 초기의 결정화 회수율 78.9% 및 재결정화 회수율 89.5%를 반영하였다.
실시예 48
톨루엔을 사용하는 화학식 IIA의 에폭시화
화학식 IIA의 엔에스테르를 토울렌을 용매로서 사용한 것만 제외하고 실시예 46에 통상 기재된 방법으로 에플러레논으로 전환시켰다. 반응기에 충전한 물질은 엔에스테르(2.7g), 트리클로로아세트아미드(2.5g), 인산수소이칼륨(1.7g), 과산화수소(17.0g) 및 토울렌(50mL)을 포함하였다. 반응을 28℃로 발열시키고 4시간안에 완료시켰다. 얻은 3상 혼합물을 15℃로 냉각시키고 여과하고 물로 세척하고 진공하에서 건조시켜 생성물 2.5g을 얻었다.
실시예 49
9,11-디엔온의 에폭시화
화학식 XVIIA를 나타낸 화합물(-A-A- 및 -B-B-는 둘다 -CH2-CH2-인 화합물 XVII)(40.67g)을 1리터의 3구 플라스크안에 있는 염화메틸렌(250mL)에 용해하고 외부에서 염 혼합물을 얼음으로 냉각시켰다. 인산이칼륨(22.5g) 및 트리클로로아세트아미드(83.5g)를 가하고 혼합물을 2℃로 냉각시키고 나서 30% 과산화수소(200g)를 1시간에 걸쳐 서서히 가하였다. 반응 혼합물을 8시간동안 12℃에서, 14시간동안 실온에서 교반하였다. 유기층을 적하시키고 어떤 출발 엔온에 대해 체크하여 <0.5%임을 알았다. 물(400mL)을 가하고 15분간 교반하고 층들을 분리시켰다. 유기층을 요오드화칼륨(10%) 200mL, 티오황산나트륨(10%) 200mL 및 중탄산나트륨 포화용액 100mL으로 연속적으로 세척하고 매번 층들을 분리하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고 농축하여 미정제 에폭시드(41g)를 얻었다. 생성물을 에틸아세테이트:염화메틸렌으로부터 결정화하여 순수한 물질 14.9g을 얻었다.
실시예 50
m-클로로퍼벤조산을 사용하는 화합물 XVIIA의 에폭시화
화합물 XVIIA(18.0g)를 염화메틸렌 250mL에 용해하고 10℃로 냉각시켰다. 교반하에서 고체 m-클로로퍼벤조산(50-60% 순도, 21.86g)을 15분동안 가하였다. 온도상승은 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 3시간동안 교반하고 디엔온의 존재에 대해 체크하였다. 반응 혼합물을 아황산나트륨 용액(10%), 수산화나트륨 용액(0.5N), 염산 용액(5%) 및 최종적으로 염수 포화용액 50mL로 연속적으로 처리하였다. 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후에 증발시켜 에폭시드 17.64g을 얻었고 다음 단계에서 바로 사용하였다. 생성물은 에틸아세테이트로부터 분쇄하여 제거한 다음에 염화메틸렌으로부터 결정화한 바이에르-빌리거 산화 생성물을 함유한다는 것을 알았다. 500g 규모에서, 침전 m-클로로벤조산을 여과한 다음에 통상 조작하였다.
실시예 51
트리클로로아세트아미드를 사용하는 화합물 XVIIA의 에폭시화
화합물 XVIIA(2g)를 염화메틸렌 25mL에 용해하였다. 트리클로로아세트아미드(2g), 인산이칼륨(2g)을 가하였다. 실온에서 교반하면서 30% 과산화수소(10mL)를 가하고 18시간동안 교반을 계속하여 에폭시드(1.63g)를 얻었다. 바이에르-빌리거 생성물은 형성되지 않았다.
실시예 52
수산화칼륨(56.39g; 1005.03mmol; 3.00당량)을 2000mL 플라스크에 넣고 주위 온도에서 디메틸술폭시드(750.0mL)로 슬러리화하였다. 화학식 XX(R3은 H이고, -A-A- 및 -B-B-는 각각 -CH2-CH2-이다)에 대응하는 트리엔온(100.00g; 335.01mmol; 1.00당량)을 THF(956.0mL)와 함께 플라스크에 넣었다. 트리메틸술포늄 메틸술페이트(126.14g; 670.02mmol; 2.00당량)를 플라스크에 넣고 얻은 혼합물을 1시간동안 80 내지 85℃에서 가열환류하였다. 17-스피로옥시메틸렌으로의 전환은 HPLC로 체크하였다. THF 약 1L를 진공하에서 반응 혼합물로부터 스트리핑하고 나서 물(460mL)을 30분에 걸쳐 충전하고 반응 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 얻은 혼합물을 여과하고 고체 옥시란 생성물을 물 200mL 분액으로 2회 세척하였다. 생성물은 매우 결정성으로 관찰되었고 여과를 용이하게 시행하였다. 다음에 생성물을 40℃에서 진공하에서 건조시켰다. 3-메틸 엔올 에테르 Δ-5,6,9,11,-17-옥시란 스테로이드 생성물 104.6g을 분리하였다.
실시예 53
나트륨에톡시드(41.94g; 616.25mmol; 1.90당량)를 질소 블랭킷하에서 건조 500mL 반응기에 넣었다. 에탄올(270.9mL)을 반응기에 넣고 나트륨메톡시드를 에탄올에서 슬러리화하였다. 디에틸말로네이트(103.90g; 648.68mmol; 2.00당량)를 슬러리에 넣고 나서 실시예 52에서 제조한 옥시란 스테로이드(104.60g; 324.34mmol; 1.00당량)를 가하고 얻은 혼합물을 80-85℃에서 가열환류하였다. 가열을 4시간동안 계속하고 나서 반응 종료를 HPLC로 체크하였다. 물(337.86mL)을 30분에 걸쳐 반응 혼합물에 넣고 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 교반을 30분동안 계속하고 반응 슬러리를 여과하고 미세한 비정질 분말로 이루어지는 필러 케이크를 얻었다. 필터 케이크를 물로 2회(각각 200mL)로 세척한 다음에 진공하에서 주위온도에서 건조시켰다. 3-메틸 엔올에테르-Δ5,6,9,11,-17-스피로락톤-21-메톡시카르보닐 중간체 133.8g을 분리하였다.
실시예 54
실시예 53에서 제조한 3-메틸 엔올에테르-Δ5,6,9,11,-17-스피로락톤-21-메톡시카르보닐 중간체(화학식 XVIII, R3은 H이고 -A-A- 및 -B-B-는 각각 -CH2-CH2-이다; 133.80g; 313.68mmol; 1.00당량)를 염화나트륨(27.50g; 470.52mmol; 1.50당량)과 함께 반응기에 넣고 디메틸포름아미드(709mL) 및 물(5mL)을 교반하에서 2000mL 반응기에 넣었다. 얻은 혼합물을 138 내지 142℃에서 3시간동안 가열환류하고 나서 반응 혼합물을 반응 종료에 대해 HPLC로 체크하였다. 다음에 물을 30분에 걸쳐 혼합물에 가하고 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 교반을 30분동안 계속하고 나서 반응 슬러리를 여과하고 필터 케이크로서 비정질 고체 반응 생성물을 회수하였다. 필터 케이크를 2회(물 200mL 분액) 세척하고 다음에 건조시켰다. 생성물 3-메틸엔올에테르-17-스피로락톤을 건조시켜 91.6g(82.3% 수율; 96면적% 평가)을 얻었다.
실시예 55
실시예 54에 따라 제조한 엔올 에테르(91.60g; 258.36mmol; 1.00당량), 에탄올(250mL), 아세트산(250mL) 및 물(250mL)을 2000mL 반응기에 넣고 얻은 슬러리를 2시간동안 가열환류하였다. 물(600mL)을 30분에 걸쳐 넣고 반응 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 반응 슬러리를 여과하고 필터 케이크를 물(200mL 분액)로 2회 세척하였다. 다음에 필터 케이크를 건조시키고; 생성물 3-케토 Δ4,5,9,11-17-스피로락톤 84.4g을 분리하였다(화학식 XVII의 화합물, R3은 H이고 -A-A- 및 -B-B-는 -CH2-CH2-이다; 95.9% 수율).
실시예 56
화합물 XVIIA(1 kg; 2.81mol)를 사염화탄소(3.2L)와 함께 22L 4구 플라스크에 넣었다. N-브로모-숙신아미드(538g)를 혼합물 다음에 아세토니트릴(3.2L)에 가하였다. 얻은 혼합물을 가열환류하고 약 3시간동안 68℃의 환류온도에서 유지하여 맑은 오렌지색 용액을 얻었다. 5시간 가열한 후에, 용액은 어두운 색으로 변하였다. 6시간 후에 열을 제거하고 반응 혼합물을 시료화하였다. 용매를 진공하에서 스트리핑하고 에틸아세테이트(6L)를 증류기의 바닥에 있는 잔사에 가하였다. 얻은 혼합물을 교반하고 나서 5% 중탄산나트륨 용액(4L)을 가하고 혼합물을 15분동안 교반하고 다음에 상들을 방치시켰다. 수층을 제거하고 염수 포화용액(4L)을 혼합물에 도입한 다음에 15분동안 교반하였다. 다시 상들을 분리하고 유기층을 진공하에서 스트리핑하여 농 슬러리를 얻었다. 다음에 디메틸포름아미드(4L)를 가하고 55℃의 포트 온도에서 스트리핑을 계속하였다. 증류기 바닥을 하룻밤 방치하고 DABCO(330g) 및 브롬화리튬(243g)을 가하였다. 다음에 혼합물을 70℃로 가열하였다. 1 내지 1.5시간 가열한 후에, 액체 크로마토그래피 시료를 취하고 3.50시간 가열한 후에 추가의 DABCO(40g)를 가하였다. 4.5시간 가열한 후에, 물(4L)을 넣고 얻은 혼합물을 15℃로 냉각시켰다. 슬러리를 여과하고 케이크를 물(3L)로 세척하고 하룻밤 필터에서 건조시켰다. 습식 케이크(978g)를 다시 22L 플라스크에 넣고 디메틸포름아미드(7L)를 가하였다. 이렇게 제조한 혼합물을 105℃로 가열하고 이 시점에서 케이크를 전체 용액에 흡수시켰다. 열을 제거하고 플라스크내의 혼합물을 교반하고 냉각시켰다. 빙수를 반응기 재킷에 가하고 반응기내의 혼합물을 14℃로 냉각시키고 2시간동안 유지하였다. 얻은 슬러리를 여과하고 물 2.5L 분액으로 2회 세척하였다. 필터 케이크를 하룻밤 진공하에서 건조시켰다. 담갈색 고체 생성물 510g을 얻었다.
실시예 57
2L 4구 플라스크에, 실시예 49, 50, 또는 51에서 제조한 9,11-에폭시 칸레논(100.00g; 282.1mmol; 1.00당량), 디메틸포름아미드(650.0mL), 염화리튬(30.00g; 707.7mmol; 2.51당량) 및 아세톤 시아노히드린(72.04g; 77.3mL; 846.4mmol; 3.00당량)을 넣었다. 얻은 현탁액을 기계적으로 교반하고 테트라메틸 구아니딘(45.49g; 49.6mL; 395.0mmol; 1.40당량)으로 처리하였다. 다음에 시스템을 물로 여과하고 HCN의 이탈을 방지하기 위해 냉각기 및 건조 얼음 냉각기(아세톤중의 건조 얼음으로 여과)로 냉각시켰다. 건조 얼음 냉각기로부터의 배출라인을 과잉량의 염소 세제가 채워진 스크러버에 통과시켰다. 혼합물을 80℃로 가열하였다.
18시간 후에, 어두운 적갈색 용액을 얻었고, 이것을 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 냉각 공정동안에 질소를 용액에 분산하여 배출라인을 스크러버중의 세제에 통과시키면서 잔류 HCN을 제거하였다. 2시간후에 용액을 아세트산(72g)으로 처리하고 30분동안 교반하였다. 미정제 혼합물을 교반하면서 빙수(2L)에 부었다. 교반 현탁액을 10% 수성 HCl(400mL)로 더 처리하고 1시간동안 교반하였다. 다음에 혼합물을 여과하여 어두운 붉은 벽돌색 고체(73g)를 얻었다. 여액을 4L 분별 깔때기에 넣고 염화메틸렌(3×800mL)으로 추출하고; 유기층을 합하고 물(2×2L)로 역추출하였다. 염화메틸렌 용액을 진공하에서 농축하여 어두운 적색 오일 61g을 얻었다.
수성 세척 분획을 하룻밤 방치한 후에 상당한 침전이 일어났다. 이 침전을 여과로 수집하고 순수한 생성 엔아민(14.8g)을 측정하였다.
건조후에 원래의 적색 오일(73g)을 HPLC로 분석하고 주성분이 9,11-에폭시엔아민임을 측정하였다. HPLC는 엔아민이 염화메틸렌 조작으로부터 얻은 적색 오일의 주성분임을 나타내었다. 엔아민의 환산한 몰 수율은 46%였다.
실시예 58
실시예 57에 따라 제조한 9,11-에폭시엔아민(4.600g; 0.011261mol; 1.00당량)을 1000mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 메탄올(300mL) 및 0.5중량% 수성 HCl(192mL)을 혼합물에 가하고 나서 17시간동안 환류하였다. 다음에 메탄올을 진공하에서 제거하여 증류기 포트내의 물질량을 50mL로 감소시켜 백색 침전을 형성하였다. 물(100mL)을 슬러리에 가한 다음에 여과하여 백색 고체 케이크를 얻었고 물로 3회 세척하였다. 고체 9,11-에폭시디케톤 생성물의 수득량은 3.747g(81.3%)이었다.
실시예 59
실시예 58에 따라 제조한 에폭시디케톤(200mg; 0.49mmol)을 메탄올(3mL)에 현탁하고 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔(DBU)을 혼합물에 가하였다. 24시간동안 환류하에서 가열시, 혼합물을 균질해졌다. 다음에 회전증발기 상에서 30℃에서 농축건조시키고 잔사를 염화메틸렌과 3.0N HCl 사이에 분배하였다. 유기상의 농축물은 황색고체(193mg)였고 이것은 22중량% 에폭시멕스레논으로 측정하였다. 수율은 20%였다.
실시예 60
메탄올 1.5mL에 현탁한 디케톤 100mg에 메탄올중의 나트륨메톡시드의 25%(w/w) 용액 10μl(0.18당량)를 가하였다. 용액을 가열환류하였다. 30분후에 잔류하는 디케톤은 없었고 5-시아노에스테르는 존재하였다. 혼합물에 25%(w/w) 메탄올중의 나트륨메탄올 용액 46μl를 가하였다. 혼합물을 23시간동안 가열환류하고 이때 주생성물은 HPLC로 에플러레논으로 판정하였다.
실시예 61
건조 메탄올 30ml에 현탁한 디케톤 2g에 트리에틸아민 0.34mL를 가하였다. 현탁액을 4.5시간동안 가열환류하였다. 혼합물을 16시간동안 25℃에서 교반하였다. 얻은 현탁액을 여과하여 백색고체로서 5-시아노에스테르 1.3g을 얻었다.
메탄올 80mL에 현탁한 디케톤 6.6g에 트리에틸아민 2.8mL를 가하였다. 혼합물을 4시간동안 가열환류하고 88시간동안 25x에서 교반하고 그 동안에 생성물을 용액으로부터 결정화하였다. 여과하고 나서 메탄올로 세척하여 백색 분말로서 시아노에스테르 5.8g을 얻었다. 물질을 클로로포름/메탄올로부터 재결정하여 결정성 물질 3.1g을 얻었고 이것은 HPLC로 균질하였다.
상기한 바와같이 본 발명의 여러 목적이 달성되고 다른 이점을 얻게 된다.
각종 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 조성물 및 방법으로 행해질 수 있었으므로, 상기 설명에 함유되고 첨부 도면에 나타낸 모든 물질은 제한하는 의미가 아닌 예시로서 해석될 것으로 의도된다.
Claims (7)
- 화학식 IV(화학식 IV)[상기 화학식에서-A-A-는 기 -CHR4-CHR5- 또는 -CR4=CR5-를 나타내고R3, R4 및 R5는 수소, 할로, 히드록시, C1-4 알킬, C1-4 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시 카르보닐, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,R1은 α-배향 C1-4 알콕시카르보닐 또는 히드록시카르보닐 라디칼을 나타내고,-B-B-는 기 -CHR6-CHR7- 또는 화학식 III의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:(화학식 III)R6 및 R7은 수소, 할로, C1-4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고,R8 및 R9는 수소, 할로, C1-4 알콕시, 아실, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 히드록시카르보닐, 알킬, 알콕시카르보닐, 아실옥시알킬, 시아노, 아릴옥시로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고, 또는 R8 및 R9는 함께 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 또는 R8 또는 R9는 R6 또는 R7과 함께 5환 D고리로 축합된 탄소환 또는 헤테로고리환 구조를 이루고, 그리고R2는 C1-4 알킬술포닐옥시 또는 아실옥시 또는 할라이드이다]의 화합물의 제조방법에 있어서,C1-4 알킬술포닐화 또는 아실화 시약, 또는 티오닐할라이드, 술푸릴할라이드 또는 옥살릴할라이드와 같은 할라이드 생성제와 다음 화학식 V의 화합물을 반응시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.(화학식 V)상기 화학식에서, -A-A-, R1, R3, -B-B-, R8 및 R9는 상기한 바와같다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 IV의 화합물은 화학식 IVA(화학식 IVA)[상기 화학식에서-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,R1은 α-배향 C1-4 알콕시카르보닐 라디칼을 나타내고,R2는 C1-4 알킬술포닐옥시 또는 아실옥시를 나타내고,-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 IIIA의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:(화학식 IIIA)X는 2개의 수소원자 또는 옥소를 나타내고,Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-을 나타내고, 또는Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고Y2는 히드록시, C1-4 알콕시 또는 X가 H2이면 C1-4 알칸오일옥시를 나타낸다] 및 X는 옥소를, Y2는 히드록시를 나타내는 화합물의 염에 대응하고;상기 방법은 수소할라이드 스캐빈저의 존재하에서 C1-4 알킬술포닐 또는 아실 할라이드와 다음 화학식 VA에 대응하는 화합물을 반응시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.(화학식 VA)상기 화학식에서, -A-A-, R1, -B-B-, X, Y1 및 Y2는 화학식 IVA에서 정의된 바와같다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 IV의 화합물은 메틸 수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤이고, 상기 화학식 V의 화합물은 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 화학식 IVA의 화합물(화학식 IVA)[상기 화학식에서-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,R1은 α-배향 C1-4 알콕시카르보닐 라디칼을 나타내고,R2는 C1-4 알킬술포닐옥시 또는 C1-4 알킬카르보닐옥시를 나타내고,-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 IIIA의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:(화학식 IIIA)X는 2개의 수소원자 또는 옥소를 나타내고,Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-을 나타내고, 또는Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고Y2는 히드록시, C1-4 알콕시 또는 X가 H2이면 C1-4 알칸오일옥시를 나타낸다] 및 X는 옥소를, Y2는 히드록시를 나타내는 화학식 IVA의 화합물의 염.
- 제 4 항에 있어서, 상기 화합물은 메틸 수소 17α-히드록시-11α-(메틸술포닐)옥시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 다음 화학식 VA의 화합물(화학식 VA)[상기 화학식에서-A-A-는 기 -CH2-CH2- 또는 -CH=CH-를 나타내고,R1은 α-배향 C1-4 알콕시카르보닐 라디칼을 나타내고,-B-B-는 기 -CH2-CH2- 또는 화학식 IIIA의 α- 또는 β-배향기를 나타내고:(화학식 IIIA)X는 2개의 수소원자 또는 옥소를 나타내고,Y1 및 Y2는 함께 산소다리결합 -O-을 나타내고, 또는Y1은 히드록시를 나타내고, 그리고Y2는 히드록시, C1-4 알콕시 또는 X가 H2이면 C1-4 알칸오일옥시를 나타낸다] 및 X는 옥소를, Y2는 히드록시를 나타내는 화학식 VA의 화합물의 염.
- 제 6 항에 있어서, 상기 화합물은 메틸 수소 11α,17α-디히드록시-3-옥소프레근-4-엔-7α,21-디카르복실레이트, γ-락톤인 것을 특징으로 하는 화합물.
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