JPS58179498A - 微生物による１１α−ヒドロキシル化アンドロスタン系化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′４＝発明は、微生物による１１α−ヒドロキシル化ア
ントロスタン系化合物の製造方法に関する。史に峰しく
は、スチロール類ｔＪＩ料として、シェードノカルディ
ア（Ｐｓ＠ｔ＋ｄｅ＋５ｏｃａｒｄｉａ　）輌Ｋ１１ｌ
する微生物を用いてアントロスタン系化合物を蓄積せし
め、ついで該化合物に対し１１α−ヒドロキシル化（以
下１１α−ＯＨ化と略す）能を有する微生物を用いて１
１α−ヒドロキシル化アントロスタン系化合物な一槽で
連続的に製造するものであり、極めて効率的な製造方法
に関する。

従来、種々のステロールｔ１４に対して１１α−ＯＨ化
能を有する微生物としては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｍ
ｓ）　属、シュードモナス（Ｐｓ＠ｕｄｏｔｍｏｍａｍ
　）　Ｉｌｇ、ストレプトマイセス（８ｔｒ＠ｐｔ＠ｓ
ｍｙｃｓｉ　）属、ムコール（Ｍｔ＋ｅｏｒ）属、リゾ
プス（Ｒｈ１ｘｏｐｕｓ　）鵬等１１３属、３００種以
上の微生物が知られている。（ステロイドと微生物、Ａ
、んアフレム、Ｙｕ、ム、チトフ着、廣用書店発行） 微生−による１１α−ＯＨ化反応が実ＷｋＫ工業的規模
で行なわれている例としては、米国７７１９３７社が開
発したスチグマステロールからコルチコイド（ｉｉｌｌ
Ｉ賢皮質ホルモン）製造工程中に′ｉ６ケるリゾゲス・
ニゲリカ／ス（Ｒｈ１ｘｏｐｕｓｎ＋ｇｒｉｅａｎｓ）
、あるいはアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐ＠ｒ
ｇｉｌｌｕｇ　ｏｅｂｒａｅｓｕｍ　）によるプロゲス
テａ７の１１α−ＯＨ化が挙げられる。これに対しアン
トロスタン系化合物、！に４−アンドロステン−６，１
７−ジオン（以下４ＡＤと略す）、１．４−アンドロス
タジエン−３゜１７−ジオン（以下ムＤＤと略す）の１
１α−ヒドロキシ誘導体もグロゲステａ７尋プレグナン
系化合物の１１α−ヒドロキシ誘導体と同様コルチコイ
ドの合成中間体として非常に重畳であるにもかかわらず
、アントロスタン系化合物の微生物変換による１１α−
ヒドロキシ化誘導体の製造物としては、唯−ＡＤＤより
１１α−０Ｈ−ＡＤＤｌＦ）製造方法としてアスペルギ
ルスオクラセウスを用いる方法（％開１１１１５６−５
８４９７号）が知られているのみである。しかもこの方
法は１本願発明のごとき特定の−を２種類用いた連続的
発酵法によるものではなく、１段階の発静法によるもの
である。

しかるに１本発明者らは鋭意研究を進めた結果、ステロ
ール類を例えばＡＤＤ、４ムＤ等のアンドロメタン系化
合物に変換、蓄積能を有するシュードノカルディア属に
属する微生物、および飼えばムＤＤ、４ムＤ＄のアンド
ロスタ／系化合物に対し強い１１α−ＯＨ化能な有する
特定の微生物の２種類の異る微生物を順次利用する連続
的発＃により効率的Ｋ　１１　（１−ＯＨ−ＡＤＤ、　
　１１　Ｑ−ＯＨ−４ＡＤ等の１１α−ヒドロキシル化
アントロスタン系化合物を製造しうろことを見い出し、
本発明を完成するに到った。

岬ち、本発明は、ステロール類をアントロスタン系化合
物例えばＡＤＤ、４ムＤへ変換する能力及び該化合物な
培墳中に蓄積する能力を有するシュードノカルディア属
に輌する微生物、例えばシュートソカルディア・メタノ
リグニカＤＩＣ−９４１２５、同ＤＩＣ−９４１２７等
を培養することによりステロール類をアントロスタン系
化合物に変換、蓄積せしめ、更に１１α−ヒドロキシル
化能な有する債生物ケ培養することを％像とするステロ
ール類を原料とした１１α−ヒドロキシル化アントロス
タン系化合物、例　。

に制するものである。

本発明は、−檜で連続的に発酵させる方法であるから中
間生成物の分離を要さず１１α−ヒドロキシル化アント
ロスタン系化合物を直＊ａ造でき、分離工程としては該
化合物σ）分離が１関ですむ。これに対し中間生成物で
あるアントロスタン系化合物を製造後分離する方法にお
いては、中間生成物の濃度を高めたり、不必費な夾雑物
を除くといつた利点があるものの、分離１機を２度も必
要とし非連続的で効率が悪い。埠ち、本発明は前述のご
とき利点により連続的、効率的な製造方法である。

以下に本発明を詳述する。

本発明に使用するアントロスタン系化合物を生産するシ
ュー）’／カルディア属に属する微生物としては、ステ
ロール類よりアントロスタン系化合物、例えば４ＡＤ、
ムＤＤを単独かつ大量に培地中に変換、蓄積する範力な
有する微生物であれば、自然変異株、人工央然変異株、
自然分離株のいずれでもよいが、好ましくはシュードノ
カルディア・メタノリグニカの突然変異株である。この
突然変異株は微生物工業技術研究所に次の番号で寄託さ
れている。即ち、ステロール類を４ＡＤに変換、蓄積す
る能力を有する微生物としてシュードノカルディア・メ
タノリグニカ（Ｐｍ＠ｍｄｅｎｏｃａｒｄｉａ　ｍ＠ｔ
ｈａｍｏｌｉｇｍｌ＠ａ　）ＤＩＣ−９４１２７（ＶＩ
Ｌ工研厘寄第６２５１号）があげられ、同様にＡＤＤに
変換、蓄積する能力な有する微生物としてシュードノカ
ルディア・メタノリグニカ・ＤＩＣ−９４１２５（ｍｌ
工＃１隋嵜第６２５０号）が代表的な一株で、各々微生
物工業技術研究所に寄託されている　この変！４株の親
株の７ユードノカルデイア・メタノリグニカは、本発明
名らにより自然界から分離されたものであり、微生物１
′！Ｅ技術研究所へ微工研嬌寄第４７４７号として寄託
されており、その陶学的性質本は特公昭５６−５３３５
２号公報に記載されている内容と一一であるので省略す
る。

生育培地としては、巌素源、窒素源、無機塩、ビタミン
類な程良（含有するものであれば合成培地、天然培地の
いず八も使用できる。

炭素源としては、資化しうるものであればいかなるもの
でもよ（、例えばブドウ糖、ショ糖、ラムノース、澱粉
、麦芽Ｓ％糖蜜勢のｅｕｉ、メタノール、エタノール、
グリセリン等のアルコール類、凰−アルカン、α−オレ
フィン、キシレン尋の炭化水素、さらには酢酸、クエン
酸、〕ｉルミルの有機ｍＩ！があげられる。

ｉ１素源としては、硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウ
ム、尿素、ペプトン、カゼイン等の無機又は有機物が使
用できる。

無機塩類としては、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄
、マンガ／、鋼、カルシウム等の各塩類が使用できる。

また黴量栄養嵩として必要に応じて、酵母エキス、肉エ
キス、味液、麦芽エキス、コーンスチープリカー、魚粉
、ビタミン類、核酸類、アミノ酸類等を添加してもよい
。

消泡剤が必要な場合は、一般に使用されているいずれも
使用可能である。

界面活性剤は、特にステロール−の乳化剤として有効で
あり培地中に適宜添加される。代表的な界面活性剤とし
ては昇イオン性乳化剤すｆわちエチレンオキサイド付加
物ポリグリコールの脂肪酸エステル等があげられる。

本発明で使用されるステロール類として（工、例えばコ
レステロール、テスモステロール、カンペステロール、
ハリク【１ナスチロール、ブラシカステロール、エルゴ
ステロール、β−シトステロール、スチグマステロール
、コルビスチロール、クリオナステロール、ポリフェラ
スチロール、フコステロール等かあげられ、なかでもコ
レステロール、カンペステロールおよびβ−シトステロ
ールがｈ過である。

ずた上記ステロール類の有ｍ酸または無機酸とのエステ
ル酵導体も使用できる。これらステロール類は、精製物
、粗Ｍｋ、、混合物いずれも使用できステロール含有天
然物、例えば羊毛脂、魚油、いか油からのアルカリ洗浄
ダーク油勢の使用も同様に可能である。

さらには各種ステロールあるいはスチロールのエステル
誘導体の酸化中間体も使用され、このような酸化中間体
として４Ｌ　Ｎえばコレスト−４−エン−３−オン、コ
レスタ−１，４−ジエン−３−オン、コレスタ−４，２
２−ジエン−３−オン、２２．２３−ビスノルコラ−５
−コレニックアシッド−３β−オール、２２．２３−ビ
スノルコラ−１，４−ジエン−６−オン−２２−オイッ
クアシッド、プレグネノ口／、プロゲステロン等があげ
られる。

これらステロール類の培地への添加は、多（の場合一体
生育稜に行なテか、最初から生育培地に全量添加するか
、画体生育途中に全量または分割で添加してもよい。

その添加＃度は１通常、培地量に対し、ｌ１１５〜５０
ｇ／）の範囲であり、好ましくは１〜１０１１／ｌの範
囲である。

ステロール類の添加方法は、乾熱殺菌あるいはオートク
レーブした後、粉体のままか加してもよいが、１体とス
テロール類との接触を増加させる必蒙があり、従ってよ
り好まし、（はあらかじめアセトン、メタノール、エタ
ノール、イングロバノール、ベンジルアルコール、エー
テル、ジメチルホルムアミド等の溶液または懸濁液とし
た後添加する。

培養は好気条件下に行なうことが望ましく、一般に通気
攪拌、蛋盪条件下に行なうのが南利である。　　９培養
及び反応温度は、）１１１常２５℃〜５０℃の範囲で可
能であるか、好ましくは３５℃〜４５℃付近である。培
地のｐ旧工通常４．５〜９０の範囲で可能であるが、好
ましくは＆ｂ〜Ｚ５の範囲である。

こうして得られるアントロスタン系化合物としては、好
まし２くは１．４−アンドロスタジエン−３，１７−ジ
オン（ＡＤＤと称す）、４−アンドロステン−３，１７
−ジオン（４ＡＤと称す）が挙げられる。

次に、前述のごとく生産せしめたアントロスタン系化合
物、例えばＡＤＤ、４ムＤ等に対し１１α−ＯＨ化能を
有する微生物を接種、培養することにより変換反応を行
ない４ムＤ、ムＤＤから１１α−ＯＨ，１１α−０Ｈ−
ムＤＤを製造する。

アントロスタン系化合物から１１α−０Ｈ−アントロス
タン系化合物への変換反応に用いる微生物とし【は、ア
ントロスタン系化合物に対し、１１α−ＯＨイＩを有す
る做生−であればいずれでもよいが、好ましくはアスペ
ルギルス属、エメリセラ属、ネオサルトリア属およびリ
ゾゲス属に属する微生物から選択される。例えば４ＡＤ
の１１α−ｏＨ化菌の代表例としては、アスベルギルス
ーオクラセウスＩＦＯ−４５４５、ＩＦＯ−８５５９、
アスペルギルス・クラバタスＩＦＯ−５８５７、アスペ
ルギルス・ニカーＩＦＯ−４４０７、アスペルギルス・
ラスタスＩＦＯ−４１１３、アスペルギルス・ベンティ
ＩＦＯ−４１０７、ＩＦＯ−６５７８、ＩＦＯ−８８７
９、エメリセラ会ニドランスＩＦＯ−８００１，ネオサ
ルトリア・フィシエリ・バール・フィシエリＩＦＯ−５
８６６、ＩＦＯ−８７９０％リゾプス・ストロニファ−
ＩＦＯ−４７８１があげられる。

またムＤＤの１１α−ＯＨ化閑の代表例としては、アス
ペルギルス・オクラセウスＩＦＯ−４５４５、ＩＦＯ−
８５５９゜アスペルギルス・ベンティーＩＦＯ−４１０
７％ＩＦＯ−６５７８、ＩＦＯ−７１２６、ＩＦＯ−８
８７９、ネオサルトリア・フィシエリ・パール・フィシ
エリＩＦＯ−８７９０が、挙げられる。

これら１１α−ＯＨ化能を有する微生物の接種は通常ア
ントロスタン系化合物、例えば４ＡＤ％ＡＤＤ生産用徽
生物による４ＡＤ、ＡＤＤ生Ｗ量が最高値に達した後に
行なうが、場合によっては４ＡＤ、ＡＤＤ発解途中に接
種な行なうことも可能であり、その接種方法は通常、別
培養を実施した１１α−ＯＨ化能を有する微生物の培養
液を４ムＤ１ムＤＤ生鑞用微生物の培養液に添加するこ
とにより行なう。

１１α−ＯＨ化能な有する微生物の培地組成は前述のア
ントロスタン系化合物生産用徴生−の生育培地をそのま
ま適用することができる。培養および反応は好気条件下
に行なうことが望ましく、一般に通気攪拌、振盪条件下
に行なうのが有利である。これらの培養および反応温度
は通常２０℃〜４５℃の範囲で可能であるが、好ましく
は２３℃〜３５℃付近である。培地のｐＨは通常２５〜
９０の範囲で可能であるが、好ましくは４．５〜１５の
範囲である。従って、アントロスタン系化合物つまりＡ
ＤＤ、４ＡＤの１１α−ＯＨ化反応開始の際、温度、ｐ
Ｈ等の反応条件を前述のような１１α−ＯＨ化反応に適
した条件に移すことが望ましいが、無−瞥でも何らさし
つかえない。１１α−ＯＨ化能な有する微生物の培養液
のアントロスタン系化合物生産用替生物培養箪（対する
添加比率は０１％〜７０％の範囲で可能であるが、好ま
しくは３％〜２５％の範囲である。

促ッテ、１１α−ＯＨ化能を有する９、生物の接種量の
大小により、必要に応じて１１α−ＯＨ化能を有する微
生物の訣素源、窒素源、その他の栄養源を加えてもよい
。１１α−ＯＨ化反応の終了後、培養液から、目的物で
ある１１α−０Ｈ−アントロスタン系化合物を通常の分
離方法にて分離・採取する、 すなわち、反応終了後の培養液を酢酸エチル、クロロホ
ルム、勤−ヘキナン、シクロヘキサン等の極性の低い有
機溶剤で抽出し、抽出液を濃縮した後、シリカゲル、ア
ルミナ等の吸着剤を充填したカラムに＠看させ、エーテ
ル、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール
、エタノール等の有＊＊媒を用いて溶出分取する。この
様にして爵出された１１α−０Ｈ−アントロスタン系化
會−１溶出箪を濃縮し溶媒を留去した後、酢酸エチル、
ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル勢の有Ｉ
ｌ溶剤から結晶化させて得られる。

以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、本発
明はその要旨をこえないかぎり、これらに限定されるも
のではない。

肖、以下の実施例においてステロール類、アントロスタ
ン系化合物（４ＡＤ、ＡＤＤ　）、および１１α−０Ｈ
−アントロスタン系化合物の定性と定量は薄層クロマト
グラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロ１
トゲラフイー、歩外吸収スペクトル、被磁気共鳴スペク
トルおよび質量分析（より確認された。

実施例１ グルコース２０ｇ、コークスチープリカー１０！ｉ、ペ
グトン５１１．リン＃２１ナトリウム５１７．　　リン
＃１２カリウム７Ｉ、水１１より成る樟培地（ｐＨ７，
０）１００ｄを５００紅容エルレンマイヤ−７２スコに
分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ後、シュー
ドノカルディアメタノリグ二力りＩＣ−９４１２７を１
白金耳接種し、４０℃、４８時間通気下に振盪し、種培
養を行なった。この種培養２紅を種培地と同一の組成か
ら成る本培誓培地１００ｄな含む５００ｄ容エルレンマ
イヤーフラスコに接種する。本培養はロータリーシエイ
カーにて４０℃、２０　Ｏｒｐｍの条件で行ない培養開
始後４８時間目にメタノール５１７Ｋｍｌ濁したコレス
テロール５ｏｏｑを添加した。コレステロール添加後、
１２８時間時間項養液の一部な採取し生成アントロスタ
ン系化合物量をガスクロマトグラフィー（て定量した結
果、フラスコあたり１７２〜の４ＡＤが確認された。又
、他のアントロスタン系化合物は全く生成しておらず、
コレステロール分解中間体であるコレスト−４−エン−
３−オンのみが１９ダ生成していた。

次にグルコース２０Ｌコーンスチーフリカー５ｇ、ペプ
トン５ｇ、９７１！１ナトリウム１ｇ、リンｉ１２カリ
ウム３／、＠＠−ｒグネ’／９Ａ１ｙ、ａｓｓ１鉄２０
！、水１ノより成る培地（ＰＨ５，，６）１００−な含
む５００ｄ容エルレンＴイヤーフラスコにて別培養（種
培養４８時間、本培養２４時間）を実施したネオすルト
リア・フィシエリ、バール・フィシエリＩＦＯ−５８６
６の培養液２０ｉｕを上述の１２８時間目における４Ａ
Ｄ生産培養１１に接種した。この際ｐＨな４５に調整し
た。接種後ロータリーシエイカーにて３０℃、２２０ｒ
ＰＩ”ｌの条件にて反応な行ない、９６時時間区反応を
停止し、培養液を全てあわせ酢酸エチルｊＱ（）ｉｌｌ
［て２回抽出した。

この抽出液をあわせて、１体などの不溶物をｆ過饅、ガ
スクロマトグラフィーにて定置を行なった結果、４ＡＤ
の残存はなく、１１α−０Ｈ−４ＡＤか７６■生成して
−・た。

肖、　６１生底物はほとんど蛯められなかった。

久に１この酢酸エチル抽出液を濃縮した後、シリカゲル
カラムに注入し、ベンゼン−エーテル系にて溶出を行な
い、アセトン−クロロホルム系より再結晶した結果、１
１α−０Ｈ−４ＡＤ５ｔ５Ｊｌを得た。得られた結晶は
融点調定、質１分析、赤外吸収スペクトル、および核磁
気共鳴スペクトルにより１１α−０Ｈ−４ＡＤであるこ
とを確緒した。

実痢例２ 実施例１においてネオサル）　リア・フィシエリ・バー
ル・フィシエリＩＦＯ−５８６６のかわりにネオサルト
リア・フィシエリ・バール・フィシエリＩＦＯ−８７９
０を用いた事を除いては実施例１と同様に行なった。ガ
スクロマトグラフィーにて定量した結果、１１α−〇Ｈ
−４ＡＤが４０ダ生成していた。副生成物として６β−
０Ｒ−４ムＤおよび６β、１１α−０Ｈ−４ムＤがそれ
ぞれ７ダ、３４〜生成していた。

実施例３ シュードノカルディア・メタノリグ′ニカＤＩＣ−９４
１２７による４ムＤの生！！は実施例１と全く同様に行
なった。一方、グリコース２０Ｉ、硝酸アンモニウム５
１１　リン１１！２カリウム２Ｊ９．硫酸マグネシクム
α５ｇ、塩化カリウムｎ、５ｙ１ｉｉ＊第１鉄５０〜よ
り成る培地（ＰＨ５−６）１ｏ０−を含む５００ｄ容エ
ルレ／マイヤーフラスコにて別培養（種培養７２時間、
本培養４８時間）を実施したアスペルギルス・ベンティ
（ムｓｐ＠ｒｇｌｌ１ｍａ　ｙ＠ｎｔｉ　ｌ　）　Ｉ　
Ｆ　０−６５７８の培養液２０１１ｊを上述の１４４時
間目における４ムＤ生産培養液に１ｌｌｌＬだ。肖、１
４４時間目の４ムＤ生成量はガスクロマトグラフィーに
よる定量の結果１８１ダであった。

接Ｓ債、ＰＨＶ４５に調整し、ロータリーシエイカーに
て３０℃、２２Ｏｒｐｍの条件で反応を行ない、９６時
時間区反応を停止し、培養ｉｌ［を全てあわせ酢酸エチ
ル１００ｄにて２回抽出した。

この抽出液をあわせて一体などの不齢物なｅ過後、ガス
ク「コマトゲラフイーにて定量を行なった結果、未反応
の４ＡＤは１６〜であり、１１α−０Ｈ−４ＡＤは６１
１ｖ生成していた。又、−生成物はほとんど緒められな
かった。

実施例４ 冥Ｊ１１ｆｆｆ　３のアスペルギルス・ペンテ４１ＦＤ
−６５７８０ρ）わりにアスペルギルス・ベンティＩＦ
Ｏ−４１０７゜同［ＦＯ−８８７９，アスペルギルス・
オクラセウスＩＦＯ−４３４５、−ＩＦＯ−８５５９、
°γアスペルギルスクラバタスＩＦＯ−５８６７、アス
ペルギルス・ニガーＩＦＯ−４４０７，アスペルギルス
・クスタスＩＦＯ−４１１３、エメリセラ・ニドラ／ス
ＩＦＯ−８００１、およびリゾゲス・ストロニファ−Ｉ
ＦＯ−４７８１を用いた事を除いては実施例３と同様に
行なった。生成した１１α−０Ｈ−４ムＤ及び副生成物
がガスクロマトグラフィーにて定量した結果な表１に示
した。

実施例５ 実施ＮＩにおいて、原料コレステロールの代わりにβ−
シトステロールとカンペステロールの２　：　１１１＋
合物、−Ｘ？グマステｐ−ル、コレスト−４−エン−３
−オンを用いた事を除いては実施ガ１と同様に行なった
。生成した１゛１α−０Ｈ−４ＡＤをガスクロマトグラ
フィーにて定量した結果を表２に示した。

表２ 実施例６ グリコース２０ｇ、コーンメチ−プリカー１０ｐ、ペプ
トン５ｇ、リン酸１ナトリウム３ｇ、リン＃２カリウム
７ｙ、水１１より成る種培地（ｐＨ７，０）１００ｉｄ
を５００ｄ容エルレ／マイヤーフラスコに分注し、１２
１℃、１５分間オートクレーブ後Ｃシュードノカルディ
ア・メタノリグニカＤＩＣ−９４１２５を１白金耳接種
し、４０℃、４８時間通気下に振盪し、種培養を行なっ
た。この種培養２ｄｌ梅培地と同一の組成から成る本培
養培地、１０〇−な含む５０〇−容エルレ／マイヤーフ
ラスコにＷ！種した。

本培養はロータリーシエイカーにて４０℃、２ＱＯｒｐ
ｍの条件で行ない、培＊＊始４８時間目に、メタノール
５−にＳ瀾したコレステロール５００〜を添加した。コ
レステロール添加後、１４４時間目に培養液の１ｆ１７
５を採取し、生成アントロスタン系化合蟻撒をガスクロ
マトグラフィーにて定置した結果、フラスコあたりＡＤ
Ｄ１３２Ｉｖ、４ＡＤ１５Ｉｖが生成していた。他のア
ントロスタン系化合物は全（生成しておらず、コレステ
ロール分解中間体としてコレスト−４−工ン−３−オン
、コレスタ−１，４−ジエン−５−オンがそれぞれ９１
１ｖ、２５ダ住成していた。

次にグルコース２０，９．コーンメチ−フリカー５Ｊ、
ペプトン５ｇ、リンａ１１ナトリウムＩＪ、　　リン酸
２カリウム５Ｉ、硫酸マグネシラＡ１ｇ、硫酸＃１１鉄
２０ｊｖ、水１１より成る培地（ｐＨ５，６）１０αｍ
ｔｌ−含む５ＯＯ−容エルレ／マイヤーフラスコにて別
培養（ｍ培養４８時間、本培養２４時關）を実施したネ
オサルトリア・フィシエリバール・フィシエリＩＦＯ−
８７９０の培養液１５１１ｊを上述の１４４時間目にお
けるＡＤＤ生童用培養液ＫＩｊ１種したにの際ｐＨを＜
Ｌ５に調整した。接種後、ロータリーシエイカーにて３
０℃、２２Ｏｒｐｍ条件で反応を行ない、４８時間目に
反応を停止し、培養液を全てあわせ酢酸エチル１００−
にて２目抽出した。

この抽阻液をあわせて１体などの不酊物を濾過後、ガス
クロマトグラフィーにて定量を行なった結果、ＡＤＤの
残存４ｔｆ＜Ｍめられず、１１　（１−ＯＨ−ＡＤＤが
１０３ＩＱ生成していた。又、１１α−０Ｈ−４ＡＤも
６呼生成しており、これはＡＤＤ発酵の副生成物４ＡＤ
から変換されたものと推定された。

次に、この酢酸エチル抽出液を＃縮した後、シリカゲル
カラムに注入し、クロロホルム・メタノール系にて解重
な行ない、エーテルより再結晶を（り返した結果、８７
〜の結晶を得た。得られた結晶は融点御ｊ足、質量分析
、赤外吸収スペクトルおよび被磁気其鳴スペクトルより
１１α−０Ｈ−ＡＤＤであることを確認した。

実施例７ シュードノカルディア・メタノリグニ力ＤＩＣ−９４１
２５にｊ、るＡＤＤの生産は実施ｆｌＪ６と全（同様に
行なった。

一方、ショ糖２０Ｊ、コーンスチープリカーｓｙ、＊母
エキス２１１ペプトン３１ｉ、硫酸マグネシウム［１５
ｊｒ、硫酸＃１１鉄５０ＪｌＦ、水１１より成る培地（
ｐＨ５，６）１００ｄを含む５００ｄ容エルレン１イヤ
ーフラスコにて別培養（種培養４８時間１本培養２４時
間）を実施したアスペルギルス・オクラセウスＩＦＯ−
８５５９の培養液２０−を上述の１６８時間目における
ムＤＤ生産培養に接種また。

＾、１６８時間目におけるムＤＤ生威蓋はガスクロマト
グラフィーによる定量の結果、１５８ダであった。又、
Ｉのも４２ダ生成していた。

１１！５ｌｐＨ４１：４５Ｋｌｌ整し、ｌ’−７９−シ
：Ｘ−４−Ｊ：Ｉ　−にテ３０℃、２２０　ｒｐｎ＋の
条件で反応を行ない、７２時間目に反応を停止し、培養
液を全てあわせて酢酸エチル１００ｍ［て２目抽出した
。

この抽出液をあわせて１体などの不溶物を濾過後、ガス
クロマトグラフィーにて定量を行なった結果、未反応の
ＡＤＤは認められず、１１α−０１（−ＡＤＤは８６ダ
生成していた、その他４ムＤに対応する変換生成物とし
て１１α−０Ｈ−４ＡＤが９ダ鰯められ１こ。同＠にし
て、アスペルギルス・オクラセクスＩＦＯ−４３４５を
用（・て１１α−ＯＨ化反応を行なった結果、恢ａ後７
２時間目のＡＤＤ残存量は１ｌｓ９Ｉｖ％１１α−０Ｒ
−ＡＤＤの生成−１は３９Ｑで、ｂ−だ。

実施？１１８ シュードノカルディア・メタノリグニカＤＩＣ−９４１
２５ＶこよるＡＤＤの生産は実１例６と全く同様に行な
った。

一方、ｆ　ル：２−ス２１．硝酸アンモニウム５．！ｉ
’、’Ｊン酸２カリウム２Ｊｉ１．硫酸マグネシウム０
５ｇ、塩化カリウムα５ｇ、硫酸第１鉄５０〜より成る
培地（ｐＨ５，６）１００ｄヲｔム５００１１ｊ容エル
レンマイヤーフラスコにて別培養（種培養７２時間、本
培養４８時間）を実施したアスペルギルス・ベンティＩ
ＦＯ−６５７８の培養１１２０ｗｊを上述の１６８時間
目におけるムＤＤ生産培養液に撤積した。尚、１６８時
間目のＡＤＤ生成量はガスクロマトグラフィーによる定
量の結果、１２２Ｉｖであった。又、４ＡＤも５８■生
成していた。

接種後ｐＨを６５に１ｉｉｌＪＩＬ、ロータリーシエイ
カーにて５０℃、２２０ｒｐｍの条件で反応を行ない、
９６時間目に反応を停止し、培養液を全てあわせ、酢酸
エチル１００Ｗ１１にて２回抽出する。この抽出液をあ
わせて菌体などの不溶物をＰＡＤ、ガスクロマトグラフ
ィーにて定量な行なった結果、未反応のムＤＤは１９Ｉ
Ｉｇであり、１１α−０Ｈ−ムＤＤは５４ダ生成してい
た。又、４ムＤに対応する変換生成物として１１α−０
Ｈ−４ムＤも１９■眩められた。

４−１０’ｉ’、　ｒＦＯ− 同様にしてアスペルギルス・ベンティＩＦ’σＭ６、お
よびＩＦ’０−８８７９を用いて１１α−ＯＨ化反応を
行なった。接種後、９６時間目における１１α−０Ｈ−
ＡＤＤの生成量をガスクロマトグラフィーにて足音した
結束ｔ′表３に示−１０ 表６ 実脚１ｆ１１９ ＄施例６において原料コレステロールのかわりにβ−シ
トヌテロールと力／ペスデロールの２：１混合物、スチ
グマステロール、コレス）−４−エン−６−オン、コレ
スタ−１，４−ジエン−６−オンを用いた事を除いては
実施例６と同様に行なった。生成した１１α−０Ｈ−ム
ＤＤｔＸｌスクロマトグラフイーにて定量した結果を！
！４に示す。

表４ 第１頁の続き ０発　明　者　松林忠勇 千葉市小仲台４−３−１８ ０発　明　者　宮用和之 小平市学園西町２−２８−１４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　ステロールａなアントロスタン系化合物へ変換し、
   該化合物を培地中に蓄積する能力を有するシュードノカ
   ルディア緘に属する微生物を培養することにより、ステ
   ロール類をアントロスタン系化合物に変換、蓄積させ更
   に、アントロスタン系化合物を１１α−ヒドロキシル化
   し培地中に１１α−ヒドロキシル化アントロスタン系化
   合物を蓄積する能力を有する微生物を引続き培養して培
   地中に１１α−ヒドロキシル化アントロスタン系化合物
   な蓄積させることを特徴とするステロール類を原料とし
   た１１α−ヒドロキシル化アントロスタン系化合物の製
   造方法。 ２　アントロスタン系化合物が、１，４−アンドロスタ
   ジエン−３，１７−ジオン、４−アンドロステン−！１
   ．１７−ジオンから選ばれたものであることを特徴とす
   る特ｔｆＷｆ４求の範囲第１］Ｊ記教の方法。 ５　シュードノカルディア緘に＠する微生物ｈ・、シュ
   ードツカ臭ディアメタノリグニ力ＤＩＣ−９４１２５、
   また−１同ＤＩＣ−９４１２７であることを特徴とする
   特肝ｄ求の範ａｌ第１項、第２項記載の方法。 ｕ ４１１α−ヒドロキシ花鮭を有する微生物が、アスペル
   ギルス属、エメリセラ属、ネオサルトリア属、リゾプス
   属から選択された微生物であることを特徴とする％ｉｌ
   ’ｆ晴求の範囲第１項、第２項、第３項記載の方法。