PL179443B1

PL179443B1 - Kompozycja insuliny, sposób wytwarzania kompozycji insuliny i sposób wytwarzania dawki insuliny w postaci aerozolu PL PL PL PL

Info

Publication number: PL179443B1
Application number: PL95316199A
Authority: PL
Inventors: John S Patton; Linda C Foster; Robert M Platz
Original assignee: Inhale Therapeutic Syst
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 2000-09-29
Also published as: CA2183577A1; NZ281112A; EP0748213A4; US7521069B2; FI963468A0; CN1098679C; WO1995024183A1; HUT75676A; NO316661B1; FI116195B; US20020192164A1; EP2036541A1; PT748213E; AU1744995A; US20030053959A1; JP2006077032A; IL112618A0; US20040096400A1; FI963468A; MY124282A

Abstract

1. Kompozycja insuliny do podawania do pluc, znamienna tym, ze zawiera insuline w postaci suchego proszku o sredniej wielkosci czastek ponizej 7,5 µm i ewentualnie nos- nik farmaceutyczny. 6. Sposób wytwarzania kompozycji insuliny do podawania do pluc, znamienny tym, ze w wodnym roztworze buforowym rozpuszcza sie insuline i ewentualnie nosnik farmace- utyczny, po czym uzyskany roztwór suszy sie rozpylowo z wytworzeniem czastek o sred- niej wielkosci ponizej 7,5 µ m. 11. Sposób wytwarzania dawki insuliny w postaci aerozolu do podawania do pluc, zna- mienny tym, ze dawke insuliny w postaci suchego proszku zawierajacego czastki o sred- niej wielkosci ponizej 7,5 µ m i ewentualnie nosnik farmaceutyczny dysperguje sie w strumieniu gazu, a powstaly aerozol wychwytuje sie w komorze przystosowanej do inhalacji doustnej. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje insuliny, sposób wytwarzania kompozycji insuliny i sposób wytwarzania dawki insuliny w postaci aerozolu do podawania insuliny do płuc.

179 443

Kompozycja według wynalazku służy do podawania diabetykom przez układ oddechowy insuliny w postaci suchego proszku dla szybkiego układowego wchłaniania przez płuca.

Insulina jest polipeptydowym hormonem o 50 aminokwasach, o masie cząsteczkowej około 6000, wytwarzanym przez komórki β trzustki normalnych (niediabetycznych) osobników. Insulina jest niezbędna w regulowaniu metabolizmu węglowodanów poprzez zmniejszanie poziomu glukozy we krwi, a jej niedobór w organizmie powoduje cukrzycę. Przeżycie diabetyków zależy od częstego i długotrwałego podawania insuliny, aby utrzymać dopuszczalny poziom glukozy we krwi.

Insulmę _naj_częściej podaje się drogą iniekcji podskórnej, zwykle w brzuch lub góm_{e cz}ęś_ci bioder. W celu utrzymania dopuszczalnego poziomu glukozy we krwi często trzeba wstrzykiwać insulinę co najmniej raz lub dwa razy dziennie, w razie potrzeby z uzupełniającymi ini_ekcjami szybko działającej insuliny. Intensywne leczenie diabetyków może wymagać je_szcze _częstszych iniekcji, gdy pacjent dokładnie śledzi poziom glukozy we krwi wykorzystując do tego domowe zestawy diagnostyczne. Wynalazek dotyczy zwłaszcza podawania szybko działających insulin, które mogą zapewnić osiągnięcie szczytowego poziomu insuliny w surowicy krwi w ciągu 1 godziny oraz minimalnego poziomu glukozy w ciągu 90 minut.

Podawanie insuliny przez iniekcję jest niedogodne z szeregu względów. Po pierwsze wi_elu pacjentom sprawia trudność lub kłopot, gdy muszą sami wstrzykiwać sobie insulinę tak często, jak to jest konieczne dla utrzymania dopuszczalnego poziomu glukozy we krwi. Taka niechęć może doprowadzić do nie przestrzegania ustaleń, co w najpoważniejszych przypadkach stwarza zagrożenie dla życia. Ponadto doukładowe wchłanianie insuliny przy podskórnych iniekcjach przebiega stosunkowo powoli i często trwa 45 - 90 minut, nawet przy stosowaniu preparatów insuliny o szybkim działaniu. Z tego względu od dawna starano się opracować alternatywne preparaty insuliny oraz takie sposoby podawania, które pozwoliłyby uniknąć potrzeby wykonywania iniekcji przez samego chorego, oraz mogły zapewnić szybką układową dostępność insuliny.

Zaproponowano szereg alternatywnych sposobów podawania insulin, w tym donosowo, doodbytniczo i dopochwowo.

Jakkolwiek takie sposoby eliminują niedogodności i niechęci związane z podawaniem podskórnym, to każdy z nich wykazuje właściwe sobie ograniczenia. Podawanie doodbytnicze i dopochwowe jest niedogodne, nieprzyjemne, a ten ostatni sposób nie jest dostępny dla całej populacji diabetyków'·. Podawanie donosowe mogłoby być wygodniejsze i prawdopodobnie stosowane mniej niechętnie niż iniekcja, ale wymaga stosowania potencjalnie toksycznych „środków wzmagających penetrację” ułatwiających przenikanie insuliny przez błone śluzową w nosie, charakteryzującą się występowaniem grubej warstwy nabłonka odpornej na przenikanie makrocząsteczek. Szczególnie interesujące z punktu widzenia wynalazku jest podawanie insuliny do płuc, polegające na tym, że pacjent wdycha preparat insuliny, a jej wchłanianie do układu zachodzi przez cienkąwarstwę komórek nabłonka w pęcherzykowych obszarach płuc. Okazało się, że takie podawanie insuliny do płuc powoduje, że szybciej przedostaje się ona do układu niż przy iniekcji podskórnej, a ponadto eliminuje się stosowanie igieł. Jednakże podawanie insuliny do płuc musi zostać powszechnie zaaprobowane. Dotychczas podawanie do płuc najczęściej realizowano poprzez rozpylanie ciekłych preparatów insuliny, co wymaga stosowania kłopotliwych rozpylaczy do cieczy. Ponadto w aerozolach wytworzonych przez takie rozpylacze stężenie insuliny jest bardzo niskie, co wymaga wielu inhalacji, aby osiągnąć właściwą dawkę. Stężenie insuliny jest ograniczone ze względu na niską rozpuszczalność insuliny w odpowiednich roztworach wodnych. W pewnych przypadkach trzeba wykonać nawet 80 łub więcej wdechów, aby osiągnąć wymaganą dawkę, toteż podawanie może trwać 10-20 minut lub nawet dłużej.

Pożądane byłoby dostarczenie ulepszonych sposobów i kompozycji do podawania insuliny do płuc. Szczególnie cenne byłyby takie sposoby i kompozycje, które byłyby na tyle wygodne, aby możliwe było samopodawanie, nawet poza domem, zapewniające dostarczenie pożądanej całkowitej dawki przy stosunkowo niewielkiej liczbie wdechów, korzystnie mniejszej niż 10. Takie sposoby i kompozycje powinny zapewniać szybkie wchłanianie doukładowe insuliny, korzystnie prowadzące do osiągnięcia piku w surowicy w ciągu 45 minut lub w krótszym czasie, oraz

179 443 związane z tym osiągnięcie minimalnego poziomu glukozy w ciągu około 1 godziny lub w krótszym czasie. Takie preparaty o szybkim działaniu będąkorzystnie przydatne do stosowania w intensywnej terapii, w przypadku której iniekcję średnio i długo działającej insuliny można będzie zmniejszyć lub wyeliminować. Kompozycje według wynalazku powinny być również trwałe, korzystnie w postaci stężonego suchego proszku.

Podawanie do układu oddechowego przeprowadzonych w stan aerozolu roztworów insuliny opisano w licznych publikacjach poczynając od Gansslena, (1925) Klin. Wochenschr. 4:71, oraz w innych publikacjach : Laube i inni, (1993) JAMA 269:2106-21-9: Elliott i inni, (1987) Aust. Paediatr.J. 23:293-297; Wigley i inni, (1971) Diabetes 20:552-556. Corthorpe i inni, (1992) Pharm Res 9:764-768; Govinda, (1959) Indian J Physiol. Pharmacol. 3:161-167; Hastings i inni, (1992) J. Appl. Physiol.. 73:1310-1316; Liu i inni, (1993) JAMA 269:2106-2109: Nagano i inni, (1985) Jikeikai Med. J. 32:503-506; Sakr, (1992) Int. J.Phar. 86:1-7; oraz Yoshida i inni, (1987) Clin.. Res. 35:160-166. Podawanie do płuc leków w postaci suchych proszków, np. insuliny, w nośniku w postaci dużych cząstek, opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 254 330. Odmierzający dawkę inhalator (MDI) do podawania krystalicznej insuliny zawieszonej w propelencie opisali Lee i Sciara, (1976) J. Pharm. Sci. 65:567-572. MDI do podawania insuliny do komory pośredniej, co umożliwia regulację szybkości wdychania, opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 320 094. Dooskrzelowe podawanie zrekombinowanej insuliny krótko opisali Schluter i inni, (skrót) (1984) Diabetes 33:75A oraz Kohler i inni, (1987) Atemw. Lungenkrkh. 13:230-232. Podawanie do nosa i do układu oddechowego różnych polipeptydów, w tym insuliny, w obecności środków wzmagaj ącego penetracj ę opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 011 678 oraz w publikacji Nagai i inni, (1984)7 Contr. Rel. 1:15-22. Donosowe podawanie insuliny w obecności środków wzmagających penetrację i/lub w postaci preparatów o kontrolowanym uwalnianiu opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 204 108,4 294 829 i 4 153 689; w zgłoszeniach PCT opublikowanych jako WO 93/02712, WO 91/02545, WO 90/09780 i WO 88/04556; w brytyjskim opisie patentowym nr 1 527 605; oraz w publikacjach Rydćn i Edman, (1992) Int. J Pharm. 83:1-10: i Bjork i Edman, (1988) Int. J. Pharm. 47:233-238. Wytwarzanie i trwałość bezpostaciowej insuliny opisali Rigsbee i Pikal w American Association of Pharmaceutical Sciences (AAPS), November 14-18, 1993, Lake Buena Vista, Floryda. Sposoby suszenia rozpyłowego polipeptydu, polinukleotydu i innych nietrwałych leków w nośniku tworzącym strukturę bezpostaciową stabilizującą lek opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 520 748.

Obecnie opracowano kompozycję insuliny, sposób jej wytwarzania i sposób przeprowadzania dawki insuliny w stan aerozolu w celu doukładowego podawania insuliny ssakom, zwłaszcza ludziom chorym na cukrzycę, zapewniający szybkie wchłanianie do krwioobiegu z wyeliminowaniem iniekcji podskórnej. W szczególności podaje się do płuc insulinę w postaci suchego proszku. Nieoczekiwanie stwierdzono, że wdychana insulina w postaci suchego proszku osadza się w obszarach pęcherzykowych płuc i zostaje szybko wchłonięta poprzez komórki nabłonkowe obszaru pęcherzykowego do krwioobiegu. Zatem podawanie do płuc insuliny w postaci proszku może stanowić skuteczną alternatywę dla podawania drogą iniekcji podskórnej.

Tak więc zgodna z wynalazkiem kompozycja insuliny do podawania do płuc zawiera insulinę w postaci suchego proszku o średniej wielkości cząstek poniżej 7,5 pm i ewentualnie nośnik farmaceutyczny.

Korzystnie kompozycja zawiera poszczególne cząstki zawierające insulinę w ilości 5 - 99% wagowych w nośniku farmaceutycznym.

Korzystnie kompozycja jest wolna od środków wzmagających penetrację.

Jako nośnik farmaceutyczny kompozycja korzystnie zawiera węglowodan wybrany z grupy obejmującej mannit, rafinozę, laktozę, maltodekstrynę i trehalozę, względnie sól organiczną wybraną z grupy obejmującej cytrynian sodowy, glukonian sodowy i askorbinian sodowy.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania kompozycji insuliny do podawania do płuc polega na tym, że w wodnym roztworze buforowym rozpuszcza się insulinę i ewentualnie nośnik

179 443 farmaceutyczny, po czym uzyskany roztwór suszy się rozpyłowo z wytworzeniem bezpostaciowych cząstek o średniej wielkości poniżej 7,5 pm.

Korzystnie suszy się roztwór zawierający 5 - 99% wagowych insuliny i 95 - 1% wagowych nośnika farmaceutycznego w przeliczeniu na suchą masę kompozycji.

Jako nośnik farmaceutyczny korzystnie stosuje się węglowodan, sól organiczną, aminokwas, peptyd lub białko, a zwłaszcza węglowodan wybrany z grupy obejmującej mannit, rafmozę, laktozę, maltodekstrynę i trehalozę, względnie sól organiczną, wybraną z grupy obejmującej cytrynian sodowy, octan sodowy i askorbinian sodowy.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania dawki insuliny w postaci aerozolu do podawania do płuc polega na tym, że dawkę insuliny w postaci suchego proszku zawieraj ącego cząstki o średniej wielkości poniżej 7,5 pm i ewentualnie nośnik farmaceutyczny dysperguje się w strumieniu gazu, a powstały aerozol wychwytuje się w komorze przystosowanej do inhalacji doustnej.

Korzystnie stosuje się dawkę insuliny zawartej w ilości około 5 - 99% wagowych w nośniku w postaci suchego proszku.

Korzystnie stosuje się dawkę insuliny wolnej od środków wzmagających penetrację.

Jako nośnik w postaci proszku korzystnie stosuje się węglowodan, sól organiczną, aminokwas, peptyd lub białko.

Korzystnie stosuje się dawkę insuliny w postaci suchego proszku zawierającego cząstki o średniej wielkości 0,1-5 pm.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycje insuliny w postaci suchego proszku są szybko wchłaniane w płucach bez stosowania środków wzmagających penetrację, takich jak środki konieczne przy wchłanianiu przez śluzówkę nosa i górnych dróg oddechowych.

Insulinę w postaci suchego proszku można ewentualnie łączyć z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem w postaci suchego proszku, lecz to szczegółowo opisano poniżej.

Kompozycja insuliny korzystnie jest wolna od środków wzmagających penetrację i składa się z cząstek o średnicy 10 pm, korzystniej poniżej 7,5 pm, a najkorzystniej poniżej pm, zazwyczaj o wielkości w zakresie 0,1-5 pm. Zwykle insulina w postaci suchego proszku zawiera 5 - 99% wagowych insuliny, a jeszcze częściej 15 - 80%, w odpowiednim nośniku farmaceutycznym, zazwyczaj typu węglowodanu, soli organicznej, aminokwasu, peptydu lub białka, jak to dokładniej opisano poniżej.

Kompozycję insuliny w postaci suchego proszku wytwarza się poprzez rozpuszczenie insuliny w wodnym roztworze buforu, a następnie suszenie rozpyłowe uzyskanego roztworu z wytworzeniem zasadniczo bezpostaciowych cząstek o wielkości poniżej 7,5 pm, korzystnie poniżej 5 pm, zazwyczaj w zakresie 0,1-5 pm. W roztworze buforowym ewentualnie rozpuszcza się również nośnik farmaceutyczny i uzyskuje się jednorodny roztwór, a w wyniku suszenia rozpyłowego roztworu otrzymuje się poszczególne cząstki zawierające insulinę, bufor stanowiący nośnik oraz jakiekolwiek inne składniki znajdujące się w roztworze. Korzystnym nośnikiem jest węglowodan, sól organiczna, aminokwas, peptyd lub białko, które przy suszeniu rozpyłowym tworzą zasadniczo bezpostaciową strukturę. Bezpostaciowy nośnik, który może być szklisty lub kauczukowaty, zwiększa trwałość insuliny podczas przechowywania. Dogodnie takie stabilizowane preparaty mogą skutecznie uwalniać insulinę do krwioobiegu po przedostaniu się w wyniku wdychania do pęcherzykowych obszarów płuc.

Insulinę w postaci suchego proszku podaje się zazwyczaj, ale nie wyłącznie, w stanie zasadniczo bezpostaciowym, rozproszonąw strumieniu powietrza lub innego fizjologicznie tolerowanego gazu i tworzącą aerozol. Aerozol wychwytuje się w komorze zawierającej ustnik, umożliwiający następnie przeprowadzenie inhalacji przez pacjenta.

Istotę i zalety wynalazku można będzie łatwiej zrozumieć po zapoznaniu się z pozostałą częścią opisu i rysunkami.

Krótki opis rysunków.

Figura 1 przedstawia schematycznie układ do przeprowadzania w stan aerozolu dawki insuliny, zgodnie ze sposobem według wynalazku.

179 443

Figura 2 przedstawia schematycznie pacjenta wdychającego przeprowadzoną w stan aerozolu dawkę insuliny z układu na fig. 1.

Figury 3 A i 3B przedstawiają wykresy ilustrujące wchłanianie zrekombinowanej ludzkiej insuliny przez szczury i uzyskanąreakcję glukozowąpo przeprowadzeniu w stan aerozolu trzech różnych preparatów w' postaci suchych proszków.Każdy punkt reprezentuje wartość średnią dla prób z 3 różnymi szczurami. W czasie 0 uruchamia się generator aerozolu suchego proszku. Przeprowadzenie w stan aerozolu osiąga się w ciągu 5 minut, 14 minut i 20 minut odpowiednio dla proszków 87% insulina/cytrynian, 20% insulina-mannit/cytrynian oraz 20% insulina-rafinoza/cytrynian. Zwierzęta głodzono przez noc.

Figury 4A i 4B przedstawiająwykresy ilustrujące średnie zmiany stężeń insuliny i glukozy w surowicy w funkcji czasu, odpowiednio przy zastosowaniu i podawaniu podskórnym małpom cynomolgus. W przypadku grupy z aerozolem podano wartości średnie dla prób z 3 małpami, a dla grupy z iniekcją podskórną podano wartości średnie dla prób z 4 małpami.

Figura 5A przedstawia wykres ilustrujący zmiany średniego stężenia insuliny w czasie przy iniekcji podskórnej (o) i przy inhalacji (3 wdechy) (·) u ludzi.

Figura 5B przedstawia średnie stężenie glukozy odpowiadające stężeniom insuliny z fig. 5A.

Figura. 6A przedstawia wykres ilustrujący zmiany średniego stężenia insuliny w czasie przy iniekcji podskórnej (o) i przy inhalacji (3 wdechy) (·) u ludzi.

Figura 6B przedstawia średnie stężenie glukozy odpowiadające stężeniom insuliny z fig. 6A.

Figury 7A i 7B przedstawiają porównanie wahań między osobnikami poziomów insuliny (7A) i glukozy (7B) w surowicy przy podawaniu podskórnym (o) i w postaci aerozolu (o).

Figury 8A, 8B i 8C przedstawiają chromatogramy rpHPLC ludzkiej insuliny. Fig. 8A przedstawia chromatogram standardowej insuliny po obróbce w 10 mM w 25°C, według którego ludzka insulina eluuje w momencie 23,87 minuty, a dezamidoinsulina eluuje w momencie 30,47 minuty. Fig. 8B przedstawia podobny chromatogram ludzkiej standardowej insuliny. Fig. 8C przedstawia podobny chromatogram roztworzonego preparatu wysuszonej rozpyłowo insuliny, wytworzonego sposobem według wynalazku.

Figura 9 przedstawia widmo w nadfiolecie preparatu insuliny przed i po suszeniu rozpyłowym. W obszarze widzialnym widma nie zaobserwowano rozproszenia światła, co świadczy o tym, że insulina nie ulega agregacji podczas suszenia rozpyłowego.

Zgodnie z wynalazkiem insulinę stosuje się w postaci suchego proszku. Określenie „suchy proszek” oznacza, że zawartość wilgoci w proszku wynosi poniżej około 10% wagowych, zwykle poniżej około 5% wagowych, a korzystnie poniżej około 3% wagowych. Określenie „proszek” oznacza, że insulinajest w postaci sypkich cząstek o tak dobranej wielkości, aby umożliwić penetrację do pęcherzyków w płucach, to znaczy o wielkości poniżej 7,5 pm, korzystnie poniżej 5 pm, zazwyczaj w zakresie 0,1-5 pm.

Wynalazek jest co najmniej w części oparty na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że insuliny w postaci suchych proszków są łatwo i szybko wchłaniane przez płuca gospodarza. Zaskakujące było to, że insuliny w postaci suchych proszków mogą przedostać się do obszaru pęcherzykowego w płucach, gdyż wiadomo, że rozpuszczalne w wodzie leki, takie jak cząstki insuliny, są higroskopijne. Patrz np. Byron, red., Respiratory Drug Delivery, CRC Press, Boca Raton (1990), str. 150. Zatem można było oczekiwać, że przy przechodzeniu cząstek przez drogi oddechowe płuc (w których wilgotność względna przekracza 99% w 3 7°C) poszczególne cząstki będą wykazywać skłonność do wchłaniania wody i będą rosnąć tak, że osiągną efektywną wielkość ponad 10 pm, stanowiącą górną dopuszczalną granicę wielkości. Gdyby zasadnicza część cząstek insuliny przekroczyła docelowy zakres wielkości, możnaby oczekiwać, że cząstki powinny osadzać się raczej w głównych drogach oddechowych płuc, a nie w obszarze pęcherzykowym, co spowodowałoby ogranicznie doprowadzania, a następnie wchłaniania układowego. Ponadto warstewka płynu na komórkach nabłonkowych w płucach jest bardzo cienka i zazwyczaj stanowi ułamek średnicy cząstek wprowadzanego proszku insuliny. Tak więc przed wynalazkiem nie można było przewidzieć, czy suche cząstki insuliny rozpuszczą się po osadzeniu w obszarze pęcherzykowym płuc. Nieoczekiwanie okazało się, że insulina w postaci suchego

179 443 proszku może zarówno penetrować do obszarów pęcherzykowych płuc, jak i rozpuszczać się po osadzeniu w obszarze pęcherzykowym płuc. Rozpuszczona insulina może następnie przejść przez komórki nabłonka do krwioobiegu.

Obecnie uważa się, że skuteczne wchłanianie insuliny następuje na skutek szybkiego rozpuszczania się w ultracienkiej (<0,1 pm) warstewce płynu wyściółki pęcherzykowej. Średnia wielkość cząstek kompozycji według wynalazku jest 10-50 razy większa od warstewki płynu w płucach, toteż zupełnie nieoczekiwane jest rozpuszczanie się cząstek i szybkie wchłanianie układowe insuliny. W rzeczywistości, jak to przedstawiono w części doświadczalnej, suche preparaty insulinowe według wynalazku mogą zapewniać jeszcze szybciej szczytowego poziomu insuliny i minimalnego poziomu glukozy w surowicy niż iniekcja podskórna stanowiąca obecnie najczęstszą drogę podawania. Jednakże zrozumienie dokładnego mechanizmu niejest niezbędne dla realizacji opisanego wynalazku.

Korzystne kompozycje według wynalazku zasadniczo są wolne od środków wzmagających penetrację. „Środki wzmagające penetrację” sązwiązkami powierzchniowo czynnymi, które ułatwiają penetrację insuliny (lub innych leków) przez błonę śluzową lub wy ściółkę i są proponowane do stosowania w preparatach leków donosowych, doodbytniczych i dopochwowych. Do przykładowych środków wzmagających penetrację należą sole żółciowe, np. taurocholan, glikocholan i dezoksycholan; fusydany, np. taurodehydrofusydan; orazbiokompatybilne detergenty, np. preparaty Tween, Lauterh-9 itp. Stosowanie środków wzmagających penetrację w preparatach do płuc jestjednak z reguły niepożądane, gdyż takie środki powierzchniowo czynne mogą niekorzystnie wpływać na nabłonkową barierę dla krwi w płucach. Nieoczekiwanie stwierdzono, że kompozycje insuliny według wynalazku w postaci suchego proszku są łatwo wchłaniane w płucach bez potrzeby stosowania środków wzmagających penetrację.

Do insulin w postaci suchych proszków nadających się do stosowania zgodnie z wynalazkiem należą insuliny bezpostaciowe, insuliny krystaliczne oraz mieszaniny insulin bezpostaciowych i krystalicznych. Insuliny w postaci suchych proszków korzystnie wytwarza się przez suszenie rozpyłowe w takich warunkach, że uzyskuje się zasadniczo bezpostaciowy proszek o wielkości cząstek w wyżej podanym zakresie. Bezpostaciowe insuliny można także wytwarzać przez liofilizację (suszenie sublimacyjne), suszenie próżniowe lub suszenie przez odparowanie odpowiedniego roztworu insuliny w warunkach zapewniaj ących uzyskanie bezpostaciowej struktury. Wytworzonąw ten sposób bezpostaciowąinsulinę można następnie rozdrobnić lub zemleć w celu uzyskania cząstek o pożądanym zakresie wielkości. Insuliny w postaci krystalicznych suchych proszków można wytwarzać przez rozdrabnianie lub mielenie strumieniowe krystalicznej insuliny w masie. Korzystnym sposobem wytwarzania insulin w postaci proszków składających się z cząstek o pożądanym zakresie wielkości jest suszenie rozpyłowe, w przypadku którego czystą insulinę w masie (zazwyczaj w postaci krystalicznej) najpierw rozpuszcza się fizjologicznie tolerowanym wodnym buforze, zazwyczaj w buforze cytrynianowym o pH w zakresie 2-9. Insulinę rozpuszcza się do uzyskania stężenia 0,01-1 % wagowych, zwykle 0,1 - 0,2%. Roztwory można następnie suszyć rozpylowo w z.wykłych urządzeniach do suszenia rozpyłowego od znanych dostawców, takich jak Buchi, Niro itp., z wytworzeniem zasadniczo bezpostaciowego produktu w postaci cząstek.

Insuliny w postaci suchych proszków mogą zasadniczo zawierać cząstki insuliny o wymaganym zakresie wielkości i mogąbyć zasadniczo wolne odjakichkolwiek biologicznie czynnych składników'·, nośników farmaceutycznych itp. Taki „czysty” preparat może zawierać składniki dodatkowe, takie jak konserwanty, w niewielkich ilościach, wynoszących typowo poniżej 10% wagowych, a zwykle poniżej 5% wagowych. Przy stosowaniu takich czystych preparatów liczbę inhalacji niezbędną do osiągnięcia nawet wysokiej dawki można znacząco zmniejszyć, często do jednorazowego wdechu.

Insuliny w postaci proszków można ewentualnie łączyć z farmaceutycznymi nośnikami lub zaróbkami nadającymi się do podawania przez drogi oddechowe i do płuc. Takie nośniki mogą służyć po prostu jako środki wypełniające, gdy pożądane jest zmniejszenie stężenia insuliny w proszku podawanym pacjentowi, ale mogąteż zwiększyć trwałość kompozycji insuliny i polepszać

179 443 zdolność do tworzenia przez proszek dyspersji w urządzeniu do rozpraszania proszków, aby zapewnić wydajniejsze i powtarzalne dozowanie insuliny, a także poprawiać właściwości ułatwiające manipulowanie insuliną, takie jak sypkość i konsystencja, co ułatwia wytwarzanie i pakowanie proszku.

Odpowiednie substancje stanowiące nośniki mogą być w postaci bezpostaciowego proszku, krystalicznego proszku lub kombinacji bezpostaciowych i krystalicznych proszków-. Do odpowiednich substancji należą, węglowodany, np. monosacharydy, takie jak fluktoza, galaktoza, glukoza, D-mannoza, sorboza itp.; dwusacharydy, takie jak laktoza, trehaloza, celobioza itp.; cyklodekstryny, takie jak 2-hydroksypropylo-|3-cyklodekstryna; oraz polisacharydy, takie jak rafinoza, maltodekstryny, dekstrany itp.; (b) aminokwasy, takie jak glicyna, arginina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, cysteina, lizyna itp.; (c) sole organiczne wytworzone z kwasów organicznych i zasad, takie jak cytrynian sodowy, askorbinian sodowy, glukonian magnezowy, glukonian sodowy, chlorowodorek trometaminy itp.; (d) peptydy i białka, takie jak aspartam, albumina surowicy ludzkiej, żelatyna itp.; (e) alditole, takie jak mannit, ksylit itp. Korzystna grupa nośników obejmuje laktozę, trehalozę, rafinozę, maltodekstryny, glicynę, cytrynian sodowy, chlorowodorek trometaminy, ludzką albuminę surowiczą i mannit.

Takie substancje stanowiące nośniki można łączyć z insuliną przed suszeniem rozpyłowym, np. dodając nośnik do roztworu buforowego przygotowanego do suszenia rozpyłowego. W takim przypadku nośnik będzie powstawać równocześnie z cząstkami insuliny i tworzyć ich część. Zazwyczaj w przypadku gdy nośnik powstaje w wyniku suszenia rozpyłowego wraz z insuliną, zawartość insuliny w każdej cząstce będzie wynosić 5 - 95%, korzystnie 20 - 80%. Resztę cząstki będzie stanowić przede wszystkim substancja stanowiąca nośnik (zazwyczaj w ilości 5 - 95%, często 20 - 80% wagowych), choć będzie ona również zawierać bufor(y) oraz może zawierać inne składniki wymienione powyżej. Stwierdzono, że obecność substancji stanowiącej nośnik w cząstkach doprowadzanych do obszaru pęcherzykowego płuc (np. tych o wymaganym zakresie wielkości poniżej 10 pm) nie zakłóca w znaczący sposób układowego wchłaniania insuliny.

Nośniki można także wytwarzać oddzielnie w postaci suchego proszku, który łączy się z insuliną w postaci suchego proszku przez zmieszanie. Osobno otrzymane nośniki w postaci proszku będą zazwyczaj krystaliczne (aby uniknąć wchłaniania wody), choć w pewnych przypadkach mogą być bezpostaciowe lub mieszane krystaliczno-bezpostaciowe. Wielkość cząstek nośnika można dobrać tak, aby poprawić sypkość insuliny w postaci proszku, a zazwyczaj będzie ona wynosić 25 - 200 pm. Cząstki nośnika o takim zakresie wielkości zazwyczaj nie będąprzenikać do obszaru pęcherzykowego płuc, a często będą oddzielać się od insuliny w urządzeniu dozującym przed wdychaniem. W związku z tym cząstki, które przenikają do obszaru pęcherzykowego płuc, będą zawierać głównie insulinę i bufor. Korzystnym nośnikiem jest krystaliczny mannit o podanym wyżej zakresie wielkości cząstek.

Insulinę w postaci suchego proszku można także łączyć z innymi składnikami czynnymi. Na przykład korzystne może być dodanie niewielkich ilości amyliny lub aktywnych analogów amyliny do insuliny w postaci proszku, aby polepszyć leczenie cukrzycy. Amylina jest hormonem wydzielanym wraz z insulinąprzez komórki β trzustki normalnych (niediabetycznych) osobników. Uważa się, że amylina moduluje aktywność insuliny in vivo, a więc uznano iż równoczesne podawanie amyliny i insuliny może ułatwić regulację poziomu glukozy we krwi. W wyniku połączenia amyliny w postaci suchego proszku z insuliną w kompozycjach według wynalazku uzyskuje się szczególnie dogodny produkt zapewniający takie równoczesne podawanie. Amylinę można dodawać do insuliny w ilości 0,1-10% wagowych (w przeliczeniu na całkowitąilość insuliny w dawce), a korzystnie 0,5 - 2,5% wagowych. Amylinajest dostępna w handlu od takich dostawców jak Amylin Corporation, San Diego, Kalifornia i można ją łatwo wprowadzać do kompozycji według wynalazku. Przykładowo amylinę można rozpuścić w wodzie lub innych odpowiednich roztworach wraz z insuliną i ewentualnie nośnikami, po czym roztwór suszy się rozpyłowo w celu uzyskania produktu w postaci proszku.

179 443

Kompozycja insuliny według wynalazku w postaci suchego proszku korzystnie przeprowadza się w stan aerozolu rozpraszaj ąc je w strumieniu przepływaj ącego powietrza lub innego fizjologicznie tolerowanego gazu w zwykły sposób. Jeden z układów przydatnych do wytwarzania takich zawiesin opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/910 048, opublikowanym jako WO 93/00951. Jak to pokazano na fig. 1, insulinę w postaci suchego, sypkiego proszku wprowadza się do strumienia powietrza lub innego gazu o wysokiej prędkości i uzyskaną dyspersję wprowadza się do komory utrzymującej 10. W komorze utrzymującej 10 znajduje się ustnik 12 na przeciwległym końcu w stosunku do wlotu dyspersji proszku w powietrzu. Objętość komory 10 jest na tyle duża, aby została wyłapana pożądana dawka, przy czym mogą się w niej ewentualnie znajdować przegrody i/lub zawory jednokierunkowe ułatwiające zatrzymanie dyspersj i. Po wychwyceniu dawki insuliny w postaci proszku w komorze 10 pacj ent P (fig. 2) wdycha przez ustnik 12 dyspersję w postaci aerozolu zasysając jądo swoich płuc. Przy wdychaniu przez pacjenta P wpływa powietrze uzupełniające przez otwór wlotowy powietrza 14 ustawiony stycznie, dzięki czemu przepływające powietrze ulega zasadniczo zawirowaniom i wymiata przeprowadzonąw stan aerozolu insulinę z komory do płuc pacjenta. Objętość komory i dawkę przeprowadzoną w stan aerozolu dobiera się tak, aby pacjent mógł całkowicie wciągnąć przeprowadzoną w stan aerozolu dawkę insuliny, a następnie taką ilość powietrza, która zapewni przedostanie się insuliny do dolnych obszarów pęcherzykowych w płucach.

Takie przeprowadzone w stan aerozolu insuliny w postaci proszków są szczególnie przydatne do stosowania zamiast podskórnych iniekcji szybko działającej insuliny przy leczeniu cukrzycy i innych stanów z niedoborem insuliny. Nieoczekiwanie stwierdzono, że podawanie insuliny w postaci suchego proszku przeprowadzonego w stan aerozolu powoduje znacznie szybsze wchłanianie insuliny i reakcję glukozową niż przy iniekcji podskórnej. Tak więc kompozycje według wynalazku będą szczególnie przydatne przy takim sposobie leczenia, gdy pacjent często śledzi poziomy glukozy we krwi i stosuje insulinę w zależności od potrzeb, aby utrzymać docelowe stężenie w surowicy, ale mogąbyć również przydatne wtedy, gdy konieczne jest systematyczne podawanie insuliny. Pacjent może zażyć pożądaną dawkę wdychając odpowiednią ilość insuliny, jak to opisano powyżej. Skuteczność dostarczania insuliny do w opisany sposób będzie zazwyczaj wynosić około 15 - 30%, przy czym pojedyncze dawki (w przeliczeniu na jeden wdech) będą zazwyczaj wynosić 0,5-10 mg. Zazwyczaj całkowita wymagana dawka przy jednorazowym podawaniu przez wdychanie wynosić będzie około 0,,5-15 mg. Oznacza to, że pożądaną dawkę pacjent może uzyskać wykonując 1-4 wdechy.

Wynalazek ilustru_j^^. poniższe przykłady.

Część doświadczalna Materiały i sposoby

Materiały

Krystaliczną ludzką insulinę cynkową, 26,3 U/mg (Lilly, partia nr 784KK2) otrzymano z Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN. Jej czystość oznaczona metodąrpHPLC wynosiła > 99%. Mannit USP otrzymano z Roquette Corporation (Gumee, IL. Rafmozę otrzymano z Pfanstiehl Laboratories (Waukagen IL). Dihydrat cytrynianu sodowego USP, ACS i monohydrat kwasu cytrynowego USP otrzymano z J. T. Baker (Phillipsburg, NJ).

Wytwarzanie proszku

Insulinę w postaci proszków otrzymano rozpuszczając krystalicznąinsulinę w buforze, cytrynianie sodowym zawierającym zaróbkę (mannit, rafmozę lub bez nich) do uzyskania ostatecznego stężenia substancji stałych 7,5 mg/ml i pH 6,7 ± 0,3. Suszarka rozpyłowa pracowała przy temperaturze na wlocie 110-120°C przy szybkości podawania cieczy 5 ml/minutę, tak że temperatura na wylocie wynosiła 70 - 80°C. Roztwory sączono przez filtr 0,22 pm i suszono rozpyłowo w suszarce rozpyłowej Buchi z wytworzeniem drobnego, białego, bezpostaciowego proszku. Uzyskane proszki przechowywano w szczelnie zamkniętych pojemnikach, w suchej atmosferze (<10% wilgotności względnej).

179 443

Analizy proszku

Rozkład wielkości cząstek w proszkach oznaczano na drodze wirowania sedymentacyjnego cieczy w aparacie Horiba CAPA-700 Particle Size Analyzer po zdyspergowaniu proszków w środku Sedisperse A-11 (Micrometrics, Norcross, GA). Zawartość wilgoci w proszkach oznaczono metodą Karla Fischera w mierniku wilgoci Mitssubischi CA-06.

Brak zmian w insulinie w wyniku przeróbki na proszek określano względem wzorca w postaci ludzkiej insuliny rozpuszczając odważonąporcję proszku w wodzie destylowanej i porównuj ąc uzyskany roztwór z wyj ściowym roztworem wprowadzanym do suszarki rozpyłowej. Czas retencji i powierzchnię piku w rpHPLC wykorzystywano do ustalania, czy w czasie obróbki cząsteczka insuliny została chemicznie zmodyfikowana lub uległa degradacji. Absorbancję UV stosowano do określania stężenia insuliny (przy 278 nm) oraz obecności lub nieobecności nierozpuszczalnych agregatów (przy 400 nm). Mierzono także pH roztworu wyjściowego i roztworu po roztworzeniu proszku. Bezpostaciowy charakter proszku insuliny potwierdziła mikroskopia w świetle spolaryzowanym.

Działanie aerozolu na szczury

Doświadczenia ze szczurami prowadzono w pomieszczeniu do ekspozycji aerozolowej. Zwierzęta (21 - 24/doświadczenie) umieszczano w rurach z pleksiglasu i wstawiano do komory ekspozycji aerozolowej tylko w stosunku do nosa, z 48 otworami (In-Tox Products, Albuquerque, NM). W strefie oddychania utrzymywano przepływ powietrza 7,2 - 8,9 litra/minutę, usuwając powietrze zapomocąpróżni, tak że w komorze panowało nieznaczne podciśnienie (~150 Pa) mierzone za pomocą przyrządu magnetohelowego. Czas ekspozycji aerozolowej wynosił 5-20 minut w zależności od ilości proszku wprowadzonego do komory. Proszki wsypywano ręcznie do małej dyszy Venturiego, która rozpylała cząstki proszku tworząc chrumę aerozolu. Dysza Venturiego pracowała pod nadciśnieniem 103,5 kPa, a przepływ powietrza nastawiono na 7,2 9,8 litra/minutę. Dysza Venturiego była przymocowana do dna komory dyspersyjnej z przezroczystego pleksiglasu (750 ml), z której aerozol przechodził bezpośrednio do komory ekspozycji aerozolowej tylko w stosunku do nosa.

Kalibracja komory aerozolowej dla szczurów

Stężenie proszku w strefie oddychania oznaczano zbierając w strefie oddychania przy różnych czasach ekspozycji szereg próbek na filtrach, stosując uchwyt do filtrów In-Tox przy przepływie podciśnieniowym 2 litry/minutę. Komorę kalibrowano zarówno ze zwierzętami, jak i pustą. Masę proszku oznaczano grawimetrycznie. Wielkość cząstek proszku w strefie oddychania oznaczano za pomocą impaktora kaskadowego (IN Tox Products) umieszczonego w otworze oddechowym i działającego przy przepływie 2 litry/minutę. Masę proszku w każdym stadium oznaczano grawimetrycznie.

Każdy test z proszkiem wykonywano na 21 - 24 szczurach przy czasie ekspozycji 5-20 minut. Po 3 szczury uśmiercano w czasie, 0, a następnie po ~7,15,30,60,90,120,180 i 240 minutach od zakończenia ekspozycji aerozolowej. Zwierzęta znieczulano, otwierano ich brzuchy i pobierano dużąporcję krwi z aorty brzusznej. Następnie zwierzęta uśmiercano przez przemieszczenie kręgów szyjnych.

Krew pozostawiano do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej na 30 minut, po czym poddawano wirowaniu przez 20 minut z szybkością 3 500 obrotów/minutę w probówkach do oddzielania surowicy. Surowicę analizowano natychmiast lub zamrażano w -80°C aż do wykonywania analiz. Możliwie jak najszybciej (0-7 minut) po zakończeniu wprowadzania aerozolu 3 szczury uśmiercano, pobierano krew, a płuca przemywano 6 porcjami po 5 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS). Ilość insuliny w ostatecznej uśrednionej próbce z przemywania przyjmowano za dawkę aerozolu dla szczura w obliczeniach biodostępności.

Układ ekspozycji ssaków naczelnych

Młode, schwytane na wolności samce małp cynomolgus, szczep Macacafascicularis (2 - 5 kg) (Charles River Primates, Inc.) zastosowano w badaniach aerozolu na naczelnych (3-4 zwierzęta w grupie). Zwierzętom wstrzykiwano podskórnie Humulin (Eli Lilly, Indianapolis, IN) lub eksponowano na aerozol zawierający insulinę w postaci proszku. Każde zwierzę umieszczano w

179 443 jednostce do ekspozycji samej głowy tak, aby zapewnić dostarczanie świeżej porcji badanej atmosfery przy odpowiedniej szybkości przepływu (7 litrów/minutę), zapewniające minimalne zapotrzebowanie zwierzęcia na tlen. Zwierzęta unieruchamiano w krzesło-podobnym aparacie, w którym umieszczano je w pozycji siedzącej, skierowane do góry. Pomieszczenia były przezroczyste, aby małpy całkowicie widziały swe otoczenie. Założony na stałe cewnik umieszczano w nodze tak, że w dowolnym momencie można było pobierać próbki krwi. Przez cały czas doświadczenia zwierzęta były przytomne i zachowywały spokój. Krew zwierząt naczelnych badano tak samo jak w przypadku szczura (patrz wyżej).

Układ do ekspozycji aerozolowej naczelnych obejmował monitor oddychania umożliwiający ilościowe oznaczenie powietrza wdychanego przez każdą małpkę. Wielkość ta w połączeniu ze zmierzonym stężeniem insuliny we wdychanym powietrzu umożliwiała dokładne obliczenie ilości insuliny wciągniętej przez każde zwierzę.

Testy na ludziach

Insulinę podawano 24 zdrowym osobnikom podskórnie lub poprzez wdychanie insuliny w postaci suchych proszków przeprowadzonych w stan aerozolu. Każda dawka podawana drogą iniekcji podskórnej zawierała 10,4 U Humulin R, 100 U/ml (Eli Lilly, Indianapolis, Indiana). Insulinę w postaci bezpostaciowych suchych proszków otrzymano przez suszenie rozpyłowe w sposób opisany powyżej z 20% wag. mannitu jako zaróbkę. Dawki (5 mg) insuliny w postaci suchego proszku rozpraszano w strumieniu powietrza o dużej prędkości z wytworzeniem subtelnego aerozolu, który wychwytywano w komorze. Każdy osobnik wdychał zawierający proszek aerozol biorąc powolny, głęboki oddech przy każdej porcji aerozolu czyli „wdech”. Proszek podawano w 3 wdechach (łączna dawka 31,9 U). Zmiany w czasie poziomów insuliny i glukozy w surowicy oznaczano w sposób podany poniżej.

Badania surowicy

Poziom insuliny w surowicy szczurów, naczelnych i ludzi oznaczano stosując zestawy do testów radioummunologicznych Coat-A-Count dla ludzkiej insuliny (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA). Dla każdej partii próbek wykonywano krzywe wzorcowe. Czułość testu wynosiła około 43 pg/ml. Wariancja wewnątrztestowa (%CV) wynosiła<5%. Testy glukozowe wykonywano w California Veterinary Diagnostics, Inc. w West Sacramento, Ca, z użyciem zestawu Glucose/HK Reagent System Pack w analizatorze Boehringer Mannheim/Hitachi 747 Analyzer. Wariancja wewnątrztestowa (%CV) wynosiła <3%.

W doświadczeniach na szczurach względnąbiodostępność aerozolu obliczano porównuj ąc dostosowaną do dawki powierzchnię dla immunoreaktywnej insuliny (IRI) pod krzywą (AUC) zmiany stężenia w czasie z wielkością uzyskaną przy iniekcji podskórnej. W przypadku szczurów całkowitą masę wymytej insuliny przyjmowano jako dawkę aerozolu. Część insuliny wchłoniętą przed płucami można było wymyć, tak więc dawka oszacowana w taki sposób była prawdopodobnie nieznacznie niedoszacowana w stosunku do całkowitej osadzonej dawki. Nie dokonywano korekty związanej z tym założonym ubytkiem.

W doświadczeniach na małpach względnąbiodostępność obliczano w podobny sposób jak dla szczurów, z tym że zamiast ilości insuliny wymytej z płuc jako dawki aerozolu uwzględniano całkowitą wciągniętą ilość insuliny. W przypadku szczurów tylko materiał osadzony w płucach, bez uwzględnienia insuliny osadzonej w kanałach nosowych i gardle, przyjmowano do szacowania dawki. W przypadku małp całą ilość insuliny wchłoniętą przez zwierzęta przyjmowano przy szacowaniu dawki.

Wyniki wchłaniania insuliny przez szczury.

Wszystkie próbki insuliny w postaci proszków stosowane w badaniach na zwierzętach zawierały cząstki o wielkości (masowa mediana średnicy) w zakresie 1-3 pm, przy wilgotności <3%. Czystość insuliny w proszkach oznaczona metodąrpHPLC wynosiła>97%. Reprezentatywne chromatogramy dla 20% preparatu insuliny pokazano na fig. 8C. Z proszków po roztwarzaniu czystą wodą uzyskiwano klarowny roztwór o absorbancji UV <0,01 przy 400 nm, pH 6,7 ± 0,3. Reprezentatywne widma w nadfiolecie (UV) dla 20% preparatu insuliny pokazano na fig. 9.

179 443

Następujące 3 preparaty insuliny w postaci proszku przebadano na szczurachjako aerozole w komorze ekspozycji In-Tox z 48 otworami.

1. 87,9% insuliny, 11,5% cytrynianu sodowego, 0,6% kwasu cytrynowego.

2. 20% insuliny, 66% mannitu, 12,4% cytrynianu sodowego, 0,6% kwasu cytrynowego.

3. 20% insuliny, 66% rafinozy, 12,4% cytrynianu sodowego, 0,6% kwasu cytrynowego.

W tabeli 1 zestawiono podstawowe pomiary w 3 różnych ekspozycjach szczurów, obejmujące charakterystykę aerozolu w strefie oddychania i w warunkach w komorze roboczej. Udział proszku wprowadzonego do dyszy Venturiego, który dochodził do stref oddychania szczurów wynosił 34 - 67% z uwagi na straty na ściankach w wyniku zderzeń lub niepełnej dyspersji proszku podczas podawania. Jednakże wielkość cząstek aerozolu w strefie oddychania była idealna do osadzania w płucach (1,3 -1,9 pm) i nieco niższa od wielkości cząstek w wyjściowym preparacie (2,0 - 2,8 pm) z uwagi na selektywny ubytek większych cząstek w komorze ekspozycji zwierzęcia.

T abela 1

Pomiary ekspozycji aerozolowej dla szczurów

	88% Insulina	20% Insulinamannit	20% Insulina-rafinoza
1	2	3	4
Szybkość przepływu w komorze	7,2 l/min.	9,6 l/min.	9,8 l/min.
Masowa mediana średnicy proszku (MMD)	2,2 pm	2,8 pm	2,0 pm
Proszek wprowadzony do komory	70 mg	255 mg	260 mg
Czas podawania proszku	5 minut	14 minut	20 minut
Proszek w strefie oddychania	40 mg	171 mg	88 mg
Insulina w strefie oddychania	35 mg	34 mg	18 mg
% Całość proszku w stefie oddychania	57%	67%	34%
Masowa aerodynamiczna mediana średnicy (MAD)	1,1 mg/litr	1,3 mg/litr	0,45 mg/litr
Wielkość cząstek w strefie oddychania	1,4 pm	1,9 pm	1,3 pm
Insulina odzyskana przy przemywaniu	30,7 ± 2 pg	12,7 ± 6,9 pg	31,6 ± 12,9 pg
AUC insuliny w surowicy (ng. min./ml)	104	201	150

W tabeli 2 przedstawiono wyniki oznaczeń poziomu insuliny i glukozy w surowicy szczura dla 3 aerozoli i jednej iniekcji podskórnej (SC). Na fig. 3 A i 3B przedstawiono krzywe zależności stężenia imunoreaktywnej insuliny (IRI) w surowicy od czasu oraz krzywe zależności stężenia glukozy w surowicy od czasu dla 3 preparatów podawanych w postaci aerozolu. W tabeli 3 przedstawiono tmaj insuliny i tm glukozy w różnych próbach oraz względnąbiodostępność aerozolu w porównaniu z iniekcją podskórną.

179 443

Tabela 2

Wyniki oznaczeń insuliny i glukozy w surowicy szczura

Preparat	Podawanie	Czas (min).	Insulina w surowicy (pg/ml ± 1 S.D.) n=3 szczury/punkt czasowy	Glukoza w surowicy (mg/dl ± 1 S.D.) n=3 szczury/punkt czasowy-
1	2	3	4	5
88% Insulina	aerozol	0	230±184	106±12
(Ekspozycja aerozolu zakończona w minucie 5)	aerozol	12	1020±312	114±10
aerozol	21	165±768	81±10
aerozol	36	876±764	66±7
Średnia dawka 31= pg/szczura	aerozol	66	684±416	62±15
aerozol	96	568±128	65±10
aerozol	126	564±260	73±11
aerozol	186	712±140	93±5
20% Insulina-mannit	aerozol	0	476±56	165±18
(Ekspozycja aerozolu zakończona w minucie 14)	aerozol	22	1476±428	117±15
aerozol	35	2480±892	101±19
aerozol	57	1204±64	64±13
Średnia dawka = 13 pg/szczura	aerozol	87	1084±396	63±17
aerozol	117	664±180	105±38
aerozol	147	1228±416	108±22
aerozol	207	676±100	119±33
20% Insulina-rafinoza	aerozol	0	426±97	157±37
	aerozol	27	2948±2816	139±46
(Ekspozycja aerozolu zakończona w minucie 20)	aerozol	42	1504±592	181±11
aerozol	57	1272±496	124±45
aerozol	87	852±164	128±17
Średnia dawka = 30 pg/szczura	aerozol	117	604±156	124±9
aerozol	147	532±172	172±12
aerozl	207	556±100	218±34
20% Insulina-mannit	podskórnie	0	360±140	107±5
Dawka = 30 pg insuliny/szczura	podskórnie	15	14200±3160	52±2
podskórnie	30	10160±720	24±5
podskórnie	60	11000±1080	28±6
podskórnie	90	2440±1160	25±7
podskórnie	120	3520-±840	49±3
podksórnie	180	1280±800	40±17
podskórnie	240	400±260	77±34

179 443

Tabela 3

Porównanie insuliny podawanej zwierzętom w aerozolu i podskórnie (SC)

	Szczur SC	Szczur Aerozol 88% insulina	Szczur Aerozol 20% insulina mannit	Szczur Aerozol 20% insulina sulinarafinoza	Małpa SC	Małpa Aerozol 20% insulina mannit
* Insulina max	15 min.	16 min.	21 min.	17 min.	15 min.	30 min.
* Glukoza min.	30 min.	31 min.	43 min.	37 min.	45 min.	45 min.
Spadek glukozy	77%	42%	62%	21%	45%	73%
Względna biodostępność	100%	10%‘*	44%‘*	14%**	100%	12%***

*

Czasy mierzone od zakończenia okresu ekspozycji aerozolu

Glukoza min = czas do zmniejszenia do >85% wielkości maksymalnej zaobserwowej w badaniu **

Na podstawie insuliny odzyskanej przy przemywaniu płuc po zakończeniu ekspozycji aerozolowej ***

Na podstawie wciągniętej insuliny, włącznie ze stratami w kanałach nosowych i gardle

Wszystkie 3 preparaty dostarczajjąszybko wchłaniającej się insuliny do układu krwioobiegu szczura (fig. 3A i 3B). Biodostępność i reakcja glukozowa były wyższe dla proszku 20% insulina/mannit (tabela 3), jednak bez przeprowadzenia wielu powtórnych doświadczeń nie można mieć pewności, że różnica jest znacząca.

Wyniki dla ssaków naczelnych

Dawkę identyczną jak w przypadku ludzi (0,2 U/kg - 27 pg/małpę) wstrzyknięto 4 małpom dla uzyskania danych po podaniu podskórnym, które porównano z wynikami dla aerozolu (fig. 4A i 4B). W tabeli 4 przedstawiono wyniki ekspozycji aerozolowej małp. W tabeli 5 podano średnie poziomy insuliny i glukozy dla ekspozycji aerozolowej i podawania podskórnego. Dawka aerozolowa zapewnia silną reakcję insulino wąi glukozową (wysoka dawka). Na figurze 4 porównano krzywe średniego poziomu insuliny w surowicy dla dwóch testów aerozolowych i jednego testu podskórnego. Na podstawie pól pod tymi krzywymi (AUC) obliczono, że względna biodostępność insuliny w postaci aerozolu wynosi 12%.

Tabela 4

Dane ekspozycji aerozolowej małp

Zwierzę	nr 1, 23-46	nr 2, 23-48	nr 3, 122-55
Masa filtru (mg)	1,07	1,01	0,97
Średnie stężenie aerozolu (pg/litr)	178	168	162
Wciągnięta objętość (litry)	8,96	19,98	14,68
Oszacowana masa wciągniętego aerozolu (pg)	1597	3363	2373
Oszacowana masa wciągniętej insuliny (pg)	320	673	475	489±178
Waga ciała (kg)	3,92	3,81	4,1
Oszacowana dawka insuliny (ng/kg)	81,5	176,6	115,7
AUC (ng min./ml)	347	1196	739

179 443

Wyniki dla ludzi

Porównawcze wyniki dla podawania przez wdychanie i iniekcji podskórnej przedstawiono poniżej w tabeli 5. Przy podawaniu aerozolu przez wdychanie uzyskano szybsze wchłanianie (szczyt po 20 minutach) niż po iniekcji (szczyt po 60 minutach) z szybsząreakcją glukozową (dolina po 60 minutach) niż przy iniekcji (dolina po 90 minutach). Powtarzalność była równie dobra, a nawet lepsza w przypadku aerozolu niż przy iniekcji, zarówno dla reakcj i insulinowej, jak i glukozowej. Dawki iniekcyjne dobrano dokładnie w zależności od wagi; w przypadku aerozoli nie dokonywano tego. Aktywność biologiczna insuliny aerozolowej na podstawie reakcji glukozowej , w stosunku do iniekcji, wynosiła 28 - 36%. Biodostępność insuliny aerozolowej, na podstawie pola pod krzywą (AUC) insuliny, w stosunku do iniekcji, wynosiła 22,8% przy 3 wdechach.

Tabela 5

Wyniki oznaczeń insuliny i glukozy w surowicy ludzi Insulina

Osobnik nr	Dawka/iniekcję lub pojemnik	Dawka na osobę*	Wzrost poziomu insuliny w surowicy pU/ml	Czas maksimum	Względna biodostępność na podstawie AUC insuliny
1-24 (iniekcja SC)	10,4 U	10,4 U	5,8-20,9	60 min.	100,0%
7-24 (3 wdechy)	76,0 U	31,9 U	6,1-28,5	20 min.	22,8%

Glukoza

Osobnik nr	Spadek średniego poziomu glukozy w surowicy mg/dl	Spadek mg/dl	Czas do minimum	%SC	Względna biodostępność w oparciu o spadek glukozy
1-24 (iniekcja SC)	93,6-64,.9	28,7	90 min.	100%	100%
7-24 (3 wdechy)	91,8-67,6	24,2	60 min.	84,3%	27,4%

Aparat Eff = 42%

Wyniki testów na ludziach pokazano również na fig. 5A-5B. Na figurze 5A przedstawiono średni poziom insuliny w surowicy w czasie dla iniekcji podskórnej (o) i inhalacji (3 wdechy, ·). Podobnie średnie poziomy glukozy w surowicy przedstawiono na figurach 5B. Piki insuliny i doliny glukozy pokazano odpowiednio na figurach 6A i 6B, a zmienność między osobami poziomu insuliny i glukozy w surowicy przedstawiono odpowiednio na figurach 7A i 7B.

Na dodatek płytkie wdychanie (falowanie oddechu) małp podczas ekspozycji aerozolowych nie stanowiło optymalnego sposobu wdychania dla głębokiego osadzania w płucach. Zgodnie z oczekiwaniem większą biodostępność zaobserwowano u ludzi (tabela 5), którzy stosują optymalne wdychanie, a porcję aerozolu wciągają w wyniku wdychania przez usta, a nie przez nos.

Jakkolwiek powyższy wynalazek został opisany z pewnymi szczegółami poprzez zilustrowanie i przykłady dlajasności i zrozumienia, oczywiste jest, że można dokonać pewnych zmian i modyfikacji w zakresie załączonych zastrzeżeń.

179 443

FIG. 9

179 443

Flir <5B

Fl(=?8C

179 443

FIG 7A

FIG 7B

179 443

Minuty

FIG. 6A

Minuty

FIG. 6B

179 443

Glukoza w surowicy (mg/dl) Insulina w surowicy (pU/ml)

FIG. 5A

Minuty

FIG. 5B

179 443

Insulina w surowicy (pQ/lTll)

FIG 4A

FIG 4B

179 443

FIG. JA

FIG. JB

179 443

FIG 1

Powietrze uzupełniające

FIG. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja insuliny do podawania do płuc, znamienna tym, że zawiera insulinę w postaci suchego proszku o średniej wielkości cząstek poniżej 7,5 pm i ewentualnie nośnik farmaceutyczny.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera poszczególne cząstki zawierające insulinę w ilości 5 - 99% wagowych w nośniku farmaceutycznym.
3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest wolna od środków wzmagających penetrację.
4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako nośnik farmaceutyczny zawiera węglowodan wybrany z grupy obejmującej mannit, rafinozę, laktozę, maltodekstrynę i trehalozę.
5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako nośnik farmaceutyczny zawiera sól organiczną wybraną z grupy obejmującej cytrynian sodowy, glukonian sodowy i askorbinian sodowy.
6. Sposób wytwarzania kompozycj i insuliny do podawania do płuc, znamienny tym, że w wodnym roztworze buforowym rozpuszcza się insulinę i ewentualnie nośnik farmaceutyczny, po czym uzyskany roztwór suszy się rozpyłowo z wytworzeniem cząstek o średniej wielkości poniżej 7,5 pm.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że suszy się roztwór zawierający 5 - 99% wagowych insuliny i 95 - 1%o wagowych nośnika farmaceutycznego w przeliczeniu na suchą masę kompozycji.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako nośnik farmaceutyczny stosuje się węglowodan, sól organiczną, aminokwas, peptyd lub białko.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się węglowodan wybrany z grupy obejmującej mannit, rafinozę, laktozę, maltodekstrynę i trehalozę.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się sól organiczną wybraną z grupy obejmującej cytrynian sodowy, octan sodowy i askorbinian sodowy.
11. Sposób wytwarzania dawki insuliny w postaci aerozolu do podawania do płuc, znamienny tym, że dawkę insuliny w postaci suchego proszku zawierającego cząstki o średniej wielkości poniżej 7,5 pm i ewentualnie nośnik farmaceutyczny dysperguje się w strumieniu gazu, a powstały aerozol wychwytuje się w komorze przystosowanej do inhalacji doustnej.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się dawkę insuliny zawartej w ilości około 5 - 99% wagowych w nośniku w postaci suchego proszku.
13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że stosuje się dawkę insuliny wolnej od środków wzmagających penetrację.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako nośnik w postaci proszku stosuje się węglowodan, sól organiczną, aminokwas, peptyd lub białko.
15. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że stosuj e się dawkę insuliny w postaci suchego proszku zawierającego cząstki o średniej wielkości 0,1-5 pm.