JPH0779694B2 - 蛋白質および同類品の保護 - Google Patents

蛋白質および同類品の保護

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JPH0779694B2 JP61503940A JP50394086A JPH0779694B2 JP H0779694 B2 JPH0779694 B2 JP H0779694B2 JP 61503940 A JP61503940 A JP 61503940A JP 50394086 A JP50394086 A JP 50394086A JP H0779694 B2 JPH0779694 B2 JP H0779694B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質および他の巨大分子の乾燥時の変質（de
naturing）を保護することに関する。
高分子化合物、とくに蛋白質およびポリペプチド含有化
合物（polypeptide-containing compounds）は、普通一
般に第３次構造（tertiary structure）として知られて
いる複雑な３次元折畳み立体配座（three-dementional
folded conformations）の形状をもった自然に発生した
水和状態で存在する。しばしば化合物は、酵素（enzym
e）、抗体（antibody）、抗原（antigen）、調味料（fl
avourant）、蛍光体（fluorescent）、ゲル化剤（gelli
ng agent）等、いずれであろうとその活性度は、第３次
構造に極めてよく依存し、たとえ化合物の化学実験式が
変わらないとしても、構造が邪魔されると極度に減少す
るかまた排除されさえもする。これは蛋白質などが貯蔵
等用に乾燥状態におかれる時には、非常に大事な問題で
ある。
この問題に打勝つため、色々の解決策が提案されてき
た。乾燥免疫試験（dryimmunoassay）キット用酵素は脂
肪体（lipsomes）中に保護されてきた。ワクチンは容易
に凍結乾燥状態で保存することは出来なかった、そこで
かさばったアンプルに保存された。免疫試験技術におい
て使用されるフィコビリン蛋白質（phycobiliprotain
s）のような蛍光蛋白質はもし乾燥すれば蛍光能力を失
い、そこで乾燥キットでは使用できない。さらにもう一
つの見本は樹脂基材に結合しまた乾燥されているモノク
ロナール（monoclonal）抗体の抗原結合能力の喪失であ
る。
そこでこの様な物質を乾燥時の脱活性化からまもる方法
が切望されている。我々は今や、トレハローズの存在下
で化合物を乾燥することによって、この目的を達成する
ことが出来ることがわかった。
トレハローズ（trehalose）、α−Ｄ−グルコピラノシ
ル（glucopyranosyl）−α−Ｄ−グルコ−ピラノシド
（glucopranoside）、は予て細胞保護と関連している必
然的に現れる非還元ジサッカリド（non-reducing disac
charide）である。植物および動物両方ともある種の有
機物は、大気の乾燥した条件のなかで体内の水分を極め
て低い水準まで乾燥作用に耐えることが出来ることが知
られている。これらの有機物は、塩水シュリンプ包嚢
（Artimia salina）、ふつか草（Selaginella lepidoph
ylla）およびパンイースト（Saccharomyces cerevisia
e）をふくんでいる。一般的特徴として、それ等はいず
れも細胞中に大量のトレハローズを持っている。
作用の本質は、凍結および脱水の間、細胞膜の安定化へ
のトレハローズをふくむ各種の水和炭化物（carbohydra
tes）の効果にある。この働きはトレハローズが他の水
和炭化物にくらべて、細胞状の有機物を結合水の喪失と
いう有害な結果から保護するのに非常にすぐれているこ
とを示している。
（Crowe,J.H.,Crowe,L.M.and Mouradian R.（1983）Cry
obiology 20,346,356; Crowe,J.H.,Crowe,L.M.and Chapman D.（1984）Archive
s Biochem.Biophysics 232,400-497;および Crowe L.M.,Mouradian R,Crowe J.H.,Jackson S.A and
Womersley C.（1984）．Biochimia & Biophysica Acta7
69,141〜150.） トレハローズは細胞にどんな風に保護効果を及ぼすかに
関して一致した意見はないが、一つの仮説は、トレハロ
ーズが生きている有機体の膜成分の結合水の代替とな
り、結合（構造）水の喪失による変質を妨げることであ
る。効果が生きている細胞においてだけでなく、驚くべ
きことには、精製された分離された状態の高分子自身に
も示されることを我々は今や見出だした。
EP140489A（和光純薬工業）は糖類の溶液中に、時には
牛血清アルブミン（borine serum albumin）のような蛋
白質と一緒に、浸せきすることによって周囲の温度での
乾燥に対して安定化されたキャリヤー例えば硝子ビーズ
の上の免疫活性物質例えば抗体を開示している。かなり
の多くの糖類が使用されると述べられている（リボーズ
（ribose）、グルコーズ（glucose）、フラクトーズ（f
ructose）、マンノーズ（mannose）、ガラクトーズ（ga
lactose）、マルトーズ（maltose）、ラクトーズ（lact
ose）、サッカローズ（sucrose）、オリゴサッカリド
（oligosaccharide）、およびポリサッカリド（polysac
charide））；好ましくはラクトーズ、サッカローズま
たはデキシトリン（dextrine）溶液。しかしながら、ト
レハローズについては言及されていない。
特許公開GB 2009198（Ａ）（Behringwerk AG）は髄膜球
菌（meningococcal）によって出来たポリサッカリドお
よびトレハローズの凍結真空乾燥（lyophilisation）を
開示している；英国特許公開GB 2126588A（旭化成KKK）
は非イオン界面活性剤またはトレハローズ（または他の
糖類）のどちらかを含むことによって凍結真空乾燥およ
び凍結に対する腫よう壊死ファクター（tumor necrosis
factor）の安定化を開示している；また公表された日
本特許出願J 58074696A（Iatron Iaboratories）はトレ
ハローズの存在下におけるATPの凍結乾燥（凍結真空乾
燥）を開示している。
これら三つの刊行物はトレハローズが冷凍乾燥されてい
る間、敏感な材料を安定化するであろう事を開示してい
ることが注目されよう。凍結乾燥（冷凍真空乾燥）は一
つの技術として、ある敏感な材料を加工できる只一つの
方法であるとして案出された。周囲または上昇温度にお
ける及び大気または減圧下の通常の乾燥は、極めて多く
のこのような物質の、敏感な蛋白質等が周囲温度で乾燥
出来ないおよび乾燥してはいけないという生物学上の分
野における言説外（without saying）で行われた物がい
つもそうであったように、不可逆的な劣化を引起こし
た。冷凍乾燥では、水は固体材料から高真空で取去られ
る。この方法で蛋白質の液膜変性、熱不安定等の問題が
回避された。トレハローズは周囲温度37〜40℃で乾燥間
完全な保護をあたえるだけでなく、蛍光性や光伝導性の
ような分子内電子的プロセスも乾燥状態でおこさせると
いうことは、以前には実現されていなかった。
本発明により、我々は蛋白質または同類品を含有する水
からなるシステムをトレハローズの存在下で乾燥させる
ことにより、乾燥時に蛋白質および他の高分子を変性か
ら保護する方法を与えるものである。トレハローズは便
利なように水からなる系に溶解されている、またいかな
る有効量にもすることが出来る。一般にトレハローズを
重量で0.05〜20％の濃度が好ましい、とくに重量で約0.
1〜10％，例えば約2.5％がより好ましい。
本乾燥工程は、適当な面、例えば硝子ないしプラスチッ
ク板、または皿、プラスチック又はニトロセルローズの
フィルム、または紙のような多孔性の支持体の上にある
蛋白質とトレハローズを含む水からなる系を単なる空気
乾燥することによって成し遂げられる。乾燥は好ましく
は大気圧で行われる。
乾燥されている製品におけるトレハローズの存在は、問
題が起こるのは明らかに希な場合（例えばトレハローズ
劣化酵素の保護）であるが、高分子物質の物理化学的な
いし生物学上の性質に何等影響を及ぼす事がない。他の
酵素、抗体、抗原および蛍光性マーカーの場合には、な
んら問題は起こらないし、化合物はあたかも水和状態に
保管されてきたように活性である。
多数の酵素が今や各種試験手順に用いられ、ないしは自
身各種検査（assays）で試験される。本発明によれば、
酵素または酵素を含む物質は乾燥し保管する事ができ
る、また必要な時には水またはバッファー液を添加する
ことにより再び活性化される。例えば、パーオキシダー
ゼ（peroxidase）（例えば、わさび大根（horseradis
h）から）およびアルカリホスファターゼ（alkaline ph
osphatase）（ほ乳動物）はこの方法で保存することが
出来る。血清中に見出だされる酵素の複合“カスケード
（cascade）”、これは抗体−抗原結合により免疫応答
において活性化されている（P.J.LachmanおよびM.J.Hob
ert,“Handbook of Experimental Immunology"ed.D.M.W
eir,Blackwell 1978）が、周知のように化学変化を起こ
しやすい。血清自身は約70〜75mg/mlの蛋白質を含み、
そのうち約2mg/mlだけが補体（complement）部分を含ん
でいる。補体含有血清（又はそれから取出された精製補
体部分）は乾燥することが出来ない、極めて低温条件
（−70〜196℃）で保管されねばならない。凍結乾燥す
ることはできるが、この技術は活性度をいくらか破壊す
る。それゆえ、例えば凍結真空乾燥された補体はリンパ
球（lymphocyte）細胞毒性検査には使うことが出来な
い。最も驚くべきことには、我々は、補体活性度が本発
明にしたがって室温で大気中で乾燥することにより完全
に保存することが出来ることを見出だした。乾燥された
材料は37℃で数週間も貯蔵することが出来、また活性度
を保ったまま再構成することが出来る。
血清試料中の必要とされるトレハローズの量は普通は蛋
白質の含有量に比例する。例えば、50重量％の血清水溶
液は少なくとも0.22Mのトレハローズ（即ち約75g/l）を
必要とし一方25％溶液では少なくとも0.15Mのトレハロ
ーズ（即ち約51g/l）を補体保護用に必要とする。他の
血清成分例えば血清抗体は必要量はかなり少ない。一般
に、それゆえ、トレハローズの蛋白質（または他の高分
子）に対する重量比は少なくとも1.4:1で、好ましくは
少なくとも2:1で、さらに好ましくは3:1が適当であり、
例えば10:1までである。
血清と血清補体、抗体、および抗原の保存は、本発明に
従えば多くのタイプのワクチンをトレハローズの存在の
もとに乾燥することにより保存がまた可能であることを
意味している。抗血清（antisera）は色々の毒性条件を
処理するのに用いられる、また殺された微生物をふくむ
免疫ワクチンが広く用いられている。両方のタイプのワ
クチンとも低温で水和条件でまたは深い冷凍条件での貯
蔵を必要とする。乾燥ワクチンは今や本発明の技術によ
り可能になった。
貯蔵と保存についてのもう一つ問題がアガローズゲルの
分野で生じた。多くの生化学技術でアガローズゲルは基
質として、例えば、電気泳動（electrophoresis）、オ
ケテルロニー拡散（ouchterlony diffusion）、免疫電
気泳動（immuno-electrophoresis）などに用いられる。
１〜３％のゲルは広くこれらの技術で分離媒質として用
いられている。現在、固体アガローズをバッファー中で
溶解するまで加熱することにより各実験用に研究室で新
鮮にしなければならない、次に溶融したアガローズを型
に流し込みアガローズをゲルに冷却する。予備成型され
たゲルは加湿した容器の中で比較的短期間貯蔵すること
だけが出来る。もし乾燥されるとゲルはゲル構造の不可
逆的な崩壊をうけて水またはバッファー中での簡単な再
水和により再構成する事は出来ない。
本発明によれば２〜20％のトレハローズを含有する２お
よび３％アガローズゲルは乾燥し、引続いて再水和する
ことができる。我々は、トレハローズなしに乾燥された
ゲルと再水和特性を比較したところ本発明の乾燥された
ゲルは初期の深さと水分量を持ったゲルを与えるよう完
全に再水和されることを見出だした。これは乾燥された
アガローズゲル板は何等特別な容器を必要とせずに無期
限に保管することが出来、また使用する時に簡単に再水
和することが出来る。
本発明によれば、大気温度で固定された全赤血球（fixe
d whole red blood cells）を乾燥することによって保
存することが又可能であり、特に例えば赤血球凝縮検査
（haemagglutination assay）として知られた極端に鋭
敏な免疫検査で使用されるような抗体、および抗原のよ
うな結びついている化学的に変化しやすい分子に固定さ
れた全赤血球を乾燥保存することが可能である。ここ
で、抗原にせよ抗体にせよどちらも化学的に赤血球（er
ythrocytes）の表面膜に結合しており、又適当な配位子
（ligand）は目にみえる集合パターンに赤血球が一緒に
固めるような能力により検出されることが出来る。抗原
が赤血球に結合している場合には、抗体の効力は抗体を
希釈段階にて滴定し赤血球のもはや凝集反応／集合をお
こさない点を観察することによって評価することが出来
る。抗体がレッドセルに結合している場合には、未知の
溶液例えば血液中の正確な抗原の量は上述のように滴定
終点を検出することにより決定される。このために、抗
原はレッドセル上で抗体によりみられることの出来る分
子について一つ以上の抗原の用地を占領せねばならな
い。
この検査はたくさんの準備を必要とする。レッドセルは
普通新鮮なものが使われ、洗浄を必要とし、化学的に抗
原又は抗体のいずれかと結合され、次に配位子の滴定稀
薄液に加えられる。
我々は抗原および抗体をグルタルアルデヒド（glutaral
dehyde）のような組織の固定液で固定されているレッド
セルに抗原と抗体を組合わせることが出来、次に組合わ
されたレッドセルをトレハローズの存在下で乾燥するこ
とが出来ることが分った。再水和の際組合わされ固定さ
れたレッドセルは、レッドセル凝集検査にて新鮮なレッ
ドセル懸濁液として振舞う完全な単一細胞懸濁液をつく
るように再懸濁することが出来る。この利用ではトレハ
ローズは二つの機能を提供する。： 1.固定レッドセル膜に結合された抗体または抗原の機能
を完全に保存する。
2.単一細胞懸濁液となるように完全にバッファー中で再
懸濁するように固定されたレッドセル自身を完全に保存
する。固定レッドセルはトレハローズなしに乾燥される
と不可逆の自然凝集反応がおこり、使用することは出来
ない。
かくて本赤血球凝集検査キットは、測定されるべき抗原
ないし抗体が単にバッファー中の乾燥レッドセルに加え
られる時にごく普通のやり方で行われる乾燥状態で組立
てられる。
Ｒ型フィコエリトリン（phycoerythrin）は海洋のロー
ドファィト（rhodephyte）、ローディメニア（rhodymen
ia）から容易に精製されるフィコビリ蛋白質（phycobil
iprotain）である。575nmで最高の発光をもつ赤−オレ
ンヂ色の蛍光をきらきらと発する。その輝かしい蛍光お
よび高い発光量は分子中のフィコウロビリン（phycouro
bilin）とフィコエリトロビリン発色団（phycoerythrob
ilin chromphore）の空間的分布と形状によるものであ
る。この蛍光蛋白質はフルオレスセィンより１モル当り
20倍明るいので、また抗原ないし蛍光性抗体またはDNA/
RNA交配（hybridisation）検査に使用されるアビディン
（avidin）／ストレプトアビディン（streptaviden）の
ようなプローブに容易に結合されるので多くの蛍光性検
査に選択される。
この試薬の使用に対する重大な欠点は蛍光性が水溶液に
おいて衰えた敏感であることである。これは蛍光の半減
期を非常に短くする。これは蛍光用刺激波長をもって光
輝いている時にフィコエリトリン分子が水溶液中でフリ
ーラジカルができることによって破壊することによるも
のである。分子を乾燥することはフリーラジカルの発生
を阻止しそれゆえ蛍光の衰えを妨げるが、蛍光特性が依
存しているこの巨大蛋白質（240Kd）の３次元構造が乾
燥時崩壊するので蛍光性の90％以上を破壊する。
我々はこの分子がトレハローズの存在下で蛍光特性の損
失無しに完全に乾燥されることが分った。これはこの蛋
白質が蛍光強度を弱めることなく又完全に保持したまま
高い強度の刺激光に長時間ないし繰返して暴露する必要
のある検査に今や用いられる事を意味している。光の弱
まりはトレハローズを洗い流し、水溶液中の分子を照射
することにより再建される。
蛋白質構造と機能の保持に対する主な要求は抗体、抗
原、および酵素の水準の臨床測定用の血液サンプルにお
いてである。現在これらのサンプルは常に４℃で短期
間、−20℃またはそれ以下で完全冷凍では長期間貯蔵さ
れる。乾燥することは出来ない。
魅力ある代わりの方法は血液成分の構造と機能がトレハ
ローズ存在下で乾燥することにより保護する。乾燥形式
で、血清または血液サンプルを貯蔵することであろう。
これを達成する簡単なまた手際のよい方法は、サンプル
貯蔵媒質として、その上に血液または血清サンプルを使
用したり、またその上で再乾燥させたりする多孔質の予
めトレハローズを含浸した基質を用いることである。乾
燥はどんな身近の大気温度、例えば熱帯地方でも行う事
ができる。トレハローズの基質中の含有量は乾燥基質の
重量の５〜25％、例えば7.5〜20％が好ましい。基質は
何らかの適当な不活性材料、例えばセルローズまたはガ
ラス紙、多孔質プラスチックフィルム、布等を含んでい
る。使用の容易さからセルローズろ紙が好ましい。吸収
された蛋白質の回復の容易さから基質は便宜的に薄いシ
ート又は織物である。
我々は理論づけようとは思わないが、乾燥状態で蛋白質
や他の高分子の構造と機能を保存するトレハローズの独
特の特性はトレハローズ分子がその水酸基に水素結合す
ることによる。このようにしてトレハローズは、乾燥に
よる高分子構造の崩壊がないように構造的な（結合）水
分子の代わりになる。トレハローズは高分子の構造的完
全さを保持しながら乾燥骨格として作用する。
多くの高分子機能は高分子の動きやすさを必要とする、
例えば抗体は静電的および疎水的相互作用により起こる
結合の為に抗原へ極めて近くに物理的に移動せねばなら
ない。基質に結び付いている酵素についても同じであ
る。小さな分子運動も又他の高分子機能として必要とさ
れる。このようにしてヘモグロビンは可逆的な酸素と二
酸化炭素の結合の間、あるアミノ酸の回転と移動をうけ
る。この分子移動は乾燥状態では全く観察されない。か
くて我々はオキシおよびカーボキシの形で乾燥ヘモグロ
ビン（haemoglobin）を得、これらの分子はトレハロー
ズの存在の下で乾燥されるとそのスペクトル特性（spec
tral propreties）を保持する。
トレハローズ中で乾燥されたカーボオキシヘモグロビン
を100％酸素にさらすとオキシの形への転換は起こらな
い、これに反して水溶液中では数分間のうちに発生す
る。対称的に、Ｒ型フィコエリトリンの蛍光は原子レベ
ル以下の“動き”だけを含んでいる。低い波長例えば
（488nm）における光エネルギーの吸収は発色団におけ
るエレクトロンをより高いエネルギー軌道に移動せしめ
る。より長い波長での蛍光性はこれらエレクトロンがよ
り低いエネルギー軌道にジヤンプバックする時に起こる
ホトン（photons）の発光によるものである。トレハロ
ーズによる乾燥状態におけるＲ型フィコエリトリンの蛍
光性の保存は、高分子の電子特性が完全にこの技術によ
って保たれることを示している。この方法はそれゆえ新
たな電子的応用における生物学上（および合成）高分子
の応用に大変興味のもてるものである。例としては、プ
ロトンおよびエレクトロンのポンピング（pumping）を
含んでいる（光にさらされた時に、バクテリオロードプ
シン（bacteriorhodopsin）およびロードプシン（rhodo
psin）により仲介されるように）。蛋白質や他の高分子
を乾燥し、それらの三次元形状や機能を保持する能力
は、生物学的分子をもちいて太陽エネルギーを水素ない
し電流に直接転換することを含む分子エレクトロニクス
の可能性を提供した。この生物学的分子は本来、分子サ
イズスケールで高い効率とセンサーと電子回路（コンピ
ューターを含む）の構成をもっている。
次に実施例は発明を詳細に説明するものである。
実施例１ フィコビリ蛋白質、Ｒ−フィコエリトリンは海洋のロー
ドフィトから精製される。輝かしい赤色の蛍光蛋白質
は、10％w/vのトレハローズ添加または無添加の燐酸塩
バッファー中に置かれたニトロセルローズ膜またはガラ
スファイバーフィルター紙上に吸取られ、室温で乾燥さ
れる。トレハローズのない場合には赤色蛋白質は紫色に
変化し、青色光で照らされた時にオレンヂ／赤の蛍光を
発する能力を失った。10％のトレハローズがある場合に
は蛋白質はその色を保持し、完全に乾いた時でさえも、
溶液中の蛋白質と同じように輝かしく蛍光を発した。
我々は同じくリンパ球の表面に結合された抗体と組合わ
されたフィコエリトリンの蛍光性をトレハローズの存在
下で乾燥することにより完全に保持した。
実施例2. 我々は同じく乾燥された時に抗体の抗原結合容量を保持
するトレハローズに対する能力を研究した。これは、１
級移植抗原（class I transplatation antigens）用の
非常に敏感な二位置酵素リンク免疫検査（two site Enz
yme Linked Immunoassay）（ELISA）への応用によって
最も良く説明される。
この検査ではモノクロナール抗原YR5/310が、96個のウ
ェル（well）を持ったミクロ滴定プレート（micro titr
e plate）（Nuc免疫板）にあるポリスチレン表面に一晩
培養して結び付けられた。次にトレハローズのないプレ
ートの24個のウェルを乾燥し、10％添加トレハローズの
24個のウェルを乾燥、残り48個のウェルは燐酸塩バッフ
ァーで湿した。乾燥は37℃で一晩行われた。
次に関連した１級分子をふくんでいる血清を加え室温で
５時間培養した。プレートを洗浄し、次にビオチン（bi
otin）と表示された第二の抗体、YR5/12を１時間加え
た。そのプレートを再び洗浄し、基体3,3-,5,5-−テト
ラメチル ベンヂヂン（tetramethylbenzidine）と20分
間培養した。反応生成物は自動ELISAプレートリーダー
で測定された。結果（第一図）はトレハローズなしに結
合抗体を乾燥することは結合活性度の90％より以上の損
失をひきおこす、一方トレハローズを加えて乾燥すると
ELISAの結果では非乾燥抗体によるものと同じであるよ
うに完全に抗体活性度を保持している。
実施例３ ドライプレート血液タイピング検査 ４個のウェルを持つ組織培養皿（Nunclon 3/132 マル
チ皿4,Nunc Denmark）が用いられた。他の安い代替品、
例えば薄いPVCシートから作られた“ブリスターパック
（blister pack）”が用いられる。また標準のミクロ滴
定プレート、94,48,ないし24個のウェルも用いられる。
製造 ３個のウェルは抗体を含み、１個は（ウェル４）Ａ血液
グループ物質にモノクロナール マウス IgM 抗体の5
0μｌのみを含む（64i.u.per ml−Blood Group Referen
ce Laboratory,Radcliffe Infirmary,Oxford.） ウェル２はＢ血液グループ物質に対しモノクロナール
マウスIgM抗体を50μｌ含む（64i.u.per ml−出所上に
同じ）。
ウェル３はRh D抗原に対しモノクロナール 人 IgM抗
体を50μｌ（1mg/ml,我々の研究所製品）。
全てのウェルが５単位のヘパリン（heparin）および0.0
1％のナトリゥム アジド（sodium azide）を加えた蒸
溜水の0.1〜10％w/vトレハローズ溶液を50μｌ含む。プ
レートは暖かい部屋の中で37℃で一晩乾燥される。その
後室温で無期限に貯蔵出来る。
利用 各々のウェルに水（蒸溜水または水道水）を２滴（約10
0μｌ）加え２〜５秒揺動プレートで広げる。全血液の
１滴を加え、血液とウェルの中身が混合するように、静
かに揺らす。５分間それぞれ数秒静かに揺する。
結果 A,BまたはRh抗原に対して陽性であるレッドセルを含ん
でいる血液は特定のウェル（ｓ）の中で30秒以内に明白
な、粗大な肉眼で見える凝集模様を与えるであらう。O,
Rh−ve血液はどのウェルにも血液凝集を起こさない。
利益 1.プレートは無期限に室温で安定である。活性度の損失
なしに37℃で２ケ月貯蔵された。
2.検査は非常に便利で速い。何等の装置も必要としな
い。全ての血液が用いられる。レッドセルは分離したり
洗ったりする必要がない。指を指すことはABOおよびRh
検査用に十分な血液を与える。
3.トレハローズは100％抗体活性度を保持する。滴定血
液凝集検査において５％の最終濃度ですべて用いられた
５つの糖類の検査結果は次の通りである。
活性度保有率 ％…HA滴定における 湿った抗体（人 IgM アンチーＤ） 100 乾燥 Ab＋添加物なし 3.7 乾燥 Ab＋トレハローズ 100 乾燥 Ab＋マルトーズ 11.1 乾燥 Ab＋サッカローズ 11.1 乾燥 Ab＋ラフィノーズ 3.7 乾燥 Ab＋グルコーズ 1.2 追加の滴定が保存用の最適のトレハローズ濃度があるか
どうか確立するため行われた。検査された抗体はマウス
モノクロナール IgM アンチＡ抗体、マウス モノ
クロナール IgM アンチＢ抗体および上述の検査で用
いられた人 モノクロナール IgM アンチRh抗体であ
った。これらは適当な出発濃度に下記のように希釈され
た：−マウスアンチＡは1:10,マウスアンチＢは1:10,人
アンチRhは最終濃度20μg/mlに。これらは最終容積50μ
ｌとなるデュルベコ（dulbecco）の燐酸塩バッファー塩
水（phosphate buffered saliue）（PBS）中で96個のウ
ェルのあるミクロ滴定板を横断し1:3滴定された。各々
の水平８個のウェルの列に50μｌのトレハローズが10％
w/vから0.1％w/vの範囲の濃度で加えられた。ウェルは
つぎに37℃で一晩乾燥された。翌日ウェルは等張性を回
復するのに十分なバッファーをふくむ100μｌの蒸溜水
で再水和された。次に50μｌの部分がｖ底のミクロ滴定
プレートに移され、適当な血液グループ抗原を運ぶ１％
の洗浄された人レッドセルを25μｌ添加され混合され
た。レッドセル凝集反応滴定が室温で２〜３時間後に読
取られた。結果は人抗体については活性度の最高保存は
100％で乾燥段階でトレハローズの最終濃度2.5％で起こ
ったことを示している。５％最終トレハローズ濃度で滴
定に僅かな減少があった。アンチＡ抗体では１％以上の
どんなトレハローズ濃度でも最高活性度を保存し、アン
チＢ抗体では0.5％以上のどんな濃度でも最高活性度を
保存した。
ノート 多くの他の抗体、IgMまたはIgG級のモノクロナールおよ
び血清抗体ともにトレハローズとのこの方法で保存され
た。活性度の保存率は常に100％またはそれに近かっ
た。抗体は疎水性で電荷相互作用により滴定プレートの
ウェルのプラスチック表面に結付けられる事もできる
し、同様な力でニトロセルローズやナイロン膜に結付け
られることも出来るし又は溶液中でフリーであることも
出来る。抗体が溶液中でフリーである場合には、その機
能は十分に保たれる、即ち抗血液グループ物質抗体（ag
glutinatng anti blood group substance antibodies）
を凝集することは乾燥しているレッドセルの激しい凝集
を引起こし、溶液中での多価結合と再水和への能力を保
持していることを示している。
実施例４ 全ての血清における抗体活性度をトレハローズの存在下
で乾燥することによる保護 ねずみIgG免疫グロビュリン（immunoglubin）（K237）
へ羊抗血清は96ウェルの平底ミクロ滴定プレートで1:3
段階で滴定された（50μlPBS中25μｌ血清）。D.W中５
％w/vトレハローズ50μｌが次に加えられ、プレートを
温室で37℃で48時間乾燥した。
ウェルは100μｌの蒸溜水で再構成される。各々のウェ
ルの内容の内50μｌがｖ底ミクロ滴定プレートへ移さ
れ、DAねずみレッドセル（DA rat erythrocytes）は塩
水で３回洗われ、DAレッドセル上へのAaクラス１移植抗
原として特殊であるモノクロナール抗体P3/13HLKの表面
にうかぶ組織培養でもって室温で２時間の培養により増
感される。レッドセルはつぎに塩水で３回洗われPBS＋
１％BSA中に１％v/vで再懸濁された。増感したねずみレ
ッドセルがくわえられる。同時に新しいK237血清が陽性
非乾燥例と同じように滴定される。
ねずみ抗体R3/13により増感させられたレッドセルの直
接的でない凝集を引起こす乾燥されたまた新しい血清へ
の能力は次のようである。
結論 トレハローズは全血清の抗体活性度を100％保存する。
トレハローズのない乾燥は活性度を99％以上破壊する。
実施例５ 多数の異なった基質がトレハローズ支持体として検査さ
れた。そこには純粋なセルローズ紙（ワットマン（what
man）No.1ろ紙）、ガラスファイバー紙（ワットマンGF/
AおよびGF/C紙）、ポリウレタンスポンヂフォーム及び
多孔質ポリエチレンシートがある。これらの基質は10％
から１％までの色々の濃度で蒸溜水に溶解したトレハロ
ーズに浸し、37℃で乾燥した。乾燥した紙のトレハロー
ズの含有量は溶液中の約２倍であった。それゆえ10％溶
液は重量でトレハローズ20％を含む乾燥紙を、また５％
溶液は10％重量のトレハローズを含む紙を与えた。色々
の血清が紙に適用され37℃で乾燥された。37℃で一定期
間貯蔵後、蒸溜水または普通の塩水で洗われる；普通は
同じ血清の新しい非乾燥サンプルとその効力が直接比較
されるように元の血清サンプルの２〜４倍量で用いられ
る。
K237、ねずみIgGに対して羊抗血清（sheep antiseru
m）、は10％トレハローズ含浸セルローズ紙、ガラスフ
ァイバー紙および多孔質ポリエチレンシート上で乾燥さ
れ37℃で７日間貯蔵される。
紙またはシートは普通の塩水の４倍量で洗われ、レッド
セル膜の上にしぼられたクラス１抗原に対してモノクロ
ナール抗体（JN2/85）で覆われたDAストレィンねずみレ
ッドセルを凝集する能力について間接レッドセル凝集検
査で滴定された。結果はセルローズ紙でまた多孔質ポリ
エチレンシート上で100％の活性度が保たれ、ガラスフ
ァイバー紙で50％であった。
紙 滴定 シュライフアー＆シュール GB003 1:640 シュライファー＆シュール GB002SB 1:640 ワットマン GF/C（ガラスファイバー） 1:1280 ワットマン No.1（セルローズ） 1:2560 多孔質ポリエチレンシート 1:2560 （非乾燥抗血清 1:2560） 同じ血清がワットマンNo.1セルローズ紙上で各種糖類の
ある場合とない場合とを乾燥することにより試験され
た。
糖類 滴定 サッカローズ 1:640 サフィノーズ 1:640 トレハローズ 1:1280 なし 1:640 湿った抗血清 1:1280 滴定が1:1280から1:640に低下したのは少なくとも50％
の抗体活性度が失われたことを意味する。サッカローズ
とラフィノーズ紙および未処理紙の間には重要な差はな
い。
実施例６ 紙または膜上のフィコエリトリンの乾燥 Ｒ型フィコエリトン5mg/mlを37℃でガラスファイバーろ
紙（ワットマンGF/C）、セルローズろ紙（ワットマンN
o.1）又はニトロセルローズ膜（シュライヒアー＆シュ
ール0.45μ孔径）の上で５％トレハローズ溶液の存在下
および不存在下で乾燥した。トレハローズのない場合に
乾燥したＲ型フィコエリトリンのスポットは色が紫がか
った赤に変わりその蛍光強度の90％より以上を失った。
トレハローズを添加した場合には色と蛍光性の両方とも
保ち続けている。トレハローズ含有サンプルは蛍光性を
うしなう事なく10か月間暗所に貯蔵された。
実施例７ ニトロセルローズ膜上でDNAを吟味するための新規試験
における膜−乾燥のフィコエリトリンの使用 フィコエリトリンの蛍光性は衰えることなしに膜上で乾
燥状態で励起されるので、非常に強い完全な蛍光信号が
この分子から写真のエマルジョン上に記録される。
この方法の敏感さの一例として、DNAの100picogramから
0.1pgへの10回連続の希釈はスロット−ブロット装置（s
lot-blot apparatus）を用いてニトロセルローズ上に乾
燥された。このDNAは光ビオチンを用いているビチオン
と分類されていた。これらの膜はＲ型フィコエリトリン
（QB−AR4 セロテック社）に、300mlのブロッキングバ
ッファー（１％BSAinPBS）中に一晩中過剰洗浄を続けら
れた1mg/ml溶液に室温で１時間培養することによって等
価に結合されているストレプトアビデインで以て検査さ
れた。つづいて膜は蒸溜水10％トレハローズ溶液で洗浄
され室温で乾燥される。膜は次に修正したポロライドVD
Uカメラで１時間露出を用いて写真を写され、一方490nm
の干渉フィルター（イーリング ベック（ealing bec
k））を通したキセノン光源からの強烈な青色光で照ら
された。カメラレンズはオレンヂ−赤蛍光だけが記録さ
れるように560nm切離しのロングパス干渉フィルターで
覆われた。レッテルを張られたDNAのしみは容易に10pgD
NAより以上の感度で検出され、バックグランドは無視出
来た。ニトロセルローズの同じ乾燥膜はこのシステムで
３日の期間に亙って20回以上蛍光信号が衰えることなし
に写真が写された。対照的に湿った状態でまたトレハロ
ーズがない場合に照らされると、蛍光信号は30秒内に衰
える。トレハローズなしに乾燥すると蛍光信号は失われ
ることになる。
実施例８ ねずみリンパ球の蛍光顕微鏡使用法（fluorescence mic
roscopy） Ｒ−フィコエリトリンを用いる蛍光顕微鏡使用法、フッ
化クロムは以前水性マウンタント（mountants）におけ
る蛍光性の衰えの為に非常に効率が悪かった。これは調
整品を乾燥することにより、またガル（Gurr）のフルオ
ロマウント（fluoromount）のような非極性マウンタン
トに乗せることにより避けることができる、しかしなが
ら乾燥はＲ−フィコエリトリンの蛍光性の90％以上を破
壊する。これは最終バッファーにトレハローズを加えて
乾燥することにより避けられる。これは有機の非水マウ
ンタンに乗せられる又蛍光信号の損失無しに長期間繰返
して試験出来るレッテルのはった細胞ないし組織の蛍光
強度の全てを事実上保存する。
アンチCD4モノクロナール抗体W3/25はビオチン（bioti
n）−リンカー（liker）−アーム（arm）Ｎ−ヒドロキ
シサクシニィミドエステル（hydroxysuccinimide este
r）と結合され、ねずみリンパ球のＴヘルパー部分集合
としてレッテルを貼るよう飽和されたドーズでもちいら
れた。これらレッテルの貼られた細胞は次にストレプト
アビディンーＲ−フィコエリトリン結合品を用いて第二
の着色過程で検出された。最終洗浄後細胞は４分割され
一つはこれらの試薬と正確なレッテルを示すようFACSで
試験された。二つの他の分割品はスピンダウンされトレ
ハローズ10％添加のまたは入っていない血清に再懸濁さ
れた。標本が作られ、乾燥され、次にフルオロマウント
に乗せられた。四番目の分割品はPBSにしめつた湿った
まま備え付けられた。全ての三つの調整品はプレーム光
学のツアィス光学顕微鏡で試験された。
湿ったマウントは約20〜30秒以内に最も明るい細胞だけ
が僅かに見分けることが出来るほど急激に衰えた約75％
輝度の蛍光細胞を示した。トレハローズをふくまない乾
燥マウントは辛うじてバックグランドの上に見ることの
できる極めて弱い蛍光細胞のみを示した。
トレハローズ添加の乾燥調整品は衰えることのない75％
輝度の蛍光細胞を示した。この調整品数週間繰返し試験
したが、何等検出しうるその細胞の衰えは見られなかっ
た。
このようにトレハローズは完全に乾燥された時でも蛋白
質のいくつかの広くことなれる又非常に変化しやすい特
性を完全に保持する。これらの特性（蛍光性と抗原結
合）Ｆ完全に分子の手のついていない第三の構造の保持
によるものである。
この現象は蛋白質の機能と構造が乾燥状態で完全に保た
れていることを意味する。かくして科学的ないし医学的
関心の蛋白質は凍結または凍結乾燥に対する必要条件な
しに保存される。免疫−検査用キットは水分損失を阻止
するため密閉するとか脂肪体−形成とかの必要性なしに
調製され貯蔵される。化学ルミネッサンス、電気伝導お
よび窒素固定とか光合成のようなあるいは複合した特性
のような新しい又ありふれていない蛋白質や他の分子が
乾燥状態で保存することが出来る。
実施例９ 酵素活性度の保存 子牛の腸（calf intestine）からの、ほ乳動物酵素アル
カリ燐酸塩は燐酸塩バッフアー塩水（PBS）で連続的に
薄められ、NUNC免疫プレートのウェルに加えられた。プ
ラスチック表面に酵素を結び付けるよう一晩以上培養の
後、ウェルは洗浄され、液をとるよう揺り動かされ、37
℃で５％トレハローズ蒸溜水溶液の存在下でまたはなし
に乾燥された。プレートは次に室温で４週間培養され
た。この時の最後にウェルは蒸溜水で再水和され基体が
加えられた。陽性コントロールは酵素の新鮮な希釈から
なっていた。一つの酵素の活性度がｐ−ニトロフェニル
フォスフェート（nitrophenylphosphate）を還元する標
準テストにより測定されまた405nmにおける光密度を監
視した。
活性度の十分な保有は酵素がトレハローズとともに乾燥
されたときに得られ、トレハローズがなしに乾燥された
ときには90％以上活性度が失われた。同一の結果がわさ
び大根からのパーオキシダーゼについて同一の実験に使
われた時に得られた。
実施例10 血清補体の保存 ギニア豚血清（guinia pig serum）が使用まで−196℃
で分割して新鮮かつ凍結されて準備された。目標細胞と
して、２週間にいたるまでアルスバー（Alsever）の溶
液に貯蔵した洗浄された羊レッドセルが牛モノクロナー
ルアンチ−ホルスマン抗体（bovin monoclonal anti-fo
rrsmann antibody）94Al−AZAと一緒に４℃で１時間培
養された、次に補体固定希釈液（CFD）で洗浄された。
新たにとかしたギニア豚血清はCFDで希釈され、その際
平底ミクロ滴定プレート（NUNC,デンマーク）が使わ
れ、またトレハローズは各種の濃度で添加される。プレ
ートは室温で一晩以上乾燥空気を流して乾燥された。
CH50検査（P.J.Lachmann 及びM.j.Hobart、“Handbook
of Experiment al Immunology"刊行,D.M.Weir,Blackwe
ll 1978）については、乾燥したまたは新鮮な補体がＵ
底のミクロ滴定プレートの中で滴定が行われ最終濃度２
％まで添加しSRBCを増感した。プレートは次に37℃１時
間培養され、遠心分離された。終点はレッドセルの50％
がその中でボタンとして残っているのがカップとして測
定された。
結果 トレハローズの保護効果は糖類の蛋白質に対するモル比
に依存した。補体活性度100％は50％規定の血清中にト
レハローズを0.22Mまたはそれ以上により保たれ、25％
血清では0.15Mと同等以上を必要とした。トレハローズ
の高い濃度（0.5Mまで）はいかなる濃度の血清おいても
抑制しなかった。
トレハローズのない場合での牛類血清（neat）の乾燥は
補体活性度の75％の損失を引起こした。トレハローズの
ない25％血清の乾燥は93％の補体活性度損失を起こし
た。これらの損失は完全にトレハローズにより阻止され
た、乾燥され再構成された補体の活性度は新鮮な補体の
ものと全く同じであった。
実施例11 アガローズ ゲル 我々は２〜20％トレハローズを含む２および３％のアガ
ローズゲルを乾燥し、それらの再水和特性をトレハロー
ズなしに乾燥したゲルと比較した。再水和の程度は再び
獲得した水の量を確立するようゲルの重量を計ることに
より測定された。分離媒質として適合性が、再水和され
たトレハローズ保存の、乾燥ゲルにおけるオケテルロニ
ー（ouchterlony）−二重拡散検査および免疫電気泳動
性を準備することによって確立された。
結果（表）は５％または10％トレハローズから乾燥され
た２％および３％ゲルは100％の水の再取得を示してい
る。これらのゲルは外観上新たに注がれて固まったゲル
と同一である。
アウチターローニー拡散と免疫電気泳動の両方とも新た
なゲルで行われる検査と同一となる結果をもってこのよ
うなゲルにおいて実行されうる。ゲルがその中で再組立
てされるバッファーを変えることによって、蒸溜水中の
アガローズ／トレハローズから乾燥された同じゲルが各
種の目的用に使用される。このようにしてオケテルロニ
ー−バッファーはこの検査に適当なゲルを作る、一方電
気泳動バッファーは電気泳動ないし免疫電気泳動を実施
するのを可能にする。
この技術はアガローズゲルが予め調製され乾燥され更に
室温で無期限に貯蔵される、またバッファーに浸すこと
により１時間以内に再び元のようにすることができ、そ
して直ちに使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 38/43 39/00

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】乾燥中の変質に対して蛋白質および他の巨
    大分子を保護する方法であって、蛋白質または他の巨大
    分子を含有する水を含んだ系をトレハローズ（trehalos
    e）の存在のもとで氷点を越える温度で乾燥することに
    よって行われることからなる蛋白質および他の巨大分子
    の保護方法。
  2. 【請求項２】水を含んだ系が0.05〜20重量％のトレハロ
    ーズを含んでいる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】トレハローズの蛋白質または他の巨大分子
    に対する割合が重量で少なくとも1.4:1である特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】蛋白質または他の巨大分子が、酵素、血
    清、血清補体、抗体または抗原（フリーなものと支持体
    に結合しているもののいずれも）、蛍光性蛋白質、ワク
    チン構成成分またはポリサッカリドである特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】系が周囲温度またはそれを越える温度で大
    気圧で乾燥されることからなる特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  6. 【請求項６】蛋白質または他の巨大分子を含有する水を
    含んだ系をトレハローズ（trehalose）の存在のもとで
    氷点を越える温度で乾燥することによって行われること
    からなる蛋白質および他の巨大分子の保護方法に用いら
    れる、トレハローズで含浸されている多孔質基質。
  7. 【請求項７】５〜25重量％のトレハローズを含んでいる
    特許請求の範囲第６項記載の多孔質基質。
  8. 【請求項８】セルローズまたはガラス−ベース紙、多孔
    質プラスチックフィルム、または織物からなる特許請求
    の範囲第６項記載の多孔質基質。
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