NO324264B1

NO324264B1 - Anti-VEGF-antistoff, sammensetning, nukleinsyre, vektor, vertcelle, fremgangsmate samt medikament for medisinsk bruk.

Info

Publication number: NO324264B1
Application number: NO19994869A
Authority: NO
Inventors: Leonard G Presta; Manuel Baca; James A Wells; Henry B Lowman; Yvonne Man-Yee Chen
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2007-09-17
Also published as: ATE349470T1; DE122005000050I1; EP1650220A2; NO2007014I1; WO1998045331A3; EP1325932B1; EP1650220B1; JP3957765B2; PT1325932E; LU91167I2; US20050112126A1; CN100480269C; NL300193I1; NO2007015I1; BR9809387A; TR199903123T2; WO1998045331A2; GEP20105118B; EP1787999A1; NZ500078A

Description

Oppfinnelsens område

Denne oppfinnelsen vedrører humaniserte anti-vaskulærendotelvekstfaktor (anti-VEGF) antistoff, fremgangsmåte for fremstilling av nevnte antistoff, sammensetning som omfatter nevnte antistoff samt et medikament som omfatter nevnte antistoff for medisinsk bruk. Videre vedrører oppfinnelsen nukleinsyrer som koder for nevnte antistoff, vektor som omfatter nevnte nukleinsyre samt vertcelle som omfatter nevnte vektor.

Beskrivelse av kjent teknikk

Det er nå veletablert at angiogenese er en del av patogenesen til forskjellige forstyrrelser. Disse inkluderer faste tumorer, intraokulær neovaskulære syndromer slik som proliferative retinopatier eller aldersrelatert makulær degenerering (AMD), rheumatoid artritt og psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991) og Garner A. Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2nd Edition Marcel Dekker, NY, s. 1625-1710 (1994)). I tilfellet av faste tumorer tillater neovaskularisering tumorcellene å få en vekstfordel og proliferativ autonomi sammenlignet med normale celler. Derfor har en korelasjon blitt observert mellom tettheten av mikroårer i tumorsnittene og pasientoverlevelse i brystcanser såvel som i flere andre tumorer (Weidner et al., N. Engl. Med. 324:1-6

(1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); og Macciarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)).

På leting efter positive regulatorer til angiogenesen har gitt mange kandidater, inklusive aFGF, bFGF, TGF-a, TGF-fi, HFT, TNF-a, angiogenin, IL-8, etc. (Folkman et al, og Klagsbrun et al.). De negative regulatorene som er identifisert så langt inkluderer trombospondin (Good et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6624-6628 (1990)), 16-kilodalton N-terminal fragmentet til prolaktin (Clapp et al., Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), angiostatin (0'Reilly et al., Cell, 79:315-328 (1994)) og endostatin (0'Reillyetal., Cell, 88:277-285 (1996)).

Arbeid som er blitt utført de seneste årene har etablert nøkkelrollen til vaskulær endotel vektstfaktor (VEGF) i reguleringen av normal og unormal angiogenese (Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). Funnene at tapet på til og med et enkelt VEGF allel resulterer i embryonisk letalitet viser en uerstattelig rolle som spilles av denne faktoren i utviklingen og differensieringen av det vaskulære system (Ferrara et al.). Videre har VEGF vist seg å være en nøkkelmediator til neovaskularisering assosiert med tumorer og intraokulære forstyrrelser (Ferrara et al.). VEGF mRNA er overuttrykt i hoveddelen av humane tumorer som er undersøkt (Berkman et al., J. Clin. Invest 91:153-159 (1993): Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735

(1993) ; Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73:931-934 (1996); og Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). Også konsentrasjonen av VEGF i øyevæsker er høyt korrelert tilstedeværelsen av aktiv proliferering av blodårer i pasienter med diabetes og andre iskemiske-relaterte retinopatier (Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487

(1994) ). Videre har nylige studier vist at lokalisering av VEGF i koroidal neovaskulære membraner i pasienter som lider av AMD (Lopez et al., Invest. Opthalmo. Vis. Sei. 37:855-868 (1996)). Anti-VEGF nøytraliserende antistoff undertrykker veksten av et antall av humane tumorcellelinjer i nakne mus (Kim et al., Nature, 362:841-844

(1993)); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrøm et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)); og Melnyk et al., Cancer Res., 56:921-924 (1996)) og inhiberer også intraokulær angiogenese i modeller for iskemiske retinale forstyrrelser (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71(1996)). En oversikt over humaniserte antistoff finnes i Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8:83-95 (1995). En generell metodebeskrivelse for humanisering av antistoff kan finnes i W09222653. Derfor er anti-VEGF monoklonale antistoff eller andre inhibitorer til VEGF virkning lovende kandidater for behandling av faste tumorer og forskjellige intraokulære neovaskulære forstyrrelser.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører et humanisert anti-vaskulært endotelvekstfaktor antistoff, kjennetegnet ved at det inhiberer VEGF-indusert angiogenese in vivo og/eller binder human VEGF med en K<j verdi på ikke mer enn 1 x 10"<8> M og/eller har en ED50 verdi for inhibering av VEGF-indusert proliferering av endotelceller in vitro som ikke er større enn 5nM, hvor antistoffet har et tungkjedevariabel domene omfattende konsensus gnuinstrukturregionene til human tungkjede undergruppe M, som vist i SEQ ID NO: 11, og hypervariabelregionene CDRH1, CDRH2 og CDRH3 som har følgende aminosyresekvenser

CDRH1: GYX,X2X3X4YGX5N (SEQ ID Nr. 117), hvor Xi er D, T eller E, X2 er F, W eller Y, X3 er T, Q, G eller S, X4 er H eller N og X5 er M eller I,

CDRH2: WINT XiTGEPTYAADFKR (SEQ ID Nr. 118), hvor X, er Y eller W og

CDRH3: YPX! YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID Nr. 119) hvor Xi er H eller Y, X2 er Y, R, K, I, T, E eller W, X3 er G, N, A, D, Q, E, T, K eller S, X4 er S, T, K, Q, N, R, A, E eller G og X5 er S eller G;

og har et lettkjedevariabel domene omfattende konsensus grunnstrukturregionene til human kappa lettkjede undergruppe I, som vist i SEQ ID NO: 12, og hypervariabel regionene CDRL1, CDRL2 og CDRL3 som har følgende aminosyresekvenser

CDRL1: X, AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID Nr. 121), hvor Xi er R eller S, X2 er S eller N, X3 er Q eller E, X4 er Q eller D og X5 er I eller L;

CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID Nr. 122);

CRDL3: QQYSXiX2PWT (SEQ ID Nr. 123), hvor X, er T, A eller N og X2 er V eller T,

hvor, sammenliknet med SEQ ID NO 11, tungkjedevariabel domenet har en substitusjon i hvilket som helst eller flere av de følgende residuer i konsensus grunnstrukturregionene: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H og 94H, og hvor, sammenliknet med SEQ DD NO 12, lettkjedevariabel domenet enten har en substitusjon i og bare i residue 46L i konsensus grunnstruktur regionene eller har substitusjoner i residue 4L og 46L i konsensus grurmstruktur regionene, hvor nummerering av residuene er som vist i Fig 1.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre: isolert nukleinsyre som koder for antistoff; en vektor som omfatter den nukleinsyren, eventuelt operativt koblet til kontrollsekvenser gjenkjent av en vertscelle transformert med vektoren; en vertscelle som omfatter den vektoren; en fremgangsmåte for å produsere antistoff som omfatter dyrkning av vertscelle slik at nukleinsyren blir uttrykt og eventuelt gjenvinning av antistoff fra vertscellekulturen (for eksempel fra vertscellekulturmediumet). Denne oppfinnelsen tilveiebringer også en sammensetning som omfatter anti-VEGF antistoff og en farmasøytisk akseptabel bærer eller diluent. Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et medikament omfattende nevnte antistofffor anvendelse for inhibering av VEGF-indusert angiogenese i et pattedyr. Sammensetningen for terapeutisk andvendelse er steril og kan bli lyofilisert.

Kort beskrivelse av tegningene

Figurene IA og IB viser aminosyresekvensene av variabel tung domene (SEQ ID nr. 9) og lett domene (SEQ ID nr. 10) av mMAb VEGF A.4.6.1, variabel tung domene (SEQ

ID nr. 7) lett domene (SEQ Id nr. 8) av humanisert F(ab) (F(ab)-12) og human konsensus grurmstrukturer (hum HI for tung subgruppe HI (SEQ ID nr. 11) huimcl for lett k gruppe 1 (SEQ ID nr. 12)). Figur IA oppstiller variable tung domene sekvenser og figur IB stiller opp variabel lett domene sekvenser. Stjernene indikerer forskjeller mellom humanisert F(ab)-12 og murin MAb eller mellom F(ab)-12 og human gmnnstruktur. Komplementære bestemmelsesregioner (CDR) er understreket. Figur 2 er et bånddiagram av modellen av humanisert F(ab)-12 og VH-domener. VL-domenet er vist i brunt med CDR i gyllenbrunt. Sidekjeden til residiet L46 er vist i gult. VH-domenet er vist i lilla med CDR i rosa. Sidekj edene av VH-residiene endret fra human til murin er vist i gult. Figur 3 viser inhibering av VEGF-indusert mutagenese av humanisert anti-VEGF F(ab)-12 fra eksempel 1. Bovin adrenal-korteks-avledet kapillær endotel celler ble sådd ut med en tetthet på 6 x IO<3> celler/brønn i seks brønners plater, som beskrevet i eksempel 1. Enten mMAb VEGF A.46.1 eller rhuMAb VEGF (IgGl; F(ab)-12) ble tilsatt i indikerte konsentrasjoner. Efter to til tre timer ble rhVEGF165 tilsatt til slutt-konsentrasjonen på 3 ng/ml. Efter fem eller seks dager ble cellene trysinert og talt. Verdiene som vises er gjennomsnittene av duplikatbestemmelser. Variasjonen fra gjennomsnittet overskred ikke 10%. Figur 4 viser inhibering av tumorvekst in vivo med humanisert anti-VEGF F(ab)-12 fra eksempel 1. A673 rhabdomyosarcoma celler ble injisert i BALB/c nakne mus med en tetthet på 2 x IO6pr. mus. Med start 24 timer efter tumorcelleinokuleringen ble dyrene injisert med en kontroll MAb, muMAb VEGF A4.6.1 eller rhu VEGF MAb (IgF; F(ab)-12 to ganger ukentlig intra peritonalt. Dosen av kontroll Mab var 5 mg/kg; anti-VEGF MAb ble gitt ved 0,5 til 5 mg/kg, som indikert (n = 10). Fire uker efter tumorcelle-injeksjonen, ble dyrene avlivet og tumorene ble fjernet og veiet. <*>: signifikant forskjell når en sammenligner med kontrollgruppen ved ANOVA (p<0,05). Figurene 5 A og 5B viser syresekvensene av lett og tung variable domener respektivt av murin antistoff A4.6.1 (SEQ ID nr. 10 for VL og SEQ ID nr. 9 for VH) og humanisert A4.6.1 varianter hu2.0 (SEQ ID nr. 13 for VL og SEQ ID nr. 14 for VH) og hu2.10 (SEQ ID nr. 15 for VL og SEQ ID nr. 16 for VH) fra eksempel 2. Sekvens-nummereringen er ifølge Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Inter ests, 5th Edition Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) og mismatcher er indikert med stjerner (murin A4.6.1 vs hu2.0) eller kuler (hu2.0 vs hu 2.10). Variant hu2.0 inneholder bare CDR sekvenser (uthevet) fra murint antistoff transplantert på en human lett kjede k subgruppe I konsensus grunnstruktur (SEQ ID nr. 12) og tungkjede subgruppe HI konsensus grunnstruktur (SEQ ID nr. 11). hu2.10 var konsensus humanisert klon ervervet fra fagesorteringseksperimentene beskrevet heri. Figur 6 viser grunnstrukturresidiene som er målet for randomisering i eksempel 2. Figur 7 viser fagemidkonstruksjonen for overflatefremvisning av Fab-pHI fusjoner på fagen. Fagemidet koder for en humanisert versjon av Fab-fragmentet for antistoffet A4.6.1. fusert til en del av Ml3 gen HI kappeprotein. Fusjonsproteinet består av Fab-koblet til karboksylterminale ende til tungkjede til en enkel glutamin residie (for suppresjon av en amber kodon i Sup E. Coli), deretter den C-terminale regionen til gen HI protein (residiene 249-406). Transformasjon inn i F<+> E. Coli fulgt av superinfeksjon med M13K07 hjelperfage, som produserer fagemidpartikler hvori en liten del av disse viser en enkel kopi av fusjonsproteinet. Figurene 8A-E viser nukleotidsekvensen (SEQ LD nr. 99) for fagefremvisnmgsantistoff-vektor phMB4-19-1.6 i eksempel 3 og aminosyresekvensene kodet for derved (SEQ JD nr. 100 og 130). Figurene 9A og 9B viser en oppstilling av aminosyresekvensene for lett og tung variable domener respektivt for affinitetsmodnet anti-VEGF varianter i eksempel 3, sammenlignet med F(ab)-12 i eksempel 1 (SEQ HD nr. 8 og SEQ HD nr. 7 for lett og tung variable domener, respektivt). CDR er understreket og kalt L, lett, eller H, tung, kjede og numrene 1-3. Residiene er nummerert sekvensielt i VL og VH-domenene som er motsatt til Kabat nummereringsskjema. Templatmolekylet, MB 1.6 (SEQ ID nr. 101 og 102 for lett og tung variable domener, respektivt) er vist, sammen med andre varianter: H2305.6 (SEQ HD nr. 103 og 104 for lett og tung variable domener, respektivt), Y0101 (SEQ ID nr. 105 og 106 for lett og tung variable domener, respektivt) og Y0192 (SEQ HD nr. 107 og 108 for lett og tung variable domener, respektivt. Forskjellene fra F(ab)-12 er vist i skyggelagte bokser. Figurene 10A og 10B viser en oppstilling av aminosyresekvensene for lett og tung variable domener respektivt av affinitetsmodnet anti-VEGF varianter fra eksempel 3 sammenlignet med F(ab)-12 i eksempel 1 (SEQ DD nr. 8 og 7 for lett og tung variable domener, respektivt). CDR er understreket og kalt L, lett, eller H, tung kjede og numrene 1-3. Variantene er betegnet Y0243-1 (SEQ ED nr. 109 og 110 for lett og tung variable domener, respektivt), Y0313-1 (SEQ ID nr. 113 og 114 for lett og tung variable domener, respektivt), og Y0317 (SEQ ED nr. 115 og 116 for lett og tung variable domener, respektivt). Forskjellene fra F(ab)-12 er vist skyggelagt. Figur 11 viser resultatene av HuVEC aktivitetsanalysen i eksempel 3 for variantene Y0238-3, Y0192 og Y0313-1 såvel som fullengde F(ab)-12 fra eksempel 1. Figur 12 viser inhibering av VEGF-inudesert mutagenese av fullengde F(ab)-12 fra eksempel 1 (rhuMAb VEGF), et Fab-fragment fra F(ab)-12 fra eksempel 1 (rhuFab VEGF), og et Fab-fragment av affinitetsmodnet variant Y0317 fra eksempel 3 (rhuFab VEGF (affinitetsmodnet)).

I. Definisjoner

Betegnelsen "humant VEGF" som brukt heri refererer seg til 165-aminosyrer human vaskulær endotel cellevekstfaktor, og beslektet med 121-, 189-, og 206-aminosyre vaskulær endotelial cellevekstfaktorer, som beskrevet av Leung et al., Science 246:1306

(1989) og Houck et al., Mol. Endocrin, 5:1806 (1991) sammen med naturlig forekommende alleliske og prosesserte former av disse vekstfaktorene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anti-VEGF antagonistiske antistoff som er i stand til å inhibere en eller flere av de biologiske aktivitetene til VEGF, for eksempelt dets mitogene eller angiogene aktivitet. Antagonistene til VEGF virker ved å interferere med binding til VEGF til en cellulær reseptor, ved å funksjonsudyktiggjøre eller drepe cellene som har blitt aktivert av VEGF, eller å interferere med vaskulær endotelcelle-aktivering efter VEGF binding til en cellulær reseptor. Alle slike karakteristika fra oppfinnelsen av VEGF antagonist skal betraktes som ekvivalent for formålene for denne oppfinnelsen.

Betegnelsen "VEGF reseptor" eller "VEGFr" som brukt heri refererer seg til en cellulær reseptor for VEGF, ordinært en celleoverflatereseptor funnet på vaskulære endotelceller, såvel som varianter derav som bibeholder evnen til å binde hVEGF. Et eksempel på en VEGF reseptor er fms-lignende tyrosin kinase (fit), en transmembran reseptor i tyrosin

kinase familien. DeVries et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519

(1990) . flt-reseptoren omfatter et ekstracellulært domene, et transmembrant domene, og et intracellulært domene med tyrosin kinase aktivitet. Det ekstracellulære domenet er involvert i bindingen av VEGF, mens det intracellulære domenet er involvert i signaltransdusjon. Et annet eksempel på en VEGF-reseptor er flk-1 reseptoren (også referert til som KDR). Matthews et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992). Binding av VEGF til fit reseptoren resulterer i dannelse av minst to høymolekylære vektkomplekser, som har en synlig molekylvekt på 205.000 og 300.000 Dalton. 300.000 Dalton-komplekset tror man er en dimer som omfatter to reseptormolekyler bundet til et enkelt molekyl av VEGF.

Betegnelsen "epitop A4.6.1" når den blir brukt heri, hvis ikke annet er indikert, refererer seg til regionen av human VEGF hvorved A4.6.1 antistoff beskrevet i Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) og Kim et al., Nature 362:851 (1993) binder.

"Behandling" refererer seg til både terapeutisk behandling og profylaktisk eller preventive metoder. De som trenger behandling inkluderer både de som allerede har sydkommen såvel som de hvor sykdommen skal forhindres.

"Mammal" når det gjelder behandling refererer seg til dyr klassifisert som pattedyr, inklusive mennesker, husdyr og gårdsdyr, dyr i zoologisk have, i sport, eller kjæledyr slike som hunder, hester, katter, kuer, etc. Fortrinnsvis er pattedyr er menneske.

"Antistoff (Ab) og "immunoglobuliner" (lg) er glykoproteiner som har de samme struktuelle karakteristika. Mens antistoff utviser bindingsspesifisitet til et spesifikt antigen, inkluderer immunoglobulinet både antistoff og andre antistoff-lignende molekyler som mangler antigenspesifisitet. Polypeptider av den sistnevnte typen er, for eksempel, produsert ved lave nivåer i lymfesystemet og ved økte nivåer av myelomaer.

"Native antistoff' og "native immunoglobuliner" er vanligvis heterotetrameriske glykoproteiner på omtrent 150.000 dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lette kjede er koblet til en tung kjede med en kovalent disulfidbinding, mens antallet av disulfidbindinger varierer mellom tunge kjeder av forskjellige immunoglobulin isotyper. Hver tunge og lette kjede har også regulær mellomromsintrakjededisulfidbroer. Hver tunge kjede har i den ene enden et variabelt domene (Vh) etterfulgt av et antall av konstante domener. Hver lette kjede har et variabelt domene i en ende og (Vl) et konstant domene i den andre enden; Det konstante domenet til den lette kjeden er sidestilt med det første konstante domenet til den tunge kjeden, og den lette kjedens variable domene er sidestilt med det variable

domenet til den tunge kjeden. Man tror at spesielle aminosyreresidier danner en inter-fase mellom lett og tungkjede variable domener.

Betegnelsen "variable" refererer seg til at visse deler av variabeldomener i stor utstrekning er forskjellig i sekvensen blant antistoff og er brukt i bindingen og spesifisiteten av hvert spesielle antistoff for dets spesielle antigen. Imidlertid, er variabiliteten ikke likt distribuert gjennom de variable domenene til antistoffene. Den er konsentrert i tre segmenter som kalles "komplementære bestemmende regioner" (CDR) eller "hypervariable regioner" begge i den lette kjeden og tunge kjedens variable domene. De mer høyt konserverte delene av variable domener blir kalt gnirmstruktur (FR). De variable domenene til native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR-regioner (henholdsvis FRI, FR2, FR3 og FR4), som stort sett har en "p-sheet" konfigurasjon, bundet med tre CDR, som danner løkker som forbinder, og i noen tilfeller danner deler av "fi-sheet" strukturen. CDR i hver kjede holdes sammen i tett nærhet av FR-regionene og med CDR fra den andre kjeden, som bidrar til dannelse av antigenbindende setet til antistoffet (se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991), sidene 647-669). De konstante domenene er ikke involvert direkte i binding av antistoff til et antigen, men utviser forskjellige effektorfunksjoner, slik som deltagelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær toksisitet.

Betegnelsen "hypervariabel region" når den blir brukt heri, refererer seg til aminosyreresidier til et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Den hypervariable regionen omfatter aminosyreresidier fra en "komplementaritets bestemmende region" eller "CDR" (dvs. residiene 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i lettkjede variabelt domene og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i tungkjede variabelt domene: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller de residiene fra en "hypervariabel løkke" (dvs. residiene 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i lettkjede variabelt domene og 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i tungkjede variabelt domene; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Gninnstruktur" eller "Fr" residier er de variable domenresidiene andre enn de hypervariable regionresidiene som er definert heri.

Papainkutting av antistoff produsert i to identiske antigenbindende fragmenter, som kalles "Fab"-fragmenter, som hver har et enkelt antigenbindingssete, og en residie "Fc" fragment, hvis navn reflekterer dets evne til å krystallisere. Pespinbehandling gir et F(ab')2 fragment som har to antigen-kombinerende seter og fortsatt er i stand til å kryssbinde antigenet.

"Fv" er minimum antistoff-fragmentet som inneholder et fullstendig antigen-gjenkjennings- og bindingssete. Denne regionen består av en dimer av et tungt og et lett kjedevariabel domene i tett ikke-kovalent assosiering. Det er i denne konfigurasjonen at tre CDR fra hver variabel domene reagerer for å definere et antigenbindingssete på overflaten av VH-VL dimer. Kollektivt utviser seks CDR antigen bindingsspesifisitet til antistoffet. Selv når et enkelt variabelt domene (eller halvdelen av en Fv som omfatter bare tre CDR spesifikke for et antigen) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigenet, selv ved en lavere affinitet enn hele bindingssetet.

Et "Fab" fragment inneholder det konstante domenet til lett kjede og det første konstante domenet (CH1) av den tunge kjeden. Fab ^fragmentene er forskjellig fra Fab-fragmentene med tilsetting av et fåtall residier i den karboksyterminale enden til den tunge kjeden CHl-domene inklusiv en eller flere systeiner fra antistoffhengsels-regionen. Fab^SH er beskrivelsen heri for Fab<1> hvori systeinresidien(e) av de konstante domenene bærer en fri tiolgruppe. F(ab')2 antistoff-rfagmenter ble i utgangspunktet produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselssysteinet mellom dem. Andre kjemiske koblinger av antistoff-rfagmentene er også kjent.

De "lette kjedene" til antistoffene (immunoglobulinet) fra en hvilken som helst vertebrat art kan bli utpekt til en av to særlig distinkte typer, kalt kappa (k) og lambda (X.), basert på aminosyresekvensene til deres konstante domene.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet av deres tunge kjeder, kan immunoglobuliner bli fastsatt til forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere bli delt inn i subklasser (isotyper): for eksempel IgG-1, IgG-2, IgG-3 og IgG-4; IgA-1 og IgA-2. De tunge kjede konstant domenene som korresponderer med forskjellige klasser av immunoglobuliner blir henholdsvis kalt a, delta, epsilon, y og u. Subenhet-strukturene og tredimensjonale konfigurasjoner av forskjellige klasser av immunoglobuliner er velkjente.

Betegnelsen "antistoff blir brukt i den bredeste betydning og dekker spesielt enkle monoklonale antistoff (inklusiv agonister og antagonist-antistoff), antistoff-sammensetninger med polyepitopisk spesifisitet, såvel som antistoff-rfagmenter (for eksempel Fab, F(ab')2 og Fv) så lenge som de utviser ønsket biologisk aktivitet.

"Antistoff fragmentet" omfatter en del av et fullengde antistoff, generelt antigenbinding eller variabelt domene derav. Eksempler på antistoff-fragmenter inkluderer Fab, Fab', F(ab')2, og Fv-fragmenter; diastoff, lineært antistoff; enkeltkjedet antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoff dannet fra antistoff-fragmentet.

Betegnelsen "monoklonalt antistoff' som brukt heri refererer seg til antistoff ervervet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoff, dvs. individuelle antistoff som omfatter populasjonen er identiske med unntak av mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan være tilstede i en mindre mengde. Monoklonale antistoff er høyt spesifikt, og blir rettet mot et enkelt antigen sete. Videre, i motsetning til konvensjonell (polyklonal) antistoff-fremstillinger som typisk inkluderer forskjellige antistoff rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), blir hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkel determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet, blir de monoklonale antistoffene fordelaktige ved at de er syntetisert i hybrodomkultur, ikke kontaminert med andre immunoglobuliner. Det modifiserte "monoklonale" indikerer karakteren av antistoffet som erverves fra en vesentlig homogen populasjon av antistoff, og kan ikke bli konstruert slik at det krever produksjon av antistoff ved en hvilken som helst spesiell metode. For eksempel kan monoklonale antistoff som blir brukt i samsvar med foreliggende oppfinnelse bli fremstilt ved hybridom metode først beskrevet av Kohler et al., Nature 256,495 (1975) eller kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-metoder, se for eksempel US patent nr. 4,816,567. "Monoklonale antistoff' kan også bli isolert fra fageantistoff-bibliotek ved å bruke teknikker beskrevet i Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Monoklonale antistoffer heri inkluderer spesifikt "kimære" antistoff (immunoglobuliner) hvori en del av tung og/eller lett kjede er identisk med eller homolog til korresponderende sekvenser i antistoff avledet fra en spesiell art eller hører til en spesiell antistoffklasse eller subklasse, mens den gjenværende av kjeden(e) er identisk med eller homolog til korresponderende sekvenser i antistoff avledet fra andre arter eller tilhører andre antistoffklasser eller subklasser, såvel som fragmenter fra slike antistoff, så lenge de utviser ønsket biologisk aktivitet (US Patent nr. 4,816,567; og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).

"Humaniserte" former av ikke-humane (for eksempel) murine antistoff er kimære antistoff som inneholder minimal sekvens avledet fra ikke-human immunoglobulin. For det meste er humaniserte antistoff humane immunoglobuliner (resipient antistoff) hvori de hypervariable regionresidiene til resipienten er erstattet med hypervariabel regionresidier fra en ikke-human art (donorantistoff) slik som mus, rotte, kanin eller ikke-human primat som har ønsket spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller, blir grunnstniltrurregion (FR) residier fra humant immunoglobulin erstattet med korresponderende ikke-humane residier. Videre, kan humaniserte antistoff omfatte residier som hverken er funnet i resipient-antistoff eller i donorantistoffet. Disse modifiseringene er fremstilt for ytterligere å foredle antistoffutførelsen. Generelt vil humaniserte antistoff omfatte i det vesentlige alle eller minst en og typisk to variable domene hvori vesentlig alle av de hypervariable regionene korresponderer til de fra et ikke-humant immunoglobulin og alle eller i det vesentlige alle av FR-regjonene er de fra et humant immunoglobulin sekvens. Humaniserte antistoff vil eventuelt også omfatte minst en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den fra et humant immunoglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature 321, 522 (1986); Reichmann et al., Nature 332,323 (1988), og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593

(1992).

"Enkel-kjede Fv" eller "sFv" antistoff-rfagmenter omfatter Vh og Vl domener fra antistoff, hvori disse domenene er tilstede i en enkel polypeptid kjede. Generelt omfatter Fv polypeptidet ytterligere en polypeptidlinker mellom VH og Vl domener som gjør sFv i stand til å danne ønsket struktur for antigenbinding. For en oversikt av sFv se Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, ss. 269-315 (1994).

Betegnelsen "diastoff' refereres til små antistoff fragmenter med to antigen-bindingsseter, hvis fragmenter omfatter en tungkjede variabelt domene (Vh) forbundet til et lettkjede variabelt domene (Vl) i samme polypeptidkjede (Vh-Vl). Ved å bruke en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på samme kjede, blir domene tvunget til å parre med komplementære domener fra en annen kjede og danne to antigenbindingsseter. Diastoff er beskrevet mer i sin helhet i for eksempel EP 404,097; WO 93/11161; og Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993).

Uttrykket "lineære antistoff" når de blir brukt i denne søknaden refererer seg til antistoff beskrevet i Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). I korthet omfatter disse antistoffene et par av tandem Fd segmenter (Vh-Ch1-Vh-Ch1) som danner et par av antigenbindende regioner. Lineære antistoff kan være bispesifikke eller monospesifikke.

En "variant" anti-VEGF antistoff refererer seg her til et molekyl som er forskjellig i aminosyresekvens fra en "foreldre" anti-VEGF antistoff aminosyresekvens i kraft av addisjon, delesjon og/eller substitusjon av en eller flere aminosyreresidie(r) i foreldre antistoffsekvensen. I en foretrukket utførelsesform omfatter varianten en eller flere aminosyresubstitusjoner i en eller flere hypervariable regioner fra foreldre antistoffet. For eksempel kan varianten omfatte minst en, for eksempel fra omtrent en til omtrent ti, og fortrinnsvis fra omtrent to til omtrent fem, substitusjoner i en eller flere hypervariable regioner til foreldreantistoffet. Vanligvis vil varianten ha en aminosyre-sekvens som har minst 75% aminosyresekvensidentitet med foreldreantistoffets tunge eller lette kjedevariabel domensekvenser (for eksempel som i SEQ ED nr. 7 eller 8), mer å foretrekke minst 80%, mer foretekkbart minst 85%, mer å foretrekke minst 90% og mest å foretrekke minst 95%. Identitet eller homologi med hensyn til denne sekvensen er definert heri som prosenten av aminosyreresidier i kandidatsekvensen som er identisk med foreldreantistoffresidiene, efter oppstilling av sekvensene og introduserende mellomrom, hvis det er nødvendig, for å oppnå maksimum prosentsekvensidentitet. Ingen av de N-terminale, C-terminale eller interne ekstensjoner, delesjoner eller insersjoner i antistoffsekvensen skal konstrueres slik at det affisere sekvensidentitet eller homologi. Variantene bibeholder evnen til å binde humant VEGF og fortrinnsvis har egenskaper som er overlegen i forhold til foreldre antistoffet. For eksempel kan varianten ha en sterkere bindingsaffinitet, forsterket evne til å inhibere VEGF indusert proliferering av endotelceller og/eller økt evne til å inhibere VEGF-indusert angiogenese in vivo. For å analysere slike egenskaper burde en sammenligne en Fab-form av varianten til en Fab-form fra foreldre antistoffet eller en fullengde form av varianten til en fullengde form av foreldre antistoffet, for eksempel siden det er blitt funnet at formatet til anti-VEGF antistoffet omfatter dets aktivitet i biologisk aktivitets-analyse beskrevet heri. Variant antistoffet av spesiell interesse heri er en som utviser minst omtrent ti ganger, fortrinnsvis omtrent minst tyve ganger og mest å foretrekke minst femti ganger forsterkning i biologisk aktivitet sammenlignet med foreldre antistoffet.

"Foreldre" antistoffet heri er en som blir kodet av en aminosyresekvens brukt for fremstilling av varianten. Fortrinnsvis har foreldre antistoffet en human gnumstruktur-region og, hvis den er tilstede, har humant antistoff konstant region(er). For eksempel, kan foreldre antistoffet være et humanisert eller humant antistoff.

Et "isolert" antistoff er et som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent fra dets naturlige miljø. Kontaminantkomponenter fra dets naturlige miljø er materialer som vil interferere med diagnostisk eller terapeutisk anvendelse av antistoffet, og kan inkludere enzymer, hormoner, og andre proteinøse eller ikke-proteinøse oppløsninger. I foretrukne utførelsesformer vil antistoffet bli renset (1) til mer enn 95% ved vekt av antistoffet som bestemt ved Lowry metoden, og mest foretrekkbart mer enn 90% ved vekt, (2) til en grad som er tilstrekkelig for å erverve minst 15 residier av den N-terminale eller interne aminosyreseskvensen ved bruk av en "spinning cup" sekuenator, eller (3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å bruke Coomassie blå eller, fortrinnsvis sølvfarging. Isolerte antistoff inkluderer antistoff in situ innen rekombinante celler siden minst en komponent av antistoffets naturlige miljø ikke vil være tilstede. Vanligvis vil isolerte antistoff imidlertid bli fremstilt ved minst et rensningstrinn.

Betegnelsen "epitop merket" når den blir brukt heri refererer seg til anti-VEGF antistoff fusert til et "epitop merke". Epitopmerket polypeptid har tilstrekkelig residier til å tilveiebringe en epitop som et antistoff mot det kan fremstilles, og at det likevel er tilstrekkelig kort slik at det ikke interfererer med aktiviteten til VEGF-antistoffet. Epitopmerket er fortrinnsvis tilstrekkelig unikt slik at antistoff mot dette ikke i det vesentlige kryssreagerer med andre epitoper. Passende merke polypeptider har generelt minst 6 aminosyreresidier og vanligvis mellom omtrent 8-50 aminosyreresidier (fortrinnsvis mellom 9-30 residier). Eksempler inkluderer flu HA merke polypeptid og dets antistoff 12CA5 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165 (1988)); c-myc merke og 8F9, 6E10, G4, B7 og 9E10 antistoff derav (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); og Herpes Simplex virus glykoprotein D (gD) merke og dets antistoff (Paborksy et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). I visse utførelsesformer er epitopmerket en "salvage reseptorbindingsepitop". Som brukt heri refererer betegnelsen "salvage reseptor bindingsepitop" til et epitop i Fc-regionen til et IgG molekyl (for eksempel IgGi, IgG2, IgG3, eller IgG4) som er ansvarlig for økningen av in vivo serums-halveringstid av IgG molekylet.

Betegnelsen "sytotoksisk middel" som brukt heri refererer seg til en substans som inhiberer eller forhindrer funksjonen av celler og/eller forårsaker destruksjon av celler. Betegnelsen har til hensikt å inkludere radioaktive isotoper (for eksempel I<13>1,112<5>, Y<90 >og Re ), kjemoterapeutiske midler, og toksiner slik som enzymatisk aktive toksiner fra bakterier, sopp, plante eller dyreopprinnelse, eller fragmenter derav.

Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er nyttig i behandlingen av cancer. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer Adriamysin, Dokorubisin, 5-Fluorourasil, Sytosin arabinosid ("Ara-C"), Syklofosfamid, Melfalan, Vinblastin, Bleomysin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomysin C, Mitoxantron, Vincreisine, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposide, Daunomysin, Carminomysin, Aminopterin, Dactinomysin, Mitomysiner, Esperamisiner (se US patent nr. 4,675,187), Melfalan og andre relaterte nitrogen senneper.

Betegnelsen "promedikament" som brukt heri i denne søknaden refererer seg til en forløper eller derivat fra en farmasøytisk aktiv substans som er mindre sytotoksisk til tumorcellene sammenlignet med foreldremedikamentet og er i stand til å være enzymatisk aktivert eller konvertert til en mer aktiv foreldreform. Se for eksempel Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, ss. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) og Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed), ss. 247-267, Human Press (1985). Promedikamentene fra denne oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, fosfatinneholdende promedikamenter, tiofosfat-inneholdende promedikamenter, sulfat inneholdende promedikamenter, peptid inneholdende promedikamenter, D-aminosyre modifiserte promedikamenter, glykosylerte promedikamenter, B-laktam-inneholdende promedikamenter, eventuelt substituert fenoksyasetamid-inneholdende promedikamenter eller eventuelt substituerte fenylasetamid- inneholdende promedikamenter, 5-fluorsytosin og andre 5-fluoruridin promedikamenter som kan bli omdannet til mer aktivt sytotoksisk fritt medikament. Eksempler på sytotoksiske medikamenter som kan bli derivatisert i et promedikament form for anvendelse i denne oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, de kjemoterapeutiske midlene beskrevet over.

Ordet "merke" når det blir brukt heri refererer seg til en detekterbar forbindelse eller sammensetning som er konjugert direkte eller indirekte på antistoffet. Merket kan i seg selv være detekterbart (for eksempel radioisotop merker eller fluorescens merker) eller, i tilfellet av enzymatisk merking, kan katalysere kjemisk endring av en substrat-forbindelse ved sammensetning som er detekterbar.

Ved "fast fase" menes en ikke-vandig matriks til hvilken antistoffet fra foreliggende oppfinnelse kan festes. Eksempler på faste faser som omfattes heri inkluderer de som er dannet partielt eller fullsendig av glass (for eksempel kontrollert poreglass), polysakkarider (for eksempel agarose), polyakrylamider, polystyren, polyvinyl alkohol og silikoner. I visse utførelsesformer, avhengig av sammenhengen, kan den faste fase omfatte brønnen på en analyseplate; i andre er den en rensningskolonne (for eksempel en affinitetslffomatografikolonne). Denne betegnelsen inkluderer også en diskontinuerlig fast fase på adskilte partikler, slik som de som er beskrevet i US patent nr. 4,275,149.

En "liposom" er en liten vesikel sammensatt av forskjellige typer av lipider, fosfolipider og/eller overflateaktivt stoff som er nyttig for avlevering av et medikament (slik som anti-VEGF antistoff beskrevet heri, og eventuelt et kjemoterapeutisk middel) til et pattedyr. Komponentene fra liposomet er vanligvis arrangert i en bilagsformasjon, på samme måte som lipidarrangementet i biologiske membraner. Et "isolert" nukleinsyremolekyl er et nukleinsyremolekyl som er identifisert og separert fra minst en kontaminerende nukleinsyremolekyl som den vanligvis er assosiert med i den naturlige kilden av antistoff nukleinsyre. Et isolert nukleinsyremolekyl er et annet enn i formen eller tilstanden hvori den finnes i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler adskilles derfor fra nukleinsyremolekyler som eksisterer i naturlige celler. Imidlertid inkluderer et isolert nukleinsyremolekyl et nukleinsyremolekyl som finnes i celler som vanligvis uttrykker antistoffet hvor, for eksempel, nukleinsyremolekylet er i en kromosomal lokalisering som er forskjellig fra naturlige celler.

Uttrykket "kontrollsekvenser" rerfererer seg til DNA sekvenser som er nødvendig for ekspresjon av en operativt koblet kodende sekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnet for prokaryoter, for eksempel, inkluderer en promoter, eventuelt en operatorsekvens, og et ribosomt bindingssete. Eukaryote celler er kjent for å utnytte promotere, polyadenyleirngssignaler og enhansere.

Nukleinsyre er "operativt koblet" når den er plassert i et funksjonelt forhold med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operativ koblet til DNA til et polypeptid hvis den blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjon av polypeptidet; en promoter eller enhanser er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den innvirker på transkripsjon av sekvensen; eller et ribosom-bindingssete er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den er posisjonert for å fremme translasjon. Generelt betyr "operativt koblet" at DNA sekvensene som kobles er nærliggende, og, i tilfelle av en sekretorisk leder, nærliggende og i leseramme. Imidlertid behøver enhancere ikke å være nærliggende. Koblingen blir fullført ved ligering ved beleilige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer blir syntetisk oligonukleotidadaptere eller linkere brukt i samsvar med konvensjonell praksis.

Som brukt heri blir uttrykkene "celle", "cellelinje" og "cellekultur" brukt om hverandre og alle slike betegnelser inkluderer avkom. Således inkluderer ordene "transformanter" og "transformerte celler" primærindivid celler og kulturer avledet derfrå uten hensyn til antallet overføringer. Det skal også forstås at alle avkom ikke behøver å være fullstendig identiske i DNA innhold, på grunn av overveide eller uaktsomme mutasjoner. Mutant avkom som har samme funksjon i biologisk aktivitet som det screenes for i de originale transformerte cellene er inkludert. Når distinkte betegnelser er tilsiktet, vil dette gå klart fram av sammenhengen.

II. Metoder for å utføre oppfinnelsen

Eksemplene herunder beskriver produksjon av humaniserte og variant anti-VEGF antistoff med ønskede egenskaper for et terapeutisk perspektiv inklusiv: a) sterk bindingsaffinitet for VEGF-antigen;

b) evnen til å inhibere VEGF-indusert proliferering og endotelceller in vitro; og

c) evnen til å inhibere VEGF-indusert angiogenese in vivo.

Antistoffaffiniteter kan bli bestemt som beskrevet i eksemplene herunder. Foretrukne

humaniserte eller variant antistoff er de som binder human VEGF med en Kd verdi på ikke mer enn 1x10 Q M, mest foretrekkbart ikke mer enn omtrent 5 x 10" QM, og/eller har en ED50 verdi for inhibering av VEGF-indusert proliferering av endotelceller in vitro som ikke er større enn 5nM

Bortsett fra antistoffene med sterk bmdin<g>saffinitet til humant VEGF, er det også ønskelig å selektere humaniserte eller variant antistoff som har andre fordelaktige egenskaper fra et terapeutisk perspektiv. For eksempel kan antistoffet være et som inhiberer endotelcellevekst i respons på VEGF. I en utførelsesform kan antistoffet være i stand til å inhibere bovine kapillær endotelcelle proliferering i respons til en nær maksimal effektiv konsentrasjon av VEGF (3 ng/ml). Fortrinnsvis har antistoffet en effektiv dose 50 (ED50) verdi på ikke mer enn omtrent 5 nM, fortrinnsvis ikke mer enn omtrent 1 nM, og mest foretrekkbart ikke mer enn omtrent 0,5 nM, for å inhibere VEGF-indusert proliferering av endotelceller i denne "endotelcellevekst-anaryse", dvs. ved disse konsentrasjonene er antistoffet i stand til å inhibere VEGF-indusert endotelcellevekst in vitro med 50%. En foretrukket "endotelcellevekstanalyse" involverer dyrkning av bovint adrenal korteks avledet kapellær endotelceller i nærvær av lav glukose Dulbecco's modifiserte "Eagles" medium (DMEM)(GE6C0) Supplert med 10% kalveserum, 2 mM glutamin, og antibiotika (vekstmedium), vesentlig som beskrevet i eksempel 1 under. Disse endotelcellene blir sådd ut med en tetthet på 6 x 10<3> celler pr. brønn, i 6-brønners plater i vekstmedium. Enten foreldre anti-VEGF antistoff (kontroll), humanisert eller variant anti-VEGF antistoff blir deretter tilsatt i konsentrasjoner som varierer mellom 1 og 5000 ng/ml. Efter 2-3 timer ble renset VEGF tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 3 ng/ml. For spesifisitetskontroll, ble hvert antistoff tilsatt til endotelceller ved en konsentrasjon på 5000 ng/ml, enten alene eller ved tilstedeværelse av 2 ng/ml bFGF. Efter fem eller seks dager blir cellene dissosiert ved eksponering til trypsin og talt i en Coulter teller (Coulter Electronics, Hialeah, FL.) Data kan bli analysert av en 4-parameters kurve tilpasningsprogram (KaleidaGraph).

Foretrukket humanisert eller variant anti-VEGF antistoff kan også være en som har in

vivo suppresjonsaktivitet. For eksempel, kan antistoffet undertrykke veksten av human A673 rhabdomyosarcoma celler eller brystkarsinoma MDA-MB-435 celler i nakne mus. For in vivo tumorstudier er human A673 rhabdomyosarcoma celler (ATCC; CRL 1598) eller MDA-MB-435 celler (tilgjengelig fra ATCC) dyrket i DMEM/F12 supplert med 10% føtal bovin serum, 2 mM glutamin og antibiotika er beskrevet i eksempel 1 under. Hunn BALB/c nakne mus, 6-10 uker gamle, blir injisert subkutant med 2 x IO<6> tumor celler i det dorsale området i et volum på 200 ul Dyrene ble derefter behandlet med humanisert eller variant antistoff og et kontroll antistoff med ingen aktivitet i denne analysen. Det humaniserte eller variant anti-VEGF MAb blir administrert med en dose på 0,5 og/eller 5 mg/kg. Hver MAb blir administrert to ganger uken intraperitonalt i et volum på 100 ul ved start 24 timer efter tumorcelleinokulering. Tumorstørrelsen blir bestemt ved ukentlige intervaller. Fire uker efter tumorcelleinokuleringen, blir dyrene avlivet og tumoren blir fjernet og veiet. Statistisk analyse kan bli utført ved ANOVA. Fortrinnsvis inhiberer antistoffet i denne " in vivo tumoranalyse" omtrent 50-100%, fortrinnsvis omtrent 70-100% og mest å foretrekke omtrent 80-100% human A673 tumor cellevekst med en dose på 5 mg/kg.

I den foretrukne utførelsesformen svikter humanisert eller variant antistoff med å reise en immunogen respons ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av antistoff til en human pasient. Hvis en immunogen respons blir reist, vil fortrinnsvis responsen være slik at antistoffet fortsatt tilveiebringer en terapeutisk fordel for pasienten som blir behandlet dermed.

Det humaniserte eller variant antistoffet er også fortrinnsvis et som er i stand til å inhibere VEGF-indusert angionese i et menneske, for eksempel for å inhibere human tumor vekst og/eller inhibere intraokulær angionense i netthinnesykdommer.

Foretrukne antistoffer binder "epitop A4.6.1" som definert heri. For å screene for antistoff som binder til epitopen på humant VEGF bundet til et antistoff av interesse (for eksempel de som blokkerer binding av A4.6.1 antistoff til human VEGF), kan en rutine kryssblokkeringsanalyse slik som den som er beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988) utføres. Alternativt kan epitopkartlegging, for eksempel som beskrevet i Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) bli utført for å bestemme om antistoffet binder et epitop av interesse.

Antistoffene til de foretrukne utførelsesformene heri har et tungkjede variabelt domene som omfatter en aminosyresekvens representert ved formelen: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, hvori "FR1-4" representerer fire grunnstriucturregioner og "CDRH1-3" representerer tre hypervariable regioner til et anti-VEGF antistoff variabelt tungt domene. FRI-4 kan bli avledet fra en "konsensus-sekvens" (dvs. mest vanlig aminosyrer i en klasse, subklasse eller subgruppe av tunge eller lette kjeder av humane immunoglobuliner) som i eksemplene under og kan bli avledet fra en individuell human antistoff grunnstrukturregion eller fra en kombinasjon av forskjellige grunnstruktur-regionsekvenser. Mange humane antistoff grurmslrukturregionsekvenser er sammenstilt i Kabat et al., supra, for eksempel. I en foretrukket utførelsesform er variabel tung FR tilveiebragt av en konsensussekvens av en human immunoglobulin subgruppe som sammenstilt i Kabat et al, supra. Fortrinnsvis er den humane immunoglobulin-subgruppen human tungkjede subgruppe KT. (for eksempel som i SEQ ID nr. 11).

Den humane variable tunge FR-sekvensen har fortrinnsvis substitusjoner deri, for eksempel hvori human FR residie er erstattet av et korresponderende ikke-human residie (ved "korresponderende ikke-human residie" menes ikke humant residie med samme Kabat-posisjonsnummerering som den humane residien av interesse når de humane og ikke-humane sekvensene er stilt opp ved siden av hverandre), men erstatning med ikke-human residie er ikke nødvendig. For eksempel kan en erstatning av FR-residie som er en annen en en korresponderende ikke-human residie bli selektert ved fagefremvisning (se eksempel 2 under). Eksempelvariabel tung FR-residier kan bli substituert inkludert en eller flere FR-residienummer: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (Kabat residie nummerering er anvendt her). Fortrinnsvis minst to eller minst tre, eller minst fire av disse residiene er substituert. En spesiell foretrukket kombinasjon er FR-substitusjoner: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H og 94H.

Med hensyn til tungkjede hypervariable regioner har disse fortrinnsvis aminosyresekvenser som følger:

CDRH1

GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ EO NR. 117), hvori Xi er D, T eller E, men fortrinnsvis er D eller T; X2 er F, W eller Y; men fortrinnsvis er F; X3 er T, Q, G eller S, men fortrinnsvis T; X4 er H eller N; og X5 er M eller I, men fortrinnsvis er M.

CDRH2

WINTXiTGEPTYAADFKR (SEQ EO NR. 118), hvori X, er Y eller W, men fortrinnsvis er Y.

CDRH3

YPX, YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NR. 119), hvori Xi er Y; X2 er Y, R, K, I, T, E eller W, men fortrinnsvis er Y; X3 er G, N, A, D, Q, E, T, K, eller S, men fortrinnsvis er G; X4 er S, T, K, Q, N, R, A, E, eller G, men fortrinnsvis er S eller T; og X5 er S eller G, men fortrinnsvis er S.

Tungkjede variabelt domene omfatter eventuelt det som har blitt betegnet "CDR7" heri med (dvs. den dannende parten av) FR3 (se figurene 9B og 10B), hvori CDR7 kan ha følgende aminosyresekvens:

CDR7

X] SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ED NR. 120, hvori Xi er F, I, V, L eller A, men fortrinnsvis er F; X2 er A, L, V, eller I, men fortrinnsvis er L; X3 er T, V eller K, men fortrinnsvis er T; X4 er S eller W, men fortrinnsvis er S; X5 er S, eller K, men fortrinnsvis er K; X6 er N, eller S, men fortrinnsvis er S; og X7 er V, A, L eller I, men fortrinnsvis er A.

Antistoffene fra foretrukket utførelsesform heri har et lett kjede variabelt domene som omfatter en aminosyresekvens representert ved formelen: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, hvori "FRI-4" representerer fire grunnstrukturregioner og "CDRL1-3" representerer tre hypervariable regioner av en anti-VEGF antistoff variabel tungdomene. FRI-4 kan bli avledet fra en "konsensus-sekvens" (dvs. mest vanlig aminosyrer i en klasse, subklasse eller subgruppe av tunge eller lette kjeder fra humane irnmunoglobuliner) som i eksemplene under eller kan bli avledet fra en individuell human antistoffgrurmstrukturregion eller fra en kombinasjon av forskjellige grurmstrukturregionsekvenser. I en foretrukket utførelsesform, blir variabel lett FR tilveiebragt av en konsensussekvens fra en human immunoglobulinsubgruppe som sammenstilt av Kabat et al., supra. Fortrinnsvis er den humane imrnunoglobulin-subgruppen human kappa lett kjede subsgruppe I (for eksempel som i SEQ ED nr. 12).

Human variabel lett FR-sekvens har fortrinnsvis substitusjoner deri, for eksempel hvori human FR-residie er erstattet av en korresponderende museresidie, men erstatningen med ikke-human residie er ikke nødvendig. For eksempel kan en erstatningsresidie som er en annen enn korresponderende ikke-human residie bli selektert ved fagefremvisning (se eksempel 2 under). Eksempler på variable lett FR-residier som kan bli substituert inkluderer en hvilken som helst eller flere av FR-residienumrene: 4L, 46L og 71L (Kabat residie nummerering er anvendt her).

Fortrinnsvis er bare 46L substituert. I en annen utførelsesform er både 4L og 46L substituert.

Med hensyn til CDR har disse fortrinnsvis aminosyresekvenser som følger:

CDRL1

X1X2X3X4X5SNYLN (SEQ ED nr. 121) hvori Xi er R eller S, men fortrinnsvis er S: X2 er S eller N, men fortrinnsvis er S; X3 er Q eller E, men fortrinnsvis er Q; X4 er Q eller D, men fortrinnsvis er D; og X5 er I eller L, men fortrinnsvis er E

CDRL2

FTSSLHS (SEQ ID NR. 122)

CDRL3

QQYSX1X2PWT (SEQ ID NR. 123), hvori X, er T, A eller N, men fortrinnsvis er T; men X2 er V eller T, men fortrinnsvis er V.

Foretrukne humaniserte anti-VEGF antistoff er de som har tung og/eller lett variable domensekvenser av F(ab)-12 i eksempel 1 og varianter derav slik som affinitetsmodne former inklusive variantene Y0317, Y0313-1 og Y0238-3 i eksempel 3, med Y0317 som den foretrukne varianten. Metoder for å danne humaniserte anti-VEGF antistoff av interesse heri er forklart i mer detalj under.

A. Antistoff fremstilling

Metoder for å humanisere ikke-human VEGF antistoff og danne varianter av anti-VEGF antistoffer beskrevet i eksemplene under. For å humanisere et anti-VEGF antistoff, blir et ikke-humant antistoff utgangsmateriale preparert. Hvor en variant skal dannes blir foreldre antistoffet fremstilt. Eksempelteknikker for å danne slike ikke-humane antistoffutgangsmaterialer og foreldre antistoff blir beskrevet i de følgende avsnitt.

( i) Antigenfremstilling

VEGF-antigen som skal brukes for produksjon av antistoff kan være, for eksempel intakt VEGF eller fragment av VEGF (for eksempel et VEGF-fragment som omfatter "epitop A4.6.1"). Andre former av VEGF som er nyttige for å danne antistoff vil være tydelig for de som kjenner fagfeltet. VEGF-antistoffet som blir brukt for å fremstille antistoffet er fortrinnsvis humant VEGF, for eksempel som beskrevet i Leung et al., Science 246:1306 (1989) og Houck et al., Mol. Endocrin, 5:1806 (1991).

( ii) Polyklonale antistoff

Polyklonale antistoffer fortrinnsvis reist i dyr ved flere subkutane (sc) eller intraperitonale (ip) injeksjoner av relevant antigen og et adjuvant. Det kan være nyttig å konjugere det relevante antigenet til et protein som er immunpgent i arten som skal immuniseres, for eksempel "keyhole limpet" hemosyanin, serum albumin, bovin tyroglobulin, eller soyabønnetrypsin inhibitor ved å bruke en bifunksjonell eller derivatiserende middel, for eksempel, maleimidobensoyl sulfosuksinimid ester (konjugsjon gjennom systeinresidiene), N-hydroksysuksmimid (gjennom lysinresidiene), glutaraldehyd, suksininanhydrid, SOCI2, eller R<1>N=C=NR, hvor R og R<1 >er forskjellig alkylgrupper.

Dyrene blir immunisert mot antigenet, immunogene konjugater, eller derivater ved å kombinere, for eksempel 100 ug eller 5 u,g av proteinet eller konjugatet (for henholdsvis kaniner eller mus) med 3 volum av Frund's fullstendige adjuvant og injisere løsningen intradermalt på flere steder. En måned senere blir dyrene "boosted" med 1/5 til 1/10 av utgangsmengden av peptid eller konjugatet i Freund's fullstendige adjuvant ved subkutan injeksjon på mange steder. Syv til 14 dager senere tas blodprøver fra dyrene og serumet blir analysert for antistofftiter. Dyrene blir "boosted" inntil titeren når et platå. Fortrinnsvis blir dyrene "boosted" med konjugatet av samme antigen, men konjugatet til forskjellig protein og/eller gjennom forskjellig krysningsreagens. Konjugatene kan også bli fremstilt i rekombinant cellekultur som proteinfusjoner. Også aggregerende midler slik som alum er egnet brukt til å øke immunresponsen.

( iii) Monoklonale antistoff

Monoklonale antistoff kan bli fremstilt ved å bruke hybridommetoden først beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), eller kan bli fremstilt ved rekombinante DNA metoder (US patent nr. 4,816,567).

I hybridommetoden blir en mus eller et annet passende vertsdyr, slik som en hamster eller en makakue ape, immunisert som ovenfor beskrevet for reise lymfosytter som produserer eller er i stand til å produsere antistoff som spesifikt vil binde til proteinet som blir brukt for immumsering. Alternativt, kan lymfosytter bli immunisert in vitro. Lymfosyttene blir deretter fusert med myeloma celler ved å bruke et egnet sammen-smeltningsmiddel slik som polyetylenglykol, for å danne en hybridomcelle (Godin, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, ss. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Hybridomcellene som derved blir fremstilt blir sådd ut og dyrket i et egnet kulturmedium som fortrinnsvis inneholder en eller flere substanser som inhiberer vekst eller overlevelse av ikke-sammensmeltede parenterale myeloma celler. For eksempel, hvis parenteral myeloma celler mangler enzymet hupoksantin guanin fosforibosyl transferase (HGPRT eller HPRT), vil kulturmediumet for hybridomaene inkludere hypoksantin, aminoterin, og tymidin (HAT medium), hvis substanser forhindrer veksten av HGPRT-mangelfulle celler.

Foretrukne myeloma celler er de som fuserer effektivt, støtter stabil høynivå produksjon av antistoff av selekterte antistoffproduserende celler, og er sensitive til et medium slik som HAT-medium. Blant disse foretrukne myelomacellelinjene er murine myeloma linjer, slik som de som er avledet fra MOP-21 og M.C-11 musetumorer tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA og SP-2 eller X63-Ag8-653 celler tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Human myeloma og muse-human heteromyeloma cellelinjer har også blitt beskrevet for produksjonen av humane monoklonale antistoff (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. New York, 1987)).

Kulturmediumet hvori hybridoma cellene blir dyrket, blir analysert ved produksjon av monoklonale antistoff rettet mot antigenet. Fortrinnsvis er bindingsspesifisiteten til de monoklonale antistoffene produsert av hybridomacellene bestemt ved irnmuno-presipitering eller ved in vitro bindingsanalyse, slik som radioirnmunoanalyse (RIA) eller enzym-koblet immunoabsorbans analyse (ELISA).

Bindingsaffiniteten av monoklonale antistoff kan, for eksempel, bli bestemt av Scatchard analyse fra Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Efter at hybridomcellene er identifisert som produserer antistoff av ønsket spesifisitet, affinitet, og/eller aktivitet, kan klonene bli subklonet ved begrenset fortynningsprosedyrer og dyrket ved standardmetoder (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles andPractice, ss. 59-103 (Academic Press, 1986)). Egnet kulturmedium for dette formålet inkluderer for eksempel D-MEM eller RPMI-1640 medium. I tillegg kan hybridomceller dyrkes in vivo som ascites tumorer i et dyr.

Monoklonale antistoff som sekreteres fra subklonene blir separert fra kulturmediumet på en egnet måte, ascites væske, eller serum ved konvensjonell immunoglobulinresnings-prosedyrer slik som for eksempel protein A-sepharose, hydroksylapatit kromatografi, gel elektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

DNA som koder for monoklonale antistoffer lett isolert og sekvensert ved å bruke konvensjonell prosedyre (for eksempel ved å bruke oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for tunge og lette kjeder til de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene tjener som foretrukket kilde for slikt DNA. Når det er isolert kan DNA bli produsert i ekspresjonsvektorer, som deretter blir transfektert inn i vertsceller slik som E. Coli celler, ape COS celler, kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, eller myeloma celler som ellers ikke ville produsere immunoglobulinprotein, for å erverve syntese av monoklonale antistoff i rekombinante vertsceller. Rekombinant produksjon av antistoff vil bli beskrevet mer detaljert under.

( tv) Humanisering og aminosyresekvensvarianter

Eksemplene 1-2 under beskriver prosedyrer for humanisering av et anti-VEGF antistoff. I visse utførelsesformer kan det være ønskelig å danne aminosyresekvensvarianter av disse humaniserte antistoffene, spesielt hvor disse forbedrer bindingsaffiniteten eller andre biologiske egenskaper til det humaniserte antistoffet. Eksempel 3 beskriver metodologier for fremstilling av aminosyresekvensvarianter av en anti-VEGF antistoff med økt affinitet i forhold til foreldre antistoffet.

Aminosyresekvensvarianten til anti-VEGF antistoffet blir fremstilt ved å introdusere passende nukleotidendringer i anti-VEGF antistoff DNA, eller ved peptidsyntese. Slike varianter inkluderer, for eksempel, delesjoner fra, og/eller insersjoner inn i og/eller substitusjoner av, residier innen aminosyresekvensene til anti-VEGF antistoffene av eksemplene heri. Enhver kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon er fremstilt for å gi en sluttkonstruksjon, forutsatt at sluttkonstruksjonen utviser ønskede karakteristika. Aminosyreendringene kan også endre posttranslasjonell prosessering av humaniserte eller variant anti-VEGF antistoff, slik som endring av antall eller posisjon av glykosyleringsseter.

En nyttig metode for å identifisere visse residier eller regioner av anti-VEGF antistoff som er foretrukne steder for mutagenese blir kalt "alanin scanning mutagense", som beskrevet av Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Her blir en residie eller en gruppe av målresidier identifisert (for eksempel ladede residier slik som arg, asp, his, lys, og glu) og erstattet med en nøytral eller negativt ladet aminosyre (fortrinnsvis alanin eller polyalanin) for å virke inn på interaksjonen til aminosyrene med VEGF-antigenet. De aminosyrelokaliseringene som viser funksjonell sensitivitet til substitusjonene blir deretter foredlet ved å introdusere ytterligere eller andre varianter av, eller for, setene for substitusjon. Derfor mens setet for introduksjon av aminosyre-sekvensvariasjonen blir forutbestemt, trenger ikke karakteren til mutasjonen per se å være forutbestemt. For eksempel for å analysere utførelse av en mutasjon på et gitt sete, blir ala scanning eller tilfeldig mutagenese utført på et målkodon eller region og de uttrykte anti-VEGF antistoffvariantene blir screenet for ønsket aktivitet. Alanin scanningsmutagense er beskrevet i eksempel 3.

Aminosyreseskvensinsersjoner inkluderer amino- og/eller karboksyl-terminale fusjoner som varierer i lengde fra en residie til polypeptider som inneholder 100 eller flere residier, såvel som intrasekvens insersjoner av enkle eller flere aminosyreresidier. Eksempler på terminale insersjoner inkluderer en anti-VEGF antistoff med en terminal metionyl residie eller antistoff fusert til et epitopmerke. Andre insersjonsvarianter av anti-VEGF antistoff molekyl inkluderer fusjon til N- eller C-terminal ende av anti-VEGF antistoff til et enzym eller et polypeptid som øker serumhalveirngstiden til antistoffet (se under).

En annen type av variant er en aminosyresubstitusjonsvariant. Disse variantene har minst en aminosyreresidie i anti-VEGF antistoff molekylet fjernet og forskjellige residier satt inn på dets plass. Setene av størst interesse for substitusjonen mutagenese inkluderer hypervariable regioner, men FR-endringer er også forutsatt. Konservative substitusjoner er vist i tabell 1 under overskriften "foretrukne substitusjoner". Hvis slike substitusjoner resulterer i endring i biologisk aktivitet, kan flere substitusjonelle endringer, betegnet "eksempel substitusjoner" i tabell 1, eller som ytterligere beskrevet under med referanse til aminosyreklasser bli introdusert og produktene screenet.

Substansielle modifiseringer i biologiske egenskaper av antistoffet blir oppnådd ved å selekterere substitusjoner som er signifikant forskjellig i deres effekt i å opprettholde a) strukturen av polypeptidskjelettet i området for substitusjonen, for eksempel, som en "sheet" eller heliks konformasjon,

b) ladning eller hydrofobisitet av molekylet i målsetet, eller

c) størrelsen av sidekjedet.

Naturlig forekommende residier blir delt i to grupper basert på vanlig

sidekj edeegenskaper

1. hydrofob: norleusin, met, ala, val, leu, ile; 2. nøytrale hydrofile: sys, ser, thr; 3. sure: asp, glu; 4. basiske: asn, gin, his, lys, arg;

5. residier som influerer kjedeorientering: gly, pro, og

aromatisk: trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil medføre bytting av representanter fra en av disse klassene til en annen klasse.

Enhver cystein residie som ikke er involvert i å opprettholde en riktig konformasjon til det humaniserte eller variant anti-VEGF antistoffet kan også bli substituert, generelt med serin, for å forbedre oksidativ stabilitet til molekylet og forhindre avvikende kryssbinding. Omvendt kan systeinbinding(er) tilsettes til antistoffet for å øke dets stabilitet (spesielt hvor antistoffet er et antstoff-fragment slik som et Fv fragment).

En spesiell foretrukket type av substitusjonen variant involverer substituering av en eller flere hypervariable regionresidier hos et foreldre antistoff (for eksempel et humanisert eller humant antistoff). Generelt vil den resulterende variant(er) selektert for ytterligere utvikling ha forbedret biologiske egenskaper i forhold til foreldreantistoffet hvor den er dannet. En enkel vei for å danne slike substitusjonelle varianter er affinitetsmodning ved å bruke fagefremvisning (se eksempel 3 heri). I korthet blir flere hypervariable regionsleder (for eksempel 6-7 steder) mutert for å danne alle mulige amino-substitusjoner på hvert sted. Antistoffvariantene som deretter dannes blir fremvist på en mono valent måte fra filamentøse fagepartikler som fusjoner til gen HI i produkt av Ml 3 pakket i hver partikkel. Fage-fremvisningsvariantene blir deretter screenet for deres biologiske aktivitet (for eksempel bindingsaffinitet) som heri beskrevet. For å identifisere kandidat hypervariable regionsteder for modifisering, kan alanin scannings mutagense (se eksempel 3) bli utført for å identifisere hypervariabel regionresidier som bidrar signifikant til antigenbinding. Alternativt eller i tillegg kan det være en fordel å analysere en krystallstriiktur til antigen-antistoff komplekset for å identifisere kontakt-punkter mellom antistoff og humant VEGF. Slike kontaktresider og nærliggende resider er kandidater for substitusjon ifølge teknikker som er utarbeidet heri. Når slike varianter er dannet blir panelet av varianter utsatt for screening som beskrevet heri og antistoffene med overlegne egenskaper i en eller flere relevante analyser kan bli selektert for

ytterligere utvikling.

En annen type av aminosyrevariant til antistoffet endrer utgangsglykosyleringsmønstret til antistoffet. Ved endring menes deletering av en eller flere karbohydratdeler funnet i antistoffet, og/eller tilsetting av en eller flere glykosileringssteder som ikke er tilstede i antistoffet.

Glykosylering av antistoffer typisk enten N-koblet eller O-koblet. N-koblet refererer seg til binding av karbohydratdelen til sidekjeden til en asparaginresidie. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er en hvilken som helst aminosyre med unntak av prolin, er gjenkjenningssekvensene for enzymatisk tilfesting av karbohydratdelen til asparaginsidekjeden. Således danner tilstedeværelse av en av disse tripeptidsekvensene i et polypeptid et potensielt glykosyleirngssete. O-koblet glykosylering refererer seg til tilfesting av en av sukrene N-aseylgalaktosamin, galaktose, eller xylose til en hydroksyaminosyre, mest vanlig serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan bli brukt.

Tilsetting av glykosyleirngsseter til antistoff blir utført ved å endre aminosyresekvenser slik at det inneholder en eller flere av de ovenforbeskrevne tripeptidseskvenser (for N-koblet glykosyleirngsseter). Endringen kan også bli gjort ved tilsetting av, eller substitusjon av, en eller flere serin eller tteoninresidier til sekvensen av utgangsantistoffet (for O-koblet glykosyleringssete).

Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvensvarianter til anti-VEGF antistoffet blir fremstilt ved forskjellige metoder kjent innen fagfeltet. Disse metodene inkluderer, men er ikke begrenset til, isolering fra en naturlig kilde (i tilfelle av naturlig forekommende aminosyresekvensvarianter) eller fremstillingen av oligonukleotid-mediert (eller setedirigert) mutagenese, PCR-mutagense og kassettmutagenese av en tidligere fremstilt variant eller en ikke-variant versjon av anti-VEGF antistoff.

( v) Humane antistoff

Som et alternativ til humanisering kan humane antistoff bli dannet. For eksempel er det nå mulig å produsere transgene dyr, (for eksempel mus) som er i stand til, ved immunisering, å produsere et fullt repertoar av humane antistoff i fravær av endogen immunoglobulinproduksjon. For eksempel har det blitt beskrevet at homozygo delesjon av antistoff tungkjede-koblingsregiongenet (JH) i kimære og kjønncellelinjemuterte mus resulterer i fullstendig inhibering av endogen antistoffbroduksjon. Overføring av human kjønncellelinje immunoglobulingenarrangement i slike kjønnscellelinje mutante mus vil resultere i produksjon av humane antistoff ved antigenutfordring. Se for eksempel Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:225-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); og US patenter 5,591,669, 5,589,369 og 5,545,807. Humane antistoff kan også bli avledet fra fage-fremvisningsbiblioteker (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 225:581-597 (1991); og US patenter 5,565,332 og 5,573,905). Som diskutert ovenfor kan humane antistoff også bli dannet ved in vitro aktiverte B-celler (se US Patenter 5,567,610 og 5,229,275).

( vi) Antistoff- rfagmenter

I visse utførelsesformer er humanisert eller variant anti-VEGF antistoff et antistoff-fragment. Forskjellige teknikker har blitt utviklet for produksjon av antistoff-fragmenter. Tradisjonelt ble disse fragmentene avledet via proteolytisk kutting av intakte antistoff (se, for eksempel, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) og Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Disse fragmentene kan imidlertid nå bli produsert direkte ved rekombinante vertsceller. For eksempel kan Fab'-SH-rfagmenter direkte gjenvinnes fra E. coli og kjemisk kobles for å danne F(ab')2 fragmenter (Carter et al., Bio/ Technology 10:163-167 (1992)). I en annen utførelsesform blir F(ab')2 dannet ved å bruke leusin "zipper" GCN4 for å fremme samling av F(ab')2 molekylet. Ifølge en annen tilnærming, kan Fv, Fab eller F(ab')2 framgmenter bli isolert direkte fra rekombinant vertscellekultur. Andre teknikker for produksjon av antistoff-rfagmenter vil være tydelig for en som kjenner fagfeltet.

( vii) Multispesifikke antistoff

I noen utførelsesformer kan det være ønskelig å danne multispesifikke (for eksempel bispesifikke) humaniserte eller variante anti-VEGF antistoff som har bindingsspesifisiteter for minst to forskjellige epitoper. Eksempel på bispesifikke antistoff kan binde to forskjellige epitoper fra VEGF-proteinet. Alternativt kan en anti-VEGF arm bli kombinert med en arm som binder til et triggermolekyl på en leukosytt slik som et T-celle reseptormolekyl (for eksempel CD2 eller CD3), eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), slik som FcyRO (CD64), FcyRK (CD32) og FcyRHI (CD16) for å fokusere på cellulære forsvarsmekansimer til VEGF-uttrykkende celle. Bispesifikke antistofff kan også bli brukt for å lokalisere sytotoksiske midler til celler som uttrykker VEGF. Disse antistoffene utviser en VEGF-bindingsarm og en arm som binder det sytotoksiske midlet (for eksempel saporin, anti-interferon-a, vinka alkaloid, risin A-kjede, metotreksat eller radioaktiv isotop hapten). Bispesifikke antistoff kan bli fremstilt som full-lengde antistoff eller antistoff-fragmenter (for eksempel F(ab')2-bispesifikke antistoff).

Ifølge en annen utførelsesform for å fremstille bispesifikke antistoff, kan grenseflaten mellom et par antistoffmolekyler bli fremstilt for å maksimalisere prosenten av heterodimerer som blir gjenvunnet fra den rekombinante cellekulturen. Foretrukket grenseflate omfatter minst en del av Cn3-domenet til et antistoff konstante domenet. I denne metoden, blir en eller flere små aminosyresidekjeder fra grenseflaten av første antistoffmolekyl erstattet med en større sidekjede (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompensasjons "hulrom" av identiske eller lik størrelse til den store sidekjeden(e) blir dannet på overflaten av det andre antistoff-molekylet ved å erstatte de store aminosyre-sidekjedene med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimerer over andre uønskede endeprodukter slike som heterodimerer. Se WO96/27011 utgitt 6. september 1996.

Bispesifikke antistoff inkluderer kryssbundet eller "heterokonjugate" antistoff. For eksempel en av av antistoffene i heterokonjugatene kan bli koblet til avidin, den andre til biotin. Heterokonjugate antistoff kan bli fremstilt ved å bruke en hvilken som helst kryssbindingsmetode. Egnede kryssbindingsmidler er velkjente innen fagfeltet, og er beskrevet i US patent nr. 4,676,980 sammen med et antall av kryssbindingsteknikker.

Teknikker for å danne bispesifikke antistoffer eller antistoff-rfagmenter har også blitt beskrevet i litteraturen. For eksempel kan bispesifikke antistoff bli fremstilt ved å bruke kjemisk kobling, Brennan et al., Science 229:8 (1985) beskriver en prosedyre hvori intakte antistoff blir proteolytisk kuttet for å danne F(ab')2 fragmenter. Disse fragmentene blir redusert ved tilstedeværelse av det ditiolkomplekserende midlet natriumarsenitt for å stabilisere tilstøtende ditioler og forhindre intermolekylær disulfiddannelse. Fab'-fragmentene som dannes blir derefter konvertert til tionitrobensoat (TNB) derivater. En av Fab'-TNB derivatene blir derefter rekonvertert til Fab'-tiol ved reduksjon med merkaptoetylarnin og blir blandet med en ekvimola mengde av det andre Fab'-TNB derivatet for å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet som produseres kan bli brukt som midler for selektiv immobilisering av enzymer. I ennå en utførelsesform kan Fab'-SH-rfagmenter som direkte blir gjenvunnet fra E. coli bli kjemisk koblet in vitro for å danne bispesifikke antistoff, Shalaby et al., /. Exp. Med. 175:217-225 (1992).

Forskjellige teknikker for å fremstille og isolere bispesifikke antistoff-rfagmenter direkte fra rekombinant cellekultur har også blitt beskrevet. For eksempel har bispesifikke antistoff blitt produsert ved å bruke leusin "zipper". Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Leusin "zippers" peptidene fra Fos og Jun proteiner ble koblet til Fab' delene av to forskjellige antistoff ved genfusjon. Antistoff-homodimerene ble redusert ved hengselsregionen for å danne monomerer og derefter reoksidert for å danne antistoff heterodimerer. Denne metoden kan også bli brukt for produksjon av antistoff homodimerer.

"Diastoff' teknologi beskrevet av Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) har tilveiebragt en alternativ mekanisme for å fremstille bispesifikke antistoff-rfagmenter. Fragmentene omfatter en tung-kjede variabel domene (Vh) forbundet med en lett-kjede variabel domene (Vl) av en linker som er for kort for å tillate parring mellom de to domenene på samme kjede. Følgelig blir Vh og Vl domenene fra et fragment tvunget til å parre med de komplementære Vl og Vh domenene på et annet fragment, for derved å danne to antigen-bindingsseter. En annen strategi for å lage bispesifikke antistoff-rfagmenter ved bruk av enkelkjede Fv (sFv) dimerer har også blitt rapportert. Se Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Alternativt kan bispesifikke antistoff være et "lineært antistoff' produsert som beskrevet i Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Antistoff med mer enn to valenser forutsettes. For eksempel kan trispesifikke antistoff bli fremstilt. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

( viii) Andre modifiseringer

Andre modifiseringer av humanisert eller variant anti-VEGF antistoff er forutsatt. For eksempel kan det være ønskelig å modifisere antistoffet fra oppfinnelsen med hensyn til effektorfunksjonen, for å øke effektiviteten av antistoffet for behandling av cancer, for eksempel. For eksempel systeinresidie(ne) kan bli introdusert i Fc-regionen, for derved å tillate en disulfiddannelse mellom kjedene i denne regionen. Homodimere antistoff som derv blir dannet kan ha forbedret internaliseringsevne og/eller økt komplement-mediert celleavlivning og antistoffavhengig cellulær sytotoksisitet (ADCC). Se Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) og Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922

(1992). Homodimere antistoff med økt antitumoraktivitet kan også bli fremstilt ved å bruke heterobifunksjonell krysskoblere som beskrevet i Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativt kan antistoff bli fremstilt som har duale Fc-regioner og derved kan ha økt komplement lysis og ADCC evner. Se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Oppfinnelsen vedrører også immunokonjugater som omfatter antistoff beskrevet heri konjugert til et sytotoksisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel, toksin, (for eksempel et enzymatisk aktivt toksin fra bakterier, sopp, plante eller av dyreopprinnelse, eller fragmenter derav), eller et radioaktivt isotop (dvs. et radiokonjugat).

Kjemoterapeutiske midler som er nyttige for dannelse av slike immunokonjugater har blitt beskrevet over. Enzymatiske aktive toksiner og fragmenter derav som kan bli brukt inkluderer difteri A kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteri toksin, eksotoksin A kjede (fra Pseudomonas aeroginosa), rikin A kjede, abrin A kjede, modekin A kjede, alfa-sarkin, Aleurites fordii proteiner, diantin proteiner, Phytolaka amerikana proteiner (PAPI, PAPJJ, og PAP-S), momordica charantia inhibitor, kursin, krotin, sapaonaria "offisinalis" inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictosin, fenomysin, enomysin og trikotekenes. Forskjellige radionukleider er tilgjengelige for produksjon av radiokonjugert anti-VEGF antistoffer. Eksempler inkluderer <212>Bi, <1>311,13lIn, <90>Y og 186Re.

Konjugater av antistoff og sytotoksisk middel blir fremstilt ved å bruke forskjellig bifunksjonell proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slike som dimetyladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidyl suberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis-asido forbindelser (slik som bis (p-asidobensoyl) heksandiamin), bis-diasonium derivater (slik som bis-(p-diasoniumbensoyl)-etylendiamin), diisosyanater (slik som tolyen, 2,6-diisosyanat), og bis-aktiv fluorin forbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobensen). For eksempel er risin immuno-toksin kan bli fremstilt som beskrevet i Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Karbon-14-merket l-isotiosyanatobensyl-3-metyldietylen trianiinpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på gelaterende middel for konjugering av radionukleotidet til antistoffet. Se WO94/11026.

I en annen utførelsesform kan antistoffet bli konugert til en "reseptor" (slik som streptavidin) for utnyttelse i tumorpremålsøking hvori antistoff-reseptor konjugatet blir administrert til pasienten, fulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkulasjonen ved å bruke et klareringsmiddel og derefter administrere en "ligand" (for eksempel avidin) som blir konjugert til et sytotoksisk middel (for eksempel et radionukleid).

Anti-VEGF antistoff beskrevet heri kan også bli formulert som immunoliposomer. Liposomer som inneholder antistoff blir fremstilt ved en metode kjent innen fagfeltet, slik som beskrevet i Epstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); og US patent nr. 4,485,045 og 4,544,545. Liposomer med økt sirkulasjonstid er beskrevet i US patent nr. 5,013,556.

Spesielt nyttige liposomer kan bli dannet ved revers faseevaporeirngsmetode med en lipid sammensetning som omfatter fosfatidylkjolin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomene blir trengt gjennom filtrene ved definert porestørrelse for å gi liposomer med ønsket diameter. Fab'-fragmentene til antistoffet fra foreliggende oppfinnelse kan bli konjugert til liposomer som beskrevet i Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via en disulfid interbyttings reaksjon. Et kjemoterapeutisk middel (slik som Doxorubicin) er eventuelt tilstede inne i liposomen. Se Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19):1484 (1989).

Antistoffet fra foreliggende oppfinnelse kan også bli brukt i ADEPT ved å konjugere antistoff til et promedikament-aktiverende enzym som konverterer et promedikament (for eksempel et peptidyl kjemoterapeutisk middel, se WO81/01145) til et aktivt anti-cancer medikament. Se for eksempel WO 88/07378 og US patent nr. 4,975,278.

Enzymkomponenten til immunokonjugatet som er nyttig for ADEPT inkluderer et hvilket som helst enzym som er i stand til å virke på et promedikament på en slik måte at det konverterer inntil dets mer aktive, sytotoksiske form.

Enzymer som er nyttige i metoden av denne oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, alkalisk fosfatase som er nyttig for å konvertere fosfatinneholdende promedikamenter til frie medikamenter; arylsulfatase som er nyttig for å konvertere sulfatinneholdende promedikamenter til frie medikamenter; sytosindiaminase som er nyttige for å konvertere ikke-toksiske 5-fluorsytosin til anti-cancer medikament, 5-fluorurasil; proteaser slik som serratia protease, termolysin, subtilisin, karboksypeptidase, og katepsiner (slik som katepsiner B og L), som er nyttige for å konvertere peptid-inneholdende promedikamenter til frie medikamenter; D-alanin-karboksypeptidase, nyttige for å konvertere promedikamenter som inneholder D-aminosyresubstituenter; karbohydrat-kuttende enzymer slik som fi-galaktosidase og neurominidase som er nyttige for å konvertere glukosilert promedikamenter til frie medikamenter; fi-laktamase som er nyttige for å konvertere medikamenter derivatisert med 6-laktamer til frie medikamenter; og penisillinamidaser, slik som penisillin V amidase eller pensillin G amidase, som er nyttige for å konvertere medikamenter til frie medikamenter. Alternativt kan antistoff med enzymatisk aktivitet, også kjent innen fagfeltet som "abzymer" bli brukt for å konvertere promedikamentene fra oppfinnelsen til frie aktive medikamenter (se for eksempel Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Antistoff-abzym konjugater kan bli fremstilt som beskrevet heri for avlevering av abzym til en tumorcellepopulasjon.

Enzymene fra denne oppfinnelsen kan bli kovalent bundet til anti-VEGF antistoff ved teknikker som er velkjent innen fagfeltet slik som anvendelse av heterobifunksjonell kryssbindingsreagenser diskutert ovenfor. Alternativt kan fusjonsproteiner som omfatter minst den antigenbindende regionen til et antistoff fra oppfinnelsen koblet til minst en funksjonell aktiv del av et enzym fra oppfinnelsen bli konstruert ved å bruke rekombinante DNA teknikker velkjent innen fagfeltet (se for eksempel Neuberg et al., Nature 312:604-608 (1984)).

I visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan det være ønskelig å bruke et antistoff-fragment, heller enn et intakt antistoff, for å øke tumorpenetrering, for eksempel. I det tilfellet kan det være ønskelig å modifisere antistoff-rfagmentet for å øke dets serums-halveringstid. Dette kan for eksempel oppnås ved å inkorporere en bevaringsreseptor-bindingsepitop i antistoff-rfagmentet, (for eksempel ved mutasjon av egnet region i antistoff-rfagmentet eller ved å inkorporere epitopet inn i et peptidmerke som derefter blir fusert til antistoff-rfagmentet enten i begge ender eller i midten, for eksempel ved DNA eller peptidsyntese). Se W096/32478 publisert 17. oktober 1996.

Bevaringsreseptorbindingsepitopet består generelt av en region hvori en eller flere

aminosyreresidier fra en eller to løkker av Fc domene blir overført til en analog posisjon i antistoff-rfagmentet. Ennå mer å foretrekke, tre eller flere residier fra en eller to løkker fra Fc-domenet blir overført. Ennå mer å foretrekke er epitopet tatt fra CH2-domenet til Fc-region (for eksempel fra et IgG) og overført til CH1, CH3 eller VH-region, eller flere enn en slik region til antistoffet. Alternativt er epitopet tatt fra CH2-domenet til Fc-

regionen og overført til CL-regionen eller VL-regionen, eller begge, til antistoff-fragmentet.

I en særlig foretrukket utførelsesform omfatter bevaringsreseptorbindingsepitopet sekvensen: PKNSSMISNTP (SEQ ED NR. 17) og omfatter eventuelt ytterligere en sekvens selektert fra gruppen bestående av HQSLGTQ (SEQ ED NR. 18), HQNLSDGK (SEQ ED NR. 19), HQNISDGT (SEQ ED NR. 20), eller VISSHLGQ (SEQ ED NR. 21), spesielt hvor antistoff-rfagmentet er en Fab eller F(ab')2. I en annen særlig foretrukket utførelsesform er bevaringsreseptorbindingsepitopet et polypeptid som inneholder sekvensen(e): HQNLSDGK (SEQ ED NR. 19), HQNISDGK (SEQ ED NR. 20), eller VISSHLGQ (SEQ ED NR. 21) og sekvensen: PKNSSMISNTP (SEQ ED NR. 17).

Kovalente modifiseringer av det humanisert eller variant anti-VEGF antistoff er også inkludert innenfor området av denne oppfinnelsen. De kan bli fremstilt ved kjemisk syntese eller ved enzymatisk eller kjemisk kutting av antistoffet, hvis det er egnet. Andre typer av kovalente modifiseringer av antistoffet er introdusert i molekylet ved å reagere målaminosyreresidiene til antistoffet med et organisk derivatisert middel som er i stand til å reagere med selekterte sidekjeder eller N- eller C-terminale residier. Eksempler på kovalente modifiseringer av polypeptidet er beskrevet i US patent nr. 5,534,615, spesielt inkorporert heri ved referanse. En foretrukket type av kovalent modifisering av antistoffet omfatter kobling av antistoffet til en av et antall av ikke-proteinøse polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylen glykol eller polyoksyalkylener, på den måten som er fremsatt i US patent nr. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144: 4,670,417: 4,791,192 eller 4,179,337.

B. Vektorer, vertsceller og rekombinante metoder

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte nukleinsyrer som koder for humaniserte eller variant anti-VEGF antistoff, vektorer og vertsceller som omfatter nukleinsyren og rekombinante teknikker for produksjon av antistoffer.

For rekombinant produksjon av antistoffet, kan nukleinsyren som koder for det bli isolert og insertert i en replikerbar vektor for ytterligere kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. I en annen utførelsesform kan antistoffet bli produsert ved homolog rekombinasjon, for eksempel som beskrevet i US patent nr. 5,204,244, spesielt inkorporert heri ved referanse. DNA som koder for monoklonale antistoff blir lett isolert og sekvensert ved å bruke konvensjonelle prosedyrer (for eksempel ved å bruke oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for tunge og lette kjeder hos antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Vektorkomponentene som generelt er inkludert, men ikke begrenset til, en eller flere av følgende: en signalsekvens, en replikasjonsopprinnelse, en eller flere markørgener, et enhanserelement, en promoter, og en transkripsjonstermineringssekvens, for eksempel som beskrevet i US patent nr. 5,534,615 utgitt 9. juli 1996, og spesifikt inkorporert heri ved referanse.

Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA i vektorene heri er prokaryote, gjær eller høyere eukaryote celler beskrevet over. Egnede prokaryoter for dette formålet inkluderer eubakterier, slik som Gram-negative eller Gram-positive organismer, for eksempel, Enterobakteriasea slik som Escherichia, for eksempel, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescan, og Shigella så vel som Bacilli, slik som B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266,710 utgitt 12. april 1989), Pseudomonas slik som P. aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E. coli kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31,446), selv om andre stammer slike som E. coli B, E. coli XI776 (ATCC 31,537) og E. coli W3110 (ATCC 27,325) er egnede. Disse eksemplene er illustrative heller enn begrensende.

I tillegg til prokaryoter, er aukaryote mikrober slik som filamentøs sopp eller gjær egnet for klonings- eller ekspresjonsverter for anti-VEGF antistoff-kodende vektorer

Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er mest vanlig brukt blant lavere eukaryote vertsorganismer. Imidlertid er et antall av andre slekter, arter og stammer vanligvis tilgjengelige og nyttige heri, slik som Schizosaccoromyces pombe; Kluyveromyces verter slik som for eksempel K. Lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickerarnii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, og K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces slik som Schanniomyces occidentalis; og filamentøse sopp slik som for eksempel Neurospora Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus verter slik som A. nidulans og A. niger.

Egnede vertsceller for ekspresjon av glykosylert anti-VEGF antistoffer avledet fra multicellulære organismer. Eksempler på invertebrate celler inklusiv planter og insektsceller. Flere bakulovirale stammer og varianter og korresponderende permissive insektsvertsceller fra verter slik som Spodoptera frugiperda (sommerfugler), Åedes aegypti (mygg), Åedes albopictus (mygg), Drosophila melanogaster (bananflue), og Bombyx mori har blitt identifisert. Forskjellige virale stammer for transfeksjon er offentlig tilgjengelig, for eksempel L-l variant av Autographa californica NP V og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV og slike virus kan bli brukt som virus heri ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda celler. Planteceller fra bomull, mais, poteter, soyabønner, petunia, tomat, og tobakk kan også bli utnyttet som verter.

Imidlertid har interessen vært størt for vertebratceller og dyrking av vertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt rutineprosedyre. Eksempler på nyttige mammalske verts-cellelinjer er apenyre CVl-linje transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embroynal nyrelinje (293 eller 293 celler subklonet for vekst i suspensjons-kultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); baby hamsternyreceller (BHK, ATCC CCL 10); kinesisk hamster ovarie celler/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); muse sertoliceller (™4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251

(1980)); apenyreceller (CV1 ATCC CCL 70); afrikansk grønn ape nyreceller (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cerviks karsinomceller (HELA, ATCC CCL 2); kanin nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); bøffel rotteleverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); muse brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI celler (Mather et al., Annals. N.Y., Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); MRC5 5 celler; FS4 celler: og human hepatom linje (Hep G2).

Vertscellene blir transformert med den ovenforbeskrevne ekspresjon eller kloningsvektorer for anti-VEGF antistoffproduksjon og dyrket på konvensjonell næringsmedium passende modifisert for å indusere promotere, selektere transformanter eller amplifisere genene som koder for ønskede sekvenser.

Vertscellene som er brukt for å produsere anti-VEGF antistoff fra denne oppfinnelsen kan bli dyrket i forskjellige medium. Kommersielt tilgjengelige medium slik som Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), og Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) er egnede for dyrking av vertsceller. I tillegg kan ethvert av mediumene beskrevet i Ham et al., Meth. Enz. 58:44

(1979), Barnes et al., Anal. Biochem 102:255 (1980), US Patent nr. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762,4,560,655 eller 5,122,569; WO 90/03430: WO 87/00195; eller US patent Re. 30,985 bli brukt som dyrkingsmedium for vertsceller. Ethvert av disse mediumene kan bli supplementert hvis nødvendig med hormoner og/eller vekstfaktorer (slik som insulin, tranferin eller epidermal vekstfaktor) salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som GENTAMYCrN™medikament), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser vanligvis tilstede i en slutt-konsentrasjoner i det mikromolære området), og glukose eller en ekvivalent energikilde. Ethvert annet nødvendig supplement kan også bli inkludert ved passende konstruksjoner som vil være kjent for de som kjenner fagfeltet. Kulturbetingelsene, slik som temperatur, pH, og lignende, er de som er tidligere brukt ved vertscelleseleksjon for ekspresjon, og vil fremgå tydelig for en som kjenner fagfeltet.

Når en bruker rekombinante teknikker kan antistoffet bli produsert intracellulært, i det periplasmatiske hulrom, eller direkte sekretert inn i mediumet. Hvis antistoffet blir produsert intracellulært, som et første trinn, blir det spesielle debriet, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, fjernet for eksempel ved sentrifugering eller ultrafilterering. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) beskriver en prosedyre for å isolere antistoff som er sekretert i det periplasmatiske hulrom hos E. coli. I korthet blir cellemassen tint ved tilstedeværelse av natriumasetat (pH 3,5), EDTA, og fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF) i omtrent 30 minutter. Celledebri kan fjernes ved sentrifugering. Når antistoffet blir sekretert inn i mediumet, blir supernatantene fra slike ekspresjonssystemer generelt først konsentrert ved å bruke et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, for eksempel, et Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltreirngsenhet. En protease inhibitor slik som PMSF kan bli inkludert i ethvert av de foregående trinnene for å inhibere proteolyse og antibiotika kan bli inkludert for å forhindre vekst av kontaminanter.

Antistoffsammensetningen fremstilt fra cellene kan bli renset ved å bruke for eksempel hydroksylapaptitt kromatografi, gelelektroforese, dialyse, og affinitetskromatografi, med affinitetskromatografi som den foretrukne rensningsteknikken. Egnetheten til protein A som en affinitetsligand avhenger av artene og isotypen til ethvert immuno-globulin Fc domene som er tilstede i antistoffet. Protein A kan bli brukt for å rense antistoff som er basert på human yl, y2, eller y4 tunge kjeder (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G anbefales for alle muse isotyper og for human y3 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matriksen til hvilken affinitets-liganden er festet er ofte agarose, men andre matrikser er tilgjengelige. Mekaniske stabile matrikser slike som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)bensen tillater raskere gjennomstrømningsrater og kortere prosesseringstider enn det som kan oppnås med agarose. Der hvor antistoffet omfatter et Ch3 domene er Bakerbond ABX™ harpiks (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) nyttig for rensning. Andre teknikker for protein-rensning slik som fraksjonering og en jonebyttekolonne, etanolpresipitering, Revers fase HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin SEPHAROSE™ kromatografi på en anion eller kationbytteharpiks (slik som en polyaspartin syrekolonne), kromato-fokusering, SDS-PAGE og ammoniumsulfat presipitering er også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal gjenvinnes.

Ved å følge et hvilket som helst forutgående rensningstrinn omfatter blandingen antistoff av interesse og kontaminanter kan bli utsatt for lav pH hydrofob interaksjons-kromatografi ved å bruke en elueringsbuffer med en pH mellom ca. 2,5-4,5, fortrinnsvis utført ved lave saltkonsentrasjoner (for eksempel fra omtrent 0-0,25 salt).

C. Farmasøytiske formuleringer

Terapeutiske formuleringer av antistoffet blir fremstilt for lagring ved å blande antistoffet som har ønsket grad av renhet med eventuelt fysiologiske akseptable bærere, eksipienter eller stabilisatorer { Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed. (1980)), i form av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, eksipienter eller stabilisatorer er ikke-toksiske til resipienten ved doseringene og konsentrasjonene som anvendes, og inkluderer buffere slik som fosfat, sitrat og andre organiske syrer; antioksidanter som inkluderer askorbinsyre og metionin; konserveringsmidler (slik som oktadesyldimetylbensyl ammonium klorid; heksamethonium klorid; bensalkonium klorid, bensethonium klorid, fenol, butyl eller bensylalkohol; alkylparabener slik som metyl eller propyl paraben; catechol; resorcinol; sykloheksanol; 3-pentanol; og m-cresol); lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 residier) polypeptider: proteiner; slik som serum albumin, gelatin, eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, eller lysin; monosakkarider, disakkarider, og andre karbohydrater inklusive glukose, mannose, eller dekstriner; chelaterende midler slik som EDTA; sukker slik som sukrose, mannitol, trehalose eller sorbitol; saltdannende motsetningsjoner slik som natrium; metallkomplekser (for eksempel Zn-protein komplekser); og/eller ikke-joniske overflateaktive stoffer slike som TWEEN™, PLURONICS™ eller polyetylenglykol (PEG).

Formuleringen heri kan også inneholde mer enn en aktiv forbindelse som er nødvendig for den spesielle indikasjonen som blir behandlet, fortrinnsvis de med komplementære aktiviteter som ikke negativt innvirker på hverandre (se avsnitt F under). Slike molekyler er passende tilstede i kombinasjon i mengder som er effektive for den tilsiktede hensikten.

De aktive ingrediensene kan også bli fanget inn i mikrokapsler fremstilt, for eksempel, ved koakservasjonsteknikker eller ved grenseflatepolymerisering, for eksempel henholdsvis hydroksmetylcellulose eller gelatin-mikrokapsel og poly-(metylmetasylat) mikrokapsel i kollodial medikamentavleveringssystemer (for eksempel, liposomer, albumin mikrosfære, mikroemulsjoner, nano-partikler og nanokapsler) eller i markoemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Formuleringene som skal bli brukt i in vivo administrering må være sterile. Dette oppnås lett ved filtrering gjennom sterile filtereringsmembraner.

Vedvarende frigivelsesrfemstillinger kan bli fremstilt. Egnede eksempler på vedvarende frigivelsesrfemstillinger inkluderer semipermeable matrikser av fast hydrofobiske polymerer som inneholder antistoffer, hvis matrikser er i form av formede artikler; for eksempel filmer, eller mikrokapsel. Eksempler på vedvarende frigivelsesmatrikser inkluderer polyestere, hydrogeler (for eksempel, poly(2-hydroksyetyl-metakrylat), eller poly(vinylalkohol)), polyastider (US patent nr. 3,773,919), kopolymerer af L-glutaminsyre og y etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylen-vinyl asetat, degraderbar melkesyreglykolinsyre kopolymerer slik som Lupron Depot™ (injiserbare mikrosfærer sammensatt av melkesyre-glykolsyre kopolymerer og leuprolid asetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymerer slike som etylenvinylasetat og melkesyre glykolsyre tillater frigivelse av molekyler i over 100 dager frigir visse hydrogeler proteiner for en kortere tidsperiode. Når innkapslede antistoffer bibeholdes i kroppen for en lang tid, kan de denaturere eller aggregere som et resultat av at de blir utsatt for fuktighet ved 37°C, resulterende i et tap av biologisk aktivitet og mulige endringer i immunogenitet. Rasjonelle strategier kan anvises for stabilisering avhengig av mekanismen som er involvert. For eksempel hvis aggregasjonsmekanismen oppdages å være intermolekylær S-S bindingsdannelse gjennom tio-disulfid utveksling, kan stabiliseringen oppnås ved å modifisere sulfhydrylresidier, lyofilisering fra eddiks-løsmnger, kontroll av fuktighetsinnholdet, ved å bruke egnede tilsetninger, og utvikling av spesifikke polymer matriks sammensetninger.

D. Ikke-terapeutiske anvendelser for antistoff

Antistoff fra oppfinnelsen kan bli brukt som affinitetsrensningsmidler. I denne prosessen blir antistoffene immobilisert på en fast fase slik som Sephadex harpiks eller filterpapir, ved å bruke metoder som er velkjent innen fagfeltet. Immobiliserte antistoff blir bragt i kontakt med en prøve som inneholder VEGF-proteinet (eller fragment derav) for å bli renset, og derefter blir støttemediumet vasket med et egnet løsningsmiddel som vil fjerne det vesentlige av alt materialet i prøven med unntak av VEGF-proteinet, som er bundet til dette immobiliserte antistoffet. Til slutt blir støttemediumet vasket med et annet egnet løsningsmiddel, slik som glysinbuffer, pH 5,0, som vil frigi VEGF-proteinet fra antistoffet.

Anti-VEGF antistoffet kan være nyttig i diagnostisk analyse for VEGF-protein, for eksempel, og detektere dets ekspresjon i spesifikke celler, vev eller serum. Slike diagnostiske metoder kan være nyttig i canserdiagnostikk.

For diagnostiske anvendelser vil antistoffet typisk være merket med en detekterbar del. Flere merker er tilgjengelige som kan grupperes generelt i følgende kategorier: a) Radioisotope slike som <3>5S, 14C, 12<5>1,<3>H, og <131>I. Antistoffet kan bli merket med radioisotoper ved å bruke teknikker beskrevet i Current Protocols in Immunology,

Volum 1 og 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs.

(1991), for eksempel og radioaktiviteten kan bli målt ved å bruke scintillasjonstelling.

b) Fluorscensmerkinger slike som sjeldne jordsjelater (europium sjelater) eller fluorescin og dets derivater, rodamin og dets derivater, dansyl, Lissamin, fykoerytrin

og Texas rød er tilgjengelig. Fluorescensmerkingene kan være konjugert til antistoffet ved å bruke teknikker beskrevet i Current Protocols in Immunology, supra, for eksempel. Fluorescens kan bli kvantifisert ved å bruke fluorimeter.

c) Forskjellige enzymsubstratmerkinger er tilgjengelig og US patent nr. 4,275,149 tilveiebringer et sammendrag av noen av disse. Enzymet katalyserer generelt en

kjemisk endring av det kromogene substratet som kan bli målt ved å bruke forskjellige teknikker. For eksempel kan enzymet katalysere en fargeendring i et substrat, som kan bli målt spektrofotometrisk. Alternativt kan enzymet endre fluorenscensen eller kjemiluminesensen til substratet. Teknikker for kvantifisering av endring i fluorescens er beskrevet over. Kjemiluminiscens-substrat blir elektronisk

utvidet av en kjemisk reaksjon og kan derefter emitere lys som kan bli målt (ved å bruke et kjemiluminometer, for eksempel) eller donere energi til en fluorescens akseptor. Eksempler på enzymatiske merkinger inkluderer lusiferase (for eksempel ildfluelusiferase og bakteriell lusiferase; US patent nr. 4,737,456), lusiferin, 2,3-dihydroftalasinedioner, malat dehydrogenase, urease, peroksidase slik som "horseradish" peroksidase (HRPO), alkalisk fosfatase, B-galaktosidase, glukoamylase, lysozyme, sakkarid oksidase, (for eksempel glukose oksidase, galaktose oksidase, glukose-6-fosfat dehydrogenase), heterosykliske oksidase (slik som urikase og xantin oksidase), laktoperoksidase, mikroperoksidase og lignende. Teknikker for konjugering av enzymer til antistoff er beskrevet i 0'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,

in Methods in Enzym, (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981),

Eksempler på enzym-substrat kombinasjer inkluderer for eksempel:

(i) "Horseradish" peroksidase (HRPO) med hydrogen peroksidase som et substrat hvori i hydrogenperoksidase oksiderer en fargeforløper (for eksemepl ortofenylen diamin (OPD) eller 3,3',5,5'-tetrametyl bensidin hydroklorid (TMB));

(ii) alkalin fosfatase (AP) med para-nitrofenyl fosfat som kromogent substrat; og

(iii) B-D-galaktosidase (B-D-Gal) med et kromogent substrast (for eksempel p-nitrofenyl-B-D-galaktosidase) eller fluorogent substrat 4-metylumbelliferyl-B-D-galaktosidase.

Flere andre enzymsubstratkombinasjoner er tilgjengelig for de som kjenner fagfeltet. For en generell oversikt av disse, se US patent nr. 4,275,149 og 4,318,980.

Noen ganger er merket indirekte konjugert med antistoffet. En som kjenner fagfeltet vil vite om forskjellige teknikker for å oppnå dette. For eksempel kan antistoffet være konjugert med biotin og enhver av de tre kategoriene med merkinger som er nevnt ovenfor kan bli konjugert med avidin, eller vise versa. Biotin binder selektivt til avidin og således kan merket bli konjugert med antistoffet på denne indirekte måten. Alternativt, for å oppnå indirekte konjugasjon av merking med antistoffet, blir antistoffet konjugert med en liten hapten (for eksempel digoksin), og en av de forskjellige typene av merker som er nevnt over blir konjugert med et anti-hapten antistoff (for eksempel, anti-digoksin antistoff). Derfor kan indirekte konjugasjon av merking med antistoff oppnås.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen trenger anti-VEGF antistoffet ikke å bli merket og tilstedeværelsen derav kan bli detektert ved å bruke merket antistoff som binder til VEGF antistoffet.

Antistoffet fra foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt i enhver kjent analysemetode, slik som konkurrerende bindingsanalyser, direkte og indirekte sandwich analyse, og immunopresipitieringsanalyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, ss. 147-158 (CRC, Press Inc., 1987).

Konkurrerende bindingsanalyser er avhengig av evnen til en merket standard til å konkurrere med testprøve "analyte" for binding med en begrenset mengde av antistoff. Mengden av VEGF-protein i testprøven er omvendt proporsjonal med mengden av standard som blir bundet til antistoffet. For å lette bestemmelsen av mengden av standard som blir bundet, blir antistoffene generelt gjort uløselige før eller efter konkurransen, slik at standarden og "analyte" som er bundet til antistoffene enkelt kan bli separert fra standarden og "analyte" forblir ubundet.

Sandwich analyse involverer bruk av to antistoff, hver i stand til å binde til en forskjellig immunogen del, eller epitop, til proteinet som skal detekteres. I en sandwich analyse blir testprøve "analyte" bundet av et første antistoff som er immobilisert på et fast støttemateriale, og derefter et andre antistoff som binder til "analyte", for dermed å danne et uløselig tre-parts kompleks. Se for eksempel US patent nr. 4,376,110. Det andre antistoffet kan i seg selv være merket med en detekterbar del (direkte sandwich analyse) eller kan bli målt ved å bruke et anti-immunoglobulin antistoff som er merket med en detekterbar del (indirekte sandwich analyse). For eksempel er en type av sandwich analyse en ELISA analyse, i hvilket tilfelle den detekterbare delen er et enzym.

For irnmunohistokjemi kan tumorprøven være fersk eller frossen eller kan være omsluttet av parafin og fiksert med et konserveringsmiddel slik som for eksempel formalin.

Antistoffene kan også bli brukt in vivo diagnostiske analyser. Generelt blir antistoffet merket med et radionukleid (slik som <ni>In, <99>Tc, <14>C, 131I, 1251,<3>H, <32>P eller <35>S) slik at tumoren kan bli lokalisert ved å bruke immunoscintiografi.

E. Diagnostiske kit

Antistoffet fra foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringes i et kit, dvs. en innpaknings-kombinasjon av reagenser i forutbestemte mengder med instruksjoner for utførelse av den diagnostiske analysen. Hvor antistoffet er merket med et enzym, vil kittet inkludere substrater og kofaktorer som kreves av enzymet (for eksempel et substratforløper som tilveiebringer detekterbar kromofor eller fluorofor). I tillegg, kan andre tilsetninger bli inkludert slik som stabilisatorer, buffere (for eksempel en blokkeringsbuffer eller lysis buffer) og lignende. De relative mengdene til forskjellige reagenser kan variere bredt for å tilveiebringe konsentrasjoner i løsningen til reagenset som i det vesentlige optimaliserer sensitiviteten til analysen. Spesielt kan reagensene bli tilveiebragt som tørre pulvere, vanligvis lyofilisert, inklusive eksipienter som ved oppløsning vil tilveiebringe en reagensløsning som har passende konsentrasjon.

F. Terapeutiske anvendelser for antistoffet

For terapeutiske anvendelser blir anti-VEGF antistoffene fra oppfinnelsen administrert til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, i en farmasøytisk akseptabel doseform slik som diskutert over, inklusiv de som kan bli administrert til et menneske, intravenøst som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon i en tidsperiode, ved intramuskulær, intrapeirotoneal, intra-cerebrospinal, subkutant, intra-artikulær, intrasynovial, intratekal, oral, topisk, eller inhalasjonsmåter. Antistoffene er også egnet for administrering ved intra tumoral, peritumoral, intralesjonal, eller perilesjonale måter, for å utvise lokal så vel som systemiske terapeutiske effekter. Den intrapeirotoneale måten er forventet å være spesielt nyttig, for eksempel i behandling av ovarietumor.

For forhindringen eller behandlingen av sykdom, vil den passende dosen av antistoff være avhengig av type av sykdom som skal behandles, som definert over, alvorlighetes-graden og utviklingen av sykdommen, om antistoffet blir administrert for preventiv virkning eller terapeutiske formål, tidligere terapi, pasientens kliniske historie og respons til antistoffet, og diskresjonen til legen. Antistoffet er egnet administrert til pasienten en gang eller en serie av behandlinger.

Anti-VEGF antistoffer nyttig i behandlingen av forskjellige neoplastiske eller ikke-neoplastiske sykdommer og forstyrrelser. Neoplasmi og relaterte tilstander er mottagelig for behandling inklusiv brystkarsinomer, lungekarsinomer, gastriske karsinomer, esofageale karsinomer, kolorektale karsinomer, lever karsinomer, ovarie-karsinomer, tekomas, arrhenoblatomas, serviks karsinomer, endometrial karsinomer, endometrial hyperplasia, endometriosis, fibrosarkomer, korio karsinomer, hode og nakke canser, nasofaryngeal karsinomer, laryngeal karsinomer, hepatoblastoma, Kaposi's sarkoma, melanom, hud karsinomer, hemangioma, cavernøs hemangioma, hemangioblastoma, pancreas karsinomer, retinoblastom, astrosytoma, glioblastom, Schwannoma, oligodendroglioma, medulloblastoma, neuroblastomer, rhabdomyosarkoma, osteogenisk sarkom, leiomyosarkomer, urinveis karsinomer, tyroid karsinomer, Wilm's tumor, nyrecelle karsinomer, prostata karsinomer, unormal vaskulær proliferering assosiert med fakomatoser, ødem (slik som assosiert med hjerne tumorer), og Meigs' syndom.

Ikke-neoplastiske sykdommer mottagelig for behandling inkluderer rheumatoid artitritt, psoriasis, arterosklerose, diabetes, og andre proliferative retinopatier inklusive retinopati av prematur, retrolental fibroplasi, neovaskulær glaukoma, aldersrelatert makulær degenerering, tyroid hyperplasi (inludert Grave's sykdom), kornea og annen vevs-transplantasjon, kronisk inflammasjon, lungeinflammasjon, nefrotisk syndrom, preeklmpsia, askites, perkardial effusjon (slik som de som er assosiert med perikariditis), og pleural effusjon.

Aldersrelatert makulær degenerering (AMD) er en ledende årsak til alvorlige synstap i den eldre befolkningen. Den eksudative formen av AMD blir karakterisert ved koroidal neovaskularisering og retinal pigment epitel celleavsondring. Fordi koroidal neovaskularisering er assosiert med en dramatisk forverring i prognose, er VEGF-antistoff fra foreliggende oppfinnelse forventet å være spesielt nyttig i å redusere alvorligheten av

AMD.

Avhengig av type og alvorlighetsgrad av sykdommen, er omtrent 1 ug/kg til omtrent 50 mg/kg (for eksempel 0,1-20 mg/kg) antistoff en initiell kandidatdose for administrering til pasienten, enten for eksempel ved en eller flere forskjellige administreringer, eller ved kontinuerlig infusjon. En typisk daglig eller ukentlig dosering kan variere fra ca. 1 Hg/kg til ca. 20 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor. For repeterte admimstreringer over flere dager eller lengere, avhengig av tilstanden, blir behandlingen repetert inntil den ønskede supresjonen av sykdomssymptonene inntreffer. Imidlertid kan andre doseregimer være nyttige. Fremgangen av denne terapien blir lett målt ved konvensjonelle teknikker og analyser, inklusiv, for eksempel radiografisk tumoravbilding.

Effektiviteten av antistoffet i å forhindre eller behandle sykdom kan bli forbedret ved administrering av antistoffet i serie eller i kombinasjon med et annet middel som er effektivt for disse formålene, slik som tumornekrosefaktor (TNF), et antistoff som er i stand til å inhibere eller nøytralisere angiogenisk aktivitet av sure eller basiske fibroblastvekstfaktor (FGF) eller hepatosytt vekstfaktor (HGF), et antistoff som er i stand til inhibere eller nøytralisere koagulent aktiviteteten til vevsfaktor, protein C, eller protein S (se Esmon et al., PCT Patent Publication nr. WO91/01753, publisert 21. februar 1991), et antistoff som er i stand til å binde til HER2 reseptor (se Hudziak et al., PCT Patent Publication nr. WO89/006692, publisert 27. juli 1989), eller en eller flere konvensjonelle terapeutiske midler slik som for eksempel alkylerende midler, folinsyre antagonister, antimetabolitter fra nukleinsyremetabolisme, antibiotika, pyrimidinanaloger, 5-fluorourasil, cisplatin, purinnukleosider, aminer, aminosyrer, triasolnukleosider, eller kortikosteroider. Slike andre midler kan være tilstede i sammensetningen som blir administrert eller kan bli administrert separat. Også antistoffet er egnet for serieadministrering eller i kombinasjon med radiologiske behandlinger, som enten involverer stråling eller administrering av radioaktive substanser.

Antistoffet og en eller flere andre anti-VEGF antagonister kan blir administrert til tumor-bærende pasienter ved terapeutisk effektive doser som bestemt for eksempel ved å observere en nukrose hos tumoren eller dets metastatiske foci, hvis dette finnes. Denne terapien fortsetter inntil det ikke blir observert ytterligere fordelaktig effekt eller at kliniske undersøkelser viser noen spor av tumor eller noen metastatiske foci. Derefter blir TNF administrert, alene eller i kombinasjon med et hjelpemiddel slik som alfa-, beta-, eller gamma-interferon, anti-HER2 antistoff, heregulin, antiheregulin antistoff, D-faktor, mterleukin-1, (EL-1), interleukin-2 (EL-2), granulosyt-makrofagkoloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller midler som fremmer mikrovaskulær koagulering i tumorer, slik som anti-protein C antistoff, anti-protein S antistoff, eller C4b bindings-protein (se Esmon et al., PCT Patent Publication nr. WO 91/01753, publisert 21. februar 1991), eller varme eller stråling.

Siden hjelpemidlene vil variere i deres effektivitet er det ønskelig å sammenligne deres innvirkning på tumor ved matriks screening på konvensjonell måte. Administreringen av anti-VEGF antistoff og TNF blir gjentatt inntil den ønskede kliniske effekt er oppnådd. Alternativt blir anti-VEGF antistoff administrert sammen med TNF og eventuelt, hjelpemiddel(er). I tillegg hvor faste tumorer finnes i lemmene eller i annen lokalisering som er følsom for isolering fra den generelle sirkulasjonen, blir det terapeutiske midlet beskrevet heri, administrert til den isolerte tumoren eller organet. I andre utførelsesformer blir en FGF eller platederivert vekstfaktor (PDGF) antagonist slik som anti-FGF eller en anti-PDGF nøytraliserende antistoff administrert til pasienten sammen med anti-VEGF antistoffet. Behandling med anti-VEGF antistoffer kan optimalt bli suspendert i periodene for sårheling eller ønsket neovaskularisering.

G. Artikler for fremstilling

Artikkelen for fremstilling omfatter en beholder og et merke. Egnede beholdere inkluderer, for eksempel, flasker, rør, sprøyter, og testrør. Beholderne kan utføres i forskjellige materialer som glass eller plast. Beholderen må ha en sammensetning som er effektiv for å behandle tilstanden og kan ha en steril inngangsdel (for eksempel kan beholderen være en intravenøs løsningsbag eller et rør som har en stopper som kan gjennomstikkes med en hypodermisk injeksjonsnål). Det aktive midlet i sammensetningen er anti-VEGF antistoff. Merket på, eller assosiert med, beholderen indikerer at sammensetningen blir brukt for behandlingen av den valgte tilstanden. Artikkelen for fremstilling kan ytterligere omfatte en annen beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som fosfatbufferet saltvann, Ringer's løsning og dekstroseløsning. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelig fra et kommersielt og brukerstandpunkt, inklusiv andre buffere, fortynnere, filtre, nåler, sprøyter, og innpakningsvedlegg med bruksanvisning.

EKSEMPEL 1

Dette eksemplet beskriver produksjonen av humanisert anti-VEGF antistoffer med ønskede egenskaper fra et terapeutisk standpunkt.

MATERIALER OG METODER

Kloning av murin A4.6.1 MAb og konstruksjon av muse-humant kimerisk Fab: Murint anti-VEGF mAb A4.6.1 har tidligere blitt beskrevet ved Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) og Kim et al., Nature 362:841 (1993). Totalt RNA ble isolert fra hybridom celler som produserer anti-VEGF Mab A4.6.1 ved å bruke RNAsol (TEL-TEST) og revers-transkribert til cDNA ved å bruke Oligo-dT primer og SuperScript II system (GE6CO BRL, Gathersburg, MD). Degenererte oligonukleotidprimer "pools" basert på N-terminal aminosyreskevenser fra de lette og tunge kjedene til antistoffet ble syntetisert og brukt som foroverprimere. Revers primere ble basert på grurmstruktur 4 sekvenser ervervet fra murin lettkjede subgruppe kV og tungkjede subgruppe II (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Publich Health Service, National Institutes of Health Bethesda, MD, (1991). Efter polymerase kjedereaksjon

(PCR) amplifisering, ble DNA fragmentene ligert til en TA kloningsvektor (frivitrogen, San Diego, CA). Åtte kloner hver av lette og tunge kjeder ble sekvensert. En klon med en konsensus sekvens for lettkjede VL-domene og en med en konsensus sekvens for tung kjede VH-domene ble subklonet respektivt inn i pEMXI vektor som inneholdt human CL og CH1 domener (Werther et al., J. Immunol. 157:4986-4995 (1996)), for derved å danne et musehumant kimær. Denne kimære F(ab) besto av det hele murine A4.6.1 VH-domenet bundet til et humant CH1 domene ved aminosyre SerHl 13 og det hele murine A4.6.1 VL-domenet bundet til humant CL-domene ved aminosyre LysL107. Ekspresjon og rensning av det kimære F(ab) var identisk med den humaniserte F(ab). Det kimære F(ab) ble brukt som standard i bindingsanalyser.

Computergrafiske modeller av murine og humaniserte F(ab):

Sekvenser fra VL og VH domener (figurene IA og IB) ble brukt for å konstruere en

computer grafisk modell av murint A4.6.1 VL-VH domene. Denne modellen ble brukt for å bestemme hvilke grurmstrukturresidier som skulle inkorporeres i det humaniserte antistoffet. En modell for humanisert F(ab) ble også konstruert for å verifisere korrekt seleksjon av murine grunnstruktur residier. Konstruksjon av modellene ble utført som beskrevet tidligere (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:4285-4289 (1992) og Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229:969-995 (1993)).

Konstruksjon av humanisert F(ab):

Plasmid pEMXI ble brukt for mutagense og ekspresjon av F(ab) i E. coli har blitt beskrevet tidligere (Werther et al., supra). I korthet inneholder plasmidet et DNA fragment som koder for en konsensus human k subgruppe I lettkjede (VLkl-CL) og en konsensus human subgruppe UJ tungkjede (CHEQ-CHl) og en alkalisk fosfatase promoter. Anvendelsen av konsensus sekvensene for VL og VH har blitt beskrevet tidligere. (Carter et al., supra).

For å konstruere den første F(ab) varianten av humanisert A4.6.1, F(ab)-1, ble setedirigert mutagense (Kunkel et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82;488-492 (1985)) utført på en doksyuridin-inneholdende templat fra pEMXI. Seks CDR ifølge Kabat et al., supra, ble endret til murin A4.6.1 sekvens. F(ab)-1 besto derfor av en fullstendig human grunnstruktur (VL k subgruppe I og VH subgruppe IH) med seks fullstendige murine CDR-sekvenser. Plasmidene for alle andre F(ab)-varianter ble konstruert fra plasmidtemplat til F(ab)-1. Plasmidene ble transformert inn i E. coli stamme XL-1 blå

(Statagene, San Diego, CA) for fremstilling av dobbelt og enkelttrådet DNA. For hver variant, ble DNA som kodet for lette og tunge kjeder fullstendig sekvenser ved å bruke dideoksynukleotidmetoden (Sequenses, US Biochemical Corp. Cleveland, OH). Plasmidene ble transformert inn i E. coli stamme 16C9, et derivat av MM294, platet på Luria næringsmediumsplater som inneholdt 50 ng/ ml karbensillin, og en enkel koloni selektert for proteinekspresjon. Den enkle kolonien ble dyrket i 5 ml Luria næringsmedium -100 mg/ml karbensillin i 5-8 timer ved 37°C. 5 ml kulturen ble tilsatt til 500 ml APS-50 ng/ml karbensillin og fikk vokse i 20 timer i en 41 rillet risteflaske

ved 30°C. AP5 mediumet besto av 1,5 g glukose, 11,0 g Hykase SF, 0,6 g gjærekstrakt (sertifisert), 0,19 g MgS04 (vannfritt), 1,07 g NH4C1, 3,73 g KC1,1,2 g NaCl, 120 ml 1 M trietanolamin, pH 7,4, til 11 vann og derefter sterilt filtrert gjennom 0,1 mm Sealkeen filter. Cellene ble høstet ved sentrifugering i en 11 sentrifugeflaske ved 3000 x g og supernatanten ble fjernet. Efter frysing i 1 time, ble pelleten resuspendert i 25 ml kald 10 mM tris-1 mM EDTA-20% sukrose, pH 8,0. 250 ml av 0,1 M bensarmidin (Sigma, St. Louis, MO) ble tilsatt for inhibere proteolyse. Efter forsiktig omrøring på is i tre timer ble prøven sentrifugert ved 40.000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble derefter satt på en protein G-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sverige) kolonne (0,5 ml volum) ekvilibrert med 10 mM tris -1 mM EDTA, pH 7,5. Kolonnen ble vasket med 10 ml av 10 mM tris-1 mM EDTA, pH 7,5 og eluert med 3 ml 0,3 M glysin, pH 3,0, i 1,25 ml 1 mM tris, pH 8,0. F(ab) ble derefter bufferbyttet i PBS ved å bruke en Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) og konsentrert til et sluttvolum på 0,5 ml. SDS-PAGE geler av alle F(ab) ble kjørt til en viss renhet og molekylvekten for hver variant ble verifisert ved elektrospray massespektrometri.

Konstruksjon og ekspresjon av kimære og humaniserte IgG:

For dannelse av humant IgGl varianter av kimært (chlgGl) og humanisert (huIgGl) A4.6.1 ble passende murine humaniserte VL og VH F(ab)-12, tabell 12) domener subklonet i separate, tidligere beskrevet, pRK vektorer (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347(1986)). DNA som koder for den fullstendige lette og den fullstendige tunge kjeden fra hver variant ble verifisert ved dideoksynukleotidsekvensering.

For transient ekspresjon av varianter ble tunge og lette kjede plasmider kotransfektert i humane 293 celler (Graham et al., J. Gen Viro. 36:59-74 (1977)) ved å bruke en høy effektiv prosedyre (Gorman et al., DNA Prot. Engl. Tech. 2:3-10 (1990)). Mediumet ble byttet til serumfritt og høstet daglig opp til fem dager. Antistoffene ble renset fra de oppsamlede supernatantene ved å bruke protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). Eluert antistoff ble bufferbyttet i PBS ved å bruke Centricon-30 (Amicon), konsentrert til 0,5 ml steril filtrert ved å bruke et Millex-GV (Millipore, Bedford, MA), og lagret ved 4°C.

For stabil ekspresjon av finalt humanisert IgGl variant (rhuMAb VEGF), ble kinesiske hamstere ovarie (CHO) celler transfektert med disistroniske vektorer fremstilt for koekspresjon av både tunge og lette kjeder (Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24:1774-79

(1996)). Plasmidene ble introdusert i DPI2 celler, et derivat av CHO-K1 DUX Bl 1 cellelinje utviklet av L. Chasin (Columbia University), via lipofeksjon og selektert for vekst i GHT-fritt medium (Chisholm, V. High efficiency gene transfer in mammalian cells, in Glover, DM, Hames, BD. DNA Cloning 4. Mammalian Systems, Oxford Univ. Press, Oxford ss. 1-41 (1996)). Ca. 20 uamplifiserte kloner ble tilfeldig valgt og sådd ut igjen på 96 brønners plater. Relativ spesifikk produktivitet fra hver koloni ble målt ved å bruke en ELISA for å kvantifisere full-lengde human IgG akkumulert i hver brønn efter tre dager og en fluorescens farge, Calcien AM, som et surrogat markør for levende cellenummer pr. brønn. Basert på disse data ble flere uamplifiserte kloner valgt for ytterligere amplifisering ved tilstedeværelse av økende konsentrasjoner av metotreksat. Individuelle kloner som overlevde ved 10, 50, og 100 nM metotreksat ble valgt og overført til 96 brønners plater for produktivitet screening. En klon som ved reproduserbarhet utviste høy spesifikk produktivitet, ble dyrket i T-flasker og brukt for å inokulere en spinnerkultur. Efter flere passasjer ble suspensjonens-tilpassede celler brukt for å inokulere produksjonskulturer i GHT inneholdende, serumfritt medium supplert med forskjellige hormoner og proteinhydrolysater. Høstet cellekulturvæske som inneholdt rhuMAb VEGF ble renset ved å bruke protein A-Sepharose CL-4B. Renheten efter dette trinnet var ~99%. Etterfølgende rensning til homogenitet ble utført ved å bruke et jonebyttekromatografitrinn. Endotoksininnholdet til sluttrenset antistoff var <0,10 eu/mg.

F(ab) og IgG kvantifisering:

For kvantifisering av F(ab) molekyler ble ELISA plater dekket med 2 ng/ml geite anti-human IgG Fab (Organon Teknika, Durham, NC) i 50 mM karbonat buffer, pH 9,6, ved 4°C natten over og blokkert med PBS-0,5% bovint serum albumin (blokkeringsbuffer) ved romtemperatur i 1 time. Standardene (0,78-50 ng/ml human F(ab)) ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, CA). Seriefortynninger fra prøver i PBS-0,5% bovint serum albumin-0,05% polysorbat 20 (analyse buffer) ble inkubert på platene i 2 timer. Bundet F(ab) ble detektert ved å bruke "horseradish" peroksidase-merket geite-anti-human IgG F(ab) (Organon Teknika) etterfulgt av 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) som substrat. Platene ble vasket mellom trinnene, Absorbansen ble lest ved 450 nm på en Vmax plate avleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Standardkurven ble tilpasset ved å bruke en fire-parameter ikke-lineær regressjonskurve tilpassingsprogram. Datapunktene som faller i området for standard kurven ble brukt for å beregne F(ab) konsentrasjonene av prøvene. Konsentrasjonen av full-lengde antistoffet ble bestemt ved å bruke geite anti-human IgG Fc (Cappel, Westchester, PA) for oppfanging og "horseradish" peroksidase-merket geite anti-human Fc (Cappel) for deteksjon. Humant IgG (Chemicon) ble brukt som standard.

VEGF bindingsanalyse:

For måling av VEGF bindingsaktivitet av F(ab) ble ELISA plater dekket med 2 ug/ml kanin F(ab')2 til human IgG Fc (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) og blokkert med blokkeringsbuffer (beskrevet over). Fortynnet kondisjonert medium som inneholdt 3 ng/ml av KDR-IgG (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25646-25645, (1994) i blokkeringsbuffer ble inkubert på platen i 1 time. Standardene (6,9-440 ng/ml) kimær F(ab)) og to ganger serier av prøvene ble inkubert med 2 nM biotinylert VEGF i 1 time i rør. Løsningene fra rørene ble overført til ELISA plater og inkubert i 1 time. Efter vask ble biotinylert VEGF bundet til KDR og detektert ved å bruke "horseradish" peroksidase merket streptavidin (Zymed, South San Francisco, CA eller Sigma, ST. Louis, MO) etterfulgt av 3,3',5,5'-tetrametylbensidin som et substrat. Titreringskurvene ble tilpasset med en fire parameters ikke-lineær regresjonskurve tilpasningsprogram (Kaleida Graph, Synergy Software, Reading, PA). Konsentrasjoner av F(ab) varianter korresponderende til midtpunktsabsorbansen av titreringskurven av standarden ble beregnet og derefter delt med konsentrasjonen av standarden korresponderende til midtpunktsabsorbansen av standardtitreringskurve. Analyser for full-lengde IgG var den samme som for F(ab) med unntak av at analysebufferen inneholdt 10% humant serum.

BIAcore™ Biosensor Analyse:

VEGF-binding av humanisert og kimert F(ab) ble sammenlignet ved å anvende en BIAcore™ biosensor (Karlsson et al., Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108 (1994)). Konsentrasjoner av F(ab) ble bestemt ved kvantitative aminosyreanalyser. VEGF ble koblet til en CM-5 biosensor chip gjennom primære aminogrupper i henhold til fabrikantens instruksjoner (Pharmacia). "Off-rate" kinetikker ble målt ved metting av chip med F(ab) (35 ul på 2 uM F(ab) ved et gjennomstrørnningsrate på 20 ul/min) og derefter byttet til buffer (PBS-0,05% poylsorbat 20). Datapunktene fra 0 til 4.500 sekunder ble brukt for "off-rate" kinetisk analyse. Dissosiasjonsratekonstanten (koff) ble ervervet fra hellingen av plottet på Ln(R0/R) versus tid, hvor RO er signalet ved t = 0, og R er signalet ved hvert tidspunkt. "On-rate" kinetikkene ble målt ved å bruke to-ganger seriefortynninger av F(ab) (0,0625 - 2 mM). Hellingen, K57 ble oppnådd fra plottet av ln/-dR/dt) versus tid for hver F(ab) konsentrasjon ved å bruke BIAcore kinetikk evalueringssoftware som beskrevet i Pharmacia Biosensor manual. R er signalet ved tiden t. Dataene mellom 80 og 168, 148,128,114,102 og 92 sekunder ble brukt for 0,0625,0,125, 0,25,0,5,1 og 2 mM F(ab), respektivt. Assosiasjonsratekonstanten (ko„) ble ervervet fra hellingen av plottet av Kg versus F(ab) konsentrasjon. Ved slutten av hver syklus, ble bundet F(ab) fjernet ved å injisere 5 ni av 50 mM HC1 med en gjennomstrørnningsrate på 20 ul/min for å regenerere chipen.

Endotelcellevekstanalyse:

Bovint adrenal korteks-avledede kapellær endotele celler ble dyrket ved tilstedeværelse av lavglukose Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM)(GIBCO) supplert med 10% kalveserum, 2 mM glutamin, og antibiotika (vekstmedium), i det vesentlige som tidligere beskrevet (Leung et al., Science 246:1306-1309 (1989)). For mitogenanalyser ble endotelcellene sådd ut med en tetthet på 6 x 10<3> celler pr. brønn, i 6-brønners plater i vekstmedium. Enten muMAb VEGF A.4.6.1 eller rhuMAb VEGF ble derefter tilsatt ved konsentrasjoner i området mellom 1 og 5000 ng/ml. Efter 2-3 timer ble renset E. coli uttrykt rh VEGF 165 tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 3 ng/ml. For spesifisitetskontroll ble hvert antistoff tilsatt til endotelceller med en konsentrasjon på 5000 ng/ml, enten alene eller ved tilstedeværelse av 2 ng/ml bFGF. Efter fem eller seks dager, ble cellene dissosiert ved eksponering til trypsin og talt i en Coulter teller (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Variasjonen av gjennomsntittet overskred ikke 10%. Dataene ble analysert av et fire-parameters kurvetilpasningsprogram (KaleidaGraph).

In Vivo tumorstudier:

Humant A673 rhabdomyosarkomaceller (ATCC; CRL 1598) ble dyrket som tidligere beskrevet i DMEM/F12 supplert med 10% føtalt bovinserum, 2 mM glutamin og antibiotika (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993) og Borgstrom et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)). Hunnkjønn BALB/c nakne mus, 6-10 uker gamle, ble injisert subkutant med 2 x IO<6> tumorceller i det dorsale området i et volum på 200 ul. Dyrene ble derefter behandlet med muMAb VEGF A.4.6.1, rhuMAb VEGF eller en kontroll MAb direkte mot gp 120 proteinet (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)). Både anti-VEGF MAb ble administrert med doser på 0,5 og 5 mg/kg; og kontroll MAb ble gitt i en dose på 5 mg/kg. Hver MAb ble administrert to ganger i uken intraperitonalt i et volum på 100 ul, som startet 24 timer efter tumorcelleinokulering. Hver gruppe besto av 10 mus, tumorstørrelsen ble bestemt på ukentlige intervaller. Fire uker efter tumorcelleinokulering, ble dyrene avlivet, og tumoren ble fjernet og veid. Statistisk analyse ble utført ved ANOVA.

RESULTATER

Humanisering:

Konsensussekvensen for human tungkjede subgruppe IQ og lettkjede subgruppe k I ble brukt som grunnstruktur for humanisering (Kabat et al., supra). (Figurene IA og IB). Denne grunnstrukturen har med stor suksess blitt brukt i humanisering av andre murine antistoff (Werther et al., supra, Carter et al., supra; Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); og Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). CDR-H1 inkluderer residiene H26-H35. De andre CDR ble ifølge Kabat et al. supra. Alle humaniserte variantene ble initielt fremstilt og screenet for binding siden F(ab) ble uttrykt i E. Coli. Typiske utbytter for 500 ml risteflaser var 0,1-0,4 mg F(ab).

Kimære F(ab) ble brukt som standard i bindingsanalysene. I den initielle varianten F(ab)-1 ble CDR-residiene overført fra murint antistoff til human grurmstruktur og basert på modellene til murine og humaniserte F(ab), ble residiene i posisjon H49 (Ala i menneske) byttet til murin Gly. I tillegg ble F(ab) som besto av kimær tung kjede F(ab)-1 lettkjede F(ab)-2) og F(ab)-2 ting kjede/kimær lett kjede F(ab)-3) dannet og testet for binding. F(ab)-1 utviste en bindingsaffinitet som er større enn 1000-ganger redusert fra det kimære F(ab) (Tabell 2). Sammenligning av bindingsaffinitetene til F(ab)-2 og F(ab)-3 indikerer at gruimstrukturresidiene i F(ab)-1 VH domene trengte å bli endret for å øke bindingen.

Endring av humanresidiene H71 og H73 til deres murine motparter i F(ab)-4 forbedret bindingen fire ganger (Tabell 2). Inspeksjon av modellene til murine og humaniserte F(ab) antyder at residie L46, nedgravd i VL-VH-grenseflaten og som reagerer med CDR-H3 (figur 2), kan også spille en rolle enten i å bestemme konfirmasjon av CDR-H3 og/eller ha innvirkning på forholdet til VL og VH-domenene. Når murin Val ble byttet med human Leu ved L46 F(ab)-5, økte bindingsaffiniteten nesten fire ganger (tabell 2). Tre andre nedgravde grurmstrulcturresidier ble evaluert basert på molekylære modeller: H49, H69 og H78. Posisjon H69 kan innvirke på konfirmasjonen til CDR-H2 mens posisjon H78 kan innvirke på konfirmasjonen til CDR-H1 (figur 2). Når hver var individuelt byttet fra human til murin motpart, forbedret bindingen seg to ganger i hvert tilfelle (F(ab)-6 og F(ab)-7 (tabell 2). Når begge samtidig ble byttet var forbedringen i bindingen åtte ganger (F(ab)-8, tabell 2). Residie H49 ble i utgangspunktet inkludert som murin Gly; når den ble byttet med human konsensus motpart Ala ble bindingen redusert 15 ganger (F(ab)-9, tabell 2).

I F(ab)-10 og F(ab)l 1 ble to residier i grurmstrukturløkken 3, FR-3 byttet til deres murine motparter: AsnH76 til murin Ser (F(ab)-lO) og LysH75 til murin Ala (F(ab)-11). Begge effektuerte en relativ liten forbedring i bindingen (tabell 2). Til slutt i posisjonen H94 har humane og murine sekvenser ofte en Arg (Kabat et al., supra). I F(ab)-12 ble denne Arg erstattet med den sjeldne Lys som ble funnet i murint antistoff (fig. IA) og dette resulterte i binding som var mindre enn to ganger fra kimær F(ab)

(tabell 2). F(ab)-12 ble også sammenlignet med kimær F(ab) ved å bruke BIAcore™ system (Pharmacia). Ved å bruke denne teknikken var Kd fra humanisert F(ab)-12 to ganger svakere enn den fra kimær F(ab) på grunn av både en langsommere Kon og raskere Koff (tabell 3).

måle dissosiasjonen efter bytting til buffer. "On-rate" kinetikk (kon) ble målt ved å bruke to gangers seriefortynninger av F(ab). K<j ekvilibriums dissosiasjonskonstanten ble beregnet som koff/kon-

b kim-F(ab) er en kimær F(ab) med murin VL og VH domener satt sammen med human CL og CH1 tunge domener.

Fullengde mAb ble konstruert ved å sette sammen VL og VH domener til den kimære F(ab) og varianten F(ab)-12 til de konstante domenene til human k lett kjede og human IgGl tung kjede. Fullengde 12-IgGl (F(ab)-12 satt sammen til human IgGl) utviste binding som var 1,7 ganger svakere enn den kimære IgGl (tabell 4). Både 12-IgGl og den kimære IgGl bandt noe dårligere enn utgangs murin mAb A.4.6.1 (tabell 4).

Biologiske studier:

rhuMAb VEGF og muMAb VEGF A4.6.1 ble sammenlignet for deres evne til å inhibere bovin kapillær endotel celleproliferering i respons til en nær maksimal effektiv konsentrasjon av VEGF (3 ng/ml). Som vist i figur 3 var de to MAb essensielt ekvivalente, både i potens og effektivitet. ED50 verdiene var henholdsvis 50 ± 5 ng/ml og 48 ± 8 ng/ml (~ 0,3 nM). I begge tilfeller var 90% inhibering oppnådd ved konsentrasjon på 500 ng/ml (~3 nM). Hverken muMAb VEGF A.4.6.1 eller rhuMAb

VEGF hadde noen effekt på basal eller bFGF-stimulert proliferering av kapillær endotelceller, noe som bekrefter at inhiberingen er spesifikk for VEGF.

For å bestemme om slik ekvivalens også gjelder i et in vivo system ble de to antistoffene sammenlignet for deres evne til å undertrykke vekst av human A673 rhabdomyosarkom celler i nakne mus. Tidligere studier har vist at muMAb VEGF A.4.6.1 har en dramatisk inhibitorisk effekt i denne tumormodellen (Kim et al., Nature 362:841-844

(1993) og Borgstrøm et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)). Som vist i ifgur 4 ved begge doser som ble testet (0,5 og 5 mg/kg) undertrykte de to antistoffene markert tumorvekst målt ved tumorvektmålinger fire uker efter celleinokulering. Nedgang i tumorvekst sammenlignet med kontrollgruppen var henholdsvis 85% og 93% ved hver dose i dyrene behandlet med muMAb VEGF A.4.6.1 versus 90% og 95% i de som ble behandlet med rhuMAb VEGF. Lignende resultat ble oppnådd med brystkarsinoma cellelinjen MDA-MB 435.

EKSEMPEL 2

I dette eksemplet ble murine anti-VEGF antistoff A.4.6.1 som diskutert over humanisert ved randomisering av et lite sett av grurmstrukturresidier og ved monovalent fremvisning av det resulterende bibliotek av antistoffmolekyler på overflaten av filamentøse fage for å identifisere høyaffinitet grurmstruktursekvenser via afflnitet-basert seleksjon.

MATERIALER OG METODER

Kontraksjon av anti-VEGF fagemidvektor, pMB4-19

Murin anit-VEGF mAb A4.6.1 blir diskutert over i eksempel 1. Første Fab-variant av humaniser A4.6.1, hu2.0, ble konstruert ved sete-dirigert mutagense ved å bruke deoksyuridinholdende templat fra plasmid pAK2 (Carter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:4285-4289 (1992)) som koder for et humant Vikl-Cki lett kjede og human VhUI-ChIyi tungkjede Fd fragment. De transplanterte A4.6.1 CDR sekvensene ble valgt ifølge deres sekvensdefinisjon fra Kabat et al., supra, unntatt CDR-H1 som inkluderte residiene 26-35. Fab-kodende sekvens ble subklonet inn i fagemidvektor phGHamg3 (Bass et al., Proteins 8:309-314 (1999) og Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838

(1991)). Denne konstruksjonen, pMB4-19, som koder for det inititelle humaniserte A4.6.1 Fab, hu2.0, med C-terminal ende fra tung kjede satt sammen med en karboksyldelen til M13 gen HI kappeprotein. pMB4-19 er lik i konstruksjon med pDH188, et tidligere beskrevet plasmid for monovalent fremvisning av Fab-fragmenter (Garrard et al., Biotechnology 9:1373-1377 (1991)). Tydelige forskjeller mellom pMB4-19 og pD188 inkluderer et kortere M13 gen HI segment (kodonene 249-406) og bruk av en amber stopp kodon umiddelbart efter antistoff tung kjede Fd fragment. Dette tillater ekspresjon av både sekretert tung kjede eller tung kjede-gen HI fusjoner i sup E. supressor stammene til E. coli.

Ekspresjon og rensning av humanisert A4.6.1 Fab-fragment

E. coli stammen 34B8, en ikke-suppressor, ble transformert med fagemid pMB4-19 eller varianter derav. Enkle kolonier fikk vokse over natten ved 37°C i 5 ml 2YT som inneholdt 50 ug/ml karbensillin. Disse kulturene ble fortynnet i 200 ml AP5 medium (Chang et al., Gene 55:189-196 (1987)) som inneholdt 20 ug/ml karbensillin og inkubert i 26 timer ved 30°C. Cellene ble pelletert ved 4000 x g og frosset ved -20°C i minst 2 timer. Cellepelletene ble derefter resuspendert i 5 ml 10 mM tris-HCl (pH 7,6) som inneholder 1 mM EDTA, ristet ved 4°C i 90 minutter og sentrifugert ved 10.000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble satt på en 1 ml streptokokkal protein G-sepharose kolonne (Pharmacia) og vasket med 10 ml 10 mM MES (pH 5,5). Bundet Fab-fragment ble eluert med 2,5 ml 100 mM eddiksyre og umiddelbart nøytralisert med 0,75 ml IM tris-HCl, pH 8,0. Fab-fremstillingene ble bufferbyttet inn i PBS og konsentrert ved å bruke Centrikon-30 konsentratorer (Amicon). Typiske utbytter for Fab var ~1 mg/l kultur, post-protein G-rensning. Renset Fab-prøver ble karakterisert ved elektrospray massespektrometri, og konsentrasjonene ble bestemt ved aminosyreanalyser.

Konstruksjon av anti-VEGF fab fagemid bibliotek

Humanisert A4.6.1 fagemid bibliotek ble konstruert ved setedirigert mutagenese ifølge metoden til Kunkel et al., Methods Enzymol. 204:125-139 (1991)). Et derivat av pMB4-19 som inneholdt TAA stop tripletter ved VH kodonene 24, 37,67 og 93 ble fremstilt for anvendelse som mutagenesetemplat (alle sekvensenummereringene var ifølge Kabat et al., supra). Denne modifiseringen var for å forhindre etterfølgende bakgrunns-kontaminering av villtypesekvensene. Kodonene som var målet for randomisering var 4 og 71 (lett kjede) og 24, 37,67,69, 71,73, 75, 76, 78,93 og 94 (tung kjede).

For å randomisere tungkjede kodonene 67,69, 71,73, 75, 76, 78, 93 og 94 med en enkel mutagen oligonukleotid, ble to 126-mer oligonukleotider først presamlet fra 60 og 66-mer fragmenter ved templatassistert enzymatisk ligering. Spesifikt 1,5 nmol av 5'

fosforylert oligonukleotid 503-1 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTTTCT

AGA GAC AAC TCC AAA AAC AC A BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ED

NR. 22)) eller 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TJA GAC_

ACC TCC GCA AGC AC ABYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ED NR. 23))

hvor kombinert med 1,5 nmol av 503-3 (5'-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC (randomiserte kodoner er understreket; N = A/G/T/C; W = A/T, B = G/T/C; D = G/A/T; R = A/G; Y = C/T). Derefter, 1,5 nmol av templat oligonukleotid (5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3' (SEQ ED NR. 25)) med komplementær sekvens til de 5' endene til 503-1/2 og den 3' enden av 503-3, ble tilsatt for å hybridisere til hver ende av ligeringskoblingen. Taq ligase (termostabil ligase fra New England Biolabs) og buffer ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble utsatt for 40 runder termale syklusrunder, (95°C, 1,25 minutter; 50°C i 5 minutter) for å la templat-oligonukleotiden kjøre i syklus mellom ligert og uligerte koblinger. Produktet 126-mer oligonukleotidene ble renset på en 6% urea/TBE polyakrylamidgel og ekstrahert fra polyakrylamid i buffer. De to 126-mer produktene ble kombinert i likt forhold, etanol presipitert og til slutt løst i 10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA. Det blandede 126-mer oligonukleotidproduktet ble merket 504-01.

Randomisering av selekterte grunnstrukturkodoner (Vl, 4, 71; Vh 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76,93,94) ble effektuert i to trinn. Først ble Vl randomiseringen oppnådd ved å fremstille 3 ytterligere derivater av modifisert pMB4-19 templat. Grurmstruktur-kodonene 4 og 71 i lett kjede ble erstattet individuelt eller parvis ved anvendelse av to mutagene oligonukleotider 5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3'

(SEQ ED NR. 26) 5'- og TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3 (SEQ ED

NR. 27). Deoksyuridin-inneholdende templat ble fremstilt fra hver av disse nye derivatene. Sammen med originaltemplatet, kodet disse fire konstruksjonene for hver av de fire mulige lette kjedegrurmstrulctur-sekvenskombinasjonene (tabell 5).

Oligonukleotidene 504-1, en blanding av to 126-mer oligonukleotider (se over) og 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT

ATC AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3' (SEQ ED NR. 28) ble brukt for å randomisere tung kjede grurmstruktur kodonene ved å bruke hver av de fire templatene som tidligere beskrevet. De fire bibliotekene ble elektroporert i E. coli XL-1 blå celler (Stratagene) og kombinert. Det totale antallet av uavhengige transformanter ble estimert til >1.2 x 10<8>, ca. 1,500 ganger større enn maksimumsantallet av DNA sekvenser i biblioteket.

Mange systemer har blitt utviklet for funksjonell fremvisning av antistoff-fragmenter på overflaten av filamentøs fage. Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12,433(1994). Disse inkluderer fremvisning av Fab eller enkel kjede Fv (scFv) fragmenter som fusjoner til enten gen HI eller gen VHI kappe proteiner hos Ml3 bakteriofage. Systemet selektert heri er lik det som er beskrevet av Garrard et al., Biotechn. 9,1373, (1991) hvori et Fab-fragment er monovalent fremvist som et gen Ut fusjon (figur 7). Dette systemet har to tydelige trekk. Spesielt ulikt scFvs, har Fab-fragmentene ingen tendens til å danne dimere arter, hvis nærvær kan hindre seleksjon av de tetteste binderne på grunn av aviditetseffekten. I tillegg eliminerer monovalensiteten til de fremviste proteinene en annet potensiell kilde for aviditetseffektene som på annen måte ville resultere fra tilstedeværelse av flere kopier av et protein på hver fagemidpartikkel. Bass og Wells, Proteins 8:309 (1990) og Lowman et al., Biochemistry 30:10832 (1991).

Fagemidpartikler som fremviste humanisert A4.6.1 Fab-fragmenter ble dyrket i E. coli XL-1 blå celler. I korthet ble cellene som inneholdt den randomiserte pMB4-19 konstruksjonen dyrket natten over ved 37°C i 25 ml 2YT medium som inneholdt 50 ug/ml karbensillin og ca. 10<10> M13K07 hjelperfage (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153:3-11 (1987)). Fagemidstokkene ble renset fra kultursupernatantene ved presipitering med en saltvanns polyetylenglykolløsning, og resuspendert i 100 fil FBS (~10<14> fagemid/ml).

Seleksjon av humaniserte A4.6.1 Fab-varianter

Renset VEGF121 (100 ul ved 10 ng/ml i PBS) ble belagt på en mikrotiterplate brønn natten over ved 4°C. Belegningsløsningen ble kastet og denne brønnen, i tillegg til en udekket brønn, ble blokkert med 6% skummet melk 1 time og vasket med PBS som inneholdt 0,05% TWEEN 20™ (detergent). Derefter ble 10 ul av fagemidstokken, fortynnet til 100 ni med 20 mM tris (pH 7,5) som inneholdt 0,1% BSA og 0,05% TWEEN 20™ tilsatt til hver brønn. Efter to timer ble brønnen vasket og bundet fage eluert med 100 ni 0,1 M glysin (pH 2,0), og nøytralisert med 25 ni IM tris pH 8,0. Em alikvot av dette ble brukt for å titrere antallet av fage som ble eluert. De gjenværende fagene eluert fra VEGF-belagte brønner ble dyrket for anvendelse i neste seleksjon-syklus. En total på 8 runder med seleksjon ble utført efter 20 individuelle kloner var selektert og sekvensert (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)).

Bestemmelse av VEGF bindingsaffiniteter

Assosiering (kon) og dissosiering (koff) ratekonstanter for binding av humanisert A4.6.1 Fab-varianter til VEGF121 ble målt ved overflateplasmonresonnans (Karlsson et al., J. Immunol. Methods 145:229-240 (1991)) på en Pharmacia BIAcore instrument. VEGF121 ble kovalent immobilisert på en biosensor chip via primære aminogrupper. Binding av humanisert A4.6.1 Fab-varianter ble målt ved sfrømningsløsninger av Fab i PBS/0,05% TWEEN 20™ over chipen med en strømningsrate på 20 ul/min. Ved å følge hver bindingsmåling ble rest-Fab tatt av den immobiliserte liganden med vasking med 5 Hl 50 mM vandig HC1 ved 3 ul/min. Bindingsprofilene ble analysert ved ikke-lineære regressjon ved å bruke enkel monovalent bindingsmodell (BIAevalaueirngssoftware v2,0; Pharmacia).

RESULTATER

Konstruksjon av humanisert A4.6.1

En initiell humanisert A4.6.1 Fab-fragment ble konstruert (hu2.0, figurene 5A og 5B), hvori CDR fra A4.6.1 ble satt på en human VlkI-VhHI grurmstruktur. Alle andre residier i hu2.0 ble opprettholdt som den humane sekvensen. Bindingen av denne varianten til VEGF var så svak at den var udetekterbar. Basert på relativ affinitet av andre svakt bindende humaniserte A4.6.1 varianter ble Kd for binding av hu2.0 estimert ved >7 uM. Denne konstrasten med en affinitet på 1.6 nM for en kimært Fab konstruksjon består av de intakte Vl og Vh domenene fra murin A4.6.1 og humane konstante domener. På denne måten var bindingen av hu2.0 til VEGF minst 4.000 ganger redusert i forhold til kimæren.

Design av antistoffbibliotek

Gruppen av grurmstrukturendringer til human grurmstruktursekvens heri er vist i tabell 5 og figur 6.

En bekymring ved desig av humaniserte A4.6.1 fagemidbibliotek var at residiene som var målet for randomiseringen var spredt distribuert over Vl og Vh sekvensene. Begrensninger i lengde av syntetisk oligonukleotider krever at samtidig randomisering av hver av disse gnmnstrukiurposisjonene bare kan oppnås gjennom anvendelse av multiple oligonukleotider. Imidlertid siden det totale antall av oligonukleotider øker, minsker effektiviteten av mutagenesen, (dvs. delen av mutanter som er ervervet som inkorporerer sekvens avledet fra alle de mutagene oligonukleotidene). For å komme rundt dette problemet ble to trekk inkorporert i bibliotekkonstruksjonen. Det første var å fremstille fire forskjellige mutagene templater som koder for hver av de mulige Vl grunnstrukturkombinasjonene. Dette var for å gi begrenset diversitet til lettkjede grumstrukturen (bare fire forskjellige sekvenser), men var fordelaktig i at den eliminerte behovet for to oligonukleotider fra mutagenesestrategien. For det andre ble to 126 base oligonukleotider satt sammen på forhånd fra mindre syntetiske fragmenter. Dette gjorde randomiseringen mulig av VH kodonene 67,69, 71,73, 75,76, 93 og 94 med en enkel lang oligonukleotid, heller enn to mindre. Sluttrandomiserings-mutagenesestrategien anvendte derfor bare to oligonukleotider samtidig på fire forskjellige templater.

Seleksjon av tett bindende humanisert A4.6.1 Fab'er

Varianter fra humanisert A4.6.1 Fab-fagemidbibliotek ble selektert basert på binding til VEGF. Anrikning av funksjonelt fagemid, målt ved å sammenligne titrene for fage eluert fra en VEGF-belagt versus ubelagt mikrotiterplatebrønn, økte opp til syv runder med affinitets "panning". Efter en ytterligere runde med sortering, ble 20 kloner sekvensert for å identifisere foretrukket gmrmstrukturresidier selektert ved hver randomisert posisjon. Disse resultatene som er summert i tabell 6 gir en sterk konsensus blant klonene som ble selektert. Ti ut av tyve kloner hadde identisk DNA sekvens, og ble kalt hu2.0. Av tretten grunnstrukturposisjoner som ble randomisert, ble atten substitusjoner selektert i hu2.10 (VL 71: VH 37,71, 73,75, 76,78 og 94). Interessant nok, ble residiene Vh 37 (He) og 78 (Val) selektert hverken som human VhHI eller murin A4.6.1 sekvens. Dette resultatet antyder at noen grurmstruktur-posisjoner kan ha fordel av å utvide diversiteten utover mål human og foreldre murin grunnstruktur sekvenser.

Forskjellene mellom hu2.0 og murin A4.6.1 antistoff er understreket. Antallet av identiske kloner identifisert for hver fageselektert sekvens er indikert i parenteser. Streker i sekvensene til fageselekterte kloner indikerer seleksjon av den humane Vikl-VhEQ grurmstruktursekvens (dvs. som i hu2.0).

Det var fire andre unike aminosyresekvenser blant de gjenværende ti klonene som ble analysert: hu2.1, hu2.2, hu2.6 oghu2.7. Ale disse, i tillegg til hu2.10 inneholdt identiskegrurmstruktursubstitusjoner i posisjonene Vh37 (Ile), 78 (Val) og 94 (Lys), men bibeholdt human VhHI konsensus sekvens i posisjonene 24 og 94. Fire kloner hadde mistet lettkjede-kodende sekvens og bandt ikke VEGF når den ble testet i fage ELISA analyse (Cunningham et al., EMBOJ. 13:2508-251 (1994)). Slike artifakter kan ofte bli minimalisert ved å redusere antallet av sorteringssykler eller ved å dyrke bibliotekene på fast medium.

Ekspresjon og bindingsaffinitet av humanisert A4.6.1 varianter:

Fage-selekterte varianter hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 og hu2.10 ble uttrykt i E. coli ved å bruke risteflasker og Fab-fragmenter ble renset fra periplasmatiske ekstrakter med protein G. affinitets kromatografi. Utbyttene av Fab fra disse fem klonene varierte fra 0,2 (hu2.6) til 1.76 mg/l (hu2.1). Affiniteten til hver av disse variantene for antigen (VEGF) ble målt ved overflateplasmonresonnans på etBIAcore instrument (tabell 7). Analsye av disse bindingsdataene viste at konsensusklonen hu2.10 utviste høyest affinitet for VEGF ut av de fem variantene som ble testet. Derfor ble Fab-fagemid-biblioteket selektivt anriket for den tetteste bindende klonen. Beregnet Kd for hu2.10 var 55 nM, minst 125 ganger tettere enn for hu2.0 som ikke innholder grunnstruktur-endringer (Kd>7 uM). De andre fire selekterte variantene utviser alle svakere binding til VEGF, varierende i området ned til en KD på 360 nM for den svakeste (hu2.7). Interessant nok var Kd for hu2.6, 67 nM bare marginalt svakere enn den hos hu2.10 og enda var bare en kopi av denne klonen funnet blant de tyve klonene som ble sekvensert. Dette kan skyldes et lavere nivå av ekspresjon og fremvisning, som var tilfellet ved ekspresjon av løselig Fab fra denne varianten. Til tross for lavere ekspresjonsrate er denne varianten imidlertid nyttig som et humanisert antistoff.

Ytterligere forbedring av humanisert variant hu2.1:

Til tross for den store forbedringen i antigenaffinitet over start humanisert variant, var bindingen til hu2.10 til VEGF fortsatt 35 ganger svakere enn et kimært Fab-fragment som inneholdt murin A4.6.1 Vl og Vh domener. Denne betydelige forskjellen antyder at ytterligere optimalisering av humanisert gnmnstruktur kan være mulig gjennom ytterligere mutasjoner. Av Vernier-residiene identifisert av Foote & Winter J. Mol. Biol. 224-487-499 (1992), varierte bare VL 46, VH 2 og VH 48 i A4.6.1 versus human VlIcI-VHI grunnstruktur (figurene 5A og 5B) men ble ikke randomisert i vårt fagemidbibliotek. En molekylær modell av humanisert A4.6.1 Fv fragment viste at Vl 46 sitter ved Vl - Vh grenseflaten og kunne influere konformasjonen til CDR-H3. Dessuten er denne aminosyren nesten alltid leusin i de fleste VLk grurmstrukturer (Kabat et al., supra), men er valin i A4.6.1. Samtidig ble en Leu - > Val substitusjon fremstilt i denne posisjonen med bakgrunn av hu2.10. Analyse av bindingskinetikken for denne nye varianten hu2.10V indikerte en ytterligere 6 gangers forbedring i Kd for VEGF-binding, som viste viktigheten av valin i posisjon Vl 46 i antistoff A4.6.1. Kd for hu2.10V (9.3 nM) var derefter innen 6 ganger den fra kimæren. I motsetning til VL 46 ble ingen forbedring i bindingsaffiniteten til hu2.10 observert for erstatning av enten Vh 2 eller Vh 48 med korresponderende residie fra murin A4.6.1.

EKSEMPEL 3

I dette eksemplet ble CDR randomisering, affinitetsmodning med monovalent Fab-fagefremvisning og kumulativ kombinasjon av mutasjoner brukt for å øke affiniteten av humanisert anti-VEGF antistoff.

Konstruksjon av humanisert antistoff pYOl 01:

Fage-fremvisningsantistoffVektoren phMB4-19-1.6 (se figurene 8A-E) ble brukt som et utgangspunkt. I denne konstruksjonen blir anti-VEGF uttrykt som et Fab-fragment som med dets tunge kjede satt sammen med den N-terminale enden av avkortet g3p. Både lette og tunge kjeder er under kontroll av phoA promoter med en oppstrøms stil signalsekvens for sekresjon inn i periplasma. Punktmutasjoner på utsiden av CDR-regionene ble gjort ved setedirigert mutagenese for å forbedre affiniteten for VEGF med oligonukleotidene HL-242, HL-243, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256 og HL-257 som vist i tabell 8 nedenfor:

Resulterende variant ble betegnet Y0101 (figurene 9A og 9B).

Konstruksjon av firste generasjon av antistoff-fagebiblioteker:

For å forhindre kontaminering av villtype sekvens ble templater med TAA stoppkodon på målstedene for randomisering fremstilt og brukt for å konstruere biblioteker ved setedirigert mutagense med oligonukleotider ved å bruke degenerert NNS-kodon (hvor N er lik en blanding av A, G, C og T mens S er en lik blanding av G og C) for metnings-mutagenese. VL1 og VH3 ble valgt som potensielle kandidater for affinitetsøkning (figurene 9A og B). Innenfor CDR ble to biblioteker konstruert fra pYOlOl templat. VL1 ble mutert ved å bruke stopptemplat oligonukleotidene HL-248 og HL-249 (tabell 9) og bibliotekoligonukleotidene HL-258, HL-259 (tabell 10). På samme måte ble tre biblioteker konstruert for VH3 ved å bruke stopptemplatoligonukleotidene HL-250, HL-251 og HL-252 (tabell 9), og bibliotekoligonukleotidene HL-260, HL-261, og HL-262 (tabell 10). Bibliotekkonstruksjonen er vist i tabell 9 og 10 under.

Produktene fra tilfeldige mutagenesereaksjoner ble elektroporert inn i XL-1 blå E. coli celler (Statagene) og amplifisert ved dyrking i 15-16 timer med M13K07 hjelperfage. Kompleksiteten av hvert bibliotek er i området fra 2 x 10 til 1,5 x 10 , ble estimert basert på utplating av initiell transformering på karbensillinplater.

Initielle affinitetsseleksjoner:

For hver runde med seleksjon ble omtrent IO<9> - IO<10> fage screenet for binding til platene (Nunc Maxiorp 96-brønn) dekket med 2 ng/ml VEGF (rekombinant; residie 9-109 versjon) i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6 og blokkert med 5% "instant" melk i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6. Efter 1-2 timers binding ved romtemperatur, i nærvær av 0,5% bovin serum albumin og 0,05% TWEEN 20™ i PBS, ble fageløsningen fjernet og platene ble vasket ti ganger med PBS/TWEEN™ (0,05% TWEEN 20™ i PBS buffer). For å selektere for økte affinitetsvarienter med langsommere disossiasjonsrater ble platene inkubert med PBS/TWEEN™ buffer i en periode som ble forlenget for hver runde med seleksjon (fra 0 minutt for første runde til 3 timer for 9. runde med seleksjon). Efter PBS/TWEEN™ bufferen var fjernet ble gjenværende fage eluert med 0,1 M HC1 og umiddelbart nøytralisert med 1/3 volum 1 M Tris, pH 8,0. Eluerte fage ble dyrket ved å infisere XL-1 blå E. coli celler (Stratagene) for neste seleksjonssyklus.

Sekvenseirngsdata viste at både VL1 bibliotekene, selv efter åtte/ni runder med sortering forble diverse, og som tolererte forskjellig typer av residier på setene for randomisering. Som en kontrast, bibeholdt VH3 bibliotekene bare villtype residiene eller hadde svært konservative substitusjoner. Dette antyder at VL1 var mer eksponert til løsningsmidlet og lå på utsiden av bindingsinterfasen. I motsetning til dette viste ikke VH3 noen dramatisk forskjell i sidekjedesubsitusjoner og derfor kan være mer tett involvert i antigenbinding.

Fage-ELISA analyse av bindingsaffiniteter

Fra hver av disse bibliotekene ble representative kloner (de som er representert ved rikelige sekvenser) analysert for deres affinitet i forhold til den fra foreldreklonen pY0101 i en fage ELISA analyse. I en slik analyse ble fagene først seriefortynnet for å bestemme en fraksjonsmetningstiter som derefter ble holdt konstant og brukt for å inkubere med forskjellig konsentrasjoner av VEGF (med start på 200 nM til 0 nM) i løsning. Blandingen ble derefter overført på plater som var dekket på forhånd med VEGF (2 ng/ml) og blokkert med 5% "instant" melk, og fikk lov til å ekvilibrere i 1 time i romtemperatur. Derefter ble fageløsningen fjernet og de gjenværende bundne fagene ble detetektert med en løsning av kanin anti-fage antistoff blandet med geit anti-kanin konjugat av "horse radish" peroksidase. Efter en times inkubering i romtemperatur ble platene fremkalt med et kromogent substrat, o-fenylendiamin (Sigma). Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1/2 volum av 2,5 M H20. Optisk tetthet ved 492 nm ble målt på en spektrofotometrisk plateavleser.

Selv om alle de selekterte klonene fra disse fem bibliotekene viste enten svakere eller lik affinitet enn den til villtype pYOlOl i fage-ELISA analysen, viste en spesiell variant (pY0192) fra bibliotek HL-258 en tydelig fordel (omtrent 10 ganger) i nivået av ekspresjon av fagefremvisning i forhold til pYOlOl. Denne klonen inneholdt mutasjonene S24R, S26N, Q27E, D28Q og 129L i VL-regionen (figur 9A). I tillegg viste det seg at denne varianten har en falsk mutasjon, M34I, i VH. Denne varianten viste ingen signifikant forskjell i bindingsaffiniteten til VEGF sammenlignet med pYOlOl varianten. For å forbedre nivået av Fab-fremvisning på fagen og signal-til-støy forholdet for fage-ELISA analysene, ble korresponderende substitusjoner i pY0192 ved VL1 inkorporert inn i templatbakgrunnen for å konstruere både CDR Ala-mutanter og andre generasjonen av anti-VEGF bibliotekene.

Ala-scanning av CDR av anti-VEGF:

For å bestemme energetiske bidrag ved hver av aminosyrene i CDR-regionene og på denne måten bedre selektere målresidier for randomisering, ble CDR-regionene screenet ved å substituere alanin for hvert residie. Hver Ala mutant ble konstruert ved å bruke sete-dirigert mutagenese med en syntetisk oligonukleotid som kodet for spesifikk alaninsubstitusjon. Hvor Ala var villtype residien, ble Ser substituert for å teste effekten av en sidekjede substitusjon. Fageklonene som har en enkel Ala-mutasjon ble renset og analysert i fage-ELISA som beskrevet over. Resultatene av Ala-scan viste at Ala-substitusjonen på forskjellige posisjoner kan ha en effekt, i området fra 2 til > 150 ganger reduksjoner, på antigen-bindingsaffinitet, sammenlignet med pY0192. I tillegg bekreftet den en tidligere observasjon at VH3, men ikke VL1, var involvert i antigenbinding. Resultatene fra CDR Ala-scan er sammenfattet i tabell 11 under.

Alle varianter er i bakgrunnen av pY0192 ("wt"; se figurene 9A-B). IC50'er ble bestemt i konkurrerende fage-ELISA analyse.

De største effektene på Ala-substitusjoner ses i CDR Hl, H2 og H3 inklusiv Y27A (34 gangers reduksjon i affinitet), N31A, Y32A, W50A, W52A, Y99A, S106A og W108A (hver >108 gangers reduksjon); N35A (66 gangers reduksjon), P100A (38 gangers reduksjon) og Fl 10A (25 gangers reduksjon). I motsetning til dette hadde bare en VL-substitusjon en stor innvirkning på bindingsaffiniteten, W96A (>150 gangers reduksjon). Disse resultatene viser til de tre VH CDR'ene som hoved energetiske determinanter for Fab-binding til VEGF, med noe bidrag fra VL3.

Design av annen generasjon CDR mutasjonsbiblioteker:

To ytterligere biblioteker som randomiserte eksisterende residier i anti-VEGF versjon Y0192 ble designet basert på inspeksjon av krystallstrukturen. IVH2 ble residiene 52-55 randomisert fordi de lå innenfor bindingsinterfasen med VEGF. En ytterligere reduksjon av Fab, "CDR7" (se figur 10B), ble også målet for randomisering fordi flere residier i denne løkken, når den ikke er i kontakt med VEGF har kontakt med VH-løkken hos antistoffet. Disse representerte potensielle seter for affinitetsforbedring gjennom sekundære effekter ved interfaseresidier. Residiene L72, T74 og S77 ble randomisert i dette CDR7 biblioteket.

Også basert på krystallstrukturen, ble en av original CDR-bibliotekene rekonstruert for å reteste potensialet for affimtetsmodning i VH1 CDR. Residiene 27,28 og 30-32 ble randomisert ved å bruke den nye Y0192 bakgrunnen.

Annen generasjon seleksjoner av anti-VEGF bibliotek:

Basert på Ala-scan resultatene såvel som krystallstnikturen til antigen-antistoff (F(ab)-12) kompleks, ble et totalt antall av 17 biblioteker konstruert ved å bruke pY0192 templat og stopp-templat oligonukleotider (som koder for et stoppkodon på setene som er målet for randomisering) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263 og HL-264 (tabell 9 ovenfor). De korresponderende randomiseringsoligonukleotider (som anvender NNS på setene som er målet for randomisering) var YC81, YC101, YC103, HL-264 og HL-266 (tabell 10 ovenfor). De resulterende transformantene ga biblioteker med kompleksisiteter som var i området fra 6 x IO7 til 5 x 10<8> som antyder at bibliotekene var omfattende i å dekke alle mulige varianter. Fagebibliotekene ble sortert i 7-8 runder ved å bruke betingelse so beskrevet i tabell 12 under.

ELISA buffer inneholdt 0,5% bovint serum albumin og 0,05% TWEEN 20™ i PBS. VEGF var inkludert i inkuberingsbufferen for å minimalisere rebinding av fagene til VEGF dekket på overflaten av platen. Sortering av disse bibliotekene ga fage-anrikninger på over 7 til 8 runder med seleksjon.

Fage-ELISA analyser av annen generasjons kloner:

Efter åtte runder med seleksjoner ble ti til tyve kloner fra hvert bibliotek isolert fra karbensillin som inneholdt plater som inneholdt E. Coli (XLI) kolonier som hadde blitt infisert med en eluert fage "pool". Kolonier ble isolert og dyrket med hjelpefage for å erverve enkeltrådet DNA for sekvensering. CDR substitusjoner som selekterte for mer fordelaktig binding til VEGF ble dedusert fra DNA sekvensene til fagemidklonene. Forskjellige prøver for selekterte kloner er vist i tabell 13 under.

Bare sekvensen til den randomisert regionen er vist som dedusert fra DNA sekvenseringen.

Når et antall av kloner ble testet sammen med foreldreklonen pY0192 i fage-ELISA analyse viste ingen en distinkt forbedring over foreldreklonen. Dette kan forklares ved tidsramme hvorved analysen ble utført (<3 timer).

For å kvantifisere forbedring i antigenbinding over foreldreklonen, ble flere anti-VEGF variant DNA transformert inn i E. Coli stamme 34B8, uttrykt som Fab, og renset ved å passere det periplasmatiske "shockate" gjennom en protein G kolonne (Pharmacia) som beskrevet i eksempel 2 over.

CDR kombinasjonsvarianter:

For å forbedre VEGF-bindingsaffiniteten ytterligere ble mutasjoner som ble funnet ved fagefremvisning kombinert i forskjellig CDR for å danne multiple CDR mutanter. Spesielt ble mutasjoner identifisert i de mest affinitetsforbedrede fagevariantene fra VH1, VH2 og VH3 biblioteker kombinert (tabell 14) for å teste addiviteten av deres bidrag til bindingsaffmtet.

Mutasjoner fra indikerte foreldre vektorer ble kombinert med de fra indikerte oligonukleotid ved setedirigert mutagense for å gi kombinasjonsvarianter som er opplistet.

Versjon Y0317 er ekvivalent til Y0313-1 med unntak av at bakgrunnsmutasjonen i VL1 ble fjernet og dets sekvens revertert tilbake til den i pYlOlO. Effektene av å mutere H101Y og S105T ble testet ved å konstruere en revers mutant fra Y0238-3.

BIAcore analyser:

VEGF-bindmgsaffinitetene til Fab-fragmentene ble beregnet fra assosiasjon og dissociasjonsratekonstanter målt ved å bruke en BIAcore-2000™ overflate plasmonresonnans system (BIAcore. Inc. Piscataway, NJ). En biosensor chip ble aktivert for kovalent kobling av VEGF ved å bruke N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) i henhold til forhandlerens instruksjoner (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). VEGF ble bufferbyttet i 20 mM natriumasetat, pH 4,8 og fortynnet til omtrent 50 ng/ml. En alikvot (35 ul) ble injisert med en strømningsrate på 2 nl/min for å oppnå omtrent 700-1400 respons-enheter (RU) av koblet protein. Til slutt ble 1 M etanolamin injisert som et blokkerings-middel.

For kinetikkmålinger ble to gangers seriefortynninger av Fab injisert i PBS/TWEENTM buffer (0,05% TWEEN™ i fosfatbufferet saltvann) ved 25°C med en strømningsrate på 10 |il/min. "On rates" og "off rates" ble beregnet ved å bruke standardprotokoller (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)). Likevektsdissosiasjons-konstantene Kd fra overflate plasmon resonnansen (SPR) målinger ble kalkulert som koff/kon. Data er vist i tabell 15 under.

BIAcore™ data i tabell 15 viser at flere varianter har forbedret affinitet over Y0192. For eksempel viste en CDRH1 variant, Y0243-1,4.1 gangers økt affinitet som oppsto fra mutasjonene T28D og N31H. Variant Y0238-3 viste minst en 14 gangers forbedring i bmdingsaffinitet over Y0192. Begge CDRH3 mutasjonene bidrar til forbedret affinitet av Y0238-3 fordi reversjon av T105 til S (variant Y0313-3) reduserer affiniteten til Y0238-3 fra 0,15 nM til 0,65 nM (se tabell 15). En større affimtetsøkning i forhold til Y0192 ble sett for Y0313-1, som inneholdt CDRH3 mutasjoner kombinert med CDRH1 mutasjoner.

Cellebasert analyse for VEGF inhibering:

Flere versjoner av A4.6.1 anti-VEGF antistoff ble testet for deres evne til å antagonisere VEGF (rekombinant; versjon 1-165) i induksjon av veksten til HuVEC (human navle-strengsveneendotelceller). På 96-brønners platene ble det sådd ut med 1000 Hu VEC pr. brønn og festet i analysemediumet (F12:DMEM 50:50 supplert med 1,5% diafiltrert føtalt bovint serum) i 24 timer. Konsentrasjonen av VEGF brukt for å indusere cellene ble bestemt ved første titrering for mengden av VEGF som kan stimulere 80% av maksimal DNA syntese. Ferskt analysemedium som inneholdt fikserte mengder av VEGF (0,2 nM sluttkonsentrasjon) og økende konsentrasjoner av anti-VEGF Fab eller Mab ble derefter tilsatt. Efter 40 timers inkubering ble DNA syntesen målt ved inkorporering av tritiert tymidin. Cellene fikk impuls med 0,5 uCi pr. brønn av [3H]-tymidin i 24 timer og ble høstet for telling ved å bruke en TopCount gamma teller.

Resultatene (figur 11) viser at full-lengden IgG formen av F(ab)-12 var signifikant mer potent til å inhibere VEGF aktivitet enn Fab formen (her, Y0192 ble brukt). Imidlertid viste begge variantene Y01238-3 og Y0313-1 mer potent inhibering av VEGF aktivitet enn Y0192 Fab eller F(ab)-12 Mab. Sammenligning av Fab-formene variant Y0313-1 viste seg å være >30 ganger mer potent enn villtype Fab. Det bør bemerkes at mengden av VEGF (0,2 nM) brukt i denne analysen er potensielt begrensende for bestemmelse av en nøyaktig IC50 for mutanten. For eksempel, hvis brndingsaffiniteten (Kd) av mutanten faktisk er <0,2 nM vil IC50 i dette eksperimentet fremstå høyere enn under betingelser med lavere VEGF konsentrasjon. Resultatet støtter derfor konklusjonen at affinitetsforbedret variant er minst 30 ganger forbedret i affinitet for VEGF og at den effektivt blokkerer VEGF affinitet in vitro. Siden variantene Y0317 er forskjellig fra Y0313-1 bare i reversjonen av VL1 sekvensen til villtype (figur 10A), er det forutsatt at Y0317 vil ha lik aktivitet til Y0313-1.

Variant Y0317 (Fab) og humanisert variant F(ab)-12 fra eksempel 1 (full-lengde og Fab) ble sammenlignet med deres evne til å inhibere bovin kapillær endotelcelle-proliferering i respons til en nær maksimal effektiv konsentrasjon av VEGF ved å bruke analysen beskrevet i eksempel 1. Som illustrert i figur 12, var Y 0317 markert mer effektivt i inhibering av bovin kapillær endotelcelle proliferering enn fullengden og Fab-formene av F(ab)-12 i denne analysen. Y0317 affinitetsmodnet Fab demonstrerte en ED50-verdi i denne analysen som bare var omtrent 20 ganger lavere enn F(ab)-12 Fab.

Claims

1. Et humanisert anti-vaskulært endotelvekstfaktor antistoff, karakterisert ved at det inhiberer VEGF-indusert angiogenese in vivo og/eller binder human VEGF med en Kd verdi på ikke mer enn 1x10" M og/eller har en ED50 verdi for inhibering av VEGF-indusert proliferering av endotelceller in vitro som ikke er større enn 5nM, hvor antistoffet har et tungkjedevariabel domene omfattende konsensus grurmstrukturregionene til human tungkjede undergruppe Ut, som vist i SEQ ED NO: 11, og hypervariabelregionene CDRH1, CDRH2 og CDRH3 som har følgende aminosyresekvenser CDRH1: GYXiX2X3X4YGX5N (SEQ EO Nr. 117), hvor Xj er D, T eller E, X2 er F, W eller Y, X3 er T, Q, G eller S, X4 er H eller N og X5 er M eller I, CDRH2: WENT XiTGEPTYAADFKR (SEQ ED Nr. 118), hvor Xt er Y eller W og CDRH3: YPXi YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ED Nr. 119) hvor Xi er H eller Y, X2 er Y, R, K, I, T, E eller W, X3 er G, N, A, D, Q, E, T, K eller S, X4 er S, T, K, Q, N, R, A, E eller G og X5 er S eller G; og har et lettkjedevariabel domene omfattende konsensus gnmnstnikturregionene til human kappa lettkjede undergruppe I, som vist i SEQ ED NO: 12, og hypervariabel regionene CDRL1, CDRL2 og CDRL3 som har følgende aminosyresekvenser CDRL1: Xi AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ED Nr. 121), hvor X, er R eller S, X2 er S eller N, X3 er Q eller E, X4 er Q eller D og X5 er I eller L; CDRL2: FTSSLHS (SEQ ED Nr. 122); CRDL3: QQYSX^PWT (SEQ ED Nr. 123), hvor X, er T, A eller N og X2 er V eller T, hvor, sammenliknet med SEQ ED NO 11, tungkjedevariabel domenet har en substitusjon i hvilket som helst eller flere av de følgende residuer i konsensus grurmstriilcturregionene: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H og 94H, og hvor, sammenliknet med SEQ ED NO 12, lettkjedevariabel domenet enten har en substitusjon i og bare i residue 46L i konsensus grurmstruktur regionene eller har substitusjoner i residue 4L og 46L i konsensus grurmstruktur regionene, hvor nummerering av residuene er som vist i Fig 1.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvor lettkjedevariabel domenet har en substitusjon i og bare i residue 46L i konsensus grurmstrukturregionene.

3. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som har substitusjoner i minst to av nevnte tungkjede residuer.

4. Antistoff ifølge krav 3, som har substitusjoner i minst tre av nevnte tungkjede residuer.

5. Antistoff ifølge krav 4, som har substitusjoner i minst fire av nevnte tungkjede residuer.

6. Antistoff ifølge krav 5, som har substitusjoner i residuene 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H og 94H.

7. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori: i CDRH1, Xi er D eller T, X2 er F, X3 er T og X5 er M; i CDRH2, Xi erY; og i CDRH3, X2 er Y, X3 er G, Xt er S eller T og X5 er S.

8. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori: iCDRLl,Xi erS,X2erS,X3erQ,X4erDogX5erI; og i CDRL3, Xi er T og X2 er V;

9. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori tungkjedevariabel domenet omfatter aminosyresekvensen: "CDR7": XiSX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO: 120), hvor Xi er F, I, V, L eller A, X2 er A, L, V eller I, X3 er T, V eller K, X4 er S eller W, X5 er S eller K, X6 er N eller S og X7 er V, A, L eller I.

10. Antistoff ifølge krav 9, hvor i CDR7, Xi er F, X2 er L, X3 er T, X4 er S, X5 er K, X6 er S og X7 er A.

11. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor tungkjedevariabel domenet har aminosyresekvensen til SEQ ED NO 7 og/eller lettkjedevariabel domenet har aminosyresekvensen til SEQ ED NO 8.

12. Antistoff ifølge krav 11, hvor tungkjedevariabel domenet har aminosyresekvensen til SEQ ED NO 7 og lettkjedevariabel domenet har aminosyresekvensen til SEQ ED NO 8.

13. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som binder human vaskulært endotelvekstfaktor (VEGF) med en Ka verdi på ikke mer enn omtrent 1x10" M.

14. Antistoff ifølge krav 13, som binder human VEGF med en Ka verdi på ikke mer enn omtrent 5 x 10"<9>M.

15. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som er et fullengde antistoff.

16. Antistoff ifølge krav 15, som er et humant IgG.

17. Antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 14, som er antistoff fragment.

18. Antistoff ifølge krav 17, som er et Fab.

19. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter antistoffet ifølge hvilket som helst av de foregående krav og en farmasøytisk akseptabel bærer.

20. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for antistoffet ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 18.

21. Vektor, karakterisert ved at den omfatter nukleinsyren ifølge krav 20.

22. Vertcelle, karakterisert ved at den omfatter vektoren ifølge krav 21.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert anti-VEGF antistoff, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 22, slik at nukleinsyren blir utrykt.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, som videre omfatter gjenvinning av humanisert anti-VEGF antistoff fra vertscellekulturen.

25. Medikament, karakterisert ved at det omfatter et humanisert anti-VEGF antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 18, for anvendelse for inhibering av VEGF-indusert angiogenese i et pattedyr, hvor nevnte medikament kan bli administrert i en terapeutisk effektiv mengde til nevnte pattedyr.

26. Medikament ifølge krav 25, hvor pattedyret er humant.

27. Medikament ifølge krav 25 eller krav 26, hvor pattedyret har en tumor.

28. Medikament ifølge krav 25 eller krav 26, hvor pattedyret har en retina! lidelse.

29. Antistoff ifølge krav 1, hvor lettkjedevariabel domenet omfatter aminosyresekvensen: DIQXiTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLH SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVE1KR (SEQ ED Nr. 124), hvori Xi er M eller L.

30. Antistoff ifølge krav 1, hvor tungkjedevariabel domenet omfatter aminosyresekvensen: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYXiTFX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGW INTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3YY GX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ED NR. 125), hvori X, er T eller D; X2 er N eller H; X3 er Y eller H og X4 er S eller T.