HU231498B1

HU231498B1 - Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelőző flokkulálás alkalmazásával

Info

Publication number: HU231498B1
Application number: HUP1900112A
Authority: HU
Inventors: Zsuzsanna Keszey; Zoltán Sütő
Original assignee: Richter Gedeon Nyrt
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2024-05-28
Also published as: HUP1900112A1; MA55503A; JP2022526965A; CA3130629A1; JP7333412B2; BR112021017206A2; WO2020200980A1; KR20210149089A; EP3947414A1; CN113710685A; AU2020252054A1; US20220194981A1

Description

IMMUNOGLOBULINOK AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA JÁNAK FEJLESZTÉSE KÖTÉST MEGELŐZŐ FLOKKULÁLÁS ALKALMAZÁSÁVAL

A TALÁLMÁNY TÁRGYA

A jelen találmány tárgya antitestek tisztítására vonatkozó módszerek, melyek célja az affinitás kromatográfia során a sejttenyészetböl származó antitest kicsapódásának megelőzése oly módon, hogy a befogásos affinitás kromatográfiát megelőzően flokkulálálást és szűrési lépéseket és a befogó lépést követően további finomtisztítási lépéseket alkalmazunk.

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

A rekombináns DNS-technológiával előállított polipeptidek tisztítására alkalmas hatékony és gazdaságos downstream lépések sorrendjének megválasztása döntő fontosságú lépés minden új terápiás alkalmazásra szánt biológiai gyógyszer fejlesztésében. A közelmúltban a monoklonális antitestek (mab-ok) - melyeknek kivételesen magas a gyógyászatban alkalmazott terápiás dózisuk - nagyléptékű tisztítási folyamatai iránti igény tovább fokozódott, s ez a növekedés a sejttenyésztési módszerek továbbfejlesztésének köszönhető, melyek alkalmazása nagyobb sejtsürűséget, magasabb expressziós rátákat és ebből következően nagyobb titert (>10 g/L) eredményezett. A tenyésztő közegekben a termékek és szennyezők növekvő koncentrációja magasabb igényeket támasztott a kötő módú kromatográfia során, mind az ezt megelőző tisztítási lépésekkel, mind az ezt követő további tisztítást szolgáló kromatográfiás lépésekkel szemben is. A teljes downstream folyamatnak: (i) képesnek kell lennie kezelni a megnövekedett termékmennyiséget, (ii) hatékonyan el kell tudnia távolítani az eljárás és a termék-eredetű szennyezőket, hogy azok a meghatározott elfogadási kritériumok alatt maradjanak, (iii) fenntartsák a gazdaságos kitermelést és (iv) biztosítsák a mab megfelelő minőségét. Általánosságban, a downstream folyamatok adják a terápiás antitest teljes előállítási költségének nagyobb részét.

A mabok nyers frakcióiban általában olyan szennyezők találhatók, mint a gazdasejt fehérjéi (HCP), a gazdasejt DNS-e (HCDNS), endotoxinok, inzulin, vírusok, aggregátumok és más nem kívánt termékvariánsok és folyamat során felhasznált anyagok különböző maradványai.

θ'

Ezeknek a szennyezőknek a jelenléte potenciális egészségügyi kockázat a betegek szamara es

SZTNH-100219547

2 6 4 0 4 ennek következtében hatósági előírás, hogy a késztermékben már ne legyenek jelen, vagy csak nagyon alacsony maradék mennyiségek engedhetők meg.

A sejjtenyészetekböl származó polipeptidek tisztításának hagyományos folyamata az ún.: befogás(os)-köztes-finomtisztítás kromatográfiás lépések sorrendje, amely a szűrési, 5 koncentrálási vagy dialízis lépésekkel együtt alkotják a downstream folyamatot. Az elmúlt években sikeresen vezették be a platform megközelítéseket a mabok tisztításának területén. Mivel a mabok a glikoproteinek egyik jól definiált osztályát képezik, amelyeknek közös fizikokémiai tulajdonságai vannak, az általános platform eljárás alkalmazása megalapozott (Kelly B 2009). Egy ilyen univerzális eljárás, több vagy kevesebb termékspecifikus 10 átdolgozással, számos mabra alkalmazható, különösen azokra az immunoglobulinokra, amelyek ugyanabba az osztályba vagy alosztályba tartoznak, pl. az IgGl-be.

A mabok tisztítására alkalmazott leggyakoribb ún.: befogásos lépés, a protein A affinitás kromatográfia. Ez a lépés kivételes szelektivitást kínál az Fc-hordozó molekulák esetében, ennek következtében a szennyezők 99,5%-a eltávolítható egyetlen lépésben. Az előnyei mellett 15 azonban két hátránya is megemlítendő. Egyik hátrány a protein A ligandnak vagy fragmenseinek nem kívánt lehasadása, amelyeket toxikus anyagként ismerünk (Gagnon P 1996). A másik hátrány az ilyen típusú gyanta magas költsége, különösen olyan mennyiségben, ami a terápiás antitestek ipari léptékű megtisztításához szükséges. Egy protein A gyanta hozzávetőlegesen 30-szor drágább, mint egy ioncserélő gyanta. 10 m³ sejttenyészet downstream 20 feldolgozásánál a protein A affinitás kromatográfia költsége kb. 4-5 milliós USD-nak adódott (Farid SS 2009).

A befogásos lépéseket sok esetben a nyers tenyésztöközeggel hajtják végre, amelyek az affinitás oszlop gyantájának szennyeződését (a szennyezők akkumulációját) okozhatják. 25 Megfelelő regenerálás hiánya a befogásos gyanta sikeres újrahasználatát akadályozhatja meg.

A nyers tenyésztő közegek szennyezői, úgymint a lipidek, az oxidáló szerek, a gazdasejt fehérjék (HCP), a gazdasejt DNS (HCDNS), aggregátumok vagy részecskék, fémionok és más anyagok, elősegítik a gyanta eltömődését, valamint kicsapódást és zavarosságot okozhatnak az alacsony pH-η történő elúció során (Shukla AA 2005) az eluátumban. A kötő csoportokra 30 kifejtett direkt hatás mellett a mátrix is irreverzibilisen szennyeződhet. Ennek következményei az ellenállás növekedése és a futtatásról futtatásra csökkenő kapacitás és áramlási sebesség. Ez a probléma nem korlátozódik a protein A gyantákra: a kromatográfiás gyanták elszennyeződése a működési élettartam alatt egy általános, jelentős probléma a kereskedelmi bioszeparációk esetén.

A hidrofób kölcsönhatási kromatográfiában és a kevert módú kromatográfiában használt hidrofób ligandumok, amelyeket befogásos lépésben használnak sejttenyészetekböl származó 5 immunoglobulinok esetében, különösen hajlamosak a tenyésztő közegekből származó lipofil szennyezők csapdázására. Annak ellenére, hogy a futtatás utáni tisztítási lépésekre szofisztikáit protokollok vannak, a kötő oszlop élettartama korlátozott és függ a ciklusok számától, az üzemeltetési körülményektől a futtatás és a tisztítás során és a minta összetételétől és tisztaságától.

Az erősen szennyezett tenyésztő közegek tisztására és előtisztítására mechanikai szeparációs lépéseket alkamaznak, amelyek a sejttörmelék és az aggregátumok nagy részét eltávolítják. A centrifugáló és szűrőállomások a leggyakoribb előkezelési lépések, amelyeket a minta befogásos gyantára való feljuttatása előtt hajtanak végre. Nagy térfogatok esetén a folyamatos 15 centrifugálást sejtszeparátorokkal hajtják végre, amelyeket mélységi szűrökkel és/vagy mikroszűrőkkel elvégzett szűrési lépések követnek. Az így létrejövő tenyésztő közeget a “tisztított sejttenyészet felülúszójának” nevezik (Liu HF 2010). Bár a szeparált felülúszó protein A gyantára történő közvetlen felvitele egy gyakran választott módszer (Fahmer RL 2001), más platform technológiák különböző tisztítási lépéseket, úgymint centrifugálás, 20 mélységi szűrés és/vagy mikroszűrés (Liu HF 2010, WO9522389, WO2001150110) alkalmaznak a befogásos oszlop védelmére. Ez csökkenti a gyanta szilárd anyagokkal és részecskékéi való szennyeződését és javítja az antitestek tisztaságát az eluátumban.

A befogást megelőző, átfolyó módban végrehajtott kromatográfiát centrifugálási/szürési lépésekkel kiegészítve alkalmazták immunoglobulimok nagyléptékű tisztítására 25 (WO2015135884). Azt találták, hogy a befogásos kromatográfiát megelőző további anioncsere kromatográfiás lépések beiktatásával a tisztítási folyamat összköltsége jelentősen csökkenthető. Egy kötést megelőző anioncserélő átfolyó kromatográfiás lépés csökkentette a szennyezésből adódó terhelést, amelynek a költséges befogó kromatográfiás töltet ki van téve.

A zavaros eluátum és a nagy oszlop ellenállás gyakori jelenség a mabok protein A kromatográfiás, savas pH-η történő elúciója során. A kutatások ezt a jelenséget a fehérje önasszociáció eredményeképpen bekövetkező folyadék-folyadék fázisszétválással kötik össze.

1926404

Ezt a hatást több tényező befolyásolja, beleértve a pH-t, a hőmérsékletet, az ionerösséget és a fehérje koncentrációt. A protein A elúció során a paraméterek gondos kiválasztása, beleértve a hőmérsékletet, az áramlási sebességet, a puffért és a sót, egyaránt segíthetnek a zavarosság és oszlop ellenállás csökkentésében (Luo H 2017). Hasonló stratégiákat alkalmaztak a protein A 5 eluátumban megmutatkozó aggregáció és a részecskeképződés problémájának elkerülésére (Shukla AA 2005). Javasolt a stabilizáló anyagok, mint a sók, a karbamid és az az aminosavak elúciós pufferhez történő hozzáadása, az alacsonyabb hőmérséklet, a mosó és elúciós pufferek pH-jának adaptálása vagy szeparált sejttenyészet előkezelése bizonyos, alacsony pH-n kicsapódó szennyezők eltávolítása érdekében. Az előkezelési módszerek között voltak az 10 anioncserélő kromatográfia, a szűrés és a szennyezők savas kicsapása (Shukla AA 2005).

A flokkulálás egy olyan eljárás, amelyet széles körben alkalmaznak a vegyiparban és az élelmiszeriparban, valamint a szennyvíztisztításban. A kicsapást és a flokkulálást egyaránt sikeresen alkalmazzák sejttenyésztö közegek tisztítására. Amíg a kicsapás a célba vett oldott 15 anyagok oldhatóságának csökkentésén, addig a flokkulálás a szemcsék (sejtek, sejttörmelékek vagy az emlőssejtes sejttenyészet kolloidjai) összegyűjtésén alapul, melyet a flokkulálószer hídképző szerepe okoz. A flokkulálószer a biokolloidális szuszpenzió destabilizálódását váltja ki azáltal, hogy a diszpergált szemcsék nagyobb méretű klaszterekbe történő összetapadását okozza, ami az átlagos szemcseméret-eloszlás növekedését eredményezi (Felo M 2015, Singh 20 N 2016). A flokkulálási módszerek osztályozhatók anionos, kationos és kevert módú flokkulálásra (Singh N 2016).

A flokkulálószerek jellemzően egyszerű savak, kétértékű kationok, polikationos polimerek, kaprilsav és olyan, stimulálásra érzékeny polimerek, amelyek alkalmasak a sejttenyészet tisztításának fokozására és csökkentik a DNS, a gazdasejt fehérjék (HCP) és a vírusok 25 mennyiségét (Felo M 2015). A flokkulálási módszereket mintegy 10 éve intenzíven kutatják a nagy léptékű monoklonális antitest előállításban való hasznosíthatóságuk miatt is.

A különböző kationok és anionok kombinációjával, sejtek jelenlétében, pH beállítással vagy anélkül végzett flokkulálást sikeresen alkalmazták monoklonális antitestek tisztítására (W02007035283). A legelőnyösebb a Ca²⁺ és a foszfát kombinációja volt. Kiemelkedő HCP30 és zavarosság csökkenést mutattak ki a protein A elúciós csúcsban a nem flokkulált kontrolihoz képest.

1926404

További módszerek polielektrolitokat alkalmaznak a szeparált sejttenyésztö közeg szennyezőinek kicsapására, úgymint a polivinil-szulfonsav, polivinil-szulfonát, polisztirolszulfonsav, poliakrilsav, polilizin vagy poliarginin (W02008091740). Hasonló módszert fejlesztettek ki szennyezők kicsapására, ahol flokkulálószerként kaprilsavat alkalmaztak 5 (W02010151632).

A szennyezők kicsapása vagy flokkulálása gyakran további pH változtatást igényel. Ezt ismertették kétértékű kationokkal történő kicsapás esetében, úgymint a Co²⁺ vagy a Ni²⁺(W02008127305) és a dextránnal való kicsapás esetén (WO2016153983).

Egy másik flokkulálásos eljárás benzilezett poliallilamint alkalmaz, mint intelligens polimert, 10 amelyet monoklonális IgGl CHO sejttenyészetböl való kicsapására fejlesztettek ki.

A stimulálást nátrium-foszfát hozzáadásával váltják ki (Kang YK 2013). További, stimulálásokra érzékeny polimerként viselkedő vegyületek is ismertek, amelyeket antitestek szeparált sejttenyészeteinek tisztítására alkalmaznak (WO2011146394).

A későbbi adszorpciós és kromatográfiás lépéseket megelőző kondicionáló módszerként írtak 15 le egy flokkulálási lépést, amely sejteket tartalmazó szeparátumhoz történő allantoin hozzáadásán alapul és amelyet etakridin hozzáadása követ (WO2014133459).

Egy másik flokkulálásos módszer C?-Cio zsírsavakat alkalmaz további funkcionális szubsztrátokkal kombinációban a szeparált sejttenyészet tisztítására (WO2014196926).

Hasonló eljárást alkalmaztak, amely C7-C10 zsírsavak és allantoin kombinációján alapul 20 (WO2015130222).

Egy összetettebb flokkulálásos módszert tártak fel, amely allantoin, kationos polimer és zsírsav kombinációját alkalmazza a sejteket tartalmazó szeparátumban lévő szennyezők eltávolítására.

A legmegfelelőbb a három flokkulálószer, az allantoin, a kitozán és a kaprilsav keveréke volt (WO2017217930).

Leírtak egy teljes eljárást antitestek vagy más célmolekulák tisztítására, amely magában foglal (i) egy kicsapási lépést a szennyezöanyagok eltávolítására, (ii) protein A kromatográfíát, amelyet (iii) egy vagy két átfolyó kromatográfia követ (W02014004281). A kicsapószert, amely flokkulálószert is tartalmaz, a szeparált sejttenyészethez adják, további, stimulálásra érzékeny alkotóelemekkel vagy azok nélkül.

A poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid, egy kationos vízoldható polimer alkalmazását tanulmányozták a mab-ot termelő CHO sejttenyészet szeparátumának tisztítására (McNemey T 2015). A szerzők közvetlenül a tenyésztő közeghez adták hozzá a flokkulálószert. A

1926404 centri fugái ást elhagyták, helyette szűrőállomást alkalmaztak. Kimutatták, hogy a toxikus polidiallil-dimetil-ammónium-klorid kimutatási határ alá csökkent egy ezt követő protein A befogásos kromatográfía után.

Olyan nagy léptékű sejttenyészet szeparáló módszert fejlesztettek ki, amely magában foglal egy 5 kiindulási, a sejtek jelenlétében zajló flokkulálásos lépést, ami poli-diallil-dimetil-ammóniumkloridon alapul (WO2013090820). A preferált flokkulálásos módszer további flokkulálást elősegítő anyagokat alkalmaz, úgymint polietilén-glikol és Triton X-100.

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

Jelen találmány tárgya a sejttenyészetekből származó immunoglobulinok kicsapódásának megelőzése affinitás befogásos kromatográfiás közegben, alacsony pH-η történő elúció során. A találmány további tárgya egy immunoglobulin hatékony és költségkímélő tisztítási módszere, megfelelő tisztaság és kitermelés mellett. Jelen találmány célja különösen a befogásos kromatográfiás gyantáról eluált immunoglobulin oldat tisztaságának javítása, ami ebből következően a végtermék jobb minőségét eredményezi.

Továbbá, a jelen találmány vonatkozik a meglehetősen költséges kromatográfiás anyagok újrahasznosítására, különösen a downstream folyamat befogásos lépésében alkalmazott affinitáskromatográfiás anyagok élettartamára és arra, hogy ez hogyan növelhető, miközben a tisztítási folyamat technikai komplexitását csökkentjük.

A sejttenyésztő közegekből származó immunoglobulinok tisztítására szolgáló hagyományos downstream kromatográfiás eljárások általában egy affinitás befogásos kromatográfiás lépéssel kezdődnek, amelyeknek során az immunoglobulint ki kell nyerni az oldatból, amely tartalmazza az immunoglobulint a szennyezőkkel együtt. Az immunoglobulint javarészt elválasztják a szennyezőktől, mivel szelektíven kötődik a befogásos kromatográfiás gyanta affinitás ligandumaihoz, míg a szennyezők nem kötődnek a gyantához és ennek következtében az átfolyt oldatban találhatóak, ellenben az immunoglobulin az eluátumba jut.

Az affinitás befogásos kromatográfía általában a legdrágább lépés az immunoglobulinok tisztítása során, ami a downstream folyamat összes költségének 40-50%-át teszi ki abban az esetben, ha protein A kromatográfíát alkalmaznak. Ugyanez vonatkozik alternatív affinitás 30 kromatográfiás oszlopokra, amelyek alkalmazhatók befogásos kromatográfiás lépésként az immunoglobulinok tisztítása során.

1920404

1928404

A nagytérfogatú sejttenyésztö közegekből és fermentlevekből, valamint az ilyen folyadékokból és tápközegekből származó tisztított oldatokban lévő immunoglobulinok költséghatékony tisztítására való igény folyamatos. Igény mutatkozik különösen az egyszerű tisztítási módszerek iránt, amelyek költséghatékonyak és még a tisztaság, valamint a kihozatal tekintetében is hatékonyak és megfelelőek.

Azt találtuk, hogy a befogó módú kromatográfiát megelőző további kromatográfiás lépés beiktatásával a tisztítási folyamat összköltsége jelentősen csökkenthető. Ez a további kromatográfiás lépés csökkenti azt a szennyezőanyag-terhelést, amelynek a költségigényes befogásos kromatográfiás töltet ki van téve. Ezt az ún. “előtisztítási” lépést anioncserélő vagy kevert módú kromatográfiás töltet alkalmazásával hajtjuk végre, amely kevésbé költséges és robosztusabb a későbbi befogó lépésben alkalmazott kromatográfiás anyagokhoz képest és könnyen regenerálható (WO2015135884). Annak érdekében, hogy a tisztítási folyamat annyira egyszerű legyen, amennyire csak lehetséges, az előtisztítási kromatográfiát átfolyó módban végzik, vagyis a megtisztítandó immunoglobulint nem kötik a gyantához, hanem az átfolyó frakció tartalmazza, míg a szennyezők nagymértékben visszatartódnak a gyantán és ezáltal elválasztódnak az immunoglobulintól. Tovább egyszerűsíti ezt a módszert az előtisztító anioncserélő oszlop közvetlen kapcsolata a protein A kötő oszloppal, vagyis az előtisztító lépés átfolyt oldatát nem tárolják átmenetileg egy gyűjtőtartályban, hanem közvetlenül a befogó kromatográfiás gyantára jut (WO2015135884).

Mindamellet, hogy a befogást megelőző tisztítási lépésként alkalmazott anioncserélő átfolyó módú kromatográfiát már nagyléptékű termelésben sikeresen alkalmazták, még továbbra is fejlesztések tárgya. Az anioncsere kromatográfia elsősorban negatív töltésű anyagokat köt meg, úgymint a HCDNS és a HCP nem specifikusan adszorbeálódó sejttörmelékekkel, aggregátumokkal, lipidekkel, stb. együtt, amelyek visszatartódnak az oszlopon. A pozitív töltésű HCP és a töltéssel nem rendelkező molekulák nagy része azonban képes áthaladni az előtisztító oszlopon. Ez a protein A elúciós csúcs esetében nem kívánt zavarossághoz vezethet. Továbbá, a nagy sejtsűrüség, a közeg táplálására alkalmazott összetett stratégiák és a korszerű emlössejtes tenyészetek magas expressziós rátái által okozott növekvő igények következtében az előtisztító oszlopnak jelentős méretűnek kell lennie ahhoz, hogy hatékonyan védjék a protein A oszlopot. Ez az árban is jelentkezik. Végezetül, az anioncserélő gyantának durva és időigényes tisztító és regeneráló lépéseken kell keresztül mennie. Ez nem előnyös a rutin termelésben, amelynek során célszerűen sarzsok sorozatát gyártják kampányszerűen.

Jelen találmány egy olyan flokkulálásos lépés megvalósíthatóságát vizsgálja, amelyet egy befogást megelőző lépésként alkalmazunk azért, hogy a kromatográfiás előtisztítás fent említett problémáit leküzdjük. Annak érdekében, hogy a terápiás célra szánt immunoglobulin kívánt 5 nagy tisztaságát elérjük, két vagy több kromatográfiás tisztítási lépés követi a flokkulálást és befogásos kromatográfiás lépést.

A jelen találmány alapját képező problémát egy olyan módszer biztosításával oldottuk meg, amely a sejttenyésztő közegből származó immunoglobulinok tisztítására szolgál és amely 10 módszer a következő lépéseket tartalmazza az alábbi sorrendben:

(a) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a sejttenyésztö közeghez/folyadékhoz;

(b) az (a) lépésben kapott keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szürlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunogloblin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, amelynek pH-ja 5-9 és ionerőssége

0,1-5,0 mol/1; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer használatával, amelynek pH-ja 2,5-4,5.

Egyes kiviteli alakokban az (a) lépés a következő lépéseket foglalja magában a sejttenyésztö /közeg centrifugálása és/vagy szűrése;

- flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a felülúszóhoz vagy szürlethez.

A flokkulálás végrehajtható kationos vegyület flokkulálószerként történő hozzáadásával is. A 25 kationos vegyület kiválasztható a kétértékű fémionok sóiból, a vízoldható szerves polimerekből és a vízben nem oldódó szerves polimerekből álló csoportból.

Egyes kiviteli alakok esetén a kétértékű fémion sója a kalcium-klorid.

Előnyös kiviteli alakok esetén a vízoldható szerves polimer poli-diallil-dimetil-ammóniumklorid. Más kiviteli példákban a vízben oldhatatlan szerves polimer a kitozán.

1928404

Jellemző módon, a flokkulálást poli-diallil-dimetil-ammónium-kloriddal, mint flokkulálószerrel végezzük el. Előnyös esetben, a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid moláris tömege 10 kDa és 10 000 kDa közötti.

Jellemző módon, a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid végső koncentrációja 0,01 - 1,0 % 5 (m/v), előnyösen a végső koncentráció 0,02 - 0,1 % (m/v), még előnyösebben a végső koncentráció 0,03 - 0,08 % (m/v).

Egyes kiviteli alakokban a flokkulálás véghezvitelére nem adagolnak más anyagokat a polidiallil-dimetil-ammónium-kloridon kívül.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósítása poli-diallil-dimetil-ammónium-kloriddal végzett flokkulálás a pH vagy a vezetőképesség további beállítása nélkül történik.

Egyes jellegzetes kiviteli alakokban a flokkulálást kevertetés mellett végzik 15 szobahőmérsékleten, legalább 5 percig, lehetőség szerint legalább 15 percig.

Az előnyös kiviteli alakokban az affinitás kromatográfia protein A kromatográfia. A protein A kromatográfiás közeg tartalmazhat ligandumként alkáli-toleráns protein A származékot, előnyösen a protein A B dómén egy alkáli-stabilizált tetramer variánsát térhálósított agaróz 20 mátrixhoz kötve.

Egyes kiviteli alakokban a mélységi szűrést követően mikroszürést végeznek.

Az affinitás kromatográfiát jellemzően legfejebb 8 órával a mélységi szűrést követően végzik, 25 előnyösen legfeljebb 3 órával a mélységi szűrés után.

Egyes kiviteli alakokban a sejttenyésztő közeg az immunoglobulinokat expresszáló rekombináns CHO sejtektől származik. Az immunoglobulin előnyösen IgGl vagy IgG2. Még előnyösebben az IgGl vagy IgG2 Fc része humán.

Az itt leírt módszer tartalmazhat olyan lépéseket, amelyek eddig meghatározásra kerültek és <ij' tartalmazhat egy vagy több affinitás kromatográfiát követő lépést, melyet a vírus inaktiválás, nj © W Φ H az ioncsere kromatográfia, a kevert módú kromatográfia, a nanoszürés és ultraszürés/diaszürés közül választunk ki.

A fent leírt módszer előnyösen tartalmazza továbbá a következő lépéseket:

(f) az (e) lépés eluátumának inkubálása vírus inaktiválás céljával alacsony, 2,5-4,5 közötti pHn legalább 10 percig;

(g) kationcserélö kromatográfia végrehajtása;

(h) kevert módú kromatográfia végrehajtása;

(i) a (h) lépésből származó eluátum vagy az ebből származó és egy vagy több további, (h) lépés 10 után végrehajtott feldolgozási lépésből nyert fehérje-elegy nanoszürése; és (j) az (i) lépés szürletének vagy ez ebből származó és egy vagy több további (i) lépési után végrehajtott további feldolgozási lépésből nyert fehérje-elegy ultraszürése/diaszürése.

A találmány továbbá megoldást nyújt a gyártási folyamat során az immunoglobulin 15 vírusbiztonságának növelésére.

AZ ÁBRÁK RÖVID LEÍRÁSA

1. ábra: Immunoglobulinok tisztításásra szolgáló hagyományos módszerek sémái

Az l.A ábra bemutatja a nagytérfogatú sejttenyészetekből származó immunoglobulinok tiszítási folyamatának általános menetét. A folyamat a tisztított sejttenyészettől indul, amely centrifugálással és/vagy szűréssel nyerhető a szeparált tenyésztő közegből, és egy protein A befogásos lépésből és az ezt követő két tisztítási lépésből áll. Ez az ábra két jellemző vírusbiztonsági lépést is tartalmaz. A vírus inaktivációs lépést úgy hajtják végre, hogy a protein

A eluátumot alacsony pH-η tartják és egy víruseltávolító nanoszűrési lépést is elvégeznek az utolsó tisztítási lépést követően. A utolsó lépés általában egy tangenciális ultraszűrés és/vagy diaszürés (UF/DF-TFF) az immunoglobulin és a hatóanyag formuláció összetevőinek kívánt koncentrációjának beállítására.

Az l.B ábra a nagy térfogatú sejttenyészetekből származó immunoglobulinok tisztításának hagyományos folyamatát mutatja be, amely három kromatográfiás lépésből áll (pl.

132G404

2 6 40 4

Fahmer R.L. 2001 vagy Kelly B. 2009 szerint). Ez megegyezik az l.A ábrán ábrázolt folyamattal, kivéve azt, hogy a tisztító lépésnek kationcserélö kromatográfíának kell lennie (1. tisztítási lépés), melyet anioncsere kromatográfia követ (2. tisztítási lépés). Kiemelendő, hogy a kationcserélö kromatográfiát kötő módban hajtják végre, míg az anioncsere kromatográfíát 5 átfolyó módban végzik el. Meg kell említeni, hogy ennek a hagyományos sémának egy gyakran alkalmazott ekvivalens változata az 1. és 2. tisztítási lépés sorrendjének egyszerű cseréje.

2. ábra: Példák a találmány szerint eljárásra előtisztítási lépések alkalmazásával

A 2. A ábra egy nagyléptékű eljárás menetét mutatja be egy befogást megelőző flokkulálásos 10 lépéssel, amelyet közvetlenül a szeparátumon, a sejtek jelenlétében végeznek el. A flokkulált anyagot ezután centrifugálással távolítják el, melyet mélységi szűrés és mikroszűrés követ. A flokkulálásos lépést kationos vegyület hozzáadásával végzik. A tisztított sejttenyésztö közeget a befogásos kromatográfiás oszlopra viszik, amely protein A-t tartalmaz. A két további tiszítási lépés a kationcserélő kromatográfia (1. tisztítási lépés), amelyet kevert módú kromatográfia (2.

tisztítási lépés) követ. Mindkét kromatográfiát a kötő-eluáló módban alkalmazzák. A kevert módú gyantának pozitív töltésű ligandumai vannak. A köztes vírusbiztonsági lépések és a végső UF/DF-TFF úgy történnek, ahogyan az 1. A ábránál leírtuk.

A 2. B ábra egy alternatív nagyléptékű eljárást mutat be, amely hasonló a 2. A ábrán látható eljáráshoz, kivéve azt, hogy a flokkulálásos lépést a sejtek elválasztását követően, a sejtek 20 jelenléte nélkül hajtják végre. Minden más lépés ugyanúgy zajlik, mint ahogyan azt a 2. A ábránál leírtuk.

A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

A leírásban használt “sejttenyésztö közeg” kifejezés a szeparált sejttenyésztö közegre, a sejttenyészet felülúszójára vagy a sejttenyészet előkezelt felülúszójára vonatkozik. A sejttenyésztő közeg közvetlenül az immunoglobulint termelő gazdasejttöl vagy organizmustól nyerhető ki. A sejjtenyésztö folyadék részben előkezelt vagy tisztított, centrifugálással és/vagy szűréssel, például mikroszűréssel, diaszűréssel, ultraszűréssel és mélységi szűréssel.

A leírásban használt, “előkezelt” kifejezés például a sejttenyészet felülúszóját jelenti, amelyet egy, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott kromatográfiás lépés során állítottak elő, például úgy, hogy a mintát kezelték a követlezök szerint: puffercserével, hígítással, sók, detergensek, kaotróp anyagok vagy szerves vegyületek hozzáadásával, pH titrálással vagy szűréssel azért, hogy a pH-t és/vagy a vezetöképességi tartományt és/vagy a pufferkapacitást beállítsák, a kívánt kromatográfiás hatékonyság elérése és az immunoglobulin stabilizálása 5 érdekében. Mivel az emlőssejtekből expresszált immunoglobulinok általában egy sejttenyésztö közegbe választódnak ki a tenyésztési folyamat során, a tenyésztési folyamat végén a termék szeparálása a sejttenyésztő közeg sejtektől történő elválasztásával valósul meg. A sejtek szétválasztására irányuló módszernek kíméletesnek kell lennie, hogy a sejtek szétzúzását minimalizálja a sejttörmelék növekedésének és a proteázok és más molekulák kioldódásának 10 elkerülésére, amelyek az immunoglobulin termék minőségét befolyásolni tudnák. Az emlőssejtes tenyészetekből származó szeparátum általában centrifugáláson megy át, melyet szűrés követ. A centrifugálásos/szűrési módszerek elkerülésének alternatívája az expandált ágyas adszorpciós kromatográfia lehet. A minta kromatográfiás lépésekkel való tisztítását megelőző egyéb kezelések a sejttenyészet felülúszójának koncentrálása és/vagy diaszürése 15 lehet specifikus immunoglobulin koncentrációra, pH tartományra, vezetőképességre és a pufferalkotók koncentrációjára.

A leírásban használt “flokkulálás” kifejezés alatt (szinonimák: koaguláció és agglomeráció), egy klaszterezési reakciót értünk, ahol a folyadékban szuszpendált szilárd anyagok 20 kölcsönhatnak a flokkulálást előidéző anyaggal, amely nagyobb méretű aggregátumok vagy pelyhek képződését eredményezi. A “flokkuláns” vagy “flokkulálást előidéző anyag” kifejezések, amelyek itt egymással felcserélhetően alkalmazhatók, kationos vagy anionos vegyületeket jelenthetnek. A flokkulánsok előnyösen kationos vegyületek. Előnyös esetben, a fiokkulánsok kationos vízoldható polimerek. “Flokkulálásos lépés” a jelen találmány szerint 25 egy előtisztítási lépésként szolgál a befogásos kromatográfia előtt. A flokkulálás végrehajtható akár a sejtek jelenlétében is, ez azt jelenti, hogy a flokkulálószert közvetlenül a sejjtenyésztö közeghez adják a tenyésztés végén és a flokkulált anyagot, beleértve a sejteket centrifugálással és/vagy szűréssel távolítják el a sejjtenyésztö közegből vagy a flokkulálószert a sejtek centrifugálással való eltávolítását követően adják a sejjtenyésztö közeghez és a flokkulált 30 anyagot szűréssel távolítják el.

A leírásban használt “kationos vegyület” kifejezésbe, beletartoznak fémionok és kationos polimerek (polikationok). A “kationos polimerek” lehetnek vízoldható polimerek vagy vízben

1926404 oldhatatlan polimerek. A “vízoldható polimerek” olyan szerves anyagokat foglalnak magukban, amelyek oldódnak vízben és ennél fogva a vizes rendszer fizikai tulajdonságait módosítják. A “vízben oldhatatlan polimerek” vízben való oldódása limitált. Vízben diszpergálódnak vagy duzzadnak és inkább hidrofil polimerek tartoznak ide, amelyek flokkulálószerként 5 funkcionálnak egy vizes szuszpenzióban. A vízben oldhatatlan polimerek vízoldhatóvá válnak nagyon alacsony vagy nagyon magas pH-η. A flokkulálószerként használt kationos vegyületek vizes közegben számos funkciót betölthetnek. A vízoldható vagy vízben oldhatatlan szerves polimerek magukban foglalják a természetes forrásból vagy kémiai szintézisből származó anyagok széles körét. A természetes vízoldható vagy vízben oldhatatlan szerves polimerek 10 példái a poliszacharidok (pl. pektin, dextrán, keményítő, kitozán és hialuronsav), a xantán gumi, a karragenán, sok egyéb más mellett. A kémiailag szintetizált szerves polimerek példái a polietilén-glikol (PEG), polivinil-pirrolidon (PVP), polivinil-alkohol (PVA), poliakrilsav (PPA), poliakrilamid, sok egyéb más mellett (az összefoglalóért lásd Kadajii VG 2011). Jelen találmány szerint a vízoldható polimerek a leglelönyösebb flokkulálószerek.

A “szennyező” és “szennyezőanyag” kifejezések itt egymással felcserélhetően alkalmazhatók és minden olyan anyagra vonatkoznak, amelyek különböznek a kívánt immunoglobulintól. Erre példák lehetnek a sejttenyésztő közeg összetevői, sejttörmelékek, gazdasejt fehérjék, endotoxinok, vírusok, lipidek, DNS, RNS, a folyamat során felhasznált anyagok maradványai 20 és ezek aggregátumai vagy fragmensei. Szennyezőnek tekintjük a termékkel kapcsolatos anyagokat is, mint az aggregátumok, töltésvariánsok, a rosszul feltekeredett molekulák vagy a szóban forgó immunoglobulin fragmensei, amelyeket el kell távolítani.

A “csapadék” kifejezés olyan szennyezőkre utal, amelyek nem oldódnak és/vagy oldhatatlan 25 állapotban vannak. A csapadékok a minta zavarosságát okozhatják.

A leírásban használt “kromatográfiás közeg” vagy “kromatográfiás közegek” alatt egy kromatográfiás anyagot vagy közeget értünk, mely lehet gyöngy, lemez, kristály, monolit, membrán, szál, szálak hálózata vagy bármilyen egyéb szilárd formában. A “közeg” funkciós 30 csoportokat hordoz, amelyeket “ligandumoknak” nevezünk, amelyek egy hordozóhoz kötődnek, közvetlenül vagy távtartón keresztül, amelyet “mátrixnak” nevezünk. Kivételt képeznek a méretkizárosos kromatográfiához használt gélkromatográfiás gyanták, amelyekhez

1926404 általában nem kötődik ligandum. A “közeg” kifejezés” nem korlátozza a találmány szerinti módszereket csak kromatográfiás gyantákat alkalmazó oszlopkromatográfiára, hanem magában foglalja a kromatográfía egyéb típusait is, például a membránkromatográfiát, amely membránadszorbereket alkalmaz. A találmány magában foglalja különösen az ioncsere 5 kromatográfiában az ioncsere kromatográfiás gyantát vagy az ioncsere kromatográfía membrán adszorbert.

A “gyanta” minden gyöngy formájú kromatográfiás anyagra vagy közegre vonatkozik, beleértve az olyan mátrixot, amelyhez funkciós csoportok (ligandumok) kötődnek, amelyek 10 kölcsönhatásba léphetnek a fehérjével vagy legalább egy szennyezőanyaggal. Kivételt képeznek a méretkizárosos kromatográfíához használt gélkromatográfiás gyanták, amelyekhez általában nem kötődik ligandum. A gyantákat különböző méretű gyöngyökként és oszlopokba töltve forgalmazzák. Alternatívaként előre töltött oszlopok is vásárolhatók.

A “mátrix” és a “szilárd fázis” kifejezések alatt olyan nem vizes mátrixot értünk, amelyhez a ligandum kötődni tud. Az itt használt mátrix általában olyan, amely üveget, kerámiát, szilíciumdioxidot, cellulózt, agarózt, metakrilát polimert vagy polisztirolt tartalmaz.

“Ligandum” alatt minden olyan funkciós csoportot értünk, amely a fehérjével vagy legalább 20 egy szennyezővel kölcsönhatásba lép és amely a “mátrixhoz” kovalensen kötődik.

A “kötő mód” vagy “kötő-eluáló mód” olyan kromatográfiás körülményekre vonatkozik, amelyek során a tisztítandó immunoglobulint tartalmazó mintát kromatográfiás közegre viszik fel, ahol az immunoglobulin kötődik a kromatográfiás közeghez. Következésképpen az 25 immunoglobulin visszatartódik a kromatográfiás közegen, ahol a minta szennyezői a nem kötődő frakcióban vannak jelen, amelyet átfolyó frakciónak is neveznek. Amikor egy kromatográfiás lépést kötő módban végeznek el, akkor az immunoglobulin kromatográfiás közeghez való kötődése után és az immunoglobulin közegről való eluálása előtt egy vagy több mosási lépést hajtanak végre. Az immunoglobulin kinyerése céljából ezután az 30 immunoglobulint eluálják és az eluátumból nyerik ki, amelyet, ha kívánatos, tovább tisztítanak további kromatográfiás lépésekben. Az immunoglobulin elúciója történhet szelektív feltételek

1926404 alkalmazásával, amelyek lehetővé teszik azt, hogy a szennyezők a közeghez kötve maradjanak, amíg az immunoglobulint eluáljuk.

A “kötő módú” kromatográfiás lépés végrehajtása nem szükségszerűen jelenti azt, hogy a kívánt immunoglobulin 100%-a megkötődik. Jelen találmány esetében a “kromatográfiás 5 gyantához kötődik” vagy a “kromatográfiás közeghez kötődik” azt jelenti, hogy az immunoglobulin legalább 50%-a kötődik, előnyösen az immunoglobulin legalább 75%-a kötődik, még előnyösebben az immunoglobulin legalább 85%-a kötődik és legelőnyösebben az immunoglobulinnak legalább a 95%-s kötődik a gyantához vagy a közeghez.

Jelen találmány esetén a befogásos kromatográfiás lépést, a köztes kationcserélö kromatográfiás lépést és a finomtisztítási célú kevert módú kromatográfiás lépést mind “kötő módban” hajtjuk végre, ahol a befogó lépés az első kromatográfiás lépés, amelyet kötő módban hajtunk végre.

Az “átfolyó mód” kifejezés olyan kromatográfiás körülményekre vonatkozik, amelyek során a kívánt immunoglobulint tartalmazó mintát olyan kromatográfiás gyantára vagy közegre visszük fel, ahol az immunoglobulin nem kötődik a kromatográfiás gyantához, hanem elsősorban a kromatográfiás gyantához vagy közeghez nem kötődő frakcióban van jelen és ennélfogva az átfolyó tartalmazza. A jelen találmány szerint kifejlesztett kromatográfiák nem alkalmaznak 20 átfolyó módot. A jelen találmány szerinti módszerek azonban kiegészíthetők további, átfolyó módú kromatográfiákkaL A szennyezők ebben a módban kötődhetnek a gyantához vagy közeghez.

A “mosási lépést” a “kötő módú” kromatográfiában hajtjuk végre, miután a mintát felvittük a 25 kromatográfiás oszlopra, de mielőtt a fehérjét eluáltuk volna az oszlopról. A mosási lépés ezen felül eltávolítja azokat a szennyezöanyagokat, amelyek kevésbé szorosan és nem specifikusan kötődnek a mátrixhoz, az immunoglobulinhoz és/vagy a ligandumhoz, anélkül, hogy szignifikánsan eluálnák a kívánt immunoglubulint a gyantáról. A mosási lépésben a gyantát a kívánt mosópufferrel mossuk (pl. a mosópuffert addig nyomjuk át a kromatográfiás oszlopon, 30 amíg az oszlop kimeneténél mért UV-abszorpció visszatér az alapvonalhoz).

Az “elúció” kifejezés alatt egy olyan folyamatot értünk, amely deszorbeálja a kívánt immunoglobulint a kromatográfiás gyantáról az oldódási feltételek megváltoztatása révén úgy,

1926404 hogy a puffer összetevői versengjenek a kívánt molekulákkal a kromatográfiás gyanta ligandum kötőhelyeiért. Az elúció másik módja affinitás kromatográfíánál fordul elő, például protein A alkalmazása esetén. Ebben az esetben, az elúciós puffer megváltoztathatja a ligandum vagy az immunoglobulin konformációját, ezáltal lazítja a kötést. A kívánt immunoglobulin eluálható az 5 ioncserélő gyantáról az ioncserélő anyagot körülevő puffer ionerősségének megváltoztatásával úgy, hogy a puffer ionjai a mobilfázisban versengenek a molekulákkal az ioncserélő gyanta töltéssel rendelkező ionos helyeiért. Alternatívaként a pH változtatása befolyásolja az amfoter fehérjéket és a pH a fehérje pl értéke fölé való növekedése ezenfelül megelőzi a fehérje kötődését a kationcserélö gyantához és fehérje eluátumhoz. Ugyanez a hatás előfordulhat 10 anioncsere kromatográfiás gyantán is, ha a pH a fehérje pl értéke alá csökken. A leírásban használt “elúció” kifejezés magában foglalja az izokratikus elúciót, az egylépéses elúciót és a gradiens elúciót, megelőző mosási lépésekkel vagy anélkül. A kívánt immunoglobulin elúcióját irányíthatja a mobilfázis ionerősségének vagy vezetőképességének növekedése, amelyet a pufferoldat sókoncentrációjának növelése befolyásol. Alternatívaként a pH értékének növelése 15 vagy csökkentése is alkalmazható lehet. A nem folytonos lépésekből álló gradiensek, a lineáris gradiensek, a nem lineáris gradiensek vagy ezek megfelelő kombinációi is alkalmazhatóak.

A mosásra és eluálásra alkalmas pufferek lehetnek acetát, citrát, szukcinát, maleát, malonát, Trisz-HCl, Trisz-acetát, Trisz-glicin, foszfát, szukcinát, malonát, MES, MOPS, PIPES, 20 PHEPES, bisztrisz, glicin vagy egyéb alkalmas pufferek só hozzáadásával úgy, mint a foszfátok, szulfátok vagy kloridok, mint a NaCl vagy a KC1. Az ionerősség és a sókoncentráció, amelynek révén az eluálás megvalósult, függnek a pufferoldat pH értékétől és a fehérje pl-jétől. A mosópuffer tartalmazhat továbbá detergenst (pl. poliszorbátot), oldószert (pl. hexilénglikolt, izopropanolt vagy etanolt), vagy polimert (pl. politetilén-glikolt). Továbbá, a mosópuffer 25 tartalmazhat kaotróp reagenseket (pl. karbamidot vagy arginint) és/vagy proteáz inhibitorokat (pl. EDTA-t).

A leírásban használt “puffer” kifejezés olyan oldatra vonatkozik, amely sav-bázis konjugátum komponensek hatása révén ellenáll a pH változásainak.

Az “immunoglobulin” és “antitest” kifejezések itt egymással felcserélve alkalmazhatók. Az immunoglobulin lehet monoklonális antitest, poliklonális antitest, multispecifikus antitest (pl.

1926404 bispecifikus antitest) és ezek fragmensei, amelyek a kívánt antigénkötö hatást kifejtik. A természetesen előforduló antitestek változatos szerkezetű molekulák. Például, a természetes IgG antitestek 150000 Daltonos heterotetramer glikoproteinek, amelyek két azonos könnyű láncból és két azonos nehéz láncból állnak, melyeket diszulfid kötések kötnek össze. Az N-töl 5 a C-terminálisig minden nehéz láncnak van egy variábilis doménje (VH), amelyet variábilis nehéz doménnek vagy nehéz lánc variábilis doménnek is neveznek, amelyet három vagy négy konstans dómén követ (CHI, CH2, CH3 és opcionálisan CH4). Hasonlóan, az N-től a Cterminálisig minden könnyű láncnak van egy variábilis doménje (VL), amelyet variábilis könnyű doménnek vagy könnyű lánc variábilis doménnek is neveznek, amelyet egy konstans 10 könnyű lánc (CL) dómén követ. Egy antitest könnyű lánca a konstans dómén aminosav sorrendje alapján besorolható a két csoport, a kappa (κ) és lambda (λ) egyikébe.

Az “antitest fragmensekbe” beleértendők a teljes hosszúságú antitestek darabjai, általánosságban ezek antigénkötö vagy variábilis régiói. Az antitest fragmensekbe 15 beletartoznak például a Fab, Fab', F(ab')2, és Fv fragmensek; az egyláncú antitest molekulák; a diatestek; a lineáris antitestek; és antitest fragmensekből létrejött multispecifikus antitestek.

Az immunoglobulin előnyösen egy monoklonális antitest. A leírásban használt “monoklonális antitest” kifejezés egy olyan antitestre vonatkozik, amely lényegében homogén antitestekből 20 származik, vagyis a populációt alkotó egyedi antitestek azonosak, kivéve a lehetséges, természetben előforduló mutációkat, amelyek kisebb mennyiségben jelen lehetnek. A hagyományos (poliklonális) antitest készítményekkel szemben, amelyek jellemzően különböző antitesteket tartalmaznak, melyek különböző determinánsok (epitópok) ellen hatnak, minden egyes monoklonális antitest az antigénen lévő egyetlen determináns ellen hat. A 25 “monoklonális” módosítószó jelzi az antitest azon jellemzőjét, hogy azt lényegében antitestek homogén populációjából nyerték ki és nem úgy kell érteni, hogy az antitestet bármilyen konkrét módszerrel állították elő.

Az immunoglobulin tartozhat az egér immunoglobulinok IgGl, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgD 30 vagy IgE osztályaiba vagy humán IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD vagy IgE osztályokba vagy lehet ezek kombinációja vagy fragmensei.

1926404

Az immunoglobulin felismerheti a következő fehérjék egyikét vagy ezek kombinációját, beleértve, de nem kizárólagosan értve, a következő antigéneket: CD2, CD3, CD4, CD8, CDI la, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, CD152, IL-la, IL-1B, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL5 23, IL-2 receptor, IL-4 receptor, IL-6 receptor, IL-12 receptor, IL-13 receptor, IL-18 receptor alegységei, PDGF-β, és ezek analógjai, PLGF, VEGF, TGF, TGF-P2, TGF-pl, EGF receptor, PLGF receptor, VEGF receptor, gpIIb/IIIa vérlemezke receptor, trombopoietin receptor, PD-1 apoptózis receptor, hepatocita növekedési faktor, oszteoprotegerin ligandum, interferon gamma, BLyS B limfocita stimulátor, T-sejt aktivációját szabályozó CTLA-4, C5 komplement, 10 IgE, CA125 tumor antigén, MUCI tumor antigén, PEM antigén, ErbB2/HER-2, tumorral összefüggő epitópok, amelyek a betegek szérumában megemelkedett szinten vannak jelen, rákkal összefüggő epitópok vagy fehérjék, amelyek emlő, vastagbél, laphámsejt, prosztata, hasnyálmirigy, tüdő és/vagy vese rákos sejtejein és/vagy melanómán, gliómán vagy neuroblasztóma sejteken expresszálódnak, tumor nekrotikus magja, integrin alfa 4 béta 7, az 15 integrin VLA-4, B2 integrinek, α4β1 és α4β7 integrin, TRAIL 1,2,3 és 4 receptorok, RANK,

RANK ligandum (RANKL), TNF-α, VAP-1 adhéziós molekula, epiteliális sejt adhéziós molekula (EpCAM), intercelluláris adhéziós molekula 3 (ICAM-3), leukointegrin adhezin, vérlemezke glikoprotein gp Ilb/IIIa, kardiális miozin nehéz lánc, mellékpajzsmirigy hormon, szklerosztin, MHC I, karcinoembriotikus antigén (CEA), alfa-fetoprotein (AFP), tumor 20 nekrózis faktor (TNF), Fc-y-1 receptor, HLA-DR 10 béta, HLA-DR antigén, L-szelektin, kallikrein, kirin és IFN-γ.

Az immunoglobulin lehet például afelimomab, abciximab, adalimumab, ado-trastuzumab, aducanumab, alemtuzumab, alirocumab, arcitumomab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, 25 belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, bocozizumab, brentuximab, brodalumab, brolucizumab, canakinumab, caplacizumab, capromab, certolizumab, cetuximab, clenoliximab, claudiximab, crizalizumab, daclizumab, daratumumab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, edrecolomab, elotuzumab, emicizumab, erenumab, evinacumab, evolocumab, fremanezumab, foravirumab, 30 galcanezumab, galiximab, gemtuzumab, golimumab, guselkumab, ibalizumab, ibritumomab, imciromab, idarucizumab, infliximab, inotuzumab, ipilimumab, ixekizumab, keliximab, V lanadelumab, lebrikizumab, lexatumumab, mavrilimumab, mepolizumab, mogamulizumab,

Ο

C © W nH muromonab-CD3, natalizumab, necitumumab, nivolumab, nofetumomab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, ravulizumab, restizumab, risankizumab, rituximab, romosozumab, rovalpituzumab, sacituzumab, sarilumab, secukinumab, sirukumab, tanecumab, tezepelumab, tezolizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, tremelimumab, ublituximab, ustekinumab és vedolizumab.

A találmány szerinti immunoglobulin előnyösen egy IgG molekula, mint például IgGl, IgG2, IgG3 vagy IgG4 molekula. Még előnyösebben, az immunoglobulin IgGl vagy IgG2. Még inkább előnyösen, az immunoglobulin IgGl vagy IgG2, ahol legalább az Fc rész humán. Az immunoglobulin lehet egér-humán kiméra IgGl, ahol az IgGl Fc része humán. A legelőnyösebben, a kiméra immunoglobulin rituximab vagy infliximab.

A rituximab egy kiméra anti-CD20 antitest, amelyet részletesen például a WO9411026 sz. bejelentés ismertet.

Az infliximab egy kiméra anti-TNFa antitest, amelyet részletesen például a WO9216553 sz. bejelentés ismertet.

Az immunoglobulin lehet egy egér progenitortól származó humanizált IgGl. A legelőnyösebben a humanizált antitest trastuzumab vagy bevacizumab.

A trastuzumab egy humanizált anti-HER2 antitest, amelyet részletesen például a WO9222653 sz. bejelentés ír le.

A bevacizumab egy humanizált anti-VEGF antitest, amelyet részletesen például a WO9845331 sz. bejelentés ismertet.

Az immunoglobulin lehet teljesen humán IgGl vagy IgG2 antitest. Legelőnyösebben a humán antitest adalimumab (IgGl) vagy denosumab (IgG2).

Az adalimumab egy humán anti-TNFa antitest, amelyet részletesen például a WO9729131 sz. bejelentés ismertet.

A denosumab egy humán anti-RANKL antitest, amelyet részletesen például a W003002713 sz. bejelentés ír le.

Az egyik kiviteli alak esetében az immunoglobulin bevacizumab, trastuzumab vagy denosumab.

A találmány szerinti monoklonális antitestekbe kifejezetten beleértjük a “kiméra” antitesteket (immunoglobulinokat), amelyekben a nehéz és/vagy a könnyű lánc azonos vagy homológ egy 5 adott fajból származó megfelelő szekvenciáival vagy egy adott antitest osztályba vagy alosztályba tartozó szekvenciákkal, míg a lánc(ok) fennmaradó része azonos vagy homológ más fajok megfelelő szekvenciáival vagy egy másik antitest osztályba vagy alosztályba tartozó szekvenciákkal, valamint ilyen antitestek fragmenseivel, mindaddig, amíg azok a kívánt biológiai aktivitást mutatják.

A találmány szerinti monoklonális antitestekbe beleértjük továbbá a “humanizált” antitesteket. Ezeket az antitesteket nem humán (például egér) antitestek “humanizálásával” nyerik, és csak minimális állati immunoglobulinból származó szekvenciát tartalmaznak. A molekula nagy része humán szekvencia. A humán recipiens antitest hipervariábilis régiójának maradványait 15 kicserélik a kívánt kötődési jellemzőkkel rendelkező nem humán donor antitest hipervariábilis régiójának maradványaival.

Végezetül, a találmány szerinti monoklonális antitestekbe beleértjük a teljesen humán antitesteket is, amelyeket humán antitest génkönyvtárból nyerhetnek szűréssel.

Az egy előnyös kiviteli alak esetében a minta egy olyan sejttenyésztő közegből származik, amelyet rekombináns CHO sejttenyészetből nyernek. Előnyösen, a sejttenyésztő közeget a növekedési fázisban lévő rekombináns sejttenyészetből nyerik.

A találmány szerinti módszer alkalmazható immunoglobulinok kis és nagy léptékben történő 25 tisztítására. A módszert előnyösen nagy léptékben hajtják végre.

A “kis lépték”, amelyre “laboratóriumi léptékként” is hivatkozunk 50g-nál kevesebb immunoglobulint, lOg-nál kevesebb immunoglobulint, Ig-nál kevesebb immunoglobulint tartalmazó minták tisztítására vonatkozik. A “kis lépték” vonatkozik azokra a tisztítási 30 eljárásokra is, amelyekben a fehérjét a kötő lépés során eluálják az oszlopról és az immunoglobulin mennyisége kevesebb, mint 50g, kevesebb, mint 10g vagy kevesebb, mint 1 < g.

& ifi W W H

A “nagy lépték”, amelyet “termelési léptéknek”, “gyártási léptéknek” vagy “kereskedelmi léptéknek” is neveznek, olyan minták tisztítására vonatkozik, amelyek 50g-nál több immunoglobulint, lOOg-nál több immunoglobulint, 200g-nál több immunoglobulint vagy 300g5 nál több immunoglobulint tartalmaznak.

A “nagy lépték” vonatkozik azokra a tisztítási eljárásokra is, amelyekben a fehérjét a befogásos lépés során eluálják az oszlopról és az immunoglobulin mennyisége több mint 50g, több mint 100g, több mint 200g és több mint 300g.

A “további eljárási lépés” minden olyan lépésre vonatkozik, amelyet gyakran alkalmaznak fehérjetisztítási protokollokban, ilyen a szűrés, a dialízis, a vírus inaktiviálás, a hígítás, a töményítés, a pH beállításai, a vezetőképesség beállításai, a köztes kromatográfiás lépés vagy egy várakozó lépés, bármilyen okból kifolyólag. A találmány szerinti összes kromatográfiás lépés között alkalmazható egy további eljárási lépés. A kromatográfiás lépések bármelyike között alkalmazható egy köztes kromatográfiás lépés. A “további eljárási lépés” kifejezés vonatkozik különösen a befogásos kromatográfia és kationcserélö kromatográfia között alkalmazott köztes kromatográfiás lépésre. A kromatográfiás lépés végrehajtható bármilyen kromatográfiás közeggel bármilyen módban. A köztes kromatográfiás lépésben alkalmazható bármilyen kromatográfiás típus, beleértve az oszlopkromatográfiát és a membrán kromatográfiát.

További köztes lépésként vagy tisztítási lépésként más kromatográfia típusok is alkalmazhatók. Például az anioncsere oszlopkromatográfia és az anioncsere membránkromatográfia alkalmazható tisztítási lépésként, legelőnyösebben átfolyó módban. Másik lehetőség a 25 hidroxiapatit kromatográfia alkalmazása, különösen a kerámia hidroxiapatit kötő módban.

A találmány elsősorban egy olyan módszerre vonatkozik, amelynek célja egy sejttenyésztő közegből származó immunoglobulin befogásos affinitás kromatográfiája során a kicsapódások megelőzése, a módszer a következő lépésekből áll az alábbi sorrendben:

(a) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a sejttenyésztő közeghez;

(b) az (a) lépésben létrejött keverék mélységi szűrése;

1926404 (c) a (b) lépésben létrejött szűrlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulint az affinitás kromatográfiás közeghez kötjük;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópuffer alkalmazásával, melynek pH-ja 5-9 közötti és ionerössége 0,1-5,0 mol/1 közötti; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer alkalmazásával, amelynek pH-ja 2,5-4,5 közötti.

Előtisztítási lépés: flokkulálás

A jelen találmány kidolgozásakor elvégzett kísérletek során megfigyeltük, hogy a sejtektől mentes szeparált anyag (tisztított felülúszó) még számos olyan anyagot tartalmaz, amelyek a tisztítandó immunoglobulin mellett erősen kötődnek a kötő gyantához. Ez hatással van a gyanta újra-használatára és az immunoglobulin minőségére a befogó gyantáról történő eluálást követően. Ez egy további, átfolyó módú anioncsere kromatográfía alapú, előtisztító kromatográfiával javítható (WO2015135884). A HCDNS és HCP szintek jelentős csökkenése ellenére további fejlesztésekre volt igény. Megfigyeltük, hogy a protein A eluátum még mindig zavaros, amelyet a szennyezők okoznak és nem maga az immunoglobulin. Az elúcióhoz szükséges alacsony pH, a szennyezők relatív mennyisége és a nagy fehérje koncentrációk elősegítik a zavarosságot. A zavaros eluátumok mellett megnövekedett ellenállást figyeltünk meg az oszlopon. Ezt legjobban a megnövekedett viszkozitás magyarázza. Ráadásul, az előtisztítási célú anioncsere kromatográfiás oszlop egy nem kívánt költségtényező, mivel viszonylag nagy méret szükséges a nagyon magas szennyezőanyag-terhelés esetén. Az utóbbit fokozzák a megnövelt fermentációs idők, amelyek a magasabb mab titerhez és ebből következően a gazdaságos termeléshez szükségesek. Mivel az anioncserélő gyanta szűrőhatása főleg a negatív töltésű molekulák visszatartására korlátozódik és a zavarosságot okozó szennyezők egy része még átjut, szükséges volt egyszerűbb és hatékonyabb befogást megelőző tisztítási stratégiára. A jelen találmány szerint, egy megfelelő előtisztító flokkulálásos módszer beiktatása meglepően jó megoldás a szeparált tenyésztő közeg gyors és egyszerű tisztítására. A további szennyezők eltávolításával, a kifejlesztett flokkulálásos módszer javítja a minta tisztaságát, csökkenti a kritikus szennyezőanyagokat, amelyek zavarosságot okoznak a befogótöltet alacsony pH-η történő elúciója során és védi a költséges affinitás oszlopot. A jelen

1926404 találmány szerinti flokkulálásos módszer egyszerű, gyors, termékveszteség nélküli és elfogadható az árazása. Továbbá kiderült, hogy a flokkulálásos módszer végrehajtható akár (i) azelőtt, mielőtt a sejteket eltávolítják a sejttenyésztő közegből, azaz a sejtek jelenlétében vagy (ii) a sejtek sejttenyésztö közegből való eltávolítását követően, azaz a sejtek távollétében. Az 5 immunoglobulin tisztasága a protein A lépés előtt vagy után mindkét módszer esetében összehasonlítható. Az előbbi módszerrel a flokkulált anyag, amely sejteket is tartalmaz, centrifugálással kerül elválasztásra és a felülúszót egy „szűrőállomáson” tisztítják tovább. Az utóbbi módszernél a sejteket centrifugálással választják le és felülúszót flokkulálják. A flokkulált anyagot ezután „szűrőállomáson” távolítják el. A „szűrőállomás” a legegyszerűbb 10 ecsetben egy mélységi szűrőből áll. A leginkább előnyös azonban a mélységi szűrés és a mikroszürés egymást követő alkalmazása. A nagy léptékű gyártásra történő léptéknövelés során kiderült, hogy a sejtek szeparálását követő flokkulálás a választandó eljárás. Amikor a flokkulálást közvetlenül a sejttenyészetben végeztük el, akkor a teljes sejttömeget tartalmazó pelyhek eltávolítása a fermentorból vagy a szeparátorból nagyon időigényes volt.

A monoklonális antitesteket expresszáló emlőssejtes tenyészetek tisztítására számos különböző, különféle flokkulálószereket alkalmazó flokkulálásos módszer ismeretes és bizonyult kísérletek során hatékonynak. A módszerek nagy részéhez anyagok kombinációja és/vagy a tenyésztő közeg további változtatása, pl. a pH módosítása szükséges. Több, már 20 ismert módszer alkalmaz továbbá flokkulálást a centrifugálási lépés helyett. Ezekkel ellentétben, a jelen találmány három módszet kombinál a tenyésztő közeg optimális tisztítására a következő sorrendben: 1) sejtek elválasztása centrifugálással vagy szűréssel, 2) flokkulálás és 3) mélységi szűrés.

Amikor a sejttenyésztő közeg pH-ja kisebb, mint a tisztítandó antitest pl-je, akkor az antitest nettó töltése pozitív. Ilyen körülmények mellett a kationos elektrolit flokkulálhatja vagy kicsaphatja a szennyezőket, a maradék sejteket és sejttörmeléket és az antitest oldatban maradhat. A pelyhek ezt követően centrifugálással és/vagy mélységi szűréssel eltávolíthatók, melyet opcionálisan mikroszürés követhet.

A jelen találmány a flokkulálás elősegítésére alkalmaz egy kationos vegyületet, mint például egy kétértékű fémiont, egy vízoldható szerves polimert vagy egy vízben oldhatatlan szerves

1926404 polimert. Semmilyen további anyag, mint például stimulálásra érzékeny polimerek vagy sók nem szükségesek a találmány ezen flokkulálásos lépésének végrehajtásához. Hasonlóképpen, a jelen találmány szerinti flokkulálásos módszert további pH vagy vezetőképesség beállítás nélkül hajtják végre.

Az “alábbi sorrendben” kifejezést úgy kell érteni, hogy a folyamat említett lépéseit a lista szerinti sorrendben hajtjuk végre. A folyamat további lépései beiktathatóak a listában szereplő eljárási lépések előtt, után és ezek között.

A kromatográfiás közeg lehet egyszer használatos vagy újrahasználható. Az egyik kiviteli alak esetén a kromatográfiás gyanta újrahasználható. Egy speciális kivitelei alakban a (b), (c) és (d) lépések kromatográfiás gyantái újrahasználhatok.

Az újrahasználható kromatográfiás közegek az egyszer használatos kromatográfiás közegekhez 15 képest költséghatékonyak. Különösen a befogásos kromatográfiánál használnak nagy térfogatú kromatográfiás közeget. Következésképpen különösen előnyös az újrahasználható kromatográfiás közeg alkalmazása, pl. egy gyakran újrahasználható affinitás kromatográfiás gyanta a befogólépéshez. A jelen találmány szerinti előtisztítási lépések alkalmazása lehetővé teszi a drága befogásos affinitás oszlop bizonyos mértékű méretcsökkentését és az élettartam 20 növelését és ezáltal az előállítási költség csökkentését.

A leírás szerinti “újrahasználható” kifejezés azt jelenti, hogy a közeget vagy gyantát úgy alakították ki, hogy egynél több tisztítási cikluson át újrahasználható legyen, vagyis legalább 2, 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500 vagy több cikluson át. Az egyes ciklusok között a 25 kromatográfiás közeg vagy gyanta mosható és/vagy regenerálható és/vagy sterilizálható és/vagy tárolható.

Egy előnyös kiviteli alak szerint, a flokkulálószerként alkalmazott kationos vegyület kiválasztható egy kétértékű fémion sója, egy vízoldható szerves polimer és egy vízben 30 oldhatatlan szerves polimer közül. A legelőnyösebbek a vízoldható szerves polimerek.

1926404

2 6 40 4

A kétértékű fémion sója lehet például CaCh. A vízoldható szerves polimer lehet például polidiallil-dimetil-ammónium-klorid. A vízben oldhatatlan szerves polimer lehet például kitozán. Még előnyösebben a flokkulálószer a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósítása szerint a vízoldható szerves polimert 0,01 - 1,0 % (m/v) közötti, előnyösebben 0,02 - 0,15 % (m/v), még előnyösebben 0,025 - 0,090 % (m/v) végső koncentrációban alkalmazzák. Egy előnyös kiviteli alakban a vízoldható szerves polimert 0,0375 - 0,075 % (m/v) közötti végső koncentrációban adagolják. Egy további előnyös kiviteli alakban a vízoldható szerves polimert 0,015 - 0,05% (m/v) közötti végső 10 koncentrációban adagolják.

Egy előnyös kiviteli alakban a flokkulálás előidézésére alkalmazott vízoldható szerves polimer a 10 - 10 000 kDa moláris tömegű poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid. Egy másik előnyös kiviteli alakban a flokkulálásos lépést kevertetés mellett, szobahőmérsékleten, legalább 10 15 percig, legalább 15 percig vagy legalább 20 percig, előnyösen legalább 30 percig végzik. Jelen találmányban a szobahőmérséklet 15-25°C-ot, 20-25°C-ot, előnyösen 18-22°C-ot jelent. A kevertetés folyamatos mozgatást és/vagy keverést jelent megfelelő mechanikai eszközök alkalmazásával.

Egy további előnyös kiviteli alakban a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid 5-15% (m/v), előnyösen 9-11% (m/v), még előnyösebben 10% (m/v) koncentrációjú kiindulási oldatát a sejjtenyésztő közeghez adjuk a flokkulálás előidézésére. A leginkább előnyös oldat semleges pH-jú, kevesebb mint 0,1% diallil-ammónium-kloridot tartalmaz, a mikrobák száma kevesebb, mint 10 CFU/ml és nátrium-kloridtól mentes.

Jelen találmány egyik kiviteli alakjában a flokkulálásos lépést azelőtt hajtják végre, mielőtt a sejteket a sejttenyésztö közegből eltávolítják úgy, hogy a flokkulálószert közvetlenül a fermentorba adagolják a tenyésztési időszak végén. Azaz, egy ilyen kiviteli alak esetén nincs további centrifugálási és/vagy szűrési lépés. A pelyheket, beleértve a sejteket, centrifugában, 30 ülepítéssel távolítják el, előnyösen nagyobb térfogatok számára alkalmas szeparátorral. Az így kapott felülúszó tovább tisztítható mélységi szűréssel, melyet opcionálisan mikroszűrés követhet.

Más kiviteli alakok szerint, az (a) lépés a következő lépéseket tartalmazza:

(al) sejttenyésztő közeg centrifugálása és/vagy szűrése; és (a2) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása az (al) lépésben kapott felülúszóhoz vagy a szűrlethez.

Más szavakkal, a flokkulálásos lépést a sejtek sejttenyésztö közegből való eltávolítása után hajtjuk végre úgy, hogy a flokkulálószert a centrifugálási és/vagy szűrési lépést követően adagoljuk.

Ennek következtében egy speciális kiviteli alakban a találmány szerinti módszer a következő lépéseket tartalmazza az alábbi sorrendben:

(al) sejttenyésztö közeg centrifugálása és/vagy szűrése;

(a2) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása az (al) lépésben kapott felülúszóhoz vagy a szűrlethez;

(b) az (a2) lépésben létrehozott keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szürlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerősségű pufferrel; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú elúciós puffer alkalmazásával.

Előnyösen, (a2) lépésben létrejött pelyheket mélységi szűréssel távolítjuk el, melyet opcionálisan mikroszűrés követ.

Előnyösen, a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid kivételével további anyagokat nem adagolunk a flokkulálás elősegítésére. Azaz, az (a) lépésben nincsen más flokkulálást elősegítő anyag a poli-diallil-dimetil-ammónium-kloridon kívül.

Előnyösen, a poli-diallil-dimetil-ammónium-kloriddal végzett flokkulálást a pH és a vezetőképesség további beállítása nélkül hajtjuk végre. Ez azt jelenti, hogy a flokkulálásos e φ n ro lépésben és az ezt követő, affinitás kromatográfiát megelőző szűrési lépésekben, különösen az az (a) flokkulálásos lépésben a pH-t és a vezetőképességet nem változtatjuk.

Ennek következtében egy speciális kiviteli alakban a találmány szerinti módszer a következő 5 lépéseket tartalmazza a következő sorrendben:

(al) sejttenyésztő közeg centrifugálása és/vagy szűrése;

(b) az (a2) lépésben létrehozott keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szűrlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerősségű mosó pufferrel; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú 15 elúciós puffer alkalmazásával;

ahol a poli-diallil-dimetil-ammónium-kloridon kívül további anyagokat nem adagolunk a flokkulálás elősegítésére; és ahol a poli-diallil-dimetil-ammónium-kloriddal végzett flokkulálást a pH vagy a vezetőképesség további változtatása nélkül hajtjuk végre.

Affinitás befogó kromatográfiás lépés: protein A kromatográfia

A “befogólépés” kifejezés alatt a kötő módban végrehajtott első kromatgráfiás lépést értjük. Az 25 immunoglobulin sejttenyésztő közegen kívüli tisztítására irányuló befogó lépést jellemzően affinitás kromatográfiás lépésként hajtják végre. Affinitás kötés céljára leginkább protein A-t vagy ennek származékait vagy analógjait alkalmazzák. Jelen találmány szerint az affinitás kromatográfiát sikeresen alkalmazták immunoglobulinok befogására. Az “affinitás kromatográfia” kifejezés jelen találmány szerint egy olyan módszerre vonatkozik, amelyben az 30 immunoglobulin szelektíven megkötődik a tenyésztő közegből egy rendkívül specifikus, a ligandum és az immunoglobulin közötti kölcsönhatás révén.

r

EIWl imiP· e φ Hl ®

Az “immunoglobulin kötö fehérje/peptid affinitás kromatográfía” ahogyan itt használjuk, olyan affinitás kromatográfiára vonatkozik, amely mikrobiális eredetű (pl. Staphylococcus aureus, Streptococcus, Peptostreptococcus magnus) rekombináns fehérjéket vagy az ezekből származó variánsokat használja ligandumként, vagy mikrobiális eredetű szintetikus peptideket, amelyek képesek az immunoglobulinhoz kötődni. Immunoglobulint kötö fehérjékre példa lehet a protein A, fehérje G, fehérje L vagy protein A/G. Az immunoglobulint kötö fehérje vagy peptid jellemzően protein A. A ligandumok magukban foglalhatják a protein A egy vagy több E, D, A, B és C doménjét. Még előnyösebben a ligandumok a protein A B doménjéböl vagy a tervezéssel létrehozott Z fehérjéből állnak. Az egyik példaként felhozott gyanta, amelynél egy

14 kD-os, Saccharomyces cerevisiae által rekombináns módon termelt pepiidet alkalmaznak ligandumként az IgSelect (GE Healthcare). Ezt a ligandumot, melyről további információ nem érhető el, specifikusan arra tervezték, hogy a humán IgG-Fc összes alosztályára vonatkozóan nagy legyen az affinitása.

A találmány szerinti módszer, amely protein A affinitás kromatográfiás lépést alkalmaz befogó lépésként az előtisztító flokkulálásos lépést követően, egy költséghatékony immunoglobulin tisztítási módszert biztosít, miközben kihasználja a protein A affinitás kromatográfía szignifikáns kötési specifícitását az immunoglobulinok tisztítására.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli alakja szerinti módszer egy immunoglobulin kinyerésére vonatkozik egy olyan mintából, amely tartalmazza az immunoglobulint és legalább egy szennyezőt, a módszer a következő lépésekből áll, az alábbi sorrendben:

(a) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a sejttenyésztö közeghez;

(b) az (a) lépésben kapott keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szürlet protein A kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az protein

A kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) a protein A kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerösségü mosó pufferrel; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú 30 elúciós puffer alkalmazásával.

1926404

Egy előnyös kiviteli alakban a befogó lépésben használt protein A kromatográfiás közeg egy alkáli-toleráns protein A származékot tartalmaz ligandumként, mely erősen térhálósított agarózhoz van kötve. Egy még előnyösebb kiviteli alakban az alkáli-toleráns protein A származék, egy a protein A B doménjének alkáli-stabilizált tetramer variánsa.

Abból a célból, hogy a protein A kromatográfiás gyantát ellenállóbbá tegyék a durva tisztítási körölményekkel szemben és védelmet biztosítsanak a futtatások közötti keresztszennyező hatások ellen, manapság gyakran alkalmaznak továbbfejlesztett protein A kromatográfiás gyantákat, amelyek olyan ligandumokat hordoznak, amelyeket speciálisan az alkáli-tolerancia 10 biztosítására fejlesztettek ki nagy kötőkapacitással és alacsony ligandumleválással. Azonban ezeknek a kromatográfiás gyantáknak egyik fő hátránya, hogy szignifikánsan drágábbak, mint a hagyományos protein A gyanták. A jelen találmány szerinti módszer fontos előnye, hogy ehhez mind a hagyományos protein A gyanták, mind az újabb, új generációs protein A gyanta termékek használhatók. Mivel a protein A gyanták kisebb szennyező-terhelésnek vannak 15 kitéve, a hagyományos és olcsóbb protein A gyanták megfelelővé váltak a viszonylag enyhe regenerálási körülmények korlátozó hatása ellenére. A találmány szerinti előtisztítási lépés eredményeképpen azonban, a kiválasztott protein A gyantától függetlenül, mind a hagyományos, mind az új generációs gyanták hosszabb élettartamon át használhatóak. Továbbá, annak köszönhetően, hogy a protein A oszlopok tisztítása könnyebb lesz, az eljárás 20 még gazdaságosabbá válik.

A találmány céljára felhasználható gyakori protein A gyanták közé tartoznak például, de nem korlátozódnak csupán a következőkre: Unosphere SUPrA (Bio-Rad), Protein A Ceramic HyperD F (Pali Corporation), Poros MabCapture A (Applied Biosystems), ProSep HC, ProSep 25 Ultra és ProSep Ultra Plus (EMD Millipore), Protein A Sepharose FF, rProtein A Sepharose FF, rmp Protein A Sepharose FF, MAbSelect, MAbSelect SuRe, MAbSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, MabSelect PrismA (GE Healthcare) és Toyopearl rProtein A (Tosoh Bioscience).

A leírás szerinti “protein A” kifejezés magában foglalja a természetes forrásból nyert protein A-t, a szintetikus vagy bioszintetikus úton (pl. peptidszintézissel vagy rekombináns V technikákkal) előállított protein A-t és ennek variánsait, amelyek megtartják azt a képességet,

ÍÍH&t, <^!

Φ n ro tf“il hogy CH2/CH3 és/vagy Fc régiókkal rendelkező fehérjéket kössenek meg. Előnyösen, a nagy megkötőképességgel és/vagy alkáli stabilitással rendelkező gyanták alkalmazhatóak. Például protein A, protein A származék vagy alkáli-stabilizált protein A-ból származó affinitás közeg alkalmazható. Előnyösen alkáli-stabilizált, fehérje-A-ból származó (E coli) ligandumok 5 alkalmazhatók. Az alkáli-stabilizált, fehérje-A-ból származó ligandumok hozzákapcsolhatók erősen térhálósított agaróz mátrixhoz, amelyet előnyösen kémiailag stabil tio-éter kötéssel rögzítettek. Egy példa a MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Sciences), amely a futtatás után gyorsan és hatékonyan tisztítható legfeljebb 0,5 M-os NaOH-dal. A MabSelect SuRe alkálistabilizált liganduma a protein A B-doménjéböl származik és lényegében hiányzik belőle a 10 VH3 kötő dómén, ami magasabb elúciós pH-t nyújt. Előnyös tennék a MabSelect SuRe LX, amelynek nagyobb a megkötő kapacitása, mint a MabSelect SuRe-nak.

A minta protein A affinitás oszlopra való felvitele és az immunoglobulin protein A oszlopról való eluálása között egy vagy több mosási lépés beiktatható speciális mosópufferek 15 alkalmazásával. A mosó puffer az a puffer, amelyet a szennyezők protein A gyantáról való eltávolítására használunk anélkül, hogy a kívánt, protein A-hoz kötött immunoglobulin szignifikáns mennyiségét eltávolítanánk. A mosópuffer tartalmazhat sót és detergenst (pl. poliszorbát); sót és oldószert (pl. hexilén-glikol); nagy koncentrációjú sót (pl. nagy molaritású Trisz puffer); vagy sót és polimert (pl. politetilén-glikol). A mosópuffer tartalmazhat továbbá 20 kaotróp reagenseket (pl. karbamid vagy arginin) és/vagy proteáz inhibitorokat (pl. EDTA).

Végül, a mosópuffer pH-ja lehet alacsonyabb a töltőpuffer pH-jánál és/vagy magasabb az elúciós puffer pH-jánál.

A kívánt immunoglobulin protein A oszlopról történő eluálására elúciós puffért alkalmaznak. 25 Az elúciós puffer előnyösen alacsony pH-jú és ezáltal megváltoztatja a protein A és a kívánt immunoglobulin közötti kölcsönhatásokat a fehérjekonformáció megváltoztatása révén. Az alacsony pH-jú elúciós puffer pH-ja előnyösen a 2 és 5 közötti tartományban van, leginkább előnyösen a 3 és 4 közötti tartományban. Példák azokra a pufferekre, amelyek ezen a tartományon belül szabályozzák a pH-t: foszfát, acetát, citrát, glicin és ammonium puffer, 30 valamint ezek kombinációi.

Ilyen előnyös pufferek a citrát és az acetát pufferek, leginkább előnyösek a nátrium-citrát vagy nátrium-acetát pufferek. Más elúciós pufferek is szóba jöhetnek, beleértve a magas pH-jú

1926404 puffereket (pl. azokat, amelyeknek pH-ja 9 vagy efölötti) vagy azok a kívánt immunoglobulin eluálására való pufferek, amelyek egy vegyületet vagy keveréket tartalmaznak, úgymint a MgCl₂ (2mM).

A protein A affinitás kromatográfiás gyanta regenerálható 0,1-0,5 NaOH-dal, előnyösen az oszlopba töltve (ún.: cleaning in place).

Köztes/(finom)tisztító kromatográfiás lépés: kationcserélő kromatográfia

Azt itt leírt módszer további kationcserélö kromatográfiás lépést tartalmazhat.

A kationcserélö kromatográfia a mintában található fehérjék és a gyantán rögzített töltések közötti ionos kölcsönhatásra épít. A kationcserélö kromatográfiában a megkötendő molekulák pozitív töltésüek és a rögzített funkciós csoportok (ligandumok) negatív töltésüek. Gyakran 15 alkalmazott kationcserélö gyanták az S-gyanták (szulfonát), SP gyanták (szulfopropil), SiB gyanták (szulfoizobutil), SE gyanták (szulfoetil) és CM gyanták (karboximetil).

Azonban, a kationcserélö kromatográfiás lépés általában minden kereskedelmi forgalomban elérhető kationcserélö gyantával vagy membránnal elvégezhető. A kationcserélö gyanták 20 alkalmazhatók elöretöltött oszlopok vagy membránok formájában, amelyeken a funckiós csoportot, pl. a szulfonsavat rögzítették. Alternatívaként a gyanták beszerezhetők ömlesztve és oszlopba tölthetöek a felhasználó által. A szokásos megkötéseken felül nincsen specifikusan korlátozva az oszlopok kapacitása és mérete. A szakterületen járatos szakemberek ismerik az alkalmazandó kationcserélö gyanta mennyiségét és az oszlop méretét. Ez függ az eljárás teljes 25 léptékétől.

A kereskedelemben elérhető jellemző termékek közé tartoznak például a Macro-Prep High S, a Macro-Prep CM, a Unosphere Rapid S, a Unosphere Rapid S40, a Nuvia S és a Nuvia HR-S (Bio-Rad, California, USA), a Toyopearl CM, a Toyopearl SP, a Toyopearl Sulfate 650 F és a 30 Toyopearl GigaCap S (Tosoh Bioscience, Németország), a Millipore ProRes S, a Fractogel

EMD COO-, a Fractogel EMD SO3-, a Fractogel EMD SE Hicap, az Eshmuno CPX (Merck KGaA, Németország), a Biosepra CM Ceramic HyperD, a Biosepra S Ceramic HyperD, az S

W

HyperCel (Pall Corporation, New York, USA), a Poros HS, Pa oros XS (Applied Biosystems, Németország), az YMC BioPro 30S, az YMC BioPro 70S (YMC Europe), a CM-Sepharose FF, az SP-Sepharose FF, az S-Sepharose FF, az SP-Sepharose HP, az SP-Sepharose XL, az SPSepharose Big Beads, a CM-Sephadex, a Capto S, a Capto SP ImpRes és a Source S (mind GE 5 Healthcare, Németország).

A kationcserélő kromatográfiát rendszerint 4 és 7 közötti pH-jú pufferrek alkalmazásával végzik.

A találmány szerinti kationcserélö gyanták előnyösen erős kationcserélők, amelyek szulfonátot, 10 szulfopropilt vagy szulfoizobutil ligandumot alkalmaznak. Legelőnyösebbek a szulfonát vagy szulfopropil ligandumok, melyeket merev mátrixhoz, mint például az erősen térhálósított agarózhoz kötnek, pl. Nuvia HR-S vagy poli(sztirol-vinil-benzol), pl. Poros 50 HS vagy polimetakrilát, pl. Fractogel EMD SO3’. A legelőnyösebb kationcserélő gyanta a Poros HS 50 szulfopropil (-CH2CH2CH2SO3·) ligandumokkal, melyeket térhálósított poli(sztirol-divinil15 benzol) mátrixhoz kötnek.

A kationcserélö kromatográfia ekvilibrálható egy pH 4 és pH 8 közötti pH-jú pufferrel. A puffer koncentrációja a lOmM és lOOmM közötti tartományban lehet, előnyösen a 20mM és 50mM közötti tartományban.

A kationcserélö kromatográfiában alkalmazható pufferekre példa a citromsav, tej sav, borostyánkösav, hangyasav, butándisav, ecetsav, malonsav, glicin, MES, PIPES, foszfát, bisztrisz vagy ezek keverékei.

A kationcserélö kromatográfiás lépéssel elválaszthatók lehetnek az immunoglobulin töltésvariánsai és csökkenthető a maradék gazdasejt-fehérjék, DNS, aggregátumok, fragmensek, vírusok, endotoxinok, flokkulánsok és a lehasadó protein A mennyisége.

Az immunoglobulin kötődhet a gyantához az immunoglobulin izoelektromos pontja (pl) alatti 30 pH-η és alacsony vezetőképesség mellett.

1926404

A fehérje izoelektromos pontja vagy pl-je azt a pH-t jelenti, amelyen a fehérje nettó össztöltése nullával egyenlő, vagyis az a pH, amelyen a fehérje pozitív és negatív töltéseinek száma egyenlő. A pl meghatározása megvalósítható korszerű módszerekkel, mint például izoelektromos fókuszálással.

Az alacsony vezetőképesség 2 mS/cm alatti.

Elálás céljára az eluáló puffer ionerösségének növelése is alkalmazható, amely egyetlen lépésben vagy gradienssel egyaránt megvalósítható. Kationcserélö kromatográfiában eluálásra 10 alkalmazható sók lehetnek például a klorid sók, szulfát sók, foszfát sók, citrát sók, formiát sók vagy acetát sók. Előnyösen NaCl-ot vagy KCl-ot alkalmaznak. Az ionerösség IM-ig növelhető.

Alternatívaként az eluáló puffer pH-jának növelése is alkalmazható, egyetlen lépésben vagy gradienssel egyaránt.

A találmány egyik előnyös kiviteli alakja szerint, a kationcserélő kromatográfia elvégzésére a pH 4 és 6 közötti tartomány, még előnyösebben a 4,5 és 5,5 közötti pH tartomány alkalmas. Karbonsavak is használhatóak puffer alkotóként, legelőnyösebben a citromsav.

Egy további előnyös kiviteli alakban a kationcserélő gyantához kötött immunoglobulin eluálását a pH változtatásával, vagyis a pH növelésével végzik. Ez elérhető egy alacsony pHtól a magas pH felé haladó gradienssel, két különböző pufferoldat keverésével. Az alacsony pH-ra a citrát pufferek az előnyösek, a magas pH-ra a foszfát pufferek. A legelőnyösebb kiviteli alakban a pH gradienst pH 5-6 körüli citrát és pH 7-9 körüli foszfát pufferek keverésével hozzák létre. A pufferek előállíthatok a savak 10 és 50mM közötti koncentrációjú nátrium sóinak alkalmazásával. A pH gradiens előnyös tartománya 5,0 és 7,5 közötti.

Alternatívaként az elúciós puffer pH-jának és ionerösségének együttes növelése is alkalmazható az elúcióra, egyetlen lépésben vagy gradienssel egyaránt.

Az egyik kiviteli alakban a protein A kromatográfia eluátumán végzik a kationcserélö V kromatográfiát.

WBT

V

W' w

H

Jellemzően a protein A kromatográfia eluátumán hajtják végre a vírus inaktivációs lépést, amelyet kationcserélö kromatográfia követ.

Ennek következtében egyes kiviteli alakokban a találmány szerinti módszerbe beletartozhatnak 5 a következő lépések az alábbi sorrendben:

(a) flokkulálást előidéző vegyidet hozzáadása a sejttenyésztő közeghez;

(b) az (a) lépésben létrehozott keverék mélységi szűrése;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerősségü mosó pufferrel; és (e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú elúciós puffer alkalmazásával;

(f) az (e) lépés szerinti eluátum inkubálása vírus inaktiválás céljára alacsony, 2,5 - 4,5 közötti 15 pH-η, legalább 10 percig; és (g) kationcserélö kromatográfia elvégzése.

A kationcserélö gyanta regenerálható 3-5 oszloptérfogatnyi 1M NaCl-dal. A helyben elvégzett tisztítási eljárásba beletartozhatnak továbbá a következő lépések: (a) mosás 1-5 20 oszloptérfogatnyi IM NaOH-dal, 1M NaCl-dal, (b) mosás 1-5 oszloptérfogatnyi 1M ecetsavval vagy TFA-val, (c) ismételt ekvilibrálás.

Finomtisztítási kromatográfiás lépés: kevert módú kromatográfia

A találmány szerinti módszer magában foglalhat továbbá egy kevert módú kromatográfiás lépést, mint tisztító lépést, vagyis ezt sorrendben (egyetlen lépésben vagy gradienssel) az affinitás kromatográfiát követően végzik el.

A kevert módú közegként vagy gyantaként alkamazott közeg olyan funkciós csoportokkal 30 rendelkezik, amelyek egyaránt állhatnak hidrofób ioncsere ligandumokból vagy kristályos ásványi anyagokból, úgymint hidroxiapatit vagy fluorapatit. A “kevert módú kromatográfia” kifejezés helyett időnként alkalmazzák a “multimodális kromatográfia” vagy egy speciális

1ÍJ26404 eljárással összefüggésben a “hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia” kifejezést. A kevert módú kromatográfia legalább két törvényszerűség, a hidrofób kölcsönhatás és az ioncsere vagy fémek affinitásán alapuló kölcsönhatás és ioncsere egymásra hatása. A kevert módú kromatográfia szelektivitása kevésbé előrejelezhetö és nem reprodukálható egyetlen kromatográfiás módszerrel, mint az ioncsere vagy a hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia külön-külön. A pozitív töltésű hidrofób ligandumok a kevert módú anioncserélök csoportjába tartoznak (például Capto Adhere), a negatív töltésű ligandumok a kevert módú kationcserélök csoportjába tartoznak (például Capto MMC). Egyes kevert módú közegeknek ikerionos karaktere van (például Bakerbond ABx). Más kevert módú közegekben hidrofób ligandumok vannak, amelyek ionizálhatok és a pH csökkentésével átalakíthatok töltés nélküliből pozitív töltésűvé (például MEP HyperCel). Végül, a hidroxiapatit és fluorapatit közegek kevert módú funkciói jóval összetettebbek, mivel pozitív töltésű kalcium ionokkal és negatív töltésű foszfát csoportokkal rendelkeznek.

Egy előnyös kiviteli alakban a kevert módú kromatográfiát tisztító lépésként alkalmazzák, kihasználva azt, hogy a gyantáknak hidrofób és anioncsere funkciói is vannak. Még előnyösebbek azok a kevert módú gyanták, amelyek pozitív töltésű N-benzil-N-metiletanolamin ligandumokat tartalmaznak, amelyek erősen térhálósított agaróz mátrixhoz kötöttek.

Egyes kiviteli alakokban a módszer a következő lépéseket tartalmazza az alábbi sorrendben:

(b) az (a) lépésben létrehozott keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szűrlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az affinitás 25 kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerösségü mosó pufferrel;

(e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú elúciós puffer alkalmazásával;

(f) az (e) lépés szerinti eluátum inkubálása vírus inaktiválás céljára alacsony, 2,5 - 4,5 közötti pH-η, legalább 10 percig; és (g) kationcserélö kromatográfia elvégzése; és (h) kevert módú kromatográfía elvégzése.

Előnyösen, a kevert módú kromatográfiás lépés a kationcserélö kromatográfiát követi. Még előnyösebben, a kationcserélő kromatográfiát követő kevert módú kromatográfiás lépést pozitív töltésű ligandumokat tartalmazó közeggel hajtják végre. Még előnyösebben a pozitív töltésű ligandum N-benzil-N-metil-etanolamin és a ligandum erősen térhálósított agarózhoz kötött.

Pozitív töltésű kevert módú kromatográfiás gyanták ötő vagy eluáló módú terhelésekor a következő feltételek alkalmazhatók: pH 6-9, előnyösen 7,0 -8,5; vezetőképesség 0,5 1 OmS/cm, előnyösen 1 - 4mS/cm. Egy vagy több mosási lépés alkalmazható. A körülmények függnek az immunoglobulin pl értékétől és specifikusan beállíthatók a kívánt elválasztásnak megfelelően.

A (d) isztítási lépéshez legelőnyösebben a Capto Adhere (GE Healthcare Life Science) kevert módú gyanta használható.

A Capto Adhere kromatográfía kötő módjában az előnyös terhelési feltételek a következők lehetnek: a gyantát 0,5M Na-foszfáttal ekvilibrálják, pH 8,2, melyet 20 mM Na-foszfát, pH 8,2 követ. A mintát (kationcserélő összeöntött frakciók) pH 8,0-8,5-re és 1-4 mS/cm vezetőképességre állítják be és felviszik az oszlopra. A 20mM Na-foszfát, pH 8,2 ekvilibráló pufferrel történő mosást követően a kívánt immunoglobulin eluálható a Capto Adhere gyantáról, például 20mM Na-foszfáttal, melyeknek pH-ja 5 és 7 közötti, előnyösen pH 5,5 - 6,5.

Alternatívaként a Capto Adhere kromatográfía elvégezhető átfolyó módban. Ez esetben a pH-t és az ionerősséget úgy kell beállítani, hogy az immunoglobulin ne kössön a kevert módú ligandumhoz, miközben a maradék szennyezőanyagok (DNS, aggregátumok, kimosódó protein A, gazdasejt fehérjék), amelyeket el kell távolítani, megkötve maradjanak. A körülmények függenek az immunoglobulin pl-jétől. Előnyösen foszfát vagy Trisz puffért használnak a 6,5-

8,5 pH tartományban, még előnyösebben pH 7 és 8 között. A vezetőképességet sóval, például

NaCl-dal vagy a puffer koncentrációjával állítják be. A legelőnyösebb a Na-foszfát puffer 10< 50 mM koncentrációtartományban NaCl-dal kiegészítve, melynek koncentrációja az 50 ©

W

HI

200mM közötti tartományban van. Figyelembe veendő, hogy a nagy sókoncentrációk, bár deszorbeálják az ionos kölcsönhatásokat, elősegítik a ligandummal való hidrofób kölcsönhatást.

A kevert módú gyanta regenerálása (cleaning in place) alacsony pH-η, nagy sókoncentrációval és magas pH-η, pl. 10 - 200mM citromsavval, 0,5-2M NaCl-dal és lOmM - 1M NaOH-dal hajtható végre.

Az előnyös regeneráló eljárást az egymást követően alkalmazott A-D oldatokkal hajtják végre:

A oldat: lOOmM citromsav, 2M NaCl; B oldat: 2M NaCl; C oldat: IM NaOH; D oldat: lOmM NaOH. A gyanta tárolása D oldatban történhet.

Egy további előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti módszer magában foglalja a következő lépéseket az alábbi sorrendben:

- flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a sejttenyésztő közeghez;

- mélységi szűrés;

- affinitás kromatográfia, ahol az immunoglobulin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

- az affinitás kromatográfiás közeg mosása 5-9 közötti pH-jú és 0,1 - 5,0 mol/1 ionerősségű 20 mosó pufferrel;

- az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról 2,5 - 4,5 közötti pH-jú elúciós puffer alkalmazásával;

- erős kationcserélő kromatográfia, ahol az immunoglobulin az erős kationcserélő kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint úgy nyerjük ki, 25 hogy az immunoglobulint deszorbeáljuk az erős kationcserélő kromatográfiás közegről; és

- pozitív töltésű kevert módú kromatográfia; ahol a gyantát 8-8,5 közötti pH-jú foszfát pufferrel ekvilibrálják, az immunoglobulint a pozitív töltésű kevert módú kromatográfiás közeghez kötik és az immunoglobulin eluálását 5-7 közötti pH-jú foszfát pufferrel végzik.

e ©

©

0) «Η

Mélységi szűrés

A találmány szerinti módszer tartalmazhat továbbá egy vagy több mélységi szűrési lépést.

Ellentétben a membránszűrökkel, amelyek úgy végzik az elválasztást, hogy a membrán 5 felületén visszatartanak részecskéket, a mélységi szűrők szálak és gyöngyök mátrixából állnak, ahol az elválasztás a szürömátrixon belük történik és nem a felszínén.

A mélységi szűrők közé tartoznak például, de nem korlátozódnak csupán a következőkre: Pali SXL sorozat (pl. SXLP700416 és SXLPDE2408SP szürőkapszulák, Pali HP sorozat (pl. PDD1, 10 PDE2, PDH4, PDK5, PEKM) (Pali Corporation), Millistak sorozat (pl. XOHC, FOHC, DOHC,

A1HC és B1HC Pod szűrők), HC-Pro sorozat, Clarisolve sorozat (pl. 40 MS) (EMD Millipore), vagy Zeta Plus sorozat (90ZB08, 30ZA/60ZA, 60ZN90ZA, delipid, VR07 és VR05 szűrőkapszulák) (3M).

A mélységi szűrők előnyösen előkezelt extrahált szervetlen szűrési segédanyagból, cellulózból és egy gyantarendszerből állnak, amely pozitív töltést ad a szürőmátrixnak, mint pl. a Zeta Plus (3M, Egyesült Királyság).

Egy másik előnyös szűrőmodul az Emphaze AEX Hybrid purifier (3M), amely egy anioncsere 20 funkciókkal rendelkező mélységi szűrő.

A találmány céljaira alkalmazott leginkább előnyös mélységi szűrők a PDE2, PDH4 és P700 sorozat szürőkapszulái (Pali Corporation).

A mélységi szűrési eljárás elvégzésének paraméterei magkban foglalják a 100 - 2000 L/m²térfogati terhelést, amely előnyösen 200 - 1500 L/m², még előnyösebben 1200 L/m² alatti és legelőnyösebben 400 - 1000 L/m², a 0,2 - 2,0 bar nyomást, amely előnyösen 0,4 - 0,6 bar és szobahőmérsékletet.

Egy további kiviteli alak szerint, a tisztítás magában foglalhat egy vagy több szűrési lépést, amely megelőzi az első kromatográfiás lépést. Egy előnyös kiviteli alakban a tisztítás magában foglalhat egy centrifugálási lépést és egy vagy több szűrési lépést. Egy másik előnyös kiviteli w' ©

w w Hí

2 6 4 0 4 alakban az első kromatográfiás lépést egy mélységi szűrési és egy flokkulálást követő mikroszürési lépés előzi meg. Egy még előnyösebb kiviteli alakban az első kromatográfiás lépést egy sejtszeparációs lépés, egy flokkulálásos lépés, egy mélységi szűrési lépés és mikroszürési lépés előzi meg. A minta flokkulálás utáni és befogó kromatográfiás lépést 5 megelőző tisztítását célzó szűrőállomásnak részei lehetnek további, pozitív és/vagy negatív töltésű membránokat alkalmazó további szűrési lépések. A különböző anyagokat kombináló, töltött és töltés nélküli szürőmodulok szintén beleértendők egy előnyös kiviteli alakba.

A mélységi szűrésre használt szűrő előnyösen egynél több rétegből áll. Például, egy kétrétegű szűrő alkalmazható mélységi szűrésre.

Ultraszürés, vírusszűrés, mikroszűrés

A találmány szerinti módszer tartalmazhat továbbá egy vagy több mikroszürési, ultraszürési és/vagy nanoszürési lépést. Az ultraszürés a membránszűrés azon formája, amelynek során nyomással kényszerítik a folyadékot egy féligáteresztő membránra. A szuszpendált szilárd anyagok és nagy molekulatömegü oldott anyagok visszatartódnak, míg a víz és a kis molekulatömegü oldott anyagok átjutnak a membránon. Az ultraszürés egy gyakran alkalmazott módszer elválasztásra, tisztításra és makromolekuláris, különösen fehérje oldatok koncentrálására. Az ultraszűrés diaszüréssel kombinálható. Ez a módszer alkalmas puffercserére, sók és azok egyéb mikromódosulatok oldatból való eltávolítására ismételt vagy folyamatos hígítás és újratöményítés révén. Az ultraszürés elvégezhető egymásra halmozott membránokkal, tangenciális áramlású vagy keresztáramlású szűrőrendszerben (TFF vagy TF25 UF), különösen nagy térfogatú minták feldolgozása esetén. Alternatívaként ún. hollow-fiber rendszereket is gyakran alkalmaznak ultraszürésre. A membránok vágási értéke a 1 - 300kD tartományba esik. Immunoglobulinok esetén a ultraszürö membránokra vonatkozó jellemző vágási érték 10-100kD. Jelen találmány keretein belül a 30 vagy 50 kD molekulatömeg vágási értékű UF membránok az előnyösek.

A mikroszűrés egy részecskeszürési módszer, amelyben 0,1 - 10 pm pórusméretü membránokat alkalmaznak. Steril szűrésre, amely a környezetre vonatkozóan speciális körülményeket támaszt, sterilizált mikroszüröket alkalmaznak, amelynek pórusmérete 0,2pm körüli. Gyakori a további, nagyobb pórusméretü (0,45 pm, 3pm) előszűrök használata. Ez megakadályozza a kis pórusméretű szűrők gyors eltömődése által okozott áramláscsökkenést.

Végül a biológiai gyógyszerek előállításában a nanoszűrést főleg vírusszűrésre alkalmazzák és 5 az emlőssejtes tenyészetekben termelt terápiás fehérjék biztonságosságához szükséges. A nanoszűrési lépéseket általában a downstream folyamatok végén, a tisztított hatóanyag letöltése előtt végzik el. A gyakran alkalmazott nanoszűrők pórusmérete a 15 és 35 nm közötti tartományban van (Planova, Asahi Kaséi, Japán; vagy Viresolve, EMD-Millipore, Németország).

Jelen találmány tárgykörén belül a “nanoszűrés” és “vírusszürés” kifejezéseket szinonimaként használjuk.

A jelen találmány egy további módszert ad meg az immunoglobulint és legalább egy szennyezőt tartalmazó sejttenyésztö közegből származó immunoglobulin tisztítására, a módszer a 15 következő lépéseket tartalmazza az alábbi sorrendben:

- a sejttenyésztő közeg centrifugálása és/vagy szűrése;

- flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a felülúszóhoz vagy szűrlethez;

- mélységi szűrés;

- mikroszürés;

- az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, melynek pH-ja 5-9, az ionerössége 0,1 - 5,0 mol/1; és

- az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer 25 alkalmazásával, melynek pH-ja 2,5-4,5.

A találmány egy előnyös kiviteli alakja szerint a tisztítási eljárás egy vagy több ultraszűrési/diaszűrési és/vagy nanoszűrési lépést tartalmaz. A szűrési lépések végrehajthatók kereskedelmi forgalomban kapható szűrőberendezések alkalmazásával, amelyek elérhetőek 30 például a Pali Corporation-nél, GE Healthcare-nél, EMD-Millipore-nál vagy a Sartorius-nál.

tő

N (®

Hí

Egy további kiviteli alakban a módszer tartalmaz egy további lépést, amelyben nanoszűrést végeznek az affinitás kromatográfia vagy a finomtisztítási lépés során nyert eluátumon vagy ezekből származó keveréken, amelyeket az említett kromatográfiás lépést követő egy vagy több további eljárási lépést követően nyertek. Nanoszűrésre előnyösen a parvovírusok visszatartására alkalmas, legelőnyösebben 15-35 nm pórusméretü szűrőt alkalmaznak.

A jelen találmány egyes kiviteli alakjai szerinti módszer egy immunoglobulin tisztítására vonatkozik egy olyan sejttenyésztö közegben, amely tartalmazza az immunoglobulint és legalább egy szennyezőt, a módszer a következő lépésekből áll, az alábbi sorrendben:

- flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a felülúszóhoz vagy szürlethez;

- mélységi szűrés;

- az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, melynek pH-ja 5-9, az ionerössége 15 0,1 -5,0mol/l;és

- az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer alkalmazásával, melynek pH-ja 2,5-4,5;

- kationcserélő kromatográfia, ahol az immunoglonbulin a kationcserélő kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint az immunoglobulin kationcserélö 20 kromatográfiás gyantáról történő deszorbeálásával nyerjük;

- kevert módú kromatográfia, ahol azt immunoglobulin a kevert módú kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint a fehérje kevert módú kromatográfiás közegről történő deszorbeálásával nyerjük; és

- az eluátum vírusszűrön való átszűrése, melyet opcionálisan egy ultraszűrési/diaszürési lépés 25 követ.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli alakja szerinti módszer egy immunoglobulin tisztítására vonatkozik egy olyan sejttenyésztö közegben, amely tartalmazza az immunoglobulint és legalább egy szennyezőt, a módszer a következő lépésekből áll, az alábbi 30 sorrendben:

< - a keverék mélységi szűrése;

T

Φ w r»

1926404

- szürlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

- az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, melynek pH-ja 5-9, az ionerőssége 0,1 - 5,0 mol/1; és

- kationcserélő kromatográfia, ahol az immunoglonbulin a kationcserélö kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint az immunoglobulin kationcserélö kromatográfiás gyantáról történő deszorbeálásával nyerjük;

- kevert módú kromatográfia, ahol azt immunoglobulin a kevert módú kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint a fehérje kevert módú kromatográfiás közegről törtánő deszorbeálásával nyerjük;

- nanoszürés; és

- ultraszürés/diaszürés.

Vírusinaktiváció

A rekomibáns fehérje gyógyszerek, mint például a sejttenyészetben előállított monoklonális 20 antitestek előállítási eljárása során szükséges a víruseltávolítás és/vagy az inaktiválás, a nyersanyagokból vagy a gyártási lépésekből esetlegesen bejutó vírusokkalszennyezéssel szemben. Ennek eredményeképpen jelentős szabályozási igény mutatkozik minden olyan gyártási eljárás vírusbiztonságára, ami sejttenyészetekböl származó biológiai terápiás fehérjéket eredményez.

A vírusinaktivációs lépésre az affinitás befogó kromatográfiát követően kerül sor úgy, hogy az eluátum pH-ját alacsonyon tartjuk. Az affinitás mátrixról az alacsony pH-η történő elúció előnyös.

Egy ilyen vizes savas környezetben számos vírus, különösen a burokkal rendelkezők, instabilak 30 és szétesnek.

Az alacsony pH 2 és 5 közötti pH értékeket jelent, előnyösen 2,5 és 4,5 közöttit, még előnyösebben 3 és 4 közöttit.

Egy előnyös kiviteli alakban a vírus inaktiválás inkubációs ideje 10 perc - 2 óra, még előnyösebben 30 perc - 90 perc, legelőnyösebben 45 perc - 75 perc.

Egy előnyös kiviteli alakban a vírusinaktiválást szobahőmérsékleten hajtják végre kevertetés mellett és a pH-t az inkubációt követően emelik meg.

Jelen találmány módszert ad meg a sejttenyésztő közegből származó az immunoglobulint és 10 legalább egy szennyezőt tartalmazó immunoglobulin tisztítására, a módszer a következő lépéseket foglalja magában az alábbi sorrendben:

(al) sejtek elválasztása a sejttenyésztő közegtől ülepítés révén;

(a) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása a felülúszóhoz vagy szűrlethez;

(b) az (a) lépés szerinti keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben nyert szürlet affinitás kromatográfiája, ahol az immunoglobulin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, melynek pH-ja 5-9, az ionerőssége 0,1 - 5,0 mol/1;

(e) az immunoglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer 20 alkalmazásával, melynek pH-ja 2,5-4,5;

(f) az (e) lépés eluátumának inkubálása vírusinaktiválás céljára alacsony, 2,5-4,5 közötti pHn, legalább 10 percig;

(g) az (f) lépés szerinti vírusinaktiválási lépést követően az eluátum vagy az ebből származó, az (f) lépést követően végrehajtott egy vagy több további eljárási lépés után nyert keverék 25 kationcserélö kromatográfiája, ahol az immunoglobulin a kationcserélő kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint az immunoglobulin kationcserélő kromatográfiás gyantáról történő deszorbeálásával nyerjük;

(h) a (g) lépésben kapott eluátum vagy az ebből származó, a (g) lépést követően végrehajtott egy vagy több további eljárási lépés után nyert keverék kevert módú kromatográfiája, ahol az 30 immunoglobulin a kevert módú kromatográfiás gyantához kötődik és az eluátumban lévő immunoglobulint az immunoglobulin kevert módú kromatográfiás gyantáról történő deszorbeálásával nyerjük;

13'

C

Ml !B

H (i) a (h) lépésben kapott eluátum vagy az ebből származó, a (h) lépést követően végrehajtott egy vagy több további eljárási lépés után nyert keverék nanoszürése; és (j) az (i) lépésben kapott szürlet vagy az ebből származó, az (i) lépést követően végrehajtott egy vagy több további eljárási lépés után nyert keverék ultraszürése/diaszűrése.

Egy előnyös kiviteli alakban az ultraszürés/diaszürés az immunoglobulin tisztításának utolsó lépése és további (b), (c) és (d) szerinti kromatográfiás lépésre nem kerül sor.

t? at? sc ex

PÉLDÁK

A találmány szerinti immunoglobulin tisztítási módszereket a következő példákra való hivatkozással szemléltetjük és illusztráljuk. Hangsúlyozzuk, hogy ezek a példák nem értelmezhetők úgy, mint amelyek a találmány oltalmi körét korlátozzák.

1. példa: Immunoglobulinok és sejttenyészetek

A találmány szerinti módszerek nem függenek sem specifikus antitestektől, sem az 15 immunoglobulinok expresszálására alkalmazott specifikus gazdasejtektöl. Ugyanez igaz az expresszió módjára és a kiválasztott tenyésztési feltételekre, amelyeket úgy állítottunk be, hogy a kitermelés maximális legyen. A találmány szerinti módszer kifejlesztése során különböző monoklonális antitesteket használtunk. Ezeket a találmány szerinti módszer szerint sikeresen tisztítottuk különböző léptékekben. A táblázatokban bemutatott kiválasztott kísérletek 20 többségét bevacizumabbal, egy humanizált anti-VEGF, IgGl antitesstel végeztük. Néhány további kísérlet zajlott továbbá trastuzumabbal, egy humanizált, anti-HER2, IgGl antitesttel és denosumabbal, egy teljesen humán anti-RANKL IgG2 antitesttel. Mindhárom antitestet CHO sejtek expresszálták rekombináns módon, amelyeket különböző léptékű rátáplálásos-szakaszos tenyészetekben tenyésztettünk. A fejlesztési fázisban lévő flokkulálásos kísérleteket 10 L-es 25 laboratóriumi léptékű és 100 L-es vagy 200 L-es félüzemi léptékű tenyésztő közegekben végeztük el. A példákban alkalmazott termelési lépték és maximális tenyésztési térfogat 5000 L volt. Egyes kísérleteket kisebb, 1000 L-es termélési léptékben végeztünk el. Hacsak másképp nem határozzuk meg, a lépték mindig a tenyészet térfogatára utal.

2. példa: Különböző flokkulálószerek összehasonlítása (1-3. táblázat)

Az 1.-3. táblázat szerinti flokkulálásos kísérleteket különböző, félüzemi léptékű (100 L) CHO sejttenyészeteket alkalmazó sorozatokban hajtottuk végre, amelyek IgGl alosztályba tartozó humanizált antitestet (bevacizumab) termeltek. Az antitest titere 1,16 és 1,52 g/L között volt. A flokkulálószereket adtuk a sejttenyészető folyadék 20 ml-es aliquotjaihoz a fermentáció végén, 5 a sejtek szeparációját megelőzően. Három különböző kationos anyagot teszteltünk három különböző koncentrációban. 1) pDADMAC = poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid, 2) kitozán, és 3) kalcium-klorid. A pDADMAC-ot 10% (m/v) oldatként szereztük be (EMD Millipore). A kitozánt szilárd anyagként szereztük be (Sigma) és 1 % (m/v)-ot oldottunk fel 0,1 M ecetsavban. A kitozán működési pH tartománya 4,5 - 5,0 körül volt. A kalcium-kloridot 10 vizes törzsoldat formájában adagoltuk.

A kísérleteket a következő lépések szerint végeztük:

A fermentlé 20 ml-es aliquotjának begyűjtése

Flokkulálószer hozzáadása

Inkubálás szobahőmérsékleten 15 percig, kevertetés mellett

- Centrifugálás 4600 rpm-en 10 percig (Thermo Scientific asztali centrifuga)

Mikroszűrés (PVDF, 0,2 pm, EMD Millipore) Zavarosság, HCDNS és HCP analízise

Annak érdekében, hogy a különböző flokkulálószerek különböző koncentrációinak közvetlen hatását értékelni tudjuk, mélységi szűrést nem hajtottunk végre. A centrifugálási lépés 20 eltávolítja a pelyheket, sejteket és sejttörmelékeket. A rákövetkező mikroszűrés eltávolítja a maradék részecskéket. A kontrollokhoz (nulla értékek) nem adtuk flokkulálószert és nem került sor inkubálásra. A mintákat azonban centrifugáltuk és szűrtük az analízis előtt.

Az antitest koncentrációkat protein A alapú HPLC módszerrel határoztuk meg.

1, a táblázat: A pDADMAC-kal végzett flokkulálás hatása a HCDNS és a zavarosság csökkenésére

2 6 4 0 4

pDADMAC
Konc. [% m/v]	0	0,0250	0,0375	0,0750	0,0900
HCDNS [ng/ml]	62900	59,9	16,0	16,0	16,0
Csökkenés [%]	0	99,91	99,98	99,98	99,98
Zavarosság [FNU]	19,90	10,30	3,20	2,55	2,46
Csökkenés [%]	0	48,24	83,92	87,19	87,64

1. b táblázat: A kitozánnal végzett flokkulálás hatása a HCDNS és a zavarosság csökkenésére

Kitozán
Konc. [% m/v]	0	0,025	0,050	0,075	0,200	0,400
HCDNS [ng/ml]	62900	32700	24200	20700	6690	5380
Csökkenés [%]	0	48,01	61,53	67,09	89,36	91,45
Zavarosság [FNU]	19,90	17,60	17,30	17,10	16,1	16,3
Csökkenés [%]	0	11,56	13,07	14,07	19,10	18,09

1. c táblázat: A CaCh-dal végzett flokkulálás hatása a HCDNS és a zavarosság csökkenésére

Kalcium-klorid
Konc. [mM]	0	40	50	60	70	80	100	120
HCDNS [ng/ml]	62900	21000	12000	1330	590	318	130	56,4
Csökkenés [%]	0	66,61	80,92	97,89	99,06	99,49	99,79	99,91
Zavarosság [FNU]	19,90	11,20	14,60	13,20	11,70	10,50	7,86	7,40
Csökkenés [%]	0	43,72	26,63	33,67	41,21	47,24	60,50	62,81

Az 1. a-c. táblázatok mutatják a három különböző flokkulálószerrel végzett flokkulálás eredményeit a HCDNS és a zavarosság csökkenésére vonatkozóan. A HCDNS-t Quant-iT™

High-Sensitivity dsDNA Assay Kittel (Thermo Fisher) és qPCR-rel (PrepSEQ™ Residual DNA Sample Preparation Kit és resDNASEQ™ Quantitative CHO DNA Kit, Thermo Fisher) határoztuk meg. A zavarosság méréseket egy Hach Turbidimeter 2100Q-ban végeztük és formazin nefelometriás egységekben (FNU) fejeztük ki. A műszer a minta által szórt fényt méri az infravörös fény beesési szögétől számított 90-fokos szögben.

Az 1. a táblázat a pDADMAC hatását mutatja 0,09 % (m/v)-ig. Már a legalacsonyabb koncentrációval (0,025 % m/v) majdnem teljesen eltávolítottak a HCDNS-t (99,9%-os, három nagyságrendnyi csökkenés). 0,075% (m/v) pDADMAC-kal 87%-os zavarosság-csökkenést tudtunk elérni. A zavarosság további csökkenését ebben a kísérletben nagyobb pDADMAC koncentrációval sem tudtuk elérni.

1926404

Az 1. b táblázatban bemutatott, kitozánnal elért eredmények hatékony HCDNS eltávolítást mutatnak, azonban ez nagyobb koncentrációkat igényéit, mint a pDADMAC esetében. 91,5% körüli csökkenést értünk el 0,4 % (m/v) esetén. Zavarosság-csökkenés tekintetében nem több mint 19%-os csökkenést mértünk.

V θ' «I'

Dll θ' •HI

A CaCh-dal végzett kísérletek eredményeit az 1. c táblázat mutatja. Ezzel a flokkulálószerrel is nagyon hatékony HCDNS eltávolítást sikerült elérni. 70mM-nál 99%-os csökkenést mértünk és 120 mM CaCh esetében 99,9%-os csökkenést. A zavarosság-csökkenés nagyobb volt, mint a kitozán esetében, de kisebb, mint a pDADMAC-nál. 120 mM-nál 63% körüli csökkenést 5 tudtunk elérni. Magasabb CaCh koncentrációkat nem teszteltünk.

Következtetések (1 .a-c táblázatok): A HCDNS kiindulási koncentrációja (vagyis a flokkulálás nélküli kontroll) rendre 62,9 pg/ml sejttenyészet felülúszó és 51,1 mg/g IgG volt. Az összes fehérjére vagy antitestre vonatkozó veszteség nem volt kimutatható egyetlen vizsgált flokkulálószer és koncentráció esetében sem. Hasonlóképpen, nem figyeltünk meg a 10 flokkulálás következtében megnövekedett sejtszétszakadást sem. Meglepő módon evidens, hogy a HCDNS csak kevéssé járul hozzá, ha hozzájárul egyáltalán a zavarossághoz. Például 0,4% (m/v) kitozánnal 91,5% körüli HCDNS-t flokkuláltunk és távolítottunk el, míg a zavarosság alig csökkent és a kontroll 82%-a maradt (1. b táblázat). Mindkettő, azaz a HCDNS és a zavarosság csökkentéséhez a pDADMAC flokkulálószer a jobb.

2. a táblázat: A pDADMAC-kal végzett flokkulálás hatása a HCP csökkenésére

	pDADMAC
Konc. [% m/v]	0	0,0250	0,0375	0,0500	0,0750	0,0900
HCP [pg/ml]	2310	2280	2240	2170	2100	2060
Csökkenés [%]	0	1,30	3,03	6,06	9,09	10,82

2. b táblázat: A kitozánnal végzett flokkulálás hatása a HCP csökkenésére

	Chitosan
Konc. [% m/v]	0	0,025	0,050	0,075	0,100	0,200	0,400
HCP [pg/ml]	1720	1670	1720	1720	1590	1580	1610
Csökkenés [%]	0	(0)	0	0	7,56	8,14	6,40

2. c táblázat: A kalcium-kloriddal végzett flokkulálás hatása a HCP csökkenésére

	Kalcium-klór'	d
Konc. [% m/v]	0	10	20	50	60	70
HCP [pg/ml]	1410	1330	1200	1080	1080	1000
Csökkenés [%]	0	5,67	14,89	23,40	23,40	29,08

A 2. a-c táblázatok mutatják a flokkulálás HCP csökkenésre gyakorolt hatását a három különböző flokkulálószer alkalmazása esetén. A HCP-t CHO HCP ELISA Kit, 3G (Cygnus technologies) használatával határoztuk meg.

A 2. a táblázat a pDADMAC HCP eltávolítására gyakorolt hatását mutatja. Még a legnagyobb vizsgált koncentráció (0,09 % m/v) esetén is csak 10,8% körüli volt a csökkenés.

Ahogyan azt a kitozán, mint flokkulálószer HCP csökkenésre gyakorolt hatását mutató 2. b táblázat mutatja, a hatás inszignifikáns. A legnagyobb csökkenés 8,1% körüli volt 0,2% (m/v)nál.

A HCP nagyobb mértékű csökkenését értük el a CaCh-dal végzett kísérletekben, amint azt a 2. c táblázat mutatja. 29,1%-os csökkenést mértünk 70 mM-nál. A nagyobb koncentrációk jobb eltávolítást eredményezhetnek, de ezeket nem teszteltük.

Következtetések (2. a-c táblázatok): A HCP kiindulási koncentrációja 1,4 és 2,3 mg/ml között volt. Tömegét tekintve ez mintegy 20-40-szerese a HCDNS terhelésnek. Ismét nyilvánvaló, hogy a HCP hozzájárulása is csekély a zavarossághoz. Például a 0,075% (m/v) pDADMAC mintegy 87%-kal csökkenti a zavarosságot (1. a táblázat), míg a HCP csökkenés csak 9% körüli (2. a táblázat). HCP flokkulálás révén történő csökkentésére a CaCh volt a legjobb. Az alábbi, 3. a-c táblázatok a HCDNS, zavarosság és HCP csökkentésére tesztelt három flokkulálószer kedvező koncetrációit foglalják össze.

3. a táblázat: Különböző flokkulálószerek kedvező koncentrációi a HCDNS csökkentésére

Flokkulálószer	Koncentráció	Csökkenés
pDADMAC	0,025 % m/v	99,9 %
Kitozán	0,400 % m/v	91,5 %
CaCI₂	70 mM	99,1 %

3. b táblázat: Különböző flokkulálószerek kedvező koncentrációi a zavarosság csökkentésére

Flokkulálószer	Koncentráció	Csökkenés
pDADMAC	0,075 % m/v	87,2 %
Kitozán	0,200 % m/v	19,1 %

62,8 %

CaCI₂

120 mM tf <© Μ

CD

Η

3. c táblázat: Különböző flokkulálószerek kedvező koncentrációi a HCP csökkentésére

Flokkulálószer	Koncentráció	Csökkenés
pDADMAC	0,090 % m/v	10,8 %
Kitozán	0,200 % m/v	8,1 %
CaCb	70 mM	29,1 %

Kationos természetüknek köszönhetően mindhárom flokkulálószer hatékonyan el tudta távolítani a HCDNS-t. Mivel a jelen találmány kiindulási problémája főleg a protein A eluátumokban megfigyelt zavarosság volt, a pDADMAC-ot választottuk ki, mint legmegfelelőbb flokkulálószert. Ez a polimer kisebb koncentrációkban alkalmazható és meglepő módon a HCDNS majdnem teljes eltávolítását eredményezi már a legalacsonyabb vizsgált koncentrációban.

3. példa: További flokkulálásos kísérletek pDADMAC-kal (4-6. táblázat)

A rákövetkező bővített tesztsorozatokban a pDADMAC HCDNS és zavarosság csökkentésére gyakorolt hatását tanulmányoztuk párhuzamos kísérletekben, melyek során hat különböző, bevacizumabot expresszáló sejttenyészetből származó mintát használtunk. A tesztmódszerek megegyeztek a 2. példában leírtakkal. A nem flokkuláltatott felülúszók (kontrollok) HCDNS tartománya 44,3 - 62,9 pg/ml, a zavarosságé 19,9 - 29,1 FNU és a HCP-é 1,24-2,14 mg/ml volt. Az antitest titere 1,16 és 1,52 mg/ml között volt. Öt különböző pDADMAC koncentrációt teszteltünk és kiszámítottuk a csökkenés átlagértékeit %-ban.

4. a táblázat: A pDADMAC koncentráció hatása a HCDNS csökkenésére különböző sejttenyészet sarzsok esetében

Gazdasejt DNS [ng/ml] % csökkenés

pDADMAC [% m/v]	0	0,0250	0,0375	0,0500	0,0750	0,0900
1. sejttenyészet	46500	3,9	3,1	0,2	0,2	0,2
0	99,99	99,99	100	100	100
2. sejttenyészet	62900	59,9	16,0	Nem végeztük el	16,0	16,0
0	99,91	99,98	99,98	99,98
3. sejttenyészet	45400	16,1	5,7	5,7	5,7	5,7
0	99,96	99,99	99,99	99,99	99,99

4. sejttenyészet

100

4,0 99,99

0,9

100

0,4

100

0,3

100

44300 0

Φ w φ Η

5. sejttenyészet	51500 0	0,7 100	0,1 100	0,1 100	0,1 100	0,1 100
6. sejttenyészet	50200 0	18,9 99,96	0,9 100	2,5 100	0,5 100	0,6 100
Átlagérték %-os csökkenés	0	99,97	99,97	100	100	100

A 4. a táblázat eredményei újra megerősítették pDADMAC kationos polimer nagy HCDNS flokkuláló potenciálját. Már a legkisebb vizsgált koncentrációban (0,025 % m/v) is majdnem 100%-os csökkenést kaptunk mind a hat sejttenyészet esetében. A HCDNS majdnem 5 kvantitatív eltávolítása a downstream feldolgozás kezdeti szakaszában nagyon előnyös és tehermentesíti a rákövetkező szűréseket és a befogásos kromatográfiát.

A zavarosság csökkentése a legfontosabb igény, melyet az előtisztítási lépés fejlesztésével kapcsolatban támasztanak. Számos IgGl vagy IgG2 antitesteket (pl. bevacizumab, trastuzumab és denosumab) expresszáló sejttenyészet esetén nő a zavarosság a befogásos kromatográfiás 10 oszlopról eluált, koncentrált oldatokban. A találmány szerinti kísérletekben megfigyeltük, hogy a zavarosság csökkenése az előtisztítási lépésben megelőzi a befogásos kromatográfiát követő zavarossá válást, ha az eljárás lépéseit megszakítás nélkül hajtjuk végre. A protein A eluatumokban nem észleltük a zavarosság újbóli megjelenését.

4. b táblázat: A pDADMAC koncentráció hatása a zavarosság csökkenésére különböző sejttenyészet sarzsok esetében

1926404

Zavarosság [FNU] % csökkenés
pDADMAC [% m/v]	0	0.0250	0.0375	0.0500	0.0750	0.0900
1. sejttenyészet	28,10	22,80	8,53	5,57	2,92	2,85
0	18,86	69,64	80,18	89,61	89,86
2. sejttenyészet	19,90	10,30	3,20	Not	2,55	2,46
0	48,24	83,92	done	87,19	87,64
3. sejttenyészet	29,10	8,95	8,50	3,50	3,25	3,40
0	69,24	70,79	87,97	88,83	88,32
4. sejttenyészet	24,90	9,68	6,74	2,30	2,18	2,38
0	61,12	72,93	90,76	91,25	90,44
5. sejttenyészet	20,80	17,10	15,20	5,01	3,18	3,10
0	17,79	26,92	75,91	84,71	85,10
Átlagérték %-os csökkenés	0	48,93	64,84	83,70	88,32	88,27

A 4. b táblázatban bemutatott eredmények alátámasztják pDADMAC flokkulálószerként való alkalmazását. 0,05% (m/v)-kal a sejttenyészetekben az átlagos csökkenés 80% fölötti volt. 0,075% (m/v) esetén az átlagos csökkenés 88% körüli. A nagyobb koncentrációk (0,09% m/v) további csökkenést nem hoztak.

Egy másik vizsgálatban a pDADMAC-kal való flokkulálást (rákövetkező mélységi szűrés nélkül) vizsgáltuk nagy sűrűségű sejttenyészettel elsődleges tisztítására. A korábbi kísérletekkel ellentétben a sejttenyészetekböl származó minták egy kiválasztott, bevacizumabot expresszáló 1000 L-es fermentációs lépték aliquotjai voltak (sejtsűrűség 9,3 x 10⁶ sejt/ml).

A kísérleteket a lépések következő sorrendje szerint hajtottuk végre:

- 40 ml-es aliquot begyűjtése a fermentléböl (50 ml-es csövek)

Flokkulálószer hozzáadása különböző koncentrációkban

Inkubáció 15 percen át szobahőmérsékleten, óvatos keverés mellett Centrifugálás: 3000 rpm / 2000 g / 5 perc

Mikroszürés (Millex Filter, 0,2 pm, EMD Millipore)

- A zavarosság azonnali vizsgálata

A mab koncentráció, HCDNS és HCP későbbi analízise

Az 5. táblázat összefoglalja ennek a vizsgálatnak az eredményeit. A zavarosságot Hach Turbidimeter 2100Q-val határoztuk meg és a korábbi kísérletekkel ellentétben nefelometriás zavarosság egységekben (NTU) fejeztük ki. A műszer a minta által szórt fényt méri a fehér fény 20 beesési szögétől számított 90-fokos szögben.

5. táblázat: pDADMAC dózis meghatározása

pDADMAC [% m/v]	0	0,0250	0,0375	0,0500	0,0750	0,1000
pDADMAC [pg/sejt]	0	27	40.5	54	81	108
mab konc, [mg/ml]	1,14	1,14	1,15	1,15	1,12	1,20
HCDNS [ng/mg]	39500	3,61	1,54	0,58	0,49	1,76
% csökkenés	0	99,99	100	100	100	100
zavarosság [NTU]	43,70	12,96	3,30	1,35	1,63	1,94
% csökkenés	0	70,34	92,45	96,91	96,27	95,56
HCP [pg/mg]	2140	1960	1990	1970	1990	1820
% csökkenés	0	8,41	7,01	7,94	7,01	14,95

1926404

Αζ 5. táblázatban bemutatott eredmények megerősítik a HCDNS, a zavarosság és a HCP csökkenésével kapcsolatos korábbi eredményeket (lásd 1. a, 2. a, 4. a és 4. b táblázatok). A pDADMAC optimális dózisát úgy definiáljuk, mint a polimernek azt a minimális koncentrációját, amely a felülúszó zavarosságának szignifikáns csökkenéséhez vezet. A pDADMAC nagyobb koncentrációban való hozzáadása nem biztos, hogy előnyös. A nagyobb koncentrációk csupán kicsivel alacsonyabb zavarossági szintet eredményeznek (lásd 5. táblázat, 0,1 % m/v pDADMAC) vagy esetlegesen a kívánt termék koncentrációjának enyhe csökkenéséhez vezetnek a felülúszóban (ezt 0,1 % m/v pDADMAC koncentrációig nem észleltük) vagy elősegítik a zavarosság gyorsabb visszatérését (lásd 6. táblázat). A nagyobb koncentrációk kisebb flokkulumok képződéséhez vezethetnek, amik átjuthatnak a mélységi szűrön. Az optimális pDADMAC koncentráció a 0,0375 - 0,075 % (m/v) tartományban van. Ez mintegy 40 - 80 pg/sejt értéket jelent a jelen kísérleti körülmények mellett. Ezen a tartományon belül a HCDNS csökkenés 100%-os volt, a zavarosság csökkenés 92-97 % körüli, a HCP csökkenés 7-8 %. Hangsúlyozandó, hogy a flokkulálás nem okozott kimutatható mab veszteséget.

Egy további kísérletet végeztünk ugyanazokkal a kiindulási anyagokkal, amelyek az 5. táblázat szerinti kísérletben használtunk, ahol a flokkulálás, centrifugálás és mikroszürés elvégzése után a zavarosság stabilitását monitoroztuk. Ugyanazokat a módszereket alkalmaztuk, amelyeket az 1. példánál leírtunk. A pDADMAC három különböző koncentrációjával (0,0375 % m/v, 0,075 % m/v és 0,09 % m/v) végzett flokkulálást követően a steril, szűrt felülúszó zavarosságát mértük szobahőmérsékleten egy 24 órás periódusban. A párhuzamos vizsgálatokból kiderült, hogy a centrifugálás és a mikroszürés nem távolította el a maradék szabad pDADMAC-ot. Ezzel ellentétben a kromatográfiás lépések (pl. protein A) kvantitatívan eltávolította a polimert. A 6. táblázat a stabilitási kísérletek eredményeit és a zavarosság újbóli megjelenésének kinetikáját mutatja.

6. táblázat: A szűrt tenyésztő közegek pDADMAC-kal történő flokkulálást követő stabilitása

Zavarosság [FNU] / % növekedés______

Idő pDADMAC koncentráció [% m/v] [h] 0,0375 0,0750 0,0900

1,5

5,48/0

6,09/11,1

3,09/0

3,16/2,3

3,65/0

4,64 /27,1

3	6,85/25,0	3,91/26,5	6,49 / 77,8
8	6,95/26,8	7,41/139,8	11,9/126,0
24	8,12/48,2	14,7/375,7	21,5/489,0

Meglepő módon a zavarosság szintje három óra elteltével nőtt, ami folyamatos kicsapódást jelez. A hatás erősen függ a pDADMAC koncentrációjától. A zavarosság növekedése 3 óra után 25% 0,0375 % (m/v) esetében, azonban 78% körüli 0,09 % (m/v) esetén. 24 óra után a 5 zavarosság a legnagyobb pDADMAC koncentrációnál elérte a nem flokkulált (kontroll) értékeket (lásd 4. b táblázat). A zavarosság flokkulálás általi kezdeti csökkenése megszűnt.

Ezekből az eredményekből arra a következtetésre jutottunk, hogy 1) a flokkulált és szűrt felülúszók gyors további feldolgozást igényelnek (mélységi szűrés, protein A kromatográfía) 10 és 2) a pDADMAC legalacsonyabb aktív koncentrációját kell kiválasztani. A 0,075 % (m/v)os felülúszó stabilitása, összehasonlítva a 0,0375% (m/v)-oséval sokkal jobb, kismértékű növekedést mutat 8 óráig. Ez egy elfogadható időablak a rutin termelés számára.

4. példa: Mélységi szűrési kísérletek flokkulálással és anélkül

Amikor fermentációs folyadékok flokkulálálást nagy léptékben (5000 L) 0,0375 - 0,075 % (m/v) pDADMAC-kal végeztük, akkor a sejtszeparátor, amely a pelyheket és sejteket eltávolítja, nagy terhelést kapott és a futtatást követő tisztítás meglehetősen időigényessé vált. Ugyanez igaz a fermentorra is, amit a maradék pelyhektől kellett mentesíteni. Emiatt a további kísérletek során alternatív előtisztítási stratégiákat teszteltünk ennek a hátránynak a 20 leküzdésére.

Elsőként azt vizsgáltuk, hogy egy flokkulálási lépés elhagyható-e és helyettesíthetö-e mélységi szűrök különböző összeállításaival, beleértve a kétlépésés mélységi szűrést. Bár számos jól bevált szűrőrendszert, beleértve előszűrőket teszteltünk számos kombinációban, az eredmények 25 nem voltak kielégítőek, vagyis a sejtszeparálást és mélységi szűrést követően a zavarosság 10 FNU körüli maradt és az ezt követő kicsapódás a protein A eluátumokban 30 FNU körüli zavarossággal jelentkezett a legjobb szűrő-összeállítás esetén. A mélységi szűrök nem csökkentették továbbá a HCDNS-t és a HCP-t.

Másodszor, vizsgáltuk azt, hogy elhagyható-e a flokkulálást követő szeparálás, amikor csak mélységi szűrőket használunk. Egyes szűrő-összeállítások valóban megfelelő módon tisztították a flokkulált sejttenyésztő közeget egy elfogadhatóan alacsony átfolyásos zavarosságra (1-2 FNU). Bár ez a stratégia ígéretes tiszítást eredményez, a szükséges 5 szüröméretek és feldolgozási idők viszonylagok nagyok és jelentős gazdaságossági tényezővé válnak. Ezt a stratégiát nem követtük tovább.

5. példa: Flokkulálásos kísérletek a tenyészet sejtmentes felülúszójával

Egy előnyös előtisztítási stratégiát dolgoztunk ki ebben a példában. Az előtisztítási lépések 10 sorrendje a következő volt (lásd a 2. B ábrát is):

Sejttenyésztö közeg aratása Sejtszeparálás/centrifugálás - Flokkulálás pDADMAC-kal (0,0375% m/v - 0,075% m/v)

Mélységi szűrés

- Mikroszürés (0,2 pm)

Protein A kromatográfia (MabSelect SuRe LX)

A 2. és 3. példákhoz képest a flokkulálást a sejtek szeparálása/centrifugálás és ezt azt követő mélységi szűrés után hajtottuk végre. Ezt a módszert 1 L, 10 L, 100 L és 5000 L sejttenyésztö közeggel (bevacizumab) hajtottuk végre és a mélységi szűrés számos paraméterét 20 összehasonlítottuk és optimalizáltuk. A felülúszó zavarossága a flokkulálást megelőzően a 30100 FNU tartományban volt az 5000 L-es lépték esetében.

A következő mélységi szűrő típusokat vizsgáltuk:

Pall Supercap 50 PDH4

Pali Supercap 50 PDE2

- Pali Supercap 50 PDD1

Pali Supercap 50 PEK.M

Pali Supercap 50 PEKX < - 3M BC25 90ZB08A

V

Φ

M σ>

H

1926404

3M BV8 Emphaze ΑΕΧ hybrid purifyer

Ismét megvizsgáltuk a HCDNS, a zavarosság, a HCP és a mab koncentrációkat (a módszereket lásd az előző példákban) és ezen eredmények alapján a PEKM, PDD1 és a PDE2 voltak a legalkalmasabbak a flokkulált felülüszók tisztítására, elfogadható áron. Kétrétegű 5 kialakításuknak köszönhetően a PDD1 és PDE2 robosztusabb módszernek mutatkoztak, mint a

PEKM (egyrétegű) és ebből következően ezek voltak az előnyös mélységi szűrők a pelyhek eltávolítására. Az átfolyosás zavarosság a mélységi szűrőket követően 1-2 FNU volt. A szűrési idő 80 - 240 perc, 250-500 L/m² terhelés mellett. A PDD1 és a PDE2 szűrletei egyaránt csak egy enyhe zavarosság-növekedést mutattak egy 24 órás periódusban és mindkét szűrletet elég 10 stabilnak találtuk a protein A-n történő további feldolgozásra.

Következtetés: A sejtmentes felülúszóval végzett flokkulálás (szeparálást/centrifugálást követően) előnyös előtisztítási stratégiának bizonyult és jól alkalmazható immunoglobulinok nagy léptékű termelésére. A flokkulált felülúszót, aminek zavarossága 30-100 FNU volt, sikeresen feldolgoztuk kétrétegű mélységi szűrőkkel, mint a PDD1 és PDE2. Az ilyen típusú 15 szűrök legalább 500 L/m²-rel terhelhetők. Nagyobb zavarosságú (>100 FNU) felülúszók esetén a hatékony szűrési felület növelhető, hogy elkerüljük a meghosszabbodott feldolgozási időt. A végül kiválasztott pDADMAC koncentráció 0,0375 % (m/v) volt és ez teljes összhangban volt a kisléptékű flokkulálásos kísérletekkel, amelyeket sejtek jelenlétében, mélységi szűrés nélkül végeztünk (1-3. példa).

6. példa: Nagyobb IgG koncentrációjú sejttenyészet felülúszók flokkulálása különböző pDADMAC koncentrációk alkalmazásával (7. táblázat)

Ebben a kísérletben két különböző kisléptékű sejttenyészetet hasonlítottunk össze, amelyekben különböző mennyiségű IgG2 antitest (denosumab) halmozódott fel. A tenyésztési térfogat 10 25 L volt és a kiindulási anyaghoz két 10 L-es tenyészetet egyesítettünk. A tenyészetet rendre 8 és nap után arattuk le, vagy állítotuk le. Az egyesített 8 napos tenyészetben 3,86 mg/ml IgG, 42,4 pg/ml HCDNS és 0,454 mg/ml HCP volt. A 10 napos tenyészetben 5,79 mg/ml IgG (+50%), 85 pg/ml HCDNS (+102%) és 0,506 mg/ml HCP (+11%) volt. A sejttenyészet felülúszóját centrifugáltuk (10 percig, 4600 rpm-en) és flokkuláltuk (15 perc inkubálás), 30 ahogyan azt az 1. példában leírtuk.

7. táblázat: Különböző kiindulási anyagok összehasonlítása a szennyezők csökkentésére pDADMAC-os flokkulálással

pDADMAC [% m/v]	1. tenyészet / 8 nap / 3,86 mg/ml lgG2	2. tenyészet / 10 nap / 5,79 mg/ml lgG2
HCDNS [ng/ml] (% csökk.)	HCP [Rg/ml] (% csökk.)	Zavarosság [FNU] (% csökk.)	HCDNS [ng/ml] (% csökk.)	HCP [Rg/ml] (% csökk.)	Zavarosság [FNU] (% csökk.)
0,0000	40100	424	55,90	80700	525	101,00
(100,00)	(100,00)	(100,00)	(100,00)	(100,00)	(100,00)
0,0100	6150	492	148,00	18600	511	238,00
(84,66)	(-15,22)	(-164,76)	(76,95)	(2,67)	(-135,64)
0,0250	0,495	427	2,02	3,250	469	3,93
(100,00)	(-0,71)	(96,39)	(100,00)	(10,67)	(96,11)
0,0375	0,015 (100,00)	365 (13,92)	1,51 (97,30)	0,091 (100,00)	406 (22,67)	2,29 (97,73)
0,0750	0,011 (100,00)	330 (22,17)	1,54 (97,25)	0,012 (100,00)	376 (28,38)	1,88 (98,14)
0,0900	0,023 (100,00)	354 (16,51)	1,84 (96,71)	0,028 (100,00)	374 (28,76)	1,98 (98,04)
0,1000	0,035 (100,00)	322 (24,06)	1,89 (96,62)	0,040 (100,00)	378 (28,00)	2,03 (97,99)

A két nagyon különböző tenyészet meglepő módon meglehetősen hasonlóan viselkedett a flokkulálásos kísérletekben. A pDADMAC nagy HCDNS eltávolító potenciálját még egyszer megerősítettük. Már 0,025% pDADMAC-kal 100% (mintegy 5 nagyságrend) volt a HCDNS csökkenése. A zavarosságot tekintve a csökkenés elérte a 97-98%-ot 0,0375% és 0,075% pDADMAC esetén. Ebben a tartományban a HCP rendre 22% és 28%-kal csökkent. A 10 flokkulálásos előtisztítási stratégia meglepő módon meglehetősen robosztusnak bizonyult tekintettel az antitest típusára, a sejtsűrüségre és a mab titerre. Nem szükséges tenyészetspecifikus sztöchiometrikus adagolás.

7. példa: A flokkulálás hatása a szennnyezőkre protein A affinitás kötést követően (8-10.

táblázat)

Ez a példa a flokkulálás maradék szennyezőkre gyakorolt hatását mutatja be a protein A nj Φ

CN eluátumban. A kiindulási anyagok trastuzumabot (IgGl) expresszáló félüzemi léptékű (200 L, 8. táblázat) és bevacizumabot expresszáló nagy léptékű (5000 L, 9. táblázat) sejttenyészetek e©

M »

H voltak. A protein A kromatográfiát a 8.2 példában leírtak szerint végeztük el. A pDADMAC koncentrációja 0,0375 % (m/v) volt és a mélységi szűrő Pall Supercap 50 PDE2 volt.

8. táblázat: Szennyezők csökkentése protein A eluátumokban előzetes pDADMAC flokkulálással

Előtisztítási lépések	HCDNS [pg/mg] (% csökkenés)	HCP [ng/mg] (% csökkenés)	Zavarosság [FNU] (% csökkenés)
Centrifugálás + mélységi szűrés (kontroll)	889 (0)	394 (0)	42,9 (0)
Centrifugálás + flokkulálás + mélységi szűrés	76 (91,5)	204 (48,2)	8,8 (79,5)

A protein A eluátum IgG koncentrációja 20,36 mg/ml volt a nem flokkuláltatott kontroll és 10 23,32 mg/ml a flokkulálásos eljárás esetén. A kontroll eljárás során flokkulálást nem hajtottunk végre és a felülúszokat centrifugálás után közvetlenül mélységi szűrésnek és protein A kromatográfiának vetettük alá. A protein A eluátumok szignifikáns kicsapódást mutattak, a zavarosság 43 FNU körül volt a kontroll esetében. Ezzel ellentétben a pDADMAC-kal végrehajtott flokkulálásnál a zavarosság jelentősen, mintegy 80%-kal csökkent. A HCDNS 15 több, mint 90%-kal csökkent nagyon alacsony, 0,076 ppm-es szintre, ami nehezen kimutatható.

A maradék HCP kiemelkedőbb volt, azaz 204 ppm, ami visszatükrözi a kiindulási anyag 2-3 nagyságrenddel nagyobb terhelését. Ennek a koncentrációja kb. felére csökkent a kontrolihoz képest. Ezek az eredmények egyértelműen demonstrálják pDADMAC flokkulálás jelentős pozitív hatását Protein A eluátumok esetén.

A következő 9. a és 9. b táblázatokban rutin gyártásközti ellenőrző adatokat mutatunk be két termelési sarzsra (5000 L bevacizumab), hogy tovább szemléltessük a szennyezők meglepően nagy csökkenését a protein A kromatográfia előtt és után. A protein A kromatográfia két egymást követő futtatásban valósult meg a teljes térfogat 50%-ával azért, hogy csökkentsük a 25 költséges gyanta oszloptérfogatát. Az ezt követő vírusinaktivációs inkubációkat a 9.3 példában leírtak szerint hajtottuk végre.

9. a táblázat: Nagy léptékű eljárás pDADMAC flokkulálással: HCDNS koncentrációk

	1. sarzs	2. sarzs	átlagérték
Lépés	IgG [mg/ml]	HCDNS [ng/mg]	IgG [mg/ml]	HCDNS [ng/mg]	HCDNS [%]
Szeparátum	1,5	87000	1,6	105250	100,0
Centrifugálás	1,6	56500	1,6	57000	59,0
Flokkulálás	1,6	n.d.	1,6	150	0,16
Szűrés	1,5	n.d.	1,5	n.d.	0,00
Protein A (1)*	16,9	n.d.	18,4	n.d.	0,00
Protein A (2)*	17,0	n.d.	18,4	n.d.
Inaktiválás (1)	14,6	n.d.	14,5	n.d.	0,00
Inaktiválás (2)	15,0	n.d.	15,1	n.d.

* A protein A kromatográfia két egymást követő futtatásban valósult meg a teljes térfogat 50% ával

n.d.: nem detektálható, a vizsgálati módszer kimutatási határa alatti

9. b táblázat: Nagy léptékű eljárás pDADMAC flokkulálással: HCP koncentrációk

	1. sarzs	2. sarzs	átlagérték
Lépés	IgG [mg/ml]	HCP [pg/mg]	IgG [mg/ml]	HCP [pg/mg]	HCP [%]
Aratás után	1,5	778,1	1,6	871,4	100,0
Centrifugálás	1,6	839,0	1,6	921,9	106,8
Flokkulálás	1,6	740,4	1,6	811,2	94,1
Szűrés	1,5	662,2	1,5	744,9	85,3
Protein A (1)*	16,9	0,269	18,4	0,252	0,028
Protein A (2)*	17,0	0,255	18,4	0,160
Inaktiválás (1)	14,6	0,259	14,5	0,225	0,027
Inaktiválás (2)	15,0	0,270	15,1	0,152

HCDNS a flokkulálást követően nehezen volt kimutatható és az ezt követő lépések során a kimutatási határ alatt maradt (9. a táblázat). A flokkulálás és a mélységi szűrés csupán mintegy 15%-kal csökkentette a HCP-t (9. b táblázat). A protein A kromatográfia azonban, nagy IgGFc szelektivitásának köszönhetően, több, mint 99,9%-kal csökkenetette a HCP szennyezőket.

Ennek ellenére a maradék, protein A kromatográfia utáni 160-270 ppm HCP koncentráció további tisztítási lépések szükségességét jelzi, legalább a humán felhasználású terápiás antitest esetén.

10. táblázat: A lehasadó protein A összehasonlítása a különböző eljárásoknál

A 10. táblázat szerinti kísérletekben három különböző eljárást hasonlítottunk össze a protein A eluátumokban lévő lehasadó protein A szempontjából. A C eljárás az az eljárás, amely jelen 5 találmány szerint alkalmazza a pDADMAC flokkulálást ugyanolyan feltételek mellett, amiket a 7. példában/8. táblázatban leírtunk (200 L trastuzumab). A két futtatás eredményeit összehasonlítottuk a korábban kialakított eljárással (B eljárás), amely anioncsere átfolyó kromatográfiát alkalmaz a protein A lépést megelőzően. Az A eljárás egy további, előtisztítási lépés nélküli kontroll (kivéve a centrifugálást ás a szűrést). Az A és B eljárásokat a 10 WO2015135884 sz. bejelentés ismerteti. Minden eljárást szobahőmérsékleten végeztünk. A protein A kromatográfiát a 8.2 példában leírtak szerint hajtottuk végre.

Eljárás	Előtisztítási lépés	Kimosódó protein A a protein A eluátumban
1. futtatás [ng/mg]	2. futtatás [ng/mg]	átlagérték [%]
A	Nincs	25,1	21,6	100
B	átfolyó Nuvia Q	10,3	7,8	39
C	pDADMAC flokkulálás	5,8	3,8	21

A eljárás: sejtek szeparálása —+ mélységi szűrés mikroszürés —► protein A

B eljárás: sejtek szeparálása mélységi szűrés —» mikroszürés —> anioncsere kromatográfía (Nuvia Q, átfolyásos) —» protein A (leírva: WO2015135884)

C eljárás: sejtek szeparálása flokkulálás (pDADMAC) —* mélységi szűrés —» mikroszürés —+ protein A

AC eljárással kimosódott protein A szignifikásan alacsonyabb volt, mint a B eljárással, amely már egy fontos előrelépés volt az alacsonyabb protein A lehasadáss felé a kontroll A eljárással összevetve. A C eljárásban a kimosódott fehérje csökkenése 48% körüli volt a B eljárással összevetve és 79% körüli az A eljárással összevetve. Következésképpen, a jelentős HCDNS és zavarosság csökkenés mellett a pDADMAC flokkulálás jelentős mértékben tovább csökkenti a lahasadó protein A-t.

1926404

8. példa: Downstream eljárás - Előtisztított sejttenyészetek felülúszójából származó immunoglobulin tisztítása

A következőkben bemutatott módszereknél leírjuk, hogy amit kis léptékben kifejlesztettünk, azt hogyan alkalmaztuk először bevacizumab (IgG 1) 100 L-es félüzemi eljárásában. Ugyanezt 5 az eljárást csupán néhány átalakítással később sikerrel léptéknöveltük 5000 L-re. További kisebb adaptációkat követően ezt az eljárást trastuzumab (IgGl) és densosumab (IgG2) esetén is bevezettük.

8.1 példa: A kromatográfiás gyanta kiválasztása (11, táblázat)

A befogó, köztes és finomtisztítási lépésekhez rendszerint alkalmazott kromatográfiás közeg 10 széleskörű tesztelését követően, amelyet a WO2015135884 sz. bejelentés ismertet, a következő kromatográfiás gyantákat választottuk ki az immunoglobulinok downstream feldolgozására (11. táblázat).

11. táblázat: Kiválasztott kromatográfiás gyanták

Eljárási lépés	Gyanta	Típus	Ligandum	Beszállító
Befogó	MabSelect SuRe LX	Affinitás	Alkáli-stabilizált protein A származék	GE Healthcare
Köztes	Poros 50 HS	CEX	Szulfopropil (SP)	Applied Biosystems
Finomtisztítás	Capto Adhere	MMC	N-benzil-N-metiletanolamin	GE Healthcare

2 6404

CEX = kationcserélő kromatográfia; MMC = kevert módú kromatográfia

A kromatográfiás futtatásokat Akta Purifier System (GE Healthcare) alkalmazásával, szobahőmérsékleten hajtottuk végre.

8.2 példa: Protein A kromatográfia

A protein A kötő kromatográfiát MabSelect SuRe LX-szel végeztük el (11. táblázat). A mintát 20 a mélységi szűrést és mikroszürést követően vettük a flokkulált felülúszóból, ahogyan azt az 5.

példában leírtuk. Az oszlopméret 20 cm átmérő x 10,4 cm töltetágy magasság (töltettérfogat mintegy 3,3 L). A protein A oszlopot 20 mM Trisz-acetát pufferrel (pH 7,2) ekvilibráltuk. A tennék oldatát (mintegy 49,5 L) 15,8 - 40,6 fehérje/L gyanta terheléssel vittük fel. Az oszlopot ekvilibráló puffenel (2 CV) mostuk, amelyet 40 mM Na-foszfát, 1,5 M NaCl, 2 M karbamid, 10 mM EDTA követett, pH 7,4 értéken. Az elúciót 100 mM Na-citráttal, pH 3,5 értéken végeztük. Az áramlási sebesség 210 cm/óra volt. A MabSelect SuRe LX gyanta regenerálását 5 ellentétes irányú mosással végeztük, (i) 0,2 M NaOH (2 CV), (ii) WFI (2 CV), 3,5% ecetsav, 100 mM Na-szulfát (2 CV) és (iii) WFI (2 CV) egymást követő alkalmazásával. Az oszlopot a következő futtatásra újra ekvilibráltuk vagy 20%-os etanolban tároltuk. A kitermelés 94-98% között volt.

8.3 példa: Vírus inaktiválás

Ahogyan azt az 1. és 2. ábra mutatja, a vírus inaktiválási lépésre a protein A affinitás kromatográfiát követően kerül sor. Az affinitás mátrixról alacsony pH-η történő elúció előnyös. Egy ilyen vizes savas környezetben számos vírus, különösen a burokkal rendelkezők, instabilak és szétesnek. A jelen találmány céljaira kifejlesztett protein A módszer olyan eluátumot hoz létre, amelynek pH-ja 3,5 (lásd 8.2 példa). A monoklonális antitestet 100 mM

Na-citrát pufferben, pH 3,5-en eluáltuk a protein A oszlopról közvetlenül a vírus inaktivációs A tartályba. Az eluátumot WFI-fel kb. 2-szeresére hígítottuk közvetlenül az A tartályban. Az oldat pH-ját ellenőriztük és szükség esetén lOOmM citromsavval visszaállítottuk 3,5-re és az oldatot ezt követően a vírus inaktivációs B tartályba vittük át, ahol 65 rpm-mel 20-24° C-on, 60 percen át kevertettük. Ezután az oldat pH-ját 4,5-re állítottuk be 100 mM NaOH-dal, hogy 20 ezzel biztosítsuk a rákövetkező kationcserélö kromatográfiás lépés kiindulási feltételeit.

8.4 példa: Kationcserélő kromatográfia Poros 50 HS-sel

Az olyan szennyezők, mint a HCP és kimosódó protein A és a termékkel kapcsolatos variánsok, mint a töltésvariánsok és aggregátumok elválasztását köztes lépésként erős kationcserélő 25 kromatográfiával, szulfopropil (SP) ligandumokkal hajtottuk végre (11. táblázat). A Poros 50

HS gyantával (dimenziók = 14 cm átmérő x 41 cm töltetágy magasság, töltettérfogat mintegy 6,3 L) töltött oszlopot (i) WFI (injekcióhoz való víz, 2 CV) és (ii) 20 mM Na-citrát, pH 4,9 (2 CV) egymást követő alkalmazásával ekvilibráltuk. A vírus inaktiválás és minta beállításai (pH 4,5) után nyert termék oldatát a 8.3 példában leírtak szerint mintegy 7,3 - 17,1 g fehérje/L 30 gyanta értékkel vittük fel az oszlopra, áthaladva egy 0,45 pm-es Kleenpak Nova előszűrőn (Pali G> r ® π cn

2 6 404

Corporation). Az oszlopot WFI-vel (1 CV) and ekvilibrációs pufferrel (2 CV) mostuk a gradiens elúció előtt. A gradiens két részből áll, amelyeknek meredeksége különböző. A gradiens 20 mM Na-citrát (pH 4,9, A puffer) és 40 mM Na-foszfát (pH 7,2, B puffer) következő arányban és sorrendben történő keverésével jön létre: (i) 100% A (0,2 CV), (ii) lineáris gradiens 40% A5 ig + 60% B (2 CV); (iii) lineáris gradiens 100% B-ig (10 CV); (iv) 100% B (2 CV). Az áramlási sebesség 75 cm/óra a gradiens során, egyébként 150 cm/óra. Az eluátumot frakciókra választottuk szét, hogy specifikus összeöntést tudjunk biztosítani. A gradiens elúció során a frakciók gyűjtése akkor keződött, amikor az A280 elérte a > 0,1 AU értéket. A frakció térfogata 2 L körüli volt. Összesen mintegy 20 frakciót gyűjtöttünk. A Poros 50 HS gyanta regenerálását 10 (i) 1 M NaCl-dal (2 CV) és (ii) 1M NaOH (2 CV)-dal való, egymást követő mosás révén hajtottuk végre. Az oszlopot ezt követően 10 mM NaOH-ban tároltuk. A kitermelés a kiválasztott összeöntött frakciókban mintegy 62-68% volt a termékkel kapcsolatos szennyezők szignifikáns mennyiségének eltávolítása miatt.

8.5 példa: Kevert módú kromatográfia Capto Adhere-rel

A végső tisztítási lépést Capto Adhere kevert módú gyantával végeztük el, amely N-benzil-Nmetil-etanolamin ligandumot alkalmaz (11. táblázat). A ligandum pozitív töltésű csoportokat hordoz és ennek következtében a hidrofób kölcsönhatások mellett anioncsere funkciókat is biztosít. A kromatográfia képes a szennyezők maradékát, mint a HCDNS, a HCP és bázikus 20 töltésvariánsok, csökkentésére. A maradék lehasadó protein A, a termék aggregátumok és termék fragmensek szintén eltávolíthatók ezzel a lépéssel. A Capto Adhere tisztítási lépést kötő módban hajtottuk végre, amely a kiválasztott végső pufferre történő puffercsere előnyét nyújtja.

A Poros 50 HS összeöntött frakciók pH-ját a 8.4 példában leírt eljárásokat követően 100 mM NaOH hozzáadásával pH 7,2-re állítottuk be. A töltött oszlop mérete 14 cm átmérő x 23 cm 25 töltetágy magasság (a töltettérfogat mintegy 3,5 L). A gyantát 50,48 mM Na-foszfáttal, pH 7,2n (3 CV) ekvilibráltuk. A termék oldatát 6,3 - 17,8 g fehérje/L gyanta értékkel vittük fel az oszlopra, amelyet ekvilibráló puffer (3 CV) követett. Az elúciót 50,48 mM Na-foszfáttal, pH 5,0-n végeztük. Az áramlási sebesség 240 cm/óra volt. A kitermelés a 87 - 98% közötti tartományban volt. Az oszlopot 2 M NaCl + 100 mM citromsavai (2 CV) és 1 M NaOH-dal (2 30 CV), fordított áramlással regeneráltuk.

fcöi?9cex

8.6 példa: Vírusszürés

A végső vírusmentesítési lépést a nanoszürés adja és ez a legnagyobb körültekintést igénylő és legmegbízhatóbb víruseltávolítási módszer, amely nanométeres tartományban, méretkizárás alapján működik. A vírusszürésre közvetlenül a 8.5 példa szerinti Capto Adhere eluátumot 5 alkalmazó kevert módú kromatográfiát követően került sor a pH 6,2-re, Na-foszfáttal történő beállítása után. A vírusokat eltávolító szűrést szobahőmérsékleten Viresolve Pro Modus 1.1 készülékkel (EMD Millipore) QuattroFlow 150 diafragma pumpa alkalmazásával végeztük. A vírusszürő elé 0,1 pm pórusméretü Opticap XL 150 PES szűrőt (EMD Millipore) helyeztünk annak érdekében, hogy a vírusszürő aggregátumok általi eltömődését elkerüljük. A szűrőket 1,5 10 L 50,48 mM Na-foszfát pufferrel, pH 6,2-n kondicionáltuk. A szűrési folyamat során a nyomás értéke 2 ± 0,2 bar volt. A 500-600 L/m² értékkel való terhelést követően mintegy 0,5-1 L térfogatú 50,48 mM Na-foszfát puffért (pH 6,2) használtunk a maradék mab szűrőállomásból történő kimosására. A vírusszürő integritását 3,4 bar nyomáson, 1 percig tartó teszttel ellenőriztük.

8.7 példa: Tangenciális áramlású ultraszürés/diaszürés (TF-UF/DF)

A végső ultraszürési/diaszűrési lépés szerepe a fehérjeoldat koncentrációjának beállítása és ha szükséges, egy puffercsere végrehajtása a hatóanyag formulációs pufferébe. A példa szerinti eljárásban a puffercserét már a kevert módú kromatográfia során végrehajtottuk, amit a kötő mód lehetővé tett (lásd 8.5 példa). A puffer mellett továbbá a hatóanyag formulációhoz egyéb 20 segédanyagok, úgymint a felületaktív anyagok, stabilizálószerek és/vagy kriokonzerválószerek is hozzáadhatok diaszürés révén. Alternatívaként a tömény mab oldatot egészítik ki ezzekkel az anyagokkal.

A 8.6 példa szerinti nanoszürt termék oldatát az UF/DF berendezés tartályába gyűjtöttük és Omega Centrasette membránkazetta (Pali Corporation, 30 kD vágási érték) alkalmazásával kb. 25 40 +/- 2 g/L-re koncentráltuk. A rátápláló nyomást egy QuattroFlow 150 diafragma pumpa biztosította. A transzmembrán nyomást 1 bar-ra állítottuk be, a rátápláló és a retentát nyomás rendre 1,0 és 0,6 bar volt. Ebben a lépésben mab veszteség nem volt. A termék tömény oldatát poliszorbát 20-szal és trehalózzal egészítettük ki. A mab végső hatóanyag koncentrációját 30 +/- 2 g/L-re állítottuk be. A végső mikroszürést (steril szűrést) 0,2pm Mini Kleenpak 30 szűrőkapszulával (Pali Corporation) végeztük.

Hivatkozások listája

1. R.L. Fahmer et ah, 2001 “Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: 5 Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes”, Biotechnology and

Genetic Engineering Reviews 18, 301-327

2. S.S. Farid, 2009 “Economic Drivers and Trade-Offs in Antibody Purification Processes: The future of therapeutic MAbs lies in the development of economically feasible downstream processes”, BioPharm Int. Supplements, October 2, 2009

3. M. Felo et aL, 2015 “Industrial application of impurity flocculation to streamline antibody purification processes” Pharm. Bioprocess 3(2), 115-125

4. P. Gagnon, 1996 “Purification Tools for Monoclonal Antibodies”, Validated Biosystems, Inc., 1-253

5. V. G. Kadajji and G. V. Betageri, 2011 “Water Soluble Polymers for Pharmaceutical 15 Applications”, Polymers 3, 1972-2009

6. Y (K) Kang et al., 2013 “Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes”, Biotechnol. Bioeng. 110 (11), 2928-2937

7. B. Kelly et al., 2009 “Downstream processing of monoclonal antibodies: Current practices 20 and future opportunities”, in: Process Scale Purification of Antibodies, edited by U. Gottschalk, John Wiley & Sons, Inc.

8. H.F. Liu, 2010 “Recovery and purification process development for monoclonal antibody production”, mabs Landes Biosciences 2(5), 480-499

9. H. Luo et aL, 2017 “Liquid-liquid phase separation causes high turbidity and pressure during 25 low pH elution process in Protein A chromatography”, J. Chromatogr. A, 1488, 57-67.

10. Τ. McNemey et al., 2015, “PDADMAC flocculation of Chinese hamster ovary cells: Enabling a centrifuge-less harvest process for monoclonal antibodies” mAb (Amgen) 7(2), 413427

11. A.A. Shukla et al., 2005, “Strategies To Address Aggregation During Protein A Chromatography” BioProcess International, May 2005, 36-44.

12. N. Singh et al., 2016, “Clarification Technologies for Monoclonal Antibody Manufacturing Processes: Current State and Future Perspectives”, Eur. J. Biochem. 192, 767-775

13. W003002713

14. W02001150110

15. W02007035283

16. W02008091740

17. W02008127305

18. W02010151632

19. WO2011146394

20. WO2013090820

21. WO2014004281

22. WO2014133459

23. WO2014196926

24. WO2015130222

25. WO2015135884

26. WO2016153983

27. WO2017217930

28. WO9216553

29. WO9222653

30. WO9411026

31. WO9522389

32. WO9729131

33. WO9845331

Claims

1. Sejttenyésztö közegből származó immunglobulin befogásos affinitás kromatográfiája során bekövetkező kicsapódás megelőzésére szolgáló eljárás, amely magában foglalja a következő lépéseket az alábbi sorrendben:

(b) az (a) lépésben létrejött keverék mélységi szűrése;

(c) a (b) lépésben kapott szűrlet affinitás kromatográfiája, ahol az immungloblin az affinitás kromatográfiás közeghez kötődik;

(d) az affinitás kromatográfiás közeg mosása mosópufferrel, amelynek pH-ja 5-9 és ionerőssége 0,1-5,0 mol/1; és (e) az immunglobulin eluálása az affinitás kromatográfiás gyantáról elúciós puffer használatával, amelynek pH-ja 2,5-4,5, ahol a flokkulálást előidéző vegyület a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az (a) lépés a következő lépésekből áll:

(al) a sejttenyésztö közeg centrifugálása és/vagy szűrése; és (a2) flokkulálást előidéző vegyület hozzáadása az (al) lépésben kapott felülúszóhoz vagy a szűrlethez.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a poli-diallil-dimetil-ammónium-klorid moláris tömege 10 kDa - 10 000 kDa.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a poli-diallil-dimetil-ammóniumkloridot 0,01 - 1,0 % (m/v) végső koncentrációban adagoljuk, a végső koncentráció előnyösen 0,02 - 0,1 % (m/v), a végső koncentráció még előnyösebben 0,03 - 0,08 % (m/v).

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a poli-diallil-dimetil-ammóniumklorid kivételével nem adagolunk további anyagot a flokkulálás előidézésére.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a poli-diallil-dimetil-ammóniumkloriddal végrehajtott flokkulálás során a pH vagy a vezetőképesség további módosítására nem kerül sor.

í** tfí

S UMMIWíe·

Ξ SZTNH-100391721

7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a flokkulálást kevertetés mellett, szobahőmérsékleten, legalább 5 percig, előnyösen legalább 15 percig hajtjuk végre.

8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az affinitás kromatográfía protein A kromatográfía.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a protein A kromatográfiás közeg alkáli-toleráns protein A származékot tartalmaz ligandumként, előnyösen a protein A B doménjének alkálistabilizált tetramer variánsát, térhálósított agaróz mátrixhoz kötve.

10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (b) lépés szerinti mélységi szűrésnél használt szűrő egynél több, előnyösen két réteget foglal magában.

11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (b) és (c) lépés között mikroszűrést hajtunk végre.

12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (c) lépést legfeljebb 8 órával a (b) lépést követően hajtjuk végre, előnyösen legfeljebb 3 órával később.

13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a sejttenyésztő közeget az immunglobulint expresszáló rekombináns CHO sejttenyészetből nyerjük ki.

14. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az immunglobulin IgGl vagy IgG2.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az IgGl vagy IgG2 Fc része humán.

16. Immunglobulin tisztítására vonatkozó eljárás, amely magában foglalja az előző igénypontok bármelyikében meghatározott lépéseket és amely tartalmaz egy vagy több affinitás kromatográfiát követő lépést a vírus inaktiválás, ioncsere kromatográfía, kevert módú kromatográfía, nanoszürés és ultraszűrés/diaszűrés közül.

íf**

Öí uft

M

ÍN

17. Aló. igénypont szerinti eljárás, ahol az egy vagy több további lépés során:

(f) az (e) lépés szerinti eluátumot inkubáljuk, alacsony, 2,5 - 4,5 pH-η, legalább 10 percen át, vírus inaktiválás céljából.

18. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol az ioncsere kromatográfia kationcsere kromatográfia.

19. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol az egy vagy több további lépés során:

(f) az (e) lépés szerinti eluátumot inkubáljuk, alacsony, 2,5 - 4,5 pH-η, legalább 10 percen át, vírus inaktiválás céljából;

(g) kationcsere kromatográfiát végzünk;

(h) kevert módú kromatográfiát végzünk;

(i) a (h) lépés szerinti eluátumon vagy az ebből származó és a (h) lépést követően egy vagy több további eljárási lépésben kapott keveréken nanoszűrést végzünk; és (j) az (i) lépés szerinti eluátumon vagy az ebből származó és a (i) lépést követően egy vagy több további eljárási lépésben kapott keveréken ultraszűrést/diaszürést végzünk.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol (g) és (h) kromatográfiákat kötő-eluáló módban, opcionálisan egy vagy több mosási lépést beleértve végezzük el.

21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, ahol a (g) lépés szerinti kationcsere kromatográfiát egy erős kationcsere közeggel, szulfopropil (-CH2CH2CH2SO3-) ligandummal végezzük el.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, ahol a szulfopropil (-CH2CH2CH2SO3-) térhálósított poli(sztirol-divinil-benzol) mátrixhoz kötött.

23. A 19-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (h) lépés szerinti kevert módú kromatográfiát pozitív töltésű kevert módú közeggel hajtjuk végre, amely előnyösen N-benzilN-metil-etanolamin ligandumot tartalmaz térhálósított agaróz mátrixhoz kötve.