JP2010507594A - 完全ヒト抗vegf抗体および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年10月20日に出願された米国仮出願番号第60/853,260号(出典明示により完全に本明細書の一部とされる)についての優先権を主張する。
以下の略語が、本明細書中で用いられる:ADCC、抗体依存性細胞障害活性;AMD、加齢性黄斑変性;CDC、補体依存性細胞毒性;CNV、脈絡膜新生血管;COPD、慢性閉塞性肺疾患;HUVEC、ヒト臍静脈内皮細胞;hVEGF、ヒトVEGF;mVEGF、ネズミVEGF;PD、薬力学;PK、薬物動力学;RA、関節リウマチ;RIA、放射性免疫沈降法;VEGF、血管内皮増殖因子;VEGF−R、血管内皮成長因子受容体;VHL、フォンヒッペル/リンダウ;X−反応性、交差反応性。
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、特定の抗原と結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または多特異的もしくは二重特異的抗体を含む、いずれかの免疫グロブリンを意味する。完全抗体は、2個の重鎖と2個の軽鎖を含む。各軽鎖は、可変領域と定常領域からなるが、各重鎖は、可変領域と第1、第2および第3の定常領域からなる。抗体は、ジスルフィド結合を介して互いに結合した2個の重鎖の第2および第3の定常領域からなる「Y」字の幹を有する、「Y」字型の形状を有する。「Y」の各腕は、単一の軽鎖の可変部分と定常領域に結合された、単一の重鎖の可変領域と第1の定常領域からなる。軽鎖および重鎖の可変領域が、抗原結合に関与する。両方の鎖の可変領域は、相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む軽鎖(L)CDR、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖(H)CDR)と呼ばれる3つの超可変ループを、一般に含む。この3つのCDRは、CDRと比べて高度に保存された、超可変ループを支持する足場を形成する、枠組み構造領域(FR)として知られる、フランキング・ストレッチ(flanking stretch)間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、クラス分けされる。抗体の主要なクラスは、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのクラスのいくつかは、サブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1またはlgA2に分けられる。
「Fab’」は、ヒンジ領域の一部を含む、Fab断片を意味する。
「F(ab’)2」は、Fabの二量体を意味する。
抗体に関する「Fc」は、ジスルフィド結合を介し、第2の重鎖の第2と第3の定常領域と結合した、第1の重鎖の第2と第3の定常領域からなる、抗体の部分を意味する。抗体のFc部分は、ADCCおよびCDCなどのさまざまなエフェクター機能の要因となるが、抗原結合には機能しない。
「一本鎖Fv抗体」または「scFv」は、互いに直接もしくはペプチドリンカー配列を介して連結された、軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる、改変抗体を意味する(Houston 1988)。
「一本鎖Fv−Fc抗体」または「scFv−Fc」は、抗体のFc領域に連結されたscFvからなる、改変抗体を意味する。
完全ヒト抗体は、安全性と効能に関して、ネズミ、キメラ、ヒト化抗体より、いくつかの潜在的な利点を有する。第1に、ヒト以外の残基がないことは、完全ヒト抗体が、投与後の宿主免疫応答を生じさせないようにする。第2に、完全ヒト抗体は、一般に、他の抗体型よりも低いクリアランス速度を示す。この減少したクリアランス速度は、低投薬量および低頻度の使用を可能にする。
使用直前に溶媒と組み合わせて直ぐ使用できる、皮下注射用錠剤を含む凍結乾燥粉剤などの滅菌乾燥可溶性品、注射に直ぐ使用できる滅菌懸濁剤、使用直前に賦形剤と組み合わせて直ぐに使用できる滅菌乾燥不溶性製品、および滅菌乳剤が含まれる。溶液は、水性でも、または非水系でもよい。
実施例1:hVEGF 165 に結合する抗体の創出:
hVEGF165に結合する能力を有する抗体断片パネルを同定するために、ヒト一本鎖Fv(scFv)ファージディスプレイ・ライブラリを、固定したhVEGF165に対してパニングした。パニングは、標準的なプロトコルを用いて行った(例えば、Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols: P.M. O'BrienおよびR. Aitken(編), Humana Press;「Panning of Antibody Phage-Display Libraries」、Coomber, D.W.J. , pp. 133-145、および「Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens」、Chames, P.ら、pp. 147-157を参照のこと)。
hVEGF165結合を示す、実施例1からのファージ・クローンを、マイクロプレート・ベースド・コンペティテブ・スクリーニングDELFIA(登録商標)アッセイ(Perkins Elmer, Waltham, MA)を用いて、VEGF−R1および/またはVEGF−R2に結合するhVEGF165をブロックする、その能力について試験した。
60%以上までVEGF−R1またはVEGF−R2に結合するhVEGF165を阻害する、実施例2からの2個のscFv、XPA.10.064およびXPA.10.072を、scFv−Fcおよび/またはIgG転換のために選択した。XPA.10.064およびXPA.10.072の重鎖可変領域(重鎖CDRを含む)および軽鎖可変領域(軽鎖CDRを含む)を、図1に示す。その重鎖CDR(例えば、HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と軽鎖CDR(例えば、LCDR1、LCDR2およびLCDR3)は、カバット・ナンバリング・システム(Kabat, E.A.ら、1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)により決定された。XPA.10.064およびXPA.10.072の両方のHCDR1、HCDR2そしてHCDR3は、それぞれ、配列番号:6、7および8記載のアミノ酸配列であると決定された。XPA.10.064のLCDR1、LCDR2およびLCDR3は、それぞれ、配列番号:12、13および14記載のアミノ酸配列と決定された。XPA.10.072のLCDR1、LCDR2およびLCDR3は、それぞれ、配列番号:9、10および11記載のアミノ酸配列であると決定された。
XPA.10.064およびXPA.10.072のscFv−Fcの結合親和性を、BIACORE2000とプロテインA/G(Piece)を高密度でフローセルに固定化したCM5センサーチップ(Biacore)を用いて、評価した。この試験のための希釈バッファーおよびランニングバッファーは、1:50希釈のChemiblocker(登録商標)(Ckemicon)を含むHBS−EP(Biacore)であった。抗体キャプチャー(捕捉)は、約50RU〜70RUの抗体キャプチャーを達成するため、様々な容量の希釈したXPA.10.064およびXPA.10.072のscFv−Fcを20μl/分でフローセル2(fc2)に注入して行った。抗体濃度は、約0.5μg/mlであった。sf21細胞により発現されるhVEGF165を、5分かけ、30μg/mlで、fc1およびfc2に対して15分の解離を含むKinjectの態様を用いて注入した。3倍希釈系列のhVEGF165の4個の希釈物、濃度5μg/ml(119nM)、1.667μg/ml(39.7nM)、0.55μg/ml(13.2nM)そして0.185μg/ml(4.4nM)を、調製した。リジェネレーション(再生)は、50μl/分で100mM HClを2回、各12秒で注入することで行った。データは、対照フローセルとブランク注入を二重に参照した後、Scrubber2と1:1ラングミュア・インターラクション・モデル(Langmuir interaction model)で処理した。XPA.10.064およびXPA.10.072のscFv−Fcは、hVEGF165に対して高親和性で、ほぼ同一の結合親和性を示した。
hVEGF165のVEGF−R1および/またはVEGF−R2への結合をブロックする、XPA.10.064およびXPA.10.072IgG2の能力を、CM5チップを用いたBiacore2000により評価した。
XPA.10.064およびXPA.10.072により認識されるhVEGF165エピトープがリニアであるか、それとも立体構造依存的であるかを決定するため、非還元または還元の、加熱変性組み換えhVEGF165の200ng試料3つを用い、3つの別々のSDS−PAGEゲルにおいて電気泳動にかけた。電気泳動にかけられた蛋白質は、Immulon−Pメンブレンにトランスファーされ、そして、そのブロットは、XPA.10.064 IgG、XPA.10.072 IgGまたはベバシズマブ抗体を用いてハイブリダイズされ、1μg/mlのヤギ抗ヒトIgG HRP複合二次抗体と共にインキュベートされた。結合は、増強されたケミルミネセンス(ECL)基質(Pierce)で検出された。
XPA.10.064、XPA.10.072およびベバシズマブはすべて、hVEGF165上のリニア・エピトープに結合した(図7)。
XPA.10.064およびXPA.10.072が、ベバシズマブと同じhVEGF121エピトープと結合するかどうかを決定するため、3回のELISA競合結合アッセイを、さまざまなhVEGF121変異体を用いて実施した。
これまでの突然変異分析は、VEGF残基M81、G88、Q89およびG92が、hVEGF165に対するベバシズマブ結合に重要であることを明らかにした(Fuh 2006)。これらの残基が、XPA.10.064とXPA.10.072の結合に重要であるかどうかを決定するため、以下のhVEGF121変異体を作製した:hVEGF121−M81A、hVEGF121−Q89A、hVEGF121−G92AおよびhVEGF121−G88S。変異体を、CHO−K1細胞で一過性に発現させ、そして、細胞上清を、ELISAによる結合分析のために回収した。
凍結された正常なヒト組織アレイ(TMA)は、単一色発色技術(single-color chromogenic technique)を用い、XPA.10.064とXPA.10.072の免疫組織化学(IHC)反応を評価するために用いられた。TMAは、32の正常なヒト組織型を含み、各型は、2人〜3人の異なるドナーからの組織からなる。TMAに加えて、正常なヒト肝臓、腎臓、ファローピウス管、膵臓、尿管および副腎のより多数の切片が、TMAでの染色結果を確認するために、あるいはTMAに含まれない組織に代えて用いられた。陽性対照は、UV−樹脂スライド上にスポットされたhVEGF蛋白質、および抗hVEGFウサギ・モノクローナル抗体による強い染色によって評価された、高レベルのhVEGFを発現する腎臓癌腫組織を含んだ。
最初のIHC実験に基づいて予想されたように、XPA.10.064とXPA.10.072は、似通った高い程度の局在を示し、そしてXPA.10.064は組織染色で最も大きな強度を示した(図8−9)。
XPA.10.064およびXPA.10.072 scFv−FcおよびIgG2は、HUVECの増殖をブロックする、それらの能力用について試験された。
プールされたHUVEC(Clonetics番号CC−2519)は、BulletKit−2(rhEGF、rhFGF、rhVGEF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、IGF、ヘパリン、ゲンタマイシン/アンホテリシンおよび2%FBSが補充される)を含むECGM完全培地(Clonetics番号CC−3024)中で、生育された。細胞は、T−75フラスコにて2〜3×105細胞で播種され、3〜4日目にコンフルエントに達した。コンフルエント前の単層を、PBSを用いて洗浄し、トリプシン処理し、PBSを含む完全培地で中和した。
表6:XPA.10.064、XPA.10.072およびベバシズマブによるHUVEC増殖の阻害
hVEGF165によるVEGF−R2リン酸化を阻害するXPA.10.064およびXPA.10.072の能力は、ELISAにより分析した。
溶菌産物プレートを作製するため、2〜6継代のHUVEC細胞を溶解し、EGM2完全培地(Lonza)のTCフラスコに蒔き、そして、1〜2継代生育させた。コンフルエント前の細胞をトリプシン処理し、完全培地を用いてで中和し、PBSで2回洗浄し、そして計数した。細胞を、24w形式(三重のウェル)において、完全培地中1×105細胞/ウェルで蒔き、24時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、室温のPBSで2回洗浄し、5時間0.1%BSAを含むEBM2培地(Lonza)中で枯渇させた。PBSを静かに注ぎ、細胞を、用量滴定のhVEGF165(刺激)または複合体形成前のVPA.10.064+hVEGF165、VPA.10.072+hVEGF165もしくはベバシズマブ+hVEGF165(阻害)とともに5分間インキュベートした。VPA.10.064+hVEGF165およびVPA.10.072+hVEGF165は、2×の用量滴定の抗体と2×のhVEGF165を1:1で混合し(終濃度:20ng/ml)、そして、24時間37℃でインキュベートすることにより、作製された。hVEGF165、VPA.10.064+hVEGF165およびVPA.10.072+hVEGF165を静かに注ぎ、細胞を氷冷PBSで2回洗浄した。65μg/ウェルの溶菌バッファー/ウェル(1% NP−40、20mMトリス、pH 8.0、137mM NaCI、10%グリセリン、2mM EDTA、1mM 活性オルトバナジウム酸ナトリウム、10μg/ml ロイペプチン)を加え、細胞を、必要とされるまで、30分間4℃で揺らした。
マトリゲル・プラグ・アッセイを用いて、生体内で脈管形成を阻害するXPA.10.064とXPA.10.072の能力を測定した。
6〜7週齢の雌のNU/NUマウスは、脈管形成を誘導するためのヒトVEGFを産生する、2×106DU145細胞を含む0.5mlのマトリゲルを腹部にs.c.注射された。マウスは、0日と3日目に賦形剤対照または0.1μg/kg、1μg/kg、または5mg/kgのXPA.10.064、XPA.10.072またはベバシズマブでi.p.注射された。7日目に、マウスは屠殺され、そして、マトリゲル・プラグが取り出され、測量され、撮影された。プラグは、以下のスキーム:0は、着色または明らかな血管がない;1は、着色とわずかな血管をうかがわせる;2は、黄色から赤色ではっきり識別できる血管がある;そして、3は、均一な赤もしくはピンク色の黒ずんだ血管、に基づいて、0〜3の視覚によるスコアが与えられた(図14)。プラグは、プラグの順序はばらばらにされた状態で、写真を受け取った盲検式の記録者により評価された。
マウス血清中のXPA.10.064、XPA.10.072およびベバシズマブ濃度は、最後の抗体投薬後の4日目に、ELISAにより測定した。試験したいずれの投薬量でも、3つの抗体の間には、抗体レベルに有意な差はなかった。
腫瘍成長を阻害するXPA.10.064とXPA.10.072の能力は、以前に開示されたプロトコル(Liang 2006)を用いた、A673横紋筋肉腫腫瘍増殖モデルにより試験された。培養液中で維持されたA673細胞は、コンフルエントまで生育され、次いで、回収され、そして無菌のマトリゲル(Matrigel)に再懸濁された。異種移植は、マトリゲル中の5×106個の細胞を6週間齢の雌のヌードマウスの横腹に、s.c.注射することにより樹立された。腫瘍サイズが約100mm3に達したときに、マウスを、無作為に10匹の8群にわけ、賦形剤のみ(群1)、0.5mg/kgのXPA.10.064IgG2(群2)、5mg/kgのXPA.10.064IgG2(群3)、0.5mg/kgのXPA.10.072IgG2(群4)、5mg/kgのXPA.10.072IgG2(群5)、5mg/kgのCHO.KLHIgG2(群6)、0.5mg/kgのベバシズマブ(群7)、または5mg/kgのベバシズマブ(群8)のみを用いて、18日間週に2回(総投薬6回)i.p.注射した。血液試料および組織試料は、最後の投薬後24時間、72時間および168時間で採取した。
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Claims (48)
- 1)配列番号:6、配列番号:7または配列番号:8記載の重鎖CDRアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または
2)(a)配列番号:9、配列番号:10または配列番号:11、あるいは(b)配列番号:12、配列番号:13または配列番号:14記載の軽鎖CDRアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 重鎖可変領域が、配列番号:2記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖可変領域が、配列番号:4記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 軽鎖可変領域が、配列番号:3記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 軽鎖可変領域が、配列番号:5記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片。
- IgG2定常領域をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の、抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体が、hVEGF165にKD <2.0nMでもって結合するところの、請求項1〜5のいずれか一項記載の、抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体が、ベバシズマブにより結合されるエピトープと重複する、hVEGF165上のエピトープに結合するところの、請求項1〜5のいずれか一項記載の、抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体が、hVEGF165のVEGF−R1およびVEGF−R2に対する結合をブロックするところの、請求項1〜5のいずれか一項記載の、抗体またはその抗原結合断片。
- それを必要とする被検体における脈管形成を阻害する方法であって、該被検体に、治療上の有効量の、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- それを必要とする被検体における異常な脈管形成を伴う疾患を処置する方法であって、該被検体に、治療上の有効量の、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- それを必要とする被検体におけるVEGFシグナル伝達と関係する炎症性疾患を処置する方法であって、該被検体に、治療上有効量の、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- 該疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、強皮症、慢性閉塞性肺疾患、および喘息からなる群より選択されるところの、請求項12記載の方法。
- それを必要とする被検体における湿潤型急性黄斑変性または糖尿病性網膜症を処置する方法であって、該被検体に、治療上有効量の、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- それを必要とする被検体における増大したVEGFシグナル伝達と関係する癌を処置する方法であって、該被検体に、治療上有効量の、請求項1記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- 抗体またはその抗原結合断片が、コンジュゲートをさらに含むところの、請求項15記載の方法。
- コンジュゲートが、トキシン、サイトカインおよび化学療法剤からなる群より選択されるところの、請求項16記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キット。
- 配列番号:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項19記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
- 請求項20記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 完全ヒト抗体であって、以下:
(1)該抗体がmVEGF165に結合するKDよりも10倍以上小さいKDでもってhVEGF165に結合すること;
(2)hVEGF165にKD <2.0nMでもって結合すること;
(3)ベバシズマブにより結合されるエピトープと重複する、hVEGF165上のエピトープに結合すること;
(4)hVEGF165のVEGF受容体に対する結合をブロックすること;および
(5)VEGF受容体のhVEGF165誘導性リン酸化を阻害すること
よりなる群から選択される特徴を1つまたは複数有する、抗体。 - hVEGF165にKD <2.0nMでもって結合するところの、請求項22記載の完全ヒト抗体。
- ベバシズマブにより結合されるエピトープと重複する、hVEGF165上のエピトープに結合するところの、請求項22記載の完全ヒト抗体。
- hVEGF165のVEGF受容体に対する結合をブロックするところの、請求項22記載の完全ヒト抗体。
- VEGF受容体が、VEGF−R1またはVEGF−R2であるところの、請求項25記載の完全ヒト抗体。
- VEGF受容体のhVEGF165誘導性リン酸化を阻害するところの、請求項22記載の完全ヒト抗体。
- 以下の重鎖CDRアミノ酸配列:配列番号:6、配列番号:7または配列番号:8を含む、重鎖可変領域を有するところの、請求項22記載の完全ヒト抗体。
- 以下の軽鎖CDRアミノ酸配列:配列番号:9、配列番号:10または配列番号:11を含む、軽鎖可変領域をさらに有する、請求項28記載の完全ヒト抗体。
- 重鎖可変領域が、配列番号:2記載のアミノ酸配列を含み、そして、軽鎖可変領域が、配列番号:3記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項29記載の完全ヒト抗体。
- 以下の軽鎖CDRアミノ酸配列:配列番号:12、配列番号:13または配列番号:14を含む、軽鎖可変領域をさらに有する、請求項28記載の完全ヒト抗体。
- 重鎖可変領域が、配列番号:4記載のアミノ酸配列を含み、そして軽鎖可変領域が、配列番号:5記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項31記載の完全ヒト抗体。
- 完全な抗体である請求項1〜5のいずれか一項記載の、抗体またはその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- ポリクローナル抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- 組み換え抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- 二重特異性抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- ヒト化抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- キメラ抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- 完全ヒト抗体であるところの、請求項33記載の抗体。
- 配列番号:3記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および配列番号:2記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、単離されたヒト抗体。
- 配列番号:5記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および配列番号:4記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、単離されたヒト抗体。
- 請求項41記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項42記載の抗体および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片、および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 少なくとも1つの、XPA.10.064またはXPA.10.072の重鎖相補性決定領域、および少なくとも1つの、XPA10.064またはXPA10.072の軽鎖相補性決定領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖相補性決定領域が、XPA.10.064またはXPA10.072の、HCDR1、HCDR1、HCDR3およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるところの、請求項46記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 軽鎖相補性決定領域が、XPA.10.064またはXPA10.072の、LCDR1、LCDR1、LCDR3およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるところの、請求項46記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
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