ES2774964T3

ES2774964T3 - Métodos para inducir la capacidad de respuesta a un agente antiangiogénico

Info

Publication number: ES2774964T3
Application number: ES14745845T
Authority: ES
Inventors: Andrea Leubitz; Naamit Sher; Erez Feige; Eyal Breitbart
Original assignee: Vascular Biogenics Ltd
Current assignee: Notable Labs Ltd
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2014-02-04
Publication date: 2020-07-23
Anticipated expiration: 2034-02-04
Also published as: US10383954B2; IL240367B; IL240367A0; EP2951307B1; WO2014118643A3; WO2014118643A2; EP2951307A4; US20170354746A1; EP2951307A2; US9682154B2; US11191848B2; US20160121001A1; US20200046852A1

Abstract

Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:19 para su uso para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita en combinación con bevacizumab, en el que: (i) el vector se administra al sujeto antes que el bevacizumab, (ii) la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab se induce o mejora después de la administración del vector, comparada con la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab sin la administración del vector, y (iii) el tumor se deriva o está asociado con un glioblastoma multiforme recurrente.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para inducir la capacidad de respuesta a un agente antiangiogénico

Antecedentes de la descripción

La angiogénesis es una característica importante y habitual de varias patologías. Entre estas, se encuentran enfermedades en las que la angiogénesis puede mejorar la condición de la enfermedad (tales como la enfermedad cardíaca isquémica) y enfermedades en las que una angiogénesis excesiva es parte de la patología y, por tanto, debe eliminarse. Estas últimas enfermedades incluyen diabetes (retinopatía diabética), enfermedades cardiovasculares (aterosclerosis), inflamación crónica (artritis reumatoide), y cáncer. La angiogénesis aparece en tumores y permite su crecimiento, invasión y metástasis. En 1971, Folkman propuso que el crecimiento de los tumores y las metástasis dependen de la angiogénesis y, por tanto, la inhibición de la angiogénesis puede ser una estrategia para detener el crecimiento tumoral.

Existen varias moléculas implicadas en la angiogénesis, desde factores de transcripción hasta factores de crecimiento. La hipoxia es un factor ambiental importante que conduce a la neovascularización e induce la liberación de varias citoquinas que son factores proangiogénicos. Entre estas se encuentran los factores de crecimiento endotelial vascular ("vascular endothelial growth factors", VEGF) y sus receptores, miembros de la familia de la angiopoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos básico, y endotelina-1 (ET-1). Estos factores están implicados en la inducción de la angiogénesis a través de la activación, la proliferación y la migración de células endoteliales. Se han ensayado formas recombinantes de los inhibidores endógenos de la angiogénesis para el tratamiento del cáncer. Los potenciales inconvenientes farmacocinéticos, biotecnológicos y económicos de la administración crónica de estos inhibidores recombinantes han conducido a los científicos a desarrollar otras estrategias.

El desarrollo del anticuerpo monoclonal anti-VEGF bevacizumab ha validado una estrategia antiangiogénica como modalidad terapéutica complementaria a la quimioterapia. Varios inhibidores de molécula pequeña, que incluyen inhibidores de tirosina quinasa de segunda generación de múltiples dianas también son prometedores como agentes antiangiogénicos para el cáncer.

Sin embargo, los potenciales inconvenientes farmacocinéticos y económicos de la administración crónica de inhibidores recombinantes, anticuerpos y moléculas pequeñas, así como la actividad limitada manifestada cuando se aplican como monoterapia, han conducido a los científicos a evaluar la terapia génica antiangiogénica. La terapia génica es una modalidad emergente para tratar enfermedades humanas heredadas y adquiridas. Sin embargo, existen una serie de obstáculos que limitan el éxito de la terapia génica, que incluyen la duración de la expresión, la inducción de la respuesta inmunológica, la citotoxicidad de los vectores y la especificidad de tejido. Se han propuesto dos estrategias generales para la terapia génica del cáncer: la terapia génica dirigida a tumor o la terapia génica sistémica. La falta de éxito para dirigir los productos de la terapia génica a las células cancerosas o su entorno mediante tratamientos sistémicos provoca que la mayoría de las terapias se administren al propio tumor. Se describe un vector para tratar el cáncer en Triozzi et al. (2011), Expert Opinion on Biological Therapy, 11(12), 1669 76, y en Breitbart et al. (2011), American Association for Cance Research Proceedings, 71(8), 1-2.

Breve sumario de la descripción

La presente invención se refiere a las realizaciones según se definen en las reivindicaciones. Así, se refiere a los siguientes puntos:

1. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:19 para su uso para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita en combinación con bevacizumab, en el que: (i) el vector se administra al sujeto antes que el bevacizumab, (ii) la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab se induce o mejora después de la administración del vector, comparada con la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab sin la administración del vector, y (iii) el tumor se deriva o está asociado con un glioblastoma multiforme recurrente. 2. El vector para el uso del punto 1, en el que la capacidad de respuesta al bevacizumab es una propiedad antiangiogénesis del bevacizumab.

3. El vector para el uso del punto 1 o 2, en el que la capacidad de respuesta al bevacizumab es un efecto antitumoral del bevacizumab.

4. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x10” partículas de virus, al menos aproximadamente 1x1012 partículas de virus, al menos aproximadamente 1x1013 partículas de virus, o al menos aproximadamente 1x1014 partículas de virus.

5. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz menor que aproximadamente 15 mg/kg, 14 mg/kg, 13 mg/kg, 12 mg/kg, 11 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg.

6. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de 3x1012 a 1 x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz de 5 mg/kg a 15 mg/kg.

7. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que el vector se administra repetidas veces. 8. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que el bevacizumab se administra repetidas veces.

9. El vector para el uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el vector se administra repetidas veces cada dos meses en una cantidad eficaz de 1x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra repetidas veces cada dos semanas en una cantidad eficaz de 10 mg/kg.

La presente descripción se dirige a un método para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales y el antagonista de VEGF al sujeto, en el que la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF se induce o mejora después de la administración del vector, comparado con la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF sin la administración del vector. La descripción se dirige además a un método para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF en una población de sujetos que lo necesita, que comprende administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales y el antagonista de VEGF al sujeto, en el que la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF se induce o mejora después de la administración del vector, comparado con la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF sin la administración del vector.

En un aspecto, el sujeto o la población de sujetos necesita inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF. En una realización, la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF es una propiedad antiangiogénesis del antagonista de VEGF. En otra realización, la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF es un efecto antitumoral del antagonista de VEGF.

En otro aspecto, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF. En un aspecto de la presente invención, el antagonista de VEGF es bevacizumab.

En algunos aspectos, el vector que comprende un gen de quimera-Fas codifica un polipéptido que comprende un dominio extracelular de un polipéptido de receptor 1 de TNF ("TNF Receptor 1", TNFR1) condensado con un dominio transmembrana y un dominio intracelular de un polipéptido de Fas.

Una característica de la presente descripción consiste en que el vector y el antagonista de VEGF se administran al mismo tiempo o de modo secuencial. Otra característica de la invención consiste en que el vector se administra antes que el antagonista de VEGF.

En una realización, el vector se administra en una cantidad eficaz igual o menor que aproximadamente 1x1013, 9x1012, 8x1012, 7x1012, 6x1012, 5x1012, 4x1012, 3x1012, 2x1012, 1x1012, 9x10", 8x10", 7x10", 6x10", 5x10", 4x10", 3x10", 2x10", 1x10", 9x1010, 8x1010, 7x1010, 6x1010, 5x1010, 4x1010, 3x1010, 2x1010, o 1x1010 partículas de virus.

En una realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x10" partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1012 partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1013 partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1014 partículas de virus.

En otra realización de la presente invención, el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz igual o menor que aproximadamente 15 mg/kg, 14 mg/kg, 13 mg/kg, 12 mg/kg, 11 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg.

En otra realización de la presente invención, el vector se administra en una cantidad eficaz de 3x1012 a 1x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz de 5 mg/kg a 15 mg/kg.

En otras realizaciones, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF de unión al receptor o una molécula de unión al receptor de VEGF. En otra realización, el anticuerpo anti-VEGF de unión al receptor es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un antagonista de VEGF puede seleccionarse de bevacizumab, ranibizumab, VGX-100, r84, aflibercept, IMC-18F1, IMC-1C11, ramucirumab, y cualquiera de sus combinaciones.

En algunas realizaciones, el vector se administra repetidas veces. El vector puede administrarse repetidas veces a diario, una vez en aproximadamente 2 días, una vez en aproximadamente 3 días, una vez en aproximadamente 4 días, una vez en aproximadamente 5 días, una vez en aproximadamente 6 días, una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 5 semanas, una vez en aproximadamente 6 semanas, una vez en aproximadamente 7 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, o una vez en aproximadamente 6 meses. En ciertas realizaciones, el bevacizumab se administra repetidas veces. En otra realización de la invención, el bevacizumab se administra repetidas veces una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, una vez en aproximadamente 3 meses, una vez en aproximadamente 4 meses, una vez en aproximadamente 5 meses, o una vez en aproximadamente 6 meses.

Realizaciones

E1. Un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de VEGF al sujeto, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector.

E2. Un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende:

(i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, en el que la capacidad de respuesta del sujeto a un antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector, y

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto.

E3. Un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende:

(i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales,

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto, y

(iii) medir la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto aumenta después de la administración del vector.

E4. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E3, en el que el tamaño del tumor del sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF.

E5. Un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de VEGF al sujeto, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector y antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que el tamaño del tumor en el sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF.

E6. Un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende:

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto, en el que el tamaño del tumor del sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF.

E7. Un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende:

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto, y

(iii) medir la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector.

E8. El método de una cualquiera de las realizaciones E4 a E7, en el que el tamaño del tumor se reduce comparado con el tamaño del tumor de un sujeto al que no se le administra el vector antes de la administración del antagonista de VEGF.

E9. El método de una cualquiera de las realizaciones E4 a E8, en el que el tamaño del tumor se mide comparando el tamaño del tumor antes de la administración del antagonista de VEGF y el tamaño del tumor después de la administración del antagonista de VEGF.

E10. Un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende administrar un antagonista de VEGF a un sujeto que lo necesita, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector y antes de la administración del antagonista de VEGF.

E11. Un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende: (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, en el que la capacidad de respuesta del sujeto a un antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector, y

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto.

E12. Un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende: (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales,

(ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto, y

E13. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E12, en el que el tumor del sujeto progresa después de la administración del vector.

E14. Un método para identificar un candidato para una terapia con un antagonista de VEGF, que comprende (i) medir el tamaño de un tumor de un sujeto al que se le ha diagnosticado un tumor antes de administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales al sujeto, y (ii) medir la progresión del tumor después de la administración del vector, en el que el sujeto se identifica como un candidato después de que el tumor haya progresado.

E15. Un método para identificar un candidato para una terapia con un antagonista de VEGF, que comprende (i) medir el tamaño de un tumor de un sujeto al que se le ha diagnosticado un tumor antes de administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales al sujeto, (ii) medir la progresión del tumor después de la administración del vector, en el que el sujeto se identifica como un candidato después de que el tumor haya progresado, y (iii) dar instrucciones a un asistente médico para que administre un antagonista de VEGF al sujeto.

E16. El método de una cualquiera de las realizaciones E13 a E15, en el que la progresión del tumor se mide mediante el crecimiento del tumor.

E17. El método de la realización E16, en el que el crecimiento del tumor se mide mediante MRI.

E18. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E17, en el que el tumor del sujeto es un tumor recurrente que surge durante el tratamiento con el vector.

E19. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E18, en el que el tumor del sujeto es un tumor metastásico que surge durante el tratamiento con el vector.

E20. El método de una cualquiera de las realizaciones E13-E19, en el que la progresión del tumor se mide al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos un mes, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas, al menos 11 semanas, al menos 12 semanas, al menos 13 semanas, al menos 14 semanas, al menos 15 semanas, o al menos 16 semanas después de la administración del vector.

E21. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E20, en el que el tamaño del tumor se mide al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, o al menos ocho semanas antes de la administración del vector. E22. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E21, en el que el antagonista de VEGF se administra repetidas veces después de determinar que el tumor del sujeto ha progresado.

E23. El método de la realización E22, en el que el antagonista de VEGF se administra repetidas veces una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente diez días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, una vez en aproximadamente 3 meses, una vez en aproximadamente 4 meses, una vez en aproximadamente 5 meses, o una vez en aproximadamente 6 meses.

E24. El método de la realización E22, en el que el antagonista de VEGF se administra repetidas veces una vez en aproximadamente dos semanas.

E25. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E24, en el que el vector se administra repetidas veces después de administrar el antagonista de VEGF.

E26. El método de la realización E25, en el que el vector se administra repetidas veces a diario, una vez en aproximadamente 2 días, una vez en aproximadamente 3 días, una vez en aproximadamente 4 días, una vez en aproximadamente 5 días, una vez en aproximadamente 6 días, una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 5 semanas, una vez en aproximadamente 6 semanas, una vez en aproximadamente 7 semanas, una vez en aproximadamente 8 semanas, una vez en aproximadamente 9 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, una vez en aproximadamente 3 meses, una vez en aproximadamente 4 meses, una vez en aproximadamente 5, o una vez en aproximadamente 6 meses.

E27. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E26, en el que el vector se administra cada 2 meses, y el bevacizumab se administra cada 2 semanas.

E28. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E27, en el que el sujeto necesita una capacidad de respuesta inducida a un antagonista de VEGF.

E29. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E27, en el que el sujeto necesita una capacidad de respuesta mejorada a un antagonista de VEGF.

E30. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E29, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF es una propiedad antiangiogénesis del antagonista de VEGF.

E31. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E30, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF es un efecto antitumoral del antagonista de VEGF.

E32. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E31, en el que el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF.

E33. El método de la realización E32, en el que el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo quimérico.

E34. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E33, en el que el antagonista de VEGF comprende Fab, F(ab)2, Fv, o scFv.

E35. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E34, en el que el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF de unión al receptor o una molécula de unión al receptor de VEGF.

E36. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E35, en el que el antagonista de VEGF se selecciona de bevacizumab, ranibizumab, VGX-100, r84, aflibercept, IMC-18F1, IMC-1C11, ramucirumab, y cualquiera de sus combinaciones.

E37. El método de la realización E36, en el que el antagonista de VEGF es bevacizumab.

E38. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E37, en el que el producto del gen de quimera-Fas comprende un polipéptido que comprende un dominio extracelular de un polipéptido de receptor 1 de t Nf (TNFR1) condensado con un dominio transmembrana y un dominio intracelular de un polipéptido de Fas.

E39. El método de la realización E38, en el que el dominio extracelular del TNFR1 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:4, en el que el dominio extracelular de TNFR1 es capaz de unirse a TNF-a.

E40. El método de la realización E39, en el que el dominio transmembrana y el dominio intracelular del polipéptido de Fas comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:8, en el que el dominio transmembrana y el dominio intracelular del polipéptido de Fas es capaz de inducir una apoptosis mediada por Fas.

E41. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E40, en el que el gen de quimera-Fas comprende una primera secuencia de nucleótidos que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:3, y una segunda secuencia de nucleótidos que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:7.

E42. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E41, en el que el promotor específico de células endoteliales comprende un promotor PPE-1.

E43. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E42, en el que el promotor específico de células endoteliales comprende además un potenciador.

E44. El método de la realización E43, en el que el potenciador comprende una secuencia de nucleótidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:16, en el que el potenciador induce una especificidad de células endoteliales mejorada, comparado con un promotor específico de células endoteliales sin el potenciador.

E45. El método de la realización E44, en el que el potenciador comprende SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12.

E46. El método de la realización E45, en el que el potenciador comprende además SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:14. E47. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E46, en el que el promotor específico de células endoteliales es un promotor PPE-1-3X.

E48. El método de la realización E47, en el que el promotor PPE-1-3X comprende una secuencia de nucleótidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:18, en el que el promotor PPE-1-3X es capaz de dirigir la expresión del gen de quimera-Fas en células endoteliales.

E49. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E48, en el que el vector no contiene una región E1 de un adenovirus.

E50. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E49, en el que el vector y el antagonista de VEGF se administran al mismo tiempo o de modo secuencial.

E51. El método de la realización E50, en el que el vector se administra antes del antagonista de VEGF.

E52. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E51, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz igual o menor que aproximadamente 1x1013, 9x1012, 8x1012, 7x1012, 6x1012, 5x1012, 4x1012, 3x1012, 2x1012, 1x1012, 9x10", 8x10", 7x1011, 6x10", 5x1011, 4x1011, 3x1011, 2x1011, 1x1011, 9x1010, 8x1010, 7x1010, 6x1010, 5x1010, 4x1010, 3x1010, 2x1010, o 1 x1010 partículas de virus.

E53. El método de una cualquiera de las realizaciones E36 a E52, en el que el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz menor que aproximadamente 15 mg/kg, 14 mg/kg, 13 mg/kg, 12 mg/kg, 11 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg.

E54. El método de una cualquiera de las realizaciones E36 a E53, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de 3x1012 a 1x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz de 5 mg/kg a 15 mg/kg.

E55. El método de una cualquiera de las realizaciones E32 a E54, en el que el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en V^hde CDR1 (SEQ ID NO:28), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:29), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:30), V^lde CDR1 (SEQ ID NO:31), V^hde CDR2 (SEQ iD NO:32), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:33), y cualquiera de sus combinaciones.

E56. El método de la realización E55, en el que el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende V^hde CDR1 (SEQ ID NO:28), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:29), y V^hde CDR3 (SEQ ID NO:30).

E57. El método de la realización E55, en el que el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende V^lde CDR1 (SEQ ID NO:31), V^lde CDR2 (SEQ ID NO:32), y V^lde CDR3 (SEQ ID NO:33).

E58. El método de la realización E55, en el que el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende V^hde CDR1 (SEQ ID NO:28), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:29), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:30), V^lde CDR1 (SEQ ID NO:31), V^lde CDR2 (SEQ ID NO:32), y V^lde CDR3 (SEQ ID NO:33).

E59. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E58, en el que el sujeto necesita una reducción de la angiogénesis.

E60. El método de la realización E59, en el que el vector y el antagonista de VEGF reducen la angiogénesis.

E61. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E60, en el que el vector es un vector de adenovirus. E62. El método de la realización E61, en el que el vector de adenovirus es un adenovirus de serotipo 5.

E63. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E62, en el que el vector comprende, consiste en o consiste fundamentalmente en la SEQ ID NO:19.

E64. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E63, en el que el vector es un virus aislado que tiene el n° de registro de la European Collection of Cell Cultures (ECACC) 13021201.

E65. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E64, en el que el promotor comprende un elemento de respuesta a la hipoxia.

E66. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E65, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de aproximadamente 1x10” , aproximadamente 1x1012, aproximadamente 1x1013, o aproximadamente 1x1014 partículas de virus.

E67. El método de una cualquiera de las realizaciones E1 a E66, en el que el tumor es un tumor cerebral.

E68. El método de la realización E67, en el que el tumor cerebral es un glioblastoma multiforme.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La figura 1 muestra un régimen de terapia de combinación de un adenovirus que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales (por ejemplo, VB-111) y bevacizumab (BEV). Pueden administrarse 1x1013 PV de VB-111 cada ocho semanas, y el bevacizumab puede administrarse cada dos semanas. Puede realizarse una evaluación con MRI cada ocho semanas para evaluar la progresión del tumor. La figura 2 muestra el tiempo para la progresión de la enfermedad del glioblastoma desde una primera recaída hasta una segunda recaída en pacientes que reciben un régimen de terapia de combinación de un adenovirus que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales (por ejemplo, VB-111) y bevacizumab (BEV).

La figura 3 muestra un ejemplo de un paciente que ha sido tratado con un régimen de combinación de un adenovirus que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales (por ejemplo, VB-111) y bevacizumab (BEV) tras la progresión de la enfermedad del glioblastoma.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

A menos que se indique lo contrario, todos los términos y expresiones técnicos y científicos empleados en la presente tienen el mismo significado que el que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluyendo las definiciones. A menos que el contexto indique lo contrario, los términos y expresiones en singular incluyen el plural, y los términos y expresiones en plural incluyen el singular.

Aunque pueden emplearse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o el ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones.

Para definir más concretamente la invención, en la presente se proporcionan los siguientes términos, expresiones y definiciones.

El término “aproximadamente” significa en la presente alrededor de, más o menos, o en la región de. Cuando se emplea el término “aproximadamente” junto con un intervalo numérico, el término modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos indicados. En general, el término “aproximadamente” se usa en la presente para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado en una varianza del 10%, arriba o abajo (más alto o más bajo).

Tal como se emplea en la presente, un “anticuerpo” significa una inmunoglobulina intacta, uno de sus fragmentos de unión al antígeno, o una molécula de unión al antígeno. Los anticuerpos de esta invención pueden ser de cualquier isotipo o clase (por ejemplo, M, D, G, E y A) o de cualquier subclase (por ejemplo, G1-4, A1 -2), y pueden tener una cadena ligera kappa (^k) o lambda (A).

La expresión “cantidad eficaz”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado. Un resultado deseado puede ser, por ejemplo, la reducción o la inhibición de la neovascularización o la angiogénesis in vitro o in vivo. Una cantidad eficaz no tiene porqué significar la eliminación completa de la neovascularización o la angiogénesis.

Tal como se emplea en la presente, una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Un resultado terapéutico puede ser, por ejemplo, la disminución de los síntomas, la regresión o la estabilización del tamaño del tumor en imágenes radiológicas, una supervivencia prolongada, una movilidad mejorada. No es necesario que un resultado terapéutico sea una “cura”. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad o una dosificación que es necesaria para evitar la aparición de un tumor.

Tal como se emplea en la presente, una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. En algunas realizaciones, puesto que se emplea una dosis profiláctica en sujetos antes de la enfermedad o en un estadio anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

El término “polinucleótido” o “nucleótido” pretende incluir un único ácido nucleico, así como una pluralidad de ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). En ciertas realizaciones, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentran en los ácidos nucleicos peptídicos (ANP)).

Tal como se emplean en la presente, un “polinucleótido”, un “nucleótido”, y un “ácido nucleico” pueden utilizarse de modo intercambiable y contienen la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADN de longitud completa, que incluye las secuencias 5' y 3' no traducidas, las secuencias codificadoras, así como fragmentos, epitopos, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico. El polinucleótido puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden a Dn y ARN que puede ser monocatenario o, más generalmente, bicatenario, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, los polinucleótidos pueden estar compuestos de regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. Los polinucleótidos también pueden contener una o más bases modificadas o esqueletos de ARN o ARN modificados para conseguir estabilidad o por otras razones. Las bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco habituales, tales como inosina. Pueden realizarse una diversidad de modificaciones en el ADN y ARN; por tanto, un “polinucleótido” incluye las formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.

En la presente invención, un polipéptido puede estar compuesto de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, concretamente, isósteros peptídicos, y puede contener otros aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes (por ejemplo, aminoácidos no naturales). Los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse mediante procesos naturales, tales como un procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son muy conocidas en la técnica. Estas modificaciones están muy bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en un gran número de referencias bibliográficas de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier lugar del polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos o los terminales amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en un mismo grado o en grados variables en varios sitios en un polipéptido concreto. Además, un polipéptido concreto puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de una ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Pueden surgir polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados de procesos naturales postraduccionales o pueden ser preparados mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o de un derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación, y ubiquitinación (véase, por ejemplo, Proteins-Structure And Molecular Properties, 2a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, pp. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol., 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NYAcad. Sci., 663:48-62 (1992)).

Los términos “fragmento”, “variante”, “derivado” y “análogo”, cuando se refieren a cualquier polipéptido o polinucleótido de la presente invención, incluyen cualquier polipéptido o polinucleótido que conserva al menos alguna de las actividades, concretamente, la capacidad para actuar igual que cualquier función natural del polipéptido o polinucleótido. Por ejemplo, un “fragmento”, “variante”, “derivado” y “análogo” del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1) tiene algunas de las actividades que aparecen en el TNFR1 natural de longitud completa, por ejemplo, la capacidad para unirse a un ligando de TNFR1, concretamente, TNF-alfa o linfotoxina. En otro ejemplo, un "fragmento”, “variante”, “derivado” y “análogo” de un polipéptido de FAS tiene algunas de las actividades que aparecen en el polipéptido de FAS natural de longitud completa, por ejemplo, la capacidad para inducir la apoptosis. En otros ejemplos, un "fragmento”, “variante”, “derivado” y “análogo” de un promotor específico de células endoteliales puede inducir la expresión específica de células endoteliales de un gen unido operablemente al promotor. Otros ejemplos no limitantes de los diversos fragmentos, variantes, análogos o derivados de TNFR1, polipéptido de FAS y promotores específicos de células endoteliales se describen a continuación.

En la presente invención, un “fragmento de polipéptido” o “fragmento de proteína” se refiere a una secuencia de aminoácidos corta de un polipéptido. Los fragmentos de proteínas o de polipéptidos pueden ser “autónomos” o estar incluidos en un polipéptido más grande del cual dicho fragmento forma una parte de una región. Los ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 70 aminoácidos, aproximadamente 80 aminoácidos, aproximadamente 90 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos.

Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una sustitución en la que el resto aminoácido es reemplazado por un resto aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos aminoácidos con cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, si un aminoácido en un polipéptido es reemplazado por otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, se considera que la sustitución es conservativa. En otra realización, un tramo de aminoácidos puede ser reemplazado de modo conservativo por un tramo similar desde el punto de vista estructural que se diferencie en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de la cadena lateral.

La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas se refiere al número de posiciones apareadas idénticas compartidas por las secuencias a lo largo de una ventana de comparación, tomando en cuenta las adiciones o las deleciones (es decir, huecos) que deben introducirse para conseguir el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Una posición apareada es cualquier posición en la que está presente un nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias diana y de referencia. Los huecos que aparecen en la secuencia diana no se cuentan, puesto que los huecos no son nucleótidos ni aminoácidos. De modo similar, los huecos que aparecen en la secuencia de referencia no se cuentan, puesto que se cuentan los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia diana, y no los nucleótidos o aminoácidos de la secuencia de referencia.

El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el resto aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias pueden lograrse empleando un software fácilmente disponible para su uso en línea y para descargar. Están disponibles programas de software adecuados en varias fuentes, y para el alineamiento de secuencias de proteínas y de nucleótidos. Un programa adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es bl2seq, parte del paquete de programas BLAST disponible en el sitio web de National Center for Biotechnology Information BLAST del gobierno de EE.UU. (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias empleando el algoritmo BLASTN o BLASTP. Se emplea BLASTN para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, por ejemplo, Needle, Stretcher, Water, o Matcher, parte del paquete de programas bioinformáticos EMBOSS y también disponibles en the European Bioinformatics Institute (EBI) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa.

Diferentes regiones dentro de una única secuencia diana polinucleotídica o polipeptídica que se alinean con una secuencia de referencia polinucleotídica o polipeptídica pueden tener cada una su propio porcentaje de identidad de secuencia. Se hace notar que el valor del porcentaje de identidad se redondea hasta la decena más cercana. Por ejemplo, 80,11, 80,12, 80,13, y 80,14 se redondean hacia abajo a 80,1, mientras que 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, y 80,19 se redondean hacia arriba a 80,2. También se hace notar que el valor de la longitud siempre será un número entero.

Los expertos en la técnica apreciarán que la generación de un alineamiento de secuencias para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones binarias de secuencia-secuencia exclusivamente dirigidas por los datos de la secuencia primaria. Pueden obtenerse alineamientos de secuencias de alineamientos de múltiples secuencias. Un programa adecuado para generar alineamientos de múltiples secuencias es ClustalW2, disponible en www.clulstal.org. Otro programa adecuado es MUSCLE, disponible en www.drive5.com/muscle/. ClustalW2 y MUSCLE también pueden obtenerse, por ejemplo, en EBI.

También se apreciará que pueden generarse alineamientos de secuencias integrando los datos de las secuencias con los datos procedentes de fuentes heterogéneas, tales como datos estructurales (por ejemplo, estructuras cristalográficas de proteínas), datos funcionales (por ejemplo, localización de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar un alineamiento de múltiples secuencias es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org, y también disponible, por ejemplo, en EBI. También se apreciará que el alineamiento final usado para calcular el porcentaje de identidad de secuencia puede curarse de modo automático o manual.

Tal como se emplean en la presente, los términos “unido”, “condensado”, “fusión”, “quimérico” y “quimera” se emplean de modo intercambiable. Estos términos se refieren a unir dos o más elementos o componentes por cualquier medio, que incluye la conjugación química o medios recombinantes. Una “fusión dentro de marco” se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abierta ("open reading frames", ORF) para formar un ORF más largo y continuo, de manera que se mantiene el marco de lectura correcto de los ORF originales. Así, la proteína quimérica o de fusión recombinante resultante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que se corresponden con polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están unidos así en la naturaleza). Aunque así se consigue que el marco de lectura sea continuo a través de los segmentos condensados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, mediante una secuencia de conector dentro de marco.

El término “heterólogo” y la expresión “resto heterólogo” significan que un polinucleótido, un polipéptido u otro resto se deriva de una entidad diferenciada de la entidad con la cual se está comparando. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede ser sintético o puede derivarse de una especie diferente, un tipo de célula diferente de un individuo, o del mismo tipo o un tipo diferente de célula de individuos diferenciados. En un aspecto, un resto heterólogo puede ser un polipéptido condensado a otro polipéptido para producir un polipéptido o proteína de fusión. En otro aspecto, un resto heterólogo puede ser un no polipéptido, tal como PEG conjugado con un polipéptido o una proteína.

En el contexto de los polipéptidos, una “secuencia lineal” o una “secuencia” es un orden de aminoácidos en un polipéptido en la dirección de amino a carboxilo terminal, en la que los restos contiguos entre sí en la secuencia están contiguos en la estructura primaria del polipéptido.

El término “expresión”, tal como se emplea en la presente, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, sin limitación, la inactivación del gen, así como la expresión transitoria y la expresión estable. Esto incluye, sin limitación, la transcripción del gen a ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeño (ARNhp), ARN de interferencia pequeño (ARNip) 0 cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en uno o más polipéptidos. Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de este producto bioquímico y cualquiera de sus precursores.

La expresión "región determinante de la complementariedad" ("complementarity determining region", CDR), tal como se emplea en la presente, se refiere a los restos aminoácidos de un anticuerpo que son los responsables de la unión a un antígeno. Las regiones de CDR de un anticuerpo se encuentran dentro de la región hipervariable de ambas cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Los anticuerpos de longitud completa comprenden tres regiones CDR en el dominio variable de cadena pesada y tres regiones CDR en el dominio variable de cadena ligera.

La expresión “administrado repetidas veces”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la administración de un agente terapéutico sobre una base repetida a intervalos definidos y fijos. Los intervalos de tiempo entre cada administración pueden alterarse durante el desarrollo de la administración repetida, y pueden ser tan largos como de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año o más.

La expresión “terapia de combinación”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la administración de dos o más modalidades terapéuticas para tratar una enfermedad o un trastorno. En un aspecto de la presente invención, la terapia de combinación se refiere a la administración de un antagonista de VEGF y un vector a un sujeto o a una población de sujetos que lo necesita. En algunas realizaciones, la terapia de combinación comprende administrar el antagonista de VEGF antes de administrar el vector. En otra realización, la terapia de combinación comprende administrar el antagonista de VEGF al mismo tiempo que la administración del vector. En otra realización, la terapia de combinación comprende administrar el antagonista de VEGF después de administrar el vector.

II. Construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un gen de quimera-FAS y un promotor específico de células endoteliales

La presente invención se refiere a métodos para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF en un sujeto o en una población de sujetos, que comprenden administrar un vector y un antagonista de VEGF. En la presente invención, el gen que codifica la proteína de quimera-FAS (o el producto del gen) puede unirse a un promotor específico de células endoteliales que dirige la expresión del producto del gen de quimera-FAS en una célula endotelial. La expresión de dicho producto de gen citotóxico es útil en una situación en la que no se desea una neovascularización excesiva ni el crecimiento excesivo de vasos sanguíneos, por ejemplo, en un tumor. La presente invención también proporciona una población homogénea de una construcción de ácido nucleico que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales.

A. Quimera-FAS

Una proteína de quimera-FAS expresada por la construcción de ácido nucleico de la invención comprende al menos dos polipéptidos de “receptor de muerte”, y cada uno de los polipéptidos se deriva de una proteína diferente. El primer polipéptido de la proteína de quimera-FAS comprende un dominio de unión al ligando del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1). El segundo polipéptido de la proteína de quimera-FAS comprende un dominio efector de un polipéptido de FAS.

El dominio de unión al ligando de TNFR1 puede ser cualquier dominio que se une a un ligando de TNFR1. En una realización, el ligando de TNFR1 es TNF-a. En otra realización, el ligando de TNFR1 es linfotoxina-a. El dominio de unión al ligando de TNFR1 puede ser un dominio extracelular de TNFR1 o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos. A continuación se describen ejemplos no limitantes de dominio de unión al ligando de TNFR1. El dominio efector de un polipéptido de FAS útil para la invención comprende cualquier dominio de FAS que forme un complejo de señalización inductor de muerte ("death-inducing signaling complex", DISC), induciendo con ello la apoptosis. En una realización, un dominio efector de un polipéptido de FAS comprende un dominio intracelular, un dominio transmembrana o ambos. A continuación se describen ejemplos no limitantes de dominios efectores del polipéptido de FAS.

El TNFR1 y el polipéptido de FAS pueden unirse mediante un enlace peptídico o mediante un conector. El conector que conecta el dominio de unión al ligando de TNFR1 con el dominio efector de FAS puede ser un conector polipeptídico o un conector no peptídico. Por ejemplo, un conector para la proteína de quimera-FAS puede comprender una o más de glicina, serina, leucina o cualquiera de sus combinaciones En una realización, un conector útil para la invención comprende Ser-Leu. En otra realización, un conector útil para la invención comprende (GGGS)n (Denise et al., J. Biol. chem., 277:35035-35043 (2002)), en el que n puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más (SEQ ID NO:27).

1. Receptor 1 del factor de necrosis tumoral

El polipéptido de TNFR1 humano de longitud completa tiene una longitud de 455 aminoácidos y también se denomina TNF-R1, receptor de tipo I del factor de necrosis tumoral (TNFRI), TNFR-I, TNFRSF1A, TN^fA^r, p55, P60, o CD120a. Se sabe que el polipéptido de TNFR1 humano natural se une a TNF-a o a la linfotoxina-a homotrimérica. La unión de TNF-a al domino extracelular conduce a la homotrimerización de TNFR1, que entonces interacciona específicamente con el dominio de muerte de la proteína del dominio de muerte asociada al receptor de tipo 1 del factor de necrosis tumoral ("Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1-Associated Death Domain Protein", TRADD). Diversas proteínas que interaccionan con TRADD, tales como los factores asociados al receptor de TNF ("TNF Receptor Associated Factors", TRAFS), serina/treonina proteína quinasa 1 de interacción con el receptor ("Receptor-Interacting Serine/Threonine-Protein Kinase 1", RIPK1), y la proteína asociada a Fas con dominio de muerte ("Fas-Associated Protein with Death Domain", FADD) son reclutadas al complejo por su asociación con TRADD. El complejo activa al menos dos cascadas de señalización diferenciadas, la apoptosis y la señalización de NF-kappa-B. Una secuencia polipeptídica de 454 aa indicada como una secuencia del polipéptido de TNFR1 humano tiene el número de registro P19438-1 en la base de datos UniProtKB. Esta secuencia del polipéptido de TNFR1 humano se denomina en la presente la isoforma A y SEQ ID NO:2. La SEQ ID NO:1 es una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:2. Se ha indicado que una secuencia polipeptídica de 108 aa es una isoforma de la secuencia del polipéptido de TNFR1 humano y tiene el número de registro P19438-2 en la base de datos UniProtKB. El polipéptido de 108 aa se corresponde con los aminoácidos 108 a 1 de la isoforma A (SEQ ID NO:2) y se denomina en la presente la isoforma B. Se ha indicado otro variante del polipéptido de TNFR1 humano que tiene 232 aa con el número de registro P19438-3 en la base de datos UniProtKB. El polipéptido de 232 aa se corresponde con los aminoácidos 1 a 232 de la isoforma A (SEQ ID NO:2) y se denomina en la presente la isoforma C. Otros variantes naturales del TNFR1 humano incluyen, pero no se limitan al polipéptido de TNFR1 de las isoformas A B, y C que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en H51Q, C59R, C59S, C62G, C62^y, P75L, T79M, C81F, C99S, S115G, C117R, C117Y, R121P, R121Q, P305T, y cualquiera de sus combinaciones. Otros variantes de TNFR1 conocidos incluyen el polipéptido de TNFR1 de las isoformas A, B, y C que comprende L13LILPQ, K255E, S286G, R394L, 412:ausente, GPAA443-446APP, o cualquiera de sus combinaciones.

La tabla 1 muestra la secuencia de aminoácidos de TNFR1 de tipo salvaje humano y una secuencia de nucleótidos que codifica el TNFR1 de tipo salvaje.

Tabla 1 - Secuencias de TNFR1

También se indica la secuencia del polipéptido de TNFR1 de ratón y sus variantes. El polipéptido de TNFR1 de ratón de 454 aa tiene el número de registro P25118 en la base de datos UniProtKB. Los polipéptidos de TNFR1 conocidos en otros animales incluyen, pero no se limitan a rata (por ejemplo, P22934 en la base de datos UniProtKB), vaca (por ejemplo, 019131 en la base de datos UniProtKB), cerdo (por ejemplo, P50555 en la base de datos UniProtKB), o caballo (por ejemplo, D1MH71 en la base de datos UniProtKB).

El TNFR1 de longitud completa puede romperse en dos cadenas: (1) el miembro 1A de la superfamilia del receptor de TNF, en la forma de membrana (concretamente, los aminoácidos 22 a 455 que corresponden al TNFR1 de longitud completa), y (2) la proteína 1 de unión a TNF ("TNF-binding protein 1", TBP1) (concretamente, los aminoácidos 41 a 291 que corresponden al TNFR1 de longitud completa). El polipéptido de TNFR1 humano de longitud completa consiste en una secuencia señal (aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2), un dominio extracelular (aminoácidos 212 a 234 de SEQ ID NO:22), un dominio transmembrana (aminoácidos 2 a 235 de SEQ ID NO:211), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 455 a 2 de SEQ ID NO:2). El dominio extracelular de TNFR1 comprende cuatro regiones repetidas de cisteína, TNFR-Cys1 (aminoácidos 43 a 82 que corresponden a SEQ ID NO:2), TNFR-Cys2 (aminoácidos 83 a 125 que corresponden a SEQ ID NO:2), TNFR-Cys3 (aminoácidos 126 a 166 que corresponden a SEQ ID NO:2), y TNFR-Cys4 (aminoácidos 167 a 196 que corresponden a SEQ ID NO:2).

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, los restos del comienzo y del fin de los dominios listados anteriormente pueden variar dependiendo del programa informático de formación de modelos usado o del método empleado para determinar el dominio. Así, diversos dominios funcionales de TNFR1 pueden ser distintos de los definidos anteriormente.

En una realización, un dominio de unión al ligando de TNFR1 útil para la proteína de quimera-FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en un dominio extracelular de TNFR1, o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos, en el que el dominio extracelular de TNFR1, o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos se une a TNF-a. En otra realización, un dominio de unión al ligando de TNFR1 comprende TNFR-Cys1; TNFR-Cys2; TNFR-Cys3; TNFR-Cys4; TNFR-Cys1 y TNFR-Cys2; TNFR-Cys1 y TNFR-Cys3; TNFR-Cys1 y TNFR-Cys4; TNFR-Cys2 y TNFR-Cys3; TNFR-Cys2 y TNFR-Cys4; TNFR-Cys3 y TNFR-Cys4; TNFR-Cys1, TNFR-Cys2 y TNFR-Cys3; TNFR-Cys1, TNFR-Cys2 y TNFR-Cys4; TNFR-Cys2, TNFR-Cys3 y TNFR-Cys4; o TNFR-Cys1, TNFR-Cys2, TNFR-Cys3 y TNFR-Cys4. En otras realizaciones, un dominio de unión al ligando de TNFR1 en la proteína de quimera-FAS comprende la proteína I de unión a TNF. En otras realizaciones, un dominio de unión al ligando de TNFR1 de la proteína de quimera-FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 22 a 190, aminoácidos 22 a 191, aminoácidos 22 a 192, aminoácidos 22 a 193, aminoácidos 22 a 194, aminoácidos 22 a 195, aminoácidos 22 a 196, aminoácidos 22 a 197, aminoácidos 22 a 198, aminoácidos 22 a 199, aminoácidos 22 a 200, aminoácidos 22 a 201, aminoácidos 22 a 202, aminoácidos 22 a 203, aminoácidos 22 a 204, aminoácidos 22 a 205, aminoácidos 22 a 206, aminoácidos 22 a 207, aminoácidos 22 a 208, aminoácidos 22 a 209, aminoácidos 22 a 210, o aminoácidos 22 a 211 de SEQ ID NO:2, en el que el dominio de unión al ligando se une a un ligando de TNFR1, por ejemplo, TNF-a.

En otras realizaciones, el dominio de unión al ligando de TNFR1 comprende además un péptido señal. Un ejemplo de un péptido señal adecuado es el péptido señal de TNFR1, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, un dominio de unión al ligando del producto del gen de quimera-FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 190, aminoácidos 1 a 191, aminoácidos 1 a 192, aminoácidos 1 a 193, aminoácidos 1 a 194, aminoácidos 1 a 195, aminoácidos 1 a 196, aminoácidos 1 a 197, aminoácidos 1 a 198, aminoácidos 1 a 199, aminoácidos 1 a 200, aminoácidos 1 a 201, aminoácidos 1 a 202, aminoácidos 1 a 203, aminoácidos 1 a 204, aminoácidos 1 a 205, aminoácidos 1 a 206, aminoácidos 1 a 207, aminoácidos 1 a 208, aminoácidos 1 a 209, aminoácidos 1 a 210, o aminoácidos 1 a 211 de SEQ ID NO:2, en el que el dominio de unión al ligando se une a un ligando de TNFR1, por ejemplo, TNF-a. En una realización específica, un dominio de unión al ligando de TNFR1 de la proteína de quimera-FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:4, en el que el dominio de unión al ligando se une a un ligando de TNFR1, por ejemplo, TNF-a.

En otras realizaciones, el dominio de unión al ligando de TNFR1 es codificado por una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:3.

En otras realizaciones, un dominio de unión al ligando de TNFR1 de la proteína de quimera-FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 22 a 108 de SEQ ID NO:2 (isoforma B de TNFR1), aminoácidos 22 a 232 de SEQ ID NO:2 (isoforma C de TNFR1), o aminoácidos 44 a 291 de SEQ ID NO:2 (TBP1), en el que el dominio de unión al ligando se une a un ligando de TNFR1, por ejemplo, TNF-a.

2. Polipéptido de FAS

El polipéptido de FAS humano de longitud completa tiene una longitud de 335 aminoácidos y también se denomina miembro 6 de la superfamilia del receptor de necrosis tumoral, antígeno Apo-1, antígeno de superficie de FAS mediador en la apoptosis, receptor de FASLG, o CD95. El polipéptido de FAS natural es un receptor para TNFSF6/FASLG. Cuando el polipéptido de FAS se une al ligando de FAS (FasL), la interacción entre FAS y FasL provoca la formación del complejo de señalización inductor de muerte ("death-inducing signaling complex", DISC), que contiene FADD, caspasa-8 y caspasa-10. En algunos tipos de células (tipo I), la caspasa-8 procesada activa directamente a otros miembros de la familia de la caspasa y activa la ejecución de la apoptosis de la célula. En otros tipos de células (tipo II), el FAS-DISC comienza un bucle de retroalimentación que rápidamente aumenta la liberación de factores proapoptóticos desde las mitocondrias y la activación amplificada de la caspasa-8. La apoptosis mediada por FAS puede desempeñar un papel en la inducción de tolerancia periférica, en el suicidio estimulado por antígenos de las células maduras, o en ambos.

Una secuencia polipeptídica de 335 aa indicada como una secuencia del polipéptido de FAS humano tiene el número de registro P25445-1 en la base de datos UniProtKB. Esta secuencia del polipéptido de FAS humano se denomina en la presente SEQ ID NO:6. La SEQ ID NO:5 es una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO:6. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FAS también se conoce como APT1, FAS1, o TNFRSF6. El polipéptido de FAS de longitud completa contiene un péptido señal (aminoácidos 1 a 25 que corresponden a SEQ ID NO:6), un dominio extracelular (aminoácidos 26 a 173 que corresponden a SEQ ID NO:6), un dominio transmembrana (aminoácidos 174 a 190 que corresponden a SEQ ID NO:6), y un dominio intracelular (o citoplásmico) (aminoácidos 191 a 335 que corresponden a S^eQ ID NO:6). El dominio intracelular contiene un dominio de muerte (por ejemplo, aminoácidos 230 a 314 que corresponden a SeQ ID NO:6).

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, los restos del comienzo y del fin de los dominios listados anteriormente pueden variar dependiendo del programa informático de formación de modelos usado o del método empleado para determinar el dominio. Así, diversos dominios funcionales de FAS pueden ser distintos de los definidos anteriormente. La tabla 2 muestra la secuencia de aminoácidos de FAS de tipo salvaje humano y una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de FAS.

Tabla 2 - Secuencias de FAS

También se indica la secuencia del polipéptido de FAS de ratón y sus variantes. El polipéptido de FAS de ratón de 327 aa tiene el número de registro P25446 en la base de datos UniProtKB. Los polipéptidos de FAS conocidos en otros animales incluyen, pero no se limitan a cercopiteco (por ejemplo, Q9BDN4 en la base de datos UniProtKB), mono Rhesus (por ejemplo, Q9BDP2 en la base de datos UniProtKB), rata (por ejemplo, Q63199 en la base de datos UniProtKB), o vaca (por ejemplo, P51867 en la base de datos UniProtKB).

Basándose en la variación de secuencia en el polipéptido de FAS, los expertos en la técnica pueden identificar variaciones de secuencia en el dominio efector del polipéptido de FAS. Por ejemplo, los variantes naturales de los dominios efectores de FAS pueden incluir una o más sustituciones o mutaciones de C178R, L180F, P183L, I184V, T1981, Y232C, T241K, T241P, V249L, R250P, R250Q, G253D, G253S, N255D, A257D, I259R, D260G, D260V, D260Y, I262S, N264K, T270I, T270K, E272G, E272K, L278F, K299N, T305I, I310S, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización, un dominio efector del polipéptido de FAS útil para la invención comprende un dominio de muerte del polipéptido de FAS. En otra realización, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 230 a 314 de SEQ ID NO:6. En otras realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende un dominio intracelular del polipéptido de FAS. En otras realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 185 a 335, aminoácidos 186 a 335, aminoácidos 187 a 335, aminoácidos 188 a 335, aminoácidos 189 a 335, aminoácidos 190 a 335, aminoácidos 191 a 335, aminoácidos 192 a 335, aminoácidos 193 a 335, aminoácidos 194 a 335, aminoácidos 195 a 335, aminoácidos 196 a 335, aminoácidos 197 a 335, aminoácidos 198 a 335, o aminoácidos 199 a 335 de SEQ ID NO:6.

En otras realizaciones, el dominio efector del polipéptido de FAS comprende además un dominio transmembrana del polipéptido de FAS. En otras realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 174 a 335 de SEQ ID NO:6. En algunas realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende además aproximadamente diez, aproximadamente nueve, aproximadamente ocho, aproximadamente siete, aproximadamente seis, aproximadamente cinco, aproximadamente cuatro, aproximadamente tres, aproximadamente dos o aproximadamente un aminoácido de la porción C-terminal del dominio extracelular de FAS. En ciertas realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 179 a 335, aminoácidos 178 a 335, aminoácidos 177 a 335, aminoácidos 176 a 335, aminoácidos 175 a 335, aminoácidos 174 a 335, aminoácidos 173 a 335, aminoácidos 172 a 335, aminoácidos 171 a 335, aminoácidos 170 a 335, aminoácidos 169 a 335, aminoácidos 168 a 335, aminoácidos 167 a 335, aminoácidos 166 a 335, aminoácidos 165 a 335, aminoácidos 164 a 335, o aminoácidos 163 a 335 de SEQ ID NO:6, en el que el dominio efector forma un complejo de señalización inductor de muerte (DISC), activa la caspasa 8, o induce la apoptosis.

En algunas realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:8, en el que el dominio efector forma un complejo de señalización inductor de muerte (DISC), activa la caspasa 8, o induce la apoptosis.

En otras realizaciones, un dominio efector del polipéptido de FAS es codificado por una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:7.

En una realización, el producto del gen de quimera-FAS para la invención comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:10, en el que el producto del gen de quimera-FAS induce la apoptosis. En otra realización, el producto del gen de quimera-FAS es codificado por una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:9, en el que el producto del gen de quimera-FAS induce la apoptosis. B. Promotor específico de células endoteliales

La construcción de ácido nucleico que comprende un gen de quimera-FAS comprende además uno o más elementos de control de la expresión útiles para regular la expresión de un gen de quimera-FAS unido operablemente. Los elementos de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a promotores, señales de secreción y otros elementos reguladores.

La construcción de ácido nucleico útil para la presente invención utiliza un promotor específico de células endoteliales para dirigir la expresión de la proteína de quimera-FAS en una célula endotelial, induciendo con ello la apoptosis de la célula endotelial.

Para el objetivo de la presente invención, un promotor específico de células endoteliales puede contener uno o más elementos reguladores en cis, que mejoran la especificidad de células endoteliales de los promotores, comparado con un promotor sin los elementos reguladores en cis. En un ejemplo, el elemento regulador en cis comprende un potenciador. En otro aspecto, el elemento regulador en cis comprende un elemento de respuesta a la hipoxia. En otros ejemplos, el elemento regulador en cis comprende un potenciador y un elemento de respuesta a la hipoxia. En una realización, un elemento regulador en cis útil para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 (la secuencia complementaria de SEQ ID NO:11), en el que el elemento regulador en cis mejora la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. El elemento regulador en cis puede comprender además una secuencia de nucleótidos adicional al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:14 (la secuencia complementaria de SEQ ID NO:13).

En otra realización, un elemento regulador en cis para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:14 (la secuencia complementaria de SEQ ID NO:13), en el que el elemento regulador en cis mejora la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. El elemento regulador en cis puede comprender además una secuencia de nucleótidos adicional al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 (la secuencia complementaria de SEQ ID NO:11).

En otras realizaciones, un elemento regulador en cis para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:16 (la secuencia complementaria de SEQ ID NO:15), en el que el elemento regulador en cis mejora la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. En otras realizaciones, un elemento regulador en cis para la construcción de ácido nucleico comprende SEQ ID NO:7 o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos, en el que los fragmentos, variantes, derivados o análogos mejoran la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado sin el elemento regulador en cis.

En algunas realizaciones, un elemento regulador en cis para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23, en el que el elemento regulador en cis mejora la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. En otras realizaciones, un elemento regulador en cis para la construcción de ácido nucleico comprende SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23 o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos, en el que los fragmentos, variantes, derivados o análogos mejoran la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado sin el elemento regulador en cis.

En otras realizaciones, un elemento regulador en cis para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:25, en el que el elemento regulador en cis mejora la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. En otras realizaciones, un elemento regulador en cis para la construcción de ácido nucleico comprende SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:25 o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos, en el que los fragmentos, variantes, derivados o análogos mejoran la especificidad de células endoteliales de un promotor, comparado sin el elemento regulador en cis.

La tabla 3 muestra diversas secuencias de elementos reguladores en cis útiles para la invención.

Tabla 3 - Promotores y elementos reguladores en cis específicos de células endoteliales

Un elemento regulador en cis para la presente invención puede estar unido a un promotor cadena arriba o cadena abajo del promotor, o estar insertado entre los dos nucleótidos en el promotor. El promotor específico de células endoteliales para la presente invención puede utilizar cualquier promotor conocido en la técnica. Por ejemplo, los promotores adecuados que pueden utilizarse para la presente invención incluyen los promotores específicos de células endoteliales preproendotelina-1 (promotor PPE-1), documento US 2010/0282634, publicado el 11 de noviembre de 11; y documento WO 2010/2011, publicado el 14 de julio de 2011); el promotor PPE-1-3X (patentes de EE. UU. n.os 7.579.327, 8.071.740, 8.039.261, US2010/0282634, US 2007/0286845, WO 2011/083464, y WO2011/083466); los promotores TIE-1 (S79347, S79346) y TIE-2 (U53603) [Sato T. N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 15 de octubre de 1993, 90(20); 9355-9658], el promotor de endoglina [Y11653; Rius C., Blood, 15 de diciembre de 1998, 92(12):4677-4690]; el factor de von Willerbrand [AF152417; Collins C. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, julio de 1987, 84(13):4393-4397]; el promotor KDR/flk [X89777, X89776; Ronicke V., Circ. Res., agosto de 1996, 79(2):277-285]; el promotor FLT-1 [D64016, AJ224863; Morishita K., J. Biol. Chem., 17 de noviembre de 1995, 270(46):27948-27953]; el promotor Egr-1 [AJ245926; Sukhatme V. P., Oncogene Res., septiembre-octubre de 1987, 1(4):343-355]; el promotor de E-selectina [Y12462; Collins T., J. Biol. Chem., 5 de febrero de 1991, 266(4):2466-2473]; los promotores de moléculas de adhesión endoteliales: ICAM-1 [X84737; Horley K. J., EMBO J., octubre de 1989, 8(10):2889-2896]; VCAM-1 [M92431; lademarco M. F., J. Biol. Chem., 15 de agosto de 1992, 267(23):16323-16329]; PECAM-1 [AJ313330, X96849; CD31, Newman P. J., Science, 9 de marzo de 1990, 247(4947):1219-1222]; los elementos específicos del músculo liso vascular: el promotor CArG box X53154 y promotor de proteína similar a carboxipeptidasa aórtica ("aortic carboxypeptidase-like protein", ACLP) [AF332596; Layne M. D., Circ, Res., 2002, 90, 728-736]; y el gen 1 expresado preferentemente aórtico [Yen-Hsu Chen, J. Biol. Chem., vol. 276, número 50, 47658-47663, 14 de diciembre, 2001].

En una realización, un promotor unido al potenciador específico de células endoteliales comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de SEQ I^dNO:17, en el que el promotor unido al elemento induce una especificidad de células endoteliales al gen unido operablemente al promotor. En otra realización, un promotor unido al elemento específico de células endoteliales comprende un fragmento, una variante, un derivado o un análogo de un promotor PPE-1 de tipo salvaje, en el que dicho fragmento, variante, derivado o análogo induce una especificidad de células endoteliales al gen unido operablemente al promotor. En un ejemplo, el elemento específico de células endoteliales puede insertarse entre los restos nucleotídicos 442 y 449 que corresponden a SEQ ID NO:17.

En otras realizaciones, un promotor específico de células endoteliales comprende un elemento de respuesta a la hipoxia. Un elemento de respuesta a la hipoxia ("hypoxia responsive element", HRE) se localiza sobre la hebra antisentido del promotor de endotelina-1. Este elemento es un sitio de unión del factor 1 inducible por hipoxia que es necesario para la regulación positiva del promotor de endotelina-1 (del gen humano, de rata y murino) por la hipoxia. La hipoxia es una señal potente que induce la expresión de varios genes, que incluyen la eritropoyetina (Epo), VEGF, y diversas enzimas glicolíticas. La secuencia central (8 pares de bases) está conservada en todos los genes que responden a condiciones hipóxicas, y las regiones flanqueantes son diferentes de otros genes. El elemento de respuesta a la hipoxia ET-1 está localizado entre los sitios de unión a GAT A-2 y a AP-1. En un ejemplo, un elemento de respuesta a la hipoxia comprende SEQ ID NO:26, o uno de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos.

En otras realizaciones, un promotor específico de células endoteliales útil para la invención comprende, consiste fundamentalmente o consiste en una secuencia de nucleótidos al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de SEQ ID NO:18, en el que el promotor unido al elemento regulador en cis induce una especificidad de células endoteliales al gen unido operablemente al promotor. En otra realización, un promotor específico de células endoteliales comprende un fragmento, una variante, un derivado o un análogo de SEQ ID NO:18, en el que dicho fragmento, variante, derivado o análogo induce una especificidad de células endoteliales al gen unido operablemente al promotor.

Pueden encontrarse otras variaciones de los promotores específicos de células endoteliales en los documentos WO2011/083464, WO2011/083466, y WO2012/052423.

La presente invención también proporciona una nueva secuencia de promotor que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:17. En un ejemplo, el promotor comprende además un elemento regulador en cis específico de células endoteliales. En un ejemplo, el elemento regulador en cis específico de células endoteliales comprende SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 o cualquiera de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos, en el que los fragmentos, variantes, derivados o análogos mejoran la especificidad de células endoteliales del promotor, comparado con un promotor sin el elemento regulador en cis. En otro ejemplo, el promotor comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:18. La invención incluye una construcción de ácido nucleico que comprende el nuevo promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga. En una realización, la secuencia de nucleótidos heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de quimera-Fas descrita en la presente. En otra realización, la secuencia de nucleótidos heteróloga comprende una secuencia de adenovirus.

C. Vector

La invención también proporciona un vector que comprende la construcción de ácido nucleico que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales. Para los objetivos de esta invención, pueden emplearse numerosos sistemas de vector. Por ejemplo, los diversos sistemas de transporte de genes víricos que pueden usarse en la práctica de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a un vector adenovírico, un vector de alfavirus, un vector de enterovirus, un vector de pestivirus, un vector lentivírico, un vector baculovírico, un vector de herpesvirus, un vector del virus de Epstein Barr, un vector papovavírico, un vector de poxvirus, un vector del virus de vaccinia, un vector de virus adenoasociado y un vector del virus del herpes simplex.

En otra realización, un vector que comprende un gen de quimera-FAS unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales es un adenovirus. Por ejemplo, el adenovirus puede ser uno o más de la especie A de adenovirus humano (serotipos 12, 18, y 31), B (serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, y 55), C (serotipos 1, 2, 5, 6, y 57), D (8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51, 53, 54, y 56), E (serotipo 4), F (serotipo 40 y 41), o G (serotipo 52). En una realización particular, el adenovirus para la invención es el adenovirus humano de serotipo 5. En algunas realizaciones, el adenovirus útil para la terapia génica es un adenovirus no replicante recombinante que no contiene una región E1 ni una región E3. En ciertas realizaciones, el adenovirus para la invención es un adenovirus de replicación condicionada que no contiene una región E3, pero sí contiene una región E1.

En una realización, el vector comprende, consiste fundamentalmente o consiste en SEQ ID NO:19. En otra realización, el vector de adenovirus es un virus aislado que tiene el n° de registro de la European Collection of Cell Cultures (ECACC) 13021201.

D. Depósitos biológicos

Los depósitos biológicos se realizaron en European Collection of Cell Cultures (ECACC) localizado en Health Protection Agency Culture Collections, Health Protection Agency, Microbiology Services, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, Reino Unido, según el Tratado de Budapest y según 37 C.F.R. § 1.808. Las muestras de los materiales depositados estarán disponibles al público tras la concesión de una patente. La invención descrita y reivindicada en la presente no está limitada por el alcance de la cepa depositada, puesto que la realización depositada solo pretende ser una ilustración de la invención.

Cepa n° de registro de ECACC Fecha de depósito

VB-111 13021201 12 de febrero de 2013

III. Antagonistas de VEGF

El VEGF, el factor de crecimiento endotelial vascular, es un mitógeno específico de células endoteliales y un inductor de la angiogénesis. El término VEGF incluye los miembros de la familia del gen VEGF: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, y VEGF-D. Se considera que VEGF-A es el miembro prototípico de la familia de genes VEGF. A través de un corte y empalme de exones alternativo, VEGF-A existe en cuatro isoformas diferentes: VEGF¹²¹, VEGF¹⁶⁵, VEGF¹⁸⁹, y VEGF²⁰⁶. Las cuatro isoformas de VEGF-A tienen una longitud de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos (respectivamente) después de la escisión de la secuencia señal.

Tras haber sido expresado, el VEGF se segrega fuera de la célula, donde se une a la región extracelular de un receptor de VEGF (VEGFR). Existen dos VEGFR principales, VEGFR-1 o VEGFR-2, siendo ambos receptores de tirosina quinasa. Un tercer VEGFR, VEGFR-3, es un receptor de tirosina quinasa relacionado que solo se une a VEGF-C y VEGF-D. Tras unirse a VEGF, el VEGFR señaliza acontecimientos corriente abajo que conducen a la proliferación de células endoteliales y a la angiogénesis. Se sabe que VEGF-C y VEGF-D regulan la angiogénesis linfática.

El gen VEGF contiene secuencias de nucleótidos que son altamente homólogas con las del factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1). Estas secuencias similares a HIF-1 permiten la inducción de la expresión del gen VEGF bajo condiciones hipóxicas. Así, en condiciones de un bajo contenido en oxígeno, tales como las que aparecen en el microentorno de un tumor, se induce la expresión del gen VEGF. La producción de niveles elevados de VEGF dentro del lecho de un tumor provoca una mayor señalización de VEGFR y, por tanto, de crecimiento de células endoteliales y angiogénesis. La formación de nuevos vasos sanguíneos dentro del tumor proporciona sangre y oxígeno al tumor en crecimiento.

Debido al papel destacado del VEGF en la angiogénesis y el crecimiento y desarrollo del tumor, se estudian a los antagonistas de VEGF como potenciales agentes terapéuticos para el cáncer. Los antagonistas de VEGF pueden evitar la actividad VEGF uniéndose directamente a VEGF y bloqueando su interacción con un VEGFR. Esto reduce la señalización desde el VEGFR y los acontecimientos corriente abajo, con lo cual se produce una reducción en la angiogénesis. En una realización, un antagonista de VEGF útil para la invención es un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF. En otra realización, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo quimérico. En otra realización, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF para la terapia comprende Fab, F(ab)², Fv, o scFv.

Otro tipo de antagonista de VEGF que puede reducir o inhibir la actividad VEGF es una molécula que se une a VEGFR y, por tanto, bloquea la interacción de VEGFR con VEGF. Esta interferencia de la unión del receptor/ligando evita la señalización de VEGFR y reduce la angiogénesis y la proliferación de células endoteliales. En una realización, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF. En otra realización, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo quimérico. En otra realización, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende Fab, F(ab)², Fv, o scFv.

Los antagonistas de VEGF que se unen a VEGF o VEGFR pueden inhibir la actividad VEGF mediante mecanismos de acción similares, ya que evitan la interacción del receptor/ligando, la señalización de VEGFR, y los acontecimientos de señalización corriente abajo, tales como la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis. Así, en una realización, el antagonista de VEGF se selecciona del grupo que consiste en bevacizumab (patente de EE. UU. n.° 7.169.901), ranibizumab (patente de EE. UU. n.° 7.297.334), VGX-100 (patente de e E. UU. n.° 7.423.125), r84 (patente de EE. UU. n.° 8.034.905), aflibercept (patente de Ee . UU. n.° 5.952.199), IMC-18F1 (patente de EE. UU. n.2 7.972.596), IMC-1C11 (documento PCT/US2000/02180), y ramucirumab (patente de EE. UU. n.° 7.498.414). Una molécula de unión a VEGF incluye otras formas de moléculas derivadas de anticuerpos, por ejemplo, un monocuerpo, un diacuerpo, un minicuerpo o cualquier proteína quimérica que comprenda al menos una CDR de un anticuerpo de unión a VEGF, por ejemplo, bevacizumab.

En una realización, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en V^hde CDR1 (SEQ ID NO:28), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:29), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:30), V^lde CDR1 (SEQ ID NO:31), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:32), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:33), y cualquiera de sus combinaciones. Véase la tabla 4.

Tabla 4 - Secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad

En otra realización, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende CDR1 (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:29), o CD^r3 (SEQ ID NO:30) de la región variable de cadena pesada (V^h) del bevacizumab. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF comprende CDR1 y CRD2 de V^h, CDR1 y CDR3 de V^h, CDR2 y CDR3 de V^h, o CDR1, CDR2 o CDR3 de V^h. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende CDR1 (SEQ ID NO:31), CDR2 (SEQ ID NO:32), o CDR3 (SEQ ID NO:33) de la región variable de cadena ligera (V^l) del bevacizumab. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF comprende CDR1 y CDR2 de V^l, CDR1 y CDR3 de V^l, CDR2 y CDR3 de V^l, o CDR1, CDR2 y CDR3 de V^l. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF comprende V^hdel bevacizumab. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF o una molécula de unión a VEGF comprende V^ldel bevacizumab.

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo anti-VEGF o la molécula de unión a VEGF comprende V^hde CDR1 (SEQ ID NO:28), V^hde CDR2 (SEQ ID NO:29), V^hde CDR3 (SEQ ID NO:30), V^lde CDR1 (SEQ ID NO:31), V^lde CDR2 (SEQ ID NO:32), y V^lde CDR3 (SEQ ID NO:33).

IV. Métodos de tratamiento que emplean adenovirus que expresan una proteína de quimera-FAS y un antagonista de VEGF

Una realización de la presente invención proporciona métodos para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF en un sujeto o en una población de sujetos que lo necesita, que comprenden administrar un vector que expresa una proteína de quimera-FAS en combinación con un antagonista de VEGF.

En un aspecto, la presente invención incluye un método para inhibir o reducir la angiogénesis en un sujeto o en una población de sujetos que lo necesita, que comprende (i) identificar un sujeto o una población de sujetos como candidatos para una mejora en la capacidad de respuesta a un tratamiento con un antagonista de VEGF, y (ii) administrar un vector que codifica una proteína de quimera-FAS y el antagonista de VEGF al sujeto o la población de sujetos, en el que el sujeto o la población de sujetos presenta una mejora en la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF después de la administración del vector.

En otro aspecto, la presente invención incluye un método para inhibir o reducir la angiogénesis en un sujeto o en una población de sujetos que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada a un antagonista de VEGF, que comprende administrar un vector que codifica una proteína de quimera-FAS y el antagonista de VEGF al sujeto o la población de sujetos, en el que el sujeto o la población de sujetos presenta una mejora en la capacidad de respuesta a un antagonista de VEGF después de la administración del vector.

En otros aspectos, la identificación de un sujeto o una población de sujetos como candidatos para una mejora en la capacidad de respuesta a un tratamiento con un antagonista de VEGF comprende (a) administrar un antagonista de VEGF por sí solo, (b) medir la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF, (c) administrar un vector que codifica una proteína de quimera-FAS, (d) administrar el antagonista de VEGF, (e) medir la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF en (d), y (f) comparar la capacidad de respuesta en (b) con la capacidad de respuesta en (d). El sujeto o la población de sujetos que muestra una mayor capacidad de respuesta en (e) que en (b) puede identificarse como un sujeto que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada al antagonista de VEGF. El sujeto o la población de sujetos que muestra una capacidad de respuesta igual entre (b) y (e), o una mayor capacidad de respuesta en (b) que en (e) puede identificarse como no candidato y ser excluido de una terapia posterior.

En una realización, la invención se dirige a un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de VEGF al sujeto, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector. En otra realización, la invención proporciona un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende: (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector, y (ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto. En otras realizaciones, la invención incluye un método para inducir la apoptosis de una célula endotelial en un tumor de un sujeto que lo necesita, que comprende (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, (ii) administrar un antagonista de VEGF al sujeto, y (iii) medir la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto aumenta después de la administración del vector. En otras realizaciones, el tamaño del tumor del sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un antagonista de VEGF al sujeto, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector y antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que el tamaño del tumor en el sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende: (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector, y (ii) administrar un antagonista de VEGF al sujeto, en el que el tamaño del tumor en el sujeto se reduce después de la administración del antagonista de VEGF. La presente invención también incluye un método para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende: (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, (ii) administrar un antagonista de VEGF al sujeto, y (iii) medir la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector. En otras realizaciones, el tamaño del tumor se reduce comparado con el tamaño del tumor de un sujeto al que no se le administra el vector antes de la administración del antagonista de VEGF. En otras realizaciones, el tamaño del tumor se mide comparando el tamaño del tumor antes de la administración del antagonista de VEGF y el tamaño del tumor después de la administración del antagonista de VEGF.

En ciertas realizaciones, la invención incluye un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende administrar un antagonista de VEGF a un sujeto que lo necesita, en el que al sujeto se le administra un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales antes de la administración del antagonista de VEGF, y en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector y antes de la administración del antagonista de VEGF. La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector, y (ii) administrar el antagonista de VEGF al sujeto. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con un tumor en un sujeto, que comprende (i) administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales, (ii) administrar un antagonista de VEGF al sujeto, y (iii) medir la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF, en el que la capacidad de respuesta del sujeto al antagonista de VEGF aumenta después de la administración del vector. En otras realizaciones, el tumor del sujeto progresa después de la administración del vector.

En algunas realizaciones, la invención incluye un método para identificar un candidato para una terapia con un antagonista de VEGF, que comprende (i) medir el tamaño de un tumor de un sujeto al que se le ha diagnosticado un tumor antes de administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales al sujeto, y (ii) medir la progresión del tumor después de la administración del vector, en el que el sujeto se identifica como un candidato después de que el tumor haya progresado. En otras realizaciones, la invención proporciona un método para identificar un candidato para una terapia con un antagonista de VEGF, que comprende (i) medir el tamaño de un tumor de un sujeto al que se le ha diagnosticado un tumor antes de administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales al sujeto, (ii) medir la progresión del tumor después de la administración del vector, en el que el sujeto se identifica como un candidato después de que el tumor haya progresado, y (iii) dar instrucciones a un asistente médico para que administre un antagonista de VEGF al sujeto. En ciertos aspectos, la progresión del tumor se mide mediante el crecimiento del tumor. En algunas realizaciones, la progresión clínica se evalúa por medio del deterioro clínico en las señales y los síntomas neurológicos de los pacientes, tales como debilidad muscular y estado mental.

En una realización concreta, el crecimiento del tumor se mide mediante MRI. En otras realizaciones, el tumor del sujeto es un tumor recurrente que surge durante el tratamiento con el vector. En otras realizaciones, el tumor del sujeto es un tumor metastásico que surge durante el tratamiento con el vector.

El término “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” significa cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, que tiene o que se espera que tenga una capacidad de respuesta mayor o mejorada a un antagonista de VEGF. En algunas realizaciones, el sujeto es cualquier sujeto que previamente no respondía a un antagonista de VEGF, pero que acaba por responder al antagonista de VEGF después de la exposición al vector. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un paciente con cáncer.

La expresión “un sujeto o una población de sujetos que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada a un antagonista de VEGF”, tal como se emplea en la presente, indica que el sujeto o la población de sujetos ha sido identificado como candidato o candidatos para la terapia de combinación. El sujeto o la población de sujetos puede identificarse como candidato o candidatos para la terapia de combinación antes de la administración del vector o del antagonista de VEGF.

En ciertas realizaciones, la identificación de un candidato para la terapia de combinación comprende medir diversas características de la angiogénesis tumoral, por ejemplo, una reducción en el tamaño del tumor, la inhibición del crecimiento del tumor, una reducción en la angiogénesis, una reducción en la neovascularización, o cualquier característica conocida de la angiogénesis.

En un aspecto, el sujeto o la población de sujetos que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada a un antagonista de VEGF presenta un tumor o una metástasis de este, y el antagonista de VEGF y el vector tratan, disminuyen o reducen el tamaño de un tumor o una metástasis de este. En otro aspecto, el sujeto o la población de sujetos que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada a un antagonista de VEGF necesita la inhibición de la angiogénesis, y el antagonista de VEGF y el vector tratan, disminuyen, previenen o reducen la angiogénesis. En otros aspectos, el sujeto o la población de sujetos que necesita una capacidad de respuesta inducida o mejorada a un antagonista de VEGF tiene cáncer, y el vector y el antagonista de VEGF tratan el cáncer. En ciertos aspectos, tras identificar al sujeto o a la población de sujetos como candidatos, el antagonista de VEGF se administra antes de administrar el vector, al mismo tiempo que la administración de un vector, o después de la administración de un vector. En otros aspectos, tras identificar la sujeto o a la población de sujetos como candidatos, el vector se administra antes del antagonista de VEGF al menos un día antes, al menos dos días antes, al menos tres días antes, al menos cuatro días antes, al menos cinco días antes, al menos seis días antes, al menos siete días antes, al menos nueve días antes, al menos 10 días antes, al menos dos semanas antes, al menos tres semanas antes, al menos cuatro semanas antes, al menos un mes antes, al menos dos meses antes, o más.

En una realización de la presente invención, la invención incluye un método para estabilizar una enfermedad o un trastorno asociado con un cáncer. En algunas realizaciones, la invención incluye un método para estabilizar una enfermedad o un trastorno asociado con el cáncer colorrectal metastásico ("metastatic colorectal cancer", mCRC), cáncer de pulmón no microcítico no escamoso avanzado ("nonsquamous non-small cell lung cancer", NSCLC), carcinoma de células renales metastásico ("metastatic renal cell carcinoma", mRCC), glioblastoma multiforme (GBM), cáncer mülleriano, cáncer ovárico, cáncer peritoneal, cáncer de trompas de Falopio, o carcinoma seroso papilar uterino. En unos aspectos, la presente invención reduce el volumen de un fluido peritoneal maligno, por ejemplo, fluido de ascitis, reduce el dolor del sujeto, prolonga la supervivencia del sujeto, o cualquiera de sus combinaciones. El tumor que puede reducirse, inhibirse o tratarse con la combinación del vector y el antagonista de VEGF puede ser un tumor sólido, un tumor primario o un tumor metastásico. El término “metastásico” o “metástasis” se refiere a células tumorales que son capaces de establecer lesiones de tumores secundarios en otras partes u otros órganos.

Un “tumor sólido” incluye, pero no se limita a sarcoma, melanoma, carcinoma, u otro cáncer de tumor sólido. Un “sarcoma” se refiere a un tumor que está formado por una sustancia, tal como tejido conectivo embrionario, y en general está compuesto de células muy compactadas dentro de una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma de partes blandas alveolares, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioides, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromático, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquístico, sarcoma sinovial, o sarcoma telangiectáltico.

El término “melanoma” se refiere a un tumor se surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma lentiginoso acral, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma maligno de lentigo, melanoma maligno, melanoma metastásico, melanoma nodular, melanoma subungal, o melanoma de propagación superficial.

El término “carcinoma” se refiere a un crecimiento nuevo maligno formado por células epiteliales propensas a infiltrarse en los tejidos circundantes y producir metástasis. Los ejemplos de carcinomas incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma quístico adenoide, carcinoma adenomatoso, carcinoma de córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedocarcinoma, carcinoma de corpus, carcinoma cribriforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epiermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma de úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de la matriz capilar, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma blando, carcinoma mucinoso, carcinoma mucoso, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células en avena, carcinoma ossificans, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma escirro, carcinoma del escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoides, carcinoma de células en huso, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cuerda, carcinoma telangiectático, carcinoma telangiectiode, carcinoma de células de transición, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso, o carcinoma velloso.

Otros cánceres que pueden inhibirse o tratarse incluyen, por ejemplo, leucemia, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón microcíticos, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de la vejiga urinaria, lesiones de la piel premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides papilar, neuroblastoma, cáncer neuroendocrino, cáncer esofágico, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer cortical adrenal, cáncer de próstata, cáncer mülleriano, cáncer ovárico, cáncer peritoneal, cáncer de las trompas de Falopio, o carcinoma seroso papilar uterino.

En otras realizaciones, el sujeto ha recibido hasta tres, hasta dos o hasta una línea previa de quimioterapia. En otras realizaciones, el sujeto no ha recibido más de 3 líneas previas de quimioterapia para un cáncer recurrente.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en un sujeto o una población de sujetos que lo necesita, que comprende administrar un vector que comprende un gen de quimera-Fas unido operablemente a un promotor específico de células endoteliales y el antagonista de VEGF al sujeto o la población de sujetos, en el que la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF se induce o mejora después de la administración del vector, comparado con la capacidad de respuesta al antagonista de VEGF sin la administración del vector.

En ciertas realizaciones, tras identificar al sujeto o a la población de sujetos como candidatos, el método comprende además administrar dosis repetidas del antagonista de VEGF y el vector.

La dosis del vector administrada como parte de la presente invención puede medirse en partículas de virus (PV). En una realización, la dosis del vector en la terapia de combinación con bevacizumab es menor que la dosis que se emplea para la terapia sin bevacizumab (por ejemplo, una terapia que emplea el vector por sí solo). Por ejemplo, una cantidad eficaz del vector en la terapia de combinación con bevacizumab incluye, pero no se limita a igual o menor que aproximadamente 1x1013, 9x1012, 8x1012, 7x1012, 6x1012, 5x1012, 4x1012, 3x1012, 2x1012, 1x1012, 9X1011, 8x1011, 7x1011, 6x1011, 5x1011, 4x1011, 3x1011, 2x1011, 1x1011, 9x1010, 8x1010, 7x1010, 6x1010, 5x1010, 4x1010, 3x1010, 2x1010, o 1 x1010 partículas de virus.

En una realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1011 partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1012 partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1013 partículas de virus. En otra realización, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1014 partículas de virus. En otras realizaciones, el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente1x107, 1 x108, 1x109, 1x1010, o 5x1010 partículas de virus.

Las dosis del antagonista de VEGF (por ejemplo, bevacizumab) puede medirse en mg/kg de peso corporal. En un aspecto, la dosis de bevacizumab en la terapia de combinación con el vector es menor que la dosis de bevacizumab sin el vector (por ejemplo, una terapia que emplea el bevacizumab por sí solo). Los ejemplos no limitantes de una cantidad eficaz de bevacizumab incluyen igual o menor que aproximadamente 15 mg/kg, 14 mg/kg, 13 mg/kg, 12 mg/kg, 11 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg. En una realización específica, el vector se administra en una cantidad eficaz de 3x1012 a 1x1013 PV, y el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz de 5 mg/kg a 15 mg/kg.

La presente invención proporciona métodos para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a antagonistas de VEGF, que comprenden administrar un vector y un antagonista de VEGF. El régimen usado para administrar el vector y el antagonista de VEGF comprende la administración repetida del vector y bevacizumab. En una realización, el vector se administra repetidas veces a diario, una vez en aproximadamente 2 días, una vez en aproximadamente 3 días, una vez en aproximadamente 4 días, una vez en aproximadamente 5 días, una vez en aproximadamente 6 días, una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 5 semanas, una vez en aproximadamente 6 semanas, una vez en aproximadamente 7 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, o una vez en aproximadamente 6 meses. En otra realización, el bevacizumab se administra repetidas veces una vez en aproximadamente 7 días, una vez en aproximadamente 2 semanas, una vez en aproximadamente 3 semanas, una vez en aproximadamente 4 semanas, una vez en aproximadamente 2 meses, una vez en aproximadamente 3 meses, una vez en aproximadamente 4 meses, una vez en aproximadamente 5 meses, o una vez en aproximadamente 6 meses. En una realización particular, el vector se administra cada 2 meses, y el bevacizumab se administra cada 2 semanas.

V. Composiciones farmacéuticas

En la invención también se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector que expresa una proteína de quimera-FAS empleada en los métodos de la invención. La composición farmacéutica puede formularse para la administración a mamíferos, incluyendo seres humanos. Las composiciones farmacéuticas usadas en los métodos de esta invención comprenden vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como la albúmina de suero humana, sustancias tamponantes, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, bifosfato de disodio, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. En una realización, la composición se formula añadiendo disolución salina.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, por vía parenteral (que incluye, por ejemplo, técnicas infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal), intraventricular, oral, mediante un pulverizado para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. Tal como se describió previamente, la composición comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un gen de quimera-FAS en una célula endotelial y, con ello, induce la apoptosis de la célula endotelial. Por consiguiente, la composición puede inhibir, reducir o disminuir el tamaño de un tumor, o una metástasis de este, mediante la inhibición de la neovascularización y/o la angiogénesis de las células endoteliales tumorales. De modo similar, el antagonista de VEGF usado en combinación con la construcción de ácido nucleico inhibe la neovascularización y/o la angiogénesis a través de la inhibición directa de la actividad VEGF. Por tanto, en una realización, la terapia de combinación se administra de modo sistémico o local. Para la administración sistémica o local, la formulación farmacéutica que contiene la construcción de ácido nucleico, el adenovirus, o la población homogénea del adenovirus puede utilizar un dispositivo mecánico, tal como una aguja, una cánula o instrumentos quirúrgicos.

Las formas inyectables estériles de las composiciones usadas en los métodos de la invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse según técnicas conocidas en la técnica empleando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes suspensores. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una suspensión en 1,3-butandiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer y la disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, de modo convencional se emplean aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, que incluye mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicérido, son útiles para la preparación de inyectables, así como los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, en especial en sus versiones polioxietiladas. Estas disoluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un dispersante o diluyente de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares, que se emplean de modo habitual en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos que se emplean habitualmente, tales como Tween, Span y otros agentes emulgentes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan habitualmente para la fabricación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptable sólidas, líquidas o de otro tipo, también pueden usarse para la formulación.

Las formulaciones parenterales pueden ser una única dosis en embolada, una infusión o una dosis en embolada de carga, seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse en intervalos fijados o variables específicos, por ejemplo, una vez diaria, o “según sea necesario”.

Ciertas composiciones farmacéuticas usadas en los métodos de esta invención pueden ser administradas por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también pueden administrarse mediante inhalación o aerosol nasal. Estas composiciones pueden prepararse como disoluciones en disolución salina, empleando alcohol bencílico u otro conservante adecuado, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad y/u otros agentes dispersantes o solubilizantes convencionales.

Una cantidad eficaz del agente quimioterapéutico está disponible en la técnica. En un aspecto, por ejemplo, una cantidad eficaz de bevacizumab puede ser al menos aproximadamente 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, o 5 mg/kg.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción y clonación del vector vírico

El vector se construyó empleando un esqueleto que contiene la mayor parte del genoma del adenovirus de tipo 5, así como una homología parcial con un plásmido adaptador, que permite la recombinación.

Se delecionó la unidad transcripcional temprana E1 del esqueleto del plásmido, que fue modificado posteriormente delecionando pWE25 y el sitio de marcador de selección de resistencia a la ampicilina (Amp).

El plásmido adaptador, que contiene secuencias de Ad5, promotor de CMV, MCS, y poliA de SV40, se modificó para delecionar el promotor de CMV, y se insertaron el promotor PPE-1 y el fragmento Fas-c mediante digestión de restricción. Se utilizaron el promotor PPE-1 modificado (PPE-1-3X, ^sE^qID NO:18) y el transgén de quimera-Fas (Fas-c, SEQ ID NO:9) para la construcción del vector adenovírico. Se construyó el elemento PPE-1-(3X)-Fas-c (2115 pb) a partir del elemento PPE-1-(3X)-luc. Este elemento contiene 1,4 kb del promotor de preproendotelina murino PPE-1-(3X), el gen de luciferasa, el sitio de poliA de SV40 y el primer intrón del gen ET-1 murino, originado a partir del plásmido pEL8 (8848 pb) usado por Harats et al. (Harats D. et al., JCI, 1995). Se extrajo el módulo PPE-3-Luc del plásmido pEL8 empleando la enzima de restricción BamHI. El gen de luciferasa se sustituyó por el gen Fas-c [compuesto de los dominios extracelular e intramembrana de TNF-R1 (receptor 1 del factor de necrosis tumoral humano, SEQ ID NO:4) y el dominio intracelular de Fas (p55) (SEQ ID NO:8) (Boldin et al., JBC, 1995)] para obtener el módulo PPE-1-3X-Fas-c.

Plásmido PPE-1 (3X)-Fas-c - El módulo después se introdujo en el esqueleto del plásmido mediante digestión de restricción, produciendo el plásmido PPE-1 (3X)-Fas-c.

Plásmido adaptador-PPE-1(3X)-Fas-c - Se extrajo el elemento PPE-1-3X-Fas-c de la construcción del plásmido PPE-1-3X-Fas-c de primera generación, y se amplificó con cebadores de PCR indicados, introduciendo sitios de restricción SnaBI y EcoRI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Estos sitios se emplearon para clonar el fragmento PPE-Fas-c en el plásmido adaptador digerido con SnaBI y EcoRI, produciendo el adaptador-PPE-1-3X-Fas-c usado para la transfección de las células hospedantes (por ejemplo, células PER.C6).

Ejemplo 2: Administración de bevacizumab a pacientes previamente tratados con Ad5-PPE-1-3X-Fas-c OBJETIVOS: Los objetivos de este estudio son: (i) evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de dosis individuales y múltiples de VB-111 (1x1012, 3x1012, 1x1013 partículas víricas [PV]) en pacientes con glioblastoma multiforme recurrente ("recurrent glioblastoma multiforme", GBM); (ii) evaluar la distribución de VB-111 después de múltiples infusiones IV y el nivel de anticuerpos contra el vector adenovírico ; y (iii) evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de un tratamiento de combinación de múltiples dosis de VB-111 (3x1012, o 1x1013 partículas víricas) junto con bevacizumab en pacientes con GBM recurrente. Un ejemplo de dicho régimen de tratamiento se muestra en la figura 1.

El VB-111 y el bevacizumab son ambos agentes antiangiogénicos que se dirigen a la vasculatura del tumor. Sin embargo, se basan en dos MOA (mecanismos de acción) distintos: el bevacizumab antagoniza a VEGF, mientras que VB-111 altera directamente los vasos angiogénicos.

Selección de pacientes

Criterios de inclusión

Los sujetos deben presentar un diagnóstico confirmado mediante histología de glioblastoma multiforme o gliosarcoma. Los sujetos con enfermedad recurrente cuya patología de diagnóstico confirma un glioblastoma multiforme o gliosarcoma no necesitan volver a someterse a biopsia;

Enfermedad mensurable mediante los criterios RANO (véase Selección, Día -21-0); véase también la tabla 8 en el ejemplo 4;

Sujetos >18 años;

Progresión de la enfermedad o recurrencia después de un tratamiento convencional con temozolomida y radiación; Un intervalo de al menos 4 semanas entre una resección quirúrgica previa y el alistamiento en el estudio;

Un intervalo de al menos 12 semanas entre una radioterapia previa o al menos 4 semanas desde una quimioterapia previa, y el alistamiento en este protocolo;

Recuperado hasta el grado 1 o menor de los efectos tóxicos de cualquier intervención anterior;

Estado de actuación de Karnofsky de al menos 60%;

Función renal, hepática y de médula ósea adecuadas según los siguientes criterios:

- Recuento absoluto de neutrófilos >1500 células/ml

- Plaquetas >125.000 células/ml

- Bilirrubina total dentro del límite superior del normal ("upper limit of normal", ULN)

- Aspartato aminotransferasa (AST) <2,5x ULN institucional

- Creatinina menor o igual al ULN o eliminación de la creatinina >50 ml/min para pacientes con niveles de creatinina por encima de los límite normales (eliminación de la creatinina calculada mediante la fórmula de Cockcroft-Gault, véase apéndice II).

- PT, PTT (en segundos) prolongados más allá de >20% de los límites superiores del normal.

Los sujetos deben tratarse con corticosteroides en el día 0. Los sujetos que ya están recibiendo esteroides deben mantenerse en una dosis estable durante al menos 1 semana antes de la inclusión sin que se prevea la necesidad de aumentar la dosis de esteroides durante el estudio;

Capacidad para comprender y voluntad de firmar un documento de consentimiento informado escrito;

Los hombres y las mujeres fértiles deben utilizar un método anticonceptivo convencional durante el desarrollo del ensayo.

Criterios de elegibilidad adicionales para las cohortes 1 y 2:

Sujetos sin efecto de masa importante del tumor (definido como desplazamiento <5 mm, sin hernia).

Criterios de elegibilidad adicionales para las cohortes 3-4 para más dosificaciones:

Sujetos que recibieron VB-111 al menos hace 2 meses y siguen sin presentar indicios de progresión de la enfermedad durante al menos 2 meses después de la dosificación. Nota: Los sujetos que recibieron la primera dosis más de 2 meses antes de la aprobación de esta modificación de múltiples dosis pueden ser elegidos para recibir la 2a dosis más tarde de 2 meses después de la primera dosis, con la condición de que se mantengan con una enfermedad estable. Los sujetos que han progresado más tarde de 2 meses después de la dosis de línea de base pueden ser elegidos para el protocolo de uso compasivo VB-111-122-CU. Los sujetos que progresaron antes de 2 meses después de la dosificación abandonarán el estudio.

En los sujetos que sufrieron un acontecimiento adverso relacionado con el fármaco VB-111 y que están programados para repetir la dosis, esta se retrasará hasta que la gravedad del acontecimiento no sea mayor que CTCAE de grado 1.

En los sujetos que sufrieron una prolongación de un PTT y que están programados para repetir la dosis, esta se retrasará hasta que el PTT se haya normalizado, volviendo a dentro del 20% del valor de línea de base, tanto si cualquier ensayo de LAC o APLA positivo se haya o no normalizado. Los sujetos con acontecimientos de sangrado o trombóticos clínicamente significativos relacionados con un PTT prolongado no deberían recibir más dosis de VB-111.

Criterios de exclusión

Terapia antiangiogénica previa que incluye agentes secuestrantes de VEGF (concretamente, bevacizumab, aflibercept, etc.) o inhibidores de VEGFR (cedirinib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, etc.);

Radioterapia estereotáctica previa;

Mujeres embarazadas o que están dando el pecho;

Medicación concomitante que pueda interferir con los resultados del estudio, por ejemplo, agentes inmunosupresores distintos de corticosteroides;

Infección activa;

Evidencia de hemorragia del SNC de CTCAE de grado 2 o mayor en MRI de línea de base;

Previsión de recibir cirugía durante el periodo del estudio;

Sujetos que han padecido un acontecimiento cardíaco agudo dentro de los últimos 12 meses;

Sujetos con enfermedad vascular activa, miocárdica o periférica (concretamente, síndrome coronario agudo, ictus cerebral, ataque isquémico transitorio o trombosis arterial, o enfermedad vascular periférica sintomática dentro de los últimos 3 meses);

Sujetos con retinopatía proliferativa y/o vascular conocida;

Sujetos con enfermedad hepática conocida (alcohólica, inducida por fármacos/toxinas, genética, o autoinmunológica);

Sujetos con malignidades secundarias activas conocidas;

Sujetos que son positivos a uno de los siguientes virus: VIH, VHB y VHC;

Sujetos que se han sometido a cirugía mayor dentro de las últimas 4 semanas antes del alistamiento;

Sujetos que no han recibido ningún otro agente de investigación dentro de las últimas 4 semanas antes del alistamiento;

Enfermedades intercurrentes descontroladas que incluyen, pero no se limitan a una infección en curso o activa, insuficiencia cardíaca congestiva sintomática, angina de pecho inestable, arritmia cardíaca o enfermedad psiquiátrica/situaciones sociales que limiten el cumplimiento de los requisitos del estudio.

Criterios de exclusión exclusivos del bevacizumab

Hipertensión no controlada adecuadamente (definida como presión sanguínea sistólica >150 mmHg y/o presión sanguínea diastólica >100 mmHg) dentro de 28 días del primer tratamiento del estudio;

Historia previa de crisis hipertensiva, encefalopatía hipertensiva, síndrome de leucoencefalopatía posterior reversible ("reverse posterior leukoencephalopathy syndrome", RPLS);

Historia previa de perforación gastrointestinal o abscesos;

Enfermedad cardiovascular clínicamente significativa (es decir, activa), por ejemplo, accidentes cerebrovasculares <6 meses antes del alistamiento en el estudio, infarto de miocardio <6 meses antes del alistamiento en el estudio, angina inestable, insuficiencia cardíaca congestiva ("congestive heart failure", CHF) de grado II o mayor según New York Heart Association (NYHA), o arritmia cardíaca grave no controlada mediante medicación o que potencialmente pueda interferir con el tratamiento del protocolo;

Historia o evidencia tras un examen físico/neurológico de una enfermedad del sistema nervioso central (por ejemplo, ataques) no relacionada con cáncer o que potencialmente pueda interferir con el tratamiento del protocolo (a menos que se controle de modo adecuado mediante medicación);

Enfermedad vascular significativa (por ejemplo, aneurisma aórtico que requiere reparación quirúrgica o trombosis arterial reciente) dentro de los 6 meses anteriores al inicio del tratamiento del estudio. Cualquier tromboembolia venosa previa >acontecimiento adverso de criterio de toxicidad común de NCI ("common toxicity criteria adverse event", C^tCAE) de grado 3;

Historia de hemorragia/hemoptisis pulmonar >grado 2 (definida como >2,5 ml de sangre de color rojo brillante por episodio) dentro de 1 mes del primer tratamiento del estudio;

Historia o evidencia de diatesis sangrante heredada o coagulopatía significativa en riesgo de sangrado (es decir, en ausencia de anticoagulación terapéutica);

Uso actual o reciente (dentro de 10 días del alistamiento del estudio) de aspirina (>325 mg/día), clopidogrel (>75 mg/día) o equivalentes. Se permite el uso profiláctico de anticoagulantes;

Procedimiento quirúrgico (incluyendo biopsia previa, resección quirúrgica, revisión de heridas o cualquier otra cirugía mayor que implique la entrada en una cavidad corporal) o lesión traumática significativa dentro de 28 días antes del primer tratamiento del estudio, o previsión de necesitar un procedimiento de cirugía mayor durante el desarrollo del estudio;

Procedimiento de cirugía menor, por ejemplo, biopsia estereotáctica, dentro de 7 días del primer tratamiento del estudio; colocación de un dispositivo de acceso vascular, dentro de 2 días del primer tratamiento del estudio;

Historia de abscesos intracraneales dentro de 6 meses antes del primer tratamiento del estudio;

Historia de sangrado gastrointestinal activo dentro de 6 meses antes del primer tratamiento del estudio;

Herida no curada grave, úlcera activa o fractura de hueso no tratada;

Hipersensibilidad conocida a cualquier componente del bevacizumab o a cualquiera de los fármacos del estudio. Proteinuria durante la selección, demostrada por:

- Proteína de la orina: proporción de creatinina (UPC) >1,0 en la selección, o

- Tiras reactivas para la orina para la proteinuria >2+ (los pacientes que presentan >2+ de proteinuria tras un análisis con tiras reactivas para la orina en la línea de base deben someterse a una recogida de orina de 24 horas y deben mostrar <1 g de proteína en 24 horas para poder ser elegidos).

Plan de tratamiento

Este será un estudio de fase / , multicéntrico, con escalada de dosis, abierto y prospectivo para medir la seguridad, la tolerabilidad, la distribución y la eficacia de dosis individuales o múltiples de VB-111 administrado por vía intravenosa en pacientes con GBM recurrente.

Cohortes de dosis

El VB-111 se administrará como una única infusión intravenosa de 1x1012 (cohorte 1) o 3x1012 PV (cohorte 2), o múltiples infusiones intravenosas que consisten en una infusión inicial de 3x1012, seguida de posteriores infusiones de 1x1013 (cohorte 3) o múltiples infusiones intravenosas de 1x1013 (cohorte 4).

Los pacientes elegibles, que hayan dado su consentimiento, se alistarán en una de cuatro cohortes de dosificación secuencial como sigue:

Tabla 5 - Plan de dosificación

El estudio se llevará a cabo según el método de 2 etapas de Simon. Se prevé que hasta 90 sujetos se alistarán en este estudio, con hasta 29 sujetos en la cohorte 3, y hasta 49 sujetos en la cohorte 4.

La etapa uno incluirá los primeros 10 pacientes evaluables al nivel de dosis de 1x1013 PV o MTD.

Para el análisis de la eficacia, los pacientes evaluables se definen como los pacientes que han recibido al menos una dosis repetida de 1x1013 PV o de MTD, o los pacientes que han progresado antes de 2 meses después de una dosis inicial de 1x1013 PV.

Se considera que un sujeto responde si está vivo y sin progresión a los 6 meses o presenta al menos una respuesta tumoral parcial según los criterios de Rano dentro de 6 meses después de la dosificación. Si se observan menos de 2 respuestas en los sujetos de la etapa 1 se detendrá la etapa 2, y por lo demás se alistarán 19 sujetos más en la etapa 2.

Escalada de la dosis y toxicidad limitantes de la dosis

Las toxicidades se clasificarán según los criterios de toxicidad habituales de NCI, versión 4.0. La toxicidad limitante de la dosis ("dose limiting toxicity", DLT) es cualquier toxicidad de grado 3 o mayor que se considera que está relacionada con el fármaco y que no responde a una terapia médica máxima.

Cohortes 1 y 2:

Se alistaron tres sujetos secuencialmente para recibir 1x1012 (cohorte 1) y se observaron durante 28 días para el control de DLT. No se produjeron DLT en la cohorte 1 y el estudio siguió con la cohorte 2.

Se alistaron tres sujetos secuencialmente para recibir 3x1012 (cohorte 2) y se observaron durante 28 días para DLT. No se indicaron DLT en la cohorte 2 y el estudio siguió con la cohorte 3.

Cohorte 3:

Los sujetos de estudio se alistaron inicialmente en esta cohorte para recibir una única dosis. Tras la aprobación de la versión 6.0 del protocolo, los sujetos que permanecían estables empezaron a recibir dosis bimensuales de VB-111 tras establecer su seguridad con dosis repetidas a una tasa de 1x1013 PV.

Cohorte 4:

Los sujetos de estudio se alistaron secuencialmente en la cohorte de múltiples dosis 4 y recibirán VB-111 a 1x1013 PV cada 2 meses.

Cohortes 3-4 EXT:

T ras la progresión de la enfermedad, los sujetos recibirán una combinación de VB-111 y bevacizumab. Los primeros sujetos que reciban este tratamiento de combinación se controlarán para DLT según lo siguiente:

Etapa 1: Un mínimo de 3 sujetos recibirán dosis bimensuales de VB-111 (3x1012 PV) y bevacizumab dos veces semanales (10 mg/Kg).

Etapa 2: Un mínimo de 3 sujetos recibirán dosis bimensuales de VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab dos veces semanales (10 mg/Kg).

Se remite al control para las toxicidades limitantes de la dosis, a continuación, para más detalles sobres el control de DLT en las cohortes 3-4.

Control para las toxicidades limitantes de la dosis:

Se realizó un control para DLT para establecer la seguridad al inicio de cada escalada del nivel de dosis (cohortes 1 4; 1x1012-1x1013 PV). No se han observado DLT en este estudio hasta la fecha y, por tanto, el estudio ha seguido según lo planeado.

Para las cohortes 3-4 EXT:

Etapa 1: Tras cada aprobación del IRB local de esta modificación del protocolo (7.0), los primeros tres sujetos que progresaron después de recibir al menos una dosis de 1x1013 PV (inicial o repetida) recibirán una combinación de una dosis reducida de VB-111 (3x1012 PV) y bevacizumab (10 mg/kg). Estos sujetos se controlarán para DLT tras esta primera dosis de combinación [puesto que es necesario un mínimo de 2 meses entre las dosis de VB-111, si un sujeto progresa antes de 2 meses, el sujeto empezará el tratamiento con bevacizumab (10 mg/kg) cada 2 semanas, y a los 2 meses desde la última dosis de VB-111, el sujeto recibirá la dosis de 3x1012 PV de VB-111].

Entre los primeros 3 sujetos alistados, si se observa 1 DLT dentro de 4 semanas después de la dosis de combinación inicial, 3 sujetos adicionales recibirán una dosis de combinación y se volverá a evaluar la seguridad. Si dos de seis sujetos que han recibido una dosis de combinación de VB-111 (3x1012 PV) y bevacizumab (10 mg/kg) sufren un DLT, la dosificación en las cohortes 3-4 EXT se detendrá, y todos los sujetos que han progresado recibirán un seguimiento a largo plazo y para la supervivencia.

Si no se observan DLT o solo se observa 1 DLT en 6 pacientes, las dosificaciones posteriores aumentarán hasta los niveles de la etapa 2: VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg), véase a continuación.

Se alistaron tres sujetos secuencialmente y recibieron 3x1012 PV y bevacizumab (10 mg/kg), y se observaron durante 28 días para DLT. No se han observado DLTS en este estudio hasta la fecha y, por tanto, el estudio ha seguido según lo planeado hasta la terapia de combinación de la etapa 2: VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg), véase a continuación.

Etapa 2:

El control de DLT se realizará para un mínimo de 3 sujetos durante 4 semanas desde la primera dosis de combinación de VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg).

Entre los primeros 3 sujetos alistados en la dosificación de la etapa 2, si se observa 1 DLT dentro de 4 semanas después de la dosis de combinación inicial, 3 sujetos adicionales recibirán una dosis de combinación y se volverá a evaluar la seguridad.

Si dos de seis sujetos que han recibido una dosis de combinación de VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg) sufren un DLT, todas las dosis futuras en las cohortes 3-4 EXT se reducirán hasta VB-111 a 3x1012 PV y bevacizumab (10 mg/kg).

Si no se observan DLT o solo se observa 1 DLT en 6 pacientes, todas las dosificaciones futuras de las cohortes 3-4 EXT seguirán según lo planeado: VB-111 (1x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg).

Para tener el tiempo suficiente para controlar los DLT, el programa de las dosis de combinación requerirá la aprobación previa de VBL.

Se alistaron tres sujetos secuencialmente y recibieron 1x1013 PV y bevacizumab (10 mg/kg), y se observaron durante 28 días para DLT. No se han observado DLT en este estudio hasta la fecha y, por tanto, todos los sujetos siguieron y recibieron una terapia combinada de VB-111 (1 x1013 PV) y bevacizumab (10 mg/kg).

Visitas del estudio

Selección, Día -21-0

Los pacientes prospectivos se seleccionarán dentro de 3 semanas del alistamiento. Cuando un paciente se somete a la selección, el coordinador del estudio en el sitio le adjudica un número de identificación de paciente ("Patient Identification Number", PIN), que será registrado en un registro de selección de pacientes, y será evaluado para su elegibilidad según los criterios de selección del protocolo. A los pacientes que cumplen los criterios de elegibilidad se les ofrece la oportunidad de participar. El PIN consiste en un número de centro (por ejemplo, 01) más el número del paciente en orden secuencial (por ejemplo, 001, 002, 003, etc.), de modo que el PIN completo para el centro 1 será 01001,01002, etc.

Los pacientes serán informados de las ventajas, los riesgos y las limitaciones del estudio, y se les pedirá que firmen un formulario de consentimiento informado.

Después los pacientes se evaluarán mediante la historia médica, un examen físico y unas pruebas de laboratorio que incluyen ECG. Los procedimientos de selección también incluyen registrar la altura, el peso, la fecha de nacimiento, el sexo y la raza del paciente.

Historia médica: Se realizará un examen físico y de la historia médica habitual dentro de 4 semanas antes del alistamiento. Se realizarán evaluaciones de laboratorio de línea de base dentro de 4 semanas antes de iniciar la terapia del protocolo y en la visita de línea de base antes de iniciar la terapia. La historia médica se centrará en enfermedades previas y/o conocidas, que incluyen posibles infecciones conocidas, tales como VHB, VIH, VHC u otras infecciones dentro del último mes, enfermedad cardíaca y enfermedad hepática. Se registran las medicaciones que se toman de modo habitual, incluyendo las que se tomaron en el último mes. Se registran los tratamientos de quimioterapia y radioterapia y/o inmunosupresores recibidos en las 12 semanas previas, así como las cirugías realizadas dentro de este periodo de tiempo. A las mujeres se les pregunta si están embarazadas o si están dando el pecho.

Durante la selección debe realizarse la determinación del estado de actuación de Karnofsky ("Karnofsky Performance Status", KPS) y ECOG.

Examen físico:

El examen físico se centrará en los órganos con tumores y las mediciones del tumor según los criterios de RANO, así como los siguientes: cabeza y cuello; ojos; pulmones; corazón; abdomen; articulaciones; circulación periférica; piel; y neurológicos.

El examen físico incluirá el registro de la altura y el peso (solo en la visita de selección).

ECG: Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo.

Análisis de laboratorio: Sangre: Se recogerá sangre en ayunas y se analiza para lo siguiente:

- Hematología: recuento sanguíneo completo con INR, PT y PTT activado

- Química: electrolitos, creatinina y urea en sangre, bilirrubina, fosfatasa alcalina, ALT y AST; calcio, proteínas totales, y albúmina,

- Ensayos de infección por virus: VIH, VHB y VHC

- Se realizará un ensayo en suero de embarazo en las mujeres fértiles

Orina: Se recoge orina para el análisis habitual y se analiza con un examen microscópico para los positivos Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica supina, frecuencia cardíaca periférica, temperatura, frecuencia respiratoria) durante la selección.

Medición del tumor: Se tomarán imágenes de MRI cerebral de contraste y no contraste durante la selección y dentro de 72 horas de la visita de la línea de base para evaluar la magnitud del cáncer. Si transcurren menos de 2 semanas entre las visitas de selección y de línea de base, solo será necesario 1 MRI.

Embarazo: Las mujeres elegibles serán informadas de las restricciones especiales con respecto al embarazo y a la lactancia durante el periodo del estudio. Tanto los hombres como las mujeres se comprometerán a usar un método anticonceptivo convencional de modo habitual durante el periodo del estudio que comienza desde la selección. Los hombres y las mujeres no deben intentar tener hijos, y las mujeres no deben quedarse embarazadas o dar el pecho mientras participen en este estudio. Si son sexualmente activos, tanto los hombres como las mujeres deben usar un método anticonceptivo eficaz desde la visita de selección y hasta un año después del tratamiento. Los anticonceptivos de barrera (condones o diafragmas) con espermicida, los dispositivos intrauterinos, los anticonceptivos hormonales (Depo-Provera, Norplant), las píldoras anticonceptivas orales, y la abstinencia total son ejemplos de métodos eficaces.

Selección de pacientes final: La decisión final acerca de la elegibilidad del paciente que se va a alistar se realizará después de que todas las evaluaciones de selección estén disponibles. Todos los criterios de inclusión y de exclusión deben cumplirse. La razón para todos los fracasos de selección se incluirá en el registro de selección. Línea de base (administración del fármaco de estudio), día 0

El VB-111 se administrará como paciente externo. Tras haber determinado que el sujeto es elegible, se le indicará que se presente en el centro clínico dentro de 3 semanas desde la selección en ayunas hasta 30 minutos después de la administración del fármaco de estudio.

Antes de la dosificación (D0): En el día de la admisión en el sitio, cada sujeto será verificado para la elegibilidad según los criterios de inclusión/exclusión (según sea pertinente) y después se ensayará dentro de 24 horas antes de la dosificación para las siguientes evaluaciones.

Análisis de laboratorio (según el manual de ejecución):

Se recogerán muestras de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Hematología: hemoglobina, recuento sanguíneo completo con diferencial, INR, PT y PTT activado;

- Química: electrolitos, creatinina y nitrógeno de urea en sangre, bilirrubina, fosfatasa alcalina, ALT y AST, calcio, proteínas totales, y albúmina;

- Anticuerpos, biodistribución (niveles de ADN del adenovirus VB-111) y determinación de la expresión de transgenes.

- Muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas:

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Solo cohortes 1 -2: Biodistribución (niveles de ADN del adenovirus VB-111)

Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica supina, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) 15 minutos antes de la dosificación.

Tratamiento antipirético: Para evitar la fiebre después de la administración del fármaco del estudio, todos los pacientes recibirán 1000 mg de acetaminofeno comenzando 1-2 horas antes de la dosificación, seguido de 500 mg PRN 24 horas.

Tratamiento con corticosteroides: Para reducir la respuesta potencial de edema durante la administración del fármaco se administrará un tratamiento de dexametasona:

Dosis inicial con VB-111: Se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 14 días después de la dosificación. Dosis posteriores con VB-111: Se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 3 días después de la dosificación. Se administrarán más tratamientos con corticosteroides según lo decida el investigador. Si cuando los sujetos comienzan el estudio ya están recibiendo esteroides, el investigador debe intentar por cualquier medio no cambiar la dosis de esteroides dentro de 5 días de la evaluación de la enfermedad, a menos que esté clínicamente garantizado. La decisión de continuar con los esteroides o de empezar a disminuirlos gradualmente después de este periodo de tiempo será tomada por el investigador.

Administración del fármaco de estudio: La preparación del fármaco y la infusión se realizarán según el manual de ejecución. El tiempo máximo del fármaco en disolución salina es de 1,5 horas a temperatura ambiente. Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica. El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 3x1012 o 1x1013 ^pV se reducirá en 30%. El VB-111 debe administrarse a 1 ml/minuto o 3 ml/minuto (solo 1x1013 PV). Se permitirá una comida normal 0,5 horas después de la dosificación. Tal como se había planeado previamente, los primeros tres sujetos que reciben una dosis repetida de 1x1013 PV (tras una dosis previa de 3x1012 PV en la cohorte 3 o una dosis inicial de 1x1013 PV en la cohorte 4) se controlaron en un entorno de pacientes internos durante un periodo 8 horas después de sus infusiones. No se indicaron acontecimientos adversos relacionados con la tasa de infusión.

Hasta 6 horas después de la administración del fármaco, día 0:

Análisis de laboratorio:

Biodistribución: Se recogerán muestras de sangre para las determinaciones de los niveles de expresión del ADN del adenovirus VB-111 en los siguientes momentos:

- 0 (antes de la dosificación, véase anteriormente)

- Al final de la infusión

- 3 ± 0,5 horas

- 6 ± 0,5 horas

Solo cohortes 1-2: Se recogerán muestras de orina para las determinaciones de los niveles de ADN del adenovirus VB-111:

- 0 (antes de la dosificación, véase anteriormente)

- Entre 0-3 horas

- Entre 3-6 horas

Muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas: Se recogerán muestras de sangre a las 6 horas después de la dosis para determinar:

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1

Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) a los 30 y 60 minutos después de la dosificación, y a las 4 y 6 horas después de la dosificación y/o tras la desaparición de cualquier acontecimiento adverso, cualquiera que suceda primero.

Acontecimientos adversos: Se emplearán medidas de apoyo total para todos los pacientes con un acontecimiento adverso. Todos los acontecimientos adversos que aparezcan después de la administración del fármaco se documentarán en los formularios de informe del caso ("case report forms", CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

Medicaciones concomitantes: No existen restricciones acerca de medicaciones concomitantes, más allá de los fármacos listados en los criterios de exclusión. Sin embargo, el VB-111 no debe mezclarse con otros fármacos. Toda la medicación concomitante administrada durante el estudio se documentará desde la línea de base durante toda la participación o hasta la visita de terminación temprana.

Otros análisis de laboratorio: Las muestras para los análisis de laboratorio extraídas en respuesta a un acontecimiento clínicamente importante serán documentadas como evaluaciones de laboratorio no programadas. Cuando aparezcan valores de laboratorio anómalos clínicamente importantes, los ensayos se seguirán realizando hasta que los valores vuelvan al intervalo normal y/o hasta que se encuentre una explicación adecuada a la anomalía. Estas investigaciones en el laboratorio se realizarán en el sitio del estudio, excepto para las evaluaciones de distribución, que se enviarán a un laboratorio central independiente. Si alguno de estos resultados requiere de confirmación, se volverán a realizar los ensayos en el mismo laboratorio hospitalario cuando sea posible. A cada laboratorio hospitalario se le deben proporcionar los certificados de acreditación del laboratorio y los intervalos de referencia normales.

Seguimiento de las cohortes 1 y 2

En los días 4 ± 1, 7 ± 1, 14 ± 2, 28 ± 3, 56 ± 3, 84 ± 3, 112 ± 3, 140 ± 3, 168 ± 7/terminación temprana, se le indicará a cada paciente que se presente en el centro clínico en ayunas para las siguientes evaluaciones.

Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica supina, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria).

Análisis de laboratorio: Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Hematología: hemoglobina, recuento sanguíneo completo, INR, PT y PTT activado

- Química: electrolitos, creatinina y nitrógeno de urea en sangre, bilirrubina, fosfatasa alcalina, ALT y AST, calcio, proteínas totales, y albúmina

Las muestras para los análisis de laboratorio extraídas en respuesta a un acontecimiento clínicamente importante serán documentadas como evaluaciones de laboratorio no programadas.

Se recogerán muestras de orina para:

- Análisis de orina habitual

- Determinaciones de los niveles de ADN del adenovirus VB-111

ECG: Se realizará un ECG en el día 28 y el día 168/visita de abandono temprano (si es anterior al día 28).

Mediciones del tumor: La supervisión después del estudio incluirá barridos de MRI cada 2 meses hasta 1 año después de la dosificación, y después cada 3 meses hasta 2 años después de la dosificación, o hasta la progresión. Además, en estos momentos se registrarán los signos vitales.

Periodo de seguimiento después de terminar: Los pacientes que progresaron y/o abandonaron el estudio recibirán un seguimiento mediante contacto telefónico cada 2 meses para la supervivencia.

Seguimiento de las cohortes 3 y 4: Día 4 tras la dosis del D0, días 56 y 112 (es decir, días 4, 60 y 116)

En la fecha de aprobación de esta modificación (modificación 11), ya no es necesaria la visita del día 4 para ningún sujeto de este ensayo. Antes de la aprobación de esta modificación, se realizó la siguiente visita clínica (en cursiva): En 4° día después de la dosis del D0, D56 y D112, se indicará a cada paciente que se presente en el centro clínico en ayunas para las siguientes evaluaciones:

Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica supina, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria).

Análisis de laboratorio: Se recogerán muestras de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Hematología: hemoglobina, recuento sanguíneo completo con diferencial, INR, PT y PTT activado: en el caso de prolongación de PTT por encima de ULN, remítase a la sección 6.2 Retraso/modificación de la dosis para más instrucciones.

- Química: electrolitos, creatinina y nitrógeno de urea en sangre, bilirrubina, fosfatasa alcalina, ALT y AST, calcio, proteínas totales, y albúmina;

- Anticuerpos, biodistribución (niveles de ADN del adenovirus VB-111) y determinación de la expresión de transgenes.

- Muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas:

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

Acontecimientos adversos: En la visita de seguimiento, se preguntará al paciente acerca de posibles acontecimientos adversos que puedan haber aparecido desde el día de la última visita. Todos los acontecimientos adversos se documentarán en los formularios de informe del caso (CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

Medicaciones concomitantes: En la visita de seguimiento al investigador, se preguntará al paciente acerca de posibles medicaciones que puedan haber tomado desde el día de la última visita. Todas las medicaciones concomitantes se registrarán con el nombre genérico, la indicación, la dosificación, las unidades, la frecuencia y las fechas de inicio y de fin.

Tras el análisis de los primeros 6 sujetos que participan en la cohorte 3 y los primeros 6 sujetos que participan en la cohorte 4, se determinará si esta visita (día 4 después de los días 56 y 112), puede eliminarse para cada cohorte. Se debe realizar un contacto telefónico de seguimiento de seguridad 14 días después de la visita de la segunda dosis (día 56) para los primeros 3-6 sujetos en cada cohorte 3 y 4 para asegurarse de que no hayan aparecido DLT. Seguimiento de las cohortes 3 y 4: Contacto telefónico de seguridad cada mes alterno entre las visitas de dosificación

En la fecha de aprobación de esta modificación (versión 7.0), las visitas de los días 28 y 84 al centro clínico ya no son necesarias para ningún sujeto de este ensayo. Debe realizarse una llamada telefónica cada mes alterno entre las visitas de dosificación (días 28, 84, 140, etc.) al sujeto para preguntarle acerca de AE ("adverse event", acontecimiento adverso) y cambios en la medicación.

Antes de la aprobación de esta modificación, se realizó la siguiente visita clínica:

Un mes después de las primeras dos infusiones (es decir, en D28 y día 84), se indicará a cada paciente que se presente en el centro clínico en ayunas para las siguientes evaluaciones:

- Hematología: hemoglobina, recuento sanguíneo completo, INR, PT y PTT activado: en el caso de prolongación de PTT por encima de ULN, remítase a la sección 6.2 Retraso/modificación de la dosis para más instrucciones.

- Muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas:

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 Las muestras para los análisis de laboratorio extraídas en respuesta a un acontecimiento clínicamente importante serán documentadas como evaluaciones de laboratorio no programadas.

Se recogerá una muestra de orina para: Análisis de orina habitual

Medición del tumor: Los sujetos se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO.

Acontecimientos adversos: En la visita de seguimiento al investigador, se preguntará al paciente acerca de posibles acontecimientos adversos que puedan haber aparecido desde el día de la última visita. Deben emplearse medidas de apoyo total en los pacientes con cualquier acontecimiento adverso. Todos los acontecimientos adversos se documentarán en los formularios de informe del caso (CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

Posterior administración de VB-111 a las cohortes 3 y 4 (cada 2 meses después de la dosis inicial: día 56, día 112, día 168, mes 8, etc.)

En el día de admisión al sitio, cada sujeto volverá a ser verificado para la elegibilidad según los criterios de inclusión/exclusión (según sea pertinente) y después se ensayará dentro de 24 horas antes de la dosificación. Los sujetos sin evidencia de enfermedad progresiva serán considerados para una dosificación posterior.

Esta visita y la dosificación de VB-111 se repetirán cada 2 meses hasta la progresión de la enfermedad.

Se realizarán las siguientes evaluaciones:

Medición del tumor: Los sujetos se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO. La formación de imágenes MRI se realizará hasta 72 horas antes de la dosificación para evaluar la magnitud del cáncer.

Examen físico: El examen físico se centrará en los órganos con tumores y las mediciones del tumor según los criterios de RANO, así como los siguientes: cabeza y cuello; ojos; pulmones; corazón; abdomen; articulaciones; circulación periférica; piel; y neurológicos.

ECG (solo día 56): Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo. Análisis de laboratorio (según el manual de ejecución): Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Se recogerán muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas antes de la dosificación y 6 horas después de la dosificación solo cuando el paciente se observa durante un mínimo de 6 horas después de la dosis (a discreción del investigador):

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 - Ensayo en suero de embarazo

Se recogerá orina para la siguiente evaluación: Análisis de orina habitual

Tratamiento antipirético: Para evitar la fiebre después de la administración del fármaco del estudio, todos los pacientes recibirán 1000 mg de acetaminofeno 1-2 horas antes de la dosificación, seguido de 500 mg cada 4 horas durante 24 horas.

Tratamiento con corticosteroides: Para reducir la respuesta potencial de edema durante la administración del fármaco se administrará un tratamiento de dexametasona: Dosis posteriores con VB-111: Se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 3 días después de la dosificación. Se administrarán más tratamientos con corticosteroides según lo decida el investigador. Si cuando los sujetos comienzan el estudio ya están recibiendo esteroides, el investigador debe intentar por cualquier medio no cambiar la dosis de esteroides dentro de 5 días de la evaluación de la enfermedad, a menos que esté clínicamente garantizado. La decisión de continuar con los esteroides o de empezar a disminuirlos gradualmente después de este periodo de tiempo será tomada por el investigador.

Administración del fármaco de estudio: La infusión se realizará según el manual de ejecución. Antes de la infusión, la disolución salina debe llevarse a temperatura ambiente. Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica e inyectarse en disolución salina normal para infusión según el manual de ejecución. La disolución final para la administración debe administrarse no más de 90 minutos después de la preparación. El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según se detalla en el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 3x1012 o 1x1013 PV se reducirá en 30%. Las infusiones intravenosas del VB-111 diluido deben administrarse a 1 ml/minuto o 3 ml/minuto (solo 1x1013 PV). Se permitirá una comida normal 0,5 horas después de la dosificación.

Acontecimientos adversos: Se emplearán medidas de apoyo total para todos los pacientes con un acontecimiento adverso. Todos los acontecimientos adversos que aparezcan después de la administración del fármaco se documentarán en los formularios de informe del caso (CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

Medicaciones concomitantes: No existen restricciones acerca de medicaciones concomitantes, más allá de los fármacos listados en los criterios de exclusión. Sin embargo, el VB-111 no debe mezclarse con otros fármacos. Toda la medicación concomitante administrada durante el estudio se documentará desde la línea de base hasta el día 168 o la visita de terminación temprana.

Hasta 6 horas después de la administración del fármaco:

En la fecha de aprobación de esta modificación (modificación 11), ya no es necesario el periodo de observación de 6 horas para ningún sujeto de este ensayo.

Antes de la aprobación de esta modificación, se realizó la siguiente visita clínica (en cursiva):

Análisis de laboratorio: Biodistribución: Se recogerá una muestra de sangre para las determinaciones de los niveles de expresión del ADN del adenovirus VB-111 en los siguientes momentos:

- 0 (antes de la dosificación, véase anteriormente)

- Al final de la infusión

- 3 ± 0,5 horas

- 6 ± 0,5 horas

Muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas: Se recogerán muestras de sangre a las 6 horas después de la dosis para determinar:

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRII, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) a los 30 y 60 minutos después de la dosificación, y a las 4 y 6 horas después de la dosificación y/o tras la desaparición de cualquier acontecimiento adverso, cualquiera que suceda primero.

Tras la progresión de la enfermedad: Extensión de las cohortes 3-4

Administración de VB-111+bevacizumab, cohortes 3 y 4 (cada 2 meses después de la progresión de la enfermedad) En el momento en que el sujeto sufra una progresión de la enfermedad (cualquier sujeto estable remanente de la cohorte 3 y todos los sujetos de la cohorte 4), se pedirá al sujeto que participe en una fase de extensión de este ensayo, en la que se le administrará VB-111 y bevacizumab como terapia de combinación. El VB-111 (3x1012 o 1x1013 PV, véanse las toxicidades limitantes de la dosis anteriormente) se administrará de modo bimensual y el bevacizumab se administrará de modo bisemanal.

Los sujetos serán informados de las ventajas, los riesgos y las limitaciones del estudio, y se les pedirá que firmen un formulario de consentimiento informado. Después los sujetos se evaluarán para asegurarse de que cumplen los criterios del estudio. Remítase a la sección 3.0 para los criterios de inclusión y de exclusión, que incluyen los criterios de exclusión específicos del bevacizumab.

Puesto que es necesario un mínimo de 2 meses entre las dosis VB-111, si un sujeto progresa antes de 2 meses, el sujeto empezará el tratamiento con bevacizumab (10 mg/kg) cada 2 semanas, y a los 2 meses desde la última dosis de VB-111, el sujeto recibirá la primera dosis de combinación.

Se realizarán las siguientes evaluaciones:

Medición del tumor: Los sujetos se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO. La formación de imágenes La MRI se realizará hasta 72 horas antes de la dosificación para evaluar la magnitud del cáncer.

ECG (se realizará cada 6 meses desde la dosis de combinación inicial).

Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo.

Análisis de laboratorio (según el manual de ejecución): Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Se recogen muestras de biomarcadores angiogénicos/citoquinas antes de la dosificación y 6 horas después de la dosificación solo cuando el paciente se observa durante un mínimo de 6 horas después de la dosis (a discreción del investigador):

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

Se recogerá orina para la siguiente evaluación:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

Administración del bevacizumab:

El bevacizumab se administrará mediante infusión a una dosis de 10 mg/kg antes que VB-111 en los días de dosificación. La tasa de infusión será según la inserción en el paquete para el bevacizumab: La dosis inicial de bevacizumab debe administrarse a lo largo de 90 minutos como una infusión IV después de quimioterapia. Si la primera infusión se tolera, la segunda infusión puede administrarse a lo largo de 60 minutos. Si la infusión de 60 minutos se tolera, todas las infusiones posteriores pueden administrarse a lo largo de 30 minutos.

Administración del fármaco de estudio:

La infusión se realizará según el manual de ejecución. Antes de la infusión, la disolución salina debe llevarse a temperatura ambiente. Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica e inyectarse en disolución salina normal para infusión según el manual de ejecución. La disolución final para la administración debe administrarse no más de 90 minutos después de la preparación. El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según se detalla en el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 3x1012 o 1x1013 PV se reducirá en 30%. Las infusiones intravenosas del VB-111 diluido deben administrarse a 1 ml/minuto o 3 ml/minuto (solo 1x1013 PV).

Hasta 8 horas después de la combinación inicial de VB-111 y bevacizumab:

Análisis de laboratorio: Biodistribución: Se recogerá una muestra de sangre para las determinaciones de los niveles de expresión del ADN del adenovirus VB-111 en los siguientes momentos:

- 0 (antes de la dosificación, véase anteriormente)

- Al final de la infusión

- 3 ± 0,5 horas

- 6 ± 0,5 horas

- Niveles de factor de von Willebrand (vWF) y TNFa (opcional).

- Además, muestras de sangre para TNF, sTNFRI, sTNFRIl, VEGF, FGF, IL-6, IL-8, E-selectina, ICAM-1 Signos vitales: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) a los 30 y 60 minutos después de la dosificación, y a las 4 y 6 horas después de la dosificación y/o tras la desaparición de cualquier acontecimiento adverso, cualquiera que suceda primero.

Seguimiento de la fase de extensión de las cohortes 3-4:

Tratamiento bisemanal con bevacizumab

El bevacizumab se administrará según las prácticas convencionales de modo bisemanal. Durante las visitas al centro clínico para recibir este tratamiento, el investigador debe ver al sujeto para evaluar la seguridad.

Administración del bevacizumab

El bevacizumab se administrará mediante infusión a una dosis de 10 mg/kg según las prácticas convencionales. Acontecimientos adversos: Se emplearán medidas de apoyo total para todos los pacientes con un acontecimiento adverso. Todos los acontecimientos adversos que aparezcan después de la administración del fármaco se documentarán en los formularios de informe del caso (CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

28 Días después del tratamiento de combinación inicial

Un mes después del tratamiento de combinación inicial, se indicará a cada paciente que se presente en el centro clínico en ayunas para las siguientes evaluaciones:

- Las muestras para los análisis de laboratorio extraídas en respuesta a un acontecimiento clínicamente importante serán documentadas como evaluaciones de laboratorio no programadas.

- Se recogerá una muestra de orina para:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

- Grado 3 (UPC>3,5, recolección de orina >3,5 g/24 hr, o tiras reactivas 4+): Detener el tratamiento de bevacizumab hasta <grado 2, según se determina mediante la proporción UPC <3,5 o 24 hr recolección <3,5 g

- Grado 4 (síndrome nefrótico): Detener el bevacizumab

Acontecimientos adversos: En la visita de seguimiento al investigador, se preguntará al paciente acerca de posibles acontecimientos adversos que puedan haber aparecido desde el día de la última visita. Deben emplearse medidas de apoyo total en los pacientes con un acontecimiento adverso. Todos los acontecimientos adversos se documentarán en los formularios de informe del caso (CRF), junto con la intensidad, las medidas terapéuticas aplicadas, el resultado y la relación con el fármaco investigado. Los acontecimientos adversos relacionados se seguirán hasta la resolución. Los acontecimientos adversos no relacionados se seguirán hasta la resolución o el final del estudio.

Final del estudio/terminación temprana

Los sujetos en las cohortes 3 y 4 continuarán recibiendo VB-111 cada 2 meses, con la condición de que sigan estando estables. Cuando los sujetos sufren una progresión de la enfermedad, pueden recibir un tratamiento de combinación con VB-111 o volverán al centro clínico para una visita final del estudio. Además, si los sujetos retiran el consentimiento o el investigador determina que el sujeto no debe continuar en el estudio, el sujeto volverá para una visita de terminación temprana. Los sujetos continuarán con un seguimiento cada 2-3 meses como parte de su seguimiento convencional. El VBL puede pedir datos de estos sujetos (por ejemplo, barridos de MRI, otros tratamientos anticáncer).

Los sujetos que ya no son recibidos en visitas convencionales en el sitio deben ser contactados por teléfono cada 2 3 meses para el seguimiento de la supervivencia y para obtener información con respecto a posteriores tratamientos del glioblastoma. El seguimiento continuará hasta que el paciente expire.

Duración del estudio

Cohortes 1-2: A cada paciente se le administrará una única inyección de VB-111 y se realizará un seguimiento con evaluaciones y visitas programadas de modo regular durante un periodo de 6 meses después de la dosificación o hasta la progresión o abandono del estudio, y después se le realizará un seguimiento para la supervivencia mediante un contacto telefónico después del estudio cada 2 meses. Además, se realizarán MRI de supervisión cada 2 meses hasta 1 año después de la dosificación, y después cada 3 meses hasta 2 años después de la dosificación. Los pacientes pueden decidir abandonar el estudio en cualquier momento. A los pacientes que lo abandonan antes del día 168 ± 7 se les debe pedir que vuelvan al centro clínico para una visita de terminación temprana y se debe seguir en contacto con ellos para preguntarles sobre AE (los pacientes que lo abandonan después del 168 no se consideran terminaciones tempranas). Todos los AE, independientemente de que estén o no relacionados con la enfermedad, serán documentados en el registro del paciente y el CRF.

Cohortes 3 y 4: Los sujetos se seleccionarán 3 semanas antes de la dosis inicial (D0) y recibirán VB-111 cada 2 meses a través de la progresión de la enfermedad. Después de la progresión de la enfermedad, se realizará un tratamiento convencional; los pacientes recibirán un seguimiento para la actualización del estado de la enfermedad y la supervivencia cada 2-3 meses.

Evaluaciones exploratorias

Muestras de biopsia opcionales: Pueden recogerse biopsias de tejido cerebral (preferiblemente muestras congeladas en fresco) para el posterior ensayo por VBL como parte del procedimiento clínicamente indicado en cualquier momento del estudio. Si se recoge una muestra de tejido cerebral, debe recolectarse una muestra de sangre para el análisis de transgenes en el mismo día.

Células endoteliales en circulación (CEC): Opcionalmente, pueden recogerse CEC y analizarse como biomarcadores para la angiogénesis por medio de una citometría de flujo en cualquier momento del estudio, si el sujeto lo consiente y el sitio tiene capacidad local de realizar dicho ensayo.

Otros ensayos exploratorios: Las muestras recogidas para obtener plasma, suero y tejido durante el estudio serán conservadas por VBL o por una persona designada para ello durante hasta 15 años para un ensayo exploratorio para comprender mejor el impacto, la respuesta potencial y la toxicidad del VB-111.

Acontecimientos adversos previstos/modificaciones de la dosis

Acontecimientos adversos previstos

Estudios preclínicos

El VB-111 provoca una toxicidad mínima en estudios de toxicología preclínicos en ratones. Se observó una anemia suave, una trombocitopenia suave, una leucocitosis suave, esplenomegalia, e hiperplasia de médula ósea. También se observaron unos aumentos transitorios de las enzimas hepáticas sin correlación con la patología clínica.

Vectores de adenovirus y agentes antiangiogénicos

La administración de vectores de adenovirus sistémicamente ha sido bien tolerada. Los síntomas similares a la gripe (fiebre, fatiga, escalofríos, náuseas y/o vómitos) son los acontecimientos adversos más habituales. La mayoría de las partículas de adenovirus inyectadas por vía intravenosa fueron secuestradas por el hígado que, a su vez, provoca una respuesta inflamatoria caracterizada por una transaminitis aguda y daños vasculares.

La administración de agentes antiangiogénicos sistémicamente también ha sido bien tolerada. Los efectos adversos previstos más importantes fueron trastornos de curación de heridas, sangrado, y acontecimientos tromboembólicos. También se ha indicado hipertensión y proteinuria con la terapia antiangiogénica.

Acontecimientos adversos previstos con el bevacizumab

Perforación gastrointestinal (GI)

A veces aparece una perforación GI grave, y a veces mortal, con más incidencia en pacientes tratados con bevacizumab, comparado con controles.

Las incidencias de perforación GI varían del 0,3% al 2,4% a través de los estudios clínicos.

Se debe abandonar el bevacizumab en pacientes con perforación GI.

Complicaciones quirúrgicas y de curación de heridas

La incidencia de complicaciones quirúrgicas y de curación de heridas, que incluyen complicaciones graves y mortales, aumenta en los pacientes tratados con bevacizumab.

No se debe iniciar el bevacizumab durante al menos 28 días después de una cirugía y hasta que la herida quirúrgica esté totalmente curada. No se ha determinado el intervalo apropiado entre la terminación del bevacizumab y una posterior cirugía electiva requerida para reducir los riesgos de una curación anómala de las heridas/dehiscencia de la herida.

Se debe abandonar el bevacizumab al menos 28 días antes de una cirugía electiva y en pacientes con complicaciones de curación de heridas que requieran una intervención médica.

Hemorragia

Ha aparecido una hemorragia grave o mortal, incluyendo hemoptisis, sangrado GI, hematemesis, hemorragia del sistema nervioso central, epistaxis, y sangrado vaginal en hasta 5 veces, con más frecuencia en pacientes que reciben bevacizumab. A través de las indicaciones, la incidencia de acontecimientos hemorrágicos de grado >3 entre pacientes que reciben bevacizumab varía del 1,2% al 4,6%.

No se debe administrar bevacizumab a pacientes con hemorragia grave o hemoptisis reciente ^{(> 1/2}tsp de sangre roja).

Se debe abandonar el bevacizumab en pacientes con hemorragia grave (es decir, que requiera una intervención médica).

Otros acontecimientos adversos graves

Otros acontecimientos adversos graves, y a veces mortales, con mayor incidencia en el brazo tratado con bevacizumab frente al control incluyen:

Formación de una fístula no-GI (<0,3%)

Acontecimientos tromboembólicos arteriales (grado >3, 2,6%)

Proteinuria (síndrome nefrótico, <1%)

Otros acontecimientos adversos graves con mayor incidencia en el brazo tratado con bevacizumab frente al control incluyen:

Hipertensión (grado 3-4, 5%-18%)

Síndrome de leucoencefalopatía posterior reversible ("reversible posterior leukoencephalopathy syndrome", RPLS) (<0,1%)

Las reacciones a la infusión con la primera dosis de bevacizumab son raras (<3%), y aparecieron reacciones graves en 0,2% de los pacientes.

Se debe informar a las mujeres fértiles del riesgo de insuficiencia ovárica antes de comenzar el tratamiento con bevacizumab.

Las reacciones adversas más habituales observadas en pacientes con bevacizumab a una tasa de >10% y al menos dos veces la tasa del brazo control son epistaxis, dolor de cabeza, hipertensión, rinitis, proteinuria, alteración del gusto, piel seca y hemorragia rectal.

Retrasos en la dosificación/modificación de la dosis

Para los sujetos que participan en múltiples cohortes de dosis, la dosificación puede retrasase en las siguientes situaciones:

- En los sujetos que sufrieron un acontecimiento adverso relacionado con el fármaco VB-111 y que están programados para repetir la dosis, esta se retrasará hasta que la gravedad del acontecimiento no sea mayor que CTCAE de grado 1.

- En los sujetos que sufrieron una prolongación de un PTT y que están programados para repetir la dosis, esta se retrasará hasta que el PTT haya vuelto a dentro del 20% del valor de línea de base, tanto si cualquier ensayo de LAC o APLA positivo se haya o no normalizado. Los casos límite pueden analizarse con el patrocinador en cada caso individual. Los sujetos con acontecimientos de sangrado o trombóticos clínicamente significativos relacionados con un PTT prolongado no deberían recibir más dosis de VB-111.

- En el caso de que un PTT se prolongue por encima de ULN, debe extraerse sangre para el anticoagulante del lupus (LAC) y para anticuerpos antifosfolípidos (IgG e IgM para beta-2-GP-1 y anticardiolipina). Los pacientes con un PTT prolongado no deben recibir VB-111 hasta que los valores de laboratorio anómalos vuelvan a dentro del 20% del valor de línea de base, tanto si cualquier ensayo de LAC o APLA positivo se haya o no normalizado. Si la repetición del ensayo para LAC/APLA sigue siendo positivo, este debe repetirse cada 12 semanas (desde el ensayo positivo inicial) hasta que vuelva a la normalidad.

- Durante el control de DLT. Para ajustarse a las restricciones del protocolo con respecto a los periodos de observación de 14 días entre pacientes.

Los pacientes se asignarán a la cohorte 3 (dosis única o múltiples dosis de 3x1012 PV) o a la cohorte 4 (múltiples dosis de 1x1013 PV). No se permite la modificación de la dosis en este ensayo. Sin embargo, se infusionará VB-111 al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según se detalla en el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 3x1012 o 1x1013 PV se reducirá en 30%. Las infusiones intravenosas del VB-111 diluido deben administrarse a 1 ml/minuto o 3 ml/minuto (solo 1x1013 PV).

Estudios correlativos/especiales

Distribución: Para la evaluación de la distribución, se recogerán muestras de sangre de todos los pacientes según el manual de ejecución. Se ensayarán estas muestras para la determinación del nivel de transgenes de adenovirus y VB-111 en el grupo de dosis máxima tolerada o en la cohorte de dosis mayor. La distribución se evaluará mediante la determinación de los niveles de ADN vírico y transgenes mediante Q-PCR y Q-RT-PCR, respectivamente, en la sangre en momentos predeterminados después de la dosificación. Se recogerán muestras de todos los pacientes en todos los momentos predefinidos. Las muestras en que no aparezcan niveles detectables de ADN vírico después de la dosificación no se ensayarán para los niveles de transgenes y no se evaluarán para momentos posteriores.

Anticuerpos: Se recogerán muestras de suero para el análisis de los niveles de anticuerpos contra el adenovirus según el manual de ejecución.

Procedimientos para manipular muestras de sangre: Se remite al manual de funcionamiento para obtener instrucciones para una descripción completa de los procedimientos para muestras de seguridad y los procedimientos para las determinaciones con Q-PCR y Q-RT-PCR.

Medición del efecto

La respuesta tumoral se evaluará usando a formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO, hasta la progresión de la enfermedad (análisis de radiología independiente local y central). Para los pacientes que no progresen o que mueran, la PFS se censurará en el momento de iniciar una terapia anticáncer alternativa, la fecha de la última evaluación radiológica o el momento del último contacto.

Definiciones

La respuesta y la progresión se evaluarán en este estudio usando los nuevos criterios internacionales propuestos por el grupo de trabajo de Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) [JCO, Updated Response Assessment Criteria for High-Grade Gliomas: Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) Working Group, en impresión]. Nota: Las lesiones son mensurables o no mensurables usando los criterios proporcionados a continuación. El término “evaluable”, con referencia a la mensurabilidad, no se utilizará porque no proporciona más significado ni precisión.

Enfermedad mensurable: Una enfermedad mensurable se define como lesiones que potencian un contraste bidimensional con márgenes claramente definidos mediante MRI, con dos diámetros perpendiculares de al menos 10 mm, visibles en 2 o más cortes axiales que, preferiblemente, están separados un máximo de 5 mm con un salto de 0 mm. En el caso de que la MRI se realice con cortes más gruesos, el tamaño de una lesión mensurable en la línea de base debe ser dos veces el grosor del corte. En caso de que existan huecos entre los cortes, esto también debe considerarse para la determinación del tamaño de las lesiones mensurables en la línea de base.

La medición de un tumor alrededor de un quiste o una cavidad quirúrgica es problemática. En general, estas lesiones deben considerarse no mensurables, a menos que exista un componente nodular que mida al menos 10 mm de diámetro. El quiste o la cavidad quirúrgica no debe medirse cuando se determina la respuesta.

Todas las mediciones tumorales deben registrarse en milímetros (o fracciones decimales de centímetros).

Enfermedad no mensurable: Se define como lesiones mensurables de modo unidimensional, masas con márgenes no definidos claramente, o lesiones con diámetros perpendiculares máximos <10 mm.

Lesiones diana: Todas las lesiones mensurables hasta un máximo de cinco lesiones deben identificarse como lesiones diana y registrarse y medirse (suma de los productos de los diámetros perpendiculares) en la línea de base. Las lesiones diana deben seleccionarse basándose en su tamaño (lesiones con los diámetros más largos) y su idoneidad para mediciones repetidas precisas mediante técnicas de formación de imágenes. A veces, las lesiones más grandes pueden no ser adecuadas para mediciones reproducibles, y deben seleccionarse las siguientes lesiones más grandes que puedan medirse de modo reproducible.

Lesiones no diana: Para pacientes con enfermedad recurrente que presentan múltiples lesiones, de las cuales solo una o dos están aumentando su tamaño, estas lesiones que aumentan de tamaño deben considerarse las lesiones diana para la evaluación de la respuesta. Las otras lesiones se considerarán lesiones no diana y también deben registrarse.

En muy pocas ocasiones, puede aparecer una progresión inequívoca de una lesión no diana que requiera la detención de la terapia, o el desarrollo de una nueva lesión que potencia el contraste, incluso en el escenario de una enfermedad estable (EE) o una respuesta parcial (RP) en las lesiones diana. Estos cambios se califican como progresión.

Las lesiones no diana también incluyen lesiones mensurables que excedan del número máximo de 5. No son necesarias mediciones de estas lesiones, pero la presencia o la ausencia de cada una de estas deben indicarse durante el seguimiento.

Líneas directrices para la evaluación de una enfermedad mensurable

Todas las mediciones deben tomarse y registrarse en anotación métrica, empleando una regla o calibradores. Todas las evaluaciones de la línea de base deben realizarse dentro de 72 horas antes del inicio del tratamiento.

Es necesaria una MRI convencional, CT no es aceptable. Debe usarse el mismo método de evaluación y la misma técnica para caracterizar cada lesión identificada e informada en la línea de base y durante el seguimiento.

Estas técnicas deben realizarse con cortes de 10 mm o menos en grosor del corte de modo contiguo. Las MRI serán evaluadas por un laboratorio central de modo local y central.

Criterios de respuesta

Evaluación de las lesiones diana: Respuesta completa (RC): Requiere todo lo siguiente:

- Desaparición completa de la enfermedad potenciadora mensurable y no mensurable sostenida durante al menos 4 semanas

- Ausencia de nuevas lesiones

- Lesiones no potenciadoras estables o mejoradas (T2/FLAIR)

- Los pacientes no deben estar tomando corticosteroides

- Clínicamente mejorado o estable

Respuesta parcial (RP): Requiere todo lo siguiente:

- >50% de disminución comparado con la línea de base en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones potenciadoras mensurables sostenida durante al menos 4 semanas

- Ausencia de progresión de una enfermedad no mensurable

- Ausencia de nuevas lesiones

- Lesiones no potenciadoras estables o mejoradas (T2/FLAIR) en la misma dosis o una dosis menor de corticosteroides, comparado con un barrido de línea de base

- La dosis de corticosteroides en el momento de la evaluación con barrido no debe ser mayor que la dosis en el momento del barrido de línea de base

- Clínicamente mejorado o estable

Enfermedad estable (EE): Requiere todo lo siguiente:

- No competente para respuesta completa, respuesta parcial o progresión

- Lesiones no potenciadoras estables (T2/FLAIR) en la misma dosis o una dosis menor de corticosteroides, comparado con un barrido de línea de base. En el caso de que la dosis de corticosteroides haya aumentado, el último barrido que se considere que muestra enfermedad estable será el barrido obtenido cuando la dosis de corticosteroides era equivalente a la dosis de línea de base

- Clínicamente estable

Progresión: Definida por cualquiera de lo siguiente:

- >25% de aumento en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de las lesiones potenciadoras, comparado con la medición tumoral más pequeña obtenida en la línea de base (si no hay disminución) o la mejor respuesta, en dosis estables o crecientes de corticosteroides

- Aumento significativo en una lesión no potenciadora T2/FLAIR en dosis estables o crecientes de corticosteroides, comparado con el barrido de línea de base o mejor respuesta después del inicio de la terapia, no debido a acontecimientos comórbidos (por ejemplo, terapia de radiación, desmielinización, lesión isquémica, infección, ataques, cambios posoperatorios, u otros efectos del tratamiento).

- Cualquier lesión nueva

- Claro deterioro clínico no atribuible a otras causas aparte del tumor (por ejemplo, ataques, efectos secundarios de medicaciones, complicaciones de la terapia, acontecimientos cerebrovasculares, infección, etc.) o cambios en la dosis de corticosteroides

- No poder regresar para la evaluación debido a muerte o condiciones deteriorantes

- Progresión clara de una enfermedad no mensurable

Si se producen dudas con respecto a si existe progresión, el paciente debe continuar el tratamiento y permanecer bajo atenta observación. Si posteriores evaluaciones sugieren que el paciente está progresando, la fecha de progresión debe ser el momento en que esta cuestión surgió inicialmente.

Estos criterios de respuesta de RANO también se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 6 - Resumen de los criterios de respuesta de RANO

Medición de confirmación/Duración de la respuesta

Confirmación

Para poder asignar un estado de RP o RC, deben confirmarse cambios en las mediciones tumorales por medio de evaluaciones repetidas que deben realizarse 4 semanas después de que se hayan cumplido por primera vez los criterios para la respuesta.

Duración de la respuesta global

La duración de la respuesta global se mide desde el momento en que se cumplen los criterios de medición para RC o RP (lo que se registre en primer lugar) hasta la primera fecha en que se haya documentado objetivamente una enfermedad recurrente o progresiva (tomando como referencia para la enfermedad progresiva las mediciones más pequeñas registradas desde que se inició el tratamiento).

La duración de la RC global se mide desde el primer momento que se cumplen los criterios de medición para RC hasta la primera fecha en que se haya documentado objetivamente una enfermedad recurrente.

Duración de la enfermedad estable

La enfermedad estable se mide desde el inicio del tratamiento hasta que se cumplen los criterios para la progresión, tomando como referencia las mediciones más bajas registradas desde que comenzó el tratamiento.

Consideraciones estadísticas

Diseño del estudio

Objetivos: Para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de dosis individuales y múltiples de VB-111 (1 x1012, 3x1012, 1x1013 partículas de virus [PV]) en pacientes con GBM recurrente; para evaluar la distribución de VB-111 después de una única infusión y de múltiples infusiones IV y el nivel de anticuerpos contra el vector adenovírico y los transgenes.

Se prevé que hasta 90 sujetos se alistarán en este estudio, con hasta 29 sujetos en el nivel de dosis de 3x1012 PV, y hasta 49 sujetos en el nivel de dosis de 1x1013 PV. Las cohortes 1-2 reclutarán hasta 6 pacientes en cada una. La cohorte 3 se llevará a cabo según el método de 2 etapas de Simon.

Para el análisis de la eficacia, los pacientes evaluables se definen como los pacientes que han recibido al menos una dosis repetida de 1x1013 PV o de MTD, o los pacientes que han progresado antes de 2 meses después de una dosis inicial de 1x1013 PV (de la cohorte 3 o 4).

Se considera que un sujeto responde si está vivo y sin progresión a los 6 meses o presenta al menos una respuesta tumoral parcial según los criterios de Rano dentro de 6 meses después de la dosificación. Si se observan menos de 2 respuestas en los sujetos de la etapa 1, se detendrá la etapa 2, y por lo demás se alistarán 19 sujetos más en la etapa 2.

La cohorte 4 reclutará hasta 49 sujetos.

Se prevé que al menos 29 pacientes alistados en las cohortes 3 o 4 serán evaluables después de alistarse en las cohortes 3-4 EXT. Basándose en información histórica, se prevé que esta muestra permitirá una evaluación preliminar de la seguridad y la eficacia de este régimen para el tratamiento de GBM recurrente.

Se aplicarán las siguientes reglas de detención del estudio:

- Si 3 de 6 sujetos en las cohortes 1 y 2 sufren DLT relacionada con el fármaco (o 5 de 9, o 6 de 12);

- Si 2 de los sujetos en la cohorte 1 sufren una DLT;

- Si se produce cualquier muerte dentro de dos semanas después de administrar el producto, excepto si la muerte es debida a la progresión de la enfermedad o claramente no está relacionada con el fármaco de estudio. El alistamiento se suspenderá temporalmente para una reunión de IDMC de emergencia ad hoc para analizar el caso y recomendar si puede reiniciarse el alistamiento.

Criterios de valoración de la seguridad y la tolerabilidad

Para evaluar la seguridad y la tolerabilidad de dosis individuales y múltiples de VB-111 (1x1012, 3x1012, 1x1013 PV), se evaluarán los siguientes criterios de valoración de la seguridad a lo largo del estudio:

- Los acontecimientos adversos se registrarán según se produzcan durante la duración completa del estudio. Los acontecimientos adversos se evaluarán para la importancia, la relación con el fármaco de estudio y la gravedad (según CTCAE 4.0).

- Los signos vitales se registrarán en la selección, antes de cada dosificación, 30 y 60 minutos, 4 y 6 horas después de la primera dosificación y en todas las visitas de seguimiento.

- Se realizarán exámenes físicos en las cohortes 1-2 en la selección, la línea de base, los días 14, 28, 56, 84, 112, 140 y el día 168. En las cohortes 3-4, se realizará un examen físico en la selección/línea de base, antes de cada dosificación, y en la finalización del estudio/terminación temprana.

- Se obtendrá un ECG de 12 derivaciones en las cohortes 1-2 en la selección, antes de la dosificación, día 28 y día 168 (o ET). En las cohortes 3-4, se obtendrá un ECG en la selección/línea de base, la visita del día 56, y en la visita de la finalización del estudio/terminación temprana.

- Se realizará una evaluación de laboratorio de seguridad (hematología sanguínea, química y análisis de orina) en la selección, antes de la dosificación, y en todas las visitas de los pacientes.

Criterio de valoración de la eficacia primario: Para evaluar la eficacia de dosis individuales y múltiples de VB-111 (1 x1012, 3x1012, 1x1013 PV) en sujetos con GBM recurrente, se evaluará la supervivencia sin progresión en 6 meses ("progression free survival", PFS), definida como la proporción de sujetos que no han progresado a los 6 meses desde el alistamiento. En otro aspecto, la supervivencia global se evaluará como el criterio de valoración de la eficacia primario, y la PFS en 6 meses se evaluará como criterio de valoración de la eficacia secundario. La supervivencia global se define como el tiempo desde el alistamiento hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de supervivencia después de finalizar el estudio o de retirarse de él por una progresión o por toxicidad, y se incluirán en los análisis de PFS y OS ("overall survival", supervivencia global).

Criterios de valoración de la eficacia secundarios: Para evaluar la eficacia de dosis individuales y múltiples de VB-111 (1x1012, 3x1012, 1x1013 PV), o de múltiples dosis de VB-111 junto con bevacizumab en sujetos con GBM recurrente, se evaluarán los siguientes criterios de valoración de la eficacia secundarios:

- En un aspecto, los criterios de valoración de la eficacia secundarios serán evaluados mediante la supervivencia global (OS): La supervivencia global se define como el tiempo desde el alistamiento hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de supervivencia después de finalizar el estudio o de retirarse de él por una progresión o por toxicidad, y se incluirán en los análisis de PFS y OS.

- En otro aspecto, los criterios de valoración de la eficacia secundarios serán evaluados mediante la supervivencia sin progresión (PFS): La supervivencia sin progresión se define como el tiempo desde el alistamiento hasta una progresión objetiva del tumor, evaluada según el grupo de trabajo Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) (véanse los detalles en la sección 8.3.1).

- La supervivencia sin progresión en 6 meses (PFS-6) se define como la proporción de sujetos que no presentan progresión a los 6 meses desde el alistamiento.

- Supervivencia sin acontecimientos ("event free survival", EFS): La supervivencia sin acontecimientos se define como la medición desde la fecha del alistamiento hasta la terminación del tratamiento debido a toxicidad, progresión de la enfermedad, recaída o muerte por cualquier causa.

- Respuesta tumoral: basándose en MRI, evaluada según el grupo de trabajo de Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) (véanse los detalles en la sección 8.3.1).

Consideraciones de potencia y tamaño de muestra

En una realización, el criterio de valoración de la eficacia primario es la supervivencia global. Usando los datos presentados en Friedman et al., “Bevacizumab alone and in combination with irinotecan in recurrent glioblastoma,” J. Clin. Oncol., 27(28):4733-4740 (2009), la OS en el grupo de bevacizumab a los 12 meses es del 25%. Basándose en los datos preliminares, se prevé que la tasa de supervivencia global en 12 meses en el grupo de VB-111 será de aproximadamente 50% (cociente de riesgo = 0,5). Suponiendo un modelo de riesgos proporcionales, con un tamaño de muestra de 45 pacientes en el grupo de VB-111 que genere aproximadamente 23 acontecimientos, un ensayo de rangos logarítmicos bilateral de nivel 0,05 tendrá una potencia de 80% para detectar una diferencia en las curvas de supervivencia. El análisis final compara las curvas de supervivencia de Kaplan Meier de BEV (basándose en los datos de Friedman et al.) con los datos de supervivencia de VB-111 usando el ensayo de rangos logarítmicos (Piantadosi, 2005).

Como alternativa, este estudio evaluará los criterios de valoración de la eficacia usando un diseño de Simon de dos etapas. En este estudio, la respuesta se define por una PFS en 6 meses o al menos una respuesta tumoral parcial. Con un mínimo de 10 pacientes y un máximo de 29 pacientes, la hipótesis nula sería que la proporción verdadera de PFS-6 es, como máximo, del 10%, frente a la hipótesis alternativa de que la PFS en 6 meses es al menos 30%: H0: PFS-6<=10%

H1: PFS-6 >=30%

Esto tiene un nivel de significancia del 5% cuando la proporción verdadera es 10%, y 80% de potencia cuando la proporción verdadera es al menos 30%.

A menos que aparezca toxicidad o que el estudio se detenga en el análisis interino, este estudio prevé acumular entre 3-6 sujetos en la cohorte 1, 3-6 sujetos en la cohorte 2, hasta 29 sujetos en la cohorte 3, y hasta 49 sujetos en la cohorte 4.

Métodos estadísticos

Todos los datos recogidos se resumirán y se presentarán. Las variables continuas se describirán como el promedio, la mediana, la desviación estándar y el rango de n observaciones. Los datos categóricos se describirán con tablas de contingencia que incluyen frecuencia y porcentaje. Se generarán y presentarán listados de los sujetos individuales.

Los intervalos de confianza se calcularán al nivel de confianza del 95% (bilateral) (excepto para los criterios de valoración de la seguridad y la eficacia primarios, que serán del 99% y 95% (unilateral), respectivamente).

Todos los pacientes que cumplan los criterios de elegibilidad que hayan firmado un formulario de consentimiento y hayan recibido VB-111 se considerarán evaluables para el análisis de la seguridad.

Los análisis y las descripciones estadísticas se realizarán usando el programa de análisis estadístico SAS (SAS Institute, Inc., Cary, N.C., EE. UU.).

Parámetros demográficos

Los parámetros demográficos que incluyen sexo, edad, altura y peso serán resumidos de forma global y por grupo de tratamiento.

Análisis de la seguridad y la toxicidad

Se utilizará el control de los acontecimientos adversos y los descubrimientos clínicos para evaluar la seguridad. Los AE serán categorizados mediante SOC y Términos preferidos, usando el diccionario MedDRA. Se presentará la incidencia de AE, así como la gravedad y la relación con el fármaco del estudio. Según NCI CTCAE versión 4.0, el término toxicidad se define como acontecimientos adversos que se clasifican como posibles, probables o definitivamente relacionados con el tratamiento del estudio. Se registrará el grado máximo para cada tipo de toxicidad para cada paciente, y se usará para el informe. Se repasarán las tablas de frecuencia para determinar patrones de toxicidad. Además, todos los datos de acontecimientos adversos de grado 3, 4 o 5 y clasificados como “no relacionados o con poca probabilidad de estar relacionados” con el tratamiento del estudio en el caso de que se esté desarrollando una relación real, serán repasados.

Los acontecimientos adversos graves se resumirán de modo similar.

Los acontecimientos adversos infusionales también serán resumidos en la evaluación de la causalidad del investigador y del patrocinador.

También se presentará el número y la proporción de pacientes con uno o más AE.

Los descubrimientos clínicos incluirán la evaluación de los exámenes físicos, los signos vitales y los resultados de los ensayos de laboratorio, otras medicaciones concomitantes y los abandonos/terminaciones. Estos descubrimientos se resumirán por grupo de dosis. Las variables continuas se describirán como el promedio, la mediana, la desviación estándar y el rango de n observaciones. Los datos categóricos se describirán con tablas de contingencia que incluyen frecuencia y porcentaje.

Análisis de la eficacia

La supervivencia global (OS) se define como el tiempo desde la primera fecha del tratamiento del estudio hasta la fecha de la muerte del sujeto por cualquier causa. Para los sujetos que no han muerto, los datos de supervivencia se censurarán en la última fecha conocida en la que el sujeto seguía vivo. Se usará el método de Kaplan-Meier para calcular la distribución y la mediana de OS para sujetos tratados al nivel de MTD.

La supervivencia sin progresión (PFS) se define como el tiempo desde la primera fecha del tratamiento del estudio hasta una progresión de la enfermedad documentada, o hasta la muerte por cualquier causa, lo que suceda primero. La respuesta tumoral y la progresión de la enfermedad serán evaluadas por el investigador según los criterios de RANO. Se presentará la proporción de sujetos con PFS en 6 meses para cada grupo de tratamiento. Para los pacientes que no progresan o que mueren, la PFS será censurada en el momento de inicio de una terapia anticáncer alternativa, la fecha de la última evaluación del tumor, o el momento del último contacto. Se usará el método de Kaplan-Meier para calcular la distribución y la mediana de PFS para sujetos tratados a los niveles de 3x1012 y 1x1013 PV, o múltiples dosis de VB-111 junto con bevacizumab.

La supervivencia sin acontecimientos se define como la medición desde la fecha del alistamiento hasta la terminación del tratamiento debido a toxicidad, progresión de la enfermedad, recaída o muerte por cualquier causa. Se usará el método de Kaplan-Meier para calcular la distribución y la mediana de la supervivencia sin acontecimientos para sujetos tratados al nivel de MTD.

La respuesta tumoral se define según los criterios de respuesta de RANO. Véase la sección 8.3 para las definiciones de respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable y progresión. La respuesta tumoral se evaluará durante la selección, antes de la dosificación, días 14, 28, 56, 84, 112, 140 (solo cohortes 1-2) y 168 y cada 2 meses en adelante, usando formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI). La frecuencia y el porcentaje de respuesta tumoral se presentarán para el momento y el grupo de tratamiento. Para las cohortes 3-4 y la extensión, la respuesta tumoral se evaluará durante la selección, antes de la dosificación, días 28, 56, 84, 112, y cada 2 meses en adelante. Después de esta modificación del protocolo (versión 7.0), se realizarán barridos cada 2 meses desde la dosis inicial.

Biodistribución

Se presentará la biodistribución de VB-111 en sangre.

Número de pacientes planeados para ser alistados

Basándose en el diseño del estudio, se calcula que es necesario un máximo de 90 personas elegibles (3-6 en cada una de las cohortes 1 y 2, hasta 29 en la cohorte 3, y hasta 49 en la cohorte 4) con cáncer de GBM recurrente, y 29 pacientes evaluables para la evaluación de la eficacia.

Criterios para terminar el ensayo

El patrocinador se reserva el derecho a terminar el estudio de una forma temprana por razones administrativas (por ejemplo, el centro no cumple con GCP) o de seguridad, como se describe en 4.2.

Procedimiento para tomar en cuenta datos que faltan, no usados y espurios

Los datos que faltan se indicarán en los litados, pero se excluirán de todos los análisis descriptivos. Todos los datos serán listados, incluyendo los datos por lo demás no usados. Los datos espurios se identificarán como tales, cuando sea posible.

Selección de los pacientes para ser incluidos en los análisis

El conjunto de análisis completo consistirá en todos los pacientes alistados que recibieron la medicación del estudio. El subconjunto de biodistribución consistirá en todos los pacientes para los cuales se obtiene un perfil de VB-111. Análisis interinos:

Se realizará un análisis interino después del alistamiento de 10 pacientes evaluables (tal como se describió anteriormente) que han alcanzado el momento del día 168 (6 meses) o que han abandonado antes de este. Los resultados del análisis interino determinarán si el resto de los pacientes se alistarán en la cohorte 4 para completar el estudio.

Ejemplo 3

Métodos:

Se administró VB-111 como una única infusión intravenosa a dosis crecientes desde 1x1012 (cohorte 1) a 3x1012 (cohorte 2) partículas de virus (PV), seguido de dosis repetidas de 3x1012 o 1x1013 cada 2 meses (cohortes 3-4). Las evaluaciones incluyeron seguridad, farmacocinética, respuesta tumoral según los criterios de RANO y supervivencia global.

Resultados:

Veintiocho pacientes de 26-74 años en 3 centros médicos en EE. UU. recibieron hasta 8 dosis repetidas de VB-111. La mediana de la supervivencia global fue de 360 [rango: 70-574] y 266 días [rango: 28-664] para los pacientes que recibieron al menos una dosis de 1x1013 PV (dosis alta) frente a sujetos que recibieron dosis más bajas, respectivamente (p NS). La supervivencia sin progresión fue de 87 frente a 55 días para los pacientes que recibieron la dosis alta y las dosis más bajas, respectivamente (p = 0,01). La mediana del seguimiento fue de 232 días. Tres pacientes presentaron una respuesta parcial (RP) a los 82, 86 y 408 días después de la dosificación inicial de VB-111. Veintiún de los pacientes que progresaron después del tratamiento de VB-111 recibieron bevacizumab fuera del estudio; 7 de los 15 pacientes evaluables (47%) presentaron una RP, comparado con una tasa de RP prevista del 30% según la bibliografía. El VB-111 fue seguro y bien tolerado, se indicaron 53 acontecimientos adversos, y 14 fueron clasificados como posiblemente relacionados con VB-111. Todos los acontecimientos fueron CTCAE de grado 1-2, excepto una embolia pulmonar (EP) de grado 3. No se produjeron muertes relacionadas con el estudio. Un paciente desarrolló un edema peritumoral después de la dosificación, que se resolvió con una terapia con corticosteroides. Los acontecimientos que aparecieron en más del 10% de los pacientes incluyeron dolor de cabeza y fatiga.

A medida que continuaba el estudio, otros sujetos con enfermedad progresiva fueron tratados con bevacizumab, y los datos del estudio se volvieron a calcular en consecuencia. Veintitrés de los sujetos que presentaron enfermedad progresiva (EP) con el tratamiento de VB-111 recibieron bevacizumab fuera del estudio; 6 de los 15 sujetos evaluables (40%) presentaron una respuesta parcial (RP), comparado con 30% previsto según la bibliografía. Los datos se proporcionan en la siguiente tabla.

Tabla 7 - Respuesta al bevacizumab después de VB-111

Posteriormente se añadieron más pacientes al estudio, y los datos se volvieron a calcular en consecuencia. Cuarenta y seis pacientes de 27-76 años en 4 centros médicos en EE. UU. e Israel recibieron hasta 13 dosis repetidas de VB-111. De estos, 30 pacientes recibieron la dosis alta (1x1013 PV). Se produjeron 22 acontecimientos adversos relacionados, 19 CTCAE de grado 1-2; el grado 3 incluyó embolia pulmonar, edema peritumoral y DVT. La mediana de la supervivencia global fue de 360 [rango: 70-574] y 266 días [rango: 28-664] para los pacientes que recibieron al menos una dosis alta frente a los sujetos que recibieron dosis más bajas, respectivamente (p NS). La supervivencia sin progresión fue de 63 frente a 55 días para los pacientes que recibieron la dosis alta frente a las dosis más bajas, respectivamente (p = 0,01). La mediana del seguimiento fue de 232 días. Seis pacientes presentaron una respuesta parcial y/o estabilidad de la enfermedad prolongada (>180 días). Las tasas de crecimiento tumoral mostraron una respuesta a la dosis estadísticamente significativa. Once pacientes recibieron una terapia de combinación de hasta 4 dosis de VB-111 junto con bevacizumab después de la progresión con una monoterapia de VB-111. La mediana del tiempo hasta la segunda progresión fue de 93 días. Estos datos se muestran en la figura 2. La figura 3 proporciona un ejemplo de un paciente que fue tratado con una combinación de VB-111 y bevacizumab tras la progresión de la enfermedad. El VB-111 fue seguro y bien tolerado, como monoterapia y como terapia combinada.

Conclusiones:

El VB-111 fue seguro y bien tolerado en pacientes con GBM recurrente con dosis repetidas de hasta 1 x1013 PV. Se observaron respuestas tumorales. La supervivencia global fue aproximadamente 3 meses más larga, comparada con los datos históricos en GBM recurrente que incluyen agentes antiangiogénicos convencionales. Los datos sugieren que VB-111 potencia la respuesta al bevacizumab administrado cuando se produce una progresión.

Ejemplo 4: Administración de múltiples dosis de Ad5-PPE-1-3X-Fas-c combinado con bevacizumab OBJETIVO: Para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de múltiples dosis de VB-111, 1x1013 partículas de virus (PV) en pacientes con GBM recurrente cada 8 semanas como monoterapia, combinado con bevacizumab 10 mg/kg cada 2 semanas tras la progresión, comparado con una monoterapia de bevacizumab en pacientes con GBM recurrente.

Los pacientes en el brazo de la intervención recibirán en primer lugar VB-111, seguido de una combinación de VB-111 con bevacizumab tras la progresión.

En una realización, también puede observarse una mayor eficacia de VB-111 en combinación con bevacizumab incluso después de la progresión con una monoterapia de VB-111, puesto que la sinergia puede potenciar la actividad de VB-111 y superar la resistencia al fármaco. Además, en algunos casos, se observó una respuesta retrasada al VB-111 en pacientes varios meses después de recibir VB-111. Por tanto, algunos pacientes pueden experimentar una progresión de la enfermedad rápida tras el alistamiento al estudio sin la oportunidad de responder al VB-111. El régimen propuesto puede aprovechar estas respuestas retrasadas.

Criterios de inclusión

Primera o segunda progresión o primera recurrencia del glioblastoma (según los criterios de RANO actualizados, véase la tabla 8) después de un tratamiento convencional con temozolomida y radiación;

Un diagnóstico histológicamente confirmado de GBM. Pueden alistarse pacientes con enfermedad quirúrgicamente extirpable en recurrencia, aunque no aparezca enfermedad residual después de la extirpación quirúrgica. Un intervalo de al menos 4 semanas entre una extirpación quirúrgica previa y el alistamiento en el estudio;

Tabla 8 - Criterios para la evaluación de la respuesta que incorporan MRI y factores clínicos (procedentes de los criterios de RANO actualizados, según se publicaron en Wen et al., “Updated response assessment criteria for highgrade gliomas: response assessment in neuro-oncology working group., J. Clin. Oncol., 28:1963-1972 (2010)).

Todas las lesiones mensurables y no mensurables deben evaluarse usando la misma técnica que en la línea de base. Abreviaturas: MRI, formación de imágenes de resonancia magnética; FLAIR, recuperación de inversión atenuada por fluidos ("fluid-attenuated inversion recovery"). * Las dosis estables de corticosteroides incluyen a los pacientes que no toman corticosteroides.

Criterios de exclusión

Mujeres pacientes embarazadas o que están dando el pecho;

Pacientes que han padecido un acontecimiento cardíaco agudo dentro de los últimos 12 meses;

Pacientes con enfermedad vascular activa, miocárdica o periférica (concretamente, síndrome coronario agudo, ictus cerebral, ataque isquémico transitorio o trombosis arterial, o enfermedad vascular periférica sintomática dentro de los últimos 3 meses);

Pacientes con retinopatía proliferativa y/o vascular conocida;

Pacientes con enfermedad hepática conocida (alcohólica, inducida por fármacos/toxinas, genética, o autoinmunológica);

Pacientes que se han sometido a cirugía mayor dentro de las últimas 4 semanas antes del alistamiento;

Procedimiento de cirugía menor, por ejemplo, biopsia estereotáctica, dentro de 7 días del primer tratamiento del estudio; colocación de un dispositivo de acceso vascular, dentro de 2 días del primer tratamiento del estudio; Historia de abscesos intracraneales dentro de 6 meses antes del primer tratamiento del estudio;

Herida no curada grave, úlcera activa o fractura de hueso no tratada.

Plan de tratamiento

Este estudio es un estudio de fase 3 multicéntrico, abierto, de 2 brazos, controlado, aleatorizado y prospectivo que mide la eficacia, la seguridad, la tolerabilidad de múltiples dosis de VB-111 administrado por vía intravenosa, seguido de VB-111 y bevacizumab, comparado con una monoterapia de bevacizumab, en pacientes con GBM recurrente.

Los pacientes se seleccionarán para la elegibilidad y después, hasta 28 días después, en la visita de la línea de base, se aleatorizarán en uno de dos grupos de tratamiento a una proporción de 1:1 (brazo de investigación frente a brazo control). Los pacientes se aleatorizarán y estratificarán según su edad en el momento de la aleatorización (<60 años, <60 años), KPS (<80, >80) y progresión (1a progresión, 2a progresión). El brazo de intervención recibirá una monoterapia con VB-111 administrado como múltiples infusiones intravenosas de 1x1013 PV cada 8 semanas, que, cuando aparezca una progresión, se combinarán con bevacizumab 10 mg/kg cada 2 semanas. Este régimen continuará hasta que aparezca otra progresión. El brazo control recibirá una monoterapia con bevacizumab 10 mg/kg cada 2 semanas hasta que aparezca una progresión.

Los pacientes se mantendrán en el estudio hasta que lo abandonen debido a la progresión de la enfermedad o su retirada. Después continuará el seguimiento para la supervivencia hasta que el paciente expire.

En la figura 1 se muestra una descripción general del estudio.

Visitas del estudio

Selección, Día -28-0 (todos los pacientes)

Los pacientes prospectivos se seleccionarán dentro de 4 semanas del alistamiento. Los pacientes serán informados de las ventajas, los riesgos y las limitaciones del estudio, y se les pedirá que firmen un formulario de consentimiento informado. A los pacientes que hayan proporcionado su consentimiento se les asignará un número de identificación, que consiste en el número del centro (por ejemplo, 01) más el número del sujeto/paciente en orden secuencial (por ejemplo, 001, 002, 003, etc.). El número de identificación completo para el primer paciente en el centro 01 será 01 001,01-002, etc.

Los pacientes avanzarán a las evaluaciones de selección tal como se muestra en el ejemplo 2.

Visita de la línea de base, día 1 (todos los pacientes)

Se le administrará el tratamiento del estudio (VB-111 o bevacizumab) como paciente externo. Tras haber determinado que el sujeto/paciente es elegible, se le indicará que se presente en el centro clínico dentro de 4 semanas desde la selección en ayunas hasta 30 minutos después de la administración del fármaco de estudio. Antes de la dosificación (D1):

En el día de la admisión al sitio, cada sujeto/paciente volverá a ser verificado para la elegibilidad según los criterios de inclusión/exclusión y después se ensayará dentro de 24 horas antes de la dosificación para las siguientes evaluaciones:

ACONTECIMIENTOS ADVERSOS: A los pacientes se les preguntará acerca de cambios en su estado físico y mental desde que firmaron el formulario de consentimiento.

MEDICACIONES CONCOMITANTES: A los pacientes se les preguntará acerca de cambios en sus terapias desde que firmaron el formulario de consentimiento.

MEDICIÓN DEL TUMOR: Se tomarán imágenes de MRI cerebral de contraste y no contraste para evaluar la magnitud del cáncer. Si transcurren menos de 2 semanas entre las visitas de selección y de línea de base, solo será necesario 1 MRI.

Análisis de laboratorio:

Muestras de sangre:

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

- Grado 3 (UPC>3,5, recolección de orina >3,5 g/24 hr, o tiras reactivas 4+): Detener el tratamiento de bevacizumab hasta <grado 2, según se determina mediante la proporción UPC <3,5 o 24 hr recolección <3,5 g - Grado 4 (síndrome nefrótico): Detener el bevacizumab

EVALUACIONES DE LA CALIDAD DE VIDA RELACIONADAS CON LA SALUD: Se rellenarán un cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y un módulo de cáncer cerebral (BCM20) antes de recibir tratamiento. ALEATORIZACIÓN: Los pacientes que se ajustan todos los criterios de entrada serán aleatorizados en uno de dos grupos de tratamiento en una proporción 1:1, respectivamente, usando un procedimiento de aleatorización centralizado: (1) monoterapia de VB-111 1x1013 PV cada 8 semanas seguida, tras la progresión, por VB-111 cada 8 semanas y bevacizumab 10 mg/kg cada 2 semanas, o (2) monoterapia de bevacizumab: 10 mg/kg cada 2 semanas. La aleatorización se estratificará según su edad en el momento de la aleatorización (<60 años, <60 años), KPS (<80, >80) y progresión (1a progresión, 2a progresión).

TRATAMIENTO PROFILÁCTICOS: PACIENTES ALEATORIZADOS EN VB-111: Para los pacientes aleatorizados en el brazo de tratamiento de VB-111, se administrarán los siguientes tratamientos profilácticos:

TRATAMIENTO ANTIPIRÉTICO: Para evitar la fiebre después de la administración del fármaco del estudio, antes del tratamiento solo con VB-111, todos los pacientes recibirán 1000 mg de acetaminofeno comenzando 1-2 horas antes de la dosificación, seguido de 500 mg PRN 24 horas.

TRATAMIENTO CON CORTICOSTEROIDES: Para reducir la respuesta potencial de edema durante la administración del fármaco se administrará un tratamiento de dexametasona antes del tratamiento solo con VB-111: Dosis inicial con VB-111: Se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 14 días después de la dosificación.

Dosis posteriores con VB-111: Se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 3 días después de la dosificación. Se administrarán más tratamientos con corticosteroides según lo decida el investigador.

Si cuando los pacientes comienzan el estudio ya están recibiendo esteroides, el investigador debe intentar por cualquier medio no cambiar la dosis de esteroides dentro de 5 días de la evaluación de la enfermedad, a menos que esté clínicamente garantizado. La decisión de continuar con los esteroides o de empezar a disminuirlos gradualmente después de este periodo de tiempo será tomada por el investigador.

Administración del fármaco de estudio:

VB-111: Antes de la infusión, la disolución salina para inyección debe llevarse a temperatura ambiente. El tiempo máximo del fármaco en disolución salina es de 90 minutos a temperatura ambiente (60 minutos más una ventana de 30 minutos). Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica y combinarse con disolución salina (véase la preparación de la infusión de VB-111, a continuación). El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según el manual de ejecución. De modo específico, para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis se reducirá en 30%. Debe administrarse una única infusión de VB-111 a 3 ml/minuto. Los pacientes que reciben VB-111 deben permanecer en el centro clínico durante 8 horas en observación.

BEVACIZUMAB: Se administrará del modo convencional ("standard of care", SOC).

SIGNOS VITALES: PACIENTES ALEATORIZADOS EN VB-111: Se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) a los 30 y 60 minutos después de la dosificación, y a las 4 y 6 horas después de la dosificación y/o tras la desaparición de cualquier acontecimiento adverso, cualquiera que suceda primero.

ACONTECIMIENTOS ADVERSOS: Los pacientes se controlarán para acontecimientos adversos mediante su observación después del tratamiento en el centro clínico.

MEDICACIONES CONCOMITANTES: Debe registrarse cualquier medicación concomitante administrada durante la observación del paciente después del tratamiento.

Visitas de seguimiento de la monoterapia de VB-111

Contacto telefónico de seguridad cada mes alterno entre las visitas de dosificación (días 28, 84, 140, etc.) Debe realizarse una llamada telefónica cada mes alterno entre las visitas de dosificación (días 28, 84, 140, etc.) al sujeto/paciente para preguntarle acerca de AE y cambios en la medicación.

Posterior administración de VB-111 (cada 8 semanas después de la dosis inicial: día 56, día 112, día 168, etc.) En el día de admisión al sitio, cada sujeto/paciente volverá a ser verificado para la elegibilidad según los criterios de inclusión/exclusión (según sea pertinente) y después se ensayará dentro de 24 horas antes de la dosificación. Los pacientes sin evidencia de enfermedad progresiva serán considerados para una dosificación posterior. Esta visita y la dosificación de VB-111 se repetirán cada 8 semanas hasta la progresión de la enfermedad.

Se realizarán las siguientes evaluaciones:

ACONTECIMIENTOS ADVERSOS: A los pacientes se les preguntará acerca de cambios en su estado físico y mental desde la última visita.

MEDICACIONES CONCOMITANTES: A los pacientes se les preguntará acerca de cambios en sus terapias desde la última visita.

EVALUACIONES DE LA CALIDAD DE VIDA RELACIONADAS CON LA SALUD: Se rellenarán un cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y un módulo de cáncer cerebral (BCM20) antes de recibir tratamiento. MEDICIÓN DEL TUMOR: Los pacientes se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO. La formación de imágenes MRI se realizará hasta 72 horas antes de la dosificación para evaluar la magnitud del cáncer (si el paciente presenta una progresión de la enfermedad confirmada, debe considerarse su participación en la terapia de combinación con VB-111 y bevacizumab. Se administrará VB-111 1x1013 PV cada 8 semanas, y se administrará bevacizumab cada 2 semanas).

EXAMEN FÍSICO: El examen físico se centrará en los órganos con tumores y las mediciones del tumor según los criterios de RANO, así como los siguientes: cabeza y cuello; ojos; pulmones; corazón; abdomen; articulaciones; circulación periférica; piel; o neurológicos.

ECG (solo día 168 y terminación temprana): Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo.

ANÁLISIS DE LABORATORIO:

Se recogerán muestras de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Ensayo en suero de embarazo

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

TRATAMIENTO ANTIPIRÉTICO: Para evitar la fiebre después de la administración del fármaco del estudio, antes del tratamiento con VB-111, todos los pacientes recibirán 1000 mg de acetaminofeno comenzando 1-2 horas antes de la dosificación, seguido de 500 mg cada 4 horas durante 24 horas.

TRATAMIENTO CON CORTICOSTEROIDES: Para reducir la respuesta potencial de edema durante la administración del fármaco se administrará un tratamiento de VB-111 y dexametasona: se administrarán 10 mg 30 minutos antes de la dosificación, seguido de 4 mgx2/día durante 3 días después de la dosificación. Se administrarán más tratamientos con corticosteroides según lo decida el investigador.

Si en el momento de la dosificación, el paciente ya está recibiendo esteroides, el investigador debe intentar por cualquier medio no cambiar la dosis de esteroides dentro de 5 días de la evaluación de la enfermedad, a menos que esté clínicamente garantizado. La decisión de continuar con los esteroides o de empezar a disminuirlos gradualmente después de este periodo de tiempo será tomada por el investigador.

ADMINISTRACIÓN DEL FÁRMACO DE ESTUDIO: La infusión se realizará según el manual de ejecución. Antes de la infusión, la disolución salina debe llevarse a temperatura ambiente. Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica e inyectarse en disolución salina normal para infusión según el manual de ejecución (véase la preparación de la infusión de VB-111, a continuación). La disolución final para la administración debe administrarse no más de 90 minutos después de la preparación (60 minutos más una ventana de 30 minutos). El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según se detalla en el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 1x1013 PV se reducirá en 30%. Las infusiones intravenosas del VB-111 diluido deben administrarse a 3 ml/minuto.

Se permitirá una comida normal 0,5 horas después de la dosificación.

Fin de la monoterapia de VB-111 tras la progresión de la enfermedad

Los pacientes continuarán recibiendo VB-111 cada 8 semanas, con la condición de que se mantengan estables. Cuando los pacientes sufren una progresión de la enfermedad, volverán al centro clínico para una visita final del estudio. Además, si los pacientes retiran el consentimiento o el investigador determina que el paciente no debe continuar en el estudio, el paciente volverá para una visita de terminación temprana. Los pacientes serán contactados por teléfono cada 2-3 meses para el seguimiento de la supervivencia.

Administración de VB-111+bevacizumab como tratamiento de combinación

En el momento en que el paciente sufra una progresión de la enfermedad, el sujeto/paciente iniciará un tratamiento con VB-111 y bevacizumab como terapia de combinación. Se administrará VB-111 1x1013 PV cada 8 semanas, y se administrará bevacizumab cada 2 semanas.

Puesto que es necesario un mínimo de 8 semanas meses entre las dosis VB-111, si un sujeto/paciente progresa antes de 8 semanas, el sujeto empezará el tratamiento con bevacizumab (10 mg/kg) cada 2 semanas, y a las 8 semanas desde la última dosis de VB-111, el sujeto/paciente recibirá la primera dosis de combinación con VB-111. A los pacientes se les volverá a informar acerca de las ventajas, los riesgos y las limitaciones de la terapia de combinación. Se realizarán las siguientes evaluaciones en cada día del tratamiento de combinación:

CALIDAD DE VIDA RELACIONADA CON LA SALUD Y FUNCIÓN NEUROCOGNITIVA: Se rellenarán un cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y un módulo de cáncer cerebral (BCM20) antes de recibir tratamiento.

MEDICIÓN DEL TUMOR: Los pacientes se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO. La formación de imágenes MRI se realizará hasta 72 horas antes de la dosificación para evaluar la magnitud del cáncer.

ECG (debe realizarse cada 6 meses desde la dosis de combinación inicial): Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo.

Análisis de laboratorio:

Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Ensayo en suero de embarazo;

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

- Grado 3-(UPC>3,5, recolección de orina >3,5 g/24 hr, o tiras reactivas 4+): Detener el tratamiento de bevacizumab hasta <Grado 2, según se determina mediante la proporción UPC <3,5 o 24 hr recolección <3,5 g - Grado 4 (síndrome nefrótico): Detener el bevacizumab

ADMINISTRACIÓN DE BEVACIZUMAB: El bevacizumab se administrará mediante infusión a una dosis de 10 mg/kg antes que VB-111 en los días de dosificación. La tasa de infusión será según la inserción en el paquete para el bevacizumab: El bevacizumab debe administrarse a lo largo de 60 minutos (+una ventana de 30 minutos) como una infusión IV. Si la infusión de 60 minutos se tolera, todas las infusiones posteriores pueden administrarse a lo largo de 30 minutos.

ADMINISTRACIÓN DE VB-111: La infusión se realizará según el manual de ejecución. Antes de la infusión, la disolución salina debe llevarse a temperatura ambiente. Los viales deben abrirse en una cabina de seguridad biológica e inyectarse en disolución salina normal para infusión según el manual de ejecución (véase la preparación de la infusión de VB-111, a continuación). La disolución final para la administración debe administrarse no más de 90 minutos después de la preparación (60 minutos más una ventana de 30 minutos). El VB-111 se infusionará al paciente a la dosificación pertinente según el peso del paciente, según se detalla en el manual de ejecución. Para pacientes con un peso menor que 50 kg, la dosis de 1x1013 PV se reducirá en 30%. Las infusiones intravenosas del VB-111 diluido deben administrarse a 3 ml/minuto.

SIGNOS VITALES: Para la dosis de combinación inicial se registrarán los signos vitales (presión sanguínea sistólica y diastólica, frecuencia cardíaca periférica, temperatura corporal, frecuencia respiratoria) a los 30 y 60 minutos después de la dosificación, y a las 4 y 6 horas después de la dosificación y/o tras la desaparición de cualquier acontecimiento adverso, cualquiera que suceda primero. Para dosis posteriores, los signos vitales deben registrarse 15 minutos antes de la dosificación y 30 minutos después de la dosificación.

Seguimiento: Tratamiento de combinación con VB-111 y bevacizumab:

Tratamiento bisemanal con bevacizumab

El bevacizumab se administrará según las prácticas convencionales cada 2 semanas. Se prefiere que el sujeto/paciente visite el centro clínico del estudio para recibir su tratamiento y que pueda ser visto por el investigador para evaluar la seguridad (a través de la recogida de información de acontecimientos adversos y de la medicación concomitante). Sin embargo, si el sujeto/paciente vive a más de 1 hora de viaje del centro clínico, el sujeto/paciente puede recibir su tratamiento de su oncólogo local, y la información de la seguridad (recogida de información de acontecimientos adversos y de la medicación concomitante) debe transferirse al centro clínico del estudio para su inclusión en los registros del estudio. Las visitas locales deben ser previamente aprobadas por el controlador médico en cada paciente.

Días después del tratamiento de combinación inicial

Análisis de laboratorio:

Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Hematología: hemoglobina, recuento sanguíneo completo con diferencial, INR, PT y PTT activado

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá una muestra de orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

- Grado 4 (síndrome nefrótico): Detener el bevacizumab

Terminación de la terapia del estudio: Tratamiento de combinación con VB-111 y bevacizumab

Los pacientes continuarán recibiendo VB-111 cada 8 semanas y bevacizumab cada 2 semanas, con la condición de que se mantengan estables. Las visitas continuarán en los días del tratamiento de combinación (cada 8 semanas). Cuando los pacientes sufren una progresión de la enfermedad, volverán al centro clínico para una visita final del estudio (véase a continuación). Además, si los pacientes retiran el consentimiento o el investigador determina que el paciente no debe continuar en el estudio, el paciente volverá para una visita final del estudio. Los pacientes serán contactados cada 2-3 meses para el seguimiento de la supervivencia.

El seguimiento continuará hasta que el paciente expire.

Administración del bevacizumab como monoterapia

Tratamiento bisemanal con bevacizumab (días 14, 28, 42... 70, 84, 98, etc.)

ADMINISTRACIÓN DE BEVACIZUMAB: El bevacizumab se administrará dos veces semanales mediante infusión a una dosis de 10 mg/kg según las prácticas convencionales. Durante las visitas al centro clínico para recibir este tratamiento, el investigador debe ver al sujeto/paciente para evaluar la seguridad.

Tratamiento con bevacizumab (días 56, 112, 168, etc.)

Se realizarán las siguientes evaluaciones:

CALIDAD DE VIDA RELACIONADA CON LA SALUD: Se rellenarán un cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y un módulo de cáncer cerebral (BCM20) en cada visita antes de recibir tratamiento.

ECG (debe realizarse 6 meses después de la dosis inicial de bevacizumab): Debe realizarse un electrocardiograma de 12 derivaciones convencional con registros de ritmo.

ANÁLISIS DE LABORATORIO (según el manual de ejecución):

Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Ensayo en suero de embarazo

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

- No se modificará la dosis para acontecimientos de grado /

ADMINISTRACIÓN DE BEVACIZUMAB: El bevacizumab se administrará mediante infusión a una dosis de 10 mg/kg antes que VB-111 en los días de dosificación. La tasa de infusión será según la inserción en el paquete para el bevacizumab: La dosis inicial de bevacizumab debe administrarse a lo largo de 60 minutos (+una ventana de 30 minutos) como una infusión IV.

Final del estudio/terminación temprana: Monoterapia con bevacizumab:

Los pacientes continuarán recibiendo bevacizumab cada 2 semanas, con la condición de que se mantengan estables. Las visitas continuarán cada 8 semanas. Cuando los pacientes sufren una progresión de la enfermedad, volverán al centro clínico para una visita final del estudio (véase la sección 4.5). Además, si los pacientes retiran el consentimiento o el investigador determina que el paciente no debe continuar en el estudio, el paciente volverá para una visita final.

Los pacientes serán contactados cada 2-3 meses para el seguimiento de la supervivencia.

El seguimiento continuará hasta que el paciente expire.

Terminación de la terapia del estudio (todas las terapias)

En el momento que el sujeto/paciente se retire del ensayo, debido a la retirada del consentimiento o la progresión de la enfermedad, se realizarán las siguientes evaluaciones como una visita final del estudio:

CALIDAD DE VIDA RELACIONADA CON LA SALUD Y FUNCIÓN NEUROCOGNITIVA: Se rellenarán un cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y un módulo de cáncer cerebral (BCM20).

MEDICIÓN DEL TUMOR: Los pacientes se evaluarán para la respuesta usando la formación de imágenes de resonancia magnética cerebral con y sin contraste (MRI), basándose la evaluación en los criterios de RANO.

Análisis de laboratorio:

Se recogerá una muestra de sangre para las siguientes evaluaciones:

- Ensayo en suero de embarazo

- Anticuerpos contra la muestra del virus Ad-5.

Se recogerá orina para las siguientes evaluaciones:

- Análisis de orina habitual

- Tiras reactivas para la proteinuria

Duración del estudio

Los pacientes se mantendrán en el estudio hasta que lo abandonen debido a la progresión de la enfermedad o una terminación temprana. Después, el paciente será contactado por teléfono cada 2-3 meses para obtener los datos de supervivencia hasta que el paciente expire.

Estudios correlativos/especiales

Anticuerpos

Se recogerán muestras de suero para el análisis de los niveles de anticuerpos contra el adenovirus.

Medición del efecto

Supervivencia global

La supervivencia global se define como el tiempo desde la primera dosis de la medicación del estudio hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de supervivencia después de finalizar el estudio o de retirarse de él por una progresión o por toxicidad.

Medición del tumor: La respuesta tumoral se evaluará usando los mismos criterios descritos en el ejemplo 2.

Líneas directrices para la evaluación de una enfermedad mensurable: Se seguirán las líneas directrices descritas en el ejemplo 2.

Criterios de respuesta: Se evaluarán los criterios de respuesta usando los mismos criterios descritos en el ejemplo 2.

Medición de confirmación/Duración de la respuesta

Confirmación: Para poder asignar un estado de RP o RC, deben confirmarse cambios en las mediciones tumorales por medio de evaluaciones repetidas que deben realizarse 4 semanas después de que se hayan cumplido por primera vez los criterios para la respuesta.

Duración de la respuesta global: La duración de la respuesta global se mide desde el momento en que se cumplen los criterios de medición para RC o RP (lo que se registre en primer lugar) hasta la primera fecha en que se haya documentado objetivamente una enfermedad recurrente o progresiva (tomando como referencia para la enfermedad progresiva las mediciones más pequeñas registradas desde que se inició el tratamiento).

Duración de una enfermedad estable: La enfermedad estable se mide desde el inicio del tratamiento hasta que se cumplen los criterios para la progresión, tomando como referencia las mediciones más bajas registradas desde que comenzó el tratamiento.

Evaluaciones exploratorias

Muestras de biopsia opcionales: Puede recogerse biopsias de tejido cerebral (preferiblemente muestras congeladas en fresco) para el posterior ensayo por VBL como parte del procedimiento clínicamente indicado en cualquier momento del estudio. Si se recoge una muestra de tejido cerebral, debe recolectarse una muestra de sangre para el análisis de transgenes en el mismo día.

Consideraciones estadísticas

Diseño del estudio

Objetivos: Para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de múltiples dosis de VB-111 1 x1013 partículas de virus [PV] Q2 meses como monoterapia, combinado con bevacizumab 10 mg/kg cada 2 semanas tras la progresión, comparado con una monoterapia de bevacizumab en pacientes con GBM recurrente.

Todos los datos recogidos se resumirán y se presentarán. Las variables continuas se describirán como el promedio, la mediana, la desviación estándar y el rango de n observaciones. Los datos categóricos se describirán con tablas de contingencia que incluyen frecuencia y porcentaje. Se generarán y presentarán listados de los sujetos/pacientes individuales.

Todos los pacientes que cumplan los criterios de elegibilidad que hayan firmado un formulario de consentimiento y hayan recibido VB-111 y/o bevacizumab se considerarán evaluables para el análisis de la seguridad y la eficacia. Los análisis y las descripciones estadísticas se realizarán usando el programa de análisis estadístico SAS (SAS Institute, Inc., Cary, N.C., EE. UU.).

Criterios de valoración del estudio

Criterio de valoración de la eficacia primario: La supervivencia global (OS) se define como el tiempo desde la primera dosis de la medicación del estudio hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de supervivencia después de finalizar el estudio o de retirarse de él por una progresión o por toxicidad.

Criterios de valoración de la eficacia secundarios: La supervivencia sin progresión (PFS) se define como el tiempo desde la primera dosis de la medicación del estudio hasta una progresión objetiva del tumor, evaluada según RANO. La respuesta tumoral se mide mediante los criterios de RANO, que incluyen respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable y progresión.

Criterios de valoración de la eficacia terciarios: La tasa de crecimiento tumoral se define mediante la tasa de cambio (pendiente) del tamaño del tumor en cada sujeto/paciente. El tamaño del tumor se determinará como el producto de las dimensiones perpendiculares del tumor.

Calidad de vida relacionada con la salud y función neurocognitiva [cuestionario de calidad de vida central de EORTC (QLQ-C30) y módulo de cáncer cerebral (BCM20)].

Criterios de valoración de la seguridad y la tolerabilidad: acontecimientos adversos, signos vitales, exámenes físicos, evaluaciones de laboratorio y electrocardiograma (ECG).

Métodos estadísticos

Todos los datos recogidos se resumirán y se presentarán. Las variables continuas se describirán como el promedio, la mediana, la desviación estándar, mínimos y máximos. Los datos categóricos se describirán con tablas de contingencia que incluyen frecuencia y porcentaje. Se generarán y presentarán listados de todos los datos de los sujetos/pacientes individuales.

Poblaciones de estudio

La intención de tratar una población ("intention to treat population", ITT) incluirá a todos los pacientes que cumplan los criterios de elegibilidad que hayan firmado un formulario de consentimiento y hayan recibido VB-111 que se consideran evaluables para los análisis de la seguridad y la eficacia.

En un aspecto, los análisis de eficacia también se realizarán en una población según el protocolo. Estos análisis serán exploratorios y se definirán en el plan de análisis estadístico.

En otro aspecto, todos los pacientes que recibieron al menos una dosis repetida de 1x1013 PV de VB-111 se consideran evaluables y se incluyen en todos los análisis de la eficacia.

Parámetros demográficos y de línea de base

Los parámetros demográficos y de línea de base que incluyen sexo, edad, altura y peso, y los detalles del diagnóstico inicial y la historia de tratamiento se resumirán de modo global y por grupo de tratamiento. Los parámetros de estratificación que incluyen edad (<60 años, >60 años), KPS (<80, >80), e historia de progresión (1a progresión, 2a progresión) se resumirán de modo global por grupo de tratamiento. Todas las variables continuas se resumirán mediante estadísticos descriptivos. Todas las variables discretas se resumirán mediante frecuencias y porcentajes.

Duración del estudio y cumplimiento

Todos los datos de administración del fármaco del estudio y de cumplimiento se resumirán.

Medicación anterior y concomitante

Toda la medicación anterior pertinente y todas las medicaciones concomitantes se resumirán mediante frecuencias y porcentajes. Todas las medicaciones se codificarán usando el diccionario de fármacos de la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Análisis de la eficacia

Análisis de la eficacia primario

Se calcularán las tasas de supervivencia global, incluyen la mediana del tiempo de supervivencia y la tasa de supervivencia en 12 meses, usando el método de Kaplan-Meier. La OS se medirá desde el momento de la primera dosis hasta la muerte o hasta la última fecha conocida en que el paciente seguía vivo. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de supervivencia después de finalizar el estudio o de retirarse de él por una progresión o por toxicidad. Para los pacientes que no han muerto en el momento del análisis, los datos de supervivencia se censurarán en la última fecha conocida en la que el sujeto seguía vivo. Se empleará el ensayo de rangos logarítmicos para comparar las distribuciones de supervivencia de los dos grupos de tratamiento. En otro aspecto, se usará el modelo de regresión de Cox con las variables de estratificación como covariantes de ajuste, para comparar las distribuciones de supervivencia de los dos grupos de tratamiento.

Análisis de la eficacia secundarios

Se calcularán las tasas de supervivencia sin progresión usando el método de Kaplan-Meier. La PFS se medirá desde el momento de la primera dosis hasta la fecha de la primera progresión o la muerte, o hasta la última fecha conocida en que el paciente estaba estable. Los pacientes recibirán un seguimiento para el estado de la progresión después de finalizar el estudio. Se empleará el ensayo de rangos logarítmicos para comparar las distribuciones de supervivencia de los dos grupos de tratamiento. En otro aspecto, se usará el modelo de regresión de Cox con las variables de estratificación como covariantes de ajuste, para comparar las distribuciones de supervivencia de los dos grupos de tratamiento.

La respuesta tumoral se evaluará cada 2 meses hasta la progresión de la enfermedad. Se resumirán la proporción de pacientes que hayan presentado respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable y progresión en cada visita por grupo de tratamiento. Las diferencias entre las proporciones en cada grupo se ensayarán usando el ensayo de chi cuadrado. En otro aspecto, se ensayarán las diferencias entre las proporciones en cada grupo usando un ensayo de Cochran Mantel Haenszel (CMH) que controla la edad, KPS, e historia de progresión.

Análisis de la eficacia terciarios

Se tomarán mediciones tumorales cada 2 meses hasta la progresión de la enfermedad. Se determinará la tasa de crecimiento tumoral calculando el cambio y el porcentaje de cambio desde la línea de base del tamaño del tumor en cada visita. La tasa de cambio (pendiente) de cada paciente se calculará y se resumirá por grupo de tratamiento. La diferencia en el logaritmo transformado de la tasa de crecimiento tumoral se comparará entre el grupo de tratamiento usando el ensayo de la T de 2 muestras o el ensayo no paramétrico de Wilcoxon, según sea apropiado.

Análisis de los subgrupos

Se realizará un análisis de los subgrupos para los criterios de valoración de la eficacia primario y secundario para las siguientes categorías:

- Edad (<60, >60);

- KPR (<80, >80);

- Primera o segunda progresión de la enfermedad;

- Tamaño del tumor residual después de la resección quirúrgica inicial (el límite de exclusión se determinará antes del desenmascaramiento del estudio);

- Tamaño del tumor en el momento de alistarse al estudio (el límite de exclusión se determinará antes del desenmascaramiento del estudio);

- Estado de mutación de MGMT;

- Género;

- País.

Las definiciones detalladas de los análisis de los subgrupos se definirán en términos generales en el plan de análisis estadístico. La estrategia para las interferencias será conservadora, basándose en las interacciones entre el grupo de tratamiento y la categoría del subgrupo, y se ajustarán para múltiples comparaciones.

Análisis de la seguridad y la toxicidad

Se usará el control de los acontecimientos adversos y los descubrimientos clínicos, que incluyen exámenes físicos, signos vitales, resultados de los ensayos de laboratorio, otras medicaciones concomitantes y los abandonos/terminaciones para evaluar la seguridad.

Acontecimientos adversos

Los AE serán categorizados mediante SOC y Términos preferidos, usando el diccionario MedDRA. Se presentará la incidencia de AE, así como la gravedad y la relación con el fármaco del estudio por grupo de tratamiento. Se resumirá la incidencia de AE que conducen al abandono del estudio y los AE graves (SAE) mediante frecuencias y porcentajes.

Según NCI CTCAE versión 4.0, el término toxicidad se define como acontecimientos adversos que se clasifican como posible, probable o definitivamente relacionados con el tratamiento del estudio. Se registrará el grado máximo para cada tipo de toxicidad para cada paciente, y se usará para el informe. Se repasarán las tablas de frecuencia para determinar patrones de toxicidad. Además, todos los datos de acontecimientos adversos de grado 3, 4 o 5 y clasificados como “no relacionados o con poca probabilidad de estar relacionados” con el tratamiento del estudio en el caso de que se esté desarrollando una relación real, serán repasados.

Los acontecimientos adversos graves se resumirán de modo similar.

Los descubrimientos clínicos incluirán la evaluación de los exámenes físicos, los signos vitales y los resultados de los ensayos de laboratorio, otras medicaciones concomitantes y los abandonos/terminaciones. Estos descubrimientos se resumirán por grupo de tratamiento. Las variables continuas se describirán como el promedio, la mediana, la desviación estándar y el rango de n observaciones. Los datos categóricos se describirán con tablas de contingencia que incluyen frecuencia y porcentaje.

Análisis interino

Se establecerá un comité de control de datos y seguridad ("Data and Safety Monitoring Committee", DSMC) para analizar los datos sobre la seguridad y la eficacia a medida que se vayan acumulando.

Los datos sobre resultados adversos se analizarán según se produzcan. El comité se reunirá a intervalos regulares que serán convenidos por los miembros del comité y el patrocinador.

El análisis final de los resultados se realizará después de que todos los pacientes hayan recibido un seguimiento durante al menos 12 meses. Se realizará un único análisis interino formal 8 meses antes del análisis final planeado, cuando se calcula que se haya acumulado 60% del número total previsto de acontecimientos. Las líneas directrices estadísticas para que el comité recomiende una terminación temprana del estudio debido a la eficacia/futilidad se basarán en lograr una diferencia estadísticamente significativa en la dirección del beneficio por VBL-111 al nivel de 0,003 bilateral.

Con la regla de la detención, las simulaciones por ordenador demuestran que, para conservar un nivel de 0,05 bilateral global, el análisis final debe usar un nivel de 0,0493 bilateral, en lugar de 0,05.

En otro aspecto, las líneas directrices estadísticas para que el comité recomiende una terminación temprana del estudio debido a la eficacia/futilidad se basarán en la probabilidad condicional (bajo la hipótesis alternativa) de lograr un resultado estadísticamente significativo al final del ensayo menor que 0,05. Bajo esta regla de detención de futilidad, el nivel de significancia del análisis final se mantendrá al nivel bilateral de 0,05, porque los análisis de futilidad no aumentan la probabilidad de un error de tipo I en la dirección de una ventaja por el tratamiento experimental.

En el momento de este análisis interino, el comité de control de datos y seguridad proporcionará al patrocinador las curvas de supervivencia de Kaplan-Meir calculadas para los dos grupos de tratamiento junto con el cociente de riesgo calculado y un valor de p bilateral para la comparación.

Potencia y nivel de significancia

El ensayo está diseñado para alistar 252 sujetos/pacientes, que serán aleatorizados en VB-111 frente a bevacizumab, a una proporción de 1:1 Véase la figura 1. El análisis final de los resultados se realizará después de que todos los pacientes hayan recibido un seguimiento durante al menos 12 meses. El número previsto de muertes que se observarán en este momento es de 151, suponiendo que se logre el reclutamiento de todos los pacientes a una tasa uniforme a lo largo de 12 meses. Si el reclutamiento tarda más de 12 meses o las tasas de reclutamiento, en lugar de ser uniformes, aumentan a medida que se desarrolla el ensayo, entonces el número previsto de muertes será mayor que 151. La justificación del tamaño de la muestra se describe a continuación:

Suponiendo un modelo de riesgos proporcional, el cociente de riesgo se calcula como la proporción de los logaritmos de las tasas de supervivencia (en cualquier momento). Suponiendo una tasa de supervivencia en 12 meses del 37,6% en el grupo de tratamiento de bevacizumab (basada en el estudio de bevacizumab) y una tasa de supervivencia en 12 meses del 55% en el grupo de VB-111 (basada en los 12 pacientes tratados con la dosis alta de VB-111 indicada anteriormente), el cociente de riesgo A = ln(0,55)/ln(0,376) = 0,611.

Se espera que este estudio reclute pacientes durante 12 meses y después realice un seguimiento durante 12 meses.

Se realizará un único análisis interino formal después de que se hayan acumulado 60% del número total previsto de acontecimientos. Para conservar un nivel de significancia de 0,05 bilateral global, el análisis final usará un nivel de 0,0493 bilateral, en lugar de 0,05. Basándose en el estudio de bevacizumab y, cuando fue necesario, en extrapolaciones de descomposición exponencial, se espera que el porcentaje de muertes observadas en el grupo de bevacizumab sea del 75,4%. Con un cociente de riesgo de 0,611, se espera que el porcentaje de muertes observadas en el grupo de VB-111 sea del 58%.

El análisis final comparará las curvas de supervivencia del bevacizumab frente a VB-111 usando el ensayo de rangos logarítmicos. Para calcular el tamaño de muestra requerido, se usó la siguiente fórmula:

i , i _ (ha)2

d l d2 (za Zp) ( 1)

en la que:

d¹= número de muertes observadas en el grupo de VB-111

d²= número de muertes observadas en el grupo de bevacizumab

A = coeficiente de riesgo supuesto = 0,611

za = desviación normal estándar para un nivel de significancia bilateral del 4,93% (ajustado para el análisis interino para conservar el nivel global del 5%) = 1,966

zp = desviación normal estándar para una potencia estadística del 85% = 1,0364

Suponiendo que:

di = pixni, en la que ni es el tamaño de la muestra en el grupo de VB-111;

d²= p²xn², en la que n²es el tamaño de la muestra en el grupo de bevacizumab;

P¹= proporción global de muertes observadas previstas en el grupo de VB-111 = 0,58;

p²= proporción global de muertes observadas previstas en el grupo de bevacizumab = 0,754; y m = n²

Se resuelve la fórmula (1) para m y n².

Estos números se dividieron entre 0,9 para tomar en cuenta una tasa de abandono del 10%.

Basándose en las anteriores suposiciones, será necesario un tamaño de muestra de 126 pacientes en el grupo de bevacizumab y de 126 pacientes en el grupo VB-111, dando un total de 252 pacientes (figura 1).

Preparación de la infusión de VB-111

Descripción del fármaco

Se suministrarán viales del fármaco del estudio a cada paciente en crioviales de 1,8 ml etiquetados (polipropileno) o viales de 10 ml de borosilicato. Cada criovial contiene un volumen de 1,1 ml (1012 PV/ml). Cada vial de borosilicato contiene un volumen de 5,3 ml (1012 PV/ml). El fármaco se conservará en la farmacia a -65 °C o menor. La información del paciente (número del paciente, fecha de visita) se añadirá a mano a la etiqueta usando un rotulador permanente y se registrará en los registros del paciente.

Procedimiento antes de la infusión

El proceso completo de preparación del fármaco se realizará a temperatura ambiente en una sala BSC de tipo II. Después de descongelar, el fármaco puede mantenerse hasta 3 horas en agua helada durante las preparaciones. El fármaco se diluye en disolución salina a temperatura ambiente. La preparación del fármaco y la inyección del fármaco se completarán dentro de 1 hora, con una ventana de 30 minutos (para un tiempo máximo de 90 minutos). El farmacéutico que prepare el fármaco verificará que la información en el recipiente sea la apropiada para el estudio y para el paciente: nombre del producto, concentración, número de lote.

Para cada paciente se usa la jeringa apropiada, según se especifica en la tabla 9. Se coloca el volumen necesario de disolución salina (que esté a temperatura ambiente) en un tubo de plástico estéril de 50 ml. Se descongelan los viales de disolución de VB-111 frotándolos entre las manos enguantadas. Hay que asegurarse de marcar el momento de la descongelación.

Usando una jeringa de 10 ml, extraer 1 ml de VB-111 de cada uno de los crioviales o 5 ml del vial de borosilicato previsto para el paciente específico. Se añade VB-111 al tubo de plástico que contiene la disolución salina preparada anteriormente. Se extrae el pistón para mezclar el VB-111 remanente en la jeringa con disolución salina, y se vuelve a empujar hacia el tubo de plástico. Se mezcla el fármaco diluido agitando el contenido a mano. Se determina el volumen que se va a aplicar según el peso del paciente y se extrae el volumen requerido para la inyección hacia la jeringa para la administración.

Después de completar la preparación, se realiza un proceso de reconciliación: se comprueba que se ha usado el número correcto de viales fuente; y se registran los viales asignados al paciente en el registro de seguimiento del fármaco.

Después de la preparación de la disolución de fármaco, se limpia el área de la formulación del fármaco en la farmacia según procedimientos farmacéuticos.

Infusión de VB-111

Los pacientes deben recibir VB-111 en ayunas. “En ayunas” significa que el paciente no ha comido ni bebido nada durante al menos las 2 horas previas.

Se administrará una única infusión intravenosa de VB-111 diluido según las siguientes instrucciones a 3 ml/minuto. Puede usarse una bomba de infusión. Puede proporcionarse una comida normal al paciente 30 minutos después de completar la dosificación. En los días de dosificación cuando el paciente se trata con VB-111 y bevacizumab, el bevacizumab se preparará y dosificará antes que el VB-111.

Tabla 9 - Preparación de VB-11

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:19 para su uso para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita en combinación con bevacizumab, en el que: (i) el vector se administra al sujeto antes que el bevacizumab, (ii) la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab se induce o mejora después de la administración del vector, comparada con la capacidad de respuesta del tumor al bevacizumab sin la administración del vector, y (iii) el tumor se deriva o está asociado con un glioblastoma multiforme recurrente.

2. El vector para el uso de la reivindicación 1, en el que la capacidad de respuesta al bevacizumab es una propiedad antiangiogénesis del bevacizumab.

3. El vector para el uso de la reivindicación 1 o 2, en el que la capacidad de respuesta al bevacizumab es un efecto antitumoral del bevacizumab.

4. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de al menos aproximadamente 1x1o9 *11 partículas de virus, al menos aproximadamente 1x1012 partículas de virus, al menos aproximadamente 1x1013 partículas de virus, o al menos aproximadamente 1x1014 partículas de virus.

5. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz menor que aproximadamente 15 mg/kg, 14 mg/kg, 13 mg/kg, 12 mg/kg, 11 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, o 1 mg/kg.

6. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector se administra en una cantidad eficaz de 3x1012 a 1x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra en una cantidad eficaz de 5 mg/kg a 15 mg/kg.

7. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector se administra repetidas veces.

8. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el bevacizumab se administra repetidas veces.

9. El vector para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el vector se administra repetidas veces cada dos meses en una cantidad eficaz de 1x1013 partículas de virus, y el bevacizumab se administra repetidas veces cada dos semanas en una cantidad eficaz de 10 mg/kg.