BR112019023795A2

BR112019023795A2 - método para produzir ranibizumabe humanizado recombinante redobrado

Info

Publication number: BR112019023795A2
Application number: BR112019023795-0A
Authority: BR
Inventors: Rahul Sharad Bhambure; Kayanat Mahammadtaki Gani
Original assignee: Council Of Scientific & Industrial Research
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2020-07-28
Also published as: MX2019013750A; US11524996B2; JP2020520642A; CN110636859A; US20200165332A1; WO2018211529A1; EP3624847A1; US20200140535A1; KR20200008147A; CA3063320A1; JP7282689B2; US11578122B2; KR102607655B1

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de clonagem, expressão e redobragem para a preparação de fragmentos de anticorpos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma plataforma de clonagem, expressão e redobragem para a preparação de Ranibizumabe humanizado recombinante (rHu).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PRODUZIR RANIBIZUMABE HUMANIZADO RECOMBINANTE REDOBRADO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um processo de clonagem, expressão e redobragem para a preparação de fragmentos de anticorpos.

[002] Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma plataforma de clonagem, expressão e redobragem para a preparação de Ranibizumabe humanizado recombinante (rHu).

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[003] O tempo e a fabricação econômica de proteínas terapêuticas alvo é um componente principal no sucesso de indústrias biossimilares. Tendência recente em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico está mais focada no desenvolvimento de fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos oferecem certas vantagens sobre a terapêutica de anticorpos monoclonais de tamanho natural, tal como penetração profunda e melhorada do tumor, ligação de epítopo específica que não são acessíveis ao mAb de tamanho natural etc.[1-2].

[004] A expressão bacteriana de fragmentos de anticorpos pequenos e não glicosilados torna-se mais fácil e mais barata que a produção de anticorpos monoclonais em sistemas celulares de mamíferos. Ranibizumabe é um fragmento de anticorpo monoclonal humanizado recombinante usado para tratamento da degeneração macular relacionada à idade do tipo úmido[3]. É antiangiogênico e inibe a atividade biológica do fator de crescimento endotelial vascular humano A (VEGF A). O fragmento de anticorpo monoclonal humanizado é convencionalmente expresso em células E. coli por tecnologia de DNA recombinante e é direcionado contra o fator de crescimento endotelial vascular humano A[3, 4].

[005] rHu Ranibizumabe contém cadeia leve de 214 resíduos ligada por uma ligação dissulfeto no seu terminal C ao segmento terminal N de 231 resíduos da cadeia pesada[5]. O peso molecular de rHu Ranibizumabe é 48.380 Dalton com um peso molecular de cadeia pesada de 24.953 Dalton e uma cadeia leve de 23.430 Dalton, respectivamente. O Ranibizumabe produzido por células de E. coli rHu forma corpos de inclusão na forma de agregados proteicos insolúveis.

[006] Em termos de rHu Ranibizumabe, expresso como corpos de inclusão, a redobragem é uma etapa-chave da limitação da taxa na fabricação geral. Os processos de redobragem comercial existentes para esta molécula Fab estão com base em uma das técnicas "3D" (Diluição ou Diafiltração ou Diálise) para converter a forma agregada da proteína em uma forma solúvel biologicamente ativa[6-9]. Atualmente, existe um entendimento insignificante a cerca da trilha de dobramento in vivo e in vitro para a preparação de Ranibizumabe. Devido ao entendimento e literatura limitados disponíveis sobre a redobragem in vitro de rHu Ranibizumabe, os fragmentos de anticorpos são frequentemente expressos na forma solúvel no periplasma de E. coli. No entanto, o periplasma bacteriano constitui apenas 8% a 16% do volume total de células, limitando a quantidade de proteína solúvel expressa. A expressão de proteínas de nível mais alto no periplasma da mesma forma leva à formação do corpo de inclusão, o que limita severamente a produtividade em termos de quantidade de proteína produzida e tempo necessário para a produção.

[007] A expressão no compartimento de periplasma de E. coli é a técnica de fabricação mais comum para fragmentos de anticorpos. A desvantagem crítica da expressão periplásmica é o menor rendimento, o que torna a viabilidade comercial de tais processos uma tarefa difícil. Existem vários relatos sobre a expressão periplásmica de fragmentos de anticorpos em E. coli. O fragmento de anticorpo contra o toxoide tetânico foi expresso no espaço periplásmico, conjugando uma sequência única com a cadeia leve e a cadeia pesada do fragmento de anticorpo, levando a um rendimento de 16 mg/l.

[008] Vale a pena observar em várias divulgações da técnica anterior que a secreção periplasmática de fragmentos de anticorpo leva à síntese de proteínas com um rendimento mínimo. Humphreys DP e outro demonstram a produção do fragmento de anticorpo de IgG anti-humana em E. coli usando o vetor promotor duplo pDPH128. A forma solúvel funcional deste fragmento de anticorpo foi alcançada por secreção periplasmática com um rendimento de 150 mg/l. O fragmento Fab de anticorpo bovino foi produzido usando o vetor pComBov em E. coli HB2151. A expressão desse fragmento de anticorpo no periplasma resultou em 2 mg/l de rendimento total[13]. A expressão periplásmica do fragmento de anticorpo de HuMAb4D5-8 foi obtida em E. coli com rendimento de 1-2 g/l[14]. A expressão periplásmica de proteínas terapêuticas geralmente leva a níveis mais baixos de expressão devido a desdobramentos e agregação[15].

[009] A literatura de patentes relacionada à expressão periplásmica de fragmentos de anticorpo e técnicas como marcação usada foram empregadas, no entanto, nenhuma das tentativas foi capaz de obter a preparação do fragmento de anticorpo.

[0010] Publicação de Patente US Nº. 20166289314 descreve uma sequência de sinal para exportar a cadeia leve e a cadeia pesada de rHu Ranibizumabe para o espaço periplásmico de células de E. coli. Esta publicação de patente descreve uma técnica para expressão da cadeia leve e pesada de rHu Ranibizumabe usando diferentes vetores de expressão, porém empregando a mesma célula hospedeira para expressão de proteínas no periplasma. Proporção igual de cadeia leve e cadeia pesada foi combinada para redobragem in vitro pelo método de diluição.

[0011] Publicação PCT Nº. WO9845331 descreve a produção de anticorpos anti-VEGF humanizados e variantes com propriedades de uma perspectiva terapêutica, incluindo: (a) forte afinidade de ligação ao antígeno VEGF; (b) capacidade de inibir a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF e (c) capacidade de inibir a angiogênese induzida por VEGF in vivo. O pedido de patente descreve a sequência nucleotídica da cadeia leve variável e da cadeia pesada variável e expressa pela transformação do vetor contendo VL e VH em células E. coli.

[0012] Publicação PCT Nº. WO2013076657 descreve a proteína metionina aminopeptidase (MAP) como um marcador de fusão para obter uma proteína solúvel de interesse nas células E. coli BL21 (DE3). A sequência de gene de cadeia leve e de cadeia pesada do ranibizumabe rHu foi marcada com a proteína s MAP e a proteína de fusão MAPLC e MAPHC foi expressa na forma solúvel.

[0013] PH12015501593 (A1) descreve uma técnica de hibridoma para sintetizar aglutinantes anti-VEGF solúveis e estáveis em anticorpos anti-VEGF compreendendo CDRs de anticorpos monoclonais de coelho. Também descreve uma sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve e cadeia pesada e construções de expressão para expressão do fragmento de anticorpos recombinantes. Os plasmídeos que expressam scFv ou polipéptidos Fab são introduzidos em um hospedeiro adequado, preferencialmente E. coli cepa JM83 para expressão periplasmática ou BL21 para expressão em corpos de inclusão. O polipeptídeo pode ser colhido do periplasma ou formar corpos de inclusão e purificado usando técnicas padrões como cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de afinidade e/ou filtração em gel.

[0014] Publicação de Patente US Nº. 2008125580 descreve um processo para purificar proteínas recombinantes redobradas produzidas em células hospedeiras heterólogas e redobrar a proteína em um tampão de pH alto. Fatores de crescimento recombinantes como proteínas, como fator de crescimento ácido de fibroblastos, fator básico de crescimento de fibroblastos e fator de crescimento vascular endotelial foram expressos em células hospedeiras e redobrados pela adição de tampão contendo agente redutor e agente caotrópico, juntamente com a adição de ar ou oxigênio.

[0015] À luz das desvantagens encontradas com a expressão periplásmica de fragmentos de anticorpo, é necessário na técnica desenvolver um processo para a expressão citoplasmática de fragmentos de anticorpo em igual proporção, tendo pureza e rendimento melhorados.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[0016] O objetivo definidor da presente invenção é fornecer um processo de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpo.

[0017] Um objetivo da presente invenção é fornecer as construções recombinantes que transportam sequências nucleotídicas que codificam para cadeia pesada e cadeia leve de fragmentos de anticorpo e sua expressão igual nas células hospedeiras.

[0018] Outro objetivo da presente invenção é obter a expressão citoplasmática de fragmentos de anticorpos recombinantes.

[0019] Ainda outro objetivo da presente invenção é empregar fermentação de alta densidade celular para produção econômica de um fragmento de anticorpo recombinante.

[0020] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um processo de redobragem de alto rendimento para a preparação de Ranibizumabe humanizado recombinante (rHu).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0021] O aspecto de definição da presente invenção é fornecer um processo de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpos redobrados.

[0022] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpos humanizados recombinantes redobrados, compreendendo o referido método: a) Transformar vetores portadores de sequência nucleotídica que codifica cadeias pesadas e leves de fragmentos de anticorpos em células hospedeiras; b) Submeter as células hospedeiras a fermentação celular de alta densidade; c) coexpressão de cadeias leves e pesadas dos referidos fragmentos de anticorpo no citoplasma da célula hospedeira em proporções iguais por indução na presença de uma mistura compreendendo glicose e IPTG.

[0023] O processo para a preparação de fragmentos de anticorpos humanizados recombinantes redobrados também compreendendo: (i) solubilizar corpos de inclusão contendo proporções iguais de cadeias leves e pesadas de fragmentos de anticorpos recombinantes na presença de um tampão de solubilização para obter cadeias leves e pesadas solubilizadas; e (ii) redobragem dos fragmentos de anticorpo solubilizado diluindo um desnaturante seguido de oxigenação na presença de um agente oxidante para desencadear oxidação da ligação dissulfeto para obter a forma biologicamente ativa de rHu Ranibizumabe.

[0024] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo de clonagem e redobragem de Ranibizumabe humanizado recombinante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A Figura 1 representa uma nova plataforma de clonagem, expressão e redobragem para rHu Ranibizumabe;

[0026] A Figura 2 representa um vetor Duet A para a expressão do gene da cadeia leve e pesada de um rHu Ranibizumabe;

[0027] A Figura 3 representa um vetor Duet B para a expressão do gene da cadeia leve e pesada de um rHu Ranibizumabe;

[0028] A Figura 4 representa a redução de SDS-PAGE em que a faixa 1: Inovador padrão reduzido rHu Ranibizumabe. 2: Expressão de gene de cadeia leve e cadeia pesada usando o vetor dueto A, 3: Expressão de gene de cadeia leve e cadeia pesada usando o vetor dueto B. 4: Células E.coli não induzidas;

[0029] A Figura 5 mostra a redução de SDS-PAGE. 1 e 2: Reduziu rHu Ranibizumabe desenvolvido 3: Inovador padrão reduzido rHu Ranibizumabe;

[0030] A Figura 6 representa SDS-PAGE não redutora. 1: Marcador de peso molecular de proteínas, 2: Inovador padrão rHu Ranibizumabe. 3: rHu Ranibizumabe redobrada;

[0031] A Figura 7 representa uma curva de crescimento para fermentação de E.coli de alta densidade celular para produção de rHu Ranibizumabe;

[0032] A Figura 8 mostra o cromatograma por HPLC de fase reversa de rHu Ranibizumabe redobrado. A: Inovador padrão rHu Ranibizumabe. B: rHu Ranibizumabe redobrada;

[0033] A Figura 9 mostra o cromatograma de exclusão de tamanho de rHu Ranibizumabe redobrado. A: Inovador padrão rHu Ranibizumabe. B: rHu Ranibizumabe redobrado;

[0034] A Figura 10 representa a análise de massa intacta de rHu Ranibizumabe por MALDI-TOF. A: Inovador padrão rHu Ranibizumabe, B: rHu Ranibizumabe redobrado;

[0035] A Figura 11 representa a análise de massa de rHu Ranibizumabe reduzido e alquilado por MALDI-TOF. A: Cadeia leve e cadeia pesada de rHu Ranibizumabe inovador padrão B: Cadeia leve e cadeia pesada de rHu Ranibizumabe desenvolvido.

[0036] A Figura 12 mostra a curva de crescimento de E. coli, mostrando o aumento da produção de biomassa em relação ao tempo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A invenção será agora descrita em detalhes em conexão com certas modalidades preferidas e opcionais, de modo que vários aspectos da mesma possam ser mais completamente compreendidos e apreciados.

[0038] Fonte do material biológico: células E. coli BL21 (DE3) adquiridas de Merck Millipore life science private limited, Índia.

[0039] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um processo de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpos humanizados recombinantes redobrados, compreendendo o referido método; d) transformar vetores que transportam a sequência nucleotídica que codifica cadeias pesadas e leves de fragmentos de anticorpo nas células hospedeiras; e) submeter as células hospedeiras a fermentação celular de alta densidade; f) coexpressão de cadeias leves e pesadas dos referidos fragmentos de anticorpo no citoplasma da célula hospedeira em proporções iguais por indução na presença de uma mistura compreendendo glicose e IPTG.

[0040] A etapa de 'vetores de transformação' na presente invenção refere-se à transformação de pelo menos um vetor de dueto carregando sequências de nucleotídeos codificando a cadeia pesada e leve de um fragmento de anticorpo nas células hospedeiras.

[0041] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um processo de clonagem para a preparação de Ranibizumabe humanizado recombinante redobrada, compreendendo o referido processo: (i) transformar vetores que transportam Seq Id Nº. 1 e a Seq Id Nº. 3 codificando a cadeia pesada e a cadeia leve de Ranibizumabe nas células hospedeiras; (ii) submeter células hospedeiras à fermentação celular de alta densidade; (iii) coexpressão de cadeias leves e pesadas dos referidos fragmentos de anticorpo no citoplasma da célula hospedeira em proporções iguais por indução na presença de uma mistura compreendendo glicose e IPTG.

[0042] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma sequência de nucleotídeos da Seq Id Nº 1 que codifica a cadeia pesada de Ranibizumabe de Seq Id Nº 2.

[0043] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma sequência nucleotídica da Seq Id Nº. 3 que codifica a cadeia leve de Ranibizumabe de Seq Id Nº. 4.

[0044] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma construção vetorial contendo Seq Id Nº. 1 e Seq Id Nº. 3 para expressão igual da cadeia pesada e cadeia leve do fragmento de anticorpo.

[0045] Consequentemente, um vetor dueto compreendendo a nucleotídeo Seq Id Nº. 3 que codifica a cadeia leve do fragmento de anticorpo inserido na extremidade 5' no local NcoI/HindIII precedido pelo promotor T7 precedido pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla I (MCS I) e no nucleotídeo Seq Id Nº. 1 que codifica cadeia pesada na extremidade 5' no local NdeI/XhoI precedido pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla II (MCS II). (Figura 2)

[0046] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um vetor dueto compreendendo nucleotídeo Seq Id Nº. 3 que codifica a cadeia leve do fragmento de anticorpo inserido na extremidade 5' no local NcoI/HindIII precedido pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla I (MCS I) e nucleotídeo Seq Id Nº. 1 que codifica a cadeia pesada na extremidade 5' no local NdeI/XhoI precedido pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla II (MCS II). (Figura 3)

[0047] Em outra modalidade preferida, pelo menos um vetor de dueto que transporta construtor de gene de cadeia leve e pesada é transformado em um sistema de expressão. O sistema de expressão mais preferível submetido a transformação são as células competentes E. coli BL21 (DE3). Os transformantes selecionados das células BL21 (DE3) foram determinados para a expressão do fragmento de anticorpo rHu.

[0048] A Figura 4 mostra a expressão de cadeia leve e de cadeia pesada usando o vetor dueto A e o vetor dueto B, que conformaram a expressão quase igual de ambas as cadeias sem qualquer expressão de vazamento em células hospedeiras de E. coli não induzidas. Mais preferencialmente, foi observado um nível consistente e mais alto de expressão igual de cadeia leve e de cadeia pesada de rHu Ranibizumabe usando o vetor dueto A, usando 12% de redução de SDS-PAGE na Figura 5.

[0049] Em mais uma modalidade, a presente invenção fornece rendimento de biomassa variando de cerca de 175g/l a cerca de 190 g/l compreendendo cerca de 5 g/l a cerca de 15 g/l do corpo de inclusão. A Figura 7 mostra um aumento na taxa de crescimento de células E. coli transformadas submetidas a fermentação de densidades celulares elevadas para a produção de rHu Ranibizumabe.

[0050] A Figura 12 mostra a curva de crescimento de E. coli, mostrando o aumento da produção de biomassa em relação ao tempo.

[0051] Em outra modalidade preferida, a presente invenção fornece um processo para a preparação de fragmentos de anticorpos humanizados recombinantes redobrados, compreendendo ainda: (i) solubilizar corpos de inclusão contendo proporções iguais de cadeias leves e pesadas de fragmentos de anticorpos recombinantes na presença de um tampão de solubilização para obter cadeias leves e pesadas solubilizadas seguidas de oxidação; e (ii) redobragem dos fragmentos de anticorpo solubilizado diluindo um desnaturante seguido de oxigenação na presença de um agente oxidante para desencadear a oxidação da ligação dissulfeto para obter a forma biologicamente ativa de rHu Ranibizumabe.

[0052] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um tampão de solubilização compreendendo um tampão Tris, EDTA, um desnaturante e um agente de redução.

[0053] O desnaturante preferido é selecionado a partir do grupo consistindo em cloridrato de guanidina ou ureia

[0054] O agente redutor preferido é selecionado a partir do grupo consistindo em ditiotreitol (DTT) ou e β-mercaptoetanol.

[0055] Desta maneira, a concentração preferida de tampão Tris está na faixa de 0,1 M a 0,5 M com pH na faixa de 7 a 10. A concentração preferida de EDTA está na faixa de 1 mM a 4 mM e a do cloridrato de guanidina está na faixa de cerca de 3 mM a cerca de 6 mM.

[0056] Mais preferencialmente, o tampão de solubilização compreende Tris 0,1 M, pH 9,0, EDTA 2 mM e cloridrato de guanidina 6M como desnaturante durante 30 minutos, e compreende ainda um agente redutor, isto é, DTT 5 mM.

[0057] A solução solúvel e reduzida do corpo de inclusão foi submetida a oxidação adicionando glutationa oxidada 10 mM. Seguido por redobragem utilizando uma diluição de 75 vezes a 10 ± 2°C em tampão de redobragem, contendo Tris 0,1 M pH 9,0, Arginina 0,6 M, Sorbitol 5%, Sorbitol 5%, EDTA 2 mM. A redobragem oxidativa foi da mesma forma realizada passando-se oxigênio puro por uma taxa de fluxo de 1 SLPM (litro padrão por minuto) para o processo de redobragem in vitro.

[0058] O oxigênio desencadeou a formação de ligação dissulfeto e taxa de reação pela oxidação do grupo tiol no aminoácido cisteína. O redox shuffle foi da mesma forma utilizado e formou uma ligação de dissulfeto mista com aminoácido de cisteína da proteína, seguido por ataque nucleofílico que permitiu formar uma ligação de dissulfeto correta entre os aminoácidos de cisteína da molécula de proteína.

[0059] rHu Ranibizumabe funcionalmente redobrado ativado biologicamente ativo na faixa de 100 a 110 µg/ml.

[0060] Além disso, uma boa concordância entre o rHu Ranibizumabe inovador e o rHu Ranibizumabe desenvolvido com 85,4% da cobertura de sequência teórica por análise de impressão digital de peptídeos é obtida.

[0061] Exemplos: Os seguintes exemplos são determinados a título ilustrativo, portanto, não devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Otimização de códons para construção da sequência de genes de cadeia leve e de cadeia pesada

[0062] A sequência de aminoácidos de cadeia leve e de cadeia pesada de rHu Ranibizumabe foi recuperada do banco de medicamentos e a otimização do códon foi realizada (nº de acesso: DB01270). Exemplo 2: Construção do vetor dueto A para expressão da cadeia leve e cadeia pesada de rHu Ranibizumabe

[0063] O vetor dueto A (Figura 2) foi construído inserindo a sequência de nucleotídeos de cadeia leve Id No.3 na extremidade 5' no local NcoI/HindIII anterior pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla I (MCS I) e no nucleotídeo de cadeia pesada Seq Id Nº. 1 na extremidade 5' no local NdeI/XhoI anterior pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla II (MCS II). Exemplo 3: Construção do vetor dueto B para expressão da cadeia leve e cadeia pesada de rHu Ranibizumabe

[0064] O vetor dueto B (Figura 3) foi construído através da inserção da sequência de nucleotídeos de cadeia leve ID Nº. 3 na extremidade 5' no local NcoI/HindIII anterior pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla I (MCS I) e na sequência de nucleotídeos de cadeia pesada ID Nº. 1 na extremidade 5' no local NdeI/XhoI anterior pelo promotor T7 no local de clonagem múltipla II (MCS II). Exemplo 4: Transformação da construção de expressão na célula hospedeira BL21 (DE3)

[0065] O vetor dueto A e B possuindo uma construção genética de cadeia pesada leve foi transformado em um sistema de expressão competente em BL21 (DE3). O método de transformação compreende[22]: Incubação de 100 µl de célula hospedeira com 0,5 µg de vetor por 30 minutos em gelo, seguido de um choque térmico a 42°C por 35 segundos. Após o choque térmico, as células foram novamente incubadas em gelo por 15 minutos. 800 µl de caldo Super Optimal com meio de repressão Catabólito (SOC) a uma mistura reacional seguida de uma incubação de uma hora e 45 minutos a 450 rpm. As células transformadas foram centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos. Os transformantes de E. coli BL21 (DE3) foram semeados em placas de ágar LB contendo 30 µg/ml de canamicina. As placas contendo células transformadas foram incubadas a 37°C durante a noite. Com base no marcador de seleção de antibióticos, células positivamente transformadas foram isoladas das placas e foram usadas para expressão de proteínas. Exemplo 5: Expressão de rHu Ranibizumabe no nível do balão de agitação

[0066] Transformantes selecionados das células BL21 (DE3) foram testados quanto à expressão de rHu Ranibizumabe. As colônias selecionadas foram inoculadas em 10 ml de caldo LB com 30 µg/ml de canamicina. As células foram cultivadas até a densidade ideal em 600 nm atingir o valor entre 1 e 1,5. 2 ml dessas colônias bem cultivadas foram transformados em 100 ml de caldo Terrific HiVegTM e incubados a 37°C e 250 rpm. Após atingir a densidade ideal de 1-1,50 a 600 nm, a cultura de E. coli foi induzida com IPTG 5 mM. As células foram colhidas após 5 horas de indução e centrifugadas a 6000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi ressuspenso em Tris 20 mM, tampão de lise EDTA 0,1 mM, pH 9,0, pH 9,0. As células foram lisadas em homogeneizador de alta pressão a 15000 bar de pressão por 20 minutos. As células lisadas foram centrifugadas a 6000 rpm por 25 minutos. A presença de proteína expressa no sobrenadante e pelota foi verificada usando análise de SDS-PAGE redutora e não redutora. A Figura 4 mostra a expressão de cadeia leve e de cadeia pesada usando o vetor dueto A e o vetor dueto B, que conformavam expressão quase igual de ambas as cadeias sem nenhuma expressão de vazamento em células hospedeiras de E. coli não induzidas. Foi observada uma expressão igual de nível mais alto de cadeia leve e de cadeia pesada de rHu

Ranibizumabe usando o vetor dueto A, usando 12% de SDS-PAGE redutora (Figura 5). A fermentação em E. coli no nível do balão de agitação levou a uma densidade óptica de 3,78 ± 0,05 a 600 nm com 9,3 ± 0,12 g/l de biomassa, levando à geração de 0,868 ± 0,01 g/l de produção corporal de inclusão. A quantidade e pureza da cadeia leve e pesada de rHu Ranibizumabe no corpo de inclusão foi medida por HPLC de fase reversa (Figura 8). Exemplo 6: Expressão de rHu Ranibizumabe no nível do biorreator

[0067] A expressão proteica foi realizada em biorreator de 1L. As células BL21 (DE3) transformadas seletivamente foram avaliadas quanto à expressão de rHu Ranibizumabe. As colônias selecionadas foram inoculadas em 10 ml de caldo LB com 30 µg/ml de canamicina. As células foram cultivadas até a densidade ideal a 600 nm atingir entre 1 e 1,5. 2 ml destas colônias bem cultivadas foram transformados em 100 ml de caldo LB e incubados a 37°C e 250 rpm. 100 ml de cultura de sementes foram transformadas em 900 ml de caldo Terrific HiVegTM. A fermentação de alta densidade celular foi realizada usando o fermentador de bancada BioFlo®/CelliGen®115 com mistura automática de gases na faixa de fluxo de gás de 1 SLPM, usando vasos de vidro revestidos a calor de 2L com conjunto de defletores com motor de acionamento direto, dois impulsores Rushton e aspersor de anel (Macrosparger) Agitação automática em cascata de DO, mistura de GasFlo e O2 foram selecionados com um ponto de ajuste de DO de 30%. O limite inferior da cascata de agitação foi mantido a 300 rpm e o limite superior foi mantido a 1000 rpm. A cascata GasFlo foi mantida a 1 SLPM e a mistura de O2 foi mantida de 0 a 80%. A cultura de E. coli foi induzida com IPTG 5 mM na fase intermediária. A célula foi colhida após 5 horas de indução e centrifugada a 6000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi ressuspenso em Tris 20 mM, tampão de lise EDTA 0,1 mM, pH 9,0, pH 9,0. As células foram lisadas em homogeneizador de alta pressão por 20 min a 15000 bar de pressão. As células lisadas foram centrifugadas a 6000 rpm por 25 minutos. A presença do rHu Ranibizumabe expresso no sobrenadante e sedimento foi determinada usando a análise SDS-PAGE. A fermentação de E. coli de alta densidade celular levou a uma densidade ideal de 75,0 ± 1,2 a 600 nm, com 182 ± 2,9 g/l de biomassa, levando à geração de 7,0 ± 0,1 g/l de produção do corpo de inclusão (Figura 7). Exemplo 7: Redobragem de proteínas e pré-tratamento para corpo de inclusão da cadeia leve e cadeia pesada de rHu Ranibizumabe Protocolo de solubilização:

[0068] 170 mg de peso úmido dos corpos de inclusão foram inicialmente solubilizados em 10 ml de tampão de solubilização contendo Tris 0,1 M pH 9,0, EDTA 2 mM e cloridrato de guanidina 6M como desnaturante por 30 minutos. A redução foi realizada adicionando TDT 5 mM e mantida durante uma hora para redução a 25°C. Esta solução solúvel e reduzida do corpo de inclusão foi mantida para oxidação adicionando glutationa oxidada 10 mM durante 3 horas a 25°C. Protocolo de redobragem:

[0069] Este corpo de inclusão solúvel e reduzido e oxidado foi diluído 75 vezes a 10 ± 2°C em tampão de redobragem contendo 0,1 M Tris pH 9,0, 0,6 M Arginina, 5% Sorbitol, 2 mM de EDTA. A redobragem oxidativa foi realizada passando-se oxigênio puro por uma taxa de fluxo de 1 SLPM (litro padrão por minuto) para o processo de redobragem in vitro. O oxigênio desencadeou a formação da ligação dissulfeto e a taxa da reação pela oxidação do grupo tiol no aminoácido cisteína. O redox shuffle foi da mesma forma utilizado e formou uma ligação dissulfeto mista com aminoácido de cisteína da proteína, seguido de ataque nucleofílico que permitiu formar uma ligação de dissulfeto correta entre os aminoácidos de cisteína da molécula de proteína. A saída de redobragem foi submetida a ultrafiltração usando o dispositivo de filtragem de fluxo tangencial 5 KDa Ultrasette™ Lab seguido de tampão trocado em Tris 20 mM pH 9,0. Observou-se rHu Ranibizumabe redobrado em SDS-PAGE 12% não redutor a 48 kDa (Figura 6). A quantidade e a qualidade do rHu Ranibizumabe redobrado foram medidas por HPLC de exclusão inversa de fase e tamanho (Figura 8). Exemplo 8: Caracterização analítica do rHu Ranibizumabe recombinante Medição da absorvância em A280 para amostras de rHu Ranibizumabe

[0070] A proteína total nas saídas de redobragem e cromatografia foi determinada usando a medição da absorvância UV a 280 nm. Todas as frações coletadas foram lidas a 280 nm usando o espectrofotômetro NanodropTM 2000 e UV-1800 Shimadzu UV Visible. Exemplo 9: Teste de Bradford para estimativa de proteína total para rHu Ranibizumabe

[0071] Uma técnica ortogonal usada para a estimativa total de proteínas foi o ensaio de Bradford a 595 nm usando o NanodropTM

2000. Após adicionar 5 µl da amostra a 250 µl de reagente Bradford, a mistura foi realizada no agitador por 30 segundos. Após a mistura, a amostra foi incubada na presença do corante por 25 minutos e a absorbância foi medida a 595 nm[25]. Exemplo 10: Análise por SDS PAGE de amostras de rHu Ranibizumabe

[0072] A análise de SDS PAGE para identificação da expressão de cadeia leve e de cadeia pesada de rHu Ranibizumabe foi realizada com 12% (espessura 1 mm) do gel de resolução em condição redutora (Figura 4) e rHu Ranibizumabe redobrado foi observado em SDS- PAGE não redutor (Figura 7) nas condições de tensão constante de 120V do gel de empilhamento e condições de tensão constante de 100V do gel de resolução. Cada amostra foi fervida por 10 minutos no tampão de partida antes de ser carregada no gel. 0,05% (p/v) de Coomassie G-250 azul brilhante em 4: 1: 5 (Água: ácido acético glacial: metanol) foi usado para detectar proteínas após separação eletroforética em géis de poliacrilamida [26]. Exemplo 11: Análise por HPLC de fase reversa de rHu Ranibizumabe

[0073] A análise quantitativa e qualitativa de rHu Ranibizumabe foi realizada usando cromatografia de fase reversa (Figura 8) usando coluna Poroshell 120 EC-C18 de 2,7 mm × 50 mm 2,7 µm no sistema Agilent 1260 HPLC. A fase móvel consistiu em 0,1% (v/v) de TFA em água (solvente A) e 0,1% (v/v) de TFA, 100% (v/v) de acetonitrila (solvente B). A taxa de fluxo foi mantida a 1 ml/min usando um gradiente linear de A a B a um comprimento de onda de 214 nm. A Figura 8 mostra o cromatograma de RP-HPLC do inovador e do rHu Ranibizumabe redobrado. Exemplo 12: Análise ELISA para quantificação da bioatividade in vitro de rHu Ranibizumabe

[0074] As amostras contendo rHu Ranibizumabe redobrado foram reagidas com o antígeno VEGF revestido na placa. RHu Ranibizumabe ligado, detectado pela enzima rábano picante peroxidase (HRP) marcada com IgG anti-humana. As reações imunológicas resultam na formação de um complexo sanduíche de anticorpo marcado com anticorpo ligado ao VEGF em fase sólida e marcado com enzima Ranibizumabe. As tiras de microtitulação são lavadas para remover quaisquer reagentes não ligados. O substrato, tetrametil benzidina (TMB) é em seguida reagido. A quantidade de substrato hidrolisado é lida em um leitor de placas de microtitulação a 450 nm e é diretamente proporcional à concentração de rHu Ranibizumabe presente. rHu Ranibizumabe biologicamente ativo, redobrado, foi quantificado utilizando bioensaio in vitro. 102 µg/ml de rHu Ranibizumabe funcionalmente ativo foi obtido[27]. Exemplo 13: Análise por HPLC de rHu Ranibizumabe

[0075] O conteúdo agregado nas várias saídas do processo foi determinado usando a análise SEC-HPLC (Figura 9) realizada usando a coluna YarraTM 3 µm SEC-2000 (300 × 7,8 mm ID). A fase móvel consiste em tampão de acetato 20 mM com tampão de cloreto de sódio 50 mM a pH 5,50. A análise foi realizada no modo isocrático com vazão de 0,5 ml/min a 25°C. A detecção de proteínas foi realizada usando um detector de fotodiodos a 280 nm. A Figura 9 mostra 99,5% de pureza de rHu Ranibizumabe purificado comparável ao inovador rHu Ranibizumabe com 0,5% de conteúdo agregado. Exemplo 14: Estimativa de DNA de filamento duplo

[0076] A presença de DNA na produção de redobragem foi estimada usando o teste Quant-iT™ picogreen. A curva padrão foi preparada usando DNA lambda de filamento duplo. 0,5 ml da amostra de saída do processo foram adicionados aos 0,5 ml de reagente Quant-iT™ dsDNA BR diluído e a mistura reacional foi incubada por 5 minutos. Após cinco minutos, a fluorescência foi medida usando espectrofotômetro de fluorescência (comprimento de onda de excitação 480 nm e comprimento de onda de emissão 520 nm). Exemplo 15: Análise de massa intacta de rHu Ranibizumabe redobrado por dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) (espectrômetro de massa por tempo de voo)

[0077] rHu Ranibizumabe purificado padrão e redobrado com matriz de ácido sinapínico foi misturado na proporção de 1:1 para realizar a análise MALDI-TOF (Figura 11). Da mesma forma, o padrão reduzido e alquilado e o rHu Ranibizumabe redobrado foram misturados com a matriz de ácido sinapínico na proporção de 1:1 para realizar a análise MALDI-TOF (Figura 12). O ácido sinapínico da matriz (10 mg/ml) foi preparado em 50% v/v de acetonitrila, 0,1% v/v de TFA em água de alta pureza. 1 µl de mistura homogeneizada de amostra e matriz foi depositado em uma placa MALDI limpa de 384 cavidades. A placa foi inserida no instrumento AB SCIEX TOF/TOFTM 5800. O instrumento foi utilizado no modo de íon positivo. O laser de nitrogênio a radiação de 337 nm foi mantido como fonte de ionização. A intensidade do laser entre 4000 e 5000 foi utilizada para a análise das amostras. A análise do resultado foi realizada usando o Data Explorer ® Software Versão 4.11. A Figura 10 mostra a comparação de massa intacta de rHu Ranibizumabe redobrado com o rHu Ranibizumabe inovador. A Figura 11 mostra a cadeia leve e a cadeia pesada da comparabilidade em massa de rHu Ranibizumabe purificado com o inovador reduzido e rHu Ranibizumabe alquilado. Exemplo 16: Impressão digital de peptídeos por LC-MS

[0078] O mapeamento peptídico foi realizado por digestão em solução de albumina sérica bovina (BSA), rHu Ranibizumabe inovador padrão e rHu Ranibizumabe redobrado. A desnaturação da proteína foi realizada usando cloridrato de guanidina 6,0 M em temperatura ambiente por uma hora. 10 mM de DTT foram adicionados para a redução de proteína desnaturada e incubados por uma hora em temperatura ambiente. A alquilação foi realizada usando iodoacetamida 15 mM (IAA) e incubada por 15 minutos em condições escuras e novamente DTT 5 mM foi adicionado para neutralizar o IAA excessivo. A amostra de proteína desnaturada, reduzida e alquilada foi trocada de tampão em bicarbonato de amônio 50 mM. A tripsina foi utilizada para digestão da amostra de proteína na proporção de 1:50 (tripsina: proteína). A mistura de digestão foi incubada a 37°C por 18 horas, seguido de limpeza da amostra usando pontas de pipeta Ziptip®. As amostras limpas foram secas usando o concentrador SPD1010 SpeedvacTM. A amostra de proteína digerida foi reconstituída em acetonitrila a 3% e ácido fórmico a 0,1% em água de grau de massa. A impressão digital dos peptídeos foi realizada usando o sistema AB SCIEX TripleTOF ™ 5600, os dados foram registrados e analisados usando o software ProteinPilotTM. Os resultados mostram uma boa concordância entre o rHu Ranibizumabe inovador e o rHu Ranibizumabe desenvolvido com 85,4% da cobertura da sequência teórica[29].

VANTAGENS DA INVENÇÃO  Expressão igual de cadeia leve e de cadeia pesada é obtida empregando as construções de vetores divulgadas na presente invenção, excluindo-se as etapas do processamento manual para obter expressão igual da cadeia leve e pesada do fragmento de mAb;  A expressão citoplasmática em vez da expressão periplásmica de fragmentos de anticorpos recombinantes resulta em alto rendimento de biomassa, resultando, portanto, em aumento do rendimento da proteína recombinante.  A fermentação de alta densidade celular usada na presente invenção fornece aumento na produção de biomassa. Referências:

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4. EMEA scientific discussion. Website: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/ document_library/EPAR_- _Scientific_Discussion/human/000715/WC500043550.pdf)

5. Ranibizumab drug bank information. (http://www.drugbank.ca/drugs/db01270).

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26. Laemmli UK., Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685

27. Alpha diagnostic international(http://www.4adi.com/commerce/ccp28617- lucentis-ranibizumab-elisa-kit-for-human--96-test-elisa-kit-200-880- lug.htm)accessed on 9/12/2016.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir Ranibizumabe humanizado recombinante redobrado, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar vetores dueto que transportam a sequência nucleotídica possuindo as SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 3 que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve de fragmentos de anticorpo nas células hospedeiras; (b) submeter as células hospedeiras à fermentação celular de alta densidade; (c) coexpressar as cadeias leves e pesadas dos referidos fragmentos de anticorpo no citoplasma da célula hospedeira em proporções iguais por indução na presença de uma mistura compreendendo glicose e IPTG para obter corpos de inclusão; (d) solubilizar os corpos de inclusão contendo proporções iguais das cadeias leves e pesadas de fragmentos de anticorpos recombinantes na presença de um tampão de solubilização para obter cadeias leves e pesadas solubilizadas de fragmentos de anticorpos; (e) redobrar as cadeias leves e pesadas solubilizadas de fragmentos de anticorpos diluindo um desnaturante seguido de oxigenação na presença de um agente oxidante para desencadear a oxidação da ligação dissulfeto para obter a forma biologicamente ativa do rHu Ranibizumabe; e (f) submeter o rHu Ranibizumabe obtido na etapa (v) à ultrafiltração usando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial de 5KDa seguido por Tris 20 mM pH 9,0 para obter um rHu Ranibizumabe redobrado purificado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solubilização é realizada usando um tampão de solubilização compreendendo tampão Tris 0,1 M, pH 9,0, EDTA 2 mM, um desnaturante e um agente redutor.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o desnaturante é selecionado a partir do grupo consistindo em cloridrato de guanidina ou ureia.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é selecionado a partir do grupo que consiste em ditiotreitol (DTT) ou β-mercaptoetanol.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as cadeias leves e pesadas solubilizadas de fragmentos de anticorpo são submetidas à oxidação pela adição de glutationa oxidada 10 mM seguida de passagem de oxigênio puro por uma taxa de fluxo de 1SLPM (litro padrão por minuto) para um processo de redobragem in-vitro.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a redobragem é realizada usando tampão de redobragem compreendendo Tris 0,1 M, pH 9,0, Arginina 0,6 M, Sorbitol 5%, EDTA 2 mM.

7. Sistema de expressão de vetor dueto (bicistrônico) para a expressão do gene da cadeia leve e pesada de rHu Ranibizumabe, caracterizado pelo fato de que o vetor dueto compreende a sequência nucleotídica que codifica a cadeia leve SEQ ID Nº: 3, sequência nucleotídica que codifica a cadeia pesada: SEQ ID Nº: 1, sequência do promotor e locais de restrição.