NO176108B - Enzymatisk detergenstilsetning, detergensblanding, en vaskemetode, en fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk enzym, en mikroorganisme som produserer enzymet samt anvendelse av enzymet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en enzymatisk detergenstilsetning hvis aktive komponent er et lipolytisk enzym.

Oppfinnelsen angår videre en detergensblanding inneholdende den enzymatiske detergenstilsetning og en vaskemetode som anvender detergensblandingen.

Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk enzym som egner seg for anvendelse i detergenser, mikroorganismestammer som produserer et slikt lipolytisk enzym samt anvendelsen av et lipolytisk enzym.

Et spesielt problem i forbindelse med vasking av klær henger sammen med fjerning av flekker av fettopprinnelse. Dette problemet forsterkes ytterligere hvis tendensen mot lavere vasketemperaturer opprettholdes. På det nåværende tidspunkt blir fettholdig smuss emulgert og fjernet som et resultat av vaskeprosessen ved høy temperatur og høy alkalitet.

På grunn av dagens tendenser i retning av energibesparelse, er det en sterk tendens mot bruk av relativt lave vasketemperaturer, det vil si rundt 40°C eller lavere. Det er derfor et behov for lipaser som er effektive ved de lave vasketemperaturer, stabile i sterk alkaliske detergensopp-løsninger og stabile under lagringsbetingelser både i faste og flytende detergensblandinger.

Selv om bruken av lipolytiske enzymer i detergensblandinger har vært kjent i mange år, se for eksempel referansene nevnt på side 1, linje 36-38 i GB-PS 1.442.418, synes de å være heller utilfredsstillende i praksis fordi de kun viser meget lav vaskeeffektivitet under vaskebetingelser og de møter ikke dagens stabilitetskrav. For et utstrakt studium skal det henvises til H. Andree et al., J. Appl. Biochem., 2 (1980), "Lipases as Detergent Components".

Lipolytiske detergensadditiver er også kjent fra for eksempel GB-PS 1.293.613 og CA-PS 835.343.

US-PS 3.950.277 og GB-PS 1.442.418 beskriver 1ipaseenzymer oppnådd med en aktivator og kalsium- og/eller magnesiumioner, som benyttes for forbløting av tilsmussede tekstiler og å fjerne triglyseridflekker og smuss fra polyester- eller polyester/bomullstekstilblandinger som egnede mikrobielle lipaser for bruk heri nevnes, bortsett fra animalske og planteavledede lipaser, de som avledes fra Pseudomonas, Aspergillus, Pneumococcus, Staphylycoccus og Staphylococcus toxins, Mycobacterium tuberculosis, Mycotorula lipolytica og Sclerotinia.

GB-PS 1.372.034 beskriver en detergensblanding omfattende en bakteriell lipase fremstilt av Pseudomonas stutzeri stamme ATCC 19154. Videre anbefales det at de foretrukne lipolytiske enzymer har et pH-optimum mellom 6 og 10 og bør være aktive i dette området, fortrinnsvis mellom 7 og 9. Kundt 1970 ble denne antatte Pseudomonas stutzeri stamme omklassifisert som Pseudomonas aeruginosa, slik det fremgår for eksempel av ATCC-katalogene.

EP-A-0130064 beskriver et enzymatisk detergensadditiv omfattende en lipase isolert fra Fusarium oxysporum med en høyere lipolytisk vaskeeffektivitet enn de konvensjonelle lipaser.

Som et resultat av utstrakt forskning og eksperimentering er det overraskende funnet at 1ipasepreparater kan oppnås ved dyrking av egnede valgte mikroorganismer, idet lipasene er i stand til å oppvise lipaseaktivitet under moderne vaskebetingelser, det vil si at de er stabile og effektive ved høye detergenskonsentrasjoner, ved høye pH-verdier og lave vasketemperaturer.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en enzymatisk detergenstilsetning hvis aktive komponent er et lipolytisk enzym, og oppfinnelsen karakteriseres ved at det lipolytiske enzym er et enzym som oppnås fra en lipaseproduserende stamme som er Pseudomonas pseudoalcaligenes CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85, CBS 473.85 eller ATCC 29625, eller Pseudomonas stutzeri CBS 461.85, eller mutanter og varianter derav som produserer lipaser med lignende egenskaper, hvorved enzymet videre karakteriseres ved: a) et pH-optimum i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLU-bestemmelse, og b) at det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en

konsentrasjon opptil ca. 10 g/l oppløsning under vaskeforhold ved en temperatur på 60° C eller derunder, og en pH-verdi mellom 7 og 11.

Som nevnt angår oppfinnelsen også en detergensblanding, og denne karakteriseres ved at den omfatter en enzymatisk detergenstilsetning som angitt ovenfor, sammen med et overflateaktivt middel og eventuelt andre bestanddeler som vanligvis inngår i slike blandinger.

Som nevnt angår oppfinnelsen også en vaskemetode, og denne karakteriseres ved at den omfatter anvendelsen av en detergensblanding som beskrevet ovenfor hvorved pH-verdien under vaskingen ligger innen området 7 til 11 og temperaturen er 60°C eller lavere.

Oppfinnelsen angår som nevnt også en fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk. enzym egnet for anvendelse i detergenser hvorved enzymet videre karakteriseres ved at: a) pH-optimum ligger i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLU-bestemmelse; og b) det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en

konsentrasjon opp til 10 g/l oppløsning under vaskeforhold

ved en temperatur på 60°C eller derunder og ved en pH-verdi mellom 7 og 11, og fremgangsmåten karakteriseres ved at den 1ipaseproduserende Pseudomonas pseudoalkaligenes-stamme CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 eller CBS 473.85 eller Pseudomonas stutzeri-stammen CBS 461.85 eller mutanter eller varianter derav som produserer lipase med tilsvarende egenskaper, dyrkes i et næringsmedium for dannelse av en lipaserik oppløsningsmiddel og at lipase isoleres fra oppløsningen.

Videre angår oppfinnelsen mikroorganismestammer som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger som beskrevet ovenfor, og disse stammer karakteriseres ved at de er Pseudomonas pseudoalkaligenes med deponeringsnummer CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 og CBS 473.85 samt Pseudomonas stutzeri med deponeringsnummer CBS 461.85.

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av et lipolytisk enzym fra den lipaseproduserende Pseudomonas pseudoalkaligenes-stamme CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 eller CBS 473.85 eller Pseudomonas stutzeri-stammen CBS 461.85 eller mutanter og varianter derav som produserer lipase med tilsvarende egenskaper, som aktiv komponent i en detergensblanding eller som en enzymatisk detergenstilsetning idet enzymet videre kjennetegnes ved: a) pH-optimum ligger i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLTJ-bestemmelse; og b) det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en

konsentrasjon opp til 10 g/l oppløsning under vaskeforhold ved en temperatur på 60°C eller derunder og ved en pH-verdi mellom 7 og 11.

I henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen kan som nevnt et lipasepreparat oppnås ved dyrking under vanlige dyrkingsbetingelser av et nytt isolat av Ps. pseudoalcaligenes valgt blant gruppen som omfatter stammer med de interne nummere Sp 9, IN II-5, Gr VI-15 og M-l, deponert 8. august 1985 i Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) i Baarn, Nederland, under numrene CBS 467.85 (7181), CBS 468.85 (7182), CBS 471.85 (7185) og CBS 473.85 (7187). Disse isolater identifiseres ved de fenotypiske karakteristika som er angitt i tabell 1.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan et 1ipasepreparat oppnås ved dyrking under vanlige dyrkingsbetingelser av typestammen av Ps. pseudoalcaligenes underart citrulli, deponert ved ATCC under nummeret 29625.

Det er velkjent for fagmannen at Pseudomonas pseudoalcal i-genes-arter, eksemplifisert ved stammen DSM 50188 (den samme som ATCC 17440, typestamme) og DSM 50189, ikke produserer lipaser. Imidlertid er det også kjent at de nevnte arter er heller heterogene. Dette manifesteres ved identifisering av nye plantpatogene bakterier, oppdaget av N.W. Schaad et al., Int. J. Syst. Microbiol., 28 (1978) 117-125, og kalt Pseudomonas pseudoalcaligenes underart citrulli, og av M. Goto, Int. J. Syst. Microbiol., 33 (1983) 539-545, kalt Pseudomonas pseudoalcaligenes underart konjaci.

Selv om de fenotypiske karakteristika for de to underarter citrulli og konjaci skiller seg noe fra hverandre og fra typestammen av artene nevnt ovenfor, anses det av fagmannen at disse underarter hører til artene Ps. pseudoalcaligenes (se for eksempel N.J. Palleroni, Bergey's Manual of Syste-matic Bacter iology, bind 1, utg. N.R. Krieg, Williams and Wilkins, Baltimore/London 1984, s. 173-174). Deres eksistens viser den naturlige variasjon som finnes i de fenotypiske karakteristika for Ps. pseudoalcaligenes-artene. "Variasjonene av de fenotypiske karakteristika uttrykkes blant annet ved produksjon av lipase av de nye underarter citrulli og konjaci av Ps. pseudoalcaligenes-artene.

Fagmannen vil også vite at de nye isolater skiller seg noe fra de beskrevne karakteristika av de inntil nå oppdagede underarter av Pseudomonas pseudoalcaligenes, men at de hører til denne art uansett.

Lipase som fremstilles av hver av de fire valgte stammer av Pseudomonas pseudoalcaligenes, definert ovenfor, viser en overraskende god stabilitet og effektivitet under vaskebetingelser. Det samme gjelder lipasen som fremstilles av typestammen av Pseudomonas pseudoalcaligenes underart citrulli, angitt ovenfor, hvis brukbare egenskaper på noen måte kunne avledes fra referansen Schaad et al.

I henhold til en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen kan som nevnt et lipasepreparat fremstilles ved under dyrkingsbetingelser å dyrke en ny Pseudomonas stutzeri-stamme som bærer det interne nummer Thai IV 17-1 og som er deponert ved CBS 8. august 1985 under nummeret CBS 461.85

(7175). Stammen er identifisert av de fenotypiske karakteristika som angis i tabell 2. Denne Pseudomonas stutzeri-stamme er i stand til å produsere en lipase som er stabil i detergensoppløsninger, inneholdende opptil 10 g detergens/liter ved 35<C>C og pH 9,0.

Som nevnt ovenfor var det allerede kjent at en Pseudomonas stutzeri-stamme, ATCC 19154, var i stand til å produsere en stabil lipase som kunne benyttes i vaskemidler, se også US-PS 3.511.753. Imidlertid er denne deponerte stamme reklassi-fisert som Pseudomonas aeruginosa, se for eksempel ATCC Catalogue of Bacteria, Phages and rDNA Vectors, 16. utg., 1985, s. 134, nr. 19154. Fagmannen skulle slett ikke kunne forutsi eller forvente at autentiske Pseudomonas stutzeri-stammer skulle kunne produsere stabile lipaser som definert ifølge foreliggende oppfinnelse. Pseudomonas stutzeri har vært kjent i lang tid som en heller heterogen art, omfattende flere bakteriestammer hvis enzymproduserende potensiale var meget forskjellig. Videre var ingen indikasjoner gitt hva angår muligheten for å benytte slike lipaser i moderne detergensblandinger og mer spesielt at dens stabilitet under de antydede vaskebetingelser skulle være så god.

I henhold til ytterligere en foretrukket utførelsesform ved oppfinnelsen kan et 1ipasepreparat oppnås ved under dyrke-betingelser å dyrke en ny isolert stamme av Acinetobacter calcoaceticus, som har det interne nummer Gr V-39 og som er deponert ved CBS 8. august 1985 under nummeret CBS 460.85

(7174). Denne stamme er identifisert ved de fenotypiske karakteristika som er angitt i tabell 2. Lipasepreparatet som oppnås fra den deponerte stamme var stabilt og effektivt opptil 10 g detergens/1 vaskeoppløsning ved 40-50°C og opptil pH 10,3.

De foretrukne lipasepreparater ifølge oppfinnelsen er de som forårsaker hydrolyse av minst ca. 10$ og fortrinnsvis minst ca. 20$ av de gjenvunnede fettstoffer under betingelse som beskrevet i eksempel 9 nedenfor for pulverformig detergens ved en minimal detergenskonsentrasjon på 2 g/l.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det som nevnt detergensblandinger som inneholder en lipase ifølge oppfinnelsen sammen med et vaskemiddel og eventuelt andre bestanddeler som vanligvis benyttes i slike midler. Bestanddelene i detergensblandingene ifølge oppfinnelsen kan i tillegg til den vesentlige lipase inneholde en eller flere av de følgende: 1. Overflateaktive midler som vanligvis benyttes i enzymatiske detergensblandinger. Generelt kan det benyttes naturlige eller syntetiske overflateaktive forbindelser, for eksempel vannoppløselige såper, kationiske, anioniske, ikke-ioniske, amfolytiske eller zwitterioniske overflateaktive midler. Et eksempel på et generelt benyttet overflateaktivt middel av denne type er dodecylbenzen-sulfonat. Generelt er de overflateaktive midler som- kan benyttes alene eller i blanding, tilstede i mengder på ca.

4 til 50 vekt-# av detergensblandingen,

2. Vannmyknere som komplekse fosfater, for eksempel alkali-metalltripolyfosfat eller et alkalimetallpyrofosfat eller zeolitter, fortrinnsvis- i mengder på opptil 40 vekt-# av detergensblandingen. Ytterligere eller alternative forbindelser som alkalimetallcyanotriacetat eller alkali-metallcitrat kan innarbeides og viser en kompleks virkning i detergenspreparater, 3. Alkalimetallsilikat eller svakt alkaliske forbindelser som alkalimetallbikarbonat, vanligvis opp til 20 vekt-#,

4. Fyllstoffer som alkalimetallsulfat,

5. Forbindelser som karboksymetylcellulose, parfymer, optiske myknere, bufferforbindelser, polyalkylenglykoler eller etanol,

6. Andre typer enzymer slik som proteaser og amylaser.

I de enzymatiske detergensblandinger ifølge oppfinnelsen ligger 1ipaseaktiviteten fortrinnsvis innen området fra 1 til 20.000 TLU/g blanding, mens den proteolytiske enzymaktivitet fortrinnsvis ligger i området 50 - 10.000 Delft-enheter/g blanding. En TLU ("True Lipase Unit") er definert som den mengde titrerbare fettsyrer ekvivalent med mengden av 1 pmol NaOH pr. minutt (se også s. 16 nedenfor). Delft-enhetene er definert i J. Åmer. Oil Chem. Soc. 60 (1983), 1672.

En annen gruppe forbindelser som kan innarbeides i detergensblandingene ifølge oppfinnelsen er blekemidler som alkalimet-allperborat, spesielt natriumperborat, alkalimetallperkarbo-nat som natriumperkarbonat, persyrer og salter derav, og aktivatorer for disse blekemidler som TAED. Når detergensblandingen inneholder perborater, perkarbonater, aktivatorer og optiske lysere på den ene side, og proteaser på den annen side, er det sterkt overraskende at lipasepreparatene ifølge oppfinnelsen fortsetter å utvise den høye stabilitet i nærvær av disse bestanddeler.

Detergensblandingene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på vanlig måte, for eksempel ved å blande sammen komponentene eller ved fremstilling av en forblanding som så gjøres ferdig ved å iblande de andre bestanddeler. I henhold til en mulig fremstillingsvei blir et eller flere 1ipasepreparater blandet med en eller flere av de andre forbindelser for å utgjøre et konsentrat med på forhånd bestemt enzymatisk aktivitet, et konsentrat som så kan blandes med de andre ønskede bestanddeler .

I henhold til en spesielt foretrukket utførelsesform foreligger de lipolytiske enzymer ifølge oppfinnelsen i form av et enzymatisk detergensadditiv. Dette kan også inneholde et eller flere andre enzymer, for eksempel en protease og/eller en amylase, som kan benyttes i moderne detergenspreparater, og en eller flere andre komponenter som vanligvis benyttes i denne teknikk, for eksempel et ikke-ionisk, salt, stabiliser-ende middel og/eller et belegningsmiddel. Fortrinnsvis omfatter det enzymatiske detergensadditiv ved siden av en lipase ifølge oppfinnelsen en protease og eventuelt en ot-amylase. Det er funnet at proteolyti ske enzymer ikke bryter ned de lipolytiske enzymer ifølge oppfinnelsen. De enzymatiske detergensadditivene ifølge oppfinnelsen blandes generelt med en eller flere detergenser og andre komponenter som er i og for seg kjente for derved å oppnå detergensblandingene.

Ifølge en spesifikk utførelsesform benyttes et enzymatisk detergensadditiv der 1ipaseaktiviteten ligger i området IO<2 >til 10^ TLU/g additiv, mens den eventuélt tilstedeværende proteolytiske aktivitet ligger innen området 5 x IO<4> til IO<6 >Delft-enheter/g.

De enzymatiske detergensadditiver ifølge oppfinnelsen kan foreligge for eksempel i form av granulater eller priller, fremstilt i henhold til generelt kjente metoder, se f.eks. GB-PS 1.324.116 og 1.362.365 og US-PS 3.519.570, 4.106.991 og 4.242.219.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes det enzymatiske detergensadditiv i flytende form med en enzymstabilisator. Denne stabilisator er f.eks. propylen-glykol. Slike flytende additiver benyttes fortrinnsvis i flytende detergensblandinger.

De stabile og effektive lipasepreparater ifølge oppfinnelsen kan hensiktsmessig fremstilles ved å dyrke de ovenfor nevnte mikroorganismer under egnede betingelser. For å oppnå høyere enzymutbytter er media inneholdende lett assimilerbare karbon- og energikilder nødvendige på samme måte som en nitrogenkilde av organisk opprinnelse slik som kasein. Mer foretrukket tilsettes et fett eller en olje til dyrknings-mediet så vel som kalsium- og magnesiumsalter og spor-elementer .

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen skjer dyrkningsprosessen i skummet melk, på forhånd fortynnet med vann i et forhold fra 1:1 opp til 1:25 vekt/volum. God "beluftning er nødvendig under fermentering. pH-verdien i mediet holdes hensiktsmessig mellom 6 og 10 og fortrinnsvis mellom 6,5 og 9.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en vaskeprosess som benytter oppfinnelsens detergensblanding. En slik prosess kan tilfredsstillende gjennomføres ved en temperatur på ca. 60° C eller under og helst ved 30-40°C med en pH-verdi vanligvis mellom 7 og 11. Vasketiden ligger generelt mellom 10 og 60 minutter. Mest foretrukket for vaskeprosessen er det å benytte en detergensoppløsning inneholde detergensblandingen ifølge oppfinnelsen i en mengde fra ca. 0,5 til 15 g/l detergensoppløsning, fortrinnsvis 1-10 g/l.

Lipases ytelse i vaskeprosessen

Moderne detergensblandinger inneholder bestanddeler som velges for optimal effektivitet i vaskeprosessen. Det er selvsagt at hvis en lipase skal benyttes i en moderne vaskeprosess, må den være kompatibel med de vanlige aktive og effektive bestanddeler som finnes i de moderne detergens-formuleringer. For dette formål er det satt opp et antall testkriterier som kan benyttes for å vise aktiviteten og effektiviteten til oppfinnelsens lipaser under vaskebetingelser. Disse kriterier er: 1. Aktiviteten til lipasene i nærvær av en hyppig benyttet detergensdanner som natriumtripolyfosfat (TPP). Dette kriterium er signifikant fordi det er en generell antagelse at lipaser er avhengig av alkalimetallioner som kalsium for aktivitet og stabilitet. Slike kalsium-avhengige lipaser ville således ikke være egnet for bruk i moderne detergensblandinger. 2. Aktivitet av lipaser i moderne detergensoppløsninger. Det er tallrike moderne detergensoppløsninger som benyttes for utprøving av aktiviteten og effektiviteten til alkaliske lipaser. Det er her blant andre foreslått å bruke en pulverdetergensblanding og en flytende formulering som typiske eksempler på hyppig benyttede moderne detergens-formuleringer. Disse typisk moderne detergensblandinger er: - "ALL", pulver, et kommersielt tilgjengelig pulver fra Unilever i Nederland. I de her gjennomførte prøver ble det benyttet "ALL"-base, oppnådd fra Unilever Research, Vlaardingen, Nederland, som har samme formulering som "ALL" men uten perborat, blekeaktivator, TAED, og enzymer. - "TIDE", en væske, et produkt fra Procter & Gamle og kommersielt tilgjengelig i USA. For de her gjennomførte prøver ble enzymene som er tilstede i formuleringen inaktivert ved varmebehandling. 3. Lipaseaktivitet i "ALL" med proteaser. Da proteaser er en viktig bestanddel i moderne detergensblandinger, bør aktivitet og effektivitet for lipasene manifestere seg i nærværet av denne detergensbestanddel (sammen med matriksen av overflateaktivt middel). 4. Lipaseaktivitet i nærvær av et typisk blekemiddel som perborat og en blekeaktivator som TAED. Blekemidler og deres aktivatorer ved lavere vasketemperaturer er viktige bestanddeler for enkelte moderne detergensblandinger. Aktiviteten og effektiviteten for lipasene i disses nærvær anses som et signifikant kriterium.

For å bedømme bidraget til lipasene ifølge oppfinnelsen på fjerning av olje og fett fra tekstiler, trenger man et skikkelig prøvesystem som tillater en utvilsom bestemmelse av aktiviteten til lipasene ifølge oppfinnelsen i detergensopp-løsninger .

Prøvetekstilene som vanligvis benyttes, for eksempel "EMPA" 101 og 102 (kommersielt tilgjengelige fra Eidgenossische Materialprtifungs und Versuchsanstalt, St. Gallen, Sveits) har den mangel at vaskeevnen måles som fjerning av pigment. Hvorvidt fjerning av pigment fra "EMPA" 101 og 102-tekstiler direkte kan korreleres til fjerning av fett eller fettsyrer er et relevant spørsmål og kun av denne grunn er disse tekstiler ikke ansett å være relevante for bedømmelsen av lipaseytelsen.

Et annet prøvesystem, som beskrevet i EP-PS 0130064, stoler også på fjerning av fargestoff fra en kunstig tilsmusset tekstil. De samme innvendinger gjelder her som angitt ovenfor. Videre blir i prøvesystemet til denne søknad emulgert fett benyttet som et substrat for alkaliske lipaser. Denne type fett tilsvarer ikke de fleste typer fettflekker som skulle måtte fjernes av en moderne detergensoppløsning, idet slike flekker ikke foreligger i emulgert form og ikke-emulgert fett som sådant er i kontakt med tekstilen.

Det prøvesystem som benyttes av Andree et al., "J. Appl. Biochem.", 2 (1980) 218-229, benytter radioaktivt merket fett avsatt på tekstilen. Etter vaskeprosessen blir radioaktivi-teten på tekstilen målt og relatert til den lipolytiske aktivitet. I dette system er det imidlertid ikke mulig å skille mellom radioaktivitet på grunn av fettet og på grunn av fettsyrer og derfor er prøvesystemet ikke et pålitelig mål på ytelsen til alkaliske lipaser i vaskeprosessen.

For oppfinnelsens formål er det utviklet en ny prøve, heretter kalt SLM-prøven, som benyttes for bedømmelse av alkaliske lipaser og deres aktivitet og effektivitet i vaskeprosessen. SLM-prøven benytter de samme prinsipper som den metode som ble utviklet av T. Hashimoto et al., "Yukagaku" 34 (1985), 606-612, men den tid som er nødvendig for analysen er sterkt redusert. Metoden inkluderer å anvende immobilisert, ikke-emulgert fett eller olje på en tekstil som prøveflekk, og ekstrahere det gjenværende etter vaskeprosessen og å analysere ekstraktet på fett og fettsyrer. Avhengig av betingelsene som benyttes kan fettsyrer som dannes som et resultat av lipaseaktivitet sammen med gjenværende triglycerider forbli på tekstilen under vaskeprosessen. Derfor synes mengdene av produkter som blir tilbake å være et godt mål på ytelsen til lipasene under vaskeprosessen. SLM-prøven beskrives i større detalj nedenfor under de generelle analysemetoder.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere ved de følgende eksempler. I disse blir de generelle analyser gjennomført som følger.

Bestemmelse av lipaseaktivitet

A. Olivenoljehydrolyse. TLU-metoden

Aktiviteten til 1ipasepreparatene ifølge oppfinnelsen ble bestemt enten basert på hydrolyse av olivenolje eller av p-nitrofenyl-laurat, NPL. Den førstnevnte metode er i det alt vesentlige i henhold til Nåher (1974) i: "Methods of Enzymatic Analysis", bind II, s. 814-818, H.U. Bergmeyer, utg., "Academic Press", N.Y., London) bortsett fra fettsyren som settes fri måles ved pH 8,0 og 25°C i en pH-stat. En "True Lipase Unit, TLU eller sann lipaseenhet, defineres som den titrerbare fettsyreekvivalent med mengden 1 jjmol NaOH pr. minutt.

B. Nitrofenyllaurathydrolyse. NPL-metoden

Metoden er basert på hydrolyse av p-nitrofenyllaurat til p-nitrofenol og laurinsyre og er i det vesentlige som følger: en egnet mengde lipase fortynnes i 0,05M MOPS (3-N-morfolin-propansulf onsyre )-NaOH , pE 8,0 til ca. 0,003-0,008 enheter NPL/ml. En NPL-enhet beskrives som den mengde lipase som er nødvendig for å sette fri et pmol p-nitrofenol. 4 ml lipase- . oppløsning blandes med 1 ml p-nitrofenyllauratoppløsning (25 mg p-nitrofenyllaurat i 25 ml etanol og to dråper IN HC1) og inkuberes i 10 minutter ved 30°C. Reaksjonen stanses ved tilsetning av 5 ml alkoholisk Tris-oppløsning (2,5 g Tris-(hydroksymetyl-aminometan) ill etanol) og avkjøles til romtemperatur. Absorbans avleses ved 400 nm og korrigeres for absorbans av inkubering uten lipase. Mengden jjmol p-nitrofenol som er satt fri beregnes ut fra en kalibreringskurve som konstrueres med absorbansverdiene ved 400 nm av egnede oppløsninger av p-nitrofenol i etanol, hvorav 1 ml tilsettes til 4 ml 0,05M "MOPS"-NaOH-buf f er, pH 8,0, og 5 ml alkoho1 isk-Tris-oppløsning.

Stabiliteten mot lipasene ble fulgt med tiden ved å måle aktivitetene ved 0, 15 og 30 minutter og enkelte ganger opptil 90 minutter med en av disse metoder.

Analyse for bestemmelse av lipasestabilitet i detergensoppløsninger

For å bedømme stabiliteten til et antall lipaser i henhold til oppfinnelsen i detergensoppløsninger ble følgende forsøk gj ennomført.

En egnet mengde av et 1ipasepreparat, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble ført inn en oppløsning av: a) Syntetisk ledningsvann, SLV, inneholdende 0,433 g CaCl2-6H20, 0,140 g MgCl2'6H20 og 0,210 g NaHC03 pr. liter

destillert vann,

b) et vaskemiddel valgt blant:

- "ALL"-base (= "ALL" uten perborat, TAED og enzymer)

- "TIDE" pluss (= "TIDE" inneholdende natriumtripolyfosfat) - "TIDE" minus (fosfatfri, inneholdende andre oppbyggere)

Forsøkene ble gjennomført ved pH 9,0 eller 10,3 ved 35, 40 eller 50°C. Prøver ble tatt fra blandingene etter 0, 15 og 30 minutter (enkelte ganger opptil 90 minutter), og gjenværende lipaseaktivitet ble bestemt ved en av de beskrevne metoder. Lipasene som ble benyttet var Pseudomonas pseudoalcaligenes-stammer Sp 9 (CBS 467.85 ), IN IL-5 (CBS 468.85 ), Gr VI-15 (CBS 471.85) og M-l (CBS 473.85), Pseudomonas stutzeri-stamme Thai IV 17-1 (CBS 461.85) og Acetobacter calcoaceticus-stamme Gr V-39 (CBS 460.85).

Resultatene er vist i eksemplene 4 til 8.

Analyse for bestemmelse av lipaseytelsen under vaskebetingelser. SML- prøven

Det følgende er et typisk eksempel på hvordan SLM-prøven fortrinnsvis gjennomføres.

"EMPA" 211 bomullslapper benyttes som tekstil og triolein eller renset olivenolje (begge kommersielle) som substrater. Hydrolysen av triolein kan følges ved kromatografiske metoder etter ekstrahering av tekstilet.

Vaskeprosedyren som fortrinnsvis ble benyttet for SLM-prøven er som følger: Et volum på 20 pl inneholdende 5 mg olivenolje oppløst i aceton (25$) påføres på en 3 cm x 3 cm bomullsf ille. Denne lufttørkes ved romtemperatur. Detergensoppløsningen bestående av 10 ml SLV (0,433 g CaCl2-6H20, 0,140 g MgCl2'6H20 og 0,210 g NaHC03 pr. liter destillert vann) eller vaskemiddel oppløst i SLV anbringes i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe med en slippropp og holdes i et rystevannbad ved 40°C. Vaskeprosessen startes ved å tilsette lipase (20 TLU, se nedenfor) og umiddelbart deretter denne tilsmussede fille, til Erlenmeyer-kolben med etterfølgende rysting i 40 minutter ved 40°C. I en blind-forsøk tilsettes ingen lipase.

Etter vasking skylles fillen med SLV og den tørkes deretter ved romtemperatur. De tørkede filler ekstraheres ved rotasjon i et glassrør inneholdende 5 ml oppløsningsmiddel med samme sammensetning som elueringsmidlet som benyttes for kromato-grafisk separering av substrat og produkter.

I ekstraheringsoppløsningen ble gjenværende triglyserid og den dannede frie fettsyre bestemt ved HPLC.

Utstyr og betingelser:

Pumpe: Modell 2150 (LKB)

Detektering: Refraksjonsindeksmonitor (Jobin Jvon ).

Injeksjonssystem: Wisp (MILLIPORE): 10 pl

Integrator: SP 4270 (Spectra Physics)

Kolonne: CP Microspher-Si (CHROMPACK), 100 x 4,6 mm Elueringsmiddel: n-heksan/isopropylalkohol/maursyre: 975:25:2,5 (v/v), 1 ml/min.

Temperatur: omgivelses

Under disse betingelser er retensjonstidene for triolein og oleinsyre 1,2 henholdsvis 1,6 minutter. Topparealet eller topphøyden måles. Disse er et mål på gjenvinning av triglyserid og fettsyre etter ekstrahering fra fillen. Gjenvinning av triglyserid etter ekstrahering fra den uvaskede fille settes som 100$.

Under de ovenfor beskrevne betingelser ble forholdet mellom refraksjonsindeksresponsene mellom olivenolje og oleinsyre funnet å være 0,85 på basis av topparealet og 1,1 på basis av topphøyden.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av frysetørket supernatant av en lipasefermen-tering av stamme Sp 9

Pseudomonas pseudoalkaligenes Sp 9 (CBS 467.85) ble inokulert i 30 ml sterilt hjerne-hjerteinfusjons(BHI)medium (Difco) i en 100 ml konisk kolbe. Kulturen ble rystet i 16 timer ved 30°C i en orbitalryster ved 300 omdr./min. BHI-dyrkede celler ble inokulert i en 2 1 konisk kolbe inneholdende 500 ml sterilt skummet-melk-medium. Skummet-melk-mediet ble fremstilt som følger: 100 g skummet melk (Difco);

deionisert vann tilsatt til 1 liter;

pH-verdi justert til 7,0 før sterilisering;

steriliseringsbetingelser: 110°C i 30 minutter.

Rystekolben med inokulert skummet melk ble rystet i 48 timer i en orbitalryster ved 250-300 omdr./min. Veksttemperaturen for lipasefremstillingen var 20°C. Buljongen ble sentrifugert med en Sorvall R GSA rotor ved 10.000 g og 8-10° C. Supernatanten oppnådd etter sentrifugering ble så frysetørket for å oppnå et 1ipasepreparat.

Fermenteringen av andre 1ipaseproduserende stammer, for eksempel stammene CBS nr. 460.85, 461.85, 468.85, 471.85 og 473.85, ATCC nr. 29625 og DSM nr. 2672 (EP-A-130064 ) ble gjennomført på tilsvarende måte bortsett fra for stamme CBS 468.85 der veksttemperaturen var 30°C.

Lipasepreparatene som ble oppnådd ifølge dette eksempel ble benyttet for de stabilitetsforsøk som er beskrevet i eksemplene 4-8.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av frysetørket supernatant av et lipasefermen-tering av stamme Thai IV 17- 1

Pseudomonas stutzeri Thai IV 17-1 (CBS 461.85) ble inokulert i 30 ml sterilt BHI-medium i en 100 ml konisk kolbe. Kulturen ble rystet i 16 timer ved 30°C i en orbitalryster ved 300 omdr./min. De BHI-dyrkede celler ble inokulert til en 2 1 konisk kolbe inneholdende 500 ml sterilt GSM-medium. Dette ble fremstilt som følger: 100 g skummet melk fra Difco eller Oxoid;

deionisert vann tilsatt til 11;

pH-verdien justert til 7,8 ved tilsetning av 4N NaOH;

temperaturen bragt til 40°C under omrøring;

"MAXATASE"-oppløsning fra Gist-brocades ble så tilsatt;

temperatur og pH-verdi regulert i 1 time. Deretter ble pH-verdien bragt til 7. Steriliseringen ble gjennomført ved 110°C i 30 minutter.

"MAXATASE"-oppiøsningen ble fremstilt som følger:

Til 1 g "MAXATASE"-pulver (2,372 x IO<6> Delft-enheter/g) ble det satt deionisert vann til 25 ml. Det hele ble rystet godt i 5-10 minutter. Uoppløselige stoffer ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 omdr./min. i SS34-rotoren til en Sorvall-sentrifuge. Supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 pm "Millipore"-filter. Filtratet ble så tilsatt pr. liter av 10$ skummet melk. Den inokulerte skummede melk ble rystet i rystekolber i 48 timer ved 20° C i en orbitalryster ved 250-300 omdr./min. Deretter ble buljongen sentrifugert i en Sorvall GSA-rotor ved 10.000 g og 8-10°C. Den oppnådde supernatant ble dialysert i EDTA-behandlede dialyserør mot 50 volumer 10 mmol Tr is-ECl-buf f er, pE 8, ved 4°C med to bufferendringer i løpet av 24 timer. Etter dialyse ble innholdene fra dialyseposene slått sammen og så frysetørket.

På tilsvarende måte ble fermenteringer gjennomført med alle andre stammer som nevnt i eksempel 1, bortsett fra stamme CBS 473.85. De 1ipaseholdige supernatanter som ble oppnådd i henhold til dette eksempel (bortsett fra lipasen fra stamme M-l) ble benyttet for de forsøk som er beskrevet i eksemplene 9 og 10.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av frysetørket supernatant av en lipasefermen-tering av stamme M- l

Pseudomonas pseudoalcaligenes-stammen M-l (CBS 473.85) ble inokulert i 500 ml steril hjerne-hjerteinfusjons(BHI)medium (Difco) i en 500 ml konisk kolbe. Kulturen ble rystet i 18 timer ved 30°C i en orbitalryster ved 280 omdr./min. De BHI-dyrkede celler ble inokulert i en 20 1 fermenter inneholdende 10 1 sterilt medium 1 eller medium 2.

Medium 1 ble fremstilt som følger:

Suspender 1000 g skummet melk i demineral i sert vann til 9,5 1; bring temperaturen til 30° C og pH-verdien til 7,8 med natriumhydroksydoppløsning, tilsett 33 x IO<5> ÅDU (= 26 x 10^ DU) "MAXÅCAL" (Gist-brocades) for proteasebehandling (30°C og pH 7,0-7,8) i løpet av en time. Autoklaveringer etter tilsetning av 0,5-10 ml antiskummingsmiddel ("SAG" 471 eller "Pluronic" L-81): 30 min. ved 110°C.

Medium 2 ble fremstilt som følger:

Suspender 400 g kasein i 5 1 demineralisert vann; bring pH-verdien til 9,0 (med en oppløsning av natriumhydroksyd) og temperaturen til 50°C; tilsett 5 x 10<7> ADU (= 4 x IO<7> DU) "Maxacal" for proteasebehandling; inkubering (90 min. ved 50°C og pH=9,0) stanses ved hurtig oppvarming (inkubering 5 min. ved 90°C). Etter avkjøling til 25°C, juster pH-verdien til 7,0 ved svovelsyretilsetning.

De andre komponenter (smør 5 0 g; MgSC>4 • 7^0 5 g; MnS04'4H20 0,1 g og antiskummingsmiddel "SAG" 471 0,5-10 ml) ble tilsatt og mediet fylt opp til 10 1 med demineralisert vann og autoklavert: 65 min. ved 120°C.

Mediet ble avkjølt til fermenteringstemperatur, 30° C. Fermenteringsbetingelser:

luftstrøm: 0,167 vvm

omrøring: 1000 omdr./min.

pH-verdi: 6,5-10,0 og fortrinnsvis 6,8-8,0. Fermenteringen ble fortsatt imellom 35 og 72 timer.

Buljongen ble sentrifugert etter fermentering på en Hettich-sentrifuge (4000 g, 8-10°C) i 30 min. Supernatanten ble avkjølt til 0°C og fast (N^^SC^ ble satt til en konsen-r trasjon av 70%, (vekt/vekt), under omrøring. Presipitatet som ble dannet ble separert fra supernatanten ved sentrifugering på en Sorvall-sentrifuge (10.000 g, 4-5°C) i 20-25 min. Presipitatet ble tatt opp i en 10 mmol Tris HCl-buffer (pH 8) ved 0°C og avkjølt aceton (< -7°C) ble i løpet av 20 min.' satt til en konsentrasjon av 65$, vekt/vekt. Etter sentri-fugeringen ble presipitatet tatt opp i 10 mmol Tris-HCl-buffer pH 8 og dialysert mot 50 volumer av den samme buffer ved 4°C med to bufferendringer over 24 timer. Etter dialyse ble materialet lyofilisert og den oppnådde aktivitet var 6000 TLU/g.

På tilsvarende måte kan alle andre stammer nevnt i eksempel 1 brukes, imidlertid med følgende lette modifikasjoner: For stamme Sp 9 kan kun medium 1 benyttes; fermenteringstempera-turen er 20°C.for alle stammer bortsett fra stamme IN II-5 som er 20 eller 30°C.

EKSEMPEL 4

Stabilitetsforsøk med Pseudomonas pseudoalcaligenes lipaser ved 8 g " ALL"- base/ l ved 35. 40 og 50°C

Kilde: frysetørket supernatant Detergensoppløsning: "ALL"-base, 8 g/l

pH-verdi: som antydet

a. Temperatur 35°C

b. Temperatur 4CTC c. Temperatur 5 0" C

EKSEMPEL 5

Stabilitetsforsøk med visse Pseudomonas pseudoalcaligenes lipaser ved 4 g " ALL"- base/ l ved 40 og 50°C

EKSEMPEL 6

Stabilitetsforsøk med Pseudomonas pseudoalcaligenes- stamme Sp 9 ved 6 g " TIDE"/ I ved 40 og 50°C

Kilde: frysetørket supernatant av Sp 9 Detergensoppløsning: som antydet, 6 g/l

pH-verdi: som antydet

a. Temperatur 40" C

b. Temperatur 50°C

EKSEMPEL 7

Stabilitetsforsøk med Pseudomonas stutzeri lipase Thai IV 17- 1 ved 5 g " ALL"- base/ l ved 40°C

EKSEMPEL 8

Stabilitetsforsøk med Acinetobacter calcoaceticus lipase ved 8 g " ALL"- base/ l ved 40 og 50°C

a. Temperatur 40°C b. Temperatur 50°C

EKSEMPEL 9

Dette eksempel viser ytelsen til lipase-stammene Ps. pseudoalcaligenes Sp 9, IN II-5, Gr VI-15, M-l, ATCC 29625, Ps. stutzeri Thai II-5 og Acetobacter calcoaceticus Gr V-39 i en vaskeprosess i henhold til SLM-prøven, der kompatibiliteten til disse enzymer med en oppbyggerkomponent tilstede i moderne vaskepreparater (TPP), en pulverdetergensblanding ("ALL"-base) og en flytende formulering ("TIDE"-væske) ble undersøkt.

SLM-prøven ble gjennomført som beskrevet på sidene 18-19 i beskrivelsen. Preliminære forsøk viste at under de benyttede betingelser forble en betydelig mengde fettsyrer dannet av lipase, sammen med gjenværende triglyserid, på tekstilet under vaskeprosessen.

Ytelsene til lipasene som nevnt ovenfor og blindprøven ble undersøkt ved SLM-metoden under følgende betingelser: standard ledningsvann (SLV) justert til en pH-verdi =9,1 med alkali.

natriumtripolyfosfat (TPP): 2 og 10 g/l (pH 9,1) flytende "TIDE": 2 og 4 g/l (pH 7,5)

"ALL"-base: 2, 4 og 8 g/l (pH 9,2-9,6)

Lipaseaktivitetsenhetene som ble tilsatt, 20 TLU, ble oppnådd fra de frysetørkede prøver fremstilt i henhold til eksempel 2 og når det gjaldt stamme M-l eksempel 3. De ble funnet å være som følger:

Resultatene er vist de følgende tabeller.

A. Alkalisk lipase: ingen ( blind)

B. Alkalisk lipase fra stamme Sp 9

C. Alkalisk lipase fra stamme IN II- 5 D. Alkalisk lipase fra stamme M- l E. Alkalisk lipase fra stamme Gr VI- 15 F. Alkalisk lipase fra stamme ATCC 29625 ( Citrulli)

G. Alkalisk lipase fra Thai IV- 17- 1 H. Alkalisk lipase fra stamme Gr V- 39

Ut fra disse tabeller fremgår det klart at lipasene ifølge oppfinnelsen viser sine lipolytiske egenskaper på tekstil og spesielt sin utmerkede ytelse i flytende og pulvervaskemidler under vaskebetingelser.

EKSEMPEL 10

Dette eksempel viser kompatibiliteten for visse lipaser ifølge oppfinnelsen og bleke- eller et proteinspaltende enzym under vaskebetingelser. Lipasene ytelse ble prøvet ved SLM-metoden som beskrevet ovenfor under følgende betingelser:

- "ALL"-base + blekeaktivator (TAED 3$): 4 g/l (pH 9,1)

- "ALL"-base + TAED + bleke (NaB03-4H20, 13<j>) : 4 g/l

(pH 9,1)

- "ALL"-base + TAED + protease (2000 DU/g vaskemiddel):

4 g/l (pH 9,1)

Tilsatte 1ipase-aktivitetsenheter, 20 TLU, ble oppnådd fra de frysetørkede prøver fremstilt ifølge eksempel 2 og ifølge eksempel 3 når det gjaldt Ml til eksempel 3 (se eksempel 9).

Lipase- stammer: IN II-5, M-l, Gr VI-15 og ATCC 29625

Protease: "MAXATASE". Den proteolytiske aktivitet til "MAXATASE" (DU/1) ble bestemt i henhold til Delft-metoden, beskrevet i "J. Amer. Oil Chem. Soc." 60 (1983), 1672.

Resultatene, uttrykt på samme måte som i eksempel 1, er vist i de følgende tabeller:

A. Alkalisk lipase fra stamme IN II- 5

B. Alkalisk lipase fra stamme M- l

C. Alkalisk lipase fra stamme Gr VI- 15 D. Alkalisk lipase fra stamme ATCC 29625

Også fra disse tabeller fremgår det klart at lipasene ifølge oppfinnelsen viser sine lipolytiske egenskaper på tekstil og spesielt deres utmerkede ytelse i flytende og pulverformige vaskemidler under vaskebetingelser.

Claims (17)

1. Enzymatisk detergenstilsetning hvis aktive komponent er et lipolytisk enzym, karakterisert ved at det lipolytiske enzym er et enzym som oppnås fra en lipaseproduserende stamme som er Pseudomonas pseudoalcaligenes CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85, CBS 473.85 eller ATCC 29625, eller Pseudomonas stutzeri CBS 461.85, eller mutanter og varianter derav som produserer lipaser med tilsvarende egenskaper, hvorved enzymet videre karakteriseres ved: a) et pH-optimum i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLU-bestemmelse, og b) at det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en konsentrasjon opptil ca. 10 g/l oppløsning under vaskeforhold ved en temperatur på 60°C eller derunder, og en pH-verdi mellom 7 og 11.

2. Enzymatisk detergenstilsetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter et proteolytisk enzym og eventuelt et amylolytisk enzym.

3. Enzymatisk detergenstilsetning ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at lipasen oppviser en lipolytisk virkning innen området 10<2> til IO<6> TLU/g tilsetning .

4. Enzymatisk detergenstilsetning ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at proteasen oppviser en proteolytisk aktivitet på 5 x IO<4> til IO<6> DU/g tilsetning.

5 . Enzymatisk detergenstilsetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den foreligger i form av et granulat eller perler.

6. Enzymatisk detergenstilsetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den foreligger i form av en væske med en enzymstabilisator.

7. Detergensblanding, karakterisert ved at den omfatter en enzymatisk detergenstilsetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6 sammen med et overflateaktivt middel og eventuelt andre bestanddeler som vanligvis inngår i slike blandinger.

8. Detergensblanding ifølge krav 7, karakterisert ved at den har en lipolytisk virkning innen området 1 til 20 000 TLU/g blanding.

9. Detergensblanding ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at den, i tillegg til det lipolytiske enzym, omfatter et proteolytisk enzym som har en proteolytisk aktivitet fortrinnsvis innen området 50 til 10 000 Delft-enheter (DU)/g blanding.

10. Vaskemetode, karakterisert ved at den omfatter anvendelsen av en deteregensblanding i henhold til et hvilket som helst av kravene 7 til 9 hvorved pH-verdien under vaskingen ligger innen området 7 til 11 og temperaturen er 60°C eller lavere.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et lipolytisk enzym egnet for anvendelse i detergeriser hvorved enzymet videre karakteriseres ved at: a) pH-optimum ligger i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLU-bestemmelse; og b) det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en konsentrasjon opp til 10 g/l oppløsning under vaskeforhold ved en temperatur på 60° C eller derunder og ved en pH-verdi mellom 7 og 11, karakterisert ved at den 1ipaseproduserende Pseudomonas pseudoalkaligenes-stamme CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 eller CBS 473.85 eller Pseudomonas stutzeri-stammen CBS 461.85 eller mutanter eller varianter derav som produserer lipase med tilsvarende egenskaper, dyrkes i et næringsmedium for dannelse av en lipaserik oppløsningsmiddel og at lipase isoleres fra oppløsningen.

12. Mikroorganismestamme som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger, karakterisert ved at stammen er Pseudomonas pseudoalkaligenes med deponeringsnummer CBS 467.85.

13. Mikroorganismestamme som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger, karakterisert ved at stammen er Pseudomonas pseudoalkaligenes med deponeringsnummer CBS 468.85.

14 . Mikroorganismestamme som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger, karakterisert ved at stammen er Pseudomonas pseudoalkaligenes med deponeringsnummer CBS 471.85.

15 . Mikroorganismestamme som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger, karakterisert ved at stammen er Pseudomonas pseudoalkaligenes med deponerings-numnmer CBS 473.85.

16. Mikroorganismestamme som produserer lipolytisk enzym til bruk i detergensblandinger, karakterisert ved at stammen er Pseudomonas stutzeri med deponeringsnummer CBS 461.85.

17. Anvendelse av et lipolytisk enzym fra den 1ipaseproduserende Pseudomonas pseudoalkaligenes-stamme CBS 467.85, CBS 468.85, CBS 471.85 eller CBS 473.85 eller Pseudomonas stutzeri-stammen CBS 461.85 eller mutanter og varianter derav som produserer lipase med tilsvarende egenskaper, som aktiv komponent i en detergensblanding eller som en enzymatisk detergenstilsetning idet enzymet videre kjennetegnes ved: a) pH-optimum ligger i området 8 til 10,5, målt i en pH-stat under forhold for TLU-bestemmelse; og b) det oppviser en effektiv lipolytisk virkning i en vannholdig oppløsning som inneholder en detergens ved en konsentrasjon opp til 10 g/l oppløsning under vaskeforhold ved en temperatur på 60° C eller derunder og ved en pH-verdi mellom 7 og 11.