ES2424346T3 - Variantes de glucósido hidrolasas - Google Patents

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Abstract

Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad con losaminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma máspreferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, caracterizado por el hecho de que lasecuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a lasposiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC IDn.º: 2, caracterizado por el hecho de que la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 yla variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, caracterizado por elhecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependientede la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad deproducto y estabilidad química.

Description

Variantes de glucósido hidrolasas.
[0001] Esta invención fue realizada con el apoyo del Gobierno bajo el Subcontrato de NREL No. ZCO-30017-02, Contrato principal DE-AC36-98GO10337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
[0002] La presente invención se refiere a variantes de una glucósido hidrolasa con una o más propiedades mejoradas en relación a su enzima progenitora, ácidos nucleicos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes y métodos de uso de las variantes.
Descripción de las técnicas relacionadas
[0003] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unido covalentemente por enlaces beta-1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos betaenlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasa y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares al azar, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas secuencialmente liberan moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble con enlace beta-1,4. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.
[0004] La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar quemar o verter en terrenos los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los desperdicios sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en el etanol.
[0005] Ståhlberg et al., 1996, J. Mol. Biol. 264: 337-349, describen estudios de actividad y estructuras de cristal de mutantes catalíticamente deficitarios de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei. Boer and Koivula, 2003, Eur. J. Biochem. 270: 841-848, revela la relación entre la termoestabilidad y el óptimo de pH estudiado con tipo salvaje y mutante de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei Cel7A.
[0006] WO 2004/016760 divulga variantes de una celobiohidrolasa Hypocrea jecorina.
[0007] Sería una ventaja en la técnica proporcionar variantes de glucósido hidrolasa con propiedades mejoradas para convertir materiales celulósicos a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Las propiedades mejoradas incluyen perfiles de actividad alterada dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad del pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
[0008] Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de glucósido hidrolasas con propiedades mejoradas en comparación con sus enzimas progenitoras.
Resumen de la invención
[0009] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad para los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, donde las secuencias de aminoácidos 1 de los polipéptidos difieren de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante ha mejorado propiedades en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, pH actividad, pH estabilidad y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
[0010] La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican las glucósido hidrolasas o polipéptidos que tienen actividad de glucósido hidrolasas y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de nucleótidos.
[0011] La presente invención también se refiere a métodos para producir variantes de una glucósido hidrolasa progenitora o polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa en una célula huésped.
[0012] La presente invención además se refiere a métodos de uso de las variantes de glucósido hidrolasa en detergentes y en la conversión de celulosa a glucosa.
Breve descripción de las figuras
[0013]
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pAJ052. La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pJC106. La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pAILo1. La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pBANe10. La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo2. La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pCW026. La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pNP776G205R. La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pMJ04. La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pMJ06. La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pMJ09. La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pCW045. La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pSTM01. La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pSMKO3. La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pEJG97. La Figura 15 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una betaglucosidasa Aspergillus fumigatus SEC ID n.°: 56 y 57, respectivamente). El péptido señal predicho está subrayado y los intrones predichos están en cursiva. La Figura 16 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 50° y 65° C. La Figura 17 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 70° C. La Figura 18 muestra la hidrólisis de celobiosa por beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 65° C. La Figura 19 muestra los perfiles de curso temporal de hidrólisis PCS por la cepa de Trichoderma reesei parental RutC30 y la variante de expresión de la cepa 776-M57.
Descripción detallada de la invención
[0014] La presente invención se refiere a una variante polipeptídica aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad para los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, donde la secuencia de aminoácidos del polipeptídico difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante ha mejorado propiedades en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, pH actividad, pH estabilidad y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
Definiciones
[0015] El término quot;glucósido hidrolasaquot; es definida en la presente como hidrolasas descritas por Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach, in quot;Recent Advances in Carbohydrate Bioengineeringquot;, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society de Chemistry, Cambridge, págs. 3-12. Ejemplos de glucósido hidrolasas incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, celobiohidrolasa, endoglucanasa y exoglucanasa. En una forma de realización preferida, las glucósido hidrolasas pertenecen a familia 7 tal y como se define por Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, supra.
[0016] El término quot;celobiohidrolasaquot; es definido aquí como un 1, 4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91), que cataliza la hidrólisis de enlaces 1, 4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, LA celotetriosa, o cualquier glucosa unida por enlace beta-1, 4 con polímero, que libera celobiosa de los extremos reductores o no reductores de la cadena.. Para fines de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279 y por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156 ; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288 . En la presente invención, se empleó el método de Lever et al. para analizar la hidrólisis de la celulosa en forraje de maíz, mientras que el método de van Tilbeurgh et al. se utilizó para determinar la actividad de celobiohidrolasa en un derivado de disacárido fluorescente
[0017] El término quot;endoglucanasaquot; es definido aquí como una endo-1,4-(1,3,1,4)-beta-D-glucan 4-glucanohidrolasa
(E.C. n.º 3.2.1.4), que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicas en celulosa, derivados de celulosa (tal como carboximetilcelulosa e hidroxietil celulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos y otro material vegetal que contenga componentes celulósicos. Para objetivos de la presente invención, la actividad de la endoglucanasa es determinada usando la hidrólisis de carboximetilcelulosa (CMC) según el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268 .
[0018] El término quot;exoglucanasaquot; es definido aquí como un 1,4-beta-D-glucan glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.74) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4 (enlaces O-glicosil) en 1,4-beta-D-glucanos para eliminar unidades sucesivas de glucosa o celobiosa. Para fines de la presente invención, la actividad de exoglucanasa se determina según el procedimiento descrito por Himmel et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 12948-12955 .
[0019] Variante: El término quot;variantequot; es definido en la presente como una glucósido hidrolasa que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones, y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en el polipéptido.
[0020] Enzima tipo salvaje: El término glucósido hidrolasa de quot;tipo salvajequot; denota una glucósido hidrolasa expresada por un microorganismo de origen natural, tal como una levadura u hongo filamentoso encontrado en la naturaleza.
[0021] Enzima progenitora: El término glucósido hidrolasa quot;progenitoraquot; según se utiliza en la presente significa una glucósido hidrolasa a la cual se le realizan modificaciones, por ejemplo, sustitución (sustituciones), inserción (inserciones), deleción (deleciones) y/o truncamiento(s), para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. Este término también se refiere al polipéptido con el cual una variante es comparada y alineada. El progenitor puede ser un polipéptido de origen natural (tipo salvaje), o este incluso puede ser una variante del mismo preparada por cualquiera de los medios adecuados. Por ejemplo, la proteína progenitora puede ser una variante de un polipéptido de origen natural que ha sido modificado o alterado en la secuencia de aminoácidos. Un progenitor también puede ser una variante alélica que es un polipéptido codificado por cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico.
[0022] Redistribución: El término quot;redistribuciónquot; significa recombinación de secuencia/s de nucleótidos entre dos o más secuencias de nucleótidos homólogos que dan como resultado secuencias de nucleótidos recombinadas (es decir, secuencias de nucleótidos que han sido sometidas a un ciclo de redistribución) con un número de nucleótidos cambiado, en comparación con las secuencias de nucleótidos iniciales.
[0023] Biblioteca aleatorizada: El término, quot;biblioteca aleatoriaquot;, quot;biblioteca de variantesquot; o quot;bibliotecaquot; es definido en la presente como una biblioteca de polipéptidos variantes. La diversidad en la biblioteca de variantes puede ser generada por medio de mutagénesis de los genes que codifican las variantes en el nivel de triplete del ADN, de manera que los codones individuales son diversificados, por ejemplo, usando cebadores de secuencias parcialmente aleatorizadas en una reacción de PCR. Se han descrito diferentes técnicas, por las que puede crearse una biblioteca combinatoria diversa diversificando diferentes posiciones de nucleótido en un gen y recombinándolas, por ejemplo, donde estas posiciones están demasiado alejadas para ser cubiertas por un solo cebador oligonucleótido (adicionado o dopado). Estas técnicas incluyen el uso de recombinación in vivo de los segmentos de gen individualmente diversificados como se describe en WO 97/07205 en la página 3, líneas 8 a 29. También incluyen el uso de técnicas de redistribución de ADN para crear una biblioteca de genes de longitud total, caracterizada por el hecho de que diferentes segmentos de gen son combinados y caracterizada por el hecho de que cada segmento puede ser diversificado, por ejemplo, por mutagénesis adicionada (Stemmer, 1994; Nature 370: 389-391; patente estadounidense n.° 5 811 238; patente estadounidense n.° 5 605 793 y patente estadounidense n.° 5 830 721). Puede usarse un gen que codifica una proteína quot;de estructura principalquot; (polipéptido progenitor de tipo salvaje) como un polinucleótido modelo y combinarlo con uno o más oligonucleótidos mono o bicatenarios como se describe en WO 98/41623 y WO 98/41622. Los oligonucleótidos monocatenarios pueden ser parcialmente aleatorizados durante la síntesis. Los oligonucleótidos bicatenarios pueden ser productos de PCR que incorporan diversidad en una zona específica. En ambos casos, se puede diluir la diversidad con segmentos correspondientes que codifican la secuencia de la proteína de estructura principal para limitar el número medio de cambios que se introducen.
[0024] Recombinación: El término quot;recombinaciónquot; es definido en la presente como un proceso caracterizado por el hecho de que los ácidos nucleicos se asocian entre sí en regiones de homología, conduciendo a intercambio de ADN intercatenario entre esas secuencias. Para fines de la presente invención, la recombinación homóloga se determina según los procedimientos resumidos por Paques y Haber, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63 349
404 . La quot;recombinación homólogaquot; es definida en la presente como la recombinación en la cual no ocurre ningún cambio en las secuencias de nucleótidos en las regiones de homología relativas a las secuencias de nucleótidos de entrada. Para la recombinación homóloga perfecta, las regiones deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 1500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1500 pares de bases y de forma más preferible 800 a 1500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia de ácidos nucleicos correspondientes para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. La recombinación puede también ocurrir por recombinación no homóloga. La “recombinación no homólogaquot; es definida en la presente como recombinación caracterizada por el hecho de que cualquier modo de reparación del ADN que incorpora intercambio de cadenas da como resultado una secuencia de nucleótidos diferente de cualquiera de las secuencias recombinantes.
[0025] Propiedad mejorada: El término quot;propiedad mejoradaquot; es definido en la presente como una característica asociada con una variante que se mejora en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora. Tales propiedades mejoradas incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, perfil de actividad alterada dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
[0026] Actividad térmica mejorada: El término quot;actividad térmica mejoradaquot; es definido en la presente como una alteración del perfil de actividad dependiente de la temperatura de una variante de glucósido hidrolasa a una temperatura específica relativa al perfil de actividad dependiente de la temperatura de la glucósido hidrolasa progenitora El valor de la actividad térmica proporciona una medida de la eficiencia enzimática en la realización de catálisis de una reacción de hidrólisis sobre una gama de temperaturas. Una glucósido hidrolasa tiene una gama de temperatura específica caracterizada por el hecho de que la proteína es estable y retiene su actividad enzimática, pero se vuelve menos estable y así menos activa con temperatura en aumento. Además, el nivel inicial de una reacción catalizada por una glucósido hidrolasa se puede acelerar por un aumento en la temperatura que se mide determinando la actividad térmica de una variante. Una variante más termoactiva llevará a un aumento en el índice de hidrólisis disminuyendo el tiempo requerido y/o disminuyendo la concentración enzimática requerida para la hidrólisis. De forma alternativa, una variante con una actividad térmica reducida catalizará una reacción de hidrólisis a una temperatura inferior a la temperatura óptima de la enzima progenitora definida por el perfil de actividad dependiente de la temperatura del progenitor.
[0027] Termoestabilidad mejorada: El término quot;termoestabilidad mejoradaquot; es definido en la presente como una enzima variante que muestra retención de actividad enzimática después de un periodo de incubación a temperatura elevada relativa a la enzima progenitora. Tal variante puede o no mostrar un perfil de actividad térmica alterada relativa al progenitor. Por ejemplo, una variante puede tener una capacidad mejorada para replegarse después de la incubación a temperatura elevada relativa al progenitor.
[0028] En una forma de realización preferida, la actividad térmica de la glucósido hidrolasa variante es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 5 veces, de forma más preferible al menos 7 veces, e incluso de forma más preferible al menos 20 veces más activa térmicamente que la variante de tipo salvaje cuando la actividad en 4-metilumbeliferil beta-d-lactosida a 64° C o una temperatura más alta es comparada con actividad a 50° C, durante 45 minutos a pH 5.0.
[0029] Especificidad de producto mejorado: El término quot;especificidad de producto mejoradaquot; es definido en la presente como una enzima variante que muestra un perfil de producto alterado relativo al progenitor en el cual el perfil de producto alterado mejora el rendimiento de la variante en una aplicación relativa al progenitor. El término quot;perfil del productoquot; es definido en la presente como la composición química de los productos reactivos producida por hidrólisis enzimática.
[0030] Estabilidad química mejorada: El término quot;estabilidad química mejoradaquot; es definido en la presente como una enzima variante que muestra retención de actividad enzimática después de un periodo de incubación en presencia de un producto químico o productos químicos, de origen natural o bien sintético, que reducen la actividad enzimática de la enzima progenitora. La estabilidad química mejorada puede también suponer variantes más capaces de catalizar una reacción en presencia de tales productos químicos.
Convenciones para la designación de las variantes
[0031] En la presente invención, se emplea una numeración específica de las posiciones de residuos de aminoácido en las variantes de glucósido hidrolasa. Por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de glucósido hidrolasas conocidas, es posible designar un número de posición de aminoácido a cualquier residuo de aminoácido en cualquier enzima de glucósido hidrolasa.
[0032] Uso del sistema de numeración originado de la secuencia de aminoácidos de la glucósido hidrolasa descrito en SEC ID nº: 2, alineado con la secuencia de aminoácidos de una cantidad de otras glucósido hidrolasa, es posible indicar la posición de un residuo de aminoácido en una glucósido hidrolasa en regiones de homología estructural.
[0033] Pueden hacerse alineamientos múltiples de secuencias proteínicas, por ejemplo, usando quot;ClustalWquot; (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensitivity de progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 ). Pueden realizarse alineamientos múltiples de secuencias de ADN usando la alineación de proteína como un molde, sustituyendo los aminoácidos con el codón correspondiente de la secuencia de ADN.
[0034] Los algoritmos de comparación de secuencias por parejas de uso común son adecuados para detectar similitudes entre secuencias proteínicas que no se han bifurcado más allá del punto de aproximadamente 20-30% de identidad de secuencia (Doolittle, 1992, Protein Sci. 1: 191-200; Brenner et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6073-6078). No obstante, las proteínas realmente homólogas con el mismo pliegue y función biológica similar frecuentemente se han bifurcado al punto en el cual las comparaciones basadas en la secuencia tradicional no detectan su relación (Lindahl y Eldesson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). Puede lograrse una sensibilidad superior en la búsqueda basada en secuencia usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de proteína (perfiles) para buscar bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de base de datos iterativo y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 ). Puede lograrse una sensibilidad aún mayor si la familia o superfamilia para la proteína de interés tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructura de proteína. Programas tales como GenTHREADER (Jones 1999, J. Mol. Biol. 287: . 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI- BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de disolución) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia problema. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903 919, puede utilizarse para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos pueden ser usados sucesivamente para generar modelos de homología para la proteína de interés y tales modelos pueden evaluarse en cuanto a su exactitud usando una variedad de herramientas desarrolladas para tal fin.
[0035] Para las proteínas de estructura conocida, están disponibles diferentes herramientas y recursos para recuperar y generar alineamientos estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de SCOP de proteínas han sido estructuralmente alineadas y esos alineamientos son accesibles y pueden descargarse. Estos alineamientos pueden utilizarse para predecir los residuos de aminoácidos correspondientes estructuralmente y funcionalmente en proteínas en la misma superfamilia estructural. Esta información, junto con información derivada de modelado por homología y búsquedas de perfiles, pueden utilizarse para predecir qué residuos van a mutar cuando se mueven las mutaciones de interés de una proteína a un homólogo remoto o cercano.
[0036] Al describir las diferentes variantes de glucósido hidrolasa de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación se adapta para facilidad de referencia. En cualquier caso, se utilizan las abreviaturas de aminoácidos aceptadas de IUPAC de una letra o tres letras.
[0037] Sustituciones. Para una sustitución de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina con alanina en la posición 226 es designada como quot;Thr226Alaquot; o quot;T226Aquot;. Las mutaciones múltiples se separan por marcas de adición (quot;+quot;), por ejemplo, quot;Gly205Arg + Ser411Phequot; o quot;G205R + S411Fquot;, representando mutaciones en las posiciones 205 y 411 sustituyendo la glicina (G) con arginina (R) y la serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente.
[0038] Deleciones. Para una deleción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición*. Por consiguiente, la deleción de glicina en la posición 195 es designada como quot;Gly195*quot; o quot;G195*quot;. Las deleciones múltiples se separan por marcas de adición (quot;+quot;), por ejemplo, quot;Gly195* + Ser411*quot; o quot;G195* + S411*quot;.
[0039] Inserciones. Para una inserción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido nuevo insertado. Por consiguiente la inserción de lisina después de la glicina en la posición 195 es designada quot;Gly195GlyLysquot; o quot;G195GKquot;. [0040] Modificaciones múltiples. Las variantes que comprenden modificaciones múltiples se separan por marcas de adición (quot;+quot;), por ejemplo, quot;Arg170Tyr+Gly195Gluquot; o quot;R170Y+G195Equot; que representan modificaciones en las posiciones en 170 y 195 substituyendo ácido glutámico y tirosina por arginina y glicina, respectivamente.
Glucósido hidrolasas progenitoras
[0041] En la presente invención, la glucósido hidrolasa progenitora es (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 o (b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones de astringencia al menos bajas con los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID .nº: 1, o su hebra complementaria.
[0042] La glucósido hidrolasa progenitora comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de aminoácidos 1 a 513 de SEC. ID nº: 2 de al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, que tiene actividad de glucósido hidrolasa (en adelante, quot;polipéptidos homólogosquot; ). Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina por el método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153 ) usando el Sdetware de MEGALIGNTM de LASERGENETM (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Penalización por espacio de 10 y penalización por longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación en pareja fueron Ktuple=1, penalización por espacio =3, ventanas =5 y diagonales=5.
[0043] Las glucósido hidrolasas progenitoras sustancialmente homólogas pueden tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácido conservador como se ha descrito anteriormente y otras sustituciones que no afectan significativamente al pliegue tridimensional o a la actividad de la proteína o el polipéptido; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones del amino o carboxilo-terminal, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un pequeño péptido de enlace de hasta 20-25 residuos aproximadamente, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una marca de afinidad), tal como un tracto de polihistidina, o proteína A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075 ; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3 . Véase, también, en general, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107 . Ejemplos de modificaciones conservadoras están en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrdeóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y pequeños aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las modificaciones de aminoácidos, que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly al igual que lo inverso (Taylor, 1986, Journal de Theoretical Biology 119: 205-218 .
[0044] Aunque los cambios anteriormente descritos son preferiblemente de una naturaleza menor, tales cambios también pueden ser de una naturaleza considerable tal como fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más tanto como extensiones amino-terminales como carboxilo-terminales.
[0045] Además de los 20 aminoácidos estándares, los aminoácidos no estándares (como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metil serina) pueden sustituirse por residuos de aminoácidos de una glucósido hidrolasa de tipo salvaje. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y los aminoácidos no naturales se pueden sustituir por residuos de aminoácidos. Los quot;aminoácidos no naturalesquot; han sido modificados después de la síntesis de proteína y/o tienen una estructura química en su/s cadena/s lateral/es diferente de los aminoácidos estándares. Los aminoácidos no naturales pueden ser sintetizados químicamente y preferiblemente están disponibles comercialmente, e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3- y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.
[0046] Preferiblemente, la glucósido hidrolasa progenitora comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2,o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En una forma de realización preferida, el polipéptido progenitor comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor comprende los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2,o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor comprende los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2,o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor consiste en los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor es codificado por la secuencia de nucleótidos contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B- 30683, caracterizado por el hecho de que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, el polipéptido progenitor es codificado por la región de codificación de polipéptido maduro contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683.
[0047] Un fragmento de SEC ID n.º: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados del término amino y/o carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 450 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 470 residuos de aminoácidos y de forma más preferible al menos 490 residuos de aminoácidos .
[0048] La glucósido hidrolasa progenitora es codificada por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia baja, preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente, condiciones de astringencia media-alta, incluso más preferiblemente, condiciones de astringencia alta, y de forma más preferible, condiciones de astringencia muy alta con una sonda de nucleótidos que se hibridiza bajo las mismas condiciones con (i)
(i) los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID n.º: 1, (ii) la secuencia genómica de nucleótidos que comprende los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID nº: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria de (i); (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, New York). La subsecuencia de la SEC ID n.º: 1 puede ser al menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos. Por otra parte, la subsecuencia puede codificar un fragmento polipeptídico que tiene actividad de glucósido hidrolasa.
[0049] Una subsecuencia de SEC ID n.º: 1, u homólogo de la misma, es una secuencia de nucleótidos en la cual uno o más nucleótidos han sido delecionados del extremo 5' y/o 3'. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 1350 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1410 nucleótidos y de forma más preferible al menos 1470 nucleótidos.
[0050] El polipéptido progenitor también puede ser una variante alélica de un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede suponer polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0051] La secuencia de nucleótidos de SEC ID n.º: 1 o una subsecuencia de la misma, al igual que la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.°: 2, o un fragmento de la misma, se puede utilizar para diseñar sondas de nucleótido a identificar y clonar polipéptidos progenitores de codificación de ADN que tienen actividad de glucósido hidrolasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o la especie de interés, siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25 y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También pueden utilizarse sondas más largas. Pueden utilizarse tanto la sonda de ADN como la de ARN. Las sondas típicamente son marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32p, 3H, 35S, biotina o avidina).
[0052] Una genoteca de ADN genómico o ADNc obtenido a partir de esos otros organismos se pueden seleccionar para ADN que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido progenitor que tiene actividad de glucósido hidrolasa. El ADN genómico u otro ADN de esos otros organismos se pueden separar por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir y ser inmovilizado en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a SEC ID n.º: 1, o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una hibridación de Southern. Para objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de nucleótidos hibridiza a una sonda de nucleótidos marcada correspondiente a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n.º: 1, o su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia de baja a muy alta. Las moléculas a las cuales la sonda se hibrida pueden ser detectadas usando, por ejemplo, película radiográfica o cualquier medio de deleción conocido en la técnica.
[0053] En una forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID n.º: 2, o una subsecuencia de de la mismo. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es SEC ID n.º: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos son los nucleótidos 52 a 1539 de SEC ID n.º: 1. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683, caracterizada por el hecho de que la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, la sonda de nucleótidos es la región de codificación de polipéptido maduro contenida en plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683.
[0054] Para las sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia baja a muy alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42º C en 5X SSPE, SDS al 0,3%, 200 !g/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y bien formamida al 25% para astringencias bajas, formamida al 35% para astringencias medias y medias-altas o formamida al 50% para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0055] Para las sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS al 0,2% preferiblemente al menos a 50º C (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55º C (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60º C (astringencia mediaalta), de forma más preferible al menos a 65º C (astringencia alta), e incluso de forma más preferible al menos a 70º C (astringencia muy alta).
[0056] Para las sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación y lavado post-hibridación a aproximadamente 5º C hasta aproximadamente 10º C por debajo de la Tm calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings de the National Academy de Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M de tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, NP-40 al 0,5%, 1X Solución de Denhardt, 1 mM de pirdeosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos estándares de hibridación de Southern durante 12 a 24 horas óptimamente.
[0057] Para las sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más SDS al 0,1% durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando 6X SSC a 5º C a 10º C por debajo de la Tm calculada.
[0058] La glucósido hidrolasa progenitora se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. Para objetivos de la presente invención, el término quot;obtenido a partir dequot; según se utiliza en este caso en relación con una fuente dada significa que la glucósido hidrolasa progenitora codificada por una secuencia de nucleótidos es producida por la fuente o por una célula en la cual la secuencia de nucleótidos de la fuente ha sido insertada. En una forma de realización preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es segregada extracelularmente.
[0059] La glucósido hidrolasa progenitora puede ser una glucósido hidrolasa fúngica. En una forma de realización más preferida, la glucósido hidrolasa fúngica es una glucósido hidrolasa de levadura tal como una glucósido hidrolasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. En otra forma de realización más preferida, la glucósido hidrolasa fúngica es una glucósido hidrolasa filamentosa fúngica tal como una glucósido hidrolasa de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Diplodia, Exidia, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
[0060] En una forma de realización más preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es una glucósido hidrolasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.
[0061] En otra forma de realización más preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es una glucósido hidrolasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Schizophyllum commune, Sclerotium rolfsii, Sporotrichum cellulophilum, Talaromyces emersonii, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. [0062] En una forma de realización aún más preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es una glucósido hidrolasa de Trichoderma reesei y de forma más preferible la celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei de SEC ID n.º: 2 o el polipéptido maduro de la misma. En otra forma de realización más preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en el plásmido pAJO52 que está contenido en Escherichia coli NRRL B-30683, caracterizado por el hecho de que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa. En otra forma de realización preferida, la glucósido hidrolasa progenitora es codificada por la región de codificación del polipéptido maduro contenida en el plásmido pAJO52 que está contenida in Escherichia coli NRRL B-30683.
[0063] Se entenderá que para las especies mencionadas, la invención incluye los estados perfectos e imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el cual son conocidos. Los expertos en la técnica fácilmente reconocerán la identidad de los equivalentes apropiados.
[0064] Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en una cantidad de colecciones de cultivos, tales como el American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0065] La glucósido hidrolasa también puede ser identificada y obtenida a partir de otras fuentes incluidos los microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (p. ej., tierra, abonos, agua, etc,) usando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son conocidas en la técnica. La secuencia de nucleótidos que codifica una glucósido hidrolasa luego puede ser derivada seleccionando de manera similar una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez que una secuencia de nucleótidos que codifica una glucósido hidrolasa ha sido detectada con sonda/s adecuada/s como se describe en la presente, la secuencia se puede aislar o clonar utilizando técnicas conocidas por los técnicos en la materia (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, New York).
[0066] Tal y como se define en la presente, una glucósido hidrolasa quot;aisladaquot; es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos no de glucósido hidrolasa, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente 60% puro, incluso más preferiblemente 80% puro, de forma más preferible 90% puro, e incluso de forma más preferible aproximadamente 95% puro, según se determina por SDS-PAGE.
[0067] La glucósido hidrolasa progenitora también puede incluir polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en los cuales otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de nucleótidos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que estas estén dentro del marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del/ de los mismo/s promotor/es y terminador. Las proteínas de fusión también pueden ser construidas usando tecnología de intein donde las fusiones se crean post-traduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583 ; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779 ).
[0068] Los aminoácidos esenciales en la glucósido hidrolasa progenitora pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 ). En esta última técnica, se introducen mutaciones de alanina únicas en cada residuo en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se prueban para analizar su actividad biológica (es decir, actividad de glucósido hidrolasa) para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708 . El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede ser determinado por análisis físico de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcaje por fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos de sitio putativo de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306312 ; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904 ; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas a partir del análisis de identidades con polipéptidos que se relacionan con un polipéptido según la invención.
[0069] Pueden realizarse y evaluarse sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o redistribución, seguido de un procedimiento de selección pertinente, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57 ; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 21522156 ; WO 95/17413 ; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden ser usados incluyen PCR con tendencia al error, exposición en fago (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; patente de EE. UU. N.º 5 223 409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, ADN 7:127).
Plásmidos
[0070] El plásmido o los plásmidos usados para preparar variantes de glucósido hidrolasa pueden ser cualquier plásmido o vector que puede someterse a procedimientos de ADN recombinante. El plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glucósido hidrolasa puede ser preparado ligando la secuencia de nucleótidos en un plásmido adecuado, o por cualquier otro método adecuado. El plásmido contiene preferiblemente uno o más marcadores seleccionables descritos en la presente que permiten la fácil selección de células transformadas. La elección del plásmido frecuentemente dependerá de la célula huésped en la cual se va a introducir.
[0071] En la presente invención, el plásmido puede ser un plásmido que se replica de manera autónoma, es decir, un plásmido que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es diferente de la replicación cromosómica.
[0072] El replicador de plásmido puede ser cualquier replicador de plásmido que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término quot;replicador de plásmidoquot; es definido en la presente como una secuencia que le permite a un plásmido o vector replicarse in vivo. Ejemplos de un replicador de plásmido útil en una célula de levadura son el origen de replicación de 2 micra, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6. Ejemplos de un replicador de plásmido útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883 ). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos descritos en WO 00/24883.
[0073] La linealización del/los plásmido/s puede ser dirigida hacia cualquier sitio en el plásmido. El/los plásmido/s se puede/n linealizar por cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, digestión con una o más enzimas de restricción. Las extremidades linealizadas del plásmido pueden ser rellenadas con nucleótidos según se describe por Pompon et al., 1989, Gene 83: 15-24. No obstante, se prefiere no llenar en los extremos linealizados puesto que esto puede crear un desplazamiento del marco de lectura.
[0074] Para facilitar el proceso de selección, el plásmido es preferiblemente un vector de expresión en el que la secuencia de nucleótidos en cuestión está operativamente vinculada a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva de un plásmido, un cósmido o un bacteriófago, o puede contener elementos de cualquiera de estos o todos estos. Para objetivos de la presente invención, los términos quot;plásmidoquot; y quot;vectorquot; se usan de forma intercambiable.
Fragmentos de ADN
[0075] La biblioteca de fragmentos de ADN para ser combinada de forma aleatoria (o quot;redistribuidosquot;) con regiones homólogas en el/los plásmido/s linealizado/s por recombinación in vivo se puede preparar por medio de cualquier método adecuado. Por ejemplo, el fragmento de ADN se puede preparar por amplificación por PCR (por ejemplo, PCR con tendencia al error) de un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos, usando cebadores específicos, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense n.° 4 683 202 o Saiki et al., 1988, Science 239: 487-491. El fragmento de ADN también puede ser aislado de un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos deseada por digestión con enzimas de restricción, seguida de aislamiento usando, por ejemplo, electroforesis.
[0076] El fragmento de ADN puede ser preparado de forma alternativa sintéticamente por métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., 1984, EMBO Journal 3: 801-805. Según el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados en un sintetizador de ADN automático, purificados, anillados, ligados y clonados en plásmidos adecuados.
[0077] El fragmento de ADN también puede ser de orígenes mezclados sintético y genómico, mezclado sintético y de ADNc o mezclado genómico y de ADNc preparados ligando fragmentos de origen de ADNc, genómico o sintético, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de nucleótidos entera, conforme a técnicas estándares.
[0078] La biblioteca de fragmentos de ADN comprende una o más mutaciones de la secuencia de nucleótidos, caracterizados por el hecho de que los fragmentos comprenden al menos dos regiones, una o más regiones que son homólogas a la región 5' o la región 3' del espacio en la secuencia de nucleótidos linealizada y/o la secuencia de plásmidos y una o más segundas regiones que son homólogas a la región 5' o la región 3' de los fragmentos de ADN de la biblioteca. [0079] Las regiones del fragmento de ADN pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia de nucleótidos y/o secuencia de plásmidos.
[0080] En una forma de realización preferida, las regiones del fragmento de ADN son una región 5' y/o una región 3' que flanquea un gen que codifica una glucósido hidrolasa, o una región 5' y/o una región 3' de un gen que codifica una glucósido hidrolasa.
[0081] En otra forma de realización preferida, el fragmento o los fragmentos de ADN son preparados bajo condiciones que conducen a una frecuencia de mutagénesis aleatoria baja, media o alta. Para obtener la frecuencia de mutagénesis baja la/s secuencia/s de nucleótidos (que comprenden el o los fragmentos de ADN) se pueden preparar por un método de amplificación por PCR estándar (US 4 683 202 o Saiki et al., 1988, Science 239: 487-491 ). Una frecuencia de mutagénesis media o alta se puede obtener mediante la realización de la amplificación por PCR bajo condiciones que reduzcan la fidelidad de la replicación por la polimerasa termoestable y aumenten la incorporación incorrecta de nucleótidos, por ejemplo como se describe por Deshler, 1992, GATA 9: 103-106; Leung et al., 1989; BioTechniques1: 11-15 .
[0082] La amplificación por PCR se puede combinar con una fase de mutagénesis usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, por ejemplo, uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, aleatorización, deleciones y/o inserciones.
[0083] En una forma de realización preferida, el/los fragmento/s de ADN que se debe/n redistribuir preferiblemente tiene/n una longitud de aproximadamente 15 bp a 8 kb, más preferiblemente aproximadamente 30 bp a 6 kb, incluso más preferiblemente aproximadamente 40 bp a 6 kb, incluso más preferiblemente aproximadamente 80 bp a 4 kb yde forma más preferible aproximadamente 100 bp a 2 kb, para ser capaces de interactuar óptimamente con el plásmido linealizado.
Células fúngicas
[0084] La célula fúngica, en la cual la mezcla de secuencias de nucleótidos de plásmido/fragmento deben ser introducidas, puede ser cualquier célula fúngica útil en la presente invención. Una quot;célula fúngica de recombinaciónquot; es definida en la presente como una célula capaz de mediar la recombinación de varias secuencias de nucleótidos homólogas.
[0085] En una forma de realización preferida, la célula de recombinación fúngica es una célula de levadura. En una forma de realización más preferida, la célula de recombinación de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia..
[0086] En una forma de realización más preferida, la célula de recombinación de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
[0087] En otra forma de realización preferida, la célula de recombinación fúngica es una célula micótica filamentosa. En una forma de realización más preferida, la recombinación fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.
[0088] En una forma de realización más preferida, la célula de recombinación fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra forma de realización más preferida, la célula de recombinación fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. En otra forma de realización más preferida, la célula de recombinación fúngica filamentosa es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0089] En otra forma de realización más preferida, la célula de Aspergillus es una célula de Aspergillus oryzae..
[0090] En otra forma de realización más preferida, la célula de Aspergillus es una célula de Aspergillus niger. [0091] En otra forma de realización más preferida, la célula de Fusarium venenatum es Fusarium venenatum A3/5, que fue originalmente depositada como Fusarium graminearum ATCC 20334 y recientemente reclasificada como Fusarium venenatum por Yoder y Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 y O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Blology 23: 57-67; al igual que equivalentes taxonómicos de Fusarium venenatum independientemente del nombre de especie por el cual son conocidos actualmente. En otra forma de realización más preferida, la célula deFusarium venenatum es un mutante morfológico de Fusarium venenatum A3/5 o Fusarium venenatum ATCC 20334 como se describe en WO 97/26330.
[0092] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica formación de protoplastso, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular en un modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huéspedes de Aspergillus y Trichoderma están descritos en EP 238 023 y Yelton et al, 1984, Proceedings de the National Academy de Sciences USA 81: 1470-1474 . Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989; Gene 78: 147-156,y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, págs.182187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal de Bacteriology 153: y Hinnen et al., 1978, Proceedings de the National Academy de Sciences USA 75: 1920.
Recombinación in vivo
[0093] Un gran número de variantes o genes homólogos se pueden combinar en una transformación para crear eficazmente genes quimeras de los genes homólogos. La redistribución de estos genes, que codifican variantes mejoradas de genes de tipo salvaje, o una combinación de las mismas, da como resultado quimeras que se pueden expresar y seguir por selección para identificar aquellas quimeras con la combinación óptima de mutaciones provechosas. El proceso aumenta de manera múltiple el número de variantes mejoradas adicionales que se puede obtener en comparación con un proceso que solo utiliza mutagénesis aleatoria (para obtener un resumen, véase Kuchner y Arnold, 1997, TIBTech 15: 523-530 ). La mutagénesis aleatoria introduce mutaciones en una secuencia de nucleótidos objetivo, creando mutaciones deletéreas con mucha más frecuencia que las provechosas. En ciclos iterativos de esa mutagénesis, las mutaciones deletéreas se acumulan más rápidamente que las provechosas, enmascarando eficazmente la identificación de mutaciones provechosas durante la selección. La recombinación aleatoria entre dos o más secuencias de nucleótidos homólogos que contienen múltiples cambios de nucleótidos únicos en sus secuencias de nucleótidos permite potencialmente que todos aquellos cambios de nucleótidos contenidos en una variante se separen uno del otro y sean combinados de forma aleatoria, en cambio, con cualquier mutación presente en otras variantes. Esta redistribución de mutaciones proporciona un medio por el cual las mutaciones de distintas secuencias progenitoras pueden ser combinadas entre sí de forma aleatoria para aumentar la probabilidad de combinación de los cambios de nucleótidos en una secuencia única de nucleótidos.
[0094] Se puede combinar los métodos de mutagénesis/redistribución con métodos de selección de alto rendimiento automatizados para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresado por células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huéspedes y ser ordenadas rápidamente usando métodos estándar de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.
[0095] La recombinación eficaz de fragmentos de superposición múltiple usando el método de recombinación in vivo es un medio para generar quimeras a partir de variantes o genes homólogos. Una superposición tan pequeña como 15 bp es suficiente para la recombinación yse puede utilizar para redistribución de dominios muy sencilla incluso de genes remotamente relacionados. En la redistribución de dominios, los bloques más grandes de ADN no homólogos son clasificados de forma aleatoria mediante extensiones de homología en sus terminales.
[0096] Se prefiere que al menos un ciclo de redistribución sea un ciclo de retrocruce con el fragmento o fragmentos de ADN inicialmente usados, que pueden ser el fragmento de ADN de tipo salvaje. Esto elimina las mutaciones no esenciales. Las mutaciones no esenciales también pueden ser eliminadas usando fragmentos de ADN de tipo salvaje como el material de ADN de entrada usado inicialmente.
[0097] Más de dos secuencias de nucleótidos pueden redistribuirse al mismo tiempo ypueden ser ventajosas puesto que un gran número de variantes bastante diferentes pueden ser hechos rápidamente sin una abundancia de procedimientos iterativos. Al recombinar muchos fragmentos de la misma región, la superposición múltiple de los fragmentos aumentará la frecuencia de intercambio de ADN por sí sola, pero también es importante tener un número relativamente alto de cruces aleatorios en las regiones de superposición para recombinar las variantes/diferencias cercanamente localizadas. [0098] Una superposición tan pequeña como 15 bp entre dos fragmentos es suficiente para obtener una recombinación eficaz. Por lo tanto, en la presente invención, es conveniente la superposición en el rango de 15 a 5000 bp, preferiblemente de 30 bp a 500 bp, especialmente de 30 bp a 100 bp.
[0099] En la presente invención, preferiblemente 2 o más fragmentos superpuestos, más preferiblemente 2 a 50 fragmentos superpuestos yde forma más preferible 2 a 10 fragmentos superpuestos, pueden ser usados ventajosamente como fragmentos de ADN en un ciclo de redistribución.
[0100] Además de permitir la creación de genes quiméricos, la utilización de fragmentos superpuestos es un método útil para la redistribución de dominios mediante la creación de pequeñas superposiciones entre fragmentos de ADN de diferentes dominios y la selección para lograr la mejor combinación. Por ejemplo, en el caso de tres fragmentos de ADN, las regiones de superposición pueden ser de la siguiente manera: el primer extremo del primer fragmento se superpone al primer extremo del plásmido linealizado, el primer extremo del segundo fragmento se superpone con el segundo extremo del primer fragmento yel segundo extremo del segundo fragmento se superpone con el primer extremo del tercer fragmento, el primer extremo del tercer fragmento se superpone (como se indica más arriba) con el segundo extremo del segundo fragmento yel segundo extremo del tercer fragmento se superpone con el segundo extremo del plásmido linealizado.
[0101] Se entiende que cuando se usan dos o más fragmentos de ADN como la materia prima, se prefiere tener superposiciones continuas entre los extremos del plásmido y los fragmentos de ADN.
[0102] Aunque se prefiere redistribuir secuencias de nucleótidos homólogas en forma de fragmento/s de ADN y plásmido/s linealizado/s, también es posible redistribuir dos o más plásmidos linealizados que comprendan secuencias de nucleótidos homólogas que codifican polipéptidos. No obstante, en tal caso, es importante linearizar los plásmidos en diferentes sitios.
[0103] En la presente invención, dos o plásmidos linealizados y uno o más fragmentos de ADN homólogos pueden ser usados como la materia prima que se debe redistribuir. La proporción entre el/los plásmido/s linealizado/s y el/los fragmento/s de ADN homólogo preferiblemente se encuentran en el rango de 20:1 a 1:50, preferiblemente de 2:1 a 1:10 (moles de plásmido:moles de fragmentos) con las concentraciones específicas que van de 1 pM a 10 M del ADN.
[0104] Los plásmidos linealizados se pueden distanciar de manera que la superposición entre los fragmentos se delecione en el plásmido. La reparación del espacio en el plásmido luego requiere que los fragmentos se recombinen uno con el otro además de recombinarse con los extremos del plásmido escindido para reconstruir un plásmido que se replica de manera autónoma y circular. En una forma de realización preferida, la linearización del plásmido o vector crea un espacio suficiente en la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos para forzar la recombinación homóloga de los fragmentos de ADN con las regiones correspondientes de la secuencia de nucleótidos, recreando un plásmido de replicación circular.
Variantes
[0105] En la presente invención, las variantes aisladas de una glucósido hidrolasa progenitora comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, caracterizados por el hecho de que las variantes, que tienen actividad de glucósido hidrolasa, comprenden secuencias de aminoácidos que tienen un grado de identidad de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97% a la secuencia de aminoácidos de la glucósido hidrolasa progenitora, caracterizado por el hecho de que una posición o más posiciones comprenden al menos una sustitución correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina por el método de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153 ) usando el Sdetware de MEGALIGNTM de LASERGENETM (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Penalización por espacio de 10 y penalización por longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación en pareja fueron Ktuple=1, penalizaciones por espacio =3, ventanas =5 y diagonales=5.
[0106] Tal y como se define en la presente, una quot;variante aisladaquot; de una glucósido hidrolasa progenitora es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos de hidrolasa no glucósida, por ejemplo, al menos 20% puro, preferiblemente al menos 40% puro, más preferiblemente al menos 60% puro, incluso más preferiblemente al menos 80% puro, de forma más preferible al menos 90% puro, e incluso de forma más preferible, al menos 95% puro, según se determina por SDS-PAGE.
[0107] En una forma de realización preferida, el número de sustituciones de aminoacidos en las variantes de la presente invención comprenden preferiblemente 33, más preferiblemente 32, incluso más preferiblemente 31, incluso más preferiblemente 30, incluso más preferiblemente 29, incluso más preferiblemente 28, incluso más preferiblemente 27, incluso más preferiblemente 26, incluso más preferiblemente 25, incluso más preferiblemente 24, incluso más preferiblemente 23, incluso más preferiblemente 22, incluso más preferiblemente 21, incluso más preferiblemente 20, incluso más preferiblemente 19, incluso más preferiblemente 18, incluso más preferiblemente 17, incluso más preferiblemente 16, incluso más preferiblemente 15, incluso más preferiblemente 14, incluso más preferiblemente 13, incluso más preferiblemente 12, incluso más preferiblemente 11, incluso más preferiblemente 10, incluso más preferiblemente 9, incluso más preferiblemente 8, incluso más preferiblemente 7, incluso más preferiblemente 6, incluso más preferiblemente 5, incluso más preferiblemente 4, incluso más preferiblemente 3, incluso más preferiblemente 2 y de forma más preferible 1.
[0108] En una forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en dos o varias posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en tres o varias posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en cuatro o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en cinco o más o varias posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en seis o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en siete o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en ocho o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en nueve o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en diez o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en once o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en doce o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en trece o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la variante de una glucósido hidrolasa progenitora comprende además sustituciones en posiciones correspondientes al menos a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0109] Todas las variantes según la invención comprenden al menos una sustitución en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende la sustitución G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0110] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 21 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 21 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Pro como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 21 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S21P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0111] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ser como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G94S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G94A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Arg como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G94R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Gln como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G94Q de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0112] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 157 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 157 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Arg como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 157 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución K157R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0113] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Tyr como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución H206Y de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0114] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 247 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 247 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Cys como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 247 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución Y247C de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0115] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 337 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 337 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Val como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 337 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución E337V de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0116] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 350 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 350 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ser como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 350 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T350S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0117] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 373 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 373 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además His como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 373 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución N373H de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0118] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 383 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 383 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 383 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T383A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0119] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 438 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 438 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Leu como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 438 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución P438L de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. [0120] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 455 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 455 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 455 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T455A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0121] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 467 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 467 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ser como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 467 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G467S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0122] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Trp como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0123] En una forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En una forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Pro como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En una forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S8P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2.
[0124] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Asp como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución G22D de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0125] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ile como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T41I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0126] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ser como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución N49S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0127] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Asn como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S57N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0128] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Asn como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S113N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0129] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Lys como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución E193K de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0130] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Pro como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 196 de aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S196P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Thr como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S196T de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Phe como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S196F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0131] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T226A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0132] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución P227A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Leu como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución P227L de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Gly como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución P227G de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2.
[0133] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ile como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T246I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0134] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Lys como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución R251K de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0135] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Pro como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0136] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Asn como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 259 ácidos de deino 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución D259N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0137] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización incluso más preferida la variante comprende además Ser como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución N301S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0138] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ile como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T356I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0139] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Cys como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución Y371C de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0140] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Phe como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0141] En otra forma de realización preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la variante comprende además Ala como una sustitución en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende además la sustitución T462A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0142] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg y Phe como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0143] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg y Ala (o Leu o Gly) como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 227, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº:
2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + P227A (o P227L o P227G) de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2.
[0144] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg and Tyr como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 206, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + H206Y de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0145] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 8 e 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 8 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Pro y Arg como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 8 e 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones S8P + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0146] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 94 e 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 94 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Ser (o Ala o Arg o Gln) y Arg como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 94 e 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G94S (o G94A o G94R o G94Q) + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2.
[0147] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 196 e 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Pro (o Thr o Phe) y Arg como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 196 e 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones S196P (o S196T o S196F) + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0148] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg y Arg como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones K157R + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0149] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg y Pro como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 255, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0150] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg, Arg y Pro como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones K157R + G205R + T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0151] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg y Phe como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0152] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg, Pro y Phe como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones G205R + T255P + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0153] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg, Arg y Phe como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones K157R + G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0154] En otra forma de realización preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la variante comprende Arg, Arg, Pro y Phe como sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la variante comprende las sustituciones K157R, G205R + T255P + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0155] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0156] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0157] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0158] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0159] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0160] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos seis sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0161] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos siete sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0162] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos ocho sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0163] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos nueve sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F, y T462A.
[0164] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos diez sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0165] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos once sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0166] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos doce sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0167] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos trece sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0168] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos catorce sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0169] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos quince sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0170] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos dieciseis sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0171] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos diecisiete sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0172] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos dieciocho sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0173] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos diecinueve sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0174] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y al menos veinte sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0175] En otra forma de realización preferida, la variante comprende la sustitución G205R y sustituciones que consisten en al menos S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S, y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente comprende además una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0176] Las variantes de la presente invención puede comprender además una o más deleciones y/o inserciones de la secuencia de aminoácidos.
[0177] En una forma de realización preferida, una variante de la presente divulgación consiste en 341 a 350,351 a 360,361 a 370,371 a 380,381 a 390,391 a 400,401 a 420,421 a 440,441 a 460,461 a 480,481 a 500, o 501 a 513 aminoácidos.
[0178] La variante que comprende la sustitución T226A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30657. La variante que comprende las sustituciones S113N + S196T + T462A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en
E. coli NRRL B- 30658. La variante que comprende las sustituciones G22D + G467S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 se codifica por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30659. La variante comprende las sustituciones S21P + S57N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30661. La variante comprende las sustituciones K157R + G205R + T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B30662. La variante comprende las sustituciones S196P + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30663. La variante que comprende las sustituciones S113N + S196T + P227A + T462A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30664. La variante comprende las sustituciones T41I + E193K + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30665. La variante comprende las sustituciones N49S + S113N + P227A + P438L de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30666. La variante comprende las sustituciones N301S + E337V de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30674. La variante comprende las sustituciones S196P + T350S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B30675. La variante comprende las sustituciones G205R + H206Y de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30676. La variante comprende las sustituciones S8P + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en
E. coli NRRL B-30677. La variante comprende las sustituciones G94S + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B- 30678. La variante comprende las sustituciones T383A + T455A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30679. La variante comprende la sustitución N373H de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30680. La variante comprende las sustituciones Y247C + Y371C + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en EE. coli NRRL B-30681. La variante comprende las sustituciones S21P + S57N
+ T246I + R251K +S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30682. La variante comprende las sustituciones P227G + D259N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 es codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en E. coli NRRL B-30762.
[0179] La presente divulgación también se refiere a métodos para obtención de una variante de una glucósido hidrolasa progenitora, que comprende: (a) introducción en la glucósido hidrolasa progenitora una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente la introducción además de una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, caracterizada por el hecho de que la variante tiene actividad de glucósido hidrolasa; y (b) recuperación de la variante.
Secuencias de nucleótidos
[0180] La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican variantes de una glucósido hidrolasa progenitora, caracterizada por el hecho de que las secuencias de nucleótidos han sido modificadas para codificar las variantes descritas en la presente.
[0181] El término quot;secuencia de nucleótidos aisladaquot; según se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de nucleótidos que está esencialmente libre de otras secuencias de nucleótidos, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40% puro, más preferiblemente al menos aproximadamente 60% puro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80% puro, y de forma más preferible, al menos aproximadamente 90% puro, según se determina por electrdeoresis de agarosa.
Constructos de ácidos nucleicos
[0182] La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de glucósido hidrolasa de la presente invención operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que la expresión incluye cualquier fase implicada en la producción de las variante incluidas, de modo enuncitivo y no limitativo, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
[0183] El quot;constructo de ácido nucleicoquot; es definido en la presente como una molécula de ácido nucleico, monocatenaria
o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico combinados y superpuestos en un modo que, de lo contrario, no existiría en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucléicos es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de una variante de la presente invención. El término quot;secuencia codificantequot; es definido en la presente como una secuencia de nucleótidos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los bordes de una secuencia codificante genómica generalmente son determinados por el codón de iniciación ATG o codones de inicio alternativo tales como GTG y TTG, localizados justo arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia del terminador de transcripción localizado justo abajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, de modo enunicativo y no limitativo, ADN, ADNc y secuencias de nucleótidos recombinantes.
[0184] Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una variante de glucósido hidrolasa de la presente invención puede ser manipulada en una variedad de maneras para proporcionar la expresión de la variante. La manipulación de la secuencia de nucleótidos antes de su inserción en un vector puede ser conveniente o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
[0185] El término quot;secuencias de controlquot; es definido en la presente para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de una variante de glucósido hidrolasa de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifica la variante. Tales secuencias de control incluyen, de manera enunicativa y no limitativa, una secuencia líder, de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y de terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas con enlaces con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos que codifica una variante de glucósido hidrolasa de la presente invención. El término quot;operativamente vinculadoquot; es definido en la presente como una configuración en la cual una secuencia de control es apropiadamente colocada en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos de manera que la secuencia de control dirige la expresión de una variante de glucósido hidrolasa.
[0186] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de nucleótidos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión de la variante de glucósido hidrolasa. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucléicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y pueden obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.
[0187] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucléico de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosafosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa deAspergillus nidulans, amiloglucosidasa de Fusarium oxysporum, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor de NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); equivalentes de los mismos; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.
[0188] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionina deSaccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, Yeast
8: 423-488.
[0189] La secuencia de control también puede ser una secuencia del terminador de transcripción adecuada, que se reconoce por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de glucósido hidrolasa. n la presente invención, se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección.
[0190] Los terminadores preferidos para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, alfaglucosidasa de Aspergillus niger y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0191] Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[0192] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente vinculada al término 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de glucósido hidrolasa. En la presente invención se puede utilizar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped de elección. [0193] Los líderes preferidos para las células fúngicas filamentosas huéspedes se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0194] Los líderes adecuados para células huéspedes de levadura se obtienen a partir de los genes para enolasa (ENO1) de Saccharomyces cerevisiae, fosfogliceratocinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
[0195] La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente vinculada al término 3' de la secuencia de codificación del polipéptido y que, al ser transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. En la presente invención, se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección.
[0196] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células fúngicas filamentosas huéspedes se obtienen a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
[0197] Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990 .
[0198] La secuencia de control puede también ser una región de codificación del péptido señal que codifica una secuencia de aminoácidos vinculada al término amino de una glucósido hidrolasa variante y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de nucleótidos puede intrínsecamente contener una región de codificación del péptido señal naturalmente vinculada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica la glucósido hidrolasa variante segregada. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región de codificación del péptido señal que sea extranjera a la secuencia codificante. La región de codificación del péptido señal extranjero puede ser requerida donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una región de codificación del péptido señal. De forma alternativa, la región de codificación del péptido señal extranjero puede simplemente reemplazar la región de codificación del péptido señal natural para mejorar la secreción de la glucósido hidrolasa variante. No obstante, en la presente invención, se puede utilizar cualquier región de codificación del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección.
[0199] Las regiones de codificación del péptido señal eficaces para células fúngicas filamentosas huéspedes son las regiones de codificación del péptido señal obtenidas a partir de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa Cel45A de Humicola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa.
[0200] Los péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura se obtienen a partir de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones de codificación del péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[0201] La secuencia de control también puede ser una región de codificación del propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de una variante de glucósido hidrolasa. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido generalmente es inactivo y puede convertirse en un polipéptido maduro activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región de codificación del propéptido se puede obtener a partir de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
[0202] En los casos en que las regiones de propéptido y péptido señal están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.
[0203] Puede también ser conveniente añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de la glucósido hidrolasa variante relativa al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan que la expresión del gen se active o no en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. En la levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser utilizados como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son los que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrdeolato-reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de nucleótidos que codifican la glucósido hidrolasa variante estaría operativamente vinculada con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
[0204] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una glucósido hidrolasa variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las diferentes secuencias de control y de nucleótidos anteriormente descritas se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante en tales sitios. De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos se puede expresar por inserción de la secuencia de nucleótidos o un constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante está operativamente vinculada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0205] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión de la secuencia de nucleótidos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual el vector será introducido. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados.
[0206] Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrdeía a auxótrdeos y similares. Los marcadores adecuados para las células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula fúngica filamentosa huésped incluyen, de modo enunciativo y no limitativo, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans oAspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
[0207] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es diferente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al ser introducido en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el/los cromosoma/s en que ha sido integrado. Además, puede utilizarse un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se introducirá en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
[0208] Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un elemento o elementos que permitan la integración del vector en el genoma de célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
[0209] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una ubicación o ubicaciones precisas en el/los cromosoma/s. Para aumentar la probabilidad de integración a una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10 000 pares de bases, preferiblemente 400 a 10 000 pares de bases, y de forma más preferible 800 a 10 000 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia meta correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia meta en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser no codificantes
o codificantes de secuencias de ácidos nucleicos. En cambio, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
[0210] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de que le permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micra, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de la replicación puede ser uno que tenga una mutación que haga que el funcionamiento sea termosensible en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings de the National Academy de Sciences USA 75: 1433 ). Ejemplos de un replicador de plásmido útil en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175 ; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos descritos en WO 00/24883.
[0211] Se puede insertar más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en la célula huésped para aumentar la producción de una variante de glucósido hidrolasa. Se puede obtener un aumento en el número de copias de la secuencia de nucleótidos integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de nucleótidos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto las copias adicionales de la secuencia de nucleótidos, pueden seleccionarse cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0212] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra)..
Células huésped
[0213] La presente invención glucósido hidrolasa variante, que es ventajosamente usada en la producción recombinante de la variante. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se auto-replica como se describe anteriormente. El término quot;célula huéspedquot; comprende cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped depende en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
[0214] La célula huésped puede ser cualquier eucariota, como un mamífero, un insecto, una planta o una célula fúngica.
[0215] La célula huésped puede ser cualquier célula fúngica. quot;Hongosquot; según se utiliza en este caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (según la definición de Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary de The Fungi, 8.ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que el Oomycota (según se cita en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
[0216] En una forma de realización preferida, la célula fúngica huésped es una célula de levadura. quot;Levaduraquot;, según se utiliza en este caso, incluye levadura ascosporogénea (Endomycetales), levadura basidiosporogénea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de la presente invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities de Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0217] En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.
[0218] En una forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.
[0219] En otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. Los quot;hongos filamentososquot; incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos generalmente son caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0220] En una forma de realización más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es, de modo enunciativo y no limitativo, una célula de Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium o Trichoderma.
[0221] En una forma de realización más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oAspergillus oryzae. En otra forma de realización más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En una forma de realización incluso más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). En otra forma de realización más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. En otra forma de realización incluso más preferida, la célula fúngica filamentosa huésped es Trichoderma reesei RutC30. [0222] Las células fúngicas se pueden transformar según los procedimientos descritos en la presente.
Métodos de producción
[0223] La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante de glucósido hidrolasa, que comprende:
1.
(a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante, caracterizado por el hecho de que la célula huésped comprende una secuencia de nucleótidos de la invención que ha sido modificada para codificar la variante que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a la 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente comprende además una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, como se describe en la presente; y
2.
(b) recuperación de la variante del medio de cultivo.
[0224] En los métodos de producción de la presente invención, las células huéspedes se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la glucósido hidrolasa variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación o fermentación en pequeña escala o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, de lote, en flujo discontínuo, o estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, se puede recuperar de lisatos celulares.
[0225] En una forma de realización alternativa, la variante de glucósido hidrolasa no es recuperada, sino que se usa como una fuente de la variante una célula huésped de la presente invención que exprese una variante.
[0226] La variante de glucósido hidrolasa puede ser detectadas usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso en los ejemplos.
[0227] La variante de glucósido hidrolasa resultante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos, de modo enunciativo y no limitativo, recogida, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
[0228] Una variante de glucósido hidrolasa de la presente invención se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluidos, de modo enunicativo y no limitativo, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, por afinidad, hidrdeóbica, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electrdeoréticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener variantes de glucósido hidrolasas sustacialmente puras.
Otros polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa
[0229] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad de glucósido hidrolasa, caracterizados por el hecho de que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en al menos la posición 205 y opcionalmente a una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difiere a una
o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0230] En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 por preferiblemente 33 aminoácidos, más preferiblemente 32 aminoácidos, incluso más preferiblemente 31 aminoácidos, incluso más preferiblemente 30 aminoácidos, incluso más preferiblemente 29 aminoácidos, incluso más preferiblemente 28 aminoácidos, incluso más preferiblemente 27 aminoácidos, incluso más preferiblemente 26 aminoácidos, incluso más preferiblemente 25 aminoácidos, incluso más preferiblemente 24 aminoácidos, incluso más preferiblemente 23 aminoácidos, incluso más preferiblemente 22 aminoácidos, incluso más preferiblemente 21 aminoácidos, incluso más preferiblemente 20 aminoácidos, incluso más preferiblemente 19 aminoácidos, incluso más preferiblemente 18 aminoácidos, incluso más preferiblemente 17 aminoácidos, incluso más preferiblemente 16 aminoácidos, incluso más preferiblemente 15 aminoácidos, incluso más preferiblemente 14 aminoácidos, incluso más preferiblemente 13 aminoácidos, incluso más preferiblemente 12 aminoácidos, incluso más preferiblemente 11 aminoácidos, incluso más preferiblemente 10 aminoácidos, incluso más preferiblemente 9 aminoácidos, incluso más preferiblemente 8 aminoácidos, incluso más preferiblemente 7 aminoácidos, incluso más preferiblemente 6 aminoácidos, incluso más preferiblemente 5 aminoácidos, incluso más preferiblemente 4 aminoácidos, incluso más preferiblemente 3 aminoácidos, incluso más preferiblemente 2 aminoácidos y de forma más preferible 1 aminoácido.
[0231] En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 al menos en la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en tres o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en cuatro o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en cinco o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en seis o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en siete o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en ocho o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en nueve o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en diez o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en once o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en la posición 205 y en doce o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondiente al menos a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difiere de SEC ID n.º: 2 en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0232] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg en una posición correspondiente a la posición 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0233] En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Pro en una posición correspondiente a la posición 8 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por S8P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0234] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Asp en una posición correspondiente a la posición 22 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por G22D de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0235] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ile en una posición correspondiente a la posición 41 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T41I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0236] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ser en una posición correspondiente a la posición 49 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por N49S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0237] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Asn en una posición correspondiente a la posición 57 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S57N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0238] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Asn en una posición correspondiente a la posición 113 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S113N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0239] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Lys en una posición correspondiente a la posición 193 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por E193K de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0240] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Pro en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S196P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Thr en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S196T de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Phe en una posición correspondiente a la posición 196 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S196F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0241] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ala en una posición correspondiente a la posición 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T226A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0242] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ala en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por P227A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Leu en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por P227L de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Gly en una posición correspondiente a la posición 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por P227G de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0243] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ile en una posición correspondiente a la posición 246 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T246I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0244] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Lys en una posición correspondiente a la posición 251 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por R251K de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0245] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Pro en una posición correspondiente a la posición 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0246] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Asn en una posición correspondiente a la posición 259 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por D259N de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0247] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ser en una posición correspondiente a la posición 301 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por N301S de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0248] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ile en una posición correspondiente a la posición 356 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T356I de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0249] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Cys en una posición correspondiente a la posición 371 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por Y371C de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0250] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Phe en una posición correspondiente a la posición 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0251] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otra forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido además difiere de SEC ID n.º: 2 por Ala en una posición correspondiente a la posición 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere además de SEC ID n.º: 2 por T462A de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0252] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Phe en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0253] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 227 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Ala (o Leu o Gly) en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 227, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R + P227A (o P227L o P227G) de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0254] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 206 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Tyr en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 206, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R + H206Y de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0255] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 8 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 8 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Pro y Arg en posiciones correspondientes a las posiciones 8 y 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por S8P + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n. 2.
[0256] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 94 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 94 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Ser (o Ala o Arg o Gln) y Arg en posiciones correspondientes a las posiciones 94 y 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G94S (o G94A o G94R o G94Q) + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0257] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Pro (o Thr o Phe) y Arg en posiciones correspondientes a las posiciones 196 y 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por S196P (o S196T o S196F) + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0258] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Arg en posiciones correspondientes a las posiciones 157 y 205, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por K157R + G205R de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0259] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Pro en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 255, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R + T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0260] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg, Arg y Pro en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 255, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por K157R
+ G205R + T255P de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0261] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SED ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SED ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg y Phe en posiciones correspondientes a las posiciones 205 e 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0262] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg, Pro y Phe en posiciones correspondientes a las posiciones 205, 255 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por G205R
+
T255P + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0263] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg, Arg y Phe en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por K157R
+
G205R + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0264] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2. En una forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.°: 2 por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En una forma de realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por Arg, Arg, Pro y Phe en posiciones correspondientes a las posiciones 157, 205, 255 y 411, respectivamente, de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por K157R, G205R + T255P + S411F de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2.
[0265] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos una diferencia seleccionada del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0266] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos dos diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A. [0267] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos tres diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos1 a 513 de SEC ID n.°: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0268] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos cuatro diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A. En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos cinco diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0269] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos seis diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º:
2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0270] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos siete diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S,
N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0271] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos ocho diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0272] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos nueve diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0273] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos diez diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difiere por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0274] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos once diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A. [0275] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos doce diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0276] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos trece diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0277] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos catorce diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0278] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos quince diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0279] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos dieciséis diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0280] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos diecisiete diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0281] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos dieciocho diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0282] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos diecinueve diferencias seleccionada del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0283] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por al menos veinte diferencias seleccionadas del grupo que consiste en S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una o más diferencias seleccionadas del grupo que consisten en S8P, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A. [0284] En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de SEC ID n.º: 2 por la diferencia G205R y por las diferencias que consisten en al menos S21P, G94S, G94A, G94R, G94Q, K157R, E193K, S196P, S196F, G205R, H206Y, P227L, P227G, T246I, Y247C, D259N, R251K, N301S, E337V, T350S, N373H, T383A, P438L, T455A, G467S y C486W de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 y opcionalmente además difieren por una
o más diferencias seleccionadas del grupo que consiste en SBP, G22D, T41I, N49S, S57N, S113N, S196T, T226A, P227A, T255P, T356I, Y371C, S411F y T462A.
[0285] Los polipéptidos aislados tienen una o más propiedades mejoradas en comparación con el polipéptido de SEC ID n.º: 2, caracterizado por el hecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en actividad térmica, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química, como se describe en la presente.
[0286] La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican tales polipéptidos, constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped que comprenden las secuencias de nucleótidos y métodos de producción de los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa, según la misma descripción en la presente para las variantes de glucósido hidrolasa.
Degradación de biomasa a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos
[0287] Las variantes de glucósido hidrolasa, los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa y las células huésped de la presente invención se pueden utilizar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como materias primas químicas o de fermentación de biomasa para la producción de etanol, plástico u otros productos o productos intermedios. Las variantes de glucósido y los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa pueden ser en forma de un caldo de fermentación crudo con o sin las células eliminadas o en forma de una preparación enzimática semi-purificada o purificada. De forma alternativa, una célula huésped de la presente invención puede ser utilizada como una fuente de la variante o el polipéptido con actividad de glucósido hidrolasa en un proceso de fermentación con la biomasa.
[0288] La biomasa puede incluir, de modo enunciativo y no limitativo, recursos de madera, desperdicios municipales sólidos, papel usado y residuos de cosecha (véase, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), páginas 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress In Bioconversion de Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Blotechnology, T. Scheper, Director Edtorial, Volumen 65, págs. 23-40, Springer-Verlag, New York).
[0289] El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa, y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y se refuerza a través de lignina polimérica reticulada de manera covalente a la hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y, de ese modo, es un beta(1-4)-D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. La celulosa se encuentra, aunque generalmente polimorfa, en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas normalmente tienen enlace de hidrógeno a celulosa, al igual que a otras hemicelulosas, lo cual ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular.
[0290] Se utilizan tres clases importantes de glicohidrolasas para descomponer la biomasa celulósica:
1.
(1) Las quot;endo-1,4-beta-glucanasasquot; o 1,4-beta-D-glucano-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4), que actúan de forma aleatoria en sustratos de 1,4-beta-glucano solubles e insolubles.
2.
(2) las quot;exo-1,4-beta-D-glucanasasquot; que incluyen las 1,4-beta-D-glucano glucohidrolasas (EC 3.2.1.74), que liberan D-glucosa de 1,4-beta-D-glucanos e hidrolizan D-celobiosa lentamente, y celobiohidrolasas (1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasas, EC 3.2.1.91), que liberan D-celobiosa de 1,4-beta-glucanos.
3.
(3) Las quot;beta-D-glucosidasasquot; o beta-D-glucósido glucohidrolasas (EC 3.2.1.21), que actúan para liberar unidades de D-glucosa de celobiosa y celodextrinas solubles, al igual que un conjunto de glucósidos.
[0291] Estas tres clases de enzimas trabajan juntas sinergísticamente dando como resultado descristalización e hidrólisis eficaces de celulosa nativa de biomasa para producir azúcares reducidos.
[0292] Las variantes de glucósido hidrolasa y los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa de la presente invención se pueden utilizar conjuntamente con las enzimas mencionadas anteriormente para degradar aún más el componente de celulosa del sustrato de biomasa, (véase, por ejemplo, Brigham et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), págs. 119-141, Taylor & Francis, Washington D.C.; Lee, 1997, Journal de Biotechnology 56: 1-24 ).
[0293] El etanol se puede producir por degradación enzimática de biomasa y conversión de los sacáridos liberados a etanol. Esta especie de etanol frecuentemente es denominada bioetanol o biocombustible. Esto puede ser usado como un aditivo o suplemento de combustible en mezclas de menos de 1% y hasta 100% (un sustituto de combustible).
Composiciones detergentes
[0294] Las variantes y los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa de la presente invención pueden ser añadidas a la composición detergente y así convertirse en un componente de la misma.
[0295] La composición detergente de la presente invención puede, por ejemplo, ser formulada como una composición detergente de lavado a mano o a máquina incluida una composición de aditivo de lavado adecuada para el tratamiento previo de tejidos manchados y una composición de suavizante agregado al enjuague, o ser formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de vajilla a mano o máquina.
[0296] En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo detergente que comprende las variantes y los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa de la presente invención. El aditivo detergente al igual que la composición detergente puede comprender una o más enzimas adicionales tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa y/o peroxidasa.
[0297] En general, las propiedades de los componentes enzimáticos deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y los componentes enzimáticos deberían estar presentes en cantidades eficaces.
[0298] Proteasas: Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Están incluidos mutantes creados genéticamente o modificados químicamente de proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carisberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descritas en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.
[0299] Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
[0300] Las enzimas proteásicas preferidas disponibles comercialmente incluyen AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM y KannaseTM (Novozymes A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM y FN3TM (Genencor International Inc.).
[0301] Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos mutantes creados genéticamente o modificados químicamente de proteínas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo, Thermomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) según se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens según se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331376); P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp, cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtills (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131:: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).
[0302] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como las descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.
[0303] Las enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen LipolaseTM y Lipolase UltraTM (Novozymes A/S).
[0304] Amilasas: Las amilasas adecuadas (a y/o �) incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos mutantes creados genéticamente o modificados químicamente de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, aamilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita en más detalle en GB
1.296.839.
[0305] Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
[0306] Las amilasas disponibles comercialmente son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor internacional Inc.).
[0307] Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Están incluidos mutantes creados genéticamente o modificados químicamente de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulosas fúngicas producidas a partir de Humicola Insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 y WO 89/09259.
[0308] Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidados del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WO 94/07998, EP 0 531315, US 5.457.046, US 5.686.593, 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
[0309] Las celulasas disponibles comercialmente incluyen CelluzymeTM y CarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM y Puradax HATM (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)TM (Kao Corporation).
[0310] Peroxidasas/oxidasas: Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Están incluidos mutantes creados genéticamente o modificados químicamente de proteínas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus y variantes de las mismas como las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.
[0311] Las peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).
[0312] El/Los componente/s enzimático/s se puede/n incluir en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un granulado, un líquido, un compuesto acuoso, etc. Las formulaciones de aditivo detergente preferidas son granulados, en particular granulados no pulverizados, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o lodos.
[0313] Los granulados no pulverizados pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en US 4.106.991 y
4.661.452 y pueden ser revestidos opcionalmente por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(etileno óxido) (polietilenglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20.000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di-y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuadas para la aplicación por técnicas de lecho fluidificado se ofrecen en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238.216.
[0314] La composición detergente de la invención puede ser en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente con 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
[0315] La composición detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluidos semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos están típicamente presentes a un nivel de 0,1% a 60% en peso.
[0316] Cuando se incluye en el mismo, el detergente normalmente contiene de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfasulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico, o jabón. [0317] Cuando se incluye en el mismo, el detergente normalmente contiene de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de un tensioactivo no iónico como alcohol etoxilato, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglucósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina (quot;glugamidasquot;).
[0318] El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst).
[0319] El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), alcohol (polivinílico), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.
[0320] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formación de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, tipo amida, imida, o sulfona.
[0321] El/Los componente/s enzimático/s de la composición detergente de la invención puede/n ser estabilizado/s usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilo borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico y la composición puede ser formulada como se describe en, por ejemplo, WO 92/19709 y WO 92/19708.
[0322] El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de tejido incluidos arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes de anti redeposición de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de decoloración o perfumes.
[0323] En las composiciones detergentes cualquier componente enzimático, en particular, las variantes y los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa de de la invención, se pueden adicionar en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.
[0324] Las variantes y los polipéptidos con actividad de glucósio hidrolasa de la invención pueden adicionalmente ser incorporados en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, que está incorporada en la presente como referencia.
Plantas
[0325] La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica una variante o polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa de la presente invención para expresar y producir la variante o el polipéptido en cantidades recuperables. La variante se puede recuperar de la planta o parte de planta. De forma alternativa, la planta o parte de planta que contiene la variante o el polipéptido recombinante puede ser utilizada como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorando el valor nutritivo, de apetencia, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
[0326] La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de prados (poa pratense, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, césped templado, tal como Agrostis y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz.
[0327] Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, moldura y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia de Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[0328] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutas, semillas y tubérculos, al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de la célula vegetal, como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma también son considerados parte de una planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera sea el origen del tejido, se considera una parte de una planta. De igual modo, las partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también son consideradas partes de la planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semillas.
[0329] También está incluida dentro del campo de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales.
[0330] La planta transgénica o célula vegetal que exprese una variante o un polipéptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En breve, la planta o la célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican una variante de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propaga la planta modificada o célula vegetal resultante en una planta transgénica o célula vegetal.
[0331] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante o un polipétido de la presente invención operativamente vinculada con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huéspedes en las cuales el constructo de expresión ha sido integrado y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto último depende del método de introducción de ADN que se utilizará).
[0332] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de terminador y promotor y opcionalmente secuencias de tránsito o señal, está determinada, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea expresar la variante o el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica una variante de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica de fase o tejido, y el producto genético puede ser dirigido a un tejido o parte de planta específica tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506 .
[0333] Para la expresión constitutiva pueden utilizarse el 355-CaMV, la ubiquitina 1 de maíz y el promotor de la actina 1 del arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689 ; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165 ). Los promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumideros de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutas (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24. 275-303) o de tejidos sumideros metabólicos tales como meristemas(Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal de Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935 941), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser una promotor específico de hoja tal como el promotor de eritrocitos de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de metiltransferasa de adenina de virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668674), o un promotor inducible por lesiones tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588 ). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de planta tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico y metales pesados.
[0334] También puede utilizarse un elemento intensificador del promotor para conseguir mayor expresión de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión.
[0335] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se pueden elegir de aquellos disponibles en la técnica.
[0336] El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluida la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535 ; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). [0337] Actualmente, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para obtener un resumen, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) y también puede ser usada para transformar monocotiledóneas, aunque frecuentemente se utilizan otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de tungsteno u oro microscópico revestidas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281 ; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162 ; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674 ). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.
[0338] Después de la transformación, los transformantes que hayan incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente, el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T-ADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
[0339] La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante o un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante o un polipéptido que tiene actividad de glucósido hidrolasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción de la variante; y (b) recuperación de la variante o el polipéptido.
Otros usos
[0340] Las variantes de glucósido hidrolasa o los polipéptidos de la presente invención también pueden ser usadas en el tratamiento de tejidos como agentes de biopulido y para reducción de pelusa, frisado, modificación de textura y lavado a la piedra (N.K. Lange, en P. Suominen, T. Reinikainen (Eds.), Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Helsinki, 1993, págs. 263-272 ). Además, las variantes o los polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa descritos también pueden ser usados en el tratamiento de la madera para biorreducción a pasta o descortezado, fabricación de papel para modificación de fibra, blanqueamiento y reducción de refinación de costes de energía, tratamiento de aguas blancas, importante para reciclaje de aguas residuales, reciclaje de fibra lignocelulósica tal como desentintado y tratamiento de fibras secundarias y utilización de residuos de madera (S.D, Mansfield y A.R. Esteghlalian en S.D, Mansfield y J.N. Saddler (Eds.), Applications de Enzymes to Lignocellulosics, ACS Symposium Series 855, Washington, D.C., 2003, págs. 2-29 ). [0341] La presente invención es descrita adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención.
Ejemplos
Cepas
[0342] Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765; Montenecourt y Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: 289- 301) fue derivado de Trichoderma reesei Qm6A (ATCC 13631; Mandels and Reese, 1957, J. Bacteriol. 73: 269-278 ).
[0343] Cepa Jal250 de Aspergillus oryzae (WO 99/61651) fue usado para la expresión de la beta-glucosidasa termoestable.
[0344] Se utilizó Saccharomyces cerevisiae YNG 344 (MATa, ura3-52, leu-2L2, pep4L1, his4-539, cir0) para generar bibliotecas de glucósido hidrolasa mutagenizada (Cel7A).
[0345] Cepas bacterianas usadas para generar plásmidos fueron células ultracompetentes en E. coli XL-10 Gold (Stratagene, Inc., la Jolla it, CA).
Medios y soluciones
[0346] El medio de selección de levadura fue compuesto por litro de 6,7 g de base nitrogenada de levadura, 0,8 g de mezcla de suplemento completo (CSM, Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA; sin uracilo y con 40 mg/ml de adenina), 5 g de ácido de casamino y 20 g de agar Noble. El medio también contenía 50 mM de succinato pH 5,0, glucosa al 2% y 25 μg de cloranfenicol por ml.
[0347] El medio de selección de levadura fue compuesto por litro de 6,7 g de base nitrogenada de levadura, 0,8 g de CSM-URA, 5 g de ácido de casamino y 20 g de agar Noble. El medio también contenía 50 mM de succinato pH 5,0, galactosa al 0,2%, glucosa al 0,1% y 25 μg de cloranfenicol por ml.
[0348] El medio YPD fue compuesto por litro de 10 g de extracto de levadura, 20 g de bacto peptona y 40 ml de glucosa al 50%.
[0349] El medio inductor de la celulasa fue compuesto por litro de 20 g de fibras celulósicas naturales de Arbocel B800
(J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft, Michigan), 10 g de sólidos de maíz fermentado (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO), 1,45 g de (NH4 )2 SO4, 2,08 g de KH2 PO4, 0,28 g de CaCl2, 0,42 g de MgSO4· 7H2O, 0,42 ml de solución de metales de Trichoderma reeseitrace y 2 gotas de ácido plurónico; pH a 6,0 con NaoH 10 N.
[0350] La solución de metales traza de Trichoderma reesei fue compuesta por litro de 216 g de FeCl3· 6H2 O, 58 g de ZnSO4 ·7H2 O, 27 g de MnSO4· H2 O, 10 g de CuSO4· 5H2 O, 2,4 g de H3 BO3 y 336 g de ácido cítrico.
[0351] Las placas de selección COVE fueron compuestas por litro de 342,3 g de sacarosa, 20 ml de solución salina COVE, 10 mM de acetamida, 15 mM de mM CsCl2 y 25 g de agar Noble.
[0352] Las placas de uridina COVE2 plus fueron compuestas por litro de 30 g de sacarosa, 20 ml solución salina COVE, 10 mM de acetamida, 10 mM de uridina y25 g de agar Noble.
[0353] La solución salina COVE fue compuesta por litro de 26 g de KCl, 26 g de MgSO4· 7H2 O, 76 g de KH2 PO4 y 50 ml de metales traza COVE.
[0354] La solución de metales traza COVE fue compuesta por litro de 0,04 g de NaB4 O7· 10H2 O, 0,4 g de CuSO4· 5H2 O, 1,2 g de FeSO4· 7H2 O, 0,7 g de MnSO4· H2 O, 0,8 g de Na2 MoO2· 2H2 O y 10 g de ZnSO4· 7H2 O.
[0355] El medio PDA fue compuesto por litro de 39 g agar de dextrosa de patata.
[0356] 1X SSC fue compuesto por litro de 8,765 g de cloruro sódico y 4,41 g citrato sódico.
[0357] El tampón PEG fue compuesto por litro de 500 g de PEG 4000 (BDH, Poole, Inglaterra), 10 mM de CaCl2 y 10 mM de Tris-HCl pH 7,5 (filtro esterilizado).
[0358] El STC fue compuesto por litro de 1 M de sorbitol, 10 mM de CaCl2 y10 mM de Tris-HCl pH 7,5 y fue esterilizado con filtro.
[0359] El medio inóculo de Trichoderma reesei fue compuesto por litro de 20 g de glucosa, 10 g de sólidos de maíz fermentado (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1,45 g de (NH4 )2 SO4, 2,08 g de KH2 PO4, 0,28 g de CaCl2, 0,42 g de MgSO4· 7H2 O, 0,42 ml ml de solución de minerales traza de Trichoderma reesei y 2 gotas de ácido plurónico; pH final 5,0.
[0360] El medio de fermentación de Trichoderma reesei fue compuesto por litro de 4 g de glucosa, 10 g de sólidos de maíz fermentado, 30 g de fibras celulósicas naturales de Arbocel B800 (J. Rettenmaier USA LP, Schoolcraft, Michigan), 3(NH4 )2 SO4, 2,8 g de KH2 PO4, 2,08 g de CaCl2, 1,63 g de MgSO4· 7H2O, 0,75 ml de solución de metales traza de
Trichoderma reesei y 1,8 ml de ácido plurónico.
[0361] El medio de alimentación de Trichoderma reesei fue compuesto por litro de 600 g de glucosa, 20 g de celulosa B800, 35,5 g de H3 PO4 y 5 ml de ácido plurónico.
[0362] El medio de inóculo de Aspergillus oryzae fue compuesto por litro de 50 g de glucosa, 2 g de MgSO4· 7H2 O, 10 g de KH2 PO4, 2 g de K2 SO4, 2,08 g de CaCl2 ·2 H2 0, 2 g de ácido cítrico, 10 g de extracto de levadura, 0,5 g de metales traza AMG y 2 g de urea, pH final 6,0.
[0363] Los metales traza AMG están compuestos por litro de 14,3 g de ZnSO4· 7H2 O, 2,5 g de CuSO4· 5H2 O, 0,5 g de NiCl2· 6H2 O, 13,8 g de FeSO4· 7H2 O, 8,5 g de MnSO4· H2 OO y 3 g de ácido cítrico. [0364] El medio de fermentación de Aspergillus oryzae fue compuesto por litro de 2 g MgSO4· 7H2 O, 2 g de KH2 PO4, 3 g de K2 SO4, 9 g de (NH4)2 HPO4,1 g de ácido cítrico· H2 O, 10 g de extracto de levadura, 0,5 ml de metales traza AMG, 25 g de sacarosa y 0,55 ml de plurónico.
[0365] El medio de alimentación de Aspergillus oryzae fue compuesto por litro de 1 g de ácido cítrico. H2 O, 320 g de SatinSweet 65 y 5 g de plurónico.
[0366] El medio MDU2BP está compuesto por litro de 45 g de maltosa, 1 g de MgSO4· 7H2 O, 1 g de NaCl, 2 g de K2 SO4, 12 g de KH2 PO4, 7 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0,5 ml de solución de metales traza AMG.
Ejemplo 1: Fermentación y tejido micelial
[0367] RutC30 de Trichoderma reesei fue cultivado bajo condiciones estándares de inducción de celulasa como se describe en la técnica (Mandels and Weber, 1969, Adv. Chem. Ser. 95: 391-413 ). Muestras miceliales fueron cosechadas por filtración a través de papel de Whatman y congeladas rápido en nitrógeno líquido. Las muestras fueron almacenadas a -80° C hasta que fueron interrumpidas para extracción de ARN.
Ejemplo 2: Construcción de genoteca de ADNc de etiquetas de secuencia expresada (EST)
[0368] El ARN celular total fue extraído de las muestras miceliales descritas en Ejemplo 1 según el método de Timberlake y Barnard (1981, Cell 26: 29-37) y las muestras de ARN fueron analizadas por hibridación de Northern después de transferencia por adsorción de 1% geles de agarosa de formaldehído (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York). Las fracciones de ARNm poliadenilatado fueron aisladas de ARN total con un mRNA Separator Kit™ (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADNc bicatenario fue sintetizado usando aproximadamente 5 μg de poli(A)+ ARNm según el método de Gubler y Hoffman (1983, Gene 25: 263-269), excepto que un cebador Not I-(dT)18 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) fue usado para iniciar la síntesis de la primera cadena. El ADNc fue tratado con nucleasa de judía mungo (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) y los extremos se hicieron romos con T4 ADN polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA).
[0369] Los adaptadores BamH I/EcoR I fueron ligados a los extremos romo del ADNc. Después de la digestión con NotI, el ADNc fue seleccionado por tamaño (aprox. 0.7-4.5 kb) por 0,7% de electroforesis en gel de agarosa usando tampón TAE (4,84 g de Tris Base, 1,14 ml de ácido acético glacial y 2 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 por litro) y ligado con pYES2 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) que ha sido dividido con Not I más BamH I defosforilado con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN). La mezcla de ligadura fue usada para transformar células E. coli TOP10 competentes (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Transformantes fueron seleccionados en placas de agar 2YT (Miller, 1992, A Short Course inBacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) suplementadas con ampicilina a una concentración final de 50 μg por ml.
Ejemplo 3: Preparación de modelo y secuenciación de nucleótidos de clones de ADNc
[0370] De la genoteca de ADNc descrita en Ejemplo 2, aproximadamente 7000 colonias transformantes fueron escogidas directamente de las placas de transformación en platos de microtitulación de 96 pocillos que contenían 100 μl de caldo 2YT suplementado con 50 μg de ampicilina por ml. Las placas fueron incubadas durante toda la noche a 37° C con agitación a 200 r.p.m. Tras la incubación, se añadieron 100 μl de glicerol al 50% estéril cada pocillo. Los transformantes fueron replicados en, placas secundarias para microcultivo de 96 pocillos de plato profundo (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) con 1 ml de Magnificent Broth™ (MacConnell Research, San Diego, CA) suplementado con 50 μg de ampicilina por ml en cada pocillo. Las placas de microtitulación primarias fueron almacenadas congeladas a -80° C. Las placas secundarias de plato profundo fueron incubadas a 37° C durante toda la noche con agitación vigorosa (300 r.p.m.) en un agitador giratorio. Para prevenir derrames y contaminación cruzada y para permitir aireación suficiente, cada placa secundaria de cultivo fue cubierta con una almohadilla de polipropileno (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD) y una cobertura de plato de microtitulación plástica.
[0371] El ADN fue aislado de cada pocillo usando un protocolo de equipo de minipreparación de 96 pocillos de Advanced Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, MD) según modificación de Utterback et al. (1995, Genome Sci. Technol. 1: 1-8 ). La secuenciación del ADN monopaso (EST) fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado Modelo 377 XL de Perkin-Elmer Applied Biosysttems (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando química de terminador de coloración (Giesecke et al., 1992, Journal de Virology Methods 38: 47-60) y un cebador de secuenciación T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 3)
Ejemplo 4: Análisis de datos de secuencia de ADN de clones de ADNc
[0372] Los datos de la secuencia de nucleótidos fueron analizados en detalle en cuanto a la calidad y las secuencias de vector y las llamadas de base ambiguas en los extremos de las secuencia de ADN fueron cortadas y todas las secuencias fueron comparadas entre sí con asistencia del software PHRED/PHRAP (University de Washington, Seattle, WA). Los contigs y los singletons fueron traducidos en seis marcos y analizados en comparación con bases de datos de proteínas públicamente disponibles usando el software GeneMatcher™ (Paracel, Inc., Pasadena, CA) con un algoritmo de Smith-Waterman modificado que usa la matriz BLOSUM 62.
Ejemplo 5: Identificación de clones de ADNc que codifican una celobiohidrolasa I de Familia 7 (Cel7A)
[0373] Los clones de ADNc putativos que codifican una celobiohidrolasa de familia 7 (Cel7A) fueron identificados por comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del ensamblado ESTs con secuencias proteínicas depositadas en bases de datos públicamente disponibles tal como Swissprot, Genpept y PIR. Un clon, EST Tr0221 de Trichoderma reesei, fue seleccionado para análisis de secuencia de nucleótidos que reveló un inserto pYES2 de 1821 pares de bases que contenía un marco de lectura abierto de 1452 de pares de bases como se muestra en SEC ID n.º: 1 y una secuencia de aminoácidos deducida como se muestra en SEC ID n.º: 2. El plásmido con celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei fue designado pTr0221.
Ejemplo 6: Construcción de vectores de Saccharomyces cerevisiae para la generación de bibliotecas de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei primaria y redistribuida
[0374] Dos vectores fueron utilizados en la generación de bibliotecas redistribuidas y primarias, pJC106 (WO9510602) y pAJ052 (Figura 1). El plásmido pJC106 es un derivado de pYES2 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) pero difiere en que pJC106 tiene un replicón de 2 micras de longitud completa, que reemplaza las 2 micras parciales en pYES2 y contiene la secuencia codificante de peroxidasa de Coprinus cinereus (CiP) (Cherry et al., 1999, Nat. Biotechnol. 4: 379-384), que es regulada por el promotor GAL1.
[0375] Para pAJ052, un fragmento de ADN de 1452 bp que se extiende desde el codón de inicio ATG al codón de terminación TAA de la secuencia codificante de Cel 7A de Trichoderma reesei fue amplificado por PCR de pTr0221 (Ejemplo 5) usando los cebadores aGal_776.1 (sentido) y aGal_776.1A (antisentido) mostrados a continuación:
Cebador aGal_776.1:
Cebador aGal_776.1A
[0376] Los cebadores aGal_776.1 y aGal_776.1A fueron diseñados para contener un promotor GAL1 homólogo (Giniger and Ptashne, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 382-386 ) y la secuencia del terminador CYC1 (Osbourne and Guarente, 1988, Genes Dev. 2: 766-772) (subrayado; respectivamente) de pJC106 para la recombinación homóloga in vivo del producto de PCR y pJC106. Los cebadores aGal_776.1 y aGal_776.1A también fueron diseñados para contener sitios de restricción BamH I y Xho I, respectivamente. El cebador aGal_776.1 además fue diseñado para contener la secuencia Kozak de levadura (ACC, -3 a -1 par de bases; Kozak, 1984, Nature 308: 241-246) inmediatamente arriba del gen ATG de celobiohidrolasa I (Cel7A) de Trichoderma reesei. La reacción de amplificación (50 μl) fue compuesta por tampón 1X PCR (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), 0,2 mM de dNTPs, 3,2 pM de cebador aGal_776.1, 3,2 Pm de cebador aGal_776.1A, aproximadamente 100 ng de pTr0221 y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 (Eppendorf EG, Hamburgo, Alemania) programado durante 1 ciclo a 94° C durante 3 minutos seguido de 30 ciclos cada uno a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos y72° C durante 90 segundos seguido de 1 ciclo a 72° C durante 5 minutos. El producto de PCR luego fue purificado usando un equipo de PCR QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante y luego fue introducido en Saccharomyces cerevisiae por recombinación in vivo. Para realizar la recombinación in vivo, aproximadamente 100 ng de pJC016, digeridos con BamH I y Xho I, y aproximadamente 500 ng del fragmento de PCR purificado, fueron cotransformados en YNG 344 de Saccharomyces cerevisiae después del protocolo de transformación de levadura YEASTMAKER (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA). La transformación fue colocada en placas sobre medio de selección de levadura para crecimiento de colonias a 30° C durante 4 días.
[0377] Una única colonia fue seleccionada y se aisló ADN plásmido según el protocolo descrito por Kaiser y Auer, 1993, BioTechniques 14: 552, que fue posteriormente transformado en la cepa de E. coli XL-10 (Stratagene Inc., La Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. El plásmido derivado de la cepa de E. coli transformada fue ordenado para verificar la fidelidad del PCR y el evento de recombinación.
Ejemplo 7: Generación de bibliotecas primarias de celobiohidrolasa I Cel7A mutagenizada en Saccharomices cerevisiae
[0378] En un esfuerzo para identificar regiones de la celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei que son críticos para la termoestabilidad de proteína y actividad de alta temperatura mejorada, el gen de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei entero de tipo salvaje fue mutagenizado usando PCR con tendencia al error con secuencias homólogas al vector de expresión de levadura pJC106 (Figura 2), que puede sufrir recombinación in vivo entre dominios homólogos de fragmentos diferentes, generando plásmidos de replicación circular de una combinación de vector linealizado y productos de PCR.
[0379] Los productos de PCR para reparación del espacio fueron generados usando una de las siguientes combinaciones de modelo/cebador:
1) El cebador aGal_776.1 y el cebador aGal_776.1a, mostrados más abajo, fueron usados en la Amplificación de PCR con tendencia al error del gen de celobiohidrolasa I Cel7A de pTR0221 para generar secuencias mutagenizadas.
2) El cebador yes2term y el cebador CiPpcrdwn, mostrados más abajo, fueron usados en la Amplificación de pCR con tendencia al error del gen de celobiohidrolasa I Cel7A de pAJ052 para generar secuencias mutagenizadas.
3) El cebador cJC106.1a y el cebador CiPpcrdwn, mostrados más abajo, también fueron usados en la Amplificación de PCR con tendencia al error del gen de celobiohidrolasa I Cel7A de pAJ052 para generar secuencias mutagenizadas.
[0380] Los fragmentos fueron clonados en pJC106 para la expresión de variantes de celobiohidrolasa I Cel7A en la levadura.
Cebador aGal_776.1:
Cebador aGal776.1a:
Cebador yes2term:
5'-GGCGTGAATGTAAGCGTGAC-3' (SEC ID N.°: 8)
Cebador CiPpcrdwn:
5'-CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGA-3' (SEC ID N.°: 9)
Cebador cJC106.1a:
5'-GCGTACACGCGTCTGTACA-3' (SEC ID N.°: 10)
[0381] Las Amplificaciones de PCR con tendencia al error (50 μl) fueron compuestas de tampón 1X PCR con MgCl2, 0,2
mM de dATP, 0,2 mM de dGTP, 0,1 mM de dCTP y 0,1 mM de dTTP, 50 pmol de cebador sentido y antisentido, 0,05 mM a 0,6 mM de MnCl2 y 10- 50 ng de ADN plásmido (en algunos casos pTR0221, en otros casos pAJ052). Las reacciones fueron incubadas usando un termociclador de MJ Research (MJ Research, Inc. Boston, MA) programado
para un ciclo a 95° C durante 3 minutos después de lo cual se añadieron 2,5 unidades de Amplitaq (Perkin Elmer, Foster City, CA) seguidos de 30 ciclos cada a 95° C durante 60 segundos, 55° C durante 60 segundos y72° C durante 90 segundos. Las reacciones fueron luego incubadas a 72° C para un extensión de 5 minutos. Una alícuota de cada producto de PCR fue realizada en un gel de agarosa al 0,7% usando tampón TAE, tal y como se describe anteriormente, generando bandas previstas de aproximadamente 1680 a 2030 pares de bases. Las reacciones de PCR fueron purificadas usando un equipo de purificación de PCR MiniElute (QIAGEN, Valencia, CA) eluido en 50 μl de tampón EB (QIAGEN Valencia, CA).
[0382] El plásmido pJC106 fue escindido por digestión con BamH I y Xho I y luego fue purificado en gel usando una columna QIAquick Minielute (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). La digestión fue verificada por fraccionamiento de una alícuota de la digestión en un gel de agarosa al 0,8% usando tampón TAE y coloreando con bromuro de etidio donde los fragmentos previstos de 10771 pares de bases (escindidos) y 1030 pares de bases (del gen de peroxidasa de Coprinus cinereus) fueron obtenidos.
[0383] Las reacciones de la PCR fueron mezcladas a aproximadamente una proporción de 3 a 1 con el vector pJC106 escindido para cotransformación en las células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG344. Los fragmentos cotransformados, amplificados usando los cebadores aGal_776.1 y aGal_776.1a, contuvieron al menos 67 pares de bases de 5' y 66 pares de bases de 3' ADN homólogo, amplificados yes2term y CiPpcrdwn contuvieron al menos 293 pares de bases de 5' y 41 pares de bases de 3' ADN homólogo y amplificado usando cJC106.1a y CiPpcrdwn contuvieron al menos 293 pares de bases de 5' y 190 pares de bases de 3' ADN homólogo en los extremos para facilitar la reparación del espacio del plásmido expresado. Las células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG 344 fueron preparadas antes de cada transformación siguiendo el Protocolo de transformación de levadura YEASTMAKER con las siguientes modificaciones: (1) el volumen de cultivo de levadura usado para inocular la incubación durante toda la noche (16-20 horas) fue entre 100-1000 !ll; (2) la recuperación de células después de la transformación fue realizada en medio YPD durante 45 minutos a 30º C; (3) la mezcla de transformación fue dividida en partes alícuotas para colocar en placas en medio de selección de levadura y fueron congeladas a -80º C en un congelador de índice controlado (Nalge Nunc International, Rochester, NY).
Ejemplo 8: Construcción de vectores de expresión Aspergillus oryzae pAILo1 y pAILo2
[0384] Como un vector estructural para clonar varias de las variantes de celobiohidrolasa Cel7A, se construyeron dos vectores de expresión de Aspergillus oryzae. El vector pAILo1 fue construido modificando pBANe6 (patente U.S. 6.461.837), que comprende el promotor alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, la secuencia del terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (terminador AMG) y gen de acetamidasa de Aspergillus nidulans (amdS). La modificación de pBANe6 fue realizada eliminando primero tres sitios de restricción Nco I en las posiciones 2051, 2722 y 3397 bp del marcador de selección amdS por mutagénesis dirigida al sitio. Todos los cambios fueron diseñados para que fueran quot;silenciososquot; dejando sin cambios la secuencia de la proteína real del producto genético amdS. La eliminación de estos tres sitios fue realizada simultáneamente con un equipo de mutagénesis dirigida GeneEditor (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante usando los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada):
Cebador AMDS3NcoMut (2050):
5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (SEC ID N.°: 11)
Cebador AMDS2NcoMut (2721):
5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3' (SEC ID N.°: 12)
Cebador AMDS1NcoMut (3396):
5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3' (SEC ID N.°: 13)
[0385] Un plásmido que comprende los tres cambios de secuencia previstos fue luego sometido a mutagénesis dirigida, usando un equipo de mutagénesis QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA), para eliminar el sitio de restricción Nco I al final del terminador AMG en la posición 1643. Los siguientes cebadores (el nucleótido subrayado representa la base cambiada) fueron usados para la mutagénesis:
Cebador superior para mutagenizar la secuencia del terminador AMG de Aspergillus niger:
5'-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (SEC ID N.°: 14)
Cebador antisentido para mutagenizar la secuencia del terminador de AMG de Aspergillus niger:
5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' (SEC ID N.°: 15)
[0386] El último paso en la modificación de pBANe6 fue la adición de un nuevo sitio de restricción Nco I en el principio del poliligador usando un equipo de mutagénesis QuickChange y los siguientes cebadores (los nucleótidos subrayados representan las bases cambiadas) para producir pAILo1 (Figura 3).
Cebador de sentido para mutagenizar el promotor de TAKA de Aspergillus oryzae:
5'-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3' (SEC ID N.°: 16)
Cebador antisentido para mutagenizar el promotor de TAKA de A. oryzae:
5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3' (SEC ID N.°: 17)
[0387] El gen amdS de pAILo1 fue cambiado con el gen pyrG de Aspergillus nidulans. El plásmido pBANe10 (Figura 4) fue usado como una fuente para el gen pyrG como un marcador de selección. El análisis de la secuencia de pBANe10 mostró que el marcador pyrG fue contenido dentro de un fragmento de restricción Nsi I y no contiene sitios de restricción Nco I ni Pac I. Ya que el amdS también es flanqueado por sitios de restricción Nsi I, la estrategia para alternar el marcador de selección fue un simple cambio de fragmentos de restricción Nsi I.
[0388] El ADN plásmido de pAILo1 y pBANe10 fue digerido con la enzima de restricción Nsi I y los productos fueron purificados por electroforesis en gel de agarosa al 0,07% usando tampón de TAE. El fragmento de Nsi I de pBANe10 con el gen pyrG fue ligado a la estructura de pAILo1 para reemplazar el fragmento de ADN Nsi I original con el gen amdS. Los clones recombinantes fueron analizados por digestión de enzima de restricción para determinar la orientación del inserto. Se seleccionó un clon con el gen pyrG transcrito en el sentido contrario a las agujas del reloj. El plásmido nuevo fue designado pAILo2 (Figura 5).
Ejemplo 9: Diseño racional de G205R variante de celobiohidrolasa I Cel7A y generación de bibliotecas primarias de G205R en Saccharomyces cerevisiae
[0389] La secuencia de proteína celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei (SEC ID nº: 2) fue comparada con otras proteínas de la misma familia de enzimas. Las secuencias incluyeron una celobiohidrolasa I Cel7A de Chaetomium thermophilum (WO 03/000941), Humicola insolens (WO 95/02675) y Neurospora crassa (SWISSPROT: pariente filogenético cercano P38676a de Chaetomium termofilum). Se hicieron alineamientos múltiples de secuencias proteínicas de celobiohidrolasa I Cel7A de Chaetomium termofilum, Humicola insolens, Trichoderma reesei y Neurospora crassa, usando el software ClustalX versión 1.81, (National Center for Biotechnology Information, NIH Bethesda, MD) (Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Res 22: 4673-4680; Thompson et al, 1997, Nucleic Acids Res 25: 4876-4882), usando la matriz Gonnet con parámetros de penalización de espacio predeterminados. Las regiones que aparecieron mal alineadas fueron realineadas iterativamente, a veces usando una matriz alternativa (Blosum) y/o parámetros de espacio variables. Se generaron modelos de homología para secuencias de celobiohidrolasa I Cel7A públicamente disponibles usando el servicio automatizado SwissModel (Biozentrum, Basilea, Suiza). El modelo de homología para celobiohidrolasa I Cel7A de Humicola insolens fue generado usando los programas Insight II (Accelrys, San Diego CA). El programa DeepView (Guex y Peitsch, 1997, Electrophoresis 18: 2714-2723) fue usado para introducir mutaciones virtuales y para todas las otras manipulaciones de estructura y minimización de energía. La estructura de referencia usada para la celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei fue PDB: 7CEL (Divne et al, 1994, Science
265: 524-528 ; Stahlberg et al, 1996, 264:337-349). Sobre la base de las comparaciones, se priorizaron las mutaciones potenciales para celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei según la probabilidad que éstas crearían una interacción estabilizante nueva (par iónico y/o enlace H) y también la probabilidad de incidencia en las secuencias y las estructuras de celobiohidrolasa I Cel7A de los hongos termofílicos Chaetomium termofilum y Humicola insolens y su ausencia en el hongo mesofílico Neurospora crassa.
[0390] Una de las sustituciones de aminoácidos sugeridas fue un cambio de glicina en la posición 205 a arginina. La variante G205R fue racionalmente diseñada para introducir par de ión con E190 y E239. Para generar la sustitución G205R, el gen de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei fue subclonado en el vector de Aspergillus oryzae pAILo02 digerido con Nco I y Pac I para formar una conjunción perfecta con el ATG del gen y el promotor de alfaamilasa de Aspergillus oryzae y la secuencia del terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger. La subclonación del gen de celobiohidrolasa I Cel7A en pAILo2 fue realizada diseñando dos cebadores, mostrados más abajo, que permitieron la clonación los sitios Nco I y Pac I. El cebador TR0221.7: 5'-GCAACATGTATCGGAAGTTGGC-3' (SEC ID N.°: 18) incorporó un sitio BspLU II, que fue compatible con el sitio Nco I en pAILo2, al extremo 5' de la celobiohidrolasa I Cel7A y el cebador cTR0221.7a: 5'-AATTAATTTTACAGGCACTGAG-3' (SEC ID N.°: 19) incorporó un sitio BspLU II sitio en el extremo 3'.
[0391] La amplificación del gen de celobiohidrolasa I Cel7A fue realizada usando tampón tampón de reacción de polimerasa 1X Tgo (Boehringer Mannheim Co, Indianapolis, IN), 25 ng de pTR0221, 0,2 mM cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 50 pmol de cada cebador (cTR0221.7 y cTR0221.7a) y 1 unidad de polimerasa Tgo (Boehringer Mannheim Co, Indianapolis, IN). Las reacciones fueron incubadas usando un termociclador MJ Research programado para un ciclo a 95° C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos cada uno a 94° C durante 60 segundos, 55° C durante 45 segundos y72° C durante 2 minutos. Las reacciones fueron luego incubadas a 72° C para un extensión de 5 minutos. Una alícuota de cada producto de PCR fue realizada en un gel de agarosa al 0,7% usando tampón TAE generando bandas previstas de aproximadamente 1545 pares de bases. El producto de PCR de 1545 pares de bases fue subclonado usando un equipo de clonación PCR4 blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue digerido con BspLU II y Pac I y fraccionado en un gel de agarosa al 0,7% usando tampón TAE generando una secuencia codificante prevista de 1,5 kb, que fue cortado y purificado en gel usando una columna Ultra-free DA Amicon (Millipore, Billerica, MA). El fragmento resultante fue posteriormente ligado en pAILo2, que fue digerido de forma similar, para generar el vector de expresión designado pCW026 (Figura 6) con el gen de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei.
[0392] Trabajando desde plásmido inicial pCW026, la variante G205R se obtuvo mediante mutación de una guanosina a citidina en la base 664 de la secuencia codificante de celobiohidrolasa I Cel7A, usando un Equipo de mutagénesis dirigida de cambio rápido (Stratagene, La Jolla, CA) con pCW026 como el modelo. Los cebadores usados para incorporar esta mutación fueron el cebador G205R.1 y el cebador G205R.1a que se muestran a continuación:
G205R. 1:
5'-GAACACGGGCATTGGACGACACGGAAGCTGCTG-3' (SEC ID N.°: 20)
G205R.1a:
5'-CAGCAGCTTCCGTGTCGTCCAATGCCCGTGTTC-3' (SEC ID N.°: 21)
El vector de expresión resultante fue designado pNP776G205R (Figura 7).
Ejemplo 10: Selección de bibliotecas de celobiohidrolasa I Cel7A
[0393] Las bibliotecas de celobiohidrolasa I Cel7A primarias fueron extendidas en medio de selección de levadura de agar en Genetix Qtrays (placas de Petri de 22 x 22 cm, Genetics Ltd., Hampshire, Reino Unido) e incubadas durante 5
días a 30º C. Usando un Genetix QPix (Genetix Ltd., Hampshire, Reino Unido), las colonias fueron escogidas en placas de 96 pocillos con medio de selección de levadura. Las placas fueron incubadas durante 7 días a 30º C. Usando un robot ORCA (Beckman Coulter, Fullerton, CA), las placas de crecimiento fueron transportadas a un Biomek Fx (Beckman Coulter, Fullerton, CA) y las muestras de caldo fueron quitadas de la placa de crecimiento y divididas en 5 partes alícuotas en dos placas de 96 pocillos de policarbonato de fondo en V. El sustrato 4-metilumbeliferil-beta-Dlactosida de celobiohidrolasa I (MUL, Marker Gene Tech. Inc., Eugene, OR) se añadió a cada placa de 96 pocillos de fondo en V a una concentración final de 0,2, 0,1 o 0,05 mg de 4-metilumbeliferil-beta-D-lactosida por ml, 0,1 M de succinato pH 5,0 yTween-20 al 0,01%. Las placas de ensayo fueron transferidas a un incubador de temperatura controlada, donde una placa fue incubada a 50° C durante 45 minutos y otra fue incubada a una temperatura 10 predeterminada, entre 62° C y 65° C durante 45 minutos. Después esta incubación, las placas fueron enfriadas a 4° C durante 1 minuto y luego fueron transferidas al Biomek Fx donde los ensayos fueron detenidos por adición de Tris-Cl, pH 9,5 a una concentración final de 0,75 M. Las muestras de reacción detenida fueron diluidas en agua y la fluorescencia de 4-metilumbeliferil liberada por hidrólisis de celobiohidrolasa I Cel7A de 4-metilumbeliferil-beta-Dlactosida se midió usando un fluorómetro BMG FLUOStar Galaxy (Defenburg; Alemania) (excitación a 360 nm, emisión 15 a 460 nm). El índice de la fluorescencia de la placa tratada a alta temperatura (quot;actividad a alta temperatura”) fue comparada con la fluorescencia de las mismas muestras incubadas a 50° C (quot;actividad a baja temperatura”), usando Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) para determinar el índice de actividad térmica relativo para cada variante. Sobre la base de los índices de actividad térmica, la selección de bibliotecas construidas en el Ejemplo 7 y el Ejemplo 9 generó las variantes presentadas en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra el grado de mejora para variantes nuevas 20 de celobiohidrolasa I Cel7A según la medición por evaluación del índice de actividad térmica de la actividad a 64° C en relación con la actividad a 50° C. Para los mutantes obtenidos en la pantalla primaria, las mejoras varían de mejoras 2,60 veces superiores a 10,20 veces superiores en relación a la enzima de tipo salvaje. Para los mutantes obtenidos de redistribución, la mejora observada fue actividad térmica 12,40 veces a 19,20 veces mejor que la enzima de tipo salvaje.
25 Tabla 1. Variantes de Cel7A con termoestabilidad y actividad térmica mejoradas. quot;Relación de mejoraquot; indica la mejora relativa en el índice de actividad térmica, medida a 64° C/50° C.
Variante de Cel7A
Sustituciones de aminoácidos* Relación de mejora
Tipo salvaje
ninguna 1
G205R
G205R 2,60
776-M1
T226A 6,20
776-M3
P227A, C486W 7,80
776-M4776-M21
S113N, S196T, T462A N301S, E337V 6,00 4,00
776-M22
S196P,T350S 1,60
776-M23
G22D, G467S 1,40
776-M26
S21P, S57N 3,80
776-M27
S411F 7,60
776-M30
T41I 2,60
776-M32
K157R, G205R, T255P 5,20
776-M35
G205R, S411F 8,40
776-M40
G205R, P227A 10,20
776-M41
G205R, H206Y 3,40
776-M42
S8P, G205R 4,60
776-M52
G94S, G205R 4,00
776-M53
S196P, G205R 4,80
776-M57
S113N, S196T, P227A, T462A 14,60
776-M65
S57N 5,00
776-M71
T383A, T455A 2,60
776-M73
N373H 4,80
776-M101
S113N, S411F 12,40
776-M108
T41I, E193K, S411F 15,60
776-M109
N49S, S113N, P227A, P438L 15,00
776-M124
Y247C, Y371C, S411F 17,40
776-M125
S21P, S57N, T246I, R251K, S411F 18,00
776-M192
K157R, G205R, T255P, S411F 15,00
776-M216
S113N, S196T, P227A, S411F 17,80
776-M252
S113N, S196T, P227A, T356I, T462A 19,20
*La numeración utiliza el primer residuo de la enzima Cel7A madura como posición 1.
Ejemplo 11: Secuenciación de ADN de las variantes
[0394] Para determinar la secuencia de las variantes de celobiohidrolasa I Cel7A derivadas de las bibliotecas de los Ejemplos 7 y 9, se aisló ADN plásmido. Cada variante fue estriada sobre medio de selección de levadura de agar e incubada durante 3-5 días a 30° C. Ocho colonias fueron aisladas e inoculadas en 1 ml de medio de selección de levadura, y cultivadas durante 5-8 días a 30° C. Las placas de agar fueron recultivadas a 30° C durante 3-5 días. El caldo de cultivo de las colonias individuales de cada variante fue evaluada en relación a la actividad térmica mejorada de la variante de celobiohidrolasa I Cel7A como se describe en el Ejemplo 10 para determinar cuáles tuvieron índices de actividad térmica mejorada en relación a la celobiohidrolasa I Cel7A de tipo salvaje (ts). El plásmido fue rescatado de las colonias que produjeron variantes de celobiohidrolasa I Cel7A con actividad térmica mejorada como describen Kaiser y Auer, 1993, BioTechniques 14: 552, usando la cepa de E. coli XL-10 (Stratagene Inc., La Jolla, CA).
[0395] La secuenciación del ADN fue realizada usando un secuenciador ABI 3700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando química de terminador de tinte (Giesecke et al., 1992, Journal de Virol. Methods 38: 47-60 ). El ADN plásmido para secuenciación fue preparado usando un Biorobot 9604, (QIAGEN Valencia, CA). La región de codificación entera para variante de celobiohidrolasa I Cel7A de Trichoderma reesei fue ordenada usando 0,5 μl de ADN plásmido y 3,2 pmol de los siguientes cebadores:
cTr0221.1: 5'-CTTCTTGGCCACAGCTCGTG-3' (SEC ID N.°: 22)
cTr0221.2: 5'-GGCTTTGTCACCCAGTCTGC-3' (SEC ID N.°: 23)
cTr0221.3: 5'-CGTCATCCAACAACGCGAAC-3' (SEC ID N.°: 24)
cTr0221.4: 5'-TTCGAGACGTCGGGTGCCAT-3' (SEC ID N.°: 25)
cTr0221.4: 5'-CGCGGAAGCTGCTCCACCAG-3' (SEC ID N.°: 26)
cTr0221.1A: 5'-AATGGAGAGGCTGTTACCGC-3' (SEC ID N.°: 27)
Los ficheros de registro de secuencia fueron editados usando el Vector NTI Contig Express (Informax, Inc., Bethesda, MD).
Ejemplo 12: Generación de bibliotecas con tendencia a error usando genes de celobiohidrolasa I Cel7A variante como modelos
[0396] Se realizó la mutagénesis aleatoria de varias de las variantes mejoradas. Se utilizó ADN plásmido que había sido rescatado de la levadura como se describe en el Ejemplo 10, y se realizó PCR con tendencia al error como se describe en el ejemplo 7. Además, la variante G205R fue mutagenizada usando pNP776G205R como un modelo en PCR con tendencia al error. Los siguientes cebadores fueron usados para generar secuencias mutagenizadas:
Cebador aGal_776.1:
Cebador aGal_776.1a:
[0397] Las amplificaciones de PCR con tendencia al error fueron analizadas en geles de agarosa al 0,7% usando tampón de TAE y transformadas con vector pJC106 escindido en Saccharomyces cerevisiae como se describe en el Ejemplo 7.
[0398] Las variantes 76-M35,776-M40,776-M41,776-M42,776-M52, y 776-M53 fueron obtenidas de bibliotecas de selección creadas por amplificación con tendencia al error del modelo G205R. La variante 776-252 fue derivada de una biblioteca creada por amplificación mutagénica de la variante 776-M57. El ADN de estas variantes fue rescatado y ordenado como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 13: Bibliotecas redistribuidas de celobiohidrolasa I Cel7A
[0399] Para redistribuir las variantes de celobiohidrolasa I Cel7A derivadas de mutagénesis de celobiohidrolasa I Cel7A de tipo salvaje y modelos G205R, el ADN plásmido fue aislado de las variantes como se describe en el ejemplo 10. Los genes de celobiohidrolasa I Cel7A fueron amplificados de las variantes usando los siguientes cebadores:
Cebador CiPpcrdwn:
5'-CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGA-3' (SEC ID N.°: 30)
Cebador cJC106.1A:
5'-GCGTACACGCGTCTGTACA-3' (SEC ID N.°: 31)
[0400] Cada reacción de amplificación (50 μl) fue compuesta por tampón 1X PCR, 0,2 mM de dNTPs, 3,2 pM de cebador aGal_776.1, 3,2 pM de cebador aGal_776.1A, aproximadamente 100 ng de pTr0221, y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programado durante 1 ciclo a 94° C durante 3 minutos seguidos de 30 ciclos cada uno a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos, y 72° C durante 90 segundos (extensión final de 5 minutos). Los productos de PCR luego fueron purificados usando un equipo de PCR QIAquick según las instrucciones del fabricante.
[0401] Para redistribución de las variantes de celobiohidrolasa I Cel7A, los productos de PCR de los genes de las variantes amplificadas fueron combinados con aproximadamente 50 ng de pJC016 digeridos con BamH I y Xho I, y 100200 ng de fragmentos surtidos de PCR fueron cotransformados en Saccharomyces cerevisiae YNG 344 después del protocolo de transformación de levadura YEASTMAKER para generar bibliotecas redistribuidas, como se describe en el ejemplo 7. Se generó un gran número de bibliotecas redistribuidas. El número total de variantes incluidas en una biblioteca única fue de dos a diez. El porcentaje de variantes activas en estas bibliotecas varió de 87% a 94%, según la actividad a 50° C determinada en el ensayo de 4-metllumbeliferil-beta- D-lactosidadescrito en ejemplo 9. Ya que la Taq ADN polimerasa usada tiene baja actividad de corrección, el proceso de redistribución puede tener nuevas mutaciones introducidas en la secuencia codificante de celobiohidrolasa I Cel7A.
[0402] Las colonias de las bibliotecas redistribuidas fueron escogidas y seleccionadas como se describe en el Ejemplo 9, usando una comparación de actividad a 64° C con la actividad a 50° C usando 4-metilumbeliferil-beta-D-lactosida como sustrato para valorar el grado de termoestabilidad y actividad térmica mejoradas de cada variante.
[0403] La selección de las bibliotecas redistribuidas dio como resultado el aislamiento de variantes mejoradas, designadas 776-M57,776- M101,776-M108,776-M109,776-M124,776-M125,776-M192 y 776-M216. El ADN de estas variantes fue rescatado y ordenado como se describe en el Ejemplo 10. Algunas de las sustituciones identificaciones por secuenciación del ADN de las variantes 776- M57,776-M 101,776-M108,776-M109,776-M124,776-M125,776-M 192 y 776-M216 contienen sustituciones previamente identificadas por secuenciación de los mutantes de bibliotecas con tendencia al error. Por ejemplo, 776-M57 contuvo la mutación S113N que también fue encontrada en un progenitor (776-M4) de la biblioteca redistribuida de la cual fue derivada Asimismo, 776-M101 contuvo S411F, una sustitución encontrada en uno de los progenitores (776-M27) de la biblioteca redistribuida de la cual fue era obtenida. Otras sustituciones encontradas en las variantes derivadas de bibliotecas redistribuidas, incluidas N49S, E193K, R251K, T246I, Y247C, Y371C y P438L, no fueron observadas en las variantes ordenadas que comprendieron las variantes progenitoras para las bibliotecas redistribuidas correspondientes. Estas mutaciones pueden haber sido introducidas por un evento de mutagénesis mediada por PCR durante la amplificación del ADN variante durante la construcción de las bibliotecas redistribuidas.
Ejemplo 14: Mutagénesis de saturación específica de sitio
[0404] Para seleccionar la sustitución óptima para actividad térmica mejorada en posiciones específicas en celobiohidrolasa I Cel7A, se realizó aleatorización específica de sitio. Los aminoácidos G94; S196 y P227 fueron aleatorizados por sustitución del codón de tipo salvaje con NN (G/C) usando PCR megacebador (Landt, et al., 1990 Gene 96: 125-128 ). Se realizó aleatorización en las tres posiciones usando los siguientes cebadores:
Aleatorización en la posición 94: Cebador aTrCBHI.2: 5'-GCGGTAACAGCCTCTCCATTNNSTTTGTCAC-3' (SEC ID N.°: 32) Cebador aTrCBHI.2a: 5'-CTGCGCAGACTGGGTGACAAASNNAATGGAGAG-3' (SEC ID N.°: 33) Aleatorización en la posición 196: Cebador aTrCBHI.3: 5'-CCATCTCCGAGGCTCTTACCNNSCACCCTTGC-3' (SEC ID N.°: 34) Cebador aTrCBHI.3a: 5'-GGCCGACAGTCGTGCAAGGGTGSNNGGTAAGAG-3' (SEC ID N.°: 35) Aleatorización en la posición 227: Cebador aTrCBHIR.1: 5'-GAGGGCTGGGAGCCGTCANNSAACAACGCG-3' (SEC ID N.°: 36) Cebador aTrCBHI.1bA: 5'-CCAATGCCCGTGTTCGCGTTGTTSNNTGACGGC-3' (SEC ID N.°: 37)
[0405] Cada reacción de amplificación (50 μl) fue compuesta por tampón 1X PCR, 0,2 mM de dNTPs, 3,2 pM de cebador de sentido, 3,2 pM de cebador antisentido, aproximadamente 100 ng de pTr0221 y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programado durante 1 ciclo a 95° C durante 3 minutos seguidos de 30 ciclos cada uno a 95° C durante 30 segundos, 55° C durante 60 segundos, y 72° C durante 90 segundos (extensión final de 5 minutos). Los productos de PCR luego fueron purificados usando un equipo de PCR QIAquick según las instrucciones del fabricante. Cada fragmento de PCR generado para las mutaciones de sitio
individuales sirvieron como megacebadores para la reacción de amplificación de extensión de superposición para generar un fragmento de gen completo de celobiohidrolasa I Cel7A, con mutaciones específicas de sitio indicadas, para generación de biblioteca Los primeros 5 ciclos de la reacción de amplificación fueron compuestos por tampón 1X PCR, 0,2 mM de dNTPs, 100 ng de megacebador de sentido (5'), 100 ng de megacebador antisentido (3') y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programadas durante 1 ciclo a 95° C durante 3 minutos seguidos de 5 ciclos cada uno a 95° C durante 30 segundos, 55° C durante 60 segundos y 72° C durante 90 segundos. A esta reacción, se agregaron 50 pmol de cebador aGal776.1 y aGal776.1A para amplificar el fragmento aleatorizado de sitio recién generado en la reacción de 5 ciclos precedente. Las reacciones después de la adición de los nuevos cebadores fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 programado durante 30 ciclos cada uno a 95° C durante 30 segundos, 55° C durante 60 segundos y 72° C durante 90 segundos (extensión final de 5 minutos). Los fragmentos de la PCR resultantes luego fueron purificados usando un equipo de PCR QIAquick según las instrucciones del fabricante. El fragmento de PCR final luego fue transformado directamente en la levadura junto con el plásmido pJC106 escindido con BamH I y Xho I (Ejemplo 6).
[0406] Ya que la Taq ADN polimerasa usada tiene baja actividad de corrección, el proceso de mutagénesis de saturación puede haber introducido mutaciones nuevas en la secuencia codificante además de los cambios diseñados en las posiciones 94, 196 y 227. Las bibliotecas que contienen aminoácidos aleatorizados específicos de sitio fueron seleccionadas como se describe en el ejemplo 10. Como se muestra en la tabla 2, varias sustituciones que mejoraron el índice de actividad térmica a 63° C/50° C en relación con el tipo salvaje fueron descubiertos además de las sustituciones identificadas mediante selección de bibliotecas mutagenizadas aleatoriamente. Por ejemplo, la variante 776-M3 se obtuvo de la selección de una biblioteca primaria, donde una prolina en la posición 227 fue convertida a una alanina. En la selección de la biblioteca aleatorizada específica de sitio en esta posición, se identificaron sustituciones a leucina y a glicina al igual que alanina.
[00407] Además de descubrir las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 227, 94, y 196, que confieren termoestabilidad y actividad mejoradas, se identificó una segunda mutación de sitio que podría mejorar la actividad térmica. Específicamente, la sustitución D259N fue identificada en la variante 776-M273 como se muestra en tabla 2.
Tabla 2, variantes de Cel7A con termoestabilidad mejorada que contiene sustituciones en las posiciones 227, 94 y 196. quot;Relación de mejoraquot; indica la mejora relativa en el índice de actividad térmica, medida a 63° C/50° C.
Variante de Cel7A
Sustitución de aminoácidos* Relación de mejora Tipo de librería
Tipo salvaje
ninguna 1 ninguna
776-M3
P227A, C486W 2,67 primaria
776-M259
P227L 1,50 Aleatoriación específica de sitio en 227
776-M273
P227G, D259N 3,00 Aleatoriación específica de sitio en 227
776-M274
P227A 2.67 Aleatoriación específica de sitio en 227
776-M275
P227L 2,00 Aleatoriación específica de sitio en 227
776-M52
G94S, G205R 2,00 primaria
776-M268
G94A, T226A 2,67 Aleatoriación específica de sitio 94
776-M264
G94R 2,07 Aleatoriación específica de sitio en 94
776-M266
G94Q 2,17 Aleatoriación específica de sitio en 94
776-M269
G94A 2,03 Aleatoriación específica de sitio en 94
776-M53
S196P, G205R 1,50 primaria
776-M4
S113N, S196T, T462A n.a. primaria
776-M261
S196P 1,33 Aleatoriación específica de sitio en 196
776-M263
T41I, S196F 1,67 Aleatoriación específica de sitio en 196
*La numeración utiliza el primer residuo de la enzima Cel7A madura como posición 1.

Ejemplo 15: Construcción de los vectores de expresión pMJ04, pMJ06 y pMJ09
[0408] El vector de expresión pMJ04 fue construido por PCR amplificando el terminador del gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) de Trichoderma reesei de ADN genómico de Trichoderma reesei RutC30 usando cebadores 993429 (antisentido) y 993428 (sentido) mostrados más abajo. El cebador de antisentido fue creado genéticamente para que tuviera un sitio Pac I en el extremo 5' y un sitio Spe I en el extremo 3' del cebador de sentido.
Cebador 993429 (antisentido): 5'-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3' (SEC ID N.°: 38) Cebador 993428 (sentido): 5'-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3' (SEC ID N.°: 39)
[0409] El ADN genómico de Trichoderma reesei RutC30 fue aislado usando un equipo DNeasy Plant Maxi (QIAGEN, Valencia, CA). Las reacciones de amplificación (50 !l) fueron compuestas por tampón de reacción 1X TermoPol (New England Biolabs, Beverly, MA), 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de ADN genómico de Trichoderma reesel RutC30, 0,3 !M de cebador 993429, 0,3 !M de cebador 993428 y 2 unidades de Vent polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MA). Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 5 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94º C, 30 segundos a 50º C, y 60 segundos a 72º C, seguidos de 25 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94 º C, 30 segundos a 65º C y 120 segundos a 72º C (final extensión de 5 minutos). Los productos reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de 229 pares de bases fue cortada del gel y purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
[0410] El fragmento de PCR resultante fue digerido con PacI y SpeI y fue ligado en pAlLo01 (Ejemplo 8) digerido con las mismas enzimas de restricción usando un equipo Rapid Ligation Kit (Roche, Indianapolis, IN), para generar pMJ04 (Figura 8).
[0411] El vector de expresión pMJ06 fue construido por PCR amplificando el terminador del gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) Cel7A de Trichoderma reesei de ADN genómico de Trichoderma reesei RutC30 usando cebadores 993696 (antisentido) y 993695 (sentido) mostrados más abajo. El cebador de antisentido fue creado genéticamente para que tuviera un sitio Sal en el extremo 5' del cebador de sentido y un sitio Nco I en el extremo 5' del cebador de antisentido.
Cebador 993695 (sentido):
5'- ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3' (SEC ID N.°: 40)
Cebador 993696 (antisentido):
5'- TGACCATGGTGCGCAGTCC-3' (SEC ID N.°: 41)
[0412] Las reacciones de amplificación (50 !l) fueron compuestas por tampón de reacción 1X TermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de ADN genómico de Trichoderma reesel RutC30 (que se preparó usando un equipo DNeasy Plant Maxi), 0,3 !M de cebador 993696, 0,3 !M de cebador 993695 y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94° C, 30 segundos a 55° C y 60 segundos a 72° C (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de 988 pares de bases fue cortada del gel y purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick según las instrucciones del fabricante.
[0413] El fragmento de PCR resultante fue digerido con Nco I y Sal I y fue ligado en pMJ04 digerido con las mismas enzimas de restricción usando un equipo Rapid Ligation Kit para generar pMJ06 (Figura 9).
[0414] El vector de expresión pMJ09 fue construido por PCR amplificando el terminador del gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) Cel7A de Trichoderma reesei de ADN genómico de Trichoderma reesei RutC30 usando cebadores 993843 (antisentido) y 999344 (sentido) mostrados más abajo. El cebador de antisentido fue creado genéticamente para que tuviera un sitio Pac I y un sitio Spe I en el extremo 5' y un sitio Pvu I en el extremo 5' del cebador de sentido.
Cebador 993844 (sentido):
5'-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3' (SEC ID N.°: 42)
Cebador 993843 (antisentido):
5'-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3' (SEC ID N.°: 43)
[0415] Las reacciones de amplificación (50 !l) fueron compuestas por tampón de reacción 1X TermoPol, 0,3 mM de dNTPs, 100 ng de ADN genómico de Trichoderma reesel RutC30 (que se preparó usando un equipo DNeasy Plant Maxi), 0,3 !M de cebador 993844, 0,3 !M de cebador 993843 y 2 unidades de Vent polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercycler 5333 programado de la siguiente manera: 30 ciclos cada uno durante 30 segundos a 94° C, 30 segundos a 55° C y 60 segundos a 72° C (extensión final de 15 minutos). Los productos reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón TAE donde una banda de producto de 473 pares de bases fue cortada del gel y purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick según las instrucciones del fabricante.
[0416] El fragmento de PCR resultante fue digerido con Pvu I y Spe I y fue ligado en pMJ06 digerido con lPac I y Spe I usando un equipo Rapid Ligation Kit para generar pMJ09 (Figura 10).
Ejemplo 16: Construcción de pCW045 para la expresión de la variante 776-M57 en Trichoderma reesei
[0417] La variante 776-M57 fue subclonada en el vector de expresión de Trichoderma reesei pMJ09 usando un equipo de clonación de PCR In-Fusion (BD Biosciences, Clonetech, Palo Alto, CA). La amplificación de PCR de las variantes fue realizada usando ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las amplificaciones estuvieron compuestas por tampón de amplificación 1X Pfx, 0.3 mM cada una de dCTP, dATP, dTTP y dGTP; 1 mM de MgSO4, 1
pmol de cebador IF-F1, 1 pmol de cebador IF-R1, 50-100 ng de DNA modelo 776-57 y 1 unidad de polimerasa Pfx. Las reacciones fueron incubadas usando un termociclador MJ Research programado para un ciclo a 95° C durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos cada uno a 95° C durante 15 segundos, 55° C durante 30 segundos y 68° C durante 2 minutos 30 segundos. Las reacciones fueron luego incubadas a 72° C para una extensión de 7 minutos.
Cebador IF-F1: 5'-CGCGGACTGCGCACCATGTATCGGAAGTTG-3' (SEC ID N.°: 44) Cebador IF-R1: 5'-CGCCACGGAGCTTAATTACAGGCACTGAGA-3' (SEC ID N.°: 45)
[0418] Una alícuota de cada producto de PCR fue realizada en un gel de agarosa al 0,7% usando tampón TAE, tal y como se describe anteriormente, generando bandas previstas de aproximadamente 1.575 pares de bases. Las reacciones de PCR fueron purificadas usando un equipo de purificación de PCR MiniElute y con eluido del ADN en 50 μl de tampón EB. Se estimó que el rendimiento de cada producto de PCR fue 125 ng por microlitros por visualización en un gel de agarosa al 0,07% usando tampón de TAE.
[0419] El plásmido pMJ09 digerido con Pac I y despuntado en el sitio Nco I fue purificado usando una columna QIAquick Minielute (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). El plásmido tuvo una concentración de 100 ng por microlitro. La concentración fue verificada por visualización en un gel de agarosa al 0,07% usando tampón de TAE. La clonación del producto de PCR 776-M57 anteriormente descrito y el vector pMJ09 digerido fue realizada usando un equipo de clonación de PCR In-Fusion (BD Biosciences, Clonetech, Palo Alto, CA). El vector de expresión Trichoderma reesei con la variante 776-M57 fue designado pCW045 (Figura 11).
Ejemplo 17: Expresión de celobiohidrolasa I Cel7A en Trichoderma reesei como la única celobiohidrolasa I
[0420] Para evaluar la variante 776-M57 como la única celobiohidrolasa I después de la expresión en el huésped nativo, una cepa de Trichoderma reesei fue construida caracterizada por el hecho de que el gen de celobiohidrolasa I Cel7A, cbh1, fue interrumpido. Una cassette de interrupción fue construida usando el gen de resistencia de higromicina (hph) de Escherichia coli como un marcador seleccionable. El marcador de hph fue flanqueadao por secuencia homóloga de cbh1 para concentrarse en el gen cbh1 nativo.
[0421] La amplificación del gen cbhI genómico fue hecha usando el método de reacción en cadena de polimerasa con PWO polimerasa (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333. Las amplificaciones fueron compuestas por tampón de amplificación 1X PWO, 0,3 mM cada uno de dCTP, dATP, dTTP y dGTP, 1 mM de MgSO4, 1 pmol cada uno de cebador cbh1 N-término y cbh1 C-término descritos
más abajo, y 50-100 ng de molde de ADN. Las amplificaciones han utilizado una desnaturalización inicial de 2 minutos a 95° C seguidas de 35 ciclos de una desnaturalización de 1 minuto, fijado de 2 minutos a 55° C y una extensión de 2 minutos a 68° C.
Cebador cbh1 N-término: 5'-GCC TTC GGC CTT TGG GTG TA-3' (SEC ID N.°: 46) Cebador cbh1 C-término: 5'-GAG CGG CGA TTC TAC GGG TT-3' (SEC ID N.°: 47)
[0422] El fragmento de PCR de 2,3 kb fue clonado usando el equipo de clonación ZeroBlunt TOPO PCR (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y propagado en las células E. coli Top10 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). El constructo resultante fue un plásmido de 5,8 kb designado pSTM01 (Figura 12).
[0423] El gen de hph fue amplificado del plásmido del PHT1 (Cummings, et al., 1999, Curr. Genet. 36: 371-382 ) usando el método de reacción en cadena de polimerasa con PWO polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333 y fueron compuestas por tampón de amplificación 1X PWO, 0,3 mM cada uno de dCTP, dATP, dTTP y dGTP, 1 mM de MgSO4, 1 pmol cada uno de cebador hph N-término y hph C-término descritos más
abajo, y 50-100 ng de molde de ADN. Las amplificaciones utilizaron una desnaturalización inicial de 2 minutos a 95° C seguidas de 35 ciclos de una desnaturalización de 1 minuto, fijado de 2 minutos a 55° C y una extensión de 2 minutos a 68° C.
Cebador hph N-término: 5'-GCC GCG GCA CGC GCC ACA CGG AAA AT-3' (SEC ID N.°: 48)
Cebador hph C-término 5'-GAC CGG TCG CAA AAT GAC AAA TAG AAG-3' (SEC ID N.°: 49)
[0424] Para generar una cassette de interrupción de cbh1, pSTM01 fue digerido con Mlu I y BstE II para crear un espacio de 1,1 kb en la secuencia codificadora de cbhI. Luego se utilizó T4 ADN polimerasa (New England Biolabs, Beverly, MApara llenar y generar extremos romos en el plásmido digerido. La reacción de T4 fue incubada durante 20 minutos a 15° C seguida de una inactivación por calor durante 15 minutos a 65° C. La mezcla de reacción entera fue fraccionada en un gel de agarosa al 1% usando tampón de TAE, y la banda mayor fue cortada y eluida del gel que usando un equipo de extracción de gel Qiaquick. El gen de hph de 1,7 kb luego fue insertado en el vector pSTM01 escindido usando un Equipo de ligamiento de ADN rápido y transformado en células competentes One Shot E. coli (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue designado pSMKO3 (Figura 13). [0425] Usando pSMKO3 como un modelo, el ADN cbhI fue amplificado usando cebadores de PCR flanqueando el gen de hph. Un fragmento de 2,7 kb fue amplificado de pSMKO3 usando los siguientes cebadores:
Cebador pSMK03-F1: 5'-GCTCCGGGCAAATGCAAA GTG TG-3' (SEC ID N.°: 50) Cebador pSMK03-R1: 5'-AGCAGGCCGCATCTCCAGTGAAAG-3' (SEC ID N.°: 51)
[0426] La amplificación fue realizada usando el método de reacción en cadena de polimerasa con PWO polimerasa. Las reacciones fueron incubadas en un Eppendorf Mastercicler 5333, y fueron compuestas por tampón de amplificación 1X PWO, 0.3 mM cada uno de dCTP, dATP, dTTP y dGTP, 1 mM de MgSO4, 1 pmol cada uno de cebador KO N-término y
KO C-término anteriormente descrito, y 50-100 ng de molde de ADN. Las amplificaciones han utilizado una desnaturalización inicial de 2 minutos a 95° C seguidas de 35 ciclos de una desnaturalización de 1 minuto, fijado de 2 minutos a 55° C y una extensión de 2 minutos a 68° C. El fragmento de ADN resultante ha contuvo 639 kb del secuencia del promotor/gen de cbhI, los 1,7 kb de la región de codificación de hph, y 659 bases de la secuencia del gen/terminador de cbhl.
[0427] Los protoplastos de Trichoderma reesei RutC30 fueron preparados para transformación por el siguiente método. Los frascos de agitación con 25 ml de medio YPD fueron inoculados con 5X107 conidia. Después de una incubación durante toda la noche (aproximadamente 18 horas) a 34° C (150 r.p.m.), los micelios fueron recogidos por filtración a través de Miracloth™ estéril (Calbiochem, San Diego, CA) y transferidos a 20 mg/ml Glucanex (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y 1,6 mg/ml de quitinasa (Sigma-Aldrich, St. Luis, MO) en 25 ml de 1 M de sorbitol. Las digestiones fueron típicamente 25-40 minutos con agitación suave (80- 100 r.p.m.) a 34° C. Los protoplastos luego fueron filtrados a través de un filtro de gasa y lavados con 1 M de sorbitol helado y luego centrifugados a 400 x g durante 8 minutos. Los protoplastos fueron lavados dos veces con 25 ml de 1 M de sorbitol y dos veces con 25 ml de 1 M de sorbitol, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2. Los protoplastos luego fueron contados usando un haemacitómetroy resuspendidos en una solución compuesta por 7 partes de 1 M de sorbitol, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2 y 2 partes de PEG-4000 al 50%, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2 a una concentración de
1 X 108 protoplastos/ml. Los protoplastos fueron usados inmediatamente o almacenados a -80° C en un congelador de índice controlado (Nalge Nunc international, Rochester, NY) hasta la transformación.
[0428] La transformación de los protoplastos fue realizada usando 5 μg de ADN lineal y 5 μl de heparina (5 mg/ml), que fueron mezclados e incubados en hielo durante 5 minutos. Cien microlitros de protoplastos luego fueron adicionados y la mezcla fue incubada durante 15 minutos en hielo. Quinientos microlitros de PEG-4000 al 50%,50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2 luego fue adicionado e incubado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Un mililitro de de PEG-4000 al 50%, 50 mM de Tris- HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2 se añadió a la mezcla y se incubó a 34° C durante 20
minutos. Después de la incubación a 34° C, se añadieron 2 ml de 1 M de sorbitol, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de CaCl2. El contenido fue suavemente mezclado antes de extender 350 μl de la mezcla de protoplasto en placas de PDA. Las placas fueron incubadas a 29° C durante aproximadamente 18 horas antes de cubrir con 100 μg/ml de higromicina B (Roche Applied Science, Manheim, Alemania) en el medio PDA: Los transformantes aparecidos dentro de 3 días de la cubierta de higromicina. Los transformantes luego fueron subcultivados a placas de PDA con 100 μg/ml de higromicina
B. Los transformantes que crecieron en las placas secundarias luego fueron usados para inoculación en la medio de inducción de celulasa (CIM).
[0429] Las cepas fueron seleccionadas para interrupción de celobiohidrolasa I por el siguiente método. Los transformantes fueron cultivados en el medio de inducción de celulasa en placas de cultivo de 24 pocillos (Coming, Acton, MA) durante 3 días a 34° C. Se añadieron diez microlitros de caldo de cultivo a 10 μl de tampón de muestra 2X más beta-mercaptoetanol al 1% y ejecutadas en un gel de acrilamida de tris-glicina al 8-16% (NUPAGE Novex Gels Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) usando tampón de migración de SDS NuPAGE® MES (NUPAGE Novex Gels Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Inactivaciones potenciales fueron seleccionadas basadas en ausencia de una banda de proteína celobiohidrolasa Cel7A en comparación con la cepa progenitora [0430] Para confirmar la eliminación del gen cbh1 en cepas candidatas que fueron seleccionadas por análisis SDS-PAGE, se realizó el análisis Southern para evaluar si el gen cbh1 había sido interrumpido. Los micelios fueron cultivados durante toda la noche en frascos de agitación con 25 ml de medio YPD. Los micelios fueron luego cosechados, filtrados y molido usando un mortero y mano de mortero con nitrógeno líquido. El ADN genómico fue aislado usando un equipo DNeasi Plant Maxi. Un microgramo de ADN fue digerido con Hind III o Nde I y ejecutado en un gel de agarosa al 0,8% gel de agarosa en tampón de TAE. El ADN fue fragmentado en el gel por tratamiento con 0,25 M de HCl, desnaturalizado con 0.5 M de NaOH, 1,5 M de NaCl, y neutralizado con 1 M de Tris, pH 8,0, 1,5 M de NaCl para transferencia posterior en 10X SSC para membrana Nitran Plus (Schleicher y Schuell BioScience, GmbH, Dassel, Alemania). El ADN fue entrecruzado en UV a la membrana y prehibridizado durante 1 hora a 60° C en 20 ml de DIG Easy Hyb (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). [0431] Dos sondas fueron preparadas para análisis de Southern. Una sonda de higromicina de 1,7 kb fue amplificada de pSMK03, usando cadena de reacción de polimerasa y los siguientes cebadores:
Cebador cpht-p: 5'-GCACGCGCCACACGGAAAAT-3' (SEC ID N.°: 52) Cebador cpht-t: 5'-CGCAAAATGACAAATAGAAG-3' (SEC ID N.°: 53)
[0432] Además, una sonda de celobiohidrolasa I de 2,1 kb fue amplificada de pSTM01 por PCR usando los cebadores pSMK03-F1 y pSMK03-R1. Las sondas fueron preparadas con un equipo de síntesis de sonda PCR DIG (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). La mezcla de síntesis de sonda PCR DIG y tampón PCR con magnesio fueron usados en 1X. Polimerasa Expand High Fidelity (Roche Applied Science, Manheim, Alemania) fue añadida a 0,75 μl por reacción. Se usaron un pmol cada uno de los cebadores y 50-100 ng de molde de ADN por reacción. Antes de su uso, la sonda fue desnaturalizada por de ebullición durante 5 minutos y luego añadida al tampón de hibridación.
[433] La sonda desnaturalizada fue añadida directamente al tampón DIG Easy Hyb y la hibridación fue durante toda la noche a 65° C. Después de los lavados de post hibridación (dos veces en 2X SSC, una vez en 0,4X SSC, 60° C, 10 minutos cada uno), se realizó detección quimioluminiscente usando el sistema de detección DIG y CPD-Star (Roche Applied Science, Manheim, Alemania). El Equipo de marcador de peso molecular de ADN III etiquetado con DIG (Roche Applied Science, Manheim, Alemania) fue usado como la fuente de marcadores estándar.
[0434] El análisis Southern indicó la presencia de una única integración de hph en el gen cbh1 para un transformante específico. Esta cepa de deleción génica de celobiohidrolasa I fue designada Trichoderma reesei SaMe013.
[0435] El plásmido pCW045, con la variante de celobiohidrolasa I 776-M57 detrás del promotor cbh1, fue introducido en Trichoderma reesei SaMe013 por transformación mediada por PEG (Penttila et al., 1987, Gene 61: 155-164 ). El plásmido contiene el gen Aspergillus nidulans amdS para permitir que los transformantes crezcan en acetamida como la única fuente de nitrógeno. Trichoderma reesei RutC30 fue cultivada a 27° C y 90 r.p.m. en 25 ml de medio YPD suplementado con 10 mM de uridina durante 17 horas. Los micelios fueron recogidos por filtración usando el Sistema de filtración desechable impulsado por vacío de Millipore (Millipore, Bedford, MA) y lavados dos veces con agua desionizada y dos veces con 1,2 M de sorbitol. Los protoplastos fueron generados suspendiendo los micelios lavados en 20 ml de 1,2 M de sorbitol con 15 mg de Glucanex por ml y 0,36 unidades de quitinasa por ml e incubando durante 15-25 minutos a 34° C con agitación suave a 90 r.p.m. Los protoplastos fueron recogidos por centrifugado durante 7 minutos a 400 x g y lavados dos veces con 1,2 M de sorbitol helado. Los protoplastos fueron contados usando un
hemacitómetro y resuspendidos en el STC a una concentración final de 1 X 108 protoplastos por ml. Los protoplastos de exceso fueron almacenados en un recipiente refrigerante Cryo 1° C (Nalgene, Rochester, NY) a -80° C.
[0436] Aproximadamente 1 μg de pCW045 digerido con Pme I se añadió a 100 μl de solución de protoplasto y se mezcló suavemente, seguido de 260 μl de tampón PEG, se mezcló e incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego STC (3 ml) fue añadido y mezclado y la solución de transformación fue colocada en placas COVE usando selección Aspergillus nidulans amdS. Las placas fueron incubadas a 28° C durante 5-7 días. Los transformantes fueron sub-cultivados sobre placas de uridina COVE2 plus y cultivados a 28° C durante 7 días.
[0437] Los transformantes de Trichoderma reesei fueron cultivados en frascos de agitación de 125 ml disipados con 25 ml de medios inductores de celulasa a pH 6,0 inoculados con esporas de los transformantes e incubada a 28° C y 200
r.p.m. durante 7 días. Trichoderma reesei RutC30 fue ejecutada como un control. Las muestras de caldo de cultivo fueron quitadas el día 7. SDS-PAGE se efectuó usando el geles de Criterion Tris-HCl (poliacrilamida al 8-16%) (BioRad, Hercules, CA) con el Sistema Criterion SDS-PAGE (BioRad, Hercules, CA). Cinco μl de sobrenadantes de día 7 fueron suspendidos en 5 μl de tampón de muestra 2X (BioRad, Hercules, CA) y calentados en presencia de betamercaptoetanol al 1% durante 5 minutos. Las muestras sobrenadantes fueron cargadas sobre una gel de poliacrilamida y sometidas a electroforesis con 1X tris/Glicina/SDS como tampón de desplazamiento (BioRad, Hercules, CA). El gel resultante fue manchado con Bio-Safe Coomassie Stain (BioRad, Hercules, CA). Los transformantes candidatos fueron evaluados en cuanto a sus capacidad para expresar la celobiohidrolasa I Cel7A variante 776-M57 en niveles que fueron aparentemente equivalentes a niveles observados en la cepa progenitora de Trichoderma reesei. Un único transformante fue seleccionado sobre esta base para producción en mayor escala en la fermentación.
[0438] La fermentación fue realizada usando la cepa que expresa la variante de celobiohidrolasa I 776-M57, y la Trichoderma reesei RutC30 (cepa huésped) se ejecutó como un control. Las esporas de Trichoderma reesei RutC30 fueron inoculadas en matraces de agitación de 500 ml, con 100 ml de Medio de inóculo de Trichoderma. Los matraces fueron colocados en un agitador orbital a 28° C por aproximadamente 48 horas tiempo en el cual 50 ml del cultivo fue inoculado en 1,8 litros de medio de fermentación de Trichoderma en un vaso de fermentación de 2 litros. Las fermentaciones fueron ejecutadas a pH 5, 0,28° C, con oxígeno disuelto mínimo a 25% a una corriente de aire 10 WM y una agitación de 1100. El medio de alimentación de Trichoderma fue administrado en el vaso de fermentación a 18 horas con un índice de alimentación de 3,6 g/hora durante 33 horas y luego 7,2 g/hora Las fermentaciones se ejecutaron durante 165 horas tiempo en el que los caldos de fermentación final fueron centrifugados y los sobrenadantes fueron almacenados a -20° C.
Ejemplo 18: Identificación de un gen de la familia GH3A de glicosil hidrolasa en la secuencia genómica de Aspergillus fumigatus
[0439] Una búsqueda de TblastN (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) de la secuencia de genoma parcial de Aspergillus fumigatus (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) se efectuó usando como secuencia de búsqueda una secuencia de proteína de beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (N.º de muestreo P48825). Diferentes genes fueron identificados como homólogos putativos de familia GH3A basado en un alto grado de similitud con la secuencia de búsqueda en el nivel de aminoácidos. Una región genómica de aproximadamente 3000 pares de bases con identidad mayor que 70% a la secuencia de búsqueda en el nivel de aminoácidos fue elegida para estudio posterior.
Ejemplo 19: Extracción de ADN genómico de Aspergillus fumigatus
[0440] Aspergillus fumigatus fue cultivado en 250 ml de medio de dextrosa de patata en un matraz oscilante disipado a 37º C y 240 r.p.m. Las micelas fueron recogidas por filtración, lavadas dos veces en tampón TE (10 mM de Tris-1 mM de EDTA), y congeladas bajo nitrógeno líquido. Los micelios congelados fueron molidos por mortero y mano de mortero a un polvo fino, que fue resuspendido en tampón de pH 8,0 con 10 mM de Tris, 100 mM de EDTA, Tritón X-100 al 1%, 0,5 M de HCl de guanidina y 200 mM de NaCl. Se agregó RNasa libre de ADNsa a una concentración de 20 mg/litro y el lisado fue incubado a 37º C durante 30 minutos. El detrito celular fue eliminado por centrifugado, y el ADN fue aislado usando una columna Qiagen Maxi 500 (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Las columnas fueron equilibradas en 10 ml de QBT lavadas con 30 ml de QC, y eluidas con 15 ml de QF (todos los tampones de QIAGEN Inc., Valencia, CA). El ADN fue precipitado en isopropanol, lavado en etanol al 70% y recuperado por centrifugado. El ADN fue resuspendido en tampón TE).
Ejemplo 20: Clonación del gen de beta-glucosidasa de la Familia GH3A y construcción de un vector de expresión de Aspergillus oryzae
[0441] Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR un gen de Aspergillus fumigatus que codifica una beta-glucosidasa putativa de la familia GH3A del ADN genómico preparado en el Ejemplo 19. Un equipo de clonación InFusion (BD Biosciences, Palo Alto, CA) fue usado para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión, pAILo2, (Ejemplo8; Figura 5).
Cebador directo 5'-ACTGGATTTACCATGAGATTCGGTTGGCTCG-3' (SEC ID N.°: 54) Cebador inverso: 5'-AGTCACCTCTAGTTACTAGTAGACACGGGGC-3' (SEC ID n.°: 55)
Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia restante contiene la identidad de secuencia en comparación con los sitios de inserción de pAlLo2 (Figura 5).
[0442] Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores mencionados fueron usados en una reacción de PCR con 100 ng de ADN genómico de Aspergillus fumigatus, tampón de amplificación 1X Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,5 !l de 10 mM de mezcla de dATP, dTTP, dGTP y dCTP, 2,5 unidades de polimerasa de ADN Platinum Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 !l de 50 mM de MgSO4 y 2,5 !l de solución intensificadora 10X pCRx (Invitrogen, Carlsbad, CA) en un
volumen final de 50 !l. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94º C durante 2 minutos; y 30 ciclos cada uno a 94º C durante 15 segundos, 55º C durante 30 segundos y 68º C durante 3 minutos. El bloque de calor luego fue conducido a un ciclo de remojo de 4º C.
[0443] Los productos reactivos fueron aislados en un gel de agarosa al 1,0% usando tampón de 40 mM de Tris base-20 mM de sodio acetato-1 mM de EDTA disodio (TAE) donde una banda de 3 kb fue cortada del gel y purificada usando un equipo de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
[0444] El fragmento luego fue clonado en el vector de expresión pAlLo2 usando un equipo de clonación Infusion El vector fue digerido con las endonucleasas de restricción Nco I y Pac I (utilizando las condiciones especificadas por el fabricante) El fragmento fue purificado por electrdeoresis de gel y purificación de gel Qiaquick. El fragmento del gen y el vector digerido fueron ligados en una reacción que dio como resultado el plásmido de expresión pEJG97(Figura 14) en la cual la transcripción del gen de beta-glucosidasa de la familia GH3A estuvo bajo el control del promotor NA2-tpi. La reacción (50 !l) fue compuesta por tampón de InFusion 1X (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1X BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1 !l de enzima de InFusion (diluido 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 150 ng de pAlLo2 digerido con NcoI y PacI, y 50 ng del producto de PCR purificado de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. La reacción fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Un !l de la reacción fue usado para transformar las células de E. coli XL10 Solopac Gold (Stratagene, La Jolla, CA). Un transformante de E. coli con el plásmido pEJG97 fue detectado por digestión de restricción y el ADN plásmido fue preparado usando un Biorobot 9600 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA)
Ejemplo 21: Caracterización de la secuencia genómica de Aspergillus fumigatus que codifica una betaglucosidasa de la familia GH3A
[0445] La secuenciación del ADN del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de pEJG97 fue realizada con un con un secuenciador de ADN automatizado Modelo 377 XL de Perkin-Elmer Applied Biosysttems (Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando una estrategia de química de terminador de coloración (Giesecke et al., 1992, Journal de Virology Methods 38: 47-60 ) y estrategia de desplazamiento de cebador. Los datos de la secuencia de nucleótidos fueron analizados en detalle en cuanto a la calidad y todas las secuencias de fueron comparadas entre sí con asistencia del software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA).
[0446] Un modelo de gen para la secuencia de Aspergillus fumigatus fue construida según la similitud con genes homólogos de Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger y Aspergillus kawachii. La secuencia de nucleótidos (SEC ID n.º: 56) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N.°: 57) se muestran en la Figura 15. El fragmento genómico codifica un polipéptido de 863 aminoácidos, interrumpido por 8 intrones de 62, 55, 58, 63, 58, 58, 63 y 51 pares de bases. El contenido %G+C del gen es 54,3%. Usando el programa de software SignaIP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predijo un péptido señal de 19 residuos. La proteína madura predicha contiene 844 aminoácidos con una masa molecular de 91,7 kDa.
[0447] Una alineación comparativa de las secuencias de beta-glucosidasa fue determinada usando el Método de Clustal W (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153 ) usando el Software de MEGALIGNTM LASERGENETM (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Penalización de espacio de 10 y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación en pareja fueron Ktuple=1, penalización de espacio=3, ventanas=5, y diagonales=5. La alineación mostró que la secuencia de aminoácidos deducida del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus compartió 78%, 76% y 76% de identidad de las secuencias de aminoácidos deducidas de beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (número de registro P48825), Aspergillus niger (número de registro 000089) y Aspergillus kawachii (número de registro P87076).
Ejemplo 22: Expresión del gen de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de la familia GH3A en Aspergillus oryzae JAL250
[0448] Los protoplastos de Aspergillus oryzae Jal250 fueron preparados según el método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 . Cinco !g de pEJG97 (así como pAILo2 como un control de vector) fue usado para transformar Aspergillus oryzae JAL250.
[0449] La transformación de Aspergillus oryzae Jal250 con pEJG97 produjo aproximadamente 100 transformantes. Diez transformantes fueron aislados en placas de PDA individuales.
[0450] La placas de PDA confluentes de cinco de los diez transformantes fueron lavadas con 5 ml de Tween 20 al 0,01% e inoculadas separadamente en 25 ml de medio MDU2BP en frascos de agitación de vidrio de 125 ml e incubadas a 34º C, 250 r.p.m. Cinco días después de la incubación, se analizaron 0,5 !l de sobrenadante de cada cultivo usando geles de SDS-PAGE de Tris-glicina al 8-16% (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Los perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que uno de los transformantes (designado transformante 1) tuvo una banda mayoritaria de aproximadamente 130 kDa.
[0451] Una placa confluyente de transformante 1 (cultivada en PDA) fue lavada con 10 ml de Tween 20 al 0,01% e inoculada en un Fernbach de 2 litros con 400 ml de medio MDU2BP para generar caldo para caracterización de la enzima. El matraz fue cosechado en el día 5 y filtrado usando una membrana GP Express plus de 0,22 μm (Millipore, Bedford, MA).
[0452] Un único transformante de pEJG97 en Aspergillus oryzae fue cultivado en un tanque de fermentación. Las esporas de Aspergillus oryzae fueron inoculadas en matraces de agitación de 500 ml, con 100 ml de Medio de inóculo. Los matraces fueron colocados en un agitador orbital a 34° C a 200 r.p.m. por aproximadamente 24 horas tiempo en el cual 50 ml del cultivo fue inoculado en 1,8 litros de medio de fermentación en un vaso de fermentación de 2 litros. Las fermentaciones fueron ejecutadas a pH 7,0, 34° C, con oxígeno disuelto mínimo a 25% a una corriente de aire 10 WM y una agitación de 1100. El medio de alimentación fue administrado en el vaso de fermentación con una adición de oxígeno disuelto con un índice de alimentación de 4 g/hora. Las fermentaciones se ejecutaron durante 164 horas tiempo en el que los caldos de fermentación final fueron centrifugados y los sobrenadantes fueron almacenados a -20° C.
Ejemplo 23: Caracterización de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus
[0453] Una alícuota de 3 ml de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, obtenida como se describe en el Ejemplo 22, fue desalinizada usando un columna de desalinización BioRad Econo-pAc 10DG (BioRad, Hercules, CA), dando como resultado aprox. 4 ml de caldo desalinizado en 100 mM de citrato sódico pH 5,0. El caldo desalinizado fue luego concentrado a aproximadamente 180 μl usando un Amicon Centricon Plus-20 (membrana PES de corte de 5 kDa Biomax-5) y diluido con 100 mM de citrato sódico pH 5,0 a un volumen final de aproximadamente 500 μl. El ensayo de BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem. 150: 76-85 ) del caldo desalinizado concentrado mostró una concentración de 1,00 mg de proteína por ml. Una segunda alícuota también fue desalinizada para obtener más material, que produjo resultados similares.
[0454] SDS-PAGE (criterio BioRad Tris-HCl al 7,5%) de las muestras desalinizadas concentradas mostró una banda mayor a aprox. 130 kD. La banda mayor a 130 kD fue recortada del gel y sometida a secuenciación de aminoácido Nterminal.
[0455] La beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus del caldo desalinizado/concentrado fue evaluado en relación a la termoestabilidad a 50°, 65°, y 70° C. Las condiciones de ensayo a 50° y 65° C fueron: 100 mM de citrato sódico pH 5,0,
Tween-20 al 0.01%,4 mM de P-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido, [proteína]AfumGH3A = 6,9 X 10-6 mg/ml,, incubado a 50° y 65° C. Las partes alícuotas fueron tomadas a 0,5, 1, 2, 3, 3,75, y 24 horas. A cada alícuota se añadió 1 M de carbonato de sodio pH 10,0, y la concentración de aniones de p- nitrofenil se determinó partir de la absorbancia a 405 nm. A 70° C, las condiciones de ensayo fueron: 100 mM de citrato sódico (pH 5,0), Tween-20 al 0,01%, 4 mM de p
nitrofenil-beta-D-glucopiranósido, [proteína] = 5,6 X 10-6 mg/ml. Las partes alícuotas fueron tomadas a 0,25, 0,5, 1, 2, 4, y 5 horas. A cada alícuota se añadió 1 M de carbonato de sodio pH 10,0, y la concentración de aniones de p- nitrofenil se determinó partir de la absorbancia a 405 nm. Obsérvese que cada una de las concentraciones de proteína anteriores se refiere a la concentración total de proteína en el ensayo, ya que todas fueron evaluadas como caldos en lugar de enzimas purificadas.
[0456] Los resultados se muestran en las Figuras 16 y 17. La termoestabilidad fue definida como cinética de reacción lineal para un intervalo de tiempo dado, dentro de una conversión de porcentaje razonable (lt;15%) a anión de pnitrofenilo. La beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus pareció ser estable al menos 24 horas a 50° C, aunque no había ningún punto temporal entre 4 horas y 24 horas. A 65 °C pareció ser estable al menos 3,75 horas, pero después la estabilidad gradualmente disminuyó con una conversión del 65% a anión de p-nitrofenilo a las 24 horas. Esta conversión fue bastante alta, de modo que cierta parte de la reducción observada en el índice puede haberse debido a depleción de sustrato y/o inhibición de producto además de posible inactivación térmica. A 70° C pareció ser estable durante 1 hora, y razonablemente estable a 2 horas.
[0457] El caldo con familia beta-glucosidasa GH3A de Aspergillus fumigatus, obtenido como se describe en el Ejemplo 22, fue primero desalinizado (columna Econo-Pac 10DG de Bio-Rad) y concentrado (Centricon Plus-20, BioBiomax-5, corte 5 kD), a una concentración de 0,92 mg/ml (ensayo BCA). Luego, fue incubado a 0,037 y 0,0092 μg/ml de proteína total con 10 mM de celobiosa en 100 mM de citrato sódico pH 5,0 más Tween-20 al 0,01% a 65°C. Las partes alícuotas fueron tomadas a 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, y 19 horas. Las partes alícuotas fueron hervidas 6 minutos para terminar la reacción, y la concentración de glucosa se determinó usando el ensayo Trinder (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y estándares de glucosa externos. Los resultados se muestran en la Figura 18. La beta-glucosidasa pareció mantener 90% de su actividad a 6 horas, y 65% a 19 horas a 65° C a la carga de proteína inferior (0,0092 μg/ml). La beta-glucosidasa pareció ser razonablemente estable hasta 6 horas a 65° C.
Ejemplo 24: Ensayo de variante de Cel7A 776-M57 en combinación con celulasas de Trichoderma
[0458] Se obtuvo forraje de maíz pretratado (PCS) del Laboratorio de Energía Nacional Renovable (NREL) del Departamento de Energía de EE. UU. Los sólidos insolubles en agua en PCS incluyen: 56,5% de celulosa, 4,6% de hemicelulosa y 28,4% de lignina Las condiciones de pretratamiento fueron: forraje de maíz, 1,4% (p/vol) de ácido sulfúrico, 165° C, 107 p.s.i., durante 8 minutos. Antes de ensayo, el PCS fue lavado con un volumen grande de agua desionizada destilada en un filtro de vidrio. El PCS fue luego molido usando un desfibrador de café para reducir el tamaño de partícula, luego fue lavado con agua en un filtro Millipore de 22 μm (6P Express Membrane, Stericup, Millipore, Billerica, MA). El PCS lavado fue resuspendido en agua desionizada para hacer una suspensión de 20 mg/ml, y fue almacenado a 4° C.
[0459] Los caldos de fermentación de Trichoderma reesei fueron filtrados (membrana de 0,4 μm, Stericup, Millipore, Billerica, MA), y el contenido de proteína fue evaluado por ensayo BCA (Pierce Biotech., Inc., Rockford, IL). La betaglucosidasa termoestable de Aspergillus fumigatus fue usada en los ensayos de PCS. La beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus fue preparada como se describe en el Ejemplo 22. Los caldos de fermentación de la betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus heterólogamente expresada fueron filtrados (membrana de 0,4 μm, Millipore, Billerica, MA), y el contenido de proteína fue evaluado por ensayo de BCA (Pierce,Biotech., Inc., Rockford, IL). Los ensayos de PCS fueron realizados en un volumen de 1,0 ml. Los ensayos incluyeron 10 mg de PCS por ml, 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 5,0), 8,5 mg de proteína de caldo de fermentación total por gramo de celulosa y 0,27 mg
de caldo de fermentación de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus. Los ensayos fueron mantenidos a 55° C y a 60° C en tubos de ensayo sellados (ImmunoWare Microtubes, Pierece Biotech., Inc., Rockford, IL) durante 5 días con inversión intermitente de tubos de ensayo.
[0460] Aproximadamente cada 24 horas, se tomaron puntos temporales de las reacciones de PCS. Partes alícuotas de diez microlitros fueron quitadas de los tubos de ensayo en 90 μl de mezcla de temple alcalina (0,102 M Na2 CO3 más
0,058 M NaHCO3). Se realizó la dilución de las muestras apagadas para un octavo o un decimosexto de la concentración de inicio. La concentración de azúcares reductores en muestras producida por degradación de PCS fue determinada por ensayo de ácido 4-hidroxibenzoico hidrazida (PHBAH) (Lever, 1972, Anal Biochem 47: 273-279 ) usando 2 partes de PHBAH al 1,25% en la mezcla de temple alcalina añadida a 3 partes de la solución de ensayo detenida. Esta solución fue luego calentada durante 10 minutos a 95° C, luego se diluyeron muestras en agua, y se midió la absorbancia a 405 nm usando un Lector de placa UltraMark (Bio-Rad, Hercules, CA). La absorbancia a 405 nm fue convertida en equivalentes de glucosa usando una curva de estándar de glucosa. Finalmente, se calculó el grado de conversión de celulosa usando la concentración inicial de celulosa y un factor de aumento de peso en la conversión de celulosa a glucosa. El grado de conversión de la celulosa a azúcar reductora (rendimiento RS, %) fue calculado usando la siguiente ecuación:
Rendimiento RS (%) = RS (mg/ml) * 100 * 162 / (5.65 (mg/ml) * 180
= RS (mg/ml) * 100 / (5.65 (mg/ml) * 1.111)
[0461] La Figura 19 muestra los perfiles temporales de la hidrólisis de PCS por la cepa Trichoderma reesei progenitora, y la cepa que expresa la variante 776-M57 en lugar de la cellobiohidrolasa I Cel7A de tipo salvaje. Es evidente que la cepa que contiene la variante supera a la progenitora bajo estas condiciones.
Depósito de material biológico
[0462] El siguiente material biológico ha sido depositado según las condiciones del Tratado de Budapest con la Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, y se les ha dado los siguientes números de registro
Depósito
Número de acceso Fecha depósito de
pAJO52
NRRL B-30683 29 de2003 julio de
776-M1
NRRL B-30657 22 de mayo de
2003
776-M4
NRRL B-30658 22 de mayo2003 de
776-M23
NRRL B-30659 22 de mayo de
2003
776-M26
NRRL B-30661 22 de mayo de
2003
776-M32
NRRL B-30662 22 de mayo de
2003
776-M53
NRRL B-30663 22 de mayo de
2003
776-M57
NRRL B-30664 22 de mayo de
2003
776-M108
NRRL B-30665 22 de mayo de
2003
776-M109
NRRL B-30666 22 de mayo de
2003
776-M21
NRRL B-30674 28 de julio de
2003
776-M22
NRRL B-30675 28 de julio de
2003
776-M41
NRRL B-30676 28 de julio de
2003
776-M42
NRRL B-30677 28 de julio de
2003
776-M52
NRRL B-30678 28 de julio de
2003
776-M71
NRRL B-30679 28 de julio de
2003
776-M73
NRRL B-30680 28 de julio de
2003 776-M124 NRRL B-30681 28 de julio de 2003 776-M125 NRRL B-30682 28 de julio de 2003 776-M273 NRRL B-30762 25 de agosto de 2004
[0463] Las cepas han sido depositadas bajo condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos estará disponible durante la pendencia de la presente solicitud de patente a una persona designada por el Comisario de Patentes y
5 Marcas Registradas que tendrá derecho a ello bajo 37 C.F.R. §.14 y 35 U.S.C. §122. Los depósitos representan cultivos substancialmente puros de las cepas depositadas. Los depósitos están disponibles según sea necesario por las leyes de patentes extranjeras en los países donde se presentaron duplicados de la solicitud en cuestión, o su progenie. No obstante, debería entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención en cuestión en derogación de los derechos de las patentes concedidas por acción gubernamental.
10 LISTADO DE SECUENCIAS
[0464]
15 lt;110gt; Novozymes Biotech, Inc.
lt;120gt; Variants de Glycoside Hydrolases
lt;130gt; 10479.204-WO 20
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22
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26
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lt;400gt; 39 agtactagta gctccgtggc gaaagcctg 29
lt;210gt; 40
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Trichoderma reesei
lt;400gt; 40 actagtcgac cgaatgtagg attgtt 26
lt;210gt; 41
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Trichoderma reesei
lt;400gt; 41 tgaccatggt gcgcagtcc 19
lt;210gt; 42
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lt;213gt; Trichoderma reesei
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lt;213gt; Trichoderma reesei
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lt;212gt; DNA
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lt;213gt; Trichoderma reesei
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Trichoderma reesei
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lt;213gt; Trichoderma reesei
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Escherichia coli
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lt;210gt; 49
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Escherichia coli
lt;400gt; 49 gaccggtcgc aaaatgacaa atagaag 27
lt;210gt; 50
lt;211gt; 23
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Trichoderma reesei
lt;400gt; 50 gctccgggca aatgcaaagt gtg 23
lt;210gt; 51
lt;211gt; 24
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Trichoderma reesei
lt;400gt; 51 agcaggccgc atctccagtg aaag 24
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lt;213gt; Escherichia coli
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lt;213gt; Escherichia coli
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lt;213gt; Aspergillus fumigatus
lt;400gt; 54 actggattta ccatgagatt cggttggctc g 31
lt;210gt; 55
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lt;212gt; DNA
lt;213gt; Aspergillus fumigatus
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lt;210gt; 56
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lt;213gt; Aspergillus fumigatus
lt;400gt;
lt;210gt; 57
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lt;212gt; PRT
lt;213gt; Aspergillus fumigatus
lt;400gt; 57

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, e incluso de forma más preferible al menos 97%, caracterizado por el hecho de que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, caracterizado por el hecho de que la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 205 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, caracterizado por el hecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
  2. 2.
    Polipéptido variante según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 es Arg.
  3. 3.
    Polipéptido variante según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 205 es G205R.
  4. 4.
    Polipéptido variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por el hecho de que el polipéptido variante comprende sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 94 e 205 de los aminoácidos 1 a 513 de SEQ ID n.°: 2.
  5. 5.
    Polipéptido variante según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que la variante comprende las sustituciones G94S + G205R.
  6. 6.
    Secuencia de nucleótidos aislada que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
  7. 7.
    Un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.
  8. 8.
    Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7.
  9. 9.
    Una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.
  10. 10.
    Un método para producir un polipéptido variante con actividad de glucósido hidrolasa, que comprende (a) cultivo de la célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas para la producción de la variante; y (b) recuperación de la variante del medio de cultivo.
  11. 11.
    Una composición detergente que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un surfactante.
  12. 12.
    Un método para degradar biomasa que contiene celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una cantidad eficaz de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y recuperación de la biomasa degradada.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2322607B1 (en) 2002-08-16 2015-09-16 Danisco US Inc. Novel variant Hyprocrea jecorina CBH1 cellulases with increase thermal stability comprising substitution or deletion at position S113
DK1682656T3 (da) 2003-10-28 2013-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med beta-glucosidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
US9969993B2 (en) 2007-05-31 2018-05-15 Novozymes, Inc. Filamentous fungal host cells and methods of recombinantly producing proteins
MX2011001006A (es) * 2008-08-01 2011-04-21 Iogen Energy Corp Celulasa de la familia 6 con inactivacion disminuida mediante lignina.
BRPI1013167A2 (pt) 2009-02-27 2015-10-06 Iogen Energy Corp enzimas celulases resistentes a lignina
WO2010129287A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Hemicellulose-degrading enzymes
EP2357227B1 (en) 2010-02-11 2015-07-15 Süd-Chemie IP GmbH & Co. KG Optimized cellulase enzymes
US9206406B2 (en) 2010-02-11 2015-12-08 Iogen Energy Corporation Carbohydate binding modules with reduced binding to lignin
DK2640833T3 (en) 2010-11-18 2016-11-28 Novozymes Inc Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
EP2686434B1 (en) 2011-03-17 2021-07-14 Danisco US Inc. Method for reducing viscosity in saccharification process
WO2012135719A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes, Inc. Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same
EP2764098A2 (en) * 2011-10-06 2014-08-13 BP Corporation North America Inc. Variant cbh i polypeptides with reduced product inhibition
JP6508816B2 (ja) 2011-10-27 2019-05-08 バックマン ラボラトリーズ インターナショナル，インコーポレイティド 製紙用の繊維を酵素処理する方法及び組成物、並びにそれにより作製された紙製品
EP2912168A1 (en) * 2012-10-23 2015-09-02 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN104870642A (zh) * 2012-12-12 2015-08-26 丹尼斯科美国公司 纤维二糖水解酶的变体
BR112015013647A2 (pt) * 2012-12-12 2017-11-14 Danisco Us Inc variante isolada de uma enzima celobio-hidrolase (cbh) parental, polinucleotídeo isolado, vetor, célula hospedeira, composição detergente, aditivo alimentar, método para hidrolisar um substrato celulósico, sobrenadante de cultura celular, métodos de produção de um polipeptídeo cbh variante e sobrenadante de cultura celular
CN104870641A (zh) * 2012-12-12 2015-08-26 丹尼斯科美国公司 纤维二糖水解酶的变体
WO2014093287A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
US20160122734A1 (en) * 2012-12-12 2016-05-05 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
US10221406B2 (en) 2013-03-08 2019-03-05 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
FR3022557B1 (fr) * 2014-06-20 2019-01-25 Proteus Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
BR112017004251A2 (pt) 2014-09-05 2017-12-12 Novozymes As variantes de módulos de ligação a carboidrato e polinucleotídeos que os codificam
DK3191587T3 (da) 2014-09-08 2019-10-14 Novozymes As Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, som koder for dem
EP3739045A3 (en) 2015-02-24 2021-03-10 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US11965189B2 (en) * 2016-03-24 2024-04-23 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN107779443B (zh) * 2017-10-26 2020-10-13 南开大学 纤维二糖水解酶突变体及其应用
CN109136124A (zh) * 2018-08-17 2019-01-04 西南科技大学 一种超富集植物体快速减容减量处理复合菌剂及其制备方法
CN109355275B (zh) * 2018-11-21 2021-08-20 中山大学 高热稳定性β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
CN109456954B (zh) * 2018-11-21 2021-08-20 中山大学 热稳定性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
CN114250214B (zh) * 2020-09-21 2023-07-07 南京工业大学 持续性内切纤维素酶突变体及其应用
CN112266907B (zh) * 2020-10-28 2022-03-15 江南大学 齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (es) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
WO1987000859A1 (en) 1985-08-09 1987-02-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
EP0258068B1 (en) 1986-08-29 1994-08-31 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent additive
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
ATE129523T1 (de) 1988-01-07 1995-11-15 Novo Nordisk As Spezifische protease.
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
NZ237549A (en) 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
WO1991016422A1 (de) 1990-04-14 1991-10-31 Kali-Chemie Aktiengesellschaft Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
AU639570B2 (en) 1990-05-09 1993-07-29 Novozymes A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
DE69129988T2 (de) 1990-09-13 1999-03-18 Novo Nordisk As Lipase-varianten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
EP0495257B1 (en) 1991-01-16 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Compact detergent compositions with high activity cellulase
ATE136055T1 (de) 1991-04-30 1996-04-15 Procter & Gamble Gerüstsubstanzhaltige flüssigwaschmittel mit borsäure-polyolkomplex zur ptoteolytischen enzyminhibierung
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
ES2121014T3 (es) 1991-05-01 1998-11-16 Novo Nordisk As Enzimas estabilizadas y composiciones detergentes.
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
ES2334590T3 (es) 1992-07-23 2010-03-12 Novozymes A/S Alfa-amilasa mutante, detergente y agente de lavado de vajilla.
KR100303619B1 (ko) 1992-10-06 2001-11-22 피아 스타르 셀룰라제변이체
CA2155831C (en) 1993-02-11 2009-11-10 Richard L. Antrim Oxidatively stable alpha-amylase
JP3618748B2 (ja) 1993-04-27 2005-02-09 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体
DK52393D0 (es) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
CN1129011A (zh) 1993-07-12 1996-08-14 诺沃挪第克公司 含有两种纤维素酶成分的洗涤剂组合物
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
EP0724631A1 (en) 1993-10-13 1996-08-07 Novo Nordisk A/S H 2?o 2?-stable peroxidase variants
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
BR9506861A (pt) 1994-02-22 1997-09-23 Novo Nordisk As Processo para preparar e produzir uma variante de uma enzima lipolítica originária variante de enzima liplítica construção de dna vetor célula hospedeira aditivo detergente e composição detergente
US6117664A (en) * 1994-03-03 2000-09-12 Novo Nordisk A/S Alkaline cellulases
EP0749473B1 (en) 1994-03-08 2005-10-12 Novozymes A/S Novel alkaline cellulases
JP3851656B2 (ja) 1994-05-04 2006-11-29 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 改善された界面活性剤耐性を有するリパーゼ
WO1995033836A1 (en) 1994-06-03 1995-12-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Phosphonyldipeptides useful in the treatment of cardiovascular diseases
AU2884595A (en) 1994-06-20 1996-01-15 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
AU2884695A (en) 1994-06-23 1996-01-19 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
JPH10507073A (ja) 1994-10-06 1998-07-14 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ エンドグルカナーゼ活性を有する酵素及び酵素調製品
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
EP0785994A1 (en) 1994-10-26 1997-07-30 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
EP0815209B2 (en) 1995-03-17 2015-02-25 Novozymes A/S Novel endoglucanases
WO1997004078A1 (en) 1995-07-14 1997-02-06 Novo Nordisk A/S A modified enzyme with lipolytic activity
WO1997007202A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
EP1213350A3 (en) 1995-08-11 2002-12-04 Novozymes A/S Method for preparing polypeptide variants by in vivo recombination
DK0877801T3 (da) 1996-01-19 2005-08-29 Novozymes Biotech Inc Morfologiske mutanter af trådsvampe
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
WO1998008940A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
BR9711479B1 (pt) 1996-09-17 2009-08-11 variante de celulase tendo uma resistência aumentada a tensìdeo de ánion.
EP0963192B1 (en) 1996-10-08 2003-01-08 Novozymes A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
ATE510910T1 (de) 1996-11-04 2011-06-15 Novozymes As Subtilase-varianten und verbindungen
CN1136311C (zh) 1996-11-04 2004-01-28 诺沃奇梅兹有限公司 枯草杆菌酶变异体和组合物
WO1998034946A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis
DK0996718T3 (da) 1997-03-18 2009-04-06 Novozymes As Fremgangsmåde til konstruktion af et bibliotek ved anvendelse af DNA-shuffling
NZ337910A (en) 1997-03-18 2001-10-26 Novo Nordisk As Shuffling of heterologous DNA sequences using conserved regions
AU4213999A (en) 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
JP5043254B2 (ja) 1998-10-26 2012-10-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 糸状面細胞内の問題のｄｎａライブラリーの作製及びスクリーニング
CA2379326A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase reduced glycosylation variants: cbhin45a; cbhin270a; and cbhin384a
US7375197B2 (en) * 2002-01-14 2008-05-20 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase I gene and improved variants
US6461837B1 (en) 1999-11-30 2002-10-08 Novozymes Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide using a consensus translational initiator sequence
ES2438146T3 (es) 2001-06-26 2014-01-16 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de celobiohirolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos
EP2322607B1 (en) * 2002-08-16 2015-09-16 Danisco US Inc. Novel variant Hyprocrea jecorina CBH1 cellulases with increase thermal stability comprising substitution or deletion at position S113
EP2298876A1 (en) * 2003-03-21 2011-03-23 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases

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