MXPA06011344A

MXPA06011344A - Suspensiones de espermatozoides para separar en poblaciones enriquecidas con cromosomas x o y.

Info

Publication number: MXPA06011344A
Application number: MXPA06011344A
Authority: MX
Inventors: Cindy L Ludwig; Kathleen S Crowley; Charles N Graves
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2006-12-15
Also published as: DK2151243T3; AR049259A1; WO2005094852A3; JP2009100752A; CA2561661C; EP1729789A2; BRPI0509488A; CN102586179B; US7838210B2; PL2151243T3; AU2005229073A1; BRPI0509485A; CA2561519C; MXPA06011345A; JP2007537727A; WO2005095590A2; AU2005229073B2; EP2801363B1; CN102586179A; NZ550196A

Abstract

Se describen suspensiones celulares de espermatozoides que comprenden un inhibidor de movilidad. Las celulas contenidas en tales suspensiones tienden a tener una mayor capacidad para resistir los diversos pasos del proceso, habitualmente asociados con la separacion de celulas de espermatozoides en una poblacion enriquecida por sexo, con lo cual resulta en composiciones despues de la separacion con un numero mayor de espermatozoides viables o moviles. Tambien se describen procesos para formar tales suspensiones celulares, asi como tambien para tincion de celulas de espermatozoides.

Description

vacas lecheras. La separación de los espermatozoides en poblaciones enriquecidas de células con cromosomas X e Y, conocida como semen enriquecido por sexo o espermatozoides enriquecidos por sexo, es un método de lograr la descendencia preseleccionada. Con el fin de obtener semen enriquecido por sexo, se deben teñir los espermatozoides con un pigmento y posteriormente separarlos en células con cromosomas X e Y. Cada uno de los procesos de tinción y de separación pone a los espermatozoides bajo una situación adversa que disminuye la viabilidad o la movilidad de las células de espermatozoides, en particular la movilidad progresiva. Salisbury et al. describen una técnica para la recolección de semen bovino eyaculado directamente en un diluyente que inhibe la movilidad de las células y previene la absorción de carbohidratos del plasma seminal circundante. Cuando se recoge el eyaculado en el diluyente y se reemplaza la fase aérea encima del líquido gasificándola con CO2 al 100%, las células del eyaculado quedan inmóviles. Mientras las células permanezcan en el diluyente y se excluya el aire, las células permanecerán inmóviles durante varias horas a temperatura ambiente y durante al menos 8 días a 5°C.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Entre los diversos aspectos de la presente invención se encuentran las suspensiones de espermatozoides que tienen una utilidad, por ejemplo, en los procesos usados para separar espermatozoides en poblaciones enriquecidas con espermatozoides de cromosomas X o Y. Por lo tanto, brevemente, la presente invención está dirigida a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables y una preparación que atenúe la incorporación de carbohidratos por parte de los espermatozoides, la concentración de espermatozoides en las suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos 1 x 108 espermatozoides por mi. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables y no móviles, la concentración de espermatozoides en las suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides por mi. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables, los espermatozoides teniendo una movilidad más característica de los espermatozoides en el epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie, la concentración de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos 1 x 108 espermatozoides por mi. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables, potasio y opcionalmente sodio, la concentración de espermatozoides en la suspensión es de al menos 1 x 10 espermatozoides por mi y la relación molar de potasio a sodio es mayor que 1 :1 , respectivamente. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables, una composición que atenúa la incorporación de carbohidratos por parte de los espermatozoides, y un pigmento selectivo para ADN. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables, inmóviles y un pigmento selectivo para ADN. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables y un pigmento selectivo para ADN, los espermatozoides teniendo una tasa metabólica y movilidad más característica de los espermatozoides del epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables e inmóviles, los espermatozoides teniendo un pigmento selectivo para ADN asociado con su ADN. La presente invención está dirigida adicionalmente a una suspensión celular de espermatozoides que comprende espermatozoides viables, los espermatozoides teniendo una tasa metabólica y movilidad más característica de los espermatozoides del epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie, los espermatozoides teniendo también un pigmento selectivo para el ADN asociado con su ADN. La presente invención está dirigida adicionalmente a un proceso para teñir células de espermatozoides, el proceso comprende formar una mezcla de tinción que contiene células de espermatozoides intactos viables, una cantidad de potasio que inhiba la movilidad, y un pigmento selectivo para ADN. La presente invención está dirigida adicionalmente a un proceso para formar una suspensión celular de espermatozoides para usar en un proceso de citometría de flujo, el proceso comprende combinar una fuente celular de espermatozoides con una composición que inhibe la movilidad de células de espermatozoides para formar una suspensión celular de espermatozoides, la concentración de células de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos 1 x 108 espermatozoides por mililitro. La presente invención está dirigida adicionalmente a un proceso para formar una suspensión celular de espermatozoides para usar en un proceso de citometría de flujo, el proceso comprende recoger la eyaculación de un mamífero en un amortiguador que contiene una cantidad inhibitoria de un inhibidor de movilidad para formar una suspensión celular de espermatozoides, la suspensión comprende menos de aproximadamente 1 X 106 ó al menos 1 x 108 espermatozoides por mililitro.

Otros aspectos y características de la invención serán en parte evidentes y en parte destacados de aquí en adelante.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 1 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en TCA en atmósfera de dióxido de carbono que contiene 10 mM de piruvato. La FIGURA 2 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 1 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 7.3. La FIGURA 3 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 1 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 4 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 2 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato y luego diluido 1 a 3 con TCA que contenga 10 mM de piruvato o con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 5 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 2 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en (1 ) TCA que contiene 10 mM de piruvato y diluido 1 a 3 con el mismo ó (2) un amortiguador con base de carbonato a pH 7.3 y diluido 1 a 3 con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 6 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 2 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 7 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 3 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en TCA que contiene 10 mM de piruvato y luego diluido 1 a 3 con TCA que contiene 10 mM de piruvato o un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2.

La FIGURA 8 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 3 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en (1 ) TCA que contiene 10 mM de piruvato y diluido 1 a 3 con el mismo ó (2) un amortiguador con base de carbonato a pH 7.3 y diluido 1 a 3 con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 9 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 3 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La FIGURA 10 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 4 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 mM de piruvato. La FIGURA 11 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 5 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 µ? de vitamina K.

La FIGURA 12 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 6 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 100 µ? de vitamina K. La FIGURA 13 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 7 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 1 mM de ácido lipoico. La FIGURA 14 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 8 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 mM de piruvato. La FIGURA 15 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 9 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 100 µ? de vitamina K. La FIGURA 16 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 10 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 1 mM de ácido lipoico. La FIGURA 17 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 11 en el cual que se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un amortiguador TCA, un amortiguador TCA que contiene 2,5 mM de piruvato, un amortiguador TCA que contiene 10 mM de piruvato, un amortiguador TCA que contiene 25 mM de piruvato y un amortiguador TCA que contiene 50 mM de piruvato. La FIGURA 18 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 12 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 20 µ? de pigmento SYBR-14 a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 mM de piruvato. La FIGURA 19 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 13 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 100 µ? de pigmento BBC a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 mM de piruvato. La FIGURA 20 representa gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el Ejemplo 14 en el cual se mide la movilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 200 µ? de pigmento BBC a 28°C en un amortiguador TCA o un amortiguador TCA que contiene 10 m de piruvato.

DESCRIPCION DETALLADA PE LA INVENCION Sorprendentemente, se ha determinado que los espermatozoides que tienen una movilidad reducida con respecto a los espermatozoides endógenos eyaculados (de la misma especie) tienden a tener una mayor capacidad para resistir los diversos pasos del proceso, habitualmente asociados con la separación de células de espermatozoides en una población enriquecida de espermatozoides con cromosomas X o Y. Por lo tanto, en una modalidad preferida, las poblaciones de espermatozoides enriquecidas por sexo se pueden preparar para inseminación artificial, las cuales tienen un número mayor de células viables o un número mayor de espermatozoides móviles, en particular espermatozoides progresivamente móviles, en una composición después de la tinción o después de la separación. De acuerdo con el proceso de la presente invención, una suspensión, ocasionalmente denominada como una dispersión, se forma conteniendo espermatozoides y una o más preparaciones que inhiben la movilidad de los espermatozoides; donde el estado de movilidad inhibida a veces se denomina inmovilidad o latencia de los espermatozoides. En general, las suspensiones contendrán espermatozoides en una densidad de aproximadamente 1 x 103 espermatozoides/ml a aproximadamente 5 x 1010 espermatozoides/ml de suspensión. Por ejemplo, en una modalidad las suspensiones pueden contener espermatozoides en una densidad "relativamente baja", es decir, en una densidad menor que aproximadamente 1 X 107 espermatozoides/ml, preferentemente menor que aproximadamente 1 X 106 espermatozoides/ml, más preferentemente de aproximadamente 1 X 103 a aproximadamente 5 X 106 espermatozoides/ml, aún más preferentemente de aproximadamente 1 X 03 a aproximadamente 1 X 106 espermatozoides/ml, aún más preferentemente de aproximadamente 1 X 104 a aproximadamente 1 X 105 espermatozoides/ml y mejor aún aproximadamente 1 X 105 espermatozoides/ml de suspensión. En una modalidad alternativa, las suspensiones pueden contener espermatozoides en una densidad "intermedia", es decir, en una densidad de aproximadamente 1 X 107 a aproximadamente 1 X 108 espermatozoides/ml de suspensión. En otra modalidad alternativa adicional, las suspensiones pueden contener espermatozoides en una densidad "relativamente alta", es decir, en una densidad de al menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides/ml, preferentemente de aproximadamente 1 X 108 a aproximadamente 5 X 1010 espermatozoides/ml, más preferentemente de aproximadamente 1.5 X 108 a aproximadamente 2 X 1010 espermatozoides/ml, más preferentemente aún de aproximadamente 1.5 X 08 a aproximadamente 2 X 108 espermatozoides/ml, y mejor aún aproximadamente 1.5 X 108 espermatozoides/ml de suspensión. Así, por ejemplo, en una modalidad la suspensión puede contener al menos aproximadamente 1.25 x 10 , al menos aproximadamente 1.5 x 10 , al menos aproximadamente 1.75 x 108, al menos aproximadamente 2 x 108, al menos aproximadamente 2.25 x 108, al menos aproximadamente 2.5 x 108, al menos aproximadamente 2.75 x 108, o incluso al menos aproximadamente 3 x 108 espermatozoides/ml de suspensión. En una modalidad alternativa, la suspensión puede contener menos de aproximadamente 9 X 105, menos de aproximadamente 7 X 105, menos de aproximadamente 5 X 105, menos de aproximadamente 2 X 105, menos de aproximadamente 1 X 105, menos de aproximadamente 1 X 104, o incluso menos de aproximadamente 1 X 103 espermatozoides/ml de suspensión. La densidad de espermatozoides en las suspensiones de espermatozoides depende de varias consideraciones, incluyendo el método por el cual se pueden enriquecer o separar posteriormente las células. Por ejemplo, las células de espermatozoides se pueden separar utilizando citometría de flujo según se describe más detalladamente a continuación. En tal caso, la suspensión amortiguada de espermatozoides puede tener habitualmente una densidad de espermatozoides "intermedia" o "relativamente alta". Otras técnicas de separación o de enriquecimiento pueden aprovechar una densidad menor de espermatozoides, tal como una densidad de espermatozoides "relativamente baja", etiquetada con un marcador, como por ejemplo los pigmentos y las etiquetas descritas en la presente. En una modalidad preferida, los espermatozoides en las suspensiones de la presente invención, se comportan en ciertos aspectos, de un modo característico a los espermatozoides del epidídimo; por ejemplo, los espermatozoides pueden estar inmóviles y/o pueden tener un menor índice de respiración endógena y un mayor índice de glucólisis aeróbica respecto a espermatozoides lavados o recién eyaculados. Resulta ventajoso que los espermatozoides inhibidos tengan la capacidad, una vez separados del inhibidor o de los inhibidores, de comportarse de un modo característico a los espermatozoides eyaculados (y no característicos de los espermatozoides del epidídimo) con respecto a la movilidad y, en una modalidad, con respecto a la movilidad y la respiración. En una modalidad, por ejemplo, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS (sistema de análisis de espermatozoides asistido por computadora Hamilton-Thorne HTM-IVOS, Hamilton-Thorne Research, Beverly MA) de al menos 50% de células de espermatozoides en la dispersión con respecto a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Preferentemente, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 60% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Más preferentemente, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 70% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Aún más preferentemente, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de! trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 80% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Más preferentemente aún, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 90% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Más preferentemente aún, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por ' medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 95% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Mejor aún, el inhibidor de movilidad reduce la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, según se mide por medio del análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 99% de células de espermatozoides en la dispersión con relación a la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas, de células de espermatozoides en un eyaculado fresco de la misma especie. Además o en lugar de un amortiguador inhibidor, la temperatura de las células de espermatozoides o el ambiente inmediato que rodea a las células de espermatozoides (es decir, una dispersión de espermatozoides) se puede reducir para que afecte la movilidad de las células. Dicha reducción en la temperatura generalmente aumentará la inmovilidad. Además, por ejemplo, la reducción de la temperatura de las células de espermatozoides o de la dispersión de espermatozoides puede permitir una reducción en la concentración del inhibidor usado para inducir la inmovilidad. En consecuencia, la dispersión de espermatozoides puede estar a una temperatura que no exceda los 5°C; preferentemente entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 5°C; más preferentemente entre aproximadamente 3°C y aproximadamente 5°C; y mejor aún a aproximadamente 5°C. En forma alternativa, la dispersión de espermatozoides puede estar a una temperatura dentro del intervalo de aproximadamente 4°C a aproximadamente 50°C; preferentemente de aproximadamente 7°C a aproximadamente 43°C; más preferentemente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 39°C; aún más preferentemente de aproximadamente 15°C a aproximadamente 30°C; más preferentemente aún de aproximadamente 17°C a aproximadamente 25°C; y mejor aún a aproximadamente 18°C. Sin embargo, se prefiere que las células de espermatozoides no estén expuestas a temperaturas que afecten en forma sustancialmente negativa la viabilidad de las células. El inhibidor puede ser cualquiera de una gama de composiciones que tienen el efecto de deprimir la movilidad de los espermatozoides. Dichas composiciones incluyen, por ejemplo, inhibidores de la ATPasa de sodio/potasio, tales como, la ouabaína; composiciones que comprenden iones potasio; y composiciones que comprenden iones potasio y sodio. Por ejemplo, las concentraciones relativamente altas de iones potasio en la suspensión tienden a disminuir la movilidad de los espermatozoides. Por lo tanto, en general, se prefiere que la suspensión contenga una fuente de iones potasio y que la concentración de potasio en la suspensión sea de al menos aproximadamente 0.05 moles/I. Más preferentemente, la concentración de potasio es de al menos aproximadamente 0.05 moles/l a aproximadamente 0.5 moles/l. Aún más preferentemente, la concentración de potasio es de al menos aproximadamente 0.1 moles/l a aproximadamente 0.3 moles/l. Mejor aún, la concentración de potasio es de aproximadamente 0.173 moles/l. Dichas suspensiones habitualmente, pero no necesariamente, contendrán también una fuente de iones sodio. Cuando esté presente el sodio, la relación molar de potasio a sodio será generalmente igual o mayor a 1 :1 , respectivamente. Preferentemente, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 1.25: 1. Aún más preferentemente, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 1 .5:1 . Aún más preferentemente, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 1.75:1. Aún más preferentemente, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 1.78:1. En una modalidad particular, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 2:1. En otra modalidad adicional, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 3:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 4:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 5:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 6:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 7:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de potasio a sodio es de al menos aproximadamente 8:1. La suspensión de espermatozoides puede comprender adicionalmente un ion o una fuente de dióxido de carbono capaz de atenuar la incorporación de carbohidratos. En esta modalidad, la fuente de dióxido de carbono puede ser, por ejemplo, uno o más carbonates. En una modalidad actualmente de elección, la suspensión de espermatozoides comprende NaHCO3 y KHCO3, que proporcionan una fuente de iones potasio y sodio así como también una presión parcial de dióxido de carbono. Por ejemplo, en una modalidad actualmente de elección, la suspensión comprende NaHC03 y KHCO3 en una solución acuosa, preferentemente NaHCOa, KHCO3, y C6H8O7'H2O en agua; en general, la concentración de KHCO3 en la dispersión puede ser de al menos aproximadamente 0.05 moles/l. Más preferentemente, la concentración de KHCO3 es de al menos entre aproximadamente 0.05 moles/l y aproximadamente 0.5 moles/l. Aún más preferentemente, la concentración de KHCO3 es de al menos entre aproximadamente 0.1 moles/l y aproximadamente 0.3 moles/l. En una modalidad particularmente de elección, la suspensión se forma usando un amortiguador inhibitorio que contiene 0.097 moles/l de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHCO3, 0.090 moles/l de C6H807*H2O en agua como se establece en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fértil., 6:351-359 (1963). Los espermatozoides generalmente permanecerán latentes mientras estén expuestos al inhibidor o a los inhibidores de movilidad. Cuando el C6H807*H20 está presente en la dispersión, la relación molar de KHCO3 a NaHC03 puede ser la que se describió anteriormente. La relación molar de KHCO3 a ?ß?8?7·?2? generalmente puede ser igual o mayor que 1 :1 , respectivamente, pero generalmente no excede la relación molar de 8:1. Preferentemente, la relación molar de KHC03 a C-6H8O7'H2O es de al menos aproximadamente 1.25:1. Aún más preferentemente, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7*H2O es de al menos aproximadamente 1.5:1. Aún más preferentemente, la relación molar de KHCO3 a C6H80 *H2O es de al menos aproximadamente 1.75:1. En una modalidad particular, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7»H2O es de al menos aproximadamente 1.78:1. En otra modalidad particular, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7'H20 es de al menos aproximadamente 2:1. En otra modalidad adicional, la relación molar de KHCO3 a C6H807*H20 es de al menos aproximadamente 3:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de KHCO3 a C6H807»H20 es de al menos aproximadamente 4:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7'H20 es de al menos aproximadamente 5:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7»H2O es de al menos aproximadamente 6:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de KHCO3 a C6H8O7*H20 es de al menos aproximadamente 7:1. En otra modalidad adicional más, la relación molar de KHCO3 a 06?807·?2? es de al menos aproximadamente 8:1. En una modalidad particularmente de elección, la dispersión se forma usando un amortiguador inhibitorio que contiene 0.097 moles/l de NaHC03, 0.173 moles/l de KHCO3, 0.090 moles/l de C6H807'H20 en agua como se establece en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fértil., 6:351-359 (1963). Las células de espermatozoides generalmente permanecerán latentes mientras estén expuestas al inhibidor o a los inhibidores de movilidad. La evidencia experimental hasta el momento sugiere además que la salud general y otras características vitales de las células de espermatozoides puede mejorarse si la suspensión celular se mantiene bajo una atmósfera que tenga una presión parcial aumentada de dióxido de carbono respecto al aire. En una modalidad de elección, la atmósfera sobre la suspensión tiene una presión parcial de dióxido de carbono de al menos 0.9; más preferentemente de al menos aproximadamente 0.95.

Las células latentes se pueden volver a un estado activo si se separan del inhibidor de movilidad y se exponen al aire. Además, la iniciación de un estado activo se puede inducir adicionalmente mediante la dilución de las células en un suero fisiológico (Salisbury et al., 1963) o en un amortiguador como por ejemplo el amortiguador TCA o PBS. Generalmente, al menos aproximadamente 20%, preferentemente al menos aproximadamente 50%, más preferentemente al menos aproximadamente 60%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 95%, todavía aún más preferentemente al menos aproximadamente 99% de las células que regresan a un estado activo (es decir, las células reactivadas) tendrán una velocidad de trayectoria, una velocidad progresiva, o ambas, medidas con el análisis de espermatozoides HTM-IVOS, de al menos aproximadamente 50%, preferentemente al menos aproximadamente 60%, más preferentemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 90%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 95%, todavía aún más preferentemente al menos aproximadamente 99% de la velocidad de trayectoria, la velocidad progresiva, o ambas de las células de espermatozoides antes de ser combinadas con el inhibidor de movilidad (es decir, células de espermatozoides de un eyaculado reciente).

En general, el proceso de separación de células comprende una serie de pasos discretos, es decir, la recolección de una muestra de células, la tinción de las células, la separación de las células, la recolección de las células separadas y, opcionalmente, la criodilución de las células separadas. Resulta ventajoso que el inhibidor de movilidad se pueda incluir en las suspensiones de espermatozoides formadas o empleadas en uno o más de estos pasos.

Recolección de la muestra de células Las células de espermatozoides intactos y viables bovinos porcinos, equinos o de otro mamífero, se pueden recoger y poner en contacto con el inhibidor de movilidad. Se conocen diversos métodos de recolección de espermatozoides viables e incluyen, por ejemplo, el método de mano enguantada, el uso de una vagina artificial y la electroeyaculación. Como ejemplo, una muestra de semen bovino, que habitualmente contiene aproximadamente de 0.5 a 10 mil millones de espermatozoides por mililitro, puede recogerse directamente del mamífero fuente en un recipiente que contenga un inhibidor de movilidad para formar una suspensión de espermatozoides. De modo alternativo, la muestra de semen puede recogerse en un recipiente vacío y posteriormente ponerse en contacto con el inhibidor de movilidad hasta varias horas después de la recolección para formar la suspensión de espermatozoides.

Además de un amortiguador, la suspensión de espermatozoides también puede contener una gama de aditivos para mejorar la viabilidad de los espermatozoides. Algunos aditivos de ejemplo incluyen fuentes de proteínas, antibióticos, y preparaciones que regulan las reacciones de oxidación/reducción en forma intracelular y/o extracelular. Las fuentes de proteínas ejemplares incluyen yema de huevo, extracto de yema de huevo, leche (incluida homogeneizada por calor y descremada), extracto de leche, proteína de soja, extracto proteico de soja, albúmina sérica, albúmina sérica bovina, suplemento sustituto de suero humano y combinaciones de estos. La albúmina, y particularmente la albúmina sérica bovina (BSA), es una fuente de proteínas preferida. Por ejemplo, si se incluye, la BSA puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una cantidad de menos de aproximadamente un 5.0% (p/v), preferentemente menos de aproximadamente un 2% (p/v), más preferentemente menos de aproximadamente un 1 % (p/v), y mejor aún en una cantidad de aproximadamente un 0.1% (p/v). El uso de una fuente de proteínas, tal como la BSA, puede iniciar por sí misma el proceso de capacitación en un porcentaje de las células de espermatozoides en la suspensión. Es preferible que este proceso tenga lugar en el conducto reproductor femenino. Por consiguiente, para inhibir la iniciación de la capacitación durante la dilución, así como durante la tinción y separación posterior, se puede incluir una fuente de proteínas alternativa o un sustituto proteico en la suspensión de espermatozoides. La fuente de proteínas o el sustituto proteico alternativo poseen los efectos ventajosos de una fuente de proteínas característica, tal como la BSA, además de la capacidad para inhibir el inicio de la capacitación en un porcentaje mayor de las células en la suspensión de espermatozoides. Los ejemplos de fuentes alternativas de proteínas incluyen suplemento sustituto de suero humano (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y BSA mejorada con colesterol, mientras que un ejemplo de sustitutos proteicos incluye un alcohol polivinílico, como por ejemplo, un alcohol polivinílico de viscosidad baja a media, en general de un peso molecular de aproximadamente 30,000 a aproximadamente 60,000. En general, si se incluyen, estas preparaciones estarán presentes en las mismas cantidades antes descritas respecto a la BSA, con el contenido total de albúmina del amortiguador o de la solución amortiguada generalmente estará por debajo de aproximadamente 5.0% (p/v). Algunas composiciones de ejemplo que regulan las reacciones de oxidación/reducción en forma intracelular y/o extracelular incluyen por ejemplo, piruvato, vitamina K, ácido lipoico, glutatión, flavinas, quinonas, superóxido dismutasa (SOD) y modelos de superóxido dismutasa. Si se incluye en la suspensión de espermatozoides, tal preparación puede estar presente en una concentración suficiente para efectuar el efecto protector sin afectar perjudicialmente la salud de los espermatozoides. Los intervalos de concentración de ejemplo incluyen de aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 20 m según factores como la composición particular que se esté usando o la concentración de espermatozoides en la suspensión. Por ejemplo, el piruvato puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, preferentemente desde aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, y más preferentemente aproximadamente 10 mM. La vitamina K puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración desde aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 100 µ?, preferentemente desde aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 100 µ?, y más preferentemente aproximadamente 100 µ?. El ácido lipoico puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración desde aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, preferentemente desde aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 1 mM, y más preferentemente aproximadamente 1 mM. Se puede incluir un antibiótico en la suspensión de espermatozoides con el fin de inhibir el crecimiento bacteriano. Los ejemplos de antibióticos incluyen, por ejemplo, tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina, Linco-Spectin® (clorhidrato de lincomicina-espectinomicina), penicilina, estreptomicina, ticarcilina, o cualquier combinación de estos. Si se incluyen, los antibióticos pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 800 pg por mi de semen, independientemente de si el semen está puro, amortiguado o contiene sustancias adicionales, como por ejemplo, cualquiera de los aditivos mencionados aquí. Los Servicios de Semen Certificados (CSS) y la Asociación Nacional de Criadores de Animales (NAAB) han promulgado las pautas con respecto al uso de antibióticos en lo que se refiere a la recolección y el uso de espermatozoides. Se puede agregar un factor de crecimiento a la dispersión de espermatozoides con el fin de mantener la viabilidad de las células de espermatozoides. Entre los ejemplos de factores de crecimiento se incluyen, por ejemplo, los factores de crecimiento transformadores ("TGF"), tales como por ejemplo, TGF -1 y TGF -2, y factores de crecimiento similares a la insulina ("IGF"), tales como por ejemplo, IGF-1. Por los general, los TGF pueden encontrarse en la dispersión de espermatozoides en forma de TGFp-en una concentración de aproximadamente 0.1 ng/l a aproximadamente 10 g/l o en forma de TGF -2 en una concentración de aproximadamente 0.1 ng/l a aproximadamente 200 ng/l, y los IGF pueden encontrarse en la dispersión de espermatozoides en forma de IGF-1 en una concentración de aproximadamente 0.1 ng/l a aproximadamente 50 pg/l. El uso de dichos factores de crecimiento es bien conocido en el área y se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente norteamericana No. 2003/0157473, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia. Una vez recolectadas, las células se pueden almacenar en un estado de latencia durante varias horas a temperatura ambiente, durante varias semanas a una temperatura reducida, tal como por ejemplo a 5°C, o se pueden almacenar durante varios meses en un criodiluyente como se trata a continuación. Preferentemente, la atmósfera encima de las células tiene una presión parcial alta de C02 como ya se discutió. Como alternativa, los espermatozoides recogidos se pueden usar dentro de un plazo de varias horas, tal como por ejemplo en un proceso de fertilización, un proceso de tinción o un proceso de separación.

Tinción de las células Se puede usar un inhibidor de movilidad para dejar inmóviles las células durante la tinción de las células. Un proceso de tinción de células de espermatozoides habitualmente comprende la formación de una mezcla de tinción, a veces denominada mezcla de etiquetado, que contiene células de espermatozoides viables intactos, un inhibidor de movilidad y un pigmento, a veces denominado etiqueta. En este aspecto de la invención, el inhibidor de movilidad puede ponerse en contacto con las células de espermatozoides para formar una suspensión de espermatozoides, y luego se pone la suspensión en contacto con un pigmento selectivo para ADN. En esta modalidad, la fuente de espermatozoides puede ser el semen puro, o de modo alternativo, un derivado de semen que contenga espermatozoides obtenido mediante centrifugación o el uso de otros medios para separar el semen en fracciones. En una modalidad alternativa, el pigmento puede combinarse con un inhibidor de movilidad, formando así una solución de pigmento. Así, por ejemplo, el pigmento en forma de un sólido puro, incluyendo un polvo que fluye libremente, o una preparación líquida se puede combinar con el inhibidor para formar una solución de pigmento, la cual puede luego combinarse con semen puro, una suspensión de espermatozoides o un derivado de semen que contenga espermatozoides. En cualquier caso, las células de espermatozoides generalmente permanecerán latentes siempre que se mantengan en el inhibidor. (Salisbury et al., 1963). Sin embargo, se prefiere que la mezcla de tinción se mantenga bajo una atmósfera que tenga una presión parcial enriquecida de dióxido de carbono respecto al aire; por ejemplo, generalmente se prefiere proporcionar una atmósfera sobre la mezcla de tinción que sea 99%+ de C02. El pH de la mezcla de tinción puede mantenerse a cualquiera de un intervalo de pH; habitualmente, estará en la escala de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 9.0. Por ejemplo, la mezcla de tinción se puede mantener en un pH "levemente ácido", es decir, de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0. En esta modalidad, el pH es preferentemente de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.0, más preferentemente de aproximadamente 6.0 y aproximadamente 6.5 y más preferentemente a aproximadamente 6.2. Como alternativa, la mezcla de tinción se puede mantener en un pH "levemente básico", es decir, de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.0. En esta modalidad, el pH es preferentemente de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0, más preferentemente de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.5 y más preferentemente a aproximadamente 7.3. La mezcla de tinción puede formarse mediante uno o más pigmentos excitables con luz ultravioleta o visible, selectivos para ADN como se describieron previamente en la Patente de los Estados Unidos No. 5,135,759 y WO 02/41906. Los ejemplos de pigmentos excitables con luz ultravioleta selectivos incluyen Hoechst 33342 y Hoechst 33258, cada uno de los cuales se puede comprar en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los ejemplos de pigmentos excitables con luz visible incluyen SYBR-14, que se puede comprar en Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1 -(difluoroboril)-3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2H-pirrol-5-il)propanoil]amino}-N-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H,3'H-2,5'-bibencimidazol-2'-il]fenoxi}acetil)amino]propil}amino)propil]hexanamida ("BBC") descrito en WO 02/41906. Cada uno de estos pigmentos puede usarse solo o combinado; de modo alternativo, se pueden usar otros pigmentos excitables con luz ultravioleta y visible que penetren en la célula, solo o en combinación con los pigmentos ya mencionados, siempre que el pigmento no afecte perjudicialmente la viabilidad de las células de espermatozoides a un grado inadmisible cuando se use en las concentraciones que permiten la separación según se describe en otro sitio. De manera alternativa, la mezcla de tinción puede formarse usando poliamidas fluorescentes, y más específicamente poliamidas con una etiqueta fluorescente o un indicador conjugado con ellas. Tales etiquetas emitirán fluorescencias cuando estén unidas a ácidos nucleicos. Los ejemplos de poliamidas con etiquetas fluorescentes o indicadores unidos a ellas incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en Best et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 100(21 ): 12063-12068 (2003); Gygi, et al., Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002); Patente norteamericana No. 5,998,140; Patente norteamericana No. 6,143,901 ; y Patente norteamericana No. 6,090,947, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia. También se pueden usar secuencias de nucleotidos fluorescentes para etiquetar las células. Dichas secuencias de nucleotidos emiten fluorescencia cuando se hibridan en un ácido nucleico que contenga una secuencia blanco o complementaria, pero de lo contrario no son fluorescentes cuando se encuentran en un estado no hibridado. Tales oligonucléotidos se describen, por ejemplo, en la Publicación de la solicitud de patentes de los Estados Unidos No. 2003/0113765 (por la presente incorporada aquí por referencia). Los anticuerpos específicos para sexo también se pueden usar para etiquetar las células de espermatozoides en una mezcla de tinción. En esta modalidad, por ejemplo, un anticuerpo específico para sexo puede conjugarse con grupo fluorescente (o molécula indicadora equivalente). Dado que el anticuerpo se une a los antígenos presentes sólo en una célula con cromosoma X o, de modo alternativo, con cromosoma Y, dichas células se pueden identificar de manera selectiva según su fluorescencia (frente a la no fluorescencia de una célula no etiquetada). Además, se pueden utilizar simultáneamente más de un anticuerpo específico para sexo, donde cada anticuerpo tiene una fracción fluorescente distinta unida. Esto permite diferenciar las células con cromosomas X y con cromosomas Y según la distinta fluorescencia de cada una.

También se puede utilizar nanocristales luminiscentes selectivos al color para etiquetar las células de espermatozoides en una mezcla de tinción. También llamadas puntos cuánticos, estas partículas son bien conocidas en el área, como lo demuestran la Patente norteamericana No. 6,322,901 y la Patente norteamericana No. 6,576,291 , cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia. Estos nanocristales se han conjugado en varios materiales biológicos, incluyendo por ejemplo, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, estreptavidina y polisacáridos, (ver, por ejemplo, las Patentes norteamericanas Nos. 6,207,392; 6,423,551 ; 5,990,479 y 6,326,144, cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia) y se han usado para detectar blancos biológicos (ver, por ejemplo, las Patentes norteamericanas Nos. 6,207,392 y 6,247,323, cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia). La concentración preferida de pigmento selectivo para ADN o de cualquier otro tipo de pigmento en la mezcla de tinción depende de una cantidad de variables que incluyen la permeabilidad de las células al pigmento seleccionado, la temperatura de la mezcla de tinción, el tiempo que se deja para la tinción y el grado de enriquecimiento deseado en el posterior paso de separación. En general, la concentración de pigmento debe ser preferentemente suficiente para lograr el grado deseado de tinción en un periodo razonablemente corto sin afectar sustancialmente de modo perjudicial la viabilidad de los espermatozoides. Por ejemplo, la concentración de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC en la mezcla de tinción en general estará de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 1.0 M, preferentemente de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 700 µ? y más preferentemente de aproximadamente 100 µ? a aproximadamente 200 µ?. En una modalidad particularmente preferida, la concentración de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC en la combinación de tinción en general estará de aproximadamente 400 µ? a aproximadamente 500 µ y más preferentemente de aproximadamente 450 µ . En consecuencia, en un conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es preferentemente de aproximadamente 100 µ?. En otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es de aproximadamente 150 µ?. En aún otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración es preferentemente de aproximadamente 200 µ?. Bajo otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es más preferentemente de aproximadamente' 450 µ?. Como otro ejemplo, la concentración de una poliamida fluorescente, como por ejemplo las descritas en la Publicación de solicitud de los Estados Unidos No. 2001/0002314, se encontrará entre aproximadamente 0,1 µ? y aproximadamente 1 mM, preferentemente de aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 1 mM, más preferentemente de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 100 µ?, e incluso más preferentemente aproximadamente 10 µ?. Opcionalmente, la mezcla de tinción también puede contener aditivos para mejorar la viabilidad de los espermatozoides. Entre los ejemplos de aditivos se incluyen un antibiótico, un factor de crecimiento o una preparación que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente como ya se discutió respecto a la recolección de la muestra de células. Estos aditivos se pueden agregar al líquido de recolección de acuerdo con eso. Una vez formada, la mezcla de tinción puede mantenerse a cualquiera de una variedad de temperaturas; habitualmente, estará en la escala de aproximadamente 4°C a aproximadamente 50°C. Por ejemplo, la mezcla de tinción puede mantenerse a una temperatura "relativamente baja", es decir, a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C, más preferentemente de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C y mejor aún a aproximadamente 28°C. De modo alternativo, la mezcla de tinción puede mantenerse en un intervalo de temperatura "intermedio", es decir, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 39°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente de aproximadamente 34°C a aproximadamente 39°C y mejor aún a aproximadamente 37°C. Además, la mezcla de tinción puede mantenerse en un intervalo de temperatura "relativamente alto", es decir, una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente de aproximadamente 40°C a aproximadamente 45°C, más preferentemente de aproximadamente 40°C a aproximadamente 43°C y mejor aún a aproximadamente 41 °C. La selección de una temperatura preferida depende en general de una cantidad de variables, incluyendo por ejemplo, la permeabilidad de las células al o a los pigmentos usados, la concentración del o de los colorantes en la mezcla de tinción, el tiempo que se mantendrán las células en la mezcla de tinción y el grado de enriquecimiento deseado en el paso de separación. Se deja que las células de espermatozoides incorporen el pigmento durante un periodo suficiente para obtener el grado deseado de tinción de ADN. Ese periodo es normalmente un periodo suficiente para que el colorante se una al ADN de las células de espermatozoides de tal manera que las células de espermatozoides con cromosomas X e Y puedan separarse según la intensidad de fluorescencia diferente y medible entre ambos. En general, esto no será más de aproximadamente 160 minutos, preferentemente no más de aproximadamente 90 minutos, más preferentemente aún no más de aproximadamente 60 minutos y mejor aún entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 40 minutos. En consecuencia, en una modalidad, una mezcla de tinción se forma de manera que contenga células de espermatozoides, un inhibidor de movilidad y un pigmento en una concentración de aproximadamente 100 µ? a aproximadamente 200 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 41 °C. En otra modalidad, el inhibidor de movilidad contiene 0.204 g de NaHCO3, 0.433 g de KHC03 y 0.473 g de 06?8?7·?2? cada 25 mi de agua purificada (0.097 moles/1 de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l C6H807»H20 en agua). En otra modalidad, se forma una mezcla de tinción de manera que comprenda células de espermatozoides, un inhibidor de movilidad y un pigmento en una concentración de aproximadamente 400 µ? a aproximadamente 500 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura dé aproximadamente 41 °C. En otra modalidad, la concentración del pigmento es de 450 µ?. En otra modalidad, el inhibidor de movilidad contiene 0,204 g de NaHCO3, 0.433 g de KHCO3 y 0.473 g de C6H8O7-H20 cada 25 mi de agua purificada (0.097 moles/l de NaHC03, 0.173 moles/l de KHCO3, 0.090 moles/l C6H8O7'H2O en agua). En otra modalidad adicional, una mezcla de tinción se forma de manera que comprenda células de espermatozoides, un inhibidor de movilidad y un pigmento en una concentración de aproximadamente 100 µ? a aproximadamente 200 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28°C. En otra modalidad, el inhibidor de movilidad contiene 0.204 g de NaHC03, 0.433 g de KHCO3 y 0.473 g de 06?8?7·?2? cada 25 mi de agua purificada (0.097 moles/l de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHCO3, 0.090 moles/l C6H807«H2O en agua). En otra modalidad adicional, una mezcla de tinción se forma de manera que contenga espermatozoides, un inhibidor de movilidad y un pigmento en una concentración de aproximadamente 400 µ? a aproximadamente 500 µ?, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28°C. En otra modalidad, la concentración del pigmento es de 450 µ?. En otra modalidad, el inhibidor de movilidad contiene 0.204 g de NaHCO3, 0.433 g de KHCO3 y 0.473 g de C6H8O7*H2O cada 25 mi de agua purificada (0.097 moles/1 de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l C6H8O7'H20 en agua).

Separación También se puede usar un inhibidor de movilidad para dejar inmóviles las células de espermatozoides durante la separación de las células de espermatozoides. Por lo general, una vez que los espermatozoides se tiñen de acuerdo con la presente invención, se pueden separar mediante métodos conocidos que permitan la separación con base en la fluorescencia. Entre los métodos comúnmente usados y más conocidos están los sistemas de citometría de flujo, que se ejemplifican y describen en las Patentes norteamericanas Nos. 5,135,759, 5,985,216, 6,071 ,689, 6,149,867 y 6,263,745, publicaciones de patentes internacionales WO 99/33956 y WO 01/37655 y la solicitud de patente norteamericana No. de serie 10/812,351 , cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia y la publicación de patente internacional correspondiente WO 2004/088283. Cuando se separa de acuerdo con dichos métodos, los espermatozoides se introducen en la boquilla de un citómetro de flujo en un líquido de muestra. Por lo tanto, en una modalidad, el líquido de muestra puede contener las células de espermatozoides teñidas y un inhibidor de la movilidad. De la misma manera, el líquido envolvente que se usa para rodear la corriente de líquido de muestra mientras atraviesa el citómetro también puede contener un inhibidor de movilidad. En general, el líquido envolvente se puede introducir en una boquilla del citómetro mediante gas a presión o mediante una bomba de jeringas. Preferentemente, el gas a presión es dióxido de carbono o nitrógeno, más preferentemente nitrógeno. De forma alternativa, el gas a presión puede ser dióxido de carbono, aunque en dichas circunstancias, se debe tener cuidado de minimizar la efervescencia. Opcionalmente, el líquido de muestra o el líquido envolvente también pueden contener un aditivo, tal como un antibiótico, una preparación que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular o extracelularmente o un factor de crecimiento como ya se discutió respecto a la recolección de la muestra de células. Cada uno de estos aditivos se puede agregar a cualquiera de los líquidos de acuerdo con eso.

Recolección de las células separadas Una vez separadas, las células separadas se recogen en un recipiente que contiene el líquido de recolección. En general, la finalidad del líquido de recolección incluye amortiguar el impacto de las células de espermatozoides con el recipiente de recolección o proporcionar un soporte líquido para las células.

En una modalidad, el líquido de recolección contiene un inhibidor de movilidad y una fuente de proteínas. Si se incluye, la fuente de proteínas puede ser cualquier fuente de proteínas que no interfiera con la viabilidad de las células de espermatozoides y que sea compatible con el inhibidor de movilidad. Son ejemplos de fuentes de proteínas la leche (incluida la homogeneizada por calor y descremada), el extracto de leche, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Dichas proteínas se pueden usar en una concentración de de aproximadamente 1% (v/v) a aproximadamente 30% (v/v), preferentemente de aproximadamente 10% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v), y más preferentemente de aproximadamente 10% (v/v). Opcionalmente, el líquido de recolección también puede contener aditivos, tal como un antibióticó, un factor de crecimiento o una preparación que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular o extracelularmente como ya se discutió respecto a la recolección de la muestra de células. Cada uno de estos aditivos se puede agregar al líquido de recolección de acuerdo con eso. En consecuencia, en cierta modalidad, el líquido de recolección contiene 0.097 moles/l de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l de ?6?8?7·?2? y 10% (v/v) de yema de huevo en agua, a un pH de aproximadamente 6.2, más preferentemente de aproximadamente 7.0 y aún más preferentemente de aproximadamente 6.5. Preferentemente, el líquido de recolección se mantiene bajo una atmósfera que tiene una presión parcial enriquecida con dióxido de carbono respecto al aire; por ejemplo, la atmósfera puede tener una presión parcial de dióxido de carbono que supere 0.9, más preferentemente 0.95 y aún más preferentemente 0.99. En lugar de utilizar un líquido de recolección más tradicional, las células separadas se pueden recoger en un recipiente que contenga o esté recubierto con un criodiluyente. En consecuencia, en una modalidad particular, las células separadas se recogen en un criodiluyente que contiene un inhibidor de movilidad. En otra modalidad, las células separadas se recogen en un criodiluyente que contiene un inhibidor de movilidad, agua, Triladyl® (Minitube, Verana, Wl, que comprende glicerol, tris, ácido cítrico, fructosa, 5 mg/100 mi de tilosina, 25 mg/100 mi de gentamicina, 30 mg/100 mi de espectinomicina y 15 mg/100 mi de lincomicina), yema de huevo y ácido pirúvico. En otra modalidad adicional, el líquido de recolección es el criodiluyente que contiene 0.097 moles/l de NaHC03, 0.173 moles/l de KHC03 y 0.090 moles/l de C6H8O7'H20 en agua y 25 g de Triladyl®, 25 g de yema de huevo y 10 mM de ácido pirúvico cada 75 mi de agua.

Criodilución de las células separadas Una vez que los espermatozoides se han separado y recolectado en recipientes de recolección, se pueden utilizar para inseminar hembras de mamíferos. Esto puede ocurrir casi de inmediato, lo que requiere poco tratamiento adicional para los espermatozoides. De la misma forma, los espermatozoides también pueden enfriarse o congelarse para utilizar posteriormente. En tales casos, resulta ventajosa para los espermatozoides la adición de un criodiluyente para minimizar el impacto que podría tener el enfriado y congelado sobre la viabilidad o la movilidad posterior al descongelado. Se puede usar un inhibidor de movilidad para dejar inmóviles las células en el criodiluyente. Por lo general, un criodiluyente puede contener un inhibidor de movilidad, una fuente de proteína y un crioprotector. Si se incluye, se puede agregar una fuente de proteína para proporcionar soporte a las células y para amortiguar el contacto de las células con el recipiente de recolección. La fuente de proteínas puede ser cualquier fuente de proteínas que no interfiera con la viabilidad de las células de espermatozoides y que sea compatible con el inhibidor de movilidad. Son ejemplos de fuentes de proteínas la leche (incluida la homogeneizada por calor y descremada), el extracto de leche, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Dichas proteínas pueden estar en una concentración de aproximadamente 10% (v/v) aproximadamente 30% (v/v), preferentemente de aproximadamente 10% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v), y más preferentemente de aproximadamente 20% (v/v). Es preferible incluir un crioprotector en el criodiluyente para disminuir o evitar el choque término o para mantener la fertilidad de los espermatozoides. Se conocen muchos crioprotectores en el área. La selección de un crioprotector adecuado para usar con un diluyente dado puede variar y depende de la especie de la cual se obtuvieron los espermatozoides que se van a congelar. Son ejemplos de crioprotectores adecuados, por ejemplo, el glicerol, el dimetil sulfóxido, el etilenglicol, el propilenglicol, la trehalosa, el Triladyl® y combinaciones de ellos. Si se incluyen, por lo general, estos criprotectores están presentes en una cantidad de aproximadamente 1 % (v/v) a aproximadamente 15% (v/v), preferentemente de aproximadamente 5% (v/v) a aproximadamente 10% (v/v), más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 7% (v/v), y más preferentemente aún en una cantidad de aproximadamente 6% (v/v). En una modalidad particular, el criodiluyente contiene un inhibidor de movilidad, agua, Triladyl®, yema de huevo y ácido pirúvico. En otra modalidad adicional, el criodiluyente contiene 0.097 moles/I de NaHC03, 0.173 moles/l de KHCO3 y 0.090 moles/l de 06?8?7·?2? en agua y 25 g de Triladyl®, 25 g de yema de huevo y 10 mM de ácido pirúvico cada 75 mi de agua. En otra modalidad particular, el criodiluyente contiene un inhibidor de movilidad, agua, Triladyl® y yema de huevo. En otra modalidad adicional más, el criodiluyente contiene 0.097 moles/I de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHC03 y 0.090 moles/l de C6H8O7'H20 en agua y 25 g de Triladyl® y 25 g de yema de huevo cada 75 mi de agua. Opcionalmente, el criodiluyente también puede contener un antibiótico, un factor de crecimiento o una preparación que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente como ya se discutió respecto a la recolección de la muestra de células. Cada uno de estos aditivos se puede agregar al líquido de recolección de acuerdo con eso. Una vez descrita la invención en detalle, resultará evidente que las modificaciones y variaciones son posibles sin apartarse del alcance de la invención definido en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención.

EJEMPLO 1 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión del semen en un amortiguador TCA o en un inhibidor con base de carbonato. El Cuadro I a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 600 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 28°C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción (aproximadamente 1 hora). Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y se analizaron mediante IVOS para medir la movilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Las comparaciones de los porcentajes de movilidades progresivas se observan en las Figuras 1-3.

EJEMPLO 2 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 450 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión del semen en un amortiguador TCA o bien en un inhibidor con base de carbonato. El Cuadro II a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

CUADRO II A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 1000 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron en un baño de agua a 28°C durante 1 hora y luego se diluyeron hasta una concentración de 150 X 06 espermatozoides/ml con piruvato 10 mM en TCA o un inhibidor con base de carbonato a un pH 6.2 como se indica específicamente en cada figura para diluir hasta una concentración típica para separar. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de espermatozoides teñidos y diluidos al momento designado en cada figura y se agregaron 200 pL de piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y se analizaron mediante IVOS para medir el porcentaje de movilidad progresiva. Las comparaciones de los porcentajes de movilidades progresivas se observan en las Figuras 4-6.

EJEMPLO 3 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 450 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión del semen en un amortiguador TCA o bien en un inhibidor con base de carbonato. El Cuadro III a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

CUADRO III A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 300 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron en un baño de agua a 41 °C durante 30 minutos y luego se diluyeron hasta una concentración de 150 X 106 espermatozoides/ml con piruvato 10 mM en TCA o un inhibidor con base de carbonato a un pH 6.2 como se indica específicamente en cada figura para diluir hasta una concentración típica para separar. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de espermatozoides teñidos y diluidos al momento designado en cada figura y se agregaron 200 pL de piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y las alícuotas se analizaron mediante IVOS para medir el porcentaje de movilidad progresiva. Las comparaciones de los porcentajes de movilidades progresivas se observan en las Figuras 7-9.

EJEMPLO 4 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de amortiguador de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/mi mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en amortiguador TCA, pH 7.3 a 41 °C. Se preparó 1 mi adicional de 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión de una alícuota de semen en amortiguador TCA a 41 °C que contiene piruvato 10 mM a pH 7.3. A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de pigmento de 400 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 41 °C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL del mismo amortiguador a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir el % de movilidad progresiva (% Prog Mot). Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 10.

EJEMPLO 5 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4 con la siguiente excepción. El amortiguador utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 10 µ? de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 11.

EJEMPLO 6 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4 con la siguiente excepción. El amortiguador utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 100 µ? de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 12.

EJEMPLO 7 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4 con la siguiente excepción. Los amortiguadores utilizados para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fueron TCA y TCA con 1 m de ácido lipoico. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 13.

EJEMPLO 8 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de amortiguador de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml mediante centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en amortiguador TCA, pH 7.3 a 28°C. Se preparó 1 mi adicional de 150 X 06 espermatozoides/ml mediante la suspensión de una alícuota de semen en amortiguador TCA a 28°C que contiene piruvato 10 mM a pH 7.3. A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 0 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de pigmento de 600 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 28°C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL del mismo amortiguador a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la movilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 14.

EJEMPLO 9 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 8 con la siguiente excepción. El amortiguador utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 100 pM de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 15.

EJEMPL0 10 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 8 con la siguiente excepción. Los amortiguadores utilizados para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fueron TCA y TCA con 1 mM de ácido lipoico. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 16.

EJEMPL0 11 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de amortiguador de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 50 X 106 espermatozoides/ml mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de amortiguador TCA o en 1 mi de amortiguador TCA con 2.5 mM, 10 mM, 25 mM ó 50 mM piruvato. A las muestras se agregó una solución de MON33342 para dar concentraciones finales de pigmento de 600 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides teñidos se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 µ?_ del mismo amortiguador a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la movilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en las Figuras 17.

EJEMPLO 12 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de amortiguador de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 06 espermatozoides/ml en amortiguador TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de amortiguador TCA. Se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml en 10 mM piruvato en TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de piruvato 10 mM en amortiguador TCA. A las muestras se agregó una solución de pigmento SYBR 14 para dar concentraciones finales de pigmento de 20 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL del mismo amortiguador a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la movilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en las Figuras 18.

EJEMPLO 13 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de amortiguador de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la movilidad y la movilidad progresiva mediante el analizador de movilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml en amortiguador TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de amortiguador TCA. Se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/mi en 10 mM piruvato en TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de piruvato 10 mM en amortiguador TCA. A las muestras se agregó una solución de BBC para dar concentraciones finales de pigmento de 100 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides teñidos se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL del mismo amortiguador a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la movilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en las Figuras 19.

EJEMPLO 14 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 4 con la siguiente excepción. La concentración de tinción fue 200 µ? de BBC. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la Figura 20.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables y no móviles, la concentración de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides por mi.

2. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables, los espermatozoides teniendo una movilidad más característica de los espermatozoides en el epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie, la concentración de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó a! menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides por mi.

3. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables, una cantidad de potasio y sodio que inhibe la movilidad, la concentración de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides por mi y la relación molar de potasio a sodio es mayor que 1 :1 , respectivamente.

4. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la relación molar de potasio a sodio es mayor que 1.25:1 , respectivamente.

5. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la relación molar de potasio a sodio es mayor que 1.5:1 , respectivamente.

6. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la relación molar de potasio a sodio es mayor que 1.75:1 , respectivamente.

7.- La suspensión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la relación molar de potasio a sodio es mayor que 2:1 , respectivamente.

8. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables e inmóviles y un pigmento selectivo para ADN.

9. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables y un pigmento selectivo para ADN, los espermatozoides tienen una tasa metabólica y movilidad más característica de los espermatozoides del epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie.

10. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables e inmóviles, los espermatozoides tienen un pigmento selectivo para ADN asociado con su ADN.

11. - Una suspensión celular de espermatozoides, caracterizada porque comprende espermatozoides viables, los espermatozoides tienen una tasa metabólica y movilidad más característica de los espermatozoides del epidídimo que de los espermatozoides endógenos eyaculados de la misma especie, los espermatozoides también tienen un pigmento selectivo para el ADN asociado con su ADN.

12. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el pigmento es un pigmento fluorescente selectivo para ADN.

13.- La suspensión de conformidad con ia reivindicación 8, caracterizada además porque el pigmento se puede excitar mediante luz UV o mediante luz visible.

14. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el pigmento se elige del grupo que consiste de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1 -(difluoroboril)-3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2H-pirrol-5-il)propanoil]am¡no}-N-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H,3'H-2,5'-bibencimidazol-2'-il]fenoxi}acetil)amino]propil}amino)propil]hexanamida.

15. - La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la suspensión comprende una fuente de carbonato.

16. - La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la suspensión comprende NaHCO3l KHC03 y C6H8O7-H2O.

17. ·- La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la suspensión se forma a partir de un amortiguador que contiene 0.097 moles/l de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHCO3 y 0.090 moles/l de CeHsOz'h^O en agua.

18. - La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es al menos 1.25 x 108 espermatozoides por mi.

19. - La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es al menos 1.5 x 108 espermatozoides por mi.

20. - La suspensión de espermatozoides de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es al menos 1.75 x 108 espermatozoides por mi.

21.- La suspensión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es menos que aproximadamente 9.0 x 105 espermatozoides por mi.

22. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es menos que aproximadamente 7 x 105 espermatozoides por mi.

23. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es menos que aproximadamente 5 x 105 espermatozoides por mi.

24. - La suspensión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es menos que aproximadamente 2 x 105 espermatozoides por mi.

25.- La suspensión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de espermatozoides en la suspensión es menos que aproximadamente 1 x 105 espermatozoides por mi.

26. - Un proceso para teñir células de espermatozoides, dicho proceso está caracterizado porque comprende formar una mezcla de tinción que contiene células de espermatozoides intactos viables, una cantidad de potasio y sodio que inhibe la movilidad y un pigmento selectivo para ADN.

27. - El proceso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la mezcla de tinción está bajo una atmósfera que tiene una presión parcial de C02 enriquecida respecto al aire.

28.- Un proceso para formar una suspensión celular de espermatozoides para usarse en separación de células, el proceso está caracterizado porque comprende combinar una fuente de células de espermatozoides con una preparación que inhibe la movilidad de las células de espermatozoides para formar una suspensión celular de espermatozoides, la concentración de células de espermatozoides en la suspensión es menor que aproximadamente 1 X 106 ó al menos 1 x 108 espermatozoides por mililitro.

29. - El proceso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la suspensión celular comprende un pigmento selectivo para ADN.

30. - La suspensión de la reivindicación 16, caracterizada además porque comprende adicionalmente un pigmento selectivo para ADN.