JP2001328901A - マウス***凍結保存用キット - Google Patents
マウス***凍結保存用キットInfo
- Publication number
- JP2001328901A JP2001328901A JP2000149039A JP2000149039A JP2001328901A JP 2001328901 A JP2001328901 A JP 2001328901A JP 2000149039 A JP2000149039 A JP 2000149039A JP 2000149039 A JP2000149039 A JP 2000149039A JP 2001328901 A JP2001328901 A JP 2001328901A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cryopreservation
- sperm
- mouse
- kit
- weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 凍結保存した***の融解後の生存率および運
動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス
***凍結保存用キットを提供すること。 【解決手段】 ラフィノースおよび蛋白源を含有するマ
ウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含
むマウス***凍結保存用キット。
動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス
***凍結保存用キットを提供すること。 【解決手段】 ラフィノースおよび蛋白源を含有するマ
ウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含
むマウス***凍結保存用キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、体外受精用のマウ
ス***の凍結保存に関し、より詳細には、凍結保存した
***の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高
い体外受精率が得られるマウス***凍結保存用キットに
関する。
ス***の凍結保存に関し、より詳細には、凍結保存した
***の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高
い体外受精率が得られるマウス***凍結保存用キットに
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、遺伝子改変雄マウスと市販の
雌マウスとの間で体外受精を行い、大量に作出した胚を
凍結保存することが行われている。胚の大量作出には高
い体外受精率を得ることが必須である。このような体外
受精には、凍結保存された雄マウス***がしばしば用い
られている。
雌マウスとの間で体外受精を行い、大量に作出した胚を
凍結保存することが行われている。胚の大量作出には高
い体外受精率を得ることが必須である。このような体外
受精には、凍結保存された雄マウス***がしばしば用い
られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
保存用液を用いてマウス***を凍結保存した場合、融解
後の***の生存率および運動性が低く、それゆえ体外受
精率が低くなるという問題があった。
保存用液を用いてマウス***を凍結保存した場合、融解
後の***の生存率および運動性が低く、それゆえ体外受
精率が低くなるという問題があった。
【０００４】本発明は、上記問題を解決するためになさ
れたものであり、その目的とするところは、融解後の精
子の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精
率が得られるマウス***凍結保存用キットを提供するこ
とである。
れたものであり、その目的とするところは、融解後の精
子の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精
率が得られるマウス***凍結保存用キットを提供するこ
とである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
対し、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
対し、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００６】本発明のマウス***凍結保存用キットは、
マウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを
含む。そのことにより、上記目的が達成される。
マウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを
含む。そのことにより、上記目的が達成される。
【０００７】本発明のマウス***の凍結保存用液は、ラ
フィノースおよび蛋白源を含有する。
フィノースおよび蛋白源を含有する。
【０００８】好適な実施態様において、マウス***の凍
結保存用液中のラフィノースおよび蛋白源の含有量は、
それぞれ１重量％〜３０重量％および０．１重量％〜２
０重量％である。
結保存用液中のラフィノースおよび蛋白源の含有量は、
それぞれ１重量％〜３０重量％および０．１重量％〜２
０重量％である。
【０００９】好適な実施態様において、蛋白源は、スキ
ムミルク、ウシ血清アルブミンおよび血清からなる群よ
り選択される少なくとも１種である。
ムミルク、ウシ血清アルブミンおよび血清からなる群よ
り選択される少なくとも１種である。
【００１０】好適な実施態様において、マウス***の凍
結保存用液は水溶液の形態である。
結保存用液は水溶液の形態である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明において、凍結保存された***の融
解後の生存率は、全***数に対する運動性を呈している
***数の割合により決定される。
解後の生存率は、全***数に対する運動性を呈している
***数の割合により決定される。
【００１３】本発明において、凍結保存された***の融
解後の運動性は、全***数に対する前進運動を呈してい
る***数の割合により決定される。
解後の運動性は、全***数に対する前進運動を呈してい
る***数の割合により決定される。
【００１４】本発明において、凍結保存された***の体
外受精率は、体外受精後、２細胞期に発生した胚および
未受精卵の数を計測し、以下の式に代入することにより
算出される： 体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の
数＋未受精卵の数）｝×１００。
外受精率は、体外受精後、２細胞期に発生した胚および
未受精卵の数を計測し、以下の式に代入することにより
算出される： 体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の
数＋未受精卵の数）｝×１００。
【００１５】本発明のマウス***の凍結保存用液は、ラ
フィノースおよび蛋白源を含有する。
フィノースおよび蛋白源を含有する。
【００１６】ラフィノースは、非還元性三糖の１種であ
り、メリトース、メリトリオース、ゴシポースまたは６
G−α−Ｄ−ガラクトシルスクロースとも呼ばれる。ラ
フィノースは、本発明のマウス***の凍結保存用液にお
いて、***細胞膜を保護し、凍結・融解による細胞膜の
損傷を防ぐ作用を奏する。
り、メリトース、メリトリオース、ゴシポースまたは６
G−α−Ｄ−ガラクトシルスクロースとも呼ばれる。ラ
フィノースは、本発明のマウス***の凍結保存用液にお
いて、***細胞膜を保護し、凍結・融解による細胞膜の
損傷を防ぐ作用を奏する。
【００１７】本発明のマウス***の凍結保存用液中のラ
フィノースの含有量は、好ましくは１重量％〜３０重量
％、より好ましくは１０重量％〜２５重量％、最も好ま
しくは１５重量％〜２１重量％である。含有量が１重量
％より少ない場合、融解後の***の運動性が極端に低下
するという問題があり、３０重量％より多い場合、短時
間の保存でも、作製した凍結保存用液中にラフィノース
の結晶が析出してくるという問題がある。
フィノースの含有量は、好ましくは１重量％〜３０重量
％、より好ましくは１０重量％〜２５重量％、最も好ま
しくは１５重量％〜２１重量％である。含有量が１重量
％より少ない場合、融解後の***の運動性が極端に低下
するという問題があり、３０重量％より多い場合、短時
間の保存でも、作製した凍結保存用液中にラフィノース
の結晶が析出してくるという問題がある。
【００１８】蛋白源は、本発明のマウス***の凍結保存
用液において、ラフィノースの***細胞膜に対する保護
効果をより高める作用を奏する。蛋白源の例としては、
例えば、スキムミルク、ウシ血清アルブミン、血清など
が挙げられる。カゼイン、アルブミン、グロブリン、プ
ロテオース、ペプトンなど種々の蛋白を含有し、それゆ
え複合的保護効果を奏する理由から、スキムミルクが好
ましい。これらの蛋白源は、単独で使用してもよく、ま
た組み合わせて使用してもよい。
用液において、ラフィノースの***細胞膜に対する保護
効果をより高める作用を奏する。蛋白源の例としては、
例えば、スキムミルク、ウシ血清アルブミン、血清など
が挙げられる。カゼイン、アルブミン、グロブリン、プ
ロテオース、ペプトンなど種々の蛋白を含有し、それゆ
え複合的保護効果を奏する理由から、スキムミルクが好
ましい。これらの蛋白源は、単独で使用してもよく、ま
た組み合わせて使用してもよい。
【００１９】本発明のマウス***の凍結保存用液中の蛋
白源の含有量は、好ましくは０．１重量％〜２０重量
％、より好ましくは１重量％〜１０重量％、最も好まし
くは２重量％〜４重量％である。含有量が０．１重量％
より少ない場合、保護効果がほとんど認められないとい
う問題があり、２０重量％より多い場合、凍結保存用液
中の浸透圧が高くなることにより、***の生存性が低下
するという問題がある。
白源の含有量は、好ましくは０．１重量％〜２０重量
％、より好ましくは１重量％〜１０重量％、最も好まし
くは２重量％〜４重量％である。含有量が０．１重量％
より少ない場合、保護効果がほとんど認められないとい
う問題があり、２０重量％より多い場合、凍結保存用液
中の浸透圧が高くなることにより、***の生存性が低下
するという問題がある。
【００２０】本発明のマウス***の凍結保存用液の形態
は、特に限定されないが、好ましくは溶液であり、より
好ましくは水溶液である。水溶液に用いる水としては、
蒸留水、注射用蒸留水などが好ましい。
は、特に限定されないが、好ましくは溶液であり、より
好ましくは水溶液である。水溶液に用いる水としては、
蒸留水、注射用蒸留水などが好ましい。
【００２１】本発明のマウス***の凍結保存用液は、ラ
フィノースおよび蛋白源を、例えば水に溶解することに
より調製され、次いで、例えばミリポアろ過装置を用い
てろ過滅菌され、容器（例えば、アンプル、バイアルな
ど）に注入され、そして封入される。もっとも、ラフィ
ノースおよび蛋白源は、一緒に、または両者を別個に容
器（例えば、アンプル、バイアル等）に保存してもよ
い。その際、少なくとも一方を水溶液としてもよく、ま
た両者を水溶液としてもよく、さらには下記に説明する
キットの構成として水のみを容器、例えばアンプル等に
充填して保存し、用時に水溶液としてもよい。
フィノースおよび蛋白源を、例えば水に溶解することに
より調製され、次いで、例えばミリポアろ過装置を用い
てろ過滅菌され、容器（例えば、アンプル、バイアルな
ど）に注入され、そして封入される。もっとも、ラフィ
ノースおよび蛋白源は、一緒に、または両者を別個に容
器（例えば、アンプル、バイアル等）に保存してもよ
い。その際、少なくとも一方を水溶液としてもよく、ま
た両者を水溶液としてもよく、さらには下記に説明する
キットの構成として水のみを容器、例えばアンプル等に
充填して保存し、用時に水溶液としてもよい。
【００２２】本発明のマウス***の凍結保存用液は、ラ
フィノースおよび蛋白源を含有することにより、凍結保
存した***の融解後の生存率および運動性が高く、それ
ゆえ高い体外受精率が得られるという効果を奏する。
フィノースおよび蛋白源を含有することにより、凍結保
存した***の融解後の生存率および運動性が高く、それ
ゆえ高い体外受精率が得られるという効果を奏する。
【００２３】本発明のマウス***凍結保存用キットは、
上記マウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャー
レを含む。
上記マウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャー
レを含む。
【００２４】ストローは、凍結保存用液に懸濁させたマ
ウス***を充填し、凍結保存するためのいわゆる凍結保
存容器として機能する。ストローの内径および長さは特
に限定されないが、***凍結時の温度における均一性の
理由から、内径０．５ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。
ウス***を充填し、凍結保存するためのいわゆる凍結保
存容器として機能する。ストローの内径および長さは特
に限定されないが、***凍結時の温度における均一性の
理由から、内径０．５ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。
【００２５】シャーレは、凍結保存用液中のマウス***
懸濁液を作製するために使用される。本発明の凍結保存
用キットに用いられるシャーレの一実施態様を図１に斜
視図にて示す。図１はシャーレ１の上面図であり、シャ
ーレ１にはウェル２が好適には４つ設けられている。シ
ャーレ１はフタ（図示せず）を有する。なお、図１には
４つのウェル２が図示されているが、ウェル２の数は特
に４つに限定されない。しかしながら、摘出した精巣上
体尾部上の血液を取り除くために、ラフィノースを含む
凍結保存用液で洗浄しなければならないため、ウェル２
の数は偶数が好ましい。
懸濁液を作製するために使用される。本発明の凍結保存
用キットに用いられるシャーレの一実施態様を図１に斜
視図にて示す。図１はシャーレ１の上面図であり、シャ
ーレ１にはウェル２が好適には４つ設けられている。シ
ャーレ１はフタ（図示せず）を有する。なお、図１には
４つのウェル２が図示されているが、ウェル２の数は特
に４つに限定されない。しかしながら、摘出した精巣上
体尾部上の血液を取り除くために、ラフィノースを含む
凍結保存用液で洗浄しなければならないため、ウェル２
の数は偶数が好ましい。
【００２６】上記ストローおよびシャーレは、エチレン
オキシドグリコール（ＥＯＧ）滅菌された後包装され
る。
オキシドグリコール（ＥＯＧ）滅菌された後包装され
る。
【００２７】本発明のマウス***凍結保存用キットはま
た、必要に応じて外箱および／または取扱説明書を含み
得る。
た、必要に応じて外箱および／または取扱説明書を含み
得る。
【００２８】次に、本発明のマウス***凍結保存用キッ
トを用いてマウス***を凍結保存する手順の一例を説明
する。
トを用いてマウス***を凍結保存する手順の一例を説明
する。
【００２９】（***の凍結保存） １．成熟雄マウス（１２週齢以上）の精巣上体尾部２個
をシャーレ（４ウェルマルチディッシュ）内の４つのウ
ェル内の１００μｌの凍結保存用液中に移し、精巣上体
管を細切後、シャーレを１分間振盪させ、***を凍結保
存用液中に懸濁する。
をシャーレ（４ウェルマルチディッシュ）内の４つのウ
ェル内の１００μｌの凍結保存用液中に移し、精巣上体
管を細切後、シャーレを１分間振盪させ、***を凍結保
存用液中に懸濁する。
【００３０】２．ストローへの***懸濁液の充填 （ａ）まず、ストローを１ｍｌのシリンジに装着し、培
養液（ＨＴＦ）を約１００μｌ吸引する。すなわち、精
子懸濁液は１本のストローに少量しか充填されないた
め、そのまま凍結に使用される液体窒素中に保存すると
ストローが液体窒素表面に浮いてしまうので、ストロー
の容積の約半分の培養液を「おもり」として充填する。
培養液としては、ＨＴＦ、ＴＹＨ、ｍＷＭおよびＲ１８
Ｓ３が例示される。
養液（ＨＴＦ）を約１００μｌ吸引する。すなわち、精
子懸濁液は１本のストローに少量しか充填されないた
め、そのまま凍結に使用される液体窒素中に保存すると
ストローが液体窒素表面に浮いてしまうので、ストロー
の容積の約半分の培養液を「おもり」として充填する。
培養液としては、ＨＴＦ、ＴＹＨ、ｍＷＭおよびＲ１８
Ｓ３が例示される。
【００３１】（ｂ）シャーレのフタに１０μｌの***懸
濁液を取り、充填した培養液との間に１０ｍｍの空気相
を挟んで***懸濁液をストローに充填する。
濁液を取り、充填した培養液との間に１０ｍｍの空気相
を挟んで***懸濁液をストローに充填する。
【００３２】（ｃ）ストローの両端部に１０ｍｍの空気
相を作製し、シーラーで封止する。
相を作製し、シーラーで封止する。
【００３３】上記（ｂ）および（ｃ）において、空気相
は、培養液および***懸濁液が凍結することにより膨張
するため、そのクッションとして設けられる。
は、培養液および***懸濁液が凍結することにより膨張
するため、そのクッションとして設けられる。
【００３４】３．凍結用フロートに***を充填したスト
ローを入れ、液体窒素保管器内の液体窒素表面に静置す
る。
ローを入れ、液体窒素保管器内の液体窒素表面に静置す
る。
【００３５】４．約１５分間静置後、フロートを液体窒
素中に浸漬し、***を凍結保存する。
素中に浸漬し、***を凍結保存する。
【００３６】上記のようにして凍結保存されたマウス精
子は、用時に融解され、そして例えば、凍結保存された
未受精卵または透明帯切開卵子と共に体外受精に供され
得る。未受精卵の凍結保存、***の融解、未受精卵の融
解、透明帯切開術および体外受精は、当該分野で公知の
従来の手順に従って行われ得る。参考のために以下にそ
れらの手順を示す。
子は、用時に融解され、そして例えば、凍結保存された
未受精卵または透明帯切開卵子と共に体外受精に供され
得る。未受精卵の凍結保存、***の融解、未受精卵の融
解、透明帯切開術および体外受精は、当該分野で公知の
従来の手順に従って行われ得る。参考のために以下にそ
れらの手順を示す。
【００３７】（未受精卵の凍結保存） １．成熟雌マウスに、５単位／匹の妊馬血清性腺刺激ホ
ルモン（ＰＭＳ）を腹腔内注射し、その４８時間後に５
単位／匹のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を腹
腔内注射して過***処理を施す。ｈＣＧ注射１４時間
後、過***処理を施した雌マウスの卵管膨大部より卵子
塊を採取し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除
去して未受精卵を得る。得られた未受精卵を２０％牛胎
仔血清（ＦＣＳ）を含む培養液（ＨＴＦ）内で１０分間
培養する。
ルモン（ＰＭＳ）を腹腔内注射し、その４８時間後に５
単位／匹のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を腹
腔内注射して過***処理を施す。ｈＣＧ注射１４時間
後、過***処理を施した雌マウスの卵管膨大部より卵子
塊を採取し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除
去して未受精卵を得る。得られた未受精卵を２０％牛胎
仔血清（ＦＣＳ）を含む培養液（ＨＴＦ）内で１０分間
培養する。
【００３８】２．室温にて１Ｍ ジメチルスルホキサイ
ド（ＤＭＳＯ）を含むリン酸緩衝液溶液のドロップ（１
００μｌ）をシャーレに作製する。作製するドロップの
数は、凍結チューブの本数＋１（例えば、凍結チューブ
が３本の場合、４個のドロップ）である。
ド（ＤＭＳＯ）を含むリン酸緩衝液溶液のドロップ（１
００μｌ）をシャーレに作製する。作製するドロップの
数は、凍結チューブの本数＋１（例えば、凍結チューブ
が３本の場合、４個のドロップ）である。
【００３９】３．上記１．で培養した未受精卵を１Ｍ
ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液の１つのドロップへ静
かに移す。
ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液の１つのドロップへ静
かに移す。
【００４０】４．未受精卵がシャーレの底に沈んだら、
残りの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液のドロッ
プに未受精卵を均等に分けて移す（通常、１ドロップ当
り４０個の未受精卵）。
残りの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液のドロッ
プに未受精卵を均等に分けて移す（通常、１ドロップ当
り４０個の未受精卵）。
【００４１】５．２０μｌ用のオートピペッターを用い
て、５μｌの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液と
共に未受精卵を凍結チューブに移し、予め０℃にしてお
いた冷却装置に移す。なお、冷却装置は、ブロッククー
ラー（ＣＨＴ−１００、ＩＷＡＫＩ）あるいはラブトッ
プクーラー（５１１５−００１２、ナルゲン）を用い
る。あるいは、氷水を用いて冷却してもよい。
て、５μｌの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液と
共に未受精卵を凍結チューブに移し、予め０℃にしてお
いた冷却装置に移す。なお、冷却装置は、ブロッククー
ラー（ＣＨＴ−１００、ＩＷＡＫＩ）あるいはラブトッ
プクーラー（５１１５−００１２、ナルゲン）を用い
る。あるいは、氷水を用いて冷却してもよい。
【００４２】６．５分後、予め０℃に冷却しておいた簡
易ガラス化保存用液（ＤＡＰ２１３：２Ｍ ＤＭＳＯ、
１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含
むリン酸緩衝液）９５μｌを凍結チューブの管壁を伝わ
らせて静かに添加する。なお、上記４．における０℃、
１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液での平衡時間が
多少延びても、融解後の未受精卵の生存性には影響しな
い。従って、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合
は、最後の凍結チューブを０℃の冷却装置に移してから
５分後に、ＤＡＰ２１３を添加する。
易ガラス化保存用液（ＤＡＰ２１３：２Ｍ ＤＭＳＯ、
１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含
むリン酸緩衝液）９５μｌを凍結チューブの管壁を伝わ
らせて静かに添加する。なお、上記４．における０℃、
１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液での平衡時間が
多少延びても、融解後の未受精卵の生存性には影響しな
い。従って、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合
は、最後の凍結チューブを０℃の冷却装置に移してから
５分後に、ＤＡＰ２１３を添加する。
【００４３】７．さらに５分後、凍結チューブをケーン
に装着し、直ちに液体窒素中に浸漬し、未受精卵を凍結
保存する。なお、ケーンは液体窒素中で予め冷却してお
く。また、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合
は、上記６．の操作時と同様、最後の凍結チューブにＤ
ＡＰ２１３を添加してから５分後に、凍結チューブをケ
ーンに装着し、液体窒素内に浸漬する。
に装着し、直ちに液体窒素中に浸漬し、未受精卵を凍結
保存する。なお、ケーンは液体窒素中で予め冷却してお
く。また、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合
は、上記６．の操作時と同様、最後の凍結チューブにＤ
ＡＰ２１３を添加してから５分後に、凍結チューブをケ
ーンに装着し、液体窒素内に浸漬する。
【００４４】（***の融解） １．凍結保存しているストローを液体窒素中から取り出
し、３７℃の温水中に浸漬する。
し、３７℃の温水中に浸漬する。
【００４５】２．１５分間放置後、温水からストローを
引き上げ、ストローの表面の水分を紙でぬぐった後、精
子懸濁液側のシール部を切り取って***懸濁液のみをシ
ャーレに取り出す。
引き上げ、ストローの表面の水分を紙でぬぐった後、精
子懸濁液側のシール部を切り取って***懸濁液のみをシ
ャーレに取り出す。
【００４６】３．***懸濁液１〜２μｌを、マイクロピ
ペッターを用いて、予め作製しておいた２００μｌの受
精用培地（ＨＴＦ）のドロップに移し、このドロップを
パラフィンオイルで被覆し、１時間前培養する。この精
子懸濁液を体外受精に供する。
ペッターを用いて、予め作製しておいた２００μｌの受
精用培地（ＨＴＦ）のドロップに移し、このドロップを
パラフィンオイルで被覆し、１時間前培養する。この精
子懸濁液を体外受精に供する。
【００４７】（体外受精） １．１時間前培養した***懸濁液の濃度を算定する。
【００４８】２．未受精卵の入ったドロップの***濃度
が１μｌあたり２００***になるように、***懸濁液の
一部を未受精卵のドロップに導入する。
が１μｌあたり２００***になるように、***懸濁液の
一部を未受精卵のドロップに導入する。
【００４９】３．３時間後に卵子を新鮮な培養液（ＨＴ
Ｆ）で洗浄し、２細胞期へ発生した胚のみを選別する。
Ｆ）で洗浄し、２細胞期へ発生した胚のみを選別する。
【００５０】（透明帯切開術）凍結保存した***の運動
性が低い場合は、透明帯切開卵子を用いて体外受精を行
う。
性が低い場合は、透明帯切開卵子を用いて体外受精を行
う。
【００５１】１．シャーレの中央に１００μｌの０．３
Ｍスクロースを含むリン酸緩衝液溶液（ＢＳＡを含まな
いもの）のドロップを作製し、ドロップ上部に３０〜４
０個の卵丘除去卵子を少量の培養液と共に移す。
Ｍスクロースを含むリン酸緩衝液溶液（ＢＳＡを含まな
いもの）のドロップを作製し、ドロップ上部に３０〜４
０個の卵丘除去卵子を少量の培養液と共に移す。
【００５２】２．すべての卵子が完全に沈み、シャーレ
の底に付着したら、ドロップを流動パラフィンで被覆す
る。
の底に付着したら、ドロップを流動パラフィンで被覆す
る。
【００５３】３．３０Ｇの注射針で透明帯の一部を切開
する。すなわち、ゆっくりと針先を下ろして、卵子の上
部に触れたら針先を透明帯に押し付け、シャーレの底を
傷つけるように手前に引くことにより透明帯を切開す
る。
する。すなわち、ゆっくりと針先を下ろして、卵子の上
部に触れたら針先を透明帯に押し付け、シャーレの底を
傷つけるように手前に引くことにより透明帯を切開す
る。
【００５４】４．すべての卵子の透明帯を切開し終えた
ら、４％ＢＳＡおよび０．３Ｍスクロースを含むリン酸
緩衝液溶液を２０μｌ加え、透明帯切開側とは逆の方向
からピペッティングすることにより、卵子をシャーレの
底から剥がす。
ら、４％ＢＳＡおよび０．３Ｍスクロースを含むリン酸
緩衝液溶液を２０μｌ加え、透明帯切開側とは逆の方向
からピペッティングすることにより、卵子をシャーレの
底から剥がす。
【００５５】５．卵子を注意深く回収し、ＨＴＦで洗浄
後、体外受精に供する。
後、体外受精に供する。
【００５６】得られた２細胞期胚は、上記（未受精卵の
凍結保存）と同様の手順を用いて凍結保存され得、そし
て凍結保存された胚は、当該分野で公知の従来の手順を
用いて融解され、例えば、当該分野で公知の経卵管壁卵
管内移植法により雌マウスに移植され得る。参考のため
に以下にその手順を示す。
凍結保存）と同様の手順を用いて凍結保存され得、そし
て凍結保存された胚は、当該分野で公知の従来の手順を
用いて融解され、例えば、当該分野で公知の経卵管壁卵
管内移植法により雌マウスに移植され得る。参考のため
に以下にその手順を示す。
【００５７】（経卵管壁卵管内移植法） （ａ）受容雌の準備 １．受容雌には、Ｊｃｌ：ＭＣＨ（ＩＣＲ）を用いる。
移植前日の夕方３時〜５時に雌マウスの外陰部を観察し
て発情前期にあるものを選び、精管結紮雄マウスと同居
させる。
移植前日の夕方３時〜５時に雌マウスの外陰部を観察し
て発情前期にあるものを選び、精管結紮雄マウスと同居
させる。
【００５８】２．雄マウスと同居させた翌日、膣栓を確
認した雌マウスを受容雌として用いる。
認した雌マウスを受容雌として用いる。
【００５９】３．ネンブタールで麻酔をした受容雌の側
面中央の毛を刈り、腹壁を切開する。
面中央の毛を刈り、腹壁を切開する。
【００６０】４．卵巣・卵管・子宮を体外に露出させ、
卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。
卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。
【００６１】（ｂ）胚とキャピラリーの準備 １．２００μｌのｍＷＭのドロップをシャーレの中央に
作製し、２０個の胚を入れる。
作製し、２０個の胚を入れる。
【００６２】２．キャピラリー（外径２００〜２５０μ
ｍ）に空気と培養液とを２〜３ｍｍ間隔で交互に吸引
し、その先端に約１０個の胚を吸引する。
ｍ）に空気と培養液とを２〜３ｍｍ間隔で交互に吸引
し、その先端に約１０個の胚を吸引する。
【００６３】（ｃ）移植 １．卵管采および膨大部を確認し、両者間の卵管壁の一
部をノエス剪刀で直径の約１／２〜２／３程度切開す
る。
部をノエス剪刀で直径の約１／２〜２／３程度切開す
る。
【００６４】２．膨大部側卵管壁を細胞用マイクロピン
セットでつまみあげ、その開口部から胚を含むキャピラ
リーを膨大部側の卵管内に挿入する。
セットでつまみあげ、その開口部から胚を含むキャピラ
リーを膨大部側の卵管内に挿入する。
【００６５】３．膨大部に空気の泡が２〜３個入るまで
静かに息を吹き込む。空気の泡を一緒に吹き込むことに
より、胚が膨大部に到着したことを確認する。
静かに息を吹き込む。空気の泡を一緒に吹き込むことに
より、胚が膨大部に到着したことを確認する。
【００６６】４．クレンメを外し、卵巣・卵管・子宮を
静かに体内に戻す。
静かに体内に戻す。
【００６７】５．皮膚をオートクリップで止めて、麻酔
がさめるまでマウスを保温する。
がさめるまでマウスを保温する。
【００６８】以上のように、本発明のマウス***凍結保
存用キットを用いてマウス***を凍結保存することによ
り、高い体外受精率で体外受精を行うことができる。
存用キットを用いてマウス***を凍結保存することによ
り、高い体外受精率で体外受精を行うことができる。
【００６９】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。
す。
【００７０】（実施例１）ラフィノースおよびスキムミ
ルクを、それらの含有量がそれぞれ１８重量％および３
重量％となるように蒸留水に溶解し、凍結保存用液を調
製した。
ルクを、それらの含有量がそれぞれ１８重量％および３
重量％となるように蒸留水に溶解し、凍結保存用液を調
製した。
【００７１】（実施例２）上記実施例１で調製した凍結
保存用液を、ミリポアろ過装置を用いてろ過滅菌し、ア
ンプルに注入し、そして封入した。次いで、内径１．２
ｍｍのストローおよび４ウェルシャーレをエチレンオキ
シドグリコール滅菌し、それぞれ別個に包装した。これ
らアンプル、ストローおよびシャーレを組み合わせ、凍
結保存用キットを作製した。
保存用液を、ミリポアろ過装置を用いてろ過滅菌し、ア
ンプルに注入し、そして封入した。次いで、内径１．２
ｍｍのストローおよび４ウェルシャーレをエチレンオキ
シドグリコール滅菌し、それぞれ別個に包装した。これ
らアンプル、ストローおよびシャーレを組み合わせ、凍
結保存用キットを作製した。
【００７２】（実施例３）内径１．８ｍｍのストローを
用いたこと以外は、実施例２と同様にして凍結保存用キ
ットを作製した。
用いたこと以外は、実施例２と同様にして凍結保存用キ
ットを作製した。
【００７３】〔試験例〕上記実施例２および３で作製し
た凍結保存用キットを用いてマウス***を凍結保存し、
融解後の生存率および運動性、ならびに体外受精率を評
価した。
た凍結保存用キットを用いてマウス***を凍結保存し、
融解後の生存率および運動性、ならびに体外受精率を評
価した。
【００７４】（凍結保存した***の融解後の生存率）凍
結保存した***の融解後の生存率を、融解した***懸濁
液を***活力検査板に滴下し、顕微鏡下で５視野を観察
して、全***数に対する運動性を呈している（少しでも
動きのある）***数の割合、すなわち、（運動性を呈し
ている（少しでも動きのある）***数）÷（全***数）
×１００により決定した。
結保存した***の融解後の生存率を、融解した***懸濁
液を***活力検査板に滴下し、顕微鏡下で５視野を観察
して、全***数に対する運動性を呈している（少しでも
動きのある）***数の割合、すなわち、（運動性を呈し
ている（少しでも動きのある）***数）÷（全***数）
×１００により決定した。
【００７５】（凍結保存した***の融解後の運動性）凍
結保存した***の融解後の運動性を、上記（凍結保存し
た***の融解後の生存率）と同様の検査法により、全精
子数に対する前進運動を呈している***数の割合、すな
わち、（前進運動を呈している***数）÷（全***数）
×１００により決定した。
結保存した***の融解後の運動性を、上記（凍結保存し
た***の融解後の生存率）と同様の検査法により、全精
子数に対する前進運動を呈している***数の割合、すな
わち、（前進運動を呈している***数）÷（全***数）
×１００により決定した。
【００７６】（体外受精率の決定）体外受精後、２細胞
期へ発生した胚および未受精卵を回収し、それらの数を
計測した。得られた数を以下の式に代入し、体外受精率
を計算した： 体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の
数＋未受精卵の数）｝×１００。
期へ発生した胚および未受精卵を回収し、それらの数を
計測した。得られた数を以下の式に代入し、体外受精率
を計算した： 体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の
数＋未受精卵の数）｝×１００。
【００７７】（試験例１〜１０）上記実施例２および３
で作製した凍結保存用キットを用いてマウス***を凍結
保存し、融解後の生存率および運動性、ならびに体外受
精率を評価した：５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（１２週齢）
の精巣上体尾部を摘出して切開し、漏出した***塊を凍
結保存用液（試験例１〜４：１２０μＬ、試験例５〜１
０：１００μＬ）中に懸濁した。得られた懸濁液（試験
例１〜４：９μＬ、試験例５〜１０：５μＬ）をストロ
ー内に封入した。このストローを前処理した後、液体窒
素内に１時間浸置した。その後、ストローを液体窒素内
より取り出し、３７℃の温水中に１５分間放置し、***
を融解した。次いで、融解した***をストローから取り
出し、ＨＴＦ培地（１００μＬ）に懸濁し、上記方法に
従って直ちに***生存率および運動性を決定した。その
結果を表１に示す。
で作製した凍結保存用キットを用いてマウス***を凍結
保存し、融解後の生存率および運動性、ならびに体外受
精率を評価した：５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（１２週齢）
の精巣上体尾部を摘出して切開し、漏出した***塊を凍
結保存用液（試験例１〜４：１２０μＬ、試験例５〜１
０：１００μＬ）中に懸濁した。得られた懸濁液（試験
例１〜４：９μＬ、試験例５〜１０：５μＬ）をストロ
ー内に封入した。このストローを前処理した後、液体窒
素内に１時間浸置した。その後、ストローを液体窒素内
より取り出し、３７℃の温水中に１５分間放置し、***
を融解した。次いで、融解した***をストローから取り
出し、ＨＴＦ培地（１００μＬ）に懸濁し、上記方法に
従って直ちに***生存率および運動性を決定した。その
結果を表１に示す。
【００７８】なお、上記前処理とは、（１）ストローを
液体窒素液表面（気層）に１５分間放置する；あるいは
（２）ストローをディープフリーザー内にアルミブロッ
クをスタンドとして１時間放置する、のいずれかであ
る。
液体窒素液表面（気層）に１５分間放置する；あるいは
（２）ストローをディープフリーザー内にアルミブロッ
クをスタンドとして１時間放置する、のいずれかであ
る。
【００７９】
【表１】
【００８０】表１から分かるように、本発明の凍結保存
用キットを用いた試験例では、凍結保存した***の融解
後の生存率および運動性は高かった。
用キットを用いた試験例では、凍結保存した***の融解
後の生存率および運動性は高かった。
【００８１】
【発明の効果】本発明によれば、凍結保存した***の融
解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受
精率が得られるマウス***凍結保存用キットを提供する
ことができる。
解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受
精率が得られるマウス***凍結保存用キットを提供する
ことができる。
【図１】本発明のマウス***凍結保存用キットに含まれ
るシャーレの一実施態様の斜視図である。
るシャーレの一実施態様の斜視図である。
１ シャーレ ２ ウェル
Claims (4)
- 【請求項１】 ラフィノースおよび蛋白源を含有するマ
ウス***の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含
むマウス***凍結保存用キット。 - 【請求項２】 マウス***の凍結保存用液中のラフィノ
ースおよび蛋白源の含有量が、それぞれ１重量％〜３０
重量％および０．１重量％〜２０重量％である請求項１
に記載のマウス***凍結保存用キット。 - 【請求項３】 蛋白源が、スキムミルク、ウシ血清アル
ブミンおよび血清からなる群より選択される少なくとも
１種である請求項１または２に記載のマウス***凍結保
存用キット。 - 【請求項４】 マウス***の凍結保存用液が水溶液の形
態である請求項１〜３のいずれかに記載のマウス***凍
結保存用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000149039A JP2001328901A (ja) | 2000-05-19 | 2000-05-19 | マウス***凍結保存用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000149039A JP2001328901A (ja) | 2000-05-19 | 2000-05-19 | マウス***凍結保存用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001328901A true JP2001328901A (ja) | 2001-11-27 |
Family
ID=18654956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000149039A Pending JP2001328901A (ja) | 2000-05-19 | 2000-05-19 | マウス***凍結保存用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001328901A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537727A (ja) * | 2004-03-29 | 2007-12-27 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 受精で用いられる***分散液 |
| JP2009022214A (ja) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine | イヌ***の凍結保存剤および凍結保存方法 |
| WO2017202102A1 (zh) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5632417A (en) * | 1979-08-27 | 1981-04-01 | Seisan Nipponsha Kk | Storage of livestock semen |
| JPH06209767A (ja) * | 1993-01-16 | 1994-08-02 | Japan Vilene Co Ltd | 動物細胞の凍結保存方法及び凍結保存担体 |
| WO1999047642A2 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-23 | University Of Hawaii | Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa |
-
2000
- 2000-05-19 JP JP2000149039A patent/JP2001328901A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5632417A (en) * | 1979-08-27 | 1981-04-01 | Seisan Nipponsha Kk | Storage of livestock semen |
| JPH06209767A (ja) * | 1993-01-16 | 1994-08-02 | Japan Vilene Co Ltd | 動物細胞の凍結保存方法及び凍結保存担体 |
| WO1999047642A2 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-23 | University Of Hawaii | Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537727A (ja) * | 2004-03-29 | 2007-12-27 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 受精で用いられる***分散液 |
| JP2009022214A (ja) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine | イヌ***の凍結保存剤および凍結保存方法 |
| WO2017202102A1 (zh) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hafez | Preservation and cryopreservation of gametes and embryos | |
| EP2605644B1 (en) | Method of forming vitrification droplets | |
| Lim et al. | The post-thaw developmental capacity of frozen bovine oocytes following in vitro maturation and fertilization | |
| US20040121303A1 (en) | Cryopreservation of sperm | |
| Nakagata | Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization | |
| O'neil et al. | Vitrification of mature mouse oocytes in a 6 M Me2SO solution supplemented with antifreeze glycoproteins: the effect of temperature | |
| CA2605928A1 (en) | N-acetylcysteine amide (nac amide) for treatment of oxidative stress associated with infertility | |
| Beebe et al. | Piglets born from centrifuged and vitrified early and peri-hatching blastocysts | |
| Czlonkowska et al. | Deep freezing of horse embryos | |
| JP3044323B1 (ja) | 細胞の凍結保存方法 | |
| Fujino et al. | Cryoprotective effect of egg yolk in cryopreservation of porcine embryos | |
| EP1131998A1 (en) | Cell-cryopreservation method | |
| Bielanski et al. | Factors affecting survival of deep frozen bovine embryos in vitro: the effect of freezing container and method of removing cryoprotectant | |
| JP2001328901A (ja) | マウス***凍結保存用キット | |
| JP2006149231A (ja) | 生物学的標本の凍結保存用細管、生物学的標本の凍結保存方法および凍結保存後の融解方法 | |
| Kuzan et al. | Cryopreservation of mammalian embryos | |
| Glenister et al. | Cryopreservation and rederivation of embryos and gametes | |
| WO1999011121A1 (en) | Method and auxiliaries for cryopreservation of biological material such as egg cells | |
| Wood et al. | Embryo cryopreservation | |
| Thorat | Assisted Reproductive Technologies (ARTs) in the Laboratory Mouse | |
| Thompson et al. | Use of Epididymal Sperm for Preservation of Genetics and Artificial Insemination | |
| JPH056983B2 (ja) | ||
| Al-Hasani et al. | Future Aspects in Human Cryopreservation | |
| KUWAYAMA | The human oocyte 21 | |
| JP3598368B2 (ja) | 胚のガラス化保存用液体組成物及びそれを用いた胚の超低温保存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050222 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050222 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20050222 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050222 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070403 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110104 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110302 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111101 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120417 |