JP4557551B2 - 運動性***選別法 - Google Patents

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Description

本発明は、運動性粒子を低運動性粒子から選別する方法に関し、特に、生物学系の運動性***及び非運動性***を選別する方法に関する。
低運動性及び/または非運動性粒子からの運動性粒子の分別または「選別」については、数多くの出願があるものの、従来、技術的に困難であるとされてきた。例えば、給水の分析に関しては、菌類や藻類等を含む運動性バクテリア及び他の微生物を、非運動性のものから分別することが望ましい。これにより、様々な種の識別・同定や列挙を簡便化することができる。運動性有機体の例としては、C．エレガンス（elegance）のような有鞭毛、繊毛バクテリアや、ゾウリムシや運動性プランクトンのような他の微税物も含まれる。運動性種が豊富なサンプルまたは運動性種が減少されたサンプルのどちらか、あるいはその両方は、単独に分析、培養等される。
特に重要な適用例としては精細胞の分別がある。例えば、体外受精において、提供者の***数が少ない場合、特に非運動性***、所望する生存可能***の運動性より低い運動性をもつ変形***、及び、他の細胞や***のデブリ（debris）が混交している場合には、受精の実施にあたって実質的に運動性***を使用すれば成功率は著しく上昇する。また、例えば、アニュエプロイド（anueploid）***やDNAフラグメント***を回避することが特に望ましい。数多くの試みの中で、例えば乳牛の誕生が望ましい場合に、生まれてくる子供の性を決定することが可能であることが好ましい。このような場合、既知の運動性の違いに基づいてX染色体含有***とY染色体含有***とが選別できると有利であろう。
従来、***過少症（***数が減少していること）の提供者からの精細胞は、遠心分離により、予め、濃縮され、また、異なる大きさ及び/または密度を有する細胞やデブリからある程度分別されてきた。しかしながら、かかる技術によっては、非生殖体（non-gametes）が***豊富サンプルに混入してしまうという問題があった。
これらの非生殖体は、いくら少数であっても、***生存可能力を継続的に維持するのに有害な酸素ラジカルを放出する。さらに、遠心分離は、多くの***、特にその中片域と末端域を損傷させる粗暴な技術である。
また、いわゆる「スイムアップ（swim up）」技術も既知のものであるが、多数の生存受精可能***の単離は困難である。エス・スミスらによる、ＦＥＲＴＩＬ．ＳＴＥＲＩＬ．１９９５，６３，５９１−９７参照。従って、医者は、しばしば、死滅した***やデブリ群から、運動性を有し、明確な形態の***を見つけるために手選による更なる選別をするが、これは極めて手間のかかるプロセスである。
また、遺伝子工学（生物工学）における適用においては、しばしば運動性に基づいた粒子の分別が必要とされる。生物学的でない適用においても、動作するマイクロロボット（運動性を有する）を動作しないマイクロロボットから分別することは、ありうる適用である。
非運動性あるいは低運動性粒子からの運動性粒子の選別は、選別される運動性粒子、及び、非運動性粒子あるいは低運動性粒子を含有する乱れのない、そして、好ましくは層状（laminar）の流れ（選別流）を設け、この選別流を第二の乱れのない、好ましくは同層状（co-laminar）の媒体の流れ（媒体流）に接触させ、少なくとも運動性粒子が豊富な媒体の流れの一部に出口流を、また、運動性粒子が減少された選別流に出口流を提供することにより実施される。運動性粒子は、その移動性により、該媒体流と該選別流間の界面に沿って該媒体流に入り込み、一方、非運動性粒子あるいは低運動性粒子は、ほぼ該選別流内に残存する。このプロセスにおける使用に適した装置は、少なくとも一つの選別流入口、一つの媒体流入口、一つの選別チャネル、一つの運動性粒子が減少された選別流出口、そして、一つの運動性粒子が豊富な媒体流出口を提供する。該装置は、マイクロマシン技術あるいはポリマー鋳造技術を利用して比較的小さい装置が構成でき、好ましくは必要な全ての機能を一枚の「チップ」に統合する。
本発明は、本発明の実施に使用することができる比較的簡単な例を示した図１及び、及び、非運動性粒子から運動性粒子を選別することを示した図２を参照することにより、容易に理解することができる。またこれらの記載の他に、装置の作用・機能、その幾何学的形状、流体及びその流れ等の特性等を更に詳細に説明する。
図１の装置は、前記したように、概略的に図示されたものである。当該装置１の例においては、運動性粒子選別流入口２（または入口としての機能をもつ運動性粒子供給貯留容器）、媒体流入口３（または媒体貯留容器）、運動性粒子が減少された選別流出口（または貯留容器）４、そして、運動性粒子が豊富な流れ出口（または貯留容器）５から構成される。当該入口２及び３と当該出口４及び５の間には、選別チャネル６が配置されている。選別チャネル６を各入口及び出口につないでいるのは選別流入口チャネル７、媒体流入口チャネル８、運動性粒子が減少した選別流出口チャネル９、及び運動性粒子が豊富な媒体流出口チャネル１０である。
選別流チャネルの幅は、当該粒子が滞ることなく効率的に通過するのに十分な大きさでなくてはならず、更にこのことは両方の出口流にも該当することである。一般的に、該入口流及び出口流は、選別チャネルよりも断面域が小さい。相対断面は、各流の流量及び流速によって決定される。相対流速は選別流と媒体流との間の混合の発生によってのみ制限されるが、当該流れの線速度（線流速）は、同じであることが望ましい。媒体流及び選別流の粘度、粒子の運動性、選別されることを所望される粒子と異なる大きさの粒子及びデブリの存在または不存在等の多くの要因によって、媒体流の容量を、選別チャネルの任意のセクションで、選別流の容量よりも少なくしたり、同じにしたり、または多くしたりする。
以下の説明の大部分は、***の選別に関連して記載されているが、これらに限定されるものではなく、本発明の本質は、他の運動性粒子源及び非運動性粒子源にも適用できることは当然である。
実施するにあたり、選別流入口２に***が供給され、最初にチャネル７を通過し、次に選別チャネル６を、そして出口チャネル９を通過して、運動性粒子が減少された選別流出口９へと流れるようにする。媒体流入口３に、選別される***と適合する（すなわち有害でない）媒体供給流が供給され、チャネル８を通って選別チャネル６へと流れ、その後、チャネル１０を通って運動性粒子が豊富な媒体出口５へと流れるようにする。
チャネル７及び８の合流点においては、混合していない流れであって、好ましくは層流が、選別流と媒体流とが平行して選別チャネルを流れるように、形成される。非運動性（あるいは低運動性）粒子は選別流内にとどまる傾向にあり、一方、運動性粒子はランダムに移動して、媒体流に入る。このようなランダムな移動の結果、選別流では運動性***が徐々に減少し、媒体流では***が徐々に増加して豊富になる。
さらに、本発明を、図２a、２b、２cを参照して、より広く説明される。図２a、２b、２cでは、図１の装置の選別チャネル内で運動性***が非運動性***及び他の非運動性粒子から分別される状態を図示しているものである。図２aにおいては、選別チャネル６が示されており、これは、選別流１１と媒体流１２との合流点の最初の段階を示した図である。選別流１１は、運動性***１３及び非運動性***１４の他に、ここで「円形細胞」１５として表示されている他の非運動性粒子を含有している。ここで留意すべき点は、図中の媒体流のサイズは選別流のサイズよりもかなり大きいことであり、それ故、媒体流の容量も、選別流の容量より多いということである。***は（そして同様に、他の運動性粒子は）、短時間のうちに、流体全体にわたり基本的にランダム分布となるため、容量の多い媒体流の容量を多くすることにより、必然的に運動性***１３の大部分の含有することになる。
図２bにおいては、２つの流れの間で運動性***のランダム化が始まり、望ましいランダム化の程度が実現されるまで継続する。このランダム化の程度は、媒体相単位容量当たりの運動性***の濃度が、選別流単位容量当たりの濃度と同じか、あるいは濃くなることが望ましい。ここで留意すべきことは、選別流と媒体流とが別個の流れとして維持され、そして好ましくは、そのそれぞれが層流を示し、共通の境界、あるいは界面１６を有する。
純粋なランダム化によって得られる量よりも、媒体流における運動性粒子の濃度を濃くするには、運動性粒子が移動性を増大する媒体流を使用する。すなわち、選別流よりも粘性の低い媒体流を選択したり、または、非運動性あるいは運動性の低い***と比較して運動性***の移動性を増加する添加剤を含有したりすることである。
図２ｃにおいては、運動性***が豊富な媒体流は、運動性粒子が豊富なチャネル１０に流れ込むようにすることで採取され、一方、運動性粒子が減少された選別流は、チャネル９から出口４へと流れる。
運動性粒子が減少された選別流を運動性粒子が豊富な流から分別する分岐接合点１７は、ここで、流れの混合を実質的に防げるものであればどのような形状を有していてもよい。該接合点１７は、当該点で、例えば、選別流入口の形状（すなわち、高さ、幅）と同じ形状の出口チャネル形状が設けられるように配置されることができる。
非運動性***による媒体流の汚染を最小限に抑えるために、運動性粒子が減少された選別流出口９に媒体流の一部分が流れ込むように、該接合点１７を構成することも可能である。この場合、運動性***が少々失われるが、その結果、運動性***が豊富な媒体流に非運動性***が混入する可能性を減少させることができる。
選別流の特性は重要ではない。処理をすることによって所望される(運動性粒子が減少されたあるいは運動性粒子が豊富な)出口流の実行可能性や生存能力が損なわれない限り、選別流は、***のような生物学的に抽出された流れでもよいし、または、洗浄されたり、希釈化されたり、添加剤や染色剤あるいは蛍光染料や粘度調節剤を用いて処理されたり、バッファリング（緩衝）等されたりしてもよい。例えばバクテリアのサンプルにおいて、生存能力や実行可能性ではなく分別が目的である場合には、選別流の変形例の可能性は増大する。
選別流は、運動性粒子が予め減少された選別流や運動性粒子が予め豊富な媒体流でもよい。マイクロロボット装置に関しては、選別流流体は、例えば水、アルコール、ケトン、グリコール、エステル、炭化水素等、当該装置の機能を損なわないものであれば何でもよい。生物学的サンプルにおいては、一般的に水をベースとする選別流が使用される。
媒体流は、選別流の選択またはその変形の際に考慮される事項と同じ基準に基づいて選択されることができる。若干の場合には、選別流は水である場合もあるが、生物系に関しては、生理食塩水、緩衝食塩水、栄養性ブイヨン等の、生物学的活性を維持あるいは高める流れを使用するのが典型的である。ヒトの***の場合、HEPES緩衝されたヒトの卵管液が媒体として望ましい。
媒体流体と選別流体の特性は、可能であれば、浸透効果による界面の混合を防止するように選択する。このことは、例えば、選別流及び媒体流双方のベースとなる流体（例えば、水）が、塩、酸、塩基、緩衝剤、溶解有機物等の可溶性成分を実質的に同じ量で含む場合に該当する。可能であれば、当該流体は、拡散による界面の混合を防止するようなものを選択する。しかしながら、この点において、あらゆる拡散をなくすということは、実現するのが難しい。
流体の相対容量は、媒体相内での運動性粒子の所望される混入程度に関連して選択される。最も高い混入程度に関して、媒体の容量は、選別流体の容量に対して多くなければならない。しかしながら、特に順次（連続）選別が実施される場合には、それよりも少ない媒体の容量でもよい。媒体流体と選別流体との割合は、１：１０００〜１０００：１が好ましく、より好ましくは１：１００〜１００：１、さらに好ましくは１：１０〜１０：１の範囲である。代表的な適用例では、媒体流体の容量と選別流体の容量の割合は１：１〜３：１の範囲内である。該媒体流体の容量は、該選別流体の容量よりも多いことが最も望ましい。
ここで述べる容量とは、選別チャネルの所定の断面の容量のことである。例えば、１００μｍ×２００μｍの寸法を有する長方形状の選別チャネルは、２×１０４μｍ２の「横断容量」を有する。かかる「横断容量」は、実際は断面積なので、チャネルの長さまたはその増加分を掛けることにより、真の容量に変換することができる。従って、前記と同様の長方形状チャネルであって２×１０４μｍ２の横断容量を有するものは、実際の容量が２×１０６μｍ３で１００μｍ以上の長さになる。
選別流体と媒体流体の線流速は、実質的に同じであることが好ましい。すなわち、１．５：１〜１：１．５の流速の範囲内であることが望ましい。媒体流体の線流速が選別流体の線流速よりも大きい場合、それに対応した媒体流体の小さい横断容量を、これと同程度の運動性粒子の混入に使用することができる。選別流体や媒体流体の所望する程度の減少/増加を容易化することが困難になるほど界面混合を悪化させなければ、対向並流も可能ではあるが、並流であるのが望ましい。
選別流体と媒体流体との間の界面は、実質的に混合しない界面であることが好ましい。「混合しない」とは、二つの流体間の過度の乱れにより生じる混合がないことを意味する。例えば、波、流れ、渦等を表す界面とは対照的に、実質的に「静止」しているように見える界面が得られるように、平行で共に流れる層流が生じることが望ましい。乱流は、一般的に、流れの一部あるいは全部を混合させ、運動性粒子の減少/増加の効率を下げ、あるいは全く不可能にしてしまう。
静止しているように見える界面または「流線」が、拡散と浸透効果のみによって界面混合が発生する場所に形成されると、理論上最も良好な運動性粒子の分別が得られる。しかしながら、界面に沿った若干の乱れを許容することは本発明の趣旨には逸脱しないものである。多段階装置を用いた場合でさえも、所望する程度の分別が得られない場合には、この乱れは過度のものである。レイノルズ数として表されるこの乱れは、いかなる場合でも２０００以下であることが好ましく、より好ましくは１００以下、さらに、より好ましくは１０以下、そして、最も好ましくは１以下であるべきである。ここで例示された高性能装置は、レイノルズ数が約０．１である。
界面の性質、つまりその乱れ度は、分別度によって判断することができるが、他の数々の方法によっても判断することができる。例えば、以下に述べるPDMS装置においては、装置の光学的な透明特性によって、例えば、片方あるいは両方の流体に色をつけて、界面における色の変化によって界面を観察することにより、顕微鏡で観察することが可能になる。また、従来の光学的技術によって、異なる屈折率をもつ媒体間の界面を簡単に観察することもできる。また、選別流と媒体流との混合度は、標識（taggant）、つまり、放射性溶解混合物、非運動性粒子、あるいは、可視または蛍光染料等を、どちらか片方にだけ入れることで観察することができる。
最初に標識を含有していなかった出口流で標識が出現することによって、乱れの界面の混合、あるいは、拡散または浸透よる界面の混合のどちらかが証明される。後者の２つの効果による混入は、少しは見込まれるが、極めて少量のものである。標識が非標識流に５０％混入すれば、ほぼ完全な混合となっている。標識を非標識流に２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくは１％以下で混合することが望ましい。適度に低いレイノルズ数を保つ限り、申し分のない乱れ度を得ることが出来るだろう。上述の基準を満たす流れは、ここでは「実質的に乱れのない流れ」である。並流の流れは乱れが少なく、それ故、対向並流よりも界面混合が少ないということは注目すべき点である。
流体流速が、上述の乱れのない条件を満たすとすれば、速さ自体は幅広く変化する。また、選別装置の壁は、流体の流れに対して固定しているので、乱れの可能性を生む。壁の効果は、狭いチャネルを使用するとき、特に、選別あるいは媒体流どちらか狭い方に接触する壁では、非常に重要である。当該装置はかなり小さく、チャネルもかなり細いので、１０ｃｍ／ｓ以下の線流速、好ましくは１０ｍｍ／ｓ以下の線流速が好ましい。また、０．１ｍｍ／ｓ〜１０ｍｍ／ｓの流速が特に好ましい。
線流速の下限は、ブラウン運動によって、選別流から媒体流へと非運動性粒子を混合することにより、決定される。例えば、流速０で、同一の基本流体組成物（例えば緩衝食塩水）では、媒体相内への非運動性粒子の分布は、時間がたてば最終的に、濃度が同一になって、完了する。流速が高ければ高いほど、非運動性粒子のブラウン再分配は少なくなる。高度の混合からも明らかなように、界面流が乱れるとき、流速は上限に達する。
相対流量、相対流速、及び、絶対流速の決定は、分別の簡単な計算及び/または測定、例えば、それぞれの速さ及び量を変化させ、選別流と媒体流との間の粒子の相対的増加及び相対的減少を決定することにより、当業者が通常に実施することができる。
装置の幾何学的形状は変化する。例えば、選別チャネルの長さは、一般的に、運動性粒子が、２つの位相との間でランダム化する速度や流速に関係する。例えば、所定の流速では、限定された運動性をもつ運動性粒子はより長い選別チャネルを必要とし、一方、所定の選別チャネルの長さでは、低運動性粒子が必要とする流速は遅い。また、界面表面積も装置の幾何学的形状に影響を与える。
例えば、ある流体に平行で、より広いチャネル面に接すると共に、他の流体が近接している、平たい長方形の選別チャネルでは、ランダム化が速まり、それ故、該第一の流体に平行で、狭いチャネル面に接触する場合より、選別チャネルの長さが短くてよい。後者の場合、界面積は、前者に比べてずっと小さくなる。
ほとんどの目的に対し、顕微鏡サイズや、長さ１０cm以上の装置を、構成することは、理論的に可能であるが、選別チャネルは極めて短く、ほとんどの場合２〜５ｃｍ以下となり、ほとんどの装置は１００μｍ〜１ｃｍとなる。例えば、***の選別において、長さ５０００μｍ（５mm）の選別チャネルは極めて申し分がない。段階的装置においては、選別チャネルが短いことが望ましい。
選別チャネルの断面の幾何学的形状は重要ではない。正方形、長方形、長円形、円形、台形、三角、その他の断面を使用してもよい。製造を簡便にするためには、ノンアンダーカット（non-undercut）チャネル、つまり、正方形、長円形、三角、台形、半円形、または、半長円形の断面が好ましい。これらの形状は、例えば、形成に、ニートキャスティング（neat casting）法、溶解キャスティング法を使用する場合に好ましい。立体印刷技術（SLA）による形成の場合、より複雑な形状のものを簡単に作ることが可能である。
装置が、例えば接合により互いに結合して連続した層を形成する場合には、アンダーカットチャネルの複雑な形状は、鋳造技術によって簡単に提供することができる。しかしながら、チャネルの幅は、媒体流と選別流の両方が粒子を混入するようなものでなければならない。例えば、人間の***の選別に関して、高さ５０μｍ、幅５００μｍで実質的に長方形のチャネルは申し分がない。判断の基準として、人間の***は、頭が直径約２.５μｍ、長さ５μｍで、全体の長さは約６０μｍである。
たいてい、供給チャネルと出口チャネルの断面積やサイズは、選別チャネルの断面積よりも小さい。選別流入口チャネルの最小サイズは、選別流内に存在する粒子のサイズによって決定される。選別流チャネルが、チャネル内に含有されると思われる粒子のサイズの３〜１０倍の遊離チャネルを提供することが好ましい。
同様の考え方は、媒体流出口チャネルのサイズにも当てはまるが、媒体流入口チャネルには必ずしも当てはまらない。上述のように、出口チャネルが入口チャネルよりも大きく、そのため、媒体流の一部を選別流の混入させることが望ましい例もあるが、選別流入口と出口チャネルとは同程度のサイズであることが好ましい。***の選別に関しては、高さ５０μｍ、幅１００μｍ、長さ５０００μｍの長方形選別流入口チャネルは申し分がない。
各種入口、出口チャネルの長さは重要ではない。入口チャネルが少なくとも一定の実質的な長さをもち、選別流チャネルと媒体流チャネルとの合流前に層状の流れの形成を助けることが望ましい。一般的に、粘性の高い流体は、粘性の小さい流体と同じ長さのチャネルを必要としない。場合によっては、入口チャネルは完全になしで済ましてもよい。つまり、選別流入口（あるいは貯留容器）及び/または媒体流入口（あるいは貯留容器）が、直接選別チャネルにつながるのである。しかしながら、たいていの場合、選別装置の構成を簡便にするためには、入口チャネルを使用することが好ましい。例えば、後述される***選別装置に関しては、長さ約３mmの入口チャネルは申し分がない。
選別流と媒体流との合流の接合点１８（図１）は、流体流が、過度に混合することなく、円滑に接合するのを助けるように構成するのが好ましい。そのため、一般に、接合点は比較的鋭利になる。選別流入口チャネルと選別チャネルとの間、及び、媒体流入口チャネルと選別チャネルとの間に含まれる角度は同じかもしれないし、異なるかもしれない。つまり、装置は必ずしも対称的でなくともよい。同じ考え方が、選別流と媒体流とが分別される、あるいは、それぞれ「それる」接合点１７にも当てはまる。しかしながら、選別流入口チャネル、選別チャネル、及び、選別流出口チャネルが、実質的に線形で、選別流内において、非運動性粒子の障害をできるだけ少なくすることが好ましい。
選別装置の構成材料は適切な材料であれば任意のものが使用でき、また当該装置の組立ては任意の組立て方法を含むことができる。例えば、装置が、ガラス、シリカ、シリコン、金属のエッチングまたはポリマー等の溶解エッチングによって、化学的にマイクロマシン化してもよい。また、既知の立体印刷技術によって、個々に装置を組み立ててもよい。また、該装置は、例えば、シリコンゴム、熱可塑性ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリアミド、ポリエステル等の成形可能なポリマーで射出成形してもよい。
ネガ型「マスタ」を供給し、マスタにキャスタブル材料を鋳造することで、選別装置を鋳造することが、今の状況では好ましい。キャスタブル材料として好ましいものは、エポキシ樹脂、硬化性ポリウレタンエラストマー、ポリマー溶液、つまり、塩化メチレンまたは他の溶媒内のアクリル塩基ポリマーの溶液を含み、好ましくは、硬化性ポリオルガノシロキサン、コストの観点から特に好ましくは、ポリディメチルシロキサン（"PDMS"）等のメチル基を主に有するポリオルガノシロキサンを含むポリマーである。
硬化性PDMSポリマーは周知のものであり、様々な入手ルートがある。添加硬化系及び凝縮硬化系、また過酸化硬化系も手に入れることができる。これら全てのPDMSポリマーは、硬化中に、反応してクロスリンクを形成し、及び/または鎖状拡大を引き起こす反応基をごく一部有している。一部系（RTV-1）及び二部系（RTV-2）両方とも手に入れることができる。添加硬化系は、生物学的粒子生存性が重要な場合に好ましい。
透明な装置は多くの場合望ましいものである。このような装置は、ガラスや透明なポリマーから作られている。PDMSポリマーは透明な装置に非常に適している。ややゴム状のポリマーを使用する利点は、脱型時と、アンダーカットチャネルを提供する可能性とにある。これは硬い材料では不可能なことである。シリコンポリマーの鋳造によるマイクロ流体装置の組立方法は周知のものである。D.C.ダフィー他，"ポリ（ジメチルシロキサン）におけるマイクロ流体系のラピッド・プロトタイピング"，アナリティカル・ケミストリー７０，４９７４−４９８４（１９９８）、J.R.アンダーソン他，アナリティカル・ケミストリー７２，３１５８−６４（２０００）、及びM.A.アンガー他，サイエンス２８８，１１３−１６（２０００）参照。
該装置のチャネルと貯留容器の壁の性質は、該装置の応用とそこで使用される流体を考慮して選択される。例えば、該壁は疎水性でもよいし、親水性でもよい。または、装置の一部が疎水性で、他の部分が親水性であってもよい。また、該壁は、生物学的に適合、あるいは生物活性のコーティングによって壁の表面を改質したり、化学的機能性を提供したりするように処理、あるいは引き出される（derivitized）。***の選別に関しては、チャネルをウル血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングすると、チャネル内の流体の流れを改善するのに有用で、チャネル壁への細胞の非特異的吸着を最小限にすることが判明している。
該装置の入口、または入口チャネルへの流体の供給は、適切な方法であれば何でもよい。例えば、入口チャネル等に取付けられている、または接合している注射器あるいはマイクロチューブから流体を供給する。選別流入口と媒体流入口とは、必要な液体量を保持、供給することができる「オンチップ」貯留容器の形状であることが、装置として好ましい。これらの貯留容器は注射器、ピペット等によって充填される。
流体の流れを実現するのは、適切な方法であれば何でもよい。例えば、少量の液体のポンピングに適する外部マイクロポンプは利用可能である。また、マイクロポンプは装置自身の中に設置され、熱勾配、磁界及び/または電界により駆動され、加圧等される。これらの全ての装置は当業者には知られているものである。受動的駆動ポンピングシステムとマイクロ流体チャネルの結合は、Ｂ．Ｈ．ウェイグル他，"マイクロタス（MICROTAS）２０００の処理"，エンスヘーデ，オランダ，２９９〜３０２頁（２０００）において開示されている。
しかしながら、流体の流れは、重力流ポンプ、毛管作用、あるいはこれらの方法の組み合わせによって実現されることが好ましい。単純重力流ポンプは、装置の外部か内部どちらかにある流体貯留容器から構成される。この流体貯留容器は、それぞれの装置の出口よりも（重力に関して）高いレベルの流体を含有する。このような重力ポンプは、貯留容器内の液体の高さが下がると、静水頭が変化し、それゆえに流速も変化するという欠陥がある。多くの装置に関しては、相対的に一定な非パルシング（non-pulsing）流が望ましい。
定流量を得るために、参考のためにここに示す、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／００８１０２Ａ１（２００２年１月１８日）に開示される重力駆動ポンプが使用される。このような装置において、流体が、貯留容器内において、液体と貯留容器の壁との間で、表面張力と毛管力とにより垂直に流れることを阻止され、水平方向に移動している場合には、水平貯留容器を使用する。該液体の高さが一定であるので、静水頭の変化は起こらない。
また、毛管作用が流れを生じさせることもある。この場合、それぞれの出口チャネルあるいは貯留容器内の流体は、統合した入口チャネルあるいは貯留容器内の毛管力に比べて、チャネルの壁あるいは貯留容器の壁に関し、非常に大きな毛管力を示す。この毛管力の違いは、さまざまな方法によってもたらされるものである。例えば、出口及び入口のチャネルの壁、あるいは貯留容器の壁を、異なる疎水性、または、親水性とする。代わりに、出口チャネルまたは貯留容器の断面積を小さくし、それにより、より大きい毛管力を示すことが好ましい。
一定流速重力駆動ポンプとして機能し、また、入口出口間で毛管力の違いを示す結合オンボード（on-board）貯留容器を使用することが最も好ましい。このような装置内の流れは、該装置が液体で満たされるとすぐ、あるいは、ブロッキングバルブあるいはプラグが開放されたときに、開始する。または、入口出口間の圧力差、例えば短時間、出口を吸引することによって、最初の補助を行う。
複雑な分別を実現し、収率を高め、分離（選別効率）を増加し、またはこれらの組み合わせを実現するために、多数の装置をさまざまな方法で接続する。また、多数の選別及び/または媒体流を使用する。多数の選別あるいは媒体流が使用される場合、選別流は、同じかもしれないし、異なるかもしれない。これは媒体流にもあてはまる。
例えば効率の促進に関して、図１に描かれるような装置の運動性粒子が減少された選別流出口は、第二装置の選別入口に接続されている。この第二装置は、また、媒体供給を有するものである。この二つの媒体流との連続接触の結果、選別流の運動性粒子はさらに減少する。両方の装置からの運動性粒子が豊富な流れは結合される。このようにいくつかの連続段を使用すると、事実上、運動性粒子の１００％の回収が可能となる。多数の装置を使用する場合、一体的な接続チャネルを使って同じ構造に組み立てることが好ましい。このような装置の一例を図３に概略的に示す。
図３において、直列に配置された二段の運動性粒子選別機は、単一の選別流体貯留容器２０からなり、選別流チャネル２１によって第一選別チャネル２２に接続されている。また、第一段は、第一媒体供給貯留容器２３，媒体流チャネル２４，運動性粒子が豊富な第一媒体チャネル２５，運動性粒子が豊富な第一媒体貯留容器２６からなる。第一段からの運動性粒子が減少された選別出口流は接続路２７を流れ、第二段選別チャネル２８への選別流入口として機能する。第二媒体貯留容器２９は、媒体入口チャネル３０を通って第二段選別チャネルへと媒体を供給する。
さらに運動性粒子が減少した選別流体は、チャネル３１から装置を出て、運動性粒子が減少された選別流貯留容器３２へと入り、運動性粒子が豊富な媒体流体の第二流は、媒体出口チャネル３３から選別チャネルを出て、貯留容器３４へと入る。二つの運動性粒子が豊富な媒体貯留容器２６及び３４は、好ましくはバルブのある通路を通じて、共通の出口チャネルあるいは貯留容器に接続したり、あるいは、例えば、必要であれば、注射器やピペットと、それらの組み合わせを使用することによって、手動で空にされる。
さらに、図４、５、及び６に、追加の装置の図を示す。図４の装置において、二つの媒体供給貯留容器４１は、媒体流体を装置４０に供給し、運動性粒子が豊富な媒体が、二つの媒体出口貯留容器４２内に集められている。単一の選別流体貯留容器は、選別流体貯留容器４３から、運動性粒子と非運動性粒子を含有する流体を供給し、運動性粒子が減少された選別流体が、選別チャネル４４を通った後、選別流体出口貯留容器４５に集められる。この場合、中央の選別流４６は、媒体流４７を、各側面に配置している。
図５及び６は、選別プロセスのさまざまな面の改善するため、各種流路の代替接続に依存する多段装置の略式図である。両方の図において、二重線は選別チャネルを示している。図５の装置は、運動性粒子を非運動性粒子から選別するだけでなく、異なる運動性の部分に選別することが可能であり、３つの選別チャネルを有している。図６の装置は、単一の選別チャネルの出口を、細かく分割している。つまり、選別流から最もかけ離れた場所に、比較的多くの高い運動性をもつ粒子が含まれている。図に示すように、本装置は、単純にも、非常に複雑にも構成することができる。また、装置は、並列、直並列、その他の様式で作動させることができる。並列処理は、異なる媒体流体を比較して、大きいサンプルを選別する場合や、選別効率を測定する場合等に、利用される。この比較は、測定が単一の装置において行われる場合に、統計的により正確である。
この明細書では大部分が、非運動性粒子からの運動性粒子の分別について述べているが、本発明のプロセス及び装置は、異なる運動性をもつ運動性粒子の分別にも適するものである。最も高い運動性粒子は、運動性の低い粒子よりも高い割合で媒体流に入る。
選別チャネル内での滞留時間は、最も高い運動性の粒子が、全流体中でランダム化分布またはランダム化に近い分布をとるように選ばれることが好ましい。しかしながら、追加の選別チャネルの長さは容認され、非運動性粒子の媒体流への分布は、実質的に、ブラウン運動、乱れ、同様の効果のみによるものである場合における、全く運動性を有しない粒子からの運動性粒子の分別と対照的に、運動性粒子と低運動性粒子が分別する際には、低運動性粒子もまた、十分な時間があればランダム化分布をとる。
これが起こらないように、選別チャネルの長さを下方に調整しなければならない。媒体流は、運動性粒子と低運動世粒子との両方が増加するが、相応して、より大きな運動性をもつ粒子が大いに増加する。第一媒体流（次の段階への選別流として供給）の多数連続処理により、異なる運動性をもつ粒子間の分別が高まる。選別流の第二及び追加の選別と、それに続く同様の処理とにより、収率が増長される。
例１
マイクロ流体***選別装置を、先に引用したＤ．Ｃ．ダッフィーらによって開示されたソフトリトグラフ技術を使用して、ダウ・コーニングＳＹＬＧＡＲＤ（R)１８４硬化性シリコーン樹脂から製造した。硬化性ＰＤＭＳを、外側装着物として好ましい貯留容器とチャネル特性を有するマスタ上にキャストした。キャストされたＰＤＭＳ選別装置を、プラズマ酸化して、キャスト物の開口チャネル側をガラス製のカバースライドにシールした。チャネルと貯留容器とは、インビトロジェンコーポレーション社（Invitrogen Corporation）製のリン酸緩衝食塩水に溶解した、１％のシグマ(Sigma)製のウシ血清アルブミンフラクションＶでコーティングした。カバースライドを除いて装置全体の厚みは約６ｍｍで、米国の１ペンスコインよりも若干大きい程度であった。該装置の斜視図を図７に示す。
図７においては、ＰＤＭＳキャスト物は透明であり、貯留容器とチャネルのみが描かれている。カバースライドは装置の底面に固定されている。数字は図１と同じものである。チャネルは、高さ５０μｍで、断面が長方形であり、貯留容器はほぼ半円である。入口貯留容器２、３の双方とも３ｍｍ程度の高さであり、一方、出口貯留容器は、２ｍｍ程度の高さである。入口及び出口チャネル７、８、９、１０は長さ約５０００μｍの長さである。***入口チャネル７及び運動性が少ない***出口チャネル９は、幅１００μｍで、媒体入口チャネル８及び出口チャネル１０は幅約３００μｍである。選別チャネル６は幅５００μｍで、長さ５０００μｍである。
***のサンプルは、不妊症評価を受けた男性から審査委員会（Review Board）機関の認可を得て入手された。選別テストは洗浄された***サンプルを使用して実施された。リストに載せられた順序において、６０μLの処理媒体を媒体入口貯留容器に、５０μLの洗浄***サンプルをサンプル入口貯留容器に、２μLの媒体を各出口貯留容器に加えた。***選別収率は、これらの希釈比を考慮に入れて計算された。運動性***の数は、メイクラーカウンティングチャンバ（Makler Counting Chamber）（イスラエル、ハイフィ（Haifi）、
セフィーメディカルインスツルメンツ（Sefi-Medical Instruments））により決定した。一般的に非運動性***に相当する、膜に欠陥のある***の視覚化に関して、３μL のヨウ化プロピジウム（モレキュラープローブ（Molecular Probes）、www.probes.com、処理媒体中に６０ｍＭ溶解）を、選別前の***サンプルに加えた。テキサスレッドフィルター（Texas Red filter）セット（励起５７７ｎｍ、放射６２０ｎｍ）を使用して、染色された細胞の赤色蛍光を見た。ＣＣＤカメラ（ハママツ ＯＲＣＡ−１００、www.hamamatsu.com）付きインバートマイクロスコープ（ニコン社製 ＴＥ３００、www.nikon-usa.com）を使用して、像をとらえて動画を撮影した。
選別装置は、非運動性***が最初のストリームラインに沿って流れて一つの出口から出るのに対して、運動性***は最初のストリームラインをそれて別の出口から出るという選別システムを採用している。この選別メカニズムは、急速に拡散する小さな分子が、該分子よりもゆっくりと拡散する大きめの分子及び粒子とは異なる出口から出るという「Ｈフィルター」において使用される「フィルタリング」メカニズムに関連している。この二つの装置の違いは、本発明の選別装置が細胞の活発な運動を利用しているのに対して、Ｈフィルターは粒子の消極的な拡散を利用していることである。かかるタイプの選別は、小さなチャネル内で複数の層流がストリーム間の界面で乱混合することなくそれぞれ平行に流れているために可能なことである。選別装置内の***サンプル及び媒体の流れ(フロー)の代表的なレイノルズ数はおよそ０．１のオーダーである。
長さ約６０μｍの非運動性のヒト***とそれとほぼ同じ大きさの非運動性粒子とはゆっくりと拡散（Ｄ＝１．５ｘ１０−１３ｍ２/秒；１０μｍ拡散するのに６９０秒）し、最初の流ストリームライン内に留まった。対照的に、運動性のヒト***は、２０℃で速度２０μｍ/秒以上で進む。この急速な移動性によって、非運動性***ではなく、運動性***が、数秒間で幅５００μｍのチャネル内にランダムに分布することができる。特に、該選別装置は、主要分別(セパレーション)チャネル内において、***に２０秒の滞留時間を与えるように設計されている。この分別（セパレーション）チャネルの端部に配置される分岐部によって、最初の入口流（ストリーム）からそれた運動性粒子のみを効率的に集めることができる。
上述の選別装置は、例えば、入口／出口ポート、流体貯留容器、ポンプ、電源、選別チャネル等の、***選別に必要なあらゆる機能を、製造及び使用に実用的な単一チップデザイン上に統合する。この例の重要な設計上の特徴は、サンプル入口／出口ポートと流体搬送（ポンピング）システムとしても機能する、四つの水平に配置された流体貯留容器一式である。これらの貯留容器の幾何学的配置、幾何学的形状、そしてサイズは、重力と表面張力とがバランスをとれるように設計され、貯留容器内の流体の容量に関係なく、長時間一定の流速を生じさせるポンピングシステムを提供する。これは、入口貯留容器内の流体の容量が減少すれば時間とともに流速も減速する従来の重力駆動ポンピングシムテムと対照的である。
貯留容器の直径は、表面張力が水平に配置された貯留容器から液体があふれ出るのを防ぐことができる程度に小さく、また、十分な量のサンプル（何十マイクロリットルから何百マイクロィットル）を保持し、適切なサンプルの導入とリカバリとを可能にする程度に大きくする。前記力のバランスによって、内部の液体がこぼれることなく貯留容器を水平に配置することができる。次に、該水平貯留容器配置は、貯留容器内にある流体の量に関係なく、入口貯留容器内の流体と、出口貯留容器内の流体との高さを同じに保ち（入口貯留容器の上面と出口貯留容器の上面とは高さが１．０ｍｍ異なる程度である）貯留容器内の流体の量が変化しても、一定の水圧を保持する。
上記の受動的駆動（passively-driven）ポンピングシステムは、水平に配置された貯留容器を使用して貯留容器内の液体量が減少すると圧力も減圧するという従来の重力駆動（gravity-driven）ポンピングの問題を解消する点において、独特のものである。さらに、ポンプの構造は、他の機械あるいは非機械ポンピングシステムに比べて非常に簡単なものであり、ポンプの製造を簡単に、小さく統合された装置にポンプを統合することができる。最後に、駆動力として重力と表面張力とを使用すると、バッテリー等の電力供給源の必要がなくなり、これにより選別装置全体のサイズが小さくすることが可能となる。
重力、表面張力、チャネル抵抗性を考慮して、該選別装置を、主要選別チャネル内部の滞留時間が約２０秒となるように***の流速を一定にするように設計した。特に、該装置は、流体貯留容器のフロー抵抗が、マイクロ流体チャネルのフロー抵抗の１０分の１以下（好ましくは何１０分の１以下）となるように設計されており、従って、ほとんど無視できるようになっている。このため、２．８ｘ１０１２ｋｇ／（秒／ｍ４）と計算される該チャネルの抵抗は、システムの全抵抗と近似するものである。０．００８μＬ／秒のバルク流速は、２０秒という好ましい滞留時間を実現するために必要であり、全抵抗が２．８ｘ１０１２ｋｇ／（秒／ｍ４）であるので、流体を駆動するのに必要な正味の圧力損失は、２３Ｎ／ｍ２である。
この望ましい圧力損失を実現するために、貯留容器の寸法は、毛管力（直径３．０mmの入口貯留容器対直径２．０mmの出口貯留容器）が１３Ｎ／ｍ２、静水（hydrostatic）力（高さの違いが１．０mm）による該選別装置のマイクロ流体チャネルへの圧力損失が９．８Ｎ／ｍ２となるように設定された。毛管力の計算に関して、接触角は０℃（BSAコーティングされたPDMS上の水の接触角は非常に小さい）、洗浄***サンプルの表面張力はほぼ０．０４０Ｎ／ｍ（タンパク質等の「不純物」により水の表面張力よりも小さい）、洗浄***サンプルの粘度は水の粘度と同様であるとした。１％BSA溶液の希釈粒子懸濁液に対する０．００８μＬ／秒のバルク流速は、計算された流速のものとほぼ同等であった。実際の***サンプルは、見掛け粘度が大きいため、流速が小さくなることもあった。***サンプルストリームの流速が小さければ、少々収率を低めるが、選別された***出口において回収される***の純度に影響することはない。
該選別装置の***選別効率は、三つの方法によって評価された。つまり、（i）相対照（phase contrast）顕微鏡によるチャネル内の運動性***の動きの追跡、（ii）蛍光顕微鏡によるチャネル内のヨウ化プロピジウムに染色された細胞の動きの追跡、（iii）グリッドをベースとする***カウント装置であるメイクラーカウンティングチャンバ（Makler Counting Chamber）の使用によって、入口及び出口貯留容器内の運動性***と非運動性***の数を決定した（図８）。***追跡（tracking）実験は、運動性***が最初のストリームラインから泳ぎ出ることができるかというプロセスを示している。PIは、運動性***は染色しないが、死滅した細胞等の細胞膜を染色し、これにより、非運動性***を赤色蛍光でハイライトし、視覚化させることができる。
図８の棒グラフは、選別前と選別後での運動性をもつ***の割合を比較している。陰影のついていない棒グラフは最初の***サンプルを示し、実線のある棒グラフは運動性粒子が豊富な媒体流を示している。選別後の運動性***の純度は、選別前の運動性***の純度に関係なくほぼ１００％であった。***サンプル入口貯留容器内の運動性***の総数に対する運動性***出口貯留容器内の運動性***の数の比として定義される収率（３８％、４２％、４３％）は、直接スイムアップ（swim-up）法、遠心分離された***のペレットからのスイムアップ、または密度勾配分別法等の従来の選別方法を使用して処理された***の回収率（０．８％〜５０％）と同程度、あるいは、該回収率より大きかった。
また、妊娠の成功と相関するもう一つの重要な特性である***の形態が、該装置で選別した後（厳密な***形態（Strict Sperm Morphology）：選別前の平均９．５±１．１％から選別後の平均２２．４±３．３％）に改善したことも認められた。クリューガーストリクト（Kruger Strict sperm）***形態は、一連の基準あるいは水準であり、この基準あるいは水準によって、***が特定の測定値内に収まるもので（頭部の幅及び長さ、尾部の長さ、***の頭の一定割合を構成するアクロソーム）、異常性（例えば、ピンヘッド、ラウンドヘッド、折れ曲がったテイル）を欠くものでなければならない。
以上述べてきたように、該運動性粒子選別装置は小さく、簡単に製造することができ、操作が容易で、高い効率を得ることがわかる。
本発明を好適例により説明したが、これらの例が、本発明の全ての可能性を説明しているわけではないことは当然である。また、明細書において使用されている文言は、限定的に解釈されるべきでなく、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない限りさまざまな変更があり得る。
本発明が適用される運動性粒子選別装置の例を簡略して示した図. 図１の装置の選別チャネルにおける運動性粒子の非運動性粒子からの選別を説明する図 選別装置を一連に連結した選別装置の一例を示す図 複数の媒体入口を有する選別装置の他の一例を示す図 本発明が適用される選別装置の他の一例を概略的に示す図 本発明が適用される選別装置の他の一例を概略的に示す図 図１と同様の装置の斜視図 ***の選別において図１と同様の装置の選別効率を示す図

Claims (7)

  1. 低運動性***及び／または非運動性***からの運動性***選別法において、
    ａ）運動性***と、低運動性***あるいは非運動性***の少なくとも１つを含有する選別流体のストリームと、
    運動性***が豊富に含まれることとなる媒体流体のストリームとを、
    選別装置の選別チャネル内において接触させるが、該選別チャネル内には、該選別流体ストリームと該媒体流体ストリームとの間に乱流のない界面が存在し、これにより、運動性***が能動運動により選別流体ストリームから媒体流体ストリームへと入り、運動性***が減少した選別流体ストリームと運動性***が豊富な媒体流体ストリームとが形成され、
    ｂ）運動性***が減少した選別流体出口ストリームを運動性***が豊富な媒体流体出口ストリームから分離し、運動性***が生きている状態で運動性***を分離する
    ことを特徴とする低運動性***及び／または非運動性***からの運動性***選別法。
  2. 前記選別流体を選別流体貯留容器に供給し、前記媒体流体を媒体流体貯留容器に供給することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 前記媒体流体と前記選別流体とは、同方向に、また、実質的に同じ流速で流れることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  4. 前記選別流体ストリームと前記媒体流体ストリームとは、前記選別チャネル内において層流を示すことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. 前記選別チャネル内の、前記媒体流体ストリームの断面容量は、前記選別流体ストリームの断面容量より大きいことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  6. 前記運動性***が減少した選別流体出口ストリームは、選別チャネルを有する第２装置への選別流体入口ストリームを含み、ａ）からｂ）の手順が繰り返され、これにより、さらに運動性***が該第２装置の媒体流へ入って、前記選別流体の運動性***をさらに減少させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  7. 前記運動性***が豊富な媒体流体出口ストリームにおける運動性***の純度は、選別流体中の運動性***の純度より高く、少なくとも８０％であり、該割合は、前記運動性***が豊富な媒体流体出口ストリームにおける総***量に対する、前記運動性***が豊富な媒体流体出口ストリームにおける運動性***の数に基づくことを特徴とする、請求項１記載の方法。
JP2003571453A 2002-02-27 2003-02-24 運動性***選別法 Expired - Lifetime JP4557551B2 (ja)

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