FI96452C - Menetelmä väriaineiden virittämiseksi - Google Patents

Description

96452

MENETELMÄ VÄRIAINEIDEN VIRITTÄMISEKSI

Keksinnön kohteena on menetelmä pitkäikäisten fluoresoivien ja fosforoivien väriaineiden virittämiseksi.

Tämän keksinnön kuvaamalla menetelmällä voidaan virittää fluoresoivia ja fosforoivia pitkäikäisiä väriaineita niiden 5 normaalia viritysaallonpituutta huomattavasti pitkäaaltoi-semmalla valolla. Keksinnön kuvaelmalla menetelmällä viritetään väriaineita ns. kaksoisfotonivirityksellä, jolloin viritys tapahtuu kahden fotonin energioiden summautuessa. Tämän keksinnön mukainen menetelmä on tarkoitettu sellai-10 sille fluoresoiville ja fosforoiville väriaineille, joiden emission puoliintumisaika on triplet-energiavälitilan vuoksi pidempi kuin 100 ns. Näiden väriaineiden viritystilojen puoliintumisaika on siis huomattavasti pidempi kuin tavanomaisten orgaanisten väriaineiden emission puoliintu-15 misaika. Orgaanisissa väriaineissa emission puoliintumisaika on yleensä 1 - 10 ns ja korkeintaan 100 ns, koska emissio ei yleensä synny näissä aineissa triplet-välitilan kautta.

Näitä fluoresoivia ja fosforoivia väriaineita käytetään 20 biospesifisissä määrityksissä merkkiaineina. Yleisimpiä biospesifisiä määritystekniikoita ovat immunomääritys ja DNA-hybridisaatio. Emissiovaloa mittaamalla havainnoidaan vasta-aineen sitoutuminen. Biospesifiset määritykset tulevat kysymykseen sekä in-vitro diagnostiikassa että-mikros-25 kopiassa. Mikroskopiassa voidaan vasta-aineiden avulla havainnoida ja paikallistaa esimerkiksi mikro-organismien rakenneosia.

Lyhytikäisten fluoresoivien aineiden kaksoisfotoniviritys on tunnettu tekniikka mm. spektroskopian ja mikroskopian 30 alalla. Nykyisellä tekniikalla menetelmän käyttö vaatii korkeatehoisten ultralyhyitä pulsseja tuottavien laserlait-teiden käyttöä. Kaksoisfotoniviritys on mahdollista, kun hetkellinen fotonitiheys on korkea. Tällöin on kahden 96452 2 fotonin yhtäaikainen absorboituminen todennäköistä. Korkea fotonitiheys saavutetaan suurella valoteholla ja kohdistamalla valo optisesti. Kaksoisfotoniviritys on teoreettisesti kuvattu jo vuonna 1931 (Göppert-Mayer, M. Ann. Phys.

5 1931, 9:273). Ensimmäiset käytännön todisteet menetelmän toimivuudesta saatiin 1960-luvulla laserlaitteistojen tullessa saataville. 1963 raportoitiin ensimmäinen kaksoisfotoniviritys orgaanisissa kiteissä (Peticolas WL, Goldsbo-rough JP, Reickhoff KE. Phys. Rev. Let. 1963, Voi 10/2).

10 Myös suuritehoisella jatkuvalla laservalolla voidaan havaita kaksoisfotonivirityksiä (Sepaniak MJ, Yeung ES. Anal. Chem. 1977, 49:1554-1556), mutta tällöin viritysvalon sironta ja näytteen lämpiäminen haittaa mittauksia erittäin paljon.

15 Kaksoisfotonivirityksen etu on siinä, että UV-virityksen sijasta voidaan käyttää näkyvää valoa viritykseen. Käytettäessä näkyvää valoa emission aikaansaamiseksi siten, että väriaine viritetään kahden fotonin yhtäaikaisella pulssilla, vähenee valon sironta huomattavasti verrattuna UV-20 valolla suoritettuun viritykseen. Edelleen kaksoisfotoniviritys vähentää valon aiheuttamia vahinkoja näytteelle tarkasteltavan kohteen ylä- ja alapuolella. Kaksoisfotoniviritys sopii parhaiten pienien näytetilavuuksien tai rakenteiden tarkasteluun.

25 Sovellettaessa kaksoisfotoniviritystä pyyhkäisymikroskopi-aan on mahdollista saavuttaa konfokaalimikroskoopin kaltainen 3-ulotteinen erottelukyky ilman konfokaalimikroskoopin vaatimaa toista neulanreikää. Menetelmä on kuvattu US-patentissä 5,034,613, 1991. Virityksen rajautuminen 3-30 ulotteisessa avaruudessa on tunnettu myös kirjallisuudesta (Anal. Chem. 1990, 62:973-976, Science, voi 248, 1990, 73-76).

4 '

On tunnettua, että yksittäisen fotonin absorptio väriaineeseen on todennäköisyyslaskennan käsitteiden mukaisesti 35 riippumaton tapahtuma. Fotonien absorboituminen on joukko

II

3 96452 yksittäisiä, riippumattomia tapahtumia. Todennäköisyyttä, että fotoni absorboituu voidaan kuvata lineaarisella funktiolla. Absorptio on lineaarinen, kun viritettävät energiatilat eivät ole kyllästyneet. On tunnettua, että kahden 5 tai useamman fotonin absorptio on epälineaarinen prosessi (US Pat. 5,034,613). Kun kaksi tai useampi fotoni absorboituu, ei yksittäisten fotonien absorptio ole riippumaton. Väriainemolekyylin virittyminen tapahtuu ainoastaan, kun kaikki fotonit absorboituvat samanaikaisesti. Usean fotonin 10 absorption todennäköisyys on yksittäisten fotonien absorp-tiotodennäköisyyksien tulo. Kahden fotonin aiheuttama emissio on siis neliöllinen prosessi, kolmen fotonin aiheuttama emissio on kuutiollinen prosessi ja niin edelleen.

Mikrokuvantamiseen tarkoitetun optisen järjestelmän ominai-15 suuksia voidaan kuvata järjestelmän vasteella pistemäiseen valolähteeseen. Pistemäinen valolähde muodostaa diffraktion vaikutuksesta optiselle järjestelmälle ominaisen intensiteetti jakauman tarkennuspisteessä (pistevaste). Tämä intensiteetti jakauma kuvaa edelleen järjestelmän erottelukyvyn. 20 Normalisoituna tämä intensiteettijakauma on todennäköisyysjakauma sille, kuinka pistemäisestä valolähteestä lähteneet fotonit saapuvat tarkennusalueelle. Kaksoisfotoniabsorption epälineaarisuutta voidaan käyttää hyväksi erottelukyvyn parantamisessa. Tällöin on kaksoisfotonitekniikalla viri-25 tyksen todennäköisyysjakauma ensimmäisen fotonin ja toisen fotonin intensiteettijakaumien normalisoitu tulo. Näin saatu todennäköisyysjakauma on 3-uloitteisessa avaruudessa, eritoten syvyyssuunnassa, selvästi yksittäisen fotonin todennäköisyysjakaumaa rajautuneempi. Kaksoisfotonivirityk-30 sellä havainnoidaan näin ollen ainoastaan se fluoresenssi, joka syntyy valonsäteen tarkennuspisteen selvästi rajatussa 3-ulotteisessa lähiympäristössä (US Pat. 5,034,613). Järjestelmä on näin periaatteeltaan samankaltainen kuin perinteisempi 3-ulotteinen valomikroskooppi eli konfokaalimik-35 roskooppi. Konfokaalimikroskoopissa järjestelmän pistevaste muodostuu pistemäisen virityksen ja pistemäisen ilmaisun todennäköisyysjakaumien normalisoidusta tulosta. (Confocal 96452 4

Microscopy, T. Wilson (ed). Academic Press, London, 1990, (1-64)).

Jotta kahden fotonin absorptio olisi mahdollista, on väriaineen absorboitava fotonit siten, että fotonien energioi-5 den yhteissumma on yhtä suuri kuin viritykseen vaadittava energia (Kuvio 1). Virittyminen tapahtuu tällöin joko molekyylin elektronien energiavälitilan kautta (φ 1) tai suoraan virittyneeseen tilaan (<D2). Kuviot IA ja IB esittävät kaksoisfotonivirityksen eri mahdollisuudet: kuvio IA 10 suoraan kahden fotonin (Λ 1 ja λ 2) yhteisvaikutuksena; kuvio IB energiavälitilan (Φ 1) kautta. Välitilan kautta tapahtuva virittyminen (kuvio IB) vaatii väriaineen, jossa tämä energiavälitila on olemassa. Kuvion IA mukainen suora kahden fotonin viritys ei vaadi välitilaa, vaan fotonien on 15 yhtäaikaisesti, eli noin 10*15 sekunnin kuluessa, absorboiduttava samaan väriainekromoforiin.

Nykyisten kaksoisfotoniviritykseen perustuvien järjestelmien haittana on erittäin suuritehoisen pulssilaserin aiheuttamat kustannukset sekä järjestelmän suuri koko ja monimut-20 kaisuus. Käytettäessä jatkuvatoimista laseria vaaditaan useiden wattien jatkuva teho. Tämä tuhoaa lähes kaikki tunnetut orgaaniset näytteet. Edelleen on haittana emis-siovalon vähäisyys suhteessa viritysvaloon ja tavanomaisten ‘ lyhytikäisten väriaineiden emission mittausta rajoittaa 25 lisäksi viritysvalon sironta.

Virittyneiden väriainemolekyylien viritystilat purkautuvat eksponentiaalisesti yhtälön [1] mukaan: N = N0exp(-t/x) [1] N on kulloinkin purkautuvien molekyylien lukumäärä, N0 30 ajanhetkellä t = 0 purkautuvien molekyylien lukumäärä ja x on viritystilojen keskimääräinen elinikä ("decay" parametri). Seuraavassa tarkastelussa pitkäikäisillä ja lyhytikäisillä väriaineilla tarkoitetaan väriaineita, joiden keski-

II

96452 5 määräinen elinikä τ on pitkä (100 ns - 10 ms) tai lyhyt (1 ns - 100 ns).

Pitkäikäisten väriaineiden aikaerotteisella mittauksella tarkoitetaan sitä, että väriaineen viritykseen käytetään 5 pulssivaloa ja mittauksen aloitusta viivästetään viritys-pulssista. Mittaus tapahtuu tyypillisesti fotonilaskentana, ja laskentaa suoritetaan tietyn aikaikkunan aikana. Lan-tanidikelaatteja mitattaessa lasketaan fotonit esimerkiksi 0.1 - 1 ms välisenä aikana virityspulssin päättymisen 10 jälkeen.

On tunnettua, että pitkäikäisten fluoresoivien väriaineiden aikaerotteisessa fluoresenssimittauksessa saavutetaan useita kertaluokkia suurempi herkkyys kuin lyhytikäisten fluoresoivien aineiden mittauksessa. Näillä aineilla on 15 immunodiagnostiikassa pystytty mm. korvaamaan radioisotoop-pien käyttöä sekä parantamaan mittauksen herkkyyttä (Soini, Lövgren. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 1987, 18:105-154).

Myös mikroskopiassa voidaan aikaerotteisella pitkäikäisen fluoresenssin mittauksella alentaa taustan määrää ja näin 20 saavuttaa suurempi herkkyys (Seveus et. ai. Cytometry.

1990, 13:329-338).

Aikaerotteisen mittauksen vaatima pitkä fluoresenssin elinikä on mm. lantanidiryhmän ioneilla Eu3+, Sm3+ ja Tb3+. Epäorgaanisina yhdisteinä esiintyessään ovat näiden metal-25 lien absorptio-ominaisuudet erittäin huonot, mutta kun metalliin liitetään orgaaninen ligandi, voidaan absorptiota parantaa merkittävästi. Näissä ns. lantanidikelaateissa virittävä fotoni absorboituu organiseen ligandiin, josta viritysenergia luovutetaan lantanidi-ionille. Kaikkien 30 tunnettujen lantanidien viritys tapahtuu UV valon alueella 250 nm - 370 nm. Lantanidikelaattien rakennetta ja käyttöä 4 » on kuvannut mm. Ilkka Hemmilä kirjassaan: Applications of Fluorescence in Immunoassays: 7.4.1 (140-145), John Wiley & Sons, New York 1991.

6 96452

Tunnettu haitta UV-viritteisillä pitkäikäisillä väriaineilla, kuten lantanidikelaateilla, on valon sironta UV-alueel-la, joka häiritsee emission mittausta. Samoin UV-valoa läpäisevien ja UV-valolla oikein toimivien komponenttien 5 valmistaminen on vaikeaa. Immunomäärityksessä nykyisin käytettävien välähdyslamppujen toiminta ja stabiilisuus ei myöskään ole kaikilta osin tyydyttävä. Näistä seikoista johtuen on edullista luoda järjestelmä, jossa voidaan käyttää pitkäaaltoisempaa viritysvaloa.

10 Käytettäessä US-patentissa 5,034,613 kuvattuja ultralyhyitä pulsseja (< 1 ps) kaksoisfotoniviritykseen, ei väriaineen eliniällä ole merkitystä, sillä lyhyt- ja pitkäikäisten valoa emittoivien väriaineiden elinikä on joka tapauksessa kertaluokkia pidempi kuin virittävän pulssin kesto. Ultra-15 lyhyen pulssin aikana energiatilat virittyvät riippumatta väriaineen emission eliniästä. Ultralyhyet pulssit ovat edullisia lyhytikäisten fluoresoivien aineiden yhteydessä, sillä keskimääräinen teho ja näytteelle aiheutettava vahinko voidaan pitää näin ollen kurissa. Samoin mittalaitteis-20 tojen havaitsema sironnut valo on vähäisintä ultralyhyillä pulsseilla. Kaksoisfotonivirityksessä saatavan fluoresenssin intensiteetin (I) riippuvuutta käytetystä viritysme-kanismista voidaan mallintaa yhtälöllä: I = Vakio * P2t [2] 25 P on pulssitetun viritysvalon huipputeho, t on virityspuls-sin kesto. Vakiotermi on optisesta järjestelmästä jä käytetystä väriaineesta riippuvainen. Tämä periaate on löydettävissä myös kirjallisuudesta (Wirth, Fatumbi. Anal. Chem. 1990, 62:973-976). Periaate on myös johdettavissa todennä-30 köisyyslaskennan keinoin.

Lyhytikäisten aineiden kaksoisfotonivirityksessä pyritään mahdollisimman tehokkaisiin ja lyhyisiin pulsseihin, jotta pulssien energia kaavan [2] mukaan pysyisi mahdollisimman 7 96452 matalana.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä pyritään kaksoisfo-toniviritys toteuttamaan ilman ultralyhyitä laserpulsseja.

5 Tämän keksinnön oleellinen sisältö on havainnossa, että pitkäikäisten fluoresoivien ja fosforoivien väriaineiden kaksoisfotonivirityksestä syntynyttä emissiota voidaan havaita aikaerotteisella mittauksella ilman, että viritys-valon sironta häiritsee mittausta. Pitkän fluoresenssin tai 10 fosforesenssin eliniän vuoksi voidaan myös käyttää pidempää virityspulssia ja vastaavasti alempaa viritystehoa. Lineaarisessa yksifotonivirityksessä voidaan pulssivaloa käytettäessä pulssin huipputehoa pudottaa suoraan siten, että pulssin huipputeho on kääntäen verrannollinen pulssin 15 kestoon. Kaksoisfotonivirityksessä voidaan pulssin huipputehoa pudottaa siten, että pulssin huipputeho on kaavan [2] mukaan kääntäen verrannollinen pulssin keston neliöjuureen.

Kaksoisfotonivirityksessä aikaerotteinen mittaus suoritetaan vastaavasti kuin normaali aikaerotteinen mittaus.

20 Pitkäikäinen väriaine viritetään kaksoisfotoniabsorption kautta pulssilla, joka on lyhyempi tai enintään yhtä pitkä kuin ko. väriaineen elinikä, lantanidikelaattien (τ = 1 ms) tapauksessa esim. 0.1 - 1 ms. Mittauksen aloitusta viivästetään kuten normaalissa aikaerotteisessa mittauksessa ja 25 mittaus suoritetaan käytetylle väriaineelle sopivassa aikaikkunassa.

Keksintöä selostetaan seuraavassa viittaamalla oheisiin kuvioihin, joissa 30 Kuviot IA ja IB esittävät kaksoisfotonivirityksen periaatekaaviota

Kuvio 2 esittää keksinnön mukaisen menetelmän todentamiseksi rakennettua laitteistoa 8 96452

Kuvio 3 esittää keksinnön mukaisella menetelmällä saadun mittausfunktion, jossa keksinnön toimivuus on todennettavissa

Kuvio 4 esittää erästä keksinnön mukaisen menetelmän 5 soveltamisesimerkkiä immunomäärityksessä

Kuvio 5 esittää erästä keksinnön mukaisen menetelmän soveltamisesimerkkiä mikroskopiassa Tämän keksinnön periaatteen matemaattinen mallintaminen onnistuu parhaiten käyttämällä yhtälöä [2] toisessa muodos-10 sa:

Pi2ti = P22t2 [3]

Yhtälön [3] molemmat puolet kuvaavat eri pulssien (pulssi-1 ja pulssi-2) huipputehojen suhdetta pulssien kestoon, kun oletetaan, että kaksoisfotonivirityksien määrä pysyy sama-15 na. US-patentissa 5,034,613 annetussa esimerkissä on kuvattu lyhytikäisen väriaineen (elinikä < 10 ns) kaksoisfo-toniviritys. Esimerkissä on laskettu keskimääräinen teho 50 mW, pulssin kesto 100 fs ja toistotaajuus 80 MHz. Huipputeho on tällöin 6.2 kW. Teoreettinen laskelma on edelleen 20 todennettu käytännön mittauksella suuruusluokaltaan paikkansa pitäväksi. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan olettaa, että pitkäikäisen väriaineen absorptiopa-rametrit ovat samat kuten US-patentin 5,034,613 esimerkissä, ja yhtälön [3] mukaisesti on 200 mW tehoisella 0.1 ms 25 pituisella pulssilla saavutettavissa sama kaksoisfotoni-fluoresenssin intensiteetti kuin 6.2 kW tehoisella ja 100 fs pituisella pulssilla. Lyhytikäisten väriaineiden fluo-resenssimittauksessa on tällainen tarkastelu lähinnä teoreettista, sillä väriaineen eliniän ollessa muutaman na-30 nosekunnin luokkaa, olisi virityspulssien pituuden oltava enintään samaa luokkaa, jotta fluoresenssista syntyvät fotonit olisivat erotettavissa virityspulssista. Aikaerot-

II

9 96452 teisessa mittauksessa, jossa väriaineen puoliintumisaika on 1 ms voi virityspulssin kesto olla 0.1 ms ilman, että pulssin pituus häiritsee merkitsevästi aikaerotteista kaksois-fotonifluoresenssin mittausta. Kuvattu menetelmä mahdollis-5 taa siis pitkäikäisten väriaineiden kaksoisfotonivirityksen matalilla pulssin huipputehoilla. Aikaerotteisessa mittauksessa saavutettavan useita kertalukuja suuremman herkkyyden ansiosta on mahdollista pudottaa virityspulssin huipputehoa. Keksinnön kuvaamalla menetelmällä on tällöin mahdol-10 lista mitata kaksoisfotoniviritettyä pitkäikäistä fluoresenssia tai fosforesenssia muutaman milliwatin suuruisella virityspulssin teholla. Käytännössä käytettävän pulssin pituus voidaan optimoida tietylle huipputehon arvolle. Kun pulssin pituus lähenee käytettävän väriaineen emission 15 puolintumisaikaa ei yhtälö [2] enää päde, sillä virityksen aikana osa viritetyistä tiloista purkautuu yhtälön [1] mukaisesti. Kun väriaineen energiatiloja ei kyllästetä, on optimaalisin pulssin pituus yleensä samaa luokkaa kuin väriaineen emission puoliintumisaika. Pulssin pituuden 20 kasvaessa kasvaa myös näytteelle vietävä energia, jolloin on huolehdittava siitä, ettei näytettä vahingoiteta. Tarvittaessa valitaan lyhyempi virityspulssin pituus tai matalampi virityspulssien toistotaajuus.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän toimivuuden todentami-25 seksi konstruoitiin kuvion 2 mukainen mittalaitteisto.

Näytteenä käytettiin europiumilla aktivoitua yttriumoxisul-fidikidettä (Y202S2:EU3+), jonka emission puoliintumisaika on noin 0.7 ms ja absorptiomaksimin aallonpituus n. 300 nm. Valolähteenä LI toimi argon-krypton seoskaasulaseri 647 nm 30 aallonpituudella. Viritysvalo fokusoitiin linssin 01 avulla pyörivään suljinlevyyn Cl ja laajennettiin edelleen yhdensuuntaiseksi linssillä 02. Viritysvalon monokromaattisuus varmennettiin virityssuodattimella F1. Säteenjakaja Ml jakoi virittävän valopulssin valon tehomonitorille P sekä 35 viritettävään kohteeseen N. Jakosuhde käytetyllä aallonpituudella oli n. 15% valon tehomonitorille ja n. 85% viritettävään kohteeseen. Säteenjakaja Ml on kvartsilasia eikä 96452 10 näinollen tuota omaa, mahdollisesti häiritsevää pitkäikäistä fluoresenssia. Mikroskooppiobjektiivilla 03 tarkennettiin valokimppu näytekiteeseen N. Näytteestä tuleva emissio palasi objektiivin 03 kautta säteenjakajaan Ml. Ml käänsi 5 15% emissiovalosta ilmaisimen II suuntaan. Hajavalon vähen tämiseksi emissiovalo tarkennettiin apertuuriin AI linssillä 04. Apertuurin edessä oli emissiosuodatin F2. Emissio-suoda ttimen päästökaista on 616 nm i 8 nm. Ilmaisu suoritettiin valomonistimella II fotonilaskentana, ja laskenta 10 rajattiin aikaikkunaan 200 μβ - 1 ms virityspulssin päättymisestä. Pulssitusta ja laskentaa toistettiin vakiomäärä, eli kunnes signaali oli riittävän selvästi erotettavissa taustasignaalista. Kaksoisfotonivirityksen todentamiseksi muunneltiin viritysintensiteettiä. Kuvio 3 esittää erään 15 Y202S2:EU3+ kiteen mittauksen, x-akseli esittää viritysinten siteettiä (Iexc) ja y-akseli saatua fluoresenssisignaalia (Iem). Suurin käytetty virityksen huipputeho näytteessä oli tässä tapauksessa alle 5 mW. Mittaus toistettiin usealle kiteelle. Toistetut mittaustulokset olivat samankaltaisia 20 virhemarginaalien puitteissa. Kuviossa 3 esitetystä tuloksesta voidaan todeta emission epälineaarinen riippuvuus viritysintensiteetistä. Kuvio 3 on virhemarginaalin ja mittauksen taustan huomioonottaen kaavan [2] mukainen.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän keksinnön mukainen . 25 menetelmä mahdollistaa mm. lantanidikelaattien kaksoisfo- tonivirittämisen matalatehoisella valolähteellä, kun fluoresenssi mitataan aikaerotteisesti. Koska viritys tapahtuu näkyvällä valolla ja matalalla pulssin huipputeholla, on laitteisto edullinen ja yksinkertainen käyttää. Keksintö 30 mahdollistaa edelleen sellaisten lantanidikelaattien käytön, joiden viritysmaksimi on alueella 270 nm - 330 nm.

Tämä lyhytaaltoinen UV alue on aikaisemmin ollut lähes käyttökelvotonta, koska tavanomaiset optiset materiaalit ja komponentit eivät toimi ko. aaltopituusalueella.

35 Keksinnön kuvaamaa menetelmää voidaan käyttää biospesifi-sissä määrityksissä siten, että tähän asti UV-viritystä 11 96455· vaatineet fluoresoivat tai fosforoivat väriaineet viritetään näkyvällä valolla, jolloin viritys perustuu kaksoisfo-toniviritykseen. Koska tarvittava pulssiteho on käytännössä matala, pysyy käytettävän laitteiston hinta myös kohtuul-5 lisena.

Biospesifisissä määrityksissä voidaan keksinnön mukaista menetelmää edelleen käyttää hyväksi rajaamaan viritettävän alueen kokoa, ja näin vähentämään määritystä haittaavan taustafluoresenssin määrää. Näin voidaan parantaa mittauk-10 sen tarkkuutta ja herkkyyttä.

Mikroskopiassa keksinnön mukainen menetelmä laajentaa edelleen pitkäikäisten fluoresoivien ja fosforoivien väriaineiden käyttömahdollisuuksia. Pyyhkäisymikroskoopin yhteydessä saavutetaan 3-ulotteinen erottelukyky ilman 15 monimutkaista laitteistoa, sekä parannetaan mikroskoopin kuvantavia ominaisuuksia suorittamalla kuvaus nykyisen mikroskooppioptiikan parhaalla spektrialueella. Lisäksi vähentyvät valosta näytteelle aiheutuneet vahingot, kun UV-valoa ei tarvita.

20 Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää myös muissa aikaerotteisissa mittausjärjestelmissä, jossa epälineaarisen kaksoisfotoniprosessin eduista on hyötyä.

Keksinnön kuvaama menetelmä voidaan laajentaa kolmi- tai monifotoni viritteiseksi. Tällöin tarvittava huipputeho 25 kasvaa, mutta edelleenkin aikaerotteisen mittauksen herkkyys mahdollistaa kohtuullisten tehojen käytön. Tässä patenttihakemuksessa käytetty termi "kaksoisfotoniviritys" tarkoittaakin yleisesti monifotoniviritystä, joista kaksois f otoniviritys on käytetyin ja helpoin toteuttaa.

30 Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää myös muiden pitkäikäisten väriaineiden kuin lantanidikelaatien kanssa. Tällaisia aineita voivat olla esim. fosforoivat metallopor- » fyriinit tai fluoresoivat kryptaatit.

96452 12

Koska keksinnön mukaisessa menetelmässä vaadittavat tehot pitkillä pulssin kestoilla ovat matalia, voidaan myös ajatella muiden valolähteiden kuin lasereiden käyttöä.

Muita valolähteitä voisivat olla esimerkiksi korkeatehoiset 5 Xenon purkauslamput. Xenon purkauslampulla voidaan viritykseen käyttää yhden aallonpituuden sijasta määrättyä spekt-rikaistaa siten, että sitä vastaa väriaineen kaksoisfo-tonivirityksen absorptiokaista.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä laserlaitteisto voi olla 10 esimerkiksi ilmajäähdytteinen jatkuvatoiminen krypton-ioni laser, jonka 647 nm krypton juovalla voidaan virittää 323.5 nm tila kaksoisfotonivirityksellä. Nykyisin on saatavissa myös puolijohdelasereita 600 nm - 1300 nm alueelle, joiden teho riittää pitkäikäisten väriaineiden kaksoisfotoniviri-15 tykseen.

Biospesifisen määrityksen yhteydessä keksinnön mukaista menetelmää voidaan hyödyntää esimerkiksi kuviossa 4 esitetyn fluorometrin kaltaisessa laitteistossa. Valolähde LI ja valolähde L2 yhdistetään dikroistisen peilin (säteenjaka-20 jän) Ml avulla sädekimpuksi. On edullista, että valolähteet LI ja L2 ovat pistemäisiä, jolloin niiden huipputeho voidaan pitää matalana. L2 ja Ml voidaan vaihtoehtoisesti • jättää pois, kun kaksoisfotoniviritys on suoritettavissa yhdellä valolähteellä. Sädekimppua katkotaan optisella 25 katkojalla Cl aikaerotteisen mittauksen vaativan pulssin aikaansaamiseksi. Pulssivalolähdettä käytettäessä Cl voidaan jättää pois. Pulssimuotoinen sädekimppu kohdennetaan linssin 01 avulla näytteeseen N. Pitkäikäinen emissiovalo palaa linssin 01 kautta ja erotetaan dikroistisella peilil-30 lä M2 ja emissiosuodattimella F1 viritysvalon aallonpituudesta. Aikaerotteinen ilmaisu suoritetaan ilmaisimella II, jonka ilmaisua viivästetään, kunnes taustafluoresenssin arvo on laskenut riittävästi. Ilmaisin II voi olla esimerkiksi valomonistinputki tai jokin muu valoilmaisin. Tämä » 35 laitteen kuvaus on ainoastaan esimerkin luonteinen.

96452 13

Mikroskopiassa keksinnön kuvaamaa menetelmää voidaan hyödyntää periaatteeltaan kuvion 4 mukaisella laitteistolla, jossa linssi 01 korvataan mikroskopiaan soveltuvalla objektiivilla, ja näyte N vastaavasti mikroskooppisella näyt-5 teellä. Valolähteiden LI ja L2 on myös tällöin oltava pistemäisiä. Kuvan muodostamiseksi jokaisen yksittäisen pistemittauksen jälkeen on joko siirrettävä näytettä AI, tai poikkeutettava sädettä. Pyyhkäisymikroskoopin rakenne on esitetty esimerkiksi kirjassa Confocal Microscopy, T.

10 Wilson (ed). Academic Press, London, 1990, (1-64). Kuvanmuodostus suoritetaan mittaustuloksia rekisteröivällä laitteella, joka voi olla esimerkiksi tietokone.

Erinomainen tapa hyödyntää puolijohdetekniikkaa ja tämän keksinnön mukaista menetelmää on esitetty kuviossa 5.

15 Pistemäinen valolähde on korvattu juovan muotoisella valolähteellä. Tämä valolähde voi olla esimerkiksi puolijohde-laserrivi tai -matriisi. Valolähteenä voidaan käyttää myös muita valolähteitä, jotka kohdistetaan esim. sylinterilins-sin avulla kapeaan rakoon. Edullisinta on kuitenkin käyttää 20 puolijohdelaseria, koska tällöin voidaan tarvittavaa tehoa kasvattaa yksinkertaisesti lisäämällä valoa tuottavien elementtien määrää. Kuvion 5 mukaisessa järjestelmässä juovamaista pulssitettua valolähdettä LI poikkeutetaan peilillä Ml ja kohdistetaan objektiivilla 01 juovamaiseksi 25 virityskaistaksi näytteeseen Nl. Matriisivalonlähdettä käytettäessä poikkeutusta ei tarvitse suorittaa. Emissiova-lo erotetaan dikroistisella peilillä M2 viritysvalosta ja kohdistetaan emissiosuodattimen F1 ja suljinelementin SI kautta CCD-kennon pinnalle. Virittävää juovaa poikkeutetta-30 essa muuttuu vastaavasti emission tallentumispaikka CCD-kennon pinnalla. CCD-kennoon integroidaan koko kuva-alue, joka syntyy, kun virittävää juovaa poikkeutetaan kuva-alueen yli. Aikaerotteisuuden aikaansaamiseksi CCD-kennolle tulevaa valoa katkotaan suljinelementillä SI. SI toimii 35 esimerkiksi mekaanisesti tai sähköisesti. Kuvattu laitteisto vastaa osin kirjallisuudessa (Brakenhoff, Visscher. J.

96452 14

Microsc. 1992, 165:139-146) esitettyä bilateraalista konfo-kaalista mikroskooppia. Bilateraalisessa konfokaalimikros-koopissa käytetään neulanreikien sijasta kapeaa rakoa, ja pyyhkäisy suoritetaan bilateraalisesti samalla peilillä 5 siten, että peilin etupuoli poikkeuttaa virittävän kapean raon kuvaa näytteessä, ja peilin takapuoli poikkeuttaa ilmaisun raon kuvaa CCD-kennolla. Kuvion 5 järjestelmässä ei epälineaarisen viritysprosessin ansiosta tarvitse bilateraalista, saman peilin molempia puolia käyttävää pyyh-10 käisyä tehdä, jolloin laitteisto yksinkertaistuu, ja suurempi osa emissiovalosta saadaan talteen.

Mikroskopian malliesimerkit ovat esimerkin luonteisia. Keksinnön mukaista menetelmää voi hyödyntää myös muissa mikroskopiaan soveltuvissa järjestelmissä.

15 Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

Claims (6)

96452 15

1. Menetelmä fluoresoivien ja fosforoivien väriaineiden virittämiseksi, jolloin väriaineesta saatava fluoresenssi-tai fosforesenssiemissio mitataan aikaerotteisella mittauksella, tunnettu siitä, että viritys suoritetaan matalate- 5 hoisella valolähteellä kaksoisfotonivirityksenä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että käytetyn väriaineen emission keskimääräinen elinikä on pitkä, vähintään 0.1 μβ.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä 10 tunnettu siitä, että virityspulssin kesto on lyhyempi tai enintään samaa luokkaa kuin kyseessä olevan väriaineen emission puoliintumisaika ja että virityspulssien toisto-taajuus on matalampi kuin 107 s'1.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä ’* 15 tunnettu siitä, että viritysvalo on lähtöisin yhdestä tai useasta valolähteestä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että väriaineen virittämiseksi valonlähdettä pulssitetaan esimerkiksi mekaanisesti tai elektronisesti 20 ja että viritysvalo kohdistetaan linssillä, objektiivilla tai muulla optisella menetelmällä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että valolähde on puolijohdelaser. 4 j 96452 16