DE2709399C3

DE2709399C3 - Einrichtung zum Messen von Zelleigenschaften

Info

Publication number: DE2709399C3
Application number: DE2709399A
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1977-03-04
Publication date: 1980-07-24
Also published as: DE2709399A1; CH626725A5; FR2382691B1; GB1574566A; FR2382691A1; US4225229A; DE2709399B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs I.

Biologische Zellen, /.. B. aus dem menschlichen Körper entnommene Zellen, können dadurch untersucht werden, daß sie mit verschiedenen chemischen Stoffen behandelt und Lichterscheinungen beobachtet und gemessen werden, die nach dieser Behandlung und Bestrahlung der Zellen mit Licht auftreten. z.B. die Fluoreszenz der Zellen. Z. B. werden Zellen mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt, von denen der eine für die DNS und der andere für das Protein der Zelle charakteristische Fluoreszenzerscheinungen verursacht.

Dabei werden Farbstoffe verwendet, die bei der Fluoreszenzanregung Maxima in verschiedenen Wellenlängen zeigen. Unter Verwendung der bisher üblichen Geräte kommt es bei simultanen Messungen dadurch zu Fehlern, daß die Fluoreszenzliehtspektren der verwendeten Farbstoffe verhältnismäßig breit sind und einander überlappen. Licht des einen Farbstoffes

erreicht bei diesen Geräten immer auch zu einem gewissen Teil den für den anderen Farbstoff bestimmten Photomultiplier, Eine Vorrichtung für diesen Zweck beschreibt M. Stöhr, »Double Beam Application in Flow Technics and Resent Results«, Pulse-Cytophotometry,

ίο 1976, p. 39—45. Die Vorrichtung ist mit einem Argon-Ionen-Laser und einem Helium-Cadmium-Laser ausgestattet, die bei 488 nm und 441 nm emittieren. Zusätzlich werden noch besondere Spiegel für 325 nm verwendet. Stöhr erwähnt noch, daß Schwierigkeiten vermieden werden können, falls die Punkte des Zusammenwirkens zwischen einem Teilchen und den erleuchtenden Laserstrahlen räumlich getrennt werden. Irgendeine Lösung dieses Problems ist jedoch in dem zitierten Aufsatz nicht dargestellt

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung mit zwei Meßstelien zu schaffen, bei denen

die Durchfluß- und Beobachtungsbedingungen im wesentlichen gleich sind.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die

Meßstellen an einem Knie des Durchflußkanals ausgebildet sind, wobei der Zufluß- und der Abflußquerschnilt je eine der beiden Meßstellen bilden, die durch die vom Knie eingeschlossene Ecke getrennt sind. Vorzugsweise ist die der eingeschlossenen Ecke

JO gegenüberliegende Außenwand des Knies als Beobachtungsfenster ausgebildet. Die Erfindung sieht ferner vor, daß das Beobachtungsfenster und die Durchtrittsflächen der Meßstellen im wesentlichen rechtwinklig zur Winkelhalbierenden des Kniewinkels sich erstrecken.

-<5 Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung zeigen die beiden Meßstelien praktisch gleiche Durchflußbedingungen. Sie sind zwar räumlich getrennt, trotzdem so eng benachbart, daß die für die Edeuchtiing erforderlichen zwei getrennten Lichtquellen keine teuren Laser zu sein brauchen. Vielmehr können nach der Erfindung die Lichtquellen zwei nebeneinander liegende, in der Durchlässigkeit verschiedene Filter sein, die zwischen einer primären Lichtquelle und der Meßstelle angeordnet sind. Unter Verwendung einer üblichen, dichromati- sehen Teilerplatte wird das Licht von der primären Lichtquelle durch die beiden Filter entsprechend dem »Köhlerschen Beleuchtungsprin/.ip« nach den beiden Meßstellen gesandt, von denen die eine das Licht des einen Filters und die andere das Licht des zweiten

vt Filters empfängt. Hinter der Teilerplatte sind unter Verwendung einer zweiten Teilerplatte zwei Photomultipiier angeordnet, die über halbseitige Blenden in entsprechender Aufteilung die Fluoreszenz von jeweils einer der Meßstellen aufnehmen.

Die Gesamtanordnung ist demnach wesentlich einfacher und billiger als die bisher bekannten Einrichtungen. Trotzdem ist mit der neuen Einrichtung eine bezüglich der Anregungslichtwellenlängen einwandfrei getrennte Anregung der Zellen beim Durch-

M) tritt durch die beiden Meßstellen möglich, ebenso eine bezüglich der Fluoreszenzlichtwellenlängen einwandfrei getrennte Messung dieser Zellen. Besondere Justierungsarbeiten, die eine bisher mögliche Überlappung weitestgehend verhindern sollten, sind nicht

f>5 erforderlich. Die Zellen können den Meßstellen mit einem Hüllstrom zugeführt werden. Damit ergibt sich eine Vereinfachung gegenüber mit Querstrom arbeitenden Durchflußkammern. Die beiden Meßstellen liegen

symmetrisch zueinander und bilden je einen Abschnitt der einwandfrei festlegbaren Fokusebene des Objektivs, Weiter ist es möglich, ein Objektiv mit großer Apertur vorzusehen. Durch die Hüllstromanordnung und entsprechende Einstellung der Strömungsbedingungen 190t sich erreichen, daß die Zellen praktisch einzeln durch die beiden Meßstellen hindurch treten.

Die Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen beispielsweise erläutert Es zeigt

Fig. 1 vereinfacht eineerfindungsgemäße Durchflußkammerund

Fig,2 eine erfindungsgemäße Einrichtung, ebenfalls in vereinfachter Darstellung.

Die Einrichtung weist eine Durchflußkammer 10 auf, in der ein Durchflußkanal 12 ausgebildet ist, der knieförmig um eine innere Ecke 16 herumführt. Der Scheitel des Kniewinkels ist abgeschnitten und durch ein Deckglas 14 ersetzt, das sich im wesentlichen rechtwinklig zur Mittelhalbierenden der Ecke 16 erstreckt.

Parallel zur Fläche des ebenen Deckglases 14 liegt dar über ein Objektiv 24 zu beobachtende Durchfrußquerschnitt, der durch die mit A-B gekennzeichnete gestrichelte Linie markiert ist. Dieser Querschnitt liegt einerseits im Zufluß- andererseits im Abflußschenkel des Kanals 12, wobei die beiden Teile durch die Kante 18 der Ecke 16 getrennt sind. Dadurch ergeben sich die beiden voneinander getrennten Meßstellen 20 und 22, durch die die zu beobachtenden Teilchen oder Zellen unter im wesentlichen gleichen Bedingungen hindurchgehen.

D«e Durchmesser im Bereich der Meßstellen 20, 22 richten sich nach den zu untersuchenden Partikeln. Je nach deren Größe liegen sie in einem Bereich zwischen 0,1 und 0,5 mm. Für Säugetierzellen sind Durchmesser von 0,2 mm zweckmäßig.

Jede der beiden Meßstellen kann geringfügige Unterschiede in der Beleuchtungsintensität aufweisen. Um darin begründete Meßfehler zu vermeiden, wird eine Hüllstromanordnung verwendet, die dazu führt, daß alle Zellen eine ganz bestimmte Stelle der Fokusebene — Meßstelle — passieren, wodurch alle Zellen derselben Lichtenergie ausgesetzt werden. Eine Zellsuspension wird von einem hier durch den Pfeil 28 markierten Vorrat in einen Zulcilungskanal 26 eingespeist, der im Zuflußschenkel 12 mündet. In den Zuflußschenkel 12 wird außerdem von einer durch den Pfeil 30 markierten Zuführungseinrichtung ein Hüllstrom in den Zdflußschenkel 12 eingeführt. Der Hüllstrom kann aus dem gleichen Medium wie die Flüssigkeit bestehen, in welchen die zu beobachtenden Zellen suspendiert sind.

Der Abflußschenke! des Kanals 12 führt, bei 32 in einen Abflußbehalter, An den Abflußschenkel kann aber auch bei 32 ein Sortiersystem für die Zellen angeschlossen werden, wobei eine Sortierung durch die Ergebnisse der Messung an den Meßstellen 20,22 gesteuert werden kann.

Die einwandfreie Trennung der Meßstellen 20, 22 durch die Kante 18 der Ecke 16 gestattet ein besonders einfaches Beleuchtungssystem. Eine primäre Lichtquelle 40 ist mit einem Kollektorsystem 42 versehen, das den Strahlengang des von der Quelle 40 ausgesandten Lichtbündels parallelisiert. Mit der Linse 44 wird die Lichtquelle in die »innere Pupille« des Mikroskopobjektivs abgebildet, was der »Köhlerischen Beleuchtung« der Meßstelle entspricht. Im Strahlengang sind zwei Filter 46, 48 nebeneinander derart angeordnet, daß das Lichtbündel der primären Lichtquelle 40 in zwei verschiedene, parallel nebeneinander liegende Lichtbündel aufgeteilt wird. Entsprechend den Filtereigenschäften entstehen dadurch zwei .-.rschiedene, im wesentlichen monochromatische Lichtbürdel I und II, so daß die Filter 46, 48 als sekundäre Lichtquellen angesehen werden können. Eine dichromatische Teilerplatte 50 ist unter 45° zur optischen Achse des Objektivs 24 angeordnet. Die optische Achse des Objektivs 24 stimmt mit der Winkelhalbierenden der Ecke 16 überein und steht damit senkrecht zur Fläche der Meßstellen 20, 22. Mit Hilfe der Teilerplatte wird durch das Bündel I, das durch das Filter 46 hindurchgegangen ist, die

jo Meßstelle 20 und durch das Bündel II, das durch die Filterplatte 48 hindurchgegangen ist, die Meßstelle 22 beleuchtet.

Mit Hilfe einer zweiten Teilerplatte 54, die ebenfalls auf der optischen Achse des Objektivs 24 unter einem

r> Winkel von 45° hinter der Teilerplatle 50 angeordnet ist, werden die Fluoreszenzerscheinungen an den Meßstellen 20,22 mittels der Photoelektronenvervielfacher 60 und 62 aufgenommen. Vor jedem Multipli-pr ist eine halbseitig geschlossene Blende 56 derart in der Zwischenbildebene des Auflichtmikroskops angeordnet, daß iias Licht von der Meßstelle 20 durch die Blende 56 den Photoelektronenvervielfacher 60 erreicht, während dieser gegen Licht von der Meßstelle 22 abgeschirmt ist. Umgekehrt geht Licht von der Meßstelle 22 durch die Teilerplatte 54 und die Blende 58 hindurch in den Photoelektronenvervielfacher 62, während dieser durch die halbseitige Schließung der Blende 58 gegen Licht von der Meßstelle 20 abgeschirmt ist.

Die Anordnung gestattet, mit einer verhältnismäßig

w großen inneren Pupille 52 und entsprechend großer Apertur des Objektivs 24 zu arbeiten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Einrichtung zum Messen von Zellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind und mit der Flüssigkeit durch Meßstellen hindurchfüeßen, die in einem Durchflußkanal einer Durchflußkammer ausgebildet und durch Fenster in der Wandung des Kanals beobachtbar sind, mittels Fluoreszenzanregung durch zwei in der Wellenlänge verschiedene Lichtquellen, von denen je eine Lichtquelle einer Meßstelle zugeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßstellen (20, 22) an einem Knie des Durchflußkanals (12) ausgebildet sind, wobei der Zufluß- und der Abflußquerschnitt je eine dar beiden Meßstellen bilden, die durch die vom Knie eingeschlossene Ecke (16,18) getrennt sind.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Beobachtungsfenster (14) die der eingeschlossenen Ecke (16, 18) gegenüberliegende Außenwand4*s Knies bildet.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Beobachtungsfenster (14) und die Fläche der Meßstellen (20, 22) im wesentlichen rechtwinklig zur Winkelhalbierenden des Kniewinkels liegen.

4. Einrichtung nach einem dar vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Hüllstromzuführung (26,28,30).

5. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquellen zwei nebeneinander liegende, in der Durchlässigkeit verschiedene Dtcr (46, 48) umfassen, die zwischen einer primären Lichtquelle (40) und den Meßstellen (20,22) angeordn-. sind.

6. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Meßstelle (20, 22) je ein Phoioclektronenvcrvielfacher (60,62) zugeordnet ist.

7. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (40, 46,48) und die Beobachtungseinrichtung (60, 62) unter Verwendung von Teilerplatten (50, 54) auf derselben Seite des Beobachtungsfensters (14) liegen.

8. Einrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor jedem Photocleklronenvervielfacher eine halbseitig geschlossene Blende (56,58) angeordnet ist.