JP2593021B2 - ウシ胚の性の識別方法 - Google Patents
ウシ胚の性の識別方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシ胚の性の識別方
法、及びかかる識別方法に用いられるプライマーＤＮＡ
に関する。
法、及びかかる識別方法に用いられるプライマーＤＮＡ
に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年のバイオテクノロジーの発展によ
り、畜産業において人工授精が通常普通に行なわれるに
至っている。特に、ウシにおいては、凍結***における
人工授精法がすでに確立している。ただし、かかるウシ
の人工授精の分野においても、現在なお簡便かつ確実な
試験管段階における雌雄の識別は産業上重要な技術であ
るにもかかわらず確立されていない。
り、畜産業において人工授精が通常普通に行なわれるに
至っている。特に、ウシにおいては、凍結***における
人工授精法がすでに確立している。ただし、かかるウシ
の人工授精の分野においても、現在なお簡便かつ確実な
試験管段階における雌雄の識別は産業上重要な技術であ
るにもかかわらず確立されていない。
【０００３】現在までに確立しているウシの人工授精の
試験管段階における雌雄の識別法としては、以下に掲げ
る方法がある。 １）雄性***の分離、同定 ウシを含めほ乳類においては雌が同型接合体、雄が異型
接合体であるため、卵子は遺伝的に１種類で、***に遺
伝的な雌雄の別がある。すなわち、雄性***と融合した
卵子は雄胚に、雌性***と融合した卵子は雌胚になる。
そこで、雄性***と雌性***との分離が可能となれば、
雌雄の産み分けができることになる。
試験管段階における雌雄の識別法としては、以下に掲げ
る方法がある。 １）雄性***の分離、同定 ウシを含めほ乳類においては雌が同型接合体、雄が異型
接合体であるため、卵子は遺伝的に１種類で、***に遺
伝的な雌雄の別がある。すなわち、雄性***と融合した
卵子は雄胚に、雌性***と融合した卵子は雌胚になる。
そこで、雄性***と雌性***との分離が可能となれば、
雌雄の産み分けができることになる。
【０００４】（１）重力を利用した沈降法あるいは密度
勾配遠心法による分離法 性染色体のうちＸ染色体はゲノムのほぼ５％、Ｙ染色体
はほぼ３％を占めるため、そのわずかな差を利用して、
軽いのは雄性***、重いのは雌性***とする。しかしな
がら、現実的にはＸとＹとの差が小さく、もともと***
の大きさにばらつきがあり、また、成熟度により***の
比重が異なるため、確実に分離することは困難であっ
た。
勾配遠心法による分離法 性染色体のうちＸ染色体はゲノムのほぼ５％、Ｙ染色体
はほぼ３％を占めるため、そのわずかな差を利用して、
軽いのは雄性***、重いのは雌性***とする。しかしな
がら、現実的にはＸとＹとの差が小さく、もともと***
の大きさにばらつきがあり、また、成熟度により***の
比重が異なるため、確実に分離することは困難であっ
た。
【０００５】（２）電気泳動による分離 一般に細胞膜の価電は糖蛋白に結合しているシアル酸の
量に依存する。本法は雌性***と雄性***の表面価電に
差があるとの前提にたつ。しかし、***形成の過程を見
るに、減数***の途時セルトリー（Ｓｅｒｔｏｌｉ）細
胞に包まれた４個の精細胞間には細胞間架橋があり、４
個の精細胞から成る１個の融合細胞（Ｓｙｎｃｙｔｉｕ
ｍ）といえる。したがって、表面価電の差は期待し難く
原理的に困難である。
量に依存する。本法は雌性***と雄性***の表面価電に
差があるとの前提にたつ。しかし、***形成の過程を見
るに、減数***の途時セルトリー（Ｓｅｒｔｏｌｉ）細
胞に包まれた４個の精細胞間には細胞間架橋があり、４
個の精細胞から成る１個の融合細胞（Ｓｙｎｃｙｔｉｕ
ｍ）といえる。したがって、表面価電の差は期待し難く
原理的に困難である。
【０００６】（３）Ｆボデイによる識別 例えば、ヒトとゴリラでは***をキナクリン蛍光色素で
染めると、Ｆボデイといい、Ｙ染色体が特異的に染ま
り、雄性***と雌性***とが識別できるとされてきた。
しかし、種によって染まらないことや、染色されるもの
とされないものとの比が５０：５０にならないこと、理
論的にＹ特異的といえないことなどから、方法自体が疑
問視されている。
染めると、Ｆボデイといい、Ｙ染色体が特異的に染ま
り、雄性***と雌性***とが識別できるとされてきた。
しかし、種によって染まらないことや、染色されるもの
とされないものとの比が５０：５０にならないこと、理
論的にＹ特異的といえないことなどから、方法自体が疑
問視されている。
【０００７】（４）フローサイトメーターを用いた***
選別 Ｘ染色体はＹ染色体より少し大きいので、蛍光染色する
と雌性***のほうが蛍光が少し強くなる。この蛍光の強
さを利用して、雌性と雄性の***を分離することができ
る。この方法で分離した***を用いて受精させれば、雌
性胚と雄性胚とを別個に作製することができる。
選別 Ｘ染色体はＹ染色体より少し大きいので、蛍光染色する
と雌性***のほうが蛍光が少し強くなる。この蛍光の強
さを利用して、雌性と雄性の***を分離することができ
る。この方法で分離した***を用いて受精させれば、雌
性胚と雄性胚とを別個に作製することができる。
【０００８】この方法の欠点は、***を染色し、レーザ
ー光をあてるので、***の変性の可能性があること、精
子の前処理に手間を要すること、顕微受精をする必要が
あること、及び高価な機器を要することである。よっ
て、当該方法は簡便な方法とはいえず、実用化されるに
は至っていない。 ２）ＨＹ抗原に対する抗体（ＨＹ抗体）を利用する方法 純系動物の雄の皮膚を雌に移植すると拒絶され、剥離し
てしまう。逆に雌から雄への移植は受容される。これは
Ｙ染色体に存在する組織適合抗原（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐ
ａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ）に起因すると考
えられ、その因子はＨＹ抗原と名づけられた。本来、組
織の拒絶反応は細胞性免疫の司るところである。しかし
ながら、雌による雄の組織拒絶反応時、あるいは雄性細
胞の感作により血液中には抗体が産生されることが判明
したことから同時に体液性免疫も働いていることにな
る。
ー光をあてるので、***の変性の可能性があること、精
子の前処理に手間を要すること、顕微受精をする必要が
あること、及び高価な機器を要することである。よっ
て、当該方法は簡便な方法とはいえず、実用化されるに
は至っていない。 ２）ＨＹ抗原に対する抗体（ＨＹ抗体）を利用する方法 純系動物の雄の皮膚を雌に移植すると拒絶され、剥離し
てしまう。逆に雌から雄への移植は受容される。これは
Ｙ染色体に存在する組織適合抗原（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐ
ａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ）に起因すると考
えられ、その因子はＨＹ抗原と名づけられた。本来、組
織の拒絶反応は細胞性免疫の司るところである。しかし
ながら、雌による雄の組織拒絶反応時、あるいは雄性細
胞の感作により血液中には抗体が産生されることが判明
したことから同時に体液性免疫も働いていることにな
る。
【０００９】マウスでは８細胞期にはすでにＨＹ抗原が
発現されているといわれ、マウス由来のＨＹ抗体を用
い、胚の雌雄判別が出来たとの報告がある。また、ラッ
ト由来のＨＹ抗体で胚を処理することにより、ウシ胚の
形態変化がおこり、雌雄の判別がある程度可能ともいわ
れている。ＨＹ抗原は種を超えて生物に共通と考えられ
るので、マウスやラット由来のＨＹ抗体でもウシに利用
できるし、また、胚発生の早期に発現されるので、胚の
雌雄識別には都合がよい。さらに、胚の−部の細胞を採
取する必要がないことも利点としてあげられている。し
かし、ＨＹ抗原は主要（ｍａｊｏｒ）組織適合抗原でな
く、非主要（ｍｉｎｏｒ）抗原であるため、抗原性が弱
く、抗体の誘導が困難であったり、動物の系統によって
は誘導が不能であったり、誘導された抗体の活性が微弱
であるなど、多くの問題がある。そして、実際の胚識別
にあたっては、反応のプラス、マイナスが判然としない
ことがある等の欠点を有するため、確実な雌雄識別方法
として実用には至っていない。 ３）細胞遺伝学的方法 （１）性クロマチンを利用する方法 哺乳類の雌では２本あるＸ染色体のうち１本を不活化す
ることにより、雄と同じ遺伝子量とする補償機構が働
く。この不活化されたＸは性クロマチンとして細胞核に
観察される。Ｘの不活化は発生初期におこるので、胚盤
胞から微小手術で栄養外胚葉細胞を採取し、性クロマチ
ンの有無を調べれば、胚の性判別ができるはずである。
しかしながら、マウスやウサギではある程度性判別が可
能であるが、他の家畜では細胞質の顆粒が妨げとなっ
て、性クロマチンの観察が困難で、実用化されるには至
っていない。
発現されているといわれ、マウス由来のＨＹ抗体を用
い、胚の雌雄判別が出来たとの報告がある。また、ラッ
ト由来のＨＹ抗体で胚を処理することにより、ウシ胚の
形態変化がおこり、雌雄の判別がある程度可能ともいわ
れている。ＨＹ抗原は種を超えて生物に共通と考えられ
るので、マウスやラット由来のＨＹ抗体でもウシに利用
できるし、また、胚発生の早期に発現されるので、胚の
雌雄識別には都合がよい。さらに、胚の−部の細胞を採
取する必要がないことも利点としてあげられている。し
かし、ＨＹ抗原は主要（ｍａｊｏｒ）組織適合抗原でな
く、非主要（ｍｉｎｏｒ）抗原であるため、抗原性が弱
く、抗体の誘導が困難であったり、動物の系統によって
は誘導が不能であったり、誘導された抗体の活性が微弱
であるなど、多くの問題がある。そして、実際の胚識別
にあたっては、反応のプラス、マイナスが判然としない
ことがある等の欠点を有するため、確実な雌雄識別方法
として実用には至っていない。 ３）細胞遺伝学的方法 （１）性クロマチンを利用する方法 哺乳類の雌では２本あるＸ染色体のうち１本を不活化す
ることにより、雄と同じ遺伝子量とする補償機構が働
く。この不活化されたＸは性クロマチンとして細胞核に
観察される。Ｘの不活化は発生初期におこるので、胚盤
胞から微小手術で栄養外胚葉細胞を採取し、性クロマチ
ンの有無を調べれば、胚の性判別ができるはずである。
しかしながら、マウスやウサギではある程度性判別が可
能であるが、他の家畜では細胞質の顆粒が妨げとなっ
て、性クロマチンの観察が困難で、実用化されるには至
っていない。
【００１０】（２）性染色体の同定 上記の性クロマチンの存在で雌胚を同定する代わりに、
直接ＸＸ，ＸＹを観察する方法が確実な雌雄識別法とし
て着目されている。実際には、胚を２分割し、一方を胚
移植に、他方を染色体の観察に利用する方法がとられ
る。幸い、ウシでは６０本の染色体のうち５８本の常染
色体はすべてＶ字型の端部着糸型で、Ｘ染色体は大きな
次中部着糸型、Ｙ染色体も動原体がやや片寄った小さな
次中部着糸型染色体であり、よい細胞標本であれば識別
は容易ある。しかしながら、よい中期染色体像が得られ
る率自体が低く、結局、識別の効率も低くなるという欠
点があり実用的とはいい難い。
直接ＸＸ，ＸＹを観察する方法が確実な雌雄識別法とし
て着目されている。実際には、胚を２分割し、一方を胚
移植に、他方を染色体の観察に利用する方法がとられ
る。幸い、ウシでは６０本の染色体のうち５８本の常染
色体はすべてＶ字型の端部着糸型で、Ｘ染色体は大きな
次中部着糸型、Ｙ染色体も動原体がやや片寄った小さな
次中部着糸型染色体であり、よい細胞標本であれば識別
は容易ある。しかしながら、よい中期染色体像が得られ
る率自体が低く、結局、識別の効率も低くなるという欠
点があり実用的とはいい難い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】上記列挙した方法が本
来的に有する欠点を克服した簡便かつ確実な胚段階での
雌雄識別法として、Ｙ染色体特異的核酸プローブを用い
て検出する方法が、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐ
ＣＲ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３９，ｐ４８７
−４９１，１９８８）の開発・進歩に伴い注目されてい
る。
来的に有する欠点を克服した簡便かつ確実な胚段階での
雌雄識別法として、Ｙ染色体特異的核酸プローブを用い
て検出する方法が、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐ
ＣＲ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３９，ｐ４８７
−４９１，１９８８）の開発・進歩に伴い注目されてい
る。
【００１２】すなわち、微量の鋳型ＤＮＡをもとに、一
部のＤＮＡを数百万倍に増幅することが可能となり、胚
の一部の細胞を採取し、その中に、Ｙ特異的配列が存在
するか否かをＰＣＲを利用して調べることにより、雌雄
の判別をすることが可能であることが示唆される。ここ
で問題となるのは、どのようなＹ特異的配列をどのよう
なプライマーを用いて増幅し、それをどのように検出す
るかである。
部のＤＮＡを数百万倍に増幅することが可能となり、胚
の一部の細胞を採取し、その中に、Ｙ特異的配列が存在
するか否かをＰＣＲを利用して調べることにより、雌雄
の判別をすることが可能であることが示唆される。ここ
で問題となるのは、どのようなＹ特異的配列をどのよう
なプライマーを用いて増幅し、それをどのように検出す
るかである。
【００１３】まず、本発明に用いるプライマーは、次の
条件を満足することが必要である。 （１）偽常染色体上の配列は用いられない。 減数***のときＸとＹ染色体とで組換えを起こす。ＭＩ
Ｃ２遺伝子等が存在する偽常染色体領域（Ｐ．Ｊ．Ｇｏ
ｄｆｅｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
３４，７４１−７４３，１９８６）は、Ｘ・Ｙ両染色体
間で９９％の類似性を示すため、雌雄の区別をつけるこ
とができず、本発明プライマーとして採用するのは不適
である。
条件を満足することが必要である。 （１）偽常染色体上の配列は用いられない。 減数***のときＸとＹ染色体とで組換えを起こす。ＭＩ
Ｃ２遺伝子等が存在する偽常染色体領域（Ｐ．Ｊ．Ｇｏ
ｄｆｅｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２
３４，７４１−７４３，１９８６）は、Ｘ・Ｙ両染色体
間で９９％の類似性を示すため、雌雄の区別をつけるこ
とができず、本発明プライマーとして採用するのは不適
である。
【００１４】（２）Ｙ染色体特異的ＤＮＡでも常に有効
とは限らない。 例えば、Ｚｆｙ遺伝子（Ｄ．Ｃ．Ｐａｇｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ，５１，１０９１−１１０４，１９８
７）のごとく、Ｙ染色体上に１個のみ存在する配列であ
っても、Ｘ染色体上に極めてよく似た配列の遺伝子があ
るものは、かかる進伝子を増幅し、雄であることを証明
しようとしても、ほとんど同じ長さのＤＮＡが増幅さ
れ、雌雄の区別をつけることは困難である。
とは限らない。 例えば、Ｚｆｙ遺伝子（Ｄ．Ｃ．Ｐａｇｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ，５１，１０９１−１１０４，１９８
７）のごとく、Ｙ染色体上に１個のみ存在する配列であ
っても、Ｘ染色体上に極めてよく似た配列の遺伝子があ
るものは、かかる進伝子を増幅し、雄であることを証明
しようとしても、ほとんど同じ長さのＤＮＡが増幅さ
れ、雌雄の区別をつけることは困難である。
【００１５】（３）Ｙ特異的ＤＮＡでも１個だけ存在す
るものは不利である。 例えば、Ｓｒｙ遺伝子（文献Ａ．Ｈ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３４６，２４０−２
４４，１９９０）はＹ染色体上に１個のみ存在し、類似
の配列がＸや常染色体上になければ、上述（２）のよう
な問題はなくなる。しかし、この場合、また上述（２）
の場合も含めて、１ゲノムを構成する約３０億塩基対か
ら、２００〜３００塩基を１ケ所だけ増幅することにな
るので、効率が悪く、かつ、僅かな汚染が失敗を招く故
かかる配列をＰＣＲの対象として雌雄の区別をつけるこ
とは困難である。
るものは不利である。 例えば、Ｓｒｙ遺伝子（文献Ａ．Ｈ．Ｓｉｎｃｌａｉｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３４６，２４０−２
４４，１９９０）はＹ染色体上に１個のみ存在し、類似
の配列がＸや常染色体上になければ、上述（２）のよう
な問題はなくなる。しかし、この場合、また上述（２）
の場合も含めて、１ゲノムを構成する約３０億塩基対か
ら、２００〜３００塩基を１ケ所だけ増幅することにな
るので、効率が悪く、かつ、僅かな汚染が失敗を招く故
かかる配列をＰＣＲの対象として雌雄の区別をつけるこ
とは困難である。
【００１６】（４）Ｙ特異的な繰り返し配列がよい。 単一の配列でなく、Ｙ染色体上に数百、数千、あるいは
それ以上存在する配列が利用できれば、ＰＣＲの原理か
らしても得策である。 （５）内部対照となる雌雄共通のプライマーも必要 Ｙ特異的ＤＮＡを用い、雄を検出すれば、理論的に残り
は雌である。しかし、ＰＣＲという超高感度の方法を利
用すると、実験条件の僅かな差や汚染が、雄に無反応で
あったり、雄でないのに反応したりすることがある。こ
のため、内部対照として雌雄共通のシグナルを与えるプ
ライマーを用い、雄であって雌でない、また雌であって
雄でないことを確実に検証する必要がある。内部対照に
も多数のコピーが存在するＤＮＡが望ましい。
それ以上存在する配列が利用できれば、ＰＣＲの原理か
らしても得策である。 （５）内部対照となる雌雄共通のプライマーも必要 Ｙ特異的ＤＮＡを用い、雄を検出すれば、理論的に残り
は雌である。しかし、ＰＣＲという超高感度の方法を利
用すると、実験条件の僅かな差や汚染が、雄に無反応で
あったり、雄でないのに反応したりすることがある。こ
のため、内部対照として雌雄共通のシグナルを与えるプ
ライマーを用い、雄であって雌でない、また雌であって
雄でないことを確実に検証する必要がある。内部対照に
も多数のコピーが存在するＤＮＡが望ましい。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意検討を行った結果、上記に掲げた条件を満た
すＰＣＲプライマーを見出すことに成功し、このＰＣＲ
プライマーをＰＣＲ法に応用することで、ウシの雌雄の
識別を正確かつ迅速に判別する方法を確立した。
ついて鋭意検討を行った結果、上記に掲げた条件を満た
すＰＣＲプライマーを見出すことに成功し、このＰＣＲ
プライマーをＰＣＲ法に応用することで、ウシの雌雄の
識別を正確かつ迅速に判別する方法を確立した。
【００１８】すなわち、本発明は、雄ウシのゲノムに特
異的にハイブリダイズするＤＮＡプライマー、及びウシ
の胚盤胞の一部を採取し、かかる胚盤胞の細胞より、Ｄ
ＮＡを抽出し、上記のＤＮＡプライマー並びに雌雄双方
のウシのゲノムにハイブリダイズするＤＮＡプライマー
を用い、ＰＣＲ法により、上記ウシの胚盤胞のＤＮＡの
特定部位を増幅させて、これにより得られるＰＣＲ産物
の種類を特定して識別することを特徴とするウシ胚の雌
雄の識別方法を提供するものである。
異的にハイブリダイズするＤＮＡプライマー、及びウシ
の胚盤胞の一部を採取し、かかる胚盤胞の細胞より、Ｄ
ＮＡを抽出し、上記のＤＮＡプライマー並びに雌雄双方
のウシのゲノムにハイブリダイズするＤＮＡプライマー
を用い、ＰＣＲ法により、上記ウシの胚盤胞のＤＮＡの
特定部位を増幅させて、これにより得られるＰＣＲ産物
の種類を特定して識別することを特徴とするウシ胚の雌
雄の識別方法を提供するものである。
【００１９】本発明においては、（１）〜（５）に示し
た特徴を有するプローブの調製をすることが必須であ
る。以下、かかる調製法について説明する。 １）雄特異的ＤＮＡクローンの単離 雌ウシのＤＮＡを常法により分離し、かかるＤＮＡを、
両端のＤＮＡ配列に規則性を有しない断片を調製する。
この断片の長さは概ね１０００塩基前後が好ましい。ま
た、この断片は例えば超音波処理等の常法により上記雌
ウシＤＮＡから調製することができる。
た特徴を有するプローブの調製をすることが必須であ
る。以下、かかる調製法について説明する。 １）雄特異的ＤＮＡクローンの単離 雌ウシのＤＮＡを常法により分離し、かかるＤＮＡを、
両端のＤＮＡ配列に規則性を有しない断片を調製する。
この断片の長さは概ね１０００塩基前後が好ましい。ま
た、この断片は例えば超音波処理等の常法により上記雌
ウシＤＮＡから調製することができる。
【００２０】これとは別に、常法により得た雄ウシＤＮ
ＡをＩＩ型の制限酵素で処理して規則的末端を調製す
る。次に上記の雌ウシ及び雄ウシのＤＮＡ断片を混合し
て、再会合反応を行なう。またかかる混合の事前又は事
後にＤＮＡ断片を一本鎖に常法により変性することが再
会合反応の前提として必要である。２種のＤＮＡの混合
割合は雌のＤＮＡを大過剰にして、具体的には、２０〜
１０００倍、特に好ましくは５０倍程度である。なお、
二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡの変性法としては、例えば
加熱処理による方法やアルカリ処理による方法を挙げる
ことができる。再会合反応は通常公知のハイブリッド条
件下行なうことができるが、ＤＮＡ鎖の再会合を促進す
るフェノール等の薬剤を添加して行なうのが好ましい。
ＡをＩＩ型の制限酵素で処理して規則的末端を調製す
る。次に上記の雌ウシ及び雄ウシのＤＮＡ断片を混合し
て、再会合反応を行なう。またかかる混合の事前又は事
後にＤＮＡ断片を一本鎖に常法により変性することが再
会合反応の前提として必要である。２種のＤＮＡの混合
割合は雌のＤＮＡを大過剰にして、具体的には、２０〜
１０００倍、特に好ましくは５０倍程度である。なお、
二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡの変性法としては、例えば
加熱処理による方法やアルカリ処理による方法を挙げる
ことができる。再会合反応は通常公知のハイブリッド条
件下行なうことができるが、ＤＮＡ鎖の再会合を促進す
るフェノール等の薬剤を添加して行なうのが好ましい。
【００２１】再会合させると、常染色体やＸ染色体由来
の雄ＤＮＡの大部分は雌ＤＮＡと共通なので、大過剰に
ある雌ＤＮＡと相補性を示して再会合する。これらは、
不特定の末端を有する雌ＤＮＡとＩＩ型制限酵素の末端
を有する雄ＤＮＡの会合物故、正しいＩＩ型制限酵素特
有の配列の末端を構成し得ない。一方、雄ＤＮＡのＹ染
色体の特有部位は、雌ＤＮＡ断片中には相補性を示す相
手が存在しないので、もとの鎖が再会合して、末端に用
いたＩＩ型制限酵素特有の配列を有する元来の二本鎖Ｄ
ＮＡに戻る。かかる末端を有する二本鎖ＤＮＡを当該末
端に相補的な制限末端を有するクローニングベクターに
通常公知の方法で組み込むことにより、雄特異的ＤＮＡ
断片のみが選択的にクローニングベクターに組み込まれ
る。上記組み込み工程を図１に示す。
の雄ＤＮＡの大部分は雌ＤＮＡと共通なので、大過剰に
ある雌ＤＮＡと相補性を示して再会合する。これらは、
不特定の末端を有する雌ＤＮＡとＩＩ型制限酵素の末端
を有する雄ＤＮＡの会合物故、正しいＩＩ型制限酵素特
有の配列の末端を構成し得ない。一方、雄ＤＮＡのＹ染
色体の特有部位は、雌ＤＮＡ断片中には相補性を示す相
手が存在しないので、もとの鎖が再会合して、末端に用
いたＩＩ型制限酵素特有の配列を有する元来の二本鎖Ｄ
ＮＡに戻る。かかる末端を有する二本鎖ＤＮＡを当該末
端に相補的な制限末端を有するクローニングベクターに
通常公知の方法で組み込むことにより、雄特異的ＤＮＡ
断片のみが選択的にクローニングベクターに組み込まれ
る。上記組み込み工程を図１に示す。
【００２２】上記組み込み反応を行なったクローニング
ベクターを宿主に導入し、適当なマーカーを用いて、ウ
シ遺伝子の導入があったか否かを確認後、所望の遺伝子
を含むＤＮＡクローンを単離する。ここで用いるマーカ
ーは、用いるクローニングベクターに応じて決定される
が、例えばアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物
質、Ｘ−ｇａｌ等を挙げることができる。所望の遺伝子
を含むＤＮＡクローンの単離は、各コロニーよりプラス
ミドＤＮＡを抽出後、これを公知の方法により放射線で
ラベルして、サザンブロット法によりクローニングする
方法や、クローニングベクターがファージの場合には、
プラークハイブリダイゼーション法を用いることにより
クローニングを行なう方法を採ることができる。このク
ローン化されたＤＮＡの塩基配列は、通常公知の方法、
例えばサンガー法により決定することができる。
ベクターを宿主に導入し、適当なマーカーを用いて、ウ
シ遺伝子の導入があったか否かを確認後、所望の遺伝子
を含むＤＮＡクローンを単離する。ここで用いるマーカ
ーは、用いるクローニングベクターに応じて決定される
が、例えばアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物
質、Ｘ−ｇａｌ等を挙げることができる。所望の遺伝子
を含むＤＮＡクローンの単離は、各コロニーよりプラス
ミドＤＮＡを抽出後、これを公知の方法により放射線で
ラベルして、サザンブロット法によりクローニングする
方法や、クローニングベクターがファージの場合には、
プラークハイブリダイゼーション法を用いることにより
クローニングを行なう方法を採ることができる。このク
ローン化されたＤＮＡの塩基配列は、通常公知の方法、
例えばサンガー法により決定することができる。
【００２３】さらに、確実な雄特異性を示すクローンを
単離する為に、上記により得られた雄特異的な配列を有
するＤＮＡ断片をプローブとして、ウシの雄のＤＮＡゲ
ノムライブラリーから、さらに雄特異的な配列を単離す
るのが好ましい。このＤＮＡの配列も上記と同様に常法
により決定することができる。 ２）雌雄で異なった会合像を与えるＤＮＡクローンの単
離 上記１）により得られたＤＮＡをプローブとして、ウシ
のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ
り、多数のクローンを得ることが可能である。
単離する為に、上記により得られた雄特異的な配列を有
するＤＮＡ断片をプローブとして、ウシの雄のＤＮＡゲ
ノムライブラリーから、さらに雄特異的な配列を単離す
るのが好ましい。このＤＮＡの配列も上記と同様に常法
により決定することができる。 ２）雌雄で異なった会合像を与えるＤＮＡクローンの単
離 上記１）により得られたＤＮＡをプローブとして、ウシ
のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ
り、多数のクローンを得ることが可能である。
【００２４】そして、これらのクローンには多くの場合
１５〜２０ｋｂの長さのラシＹ染色体のＤＮＡが含まれ
ている。このように長い配列の中にはＹ染色体以外のＸ
染色体や常染色体と会合する配列のＤＮＡが含まれてい
ることがある。かかるＤＮＡを通常公知の方法により単
離、精製後プロープとして使用して、サザンブロットを
行うと、電気泳動像のバンドの数や濃淡に雌雄間で差が
生じる。かかるクローンＤＮＡを利用して雌雄識別用の
ＰＣＲプライマーを得るには２つの方法がある。第１の
方法は制限酵素等を利用してＤＮＡをさらに細分化し、
雄特異的に会合する部分と雌雄共通に会合する部分とを
再クローニングするのである。第２の方法は塩基配列決
定後任意の部分をＰＣＲプライマーとして合成し、その
プライマーが雄特異的あるいは雌雄共通のＰＣＲ産物を
与えるかを検討するのである。 ３）雌雄共通部分に結合するＤＮＡ断片の単離 上記２）で示したように、雌雄で異なった会合像を与え
る配列を有するＤＮＡより雌雄共通の部分を抽出するこ
とができる。或いは直接プライマーを作製し、雌雄共通
のＰＣＲ産物を与えるものを検索してもよい。
１５〜２０ｋｂの長さのラシＹ染色体のＤＮＡが含まれ
ている。このように長い配列の中にはＹ染色体以外のＸ
染色体や常染色体と会合する配列のＤＮＡが含まれてい
ることがある。かかるＤＮＡを通常公知の方法により単
離、精製後プロープとして使用して、サザンブロットを
行うと、電気泳動像のバンドの数や濃淡に雌雄間で差が
生じる。かかるクローンＤＮＡを利用して雌雄識別用の
ＰＣＲプライマーを得るには２つの方法がある。第１の
方法は制限酵素等を利用してＤＮＡをさらに細分化し、
雄特異的に会合する部分と雌雄共通に会合する部分とを
再クローニングするのである。第２の方法は塩基配列決
定後任意の部分をＰＣＲプライマーとして合成し、その
プライマーが雄特異的あるいは雌雄共通のＰＣＲ産物を
与えるかを検討するのである。 ３）雌雄共通部分に結合するＤＮＡ断片の単離 上記２）で示したように、雌雄で異なった会合像を与え
る配列を有するＤＮＡより雌雄共通の部分を抽出するこ
とができる。或いは直接プライマーを作製し、雌雄共通
のＰＣＲ産物を与えるものを検索してもよい。
【００２５】一方、Ｙ染色体上にはＸ染色体や常染色体
と会合するＤＮＡも多数存在するため、１）の雄特異的
ＤＮＡクローンを単離する際、当該雌雄共通に会合する
配列を有するクローンも単離される可能性が高い。かか
るクローンＤＮＡの塩基配列は通常公知の方法で決定で
きるので雌雄共通に結合するプライマーを作製するのに
利用することができる。 ４）ＰＣＲ用プライマーの調製 上記１）及び３）又は２）により得られた、雄特異的な
塩基配列を有するＤＮＡと雌雄に共通な塩基配列を有す
るＤＮＡの夫々の塩基配列の少なくとも一部によりなる
ＤＮＡ鎖、ならびにそれぞれのＤＮＡの相補鎖の少なく
とも一部によりなるＤＮＡ鎖をＰＣＲプライマーとして
用いることができる。当該ＰＣＲプライマーの長さは通
常１０〜４０ｍｅｒ程度、好ましくは１５〜２５ｍｅｒ
程度である。かかるＰＣＲプライマーの調製は、制限酵
素を用いて直接上記１）、２）又は３）より得られたＤ
ＮＡから切り出し、これを１本鎖に分離後精製すること
により実行することも可能であり、直接ＤＮＡ合成装置
を用いて合成することもできる。調製の確実・容易を期
する必要がある点を考慮すれば、ＤＮＡ合成装置を用い
て直接調製するのが好ましい。
と会合するＤＮＡも多数存在するため、１）の雄特異的
ＤＮＡクローンを単離する際、当該雌雄共通に会合する
配列を有するクローンも単離される可能性が高い。かか
るクローンＤＮＡの塩基配列は通常公知の方法で決定で
きるので雌雄共通に結合するプライマーを作製するのに
利用することができる。 ４）ＰＣＲ用プライマーの調製 上記１）及び３）又は２）により得られた、雄特異的な
塩基配列を有するＤＮＡと雌雄に共通な塩基配列を有す
るＤＮＡの夫々の塩基配列の少なくとも一部によりなる
ＤＮＡ鎖、ならびにそれぞれのＤＮＡの相補鎖の少なく
とも一部によりなるＤＮＡ鎖をＰＣＲプライマーとして
用いることができる。当該ＰＣＲプライマーの長さは通
常１０〜４０ｍｅｒ程度、好ましくは１５〜２５ｍｅｒ
程度である。かかるＰＣＲプライマーの調製は、制限酵
素を用いて直接上記１）、２）又は３）より得られたＤ
ＮＡから切り出し、これを１本鎖に分離後精製すること
により実行することも可能であり、直接ＤＮＡ合成装置
を用いて合成することもできる。調製の確実・容易を期
する必要がある点を考慮すれば、ＤＮＡ合成装置を用い
て直接調製するのが好ましい。
【００２６】次に、ウシの雌雄を決定方法について説明
する。雌雄決定の対象は、ある程度胚が成長し胚から細
胞を分離しても胚に決定的なダメージを与えず、かつ人
工受精法において未だ試験管段階であるものが好まし
い。かかる意味において、栄養外胚葉と内部細胞塊が分
化した胚である胚盤胞を用いるのが好ましい。
する。雌雄決定の対象は、ある程度胚が成長し胚から細
胞を分離しても胚に決定的なダメージを与えず、かつ人
工受精法において未だ試験管段階であるものが好まし
い。かかる意味において、栄養外胚葉と内部細胞塊が分
化した胚である胚盤胞を用いるのが好ましい。
【００２７】胚盤胞からの細胞の採取は、胚盤胞を培養
液から胚盤胞が生存するに適切な溶液、例えばＤｕｌｂ
ｅｃｃｏの改変リン酸緩衝食塩液に入れ、かかる胚盤胞
から通常公知の方法を用いて細胞を切り出すことによっ
て行なわれる。かかる切り出しは、胚盤胞が容器の内壁
に接着後行なうのが安全を期するうえにおいて好まし
い。切り出しには微小ナイフを用いることが可能で、切
り出し部位は、切り出し後、胚盤胞にダメージを与える
ことが可能な限り少ない部位、例えば栄養外胚葉から切
り出すのが好ましい。なお、採取する細胞の個数は、１
０個程度で十分である。
液から胚盤胞が生存するに適切な溶液、例えばＤｕｌｂ
ｅｃｃｏの改変リン酸緩衝食塩液に入れ、かかる胚盤胞
から通常公知の方法を用いて細胞を切り出すことによっ
て行なわれる。かかる切り出しは、胚盤胞が容器の内壁
に接着後行なうのが安全を期するうえにおいて好まし
い。切り出しには微小ナイフを用いることが可能で、切
り出し部位は、切り出し後、胚盤胞にダメージを与える
ことが可能な限り少ない部位、例えば栄養外胚葉から切
り出すのが好ましい。なお、採取する細胞の個数は、１
０個程度で十分である。
【００２８】この細胞のＤＮＡを通常公知の方法により
抽出し、かかるＤＮＡを鋳型として前出の雄特異的なら
びに雌雄共通の２対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ
法により、ウシ胚の性別を識別することが可能である。
すなわち、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動にかけ、蛍光染色
し、雄特異的なバンドと雌雄共通のバンドの二本のバン
ドを著明に与える場合には雄胚、雌雄共通の一本のバン
ドを著明に与える場合には雌胚と判別することが可能で
ある。
抽出し、かかるＤＮＡを鋳型として前出の雄特異的なら
びに雌雄共通の２対のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ
法により、ウシ胚の性別を識別することが可能である。
すなわち、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動にかけ、蛍光染色
し、雄特異的なバンドと雌雄共通のバンドの二本のバン
ドを著明に与える場合には雄胚、雌雄共通の一本のバン
ドを著明に与える場合には雌胚と判別することが可能で
ある。
【００２９】なお、上記ＰＣＲ法の実施に際するＰＣＲ
プライマーの選択にあたっては、そのＰＣＲ産物同士
が、雄特異的であるか雌雄共通の配列であるかを識別可
能な程塩基の長さが異なっており、かつそれぞれのＰＣ
Ｒ産物の長さが、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラー
ゼが働き得る長き以内であるように設定することが必要
である。より具体的には、対比するＰＣＲ産物同士の塩
基の長さの差は少なくとも２０程度、好ましくは５０〜
１００程度であり、各々のＰＣＲ産物の長さは１００〜
５００、好ましくは１５０〜３００程度となるようにＰ
ＣＲプライマーを選択するのが好ましい。
プライマーの選択にあたっては、そのＰＣＲ産物同士
が、雄特異的であるか雌雄共通の配列であるかを識別可
能な程塩基の長さが異なっており、かつそれぞれのＰＣ
Ｒ産物の長さが、ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラー
ゼが働き得る長き以内であるように設定することが必要
である。より具体的には、対比するＰＣＲ産物同士の塩
基の長さの差は少なくとも２０程度、好ましくは５０〜
１００程度であり、各々のＰＣＲ産物の長さは１００〜
５００、好ましくは１５０〜３００程度となるようにＰ
ＣＲプライマーを選択するのが好ましい。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、ウシ胚の雌雄をＰＣＲ法
を用いて容易に判別可能なＰＣＲプライマーの提供、及
びかかるＰＣＲプライマーを用いたウシの雌雄の正確か
つ迅速な判別が可能になる。
を用いて容易に判別可能なＰＣＲプライマーの提供、及
びかかるＰＣＲプライマーを用いたウシの雌雄の正確か
つ迅速な判別が可能になる。
【００３１】
【実施例】以下、実施例により本発明について具体的に
説明する。
説明する。
【００３２】〔実施例１〕 （１）雄ウシのＤＮＡに特異的に結合するＤＮＡを有す
るクローンの単離 雌ウシ（ホルスタイン種）の肝臓のＤＮＡをフェノール
法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９）により調製し、その２００μｇのＤＮＡ
を超音波で処理して１０００塩基前後の長さに切断し
た。
るクローンの単離 雌ウシ（ホルスタイン種）の肝臓のＤＮＡをフェノール
法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９）により調製し、その２００μｇのＤＮＡ
を超音波で処理して１０００塩基前後の長さに切断し
た。
【００３３】これとは別に、雄ウシ（ホルスタイン種）
の肝臓のＤＮＡを上記と同様の方法により２０μｇ抽出
し、かかる雄ウシＤＮＡを↓ＧＡＴＣを識別して切るＩ
Ｉ型の制限酵素であるＭｂｏＩ（タカラ酒造社製）を至
適条件にて１００ユニットを用いて処理し、雄ウシＤＮ
Ａを完全に分解した。上記雌雄双方由来のＤＮＡ断片を
雌ＤＮＡ断片５０μｇ及び雄ＤＮＡ断片１μｇを蒸留水
２５０μｌ中に入れ、１００℃まで加熱して二本鎖ＤＮ
Ａを一本鎖に変性した。変性後、１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）１２０μｌ、５ＭのＮａＣｌＯ４２５０
μｌ、フェノール８１μｌ、蒸留水を２９９μｌ加え総
量を１ｍｌとして室温で９３時間振盪した。フェノール
抽出後水層をとりエタノールでＤＮＡを沈澱させて、こ
れを２０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した。
この１μｌをとりプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タ
カラ酒造社製）をＧ↓ＧＡＴＣＣを認識して切断するＢ
ａｍＨＩ（タカラ酒造社製）で消化し、５’のリン酸を
除去したもの２００μｇと１６℃下混合し、ライゲーシ
ョンキット（タカラ酒造社製）で２時間処理して、末端
にＧＡＴＣを有する雄特異性ＤＮＡを組み込んだプラス
ミドを調製した。
の肝臓のＤＮＡを上記と同様の方法により２０μｇ抽出
し、かかる雄ウシＤＮＡを↓ＧＡＴＣを識別して切るＩ
Ｉ型の制限酵素であるＭｂｏＩ（タカラ酒造社製）を至
適条件にて１００ユニットを用いて処理し、雄ウシＤＮ
Ａを完全に分解した。上記雌雄双方由来のＤＮＡ断片を
雌ＤＮＡ断片５０μｇ及び雄ＤＮＡ断片１μｇを蒸留水
２５０μｌ中に入れ、１００℃まで加熱して二本鎖ＤＮ
Ａを一本鎖に変性した。変性後、１Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．８）１２０μｌ、５ＭのＮａＣｌＯ４２５０
μｌ、フェノール８１μｌ、蒸留水を２９９μｌ加え総
量を１ｍｌとして室温で９３時間振盪した。フェノール
抽出後水層をとりエタノールでＤＮＡを沈澱させて、こ
れを２０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した。
この１μｌをとりプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タ
カラ酒造社製）をＧ↓ＧＡＴＣＣを認識して切断するＢ
ａｍＨＩ（タカラ酒造社製）で消化し、５’のリン酸を
除去したもの２００μｇと１６℃下混合し、ライゲーシ
ョンキット（タカラ酒造社製）で２時間処理して、末端
にＧＡＴＣを有する雄特異性ＤＮＡを組み込んだプラス
ミドを調製した。
【００３４】上記処理後、反応液をそのままＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５α（東京大学応用微生物研究所より入手）に
通常公知の方法により組み込み、色素Ｘ−ｇａｌを（４
０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（４０μｇ／ｍｌ）及びアン
ピシリンを５０μｇ／ｍｌ含有するＬＢ寒天培地上にま
き、培養後生じたコロニーのうちから白いもの、すなわ
ちＸ−ｇａｌを分解できない組換えプラスミドを有する
コロニー４００個を単離した。各コロニーより通常公知
の方法によりＤＮＡを抽出し、ウシＹ染色体由来ＤＮＡ
を有するか否かを検定した。すなわち各プラスミドＤＮ
Ａをランダムプライマー法により３２Ｐで標識し、別
途、雌雄のウシのＤＮＡをそれぞれ１０μｇ抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩ（タカラ酒造社製）１００ユニットで３７℃下
完全消化後、ゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜にゲル上
のＤＮＡを移し取り、これに上記の標識したプラスミド
を合わせ、各プラスミドが雄ウシＤＮＡと特異的に結合
するか否かをオートラジオグラムにより調べた。
ｉ ＤＨ５α（東京大学応用微生物研究所より入手）に
通常公知の方法により組み込み、色素Ｘ−ｇａｌを（４
０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（４０μｇ／ｍｌ）及びアン
ピシリンを５０μｇ／ｍｌ含有するＬＢ寒天培地上にま
き、培養後生じたコロニーのうちから白いもの、すなわ
ちＸ−ｇａｌを分解できない組換えプラスミドを有する
コロニー４００個を単離した。各コロニーより通常公知
の方法によりＤＮＡを抽出し、ウシＹ染色体由来ＤＮＡ
を有するか否かを検定した。すなわち各プラスミドＤＮ
Ａをランダムプライマー法により３２Ｐで標識し、別
途、雌雄のウシのＤＮＡをそれぞれ１０μｇ抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩ（タカラ酒造社製）１００ユニットで３７℃下
完全消化後、ゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜にゲル上
のＤＮＡを移し取り、これに上記の標識したプラスミド
を合わせ、各プラスミドが雄ウシＤＮＡと特異的に結合
するか否かをオートラジオグラムにより調べた。
【００３５】その結果、図２に示すごとくレーン１の雄
ウシＤＮＡにのみプラスミドＤＮＡが結合するクローン
を得た。なお、レーン２は雌ウシＤＮＡの結果について
示している。当該ＤＮＡの塩基配列はサンガー法により
配列番号１に示す配列を有することが判明した。なお、
この配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡは常法に
より大腸菌に導入され、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．１１
８−ｂｍｓ１は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１２６４８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４８）と
して寄託されている。
ウシＤＮＡにのみプラスミドＤＮＡが結合するクローン
を得た。なお、レーン２は雌ウシＤＮＡの結果について
示している。当該ＤＮＡの塩基配列はサンガー法により
配列番号１に示す配列を有することが判明した。なお、
この配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡは常法に
より大腸菌に導入され、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．１１
８−ｂｍｓ１は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第１２６４８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４８）と
して寄託されている。
【００３６】さらに万全を期するために、上記配列番号
１に示すＤＮＡ断片をプローブとして、雄ウシＤＮＡを
ＭｂｏＩにより部分分解後、通常公知の方法により、Ｅ
ＭＢＬ３ファージベクター（ストラタジーン社製）に組
み込んで得られたＤＮＡライブラリーを用いてプラーク
ハイブリダイゼーション法を行い、約５０万のクローン
よりなるＤＮＡライブラリーより約２５万のクローンよ
り上記プローブに反応する２８個のクローンを得た。そ
のうち１つのクローンを選択して、ＤＮＡを抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩで３７℃下完全分解し、個々のＥｃｏＲＩ断片
につきサザンブロット法により、雄特異的な断片を得
た。このＤＮＡ断片の塩基配列をサンガー法で調べた結
果、配列番号２及び配列番号３に示すことが判明した。
１に示すＤＮＡ断片をプローブとして、雄ウシＤＮＡを
ＭｂｏＩにより部分分解後、通常公知の方法により、Ｅ
ＭＢＬ３ファージベクター（ストラタジーン社製）に組
み込んで得られたＤＮＡライブラリーを用いてプラーク
ハイブリダイゼーション法を行い、約５０万のクローン
よりなるＤＮＡライブラリーより約２５万のクローンよ
り上記プローブに反応する２８個のクローンを得た。そ
のうち１つのクローンを選択して、ＤＮＡを抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩで３７℃下完全分解し、個々のＥｃｏＲＩ断片
につきサザンブロット法により、雄特異的な断片を得
た。このＤＮＡ断片の塩基配列をサンガー法で調べた結
果、配列番号２及び配列番号３に示すことが判明した。
【００３７】かかる配列番号２及び配列番号３に示した
塩基配列を有するＤＮＡを用いて上記と同じくサザンブ
ロット法による解析を行った結果を図３に示す。図３に
おいてレーン１、２は配列番号２に示した塩基配列を有
するＤＮＡを、レーン３、４は配列番号３に示した塩基
配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、レーン
１、３は雄、レーン２、４は雌のＤＮＡと各プローブを
回合させたものである。
塩基配列を有するＤＮＡを用いて上記と同じくサザンブ
ロット法による解析を行った結果を図３に示す。図３に
おいてレーン１、２は配列番号２に示した塩基配列を有
するＤＮＡを、レーン３、４は配列番号３に示した塩基
配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、レーン
１、３は雄、レーン２、４は雌のＤＮＡと各プローブを
回合させたものである。
【００３８】この結果、配列番号２に示す塩基配列を有
するＤＮＡも配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ
も、雄ＤＮＡとのみ会合することが判明した。このファ
ージクローンは２５万のクローンより得られた２８個の
クローンの１つである。すなわち、約１万から１クロー
ンを得たということになる。サザンプロット像の強さか
ら各クローンには１０〜１００のコピー数の存在が考え
られる。一方、ヒトの全ゲノム中に１個存在する遺伝子
をスクリーニングするには通常１００万クローンを要す
る。単純に考えれば、もとのクローンはゲノム中に１０
００〜１００００コピーも存在することになる。したが
って、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示し
た配列をプローブとして用いれば類似のクローンは容易
に得ることができる。また、ＰＣＲでは反応生成物は１
回の反応ごとにほぼ倍増してゆく。１，０００は
２１０、１０，０００は２１３に近く、単一コピーを増
幅するのに比べ、反応を１０〜１３回少なくすることが
できる計算になる。
するＤＮＡも配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ
も、雄ＤＮＡとのみ会合することが判明した。このファ
ージクローンは２５万のクローンより得られた２８個の
クローンの１つである。すなわち、約１万から１クロー
ンを得たということになる。サザンプロット像の強さか
ら各クローンには１０〜１００のコピー数の存在が考え
られる。一方、ヒトの全ゲノム中に１個存在する遺伝子
をスクリーニングするには通常１００万クローンを要す
る。単純に考えれば、もとのクローンはゲノム中に１０
００〜１００００コピーも存在することになる。したが
って、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示し
た配列をプローブとして用いれば類似のクローンは容易
に得ることができる。また、ＰＣＲでは反応生成物は１
回の反応ごとにほぼ倍増してゆく。１，０００は
２１０、１０，０００は２１３に近く、単一コピーを増
幅するのに比べ、反応を１０〜１３回少なくすることが
できる計算になる。
【００３９】なお、上記配列番号２及び配列番号３に示
す塩基配列を有するＤＮＡは常法により大腸菌に導入さ
れ、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ１及び
Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ２は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１２６４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２６４２）及び微工研菌寄第１２６４３号（ＦＥＲＭＰ
−１２６４３）として寄託されている。 （２）雌雄のウシのＤＮＡに対して異なった会合像を与
えるＤＮＡを有するクローンの単離 上記（１）で得られた２８個のクローンのうち１つを選
択して、ＤＮＡを抽出し、そのＥｃｏＲＩ断片につき、
当該断片の塩基配列を解析したところ配列番号４に示す
塩基配列を有することが判明した。この２１０４塩基に
よりなるＥｃｏＲＩ断片を３２Ｐで標識してプローブと
用いて、サザンブロット法によって解析した結果を図４
に示す。図４においてレーン１は雄ＤＮＡとの会合像
を、レーン２は雌ＤＮＡとの会合像を示したもので、配
列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡは雌雄双方のＤ
ＮＡと会合するが、両者間で異なる会合像を与えること
が判明した。
す塩基配列を有するＤＮＡは常法により大腸菌に導入さ
れ、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ１及び
Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ２は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１２６４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２６４２）及び微工研菌寄第１２６４３号（ＦＥＲＭＰ
−１２６４３）として寄託されている。 （２）雌雄のウシのＤＮＡに対して異なった会合像を与
えるＤＮＡを有するクローンの単離 上記（１）で得られた２８個のクローンのうち１つを選
択して、ＤＮＡを抽出し、そのＥｃｏＲＩ断片につき、
当該断片の塩基配列を解析したところ配列番号４に示す
塩基配列を有することが判明した。この２１０４塩基に
よりなるＥｃｏＲＩ断片を３２Ｐで標識してプローブと
用いて、サザンブロット法によって解析した結果を図４
に示す。図４においてレーン１は雄ＤＮＡとの会合像
を、レーン２は雌ＤＮＡとの会合像を示したもので、配
列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡは雌雄双方のＤ
ＮＡと会合するが、両者間で異なる会合像を与えること
が判明した。
【００４０】なお、上記配列番号４に示す塩基配列を有
するＤＮＡは常法により大腸菌に導入され、かかる形質
転換体Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ３は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第１２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２６４４）として寄託されている。 （３）雌雄共通のウシのＤＮＡに結合するＤＮＡを有す
るクローンの単離 実施例１において、雄特異的一次クローンを検索した
際、サザンブロット法で雌雄のＤＮＡに共通に結合する
クローンを２０個得ていたので、これらを利用すること
にした。会合の強さなどを勘案し、繰り返し配列よりな
ると予想されるクローン３個選び、上記（１），（２）
と同様にして、これらのクローンＤＮＡのＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列を決定し、配列番号５、
配列番号６および配列番号７に示した。かかるＥＣＯＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を３２Ｐで標識してプローブと
して用い、サザンブロット法によって解析した結果を図
５に示す。
するＤＮＡは常法により大腸菌に導入され、かかる形質
転換体Ｅ．ｃ．ｇｅｍ−ｂｍｓ３は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第１２６４４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１２６４４）として寄託されている。 （３）雌雄共通のウシのＤＮＡに結合するＤＮＡを有す
るクローンの単離 実施例１において、雄特異的一次クローンを検索した
際、サザンブロット法で雌雄のＤＮＡに共通に結合する
クローンを２０個得ていたので、これらを利用すること
にした。会合の強さなどを勘案し、繰り返し配列よりな
ると予想されるクローン３個選び、上記（１），（２）
と同様にして、これらのクローンＤＮＡのＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列を決定し、配列番号５、
配列番号６および配列番号７に示した。かかるＥＣＯＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を３２Ｐで標識してプローブと
して用い、サザンブロット法によって解析した結果を図
５に示す。
【００４１】図５において、レーン１・２は配列番号
５、レーン３・４は配列番号６、レーン５・６は配列番
号７に示したＤＮＡを３２Ｐで標識し、サザンブロット
法におけるプローブとして用いたものである。レーン１
・３・５は雄ＤＮＡ、レーン２・４・６は雌ＤＮＡをそ
れぞれＥｃｏＲＩで分解したものである。この結果よ
り、配列、番号５及び配列番号７に示した配列のコピー
数が極めて多いことがわかった。
５、レーン３・４は配列番号６、レーン５・６は配列番
号７に示したＤＮＡを３２Ｐで標識し、サザンブロット
法におけるプローブとして用いたものである。レーン１
・３・５は雄ＤＮＡ、レーン２・４・６は雌ＤＮＡをそ
れぞれＥｃｏＲＩで分解したものである。この結果よ
り、配列、番号５及び配列番号７に示した配列のコピー
数が極めて多いことがわかった。
【００４２】なお、上記配列番号５、配列番号６及び配
列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡは常法により大
腸菌に導入され、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．１１８−ｂ
ｍｆ１、Ｅ．ｃ．１１８−ｂｍｆ２及びＥ．ｃ．１１８
−ｂｍｆ３は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１２６４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４５）、微
工研菌寄第１２６４６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４６）
及び微工研菌寄第１２６４７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
４７）として寄託されている。
列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡは常法により大
腸菌に導入され、かかる形質転換体Ｅ．ｃ．１１８−ｂ
ｍｆ１、Ｅ．ｃ．１１８−ｂｍｆ２及びＥ．ｃ．１１８
−ｂｍｆ３は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第１２６４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４５）、微
工研菌寄第１２６４６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６４６）
及び微工研菌寄第１２６４７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
４７）として寄託されている。
【００４３】〔実施例２〕 （１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列
番号４に示した配列より、雄特異的バンドを与えるＰＣ
Ｒ用のプライマーをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製）を用
いて合成した。 かかるＰＣＲプライマーは、各々配列番号８、配列番号
９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１
８、配列番号１９に表される塩基配列を有するものであ
る。
番号４に示した配列より、雄特異的バンドを与えるＰＣ
Ｒ用のプライマーをＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製）を用
いて合成した。 かかるＰＣＲプライマーは、各々配列番号８、配列番号
９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１
８、配列番号１９に表される塩基配列を有するものであ
る。
【００４４】この内、配列番号９と配列番号１３、配列
番号８配列番号１３、配列番号８と配列番号９、配列番
号１４と配列番号１５、配列番号１６と配列番号１７、
又は配列番号１８と配列番号１９で示されるプライマー
対を用いた場合は、ＰＣＲ反応が進行し、雄特異的なＰ
ＣＲ産物を得ることができたが、配列番号１２と配列番
号１３の組合せの場合は、ＰＣＲ反応は進行しなかっ
た。 （２）配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に示し
た配列より、上と同様に雌雄共通のバンドを与えるＰＣ
Ｒプライマーを合成した。
番号８配列番号１３、配列番号８と配列番号９、配列番
号１４と配列番号１５、配列番号１６と配列番号１７、
又は配列番号１８と配列番号１９で示されるプライマー
対を用いた場合は、ＰＣＲ反応が進行し、雄特異的なＰ
ＣＲ産物を得ることができたが、配列番号１２と配列番
号１３の組合せの場合は、ＰＣＲ反応は進行しなかっ
た。 （２）配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に示し
た配列より、上と同様に雌雄共通のバンドを与えるＰＣ
Ｒプライマーを合成した。
【００４５】かかるＰＣＲプライマーは、各々配列番号
１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配
列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２
５、配列番号２６、配列番号２７に表される塩基配列を
有するものである。この内配列番号１０と配列番号１
１、配列番号２０と配列番号２１、配列番号２２と配列
番号２３、配列番号２４と配列番号２５、又は配列番号
２６と配列番号２７で示されるプライマー対を用いた場
合には、ＰＣＲ反応が進行し、雄雌共通のＰＣＲ産物を
得ることができた。
１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配
列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２
５、配列番号２６、配列番号２７に表される塩基配列を
有するものである。この内配列番号１０と配列番号１
１、配列番号２０と配列番号２１、配列番号２２と配列
番号２３、配列番号２４と配列番号２５、又は配列番号
２６と配列番号２７で示されるプライマー対を用いた場
合には、ＰＣＲ反応が進行し、雄雌共通のＰＣＲ産物を
得ることができた。
【００４６】〔実施例３〕 精製した雌雄のウシのＤＮＡを量をかえてとり、ここに
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号
１１に示したプライマーを各２０ｐｍｏｌ加え、５０サ
イクルのＰＣＲ反応による遺伝子の増幅を行なった。そ
して、かかるＰＣＲ産物をアガロースゲルに載せ電気泳
動を行なった。これをエチジウムブロマイドで染色し、
紫外光照射下、写真を撮影した（図６）。図６におい
て、ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉは雄ＤＮＡ、ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，
ｊは雌ＤＮＡである。ａ，ｂは雌雄ウシＤＮＡをそれぞ
れ１ｎｇ、ｃ，ｄは同じく１００ｐｇ、ｅ，ｆは同じく
１０ｐｇ、ｇ，ｈは同じく１ｐｇ、ｉ，ｊは同じく１０
０ｆｇで反応させたものである。ｋは陰性対照として蒸
留水を用いたものである。
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号
１１に示したプライマーを各２０ｐｍｏｌ加え、５０サ
イクルのＰＣＲ反応による遺伝子の増幅を行なった。そ
して、かかるＰＣＲ産物をアガロースゲルに載せ電気泳
動を行なった。これをエチジウムブロマイドで染色し、
紫外光照射下、写真を撮影した（図６）。図６におい
て、ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉは雄ＤＮＡ、ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，
ｊは雌ＤＮＡである。ａ，ｂは雌雄ウシＤＮＡをそれぞ
れ１ｎｇ、ｃ，ｄは同じく１００ｐｇ、ｅ，ｆは同じく
１０ｐｇ、ｇ，ｈは同じく１ｐｇ、ｉ，ｊは同じく１０
０ｆｇで反応させたものである。ｋは陰性対照として蒸
留水を用いたものである。
【００４７】この結果、試料のＤＮＡは、１０ｐｇあれ
ば本発明方法で雌雄を判別可能であることが判明した
（図６、ｅ）。１細胞あたりのＤＮＡ量は、約３ｐｇな
ので上記胚盤胞からは３細胞採取すれば十分であること
が示唆された。
ば本発明方法で雌雄を判別可能であることが判明した
（図６、ｅ）。１細胞あたりのＤＮＡ量は、約３ｐｇな
ので上記胚盤胞からは３細胞採取すれば十分であること
が示唆された。
【００４８】〔実施例４〕ウシ培養細胞を用いた雌雄の
判別 雌雄のウシ肝より、通常公知の方法（日本組織培養学会
編、組織培養の技術、第２版、朝倉書店、１９８８）に
より、繊維芽細胞を培養し、これをＴｒｉｓ緩衝液中で
凍結保存し、これを９０℃３０分で凍結融解後一定数の
細胞懸濁液を順次希釈し、配列番号８及び配列番号９に
示したプライマーを用いて前記実施例３と同様の方法で
ＰＣＲによる遺伝子の増殖を行ない雌雄を判別した。図
７において、レーンａ〜ｅは雄細胞、ｆ〜ｊは雌細胞、
ａ，ｆは上記培養細胞を１００細胞用いて判別を行なっ
たもの、ｂ，ｇは同じく３０細胞用いたもの、ｃ，ｈは
同じく１０細胞用いたもの、ｄ，ｉは同じく３細胞用い
たもの、ｅ，ｊは同じく１細胞用いたもの、ｋは実施例
３で用いた雄精製ＤＮＡ（１０ｐｇ）を用いたもの、１
は同じく雌精製ＤＮＡ（１０ｐｇ）を用いたものであ
る。ｋは陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水を用いた
ものである。
判別 雌雄のウシ肝より、通常公知の方法（日本組織培養学会
編、組織培養の技術、第２版、朝倉書店、１９８８）に
より、繊維芽細胞を培養し、これをＴｒｉｓ緩衝液中で
凍結保存し、これを９０℃３０分で凍結融解後一定数の
細胞懸濁液を順次希釈し、配列番号８及び配列番号９に
示したプライマーを用いて前記実施例３と同様の方法で
ＰＣＲによる遺伝子の増殖を行ない雌雄を判別した。図
７において、レーンａ〜ｅは雄細胞、ｆ〜ｊは雌細胞、
ａ，ｆは上記培養細胞を１００細胞用いて判別を行なっ
たもの、ｂ，ｇは同じく３０細胞用いたもの、ｃ，ｈは
同じく１０細胞用いたもの、ｄ，ｉは同じく３細胞用い
たもの、ｅ，ｊは同じく１細胞用いたもの、ｋは実施例
３で用いた雄精製ＤＮＡ（１０ｐｇ）を用いたもの、１
は同じく雌精製ＤＮＡ（１０ｐｇ）を用いたものであ
る。ｋは陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水を用いた
ものである。
【００４９】この結果、上記培養細胞は１０細胞あれば
雌雄の判別に十分であることが判明した。
雌雄の判別に十分であることが判明した。
【００５０】〔実施例５〕ウシ胚を用いた雌雄の識別
（１） 通常公知の方法で培養した胚盤胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの
改変リン酸食塩緩衝液（Ｄ．Ｇ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａ
ｍ，Ｎａｔｕｒｅ，２３３，１２５−１２６，１９７
１）に入れ、約１０分間室温にて放置し、無処理のプラ
スチックシャーレの器底に接着させた。かかる胚盤胞を
図８に示すごとく、微小ナイフで二分割した後、栄養外
胚葉の一部を切り出し、胚盤胞細胞を得た。そして、双
方を配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列
番号１１に示す塩基配列を有するプライマーを用い、本
発明方法によって雌雄を判別した。本発明方法による雌
雄の判別法は、実施例４と同様の方法で行なった。本発
明方法による判別結果を図９に示す。図９において、レ
ーンａ，ｂ及びｄ，ｅはそれぞれ同一胚盤胞を二分割し
たものであり、ｃ，ｆはそれぞれの胚を培養した培養液
を陰性対照として用い、ｇ，ｈはそれぞれ実施例４で用
いた精製した雄雌のＤＮＡ（１０ｐｇ）を陽性対照とし
て用いたものである。その結果、同一胚由来のレーン
ａ，ｂ双方共陽性対照の雄ＤＮＡと同じ長さのＰＣＲ産
物を与えたので、この胚は雄であることが想定された。
同じくｃ，ｄは陽性対照の雌ＤＮＡと同じ長さのＰＣＲ
産物を与えたので雌であることが想定された。
（１） 通常公知の方法で培養した胚盤胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの
改変リン酸食塩緩衝液（Ｄ．Ｇ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａ
ｍ，Ｎａｔｕｒｅ，２３３，１２５−１２６，１９７
１）に入れ、約１０分間室温にて放置し、無処理のプラ
スチックシャーレの器底に接着させた。かかる胚盤胞を
図８に示すごとく、微小ナイフで二分割した後、栄養外
胚葉の一部を切り出し、胚盤胞細胞を得た。そして、双
方を配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列
番号１１に示す塩基配列を有するプライマーを用い、本
発明方法によって雌雄を判別した。本発明方法による雌
雄の判別法は、実施例４と同様の方法で行なった。本発
明方法による判別結果を図９に示す。図９において、レ
ーンａ，ｂ及びｄ，ｅはそれぞれ同一胚盤胞を二分割し
たものであり、ｃ，ｆはそれぞれの胚を培養した培養液
を陰性対照として用い、ｇ，ｈはそれぞれ実施例４で用
いた精製した雄雌のＤＮＡ（１０ｐｇ）を陽性対照とし
て用いたものである。その結果、同一胚由来のレーン
ａ，ｂ双方共陽性対照の雄ＤＮＡと同じ長さのＰＣＲ産
物を与えたので、この胚は雄であることが想定された。
同じくｃ，ｄは陽性対照の雌ＤＮＡと同じ長さのＰＣＲ
産物を与えたので雌であることが想定された。
【００５１】〔実施例６〕ウシ胚を用いた胚の識別
（２） 実施例５と同様に、二分割した胚盤胞より、それぞれ８
個の胚盤胞細胞を得た。そして、それぞれ、二分割した
一方について実施例５と同様の方法で雌雄を判別した。
結果を図１０に示す。レーンａ〜ｈは、二分割胚のＰＣ
Ｒの結果である。ｉは実施例３で用いた雄精製ＤＮＡ
（１０ｐｇ）について、ｊは同じく雌精製ＤＮＡ（１０
ｐｇ）についてのＰＣＲの結果である。その結果ａ，
ｂ，ｅ，ｆ，ｈは雄と、ｃ，ｄ，ｇは雌と判定された。
これらのうち、ｃ，ｅ，ｇの二分割胚の他方について
は、顕微鏡下、細胞遺伝学的に染色体の核型により雌雄
を判別することが可能であった。すなわち、レーンｅの
二分割胚については、図１１．ａに示すようにＸ・Ｙ染
色体を有するので雄、ｃ・ｇについては図１１・ｂに示
すようにＸ・Ｘ染色体を有するので雌と判定された。な
お、当該核型分析は、胚を０．０４μｇ／ｍｌのコルセ
ミド存在下ＴＣＭ−１９９培地（Ｌ．Ｌｅｉｂｆｒｉｅ
ｄ ＆ Ｎ．Ｌ．Ｆｉｒｓｔ，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃ
ｉ．，５３，７６〜８６（１９７８））で３７℃で２時
間培養し、０．９％のクエン酸ナトリウム溶液で数分間
低張処理を行ない、メタノール、酢酸、水の３：２：１
混合液で固定、ガラススライド上に展開し、ギムザ染色
後、顕微鏡下で観察した。図１１において長い矢印はＸ
染色体を、短い矢印はＹ染色体を示す。
（２） 実施例５と同様に、二分割した胚盤胞より、それぞれ８
個の胚盤胞細胞を得た。そして、それぞれ、二分割した
一方について実施例５と同様の方法で雌雄を判別した。
結果を図１０に示す。レーンａ〜ｈは、二分割胚のＰＣ
Ｒの結果である。ｉは実施例３で用いた雄精製ＤＮＡ
（１０ｐｇ）について、ｊは同じく雌精製ＤＮＡ（１０
ｐｇ）についてのＰＣＲの結果である。その結果ａ，
ｂ，ｅ，ｆ，ｈは雄と、ｃ，ｄ，ｇは雌と判定された。
これらのうち、ｃ，ｅ，ｇの二分割胚の他方について
は、顕微鏡下、細胞遺伝学的に染色体の核型により雌雄
を判別することが可能であった。すなわち、レーンｅの
二分割胚については、図１１．ａに示すようにＸ・Ｙ染
色体を有するので雄、ｃ・ｇについては図１１・ｂに示
すようにＸ・Ｘ染色体を有するので雌と判定された。な
お、当該核型分析は、胚を０．０４μｇ／ｍｌのコルセ
ミド存在下ＴＣＭ−１９９培地（Ｌ．Ｌｅｉｂｆｒｉｅ
ｄ ＆ Ｎ．Ｌ．Ｆｉｒｓｔ，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃ
ｉ．，５３，７６〜８６（１９７８））で３７℃で２時
間培養し、０．９％のクエン酸ナトリウム溶液で数分間
低張処理を行ない、メタノール、酢酸、水の３：２：１
混合液で固定、ガラススライド上に展開し、ギムザ染色
後、顕微鏡下で観察した。図１１において長い矢印はＸ
染色体を、短い矢印はＹ染色体を示す。
【００５２】
【配列表】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【図１】雄特異的ＤＮＡ断片をクローニングする方法の
概略図である。
概略図である。
【図２】雄ＤＮＡを特異的に識別するクローンを単離し
た電気泳動写真である。
た電気泳動写真である。
【図３】雄特異的に会合する二次的クローンについての
電気泳動写真である。
電気泳動写真である。
【図４】雄特異的及び雌雄共通に会合する部分により構
成されるＤＮＡをプローブとしたときのサザンブロット
像を示す電気泳動写真である。
成されるＤＮＡをプローブとしたときのサザンブロット
像を示す電気泳動写真である。
【図５】雌雄共通の会合像を与えるクローンを用いたと
きのサザンブロット像を示す電気泳動写真である。
きのサザンブロット像を示す電気泳動写真である。
【図６】精製雌雄ＤＮＡを用いた本発明方法の検出感度
を示す電気泳動写真である。
を示す電気泳動写真である。
【図７】ウシの培養細胞を用いた本発明方法の検出感度
を示す電気泳動写真である。
を示す電気泳動写真である。
【図８】胚盤胞を器壁に接着させ、栄養外胚葉を切り出
す方法を示す生物の形態写真である。
す方法を示す生物の形態写真である。
【図９】本発明方法による二分割ウシ胚細胞の雌雄を判
別した電気泳動写真である。
別した電気泳動写真である。
【図１０】本発明方法による二分割ウシ胚細胞の雌雄の
判別した電気泳動写真である。
判別した電気泳動写真である。
【図１１】分割胚の核型を顕微鏡下において示した生物
の形態写真である。
の形態写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 須藤 鎮世 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２ 番 伊藤ハム株式会社 中央研究所内 (72)発明者 中村 豊郎 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２ 番 伊藤ハム株式会社 中央研究所内 (56)参考文献 特表 平６−501386（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503357（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503358（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−500453（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500214（ＪＰ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】 配列番号１によって表わされる塩基配列
よりなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズする
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号２によって表わされる塩基配列
よりなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズする
ＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号３によって表わされる塩基配列
よりなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズする
ＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号４によって表わされる塩基配列
よりなる雄ウシ特異的及び雌雄ウシに共通に会合する部
分により構成されるＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、
又は配列番号４によって表される塩基配列よりなるＤＮ
Ａをプローブとして用い、雄ウシのＤＮＡとハイブリダ
イズさせることにより選択されるＤＮＡ。 - 【請求項６】 少なくとも配列番号１によって表される
塩基配列よりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部によりな
る雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ
プライマー。 - 【請求項７】 少なくとも配列番号２によって表される
塩基配列よりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部によりな
る雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ
プライマー。 - 【請求項８】 少なくとも配列番号３によって表わされ
る塩基配列によりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部によ
りなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズするＤ
ＮＡプライマー。 - 【請求項９】 少なくとも配列番号４によって表わされ
る塩基配列によりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部によ
りなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズするＤ
ＮＡプライマー。 - 【請求項10】 少なくとも配列番号１、配列番号２、配
列番号３、又は配列番号４によって表される塩基配列よ
りなるＤＮＡをプローブとして用い、雄ウシのＤＮＡと
ハイブリダイズさせることにより選択されるＤＮＡ又は
その相補鎖の一部によりなる雄ウシのゲノムに特異的に
ハイブリダイズするＤＮＡプライマー。 - 【請求項11】 配列番号５によって表される塩基配列よ
りなる雌雄双方のウシのゲノムにハイブリダイズするＤ
ＮＡ。 - 【請求項12】 配列番号６によって表わされる塩基配列
よりなる雌雄双方のウシのゲノムにハイブリダイズする
ＤＮＡ。 - 【請求項13】 配列番号７によって表わされる塩基配列
よりなる雌雄双方のウシのゲノムにハイブリダイズする
ＤＮＡ。 - 【請求項14】 少なくとも配列番号５によって表される
塩基配列によりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部により
なる雌雄双方のウシのゲノムに特異的にハイブリダイズ
するＤＮＡプライマー。 - 【請求項15】 少なくとも配列番号６によって表される
塩基配列によりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部により
なる雌雄双方のウシのゲノムに特異的にハイブリダイズ
するＤＮＡプライマー。 - 【請求項16】 少なくとも配列番号７によって表される
塩基配列によりなるＤＮＡ又はその相補鎖の一部により
なる雌雄双方のウシのゲノムに特異的にハイブリダイズ
するＤＮＡプライマー。 - 【請求項17】 配列番号８によって表される塩基配列よ
りなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズするＤ
ＮＡプライマー。 - 【請求項18】 配列番号９によって表される塩基配列に
よりなる雄ウシのゲノムに特異的にハイブリダイズする
ＤＮＡプライマー。 - 【請求項19】 配列番号10によって表される塩基配列に
よりなる雌雄双方のウシのゲノムに特異的にハイブリダ
イズするＤＮＡプライマー。 - 【請求項20】 配列番号11によって表される塩基配列に
よりなる雌雄双方のウシのゲノムに特異的にハイブリダ
イズするＤＮＡプライマー。 - 【請求項21】 ウシの胚盤胞の一部を採取し、かかる胚
盤胞の細胞より、ＤＮＡを抽出し、請求項６、請求項
７、請求項８、請求項９、請求項10、請求項17、又は請
求項18記載のＤＮＡプライマーにより選ばれる複数の異
なるＤＮＡプライマー、並びに請求項14、請求項15、請
求項16、請求項19、又は請求項20記載のＤＮＡプライマ
ーにより選ばれるそれぞれ１対の異なるＤＮＡプライマ
ーをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲ法により、上
記ウシの胚盤胞のＤＮＡの特定部位を増幅させて、これ
により得られるＰＣＲ産物の種類を特定して識別するこ
とを特徴とするウシ胚の雌雄の識別方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3352032A JP2593021B2 (ja) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | ウシ胚の性の識別方法 |
| AU29818/92A AU649900B2 (en) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Sexing method of bovine embryos |
| EP92311013A EP0546762B1 (en) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Sexing method of bovine embryos |
| NZ245340A NZ245340A (en) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Sexing bovine embryos using dna probes |
| US07/984,044 US5461145A (en) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Sexing method of bovine embyros |
| DE69218734T DE69218734T2 (de) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Rinderembryos |
| CA002084339A CA2084339C (en) | 1991-12-13 | 1992-12-02 | Method of sexing bovine embryos |
| US08/458,393 US5661011A (en) | 1991-12-13 | 1995-06-02 | Sexing method of bovine embryos |
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