MXPA03002265A - Vacuna. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la combinacion de dos o mas proteinas de S. pneurnoniae, su elaboracion y uso en medicina como una vacuna; dichas combinaciones son particularmente utiles para la proteccion de infantes y ancianos en contra de la infeccion estreptococal.

Description

VACUNA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una combinación de 2 o más proteínas de S. pneumoniae, su elaboración y uso para la protección de infantes y ancianos en contra de la infección estreptococal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Stmptococcus pneumoniae es una bacteria Gram positiva responsable de una gran morbidez y mortalidad (particularmente en los jóvenes y en los ancianos), ocasionando enfermedades invasivas tales como neumonía, bacteremia y meningitis, y enfermedades asociadas con la colonización, tales como Otitis media aguda. La relación de neumonía neumococal en los Estados Unidos para personas mayores de 60 años de edad se estima que es de 3 a 8 por 100,000. En 20% de los casos esto lleva a bacteremia, y a otras manifestaciones tales como meningitis, con una relación de mortalidad cercana al 30 % incluso con tratamiento de antibióticos. El neumococo está encapsulado con un polisacárido asociado químicamente que le confiere especificidad de serotipo. Hay 90 serotipos conocidos de neumococos, y la cápsula es el determinante de virulencia principal para los neumococos, puesto que la cápsula no solamente protege la superficie interna de la bacteria a partir del complemento, sino que por si misma es escasamente inmunogónica. Los polisacáridos son antfgenos independientes de T, y no pueden ser procesados o presentados sobre moléculas del MHC para interactuar con las células T. Estos pueden, sin embargo, estimular al sistema inmune a través de un mecanismo alternativo el cual implica el entrecruzamiento de los receptores de superficie en las células B. Se demostró en varios experimentos que la protección en contra de las enfermedades invasivas por neumococos se correlaciona más fuertemente con anticuerpo específico para la cápsula, y la protección es especifica del serotipo. Streptococcus pneumoniae es la causa más común de enfermedades invasivas bacterianas y de Otitis media en infantes y niños pequeños. Similarmente, los ancianos montan respuestas deficientes a las vacunas neumococales [ oghamm et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270], de ahí la incidencia incrementada de neumonía bacteriana en esta población [Verghese y Beck, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271-285]. La vacuna neumococal no conjugada 23-valente ha mostrado una amplia variación en eficiencia clínica, de 0% a 81% (Fedson et al., (1994) Aren. Intern Med. 154: 2531-2535). La eficiencia parece estar relacionada con el grupo de riesgo que ha sido inmunizado, tales como los ancianos, enfermedad de Hodgkin, esplenectomla, enfermedad de célula falciforme y agammaglobulinómicos (Fine et al., (1994) Aren Intem Med. 154: 2666-2677), y también a la manifestación de la enfermedad. La vacuna 23-valente no demuestra protección en contra de la neumonía neumococal (en ciertos grupos de alto riesgo tales como los ancianos) y enfermedades de Otitis media. Las estrategias, que han sido diseñadas para superar esta carencia de ¡nmunogenicidad en los infantes, incluye la asociación del polisacarido a proteínas inmunogénicas grandes, que proveen a la célula auxiliar T circunstante y que induce memoria inmunológica en contra del antígeno de polisacárido al cual está conjugado. Por lo tanto hay una necesidad para mejorar las composiciones de vacuna neumococal, particularmente aquellas que serán más efectivas en la prevención o mejoría de enfermedades neumococales (particularmente neumonía) en los ancianos y en niños pequeños. La presente invención provee dicha vacuna mejorada.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente invención es una composición inmunogónica que comprende al menos 2 proteínas de S. pneumoniae seleccionadas a partir del grupo que consiste de familia Tríada de Poli Histidina (PhtX), familia de Proteína de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas truncado de CbpX-truncado de LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101 , Sp130, Sp125 y Sp133. En una modalidad preferida, una de las proteínas es a partir de la familia Tríada de Poli Histidina (PhtX). En otra modalidad preferida, una de las proteínas es a partir de la familia de Proteína de Unión a Colina (CbpX), o truncados de CbpX, o proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX. En un aspecto relacionado, la presente invención provee una vacuna para tratar o mejorar Otitis media en infantes o neumonía en los ancianos. Opcionalmente, la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante, el cual preferiblemente es un inductor de una respuesta TH1. En incluso otro aspecto relacionado es un método para elaborar la vacuna de la invención mediante la selección y aislamiento de 2 diferentes proteínas de S. pneumoniae y mezclado de ambas proteínas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee una vacuna mejorada particularmente para la prevención o mejoría de infección neumococal de los ancianos (por ejemplo, neumonía) y/o en infantes (por ejemplo, Otitis media), mediante la RELYING en un método basado en proteína neumococal. En una modalidad preferida, la vacuna es adecuada para la prevención o mejoría de la infección neumococal de los ancianos. Puesto que la mayoría de los adultos han sido expuestos a Streptococcus pneumoniae, la presente vacuna se pretende que refuerce la respuesta inmune subyacente en los adultos y en los ancianos a niveles protectores mediante la administración de al menos 2 proteínas neumococales identificadas en la presente invención. Las proteínas neumococales se administran en la ausencia de polisacáridos de S. pneumoniae. En el contexto de la presente invención un paciente se considera anciano si éstos tienen 55 años o más de edad, típicamente más de 60 años y más generalmente más de 65 años. Por lo tanto en una modalidad la invención provee una composición de vacuna que comprende proteínas neumococales para la prevención de neumonía en los ancianos. En otra modalidad preferida, la presente invención provee una composición de vacuna, adecuada para uso en infantes (típicamente de 0 a 2 años de edad), que comprende dos o más proteínas neumococales identificadas en la presente invención.

Proteínas neumococales de la invención Las proteínas de Streptococcus pneumoniae de la invención son ya sea proteínas expuestas en la superficie, al menos durante una parte del ciclo de vida de los neumococos, o son proteínas las cuales son secretadas o liberadas por los neumococos. Preferiblemente la combinación de proteínas de la invención se seleccionan a partir de 2 categorías diferentes tales como proteínas que tienen un motivo secuencia Señal Tipo II de LXXC (en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, la familia tríada de polihistidina (PhtX)), proteínas de unión a colina (CbpX), proteínas que tienen un motivo de secuencia Señal Tipo I (por ejemplo, Sp101 ), proteínas que tienen un motivo LPXTG (en donde, X es cualquier aminoácido, por ejemplo, Sp128, Sp130), toxinas (por ejemplo, PIy), etc. Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las siguientes proteínas, o equivalentes inmunológicamente funcional de las mismas. La composición inmunogénica de la invención comprende al menos 2 proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia Tríada de Poli Histidina (PhtX), familia de Proteínas de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncado de CbpX-truncado de LytX , neumolisina (PIy), PspA, PsaA, Sp128, Sp101 , Sp130, Sp125 y Sp133. Sin embargo, si CbpX es PspC, entonces la segunda proteína no es PspA o PsaA. Preferiblemente, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia Tríada de Poli Histidina (PhtX), familia de Proteínas de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncado de CbpX-truncado de LytX, neumolisina (PIy), PspA, PsaA y Sp128. Más preferiblemente, la composición inmunogénica comprende 2 o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de la familia Tríada de Poli Histidina (PhtX), familia de Proteínas de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas (o fusiones) de truncado de CbpX-truncado de LytX , neumolisina (PIy) y Sp128.

La familia Pht (Tríada de Poli Histidina) comprende proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia está caracterizada por una secuencia de lipidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varias tríadas de histidina, posiblemente implicadas en la unión a metal o a nucleósido o a la actividad enzimática, regiones enrolladas en espiral (3-5), un N-terminal conservado y un C-terminal heterogéneo. Este está presente en todas las cepas de neumococos evaluadas. Las proteínas homólogas también han sido encontradas en otros estreptococos y Neissería. Los miembros preferidos de la familia comprenden PhtA, PhtB y PhtD. Más preferiblemente, ésta comprende PhtA o PhtD. Se entiende, sin embargo, que los términos Pht A, B, D, y E se refieren a proteínas que tienen secuencias descritas en las citas a continuación, así como a variantes de las mismas que ocurren de manera natural (y elaboradas por el hombre) que tienen una homología de secuencia que es al menos 90% idéntica a las proteínas de referencia. Preferiblemente ésta es al menos 95% idéntica y más preferiblemente ésta es 97% idéntica. Con respecto a las proteínas PhtX, PhtA se describe en WO 98/ 8930, y también se refiere como Sp36. Como se mencionó anteriormente, esta es una proteína a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II de LXXC. PhtD se describe en WO 00/37105, y también está referida como Sp036D. Como se mencionó anteriormente, esta también es una proteína a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II LXXC.

PhtB se describe en WO 00/37105, y también se refiere como Sp036B. Otro miembro de la familia PhtB es el polipéptido degradador C3, como se describe en WO 00/17370. Esta proteína también es a partir de la familia tríada de polihistidina y tiene el motivo señal tipo II LXXC. Un equivalente inmunológicamente funcional en la proteína Sp42 descrita en WO 98/18930. Un truncado de PhtB (de aproximadamente 79 kD) se describe en WO 99/15675 el cual también se considera un miembro de la familia PhtX. PhtE se describe en WO 00/30299 y se refiere como BVH-3. Con respecto a la familia de la Proteínas de Unión a Colina (CbpX), los miembros de esa familia se identificaron originalmente como proteínas neumococales que pudieron ser purificadas mediante cromatografía de afinidad a colina. Todas las proteínas de unión a colina no se unen de manera covalente a porciones de fosforilcolina del ácido teichóico de la pared celular y al ácido lipoteichóico asociado a membrana. Estructuralmente, éstas tienen varias regiones en común a lo largo de toda la familia, aunque el número exacto de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc.) puede variar. En general, las proteínas de unión a colina comprende una región N terminal (N), regiones repetidas conservadas (R1 y/o R2), una región rica en prolina (P) y una región conservada de unión a colina (C), elaborada de múltiples repetidos, que comprenden aproximadamente una mitad de la proteína. Como se utiliza en esta solicitud, el término "familia de Proteínas de Unión a Colina (Cbp)" se selecciona a partir del grupo que consiste de Proteínas de Unión a Colina como se identifican en WO 97/41151 , PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se describe en WO 97/41151. CbpD y CbpG se describen en WO 00/29434. PspC se describe en WO 97/09994. PcbA se describe en WO 98/21337. Preferiblemente las Proteínas de Unión a Colina se selecciona a partir del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Otra modalidad preferida son los truncados de CbpX en donde "CbpX" se definió anteriormente y "truncado" se refiere a proteínas CbpX que carecen del 50% o más de la región de unión a Colina (C). Preferiblemente dichas proteínas carecen de toda la1 región de unión a colina. Más preferiblemente, dichos truncados de proteína carecen de (i) la región de unión a colina y (ii) también de una porción de la mitad N-terminal de la proteína, que aún así retiene al menos una región repetida (R1 o R2). Más preferiblemente aún, el truncado tiene 2 regiones repetidas (R1 y R2). Los ejemplos de dichas modalidades preferidas son NR1xNr2 y R1 xR2 como se ilustran en WO 99/51266 o WO 99/51188, sin embargo, otras proteínas de unión a colina que carecen de una región similar de unión a colina también están contempladas dentro del alcance de esta invención. La familia Lyt son proteínas asociadas a la membrana asociadas con la lisis celular. El dominio N-terminal comprende un dominio(s) de unión a colina, sin embargo la familia Lyt no tiene todas las características encontradas en la familia CbpA mencionada anteriormente y por lo tanto para la presente invención, la familia LytX se considera distinta a partir de la familia CbpX. En contraste con la familia CbpX, el dominio C-terminal contiene el dominio catalítico de la familia de proteína LytX. La familia comprende LytA, B y C. Con respecto a la familia LytX, LytA se describe en Ronda et al., Eur. J Biochem, 164: 621-624 (1987). LytB se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp46. LytC también se describe en WO 98/18930, y también se refiere como Sp91. Un miembro preferido de esa familia es LytC. Otra modalidad preferida son los truncados de LytX en donde "LytX" se definió anteriormente y "truncados" se refiere a las proteínas LytX que carecen de 50% o más de la región de unión a colina. Preferiblemente dichas proteínas carecen de toda la región de unión a colina. Un ejemplo de dichos truncados se puede encontrar en la sección de ejemplos de esta invención. Incluso otra modalidad preferida de esta invención son proteínas quiméricas (o fusiones) truncado de CbpX -truncado de LytX. Preferiblemente éstas comprenden NR1xR2 (o R1xR2) de CbpX y la porción C terminal (Cterm, por ejemplo, que carece de los dominios de unión a colina) de LytX (por ejemplo, LytCCterm o Sp91 Cterm). Más preferiblemente CbpX se selecciona a partir del grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA y PspC. Más preferiblemente aún, ésta es CbpA. Preferiblemente, LytX es LytC (también referida como Sp91 ). Otra modalidad de la presente invención es un truncado de PspA o de PsaA que carece del dominio de unión a colina (C) y que se expresa como una proteína de fusión con LytX. Preferiblemente, LytX es LytC.

La neumolisina es una toxina multifuncional con una actividad citolítica distintiva (hemolítica) y actividades de activación del complemento (Rubins et al., Am. Respi. Cit. Care Med, 153: 1339-1346 (1996)). La toxina no se secreta por los neumococos, pero se libera después de la lisis de los neumococos bajo la influencia de autolisina. Sus efectos incluyen por ejemplo, la estimulación de la producción de citoquinas inflamatorias por monocitos de humano, la inhibición del movimiento de los cilios en el epitelio respiratorio de humano, y la disminución del actividad bactericida y migración de neutrófilos. El efecto más obvio de la neumolisina está en la lisis de los glóbulos rojos sanguíneos, lo cual implica la unión al colesterol. Debido a que es una toxina, necesita ser detoxificada (por ejemplo, no tóxica a un humano cuando se provee a una dosis adecuada para protección) antes de que ésta pueda ser administrada in vivo. La expresión y clonación de la neumolisina de tipo silvestre o nativa se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker et al. (Infecí Immun, 55: 1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007: 67-72 (1989) y Mitchell et al (NAR, 18: 4010 (1990)). La detoxificación de ply puede realizarse por métodos químicos, por ejemplo, sometiéndola a tratamiento con formalina o glutaraldehído o una combinación de ambos. Dichos métodos se conocen bien la técnica para varias toxinas. Alternativamente, ply puede ser detoxificada genéticamente. Así, la invención abarca derivados de proteínas neumococales los cuales pueden ser, por ejemplo, proteínas mutadas. El término "mutada" se utiliza en la presente invención para referirse a una molécula que ha llevado a cabo deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos utilizando técnicas bien conocidas para mutagónesis sitio dirigida o cualquier otro método convencional. Por ejemplo, como se describió anteriormente, una proteína mutante ply puede ser alterada de manera que sea biológicamente inactiva mientras que aún mantiene sus epítopes inmunogónicos, véase, por ejemplo, WO 90/06951 , Berry et al. (Infect Immun, 67: 981-985 (1999)) y WO 99/03884. Como se utiliza en la presente invención, se entiende que el término "Ply" se refiere a neumoiisina mutada o detoxificada adecuada para uso módico (por ejemplo, no tóxica). Con respecto a PsaA y PspA, ambas se conocen en la técnica. Por ejemplo, PsaA y variantes transmembranales de deleción de las mismas han sido descritas por Berry y Patón, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62. PspA y variantes transmembranales de deleción de las mismas han sido descritas en, por ejemplo, EUA 5804193, WO 92/14488, y WO 99/53940. Sp128 y Sp130 se describen en WO 00/76540. Sp125 es un ejemplo de una proteína neumococal de superficie con el motivo de Anclaje a Pared Celular de LPXTG (en donde X es cualquier aminoácido). Se ha encontrado que cualquier proteína dentro de esta clase de proteínas neumococales de superficie con este motivo es útil dentro del contexto de esta invención, y por lo tanto se considera una proteina adicional de la invención. Sp125 por sí misma se describe en WO 98/18930, y también se conoce como ZmpB- una metaloproteinasa de zinc.

Sp101 se describe en WO 98/06734 (en donde ésta tiene el # de referencia y 85993). Está caracterizada por una secuencia señal Tipo I. Sp133 se describe en WO 98/06734 (en donde ésta tiene el # de referencia y 85992). También está caracterizada por una secuencia señal Tipo I. Las proteínas de la invención también pueden combinarse de manera benéfica. Las combinaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, PhtD + NR1xR2, proteínas quiméricas o de fusión PhtD + NR1xR2-Sp91 Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, proteínas quiméricas o de fusión PhtA + NR1xR2-Sp91 Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PthD, R1xR2 + PthA. Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2) es a partir de CbpA o PspC. Más preferiblemente éste es de a partir de CbpA. Una combinación particularmente preferida de proteínas neumococales comprende Ply (o un equivalente truncado o inmunológicamente funcional de las mismas) + PthD (o un equivalente truncado o inmunológicamente funcional de la misma) + NR1xR2 (o R1xR2). Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2) es a partir de CbpA o PspC. Más preferiblemente éste es a partir de CbpA. La presente invención también abarca "equivalente(s) inmunológicamente funcional(es)" a las proteínas de la invención, "equivalente(s) inmunológicamente funcional(es)" se define como un péptido o proteína que comprende al menos un epítope protector a partir de las proteínas de la invención. Dichos epítopes característicamente están expuestos en la superficie, están altamente conservados, y pueden producir una respuesta de anticuerpo bactericida en un hospedero o prevenir efectos tóxicos. Preferiblemente, el equivalente funcional tiene al menos 15 y preferiblemente 30 o más aminoácidos contiguos a partir de la proteína de la invención, con la condición de que sean capaces de generar substancialmente la misma respuesta inmune que la proteína nativa. La posición de los epítopes potenciales de célula B en una secuencia de protelna puede determinarse fácilmente mediante la identificación de póptidos que están expuestos tanto en la superficie y que son antigónicos, utilizando una combinación de dos métodos: predicción de estructura 2D y predicción del índice antigénico. La predicción de estructura 2D puede realizarse utilizando el programa PSIPRED (a partir de David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, RU). El índice antigénico puede ser calculado con base en el método descrito por Jameson y Wolf (CABIOS 4: 181-186

[1988]). La presente invención tiene ventajas sobre las vacunas de polisacárido de S. pneumoniae en tanto que las composiciones múltiples de proteína de S. pneumoniae (inmunogenica) pueden incluir mayor protección cruzada entre los numerosos serotipos, puede adicionalmente inhibir la adherencia y formación de colonias, y puede generar potencialmente anticuerpos que puede neutralizar las funciones tóxicas/enzimáticas de un patógeno. Además, los antígenos de superficie adicionales proveen modos para estimular adicionalmente la opsonofagocitosis. La presente invención también contempla vacunas de combinación las cuales proveen protección en contra de un intervalo de diferentes patógenos. Muchas vacunas pediátricas actualmente se dan como vacunas de combinación para reducir el número de inyecciones que recibe el niño. Por lo tanto para las vacunas pediátricas, se pueden formular otros antígenos a partir de otros patógenos con las vacunas de la invención. Por ejemplo, las vacunas de la invención pueden ser formuladas con (o separadamente administradas pero al mismo tiempo) la vacuna de combinación "trivalente" bien conocida que comprende toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT), y componentes de pertussis [típicamente toxoide de Pertussis detoxificado (PT), y hemaglutinina filamentosa (FHA) con pertactina opcional (PRN) y/o aglutinina 1 +2], por ejemplo la vacuna comercial INFANRIX-DTPa™ (SmithKIineBeecham Biologicals) la cual contiene antígenos de DT, TT, PT, FHA y PRN, o con un componente de pertussis de célula completa por ejemplo como el comercializado por SmithKIineBeecham Biologicals s.a., como Tritanrix™. La vacuna combinada también puede comprender otro antígeno, tal como antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg), antígenos de virus de Polio (por ejemplo virus de polio trivalente inactivado - IPV), proteínas de la membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas no-tipificadas de Haemophilus influenzae, proteínas de la membrana externa de N. meningitidis B. Los ejemplos de antígenos preferidos de proteína de Moraxella catarrhalis que pueden ser incluidos en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) y WO 96/34960 (PMC)]; OMP21 ; LbpA y/o LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA y/o TbpB [WO 97/13785 y WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61 : 2003-2010]; UspAI y/o UspA2 [WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP 99/03824); PilQ (PCT/EP 99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Lipo06 (GB 9917977. 2); Iipo10 (GB 991828.1 ); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); Omp1A1 (PCT/EP99/06781 ); Hly3 (PCT/EP99/03257); y OmpE. Los ejemplos de antígenos no-tipificados de Haemophilus influenzae que pueden ser incluidos en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: proteína Fimbrina [(EUA 5766608 - Ohio State Research Foundation -Fundación para Investigación del Estado de Ohio)] y las fusiones que comprenden póptidos de la misma [por ejemplo, fusiones del péptido LB1 (f); EUA 5843464 (OSU) o WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortees)]; P6 [EP 281673 (Universidad Estatal de Nueva York)]; TbpA y/o TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641 ); proteína D (EP 594610); P2; y P5 (WO 94/26304).

En otra modalidad, varios antígenos mencionados anteriormente pueden ser incluidos en la composición inmunogénica de la invención como antígenos presentes sobre la superficie de las vesículas de la membrana externa (ampollas) elaboradas a partir de las bacterias a partir de las cuales se derivan. Otras combinaciones contempladas son las proteínas de S. pneumoniae de la invención en combinación con antígenos virales, por ejemplo, a partir de la influenza (fragmento atenuado o subunidad [por ejemplo, glucoproteínas de superficie tipo neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA). Véase, por ejemplo, Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microblol. Infecí. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (por ejemplo, antígenos F y G o fusiones F/G, véase, por ejemplo, Schmidt A. C. et al, J Viral, mayo 2001 , p 4594-4603), PIV3 (por ejemplo, proteínas HN y F, véase Schmidt et al. anteriormente mencionado), Varicela (por ejemplo, glucoproteínas l-V atenuadas, etc.), y cualquier (o todos) componente(s) de MMR (sarampión, parotiditis, rubéola).

Antígenos de polisacárido de la invención La presente solicitud también contempla vacunas de combinación con 2 o más proteínas de S. pneumoniae combinadas con polisacáridos diferentes a los de S. pneumoniae. Dichos polisacáridos pueden ser aislados a partir de, por ejemplo, H. influenzae, H. influenzae tipo B (Hib), N. meningitidis grupos A, C, W, Y, estreptococos diferentes a los de S. penumoniae (por ejemplo, estreptococos del grupo B, S. pyogenes, etc.), Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis), E, coli, Enterococcus (por ejemplo, E. faecalis y E. faecium), etcétera. Preferiblemente los polisacáridos son a partir de H. influenzae tipo B (Hib), y/o N. meningitidis grupos A, C, W135, y/o Y. Como se mencionó anteriormente, un problema asociado con el método de polisacárido a la vacunación, es el hecho de que los polisacáridos per se son escasamente inmunógenos. Para superar esto, los polisacáridos pueden conjugarse a proteínas vehículo, las cuales se proveen a la célula T auxiliar circunstante. Se prefiere, por lo tanto, que los polisacáridos utilizados en la invención estén asociados a dicha proteína vehículo. Los ejemplos de dichos vehículos que son actualmente utilizados de manera común para la producción de inmunógenos de polisacáridos incluyen los toxoides de difteria y del tétanos (DT, DT CRM197, otros mutantes DT, por ejemplo posisicón-148, etc. [véase, por ejemplo, EUA 4, 709, 017, WO93/25210, W095/33481 , etc.] y TT (y fragmento C de TT) respectivamente), Hemocianina de la Lapa Keyhole (KLH), OMPC a partir de N. meningitidis, y la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD). Otro vehículo para las composiciones inmunogónicas basadas en polisacárido (o vacunas) es la proteína D a partir de Haemophilus influenzae (EP 594610-B), o fragmentos de la misma. Los fragmentos adecuados para uso incluyen los fragmentos que abarcan los epítopes auxiliares T. En particular un fragmento de proteína D preferiblemente contendrá 1/3 del N-terminal de la proteína. El polisacárido puede estar asociado a la proteína vehículo mediante cualquier método conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de E.U.A. 4, 372, 945 y por Armor et al., Patente de E.U.A. 4, 474, 757). Preferiblemente, se lleva a cabo la conjugación CDAP (WO 95/08348). Para mejorar la inmunogenicidad, los polisacáridos pueden ser ajustados a tamaño (depolimerizados), unidos a adyuvante, liofilizados, o conjugados a diferentes proteínas vehículo.

Adyuvantes TH1 de la invención Las vacunas de la presente invención preferiblemente están asociadas a adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilatada, o azúcares acilatados, polisacáridos derivados catíónicamente o aniónicamente, o polifosfazenos. Se prefiere que el adyuvante se seleccione a partir de un inductor preferencial de un tipo de respuesta TH1. Dichos altos niveles de citoquinas tipo Th1 tienen a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por la célula a un antígeno dado, mientras que elevados niveles de citoquinas tipo Th2 tienen a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales al antígeno.

Es importante recordar que la distinción de la respuesta inmune tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad un individuo mantendrá una respuesta inmune que se describe como que es predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo descrito en las clonas de célula T CD4 +ve de murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-? e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente están asociadas de manera directa con la inducción de las respuestas inmunes tipo Th1 que no se producen por las células T, tal como IL-2. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la secreción de II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente de Th1 incluyen: Monofosforil lípido A o un derivado del mismo, particularmente 3-de-O-acilado monofosforil lípido A (3D-MPL) (para esta preparación véase GB 2220211 A); y una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente 3-de-O-acilado monofosforil lípido A, junto con ya sea una sal de aluminio (por ejemplo fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite-en-agua. En dichas combinaciones, el antígeno y el 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, permitiendo una administración más eficiente de las señales antigénicas e inmunoestimulantes. Los estudios han mostrado que 3D-MPL es capaz de mejorar adicionalmente la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido a alumbre [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454-B1]. Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en WO 94/00153, o una composición que produce menos reacción en donde la QS21 se elimina con colesterol como se describe en WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica a QS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210, y es una formulación preferida. Preferiblemente la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (WO 95/17210). La presente invención también provee un método para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL. Los oligonucleótidos no metilados que contienen CpG (WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para uso en la presente invención. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee una vacuna como se describe en la presente invención para uso en medicina. En una modalidad hay un método para prevenir o mejorar neumonía en una humano anciano que comprende administrar una cantidad segura y efectiva de una vacuna de la invención, y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho paciente anciano. En una modalidad adicional se provee un método para prevenir o mejorar otitis media en infantes (de hasta 24 meses de edad) o niños (típicamente de 24 meses de edad a 5 años de edad), que comprende administrar una cantidad segura y efectiva de una vacuna que comprende proteínas de Streptococcus pneumoniae de la invención y opcionalmente un adyuvante Th1 , a dicho infante o niño.

Preparaciones de vacuna para la invención Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden ser utilizadas para proteger o tratar a un mamífero (preferiblemente un paciente humano) susceptible a la infección, por medio de la administración de dicha vacuna via una ruta sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección vía las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradermal o subcutánea; o vía administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de vacunas para el tratamiento de neumonía o de otitis media (un transporte nasofaríngeo de neumococos puede ser prevenido de manera más efectiva, por lo tanto atenuado la infección en sus primeras etapas). Aunque la vacuna de la invención puede ser administrada como una sola dosis, los componentes de la misma también pueden ser co-administrados juntos al mismo tiempo o en tiempos diferentes (por ejemplo los polisacáridos neumococales podrían ser administrados separadamente al mismo tiempo o 1 -2 semanas después de la administración del componente de proteína bacteriana de la vacuna para una coordinación óptima de las respuestas inmunes entre sí). Además de una sola ruta de administración, se pueden utilizar 2 rutas diferentes de administración. Por ejemplo, cualesquiera antígenos virales pueden ser administrados ID (intradermal), mientras que las proteínas bacterianas pueden ser administradas IM (intramuscular) o IN (intranasal). Si los polisacáridos están presentes, éstos pueden ser administrados IM (o ID) y las proteínas bacterianas pueden ser administradas IN (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden ser administradas IM para dosis de cebado e IN para dosis de refuerzo. La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos laterales significativos, adversos en las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1-100 g, preferiblemente 5-50 µg, más típicamente en el intervalo de 0.1 -10 µg, de los cuales 1 a 5 µg es el intervalo más preferible. Cantidades óptimas de los componentes para una vacuna particular pueden ser comprobados por estudios estándares que implican observación de las respuestas inmunes apropiadas en los sujetos. Siguiendo a una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas. Típicamente una vacuna comprenderá un antígeno (proteínas), un adyuvante, y excipientes o un vehículo farmacéuticamente aceptable. La preparación de vacuna generalmente se describe en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, Patente de E.U.A. 4, 235, 877. A pesar de que las vacunas de la presente invención pueden ser administradas por cualquier ruta, la administración de las vacunas descritas dentro de la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana comprende una cutícula "dura" externa, denominada el estrato córneo, la cual se sobrepone a la epidermis. Por debajo de esta epidermis está una capa denominada la dermis, la cual a su vez se sobrepone al tejido subcutáneo. Los investigadores han mostrado que la inyección de una vacuna dentro de la piel, y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmune, la cual también puede estar asociada con varias ventajas adicionales. La vacunación intradermal con las vacunas descritas aquí forma una característica preferida de la presente invención. La técnica convencional de inyección intradermal, el "procedimiento mantoux", comprende pasos de limpieza de la piel, y luego estiramiento con una mano, y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26-31 ) mirando hacia arriba, la aguja se inserta en un ángulo de entre 10-15 °. Una vez que el bisel de la aguja está insertado, la punta de la aguja se baja y se avanza adicionalmente mientras que se provee una ligera presión para elevarlo bajo la piel. El líquido se inyecta entonces muy lentamente por lo tanto formando una ampolla o protuberancia en la superficie de la piel, seguido por el retiro lento de la aguja. Más recientemente, han sido descritos los dispositivos que han sido diseñados específicamente para administrar agentes líquidos dentro de o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en WO 99/34850 y EP 1092444, también el dispositivo para inyección a chorro descrito por ejemplo en WO 01/13977; EUA 5, 480,381 , EUA 5, 599,302, EUA 5, 334, 144, EUA 5, 993, 412, EUA 5, 649, 912, EUA 5, 569, 189, EUA 5, 704, 91 1 , EUA 5, 383, 851 , EUA 5, 893, 397, EUA 5, 466, 220, EUA 5, 339, 163, EUA 5, 312, 335, EUA 5, 503, 627, EUA 5, 064, 413, EUA 5, 520, 639, EUA 4, 596, 556, EUA 4, 790, 824, EUA 4, 941 , 880, EUA 4, 940, 460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradermal de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivo diseñados para administración balística de vacunas sólidas (WO 99/27961 ), o parches transdermales (WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicadas a la superficie de la piel (administración transdermal o transcutánea WO 98/20734; WO 98/28037). Cuando las vacunas de la presente invención se van a administrar a la piel, o más específicamente dentro de la dermis, la vacuna está en un volumen pequeño de líquido, particularmente un volumen de entre aproximadamente 0.05 mi y 0.2 mi. El contenido de antlgenos en las vacunas para la piel o intradermales de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales como se encuentra en las vacunas intramusculares. Por consiguiente, los antígenos de proteína presentes en las vacunas intradermales pueden estar en el intervalo de 1 -100 preferiblemente de 5-50 Similarmente, si está presente, la cantidad de antígeno de polisacárido conjugado en cada dosis de vacuna generalmente se espera que comprenda de 0.1-100 µg de polisacárido, preferiblemente de 0.1-50 µ9, preferiblemente de 0.1-10 µ9, y puede estar entre 1 y 5 µg. Sin embargo, es una característica de las vacunas para la piel o intradermales que las formulaciones puedan ser de "dosis baja". Por consiguiente, los antígenos de proteína en las vacunas de "dosis baja" preferiblemente están presentes en tan poco como 0.1 a 10 µ?, preferiblemente 0.1 a 5 9 por dosis; y si están presentes, los antlgenos de polisacárido conjugado pueden estar presentes en el intervalo de 0.01-1 µ9, y preferiblemente entre 0.01 a 0.5 g de polisacárido por dosis. Como se utiliza en la presente invención, el término "administración intradermal" significa administración de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente estará localizada exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel localizada entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.0 mm a partir de la superficie en la piel de humano, pero hay una cierta cantidad de variación entre los individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis al localizarse a 1.5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea por debajo de ésta. Dependiendo del modo de administración, la vacuna puede localizarse finalmente solamente o principalmente dentro de la dermis, o puede ser distribuida finalmente dentro de la epidermis y la dermis. En otro aspecto de la invención, la presente invención puede contener ADN que codifica una o más proteínas de S. penumoniae, de manera que la proteína se genera in situ. El ADN puede estar presente en cualesquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión bacterianos y virales. Numerosas técnicas de administración de genes se conocen bien en la técnica, tales como aquellas descritas por Rolland, (Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 5: 143-198, 1998) y referencias citadas en la presente invención. Los sistemas apropiados de expresión de ácido nucleico contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor adecuado y una señal de terminación). Cuando el sistema de expresión es un organismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria, el gen de interés puede ser insertado dentro del genoma de un virus o bacteria recombinante viva. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo llevará a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias utilizadas para este propósito son por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela, difteria), virus alfa (virus Sindbis, Virus Semliki Forest, Virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adeno-asociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus zooster de la varicela, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o pueden estar atenuados en varias formas con el objeto de obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas también forman parte de la invención. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee un método de elaboración de una formulación de vacuna como se describe en la presente invención, en donde el método comprende mezclar una combinación de proteínas de conformidad con la invención. Preferiblemente las composiciones antigónicas (y vacunas) que contienen polisacáridos descritos anteriormente en la presente invención están liofilizadas hasta que están listas para ser utilizadas, punto en el cual son reconstituidas extemporáneamente con diluyente. Más preferiblemente éstas son liofilizadas en la presencia de 3D-MPL, y son reconstituidas extemporáneamente con solución salina. La liofilízación de las vacunas se conoce bien en la técnica. Típicamente la vacuna líquida se seca mediante congelación en la presencia de un agente anti-formador de plasta por ejemplo azúcares tales como sacarosa o lactosa (presentes a una concentración inicial de 10-200 mg/mL). La liofilízación ocurre típicamente durante una serie de pasos, por ejemplo un ciclo inicial a -69°C, gradualmente se ajusta a -24°C durante 3 horas, luego se retiene esta temperatura por 18 horas, y luego gradualmente se ajusta a -16°C durante 1 hora, luego se retiene esta temperatura por 6 horas, y luego gradualmente se ajusta a + 34 °C durante 3 horas, y finalmente se retiene esta temperatura durante 9 horas. Las composiciones inmunogónicas y vacunas de la invención pueden ser evaluadas en varios modelos animales o con suero de humano. Como una ilustración, los siguientes modelos animales pueden ser utilizados para evaluar infección neumococal. Ratones C3H/Hej (de 6 a 8 semanas de edad) pueden ser inmunizados s.c. con 15 µg de protelna asociada a adyuvante con 50 µ? de CFA, seguido 3-4 semanas después por refuerzo con 15 µ9 de proteína con IFA. Para demostrar protección pasiva y activa a partir de la infección sistémica, a los ratones se les puede administrar intraperitonealmente con suero inmune o proteínas antes de la prueba por infección intraperitoneal con 15 a 90 LD50 de neumococos a la semana 8-10. Adicionalmente, las proteínas se pueden evaluar en un modelo de ratón de colonización en nasofaringe por (Wu et al Microbial Pathogenesis 1997; 23: 127-137). Además de los ratones, las crías de rata son susceptibles a colonización e infección por S. pneumoniae. En los estudios de protección pasiva, la administración del suero inmune de ratón (100 ul i.p. o 10 ul i.n.) puede realizarse antes de la prueba con administración intranasal de S. penumoniae (10 ul) en crías de rata de 2-5 días de edad. La colonización se puede determinar por sembrado de lavados nasales (20-40 ul instilados, 10 ul retirados). Las interacciones favorables entre los componentes de proteína de la vacuna de combinación pueden mostrarse mediante la administración de una dosis de cada proteína en la vacuna la cual podría ser sub-protectora en una vacuna monovalente. La eficiencia protectora incrementada de la vacuna de combinación en comparación con las vacunas monovalentes puede ser atribuida a una interacción favorable entre los componentes. La invención se ilustra en los ejemplos anexos. Los ejemplos se llevan a cabo utilizando técnicas estándares, las cuales se conocen bien y son de rutina para aquellos expertos en la técnica, excepto cuando se describa de otra manera en detalle. Se pretende que los ejemplos ilustren, pero no limiten la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción v expresión de antígenos NR1xR2 CbpA es una proteína expuesta de superficie de 75 kDa que consiste de varios dominios. El dominio N-terminal comprende dos repetidos altamente conservados (R1 y R2) y el dominio C-terminal comprende 10 secuencias en tándem, repetitivas directas de 20 aminoácidos. Un truncado CbpA se preparó para producir NR1 R2, por ejemplo, sin el dominio de unión a colina. El gen NR1xR2 se amplificó, mediante PCR, a partir del ADN obtenido a partir del serotipo 4 de la cepa de S. pneumoniae (véase, por ejemplo, WO 97/41157, o WO 99/51266). El PCR se llevó a cabo con el sistema de PCR Expand High Fidelity, o Hi-Fi (Roche). Está compuesto de una mezcla que contiene polimerasa Taq y una polimerasa de prueba de lectura. Debido a la actividad inherente de prueba de lectura de la exonucleasa 3'-5', el uso de Hi-Fi resulta en una fidelidad incrementada en 3 veces la síntesis del ADN en comparación con la polimerasa Taq. Los fragmentos de PCR se clonaron dentro del vector pGEM-T a partir de pGEM-T Vector Systems (Promega). Este paso se necesita para facilitar la digestión por enzima de restricción del fragmento de PCR para ligación futura. El vector pGEM-T se provee de manera lineal y contiene sobrantes T hacia 3'. Estos sobrantes facilitan la inserción de los productos de PCR generados por polimerasas termoestables que añaden una desoxiadenosina particular, de manera independiente del molde, a los extremos 3' del fragmento amplificado. Los fragmentos y vectores se purificaron después de las digestiones enzimáticas (digestiones Ndel y Xbal) de conformidad con el articulo de Berone-Parsons et al. (Nucleic Acids Research, 23, 4926-4927, 1995). La rebana de agarosa se liofilizó completamente durante 3-4 horas. Se añadió una solución 1 :1 de etanol-TE al gel liofilizado. La muestra se mezcló suavemente por 1 hora, la agarosa se comprimió y se removió completamente mediante centrifugación. El ADN se recuperó a partir del eluído mediante precipitación con etanol. El ADN que codifica NR1xR2 se clonó dentro de un vector que contiene al promotor largo L a partir del fago ?. La proteína de interés pudo ser inducida mediante calor cuando estuvo presente en una cepa AR 58 de coli, o mediante ácido nalidíxico en la cepa AR 120 de E. coli. Un precultivo de las bacterias se realizó durante toda la noche a 30°C. Este precultivo se diluyó aproximadamente 40 veces en un volumen total de 20 mi y se puso a 30°C hasta una D.O. de 0.4-0.6. Luego, se realizó la inducción por calor a 42°C. Las muestras se tomaron en diferentes puntos de tiempo. Un mi del cultivo se centrifugó 5 minutos a 7000 rpm. El sobrenadante de cultivo se conservó a -20°C y el concentrado (extracto total) se resuspendió en 500 µ? del regulador de pH para muestra (análisis Western blot o SDS-PAGE), o en 500 µ? del regulador de pH para lisis y se incubó 30 minutos a 37°C (ELISA). La composición del regulador de pH para lisis es: SDS 0.1 %, Deoxicolato 0.1 %, citrato de Na: 0.015 M. Las muestra se corrieron en un SDS-PAGE, se cargaron sobre un gel al 4-20% (Novex, Invitrogen). La migración se realizó a 200 V. Se llevó a cabo la tinción con azul Coomassie. Las muestras se cargaron sobre un gel al 4-20% (Novex, Invitrogen) para Western blot. La migración se realizó a 200 V. El gel se transfirió sobre nitrocelulosa y los puntos se revelaron con anticuerpos policlonales de conejo <x-NR1XR2 (primer anticuerpo) y un anticuerpo a-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (segundo anticuerpo). Una banda de aproximadamente 55 kDa se observó mediante análisis de SDS-PAGE. Una clona, 28B2, se eligió con base en el análisis de SDS-PAGE y se transfirió para fermentación. Esta clona se secuenció y su secuencia se confirmó (aminoácidos 39 (por ejemplo, después de la secuencia señal) a 446 = 406 aminoácidos). La solubilidad de NR1XR2 también se estudió, después de la lisis de las bacterias inducidas durante toda la noche, seguido por centrifugación. Se llevaron a cabo un análisis SDS-PAGE y una prueba de ELISA. NR1XR2 pareció recuperarse principalmente (> 95%) en la fracción soluble.

R1xR2. PhtD. SP91. (N)R1xR2-Sp91 rdominio C-terminall. v Plv Estos genes también fueron clonados, secuenciados y expresado de manera similar a NR1xR2. R1xR2 contiene los aminoácidos 177 a 443 de CbpA (del serotipo 4N de S. penumoniae), PhtD contiene los 21 aminoácidos (por ejemplo, después de la secuencia señal) en el extremo (aminoácido 839 del serotipo 4N de S. pneumoniae), Sp91 inicia en el aminoácido 20 (VAA) hasta el fin. Para las proteínas de fusión, R1xR2-Sp91Cterm contiene los aminoácidos 177-446 de CbpA y los 271 aminoácidos hasta la señal de paro de la traducción; NR1xR2-Sp91Cterm contiene los aminoácidos 39-446 de CbpA y los 271 aminoácidos hasta la señal de paro de la traducción. Para ambas proteínas de fusión, se encontraron 2 aminoácidos adicionales (GS) entre las secuencias (N)R1xR2 y Sp91 Cterm. Para todas las construcciones, se introdujo una ATG hacia 5' del inicio del gene para permitir la transcripción y traducción, lo cual significa que hubo una metionina N-terminal adicional enfrente de cada secuencia anteriormente mencionada.

EJEMPLO 2 Seroloqía Utilizando el suero a partir de estudios clínicos, se midieron los ELISAs a partir de la respuesta del anticuerpo que se desarrolló de manera natural a las proteínas de S. pneumoniae. 2.1 Procedimiento experimental • Muestras de suero Suero apareado de infantes recolectado cuando los infantes tuvieron de 2 a 4 meses de edad y de 6 a 12 meses de edad, respectivamente (N = 20, estudios DTPa HBV). Suero de adultos de -20 años de edad (N = 50). Suero de adultos de > 65 años de edad (N = 140).

• Procedimientos de ELISA Las inmunoplacas se revistieron durante toda la noche a 4°C con 1 µ9/??? de cada proteína. Diluciones seriales duplicadas de suero (iniciando a una dilución de 1/10) fueron incubadas posteriormente por 1 hora a temperatura ambiente (RT) bajo agitación. La inmuno-detección se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-lgG de humano acoplado a peroxidasa (Strateck, HP6043) diluido 4000 veces e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación. Después de la revelación, los títulos de punto medio se calcularon mediante SoftMaxPro. Los sueros con los títulos > 10 fueron considerados como positivos. A partir del cálculo de la media geométrica, un título de 5 (la mitad del límite) se atribuyó arbitrariamente al suero negativo. Las concentraciones de IgG expresadas como µ9/?t?? se establecieron mediante la comparación de las densidades ópticas de la muestra (DO) a la curva de DO de la IgG de chromopure (Jackson) atrapada en la placa por los anticuerpos policlonales de cabra anti-lgG de humano y revelada mediante el mismo anticuerpo marcado con peroxidasa como se mencionó anteriormente. 2.2 Resultados 2.2.1 Serología de protelna de Stmptococcus en infantes Los mayores títulos de anticuerpo y las relaciones de seropositividad que se midieron en el suero de infantes de 2 a 4 meses de edad se obtuvieron con PhtD, PsaA, SP128, NR1xR2 y en menor grado, con SP91 y PIy. No se detectó ninguna respuesta o se detectaron respuestas bajas a Sp101 y Sp130. SP46 y PhtA no se evaluaron (asunto de disponibilidad de material). Las respuestas de los anticuerpos generalmente disminuyeron en el suero recolectado de los mismos sujetos cuando éstos tuvieron de 6 a 12 meses de edad, sugiriendo que los títulos altos se debieron principalmente a anticuerpos maternos pasivamente transferidos. Sin embargo, en ciertos infantes, la respuesta inmune a algunas proteínas de incremento con la edad, probablemente como una consecuencia de la exposición natural a los neumococos. El antígeno involucrado principalmente para esta seroconversión fue claramente PsaA. Dependiendo del sujeto, también se mostraron los aumentos de los niveles de anticuerpo a PhtD, NR1xR2, Sp128, Sp91 y PIy. Solamente se observó una variación marginal en la respuesta humoral a Sp101 y Sp139. (Véase figuras 1 y 2) 2.2.2 Seroloqfa de la proteína de Streptococcus en adultos jóvenes De conformidad con los títulos de la media geométrica, PhtD, PhtA y NR1xR2 son las proteínas más inmunogénicas en la población de adultos jóvenes evaluada, seguidas posteriormente por Sp128, Ply y Ap91. Todos los sujetos tuvieron anticuerpos detectables a estas proteínas. Las respuestas menores se midieron para Sp46, y especialmente para Sp130 y Sp101. PsaA no fue evaluada (no hubo suficiente suero disponible). (Véase figuras 3 y 4) 2.2.3 Seroloqla de proteína de Streptococcus en adultos ancianos Hubo una disminución clara de los niveles de anticuerpo a las proteínas de Streptococcus en los humanos ancianos en comparación con adultos jóvenes. En la gente de edad avanzada, el mejor inmunógeno es PhtD, seguido por Sp128, NR1xR2, Sp91 , Ply y PsaA. Solamente se midieron respuestas marginales para Sp101 y Sp130. Sp46 y PhtA no se evaluaron (asunto de disponibilidad de material). (Véase figuras 5 y 6) CUADRO 1 Media geométrica de concentraciones de IgG (GMC), expresadas como ug/ml. en gente anciana Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitadas a las patentes y solicitudes de patente, citadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia como si cada publicación individual estuviera indicada específica e individualmente a ser incorporada como referencia aquí como si se estableciera completamente. Mientras que las modalidades preferidas de la invención se ilustran por lo anteriormente expuesto, se entiende que la invención no se limita a las instrucciones precisas descritas en la presente invención y que se reserva el derecho a todas las modificaciones que surgen del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica que comprende al menos 2 proteínas de S. pneumoniae en donde una de las proteínas se selecciona a partir de la familia tríada de polihistidina (PhtX) y otra proteína se selecciona a partir del grupo que consiste de familia de Proteína de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, familia LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas truncado de CbpX-truncado de LytX, neumolisina (PIy), PspA, PsaA, Sp128, Sp101 , Sp130, Sp125 y Sp133.

2. - Una composición inmunogénica que comprende al menos 2 proteínas de S. pneumoniae en donde una de las proteínas se selecciona a partir del grupo que consiste de familia de Proteína de Unión a Colina (CbpX), truncados de CbpX, y proteínas quiméricas truncado de CbpX-truncado de LytX y otra proteína se selecciona a partir del grupo que consiste de familia tríada de polihistidina (PhtX), LytC, neumolisina (PIy), PsaA ySp 28.

3. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1-2, caracterizada además porque PhtX es PhtA, PhtB o PhtD.

4. - La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque CbpX es CbpA o PspC.

5. - La composición ¡nmunogónica de conformidad con las reivindicaciones 1 -4, caracterizada además porque comprende un adyuvante.

6. - Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación 5.

7.- El uso de la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-5 para preparar una vacuna para producir una respuesta inmune en un mamífero.

8. - El uso de una vacuna como al que se reclama en la reivindicación 6, en la elaboración de un medicamento para prevención de neumonía en pacientes mayores de 55 años de edad.

9. - El uso de la vacuna de la reivindicación 6 en la elaboración de un medicamento para prevenir o mejorar Otitis media en infantes.

10. - Un método para elaborar una vacuna de la reivindicación 6, caracterizado porque comprende los pasos de: seleccionar y aislar dos proteínas diferentes de S. pneumoniae; y mezclar dichas proteínas juntas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.