KR20150058571A - 면역원성 조성물 - Google Patents

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KR20150058571A
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빈센트 베르랜트
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 26μg-45μg의 뉴몰리신 및/또는 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물, 면역원성 조성물을 포함하는 백신 및 의약에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITION}
본 발명은 개선된 면역원성 조성물 및 백신, 및 의약품에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 인간 용량 당 26-46μg의 뉴몰리신 및/또는 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
폐렴구균으로도 또한 공지된 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)(에스. 뉴모니애)는 그램-양성 박테리아다. 에스. 뉴모니애는 전세계 모두에서 주요한 공중 보건 문제이며, 특히 영아, 노인 및 면역손상된 사람에서 상당한 이환률 및 사망률의 원인이다. 에스. 뉴모니애는 지역사회 획득 폐렴, 급성 부비동염(acute sinusitis), 중이염(otitis media), 수막염(meningitis), 세균혈증(bacteremia), 패혈증(septicemia), 골수염(osteomyelitis), 패혈성 관절염(septic arthritis), 심장내막염(endocarditis), 복막염(peritonitis), 심장막염(pericarditis), 연조직염(cellulitis), 및 뇌농양(brain abscess)을 포함하는 광범위한 중요 인간 병리를 야기시킨다. 에스. 뉴모니애는 미국에서만 매년 3,000 병증의 수막염, 50,000 병증의 세균혈증, 500,000 병증의 폐렴, 및 7,000,000 병증의 중이염에서 병원체인 것으로 추정된다 (Reichler, M. R. et al., 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346; Stool, S. E. and Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11). 폐렴구균 질병으로 인한 사망률은 선진국 및 개발도상국 둘 모두에서 5세보다 어린 연령의 소아에서 특히 높다. 노인, 면역손상 및 다른 내재성 질환(당뇨병, 천식)을 갖는 환자가 또한 상기 질병에 특히 민감하다.
에스. 뉴모니애에 의해 야기되는 주요 임상 증상은 널리 인지되어 있고, 모든 표준 의학 교과서에 논의되어 있다(Fedson D S, Muscher D M. In: Plotkin S A, Orenstein W A, editors. Vaccines. 4rth edition. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588). 예를 들어, 침습성 폐렴구균 질병(invasive pneumococcal disease, IPD)은 에스. 뉴모니애가 혈액 또는 또 다른 일반적으로 무균인 부위로부터 분리되는 임의의 감염으로 정의된다 (Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious diseases (5th ed). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147).
만성 폐쇄성 폐질환(Chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)은 폐의 만성 염증성 질병이며, 이는 전세계적인 이환률 및 사망률의 주요 원인이다. 미국에서 2005년에 20명당 약 1명의 사망이 COPD를 선행 원인으로 가졌다(Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). 2020년에, COPD는 장애보정손실년수(disability adjusted life years), 즉 만성 무효화 질병의 다섯 번째의 주요 원인이 될 것이며, 세 번째로 가장 중요한 사망률의 원인이 될 것으로 예측된다(Lancet 349:1498-1504 (1997)).
비록 항균성 약물의 출현이 폐렴구균 질환으로부터의 전체적인 사망률을 감소시켰으나, 에스. 뉴모니애의 항생제 내성 균주의 출현은 빠르게 증가하는 심각한 문제이다. 따라서, 에스. 뉴모니애에 유효한 백신이 개발되는 것이 중요하다. 유효한 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니애 질환과 관련된 이환률 및 사망률에 큰 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 인간 용량 당 26-45μg의 뉴몰리신 또는 PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 D)을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 뉴몰리신 및/또는 PhtD가 균주로부터 유래된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류와 함께 공동-투여될 때 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주에 대한 항체-매개된 옵소닌 활성을 향상시킬 수 있음을 발견하였고, 즉 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류와 높은 수준의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질의 공동-투여는 당류가 유래되는 균주에 대해 생성되는 항체-매개된 옵소닌 활성에서의 증가를 발생시킨다. 본 발명자들은 또한 저 용량의 뉴몰리신 및/또는 PhtD를 포함하는 조성물이 투여될 때보다 26-45μg의 뉴몰리신 및/또는 PhtD를 포함하는 조성물이 투여될 때 이러한 효과가 더 높음을 발견하였다. 더욱이 본 발명자들은 이러한 고 용량의 뉴몰리신 및/또는 PhtD는 더 높은 용량의 항원이 투여될 때 예상될 수 있는 통계적으로 현저하게 증가된 반응성과 관련이 없음을 발견하였다.
폐렴구균의 당류와 단백질 간의 양성 상호작용이 이전에 입증되긴 했으나 (예를 들어 WO02/22167호) WO02/22167호는 면역계의 세포 매개 지점 및 면역계의 체액 지점을 동시에 자극함에 의해 얻어진 결과를 의미한다. WO02/22167호에서의 효과는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 균주에 대한 항체-매개된 옵소닌 활성을 향상시키지 않을 것이고, 옵소닌식작용(면역원성 조성물)(OPA) 검정을 이용하여 측정되는 향상된 항체-매개된 옵소닌 활성에 반영되지 않을 것이다. 이는 OPA 검정 (실시예 2에 기재된 바와 같음)을 이용하여 측정된 옵소닌 활성이 세포 매개된 면역계의 구성요소의 부재하에 측정되기 때문이다.
간략 개요
본 발명자들의 놀랍게도 26-45μg의 뉴몰리신 및/또는 PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 D)를 포함하는 면역원성 조성물이 낮은 용량의 뉴몰리신 및/또는 Phtd를 갖는 조성물보다 훨씬 더 반응원성이 아니고, 뉴몰리신 및/또는 PhtD가 그 균주로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류와 함께 공동-투여될 때 높은 (26-45μg) 용량이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주에 대해 항체 매개된 옵소닌 활성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
따라서 첫 번째 양태에서, 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
두 번째 양태에서, 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
세 번째 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신이 제공된다.
네 번째 양태에서, 면역보호 용량의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환에 대해 인간 숙주를 면역시키는 방법이 제공된다.
다섯 번째 양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다.
여섯 번째 양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도가 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 10μg 탈독화 뉴몰리신 (Ply-10), 30μg 탈독화 뉴몰리신 (Ply-30), 10μg의 탈독화 뉴몰리신 및 10μg의 PhtD (PlPh-10), 30μg의 탈독화 뉴몰리신 및 30μg의 PhtD (PlPh-3), 10μg 탈독화 뉴몰리신 및 10μg의 PhtD와 조합된 10개 폐렴구균의 컨쥬게이트를 포함하는 백신 (10vPP10), 30μg 탈독화 뉴몰리신 및 30μg의 PhtD와 조합된 10개 폐렴구균의 컨쥬게이트를 포함하는 백신 (10vPP30), 및 23개 컨쥬게이션되지 않은 폐렴구균의 당류를 포함하는 백신으로 면역화 후 성인에서 ELISA 검정에 따른 항-dPly 항체 역가를 도시하는 막대 차트. 흰색 막대는 면역화 이전의 면역원성을 나타내고, 회색 막대는 1회 용량의 백신 이후에 면역원성을 나타내고, 검정색 막대는 2회 용량의 백신 이후에 면역원성을 나타낸다.
도 2: 항-Ply 역가가 아닌 항-PhtD 역가를 도시하는 도 2와 유사한 막대 차트.
도 3: 10μg 탈독화 뉴몰리신 (Ply-10), 30μg 탈독화 뉴몰리신 (Ply-30), 10μg의 탈독화 뉴몰리신 및 10μg의 PhtD (PlPh-10), 30μg의 탈독화 뉴몰리신 및 30μg의 PhtD (PlPh-3), 10μg 탈독화 뉴몰리신 및 10μg의 PhtD와 조합된 10개 폐렴구균의 컨쥬게이트를 포함하는 백신 (10vPP10), 30μg 탈독화 뉴몰리신 및 30μg의 PhtD와 조합된 10개 폐렴구균의 컨쥬게이트를 포함하는 백신 (10vPP30), 및 23개 컨쥬게이션되지 않은 폐렴구균의 당류를 포함하는 백신으로 면역화 후 성인에서 옵소닌식작용 검정에 따른 항-PS1 옵소닌 항체 역가를 도시하는 막대 차트. 흰색 막대는 면역화 이전의 면역원성을 나타내고, 회색 막대는 1회 용량의 백신 이후에 면역원성을 나타내고, 검정색 막대는 2회 용량의 백신 이후에 면역원성을 나타낸다.
도 4: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS4 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 5: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS5 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 6: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS6B 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 7: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS7F 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 8: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS9V 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 9: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS14 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 10: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS18C 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 11: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS19F 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 12: 항-PS1 역가가 아닌 항-PS23F 역가를 도시하는 도 3과 유사한 막대 차트.
도 13: 서열 목록
도 14: 항-당류 ELISA 검정을 이용하여 마우스의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 12 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (12V) 및 10 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (10V)과 비교하는 그래프. GMC = 기하 평균 농도. IC = 신뢰 구간.
도 15: 옵소닌식작용 검정을 이용하여 마우스의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 12 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (12V) 및 10 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (10V)과 비교하는 그래프. GMT = 기하 평균 역가.
도 16: 항-단백질 ELISA 검정을 이용하여 마우스의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 PhtD, dPly 및 PE-PilA만을 포함하는 조성물 (prot)과 비교하는 그래프. GMC = 기하 평균 농도. IC = 신뢰 구간.
도 17: 옵소닌식작용 검정을 이용하여 기니아 피그의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 12 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (12V) 및 10 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (10V)과 비교하는 그래프. GMT = 기하 평균 역가.
도 18: 항-당류 ELISA를 이용하여 기니아 피그의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 12 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (12V) 및 10 당류 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (10V)과 비교하는 그래프. GMC= 기하 평균 농도. IC = 신뢰 구간.
도 19: 항-단백질 ELISA를 이용하여 기니아 피그의 주입 후에 측정하는 경우, 12 당류 컨쥬게이트, PhtD, dPly 및 PE-PilA를 포함하는 조성물 (12V + prot)의 면역원성을 PhtD, dPly 및 PE-PilA만을 포함하는 조성물 (prot)과 비교하는 그래프. GMC = 기하 평균 농도. IC = 신뢰 구간.
상세한 설명
첫 번째 양태에서, 본 발명은 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 27μg-39μg, 27μg-37μg, 28μg-35μg, 29μg-33μg 또는 약 30μg)의 뉴몰리신을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 뉴몰리신은 화학적으로 탈독화되었다. 추가의 구체예에서 뉴몰리신은 유전적으로 탈독화되었다. 한 구체예에서 조성물은 PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 D)를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서 조성물은 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 27μg-39μg, 27μg-37μg, 28μg-35μg, 29μg-33μg 또는 약 30μg)의 탈독화 PhtD를 포함한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 인간 용량 당 26μg-45μg (26μg-40μg, 27μg-39μg, 27μg-37μg, 28μg-35μg, 29μg-33μg 또는 약 30μg)의 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 PhtD는 WO00/37105호 (본원에 참조로서 포함됨)의 SEQ ID NO:4의 아미노산 21-838에 있는 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다 (WO00/37105호의 SEQ ID NO:4의 아미노산 21-828은 본 출원의 도 13의 SEQ ID NO:1의 서열을 갖는다). 추가의 구체예에서 조성물은 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서 조성물은 인간 용량 당 26μg-45μg (26μg-40μg, 27μg-39μg, 27μg-37μg, 28μg-35μg, 29μg-33μg 또는 약 30μg)의 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 포함한다.
뉴몰리신
뉴몰리신, 또는 "Ply"은 폐렴구균으로부터의 천연 또는 야생형 뉴몰리신, 재조합 뉴몰리신, 및 이의 단편 및/또는 변이체를 의미한다. 구체예에서, 뉴몰리신은 폐렴구균으로부터의 천연 또는 야생형 뉴몰리신 또는 재조합 뉴몰리신이다.
Ply는 53 kDa 포어-형성 독소이고 이를테면 다수의 포유동물 세포 유형에 용해 효과를 지니며, 아용해(sublytic) 농도에서 Ply는 항뉴몰리신 항체의 부재하에 보체 활성화 및 전-염증성 매개체의 유도를 포함하는 다수의 다른 효과를 갖는다 (Hirst et al., 2000; Mitchell & Andrew, 1997; Paton et al., 1984; Zysk et al., 2001). 보체 활성화는 독소의 용혈 활성과 무관하다 (Berry et al., 1995). 뉴몰리신은 현재 Toll-유사 수용체 4 (TLR-4)와 직접 상호작용하여 골수 분화 마커 88을 통해 신호를 보내어 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨 6의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Malley et al., 2003; Trzcinski et al., 2008). 뉴몰리신은 혈청형 및 유전형과 무관하게 에스. 뉴모니애의 모든 공지된 임상 단리물에 의해 생성된다. 야생형 또는 천연 뉴몰리신의 발현 및 클로닝은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) and Mitchell et al (NAR, 18:4010 (1990))]을 참조하라. WO2010/071986호 (본원에서 참조로서 포함됨)는 야생형 Ply, 예컨대, SEQ ID: 2-42 (예를 들어 SEQ ID: 34, 35, 36, 37, 41)를 기재한다. 한 양태에서, 뉴몰리신은 WO2010/071986호의 SEQ ID NO:34이다. 또 다른 양태에서, 뉴몰리신은 WO2010/071986호의 SEQ ID NO:35이다. 또 다른 양태에서, 뉴몰리신은 WO2010/071986호의 SEQ ID NO:36이다. 또 다른 양태에서, 뉴몰리신은 WO2010/071986호의 SEQ ID NO:37이다. 또 다른 양태에서, 뉴몰리신은 WO2010/071986호의 SEQ ID NO:41이다. 더욱이, EP1601689B1호는 세척제 및 높은 염의 존재하에 크로마토그래피에 의해 폐렴구균의 뉴몰리신과 같은 박테리아 세포용해소를 정제하는 방법을 기재하고 있다.
구체예에서, 용어 '뉴몰리신'은 야생형 서열에 비해 핵산 또는 아미노산 서열에서의 차이를 갖는 뉴몰리신의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 뉴몰리신의 단편을 이용하는 경우, 이러한 단편은 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기의 길이일 것이다. 본 발명의 구체예에서, 뉴몰리신의 면역원성 단편은 전장 서열의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있다. 뉴몰리신은 4개의 주요 구조적 도메인으로 구성된다고 공지되어 있다 (Rossjohn et al. Cell. 1997 May 30; 89(5):685-92). 이러한 도메인은 이러한 도메인들 중 하나 이상을 제거하고/거나 변형시킴에 의해 변형될 수 있다. 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 정확히 또는 적어도 1, 2 또는 3개 도메인을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 정확히 또는 적어도 2 또는 3개 도메인을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 적어도 3개 도메인을 함유한다. 단편 또는 각 단편은 야생형 뉴몰리신 서열과 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% 넘게 또는 100% 동일할 수 있다.
본 발명에 따르면, 뉴몰리신의 변이체는 하나 이상의 아미노산이 야생형 서열에 비해 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입된 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 한 양태에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은, 변이체가 면역원성 폴리펩티드인 한, 단일한 변이체에서 조합될 수 있다. 뉴몰리신의 변이체는 전형적으로 야생형 뉴몰리신 서열, 예컨대 WO2010/071986호의 SEQ ID: 2-42 (예를 들어 SEQ ID: 34, 35, 36, 37, 41)와 적어도 80, 90, 94, 95, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 임의의 뉴몰리신 또는 뉴몰리신의 임의의 단편을 포함한다. 구체예에서, 뉴몰리신의 변이체는 전형적으로 WO2010/071986호의 SEQ ID: 36과 적어도 80, 90, 94, 95, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 임의의 뉴몰리신 또는 뉴몰리신의 임의의 단편을 포함한다. 구체예에서, 본 발명은 여러 아미노산, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개, 10개 이하, 20개 이하, 30개 이하 또는 50개 이하의 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 포함하는 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 그러한 에피토프는, PSIPRED 프로그램 (David Jones로부터, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK) 및 Jameson 및 Wolf에 의해 기재된 방법을 기초로 하여 계산된 항원성 지수 (CABIOS 4:181-186 [1988])를 이용하는 것과 같은, 2D-구조 에측의 조합을 이용하여 예측될 수 있다. 뉴몰리신의 변이체는 예를 들어 WO04/43376호, WO05/108580호, WO05/076696호, WO10/071986호, WO10/109325호 (모두는 본원에 참조로서 포함된다)(SEQ ID: 44, 45 및 46) 및 WO10/140119호 (본원에서 참조로서 포함됨) (SEQ ID: 50 및 51)에 기재되어 있다. 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 뉴몰리신의 변이체, 예를 들어, WO05/108580호, WO05/076696호, WO10/071986호에 기재된 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단편"은 숙주 동물에서 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 모이어티이다. 단백질의 단편은 당 분야에 공지된 기법을 이용하여, 예컨대 재조합적으로, 단백질분해에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 한 끝 (말단 단편의 경우) 또는 양 끝 (내부 단편의 경우)으로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함에 의해 생성될 수 있다. 전형적으로, 단편은 전장 서열의 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 단편은 N 및 C 말단의 어느 한쪽 또는 양쪽으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산을 첨가하거나 제거함에 의해 용이하게 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 그 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성, 또는 친수성에 영향이 거의 또는 전혀 없도록 하고, 면역원성의 감소를 발생시키지 않으면서, 천연 아미노산 잔기를 비-천연 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이는 하기 그룹 내에서의 치환일 수 있다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 폴리펩티드 서열에 대한 보존적 아미노산 변형 (및 엔코딩 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형)은 부모 폴리펩티드의 것과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결실"은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거이다. 전형적으로, 대략 1 내지 6개를 넘지 않는 잔기 (예컨대, 1 내지 4개 잔기)가 단백질 분자 내의 임의의 한 부위에서 결실된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "삽입"은 단백질 서열에서 하나 이상의 비-천연 아미노산 잔기의 첨가이다. 전형적으로, 대략 1 내지 6개를 넘지 않는 잔기 (예컨대, 1 내지 4개 잔기)가 단백질 분자 내의 임의의 한 부위에서 삽입된다.
본 발명의 구체예에서, 뉴몰리신 및 이의 단편 및/또는 이들의 변이체는 뉴몰리신에 대한 야생형 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열, 예컨대 WO2010/071986호로부터의 SEQ ID: 34, 35, 36, 37, 41을 갖는다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 뉴몰리신 및 이의 단편 및/또는 이들의 변이체는 뉴몰리신에 대한 야생형 서열의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.
뉴몰리신은 탈독화된 후에 (즉, 보호에 적합한 투여량으로 제공될 때 인간에 무독성이 되게 한다) 투여된다. 본원에서 사용되는 대로, 용어 "dPly"는 의료용에 적합한 탈독화 뉴몰리신 (즉, 무독성)인 것으로 이해된다. 뉴몰리신은 화학적으로 및/또는 유전적으로 탈독화될 수 있다. 뉴몰리신의 탈독화는 가교제, 예컨대 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 N-하이드록시숙시노미도 에스테르 및/또는 말레이미드기 (예컨대, GMBS)를 함유하는 가교 시약 또는 이들의 조합물을 이용하는 것과 같은, 화학적 수단에 의해 수행될 수 있다. 한 구체예에서 뉴몰리신은 포름알데히드로의 노출에 의해 탈독화된다. 그러한 방법은 다양한 독소에 대해 당 분야에 널리 알려져 있다; 예를 들어 EP1601689B1호, WO04/081515호, WO2006/032499호를 참조하라. 화학적 탈독화에 이용되는 뉴몰리신은 천연 또는 재조합 단백질 또는 이의 독성을 감소시키기 위해 유전적으로 공학처리된 단백질일 수 있다 (하기 참조). 뉴몰리신의 융합 단백질 또는 뉴몰리신의 단편 및/또는 변이체가 또한 화학적 수단에 의해 탈독화될 수 있다. 따라서, 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은, 예컨대, 포름알데히드 처리에 의해 화학적으로 탈독화된 뉴몰리신을 포함할 수 있다.
뉴몰리신은 또한 유전적으로 탈독화될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 돌연변이된 단백질일 수 있는 폐렴구균의 단백질을 포함한다. 용어 "돌연변이된"은, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발을 위한 널리 공지된 기법 또는 임의의 다른 통상적인 방법을 이용함에 의해, 하나 이상의 아미노산 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 아미노산)의 결실, 첨가 또는 치환을 겪은 분자를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 한 구체예에서, 분자는 1-15개, 적합하게는 10-15개 아미노산의 결실 또는 치환을 겪었다. 돌연변이된 서열은 막 투과, 세포 용해, 및 인간 적혈구 및 다른 세포에 대한 세포 용해 활성과 같은 요망되지 않는 활성을 제거하여, 인간에 투여 이후 항-뉴몰리신 보호 및/또는 중화 항체를 유도하는 능력을 보유하면서, 독성을 감소시킬 수 있다. 뉴몰리신의 융합 단백질 또는 뉴몰리신의 단편 및/또는 변이체는 또한 유전적 수단에 의해 탈독화될 수 있다. 이러한 임의의 변형은 표준 분자 생물학 및 생화학기법을 이용하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 대로, 돌연변이 뉴몰리신 단백질은 생물학적으로 비활성이면서 여전히 이의 면역원성 에피토프를 유지하도록 변경될 수 있다, 예를 들어, 문헌[WO90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) and WO99/03884]을 참조하라. 예를 들어, 뉴몰리신 단백질은 T65에서 C, G293에서 C 및 C248에서 A를 포함하는 3개의 아미노산 치환에 의해 탈독화될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 유전적으로 탈독화된 뉴몰리신의 또 다른 예는 WO2011/075823호 (본원에서 참조로서 포함됨)로부터의 SEQ ID: 9이다. 따라서, 추가의 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 유전적으로 탈독화된 뉴몰리신을 포함할 수 있다.
뉴몰리신을 탈독화하기 위해 기법들을 조합시켜 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물은 화학적으로 그리고 유전적으로 탈독화된 뉴몰리신을 포함할 수 있다.
PhtD
본원에서 사용되는 용어 "PhtD" (폴리 히스티딘 트라이애드 D)은 부착된 신호 서열을 갖는 전장 단백질 또는 제거된 신호 펩티드 (예를 들어 N-말단에 있는 20개 아미노산)를 갖는 성숙한 전장 단백질, 및 이들의 단편, 변이체 및/또는 융합 단백질, 예컨대 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4를 포함한다. PhtD는 "Sp036D"로도 불린다. 한 양태에서, PhtD는 부착된 신호 서열을 갖는 전장 단백질, 예컨대 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4이다. 또 다른 양태에서, PhtD는 제거된 신호 펩티드 (예를 들어 N-말단에 있는 20개 아미노산)를 갖는 성숙한 전장 단백질을 포함하는 서열, 예컨대 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4의 아미노산 21-838 (또는 본 출원의 SEQ ID NO:1)이다. 적합하게는, PhtD 서열은 N-말단 메티오닌을 포함한다. 본 발명은 또한 PhtD의 면역원성 단편, PhtD의 변이체 및/또는 PhtD의 융합 단백질인 PhtD 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, WO00/37105호, WO00/39299호, US6699703호 및 WO09/12588호에 기재되어 있다.
PhtD 단백질의 단편이 이용되는 경우 (별도로 또는 융합 단백질의 일부로서), 이러한 단편은 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4와 같은, 예컨대 WO00/37105호 또는 WO00/39299호의 PhtD 아미노산 서열로부터의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기의 길이일 것이다. 본 발명의 구체예에서, PhtD 단백질의 면역원성 단편은 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4에 제시된 서열의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들어 WO09/12601호, WO01/98334호 및 WO09/12588호에 기재된 PhtD의 단편을 포함한다. PhtD 단백질의 단편이 이용되는 경우 (별도로 또는 융합 단백질의 일부로서), 각 단편은 임의로 그러한 폴리펩티드의 하나 이상의 히스티딘 트라이애드 모티프(들)를 함유한다. 히스티딘 트라이애드 모티프는 서열 HxxHxH (SEQ ID NO:2)를 갖는 폴리펩티드의 부분이고 여기서 H는 히스티딘이고 x는 히스티딘 이외의 아미노산이다. 본 발명의 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 정확히 또는 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 히스티딘 트라이애드 모티프를 함유하고 (임의로, 2개 이상의 트라이애드 사이에 천연 PhtD 서열, 또는 트라이애드-내 서열을 지님) 여기서 단편은 천연 폐렴구균의 트라이애드-내 PhtD 서열 (예컨대, WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4에 제시된 트라이애드-내 서열)과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 넘게 동일하거나 100% 동일하다. PhtD 단백질의 단편은 임의로 그러한 폴리펩티드의 하나 이상의 코일드 코일 영역을 함유한다. 코일드 코일 영역은 "Coils" 알고리듬 (Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164)에 의해 예측되는 영역이다. 본 발명의 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 정확히 또는 적어도 2, 3 또는 4개의 코일드 코일 영역을 함유한다. 본 발명의 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 정확히 또는 적어도 2, 3 또는 4개의 코일드 코일 영역을 함유하고, 여기서 단편은 천연 폐렴구균의 PhtD 서열 (예컨대, WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4에 제시된 서열)과 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 98, 99% 넘게 동일하거나 100% 동일하다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 단편 또는 각 단편은 하나 이상의 히스티딘 트라이애드 모티프 뿐만 아니라 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 코일드 코일 영역을 포함한다.
PhtD 폴리펩티드가 변이체인 경우에, 변이는 일반적으로 히스티딘 트라이애드 잔기 및 코일드-코일 영역 이외의 이의 일부에 존재하고, 변이는 이러한 영역들 중 하나 이상에 만들어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 아미노산이 야생형 서열에 비해 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입된 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 한 양태에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 조합은, 변이체가 면역원성 폴리펩티드인 한, 단일한 변이체에서 조합될 수 있다. PhtD의 변이체는 통상적으로 WO00/37105호의 SEQ ID NO: 4와 같은 야생형 PhtD 서열과 적어도 80, 90, 95, 96, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 PhtD의 임의의 단편 또는 변이를 포함한다. 구체예에서, 본 발명은 여러 아미노산, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개, 10개 이하, 20개 이하, 30개 이하 또는 50개 이하의 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 포함하는 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 그러한 에피토프는, PSIPRED 프로그램 (David Jones로부터, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK) 및 Jameson 및 Wolf에 의해 기재된 방법을 기초로 하여 계산된 항원성 지수 (CABIOS 4:181-186 [1988])를 이용하는 것과 같은, 2D-구조 에측의 조합을 이용하여 예측될 수 있다. 변이체는 통상적인 분자 생물학 기법에 의해 생성될 수 있다. 본원에서 이용되는 변이체는 또한 상동인 PhtD 유전자 내의 하나 이상의 부위에서 다형성을 나타내는 대안적인 스트렙토코쿠스 균주로부터의 천연 발생 대립유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/37105호의 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 21 내지 838과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/37105호의 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 21 내지 838과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다. 적합하게는, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 N-말단 메티오닌을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/37105호의 SEQ ID NO:4에 제시된 서열의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개, 또는 적어도 약 400개 또는 적어도 약 800개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/39299호 (본원에서 참조로서 포함됨)의 아미노산 서열 SEQ ID NO:73과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/39299호의 아미노산 서열 SEQ ID NO:73과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, PhtD 및 이의 단편, 변이체 및/또는 이들의 융합 단백질은 WO00/39299호의 SEQ ID NO:73에 제시된 서열의 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 또는 적어도 약 60개, 또는 적어도 약 100개, 또는 적어도 약 200개, 또는 적어도 약 400개 또는 적어도 약 800개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, PhtD 서열은 WO2011/075823호로부터의 SEQ ID NO: 1 또는 5이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열을 포함하지 않는 방법으로 천연 발생 에스. 뉴모니애 폴리펩티드와 상이한 PhtD 단백질을 포함한다. 비-서열 변형은 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 카르복실화, 또는 글리코실화에서의 변화를 포함한다. 펩티드 안정성을 증가시키는 변형을 이용한 것들이 또한 본 발명 내에 있다; 그러한 유사체는, 예를 들어, 펩티드 서열에 하나 이상의 비-펩티드 결합 (펩티드 결합을 대신하는)을 함유할 수 있다. 천연 발생 L-아미노산 이외의 잔기, 예컨대, D-아미노산 또는 비-천연 발생 또는 합성 아미노산, 예컨대, β 또는 γ 아미노산, 및 사이클릭 유사체를 포함하는 유사체가 또한 본 발명 내에 있다.
투여량
본원에서 사용되는 용어 "인간 용량"은 인간에 사용하기 적합한 부피의 용량을 의미한다. 일반적으로 인간 환자에 투여되는 최종 용량 부피 (백신 조성물 부피)는 0.25 내지 1.5 ml, 0.2 내지 1.0 ml, 또는 0.4 내지 0.6 ml일 수 있다. 구체예에서, 인간 용량은 0.5 ml이다. 추가의 구체예에서, 인간 용량은 0.5 ml 초과, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 ml이다. 추가의 구체예에서, 인간 용량은 1 ml 내지 1.5 ml이다. 또 다른 구체예에서, 특히 면역원성 조성물이 소아 집단을 위한 것일 때, 인간 용량은 0.5 ml 미만, 예컨대 0.25 내지 0.5 ml일 수 있다.
추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 에스 . 뉴모니애 단백질
본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질을 포함할 수 있다. 본 출원의 목적을 위해 용어 에스. 뉴모니애 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 서로 교환가능하고 동등한 것으로 고려된다. 한 구체예에서 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질은 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 (PhtX), 콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX), CbpX 트렁케이트, LytX (자가용해 효소) 패밀리, LytX 트렁케이트, CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질, PcpA (폐렴구균의 콜린 결합 단백질 A), PspA (폐렴구균의 표면 단백질 A), PsaA (폐렴구균의 표면 부착 단백질 A), Sp128 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 128), Sp101(스트렙토코쿠스 뉴모니애 101), Sp130 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 130), SP125 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 125) 및 SP133 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 133)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 구체예에서 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질은 콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX), CbpX 트렁케이트, LytX 패밀리, LytX 트렁케이트, CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질, PcpA, PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, SP125 및 SP133으로 구성된 군으로부터 선택된다.
Pht (폴리 히스티딘 트라이애드) 패밀리는 단백질 PhtA (폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 A), PhtB (폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 B), PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 B), 및 PhtE(폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 E)를 포함한다. 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리는 폐렴구균의 히스티딘 트라이애드 패밀리로도 알려져 있으며, 따라서 용어 '폴리 히스티딘 트라이애드' 및 '폐렴구균의 히스티딘 트라이애드'는 서로 상호교환적이고 동등한 것으로 고려된다. 상기 패밀리는 지질화 서열, 가능하게는 금속 또는 뉴클레오시드 결합 또는 효소 활성에 관여하는 프롤린-풍부 영역 및 여러 히스티딘 트라이애드에 의해 분리되는 2개의 도메인, (3-5) 코일드-코일 영역, 보존된 N-말단 및 이종성 C 말단을 특징으로 한다. 이는 시험된 모든 폐렴구균 균주에 존재한다. 상동인 단백질은 다른 스트렙토코쿠스(Streptococci) 및 네이세리아(Neisseria)에서도 발견되었다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 Pht 단백질은 PhtD이다. 그러나, 용어 Pht A, B, D, 및 E는 아래의 인용구에 개시된 서열을 갖는 단백질 뿐만 언급된 단백질과 적어도 90% 동일한 서열 상동성을 갖는 이의 천연-발생 (및 인공) 변이체도 나타내는 것으로 이해된다. 임의로, 이는 적어도 95% 동일하거나 적어도 97% 동일하다.
PhtX 단백질에 관해, PhtA는 WO 98/18930호에 기재되어 있고, Sp36으로도 지칭된다. 전술한 바와 같이, 이는 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리로부터의 단백질이고 LXXC (SEQ ID NO:3)의 타입 II 신호 모티프를 갖는다. PhtD는 WO 00/37105호에 기재되어 있고, Sp036D로도 지칭된다. 전술한 바와 같이, 이것 또한 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리로부터의 단백질이고 타입 II LXXC 신호 모티프를 갖는다. PhtB는 WO 00/37105호에 기재되어 있고, Sp036B로도 지칭된다. PhtB 패밀리의 또 다른 구성원은 WO 00/17370호에 기재된 C3-분해 폴리펩티드이다. 이러한 단백질 또한 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리에서 비롯되며 타입 II LXXC 신호 모티프를 갖는다. 예를 들어, 면역학적 기능성 등가물은 WO 98/18930호에 기재된 단백질 Sp42이다. PhtX 패밀리의 구성원으로도 고려되는 PhtB 트렁케이트 (대략 79kD)는 WO99/15675호에 기재된다. PhtE는 WO00/39299호에 기재되며 BVH-3으로서 지칭된다. 임의의 Pht 단백질이 본원에 언급되는 경우, Pht 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 융합체가 이용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, PhtX에 대한 언급은 임의의 Pht 단백질로부터의 면역원성 단편 또는 이의 융합체를 포함한다. PhtD 또는 PhtB에 대한 언급은, 예를 들어, WO0198334호에서 발견된 PhtDE 또는 PhtBE 융합체에 대한 언급이기도 하다.
콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX)와 관련하여, 그 패밀리의 구성원은 원래 콜린-친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 폐렴구균의 단백질로서 동정되었다. 모든 콜린-결합 단백질은 세포벽 테이코산 및 막-결합된 리포테이코산의 포스포릴콜린 모이어티에 비공유적으로 결합된다. 구조적으로, 단백질의 정확한 특성 (아미노산 서열, 길이 등)은 달라질 수 있지만, 이들은 전체 패밀리에 걸쳐 공통적인 여러 영역을 갖는다. 일반적으로, 콜린 결합 단백질은 N 말단 영역 (N), 보존된 반복 영역 (R1 및/또는 R2), 프롤린 풍부 영역 (P) 및 단백질의 대략 절반을 포함하는 다수의 반복체로 이루어진 보존된 콜린 결합 영역 (C)을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX)"는 WO97/41151호에서 동정된 콜린 결합 단백질, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, 및 CbpG로 구성된 군으로부터 선택된다. CbpA는 WO97/41151호에 기재된다. CbpD 및 CbpG는 WO00/29434호에 기재된다. PspC는 WO97/09994호에 기재된다. PbcA는 WO98/21337호에 기재된다. SpsA는 WO 98/39450호에 기재된 콜린 결합 단백질이다. 임의로 콜린 결합 단백질은 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체예는 CbpX 트렁케이트를 포함하고 여기서 "CbpX"는 상기 정의된 바와 같고 "트렁케이트"는 50% 이상의 콜린 결합 영역 (C)이 결여된 CbpX 단백질을 지칭한다. 임의로 그러한 단백질에는 전체 콜린 결합 영역이 결여되어 있다. 임의로, 그러한 단백질 트렁케이트에는 (i) 콜린 결합 영역 및 (ii) 단백질의 N-말단 절반의 일부도 결여되지만, 적어도 하나의 반복 영역 (R1 또는 R2)을 보유한다. 임의로, 트렁케이트는 2개의 반복 영역 (R1 및 R2)을 갖는다. 그러한 구체예의 예는 WO99/51266호 또는 WO99/51188호에 예시된 NR1xR2 및 R1xR2지만, 유사한 콜린 결합 영역이 결여된 그 밖의 콜린 결합 단백질도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
LytX 패밀리는 세포 용해와 관련된 막 결합 단백질이다. N-말단 도메인은 콜린 결합 도메인(들)을 포함하지만, LytX 패밀리가 상기 언급된 CbpA 패밀리에서 발견된 모든 특징들을 갖는 것은 아니므로, 본 발명에서, LytX 패밀리는 CbpX 패밀리와 별개인 것으로 간주된다. CbpX 패밀리와 대조적으로, C-말단 도메인은 LytX 단백질 패밀리의 촉매적 도메인을 함유한다. 패밀리는 LytA, B 및 C를 포함한다. LytX 패밀리에 관해, LytA는 문헌[Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)]에 기재되어 있다. LytB는 WO 98/18930호에 기재되며, Sp46으로도 불린다. LytC는 또한 WO 98/18930호에 기재되며, Sp91로도 불린다. 본 발명의 구체예는 LytC를 포함한다.
또 다른 구체예는 LytX 트렁케이트를 포함하고 여기서 "LytX"는 상기 정의된 바와 같고 "트렁케이트"는 50% 이상의 콜린 결합 영역이 결여된 LytX 단백질을 지칭한다. 임의로 그러한 단백질에는 전체 콜린 결합 영역이 결여되어 있다. 또한 본 발명의 또 다른 구체예는 CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질 (또는 융합체)을 포함한다. 임의로 이는 CbpX의 NR1xR2 (또는 R1xR2) 및 LytX (예컨대, LytCCterm 또는 Sp91Cterm)의 C-말단 부분 (Cterm, 즉, 콜린 결합 도메인이 결여됨)을 포함한다. 임의로 CbpX는 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의로, 이는 CbpA이다. 임의로, LytX는 LytC이다 (Sp91로도 불린다). 본 발명의 또 다른 구체예는 콜린 결합 도메인 (C)이 결여되어 있고 LytX를 갖는 융합 단백질로서 발현되는 PspA 또는 PsaA 트렁케이트이다. 임의로, LytX는 LytC이다.
PsaA 및 PspA와 관련하여, 둘 모두는 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, PsaA 및 이의 막관통 결실 변이체는 문헌[Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62]에 기재되었다. PspA 및 이의 막관통 결실 변이체는, 예를 들어, US 5804193호, WO 92/14488호, 및 WO 99/53940호에 기재되었다.
PcpA와 관련하여 이러한 단백질은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PcpA는 WO2011/075823호에 기재되었다. 용어 'PcpA'는 WO2011/075823호 (본원에서 참조로서 포함됨)로부터의 SEQ ID NO:2 또는 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단백질 또는 WO2011/075823호로부터의 SEQ ID NO:2 또는 7의 적어도 100, 150, 200, 250개 이상의 연속적인 아미노산의 단편을 나타낸다.
Sp128 및 Sp130은 WO00/76540호에 기재된다. Sp125는 LPXTG (SEQ ID NO:4)(여기서 X는 임의의 아미노산이다)의 세포벽 앵커링 모티프를 갖는 폐렴구균의 표면 단백질의 예이다. 이러한 모티프를 갖는 이러한 부류의 폐렴구균의 표면 단백질 내의 임의의 단백질은 본 발명의 맥락에서 유용한 것으로 밝혀졌고, 이에 따라 본 발명의 추가의 단백질로 간주된다. Sp125 자체는 WO 98/18930호에 기재되며, ZmpB - 아연 메탈로프로테이나제로도 알려져 있다. Sp101은 WO 98/06734호 (여기서 참조번호 # y85993를 갖는다)에 기재된다. 이는 타입 I 신호 서열을 특징으로 한다. Sp133은 WO 98/06734호 (여기서 참조번호 # y85992를 갖는다)에 기재된다. 이것 또한 타입 I 신호 서열을 특징으로 한다.
이러한 임의의 추가의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질은 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 형태로 존재할 수 있다. 하나 이상의 에스. 뉴모니애 단백질은 임의로 에스. 뉴모니애 당류에 컨쥬게이션된다 (하기 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류 컨쥬게이트라는 제목의 섹션에 기재됨). 임의로 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질은 상이한 박테리아로부터의 당류에 컨쥬게이션된다.
이러한 문맥에서 '~에 컨쥬게이션된"이라는 용어는 단백질이 당류에 공유적으로 결합되고, 이러한 상황에서 단백질이 담체 단백질로서 기능함을 의미한다.
구체예에서 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애 단백질은 PhtB, PhtE, PhtA, 및 PhtBD 또는 PhtDE 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리 히스티딘 패밀리 (PhtX) 단백질을 포함한다.
한 구체예에서 조성물은 단백질에 대해 인간 용량 당 1μg-100μg, 1μg-75μg, 1μg-50μg, 1μg-25μg, 1μg-20μg, 5μg-15μg, 25μg-40μg, 28μg-35μg, 약 10μg 또는 약 30μg의 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애 단백질을 포함한다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트
한 구체예에서 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상 (예컨대, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개)의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트를 추가로 포함한다. 용어 캡슐 당류는 캡슐 다당류에서 유래될 수 있는 캡슐 다당류 및 올리고당류를 포함한다. 올리고당류는 적어도 4개의 당 잔기를 함유한다. 용어 컨쥬게이트 및 컨쥬게이션된은 담체 단백질에 공유적으로 결합된 캡슐 당류에 관한 것이다.
임의로 당류 혈청형의 총 수는 23개 미만 또는 23개이고, 임의로 면역원성 조성물은 10-23개 혈청형, 10-16개 혈청형, 10-15개 혈청형, 10-14개 혈청형, 10-13개 혈청형 또는 10-12개 혈청형을 포함한다.
한 구체예에서 본 발명의 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트는 하기 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택되는 혈청형으로부터 유래된 당류를 포함할 것이나, 하나 또는 2개의 그 밖의 혈청형이 면역원성 조성물을 수용하는 수용체의 연령 및 백신이 투여될 지리적 위치에 따라 대용될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 7가(valent) 면역원성 조성물은 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터의 당류를 포함할 수 있다. 10가 면역원성 조성물은 동일한 7개 혈청형으로부터 유래된 당류를 포함할 수 있고 혈청형 1, 5 및 7F로부터의 당류를 추가로 포함한다. 12가 면역원성 조성물은 동일한 10개 혈청형으로부터 유래된 당류를 포함할 수 있고 혈청형 6A 및 19A로부터의 당류를 추가로 포함한다. 13가 면역원성 조성물은 동일한 12개 혈청형을 포함할 수 있고 혈청형 3을 추가로 포함한다. 15가 면역원성 조성물은 동일한 13개 혈청형으로부터 유래된 당류를 포함할 수 있고 혈청형 22F 및 33F로부터의 당류를 추가로 포함한다.
추가의 당류 항원, 예를 들어 23가 (예컨대 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F)도 본 발명에서 고려된다.
용어 "담체 단백질"은 소형 펩티드 및 큰 폴리펩티드 (>10 kDa) 둘 모두를 포함하고자 한다. 담체 단백질은 임의의 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 이는 하나 이상의 T-헬퍼 에피토프를 포함할 수 있다. 담체 단백질은 파상풍 톡소이드 (TT), 파상풍 톡소이드 단편 C, 파상풍 독소의 무독성 돌연변이체 [모든 그러한 TT 변이체가 본 발명의 목적을 위해 동일한 유형의 담체 단백질인 것으로 고려됨을 주목하라], 파상풍 독소 T-세포 에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 N19 (WO2006/067632), 디프테리아 톡소이드 (DT), CRM197 (교차반응성 물질 197), 디프테리아 독소의 다른 무독성 돌연변이체 [예컨대 CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 및 CRM107 (여기서 CRM은 교차반응성 물질을 나타낸다) 및 문헌[Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 Nicholls 및 Youle에 의해 기재된 그 밖의 돌연변이; Glu-148의 Asp, Gln 또는 Ser로의 결실 또는 돌연변이 및/또는 Ala 158의 Gly로의 결실 또는 돌연변이 및 US 4709017호 또는 US 4950740호에 기재된 다른 돌연변이; 적어도 하나 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 US 5917017호 또는 US 6455673호에 기재된 다른 돌연변이; 또는 US 5843711호에 기재된 단편](모든 그러한 DT 변이체가 본 발명의 목적을 위해 동일한 유형의 담체 단백질인 것으로 고려됨을 주목하라), 폐렴구균의 뉴몰리신 (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (외막 단백질 C)(수막구균의 외막 단백질 - 일반적으로 엔. 메닌지티디스(N. meningitidis) 혈청군 B로부터 추출됨 - EP0372501), 합성 펩티드 (EP0378881, EP0427347), 열 쇼크 단백질 (WO 93/17712, WO 94/03208), 백일해 단백질 (WO 98/58668, EP0471177), 사이토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (WO 91/01146), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다수의 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), 예컨대 N19 단백질 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) 폐렴구균의 표면 단백질 PspA (폐렴구균의 표면 단백질 A) (WO 02/091998), 철 흡수 단백질 (WO 01/72337), 씨. 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B (WO 00/61761), 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 단백질 D (EP594610 및 WO 00/56360), 폐렴구균의 PhtA (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 A) (WO 98/18930, Sp36으로도 지칭됨), 폐렴구균의 PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 D (상기 PhtD 섹션에 기재된 바와 같음), 폐렴구균의 PhtB (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 B) (WO 00/37105호에 기재됨, Sp036B로도 지칭됨), 또는 PhtE (폴리 히스티딘 트라이애드 단백질 E) (WO00/30299호에 기재되고 BVH-3으로서 지칭됨)일 수 있다.
한 구체예에서 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트는 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM197 (교차반응성 물질 197), 탈독화 뉴몰리신, 단백질 D (에이치. 인플루엔자로부터), PhtD, PhtDE 및 N19로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트는 모두 독립적으로 CRM197에 컨쥬게이션된다.
한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D에 컨쥬게이션된 적어도 하나의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류를 포함한다. 한 구체예에서 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류의 소수는 단백질 D에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D에 컨쥬게이션된 1-20, 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 또는 1-2개의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된 적어도 하나의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류를 포함한다. 추가의 구체예에서 면역원성 조성물은 19F 당류 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 19F 당류는 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 적어도 하나의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류를 포함한다. 추가의 구체예에서 면역원성 조성물은 18C 당류 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 18C 당류는 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된다.
한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 1 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 4 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 5 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 6B 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 7F 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 9V 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 14 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 파상풍 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 혈청형 18C 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 디프테리아 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 19F 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 23F 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 CRM197에 컨쥬게이션된 19A 당류를 포함한다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 CRM197에 컨쥬게이션된 6A 당류를 포함한다.
한 구체예에서 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 컨쥬게이트는 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F 당류, 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C 당류 및 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된 19F 당류를 포함한다.
임의로 담체 단백질 대 에스. 뉴모니애 당류의 비는 1:5 내지 5:1; 1:2 내지 2.5:1; 1:1 내지 2:1 (w/w)이다. 구체예에서, 컨쥬게이트의 대부분, 예를 들어 컨쥬게이트들 중 6, 7, 8, 9개 이상은 1:1 초과, 예를 들어 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1 또는 1.6:1의 담체 단백질 대 당류의 비를 갖는다.
본 명세서를 통틀어 용어 "당류"는 다당류 또는 올리고당류를 나타낼 수 있고 둘 모두를 포함한다. 다당류는 박테리아로부터 분리되고 공지된 방법 (예를 들어 EP497524호 및 EP497525호를 참조하라)에 의해 그리고 임의로 미세유동화에 의해 어느 정도로 크기조정될 수 있다. 다당류는 다당류 샘플에서의 점도를 감소시키고/거나 컨쥬게이션된 생성물에 대한 여과성을 개선시키기 위해 크기조정될 수 있다. 올리고당류는 낮은 수의 반복 단위 (전형적으로 5-30 반복 단위)를 갖고 전형적으로 가수분해된 다당류이다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애의 캡슐 다당류는 8개 이하의 당 잔기를 함유할 수 있는 반복성 올리고당류 단위를 포함한다. 중요한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형에 대한 올리고당류 단위의 검토를 위해 문헌[JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc., June 2005, vol.77, no.2, p.293-324. ISSN 0001-3765]을 참조하라. 한 구체예에서, 캡슐 당류 항원은 전장 다당류일 수 있지만, 다른 경우에 이것은 하나의 올리고당류 단위일 수 있거나, 반복성 올리고당류 단위의 천연 길이 당류 사슬보다 짧을 수 있다. 한 구체예에서, 백신에 존재하는 모든 당류는 다당류이다. 전장 다당류는 "크기조정"될 수 있고, 즉 이들의 크기는 산 가수분해 처리, 과산화수소 처리, emulsiflex®에 의한 크기조정 이후 과산화수소 처리에 의한 올리고당류 단편 생성 또는 미세유동화와 같은 다양한 방법에 의해 감소될 수 있다.
컨쥬게이션
본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 당류 컨쥬게이트는 임의의 컨쥬게이션 기법을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다.
구체예에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 당류는 링커, 예를 들어 이작용성 링커를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 링커는 임의로, 예를 들어 반응성 아미노기 및 반응성 카르복실산기, 2개의 반응성 아미노기 또는 2개의 반응성 카르복실산기를 갖는, 이종이작용성 또는 동종이작용성이다. 링커는, 예를 들어 4 내지 20개, 4 내지 12개, 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 가능한 링커는 ADH이다. 그 밖의 링커는 B-프로피온아미도 (WO 00/10599), 니트로페닐-에틸아민 (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), 할로알킬 할라이드 (US4057685), 글리코시드 결합 (US4673574, US4808700), 헥산 디아민 및 6-아미노카프로산 (US4459286)을 포함한다. 구체예에서, ADH는 혈청형 18C로부터의 당류를 컨쥬게이션하는데 링커로서 이용된다.
본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 당류 컨쥬게이트는 임의의 공지된 커플링 기법에 의해 제조될 수 있다. 컨쥬게이션 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)를 이용한 당류의 활성화에 의존하여 시아네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 따라서 활성화 당류는 담체 단백질 상의 아미노기에 직접 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 말레이미드-활성화 담체 단백질 (예를 들어 GMBS 이용) 또는 할로아세틸화 담체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예컨대, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP 이용)과의 반응 후에 얻어진 티오에테르 결합을 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화 다당류를 제공하는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있었다. 임의로, 시아네이트 에스테르 (임의로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 ADH와 커플링되고 아미노-유도체화 당류는 카르보디이미드 (예컨대, EDAC 또는 EDC) 화학을 이용하여 단백질 담체 상의 카르복실기를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 그러한 컨쥬게이트는 PCT 공개 출원 WO 93/15760 Uniformed Services University 및 WO 95/08348호 및 WO 96/29094호에 기재되어 있다.
그 밖의 적합한 기법은 카르보디이미드, 카르비이니드, 하이드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-하이드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU를 이용한다. 다수가 WO 98/42721호에 기재된다. 컨쥬게이션은 당류의 유리 하이드록실기와 CDI의 반응에 의해 형성된 후 (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) 단백질과의 반응으로 카르바메이트 결합을 형성할 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있다. 이는 일차 하이드록실기에 대한 아노머 말단의 감소, CDI 카르바메이트 중간체를 형성하는 일차 하이드록실기와 CDI의 일차 하이드록실기 반응의 보호/탈보호 및 CDI 카르바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노기의 커플링을 수반할 수 있다.
컨쥬게이트는 또한 US 4365170호 (Jennings) 및 US 4673574호 (Anderson)에 기재된 직접 환원성 아민화 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 방법은 EP-0-161-188호, EP-208375호 및 EP-0-477508호에 기재된다.
추가의 방법은 카르보디이미드 축합 (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256)에 의해, 예를 들어 EDAC (1-에틸-2-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드)를 이용한 단백질 담체로의 아디프산 디하이드라지드 (ADH)로 유도체화된 시아노겐 브로마이드 (또는 CDAP) 활성화 당류의 커플링을 포함한다.
구체예에서, 당류 상의 하이드록실기 (임의로 활성화 하이드록실기, 예를 들어 시아네이트 에스테르를 제조하도록 활성화된 하이드록실기 [예컨대 CDAP 이용])는 단백질 상의 아미노기 또는 카르복실기에 직접적으로 또는 간접적으로 (링커를 통해) 연결된다. 링커가 존재하는 경우, 당류 상의 하이드록실기는 임의로, 예를 들어 CDAP 컨쥬게이션을 이용하여, 링커 상의 아미노기에 연결된다. 링커, 예를 들어 ADH의 추가의 아미노기는, 예를 들어 카르보디이미드 화학을 이용하여, 예를 들어 EDAC를 이용하여, 단백질 상의 카르복실산기에 컨쥬게이션될 수 있다. 구체예에서, 폐렴구균의 캡슐 당류(들)는 먼저 링커에 컨쥬게이션된 후, 링커가 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 대안적으로, 링커는 당류에 컨쥬게이션되기 전에 담체에 컨쥬게이션될 수 있다.
일부 당류-단백질 컨쥬게이트는 CDAP에 의해 제조되고, 일부는 환원성 아민화에 의해 제조되는, 기법들의 조합도 이용될 수 있다.
일반적으로 단백질 담체 상의 하기 유형의 화학기를 커플링/컨쥬게이션에 이용할 수 있다:
A) 카르복실 (예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산을 통해). 한 구체예에서 이러한 기는 당류의 아미노기에 직접 연결되거나 카르보디이미드 화학, 예컨대 EDAC를 이용하여 링커 상의 아미노기에 연결된다.
B) 아미노기 (예를 들어 리신을 통해). 한 구체예에서 이러한 기는 당류의 카르복실기에 직접 연결되거나 카르보디이미드 화학, 예컨대 EDAC를 이용하여 링커 상의 카르복실기에 연결된다. 또 다른 구체예에서 이러한 기는 당류 상의 CDAP 또는 CNBr로 활성화된 하이드록실기에 직접 연결되거나 링커 상의 그러한 기; 알데히드기를 갖는 당류 또는 링커; 숙신이미드 에스테르기를 갖는 당류 또는 링커에 연결된다.
C) 설프하이드릴 (예를 들어 시스테인을 통해). 한 구체예에서 이러한 기는 말레이미드 화학을 이용하여 브로모 또는 클로로 아세틸화 당류 또는 링커에 연결된다. 한 구체예에서 이러한 기는 비스 디아조벤지딘으로 활성화/변형된다.
D) 하이드록실기 (예를 들어 티로신을 통해). 한 구체예에서 이러한 기는 비스 디아조벤지딘으로 활성화/변형된다.
E) 이미다졸릴기 (예를 들어 히스티딘을 통해). 한 구체예에서 이러한 기는 비스 디아조벤지딘으로 활성화/변형된다.
F) 구아니딜기 (예를 들어 아르기닌을 통해).
G) 인돌릴기 (예를 들어 트립토판을 통해).
당류 상에서, 일반적으로 하기 기가 커플링에 이용될 수 있다: OH, COOH 또는 NH2. 알데히드기는 퍼아이오데이트, 산 가수분해, 과산화수소 등과 같은 당 분야에 공지된 상이한 처리 후에 생성될 수 있다.
직접 커플링 접근법:
당류-OH + CNBr 또는 CDAP -----> 시아네이트 에스테르 + NH2-Prot ----> 컨쥬게이트
당류-알데히드 + NH2-Prot ----> Schiff 염기 + NaCNBH3 ----> 컨쥬게이트
당류-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> 컨쥬게이트
당류-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> 컨쥬게이트
스페이서 (링커)를 통한 간접 커플링 접근법:
당류-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2---- NH2 ----> 당류----NH2 + COOH-Prot + EDAC -----> 컨쥬게이트
당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH2-----SH -----> 당류----SH + SH-Prot (노출된 시스테인을 갖거나 예를 들어 SPDP에 의해 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 천연 단백질) -----> 당류-S-S-Prot
당류-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2----SH -------> 당류----SH + 말레이미드-Prot (아미노기의 변형) ----> 컨쥬게이트
당류-OH + CNBr 또는 CDAP ---> 시아네이트 에스테르 + NH2-----SH ---> 당류-SH + 할로아세틸화-Prot ----> 컨쥬게이트
당류-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 당류------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> 컨쥬게이트
당류-COOH + EDAC + NH2----SH -----> 당류----SH + SH-Prot (노출된 시스테인을 갖거나 예를 들어 SPDP에 의해 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 천연 단백질) -----> 당류-S-S-Prot
당류-COOH + EDAC + NH2----SH -----> 당류----SH + 말레이미드-Prot (아미노기의 변형) ----> 컨쥬게이트
당류-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 당류-SH + 할로아세틸화-Prot ----> 컨쥬게이트
당류-알데히드 + NH2-----NH2 ----> 당류---NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> 컨쥬게이트
주석: 상기 EDAC 대신, 임의의 적합한 카르보디이미드를 이용할 수 있다.
요약하면, 당류와의 커플링에 일반적으로 이용될 수 있는 단백질 담체 화학기의 유형은 아미노기 (예를 들어 리신 잔기 상의), COOH 기 (예를 들어 아스파르트산 및 글루탐산 잔기 상의) 및 SH 기 (접근할 수 있는 경우) (예를 들어 시스테인 잔기 상의)이다.
한 구체예에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 에스. 뉴모니애 당류가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 에스. 뉴모니애 당류가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서 1 내지 23, 2 내지 22, 3 내지 21, 4 내지 20, 5 내지 19, 6 내지 18, 7 내지 17, 8 내지 16, 9 내지 15, 10 내지 14, 11 내지 13, 1 내지 23, 및 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2개의 에스. 뉴모니애 당류가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서 모든 에스. 뉴모니애 캡슐 당류는 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.
한 구체예에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 에스. 뉴모니애 당류는 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만의 에스. 뉴모니애 당류가 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서 1 내지 23, 2 내지 22, 3 내지 21, 4 내지 20, 5 내지 19, 6 내지 18, 7 내지 17, 8 내지 16, 9 내지 15, 10 내지 14, 11 내지 13, 1 내지 23, 및 22개, 1 내지 21, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 10 내지 14, 10 내지 13, 10 내지 12, 10 내지 11, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2개의 에스. 뉴모니애 당류가 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 추가의 구체예에서 모든 에스. 뉴모니애 캡슐 당류는 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.
한 구체예에서 본 발명의 면역원성 조성물은 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 당류를 포함하고 환원성 아민화 이외의 화학, 예를 들어 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개의 당류를 포함한다.
구체예에서 혈청형 1, 3, 19A 및 19F로 구성된 군으로부터 선택되는 혈청형들 중 적어도 하나로부터의 캡슐 당류는 환원성 아민화 이외의 화학을 통해 컨쥬게이션되고 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 구성된 군으로부터 선택되는 혈청형들 중 적어도 하나로부터의 캡슐 당류는 환원성 아민화를 통해 컨쥬게이션된다. 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 환원성 아민화 이외의 화학을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1 또는 3 또는 19A 또는 19F; 1 및 3; 1 및 19A; 1 및 19F; 3 및 19A; 3 및 19F; 19A 및 19F; 1, 3 및 19A; 1, 3 및 19F, 1, 19A 및 19F; 3, 19A 및 19F 또는 1, 3, 19A 및 19F로부터의 에스. 뉴모니애 캡슐 당류(들)를 포함한다. 구체예에서, 19F는 환원성 아민화 이외의 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 CDAP 화학과 같은 시아닐화 화학을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1 또는 3 또는 19A 또는 19F; 1 및 3; 1 및 19A; 1 및 19F; 3 및 19A; 3 및 19F; 19A 및 19F; 1, 3 및 19A; 1, 3 및 19F, 1, 19A 및 19F; 3, 19A 및 19F 또는 1, 3, 19A 및 19F로부터의 에스. 뉴모니애 캡슐 당류를 포함한다. 구체예에서, 19F는 CDAP 화학에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 본 발명의 구체예에서, 하기 에스. 뉴모니애 캡슐 당류 또는 이들의 그룹은 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다; 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 또는 23F, 4 및 5, 4 및 6A, 4 및 6B, 4 및 7F, 4 및 9V, 4 및 14, 4 및 18C, 4 및 23F, 5 및 6A, 5 및 6B, 5 및 7F, 5 및 9V, 5 및 14, 5 및 18C, 5 및 23F, 6A 및 6B, 6A 및 7F, 6A 및 9V, 6A 및 14, 6A 및 18C, 6A 및 23F, 6B 및 7F, 6B 및 9V, 6B 및 14, 6B 및 18C, 6B 및 23F, 7F 및 9V, 7F 및 14, 7F 및 18C, 7F 및 23F, 9V 및 14, 9V 및 18C, 9V 및 23F, 14 및 18C, 14 및 23F 또는 18C 및 23F. 구체예에서, 23F는 환원성 아민화 화학에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.
당류 컨쥬게이트의 용량
일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 컨쥬게이트 당 0.1 내지 20μg, 1 내지 5μg, 1 내지 10μg 또는 1 내지 3μg의 용량의 당류를 포함할 수 있다.
구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 각 에스. 뉴모니애 캡슐 당류를 0.1-20μg; 0.5-10μg; 0.5-5μg 또는 1-3μg의 당류의 용량으로 포함하는 컨쥬게이트를 함유한다. 구체예에서, 캡슐 당류는 상이한 투여량으로 존재할 수 있고, 예를 들어 일부 캡슐 당류는 정확히 1μg의 용량으로 존재할 수 있거나 일부 캡슐 당류는 정확히 3μg의 용량으로 존재할 수 있다. 구체예에서, 혈청형 3, 18C 및 19F (또는 4, 18C 및 19F)로부터의 당류는 다른 당류들보다 높은 용량으로 존재한다. 이러한 구체예의 한 양태에서, 혈청형 3, 18C 및 19F (또는 4, 18C 및 19F)는 대략 또는 정확히 3 μg의 용량으로 존재하는 한편 면역원성 조성물의 그 밖의 당류는 대략 또는 정확히 1μg의 용량으로 존재한다. 한 구체예에서 혈청형 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및 23F는 대략 또는 정확히 1μg의 용량으로 존재한다.
애쥬번트
한 구체예에서 조성물은 리포솜의 형태로 제공되는, QS21, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 인지질 및 스테롤을 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는다. 리포솜의 형태로 제공되는 QS21, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 인지질 및 스테롤을 포함하는 애쥬번트를 포함하는 조성물은 PCT 출원 번호 WO2012/156391호에 기재된다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 QS 21을 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서 면역원성 조성물은 모노포스포릴 지질 A (MPL)를 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는다. 한 구체예에서 면역원성 조성물은 QS21이나 MPL을 포함하는 않는다. QS21은 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 나무로부터 유래된 애쥬번트이다.
한 구체예에서 면역원성 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다.
적합한 애쥬번트는 비제한적으로 알루미늄 염 (알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드), 모노포스포릴 지질 A (예를 들어 3D-MPL), 사포닌 (예를 들어 QS21), 수중유 에멀젼, 그램 음성 박테리아 균주로부터의 수포 또는 외막 소포 제조물 (예컨대 WO02/09746호에 교시된 것들), 지질 A 또는 이의 유도체, 알킬 글루코사미드 포스페이트 또는 이러한 애쥬번트들 중 2개 이상의 조합물을 포함한다. 한 구체예에서 애쥬번트는 알루미늄 포스페이트이다. 추가의 구체예에서 애쥬번트는 인간 용량 당 100-750, 150-600, 200-500, 250-450, 300-400, 또는 약 350μg의 알루미늄을 알루미늄 포스페이트로서 포함한다. 추가의 구체예에서 애쥬번트는 알루미늄 하이드록사이드이다. 한 구체예에서 애쥬번트는 수중유 애쥬번트를 포함하지 않는다.
백신
본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관한 본원의 구체예는 또한 본 발명의 "백신"에 관한 구체예에 이용될 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 구체예에서, 백신은 본 발명의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
본 발명의 백신은 임의의 적합한 전달 경로, 예컨대 피내, 점막, 예컨대 비내, 경구, 근내 또는 피하 경로에 의해 투여될 수 있다. 그 밖의 전달 경로는 당 분야에 잘 알려져 있다. 백신 제조물은 일반적으로 문헌[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기재되어 있다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 근내 전달 경로에 의해 투여된다. 근내 투여는 대퇴 또는 상완에 있을 수 있다. 주입은 전형적으로 바늘을 통해서지만 (예컨대, 피부밑 바늘), 바늘 없는 주입이 대안적으로 이용될 수 있다. 전형적인 근내 용량은 0.5 ml이다.
백신의 피내 투여는 본 발명의 구체예를 형성한다. 인간 피부는 표피를 덮고 있는 각질층이라 불리는 외부 "각질" 껍질을 포함한다. 이러한 표피 아래에는 다시 피하 조직을 덮고 있는 진피라 불리는 층이 있다. 피내 주입의 통상적인 기법인 "망토(mantoux) 절차"는 피부를 세정한 후에 한 손으로 잡아당기는 단계를 포함하고, 위로 향한 좁은 게이지 바늘 (26 내지 31 게이지)의 경사면을 이용하여 바늘을 10 내지 15°의 각도로 삽입한다. 바늘의 경사면이 삽입되면, 바늘의 통을 낮추어 더 밀어넣는 동안 피부 아래에서 이것을 끌어올리는 약간의 압력을 제공한다. 그 후 액체를 매우 천천히 주입함으로써 피부 표면에 수포 또는 융기를 형성한 후, 바늘을 느리게 빼낸다.
보다 최근에, 액체 제제를 피부에 또는 피부를 가로질러 투여하도록 구체적으로 설계된 장치가 기재되었고, 예를 들어 상기 장치는 WO99/34850호 및 EP1092444호에 기재되고, 또한 분사식 주입 장치는 예를 들어 WO01/13977, US5,480,381, US5,599,302, US5,334,144, US5,993,412, US5,649,912, US5,569,189, US5,704,911, US5,383,851, US5,893,397, US5,466,220, US5,339,163, US5,312,335, US5,503,627, US5,064,413, US5,520,639, US4,596,556, US4,790,824, US4,941,880, US4,940,460, WO97/37705 및 WO97/13537에 기재된다. 백신 제조물의 피내 투여의 대안적인 방법은 통상적인 주사기와 바늘, 또는 고형 백신의 탄도 전달을 위해 설계된 장치 (WO99/27961), 또는 경피 패치 (WO97/48440, WO98/28037)를 포함할 수 있거나, 피부 표면에 도포될 수 있다 (경피 또는 피부통과 전달 WO98/20734, WO98/28037).
본 발명의 백신이 피부, 또는 보다 구체적으로 진피에 투여되어야 할 때, 백신은 낮은 액체 부피, 특히 약 0.05 ml 내지 0.2 ml의 부피이다.
또 다른 적합한 투여 경로는 피하 경로이다. 임의의 적합한 장치, 예를 들어 전통적인 바늘이 피하 전달에 이용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 바늘이 없는 분사식 주입기 서비스가 이용되며, 예컨대 이는 WO01/05453, WO01/05452, WO01/05451, WO01/32243, WO01/41840, WO01/41839, WO01/47585, WO01/56637, WO01/58512, WO01/64269, WO01/78810, WO01/91835, WO01/97884, WO02/09796, WO02/34317호에서 공개된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 장치는 액체 백신 제형으로 미리 충전된다. 대안적으로 백신은 비내 투여된다. 통상적으로, 백신은, 예컨대, 폐로 흡입되지 않고 비인두 영역에 국소적으로 투여된다. 백신 제형이 폐로 들어가지 않거나 실질적으로 폐로 들어가지 않으며, 백신 제형을 비인두 영역에 전달하는 비내 전달 장치를 이용하는 것이 요망된다. 본 발명에 따른 백신의 비내 투여에 바람직한 장치는 분무 장치이다. 시판되는 적합한 코 분무 장치는 Accuspray™ (Becton Dickinson)을 포함한다.
구체예에서, 비내 이용을 위한 분무 장치는 장치의 성능이 사용자에 의해 가해진 압력에 의존하지 않는 장치이다. 이러한 장치는 압력 임계 장치로서 공지되어 있다. 액체는 임계 압력이 가해질 때에만 노즐로부터 방출된다. 이러한 장치는 규칙적인 소적 크기를 갖는 분무를 달성하기 쉽게 만든다. 본 발명에 사용하기 적합한 압력 임계 장치는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 WO91/13281호 및 EP311863호 및 EP516636호에 기재되어 있다. 상기 장치는 Pfeiffer GmbH에서 시판되며 또한 문헌[Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999]에 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, 비내 장치는 1 내지 200 μm, 예컨대 10 내지 120 μm 범위의 소적 (액체로서 물을 이용하여 측정시)을 생성한다. 10 μm 미만인 경우, 흡입의 위험이 있으므로, 10 μm 미만의 소적을 약 5% 넘지 않게 갖는 것이 요망된다. 120 μm 초과의 소적 뿐만 아니라 더 작은 소적들은 확산되지 않으므로, 120 μm를 초과하는 소적을 약 5% 넘지 않게 갖는 것이 요망된다.
2-용량 전달은 본 발명에 따른 백신에 사용하기 위한 비내 전달 시스템의 또 다른 구체예이다. 2-용량 장치는 두 서브-용량의 단일한 백신 용량을 함유하는데, 한 서브-용량은 한 콧구멍에 투여하기 위한 것이다. 일반적으로 두 서브-용량은 단일한 챔버에 존재하고, 장치의 구조는 한 번에 단일한 서브-용량의 효율적인 전달을 허용한다. 대안적으로, 단일용량 장치를 본 발명에 따른 백신을 투여하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 컨쥬게이션되지 않은 에스. 뉴모니애 단백질을 애쥬번트 조성물과 혼합시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 백신을 제조하는 방법이다.
비록 본 발명의 백신이 단일한 용량으로서 투여될 수 있으나, 이의 구성요소들은 또한 동시에 또는 상이한 시점에 함꼐 공동-투여될 수 있다 (예를 들어, 폐렴구균의 당류 컨쥬게이트들은 따로따로, 동시에 또는 서로에 대한 면역 반응의 최적 협력을 위해 백신의 임의의 박테리아 단백질 구성요소를 투여한 지 1 내지 2주 후에 투여될 수 있었다). 초기 백신화 후에, 피검체는 적절한 간격으로 1회 또는 수 회의 추가 면역화를 받을 수 있다.
본 발명의 한 양태에서 면역보호 용량의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환에 대해 인간 숙주를 면역화시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도가 제공된다.
한 구체예에서 숙주는 성인이고, 성인은 나이가 18세가 넘는 인간이다. 추가의 구체예에서 숙주는 노인, 적합하게는 연령이 60, 62, 65, 67, 또는 70세 이상인 노령자이다. 추가의 구체예에서 숙주는 젊은 성인 (즉, 18세 내지 64세), 임의로 젊은 고-위험 성인, 예컨대 보건 기관에서 일하는 젊은 성인 또는 심혈관 및 폐 질환, 또는 당뇨병과 같은 위험 인자를 가진 젊은 성인이다. 추가의 구체예에서 숙주는 영아, 예컨대 6개월이 넘은 소아, 특히 6개월 내지 23개월의 소아이다. 임의로 숙주는 유아, 예컨대 9개월 내지 3세의 소아이다.
추가의 본 발명의 구체예에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균 질환 (IPD), 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)의 악화, 중이염, 재발 중이염, 수막염, 균혈증 및 결막염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
개괄
"약" 또는 "대략"은 본 발명의 목적을 위해 주어진 숫자의 10% 크거나 작은 범위 내인 것으로 정의된다.
본원의 용어 "포함하는" 및 "포함하다"은 모든 경우에 본 발명자들에 의해 각각 "구성되는" 및 "구성되다"의 용어와 임의로 치환될 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 "백신 조성물"에 관한 본원의 구체예는 또한 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관한 구체예에 적용될 수 있고, 그 반대도 가능하다.
'폐렴구균' 및 '에스. 뉴모니애'에 대한 언급은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 언급으로 간주될 수 있다.
본 특허 명세서에 인용된 모든 참조문헌 또는 특허 출원은 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 개시된다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 하며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안 된다.
실시예
실시예 1 - 임상 시험 연구를 위한 백신의 생성
6개 백신을 설계하였다:
dPly -10- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 10μg의 dPly를 포함하는 백신.
dPly -30- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 30μg의 dPly를 포함하는 백신.
dPly / PhtD -10- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 10μg의 dPly 및 10μg의 PhtD를 포함하는 백신.
dPly / PhtD -30- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 30μg의 dPly 및 30μg의 PhtD를 포함하는 백신.
10 PCV / dPly / PhtD -10- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 하기 항원을 포함하는 백신:
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1로부터의 1μg 캡슐 당류 (1-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4로부터의 3μg 캡슐 당류 (4-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5로부터의 1μg 캡슐 당류 (5-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B로부터의 1μg 캡슐 당류 (6B-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F로부터의 1μg 캡슐 당류 (7F-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V로부터의 1μg 캡슐 당류 (9V-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14로부터의 1μg 캡슐 당류 (14-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 1μg 캡슐 당류 (23F-PD)
파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C로부터의 3μg 캡슐 당류 (18C-TT)
디프테리아 독소에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 1μg 캡슐 당류 (19F-DT)
10μg dPly
10μg PhtD
10 PCV / dPly / PhtD -30- AlPO 4 : 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 하기 항원을 포함하는 백신:
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1로부터의 1μg 캡슐 당류 (1-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4로부터의 3μg 캡슐 당류 (4-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5로부터의 1μg 캡슐 당류 (5-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B로부터의 1μg 캡슐 당류 (6B-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F로부터의 1μg 캡슐 당류 (7F-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V로부터의 1μg 캡슐 당류 (9V-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14로부터의 1μg 캡슐 당류 (14-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 1μg 캡슐 당류 (23F-PD)
파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C로부터의 3μg 캡슐 당류 (18C-TT)
디프테리아 독소에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 1μg 캡슐 당류 (19F-DT)
30μg dPly
30μg PhtD
10 PCV: 알루미늄 포스페이트가 애쥬번트로 첨가된 하기 항원을 포함하는 백신:
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1로부터의 1μg 캡슐 당류 (1-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4로부터의 3μg 캡슐 당류 (4-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5로부터의 1μg 캡슐 당류 (5-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B로부터의 1μg 캡슐 당류 (6B-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F로부터의 1μg 캡슐 당류 (7F-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V로부터의 1μg 캡슐 당류 (9V-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14로부터의 1μg 캡슐 당류 (14-PD)
단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 1μg 캡슐 당류 (23F-PD)
파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C로부터의 3μg 캡슐 당류 (18C-TT)
디프테리아 독소에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 1μg 캡슐 당류 (19F-DT)
30μg dPly
30μg PhtD
항원의 제조
dPly 의 제조: 폐렴구균의 뉴몰리신을 WO2004/081515호 및 WO2006/32499호에 기재된 대로 포름알데히드 탈독화를 이용하여 제조하고 탈독화하였다.
PhtD 의 발현 및 정제:
PhtD 의 발현: PhtD 단백질은 히스티딘-트라이애드의 존재를 특징으로 하는 폐렴구균의 히스티딘-트라이애드 (Pht) 단백질 패밀리의 구성원이다. PhtD는 838 aa-분자이고 5개의 히스티딘 트라이애드를 지닌다 (Medlmmune WO00/37105호 아미노산 서열에 대해 SEQ ID NO: 4 및 DNA 서열에 대해 SEQ ID NO: 5를 참조하라). PhtD는 또한 중간에 프롤린-풍부 영역 (아미노산 위치 348-380)을 함유한다. PhtD는 20 aa-N-말단 신호 서열이다. PhtD의 제조 및 정제는 WO2007/071710호에 기재되어 있다 (예를 들어 실시예 1b를 참조하라).
단백질 D의 발현
단백질 D는 WO2007/071710호에 기재된 대로 발현되었다.
컨쥬게이트의 제조
정제된 폐렴구균 다당류를 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 실시예의 목적에 있어서, 다당류는 본질적으로 EP072513호에 기술된 바와 같이 또는 밀접하게 관련된 방법에 의해 제조되었다. 컨쥬게이션 전에, 다당류를 하기 기술된 바와 같이 미세유동화에 의해 크기조정될 수 있다.
활성화 및 커플링 조건은 각 다당류에 대해 특이적이다. 이는 표 1에 제시되어 있다. 크기조정된 다당류 (6B 및 23F 제외)를 NaCl 2M, NaCl 0.2M 또는 주입수 (WFI)에 용해시켰다. 최적의 다당류 농도를 모든 혈청형에 대해서 평가하였다. 혈청형 18C를 제외한 모든 혈청형을 하기 상세히 기술된 바와 같은 담체 단백질에 직접 컨쥬게이션시켰다.
아세토니트릴 또는 아세토니트릴/물 (50%/50%) 용액 중 100 mg/ml 원액으로부터, CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트) (CDAP/PS 비 0.5-1.5 mg/mg PS)를 다당류 용액에 첨가하였다. 1.5분 후, 0.2M-0.3M NaOH를 첨가하여 특정 활성화 pH를 수득하였다. 다당류의 활성화를 이러한 pH에서 3분 동안 25℃에서 실행시켰다. 정제된 단백질 (단백질 D, CRM197 또는 DT) (초기 PS/담체 단백질 비에 따른 양)을 활성화된 다당류에 첨가하고, 커플링 반응을 (혈청형에 따라) pH 조절하에 2시간 이내로 특이적 pH에서 수행하였다. 비반응된 시아네이트 에스테르 기를 켄칭시키기 위해, 이어서 2M 글리신 용액을 혼합물에 첨가하였다. pH를 켄칭 pH (pH 9.0)로 조정하였다. 용액을 30분 동안 25℃에서 교반하고 이어서 연속해서 느리게 교반하면서 2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
18C의 제조:
18C를 링커 - 아디프산 디하이드라지드 (ADH)를 통해 담체 단백질에 연결하였다.
다당류 혈청형 18C를 컨쥬게이션 전에 미세유동화시켰다.
EDAC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 )로의 파상풍 톡소이드의 유도체화
파상풍 톡소이드의 유도체화에 있어서, 정제된 TT를 0.2M NaCl에서 25 mg/ml로 희석하고, 0.2M의 최종 농도에 도달하기 위해 ADH 스페이서를 첨가하였다. 스페이서의 용해가 완료되면, pH를 6.2로 조정하였다. 이어서 EDAC (1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카르보디이미드)를 첨가하여 0.02M의 최종 농도에 도달시키고, 혼합물을 pH 조절하에 1시간 동안 교반하였다. 적어도 30분 동안 25℃에서 pH를 9.0까지 증가시킴으로써 축합 반응을 중단시켰다.
이어서 잔여 ADH 및 EDAC 시약을 제거하기 위해 유도체화된 TT를 투석여과하였다 (10 kDa CO 막).
TTAH (ADH 링커에 컨쥬게이션된 파상풍 톡소이드) 벌크를 커플링 단계까지 최종적으로 멸균 여과하고 -70℃에서 저장하였다.
TT AH 의 PS 18C로의 화학적 커플링
컨쥬게이션 파라메터의 상세한 사항은 표 1에서 찾아볼 수 있다. 2 그램의 미세유동화된 PS를 물 중에서 지정된 농도로 희석하고 NaCl 분말 첨가에 의해 2M NaCl로 조절하였다.
CDAP 용액 (50/50 v/v 아세토니트릴/WFI 중에 새로 제조된 100 mg/ml)을 첨가하여 적당한 CDAP/PS 비에 도달하였다.
0.3M NaOH를 첨가하여 pH를 활성화 pH 9.0까지 증가시키고, TTAH 첨가시까지 이러한 pH에서 안정화시켰다.
3분 후, 유도체화된 TTAH (0.2 M NaCl 중 20 mg/ml)를 첨가하여 2의 TTAH /PS 비에 도달시켰다; pH를 커플링 pH 9.0으로 조절하였다. 용액을 pH 조절하에 1시간 동안 그대로 두었다.
켄칭에 있어서, 2M 글리신 용액을 혼합물 PS/TTAH/CDAP에 첨가하였다.
pH를 켄칭 pH (pH 9.0)로 조정하였다.
용액을 30분 동안 25℃에서 교반하고, 이어서 2-8℃에서 밤새 연속하여 느리게 교반하였다.
에스 . 뉴모니애 캡슐 당류-단백질 D/ TT / DT / PhtD / Ply 컨쥬게이트의 특정 활성화/커플링/ 켄칭 조건
"μ유체"가 열 헤더 (row header)에 나타난 경우, 이는 당류가 컨쥬게이션 전에 미세유동화에 의해 크기조정되었음을 나타낸다. 미세유동화 후 당류의 크기는 표 2에 제시되어 있다.
표 1. 에스 . 뉴모니애 캡슐 당류-단백질 D/ TT / DT / CRM197 컨쥬게이트의 특정 활성화/커플링/ 켄칭 조건
Figure pct00001
Figure pct00002
주석: pHa,c,q는 각각 활성화, 커플링 및 켄칭 pH에 상응한다.
컨쥬게이트의 정제:
컨쥬게이트를 0.15M NaCl로 평형화된 세파크릴 S400HR (Sephacryl S400HR) 겔 여과 칼럼을 사용하여 겔 여과에 의해 정제하여 (단 S500HR이 18C를 위한 완충제로서 사용되며, 1.15MNaCl pH6.2를 함유하는 20mM 아세테이트가 19A에 대해 사용됨) 소분자 (DMAP 포함) 및 컨쥬게이션되지 않은 당류 및 단백질을 제거하였다. 반응 성분들의 상이한 분자 크기에 기반하여, PS-PD, PS-TT, PS-CRM197 또는 PS-DT 컨쥬게이트를 먼저 용리시킨 후 자유 PS를 용리시키고, 이어서 자유 단백질 담체 및 최종적으로 DMAP 및 그 밖의 염 (NaCl, 글리신)을 용리시켰다.
컨쥬게이트를 함유하는 분획을 UV280 nm에 의해 검출하였다. 분획물을 이들의 Kd에 따라 풀링시키고, 멸균 여과시키고 (0.22 μm), +2-8℃에서 저장하였다. 컨쥬게이트 제조물 중 PS/단백질 비를 측정하였다.
실시예 2 - 고 용량 및 저 용량의 dPly 및 PhtD 를 포함하는 백신의 효능을 연구하기 위한 임상 시험을 성인에서 수행하였다
임상 시험은 7개의 유사한 그룹을 이용하여 수행되었다;
1. dPly -10- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 'Ply-10'): 피검체는 실시예 1에 기재된 dPly-10-ALPO4 백신을 수용한다 (167μg AlPO4, 150mM NaCl 및 0.78mM PO4 완충제로 제형화됨).
2. dPly -30- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 'Ply-30'): 피검체는 실시예 1에 기재된 dPly-30-ALPO4 백신을 수용한다 (500 AlPO4, 150nM NaCl 및 0.78mM PO4 완충제로 제형화됨).
3. dPly / PhtD -10- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 'PlPh-10'): 피검체는 실시예 1에 기재된 dPly/PhtD-10-AlPO4 백신을 수용한다 (500 μg AlPO4, 150mM NaCl 및 0.72mM PO4 완충제로 제형화됨).
4. dPly / PhtD -30- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 'PlPh-30'): 피검체는 실시예 1에 기재된 dPly/PhtD-30-AlPO4 백신을 수용한다 (500 μg AlPO4, 150mM NaCl 및 0.86mM PO4 완충제로 제형화됨).
5. 10 PCV / dPly / PhtD -10- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 '10vPP10'): 피검체는 실시예 1에 기재된 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4 백신을 수용한다 (500 μg AlPO4, 150mM NaCl 및 0.72mM PO4 완충제로 제형화됨).
6. 10 PCV / dPly / PhtD -30- AlPO 4 그룹 (결과 표 및 도면에서 '10vPP30'): 피검체는 실시예 1에 기재된 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4 백신을 수용한다 (500 μg AlPO4, 150mM NaCl 및 0.86 mM PO4 완충제로 제형화됨).
7. 23 PPV 비교 그룹 (결과 표 및 도면에서 '23PPV'): 피검체는 0일 (0개월)에 Pneumovax 23™으로 명명된 1회 용량의 시판되는 허가된 23-가 c 다당류 백신 (23PPV)을 수용한 후 60일 (2개월)에 플라시보를 수용한다.
모든 그룹의 피검체는 0일 (0개월)에 1회 및 60일 (2개월)에 1회로서 2회 용량의 개별적인 연구 백신을 수용하였다; 23PPV 비교 그룹은 0일 (0개월)에 허가된 23PPV 백신 및 60일 (2개월)에 플라시보를 수용하였다. 백신은 비 우세(non dominant) 삼각근에 근내 주입으로서 투여되었다. 피검체는 첫 번째 백신접종시 18세 및 40세를 포함하는 18세 내지 40세 사이의 건강한 남성 또는 여성이었다.
안전성/ 반응원성 방법
증상의 유형, 강도 및 백신접종의 상관관계에 따라, 각 백신 용량 및 전체 이후에, 31일의 백신접종 후 추적 관찰 기간 동안 응답형 및/또는 비응답형 국소 및 일반 AE (부작용)의 발생을 95% CI (신뢰 구간)로 계산하였다. 증상의 유형, 강도 및 백신접종의 상관관계에 따라, 각 백신 용량 및 전체 이후에, 7일의 백신접종 후 추적 관찰 기간 동안 보고된 각 국소 및 각 일반 응답형 증상의 발생을 95% CI로 계산하였다. 31일의 백신접종 후 추적 관찰 기간 내에 보고된 비응답형 증상을 가진 피검체/용량의 백분율을 강도 및 백신접종의 상관관계에 따라 95% CI (신뢰 구간)로 조절 활성에 대한 의학 사전 (MedDRA)에 따라 요약하였다. 7일의 백신접종 후 추적 관찰 기간 동안 그리고 31일의 백신접종 후 추적 관찰 기간 동안 부수적인 해열제/약물의 보급이 각 백신 용량 및 전체 이후에 95% CI로 계산되었다. 전체 연구 기간 동안 보고된 부작용(들)으로 인한 중대 유해 사례(SAE) 및 투여중지가 상세하게 기재되었다. 각각의 혈액학적 및 생화학적 파라메터에 관해, 상기 정상 범위 미만, 이내 및 초과의 수준을 갖는 피검체의 수 및 백분율이 평가되는 각 시점에 연구 그룹에 대해 표로 제시되었다. 등급 및 기준선 (기준선: 0일 평가)으로부터 등급의 변화가 평가되는 각 시점에 연구 그룹에 대해 요약되었다. 각각의 소변 파라메터에 관해, 등급 및 기준선 (기준선: 0일 평가)으로부터 등급의 변화가 평가되는 각 시점에 연구 그룹에 대해 요약되었다. 시간이 지남에 소변검사에서 정량되는 pH가 연구 그룹에 대해 표시되었다.
면역원성 평가를 위한 실험실 검정 및 시점
모든 피검체에 대해, 전체 정맥혈의 약 20 mL 샘플을 Visit 1 [Pre], Visit 4 [(PI(D30) (30일차 용량 I 후)] 및 Visit 8 [(PII(D90) (90일차 용량 II 후)]에 혈청학을 위해 수집하였다. 혈액 원심분리 및 혈청 분리 후에, 스폰서에 의한 수집시까지 샘플을 -20℃에 저장하였다. 혈청의 분취량 (약 10 mL)을 하기 문단에 기재된 혈청학적 검사를 위해 GSK 바이오로지칼즈에 보냈다.
10개 폐렴구균의 혈청형 각각에 대한 항체 (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F에 대한 항체)에 대한 옵소닌식작용 활성을 HL 60 세포주를 이용한 사멸-검정에 의해 측정하였다. 결과를, 검정 조건 하에 살아 있는 폐렴구균의 50% 사멸을 수행할 수 있는 혈청의 희석율 (옵소닌 역가)로서 제시하였다. 검정의 컷오프는 8의 옵소닌 역가였다.
항-dPly 및 항-PhtD 항체를 ELISA (효소 결합 면역흡수 검정)를 이용하여 정량하였다.
샘플 ELISA 프로토콜을 하기에 설명한다:
미세역가 플레이트를 정제된 혈청형 특이적 폐렴구균의 PS (다당류)로 코팅하고 메틸화 인간 혈청 알부민 (PS에 따라 0.5 내지 7.5 μg/ml)과 혼합시켰다. 혈청 샘플을 10 μg/ml의 CWPS (캡슐 벽 다당류) (SSI) 및 2 μg/ml의 혈청형 22F의 PS (ATCC)를 함유하는 흡착 완충제 (포스페이트-완충된 염수 [PBS], 10% 우태아 혈청 [FCS], 0.1% 폴리비닐 알콜)에 희석시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 89-SF 참조 혈청 샘플 (FDA) (89-SF는 세계 보건 기구에 의해 결정된 참조 혈청의 번호이다)을 동일하지만 10 μg/ml의 CWPS만을 지니는 흡착 완충제에 희석시키고, 혼합물을 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 표준 혈청 샘플 89-SF에 대해 결정된 내부 참조 혈청 샘플을 모든 플레이트에 포함시켰다. WHO의 권고에 따른 작업 표준 혈청 샘플과는 달리, 89-SF 참조 혈청 샘플은, 89-SF 참조 혈청 샘플의 항-PS 농도에 대한 값이 22F PS를 사용하지 않고 지정되므로, 22F를 사용하지 않고 CWPS만을 이용하여 미리 흡착된다. 결합된 항체를 알칼린 포스파타제-컨쥬게이션된 항-인간 IgG를 이용하여 검출하였다.
샘플 OPA (옵소닌식작용 검정)을 하기에 설명한다;
OPA 검정은 다음과 같이 수행된다: 혈청 샘플을 40분 동안 56℃에서 가열시켜 임의의 남아 있는 내인성 보체를 불활성화시켰다. 각 1:2 희석된 혈청 샘플의 25 마이크로리터 분취량을 96-웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트 (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)의 웰 당 25 μl의 OPA 완충제 (Hank's Balanced salt solution 또는 HBSS -14.4% 불활성화 FBS (우태아 혈청))에서 2배 연속 희석시켰다. 검정 유효성을 확인하기 위해 특수한 폐렴구균의 혈청형에 대해 공지된 옵소닌식작용 역가를 지닌 2개의 양성 대조 샘플을 각 검정 플레이트에서 실행시켰다. 한 컬럼에서 옵소닌식작용 항체의 부재하에 0% 사멸에 대응하는 평균 CFU (콜로니 형성 단위)를 추정하기 위해 혈청 샘플을 첨가하지 않았다. 이어서, 활성화 HL-60 세포 (1×107개 세포/ml), 신선하게 해동된 폐렴구균의 작업 시드 및 신선하게 해동된 새끼 토끼 보체의 25 μl의 혼합물을 예컨대 4/2/2.82 비 (부피/부피/부피 (v/v/v); 상기 비는 보체의 로트에 따라 달라질 수 있다)로 희석된 혈청에 첨가하여 50μl의 최종 부피를 얻었다. 결과적으로, 혈청 샘플의 최종 연속 희석율은 1:8-1:1024이다. 검정 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 오비탈 진탕 (210 rpm)을 이용하여 인큐베이션시켜 식세포 과정을 촉진시켰다. 마이크로플레이트를 얼음 위에 적어도 1분 동안 두어 반응을 중단시켰다. 그 후 플레이트의 각 웰의 20μl 분취량을 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트 (Nalge Nunc International)의 상응하는 웰에 옮기고 100μl의 Todd-Hewitt Broth-0.9% 아가를 각 웰에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션 후에, 아가에 나타난 폐렴구균 콜로니를 자동화 이미지 분석 시스템 (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 계수하였다. 혈청 샘플이 없는 8개의 웰을 박테리아 대조군으로서 이용하여 웰 당 폐렴구균의 수를 확인하였다. 대조군 웰의 CFU의 평균 수를 결정하고 각 혈청 샘플에 대한 사멸 활성의 계산에 이용하였다. 혈청 샘플에 대한 OPA 역가는 폐렴구균의 50% 사멸을 촉진할 수 있는 혈청의 상호 희석율에 의해 결정된다. 옵소닌식작용 역가는 4-파라메터 곡선 핏 분석을 이용하여 계산된다. 각 샘플 역가를 실제 측정된 역가/각각의 검정에 포함된 2개의 양성 대조 샘플의 공지된 역가의 평균 비에 기반하여 조정 인자를 통해 조정하였다. 모든 혈청형에 대한 컷오프 OPA 역가는 8의 상호 혈청 희석율이다. OPA 역가가 <8인 혈청 샘플을 데이터 분석을 위해 역가 4로 지정한다.
샘플 항-PhtD 및 항-Ply ELISA를 하기에 설명한다:
플레이트를 웰 당 100 μl의 PBS 중 2 μg/ml의 PhtD (1021 μg/ml), TR034 (Na 50mM ph 9.5) 중 3 μg/ml의 Ply (3675μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅시켰다.
그 후 플레이트를 TR 112 (Na2K 39.65 mM - NaCl 1.73 M - 폴리소르베이트 20 0.275% 5P/V°pH 6.6-6.8)로 3회 세척하였다.
첫 번째 세척 후에, 플레이트를 200μl/웰의 희석 완충제 (PhtD의 경우 Ca 및 Mg가 없는 PBS -BSA 1% 또는 Ply의 경우 BSA 5% - 폴리소르베이트 20 0.1% - ProClin 300™ 0.2% pH 7.0)를 이용하여 진탕시키며 RT에서 1시간 동안 포화시켰다.
두 번째 세척 후에 (동일한 완충제) 100μl의 혈청을 희석 완충제에서 1/100, 1/1000 및 1/10000의 희석율로 마이크로웰에 첨가하였다.
플레이트를 진탕시키며 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 5회 세척 후에, 플레이트를 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG Fc 항체와 인큐베이션하고, PhtD에 대해 1/20000 및 Ply에 대해 1/12500으로 실온에서 1시간 동안 진탕시키며 희석하였다 (웰 당 100 μl). 플레이트를 상기와 같이 세척하고 100 μl의 TMB 기질 컨쥬게이트를 각 웰에 암실에서 10분 동안 첨가하였다.
H2SO4 (0.18M) 100 μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 450nm 및 650 nm에서 판독하였다.
면역원성
면역원성 분석을 면역원성에 대한 프로토콜 (ATP)에 따라 코호트에 대해 수행하였다. 면역원성에 대해 5% 미만의 피검체가 ATP 코호트로부터 배제되었으므로 총 백신접종된 코호트에 대한 두 번째 분석은 수행되지 않았다. 혈청을 dPly, PhtD, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F에 대한 항체의 존재에 대해 분석하였다.
항-Ply 항체에 대한 혈청양성률 및 GMC가 하기 표 1에 기재되며, 이러한 데이터는 도 1에 예시된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
혈청양성 피검체는 항체 농도가 ≥ 0.05 μg/mL인 피검체로서 정의되었다.
GMC = 모든 피검체에 대해 계산된 기하 평균 항체 농도
N = 이용가능한 결과를 갖는 피검체의 수
n/% = 명시된 범위 내의 농도를 갖는 피검체의 수/백분율
95% CI = 95% 신뢰 구간; LL = 하한, UL = 상한
PRE = 백신접종 전 혈액 샘플
PI(D30) = 용량 I 후 30일에 취해진 혈액 샘플
PII (D90)= 용량 II 후 90일에 취해진 혈액 샘플
항-dPly 항체 GMC에서의 증가는 dPly를 수용하지 않은 23PPV 그룹을 제외한 모든 그룹에서 각 백신접종 후에 관찰되었다. 항-dPly 항체 GMC는 Ply-10 및 Ply-30 그룹보다 각각 PlPh-10 및 PlPh-30 그룹에서 더 높아지는 경향이 있는데, 이는 PhtD 및 dPly 간의 항원 간섭을 예상했으므로 예기치 못한 것이다. 가장 높은 항-dPly 항체 GMC는 30 μg의 dPly 및 PhtD 단백질을 함유하는 제형 (즉 PlPh-30 및 10vPP30 그룹)에서 관찰되었다.
항-PhtD 항체에 대한 혈청양성률 및 GMC (면역원성에 대한 ATP 코호트)가 하기 표 2에 기재되고 도 2에 예시된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
항-PhtD 항체 GMC에서의 증가는 PhtD를 수용하지 않은 Ply-10, Ply-30 및 23PPV 그룹을 제외하고 각 용량을 이용하여 관찰되었다. 용량 1-후 및 용량 2-후 항-PhtD 항체 GMC는 PlPh-10 및 PlPh-30 그룹에 비해 각각 10vPP10 내지 10vPP30 그룹에서 낮아지는 경향이 있다. 가장 높은 항-PhtD 항체 GMC는 30 μg의 dPly 및 PhtD 단백질을 함유하는 제형 (즉 PlPh-30 및 10vPP30 그룹)에서 관찰되었다.
혈청형 1 항체에 대한 혈청양성률 및 GMC가 하기 표 3에 기재되고, 이러한 데이터는 도 3에 예시된다:
Figure pct00007
Figure pct00008
혈청형 4 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA (옵소닌식작용) GMT가 하기 표 4에 기재되고, 이러한 데이터는 도 4에 예시된다:
Figure pct00009
Figure pct00010
혈청형 5 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA (옵소닌식작용) GMT가 하기 표 5에 기재되고, 이러한 데이터는 도 5에 예시된다:
Figure pct00011
Figure pct00012
혈청형 6B 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA (옵소닌식작용) GMT가 하기 표 6에 기재되고, 이러한 데이터는 도 6에 예시된다:
Figure pct00013
Figure pct00014
혈청형 7F 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA (옵소닌식작용) GMT가 하기 표 7에 기재되고, 이러한 데이터는 도 7에 예시된다:
Figure pct00015
Figure pct00016
혈청형 9V 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA GMT가 하기 표 8에 기재되고, 이러한 데이터는 도 8에 예시된다:
Figure pct00017
Figure pct00018
혈청형 14 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA GMT가 하기 표 9에 기재되고, 이러한 데이터는 도 9에 예시된다:
Figure pct00019
Figure pct00020
혈청형 18C 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA GMT가 하기 표 10에 기재되고, 이러한 데이터는 도 10에 예시된다:
Figure pct00021
Figure pct00022
혈청형 19F 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA GMT가 하기 표 11에 기재되고, 이러한 데이터는 도 11에 예시된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
혈청형 23F 항체에 대한 혈청양성률 및 OPA GMT가 하기 표 12에 기재되고, 이러한 데이터는 도 12에 예시된다:
Figure pct00025
Figure pct00026
결과의 요약
모든 후보 백신 제형은 안전하고 잘 관용되었다. 시간 경과에 따라 혈액학, 생화학 및 소변 파라메터에서의 어떠한 임상적으로 현저한 변화도 관찰되지 않았다.
용량 1 후에 7일의 백신접종 후 기간 동안 최대 4.2% 내지 12.5%의 용량의 후보 백신 제형 이후에 3등급 응답형 국소 및 일반 AE가 각각 발생하였다. 이러한 발생은 23PPV 비교 그룹 (4.2%의 용량)에서 관찰된 것과 동일한 범위 내에 있었다. 3등급 발열 (구강 온도 > 39.5℃)은 보고되지 않았다.
높은 발생률의 3등급 응답형 국소 및/또는 일반 AE로의 경향은 일반적으로 후보 백신 제형의 연속 용량을 이용한 모든 그룹에서 관찰되지 않았다.
3등급 비응답형 AE가 후보 백신 제형에 대해 4.5% 내지 13.3%의 용량 이후에 보고되었다. 연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 고려되는 비응답형 AE가 후보 백신 제형에 대해 10.4% 내지 33.3%의 용량 이후에 보고되었고 주로 국소 반응이었다.
후보 백신 제형을 수용한 피검체에서 SAE는 보고되지 않았다.
PhtD와 함께 또는 PhtD 없이 폐렴구균의 단백질 dPly를 함유하는 제형은 면역원성이었다. 항-Ply 항체 GMC에서의 증가가 dPly 함유 제형으로 백신접종된 그룹에서 각 백신접종 후에 관찰되었고; 항-PhtD 항체 GMC에서의 증가가 PhtD 함유 제형으로 백신접종된 그룹에서 각 백신접종 후에 관찰되었다. 가장 높은 항-Ply 및 항-PhtD 항체 GMC는 30 μg의 dPly 및 PhtD 단백질을 함유하는 제형 (즉, 그룹 PlPh-30에 이어 10vPP30 그룹)에 대해 관찰되었다.
유리 단백질 제형 (알룸 흡착됨)은 OPA 반응을 유도하지 않는다. 각각의 백신 폐렴구균 혈청형에 대해 용량 1-이후 1개월 및 용량 2-이후 1개월에, 폐렴구균의 단백질들 (dPly 및 PhtD) 및 10Pn-PD-DiT를 조합시킨 제형을 수용한 피검체의 적어도 95.7%는 ≥ 8의 OPA 역가를 지녔다. OPA GMT에서의 증가는 용량 1-이후부터 용량 2-이후 시점까지 폐렴구균 혈청형의 일부에 대해 관찰되었다. 시험된 혈청형 (6B, 7F, 9V, 18C, 19F, 23F)의 대다수에서 용량 1 이후 또는 용량 2 이후의 계산된 OPA GMT 포인트 추정치는 10vPP10 그룹에 비해 10vPP30 그룹에서 더 높았다.
실시예 3 - 유아에서 수행된 고 용량 및 저 용량의 dPly 및 PhtD 를 포함하는 백신의 효능을 연구하기 위한 임상 시험
글락소스미스클라인 (GSK) 바이오로지칼즈의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질 함유 백신의 두 제형의 안전성, 반응원성 및 면역원성을 평가하기 위한 II기 랜덤화 제어된 관찰자-블라인드 연구가 생후 처음 6개월 동안 DTPa-HBV-IPV/Hib 백신과 공동-투여되는 3-용량 일차 백신접종 코스 (Epoch 1) 및 12-15개월에 부스터 용량 (Epoch 2)으로서 제공되었다.
이러한 임상 시험은 4개의 유사한 그룹을 이용하여 수행되었다;
1. 10 PCV / dPly / PhtD -10- AlPO 4 그룹 ('10vPP10' 결과 표 및 도면에서): DTPa-HBV-IPV/Hib 백신과 공동-투여되는 GSK 바이오로지칼즈의 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4 백신을 수용한 피검체.
2. 10 PCV / dPly / PhtD -30- AlPO 4 그룹 ('10vPP30' 결과 표 및 도면에서): DTPa-HBV-IPV/Hib 백신과 공동-투여되는 GSK 바이오로지칼즈의 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4 백신을 수용한 피검체.
3. 10 PCV 그룹 ('10Pn' 결과 표 및 도면에서): DTPa-HBV-IPV/Hib 백신과 공동-투여되는 GSK 바이오로지칼즈의 10PCV 백신을 수용한 피검체.
4. Prev13 그룹 ('13Pn-DTPa' 결과 표 및 도면에서): DTPa-HBV-IPV/Hib 백신과 공동-투여되는 화이자의 시판되는 13가 폐렴구균 컨쥬게이트 백신 (프레베나 13)을 수용한 피검체.
백신은 2, 3, 4개월에 3-용량 일차 백신접종 스케쥴 (Epoch 1, 완료됨)에 이어 12-15개월에 부스터 용량 (Epoch 2, 연구 진행중)에 따라 건강한 유아에 제공되었다.
안전성/ 반응원성 방법
그룹 평가 내 (설명 분석):
각 백신 용량 및 전체 일차 용량 이후에, 7일 (0일-6일)의 응답형 추적 관찰 기간 동안 각 개별적인 응답형 국소 및 일반 AE (부작용)를 보고하는 피검체의 백분율을 정확한 95% CI (신뢰 구간)로 각 그룹에 대해 표로 나타내었다. 용량 이후의 각 개별적인 응답형 국소 및 일반 AE 백분율을 각 그룹에 대해, 전체 일차 백신접종 과정을 통해, 정확한 95% CI로 표로 나타내었다. 백신접종과 인과 관계가 있는 3등급 응답형 AE 및 응답형 AE에 대해 동일한 도표화를 실행하였다. 발적 및 부종에 대해, 2 또는 3등급 AE도 도표화되었다. 발열은 0.5℃ 누적 증분에 대해 보고되었다. 각 개별적인 응답형 부작용에 대한 상기 모든 도표는 또한 각 백신접종 후 4일의 추적 관찰 기간 (0일-3일) 동안 수행되었다.
조절 활성에 대한 의학 사전 (MedDRA)에 의해 분류된 비응답형 AE의 적어도 1회의 보고가 있고 일차 백신접종 후 30일 이내에 보고된 피검체/용량의 비율을 각 그룹에 대해 정확한 95% CI로 표로 나타내었다. 백신접종과 인과 관계가 있는 3등급 비응답형 AE 및 비응답형 AE에 대해 동일한 도표화를 시행하였다.
의학적 방문 참석을 일으킨 AE의 비율도 표로 나타내었다.
SAE (중대 유해 사례) 및 SAE(들)로 인한 투여중지(들)를 상세하게 설명하였다.
면역원성 평가를 위한 실험실 검정 및 시점
Epoch 001 동안 Visit 1 및 Visit 4에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 원심분리 및 혈청 분리 후에, 스폰서에 의한 수집시까지 샘플을 -20℃에 저장하였다. 혈청의 분취량 (약 2.5 mL)을 하기 문단에 기재된 혈청학적 검사를 위해 GSK 바이오로지칼즈에 보냈다.
폐렴구균의 혈청형에 특이적인 총 IgG 항체 (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F에 대한 항체)를 실시예 2에 기재된 22F-억제 ELISA (효소 결합 면역흡수 검정)에 의해 각각 측정하였다. 항체 농도를, 10개 혈청형에 대한 IgG 및 IgM의 농도가 μg/mL로 알려져 있는 미식품의약국(FDA)으로부터 이용가능한 표준 참조 혈청 89-SF와 ELISA 곡선의 로지스틱 로그 비교에 의해 결정하였다. 검정의 컷오프는 0.05 μg/mL였다.
폐렴구균의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F 각각에 대한 항체에 대해 옵소닌식작용 활성 (OPA)을 OPA 검정 (실시예 2에 기재된 것과 유사함)에 의해 측정하였다. 결과를, 검정 조건 하에 살아 있는 폐렴구균의 50% 사멸을 수행할 수 있는 혈청의 희석율 (옵소닌 역가)로서 제시하였다. 검정의 컷오프는 8의 옵소닌 역가였다.
항-Ply 및 항-PhtD 항체를 개별적인 ELISA를 이용하여 정량하였다. 특수한 항-Ply 및 항-PhtD 항체의 농도를 표준 참조 혈청을 이용하여 결정하였다. 검정의 컷오프는 PD에 대해 100 EL.U/mL, dPly에 대해 12 EL.U/mL 및 PhtD에 대해 17 EL.U/mL였다.
안전성 및 반응원성 결과 (연구의 일차 결과)
안전성 분석을 총 백신접종된 코호트에서 수행하였다. 응답형 부작용
7일의 백신접종 후 기간 동안:
발적은 각 그룹에서 가장 빈번하게 보고되는 응답형 국소 AE였다 (10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4, 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4, 10PCV 및 Prev13 그룹에서 각각 43.6%, 44.7%, 40.1% 및 41.1%의 용량 후). 3.3%가 넘지 않는 용량 이후에는 각 그룹에서 주어진 카테고리의 3등급 응답형 국소 AE가 이어졌다.
과민성은 각 그룹에서 가장 빈번하게 보고되는 응답형 일반 AE였다 (10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4, 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4, 10PCV 및 Prev13 그룹에서 각각 55.5%, 55.5%, 55.0% 및 56.6%의 용량 후). 4.8%가 넘지 않는 용량 이후에는 각 그룹에서 주어진 카테고리의 3등급 응답형 일반 AE가 이어졌고 이들 중 대부분은 연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 간주되었다.
3-용량 일차 백신접종 과정 동안, 어떠한 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4 또는 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4 백신의 연속 용량에서도 응답형 국소 및 일반 AE의 발생률의 증가는 관찰되지 않았다.
비응답형 부작용
31일의 일차 백신접종 후 기간 동안:
10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4, 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4, 10PCV 및 Prev13 그룹의 각각 16.9%, 21.1%, 20.1% 및 19.7%의 용량 이후에 적어도 하나의 비응답형 AE가 따라왔다.
3등급 비응답형 AE는 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4, 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4, 10PCV 및 Prev13 그룹의 각각 0.0%, 0.2%, 0.5% 및 0.2%의 용량 후에 보고되었다. 이들 중에서 10PCV 그룹에서 보고된 한 3등급 AE (저장성 저반응성 에피소드)는 연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 고려되었다.
연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 고려된 비응답형 AE는 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4, 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4, 10PCV 및 Prev13 그룹의 각각 0.2%, 0.5%, 0.9% 및 0.0%의 용량에 대해 보고되었다.
중대 유해 사례:
일차 epoch (용량 1에서 visit 4까지) 동안, 적어도 하나의 SAE가 20명의 피검체에서 보고되었다: 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4 그룹에서 146명의 백신접종된 피검체 중 5명 (3.4%), 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4 그룹에서 142명의 백신접종된 피검체 중 2명 (1.4%), 10PCV 그룹에서 145명의 백신접종된 피검체 중 10명 (6.9%) 및 Prev13 그룹에서 142명의 백신접종된 피검체 중 3명 (2.1%). 이들 중에서 10Pn 그룹에서 31일의 추적 관찰 기간 동안 3등급 AE로서 보고된 한 SAE (저장성 저반응성 에피소드)는 연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 고려되었다. visit 4 때에 해소되지 않은 10Pn 그룹의 한 SAE (정신지체)를 제외하고 모든 SAE는 후유증 없이 해소되었다. 치명적인 SAE는 보고되지 않았다.
부작용 /중대 유해 사례로 인한 투여중지:
10PCV 그룹 (피검체 번호 607)의 한 피검체는 연구자에 의해 백신접종과 인과 관계가 있는 것으로 고려되는 SAE (저장성-저반응성 에피소드)로 인해 연구에서 물러났다. 이러한 사례는 6일 후에 후유증 없이 해소되었다.
면역원성
상기 결과는 10PCV/dPly/PhtD-10-AlPO4 및 10PCV/dPly/PhtD-30-AlPO4 백신이 모든 백신 항원 (즉, dPly 및 PhtD 폐렴구균의 단백질, 폐렴구균의 혈청형-특이적 캡슐 다당류 및 NTHi 단백질 D)에 대한 면역 반응을 유도하였음을 시사하였다.
실시예 4: PE - PilA 융합 단백질을 포함하는 다가 백신의 제형
3개의 백신을 설계하였다:
10V: 하기 10개의 에스. 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트를 함유하는 10가 (10V) 백신: 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1로부터의 캡슐 당류 (1-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4로부터의 캡슐 당류 (4-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5로부터의 캡슐 당류 (5-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B로부터의 캡슐 당류 (6B-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F로부터의 캡슐 당류 (7F-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V로부터의 캡슐 당류 (9V-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14로부터의 캡슐 당류 (14-PD), 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 캡슐 당류 (23F-PD), 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C로부터의 캡슐 당류 (18C-TT) 및 디프테리아 독소에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 캡슐 당류 (19F-DT).
12V: 10V와 동일한 10개의 에스. 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트와 추가적인 2개의 에스. 뉴모니애 당류 컨쥬게이트, 즉 CRM197에 컨쥬게이션된 19A (19ACRM) 및 CRM197에 컨쥬게이션된 6A (6ACRM)를 함유하는 12가 (12V) 백신.
12V+ 단백질 (12V+ prot ): PhtD, dPly 및 PE-PilA 융합 단백질이 첨가된 12V와 동일한 12개의 에스. 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트를 함유하는 백신.
항원의 제조
실시예 1에 기재된 대로 항원을 제조하였다. PEPilA 항원을 WO2012/139225호에 기재된 대로 제조하였다.
백신의 제형
10V 백신은 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 μg의 인간 용량으로 알루미늄 포스페이트에 함께 흡착된 에스. 뉴모니애 캡슐 당류 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 컨쥬게이트를 함유한다 (당류는 개별적으로 알루미늄 포스페이트에 흡착되며, 이어서 이들을 함께 혼합하고, 알루미늄 포스페이트 수준을 500μg로 조절하였다).
12V 백신을 10V 백신과 동일한 방식으로 제조하되 알루미늄 포스페이트 상에 흡착된 2μg 용량의 추가적인 혈청형 19A 및 6A 컨쥬게이트를 첨가하였다.
12V+ 단백질 백신을 12V 백신과 동일한 방식으로 제조하되 단 단백질 PhtD, dPly 및 PE-PilA를 첨가하였다. 12 컨쥬게이트 및 단백질을 각 30μg의 용량의 단백질 및 상기 12V에 대해 기술된 투여량을 이용하여 함께 혼합하였다 (이는 30μg의 PE-PilA를 나타내며, 30μg의 PE 및 30μg의 PilA를 나타내는 것은 아님을 주의하라).
실시예 5: 마우스에서 10V, 12V 및 12V+ 단백질 백신의 면역원성 비교
항-폐렴구균 다당류 PS (다당류) ELISA 의 설명
마이크로플레이트를 2시간 동안 37℃에서 캡슐 다당류 (CPS)로 코팅하였다 (PBS 중 웰 당 100μl의 2.5 μg/ml의 PS1 및 PS3, 5 μg/ml의 PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V 또는 14; 10 μg/ml의 PS19A 및 23F 또는 40 μg/ml의 PS18C 및 PS19F). 플레이트를 NaCl 150 mM (0.9%)-폴리소르베이트20 0.05%로 3회 세척하였다. 혈청을 CPS (1 mg CPS/비희석된 혈청 ml, 단 6A 및 6B는 2.5mg/ml임)를 함유하는 PBS-폴리소르베이트20 0.05% V/V에서 희석시키고 (6A 및 6B에 있어서는 1/2, 그 외의 혈청형에 있어서는 1/10), CPS에 대해 유도된 항체를 중화시키기 위해 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. '마우스에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 마우스로부터의 혈청 또는 참조 혈청 (크롬퓨어 (Chrompure)마우스 IgG로 보정된 내부 기준)을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% 중에 100 μl 연속 희석하였다 (2배 희석 단계). 플레이트를 실온에서 30분 동안 교반 하에 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 희석하고, 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체 (웰 당 100 μl)를 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 기질 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5-4.6 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA (오르토 페닐렌-디아민))을 각 웰 (100 μl)에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다. HCl 1N (50μl)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 분광기를 사용하여 흡광도를 490nm 또는 기준의 경우 620nm에서 판독하였다. 현상된 색은 혈청 중에 존재하는 항체의 양에 정비례한다.
PD , PE 및 PilA 항체를 측정하기 위한 ELISA 의 설명
플레이트를 탄산염 완충제 pH 9.6 중 웰 당 100 μl의 2 μg/ml의 PD (1 mg/ml), 2 μg/ml의 PE (1500 μg/ml), 2 μg/ml의 PilA (3660 μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 NaCl 0.9% 폴리소르베이트 20 0.05%로 4회 세척하였다. PE 및 PilA ELISA에 있어서, 플레이트를 실온에서 30분 동안 (진탕시키면서) PBS-BSA1%로 포화시켰다. 세척 후, '마우스에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 마우스로부터의 혈청 또는 참조 혈청 (크롬퓨어 마우스 IgG로 보정된 내부 기준)을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% (PD 검정에 있어서) 및 PBS 폴리소르베이트 20 0.05% BSA 0.1% (PE 및 PilA 검정) 중에서 100 μl 연속 희석하였다 (2배 희석 단계). 이어서 플레이트를 교반시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체 (웰 당 100 μl)와 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 세척하고, 기질 컨쥬게이트 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5-4.6 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA (오르토 페닐렌-디아민))을 각 웰 (100 μl)에 암실에서 15분 동안 첨가하였다. HCl 1N 50μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 490nm (기준의 경우 620nm)에서 판독하였다.
PhtD 및 dPly 항체를 측정하기 위한 ELISA 의 설명
플레이트를 2시간 동안 37℃에서 웰 당 100 μl의 1 μg/ml의 PhtD (1021 μg/ml) 또는 4μg/ml의 Ply (367μg/ml)로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 NaCl 0.09% 폴리소르베이트 0.05%로 3회 세척하였다. 세척 후, '마우스에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 마우스로부터의 혈청 또는 참조 혈청 (크롬퓨어 마우스 IgG로 보정된 내부 기준)을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% 중에서 100 μl 연속 희석하였다 (2배 희석 단계). 플레이트를 교반시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체 (웰 당 100 μl)와 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 세척하고, 기질 컨쥬게이트 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA)을 각 웰 (100 μl)에 암실에서 15분 동안 첨가하였다. HCl 1N 50μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 490nm (기준 필터의 경우 620nm)에서 판독하였다.
옵소닌식작용 검정 ( OPA )의 설명
혈청 샘플을 45분 동안 56℃에서 가열시켜 임의의 남아 있는 내인성 보체를 불활성화시켰다. 각 1:2 희석된 혈청 샘플의 25 마이크로리터 분취량을 96-웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트의 웰 당 25 μl의 OPA 완충제 (HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)-14.4% 불활성화된 FCS (우태아 혈청))으로 2배 연속 희석하였다. 후속하여, 예를 들어, 4/2/1 비 (v/v/v)의 활성화된 HL-60 세포 (1 x 107개 세포/ml), 새로 해동된 폐렴구균 작업 시드 및 새로 해동된 새끼 토끼 보체의 25 μl의 혼합물 (단 혈청형 1, 6B 및 6A에 있어서 비는 4/2/2임)을 희석된 혈청에 첨가하여 최종 부피 50 μl를 수득하였다. 검정 플레이트를 오비탈 진탕 (210 rpm)으로 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 식세포 과정을 촉진하였다. 적어도 1분 동안 얼음위에 마이크로플레이트를 두어 반응을 중단시키고, 플레이트를 사용시까지 얼음 상에 유지시켰다. 플레이트의 각 웰의 20 μl의 분취량을 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트의 상응하는 웰로 옮기고, 50 μl의 Todd-Hewitt Broth-0.9% 아가를 각 웰에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한 후, 아가에 나타난 폐렴구균 콜로니를 자동화 이미지 분석 시스템 (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 계수하였다. 혈청 샘플이 없는 8개의 웰을 박테리아 대조군으로서 사용하여 웰 당 폐렴구균의 수를 측정하였다. 대조군 웰의 CFU의 평균 수를 측정하고 각 혈청 샘플에 대한 사멸 활성의 계산에 사용하였다. 혈청 샘플에 대한 OPA 역가를 폐렴구균의 50% 사멸을 촉진할 수 있는 혈청의 상호 희석율에 의해 결정하였다. 옵소닌식작용 역가를 4-파라메터 곡선 핏 분석을 이용하여 계산하였다.
마우스에서 3개 백신 제형의 면역원성
두 그룹의 27마리 암컷 Balb/c 마우스를 단독의 단백질 (PhtD, dPly 및 PEPilA - 결과는 제시되지 않음), Prevnar 13 (TM 시중에서 입수가능한 스트렙토코쿠스 백신 - 결과는 제시되지 않음) 10V, 12V (DSP2A017) 및 12V+ 단백질 (DSP2A012) GMP 로트를 포함하는 상이한 제형의 1/10 인간 용량으로 0, 14 및 28일에 근내 (IM) 주입에 의해 면역화시켰다. 마우스의 다른 다리에 (임상 시험에서 유아의 다른 부위에서의 공동-투여를 모방함) 인간 용량의 10분의 1의 Infanrix Hexa (TM 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 필라멘트 헤마글루티닌, 퍼탁틴, B형 간염 표면 항원, 불활성화된 폴리오 바이러스 타입 1, 2 및 3, 및 해모필루스 인플루엔자 b 당류 (PRP)를 포함하는 백신))를 수용하게 하였다.
항-IgG 수준 및 옵소닌식작용 역가를 개체에서 개별적으로 측정하고 42일에 풀링된 혈청을 수집하였다.
IgG 항체 역가 및 옵소닌 활성을 유도하는 12V+ 단백질 백신의 능력을 평가하고 12V 및 10V 백신의 것과 비교하였다.
상이한 제형이 주입된 마우스로부터의 혈청을 다당류 혈청형 및 단백질에 대해서는 ELISA (상기 기술된 바와 같음) 및 12 다당류 혈청형에 대해서는 OPA에서 평가하였다.
12V+ 단백질 백신은 대부분의 혈청형에 있어서 12V와 유사한 반응을 유도하였다 (도 14 및 15).
도 16의 결과는 12V+ 제형 및 에스. 뉴모니애 당류 컨쥬게이트를 포함하지 않은 제형에 있어서 측정된 PE, PilA, PhtD, Ply 및 PD 항체 반응들 간에 통계적 차이가 없음을 입증하였다.
실시예 6: 기니아 피그에서 10V, 12V 및 12V+ 단백질 백신의 면역원성 비교
ELISA 항-폐렴구균 다당류 PS 의 설명
마이크로플레이트를 2시간 동안 37℃에서 PBS 중 기준 웰에 있어서 웰 당 100μl의 2.5 μg/ml의 PS1, 5 μg/ml의 PS4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V 또는 14; 10 μg/ml의 PS19A 및 23F, 40 μg/ml의 PS18C 및 PS19F 또는 2.5 μg/ml로 희석된 Affinipure 염소 항-기니아 피그 IgG (2.4mg/ml)로 코팅하였다. 플레이트를 NaCl 150 mM (0.9%)-폴리소르베이트 20 0.05%로 3회 세척하였다. 각 그룹으로부터의 풀링된 혈청을 CPS (1 mg CPS/비희석된 혈청 ml, 단 6A 및 6B는 2.5mg/ml임)를 함유하는 PBS-폴리소르베이트20 0.05% V/V에서 희석시키고 (6A 및 6B에 있어서는 1/2, 그 외의 모든 혈청형에 있어서는 1/10), CPS에 대해 유도된 항체를 중화시키기 위해 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. '기니아 피그에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 기니아 피그로부터의 혈청을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% 중에 100 μl 연속 희석하거나 (2배 희석 단계), 참조 혈청 (PBS-폴리소르베이트20 0.05% 중에 0.25 μg/ml로 희석된 크롬퓨어 기니아 피그 IgG (11 mg/ml))를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 교반 하에 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 희석하고, 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-기니아 피그 IgG 항체 (웰 당 100 μl)를 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 기질 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5-4.6 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA)을 각 웰 (100 μl)에 첨가하고, 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다. HCl 1N를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 분광기를 사용하여 흡광도를 490nm (기준의 경우 620nm)에서 판독하였다. 현상된 색은 혈청 중에 존재하는 항체의 양에 정비례한다.
PD , PE 및 PilA 항체를 측정하기 위한 ELISA 의 설명
플레이트를 PBS 중 탄산염 완충제 pH 9.6 중 웰 당 100 μl의 2 μg/ml의 PD (1 mg/ml), 2 μg/ml의 PE (1500 μg/ml) 또는 2 μg/ml의 PilA (3660 μg/ml), 또는 기준 웰에 있어서 PBS 중 2μg/ml로 희석된 Affinipure 염소 항-기니아 피그 IgG (2.4mg/ml)로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 NaCl 0.9% 폴리소르베이트 20 0.05%로 4회 세척하였다. PE 및 PilA ELISA에 있어서 (본 단계는 PD 및 Ply ELISA의 경우에는 수행되지 않음), 플레이트를 실온에서 30분 동안 PBS-BSA1%로 포화시켰다. 세척 후, '기니아 피그에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 기니아 피그로부터의 혈청 또는 참조 혈청 샘플 (크롬퓨어 기니아 피그 IgG로 보정된 내부 기준)을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% (PD ELISA에 있어서) 및 PE 및 PilA ELISA에 있어서 PBS 폴리소르베이트 20 0.05% BSA 0.1% 중에서 100 μl 연속 희석하였다 (2배 희석 단계). 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-기니아 피그 IgG 항체 (웰 당 100 μl)와 교반시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 세척하고, 기질 컨쥬게이트 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5-4.6 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA)을 각 웰 (100 μl)에 암실에서 15분 동안 첨가하였다. HCl 1N 50μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 490nm (기준 필터의 경우 620nm)에서 판독하였다.
PhtD 및 dPly 항체를 측정하기 위한 ELISA 의 설명
플레이트를 2시간 동안 37℃에서 PBS 중 웰 당 100 μl의 1 μg/ml의 PhtD (1021 μg/ml) 또는 2μg/ml의 Ply (376 μg/ml)로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 NaCl 0.9% 폴리소르베이트 0.05%로 4회 세척하였다. 세척 후, '기니아 피그에서 3개 백신 제형의 면역원성'이라는 제목의 섹션에 기술된 바와 같이 면역화된 기니아 피그로부터의 혈청 또는 참조 혈청 (크롬퓨어 기니아 피그 IgG로 보정된 내부 기준)을 마이크로웰에 첨가하고, PBS-폴리소르베이트20 0.05% 중에서 100 μl 연속 희석하였다 (2배 희석 단계). 플레이트를 교반시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-기니아 피그 IgG 항체 (웰 당 100 μl)와 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 세척하고, 기질 컨쥬게이트 (10ml의 시트레이트 0.1M pH 4.5-4.6 및 5 μl의 H2O2 중 4 mg의 OPDA)을 각 웰 (100 μl)에 암실에서 15분 동안 첨가하였다. HCl 1N 50μl를 첨가하여 반응을 중단시키고, 흡광도를 490nm (기준 필터의 경우 620nm)에서 판독하였다.
옵소닌식작용 검정
혈청 샘플을 45분 동안 56℃에서 가열하여 임의의 남아 있는 내인성 보체를 불활성화시켰다. 각 1:2 희석된 혈청 샘플의 25 마이크로리터 분취량을 96-웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트의 웰 당 25 μl의 OPA 완충제 (HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)-14.4% 불활성화된 FCS (우태아 혈청))에서 2배 연속 희석하였다. 후속하여, 예를 들어, 4/2/1 비 (v/v/v)의 활성화된 HL-60 세포 (1 x 107개 세포/ml), 새로 해동된 폐렴구균 작업 시드 및 새로 해동된 새끼 토끼 보체의 25 μl 혼합물 (단 혈청형 1, 6B 및 6A에 있어서 비는 4/2/2임)을 희석된 혈청에 첨가하여 최종 부피 50 μl를 수득하였다. 검정 플레이트를 오비탈 진탕 (210 rpm)으로 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 식세포 과정을 촉진하였다. 적어도 1분 동안 얼음 위에 마이크로플레이트를 두어 반응을 중단시키고, 플레이트를 추가 사용시까지 얼음 상에 유지시켰다. 플레이트의 각 웰의 20 μl 분취량을 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트의 상응하는 웰로 옮기고, 50 μl의 Todd-Hewitt Broth-0.9% 아가를 각 웰에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한 후, 아가에 나타난 폐렴구균 콜로니를 자동화 이미지 분석 시스템 (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 계수하였다. 혈청 샘플이 없는 8개 웰을 박테리아 대조군으로서 사용하여 웰 당 폐렴구균의 수를 측정하였다. 대조군 웰의 CFU의 평균 수를 측정하고 각 혈청 샘플에 대한 사멸 활성의 계산에 사용하였다. 혈청 샘플에 대한 OPA 역가를 폐렴구균의 50% 사멸을 촉진할 수 있는 혈청의 상호 희석율에 의해 결정하였다. 옵소닌식작용 역가를 4-파라메터 곡선 핏 분석을 이용하여 계산하였다.
기니아 피그에서 3개 백신 제형의 면역원성
두 그룹의 17마리 기니아 피그를 단독의 단백질 (PhtD, dPly 및 PEPilA - 결과는 제시되지 않음), Prevnar 13 (TM 시중에서 입수가능한 스트렙토코쿠스 백신 - 결과는 제시되지 않음) 10V, 12V (DSP2A017) 및 12V+ 단백질 (DSP2A012) GMP 로트를 포함하는 상이한 제형의 1/4 인간 용량으로 0, 14 및 28일에 근내 (IM) 주입에 의해 면역화시켰다. 기니아 피그의 다른 다리에 (임상 시험에서 유아의 다른 부위에서의 공동-투여를 모방함) 인간 용량의 4분의 1의 Infanrix Hexa (TM 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 필라멘트 헤마글루티닌, 퍼탁틴, B형 간염 표면 항원, 불활성화된 폴리오 바이러스 타입 1, 2 및 3, 및 해모필루스 인플루엔자 b 당류 (PRP)를 포함하는 백신))를 수용하게 하였다.
항-IgG 수준 및 옵소닌식작용 역가를 개체에서 개별적으로 측정하고 42일에 풀링된 혈청을 수집하였다.
12V+ 단백질, 12V 및 10V 백신간의 IgG 항체 역가 및 옵소닌 활성을 평가하고, 비교하였다.
상이한 제형이 주입된 기니아 피그로부터의 혈청을 다당류 혈청형 및 단백질에 대해서는 ELISA 및 12 혈청형 제형에 대해서는 OPA에서 평가하였다.
12V+ 단백질은 12V 제형과 유사한 반응을 유도하였다.
도 17 및 18의 결과는 PEPilA와 조합될 때 12가 컨쥬게이트의 면역원성에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 없음을 입증하였다.
12V+ 단백질 GMP 제형에서 얻어진 결과는 10V 다당류 뿐만 아니라 단백질의 면역원성을 입증하며 이러한 제형의 임상 평가를 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A <120> IMMUNOGENIC COMPOSITION <130> VB65266 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 818 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val Lys Lys Glu Ser 1 5 10 15 Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Ala Gly Gln Lys Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly Ile Asn Ala Glu 35 40 45 Gln Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gln Gly Tyr Val Thr Ser His Gly 50 55 60 Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr Asp Ala Ile Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln Leu Lys Asp Ser 85 90 95 Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile Lys Val Asp Gly 100 105 110 Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala Asp Asn Ile Arg 115 120 125 Thr Lys Glu Glu Ile Lys Arg Gln Lys Gln Glu His Ser His Asn His 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Asn Asp Gln Ala Val Val Ala Ala Arg Ala Gln Gly 145 150 155 160 Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala Ser Asp Ile Ile 165 170 175 Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile Val Pro His Gly Asp His Tyr His 180 185 190 Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ala Ala Glu 195 200 205 Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser 210 215 220 Tyr Asn Ala Asn Pro Ala Gln Pro Arg Leu Ser Glu Asn His Asn Leu 225 230 235 240 Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu Asn Ile Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg His Val Glu 260 265 270 Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser Arg Thr Ala 275 280 285 Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr 290 295 300 Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro Leu 305 310 315 320 Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro 325 330 335 Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro 340 345 350 Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys 355 360 365 Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly 370 375 380 Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala 385 390 395 400 Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu 405 410 415 Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn 420 425 430 Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn 435 440 445 Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg 450 455 460 Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu 465 470 475 480 Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn 485 490 495 Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala 500 505 510 Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile 515 520 525 Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His Ser 530 535 540 His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala 545 550 555 560 Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His 565 570 575 Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn 580 585 590 Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn 595 600 605 Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His 610 615 620 Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu 625 630 635 640 Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val 645 650 655 Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn Gly 660 665 670 Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp Gln Asp 675 680 685 Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr 690 695 700 His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser 705 710 715 720 Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu 725 730 735 Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val Glu Asn 740 745 750 Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu Lys 755 760 765 Val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gln Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly 770 775 780 Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser 785 790 795 800 Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gln Pro Ala 805 810 815 Pro Ile <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S. pneumoniae polyhistidine triad protein (Pht) family histidine triad motif <221> VARIANT <222> (2)...(3) <223> X is any amino acid other than his <221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> X is any amino acid other than his <400> 2 His Xaa Xaa His Xaa His 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> S. pneumoniae protein having a Type II Signal sequence Motif <221> VARIANT <222> (2)...(3) <223> X is any amino acid <400> 3 Leu Xaa Xaa Cys 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> unknown <220> <223> S. pneumoniae surface protein Cell Wall Anchored motif <221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> X is any amino acid <400> 4 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5

Claims (79)

  1. 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 뉴몰리신이 화학적으로 탈독화된 것인 면역원성 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 뉴몰리신이 유전적으로 탈독화된 것인 면역원성 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 D)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 면역원성 조성물이 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물.
  6. 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 PhtD를 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 D)가 WO00/37105호의 서열 ID No.4의 아미노산 21-838에 있는 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 조성물.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 조성물이 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 조성물이 인간 용량 당 26μg-45μg (예를 들어 26μg-40μg, 28μg-35μg 또는 약 30μg)의 탈독화 뉴몰리신 (dPly)을 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 0.2 내지 1.0 ml의 용량 부피를 갖는 면역원성 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 0.5ml의 용량 부피를 갖는 면역원성 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질이 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 (PhtX), 콜린 결합 단백질 패밀리 (CbpX), CbpX 트렁케이트, LytX (자가용해 효소) 패밀리, LytX 트렁케이트, CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질, PcpA (폐렴구균의 콜린 결합 단백질 A), PspA (폐렴구균의 표면 단백질 A), PsaA (폐렴구균의 표면 부착 A), Sp128 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 128), Sp101 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 101), Sp130 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 130), SP125 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 125) 및 SP133 (스트렙토코쿠스 뉴모니애 133)으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질이 PhtB, PhtE, PhtA 또는 PhtBD 또는 PhtDE 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리 히스티딘 트라이애드 패밀리 (PhtX) 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 인간 용량 당 1μg-100μg, 1μg-50μg, 1μg-20μg, 28μg-35μg, 약 10μg 또는 약 30μg의 적어도 하나의 추가의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 수중유 애쥬번트를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 리포솜의 형태로 제공되는, QS21, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 인지질 및 스테롤을 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 QS21을 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 모노포스포릴 지질 A (MPL)를 포함하는 애쥬번트를 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 하나 이상 (예컨대, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개)의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 1 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 4 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 5 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 6B 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 7F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제 20항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 9V 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  27. 제 20항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 14 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  28. 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 18C 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  29. 제 20항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 19F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  30. 제 20항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 23F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  31. 제 20항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 3 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  32. 제 20항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 6A 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  33. 제 20항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 19A 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  34. 제 20항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 33F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  35. 제 20항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이션된 혈청형 22F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제 20항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 디프테리아 톡소이드, CRM197 (교차반응성 물질 197), 탈독화 뉴몰리신, 단백질 D (에이치. 인플루엔자로부터), PhtD (폴리 히스티딘 트라이애드 D), PhtDE (폴리 히스티딘 트라이애드 D 및 폴리 히스티딘 트라이애드 E 간의 융합 단백질) 및 N19로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 담체 단백질에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  37. 제 20항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 모두 독립적으로 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  38. 제 21항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 1 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  39. 제 22항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 4 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  40. 제 23항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 5 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  41. 제 24항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 6B 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  42. 제 25항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 7F 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  43. 제 26항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 9V 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  44. 제 27항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 14 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  45. 제 28항에 있어서, 컨쥬게이션된 혈청형 18C 당류가 파상풍 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  46. 제 29항에 있어서, 컨쥬게이션된 19F 당류가 디프테리아 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  47. 제 30항에 있어서, 컨쥬게이션된 23F 당류가 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  48. 제 32항에 있어서, 컨쥬게이션된 6A 당류가 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  49. 제 33항에 있어서, 컨쥬게이션된 19A 당류가 CRM197에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  50. 제 20항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트 중 소수가 단백질 D에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  51. 제 20항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 1 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 4 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 5 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 6B 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 7F 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 9V 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 14 당류, 단백질 D에 컨쥬게이션된 혈청형 23F 당류, 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 18C 당류 및 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된 혈청형 19F 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  52. 제 20항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  53. 제 20항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 뉴모니애로부터의 하나 이상의 캡슐 당류가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  54. 제 20항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  55. 제 20항 내지 제 51항, 제 52항 또는 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
  56. 제 20항 내지 제 51항, 제 52항 또는 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 환원성 아민화를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 당류를 포함하고 환원성 아민화 이외의 화학, 예를 들어 CDAP 화학을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  57. 제 20항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트의 용량이 컨쥬게이트 당 1 내지 10μg, 1 내지 5μg, 또는 1 내지 3μg의 당류인 면역원성 조성물.
  58. 제 20항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이트 당 1μg의 당류의 투여량의 혈청형 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및 23F (및 임의로 6A 및/또는 3)로부터의 당류의 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
  59. 제 20항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트가 컨쥬게이트 당 3μg의 당류의 투여량의 혈청형 4, 18C, 및 19F(및 임의로 22F 및/또는 19A)로부터의 당류의 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
  60. 제 20항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14 또는 13개 미만의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 당류 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
  61. 제 20항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이, 컨쥬게이션된 당류 혈청형 및 컨쥬게이션되지 않은 당류 혈청형의 수가 23개 이하가 되도록, 컨쥬게이션된 것들과 상이한 혈청형의 컨쥬게이션되지 않은 에스. 뉴모니애 당류를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  62. 제 1항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  63. 제 62항에 있어서, 애쥬번트가 알루미늄 포스페이트인 면역원성 조성물.
  64. 제 62항에 있어서, 애쥬번트가 알루미늄 하이드록사이드인 면역원성 조성물.
  65. 제 63항에 있어서, 애쥬번트가 인간 용량 당 100-750, 200-500, 또는 300-400 μg의 Al을 알루미늄 포스페이트로서 포함하는 면역원성 조성물.
  66. 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신.
  67. 면역보호 용량의 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 66항의 백신을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환에 대해 인간 숙주를 면역화시키는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 숙주가 성인인 방법.
  69. 제 67항에 있어서, 숙주가 노인인 방법.
  70. 제 67항에 있어서, 숙주가 영아 또는 유아인 방법.
  71. 제 67항 내지 제 70항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 폐렴(pneumonia), 침습성 폐렴구균 질환(invasive pneumoncoccal disease)(IPD), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)의 악화, 중이염(otitis media), 재발 중이염, 수막염(meningitis), 균혈증(bacteraemia), 및 결막염(conjunctivitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 포함하는 방법.
  72. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 제 66항에 따른 백신.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 사용이 면역원성 조성물의 성인 숙주로의 투여를 포함하는 면역원성 조성물.
  74. 제 72항 또는 제 73항에 있어서, 상기 사용이 면역원성 조성물의 노인 숙주로의 투여를 포함하는 면역원성 조성물.
  75. 제 72항에 있어서, 상기 사용이 면역원성 조성물의 영아 또는 유아 숙주로의 투여를 포함하는 면역원성 조성물.
  76. 제 72항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 폐렴, 침습성 폐렴구균 질환 (IPD), 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)의 악화, 중이염, 재발 중이염, 수막염, 균혈증, 및 결막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 포함하는 면역원성 조성물.
  77. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 66항의 백신의 용도.
  78. 제 77항에 있어서, 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 66항의 백신을 성인 숙주, 노인 숙주 및 영아 또는 유아 숙주로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주에 투여하는 것을 포함하는 용도.
  79. 제 77항 또는 제 78항에 있어서, 질환이 폐렴, 침습성 폐렴구균 질환 (IPD), 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)의 악화, 중이염, 재발 중이염, 수막염, 균혈증, 및 결막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 포함하는 용도.
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