JP2014000016A - 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 - Google Patents
豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014000016A JP2014000016A JP2012136031A JP2012136031A JP2014000016A JP 2014000016 A JP2014000016 A JP 2014000016A JP 2012136031 A JP2012136031 A JP 2012136031A JP 2012136031 A JP2012136031 A JP 2012136031A JP 2014000016 A JP2014000016 A JP 2014000016A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vaccine
- gene
- recombinant protein
- seq
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質、該組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、他の特定の塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、前記組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
【選択図】なし
Description
〔1〕配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質、
〔2〕配列番号1に示すアミノ酸配列を含む前記組換えタンパク質、
〔3〕前記組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
配列番号2に示す塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子、
〔4〕配列番号2に示す塩基配列からなるDNAを含む前記遺伝子、
〔5〕前記遺伝子を含む組換えベクター、
〔6〕前記組換えベクターを含む形質転換体、
〔7〕前記形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から組換えタンパク質を採取する工程を含む、前記組換えタンパク質の製造方法、
〔8〕前記組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔9〕前記組換えベクターを利用したヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔10〕さらにアジュバンドを含む前記ヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン、
〔11〕豚用である前記ヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン
に関する。
また、前記組換えタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを利用して、DNAワクチン又はウイルスワクチンを作製することもできる。
本発明は、配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質に関する。
なお、ERH_0768の全アミノ酸配列や全塩基配列は、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)などの公知のデータベースで、確認することができる。
具体的には、配列番号1に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。これらの変異を施す配列の位置は、特に限定はないが、前記の相同性の範囲内であることに加えて、後述の豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を失わない位置であればよい。また、本発明では、pQE‐30以外の発現ベクターを使用した場合に、配列番号1のN末端側のアミノ酸配列が変更されたアミノ酸配列も「配列番号1に示すアミノ酸配列」に含まれる。また、配列番号1に示すアミノ酸配列を全て備えたアミノ酸配列は100%の相同性を有するとする。
前記組換えタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号2に示す塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子が挙げられる。
配列番号2に示す塩基酸配列は、1794塩基から構成されている。5’末端側の48個の塩基配列は発現ベクターpQE‐30(QIAGEN 社)由来のものである。そして、続く1746個のアミノ酸はERH_0768由来の配列であり、その全塩基配列からシグナル配列である、5’末端側の75塩基を除いた配列である。
また、配列番号2に示す塩基配列を全て備えた塩基配列は100%の相同性を有するとする。
また、得られる塩基配列に対しては、必要に応じて、公知の手法に基づいて、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加させてもよい。
本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の前記遺伝子を連結(挿入)して得ることができる。前記組換えベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
なお、前記DNAワクチンでは前記組換えベクターを組み込んだDNAをワクチンとし、ウイルスワクチンでは前記組換えベクターを含むウイルスをワクチンとし、細菌ワクチンでは前記組換えベクターを含む細菌をワクチンとするが、いずれも処置対象の非ヒト動物に対して適当なDNA、ウイルス、細菌を適宜選択し、公知の手法に従って作製すればよい。なお細菌ワクチンに使用する細菌は、後述の形質転換体で宿主となる細菌と同じものも使用できる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジン等から株化した植物細胞やプロトプラスト、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞等が挙げられる。
また、本発明の組換えベクターを導入した宿主をワクチンとする場合には、例えば、ウイルスワクチンではアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、
等のウイルス、細菌ワクチンでは豚丹毒菌、乳酸菌、サルモネラ菌等が挙げられる。
これらの宿主は目的に応じて適宜選択すればよい。
本発明の組換えタンパク質は、前述の形質転換体(宿主細胞)を適当な培地で培養し、その培養物から豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体の培養は、常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる天然培地、あるいは合成培地で培養すればよい。また、植物細胞を宿主として用いている場合には、チアミン、ピリドキシン等のビタミン類を添加した植物細胞用の培地で培養すればよい。
本発明の組換えタンパク質は、ヒト又は非ヒト動物における豚丹毒菌の感染症を防ぐためのワクチン(以下、豚丹毒菌ワクチンという)用の抗原として使用できる。したがって、本発明の豚丹毒菌ワクチンは、前記組換えタンパク質を含むものである。ただし、前記組換えタンパク質をそのままワクチンとして使用した場合、抗体の産生や感染防御効果は弱いと考えられる。そのため、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化することによって、前記組換えタンパク質に対する抗体の産生や、感染防御効果の増強が必要になる。各種免疫賦活剤の添加も有効である。
前記DNAワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン等の調製方法は特に限定されない。DNAワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン等も上記の組換えタンパク質の場合と同様に滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化することができる。
本発明のワクチンは、このアジュバントの配合によって、豚丹毒菌に対する優れた防御効果と高い安全性を獲得することができる。
豚丹毒菌の全ゲノム配列(アクセションナンバーAP012027)において、C末端にGWモジュールを含む繰り返しアミノ酸配列を含むタンパク質を検索し、ERH_0768を同定した。豚丹毒菌Fujisawa株のゲノムDNAをテンプレートに、ERH_0768遺伝子は、768F(配列番号3:CCCGAGCTCGAGGAGCGAAAACCGAGAGAA)及び768R(配列番号4:CCCAAGCTTCTATTTTTTTAGTGCTCCTTG)のプライマーを用いてそれぞれPCRを行い増幅した。この増幅産物をSac I及びHind IIIの制限酵素で消化後、同制限酵素で消化したpQE30ベクター(Qiagen社)にライゲーション後、クローニングを行った。なお、前記PCR、ライゲーション及びクローニングは公知の手法に基づいて行った。また、塩基配列の決定は、サンガー法により行い、図1、配列番号2に示す配列であることを確認した。この組換えタンパク質は、図2及び配列番号1に示すようにN末端側に6個の連続したヒスチジン配列のタグを含み、ERH_0768の全アミノ酸配列からシグナル配列である、N末端側の25アミノ酸を除いたERH_0768のアミノ酸配列をからなる約70kDaの組換えタンパク質である(図3参照)。
実施例1で得られた組換えタンパク質について、マウス豚感染モデルを用いた組み換えワクチンとしての有効性を以下のようにして評価した。
供試動物:4週齢のddyマウス20匹をワクチン群10匹、対照群10匹に振り分けた。
ワクチンの調整:ERH_0768遺伝子産物をPBSで終濃度0.2mg/mlになるように希釈したもの1容量と1/3容量のISA‐25(SEPPIC)を混合、乳化したものをワクチンとして用いた。
ワクチン接種方法:各ワクチン群に対して2週間隔で2回、下肢筋肉内に0.1mlずつ接種した。対照群については接種を行わなかった。
攻撃材料:豚丹毒菌強毒株(Fujisawa株)を一晩培養した菌液を攻撃材料とし た。
攻撃方法:最終免疫後2週後に攻撃材料0.1ml(1×105CFU/ml)を下肢皮下に接種した。
観察及び効果判定:攻撃後10日間、臨床症状観察を行った。
対照群においては攻撃後2日目からマウスの死亡が観察され、4日目には全頭が死亡した。一方、ワクチン免疫群では5日目からマウスの死亡が観察され、観察終了時の生存率は30%であった。
これらの結果からERH_0768遺伝子産物を免疫したマウスは、豚丹毒菌強毒株(Fujisawa株)攻撃による致死活性に対する防御効果を示すことが確認された。
Claims (11)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有する組換えタンパク質。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列を含む請求項1に記載の組換えタンパク質。
- 請求項1又は2に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
配列番号2に示す塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ豚丹毒菌に対する防御免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 - 配列番号2に示す塩基配列からなるDNAを含む請求項3に記載の遺伝子。
- 請求項3又は4に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から組換えタンパク質を採取する工程を含む、請求項1又は2に記載の組換えタンパク質の製造方法。
- 請求項1又は2に記載の組換えタンパク質を含むヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
- 請求項5に記載の組換えベクターを利用したヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
- さらにアジュバンドを含む請求項8又は9に記載のヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
- 豚用である請求項8〜10いずれかに記載のヒト又は非ヒト動物用豚丹毒菌ワクチン。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012136031A JP2014000016A (ja) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012136031A JP2014000016A (ja) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014000016A true JP2014000016A (ja) | 2014-01-09 |
Family
ID=50033880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012136031A Pending JP2014000016A (ja) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2014000016A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115850404A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-03-28 | 中国兽医药品监察所 | 一种串联优势表位的重组猪丹毒杆菌表面保护抗原a及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002510649A (ja) * | 1998-04-07 | 2002-04-09 | メディミューン,インコーポレイテッド | 肺炎球菌コリン結合タンパク質誘導体を利用するワクチンと抗体 |
JP2004508417A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-03-18 | グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ワクチン |
WO2005083072A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における豚丹毒菌表層防御抗原変異体の製造方法 |
-
2012
- 2012-06-15 JP JP2012136031A patent/JP2014000016A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002510649A (ja) * | 1998-04-07 | 2002-04-09 | メディミューン,インコーポレイテッド | 肺炎球菌コリン結合タンパク質誘導体を利用するワクチンと抗体 |
JP2004508417A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-03-18 | グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ワクチン |
WO2005083072A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における豚丹毒菌表層防御抗原変異体の製造方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6016000006; Y Ogawa, et al.: 'The Genome of Erysipelothrix rhusiopathiae, the Causative Agent of Swine Erysipelas, Reveals New Ins' JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 193, No. 12, 201106, 2959-2971 * |
JPN6016000008; 'choline-binding protein [Erysipelothrix rhusiopathiae str. Fujisawa]' [online] , 20110531, [retrieced on 2015-12-17] * |
JPN6016000009; 'Erysipelothrix rhusiopathiae str. Fujisawa DNA, complete genome.' [online] , 20110531 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115850404A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-03-28 | 中国兽医药品监察所 | 一种串联优势表位的重组猪丹毒杆菌表面保护抗原a及其应用 |
CN115850404B (zh) * | 2022-12-13 | 2024-02-09 | 中国兽医药品监察所 | 一种串联优势表位的重组猪丹毒杆菌表面保护抗原a及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3370672B2 (ja) | ウェルシュ菌ワクチン | |
JP3415145B2 (ja) | 弱毒化細菌における組換えタンパク質の発現 | |
US20100266639A1 (en) | Expression system | |
JP2002511752A (ja) | 生弱毒ワクチン | |
KR20090074262A (ko) | 돌연변이된 클로스트리듐 퍼프린겐스 알파 독소 항원을 포함하는 괴사성 장염의 가금류 백신, 및 백신의 제조 방법 | |
US20180015157A1 (en) | Attenuated Pasteurella Multocida Vaccines & Methods of Making & Use Thereof | |
US11857613B2 (en) | Vaccine for prevention of necrotic enteritis in poultry | |
US11975061B2 (en) | Protective immunity enhanced Salmonella vaccine (PIESV) against Brucella spp | |
Chen et al. | Immunogenicity and efficacy of two DNA vaccines encoding antigenic PspA and TerD against Nocardia seriolae in hybrid snakehead | |
KR101987775B1 (ko) | 구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 | |
JP2014000016A (ja) | 豚丹毒菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 | |
WO2009113664A1 (ja) | 組換え皮膚壊死トキソイドを含有する豚萎縮性鼻炎用薬剤 | |
CN114058634B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体基因工程亚单位疫苗 | |
CN102847168B (zh) | 一种预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的设计及其构建 | |
KR101975895B1 (ko) | 구제역 바이러스의 가용성 다가 항원단백질 및 이의 용도 | |
KR20190014265A (ko) | 돼지 흉막폐렴의 예방 또는 치료용 백신 조성물 | |
WO2010097977A1 (ja) | 豚丹毒・豚マイコプラズマ肺炎経口投与型多価ワクチン | |
CN113046384A (zh) | 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法 | |
CN104402974A (zh) | 一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途 | |
JP6039648B2 (ja) | 併用ワクチン | |
RU2677790C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка | |
US20130330295A1 (en) | Antigenic gly1 polypeptide | |
KR101672719B1 (ko) | 바이러스 중화항원 단백질 발현을 위한 보르데텔라 백일해 균주 및 이를 이용한 면역원성 조성물 | |
JP2013192546A (ja) | マイコプラズマ属細菌の新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組換えベクターとその利用 | |
KR101713635B1 (ko) | 비브리오 패혈증균의 시스테인 단백질 분해효소 도메인 유래 재조합 단백질 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150417 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150417 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20151224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160112 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160517 |