MX2012009142A - Proceso para produccion de gamma-butirolactona. - Google Patents

Proceso para produccion de gamma-butirolactona.

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Erik Anderson
John Licata
Kevin A Sparks
Christopher Mirley
M S Sivasubramanian
William R Farmer
Jeffrey A Bickmeier
Ann D Ambruoso
Frank A Skraly
Thomas M Ramseier
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Abstract

En la presente se describen procesos y métodos para producir gamma-butirolactona de base biológica a partir de recursos de carbono renovables.

Description

PROCESO PARA PRODUCCION DE GAMMA-BUTIROLACTONA Antecedentes de la Invención Con la disminución de los recursos de petróleo, aumento de los precios de energía, y preocupaciones ambientales, el desarrollo de procesos de biorefinerías con uso eficiente de energía para producir productos químicos de base biológica a partir de recursos de carbono, de bajo costo, renovables ofrece una solución única para superar las limitaciones incrementadas de productos químicos a base de petróleo .
Un producto químico con amplios usos industriales y farmacéuticos que podría ser manufacturado usando un proceso de biorefinería es la gamma-butirolactona (GBL) . La demanda del mercado mundial para GBL se ha estimado en 850 millones de lbs/año, traducido a ventas totales de $1 billón anualmente. La gamma-butirolactona es un líquido incoloro de olor débil que se usa predominantemente como un intermediario en la manufactura de productos químicos comercialmente importantes tales como 1,4-butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano (THF) , N-metilpirrolidona (NMP) , N-etilpirrolidona (NEP) , 2-pirrolidinona, N-vinilpirrolidona ( VP) , polivinilpirrolidona (PVP) etcétera. Estos productos químicos tienen aplicaciones en solventes de alto desempeño para electrónica, extracción de aceite lubricante, revestimientos de cables magnéticos, Ref . : 233343 resinas de ingeniería, intermediarios farmacéuticos, cosméticos, aerosol para el cabello y polímeros de alto valor. La GLB por si sola tiene muchos usos incluyendo como un solvente para despintado, desengrasante, modificador de viscosidad para poliuretanos , dispersante de tintas solubles en agua, agente de curación para uretanos y poliamidas, agente de grabado para plásticos revestidos con metal, aditivo de caucho e ingrediente herbicida.
La GBL a base de petróleo se manufactura por diversos procesos químicos diferentes. Por ejemplo, se sintetiza por deshidratación de ácido gamma-hidroxibutírico (GHB) , por la reacción de acetileno con formaldehído o hidrogenación en fase vapor de anhídrido maleico o anhídrido succínico y sus éteres . Los últimos dos métodos son respectivamente conocidos como el proceso Reppe y el proceso Davy. El proceso Reppe fue desarrollado en la década de 1940 e históricamente fue la primera ruta comercial para producir 1 , 4 -butanodiol . El proceso inicia haciendo reaccionar acetileno y formaldehído conjuntamente lo cual luego es seguido por una serie de etapas de hidrogenación para obtener BDO y finalmente la deshidrogenación para generar GBL. Las desventajas principales de este proceso son que los reactivos de partida son bastante peligrosos y generalmente presentan al fabricante desafíos de manejo y ambientales. Adicionalmente, el acetileno es un material de partida relativamente costoso.
El Proceso Davy, desarrollado en la década de 1990, usa un proceso de múltiples etapas que inicia haciendo reaccionar anhídrido maleico fundido con metanol para producir maleato de monometilo. Luego el maleato de monometilo se convierte de maleato de mono a dimetilo en la presencia de un catalizador de resina ácida. Utilizando la hidrogenación catalítica en fase vapor, el maleato de dimetilo se convierte a succinato de dimetilo y luego finalmente a través de una serie de reacciones adicionales a una GBL. El producto final se refina para obtener la GBL de alta pureza. Muchas patentes describen los diversos tipos de catalizadores de hidrogenación utilizados para convertir el anhídrido maleico o anhídrido succínico a GBL. Estos incluyen cromito de cobre (descrito en la Patente de Estados Unidos No. 3,065,243), cromito de cobre con níquel (Patente de Estados Unidos No. 4,006,165), y mezclas de óxidos de cobre, zinc o aluminio (Patente de Estados Unidos No. 5,347,021) así como también mezclas de óxidos de aluminio y cobre reducidos (Patente de Estados Unidos No. 6,075,153).
Aún con el gran número de catalizadores de hidrogenación disponibles para la producción de GBL, hay deficiencias en el desempeño del catalizador las cuales necesitan ser superadas tales como el rendimiento, selectividad, fácil recuperación del producto y costo.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevos procesos de manufactura de GBL que dirijan no solamente las mejoras en el rendimiento, pureza, y costo del producto sino también usen materiales de partida sustentables que tengan un impacto más positivo en el medio ambiente.
Breve Descripción de la Invención La invención generalmente se refiere a procesos de biorefinería integrados para producir el producto gamma-butirolactona (GBL) de base biológica de alto rendimiento, de alta pureza a partir de recursos de carbono renovables. En un aspecto, se describe un proceso para la producción de producto gamma-butirolactona (GBL) a partir de una biomasa microbiana genéticamente modificada que metaboliza la glucosa o cualquier otro material de alimentación renovable para producir el homopolímero de -hidroxibutirato (P4HB) dentro de las células microbianas, seguido por calentamiento controlado de la biomasa que contiene P4HB con un catalizador que forma el producto gamma-butirolactona (GBL) . El nivel de P4HB en la biomasa debe ser mayor que 10% en peso de la biomasa total. Las ventajas de este bioproceso son que usa una fuente de carbono renovable como el material de alimentación, el microbio genéticamente modificado produce P4HB con rendimiento muy alto sin efectos de toxicidad adversos a la célula huésped (lo cual podría limitar la eficiencia del proceso) y cuando se combina con un catalizador y se calienta es capaz de producir GBL de base biológica con alto rendimiento, con alta pureza.
En ciertos aspectos, una biomasa de P4HB modificada recombinante de un organismo huésped sirve como una fuente renovable para convertir el homopolímero de 4-hidroxibutirato a la GBL intermediaria útil. En algunas modalidades, una fuente del material de alimentación renovable se selecciona de glucosa, fructosa, sacarosa, arabinosa, maltosa, lactosa, xilosa, ácidos grasos, aceites vegetales, y gas de síntesis derivado de biomasa o una combinación de dos o más de estos. La biomasa de P4HB producida luego se trata en la presencia de un catalizador para producir gamma-butirolactona (GBL) . En otras modalidades, la biomasa de P4HB se seca antes de la combinación con el catalizador. En ciertas modalidades, el proceso adicionalmente comprende recuperar el producto gamma-butirolactona. En ciertas modalidades, la recuperación es por condensación.
En algunas modalidades, la GBL se procesa adicionalmente para la producción de otros productos básicos y especializados deseados, por ejemplo 1 , 4 -butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano (THF) , N-metilpirrolidona ( MP) , N-etilpirrolidona (NEP) , 2-pirrolidinona, N-vinilpirrolidona ( VP) , polivinilpirrolidona (PVP) y similares.
El organismo huésped utilizado para producir la biomasa que contiene P4HB se ha modificado genéticamente por introducción de genes y/o supresión de genes en un organismo de producción de P4HB de tipo silvestre o genéticamente modificado creando cepas que sintetizan el P4HB a partir de materiales de alimentación renovables no costosos. Una trayectoria ejemplar para la producción de P4HB se proporciona en la FIG. 1 y se entiende que los cambios enzimáticos adicionales que contribuyen a esta trayectoria también se pueden introducir o suprimir para una producción deseada de P4HB.
En un aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la producción de producto gamma-butirolactona de base biológica. En ciertas modalidades, la gamma-butirolactona en el producto tiene 100% contenido de carbono de base biológica (por ejemplo, como se determina con base en el análisis de isótopo 1C) . El proceso incluye combinar una biomasa genéticamente modificada que comprende poli-4-hidroxibutirato y un catalizador; calentar la biomasa con el catalizador para convertir el 4-hidroxibutirato a producto gamma-butirolactona . En ciertas modalidades, un rendimiento de producto gamma-butirolactona es aproximadamente 85% en peso o mayor con base en un gramo de una gamma-butirolactona en el producto por gramo del poli-4-hidroxibutirato . El huésped recombinante genéticamente modificado produce un polímero de 4-hidroxibutirato.
En otro aspecto, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4-hidroxibutirato, en donde el huésped tiene una mutación de inhibición en su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NAD independiente de CoA o su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADP independiente de CoA, o que tiene mutaciones de inhibición en ambos genes, y que tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehído deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a 4 -hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4 -hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4 -hidroxibutirilo-CoA a poli -4-hidroxibutirato . En un aspecto adicional, el huésped tiene dos o más, tres o más, cuatro o más o todos los cinco de los genes establemente incorporados que codifican las enzimas listadas anteriormente.
En todavía otro aspecto de la invención, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldeído 3-fosfato a 1 , 3 -bisfosfoglicerato formando NADPH+H+, una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a 1 , 3 -bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4 -hidroxibutirilo- fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirilo-fosfato a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de ynel, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
En un aspecto adicional, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4-hidroxibutirato y que establemente expresa dos o más genes que codifican dos o más enzimas, tres o más genes que codifican tres o más enzimas, cuatro o más genes que codifican cuatro o más enzimas o cinco o más genes que codifican cinco o más enzimas seleccionadas de: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, y una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a 1, 3-bisfosfoglicerato formando NADPH+H, una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a 1, 3-bisfosfoglicerato formando NADH+H; y opcionalmente que tiene una interrupción en uno o más genes, dos o más genes, tres o más genes, cuatro o más genes, cinco o más genes, o seis genes seleccionados de ynel, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
En otra modalidad, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4-hidroxibutirato, en donde el huésped tiene una mutación de inhibición en su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NAD independiente de CoA o su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADP independiente de CoA, o que tiene mutaciones de inhibición en ambos genes, y que tiene genes establemente incorporados que codifican las siguientes enzimas: una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehído deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a -hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4 -hidroxibutirilo-CoA a poli-4-hidroxibutirato.
En todavía otra modalidad, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado genes que codifican las siguientes enzimas: una fosfpenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a l, 3-bisfosfoglicerato formando NADPH+H+, una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a 1 , 3 -bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4 -hidroxibutirilo-fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirilo- fosf to a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de ynel, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
En ciertas modalidades, en donde la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4 -hidroxibutirato, en donde el huésped tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehído deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a 4 -hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4-hidroxibutirilo-CoA a poli-4 -hidroxibutirato .
En otras modalidades, la biomasa genéticamente modificada para uso en los procesos de la invención es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a raalato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosf to a 1,3-bisfosfoglicerato formando NADPH+H"1", una gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4 -hidroxibutirilo- fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirilo-fosfato a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de ynel, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
En un cierto aspecto de la invención, un huésped recombinante se cultiva con un material de alimentación renovable para producir una biomasa de 4-hidroxibutirato, la biomasa producida luego se trata en la presencia de un catalizador para producir el producto gamma-butirolactona (GBL) , en donde un rendimiento del producto gamma-butirolactona es aproximadamente 85% en peso.
En ciertas modalidades, la fuente del material de alimentación renovable se selecciona de glucosa, fructosa, sacarosa, arabinosa, maltosa, lactosa, xilosa, ácidos grasos, aceites vegetales, y gas de síntesis derivado de biomasa o una combinación de los mismos.
La invención también pertenece a un producto gamma-butirolactona de base biológica producido por los procesos descritos en la presente. En ciertos aspectos, la cantidad de gamma-butirolactona en el producto producido es 85% o mayor que 85%. En un aspecto adicional, la invención pertenece a una biomasa de poli-4-hidroxibutirato producida a partir de recursos renovables la cual es adecuada como un material de alimentación para producir el producto gamma-butirolactona, en donde el nivel de poli-4-hidroxibutirato en la biomasa es mayor que 50% en peso de la biomasa.
En ciertas modalidades de la invención, el huésped de biomasa es bacterias, levadura, hongos, algas, cianobacterias , o una mezcla de dos o más de los mismos. Las bacterias incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus (renombrada como Ralstonia eutropha) , Bacillus spp., Alcaligenes latus, Azotobacter, Aeromonas, Comamonas, Pseudomonads) , Pseudomonas, Ralstonia, Klebsiella) , Synechococcus sp PCC7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803, y Thermosynechococcus elongatus BP-I (cianobacteria) , Chlorobium tepidum (bacteria verde de azufre) , Chloroflexus auranticus (bacteria verde no de azufre) , Chromatium tepidum y Chromatium vinosum (bacteria púrpura de azufre) , Rhodospirillum rubru , Rhodobacter capsulatus, y Rhodopseudomonas palustris . En otras modalidades, el huésped recombinante es algas. Las algas incluyen, pero no se limitan a, Chlorella minutissima, Chlorella emersonii , Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. , o Chlorella protothecoides .
En ciertas modalidades de la invención, el calentamiento es a una temperatura de aproximadamente 100°C a aproximadamente 350°C o aproximadamente 200°C a aproximadamente 350°C, o desde aproximadamente 225°C a 300°C. En algunas modalidades, el calentamiento reduce el contenido de agua de la biomasa a aproximadamente 5% en peso, o menos. En las modalidades descritas, el calentamiento es por un período de tiempo desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos o es desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas. En ciertas modalidades, la gamma-butirolactona comprende menos de 5% de productos secundarios no deseados. En ciertas modalidades, el catalizador es carbonato de sodio o hidróxido de calcio. El porcentaje en peso de catalizador está en el intervalo de aproximadamente 4% a aproximadamente 50%. En modalidades particulares, el % en peso del catalizador está en el intervalo de aproximadamente 4% a aproximadamente 50%, y el calentamiento es a aproximadamente 300°C. En ciertas modalidades, el producto gamma-butirolactona se recupera adicionalmente . En algunas modalidades, el catalizador tiene 4% en peso de hidróxido de calcio y el calentamiento es a una temperatura de 300°C.
Adicionalmente, la biomasa reducida en PHA (residual) agotada adicionalmente se utiliza para el desarrollo de energía, por ejemplo como un combustible para generar vapor y/o calor de proceso.
Breve Descripción de las Figuras Lo anterior será evidente a partir la siguiente descripción más particular de las modalidades ejemplares de la invención, como se ilustra en las figuras acompañantes en las cuales los caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en todas las vistas diferentes. Las figuras no son necesariamente a escala, en su lugar se pone énfasis en ilustrar las modalidades de la presente invención.
La FIG. 1 es un diagrama esquemático de trayectorias metabólicas centrales de E. coli ejemplares que muestran las reacciones que fueron modificadas o introducidas en los Ejemplos o que podrían ser modificadas. Los números en la figura se refieren a números de reacción en la Tabla 1A. Las reacciones que fueron eliminadas suprimiendo los genes correspondientes son marcadas con una "X" . Abreviaturas : "GA3P" , D-gliceraldehído-3-fosfato; "G1,3P", 1,3-difosfatoglicerato; "PEP" , fosfoenolpiruvato; "PYR" , piruvato; "AcCoA" , acetil-CoA; "CIT" , citrato; "ICT", isocitrato; "aKG" , alfa-cetoglutarato "SUC-CoA", succinilo CoA; "SUC", succinato; "Fum" , fumarato; "MAL", L-malato; "OAA" , oxaloacetato; "SSA" , semialdehído succínico; "4HB" , 4-hidroxibutirato; "4HB-CoA" , 4-hidroxibutirilo CoA; "P4HB", poli-4 -hidroxibutirato . Reacciones numeradas: "1", gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; "2", piruvato cinasa; "3", fosfoenolpiruvato carboxilasa "4", enzima málica; "5", isocitrato liasa; "6", malato deshidrogenasa; "7", succinato semialdehído deshidrogenasa; "8", alfa-cetoglutarato descarboxilasa; "9", semialdehído succínico reductasa; "10", CoA transferasa; "11", polihidroxialcanoato sintasa; "12", succinato-semialdehído deshidrogenasa, dependiente de NADP+ .
La FIG. 2 es un esquema de la recuperación de GBL de la biomasa con residuos convertidos a combustible sólido, de acuerdo con varias modalidades.
La FIG. 3 es una curva de pérdida de peso contra tiempo a 300°C en N2 para caldo de fermentación de P4HB seco sin cal (curva continua) y con adición de 5% cal (curva punteada), de acuerdo con las diversas modalidades. Las curvas muestran las inclinaciones de pérdida de peso y tiempos de comienzo de la pérdida de peso completada.
Las FIGS. 4A-4C es una serie de cromatogramas de gas de polímero puro de P4HB, caldo seco de P4HB y caldo seco de P4HB + 5% catalizador de cal (Ca(OH)2) después de la pirólisis a 300°C, de acuerdo con una modalidad.
La FIG. 5 es una coincidencia de biblioteca espectral de masas del pico de GC-MS a 6.2 min a GBL (gamma-butirolactona) de acuerdo con una modalidad.
La FIG. 6 es una coincidencia de biblioteca espectral de masas del pico de GC-MS a 11.1 min de pico para dímero de GBL de acuerdo con una modalidad.
La FIG. 7 es un diagrama esquemático del kit utilizado para la pirólisis aumentada de biomasa de P4HB.
Descripción Detallada de la Invención Sigue una descripción de las modalidades ejemplares de la invención.
La presente invención proporciona procesos y métodos para la manufactura de gamma-butirolactona (GBL) de base biológica a partir de un microbio genéticamente modificado que produce polímero de poli-4-hidroxibutirato (biomasa de P4HB) . Para los propósitos de esta invención P4HB se define para incluir también el copolímero de 4- idroxibutirato con 3 -hidroxibutirato donde el % del 4-hidroxibutirato en el copolímero es mayor que 80%, 90%, preferiblemente mayor que 95% de los monómeros en el copolímero. En ciertas modalidades, la biomasa de P4HB se produce por procesos de producción de P4HB mejorados utilizando los huéspedes recombinantes descritos en la presente. Estos huéspedes recombinantes se han construido genéticamente para aumentar el rendimiento de P4HB manipulando (por ejemplo, inhibición y/o sobre-expresión) ciertos genes en la trayectoria de P4HB para aumentar el rendimiento de P4HB en la biomasa. La biomasa de P4HB se produce en un proceso de fermentación en el cual el microbio genéticamente modificado se alimenta con un sustrato renovable. Los sustratos renovables incluyen materiales de alimentación de fermentación tales como azúcares, aceites vegetales, ácidos grasos o gas de síntesis producidos de materiales de cultivo de plantas. El nivel de P4HB producido en la biomasa del sustrato de azúcar es mayor que 10% (por ejemplo, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%) del peso seco total de la biomasa. La biomasa de P4HB luego se combina con un catalizador y se calienta para descomponer térmicamente el P4HB a GBL de base biológica.
En la presente se describen unos procesos alternativos para manufacturar GBL con base en la utilización de fuentes de carbono renovables para producir un polímero de poli-4-hidroxibutirato (P4HB) de base biológica en una biomasa que luego se convierte a gamma-butirolactona de base biológica .
Los polímeros biodegradables de base biológica tales como polihidroxialcanoatos (PHAs) , se producen naturalmente en sistemas de biomasa, tal como biomasa microbiana (por ejemplo, bacterias incluyendo cianobacterias, levadura, hongos), biomasa de plantas, o biomasa de algas. Se han desarrollado sistemas de biomasa genéticamente modificados los cuales producen una amplia variedad de copolímero y polímeros de PHA biodegradables con alto rendimiento (Lee (1996) , Biotechnology & Bioengineering 49:1-14; Braunegg et al. (1998), J". Biotechnology 65:127-161; Madison, L. L. and Huisman, G. W. (1999) , Metabolic Engineering of Poly-3 -Hidroxialcanoatos ; From DNA to Plástic, in: Mícrobiol . Mol. Biol . Rev. 63:21-53). Los polímeros de PHA son bien conocidos como compuestos térmicamente inestables que se degradan fácilmente cuando se calientan hasta y más allá de sus puntos de ebullición (Cornelissen et al., Fuel, 87, 2523, 2008). Usualmente es un factor limitante cuando el procesamiento de los polímeros para aplicaciones plásticas que, sin embargo, pueden ser apalancadas para crear productos de base biológica, los procesos de manufactura químicos que parten de 100% recursos renovables.
Cuando el poli -4 -hidroxibutirato (P4HB) puro, producido usando 1 , 4 -butanodiol derivado de petróleo, se calienta hasta 250-350°C, se degrada térmicamente a GBL volátil exclusivamente descomprimiendo la cadena de polímero (Kim et al. (2006), Polymer Degradation and Stability, 91:2333-2341) . Como se describe en la presente, se agregan catalizadores de bajo costo a una biomasa genéticamente modificada con una producción aumentada de P4HB para acelerar la reacción de degradación a gamma-butirolactona . La gamma-butirolactona se recupera y el catalizados no costoso se deja con la biomasa residual o se puede recircular opcionalmente de nuevo al proceso después de la regeneración adecuada incluyendo la regeneración térmica. La combinación de la reacción de catalizador con biomasa que produce P4HB de alto rendimiento específicamente genéticamente modificada es una alternativa económica y ambiental a los procesos a base de petróleo tradicionales.
Huéspedes Recombinan es con Trayectorias Metabólicas para producir P4HB La modificación genética de huéspedes (por ejemplo, bacterias, hongos, algas, plantas y similares) como plataformas de producción para materiales nuevos y modificados proporciona una solución sustentable para aplicaciones industriales amigables para el medio ambiente, de alto valor para la producción de productos químicos. En la presente se describen métodos de proceso para producir gamma-butirolactona de base biológica a partir de una biomasa de polihidroxialcanoato P4HB recombinante genéticamente modificada. Los procesos descritos en la presente evitan efectos tóxicos al organismo huésped produciendo el producto químico de base biológica posterior al cultivo o posterior a la recolección, son rentables y altamente eficientes (por ejemplo, usan menos energía para la producción) , disminuyen las emisiones de gas de invernadero, usan recursos renovables y se pueden procesar adicionalmente para producir producto de alta pureza a partir de GBL con alto rendimiento.
La biomasa de PHA utilizada en los métodos descritos en la presente se modifica genéticamente para producir el poli-4 -hidroxibutirato (P4HB) . Una trayectoria ejemplar para la producción de P4HB se proporciona en la FIG. 1 y a continuación se proporciona una descripción más detallada de la trayectoria, huéspedes recombinantes que producen la biomasa de P4HB.L La trayectoria se puede modificar genéticamente para aumentar la producción de P4HB a partir de fuentes de alimentación de carbono.
Como se usa en la presente, "biomasa de P4HB" se propone que signifique cualquier biomasa genéticamente modificada a partir de un huésped recombinante (por ejemplo, bacteria) , que incluye una cantidad que no se presenta naturalmente del polímero de polihidroxialcanoato , por ejemplo, poli -4 -hidroxibutirato (?4??) . En algunas modalidades, una fuente de la biomasa de P4HB es bacteria, levadura, hongos, algas, cianobacteria de cultivo de planta, o una mezcla de dos o más de los mismos. En ciertas modalidades, el título de biomasa (g/L) de P4HB se ha incrementado cuando se compara con el huésped sin la sobre-expresión o inhibición de un o más genes en la trayectoria de P4HB. En ciertas modalidades, el título de P4HB se reporta como un porcentaje de peso de célula seca (% dcw) o como gramos de P4HB/Kg de biomasa.
La "sobre-expresión" se refiere a la expresión de un polipéptido o proteína codificada por un ADN introducido en una célula huésped, en donde el polipéptido o proteína ya sea no está presente normalmente en la célula huésped, o donde el polipéptido o proteína está presente en la célula huésped a un nivel mayor que el normalmente expresado del gen endógeno que codifica el polipéptido o proteína. "Inhibición" o "bajo regulación" se refiere a la supresión o eliminación de un gen que codifica un polipéptido o proteína. En algunas modalidades, la inhibición significa inactivar el gen que produce una enzima en la trayectoria. En ciertas modalidades, los genes introducidos son de un organismo heterólogo .
Se han desarrollado sistemas de producción de PHA microbiano genéticamente modificado con huéspedes que crecen en grasa tal como Escherichia coli. En ciertas modalidades, la modificación genética también permite la modificación de microbios de tipo silvestre para mejorar la producción del polímero de P4HB. Los ejemplos de modificaciones de producción de PHA se describen en Steinbuchel & Valentín, FEMS Microbiol . Lett. 128:219-28 (1995) . La Publicación de PCT No. WO 98/04713 describe métodos para controlar el peso molecular utilizando modificación genética para controlar el nivel de la enzima PHA sintasa. Las cepas comercialmente útiles, incluyendo Alcaligenes eutrophus (renombrada como Ralstonia eutropha) , Alcaligenes latus, Azotobacter vinlandii , y Pseudomonads , para producir PHAs se describen en Lee, Biotechnology & Bioengineering, 49:1-14 (1996) y Braunegg et al., (1998) , J. Biotechnology 65: 127-161. Las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,316,262, 7,229,804 6,759,219 y 6,689,589 describen sistemas biológicos para la manufactura de polímeros de PHA que contienen 4-hidroxiácidos , incorporados para referencia en la presente .
Aunque han existido reportes de producción de copolímeros de 4 -hidroxibutirato a partir de recursos renovables tales como azúcar o aminoácidos, el nivel de 4HB en los copolímeros producidos a partir de sustratos renovables escalables ha sido mucho menor que 50% de los monómeros en los copolímeros y por lo tanto no adecuado para practicar la invención descrita. La producción de la biomasa de P4HB utilizando un microorganismo modificado genéticamente con recursos renovables donde el nivel de P4HB en la biomasa es suficiente para practicar la invención descrita (es decir, mayor que 40%, 50%, 60% o 65% del peso de biomasa seca total) previamente no se ha logrado .
El porcentaje en peso de PHA en la biomasa de tipo silvestre varía con respecto a la fuente de la biomasa. Para sistemas microbianos producidos por un proceso de fermentación a partir de materiales de alimentación, basados en recursos renovables, tales como azúcares, aceites vegetales o glicerol, la cantidad de PHA en la biomasa de tipo silvestre puede ser aproximadamente 65% en peso, o más, del peso total de la biomasa. Para sistemas de cultivo de plantas, en particular cultivos de biomasa tales como caña de azúcar o pasto aguja, la cantidad de PHA puede ser aproximadamente 3%, o más, del peso total de la biomasa. Para sistemas de algas o cianobacterias , la cantidad de PHA puede ser aproximadamente 40%, o más del peso total de la biomasa.
En ciertos aspectos de la invención, el huésped recombinante se ha modificado genéticamente para producir una cantidad aumentada de P4HB en comparación con el huésped de tipo silvestre. La biomasa de P4HB de tipo silvestre se refiere a la cantidad de P4HB que un organismo típicamente produce en la naturaleza.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, el P4HB se aumenta entre aproximadamente 20% a aproximadamente 90% sobre el tipo silvestre o entre aproximadamente 50% a aproximadamente 80%. En otras modalidades, el huésped recombinante produce al menos aproximadamente un aumento de 20% de P4HB sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 30% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 40% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 50% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 60% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 70% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 75% sobre el tipo silvestre, al menos aproximadamente un aumento de 80% sobre el tipo silvestre o al menos aproximadamente un aumento de 90% sobre el tipo silvestre. En otras modalidades, el P4Hb está entre aproximadamente un aumento de 2 veces a aproximadamente un aumento de 400 veces sobre la cantidad producida por el huésped de tipo silvestre. La cantidad de P4HB en el huésped o planta se determina por cromatografía de gas de acuerdo con los procedimientos descritos en Doi, Microbial Polyesters , John Wiley&Sons, p24, 1990. En ciertas modalidades, se logra un título de biomasa de 100-120g de P4HB/Kg de biomasa. En otras modalidades, la cantidad de título de P4HB se presenta como porcentaje en peso de célula seca (% dcw) .
Cepas de huéspedes adecuadas En ciertas modalidades, la cepa huésped es cepa E. coli K-12 LS5218 (Spratt et al., J. Bacteriol. 146 (3) : 1166-1169 (1981); Jenkins and Nunn, J". Bacteriol. 169 (l) :42-52 (1987)) . Otras cepas de huésped E. coli K-12 adecuadas incluyen, pero no se limitan a, MG1655 (Guyer et al., Cold Spr. Harb. Symp . Quant . Biol . 45:135-140 (1981)), WG1 y W3110 (Bachmann Bacteriol. Rev. 36(4) : 525-57 (1972) ) . Alternativamente, la cepa E. coli W (Archer et al., BMC Genomics 2011, 12:9 doi : 10.1186/ 1471 - 2164 - 12 - 9 ) o cepa E. coli B (Delbruck and Luria, Arch. Biochem. 1:111-141 (1946) ) y sus derivados tal como REL606 (Lenski et al., Am. Nat . 138:1315-1341 (1991)) son otras cepas de huésped E. coli adecuadas.
Otras cepas de huésped microbiano ejemplares incluyen pero no se limitan a: Ralstonia eutropha, Zoogloea ramiger , Allochromatiu vinosum, Rhodococcus ru£>er, Delftia acidovorans, Aero onas caviae, Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942, Thiocapsa pfenigii, Bacillus megaterium, Acinetobacter bau annii , Acinetobacter baylyi, Clostrídium kluyveri , Methylobacteriu extorquens, Nocardia corralina, Nocardia salmonicolor, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp. 6-19, Pseudomonas sp. 61-3 y Pseudomonas putida, Rhodobacter sphaeroides, Alcaligenes latus, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynejbacterium grlutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, y Clostridium acetobutylicum. Las levaduras u hongos ejemplares incluyen especies seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyvero yces arxi nus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Pichia pastoris .
Las especies de cepas de algas ejemplares incluyen pero no se limitan a: cepas de Chlorella, especies seleccionadas de: Chlorella minutissima, Chlorella emersonii , Chlorella sorokiniana , Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. , o Chlorella protothecoides. Fuente de genes recombinantes Las fuentes de ácidos nucleicos codificantes para una enzima de trayectoria de P4HB pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie donde el producto de gen codificado es capaz de catalizar la reacción referenciada . Tales especies incluyen organismo tanto procariotas como eucariotas incluyendo, pero no limitadas a, bacterias, incluyendo arqueas y eubacterias, y eucariotas, incluyendo levadura, plantas, insectos, animales, y mamíferos, incluyendo humano.
Las especies ejemplares para tales fuentes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Saccharo yces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri , Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beij erinckii , Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perjringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii , Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thermophilus, especies de Pseudomonas, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri , Pseudomonas fluorescens, Chlorella minutissima, Chlorella emersonii , Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Chlorella sp. , Chlorella protothecoides, Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter spaeroides, Thermoanaerobacter brock.il, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, ChloroJlexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii , Erythrobacter, Simmondsia chinensis, especies de Acinetobacter, incluyendo Acinetojacter calcoaceticus y Acinetobacter baylyi, Porphyromonas gingivalis, Sulfolobus tokodaii , Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius , Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus egaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Rattus norvegicus, Klebsiella pneumonía, Klebsiella oxytoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thermoacetica, Thermotoga marítima, Halobacteriu salina rum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa, Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcusfermentans, Lactococcus lac tis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida, Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Kluyvero yces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, Natranaerobius thermophilusm, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia arcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, gamma proteobacteria marina Penicillium chrysogenum, y bacteria que produce butirato. Por ejemplo, los huéspedes microbianos (por ejemplo, organismos) que tienen producción biosintética de P4HB se ejemplifican en la presente con referencia a un huésped de E. coli. Sin embargo, con la secuencia de genoma completa disponible para ahora más de 550 especies (con más de la mitad de estas disponibles en bases de datos públicas tales como la NCBI) , incluyendo 395 genomas de microorganismos y una variedad de genomas de levadura, hongos, plantas, y mamíferos, la identificación de los genes que codifican la actividad biosintética de P4HB necesaria para uno o más genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, desplazamientos genéticos homólogos, ortólogos, parálogos y no ortólogos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones genéticas entre organismos es rutinario y bien conocido en el arte. Por consiguiente, las alteraciones metabólicas que hacen posible la biosíntesis de P4HB y otros compuestos de la invención descritos en la presente con referencia a un organismo particular tal como E. coli se pueden aplicar fácilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos iguales procariotas y eucariotas . Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos expertos en el arte reconocerán que una alteración metabólica ejemplificada en un organismo se puede aplicar igualmente a otros organismos .
Producción de Huésped Transgénico para Producir 4HB Los huéspedes transgénicos (Recombinantes ) para producir P4HB son genéticamente modificados utilizando técnicas convencionales conocidas en el arte. Los genes clonados y/o valorados para cepas huéspedes que producen PHA que contiene P4HB y productos químicos de 4 carbonos son presentados más adelante en la Tabla 1A, junto con el número de Comisión de Enzima (número EC) y referencias apropiados. Algunos genes fueron sintetizados para la optimización de codón mientras que otros fueron clonados vía PCR del ADN genómico del huésped nativo o tipo silvestre. Como se usa en la presente, "heterólogo" significa de otro huésped. El huésped puede ser de la misma o diferente especie. La FIG. 1 es una trayectoria ejemplar para producir P4HB.
Tabla 1A. Genes en cepas huéspedes microbianas que producen PHA que contiene 4HB y productos químicos de 4 carbonos. Un asterisco (*) después del nombre del gen denota que la secuencia de nucleótido fue optimizada para la expresión en E. coli.
Otras proteínas capaces de catalizar las reacciones listadas en la Tabla 1A se pueden descubrir consultando la literatura científica, patentes o por búsquedas de BLAST contra, por ejemplo bases de datos de nucleótidos o proteínas en NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los genes sintéticos luego se pueden crear para proporcionar una trayectoria fácil de las bases de datos de secuencia a ADN físico. Tales genes sintéticos se diseñan y fabrican desde el principio, utilizando codones para mejorar la expresión de proteína heteróloga, optimizando las características necesarias para el sistema de expresión y huésped. Las compañías tales como, por ejemplo DNA 2.0 ( enlo Park, CA 94025, USA) proporcionarán tal servicio rutinario. Las proteínas que pueden catalizar algunas de las reacciones bioquímicas listadas en la Tabla 1A se proporcionan en las Tablas 1B-1Z.
Tabla IB. Homólogos adecuados para la proteína GapA (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa-A, de Escherichia coli, EC No. 1.2.1.12, la cual actúa en D-gliceraldehído 3-fosfato para producir 1 , 3 -difosfatoglicerato no. de acceso de proteína NP_416293.1) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína gliceraldehído-3 -fosfato NP 456222 deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato ZP 04561688 deshidrogenasa A gliceraldehído- 3 - fosfato CBK85249 deshidrogenasa gliceraldehído-3 -fosfato ZP 05729429 deshidrogenasa, tipo I gliceraldehído-3 -fosfato ZP 04613128 deshidrogenasa gliceraldehído-3 - fosfato NP 929794 deshidrogenasa gliceraldehído-3 -fosfato YP 002648641 deshidrogenasa A gliceraldehído-3 -fosfato CBA72924 deshidrogenasa A gliceraldehído-3 -fosfato ZP 07394569 deshidrogenasa A Tabla 1C. Homólogos adecuados para la proteína Gdpl (gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa, de Kluyveromyces lactis, EC No. 1.2.1.12, la cual actúa en D-gliceraldehído 3-fosfato para producir 1, 3-difosfatoglicerato; no. de acceso de proteína XP_455496) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína proteína hipotética XP 446770 producto de proteína no nombrado CAA24607 gliceraldehído 3 -fosfato EDN63283 deshidrogenasa gliceraldehído 3 -fosfato Q9UVC0 deshidrogenasa gliceraldehído 3 -fosfato XP 002171328 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato Q01077 deshidrogenasa proteína hipotética CRE_18 XP 003115497 gliceraldehído 3-fosfato CAA06030 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato ABQ81648 deshidrogenasa Tabla ID. Homólogos adecuados para la proteína Gap2 (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+) (fosforilación), de Synechocystis sp., EC No. 1.2.1.59, la cual actúa en D-gliceraldehído 3-fosfato para producir 1,3-difosfatoglicerato; no. de acceso de proteína CAA58550) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína gliceraldehído 3-fosfato NP_442821 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_003889819 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_002372721 deshidrogenasa producto de proteína no nombrado CA091151 gliceraldehído 3-fosfato ZP_01729953 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_723521 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato ZP_06309941 deshidrogenasa, tipo I gliceraldehído 3-fosfato ZP_07113693 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato ZP 01623628 deshidrogenasa Tabla 1E. Homólogos adecuados para la proteína GapB (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 2, de Bacillus subtilis, EC No. 1.2.1.59, la cual actúa en D-gliceraldehído 3-fosfato para producir 1, 3-difosfatoglicerato; no. de acceso de proteína NP_390780) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína gliceraldehído 3-fosfato YP_003974321 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_003921301 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_001487767 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_080196 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_148579 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato YP_001376482 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato ZP_01173259 deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato ZP_06809473 deshidrogenasa, tipo I gliceraldehído 3-fosfato YP_00ll2674l deshidrogenasa Tabla 1F . Homólogos adecuados para la proteína GapN (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP putativa, de Streptococcus pyogenes, EC No. 1.2.1.12, la cual actúa en D-gliceraldehído 3-fosfato para producir 1,3-difosfatoglicerato; no. de acceso de proteína NP_664849) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína gliceraldehído-3 -fosfato YP_002997128 deshidrogenasa dependiente de NADP gliceraldehído-3-fosfato YP_002744716 deshidrogenasa dependiente de NADP gliceraldehído-3-fosfato Q3C1A6 deshidrogenasa dependiente de NADP gliceraldehído-3-fosfato ZP_07725052 deshidrogenasa (NADP+) gliceraldehído-3 -fosfato YP_820625 deshidrogenasa dependiente de NADP gliceraldehído-3 -fosfato YP_001034755 deshidrogenasa dependiente de NADP, putativa ADN ligasa LigA dependiente de ZP_01825832 NAD gliceraldehído-3 -fosfato ZP_06011937 deshidrogenasa (NADP+) aldehido deshidrogenasa YP_003307897 Tabla 1G. Homólogos adecuados para la proteína Ppc ( fosfoenolpiruvato carboxilasa, de Escherichia coli, EC No. 4.1.1.31, la cual actúa en fosfoenolpiruvato y dióxido de carbono para producir oxaloacetato; no. de acceso de proteína NP_418391) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_ 02904134 fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_ 002384844 fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_ 003367228 fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_ 02345134 fosfoenolpiruvato carboxilasa ZP_ 04558550 fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_ 003615503 fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_ 002241183 fosfoenolpiruvato carboxilasa CBK84190 fosfoenolpiruvato carboxilasa YP_ 003208553 Tabla 1H. Homólogos adecuados para la proteína Ppc (fosfoenolpiruvato carboxilasa, de Medicago sativa, EC No. 4.1.1.31, la cual actúa en fosfoenolpiruvato y dióxido de carbono para producir oxaloacetato; no. de acceso de proteína Q02909) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa proteína prela fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa fosfoenolpiruvato carboxilasa Tabla II . Homólogos adecuados para la proteína AceA (isocitrato liasa, de Escherichia coli K-12, EC No. 4.1.3.1, la cual actúa en isocitrato para producir glioxilato y succinato; no. de acceso de proteína NP_418439) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína isocitrato liasa NP_290642 isocitrato liasa ZP_04558565 isocitrato liasa YP_002218096 isocitrato liasa, putativa YP_002932565 isocitrato liasa YP_002241049 proteína hipotética ESA_00054 YP_001436195 isocitrato liasa YP_003261295 proteína de la familia isocitrato ZP_07952710 liasa isocitrato liasa YP_002514615 isocitrato liasa YP_001234628 Tabla 1J. Homólogos adecuados para la proteína AceB (malato sintasa A, de Escherichia coli K-12, EC No. 2.3.3.9, la cual actúa en glioxilato y acetilo-CoA para producir malato; no. de acceso de proteína NP_418438) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína malato sintasa YP 002385083 malato sintasa A ZP_06356448 malato sintasa YP_002917220 malato sintasa YP_001480725 malato sintasa YP_001399288 malato sintasa A YP_003714066 malato sintasa NP_933534 malato sintasa A YP_002253716 malato sintasa YP_081279 Tabla 1K. Homólogos adecuados para la proteína SucD (succinato semialdehído deshidrogenasa, de Clostridium kluyveri, EC No. 1.2.1.76, la cual actúa en succinilo-CoA para producir succinato semialdehído; no. de acceso de proteína YP_001396394 ) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína Succinato semialdehído AAA92347 deshidrogenasa dependiente de CoA succinato- semialdehído ZP_06559980 deshidrogenasa [NAD(P}+] succinato-semialdehído ZP_05401724 deshidrogenasa [NAD(P)+] proteína de la familia aldehido- ZP_07821123 alcohol deshidrogenasa succinato- semialdehído ZP_06983179 deshidrogenasa [NAD(P)+] succinato- semialdehído YP_001928839 deshidrogenasa proteína hipotética ZP_03778292 CLOHYLEM_05349 succinato-semialdehído YP_003994018 deshidrogenasa [NAD (P) +] succinato-semialdehído NP_904963 deshidrogenasa Tabla 1L. Homólogos adecuados para la proteína KgdM (alfa-cetoglutarato descarboxilasa, de Mycobacterium tuberculosis, EC No. 4.1.1.71, la cual actúa en alfa-cetoglutarato para producir succinato semialdehído y dióxido de carbono; no. de acceso de proteína NP_335730) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína alfa-cetoglutarato descarboxilasa yp_ 001282558 alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_ 854934 2-oxoglutarato deshidrogenasa ZP_ 06454135 SUCA 2-oxoglutarato deshidrogenasa ZP_ 04980193 sucA alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_ 961470 alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_ 001852457 Kgd alfa-cetoglutarato descarboxilasa NP_ 301802 alfa-cetoglutarato descarboxilasa ZP_ 05215780 alfa-cetoglutarato descarboxilasa YP_ 001702133 Tabla 1M. Homólogos adecuados para la proteína SsaRAt (semialdehído succínico reductasa, de Arabidopsis thaliana, EC No. 1.1.1.61, la cual actúa en succinato semialdehído para producir 4 -hidroxibutirato; no. de acceso de proteína AAK94781) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína proteína que contiene dominio de XP_002885728 enlace de NAD 6-fosfogluconato deshidrogenasa proteína hipotética isoforma 1 XP_002266252 proteína prela XP_002320548 proteína hipotética isoforma 2 XP_002266296 desconocida ACU22717 3 -hidroxiisobutirato XP_002524571 deshidrogenasa, putativa desconocida ABK22179 desconocida ACJ85049 proteína prela XP_001784857 Tabla 1N. Homólogos adecuados para la proteína 4hbD (semialdehído succínico reductasa , de Clostridium Jlu veri, EC No. 1.1.1.61, la cual actúa en succinato semialdehído para producir 4 -hidroxibutirato; no. de acceso de proteína YP_001396393) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa NP_348201 dependiente de NAD 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa ZP_05401720 dependiente de NAD 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa ZP_06902666 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa ZP_06983178 dependiente de NAD 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa NP_904964 dependiente de NAD 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa ZP_04389726 dependiente de NAD alcohol deshidrogenasa, ZP_07821131 dependiente de hierro 4 -hidroxibutirato deshidrogenasa ZP_05427218 dependiente de NAD proteína hipotética CLOL250_02815 ZP_02076027 Tabla 10. Homólogos adecuados para la proteína SsaRAt2 ( semialdehído succínico reductasa, de Aspergillus terreus, EC No. 1.1.1.61, la cual actúa en succinato semialdehído para producir 4 -hidroxibutirato; no. de acceso de proteína XP_001210625) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína aflatoxina Bl-aldehído reductasa, XP_001268918 putativa aflatoxina Bl-aldehído reductasa, XP_001264422 putativa proteína hipotética An08g06440 XP_001392759 Pcl3gll860 XP_002559603 TPA: aflatoxina Bl-aldehído CBF89011 reductasa tipo GliO, putativa aflatoxina Bl aldehido reductasa EEH21318 miembro de aflatoxina Bl aldehido XP_003069315 reductasa, putativa aldo/ceto reductasa XP_002625767 miembro 2 de aflatoxina Bl XP_002845070 aldehido reductasa Tabla 1P. Homólogos adecuados para la proteína SsaRMm (semialdehído succínico reductasa, de Mus musculus, EC No. 1.1.1.61, la cual actúa en succinato semialdehído to produce 4-hidroxibutirato; no. de acceso de proteína AKR7A5) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína miembro 2 de aflatoxina Bl XP_001092177 aldehido reductasa proteína AKR7A2 AAI49541 similar al miembro 3 de XP_001917301 aflatoxina Bl aldehido reductasa miembro A3 de familia 7 de aldo- XP_002685838 ceto reductasa Tabla 1Q . Homólogos adecuados para la proteína YqhD (semialdehído succínico reductasa, de Escherichia coli K-12, EC No. 1.1.1.61, la cual actúa en succinato semialdehído para producir 4-hidroxibutirato; no. de acceso de proteína NP_417484) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína alcohol deshidrogenasa yqhD ZP_02900879 alcohol deshidrogenasa, YP_002384050 dependiente de NAD(P) alcohol deshidrogenasa YP_003367010 putativa alcohol deshidrogenasa YqhD ZP_02667917 alcohol deshidrogenasa YP_218095 putativa proteína hipotética YP_001436408 ESA_00271 alcohol deshidrogenasa que YP_003437606 contiene hierro proteína hipotética YP_001455898 CKO_04406 alcohol deshidrogenasa ZP 03373496 Tabla IR. Homólogos adecuados para la proteína OrfZ (CoA transferasa, de Clostridium kluyveri DSM 555, EC No. 2.8.3.n, la cual actúa en 4 -hidroxibutirato para producir 4-hidroxibutirilo CoA; no. de acceso de proteína AAA92344) Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína 4 -hidroxibutirato coenzima A YP_001396397 transferasa acetilo-CoA ZP_05395303 hidrolasa/transferasa acetilo-CoA YP_001309226 hidrolasa/transferasa 4 -hidroxibutirato coenzima A NP 781174 transferasa 4 -hidroxibutirato coenzima A ZP_05618453 transíerasa acetilo-CoA ZP_05634318 hidrolasa/transferasa 4 -hidroxibutirato coenzima A ZP_00144049 transferasa proteína hipotética A ASTE_01215 ZP_02862002 4 -hidroxibutirato coenzima A ZP_07455129 transferasa Tabla 1S . Homólogos adecuados para la proteina PhaCl (polihidroxialcanoato sintasa, de Ralstonia eutropha H16, EC No. 2.3.1.n, la cual actúa en (R) -3 -hidroxibutirilo-CoA o 4-hidroxibutirilo-CoA + [ (R) -3 -hidroxibutanoato-co-4 -hidroxibutanoato] n para producir [ (R) -3-hidroxibutanoato-co-4 -hidroxibutanoato] (?+? + CoA y también actúa en 4-hidroxibutirilo-CoA + [4 -hidroxibutanoato] n para producir [4-hidroxibutanoato] (n+D + CoA; No. de acceso de proteína YP_725940 (Peoples and Sinskey, J. Biol . Chem. 264:15298-15303 (1989) ) ) .
Nombre de la Proteína No . de Acceso de Proteína ácido polihidroxialcanoico YP_002005374 sintasa PHB sintasa BAB96552 PhaC AAF23364 Proteína PhaC AAC83658 Polihidroxialcanoato sintasa polihidroxibutirato sintasa AAL17611 ácido poli (R) -hidroxialcanoico YP_002890098 sintasa, clase I poli-beta-hidroxibutirato YP_159697 polimerasa PHB sintasa CAC41638 PHB sintasa YP_001100197 Tabla IT. Homólogos adecuados para la proteína PhaC3/Cl (Proteína de fusión polihidroxialcanoato sintasa de Pseudomonas putida y Ralstonia eutropha JMP134, EC No. 2.3.1.n, la cual actúa en (R) -3-hidroxibutirilo-CoA o 4-hidroxibutirilo-CoA + [ (R) -3 -hidroxibutanoato-co-4 -hidroxibutanoato] n para producir [ (R) -3-hidroxibutanoato-co- 4 -hidroxibutanoato] (n+u + CoA y también actúa en 4-hidroxibutirilo-CoA + [4 -hidroxibutanoato] n para producir [4-hidroxibutanoato] (n+i) + CoA Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína ácido poli (R) -hidroxialcanoico YP_295561 sintasa, clase I Poli (3-hidroxibutirato) YP_725940 polimerasa ácido polihidroxialcanoico AA 65074 sintasa ácido polihidroxialcanoico YP_002005374 sintasa ácido poli (R) -hidroxialcanoico YP_583508 sintasa, clase I polihidroxialcanoato sintasa ADM24646 intracelular Poli (3-hidroxialcanoato) ZP_00942942 poliraerasa ácido polihidroxialcanoico YP_003752369 sintasa PhaC AAF23364 Tabla 1U. Homólogos adecuados para la proteína Bukl (butirato cinasa I, de Clostridium acetobutylicu ATCC824, EC No. 2.7.2.7, la cual actúa en 4 -hidroxibutirato para producir fosfato de 4 -hidroxibutirilo Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína butirato cinasa YP_001788766 butirato cinasa YP_697036 butirato cinasa YP_003477715 butirato cinasa YP_079736 acetato y butirato cinasa ZP_01667571 butirato cinasa YP_013985 butirato cinasa ZP_04670620 butirato cinasa ZP_04670188 butirato cinasa ZP_07547119 Tabla IV. Homólogos adecuados para la proteína Buk2 (butirato cinasa II, de Clostridium acetobutylicum ATCC824, EC No. 2.7.2.7, la cual actúa en 4-hidroxibutirato para producir fosfato de 4 -hidroxibutirilo Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína butirato cinasa YP_001311072 proteína hipotética CLOSPO_00144 ZP_02993103 proteína hipotética COPEUT_01429 ZP_02206646 butirato cinasa EFR5649 butirato cinasa ZP_0720132 butirato cinasa YP_0029418 butirato cinasa YP_002132418 butirato cinasa ZP_05389806 fosfato butirilotransferasa ADQ27386 Tabla 1W. Homólogos adecuados para la proteína Ptb (fosfotransbutirilasa, de Clostridium acetobutylicum ATCC824, EC No. 2.3.1.19, la cual actúa en fosfato de 4-hidroxibutirilo para producir 4 -hidroxibutirilo CoA Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína fosfato butirilotransferasa YP_001884531 proteína hipotética COPCOM_01477 ZP_03799220 fosfato butirilotransferasa YP_00331697 fosfato butirilotransferasa YP_004204177 fosfato ZP_05265675 acetilo/butirilotransferasa fosfato ZP_05283680 acetilo/butirilotransferasa putativa enoil-CoA hidratasa/fosfato YP_426556 acetiltransferasa bifuncional proteína hipotética CLOBOL_07039 ZP_02089466 fosfato butirilotransferasa YP 003564887 Tabla IX. Homólogos adecuados para la proteína SucC (succinato-CoA ligasa (formación de ADP) , subunidad beta, de Escherichia coli K-12, EC No. 6.2.1.5, la cual actúa en succinato y CoA para producir succinilo-CoA Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína succinilo-CoA sintetasa, cadena YP_003942629 beta succinilo-CoA sintetasa YP_003005213 subunidad beta succinilo-CoA sintetasa YP_002150340 subunidad beta succinilo-CoA ligasa (formación ZP_06124567 de ADP) succinilo-CoA sintetasa YP 001187988 - subunidad beta succinilo-CoA sintetasa ZP_01075062 subunidad beta succinilo-CoA ligasa (formación ZP_05984280 de ADP) succinilo-CoA sintetasa 003699804 subunidad beta succinilo-CoA sintetasa 003443470 subunidad beta Tabla 1Y. Homólogos adecuados para la proteína SucD (succinato-CoA ligasa (formación de ADP) , subunidad alfa, de Escherichia coli K-12, EC No. 6.2.1.5, la cual actúa en succinato y CoA para producir succinilo-CoA Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína succinilo-CoA sintetasa YP_402344 subunidad alfa succinato-CoA ligasa ZP_07949625 succinilo-CoA sintetasa NP_792024 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa, YP_001784751 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa cadena ZP_03822017 alfa succinilo-CoA ligasa ZP_07004580 proteína hipotética XP_002872045 ARALYDRAFT_489184 succinilo-CoA sintetasa YP_896208 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa YP 611746 (formación de ADP) subunidad alfa Tabla 1Z. Homólogos adecuados para la proteína Catl (succinilo-CoA: coenzima A transferasa, de Clostridiu kluyveri DSM 555, EC No. 2.8.3.n, la cual actúa en succinato y acetilo-CoA para producir succinilo-CoA y acetato Nombre de la Proteína No. de Acceso de Proteína succinilo-CoA sintetasa YP_402344 subunidad alfa succinato-CoA ligasa ZP_07949625 succinilo-CoA sintetasa NP_792024 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa, YP_001784751 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa ZP_03822017 cadena alfa succinilo-CoA ligasa ZP_07004580 proteína hipotética XP_002872045 ARALYDRAFT_489184 succinilo-CoA sintetasa YP_896208 subunidad alfa succinilo-CoA sintetasa YP_611746 (formación de ADP) subunidad alfa Vectores y plásmidos extracromosómicos adecuados Un "vector", como se utiliza en la presente, es un replicón extracromosómico, tal como un plásmido, fago, o cósmido, en el cual otro segmento de ADN se puede insertar para causar la replicación del segmento insertado. Los vectores varían en número de copia y dependiendo del origen de su replicación contienen, su tamaño, y el tamaño del inserto. Los vectores con diferente origen de replicaciones se pueden propagar en la misma célula microbiana a menos que estén estrechamente relacionados tales como pMBl y ColEl . Los vectores adecuados para expresar las proteínas recombinantes pueden constituir vectores pUC con un origen de replicación pMBl que tiene 500-700 copias por célula, vectores pBluescript con un origen de replicación ColEl que tiene 300-500 copias por célula, pBR322 y derivados con un origen de replicación pMBl que tiene 15-20 copias por célula, pACYC y derivados con un origen de replicación pl5A que tiene 10-12 copias por células, y pSClOl y derivados con un origen de replicación pSClOl que tiene aproximadamente 5 copias por célula como se describe en el Manual de Purificación de Plásmidos QIAGEN® (encontrado en la red mundial en: //kirshner.med. harvard. edu/files/protocols/QIAGEN_QlAGENPlasm idPurification_EN.pdf) .
Estrategias Adecuadas y Secuencias de Control de Expresión para Expresión de Gen Recombinante Las estrategias para lograr la expresión de genes recombinantes en E. coli se han descrito extensamente en la literatura (Gross, Chimica Oggi 7(3):21-29 (1989); Olins y Lee, Cur. Op. Biotech. 4:520-525 (1993); Makrides, Microbiol. Rev. 60 (3) : 512-538 (1996); Hannig and Makrides, Trends in Biotech. 16:54-60 (1998)). Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, mej oradores de transcripción, terminadores de transcripción, y similares los cuales son bien conocidos en el arte. Los promotores adecuados incluyen, pero no se limita a, Plací Ptac i Ptrc i R> PLI Ptrp i PphoA i Para i PuspA i PrspUi Psyn (Rosenberg and Court, Ann. Rev. Genet . 13:319-353 (1979); Hawley and McClure, Nucí. Acids Res. 11 (8) : 2237-2255 (1983); Harley and Raynolds, Nucí. Acids Res. 15:2343-2361 (1987); además ecocyc.org y partsregistry.org.
Construcción de Huéspedes recombinantes Los huéspedes recombinantes que contienen los genes necesarios que codificarán la trayectoria enzimática para la conversión de un sustrato de carbono a P4HB se pueden construir utilizando técnicas bien conocidas en el arte.
Los métodos para obtener genes deseados de un organismo de fuente (huésped) son comunes y bien conocidos en el arte de biología molecular. Tales métodos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) . Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, el ADN se puede amplificar del ADN genómico utilizando reacción en cadena de polimerasa (Mullís, Patente de Estados Unidos No. 4,683.202) con cebadores específicos para el gen de interés para obtener cantidades de ADN adecuadas para la ligación en vectores apropiados. Alternativamente, el gen de interés se puede sintetizar químicamente de nuevo para tomar en consideración la desviación de codón del organismo huésped para mejorar la expresión de proteína heteróloga. Las secuencias de control de expresión tales como promotores y terminadores de transcripción se pueden unir a un gen de interés vía la reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores modificados genéticamente que contienen tales secuencias. Otra manera es introducir el gen aislado en un vector que ya contiene las secuencias de control necesarias en el orden apropiado por ligación y digestión de endonucleasa de restricción. Un ejemplo de este último procedimiento es la tecnología BioBrick™ (ver la red mundial en biobricks.org) donde las múltiples piezas de ADN se pueden ensamblar consecutivamente conjuntamente en una manera estandarizada utilizando los mismos dos sitios de restricción.
Además de utilizar vectores, los genes que son necesarios para la conversión enzimática de un sustrato de carbono a P4HB se pueden introducir en un organismo huésped por integración en el cromosoma utilizando ya sea un procedimiento dirigido o aleatorio. Para la integración dirigida en un sitio específico en el cromosoma, el método generalmente conocido como ingeniería recombinógena Red/ET se utiliza como originalmente se describe por Datsenko and Wanner (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) . La integración aleatoria en el cromosoma involucrado utilizando un procedimiento mediado por transposón mini-Tn5 como se describe por Huisman et al. (Patentes de Estados Unidos Nos. 6, 316, 262 y 6, 593 , 116) .
Cultivo del Huésped para producir Biomasa de P4HB En general, el huésped recombinante se cultiva en un medio con una fuente de carbono y otros nutrientes esenciales para producir la biomasa de P4HB por técnicas de fermentación ya sea en lotes o continuamente utilizando métodos conocidos en el arte. También se pueden incluir aditivos adicionales, por ejemplo, agentes anti-espumantes y similares para lograr las condiciones de crecimiento deseadas. La fermentación es particularmente útil para la producción a gran escala. Un método ejemplar utiliza bioreactores para cultivar y procesar el caldo de fermentación al producto deseado. Otras técnicas tales como técnicas de separación se pueden combinar con fermentación para producción a gran escala y/o continua.
Como se utiliza en la presente, el término "material de alimentación" se refiere a una sustancia utilizada como una materia prima de carbono en un proceso industrial. Cuando se utiliza con referencia a un cultivo de organismos tales como organismos microbianos o algas tal como un proceso de fermentación con células, el término se refiere a la materia prima utilizada para suministrar un carbono u otra fuente de energía para las células. Las fuentes de carbono útiles para la producción de GBL incluyen fuentes simples, no costosas, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa y similares solas o en combinación. En otras modalidades, el material de alimentación es melasa o almidón, ácidos grasos, aceites vegetales o un material de lignocelulosa y similares. También es posible utilizar organismos para producir la biomasa de P4HB que crece en gas de síntesis (C02, CO e hidrógeno) producido de recursos de biomasa renovables.
La introducción de genes de trayectoria de P4HB permite la flexibilidad para utilizar materiales de alimentación fácilmente disponibles y no costosos. Un material de alimentación "renovable" se refiere a una fuente de energía renovable tal como material derivado de organismos vivientes o sus subproductos metabólicos incluyendo material derivado de biomasa, que frecuentemente consiste de componentes sub-utilizados como broza o rastrojo. Los productos agrícolas que específicamente crecen para uso como materiales de alimentación renovables incluyen, por ejemplo, maíz, soya, pasto aguja y árboles tales como álamo, trigo, linaza y semilla de colza, caña de azúcar y aceite de palma.
Como fuente renovables de materias primas y energía, los materiales de alimentación agrícolas basados en cultivos son el remplazo decisivo de reservas de petróleo en declive. Las plantas usan energía solar y fijación de dióxido de carbono para producir miles de bioquímicos funcionales y complejos más allá de la capacidad actual de la química sintética moderna. Estos incluyen productos químicos finos y voluminosos, productos farmacéuticos, nutracéuticos, flavanoides, vitaminas, perfumes, polímeros, resinas, aceites, aditivos de alimentos, bio-colorantes , adhesivos, solventes, y lubricantes.
Combinación de Biomasa de P4HB con Catalizador En general, durante o después de la producción (por ejemplo, cultivo) de la biomasa de P4HB, la biomasa se combina con un catalizador bajo condiciones adecuadas para ayudar a convertir el polímero de P4HB a producto gamma-butirolactona de alta pureza. El catalizador (en forma sólida o solución) y la biomasa se combinan, por ejemplo, por mezclado, floculación, centrifugación o secado por pulverización, u otro método adecuado conocido en el arte para promover la interacción de la biomasa y catalizador impulsando una conversión eficiente y específica de P4HB a gamma-butirolactona . En algunas modalidades, la biomasa inicialmente se seca, por ejemplo a temperatura entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 150°C y por una cantidad de tiempo para reducir el contenido de agua de la biomasa. La biomasa seca luego se resuspende en agua antes de combinarla con el catalizador. Las temperaturas y duración de secado adecuadas se determinan para la pureza y rendimiento de producto y en algunas modalidades pueden incluir bajas temperaturas para remover el agua (tal como entre 25°C y 150 °C) por un período de tiempo extendido o en otras modalidades pueden incluir el secado a una alta temperatura (por ejemplo, arriba de 450°C) por una corta duración de tiempo. Bajo "condiciones adecuadas" se refiere a condiciones que promueven la reacción catalítica. Por ejemplo, bajo condiciones que maximizan la generación del producto gamma-butirolactona tal como en la presencia de co-agentes u otro material que contribuye a la eficiencia de reacción. Otras condiciones adecuadas incluyen la ausencia de impurezas, tales como metales u otros materiales que obstruirían la reacción de la progresión.
Como se usa en la presente, "catalizador" se refiere a una sustancia que inicia o acelera una reacción química sin que la misma sea afectada o consumida en la reacción. Los ejemplos de catalizadores útiles incluyen catalizadores metálicos. En ciertas modalidades, el catalizador disminuye la temperatura de inicio de la descomposición térmica y aumenta la velocidad de la descomposición térmica a ciertas temperaturas de pirólisis (por ejemplo, aproximadamente 200°C a aproximadamente 325°C) .
En algunas modalidades, el catalizador es un compuesto cloruro, óxido, hidróxido, nitrato, fosfato, sulfonato, carbonato o estearato. que contiene un ion metálico. Los ejemplos de iones metálicos adecuados incluyen aluminio, antimonio, bario, bismuto, cadmio, calcio, cerio, cromo, cobalto, cobre, galio, hierro, lantano, plomo, litio, magnesio, molibdeno, níquel, paladio, potasio, plata, sodio, estroncio, estaño, tungsteno, vanadio o zinc y similares. En algunas modalidades, el catalizador es un catalizador orgánico que es una amina, azida, enol, glicol, sal de amonio cuaternario, fenóxido, cianato, tiocanato, dialquil amida y tiolato de alquilo. En algunas modalidades, el catalizador es hidróxido de calcio. En otras modalidades, el catalizador es carbonato de sodio. También se incluyen mezclas de dos o más catalizador .
En ciertas modalidades, la cantidad de catalizador metálico es aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15% o aproximadamente 1% a aproximadamente 25%, o 4% a aproximadamente 50%, o aproximadamente 4% a aproximadamente 50% con base en el peso de ión metálico con relación al peso sólido seco de la biomasa. En algunas modalidades, la cantidad de catalizador está entre aproximadamente 7.5% y aproximadamente 12%. En otras modalidades, la cantidad de catalizador es aproximadamente 0.5 % en peso de célula seca, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, o aproximadamente 10%, o aproximadamente 11%, o aproximadamente 12%, o aproximadamente 13%, o aproximadamente 14 %, o aproximadamente 15%, o aproximadamente 20%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 40% o aproximadamente 50% o cantidades entre estas.
Como se usa en la presente, el término "cantidad suficiente" cuando se utiliza con referencia a un reactivo químico en una reacción se propone que signifique una cantidad del reactivo de referencia que puede cumplir las demandas de la reacción química y la pureza deseada del producto .
Degradación Térmica de la Biomasa de P4HB "Calentamiento", "pirólisis", "termólisis" , y "torrefacción" como se usan en la presente se refieren a la degradación térmica (por ejemplo, descomposición) de la biomasa de P4HB para la conversión a GBL . En general, la degradación térmica de la biomasa de P4HB ocurre a una temperatura elevada en la presencia de un catalizador. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la temperatura de calentamiento para los procesos descritos en la presente está entre aproximadamente 200 °C a aproximadamente 400°C. En algunas modalidades, la temperatura de calentamiento es aproximadamente 200°C a aproximadamente 350°C. En otras modalidades, la temperatura de calentamiento es aproximadamente 300°C. "Pirólisis" tipicamente se refiere a una descomposición termoquímica de la biomasa a temperaturas elevadas durante un período de tiempo. La duración puede variar de unos cuantos segundos a horas . En ciertas condiciones, la pirólisis ocurre en la ausencia de oxígeno o en la presencia de una cantidad limitada de oxígeno para evitar la oxigenación. Los procesos para la pirólisis de la biomasa de P4HB pueden incluir la transferencia directa de calor o transferencia indirecta de calor. "Pirólisis instantánea" se refiere al calentamiento rápido de la biomasa a una alta temperatura para la rápida descomposición de la biomasa de P4HB, por ejemplo, despolimerización de un P4HB en la biomasa. Otro ejemplo de pirólisis instantánea es pirólisis térmica rápida RTP™. La tecnología y kit RTP™ de Envergent Technologies, Des Plaines, IL convierte los materiales de alimentación en bio-combustible . "Torrefacción" se refiere al proceso de torrefacción, el cual es un término reconocido en el arte que se refiere al secado de la biomasa a temperatura elevada con la pérdida de agua y volátiles orgánicos para producir una biomasa torrada con propiedades de combustible sólido mejoradas. La biomasa torrada típicamente tiene mayor valor de calentamiento, mayor densidad aparente, triturabilidad mejorada para calderas de combustible pulverizado', resistencia a mohos aumentada y sensibilidad · a la humedad reducida en comparación con la biomasa secada para remover el agua libre solamente (por ejemplo, secado en horno convencional a 105°C) . El proceso de torrefacción típicamente involucra calentar una biomasa en una intervalo de temperatura desde 200-350°C, durante una duración relativamente larga (por ejemplo, 10-30 minutos) , típicamente en la ausencia de oxígeno. El proceso resulta por ejemplo, en una biomasa torrada que tiene un contenido de agua que es menor que 7% en peso de la biomasa. La biomasa torrada luego se puede procesar adicionalmente . En algunas modalidades, el calentamiento se hace en un vacío, a presión atmosférica o bajo presión controlada. En ciertas modalidades, el calentamiento se realiza sin el uso o con un uso reducido de energía generada por petróleo.
En ciertas modalidades, la biomasa de P4HB se seca antes del calentamiento. Alternativamente, en otras modalidades, el secado se hace durante la degradación térmica (por ejemplo, calentamiento, pirólisis o torrefacción) de la biomasa de P4HB. El secado reduce el contenido de agua de la biomasa. En ciertas modalidades, la biomasa se seca a una temperatura de entre aproximadamente 100°C a aproximadamente 350°C, por ejemplo, entre aproximadamente 200 °C y aproximadamente 275 °C. En algunas modalidades, la biomasa de 4PHB seca tiene un contenido de agua de 5% en peso, o menos.
En ciertas modalidades, el calentamiento de la mezcla de biomasa de P4HB/catalizador se realiza por un tiempo suficiente para convertir eficientemente y específicamente la biomasa de P4HB a GBL. En ciertas modalidades, el período de tiempo de calentamiento es desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, desde aproximadamente 30 segundo a aproximadamente 1.5 minutos, desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos o un tiempo entre, por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos , aproximadamente 1.5 minutos , aproximadamente 2.5 minutos , aproximadamente 3.5 minutos .
En otras modalidades, el período de tiempo es desde aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 minutos . En aún otras modalidades, la duración de tiempo de calentamiento es por un tiempo entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 30 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 2 horas, o entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 10 horas o por más de 10 horas (por ejemplo, 24 horas) .
En ciertas modalidades, la temperatura de calentamiento es a una temperatura de aproximadamente 200°C k aproximadamente 350°C incluyendo una temperatura entre, por ejemplo, aproximadamente 205°C, aproximadamente 210°C, aproximadamente 215°C, aproximadamente 220°C, aproximadamente 225°C, aproximadamente 230°C, aproximadamente 235°C, aproximadamente 240°C, aproximadamente 245°C, aproximadamente 250 °C, aproximadamente 255°C aproximadamente 260°C, aproximadamente 270 °C, aproximadamente 275°C, aproximadamente 280°C, aproximadamente 290 °C, aproximadamente 300°C, aproximadamente 310°C, aproximadamente 320 °C, aproximadamente 330°C, aproximadamente 340°C, o 345°C. En ciertas modalidades, la temperatura es aproximadamente 250 °C. En ciertas modalidades, la temperatura es aproximadamente 275°C. En otras modalidades, la temperatura es aproximadamente 300°C.
En ciertas modalidades, el proceso también incluye la pirolización instantánea de la biomasa residual, por ejemplo a una temperatura de 500°C o mayor por un período de tiempo suficiente para descomponer al menos una porción de la biomasa residual en líquidos de pirólisis. En ciertas modalidades, la pirolización instantánea se conduce a una temperatura de 500°C a 750°C. En algunas modalidades, un tiempo de residencia de la biomasa residual en la pirolización instantánea es desde 1 segundo a 15 segundos, o desde 1 segundo a 5 segundos o por un tiempo suficiente para pirolizar la biomasa para generar los precortes de pirólisis deseados, por ejemplo, líquidos de pirólisis. En algunas modalidades, la pirólisis instantánea puede tomar lugar en lugar de la torrefacción. En otras modalidades, la pirólisis instantánea puede tomar lugar después que el proceso de torrefacción se completa.
Como se usa en la presente, los "líquidos de pirólisis" se definen como un fluido de baja viscosidad con hasta 15-20% de agua, típicamente conteniendo azúcares, aldehidos, furanos, cetonas, alcoholes, ácidos carboxílieos y ligninas. También conocido como bio-combustible , este material se produce por pirólisis, típicamente pirólisis rápida de biomasa a una temperatura que es suficiente para descomponer al menos una porción de la biomasa en gases y líquidos recuperables que pueden solidificarse en reposo. En algunas modalidades, la temperatura que es suficiente para descomponer la biomasa es una temperatura entre 400°C a 800°C.
En ciertas modalidades, "recuperación" del vapor de gamma-butirolactona incluye la condensación del vapor. Como se usa en la presente, el término "recuperación" como se aplica al vapor significa aislarlo de los materiales de biomasa de P4HB, por ejemplo incluyendo, pero no limitado a: recuperación por condensación, metodologías de separación, tal como el uso de membranas, separación de fase de gas (por ejemplo, vapor), tal como destilación, y similares. Por consiguiente, la recuperación se puede realizar vía un mecanismo de condensación que captura el vapor de componente monomérico, condensa el vapor del componente monomérico a una forma líquida y lo transfiere lejos de los materiales de biomasa .
Como un ejemplo no limitante, la condensación del vapor de gamma-butirolactona se puede describir como sigue. La corriente de gas/vapor entrante de la cámara de pirólisis/torrefacción entra en un intercambiador, donde la corriente de gas/vapor se puede pre-enfriar. La corriente de gas/vapor luego pasa a través de un enfriador donde la temperatura de la corriente de gas/vapor se disminuye a la requerida para condensar los vapores designados del gas por contacto indirecto con un refrigerante. El gas y vapores condensados fluyen del enfriador en un separador, donde los vapores condensados se colectan en el fondo. El gas, libre de los vapores, fluye del separador, pasa a través del intercambiador y sale de la unidad. Los líquidos recuperados fluyen, o son bombeados, desde el fondo del separador al almacenamiento. Para algunos de los productos, los vapores condensados se solidifican y el sólido se colecta.
En ciertas modalidades, la recuperación del catalizador se incluye adicionalmente en los procesos de la invención. Por ejemplo, cuando se utiliza un catalizador de calcio la calcinación es una técnica de recuperación útil. La calcinación es un proceso de tratamiento término que se realiza en minerales, metales o menas para cambiar los materiales a través de la descarboxilación, deshidratación, desvolatilización de materia orgánica, transformación de fase u oxidación. El proceso se realiza normalmente en reactores tales como hornos de solera, hornos de cubilote, estufas rotatorias o más recientemente reactores de lechos fluidizados. La temperatura de calcinación se elige para estar por debajo del punto de fusión del sustrato pero arriba de su temperatura de descomposición o transición de fase. Frecuentemente se toma como la temperatura a la cual la energía de reacción libre de Gibbs es igual a cero. Para la descomposición de CaC03 a CaO, la temperatura de calcinación a AG=0 se calcula que es ~ 850°C. Típicamente para la mayoría de los minerales, la temperatura de calcinación está en el intervalo de 800-1000°C pero las calcinaciones también referirse al calentamiento realizado en el intervalo de 200-800°C.
Para recuperar el catalizador de calcio de la biomasa después de la recuperación de la GBL, se transferiría el residuo de biomasa agotada directamente de la pirólisis o torrefacción en un reactor de calcinación y continuaría el calentamiento del residuo de biomasa en aire a 825-850°C por un período de tiempo para remover todas las trazas de la biomasa orgánica. Una vez que la biomasa orgánica se remueve, el catalizador se podría usar como está o purificar adicionalmente separando los óxidos metálicos presentes (de los medios de fermentación y catalizador) con base en la densidad utilizando kit conocido por aquellos en el arte.
En ciertas modalidades, el proceso es selectivo para producir el producto gamma-butirolactona con una cantidad relativamente pequeña de productos secundarios no deseados (por ejemplo, producto dimerizado de GBL (3-(dihidro-2 (3H) -furanilideno) dihidro-2 (3H) -furanona) , otros oligómeros de GBL u otros productos secundarios) . Por ejemplo, en algunas modalidades el uso de un catalizador específico en una cantidad suficiente reducirá la producción de productos secundarios no deseados y aumentará el rendimiento de gamma-butirolactona por al menos aproximadamente 2 veces. En algunas modalidades, la producción de productos secundarios no deseados será reducida a al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 20% al menos aproximadamente 10%, o aproximadamente al menos 5%. En cierta modalidad, los productos secundarios no deseados serán menos de aproximadamente 5% de la gamma-butirolactona recuperada, menos de aproximadamente 4% de la gamma-butirolactona recuperada, menos de aproximadamente 3% de la gamma-butirolactona recuperada, menos de aproximadamente 2% de la gamma-butirolactona recuperada, o menos de aproximadamente 1% de la gamma-butirolactona recuperada.
Los procesos descritos en la presente pueden proporcionar un rendimiento de GBL expresado como un porcentaje de rendimiento, por ejemplo, cuando crece de glucosa como una fuente de carbono, el rendimiento es hasta 95% basado en gramo de GBL recuperado por gramo de P4HB contenido en la bioraasa alimentada al proceso (reportado como porcentaje) . En otras modalidades, el rendimiento está en un intervalo entre aproximadamente 40% y aproximadamente 95%, por e emplo entre aproximadamente 50% y aproximadamente 70%, o entre aproximadamente 60% y 70%. En otra modalidad, el rendimiento es aproximadamente 75%, aproximadamente 70%, aproximadamente 65%, aproximadamente 60%, aproximadamente 55%, aproximadamente 50%, aproximadamente 45% o aproximadamente 40%.
Como se usa en la presente, "gamma-butirolactona" o GBL se refiere al compuesto con la siguiente estructura química: gamma-butirolactona El término "producto gamma-butirolactona" se refiere a un producto que contiene al menos aproximadamente 70 hasta 100 por ciento en peso de gamma-butirolactona. Por ejemplo, en una cierta modalidad, el producto gamma-butirolactona puede contener 95% en peso de gamma-butirolactona y 5% en peso de productos secundarios. En algunas modalidades, la cantidad de gamma-butirolactona en el producto gamma-butirolactona es aproximadamente 71% en peso, aproximadamente 72% en peso, aproximadamente 73% en peso, aproximadamente 74% en peso, aproximadamente 75% en peso, aproximadamente 76% en peso, aproximadamente 77% en peso, aproximadamente 78% en peso, aproximadamente 79% en peso, aproximadamente 80% en peso, 81% en peso, aproximadamente 82% en peso, aproximadamente 83% en peso, aproximadamente 84% en peso, aproximadamente 85% en peso, aproximadamente 86% en peso, aproximadamente 87% en peso, aproximadamente 88% en peso, aproximadamente 89% en peso, aproximadamente 90% en peso, 91% en peso, aproximadamente 92% en peso, aproximadamente 93% en peso, aproximadamente 94% en peso, aproximadamente 95% en peso, aproximadamente 96% en peso, aproximadamente 97% en peso, aproximadamente 98% en peso, aproximadamente 99% en peso o aproximadamente 100% en peso. En modalidades particulares, el porcentaje en peso de producto gamma-butirolactona producido por los procesos descritos en la presente es 85% o más de 85%.
En otras modalidades, el producto gamma-butirolactona se puede purificar adicionalmente si es necesario por métodos adicionales conocidos en el arte, por ejemplo, por destilación, por destilación reactiva (por ejemplo, el producto gamma-butirolactona se acidifica primero para oxidar ciertos componentes (por ejemplo, para fácil separación) y luego se destila) por tratamiento con carbón activado para remoción de cuerpos de color y/u olor, por tratamiento de intercambio iónico, por extracción líquido-líquido - con solvente inmiscible en GBL (por ejemplo, solventes no polares, como ciclopentano o hexano) para remover ácidos grasos, etc, para purificación después de la recuperación de GBL, por destilación en vacío, por destilación por extracción o utilizando métodos similares que resultarían en la purificación adicional del producto gamma-butirolactona para aumentar el rendimiento de la gamma-butirolactona . También se pueden utilizar las combinaciones de estos tratamientos.
En ciertas modalidades, la GBL adicionalmente se modifica y/o sustituye químicamente a otros productos de cuatro carbonos (productos 4C) y derivados incluyendo, pero no limitado a, ácido succínico, 1, 4-butanodiamida, succinonitrilo, succinamida, N-vinil-2-pirrolidona (NVP) , 2-pirrolidona (2-Py) , N-metil-2-pirrolidona ( MP) , tetrahidrofurano (THF) , 1 , 4 -butanodiol (BDO) . Los métodos y reacciones para producción de estos derivados a partir de gamma-butirolactona son fácilmente conocidos por un experto en el arte.
Como se usa en la presente, el término "biomasa residual" se refiere a la biomasa después de la conversión de PHA a los intermediarios de molécula pequeña. La biomasa residual luego se puede convertir vía torrefacción a un combustible utilizable, reduciendo los residuos de la producción de PHA y ganando productos químicos básicos valiosos adicionales de procesos de torrefacción típicos. La torrefacción se conduce a una temperatura que es suficiente para densificar la biomasa residual. En ciertas modalidades, los procesos descritos en la presente se integran con un proceso de torrefacción donde la biomasa residual continúa siendo tratada térmicamente una vez que los intermediarios químicos volátiles se han liberado para proporcionar un material combustible. Los materiales combustibles producidos por este proceso se utilizan para la combustión directa o se tratan adicionalmente para producir líquidos de pirólisis o gas de síntesis. En general, el proceso tiene la ventaja agregada que la biomasa residual se convierte a un combustible de mayor valor el cual luego se puede utilizar para la producción de electricidad y vapor para proporcionar energía para el proceso eliminando la necesidad de tratamiento de residuos.
Una "huella de carbono" es una medida del impacto que los procesos tienen en el ambiente, y en particular el cambio climático. Se refiere a la cantidad de gases de invernadero producidos.
En ciertas modalidades, puede ser deseable etiquetar los constituyentes de la biomasa. Por ejemplo, puede ser útil etiquetar deliberadamente con un isótopo de carbono (por ejemplo, 13C) para facilitar la determinación de la estructura o por otro medio. Esto se logra haciendo crecer microorganismos genéticamente modificados para expresar los constituyentes, por ejemplo, polímeros, pero en lugar del medio usual, las bacterias crecen en un medio de crecimiento con fuente de carbono que contiene 13C, tal como glucosa, ácido pirúvico, etc. De esta manera, se pueden producir polímeros que son etiquetados con 13C uniformemente, parcialmente, o en sitios específicos. Adicionalmente , el etiquetado permite que el porcentaje exacto en los bioplásticos que vienen de fuentes renovables (por ejemplo, derivados de plantas) pueda ser conocido vía ASTM D6866 - una aplicación industrial de datación por radiocarbono . ASTM D6866 mide el contenido de Carbono 14 de los materiales de base biológica; y puesto que los materiales basados en combustibles fósiles no tienen más tiempo Carbono 14, ASTM D6866 puede disipar efectivamente las afirmaciones inexactas de contenido de base biológica.
EJEMPLOS La presente tecnología se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser construidos como limitantes en alguna manera.
Métodos Experimentales Medición del Comportamiento de la Degradación Térmica por Análisis Termogravimétrico (TGA) La pérdida de peso isotérmica contra el tiempo para las muestras de biomasa se midió utilizando un Analizador Termogravimétrico (TGA, por sus siglas en inglés) TA Instruments Q500. El TGA es una técnica comúnmente utilizada para medir el comportamiento de la degradación térmica de materiales tales como PHAs . El instrumento consiste de una balanza sensible de la cual una muestra se suspende. Luego un horno se pone alrededor de la muestra y se programa para calentar a una velocidad específica (condiciones de aumento) o a una cierta temperatura y retención (condiciones isotérmicas) . Un gas de purga es barrido a través de la muestra durante el calentamiento el cual típicamente es nitrógeno o aire. Cuando la mezcla se calentó, comenzó a perder peso lo cual se registró por la balanza. Al final del análisis, los resultados luego se pudieron graficar como porcentaje de pérdida de peso de muestra contra temperatura o tiempo. Cuando se gráfica como pérdida de peso contra tiempo, la velocidad de degradación luego se puede determinar de la inclinación de esta curva. Para los siguientes ejemplos, 5-10 mg de biomasa seca se pesaron en una bandeja de platino y luego se cargaron sobre la balanza de TGA. El gas de purga utilizado fue nitrógeno a una velocidad de flujo de 60 ml/min. Para las condiciones de prueba isotérmicas, la muestra de biomasa se precalento desde temperatura ambiente a la temperatura isotérmica programada a una velocidad de calentamiento de 150-200°C/min y se mantuvo a la temperatura isotérmica por 10-30 min. Los datos luego se graficaron como % de pérdida de peso de muestra contra tiempo y la velocidad de degradación térmica se calculó de la inclinación inicial de la curva.
Medición de los Productos de Degradación Térmica por Pirólisis-Cromatografía de Gas-Espectroscopia de Masas (Py-GC-MS) .
Para identificar y semi-cuantificar los compuestos de monómero generados a partir de biomasa seca mientras se calientan a varias temperaturas, se utilizó un GC-MS Agilent 7890A/5975 equipado con un pirolizador Frontier Lab PY-2020ÍD. Para esta técnica, se pesó una muestra en una taza de acero y se cargó en el automuestreador del pirolizador. Cuando el pirolizador y GC-MS se iniciaron, la taza de acero se colocó automáticamente en el pirolizador el cual se ha establecido a una temperatura específica. La muestra se mantuvo en el pirolizador por un corto período de tiempo mientras los volátiles se liberaron por la muestra. Los volátiles luego se barrieron utilizando gas helio en la columna de GC donde se condensaron sobre la columna la cual está a temperatura ambiente. Una vez que la pirólisis es terminada, la columna de GC se calienta a una cierta velocidad para eluir los volátiles liberados de la muestra. Los compuestos volátiles luego se barrieron utilizando gas helio en un detector de espectro de masas/ionización electrónica (intervalo de masa de 10-700 daltons) para identificación y cuantificación.
Para los siguientes ejemplos, 200-400 g de biomasa seca se pesaron en una taza de acero del pirolizador utilizando una microbalanza . La taza luego se cargó en el automuestreador del pirolizador. El pirolizador se programó para calentar a temperaturas que varían desde 225-350°C por una duración de 0.2-1 minuto. La columna de GC utilizada en los ejemplos fue ya sea una columna capilar Frontier Lab Ultra Alloy o una columna HP-5MS (longitud 30m, ID 0.25 µp?, espesor de película 0.25 µ??) . La GC luego se programó para calentar desde temperatura ambiente a 70°C durante 5 minutos, luego a 240°C a 10°C/min por 4 min. y finalmente a 270°C a 20°C/min por 1.5 min. El tiempo de corrida de GC total fue 25 minutos. Los picos mostrados en el cromatograma se identificaron por la mejor correlación de probabilidad con los espectros de una biblioteca espectral de masa NIST. La 'pureza' de GBL se midió tomando los conteos de área para el pico de GBL y dividiéndolos por los conteos de área para el pico de dímero de GBL.
Estos ejemplos describen un número de herramientas y métodos de biotecnología para la construcción de cepas que generan un producto de interés . Se describen cepas huéspedes adecuadas, la fuente potencial y una lista de genes recombinantes utilizados en estos ejemplos, vectores extracromosómicos adecuados, estrategias adecuadas y elementos regulatorios para controlar la expresión de gen recombinante , y una selección de técnicas de construcción para sobre-expresar los genes o inactivar los genes de los organismos huéspedes . Estas herramientas y métodos de biotecnología son bien conocidos por aquellos expertos en el arte .
EJEMPLO 1. Producción de Polímero de 4HB antes de la Modificación Este ejemplo muestra que la capacidad de producción de polímero de 4HB de cepas microbianas no se ha optimizado para incorporar 4HB de alto % mol de recursos de carbono renovables. Las cepas utilizadas en este ejemplo son listadas en la Tabla 2. Las cepas 1 y 2 se describieron por Dennis and Valentín (Patente de Estados Unidos No. 6,117,658).
Tabla 2. Cepas utilizadas en el Ejemplo 1 La cepa 3 contuvo supresiones de los genes cromosómicos tanto ynel como gabD (FIG. 1 y Tabla 1A, Número de Reacción 12) que codifican la succinato semialdehído (SSA) deshidrogenasa dependiente de NAD, independiente de CoA y la SSA deshidrogenasa dependiente de NADP, independiente de CoA, respectivamente. Para realizar esto, se utilizó una cepa derivada de LS5218 [Jenkins and Nunn J. Bacteriol. 169:42-52 (1987)) que expresó phaA, phaB y phaC como se describe previamente por Huisman et al. (Patente de Estados Unidos No. 6,316,262). Los imitantes gabD y ynel nulos únicos se construyeron como se describe por Farmer et al. (Patente WO No. 2010/068953) y se utilizó el método de ingeniería recombinógena Red/ET descrito por Datsenko and anner {Proc. Nati. Acad. Sci . USA. 97:6640-6645 (2000)), un método bien conocido por aquellos expertos en el arte. Esto resultó en que la cepa 3 tuvo las secuencias de codificación completas de los genes tanto yneJ y gabD removidos del genoma. Nótese que las cepas 1, 2 y 3 contienen el mismo cásete de genes Piac-orfZ- *catl-sucD-4hbD como se describe por Dennis and Valentín, donde sucD no es de codón optimizado para la expresión en E. coli.
Para examinar la producción de P3HB-co-4HB (poli-3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) , la cepa 3 se cultivó durante la noche en un tubo estéril que contiene 3 mL de LB y antibióticos apropiados. De esto, 50 µ:.. se agregaron por triplicado a placa de cavidades profundas Duetz que contienen 450 iL> de LB y antibióticos. Esto creció por 6 horas a 30°C con agitación. Luego, 25 µL de cada cultivo LB duplicado se agregaron a 3 cavidades adicionales que contienen 475 xl¡ de medio LB suplementado con 10 g/L de glucosa, ???µ? IPTG, 100 g/mL ampicilina, y 25 g/mL de cloramfenicol , y se incubó a 30°C con agitación por 72 horas. Después, los conjuntos de cavidades de producción se combinaron (1.5 mL total) y se analizaron para contenido de polímero. Al final del experimento, los cultivos se giraron a 4150 rpm, se lavaron una vez con agua destilada, se congelaron a -80°C por al menos 30 minutos, y se liofilizaron durante la noche. Al día siguiente, una cantidad medida de pelotilla celular liofilizada se agregó a un tubo de vidrio, seguido por 3 mL de reactivo de butanólisis que consiste de una mezcla de volumen igual de 99.9% n-butanol y HC1 4.0 N en dioxano con 2 mg/mL. de difenilmetano como estándar interno. Después de tapar los tubos, se sometieron a vórtice brevemente y se colocaron en un bloque de calor establecido a 93 °C por seis horas con vórtice periódico. Después, el tubo se enfrió a temperatura ambiente antes de agregar 3 mL de agua destilada. El tubo se sometió a vórtice por aproximadamente 10 s antes de girarlo a 620 rpm (centrifuga de mesa Sorvall Legend RT) por 2 min. 1 mL de la fase orgánica se pipeteó en un vial de GC, el cual luego se analizó por cromatografía de gas-detección de ionización de llama (GC-FID) (Hewlett-Packard 5890 Series II) . La cantidad de PHA en la pelotilla celular se determinó por comparación contra una curva estándar para 4HB (para análisis de P4HB) o por comparación contra curvas estándares tanto para 3HB como 4HB (para análisis de PHB-co-4HB) . La curva estándar de 4HB se generó agregando diferentes cantidades de una solución al 10% de ?-butirolactona (GBL) en butanol para separar las reacciones de butanólisis. La curva estándar de 3HB se generó agregando diferentes cantidades de 99% 3-hidroxibutirato de etilo para separar las reacciones de butanólisis.
Los resultados en la Tabla 3 muestran que la cepa 3 incorporada de manera similar baja el % mol de 4HB en el copolímero como se describió en la Patente de Estados Unidos No. 6,117,658.
Tabla 3. Producción de polímero de P3HB-CO-4HB a partir de cepas microbianas EJEMPLO 2. Producción de P4HB vía una a-cetoglutarato descarboxilasa o una succinilo-CoA deshidrogenasa Diversas trayectorias metabólicas se propusieron para generar semialdehído succínico (SSA) del ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) (revisado por Steinbüchel and Lütke-Eversloh, Bioche . Engineering J. 16:81-96 (2003) y Efe et al., Biotechnology and Bioengineering 99:1392-1406 (2008). Una trayectoria convierte la succinilo-CoA a SSA vía una succinilo-CoA deshidrogenasa, la cual se codifica por sucD (Sohling and Gottschalk, J". Bacterial. 178:871-880 (1996); FIG. 1, Número de reacción 7) . Una segunda trayectoria convierte el alfa-cetoglutarato a SSA vía una alfa-cetoglutarato descarboxilasa que se codifica por kgdM (Tian et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 102:10670-10675 (2005); FIG.l, Número de reacción 8). Una tercera trayectoria convierte el alfa-cetoglutarato a SSA vía L-glutamato y 4-aminobutirato utilizando una glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.4), una glutamato descarboxilasa (EC 4.1.1.15), y una 4 -aminobutirato transaminasa (EC 2.6.1.19), o una 4-aminobutirato aminotransferasa (EC 2.6.1.19). Van Dien et al. (Patente O No. 2010/141920) mostró que las trayectorias tanto sucD como kgdM trabajaron independientemente una de otra y fueron aditivas cuando se combinaron para producir 4HB. Nótese que kgdM se llama sucA en van Dien et al.
En este ejemplo, las dos trayectorias metabólicas via sucD o kdgM se compararon para ver cual podría producir los títulos de P4HB más altos. Las siguientes tres cepas se construyeron por consiguiente utilizando las herramientas y métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente, todas las cuales contuvieron supresiones cromosómicas de ynel y gabD y sobre-expresaron una PHA sintasa, y una CoA transferasa, y ya sea una alfa-cetoglutarato descarboxilasa con una SSA reductasa (cepa 5) , o una succinilo-CoA deshidrogenasa con una SSA reductasa (cepa 6) . La cepa 4 sirvió como un control negativo y solo contuvo el vector vacío en lugar de Pcrc-JgrdM-ssa.At* o Ptrc-sucD* -ssaRAt* (ver Tabla 4) .
Tabla 4. Cepas Microbianas utilizadas en el Ejemplo 2 Las cepas crecieron en una placa de ensayo agitada 24 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 10 g/L de glucosa, 5 g/L de 4-hidroxibutirato de sodio, 2 mM MgS04, lx Solución de Micro Sales, y 100 µ? IPTG. La solución madre E2 50x consiste de 1.275 M NaNH4HP04-4H20, 1.643 M K2HP04 , y 1.36 M KH2P04. La Solución de Micro Sales madre lOOOx se preparó agregando por 1 L de 1.5 N HC1: 50 g de FeS04-7H20, 11 g de ZnS04-7H20, 2.5 g de MnS04-4H20, 5 g de CuS04-5H20, 0.5 g de (NH4) 6Mo7024 · 4H20, 0.1 g de Na2B407, y 10 g de CaCl2-2H20. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 5 sorprendentemente muestran que solamente la cepa 6 que expresa la trayectoria sucD produjo cantidades significativas de P4HB. En contraste con las cepas descritas por van Dien et al. (Patente WO No. 2010/141920) que producen 4HB vía las trayectorias tanto kgdM como sucD en cantidades similares, la trayectoria de alfa-cetoglutarato descarboxilasa utilizada aquí produjo solamente cantidades muy bajas de P4HB.
Tabla 5. Título de Biomasa y P4HB EJEMPLO 3. Mejoramiento de la producción de P(4HB) mediante la sobre-expresión de ciertos genes de semialdehído succínico reductasa Efecto de 4Jibd en la producción de P4HB El gen de semialdehído succínico (SSA) reductasa 4hbD se utilizó por Dennis and Valentín (Patente de Estados unidos No. 6,117,658) para producir el copolímero de P3HB-co-4HB. Para ver cómo la sobre-producción efectiva de esta SSA reductasa fue para la producción de homopolímero de P4HB, el gen 4hbD se sobre-expresó por el promotor Ptrc inducible por IPTG (cepa 8) . Un cepa que contiene vector vacío sirvió como un control (cepa 7) . La cepa huésped utilizada contuvo supresiones cromosómicas de los genes ynel y gabD y también sobre-expresó los genes recombinantes orfZ, sucD* y phaC3/Cl* como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6. Cepas Microbianas utilizadas en esta sección del Ejemplo 3 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido 48 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 20 g/L de glucosa, lx Solución de Micro Sales y 100 µ? IPTG. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 7, la cepa 8 que expresa 4hbD incorporó bajas cantidades de 4HB en el polímero, similar a las cepas descritas en la Patente de Estados Unidos No. 6,117,658 y se verificó en el Ejemplo 1. Sin embargo, muy inesperadamente, la cepa de control 7 de vector vacío, la cual no expresa el gen 4hbd, produjo título de P4HB significativamente aumentados.
Tabla 7. Título de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 7 y 8 Efecto de otros genes de SSA reductasa en la producción de P4HB Puesto que la SSA reductasa codificada por 4hbD inesperadamente no produce cantidades mayores de P4HB que su cepa parental, otra SSA reductasa conocida de Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)) se clonó en la búsqueda de una enzima catalíticamente más activa. Además, se probaron diversos genes cuyas secuencias de proteína se encontró que son homologas a la enzima A. thaliana . Estos incluyeron genes de SSA reductasa putativa de Mus musculus y Aspergillus terreus. Además, para investigar si una aldehido deshidrogenasa no específica de E. coli que no mostró homología significativa a la enzima Arabidopsis podría catalizar la reacción de SSA a 4HB, el gen yqhD también se clonó. Previamente se mostró que YqhD tiene una actividad catalítica para convertir el 3-hidroxipropionaldehído a 1 , 3 -propanodiol (Emptage et al., Patente de Estados Unidos No. 7,504,250). Las cepas resultantes se listan en la Tabla 8.
Tabla 8. Cepas microbianas utilizadas en el Ejemplo 3 Las cepas 9 a 13 crecieron y los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describió anteriormente. La Tabla 9 muestra que a diferencia de la SSA reductasa codificada por 4hbD, la sobreproducción de la SSA reductasa de A. thaliana significativamente aumentó la producción de P4HB. Esto claramente ilustra lo impredecible que es el resultado de ingeniería metabólica no obstante la función conocida de las enzimas tanto C. Arluyveri como A. thaliana . Los genes de SSA reductasa putativa de M. musculus y A. terreus también mejoraron la producción de P4HB a varios grados. Inesperadamente, la aldehido deshidrogenasa E. coli YghD no específica aumentó la producción de P4HB a un grado similar como fue observado para la SSA reductasa A. thaliana. Tabla 9. Título de biomasa y P4HB para las cepas microbianas 9-13 EJEMPLO 4. Producción de P4HB mejorada por supresión de piruvato cinasas La remoción de piruvato cinasa I codificada por pykF y piruvato cinasa II codificada por pykA (Figura 1, Número de Reacción 2) se ha mostrado que reduce la producción de acetato y favorece la generación de C02 (Zhu et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:624-628). Estos resultados indican que la remoción de pykF y pykA causa que el flujo de carbono sea suministrado al ciclo de TCA, y de este modo estas modificaciones genéticas se han descrito como útiles para la producción microbiana de succinato y 1 , 4 -butanodiol (Park et al., Patente WO No. 2009/031766). Para determinar si la supresión de los genes de piruvato cinasa pykF y pykA conducirían a títulos de P4HB mejorados, las siguientes dos cepas se construyeron utilizando las herramientas y métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente, ambas cepas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel y gabD y sobreexpresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa y una CoA- transferasa . La cepa 14 retuvo sus copias no modificadas nativas de pykF y pykA en el cromosoma, mientras que la cepa 15 tuvo ambos genes removidos (Tabla 10) .
Tabla 10. Cepas microbianas utilizadas en el Ejemplo 4 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido 48 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 30 g/L de glucosa y lx Solución de Micro Sales. Tanto el medio E2 como los microelementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 11 muestran que la cepa 15 la cual carece de pykF y pykA produjo más P4HB que la cepa 14 que retuvo estos dos genes .
Tabla 11. Títulos de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 14 y 15.
EJEMPLO 15. Producción de P4HB mejorada mediante la sobre-expresión de PEP carboxilasa La sobre-expresión de PEP carboxilasa (FIG. 1, Número de reacción 3) se ha utilizado para mejorar la producción tanto de la familia aspartato de aminoácidos como succinato aumentando el flujo de carbono en el ciclo de TCA. Sin embargo, puesto que muchos homólogos tipo silvestre de PEP carboxilasa son regulados por retroalimentación por L-aspartato u otros metabolitos derivados del ciclo de TCA, una cantidad considerable del arte previo se ha creado con respecto a la identificación ya sea de mutantes desensibilizados a retroalimentación (Sugimoto et al., Patente de Estados Unidos No. 5876983; San et al., Patente de Estados Unidos No. 2005/0170482) u homólogos alternativos que exhiben naturalmente menos regulación alostérica (Rayapati and Crafton, Patente de Estados Unidos No. 2002/0151010) .
Para determinar si la sobre-expresión de PEP carboxilasa conduciría al título de P4HB mejorado, las siguientes tres cepas fueron construidas utilizando las herramientas y métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Estas cepas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel y gabD y sobre-expresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa, una CoA- transferasa, y ya sea PEP carboxilasa tipo silvestre (ppcEc) de E. coli (cepa 17) o PEP carboxilasa tipo silvestre (ppcMs) de Medicago sativa (cepa 18) la cual tiene regulación alostérica reducida (Rayapati and Crafton, US20020151010 Al) . La cepa 16 sirvió como un control negativo y contuvo solamente un vector vacío en lugar de P3yni-ppcEc Psyni-ppcM3 (Tabla 12) .
Tabla 12. Cepas microbianas utilizadas en el Ejemplo 5 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido 44 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 25 g/L de glucosa y lx Solución de Micro Sales. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 13 muestran que tanto las cepas 17 como 18, las cuales expresan ya sea PEP carboxilasa de E. coli tipo silvestre o un homólogo menos regulado de la misma, produjeron cantidades significativamente mayores de P4HB que la cepa de control 16.
Tabla 13. Título de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 16, 17 y 18.
EJEMPLO 6. Producción de P4HB mejorada por supresión de enzimas málicas E. coli posee dos isoformas de enzima málica las cuales requieren ya sea NAD+ (maeA) o NADP+ (maeB) como cofactor reductor (Bologna et al., J. Bacteriol. 189 (16) : 5937-5946 (2007) para la conversión reversible de malato a piruvato (FIG. 1, Número de reacción 4) . Se ha mostrado que la supresión tanto de aeA como maeB mejora la producción de L-lisina y L-treonina en E. coli, presumiblemente previniendo la pérdida de carbono del ciclo de TCA (van Dien et al., Patente WO No. 2005/010175). Para determinar si la supresión de ambas enzimas málicas también conduciría a títulos de P4HB mejorados, las siguientes dos cepas se construyeron utilizando las herramientas y métodos de biotecnología bien conocidos descritos anteriormente. Ambas cepas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel y gabD y sobre-expresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa y una CoA- transferasa . La cepa 19 retuvo sus copias no modificadas nativas de maeA y maeB en el cromosoma, mientras que la cepa 20 tuvo ambos genes removidos (Tabla 14) .
Tabla 14. Cepas microbianas utilizadas en el Ejemplo 6 Las cepas crecieron en un ensayo de placa agitado 48 horas. El medio de producción consistió de lx solución de, sales mínimas E2 que contiene 30 g/L de glucosa y lx Solución de Micro Sales. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 15 muestran que la cepa 20 la cual carece de maeA y maeB produjo más P4HB que la cepa 19 la cual retuvo estos dos genes.
Tabla 15. Título de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 19 y 20 EJEMPLO 7. Producción de P4HB mejorada mediante la sobre-expresión de la derivación de glioxilato Efecto de la remoción de los genes de derivación de glioxilato Noronha et al. [Biotechnology and Bioengineering 68(3): 316-327 (2000)) concluyeron que el glioxilato derivado es inactivo en una cepa E. coli positiva a fadR (y positiva a iclR) utilizando 13C- MR/MS. Sin embargo, los mutantes de E. coli que son negativo a fadR se describieron por Maloy et al. (J. Bacteriol. 143 : 720-725 (1980)) teniendo niveles elevados de las enzimas de glioxilato derivado, isocitrato liasa y malato sintasa. Puesto que la cepa huésped LS5218 de origen utilizada en estos ejemplos contiene una mutación desconocida en el gen fadR, llamada fadR601 (E. coli Genetic Resources at Yale, The Coli Genetic Stock Center, CGSC#: 6966; encontrado en la red mundial: //cgsc . biology . yale . edu/index . php) , fue de interés para investigar si el carbono fue acanalado a través del glioxilato derivado (FIG. 1, Números de reacción 5 y 6) y/o la ramificación oxidativa del ciclo de TCA vía el alfa-cetoglutarato hacia la succinilo-CoA. Dos cepas por consiguiente se construyeron, ambas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel, gabD, pykF, pykA, aeA, aeB y sobre-expresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa, una CoA-transferasa y una PEP carboxilasa (cepa 21) . La cepa 22 contuvo supresiones adicionales de los genes aceA y aceB que codifican la isocitrato liasa y malato sintasa, respectivamente (Tabla 16) .
Tabla 16. Cepas microbianas utilizadas en esta sección del Ejemplo 7 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido 24 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 15 g/L de glucosa, lx Solución de Micro Sales. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 17 muestran que la cepa 22 que contiene un glioxilato derivado inactivo tuvo títulos de P4HB altamente reducidos en comparación con su cepa 21 parental .
Tabla 17. Título de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 21 y 22 Efecto de la sobre-expresión de los genes de derivación de glioxilato Se construyeron dos cepas, ambas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel, gabD, pykF, pykA y sobre-expresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa, una CoA-sintetasa y una PEP carboxilasa (cepa 23) . La cepa 24 sobre-expresó además los genes aceBA del promotor Ptrc inducible por IPTG mientras que la cepa 23 contuvo un vector vacío (Tabla 18) .
Tabla 18. Cepas microbianas utilizadas en esta sección del Ejemplo 7 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido 24 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas que contiene 15 g/L de glucosa, lx Solución de Micro Sales y 100 µ? IPTG. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 19 muestran que la cepa 24 que sobre-expresa las dos enzimas de trayectoria de glioxilato derivado produjeron títulos de P4HB mayores que su cepa 23 de origen que no expresa los genes aceBA del promotor Ptrc · Tabla 19. Título de Biomasa y P4HB para las cepas microbianas 23 y 24 EJEMPLO 8. Producción de P4HB mejorada mediante la sobre-expresión de gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa Martínez et al., (Metab. Eng. 10:352-359 (2009)) modificaron genéticamente una cepa de Escherichia coli para aumentar la disponibilidad de NADPH para mejorar la productividad de licopeno y e-caprolactona que requieren NADPH en su biosíntesis. Su procedimiento involucró una alteración de la etapa de glicólisis donde el gliceraldehído-3-fosfato se oxida a 1,3 bisfosfoglicerato. Esta reacción se catalizó por gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (GAPDH) endógena dependiente de NAD codificada por el gen gapA (FIG. 1, Número de reacción 1) . Construyeron una cepa de E. coli recombinante remplazando el gen gapA dependiente de NAD nativo con una GAPDH dependiente de NADP de Clostridiu acetobutylicum y demostraron mayor productividad significativa de licopeno y e-caprolactona que las cepas de origen.
Para determinar si la sobre-expresión de una GAPDH generadora de NADPH conduciría al título de P4HB mejorado, las siguientes seis cepas se construyeron utilizando las herramientas y métodos de biotecnología bien conocidos descritos antes. Todas las cepas contuvieron supresiones cromosómicas de ynel y gabD y sobre-expresaron una PHA sintasa, una succinilo-CoA deshidrogenasa, una SSA reductasa, una CoA- ransíerasa . La cepa 25 contuvo un vector vacío y sirvió como un control negativo en donde ningún otro gen recombinante fue expresado. Las cepas 26 a 29 sobre-expresaron un gen de un promotor inducible por IPTG que codifica una GAPDH generadora de NADPH de varios organismos, es decir gdpl de Kluyveromyces lactis, gap2 de Synechocystis sp. PCC6803, gapB de Bacillus subtilis, y gapN de Streptococcus pyogenes, respectivamente. Como otro control, la cepa 30 sobre -expresó el gen gapA de E. coli que codifica la GAPDH generadora de NADH (Tabla 20) .
Tabla 20. Cepas microbianas utilizadas en el Ejemplo 8 Las cepas crecieron en un ensayo de placa sacudido a 24 horas. El medio de producción consistió de lx solución de sales mínimas E2 que contiene 10 g/L de glucosa y lx Solución de Micro Sales y 100 µ? IPTG. Tanto el medio E2 como micro elementos se describen en el Ejemplo 2. Al final de la fase de crecimiento, los títulos de biomasa y P4HB se determinaron como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados en la Tabla 21 muestran que las cepas 26, 27, y 29 produjeron cantidades mayores de P4HB que cotrolan la cepa 25. De manera interesante, la cepa 28 produjo mucho menos P4HB que la cepa 25. De manera sorprendente, la sobre-expresión del gen gapA endógeno que codifica la GAPDH generadora de NADH en la cepa 30 superó todas las otras cepas .
Tabla 21. Título de Bioraasa y P4HB para las cepas microbianas 25-30 Breve Descripción de las Secuencias de Nucleótidos y Proteínas Secuencia de Nucleótido de Gen ID 001: fosfoenolpiruvato carboxilasa ppc* de Medicago sativa ATGGCAAACAAAATGGAAAAGATGGCAAGCATTGACGCGCAACTGCGCCAGTTGGTCCCGG CAAAAGTCAGCGAGGACGACAAATTGATTGAATACGATGCTCTGTTGCTGGACCGCTTTCT GGACATTCTGCAAGATCTGCATGGCGAGGATCTGAAGGATTCGGTTCAGGAAGTTTACGAA CTGTCTGCGGAGTATGAGCGTAAGCATGACCCGAAGAAGCTGGAAGAGCTGGGTAACTTGA TTACGAGCTTTGACGCGGGCGACAGCATTGTCGTGGCGAAATCGTTCTCTCATATGCTGAA TCTGGCGAACCTGGCCGAAGAAGTTCAAATTGCTCACCGCCGTCGTAACAAGCTGAAGAAG GGTGATTTTCGTGATGAGAGCAATGCGACCACCGAGTCCGATATTGAGGAGACTCTGAAGA AACTGGTTTTCGACATGAAGAAGTCTCCGCAAGAAGTGTTTGACGCGTTGAAGAATCAGAC CGTGGACCTGGTGCTGACGGCACATCCTACCCAGAGCGTTCGCCGTTCCCTGCTGCAAAAG CATGGTCGTGTTCGTAATTGCTTGAGCCAGCTGTATGCGAAAGACATTACCCCGGATGACA AACAAGAGCTGGACGAGGCACTGCAGCGTGAAATCCAGGCAGCGTTCCGTACCGATGAAAT CAAACGTACCCCGCCGACCCCACAAGACGAAATGCGTGCTGGCATGAGCTATTTCCACGAA ACCATCTGGAAGGGCGTCCCGAAGTTCCTGCGTCGCGTGGACACCGCGTTGAAGAACATCG GCATTAACGAACGCGTGCCGTATAACGCCCCGCTGATTCAATTCAGCAGCTGGATGGGTGG CGACCGTGACGGCAATCCGCGTGTTACGCCAGAAGTGACCCGTGATGTTTGTCTGCTGGCG CGTATGATGGCGGCGAATTTGTACTATAGCCAGATTGAAGATCTGATGTTTGAGCTGTCTA TGTGGCGCTGTAATGATGAGTTGCGTGTGCGTGCCGAAGAACTGCACCGCAATAGCAAGAA AGACGAAGTTGCCAAGCACTACATCGAGTTCTGGAAGAAGATCCCGTTGAACGAGCCGTAC CGTGTTGTTCTGGGTGAGGTCCGCGATAAGCTGTATCGCACCCGTGAGCGCAGCCGTTATC TGCTGGCACACGGTTATTGCGAAATTCCGGAGGAGGCGACCTTTACCAACGTGGATGAATT TCTGGAACCGCTGGAGCTGTGTTATCGTAGCCTGTGCGCGTGCGGTGACCGCGCGATTGCG GACGGTTCTTTGCTGGATTTCCTGCGCCAGGTGAGCACGTTTGGTCTGAGCCTGGTCCGTC TGGATATCCGTCAGGAATCGGACCGCCATACGGATGTGATGGACGCTATTACCAAACACCT GGAAATTGGCAGCTACCAGGAGTGGAGCGAGGAGAAACGTCAAGAGTGGCTGCTGAGCGAG CTGATCGGTAAGCGTCCGCTGTTCGGTCCAGATCTGCCGCAAACCGACGAAATCCGCGACG TTCTGGACACCTTTCGTGTGATTGCCGAACTGCCGAGCGACAACTTCGGCGCGTACATTAT CTCCATGGCCACCGCCCCGAGCGATGTCCTGGCAGTCGAGCTGCTGCAACGCGAATGTAAG GTCCGTAACCCGTTGCGCGTGGTTCCGCTGTTTGAAAAGCTGGATGACCTGGAGAGCGCAC CGGCCGCACTGGCTCGTCTGTTTAGCATTGACTGGTACATTAACCGTATTGATGGTAAACA GGAAGTGATGATTGGTTACTCCGACAGCGGTAAAGATGCGGGTCGTTTTAGCGCCGCATGG CAGCTGTACAAGGCACAAGAAGATCTGATCAAGGTTGCACAGAAGTTCGGCGTTAAACTGA CCATGTTCCACGGTCGCGGTGGTACGGTTGGCCGTGGTGGCGGCCCAACCCACCTGGCGAT TCTGAGCCAACCGCCGGAGACTATCCATGGTTCCTTGCGTGTCACCGTCCAGGGCGAAGTG ATTGAGCAAAGCTTCGGCGAGGAACATCTGTGCTTTCGCACCCTGCAGCGTTTTACGGCCG CGACTTTGGAACACGGCATGCGTCCGCCATCCAGCCCAAAGCCAGAATGGCGTGCGCTGAT GGACCAAATGGCGGTTATCGCGACCGAGGAGTATCGCAGCATTGTGTTCAAAGAGCCGCGT TTTGTGGAGTATTTCCGTTTGGCAACGCCGGAGATGGAGTACGGCCGCATGAATATCGGCA GCCGTCCGGCAAAACGTCGCCCGTCCGGCGGCATCGAGACGCTGCGTGCCATCCCGTGGAT TTTCGCGTGGACGCAGACCCGTTTCCATTTGCCGGTGTGGCTGGGTTTCGGTGCCGCCTTT CGTCAAGTCGTGCAGAAGGACGTGAAGAATCTGCATATGCTGCAGGAGATGTACAACCAGT GGCCGTTCTTTCGTGTCACCATTGATCTGGTGGAAATGGTCTTTGCGAAAGGTGATCCGGG CATCGCGGCGTTGAATGACCGTCTGCTGGTTTCCAAAGACCTGTGGCCTTTTGGTGAACAG CTGCGTAGCAAGTACGAGGAAACCAAGAAACTGCTGTTGCAAGTTGCGGCGCACAAGGAGG TGCTGGAAGGTGACCCTTATCTGAAGCAACGCCTGCGTCTGCGTGACTCGTACATCACGAC CCTGAATGTCTTTCAGGCGTATACCCTGAAGCGTATCCGTGACCCGAATTACAAAGTGGAA GTTCGCCCTCCGATCAGCAAGGAGAGCGCGGAGACTAGCAAACCAGCGGACGAACTGGTCA CCCTGAATCCGACCTCGGAGTATGCTCCGGGTTTGGAAGATACGCTGATTCTGACGATGAA GGGTATCGCGGCTGGCATGCAGAACACGGGCTAA (SEC ID NO . 1) Secuencia de Proteína de Gen ID 001: fosfoenolpiruvato carboxilasa ppc* de Medicago sativa MANKMEKMASIDAQLRQLVPAKVSEDDKLIEYDALLLDRFLDILQDLHGEDLKDSVQEVYE LSAEYERKHDPKKLEELGNLITSFDAGDSIWA SFSHMLNLANLAEEVQIAHRRR LKK GDFRDESNATTESDIEETLKKLVFDMKKSPQEVFDALKNQTVDLVLTAHPTQSVRRSLLQK HGRVRNCLSQLYAKDITPDDKQELDEALQREIQAAFRTDEIKRTPPTPQDEMRAGMSYFHE TIWKGVPKFLRRVDTALKNIGINERVPYNAPLIQFSSWMGGDRDGNPRVTPEVTRDVCLLA RMMAANLYYSQIEDLMFELSMWRCNDELRVRAEELHR SKKDEVAKHYIEF KKIPLNEPY RWLGEVRDKLYRTRERSRYLLAHGYCEIPEEATFTNVDEFLEPLELCYRSLCACGDRAIA DGSLLDFLRQVSTFGLSLVRLDIRQESDRHTDVMDAITKHLEIGSYQEWSEEKRQEWLLSE LIGKRPLFGPDLPQTDEIRDVLDTFRVIAELPSDNFGAYIISMATAPSDVLAVELLQRECK VRNPLRWPLFEKLDDLESAPAALARLFSIDWYINRIDGKQEVMIGYSDSGKDAGRFSAAW QLYKAQEDLIKVAQKFGVKLT FHGRGGTVGRGGGPTHLAILSQPPETIHGSLRVTVQGEV IEQSFGEEHLCFRTLQRFTAATLEHGMRPPSSPKPEWRALMDQMAVIATEEYRSIVFKEPR FVEYFRLATPEMEYGRMNIGSRPAKRRPSGGIETLRAIPWIFAWTQTRFHLPV LGFGAAF RQWQKDVKNLHMLQEMYNQ PFFRVTIDLVEMVFAKGDPGIAALNDRLLVSKDLWPFGEQ LRSKYEETKKLLLQVAAHKEVLEGDPYLKQRLRLRDSYITTL VFQAYTLKRIRDPNYKVE VRPPISKESAETSKPADELVTLNPTSEYAPGLEDTLILTMKGIAAGMQNTG (SEC ID NO. 2) Secuencia de Nucleótido de Gen ID 002: succinato semialdehído deshidrogenasa sucD* de Clostridium kluyveri ATGTCCAACGAGGTTAGCATTAAGGAGCTGATTGAGAAGGCGAAAGTGGCGCAGAAAAAGC TGGAAGCGTATAGCCAAGAGCAAGTTGACGTTCTGGTCAAGGCGCTGGGTAAAGTTGTGTA CGACAACGCCGAGATGTTCGCGAAAGAGGCGGTGGAGGAAACCGAGATGGGTGTTTACGAG GATAAAGTGGCTAAATGTCATCTGAAATCTGGTGCAATCTGGAATCACATTAAAGATAAGA AAACCGTTGGTATTATCAAGGAAGAACCGGAGCGTGCGCTGGTGTACGTCGCGAAGCCTAA AGGTGTTGTGGCGGCGACGACCCCTATCACCAATCCTGTGGTTACCCCGATGTGTAACGCG ATGGCAGCAATTAAAGGTCGCAACACCATCATTGTCGCCCCGCATCCGAAGGCGAAGAAGG TGAGCGCGCACACCGTGGAGCTGATGAATGCAGAACTGAAAAAGTTGGGTGCGCCGGAAAA CATTATCCAGATCGTTGAAGCCCCAAGCCGTGAAGCAGCCAAGGAGTTGATGGAGAGCGCA GACGTGGTTATCGCCACGGGTGGCGCAGGCCGTGTTAAAGCAGCGTACTCCTCCGGCCGTC CGGCATACGGTGTCGGTCCGGGCAATTCTCAGGTCATTGTCGATAAGGGTTACGATTATAA CAAAGCTGCCCAGGACATCATTACCGGCCGCAAGTATGACAACGGTATCATTTGCAGCTCT GAGCAGAGCGTGATCGCACCGGCGGAGGACTACGACAAGGTCATCGCGGCTTTCGTCGAGA ATGGCGCGTTCTATGTCGAGGATGAGGAAACTGTGGAGAAATTCCGTAGCACGCTGTTCAA GGATGGCAAGATCAATAGCAAAATCATCGGTAAATCCGTGCAGATCATCGCTGACCTGGCT GGTGTCAAGGTGCCGGAAGGCACCAAGGTGATCGTGTTGAAGGGCAAGGGTGCCGGTGAAA AGGACGTTCTGTGCAAGGAGAAAATGTGCCCGGTCCTGGTTGCCCTGAAATATGACACCTT TGAGGAGGCGGTCGAGATCGCGATGGCCAACTATATGTACGAGGGTGCGGGCCATACCGCC GGTATCCACAGCGATAACGACGAGAATATCCGCTACGCGGGTACGGTGCTGCCAATCAGCC GTCTGGTTGTCAACCAGCCAGCAACTACGGCCGGTGGTAGCTTTAACAATGGTTTTAATCC GACCACCACCTTGGGCTGCGGTAGCTGGGGCCGTAACTCCATTAGCGAGAACCTGACGTAT GAGCATCTGATTAATGTCAGCCGTATTGGCTATTTCAATAAGGAGGCAAAAGTTCCTAGCT ACGAGGAGATCTGGGGTTAA (SEC ID NO. 3) Secuencia de Proteína de Gen ID 002: succinato semialdehído deshidrogenasa sucD* de Clostridium kluyveri MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKWYDNAEMFAKEAVEETEMGVYE DKVAKCHLKSGAIW HIKDKKTVGIIKEEPERALVYVAKPKGWAATTPITNPWTPMCNA MAAIKGRNTIIVAPHPKAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESA DWIATGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDIITGRKYDNGIICSS EQSVIAPAEDYDKVIAAFVENGAFYVEDEETVEKFRSTLFKDGKINSKIIG SVQIIADLA GVKVPEGTKVIVLKGKGAGEKDVLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMA YMYEGAGHTA GIHSDNDENIRYAGTVLPISRLWNQPATTAGGSF NGFNPTTTLGCGS GR SISENLTY EHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG (SEC ID NO . 4) Secuencia de Nucleótido de Gen ID 003 : semialdehído succínico reductasa ssaRAt* de Arabidopsis thaliana ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATGAACCTGCTGA AAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCTAAATGTGATGAACTGGTTGA ACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCTGAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATC GCGATGCTGAGCGATCCGTGTGCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGG AACAGATCTGCGAGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCT GAAAATTAACGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCTGTTAGCGGT TCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCCTGGCAGCAGGCGACAAAGCACTGT TCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTGGGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGT GGGTAACGGTGCGAAAATGAAACTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTATGATGAACGCG TTTAGCGAAGGTCTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATA TTCTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCCATGACTAA ATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAAGACATGCGTCTGGCTCTG GCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCGGTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCA AGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTGGGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAA ATTCTCTCGTGAATAA (SEC ID NO . 5) Secuencia de Proteína de Gen ID 003: semialdehído succínico reductasa ssaRAt* de Arabidopsis thaliana MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPAEVIKKCKYTI AMLSDPCAALSWFDKGGVLEQICEG GYIDMSTVDAETSLKINEAITGKGGRFVEGPVSG SKKPAEDGQL11LAAGDKALFEESIPAFDVLGKRSFYLGQVGNGAKMKLIV MIMGSMMNA FSEGLVLADKSGLSSDTLLDILDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLAL ALGDENAVSMPVAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE (SEC ID NO . 6) Secuencia de Nucleótido de Gen ID 004: semialdehído succínico reductasa ssaRAt2* de Aspergillus terreus atgccactggttgctcaaaatccactgccacgtgctattctgggtctgatgactttcggtc cgagcgaaagcaaaggtgcgcgtatcacttccctggatgagtttaacaagtgcctggatta cttccagcagcagggcttccaggaaatcgataccgcgcgcatctacgtcggcggtgaacag gaggcattcacggcgcaggcaaagtggaaagaacgcggcctgacgctggcgactaagtggt atccgcagtacccgggtgcgcacaaaccggatgtcctgcgtcagaacctggagctgtccct gaaagaactgggcacgaaccaggtcgatatcttctatctgcacgccgcggatcgttctgtg ccgttcgcggaaactctggaaactgttaacgaactgcacaaagaaggcaaatttgttcagc tgggtctgtctaactacaccgctttcgaagtagctgaaatcgtgaccctgtgtaacgagcg tggttgggttcgtccgactatctaccaggcgatgtataacgc tcacccgtaacatcgaa actgaactgatcccggcgtgcaagcgttacggtattgacattgttatctacaacccactgg cgggtggcctgttcagcggcaaatacaaagcacaggacatcccggctgaaggtcgttacag cgaccaatcttccatgggccagatgtaccgcaaccgttactttaaggacgcaacctttgac gctctgcgcctgatcgaaccggttgttgcgaagcacggcctgacgatgccggaaaccgcgt tccgctgggtccaccaccactccgcactgaacatggaagatggcggccgtgacggcatcat tctgggtgtaagcagcctggctcagctggaaaacaacctgaaagacattcagaaaggtccg ctgccgcaggaggttgtagacgtcctggatcaggcttggctggtggctaagccgacggctc caaactactggcatctggacctgaaatacacgtacgacacccaggaagctctgttcaaacc gaaatctaaggcgtaa (SEC ID NO. 7) Secuencia de Proteína de Gen ID 004: semialdehído succínico reductasa ssaRAt2* de Aspergillus terreus MPLVAQNPLPRAILGLMTFGPSESKGARITSLDEFNKCLDYFQQQGFQEIDTARIYVGGEQ EAFTAQAK KERGLTLATK YPQYPGAHKPDVLRQNLELSLKELGTNQVDIFYLHAADRSV PFAETLETV ELHKEGKFVQLGLSNYTAFEVAEIVTLCNERG VRPTIYQAMYNAITR IE TELIPACKRYGIDIVIYNPLAGGLFSGKYKAQDIPAEGRYSDQSSMGQMYRNRYFKDATFD ALRLIEPWAKHGLTMPETAFRWVHHHSALNMEDGGRDGIILGVSSLAQLE LKDIQKGP LPQEWDVLDQA LVAKPTAPNYWHLDLKYTYDTQEALFKPKSKAAVKFSRE (SEC ID NO. 8) Secuencia de Nucleótido de Gen ID 005: semialdehído succínico reductasa ssaRMm* de Mus musculus atgctgcgtgctgcttctcgtgctgttggtcgtgctgctgtacgttccgctcaacgttctg gtactagcgttggccgtccgctggcgatgtcccgtccaccgccgcctcgcgcagctagcgg tgccccgctgcgtccggcaaccgtactgggcactatggagatgggtcgtcgcatggacgct tctgcatccgcggcaagcgttcgtgcgttcctggaacgtggccatagcgaactggataccg ctttcatgtattgcgacggtcagtccgaaaatatcctgggtggcctgggcctgggtctggg ctccggtgattgtaccgttaaaattgcgaccaaggcgaacccttgggagggcaagagcctg aagccggattctgtgcgttctcagctggagacttctctgaaacgtctgcagtgtccgcgcg tagacctgttctatctgcatgcgccggaccacagcactccggtagaggaaactctgcgtgc gtgtcatcagctgcaccaggaaggcaagttcgtcgaactgggtctgtctaactacgcatct tgggaagtggcagaaatctgtacgctgtgtaagtctaatggttggatcctgccaaccgtgt accagggcatgtacaacgctaccacccgccaggtagaagcagaactgctgccgtgcctgcg tcacttcggcctgcgcttttacgcttacaacccgctggcgggtggtctgctgacgggcaaa tacaagtatgaagataaagatggtaaacaaccggtcggtcgtttctttggtaacaactggg ccgaaacctaccgtaatcgcttctggaaagagcaccactttgaagcgatcgcactggttga aaaagcgctgcagacgacttatggcactaacgcgccgcgtatgacctccgctgcgctgcgt tggatgtaccaccatagccagctgcagggtactcgcggcgatgccgttatcctgggcatga gctccctggaacagctggaacagaacctggccgcgactgaagagggcccgctggaaccggc agttgtcgaagcttttgaccaggcatggaacatggtggcgcacgaatgtccaaactatttc cgctaa (SEC ID NO. 9) Secuencia de Proteína de Gen ID 005: semialdehído succínico reductasa ssaRMm* de Mus musculus MLRAASRAVGRAAVRSAQRSGTSVGRPLAMSRPPPPRAASGAPLRPATVLGTMEMGRRMDA SASAASVRAFLERGHSELDTAFMYCDGQSENILGGLGLGLGSGDCTVKIATKA P EGKSL KPDSVRSQLETSLKRLQCPRVDLFYLHAPDHSTPVEETLRACHQLHQEGKFVELGLSNYAS WEVAEICTLCKSNGWILPTVYQGMYNATTRQVEAELLPCLRHFGLRFYAYNPLAGGLLTGK YKYEDKDGKQPVGRFFGNNWAETYR RFWKEHHFEAIALVEKALQTTYGTNAPRMTSAALR WMYHHSQLQGTRGDAVILGMSSLEQLEQNLAATEEGPLEPAWEAFDQA NMVAHECPNYF R (SEC ID NO. 10) Secuencia de Nucleótido de Gen ID 006: proteína de fusión phaC3/Cl de polihidroxialcanoato sintasa de pseudomonas putida/Ralstonia eutropha JMP134 ATGACTAGAAGGAGGTTTCATATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGGCGACGGGTAAAG GTGCTGCTGCATCTTCTACTGAAGGTAAATCTCAGCCGTTTAAATTCCCACCGGGTCCGCT GGACCCGGCCACTTGGCTGGAATGGAGCCGTCAGTGGCAAGGTCCGGAGGGCAATGGCGGT ACCGTGCCGGGTGGCTTTCCGGGTTTCGAAGCGTTCGCGGCGTCCCCGCTGGCGGGCGTGA AAATCGACCCGGCTCAGCTGGCAGAGATCCAGCAGCGTTATATGCGTGATTTCACCGAGCT GTGGCGTGGTCTGGCAGGCGGTGACACCGAGAGCGCTGGCAAACTGCATGACCGTCGCTTC GCGTCCGAAGCGTGGCACAAAAACGCGCCGTATCGCTATACTGCGGCATTTTACCTGCTGA ACGCACGTGCACTGACGGAACTGGCTGATGCAGTAGAAGCGGATCCGAAAACCCGTCAGCG TATCCGTTTTGCGGTTTCCCAGTGGGTAGATGCTATGAGCCCGGCTAACTTCCTGGCCACC AACCCGGACGCTCAGAACCGTCTGATCGAGAGCCGTGGTGAAAGCCTGCGTGCCGGCATGC GCAATATGCTGGAAGATCTGACCCGCGGTAAAATTTCCCAAACCGATGAGACTGCCTTCGA AGTAGGCCGTAACATGGCAGTTACCGAAGGTGCTGTGGTATTCGAAAACGAGTTCTTCCAG CTGCTGCAGTACAAACCTCTGACTGACAAAGTATACACCCGTCCGCTGCTGCTGGTACCGC CGTGCATTAACAAGTTCTATATTCTGGACCTGCAGCCGGAAGGTTCTCTGGTCCGTTACGC AGTCGAACAGGGTCACACTGTATTCCTGGTGAGCTGGCGCAATCCAGACGCTAGCATGGCT GGCTGTACCTGGGATGACTATATTGAAAACGCGGCTATCCGCGCCATCGAGGTTGTGCGTG ATATCAGCGGTCAGGACAAGATCAACACCCTGGGCTTTTGTGTTGGTGGCACGATCATCTC CACTGCCCTGGCGGTCCTGGCCGCCCGTGGTGAGCACCCGGTGGCCTCTCTGACCCTGCTG ACTACCCTGCTGGACTTCACCGATACTGGTATCCTGGATGTTTTCGTGGACGAGCCACACG TTCAGCTGCGTGAGGCGACTCTGGGCGGCGCCAGCGGCGGTCTGCTGCGTGGTGTCGAGCT GGCCAATACCTTTTCCTTCCTGCGCCCGAACGACCTGGTTTGGAACTACGTTGTTGACAAC TATCTGAAAGGCAACACCCCGGTACCTTTCGATCTGCTGTTCTGGAACGGTGATGCAACCA ACCTGCCTGGTCCATGGTACTGTTGGTACCTGCGTCATACTTACCTGCAGAACGAACTGAA AGAGCCGGGCAAACTGACCGTGTGTAACGAACCTGTGGACCTGGGCGCGATTAACGTTCCT ACTTACATCTACGGTTCCCGTGAAGATCACATCGTACCGTGGACCGCGGCTTACGCCAGCA CCGCGCTGCTGAAGAACGATCTGCGTTTCGTACTGGGCGCATCCGGCCATATCGCAGGTGT GATCAACCCTCCTGCAAAGAAAAAGCGTTCTCATTGGACCAACGACGCGCTGCCAGAATCC GCGCAGGATTGGCTGGCAGGTGCTGAGGAACACCATGGTTCCTGGTGGCCGGATTGGATGA CCTGGCTGGGTAAACAAGCCGGTGCAAAACGTGCAGCTCCAACTGAATATGGTAGCAAGCG TTATGCTGCAATCGAGCCAGCGCCAGGCCGTTACGTTAAAGCGAAAGCATAA (SEG ID NO. 11) Secuencia de Proteína de Gen ID 006: proteína de fusión phaC3/Cl de polihidroxialcanoato sintasa de pseudomonas putida/Ralstonia eutropha J P134 MSNKN DELATGKGAAASSTEGKSQPFKFPPGPLDPAT LEWSRQWQGPEGNGGTVPGGFP GFEAFAASPLAGVKIDPAQLAEIQQRYMRDFTELWRGLAGGDTESAGKLHDRRFASEAWHK NAPYRYTAAFYLLNARALTELADAVEADPKTRQRIRFAVSQWVDAMSPA FLATNPDAQNR LIESRGESLRAGMR MLEDLTRGKISQTDETAFEVGRNMAVTEGAWFENEFFQLLQYKPL TDKVYTRPLLLVPPCINKFYILDLQPEGSLVRYAVEQGHTVFLVSWR PDASMAGCT DDY IENAAIRAIEWRDISGQDKINTLGFCVGGTIISTALAVLAARGEHPVASLTLLTTLLDFT DTGILDVFVDEPHVQLREATLGGASGGLLRGVELANTFSFLRPNDLVWNYWDNYLKGNTP VPFDLLFW GDATNLPGPWYCWYLRHTYLQNELKEPGKLTVCNEPVDLGAINVPTYIYGSR EDHIVPWTAAYASTALLK DLRFVLGASGHIAGVINPPAKKKRSH TNDALPESAQDWLAG AEEHHGSWWPDWMTWLGKQAGAKRAAPTEYGSKRYAAIEPAPGRYVKAKA (SEC ID NO. 12) EJEMPLO 9: Generación de Gamma-Butirolactona a partir de la Pirólisis de un Microbio Genéticamente Modificado Que Produce Poli -4 -hidroxibutirato .
La biomasa que contiene poli (4 -hidroxibutirato) (P4HB) se produjo en un fermentador New Brunswick Scientific (BioFlo 4500) de 20 L utilizando una cepa E. coli genéticamente modificada específicamente diseñado para la producción de poli-4HB a partir de jarabe de glucosa como una fuente de alimentación de carbono. Los ejemplos de las cepas de E. coli, condiciones de fermentación, medio y condiciones de alimentación se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,316,262; 6,689,589; 7,081,357; y 7,229,804 incorporadas para referencia en la presente. La cepa E. coli generó un caldo de fermentación el cual tuvo un título de P4HB de aproximadamente 100-120 g de P4HB/kg de caldo. Después que la fermentación se completó, 100 g del caldo de fermentación (por ejemplo, biomasa de P4HB) sé mezclaron con una pasta aguada acuosa que contiene 10% en peso de cal (Ca(OH) 2 95+%, Sigma Aldrich) . Una porción de 2 g de la mezcla de caldo + cal luego se secó en una bandeja de aluminio a 150°C utilizando una balanza de calor infrarrojo (Analizador de Humedad MB-45 Ohaus) a peso constante. El agua residual que permaneció fue <5 % en peso. La concentración de cal final en el caldo seco fue 50 g de cal/kg de sólidos secos o 5% en peso. También se preparó una muestra que contiene solamente caldo de fermentación seco (sin adición de cal) . Adicionalmente, una muestra de poli-4HB puro se recuperó por extracción con solvente como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 7,252,980 y 7,713,720, seguido por secado en horno para remover el solvente residual.
Las muestras de biomasa de P4HB seca se analizaron por TGA utilizando una temperatura isotérmica de 300°C bajo una purga de gas N2. La FIG. 3 muestra las curvas de pérdida de peso contra tiempo de TGA para el caldo de fermentación seco con cal (curva punteada) , y sin cal (curva continua) . Cada muestra de caldo seco mostró un evento de pérdida de peso mayor único. En las gráficas también se muestran las inclinaciones de las curvas de pérdida de peso (indicando la velocidad de degradación térmica) y los tiempos de comienzo para la terminación de pérdida de peso. La Tabla 22 muestra los datos de velocidad de degradación térmica para las dos muestras de caldo seco. Con la adición de 5% en peso de cal, el caldo seco mostró una velocidad 34% más rápida de pérdida de peso en comparación con el caldo seco sin cal agregada. Además el tiempo de comienzo para la terminación de la degradación térmica fue aproximadamente 30% más corto en el caldo seco con muestra de cal agregada. Estos resultados mostraron que el catalizador de cal significativamente aceleró el proceso de degradación térmica de biomasa de P4HB.
Tanto las muestras de caldo seco como una muestra de poli-4HB puro luego se analizaron por Py-GC-MS para identificar los compuestos que se generaron durante la degradación térmica a 300°C en una atmósfera inerte. La FIG. 4 muestra los cromatogramas del poli-4HB puro pirolizado, caldo seco sin cal agregada, y caldo seco con cal agregada. Para todas las muestras, dos componentes de degradación térmica principales se identificaron de la pirólisis a 300°C: GBL (pico a 6.2 min) , y el dimero de GBL (pico a 11.1 min). El dimero de GBL se identificó como (3- (dihidro-2 (3H) -furanilideno) dihidro-2 (3H) -furanona) . La FIG. 4 muestra las de bibliotecas espectrales de masa que identifican estos dos picos.
La Tabla 22 más adelante resume los datos de Py-GC-MS medidos para el polímero de poli-4HB puro, caldo seco de poli-4HB sin cal agregada, y el caldo seco de poli-4HB con cal agregada. Fue observado que tanto la selectividad como rendimiento de GBL del caldo aumentan con la adición del catalizador de cal. El rendimiento fue calculado tomando los conteos de área pico de GBL y dividiendo por el peso de P4HB en cada muestra. Para las muestras de caldo, el % de P4HB medido fue ~ 49% en peso de la biomasa total. El medio de caldo de fermentación típicamente tiene potasio (4-7% en peso) y sales de metal de sodio (<1% en peso) presentes en este de modo que el aumento en el rendimiento de GBL fue solamente 10% después de la adición de cal. Sin embargo, la selectividad para GBL se aumentó por un factor de 2 después de la adición de cal. Como es evidente de la Tabla 22, la concentración de cal mayor suprimió la formación del dimero de GBL, mientras aumentó el rendimiento de GBL con relación al peso de poli-4HB pirolizado. 22. Resumen de datos de Pirolisis-GC- S a 300°C y TGA polímero puro de poli-4HB, caldo seco de poli-4HB y caldo seco de poli-4HB con cal agregada.
* Medida de la inclinación de las curvas de pérdida de peso de TGA a 300°C bajo atmósfera de N2.
EJEMPLO 10. Efecto de la Temperatura, Tipo de Catalizador, Concentración de Catalizador y tipo de Caldo en la Generación de Gamma-Butirolactona de la Pirólisis de un Microbio Genéticamente Modificado Que Produce Poli-4- idroxibutirato En este ejemplo, se realizó un experimento diseñado (DOE) para determinar los efectos de la temperatura de pirólisis, tipo de catalizador, concentración de catalizador y tipo de caldo en la pureza de GBL producida de un caldo de fermentación microbiana que contiene P4HB. La Tabla 23 muestra los parámetros de DOE y condiciones probadas. En total se probaron dieciséis diferentes condiciones experimentales. Se utilizó Py-GC-MS para medir la pureza de GBL. Dos duplicados en cada condición se realizaron para un total de treinta y dos corridas de Py-GC-MS. TGA también se midió para valorar el efecto de los catalizadores en la velocidad de degradación térmica de P4HB a las diversas temperaturas de pirólisis. Se hicieron solamente corridas únicas en cada condición experimental para estas mediciones. Para comparación, las muestras de caldo seco + P4HB (lavadas y no lavadas) que no tienen catalizador agregado también se prepararon y analizaron por TGA y Py-GC-MS pero no fueron parte del experimento total.
Tabla 23. Diseño de los parámetros y condiciones del experimento para determinar el efecto de la temperatura de pirólisis, tipo de catalizador, concentración de catalizador y tipo de caldo en la pureza de GBL generada de caldo de fermentación microbiana + P4HB. *% en peso de ión metálico con relación a la masa celular seca del caldo.
La biomasa que contiene poli (4-hidroxibutirato) (poli-4HB) se produjo en un fermentador New Brunswick Scientific (BioFlo 4500) de 20 L utilizando una cepa de E. coli genéticamente modificada específicamente diseñado para la producción a alto rendimiento de poli-4HB a partir de jarabe de glucosa como una fuente de alimentación de carbono.
Los ejemplos de las cepas de E. coli, condiciones de fermentación, medio y condiciones de alimentación se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,316,262; 6,689,589; 7,081,357; y 7,229,804. La cepa de E. coli generó un caldo de fermentación el cual tuvo un título de PHA de aproximadamente 100-120 g de PHA/kg de caldo. Después de la fermentación, el caldo de fermentación que contiene la biomasa microbiana y polímero de P4HB se dividió en dos fracciones. Una fracción se utilizó sin algún procesamiento adicional y se identificó como caldo ??? lavado' . El caldo no lavado tuvo un contenido de sólidos secos de 13.7% (el peso de sólidos secos se midió utilizando un Analizador de Humedad MB-45 Ohaus) . La otra fracción se lavó agregando un volumen igual de agua destilada y desionizada al caldo, agitando la mezcla por 2 minutos, centrifugando y luego decantando el líquido y reteniendo la biomasa sólida + P4HB. La etapa de lavado se repitió una segunda vez y luego después de la centrifugación y decantación, los sólidos remanentes se resuspendieron de nuevo en agua DI para producir una solución de sólidos secos de 12.9% en peso. Este material fue designado caldo 'lavado' . La Tabla 24 muestra el análisis de micro metales por Cromatografía de Iones de los dos tipos de caldo. Los resultados mostraron que el caldo no lavado tuvo altos niveles de iones potasio y sodio presentes debido a los componentes del medio utilizados para hacer crecer las células microbianas. Después de la etapa de lavado, los iones de potasio, magnesio y sodio se redujeron significativamente reduciendo el contenido total de metales del caldo + P4HB por un factor de 6.
Tabla 24. Resumen de los resultados de la Cromatografía de Iones para el caldo de fermentación + P HB antes y después del lavado con agua destilada, desionizada.
Los catalizadores de pirólisis utilizados en este experimento incluyeron Ca(OH)2 (95+% Sigma Aldrich) , Mg(OH)2 (Sigma Aldrich), FeS04 7H20 (JT Baker), y Na2C03 (99.5+% Sigma Aldrich) . Las pastas aguadas acuosas de los catalizadores Ca(OH)2, Mg(OH)2 y FeS047H20 se prepararon en agua DI (25-30% en peso de sólidos) y se agregaron a las muestras de caldo mientras que el Na2C03 se agregó al caldo + P4HB directamente como un sólido. Como se muestra en la Tabla 23, las concentraciones de catalizador dirigidas para el experimento fueron 1%, 3%, 5% y 10% con base en el peso del ión metálico con relación al peso de sólidos secos del caldo. Para preparar las muestras de caldo + P4HB/catalizador, 10 g de caldo ya sea lavado o no lavado se agregaron a un tubo de centrifuga de 15 mi. Luego, la cantidad apropiada de sólido o solución de catalizador se agregó y la mezcla se sometió a vórtice por 30 seg. La mezcla luego se centrifugó, se decantó y se vertió en un plato de secado. Finalmente el plato de secado se colocó en un horno a 110°C y se secó a peso constante. Las muestras secas del caldo no lavado y lavado que no contienen catalizadores también se prepararon por centrifugación, decantación y secado a 110 °C.
La Tabla 25 muestra los resultados de los análisis TGA y Py-GC-MS en las muestras de caldo + P4HB las cuales no tienen catalizadores agregados.
Tabla 25. Resumen de los resultados de TGA y Py-GC-MS para las muestras de caldo + P4HB que no tienen catalizador agregado a estas.
Los resultados de la Tabla 25 muestran que el lavado del caldo + P4HB antes de la pirolización tuvo un impacto significativo en la disminución de la velocidad de la descomposición térmica a todas las temperaturas de pirólisis. De los resultados de la Cromatografía de Iones en la Tabla 24, se puede ver que la concentración total de los iones metálicos presentes en el caldo lavado se disminuyó por un factor de 6 en comparación con el caldo no lavado. Esto indicó que los iones metálicos presentes en el caldo + P4HB después de una corrida de fermentación, por si solos tuvieron un efecto catalítico en la velocidad de degradación de P4HB durante la pirólisis. Kim et.al. (2008, Polymer Degradation and Stability, 93, p776-785) han mostrado que los iones metálicos Ca, Na, g, Zn, Sn y Al son todos efectivos en la catalización de la degradación térmica de P4HB. Lo que no se mostró, sin embargo, fue el efecto que estos iones metálicos tuvieron en la pureza de la GBL producida por la descomposición térmica de P4HB. La Tabla 25 muestra que para las muestras de caldo no lavado + P4HB, la pureza de GBL (relación de área pico de dímero de GBL/GBL) disminuyó cuando la temperatura de la pirólisis aumentó. Para las muestras lavadas, la pureza mejoró marginalmente con el aumento de la temperatura de la pirólisis.
Los datos en la Tabla 25 sugieren que para cualquier proceso que produce GBL de base biológica por descomposición térmica de P4HB y un catalizador, existe un equilibrio entre la velocidad de la reacción y pureza del producto final. Los siguientes datos mostrarán que el tipo y concentración de catalizador utilizados impacta significativamente tanto en la velocidad de degradación térmica como la pureza de GBL en formas no anticipadas .
La Tabla 26 resume los resultados experimentales de TGA y Py-GC-MS para la pirólisis de caldo + P4HB como una función del tipo de catalizador, concentración, temperatura de la pirólisis y tipo de caldo.
Tabla 26. Resumen de los resultados de TGA y Py-GC-MS para el caldo + P4HB como una función del tipo de catalizador, concentración de catalizador, temperatura de la pirólisis y tipo de caldo. *% en peso de ión metálico con relación al peso de sólidos secos del caldo .
Los análisis estadísticos de los datos en la Tabla 26 (utilizando software estadístico J P de SAS) , mostró que para la velocidad de degradación térmica más rápida, los parámetros de variables óptimos para usar serían caldo no lavado + P4HB, Na2C03 como el catalizador a 5% de concentración y una temperatura de pirólisis de 300°C. El tipo de catalizador fue la variable más significativa que afectó las velocidades de degradación las cuales variaron desde -1 a -185% en peso de pérdida/min. Las muestras con catalizador de FeS04 tuvieron velocidades de degradación menores que aún el caldo lavado + P4HB indicando que este compuesto actuó más como un estabilizante térmico de P4HB antes que un promotor de catalizador. Las muestras las cuales tuvieron las velocidades de degradación más altas fueron aquellas con ya sea Na2C03 o Ca(OH)2. Las temperaturas mayores y concentración de catalizador generalmente mayor también favorecieron las velocidades de degradación más rápidas.
El análisis estadístico de los datos de pureza de GBL mostró que los parámetros de variables óptimos para la pureza de GBL más alta se encontraron utilizando catalizador de Ca(OH)2 a concentración al 10% y una temperatura de pirólisis de 250°C. En comparación con las otras variables, el tipo de caldo tuvo un efecto insignificante en la pureza de GBL. Las variables más estadísticamente significativa para la pureza de GBL, las cuales variaron de valor desde 17 a 2016 (relación de área pico de dímero de GBL/GBL) fueron la concentración y tipo de catalizador. Se observó que los valores de intervalo superior para la pureza de GBL en los resultados experimentales fueron mucho mayores que aquellos observados para las muestras de caldo no lavado + P4HB en la Tabla 25. Esto indicó que los iones metálicos que permanecieron en el caldo de fermentación (mayormente potasio) no fueron tan efectivos para mejorar la pureza de GBL como aquellos utilizados en el experimento. También se encontró que la temperatura de la pirólisis es una variable estadísticamente significativa para la pureza de GBL (las temperaturas mayores generaron más dímero) . En la Tabla 26, la ausencia de datos de Py-GC-MS para el caldo + P4HB con FeS04 como el catalizador fue debido al hecho que las muestras tomaron demasiado tiempo para pirolizarse bajo las condiciones de Py-GC-MS y por lo tanto no se podrían cuantificar. Esto estuvo de acuerdo con los datos de TGA los cuales mostraron que el FeS04 actuó como un estabilizante térmico antes que el promotor catalizador.
Como se muestra en el Ejemplo 9, la adición del catalizador de Ca(OH)2 a la biomasa microbiana + P4HB suprimió la formación del dímero de GBL produciendo un líquido de GBL pura durante la pirólisis de la biomasa. Los datos experimentales anteriores confirmaron esta observación y mostraron que la concentración de catalizador y temperatura de la pirólisis también fueron importantes en la determinación de las condiciones óptimas para producir GBL de alta pureza a partir de caldo seco + P4HB mediante pirólisis. También se mostró que la elección del catalizador y temperatura de la pirólisis impactó en la velocidad de la degradación térmica de P4HB. Por lo tanto se necesita elegir cuidadosamente las condiciones correctas para optimizar ambas variables cuando se diseña un proceso robusto para la producción de GBL de base biológica.
EJEMPLO 11. Producción a Gran Escala de Gamma-Butirolactona a partir de la Pirólisis de un Microbio Genéticamente Modificado Que Produce Poli-4-hidroxibutirato.
En el siguiente ejemplo, la producción de GBL a partir de pirólisis de una mezcla de caldo de fermentación + P4HB + catalizador será resumida mostrando la capacidad para producir una GBL de base biológica de alto rendimiento, alta pureza en la escala de cientos de gramos.
La biomasa que contiene poli-4-hidroxibutirato (poli-4HB) se produjo en un fermentador New Brunswick Scientific (BioFlo 4500) de 20 L utilizando una cepa de E. coli genéticamente modificada diseñado específicamente para la producción a alto rendimiento de poli-4HB a partir de jarabe de glucosa como una fuente de alimentación de carbono. Los ejemplos de las cepas de E. coli, condiciones de fermentación, medio y condiciones de alimentación se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,316,262; 6,689,589; 7,081,357; y 7,229,804. La cepa de E. coli generó un caldo de fermentación el cual tuvo un título de PHA de aproximadamente 100-120 g de PHA/kg de caldo. Después de la fermentación, el caldo fue lavado con agua DI agregando un volumen igual de agua, mezclado por 2 minutos, centrifugación y decantación del agua. Luego, el caldo de lavado se mezcló con cal (cal hidratada estándar Ca(OH)2 98%, Mississippi Lime) que dirige 4% en peso de sólidos secos. La mezcla luego se secó en una secadora de tambor giratorio a 125-130°C a un peso constante. Los niveles de humedad en la biomasa seca fueron aproximadamente 1-2% en peso. El % en peso de ión de calcio final en el caldo seco + p4HB se midió por Cromatografía de Iones siendo 1.9% (3.5% en peso de Ca(0H)2).
La pirólisis del caldo seco + P4HB + Ca(OH)2 se realizó utilizando una estufa rotatoria de vidrio de cuarzo de cuatro pulgadas (10.16 cm) de diámetro suspendida dentro de un horno de tubos tipo almeja. Al inicio del proceso, una muestra pesada de caldo seco + P4HB + Ca(OH)2 se colocó dentro de la estufa de vidrio y un flujo de purga de nitrógeno establecido. La rotación del horno y calentamiento luego se iniciaría. Cuando la temperatura del horno alcanzó su valor de punto de ajuste, los gases generados por la muestra de caldo + P4HB + Ca(OH)2 serían barridos de la estufa por la purga de nitrógeno y entrar en una serie de condensadores de vidrio o trampas enfriadas . Los condensadores consistieron de una torre condensadora de vidrio vertical enfriada con una cubeta de colección de condensado ubicada en su base. Una mezcla de glicol/agua mantenida a 0°C se circuló a través de todos los condensadores de vidrio. Los gases enfriados que salieron de la parte superior del primer condensador fueron dirigidos hacia abajo a través de un segundo condensador y a través de un impactador de vidrio llenado con agua desionizada. La FIG. 7 muestra un diagrama esquemático del pirolizador y kit de colección de gas.
Para el experimento de pirólisis a gran escala, 292 g de caldo seco + P4HB + Ca(0H)2 primero se cargó en la estufa de cuarzo a temperatura ambiente. El peso total de la biomasa de P4HB se estimó que es 281.4 g basado en la carga de Ca(OH)2. El % en peso de P4HB en la mezcla también se midió siendo 66.7% (ver Doi, Microbial Polyesters, John iley and Sons, p23, 1990) con base en los sólidos secos los cuales vuelven la masa de P4HB en la estufa igual a 195 g. El sistema luego se selló y se estableció una purga de nitrógeno de aproximadamente 1500 ml/min. Se aplicó energía al horno y el caldo seco + P4HB + Ca(OH)2 se calentó hasta la temperatura de pirólisis objetivo de 250°C. Durante la pirólisis, los productos de la degradación térmica de la biomasa + P4HB, GBL, se colectaron en las trampas de condensado por debajo de los condensadores enfriados. El agua podría ser vista colectada inicialmente en cada una de las cubetas de colección. La mayoría del producto licuado (>95%) se colectó en la primera cubeta de colección de vidrio. El tiempo de corrida de pirólisis total fue aproximadamente 60 minutos . El peso de la biomasa remanente después de la pirólisis se midió siendo 11.9 g.
Después de la terminación de la corrida de pirólisis, los condensados de los condensadores se colectaron y pesaron. Los resultados mostraron que el peso de condensado combinado fue 181 g. El análisis del condensado por análisis de humedad de Karl Fisher y GC-MS mostró que el condensado contuvo 6.1% de agua, 0.06% de ácidos grasos con el resto del material siendo productos GBL. El rendimiento del producto GBL ( (g de producto GBL/g de P4HB de partida) xl00%) , por lo tanto, se calculó que es aproximadamente 87%. Los resultados de GC-MS también mostraron que la impureza mayor en el producto GBL fue el dimero de GBL donde la relación de área pico de dimero de GBL/GBL se calculó que es 2777. Esto estuvo de acuerdo con los resultados del experimento en el Ejemplo 10 que muestran que las condiciones de proceso óptimas para la pureza de GBL más alta fueron a la temperatura de pirólisis de 250°C con el catalizador de Ca(0H)2. Otras impurezas tales como compuestos amida y organoazufre también se detectaron por GC-MS como presentes en el condensado. La conversión de la biomasa de P4HB sólida a líquida ( (g de biomasa seca - g de biomasa residual/g de biomasa seca)xl00%) se calculó siendo 96%.
En otra modalidad, también es posible someter la gamma-butirolactona generada de los procesos descritos en la presente directamente a condiciones de hidrogenación, esterificación o amidación para producir el diol, éster de hidroxilo y amida correspondiente (por ejemplo, 1,4-butanodiol, alquil 4-hidroxi butirato, o N-alquilo 2-pirrolidona cuando se somete a hidrogenación con H2, esterificación con alcohol alquílico y amidación con alquil amina respectivamente) .
El procesamiento de grasas y aceites para producir alcoholes proporciona alguna guía a este respecto. Los aceites y grasas son fuentes significativas de alcoholes grasos que se utilizan en una variedad de aplicaciones tales como lubricantes y tensioactivos . Las grasas típicamente no se hidrogenan directamente ya que las condiciones de reacción intensivas tienden a degradar el glicerol a alcoholes inferiores tales como propilenglicol y propanol durante el curso de la hidrogenación. Por esta razón es más convencional hidrolizar primero el aceite y luego pre-purificar los ácidos grasos para habilitar una hidrogenación más eficiente (ver, por ejemplo, proceso de hidrogenación de Lurgi en Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Sexta Edición, Volumen Seis Set. Editado por Fereidoon Shahidi, John Wiley & Sons, Inc. 2005) .
Ejemplo 12. Generación de 1,4-Butanodiol de Base Biológica a partir de la Pirólisis de una Biomasa Genéticamente Modificada Que Produce Poli-4 -hiroxibutirato Seguida por Hidrogenación Directa. El siguiente ejemplo describe la generación de 1 , 4 -butanodiol de base biológica a partir de biomasa que contiene poli-4HB el cual luego se puede convertir a gamma-butirolactona producida por pirólisis y finalmente a 1, -butanodiol vía hidrogenación directa. La hidrogenación puede tomar lugar ya sea en la fase líquida o fase gas. Los ejemplos de ambos métodos se dan más adelante.
Método de Hidrogenación en Fase Líquida. 5 g de biomasa microbiana que contiene >40% en peso de poli-4HB se pueden calentar a presión atmosférica bajo nitrógeno a 275°C. Los vapores generados compuestos de >90% GBL se colectaron utilizando un condensador enfriado con agua mantenido a 20°C. Aproximadamente 2-3 g de "producto GBL luego se pueden recuperar por hidrogenación subsecuente. Un autoclave de 50 mL se cargó con 0.3 g de un catalizador de óxido de Cu/Al/Zn como se resume en la Patente de Estados Unidos 4,048,196. El autoclave luego se lavó a chorro con una mezcla de gas nitrógeno/hidrógeno 98%/2% y se calentó a 150°C para reducir el catalizador. Una solución de 10% en peso de producto GBL recuperado en agua DI se introdujo en el reactor. El reactor se presurizó adicionalmente a 250 bar con gas H2 puro y la reacción de hidrogenación se dejó proceder por 1-2 horas. En la terminación de la reacción, el reactor se enfrió y despresurizó seguido por lavado a chorro con nitrógeno. Los contenidos del autoclave se descargaron y el catalizador se separó por decantación. El catalizador se lavó con agua DI adicional y el lavado se agregó al sobrenadante. Una alícuota de sobrenadante se filtró y analizó por HPLC para determinar el porcentaje de conversión de GBL y el porcentaje de rendimiento de 1, 4-butanodiol en una base molar.
Hidrogenación en Fase Vapor: Utilizando la instalación de pirólisis a escala mayor descrita en el Ejemplo 11, el producto GBL en fase vapor generado de la pirólisis a 250°C de biomasa de P4HB + Ca(OH)2 se dirigió en un tubo de reactor caliente y sellado que tiene una relación de altura/diámetro de 115. Previamente el reactor se ha cargado con 3.5 kg de pelotillas de catalizador de óxido de Cu/Cr/Ba reducido como se describe en la Patente de Estados Unidos 4,652,685. El catalizador se redujo calentando primero el reactor a 130°C bajo una purga de N2. El reactor luego se calentó a 170°C, el flujo de N2 se detuvo y se introdujo 100% H2 al reactor. La temperatura del reactor luego se aumentó a 210°C y la velocidad de flujo de H2 se estableció a ~8kg/hr. En el reactor se introdujo GBL vaporizada de la pirólisis de la biomasa de P4HB + Ca(OH)2 y pasó a través del catalizador reducido. El producto hidrogenado luego se envió a un condensador enfriado con agua mantenido a 20 °C y el condensado líquido se colectó. Una alícuota del condensado se analizó por HPLC para determinar el porcentaje de conversión de GBL y el porcentaje de rendimiento de 1, 4-butanodiol en una base molar.
Ejemplo 13. Generación de N-metil pirrolidona a partir de la Pirólisis de una Biomasa Genéticamente Modificada Que Produce Poli-4-hidroxibutirato Seguida por la Reacción con Monometilamina. El siguiente ejemplo describe la generación de N-metil pirrolidona a partir de biomasa que contiene poli-4HB el cual luego se puede convertir a gamma-butirolactona por pirólisis y finalmente se hace reaccionar con monometilamina para producir la N-metií pirrolidona. 5 g de biomasa microbiana que contiene >40% en peso de poli-4HB se pueden calentar a presión atmosférica bajo nitrógeno a 275°C. Los vapores generados compuestos de >90% de GBL se pueden colectar utilizando un condensador enfriado con agua mantenido a 20°C. Aproximadamente 2-3 g de producto GBL luego se pueden recuperar para la reacción subsecuente. Un autoclave de 50 mL se cargó con 3 g de producto GBL y 3.8 g de una solución acuosa al 40% de monometilamina. El autoclave se calentó a una temperatura de 290 °C la cual generó una presión de 77 bares. La reacción se continuó por un tiempo total de 2 horas. Una alícuota del producto de reacción se analizó por HPLC para determinar el % de conversión del producto GBL y el % de rendimiento de N-metilpirrolidona en una base molar. La reacción se realizó como se describe en la Patente de Estados Unidos 6,075,153.
Ejemplo 14. Generación de Poli-vinilpirrolidona a partir de la Pirólisis de una Biomasa Genéticamente Modificada Que Produce Poli-4-hidroxibutirato Seguida por Amidación, Deshidratacion en Fase Vapor y Polimerización. En este ejemplo, se describe un método para preparar poli-vinil pirrolidona partiendo de biomasa de P4HB. 5 g de biomasa microbiana que contiene >40 g en peso de poli-4HB se calentaron a presión atmosférica bajo nitrógeno a 275 °C. Los vapores generados compuestos de >90% de GBL se colectaron utilizando un condensador enfriado con agua mantenido a 20 °C. Aproximadamente 2-3 g de producto GBL luego se recuperaron para la reacción subsecuente. Un autoclave de 50 mL se cargó con 3 g de producto GBL y 2.3 g de etanolamina (Sigma Aldrich, cat# 398136, >99% pura) . El autoclave se calentó bajo una purga de nitrógeno a una temperatura de 200°C por 90 minutos. Después de la reacción, la mezcla se removió y se colocó en un matraz de fondo redondo de 10 mi equipado con un microcondensador enfriado con agua. La mezcla se destiló a una temperatura de 105 °C para remover el agua. El líquido remanente, N(2-hidroxietil) -2-pirrolidona (HEP) , luego se deshidrató utilizando un catalizador de cesio en sílice como se describe en la Patente de Estados Unidos 7,141,679. Un reactor de tubo, de acero inoxidable, de 1 pulgada (2.54 cm) de diámetro se cargó con 4 g del catalizador y se selló. El reactor luego se calentó a 375°C bajo una purga de nitrógeno. La HEP recuperada se mezcló con bastante agua DI para hacer una solución al 10%. El agua agregada según se informa reduce la formación de N-etil-2-pirrolidona como un sub-producto durante la deshidrogenación. La solución de HEP se alimentó en el reactor y se vaporizó. Los vapores de HEP y agua se pasaron sobre el catalizador, el efluente de reactor salió al reactor y el NVP se colectó en una trampa fría. La polimerización de la NVP colectada se puede realizar bajo condiciones acuosas como se describe en la Patente de Estados Unidos 4,254,239 o en solvente orgánico como se describe en la Patente de Estados Unidos 4,058,655. Ambos métodos utilizan organoperóxidos para iniciar la reacción de polimerización.
Ejemplo 15: Conversión No Catalítica de Gamma- Butirolactona de Base Biológica a 2 -Pirrolidona .
En este ejemplo, se describe un método para preparar 2 -pirrolidona partiendo de biomasa de P4HB. La GBL intermediaria se convirtió no catalíticamente a 2 -pirrolidona como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,393,888. 5 g de biomasa microbiana que contiene >40% en peso de poli-4HB se calentaron a presión atmosférica bajo nitrógeno a 275 °C. Los vapores generados compuestos de >90% de GBL se colectaron utilizando un condensador enfriado con agua mantenido a 20 °C. Aproximadamente 2-3 g de producto GBL luego se recuperaron para la reacción subsecuente. Un autoclave de 50 mL se mantuvo a 325°C y 1,000 psi. Se introdujeron 3g de GBL al reactor y después que se alcanzó la temperatura de reacción, se introdujo amoníaco líquido en dos etapas separadas por 10 minutos para lograr una relación molar final de 0.6 mol de amoníaco a 1.0 mol de GBL. La reacción se continuó mientras se mantuvo la temperatura y presión por unos 30 minutos adicionales después que la mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de la remoción y purificación por destilación de dos etapas para remover las impurezas de baja y alta ebullición. La 2-pirrolidona con pureza en exceso de 99% se produjo después de la destilación.
Las modalidades, ilustrativamente descritas en la presente se pueden practicar adecuadamente en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente descritos en la presente. Por consiguiente, por ejemplo, los términos "comprendiendo", "incluyendo", "conteniendo", etc. se deberán leer expansivamente y sin limitación. Adicionalmente, los términos y expresiones empleados en la presente se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquiera de los equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la tecnología reivindicada. Adicionalmente, la frase "consiste esencialmente de" se entenderá que incluye aquellos elementos específicamente citados y aquellos elementos adicionales que no afectan materialmente las características básicas y nuevas de la tecnología reivindicada. La frase "consiste de" excluye cualquier elemento no especificado.
La presente descripción no será limitada en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud. Muchas modificaciones y variaciones se pueden hacer sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente por aquellos expertos en el arte. Los métodos y composiciones funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la descripción, además de aquellos enumerados en la presente, serán evidentes por aquellos expertos en el arte a partir de las descripciones anteriores. Tales modificaciones y variaciones se proponen para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La presente descripción será limitada solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes al cual tales reivindicaciones se autorizan. Se entenderá que esta descripción no se limita a los métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, la cual desde luego varía. También se entenderá que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y no se propone que sea limitante.
Además, donde las características o aspectos de la descripción se describen en términos de grupos Markush, aquellos expertos en el arte reconocerán que la descripción también se describe en términos de cualquier miembro o subgrupo individual de miembros del grupo Markush.
Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes emitidas, y otros documentos referidos a esta descripción se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación, solicitud de patente, patente emitida, u otro documento individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada para referencia en su totalidad. Las definiciones que están contenidas en el texto incorporado para referencia se excluyen al grado que contradicen las definiciones en esta descripción.
Las enseñanzas de todas las patentes, solicitudes publicadas y referencias citadas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad.
Mientras que esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a las modalidades ejemplares de la misma, se entenderá por aquellos expertos en el arte que los diversos cambios en forma y detalles se pueden hacer en la presente sin apartarse del alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un proceso para la producción de un producto gamma-butirolactona de base biológica, caracterizado porque comprende a) combinar una biomasa genéticamente modificada que comprende poli-4 -hidroxibutirato y un catalizador; y b) calentar la biomasa con el catalizador para convertir el poli- -hidroxibutirato a un producto gamma-butirolactona;
2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4-hidroxibutirato, en donde el huésped tiene una mutación de inhibición en su gen de semialdehido succínico deshidrogenasa dependiente de NAD independiente de CoA o su gen de semialdehido succínico deshidrogenasa dependiente de NADP independiente de CoA, o tiene las mutaciones de inhibición en ambos genes, y tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehido deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a 4-hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4-hidroxibutirilo-CoA a poli-4-hidroxibutirato.
3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 - fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldeído 3-fosfato a 1, 3-bisfosfoglicerato formando NADPH+H+, una gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3 -fosfato a 1 , 3-bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a -hidroxibutirilo- fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirilo- fosfato a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de yneJ, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el proceso adicionalmente incluye una etapa inicial de cultivar un huésped recombinante con un material de alimentación renovable para producir una biomasa de poli-4-hidroxibutirato .
5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque una fuente del material de alimentación renovable se selecciona de glucosa, fructosa, sacarosa, arabinosa, maltosa, lactosa, xilosa, ácidos grasos, aceites vegetales, y gas de síntesis derivado de biomasa o una combinación de los mismos.
6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el huésped de biomasa es una bacteria, levadura, hongos, algas, cianobacteria, o una mezcla de dos o más de los mismos.
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el huésped de biomasa es bacteria.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la bacteria se selecciona de Escherichia. coli, Alcaligenes eutrophus (renombrada como Ralstonia eutropha) , Bacillus spp., Alcaligenes latus, Azotobacter, Aeromonas, Comamonas, Pseudomonads) , Pseudomonas, Ralstonia, Klebsiella) , Synechococcus sp PCC7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp . PCC 6803, Thermosynechococcus elongatus BP-I, Chlorobium tepidum, Chloroflexusauranticus, Chromatium tepidum y Chromatium vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, y Rhodopseudomonas palustris .
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el huésped recombinante es algas.
10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el calentamiento es a una temperatura desde aproximadamente 100 °C a aproximadamente 350°C.
11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el catalizador es carbonato de sodio o hidróxido de calcio.
12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el porcentaje en peso de catalizador está en el intervalo de aproximadamente 4% a aproximadamente 50%.
13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el calentamiento reduce el contenido de agua de la biomasa a aproximadamente 5% en peso, o menos.
14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la temperatura de calentamiento es desde aproximadamente 200°C a aproximadamente 350°C.
15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la temperatura de calentamiento es desde aproximadamente 225°C a aproximadamente 300°C.
16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el calentamiento es por un período de tiempo desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos .
17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el calentamiento es por un período de tiempo es desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas .
18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar el producto gamma-butirolactona .
19. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el producto gamma-butirolactona comprende menos de 5% en peso de productos secundarios .
20. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque la gamma-butirolactona se procesa adicionalmente para formar uno o más de los siguientes: 1, 4-butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano (THF) , N-metilpirrolidona ( MP) , N-etilpirrolidona (NEP) , 2-pirrolidinona, N-vinilpirrolidona ( VP) y polivinilpirrolidona (PVP) .
21. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4 -hidroxibutirato, en donde el huésped opcionalmente tiene una mutación de inhibición en su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NAD independiente de CoA o su gen de semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADP independiente de CoA, o tiene mutaciones de inhibición en ambos genes, y tiene genes establemente incorporados que codifican las siguientes enzimas: una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehído deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a 4 -hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirato a 4 -hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4 -hidroxibutirilo-CoA a poli-4-hidroxibutirato .
22. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado genes que codifican las siguientes enzimas: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldehido 3-fosfato a 1 , 3 -bisfosfoglicerato formando NADPH+H+, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehido-3- fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehido 3-fosfato a 1, 3 -bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo-fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirilo-fosfato a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de ynel, gabD, pykF, pykA, maeA y maeB.
23. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene una trayectoria de poli-4 -hidroxibutirato, en donde el huésped tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de una succinilo-CoA: coenzima A transferasa en donde la succinilo-CoA: coenzima A transferasa es capaz de convertir el succinato a succinilo-CoA, una succinato semialdehído deshidrogenasa en donde la succinato semialdehído deshidrogenasa es capaz de convertir la succinilo-CoA a semialdehído succínico, una semialdehído succínico reductasa en donde la semialdehído succínico reductasa es capaz de convertir el semialdehído succínico a -hidroxibutirato, una CoA transferasa en donde la CoA transferasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa en donde la polihidroxialcanoato sintasa es capaz de polimerizar la 4 -hidroxibutirilo-CoA a poli-4-hidroxibutirato.
24. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa genéticamente modificada es de un huésped recombinante que tiene establemente incorporado uno o más genes que codifican una o más enzimas seleccionadas de: una fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde la fosfoenolpiruvato carboxilasa es capaz de convertir el fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, una isocitrato liasa en donde la isocitrato liasa es capaz de convertir el isocitrato a glioxalato, una malato sintasa en donde la malato sintasa es capaz de convertir el glioxalato a malato y succinato, una succinato-CoA ligasa (formación de ADP) en donde la succinato-CoA ligasa (formación de ADP) es capaz de convertir el succinato . a succinilo-CoA, una gliceraldehído-3 - fosf to deshidrogenasa dependiente de NADP en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP es capaz de convertir el gliceraldehído 3-fosf to a 1,3-bisfosfoglicerato formando NADPH+H+, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD en donde la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD es capaz de convertir el gliceraldehído 3 -fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato formando NADH+H+, una butirato cinasa en donde la butirato cinasa es capaz de convertir el 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutirilo- fosfato, una fosfotransbutirilasa en donde la fosfotransbutirilasa es capaz de convertir el 4 -hidroxibutirilo- fosfato a 4-hidroxibutirilo-CoA; y que opcionalmente tiene una interrupción en uno o más genes seleccionados de ynel, gabD, py F, pykA, maeA y maeB.
25. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizado porque el % en peso del catalizador está en el intervalo de aproximadamente 4% a aproximadamente 50%, y el calentamiento es a aproximadamente 300°C.
26. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque el catalizador es aproximadamente 4% en peso de hidróxido de calcio y el calentamiento es a una temperatura de 300°C.
27. Un producto gamma-butirolactona de base biológica, caracterizado porque se produce por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .
28. El producto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el producto gamma-butirolactona comprende menos de 5% en peso de productos secundarios .
29. Una biomasa de poli-4-hidroxibutirato, caracterizada porque se produce a partir de recursos renovables, la cual es adecuada como un material de alimentación para producir el producto gamma-butirolactona, en donde el nivel de poli-4-hidroxibutirato en la biomasa es mayor de 50% en peso de la biomasa.
30. El producto gamma-butirolactona de base biológica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la gamma-butirolactona en el producto tiene 100% de contenido de carbono de base biológica.
31. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el producto es aproximadamente 85% en peso o mayor con base en un gramo de una gamma-butirolactona en el producto por gramo de poli-4-hidroxibutirato .
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