JP4327909B2 - 組み換え生物による1,3―プロパンジオールの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は分子生物学の分野及び所望する化合物の生産のための組み換え生物の使用に関する。より具体的には、本発明は1,3−プロパンジオールの増大生産のために、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)、並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)のクローン化された遺伝子の別個または一緒のいずれかの発現を記述する。
発明の背景
1,3−プロパンジオールはポリエステル繊維の製造並びにポリウレタン及び環式化合物の製造に潜在的有用性を有するモノマーである。
1,3−プロパンジオールへの様々な化学経路が知られている。例えば、アクロレインの触媒溶液相水和及びそれに続く還元により、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下で触媒でエチレンオキシドを1,3−プロパンジオールに転化することができ、またはグリセロールのような炭化水素から、周期表のVIII族からの原子を有する触媒で一酸化炭素及び水素の存在下で反応させることができる。これらの方法により1,3−プロパンジオールを生成することは可能であるが、それらは高価であり且つ環境汚染物質を含有する廃棄物の流れを生じる。
グリセロールの発酵から1,3−プロパンジオールを生成できることは百年以上の間知られている。1,3−プロパンジオールを生産することができるバクテリア株は例えばシトロバクター(Citrobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロバクター(Enterobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)、クレブシエラ(Klebsiella)、ラクトバシラス(Lactobacillus)及びペロバクター(Pelobacter)の群に見いだされている。研究された各場合で、グリセロールは2段階の酵素触媒反応順序で1,3−プロパンジオールに転化される。第一段階では、デヒドラターゼがグリセロールの3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3−HP)及び水への転化を触媒する(式1)。第二段階では、NAD+結合(NAD+−linked)オキシドレダクターゼにより3−HPが1,3−プロパンジオールに還元される(式2)。
グリセロール→3−HP+H2O (式1)
3−HP+NADH+H+→1,3−プロパンジオール+NAD+ (式2)
1,3−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、培地中に高濃度で蓄積する。全反応は補因子の形態の還元当量(equivalent)、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)に酸化される。
通常、グリセロールからの1,3−プロパンジオールの生産は、グリセロールを唯一の炭素源として用いて嫌気的条件下で他の外因性還元当量受容体の非存在下で実施される。これらの条件下で、例えば、シトロバクター、クロストリジウム及びクレブシエラの株では、グリセロールの並発経路が動き、それはまずNAD+(またはNADP+)結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン(DHA)への酸化を伴う(式3)。DHAはDHAキナーゼによるジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)へのリン酸化(式4)の後に、生合成のため及び例えば解糖によるATP生成を補助するために利用できるようになる。
グリセロール+NAD+→DHA+NADH+H+ (式3)
DHA+ATP→DHAP+ADP (式4)
1,3−プロパンジオール経路と異なり、この経路は炭素及びエネルギーを細胞に与えることができ、そしてNADHを消費するよりむしろ生成する。
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)及びシトロバクター・フロインジイ(Citrobacter freundii)では、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)、グリセロールデヒドロゲナーゼ(dhaD)及びジヒドロキシアセトンキナーゼ(dhaK)の機能的に連結した活性をコードする遺伝子はdhaレギュロンにより包含される。シトロバクター及びクレブシエラからのdhaレギュロンはエシェリキア・コリ(Escherichia coli)で発現されており、そしてグリセロールを1,3−プロパンジオールに転化することが示されている。
グリセロールの製造のための生物学的方法は知られている。グリセロール生産体の圧倒的大多数は酵母であるが、いくつかのバクテリア、他の真菌及び藻類もグリセロールを生産することが知られている。バクテリア及び酵母は両方とも解糖のフルクトース−1,6−ビスリン酸経路を通してグルコースもしくは他の炭水化物を転化するかまたはエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によりグリセロールを生産し、一方、ある種の藻類は葉緑体中の溶存二酸化炭素もしくは重炭酸塩をカルビン回路の3炭素中間体に転化する。一連の工程で、3炭素中間体のホスホグリセリン酸はグリセルアルデヒド3−リン酸に転化され、それをそのケト異性体ジヒドロキシアセトンリン酸に容易に相互転化することができ、そして最終的にグリセロールに転化される。
特に、バクテリアのバシラス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)及びラクトバシラス・リコペルシカ(Lactobacillus lycopersica)はグリセロールを合成し、そしてグリセロール生産は高い外部の塩濃度に対する防護のために耐塩性藻類ドゥナリエラ種(Dunaliella sp.)及びアステロモナス・グラシリス(Asteromonas gracilis)に見いだされる(Ben−Amotz等、Experientia 38、49−52、(1982))。同様に、各種浸透圧耐性(osmotolerant)酵母は防護手段としてグリセロールを合成する。サッカロミセス(Saccharomyces)の大部分の株はアルコール発酵中にいくらかのグリセロールを生産し、そして浸透圧ストレスの添加によりこれを生理学的に増やすことができる(Albertyn等、Mol.Cell.Biol.14、4135−4144、(1994))。今世紀初期の商業的グリセロール製造は、亜硫酸塩またはアルカリのような「スティアリング(steering)試薬」が添加されたサッカロミセス培養物の使用により実施された。不活性複合体の形成により、舵取り剤はエタノールへのアセトアルデヒドの転化を阻止または阻害し;従って、過剰の還元当量(NADH)は還元のためにDHAPが利用できるかまたはそれに「導かれ」てグリセロールを生成する。この方法は亜硫酸塩による酵母の生育の部分的阻害により制限される。異なる機構で過剰のNADH当量を生じるアルカリの使用によりこの制限をある程度克服することができる。この操作で、アルカリはカニッツァロ不均化を開始して2当量のアセトアルデヒドからエタノールと酢酸を生成する。
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(DAR1、GPD1)はサッカロミセス・ジアスタチカス(S.diastaticus)からクローン化され、シークエンスされている(Wang等、J.Bact.176、7091−7095、(1994))。DAR1遺伝子はシャトルベクター中にクローン化され、そしてエシェリキア・コリを形質転換するために用いられ、その場合、発現により活性酵素が生産された。Wang等(上記)はDAR1が細胞の浸透圧環境により調節されることを認めるが、組み換え生物において1,3−プロパンジオール生産を高めるためにその遺伝子がどのように用いられる可能性があるかを示唆していない。
他のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離されており;例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae))からsn−グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼがクローン化され、シークエンスされており(Larason等、Mol.Microbiol.10、1101、(1993))、そしてAlbertyn等(Mol.Cell.Biol.14、4135(1994))はサッカロミセス・セレビシエからのグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするGPD1のクローニングを教示している。Wang等(上記)のように、Albertyn等及びLarason等はこの遺伝子の調節の浸透圧感受性を認めるが、組み換え生物における1,3−プロパンジオールの生産にその遺伝子がどのように用いられる可能性があるかを示唆していない。
G3PDHでのように、グリセロール−3−ホスファターゼがサッカロミセス・セレビシエから単離されており、そのタンパク質はGPP1及びGPP2遺伝子によりコードされると同定されている(Norbeck等、J.Biol.Chem.271、13875、(1996))。G3PDHをコードする遺伝子のように、GPP2は浸透圧感受性であるようである。
グリセロール及び1,3−プロパンジオールの両方の生産の生物学的方法は知られているが、全工程を単一の組み換え生物により成し遂げることができることはこれまで一度も示されていない。
化学的方法はエネルギー集約的であり、そして生物学的方法は高価な出発原料のグリセロールを必要とするので、1,3−プロパンジオールの製造に関して上に記述した化学的または生物学的方法はいずれも工業規模生産には十分に適していない。低いエネルギー入力及び安価な出発原料を必要とする方法が求められている。より望ましい方法は所望する1,3−プロパンジオール最終生成物に炭水化物または糖類のような基本的な炭素源を転化する能力を有する微生物を含む。
1,3−プロパンジオールへのグリセロールまたはジヒドロキシアセトン以外の発酵可能な炭素源の単一生物転化が望ましいが、そのような試みには克服すべきかなりの難題があることが実証されている。例えば、Gottschalk等(EP 373 230)はシトロバクター・フロインジイ、クロストリジウム・アセトトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butylicum)及びクレブシエラ・ニューモニエを初めとする1,3−プロパンジオールの生産のために有用な大部分の株の生育がフルクトースまたはグルコースのような水素供与体の存在により妨げられることを教示している。グリセロールとフルクトースまたはグルコースの同時発酵で1,3−プロパンジオールを生成するラクトバシラス・ブレビス(Lactobacillus brevis)及びラクトバシラス・ブフナー(Lactobacillus buchner)の株は、グリセロールが唯一の炭素源として与えられる場合には生育せず、そして得られる細胞がグルコースまたはフルクトースを代謝できることは示されているが、それらは1,3−プロパンジオールを生成しない(Veiga DA Cunha等、J.Bacteriol.174、1013(1992))。同様に、グリセロール及びアセテートが与えられる場合に1,3−プロパンジオールを生産するイリオバクター・ポリトロプス(Ilyobacter polytropus)の株は、フルクトース及びグルコースを初めとするグリセロール以外の炭素基質から1,3−プロパンジオールを生成しないことが示されている(Steib等、Arch.Microbiol.140、139(1984))。最後に、Tong等(Appl.Biochem.Biotech.34、149(1992))はグリセロールデヒドラターゼをコードするdhaレギュロンで形質転換された組み換えエシェリキア・コリが外因性グリセロールの非存在下でグルコースまたはキシロースのいずれもから1,3−プロパンジオールを生産しないことを教示している。
グリセロールからの1,3−プロパンジオールの収率を上げる試みが報告されており、その場合、還元当量を与えることができる補助基質、典型的には発酵可能な糖類が工程に含まれる。収率の向上はグリセロール及びグルコースを同時発酵するシトロバクター・フロインジイ及びクレブシェラ・ニューモニエDSM 4270の休止細胞に対して主張されているが(Gottschalk等、上記及びTran−Dinh等、DE 3734 764);グリセロール及びグルコースを同時発酵するクレブシエラ・ニューモニエATCC 25955の増殖細胞には主張されておらず、それらは1,3−プロパンジオールを生成しなかった(I−T.Tong、Ph.D.学位論文、ウィスコンシン大学(University of Wisconsin)−Madison(1992))。増加した収率は組み換えエシェリキア・コリによるグリセロールとグルコースまたはフルクトースの同時発酵に対して報告されているが;しかしながら、グリセロールの非存在下で1,3−プロパンジオールは生産されない(Tong等、上記)。これらの系で、単一生物は細胞の維持または増殖のためにエネルギー及び炭素を与えながらNADHを生成する供給源として炭水化物を用いる。これらの開示は1,3−プロパンジオールを生産する炭素の流れに糖類が入らないことを示唆する。いずれの場合でもグリセロールの外因性供給源の非存在下で1,3−プロパンジオールは生産されない。従って、文献のウェートから、単一生物による炭水化物源からの1,3−プロパンジオールの生産は可能ではないことが明らかに示唆される。
本発明により解決される問題はグルコースまたは他の糖類のような安価な炭素基質からの単一組み換え生物による1,3−プロパンジオールの生物学的生産である。1,3−プロパンジオールの生物学的生産は2段階の連続反応の基質としてグリセロールを必要とし、その場合、デヒドラターゼ酵素(典型的には補酵素B12依存性デヒドラターゼ)がグリセロールを中間体の3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに転化し、次にそれはNADH(またはNADPH)依存性オキシドレダクターゼにより1,3−プロパンジオールに転化される。補因子条件の複雑さのために、1,3−プロパンジオールの製造にこの反応順序を利用する工業的方法は全細胞触媒の使用を必要とする。さらに、この方法を経済的に実用的にするために、グリセロールまたはジヒドロキシアセトンより安価な供給原料が必要とされる。グルコース及び他の炭水化物は適当な基質であるが、上に説明したように、それらは1,3−プロパンジオール生成を妨げることが知られている。その結果として、いかなる単一生物もグルコ−スを1,3−プロパンジオールに転化することが示されていない。
出願人等は提示した問題を解決し、そして本発明は単一の組み換え生物を用いて発酵可能な炭素源を直接1,3−プロパンジオールに生物転化することを規定する。グルコースをモデル基質として用い、そして生物転化はあらゆる生存する微生物に適用できる。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)、グリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を保有する微生物は、グリセロール分解経路により優れた収率及び選択性でグルコース及び他の糖類を1,3−プロパンジオールに転化することができる。さらに、本発明を1)グリセロール、2)ジヒドロキシアセトンまたは3)グリセロールの酸化状態のC3化合物(例えば、グリセロール3−リン酸)または4)ジヒドロキシアセトンの酸化状態のC3化合物(例えば、ジヒドロキシアセトンリン酸もしくはグリセルアルデヒド3−リン酸)に容易に転化されるあらゆる炭素基質を含むように一般的に適用することができる。
本発明の要約
本発明は
(i)(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子;(b)グリセロール−3−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子;(c)デヒドラターゼ活性をコードする遺伝子;及び(d)1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする遺伝子の少なくとも1つを含んでなる形質転換カセットで適当な宿主生物を形質転換し、ただし、形質転換カセットが(a)−(d)の全てより少ない遺伝子を含んでなる場合には、適当な宿主生物が内因性遺伝子を含んでなり、それにより得られる形質転換された宿主生物が少なくとも1つの各々の遺伝子(a)−(d)を含んでなり;
(ii)形質転換された宿主生物を単糖、オリゴ糖、多糖または1炭素基質よりなる群から選択される少なくとも1つの炭素源の存在下で適当な条件下で培養し、それにより1,3−プロパンジオールが生成され;そして
(iii)1,3−プロパンジオールを回収すること
を含んでなる組み換え生物からの1,3−プロパンジオールの生産方法を提供する。
本発明はさらに1,3−プロパンジオールの生産のためにグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3−ホスファターゼ、グリセロールデヒドラターゼ及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を発現することができる発現カセットを含んでなる形質転換された宿主を提供する。
本方法に用いる適当な宿主生物はバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から選択される。より具体的には、適当な宿主生物はシトロバクター、エンテロバクター(Enterobacter)、クロストリジウム、クレブシエラ、エロバクター(Aerobacter)、ラクトバシラス、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ザイゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ピチア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシェリキア、サルモネラ(Salmonella)、バシラス、ストレプトミセス(Streptomyces)及びシュードモナス(Pseudomonas)よりなる属の群から選択される。最も具体的には、適当な宿主生物はエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミセス種よりなる群から選択される。本方法に用いる特定の形質転換された宿主生物は1)遺伝子dhaB1、dhaB2、dhaB3及びdhaTを含んでなる形質転換カセットで形質転換されたサッカロミセス種で、その場合、それらの遺伝子はサッカロミセス種ゲノム中に安定に組込まれる;及び2)遺伝子GPD1及びGPP2を含んでなる形質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種である。
本発明の好ましい炭素源はグルコースである。
本方法はさらに配列番号11、配列番号12及び配列番号13に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を用い、それらのアミノ酸配列はグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号33及び配列番号17に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択されるグリセロール−3−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらのアミノ酸配列はグリセロール−3−ホスファターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号18に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールキナーゼ酵素をコードする遺伝子も用い、そのアミノ酸配列はグリセロールキナーゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法はdhaB1、dhaB2及びdhaB3を含んでなるデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、それらの遺伝子はそれぞれ配列番号34、配列番号35及び配列番号36に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列はデヒドラターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。また、本方法は配列番号37に示されるアミノ酸配列に対応する1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子も用い、そのアミノ酸配列は1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する。
また、本発明は
(a)(1)配列番号11に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子;
(2)配列番号17に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−3−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子;
(3)配列番号34に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のαサブユニットをコードする遺伝子;
(4)配列番号35に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のβサブユニットをコードする遺伝子;
(5)配列番号36に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のγサブユニットをコードする遺伝子;及び
(6)配列番号37に示されるアミノ酸配列に対応する1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子、
を含んでなる遺伝子の群、(a)(1)−(6)のそれぞれのアミノ酸配列は遺伝子(1)−(6)の酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する、並びに
(b)(a)の遺伝子の群で形質転換された宿主細胞で、それにより形質転換された宿主細胞が単糖、オリゴ糖及び多糖よりなる群からまたは1炭素基質から選択される少なくとも1つの基質で1,3−プロパンジオールを生産する、
を含んでなる形質転換された宿主細胞も包含する。
生物学的寄託及び配列表の簡単な説明
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有する(エシェリキア・コリ宿主W1485並びにプラスミドpDT20及びpAH42を含んでなる)形質転換されたエシェリキア・コリW2042を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でATCCに1996年9月26日に寄託し、そしてそれをATCC 98 188と称する。
グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有するプラスミドpMCK10、pMCK17、pMCK30及びpMCK35を保有するサッカロミセス・セレビシエYPH500を特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下でATCCに1996年9月26日に寄託し、そしてそれをATCC 74392と称する。
「ATCC」は12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852 U.S.A.に位置するAmerican Type Culture Collection国際受託所をさす。名称は寄託したものの受託番号をさす。
出願人等は特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列の標準表示に関する規則(OJ EPO、12/1992への追補番号2中に公開された、EPOの総裁の決定への付加条件I及びII)並びに37 C.F.R.1.821−1.825及び付録A及びB(ヌクレオチド及び/またはアミノ酸配列を含む出願開示のための条件)と適合する49配列を提供している。
発明の詳細な説明
本発明は単一の組み換え生物における発酵可能な炭素源からの1,3−プロパンジオールの生物学的生産方法を提供する。本方法はグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)、グリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有する微生物を含む。組み換え微生物を炭素基質と接触させ、そして1,3−プロパンジオールを増殖培地から単離する。
本方法はポリエステル及び他のポリマーの製造に有用な1,3−プロパンジオールモノマーの迅速で安価で且つ環境的に信頼できる供給源を提供する。
以下の定義は請求及び明細書を説明するために用いられる。
「グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ酵素」という用語はグリセロール分子を生成物の3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに異性化または転化することができる酵素活性のポリペプチドをさす。本発明の目的のためには、デヒドラターゼ酵素はそれぞれグリセロール及び1,2−プロパンジオールという好ましい基質を有するグリセロールデヒドラターゼ(ジーンバンク(GenBank)U09771、U30903)及びジオールデヒドラターゼ(ジーンバンク D45071)を含む。クレブシエラ・ニューモニエATCC 25955のグリセロールデヒドラターゼは配列番号1、2及び3としてそれぞれ同定される遺伝子dhaB1、dhaB2及びdhaB3によりコードされる。dhaB1、dhaB2及びdhaB3遺伝子はそれぞれグリセロールデヒドラターゼ酵素のα、β及びγサブユニットをコードする。
「オキシドレダクターゼ」または「1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」という用語は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの1,3−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼは例えば、dhaT遺伝子(ジーンバンク U09771、U30903)によりコードされるポリペプチドを含み、それを列番号4として同定する。
「グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ」または「G3PDH」という用語はジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)のグリセロール−3−リン酸(G3P)への転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。インビボのG3PDHはNADH、NADPHまたはFAD依存性である可能性がある。この酵素活性の例は以下のものを含み:NADH依存性酵素(EC 1.1.1.8)はGPD1(ジーンバンク Z74071x2)またはGPD2(ジーンバンク Z35169x1)またはGPD3(ジーンバンク G984182)またはDAR1(ジーンバンク Z74071x2)を初めとするいくつかの遺伝子によりコードされ;NADPH依存性酵素(EC 1.1.1.94)はgpsA(ジーンバンク U32164、G466746(cds 197911−196892)及びL45246)によりコードされ;そしてFAD依存性酵素(EC 1.1.99.5)はGUT2(ジーンバンク Z47047x23)またはglpD(ジーンバンク G147838)またはglpABC(ジーンバンク M20938)によりコードされる。
「グリセロール−3−ホスファターゼ」または「sn−グリセロール−3−ホスファターゼ」または「d,l−グリセロールホスファターゼ」または「G3Pホスファターゼ」という用語は、グリセロール−3−リン酸のグリセロールへの転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。G3Pホスファターゼは例えばGPP1(ジーンバンク Z47047x125)またはGPP2(ジーンバンク U18813x11)によりコードされるポリペプチドを含む。
「グリセロールキナーゼ」という用語は、反応条件により、グリセロール−3−リン酸へのグリセロールのまたはグリセロールへのグリセロール−3−リン酸の転化を触媒することができる酵素活性のポリペプチドをさす。グリセロールキナーゼは例えばGUT1(ジーンバンク U11583x19)によりコードされるポリペプチドを含む。
「GPD1」、「DAR1」、「OSG1」、「D2830」及び「YDL022W」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号5として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「GPD2」という用語は細胞質グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号6として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「GUT2」及び「YIL155C」という用語は互換的に用いられ、そしてミトコンドリアのグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし且つ配列番号7に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「GPP1」、「RHR2」及び「YIL053W」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−3−ホスファターゼをコードし且つ配列番号8に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「GPP2」、「HOR2」及び「YER062C」という用語は互換的に用いられ、そして細胞質グリセロール−3−ホスファターゼをコードし且つ配列番号9に示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「GUT1」という用語は細胞質グリセロールキナーゼをコードし且つ配列番号10として示される塩基配列を特徴とする遺伝子をさす。
「機能」または「酵素機能」という用語は特定の化学反応を実施するために必要なエネルギーを変えることにおける酵素の触媒活性をさす。適当な条件下で生成物または基質のいずれかの生成を成し遂げることができる平衡の反応にそのような活性を適用することができると理解される。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換可能に用いられる。
「炭素基質」及び「炭素源」という用語は本発明の宿主生物が代謝することができる炭素源、具体的には単糖、オリゴ糖、多糖及び1炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源をさす。
「宿主細胞」または「宿主生物」という用語は外来または異種起源の遺伝子を受け入れること及びそれらの遺伝子を発現して活性のある遺伝子産物を生産することができる微生物をさす。
「外来遺伝子」、「外来DNA」、「異種起源の遺伝子」及び「異種起源のDNA」という用語は、様々な方法により宿主生物内に置かれたある生物に固有の遺伝物質をさす。
「組み換え生物」及び「形質転換された宿主」という用語は異種起源または外来遺伝子で形質転換されているあらゆる生物をさす。本発明の組み換え生物は適当な炭素基質からの1,3−プロパンジオールの製造のためにグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする外来遺伝子を発現する。
「遺伝子」はコーディング領域の前(5’非コーディング)及び後(3’非コーディング)の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをさす。「天然」及び「野生型」という用語は遺伝子自体の調節配列と共に天然に見いだされるような遺伝子をさす。
「コードする」及び「コーディング」という用語は、転写及び翻訳の機構を通して遺伝子がアミノ酸配列を生成する方法をさす。特定のアミノ酸配列をコードする方法は、コードされるアミノ酸に変化を生じない塩基変異を含むことができるか、または1個もしくはそれより多いアミノ酸を変える可能性があるが、DNA配列によりコードされるタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない塩基変異を含むDNA配列を含有すると理解される。従って、本発明は特定の例示配列より多くを包含すると理解される。また、得られるタンパク質分子の機能特性を実質的に変えないサイレント変異を生じる配列中の欠失、挿入または置換のような配列に対する改変も意図される。例えば、遺伝暗号の縮重を反映するかまたは与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸の生成をもたらす遺伝子配列の改変が考えられる。従って、疎水性アミノ酸のアミノ酸アラニンのコドンをグリシンのような別のより疎水性が低い残基またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水的な残基をコードするコドンで置換することができる。同様に、グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸のような、ある負に荷電した残基の別のものでの置換またはアルギニの代わりのリシンのような、ある正に荷電した残基の別のものでの置換をもたらす変異も生物学的に同等な生成物を生じると予想することができる。また、タンパク質分子のN末端及びC末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変異もタンパク質の活性を変えないと予想される。ある場合には、実際、タンパク質の生物学的活性に対する改変の影響を調べるために配列の突然変異体を作製することが望ましいことがある。提示した改変の各々は、コードされる生成物の生物学的活性の保持の測定のように、当該技術分野の日常技術の十分に範囲内である。さらに、本発明により包含される配列が本明細書に例示される配列とストリンジェントな条件下(0.1 X SSC、0.1% SDS、65℃)でハイブリダイスするそれらの能力によっても特定されることを当業者は理解する。
「発現」という用語は遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写及び翻訳をさす。
「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は細胞の主要な代謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有し、そして通常、環状二本鎖DNA分子の形態の染色体外成分をさす。そのような成分は適切な3’非翻訳配列と共にプロモーターフラグメント及び選択した遺伝子産物のDNA配列を細胞中に導入することができる独特な構築物に多数のヌクレオチド配列を連結または再結合している、あらゆる起源に由来する1本または2本鎖のDNAまたはRNAの線状または環状の自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。「形質転換カセット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする成分を有する特定のベクターをさす。「発現カセット」は外来遺伝子を含有し且つ外来遺伝子に加えて外来宿主におけるその遺伝子の高められた発現を可能にする成分を有する特定のベクターをさす。
「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は核酸の取込み後の細胞における新しい遺伝子の取得をさす。取得される遺伝子を染色体DNA中に組込むかまたは染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換体」という用語は形質転換の産物をさす。
「遺伝的に改変された」という用語は形質転換または突然変異により遺伝物質を変える工程をさす。
組み換え生物の構築:
炭素基質の1,3−プロパンジオールへの転化の酵素経路をコードする必要な遺伝子を含有する組み換え生物を当該技術分野でよく知られている技術を用いて構築することができる。本発明では、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)、グリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子をクレブシエラまたはサッカロミセスのような天然の宿主から単離し、そしてエシェリキア・コリDH5α、ECL707、AA200もしくはW1485;サッカロミセス・セレビシエ株YPH500;またはクレブシエラ・ニューモニエ株ATCC 25955もしくはECL2106のような宿主株を形質転換するために用いた。
遺伝子の単離
バクテリアゲノムから所望する遺伝子を得る方法は一般的であり、分子生物学の当該技術分野でよく知られている。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適当なゲノムライブラリーを作製することができ、そして所望する遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーニングすることができる。いったん配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(U.S.4,683,202)のような標準的なプライマーによる増幅方法を用いてDNAを増幅して適切なベクターを用いた形質転換のために適当なDNAの量を得ることができる。
あるいはまた、コスミドライブラリーを作製することができ、その場合、ゲノムDNAの大きいセグメント(35−45kb)をベクター中にパッケージングし、適切な宿主を形質転換するために用いることができる。コスミドベクターは大量のDNAを受け入れることができる点で独特である。通常、コスミドベクターは少なくとも1コピーのcosDNA配列を有し、それはパッケージング及びそれに続く外来DNAの環化のために必要である。cos配列に加えてこれらのベクターはColE1のような複製起点及びアンピシリンまたはネオマイシンに耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含有する。適当なバクテリア宿主の形質転換のためにコスミドベクターを用いる方法はSambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)中に詳しく記述されている。
コスミドをクローン化するために典型的には、外来DNAを単離し、そして適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてコスミドベクターのcos領域の近くに連結する。次に、直鎖状にした外来DNAを含有するコスミドベクターをバクテリオファージλのようなDNAパッケージング媒体と反応させる。パッケージング工程中にcos部位は切断され、外来DNAはバクテリアウイルス粒子の頭部中にパッケージングされる。次に、これらの粒子を用いてエシュリキア・コリのような適当な宿主細胞をトランスフェクトする。いったん細胞中に注入されると、外来DNAはcos付着末端の影響で環化する。このようにして、外来DNAの大きいセグメントを組み換え宿主細胞に導入し、発現させることができる。
グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子の単離及びクローニング
グリセロールを1,3−プロパンジオールに処理することができる遺伝子を保有することが知られているバクテリアの属からゲノムDNAの大きいセグメントをクローン化するために本発明の文脈内ではコスミドベクター及びコスミド形質転換法を用いた。具体的には、クレブシエラ・ニューモニエATCC 25955からのゲノムDNAを当該技術分野でよく知られている方法により単離し、コスミドベクターSupercos 1中への挿入のために制限酵素Sau 3Aで消化し、そしてGigapackIIパッケージング抽出物を用いてパッケージングした。ベクターの構築後にエシュリキア・コリXL1−Blue MR細胞をコスミドDNAで形質転換した。グリセロールの存在下で細胞を生育し、そして1,3−プロパンジオール形成に関して培地を分析することにより、グリセロールを1,3−プロパンジオールに転化する能力に関して形質転換体をスクリーニングした。
1,3−プロパンジオール陽性の形質転換体のうち2個を分析し、それらのコスミドをpKP1及びpKP2と命名した。DNAシークエンシングによりシトロバクター・フロインジイからのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子(dhaB)に対する大きい相同性が示され、これらの形質転換体がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするDNAを含有することを表した。他の1,3−プロパンジオール陽性の形質転換体を分析し、それらのコスミドをpKP4及びpKP5と命名した。DNAシークエンシングによりこれらのコスミドがジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするDNAを保有することが示された。
本発明はクレブシエラコスミド内から単離された遺伝子を利用するが、デヒドラターゼ遺伝子の別の起源はシトロバクター、クロストリジウム及びサルモネラを含み、しかしそれらに限定されない。
G3PDH及びG3Pホスファターゼをコードする遺伝子
本発明は宿主細胞におけるG3PDH及びG3Pホスファターゼ活性の発現のために適当な遺伝子を提供する。
G3PDHをコードする遺伝子は知られている。例えば、GPD1がサッカロミセスから単離されており、配列番号5で示される塩基配列を有し、配列番号11に示されるアミノ酸配列をコードする(Wang等、上記)。同様に、配列番号6に示される塩基配列を有し、配列番号12に示されるアミノ酸配列をコードするGPD2によりコードされるG3PDH活性もサッカロミセスから単離されている(Eriksson等、Mol.Microbiol.17、95、(1995))。
G3PDH活性のポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的のために適当であり、その場合、その活性はジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)のグリセロール−3−リン酸(G3P)への転化を触媒することができると考えられる。さらに、遺伝子GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD及びglpABCのαサブユニットにそれぞれ相当する配列番号11、12、13、14、15及び16のいずれかにより示されるようなG3PDHのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、そのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含すると考えられる。他の起源から単離されたG3PDHをコードする遺伝子も本発明における使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、原核生物から単離された遺伝子はジーンバンク登録M34393、M20938、L06231、U12567、L45246、L45323、L45324、L45325、U32164及びU39682を含み;真菌から単離された遺伝子はジーンバンク登録U30625、U30876及びX56162を含み;昆虫から単離された遺伝子はジーンバンク登録X61223及びX14179を含み;そして哺乳類起源から単離された遺伝子はジーンバンク登録U12424、M25558及びX78593を含む。
G3Pホスファターゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、GPP2がサッカロミセス・セレビシエから単離されており、配列番号9で示される塩基配列を有し、それは配列番号17に示されるアミノ酸配列をコードする(Norbeck等、J.Biol.Chem.271、p13875、1996)。
G3Pホスファターゼ活性をコードするあらゆる遺伝子が本発明の目的のために適当であり、その場合、その活性はグリセロール−3−リン酸のグリセロールへの転化を触媒することができると考えられる。さらに、配列番号33及び17により示されるようなG3Pホスファターゼのアミノ酸配列をコードするあらゆる遺伝子が本発明において機能的であり、その場合、そのアミノ酸配列は酵素の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含すると考えられる。他の起源から単離されたG3Pホスファターゼをコードする遺伝子も本発明における使用のために適当であることを当業者は認識する。例えば、グリセロールを生じるためのグリセロール−3−リン酸の脱リン酸を1つまたはそれより多い以下の一般的または特異的ホスファターゼで実施することができる:アルカリホスファターゼ(EC 3.1.3.1)[ジーンバンクM19159、M29663、U02550もしくはM33965];酸性ホスファターゼ(EC 3.1.3.2)[ジーンバンクU51210、U19789、U28658もしくはL20566];グリセロール−3−ホスファターゼ(EC 3.1.3.−)[ジーンバンクZ38060もしくはU18813x11];グルコース−1−ホスファターゼ(EC 3.1.3.10)[ジーンバンクM33807];グルコース−6−ホスファターゼ(EC 3.1.3.9)[ジーンバンクU00445];フルクトース−1,6−ビスホスファターゼ(EC 3.1.3.11)[ジーンバンクX12545もしくはJ03207]またはホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼ(EC 3.1.3.27)[ジーンバンクM23546及びM23628]。
グリセロールキナーゼをコードする遺伝子は知られている。例えば、サッカロミセスからのグリセロールキナーゼをコードするGUT1が単離され、シークエンスされており(Pavlik等、Curr.Genet.24、21、(1993))、そしてその塩基配列は配列番号10により示され、それは配列番号18に示されるアミノ酸配列をコードする。グリセロールキナーゼは現実にはグリセロールの分解を触媒するが、同じ酵素が適切な反応エネルギー条件下でグリセロール−3−リン酸をグリセロールに転化するようにグリセロールの合成において機能できることを当業者は認識する。グリセロールキナーゼによるグリセロール生成の証拠が存在する。嫌気的または呼吸阻害条件下で、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)はグリセロール−3−P及びADPの存在下でグリセロールを生産する。その反応はグリコソームコンパートメント中で起こる(D.Hammond、J.Biol.Chem.260、15646−15654、(1985))。
宿主細胞
G3PDH及びG3Pホスファターゼの発現によるグリセロールの組み換え生産のために適当な宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよく、そして活性のある酵素を発現するそれらの能力によってのみ限定される。好ましい宿主はシトロバクター、エンテロバクター、クロストリジウム、クレブシエラ、エロバクター、ラクトバシラス、アスペルギルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ザイゴサッカロミセス、ピチア、クルイベロミセル、カンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコール、トルロプシス、メチロバクター、エシェリキア、サルモネラ、バシラス、ストレプトミセス及びシュードモナスのようなグリセロールまたは1,3−プロパンジオールの生産のために典型的に有用なものである。本発明において最も好ましいものはエシェリキア・コリ、クレブシエラ種及びサッカロミセス種である。
アデノシル−コバラミン(補酵素B12)はグリセロールデヒドラターゼ活性のために必須の補因子である。この補酵素は知られている最も複雑な非ポリマー天然物であり、そのインビボでの合成は約30の遺伝子の産物を用いて導かれる。補酵素B12の合成は原核生物において見いだされ、それらのあるものはその化合物をデノボで合成することができ、一方、あるものは部分反応を実施することができる。
例えば、エシェリキア・コリはコリン環構造を作ることができないが、コビナミドのコリノイドへの転化を触媒することができ、そして5’−デオキシアデノシル基を導入することができる。
真核生物は補酵素B12をデノボで合成することができず、代わりに細胞外環境からビタミンB12を輸送し、続いて、細胞の酵素によりその化合物をその化合物の機能形態に転化する。この一連の反応に対して3つの酵素活性が記述されている。
1)アクアコバラミンレダクターゼ(EC 1.6.99.8)はCo(III)をCo(II)に還元し;
2)コブ(II)アラミン(cob(II)alamin)レダクターゼ(EC 1.6.99.9)はCo(II)をCo(I)に還元し;そして
3)コブ(I)アラミン(cob(I)alamin)アデノシルトランスフェラーゼ(EC 2.5.1.17)はATPから5’デオキシアデノシン部分を還元されたコリノイドに移す。この最後の酵素活性はそれら3つのうちで最も特性化されており、サルモネラ・チフィムリウム(S.typhimurium)ではcobA、エシェリキア・コリではbtuR、そしてシュードモナス・デニトリフィカンス(P.denitrificans)ではcobOによりコードされる。これら3個のコブ(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子はクローン化され、シークエンスされている。コブ(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性はヒト繊維芽細胞及び単離されたラットミトコンドリアで検出されている(Fenton等、Biochem.Biophys.Res.Commun.98、283−9、(1981))。コバルト還元に関与する2つの酵素は十分に特性化されておらず、遺伝子配列は利用できない。ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)からのアクアコバラミンレダクターゼの報告があり(Watanabe等、Arch.Biochem.Biophys.305、421−7、(1993))、そしてミクロソームのコブ(III)アラミンレダクターゼはラット繊維芽細胞からのミクロソーム及びミトコンドリアの内膜画分に存在する(Pezacka、Biochim.Biophys.Acta、1157、167−77、(1993))。
ビタミンB12を培養培地に補足することは、多くの微生物でグリセロールデヒドラターゼ活性のために補酵素B12を生産する必要性を満たすことができるが、ある場合には、さらなる触媒活性をインビボで添加または増加しなければならない可能性がある。真核生物における補酵素B12の高められた合成は特に望ましい可能性がある。コブ(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の公開された配列を与えられれば、この遺伝子のクローニング及び発現を当業者は成し遂げることができる。例えば、グルコースのような炭素基質の1,3−プロパンジオールへの転化をもたらすために必要な遺伝子に加えてコブ(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するようにサッカロミセスのような酵母を構築することができると考えられる。コバルト還元のための遺伝子のクローニング及び発現は異なる方法を必要とする。これは唯一のN2源としてのエタノールアミンでの生育に関するエシェリキア・コリにおける選択に基づくことができる。補酵素B12の存在下でエタノールアミンアンモニア−リアーゼにより他のN2源の非存在下で細胞は生育できる。エシェリキア・コリ細胞がコブ(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼのクローン化された遺伝子及び別の生物からの無作為にクローン化されたDNAを含有する場合、アクアコバラミンの存在下でのエタノールアミンでの生育は高められるはずであり、そして無作為にクローン化されたDNAがアクアコバラミンのアデノシル化を促進するコバルト還元特性をコードするかどうかに関して選択されるはずである。
エシェリキア・コリ及びサッカロミセスに加えて、クレブシエラは特に好ましい宿主である。クレブシエラ・ニューモニエの株は唯一の炭素としてグリセロールで生育すると1,3−プロパンジオールを生産することが知られている。単糖、オリゴ糖、多糖または1炭素基質から1,3−プロパンジオールを生産するようにクレブシエラを遺伝的に改変することができると考えられる。
そのような株を作製するためには、1つまたはそれより多い構成的または誘導性プロモーターの転写制御下で、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロールへの転化及びグリセロールの1,3−プロパンジオールへの転化を促進する遺伝子を別々または一緒にクレブシエラ宿主に与えることが都合よい。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−3−ホスファターゼをそれぞれコードするDAR1及びGPP2遺伝子の導入により、クレブシエラは適切な炭素基質から1,3−プロパンジオールを生産するための遺伝子装置が与えられる。
それらの遺伝子(例えば、G3PDH、G3Pホスファターゼ、dhaB及び/またはdhaT)をクレブシエラ・ニューモニエにおいて複製することができるあらゆるプラスミドベクターで導入してもよく、またはそれらをクレブシエラ・ニューモニエゲノム中に組込んでもよい。例えば、クレブシエラ・ニューモニエATCC 25955及びクレブシエラ・ニューモニエECL 2106はテトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに感受性であることが知られており;従って、クレブシエラ・ニューモニエにおいて複製すること及びこれらの抗生物質のいずれかまたは両方に対する耐性をコードすることの両方ができるプラスミドベクターを用いてこれらの遺伝子をクレブシエラ・ニューモニエ中に導入することができる。目的の遺伝子でクレブシエラを形質転換する方法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、そして適切なベクター及び発現技術を初めとする適当なプロトコルをSambrook、上記中に見いだすことができる。
ベクター及び発現カセット
本発明は適当な宿主細胞へのG3PDH及びG3Pホスファターゼのクローニング、形質転換及び発現のために適当な様々なベクター及び形質転換及び発現カセットを提供する。適当なベクターは用いるバクテリアと適合するものである。適当なベクターは例えばバクテリア、(バクテリオファージT7もしくはM−13由来のファージのような)ウイルス、コスミド、酵母または植物から得ることができる。そのようなベクターを獲得及び使用するためのプロトコルは当業者に知られている(Sambrook等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual−1、2、3巻(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、(1989))。
典型的に、ベクターまたはカセットは関係のある遺伝子の転写及び翻訳を導く配列、選択マーカー及び自律的複製または染色体組込みをさせる配列を含有する。適当なベクターは転写開始制御を保有する遺伝子の5’の領域及び転写の終結を制御するDNAフラグメントの3’の領域を含んでなる。そのような制御領域は生産宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないと理解されるが、両方の制御領域が形質転換される宿主細胞に相同な遺伝子から得られる場合が最も好ましい。
所望する宿主細胞においてG3PDH及びG3Pホスファターゼ遺伝子の発現を導くために有用な開始制御領域またはプロモーターは非常に多く、そして当業者によく知られている。(サッカロミセスにおける発現のために有用な)CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI;(ピチアにおける発現のために有用な)AOX1;並びに(エシェリキア・コリにおける発現のために有用な)lac、trp、λPL、λPR、T7、tac及びtrcを初めとするがそれらに限定されない、これらの遺伝子を導くことができる実質的にあらゆるプロモーターが本発明のために適当である。
終結制御領域も好ましい宿主に固有の各種遺伝子から得ることができる。場合により、終結部位が必要ない可能性があるが、しかしながら、含まれる場合が最も好ましい。
本発明の酵素の有効な発現のために、発現が適切なメッセンジャーRNAの形成をもたらすように、酵素をコードするDNAを選択した発現制御領域に開始コドンを通して機能的に連結する。
1,3−プロパンジオールの生産のための適当な宿主の形質転換及び遺伝子の発現
いったん適当なカセットが構築されると、それらを用いて適切な宿主細胞を形質転換する。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有するカセットを別々または一緒に宿主細胞中に導入することを(例えば、カルシウム−透過性細胞、エレクトロポレーションを用いる)形質転換によるかまたは組み換えファージウイルスを用いるトランスフェクションによるような既知の方法により成し遂げることができる(Sambrook等、上記)。
本発明では、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有するエシェリキア・コリW2042(ATCC 98188)を作製した。さらに、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)及びグリセロール−3−ホスファターゼ(G3Pホスファターゼ)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB)並びに1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)をコードする遺伝子を含有するプラスミドpMCK10、pMCK17、pMCK30及びpMCK35を保有するサッカロミセス・セレビシエYPH500(ATCC 74392)を構築した。上記の形質転換されたエシェリキア・コリ及びサッカロミセスは両方とも本発明の好ましい態様を表す。
培地及び炭素基質:
本発明の発酵培地は適当な炭素基質を含まなければならない。適当な基質はグルコース及びフルクトースのような単糖、ラクトースもしくはショ糖のようなオリゴ糖、澱粉もしくはセルロースのような多糖またはそれらの混合物、並びにチーズ乳清透過物、トウモロコシ浸し液(cornsteep liquor)、テンサイ糖蜜及びオオムギモルトのような継続できる供給原料からの未精製混合物を含むことができるがそれらに限定されない。さらに、炭素基質は重要な生化学中間体への代謝転化が示されている二酸化炭素またはメタノールのような1炭素基質であってもよい。
単一の炭素源(例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはホルメート)からのグリセロール生産はメチル栄養(methylotrophic)酵母(Yamada等、Agric.Biol.Chem.53(2)541−543、(1989))及びバクテリア(Hunter等、Biochemistry、24、4148−4155、(1985))で報告されている。これらの生物はメタンからホルメートまでの酸化状態である単一の炭素化合物を同化してグリセロールを生産することができる。炭素同化の経路はリブロース1リン酸、セリンまたはキシルロース−1リン酸を通してであってもよい(Gottschalk、Bacterial Metabolism、第2版、Springer−Verlag:New York(1986))。リブロース1リン酸経路はホルメートをリブロース−5−リン酸と縮合して6炭素糖を形成し、それがフルクトースそして最終的に3炭素生成物のグリセルアルデヒド−3−リン酸になることを含む。同様に、セリン経路は1炭素化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸塩を経て解糖系に同化する。
1及び2炭素基質の利用に加えて、メチル栄養生物は代謝活動のためにメチルアミン、グルコサミン及び各種アミノ酸のような多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチル栄養酵母はトレハロースまたはグリセロールを形成するためにメチルアミンからの炭素を利用することが知られている(Bellion等、Microb.Growth C1 Compd.、[国際シンポジウム]、第7回(1993)、415−32.編集者:Murrell、J.Collin;Kelly、Don P.出版社:Intercept、Andover、UK)。同様に、カンジダの様々な種はアラニンまたはオレイン酸を代謝する(Sulter等、Arch.Microbiol.153(5)。485−9(1990))。従って、本発明に利用する炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含することができ、そして宿主生物の条件によってのみ限定される。
上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが本発明に適していると考えられるが、好ましい炭素基質は単糖、オリゴ糖、多糖及び1炭素基質である。より好ましいものはグルコース、フルクトース、ショ糖のような糖類並びにメタノール及び二酸化炭素のような単一炭素基質である。最も好ましいものはグルコースである。
適切な炭素源に加えて、発酵培地は培養物の増殖及びグリセロール生成のために必要な酵素経路の促進のために適当な、当業者に知られている適当な鉱物、塩、補因子、バッファ−及び他の成分を含まなければならない。Co(II)塩及び/またはビタミンB12またはその前駆物質に特に注意を払う。
培養条件:
典型的には、細胞を適切な培地中30℃で増殖させる。本発明における好ましい増殖培地はルリア・ベルタニ(Luria Bertani))(LB)培地、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextorose)(SD)培地または酵母麦芽エキス(Yeast Malt Extract)(YM)培地のような一般の商業的に調製される培地である。他の特定または合成の増殖培地を用いてもよく、特定の微生物の増殖のために適切な培地は微生物学または発酵科学の当業者により知られている。また、カタボライト抑制を直接的または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば、サイクリックアデノシン2’:3’−1リン酸またはサイクリックアデノシン2’:5’−1リン酸の使用を反応培地中に含んでもよい。同様に、グリセロール生成の増大を導く酵素活性を調節することが知られている薬剤(例えば、亜硫酸塩、重亜硫酸塩及びアルカリ)の使用を遺伝子操作と共にまたはその代わりとして用いることができる。
発酵のために適当なpHの範囲はpH5.0ないしpH9.0の間であり、その場合、pH6.0ないしpH8.0が初期条件の範囲として好ましい。
好気的または嫌気的条件下で反応を実施することができ、その場合、嫌気的または微好気的条件が好ましい。
バッチ及び連続発酵:
本発明の方法は発酵のバッチ法を用いる。古典的なバッチ発酵は密閉系であり、その場合、培地の組成は発酵の開始時に設定され、そして発酵中に人為的改変を受けない。従って、発酵の開始時に適切な生物または複数の生物を培地に接種し、そして系に何も添加せずに発酵を起こすことができる。しかしながら、典型的には、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ」であり、pH及び酸素濃度のような因子を制御する試みがしばしばなされる。バッチ系の代謝産物及びバイオマス組成は発酵を停止する時まで絶えず変化する。バッチ内で細胞は静止状態の誘導期を経て高増殖の対数期に、そして最終的に増殖速度が減少するかまたは止まる定常期になる。処理されない場合、定常期の細胞は結局死ぬ。通常、対数期の細胞が最終生成物または中間体の生成の大部分を生じる。
標準的なバッチ系に対する変形はFed−バッチ発酵系であり、それも本発明に適当である。典型的なバッチ系のこの変形では、発酵が進むにつれて基質を増加して添加する。Fed−バッチ系はカタボライト抑制が細胞の代謝を抑制しがちである場合及び培地中に制限された量の基質があることが望ましい場合に有用である。Fed−バッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、それ故、pH、溶存酸素及びCO2のような廃ガスの分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて概算する。バッチ及びFed−バッチ発酵は一般的であり、当該技術分野でよく知られており、Brock、上記中に実施例を見いだすことができる。
また、本方法が連続発酵法に適応できることも考えられる。連続発酵は開放系であり、その場合、特定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に等量のならし培地が処理のために取り出される。通常、連続発酵は培養物を一定の高密度で維持し、その場合、細胞は主として対数期増殖である。
連続発酵は細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす1つの因子またはあらゆる数の因子を調節することができる。例えば、ある方法では炭素源または窒素レベルのような制限的栄養物質を固定した割合で維持し、そして全ての他のパラメーターを調節することができる。他の系では、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変えることができる。連続系は定常状態増殖条件を維持するように努め、従って、取り出される培地による細胞損失を発酵における細胞増殖速度で埋め合わせなければならない。連続発酵法の栄養物質及び増殖因子を調節する方法並びに生成物形成の割合を最大にする技術は工業微生物学の当該技術分野でよく知られており、様々な方法がBrock、上記により詳細に記述されている。
バッチ、fed−バッチまたは連続法のいずれかを用いて本発明を実施することができ、発酵のそのあらゆる既知の形態が適当である。さらに、細胞を全細胞触媒として基質上に固定し、1,3−プロパンジオール生成の発酵条件に供することができると考えられる。
1,3−プロパンジオール生成の代替経路:
代表的な酵素経路
グルコースからの1,3−プロパンジオールの生成を以下の一連の工程により成し遂げることができる。この一連のものは当業者に知られている多数の経路の代表である。グルコースは解糖系の酵素により一連の工程でジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)及び3−ホスホグリセルアルデヒド(3−PG)に転化される。次に、DHAPのジヒドロキシアセトン(DHA)への加水分解及びそれに続く還元、またはDHAPのグリセロール3リン酸(G3P)への還元及びそれに続く加水分解のいずれかによりグリセロールが形成される。基質に関して特異的または非特異的であることが知られているあらゆる数の細胞性ホスファターゼにより加水分解工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。NAD+(またはNADP+)結合宿主酵素により還元工程を触媒することができ、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。dhaレギュロンが式3の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.6)を含有することは重要である。
グリセロール→3−HP+H2O (式1)
3−HP+NADH+H+→1,3−プロパンジオール+NAD+ (式2)
グリセロール+NAD+→DHA+NADH+H+ (式3)
上に詳細に記述されているようにグリセロールは中間体の3−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド(3−HP)を経て1,3−プロパンジオールに転化される。中間体の3−HPは宿主によりコードすることができるかまたは組み換えにより宿主中に導入することができるデヒドラターゼ酵素によりグリセロールから生成される(式1)。このデヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)、ジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)またはこの転化を触媒することができるあらゆる他の酵素であってもよい。グリセロールデヒドラターゼはdhaレギュロンによりコードされるが、ジオールデヒドラターゼはそうではない。1,3−プロパンジオールはNAD+(もしくはNADP+)結合宿主酵素により3−HPから生成され(式2)、またはその活性を組み換えにより宿主中に導入することができる。1,3−プロパンジオールの生成のこの最終反応を1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.202)または他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒することができる。
炭素チャネリング(channeling)に影響を及ぼす突然変異及び形質転換
1,3−プロパンジオール生産経路中に変異を含んでなる様々な突然変異体生物は本発明に有用である。微生物へのトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異(tpi−)の導入は炭素チャネリングによる効率を上げるための突然変異の使用の例である。あるいはまた、エタノール(adh)またはラクテート(ldh)の生成を減少する突然変異は1,3−プロパンジオールの生産に対するNADHの利用性を増す。ホスホグリセリン酸ムターゼ(pgm)のようなグリセルアルデヒド−3−リン酸の後の解糖の工程のさらなる突然変異は1,3−プロパンジオール生産経路への炭素の流れを増すために有用である。PEPの損失を防ぐPTSのようなグルコース輸送をもたらす突然変異も有用となる可能性がある。また、グリセロール異化経路(glp)のような1,3−プロパンジオール生産経路の中間体の代替経路を妨げる突然変異も本発明に有用である。突然変異は酵素活性の活性を弱めるかもしくは上げるように構造遺伝子に対してでもよく、または酵素活性の発現レベルを調節するように調節遺伝子に対してでもよい。
あるいはまた、1,3−プロパンジオール生産の増大のために特定の酵素活性を制御するように形質転換と突然変異を組み合わせることができる。従って、1,3−プロパンジオールの増加した生産をもたらす全細胞触媒の改変を予想することは本発明の範囲内である。
1,3−プロパンジオールの同定及び精製:
発酵培地からの1,3−プロパンジオールの精製法法は当該技術分野で知られている。例えば、反応混合物を有機溶媒での抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに供することにより細胞培地からプロパンジオールを得ることができる(U.S.5,356,812)。この方法のための特に優れた有機溶媒はシクロヘキサンである(U.S.5,008,473)。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に培地を供することにより直接1,3−プロパンジオールを同定することができる。本発明に好ましいものはアイソクラチックで0.01N硫酸の移動相を用いて分析イオン交換カラムで発酵培地を分析する方法である。
G3PDH及びG3Pホスファターゼの同定及び精製:
タンパク質G3PDH及びG3Pホスファターゼの発現のレベルを酵素アッセイにより測定し、G3PDH活性アッセイはG−3−PへのDHAP転化における補助基質のNADHの分光特性による。NADHは固有のUV/可視吸収を有し、その消費を340nmで分光光度計で調べることができる。反応で遊離される無機リン酸塩を測定するあらゆる方法によりG3Pホスファターゼ活性を測定することができる。最も一般的に用いられる検出方法は青色に着色したリンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を用いた。
実施例
一般法
リン酸化、ライゲーション及び形質転換の方法は当該技術分野でよく知られている。以下の実施例における使用のために適した技術をSambrook、J.等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)中に見いだすことができる。
バクテリア培養物の維持及び増殖のために適した材料及び方法は当該技術分野でよく知られてい得る。以下の実施例における使用のために適した技術をManual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt、R.G.E.Murray、Ralph N.Costilow、Eugene W.Nester、Willis A.Wood、Noel R.Kreig及びG.Briggs Phillips、編集、American Society for Microbiology、Washington,DC.(1994))中またはThomas D.BrockによるBiotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology、第2版、Sinauer Associates,Inc.、Sunderland、MA(1989)中に記述されたように見いだすことができる。他に記載しないかぎり、バクテリア細胞の増殖及び維持のために用いた全ての試薬及び材料をAldrich Chemicals(Milwaukee、WI)、DIFCO Laboratories(Detroit、MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg、MD)またはSigma Chemical Company(St.Louis、MO)から購入した。
略語の意味は以下のとおりであり:「h」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味する。
酵素アッセイ
無細胞抽出物中のグリセロールデヒドラターゼ活性を1,2−プロパンジオールを基質として用いて測定した。メチルベンゾ−2−チアゾロンヒドラゾンとアルデヒドの反応に基づくそのアッセイはForage及びFoster(Biochim.Biophys.Acta、569、249(1979))により記述されている。同様に記述されているように、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼとも呼ばれれ1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼの活性を1,3−プロパンジオール及びNAD+を基質として用いて溶液中またはスラブゲル中で測定した。Johnson及びLin、J.Bacteriol.、169、2050(1987)。記述されているように(R.M.Bell及びJ.E.Cronan、Jr.、J.Biol.Chem.250;7153−8(1975))、NADHまたはNADPHの消失により、NADHまたはNADPH依存性グリセロール3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)活性を分光光度計で測定した。
グリセロール−3−ホスファターゼ、GPPのアッセイ
ビス−TrisまたはMES及びマグネシウムバッファー、pH6.5中で抽出物を有機リン酸エステル基質とインキュベートすることにより酵素活性のアッセイを実施した。用いた基質は1−α−グリセロールリン酸;d,l−α−グリセロールリン酸であった。アッセイにおける試薬の最終濃度は:バッファー(20mMビス−Trisまたは50mM MES);MgCl2(10mM);及び基質(20mM)である。サンプル中の全タンパク質が少なく、酸クエンチで目に見える沈殿が生じない場合、サンプルをキュベット中で都合よくアッセイした。この方法は20mMの基質(50μL、200mM)、50mM MES、10mM MgCl2、pH6.5バッファーを含有するキュベット中で酵素サンプルをインキュベートすることを含んだ。最終ホスファターゼアッセイ容量は0.5mLであった。酵素を含有するサンプルを反応混合物に添加し;キュベットの中身を混合し、次に、キュベットをT=37℃で循環する水浴中に酵素サンプル中のホスファターゼ活性が2から0.02U/mLまでの範囲であるかどうかにより5ないし120分間置いた。酸性モリブデン酸塩試薬(0.4mL)の添加により酵素反応をクエンチした。Fiske SubbaRow試薬(0.1mL)及び蒸留水(1.5mL)を添加した後、溶液を混合し、発色させた。10分後にサンプルの吸光度をCary 219 UV/可視分光光度計を用いて660nmで読み取った。ストック無機リン酸塩溶液(0.65mM)を用いて0.026から0.130μmol/mLまでの範囲の最終無機リン酸塩濃度を有する6個の標準液を調製することにより作成した標準曲線に遊離された無機リン酸塩の量を比較した。
1,3−プロパンジオールの単離及び同定
1,3−プロパンジオールへのグリセロールの転化をHPLCにより調べた。クロマトグラフィーの当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施した。一つの適当な方法はUV(210nm)及びRI検出を用いてWaters Maxima 820 HPLCシステムを利用した。0.5mL/分の流速で0.01N H2SO4を移動相として用いて、50℃に温度温度された、Shodex SH−1011Pプレカラム(6mmx50mm)を備えたshodex SH−1011カラム(8mmx300mm、Waters、Milford、MAから購入した)にサンプルを注入した。定量分析が所望される場合には、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いてサンプルを調製した。典型的に、グリセロール(RI検出)、1,3−プロパンジオール(RI検出)及びトリメチル酢酸(UV及びRI検出)の保持時間はそれぞれ20.67分、26.08分及び35.03分であった。
1,3−プロパンジオールの生成をGC/MSにより確かめた。GC/MSの当業者が利用できる標準技術及び材料を用いて分析を実施した。一つの適当な方法はHewlett Packard 5971シリーズ質量選択的検出器及びHP−INNOWaxカラム(30mの長さ、0.25mmのi.d.、0.25ミクロンフィルムの厚さ)に連結されたHewlett Packard 5890シリーズIIガスクロマトグラフを利用した。生成された1,3−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを真の1,3−プロパンジオール(m/e:57、58)のものに比較した。
GC/MSの代わりの方法はサンプルの誘導化を含んだ。1.0mLのサンプル(例えば、培養上清)に30μLの濃(70% v/v)過塩素酸を添加した。混合した後、サンプルを冷凍し、凍結乾燥した。ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド:ピリジンの1:1混合物(300μL)を凍結乾燥物質に添加し、強く混合し、65℃で1時間置いた。遠心分離によりサンプルから不溶物を除いた。得られた液体は2相に分配し、上層を分析に用いた。サンプルをDB−5カラム(48m、0.25mm I.D.、0.25μmフィルムの厚さ;J&W Scientificから)でクロマトグラフィーにより分離し、培養上清から得られた1,3−プロパンジオール誘導体の保持時間及び質量スペクトルを真の基準から得られたものに比較した。TMSで誘導された1,3−プロパンジオールの質量スペクトルは205、177、130及び115 AMUの特性イオンを含有する。
実施例1
1,3−プロパンジオールの発現のためのコスミドDNAでのクローニング及びエシェリキア・コリ宿主細胞の形質転換
培地
1,3−プロパンジオールを製造する能力に関するバクテリア形質転換体のスクリーニングに合成S12培地を用いた。S12培地は:10mM硫酸アンモニウム、50mMリン酸カリウムバッファー、pH7.0、2mM MgCl2、0.7mM CaCl2、50μM MnCl2、1μM FeCl3、1μM ZnCl、1.7μM CuSO4、2.5μM CoCl2、2.4μM Na2MnO4及び2μMチアミン塩酸塩を含む。
増殖及び発酵のために用いた培地Aは:10mM硫酸アンモニウム;50mM MOPS/KOHバッファー、pH7.5;5mM リン酸カリウムバッファー、pH7.5;2mM MgCl2;0.7mM CaCl2;50μM MnCl2;1μM FeCl3;1μM ZnCl;1.72μM CuSO4;2.53μM CoCl2;2.42μM Na2MnO4;2μMチアミン塩酸塩;0.01%酵母エキス;0.01%カザミノ酸;0.8μg/mLビタミンB12及び50μg/mLアンピシリンからなった。必要な場合、0.2%グリセロールまたは0.2%グリセロール+0.2% D−グルコースのいずれかを培地Aに補足した。
細胞:
文献でクレブシエラ・エロゲネス(K.aerogenes)またはエロバクター・エロゲネス(Aerobacter aerogenes)としても知られているクレブシエラ・ニューモニエECL2106(Ruch等、J.Bacteriol.、124、348(1975))をE.C.C.Lin(Harvard Medical School、Cambridge、MA)から得、実験室培養物として維持した。
クレブシエラ・ニューモニエATCC 25955をAmerican Type Culture Collection(Rockville、MD)から購入した。
エシェリキア・コリDH5αをGibco/BRLから購入し、グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ酵素のいずれかをコードする遺伝子を含有するクレブシエラ・ニューモニエATCC 25955から単離されたコスミドDNAで形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドをpKP1及びpKP2として同定し、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドをpKP4として同定した。形質転換されたDH5αをDH5α−pKP1、DH5α−pKP2及びDH5α−pKP4として同定した。
エシェリキア・コリECL707(Sprenger等、J.Gen.Microbiol.、135、1255(1989))をE.C.C.Lin(Harvard Medical School、Cambridge、MA)から得、クレブシエラ・ニューモニエからのコスミドDNAで同様に形質転換した。これらの形質転換体をグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有するECL707−pKP1及びECL707−pKP2並びにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するECL707−pKP4として同定した。
tpi遺伝子(Anderson等、J.Gen.Microbiol.、62、329(1970))に突然変異を含有するエシェリキア・コリAA200をE.Coli Genetic Stock Center、Yale University(New Haven、CT)から購入し、クレブシエラコスミドDNAで形質転換してグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組み換え生物AA200−pKP1及びAA200−pKP2並びにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するAA200−pKP4を得た。
DH5α:
クレブシエラ・ニューモニエDNAでトランスフェクトした約1,000コロニーのエシェリキア・コリXL1−Blue MRを含有する6枚の形質転換プレートを5mLのLB培地で洗浄し、遠心分離した。バクテリアをペレットにし、5mlのLB培地+グリセロールに再懸濁した。0.2%グリセロール+400ng/mLのビタミンB12+0.001%酵母エキス+50μg/mLアンピシリンを含むS12合成培地を含有する15mLのチューブにアリコート(50μL)を接種した。培地でチューブを最上部まで満たし、パラフィルムで包み、30℃でインキュベートした。48時間後にわずかな濁りが見られた。78時間及び132時間で上記のように生成物区分に関して分析したアリコートは1,3−プロパンジオールに関して陽性であり、後者の時点は増加した量の1,3−プロパンジオールを含有した。
1,3−プロパンジオール生産に関して陽性結果であるバクテリアを単一コロニーを単離するために連続希釈してLB−50ampプレートで培養した。48個の単一コロニーが単離され、それらを再び1,3−プロパンジオールの生産に関して調べた。6個の別個のクローンからコスミドDNAを単離し、エシェリキア・コリ株DH5α中に形質転換した。形質転換体を再び1,3−プロパンジオールの生産に関して調べた。2個の形質転換体をさらに特性化し、DH5α−pKP1及びDH5α−pKP2と称した。
pIBI31(IBI Biosystem、New Haven、CT)中にサブクローン化した、pKP1からの12.1kb EcoRI−SalIフラグメントをシークエンスし、pHK28−26(配列番号19)と称した。シークエンシングからグリセロールデヒドラターゼをコードするdhaオペロンの関係のあるオープンリーディングフレーム及び調節のために必要な遺伝子の遺伝子座が明らかになった。配列番号19に関して、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするdhaKのオープンリーディングフレームのフラグメントは塩基1−399で見いだされ;グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするオープンリーディングフレームdhaDは塩基983−2107で見いだされ;リプレッサーをコードするオープンリーディングフレームdhaRは塩基2209−4134に見いだされ;1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードするオープンリーディングフレームdhaTは塩基5017−6180で見いだされ;αサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームdhaB1は塩基7044−8711に見いだされ;βサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームdhaB2は塩基8724−9308に見いだされ;γサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードするオープンリーディングフレームdhaB3は塩基9311−9736に見いだされ;そして未知の機能のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームdhaBXは塩基9749−11572に見いだされる。
クレブシエラ・ニューモニエからのパッケージングされたコスミドDNAでトランスフェクトしたエシェリキア・コリXL1−Blue MRの単一コロニーを200μLのS15培地(硫酸アンモニウム、10mM;リン酸カリウムバッファー、pH7.0、1mM;MOPS/KOHバッファー、pH7.0、50mM;MgCl2、2mM;CaCl2、0.7mM;MnCl2、50μM;FeCl3、1μM;ZnCl、1μM;CuSO4、1.72μM;CoCl2、2.53μM;Na2MnO4、2.42μM;及びチアミン塩酸塩、2μM)+0.2%グリセロール+400ng/mLのビタミンB12+0.001%酵母エキス+50μg/mLアンピシリンを含有するマイクロタイターウェル中に接種した。マイクロタイターウェルに加えて、LB−50ampを含有するマスタープレートにも接種した。96時間後に100μLを取り出し、0.2ミクロンのナイロン膜フィルターを含有するRainin微量遠心管で遠心分離した。バクテリアは保持され、濾過液をHPLC分析のために処理した。約240コロニーをスクリーニングした後、1,3−プロパンジオール生産を示す陽性クローンを同定した。3個の陽性クローンを同定し、それらのうち2個はLB−50ampで生育し、1個は生育しなかった。LB−50ampで生育した2個の陽性クローンのうちの1個から単離し、そして1,3−プロパンジオールの生産に関して確かめた単一コロニーをpKP4と称した。pKP4を含有するエシェリキア・コリ株からコスミドDNAを単離し、エシェリキア・コリ株DH5αを形質転換した。DH5α−pKP4と命名した別個の形質転換体を1,3−プロパンジオールの生産に関して確かめた。
ECL707:
pKP1、pKP2、pKP4のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ニューモニエDNAまたはSupercosベクターのみでエシェリキア・コリ株ECL707を形質転換し、それぞれ、ECL707−pKP1、ECL707−pKP2、ECL707−pKP4及びECL707−scと命名した。ECL707はATP依存性グリセロールキナーゼ、NAD+−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系のジヒドロキシアセトンの酵素IIをそれぞれコードするglpK、gld及びptsDを欠損している。
LB−50ampプレートから単離された、各コスミド形質転換体の20個の単一コロニー及び5個のSupercosベクターのみ(陰性コントロール)の形質転換体をマスターLB−50ampプレートに移した。また、これらの単離体がデヒドラターゼ活性を含有するかどうかを決定するためにグリセロールを1,3−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関しても試験した。0.2%グリセロールまたは0.2%グリセロール+0.2%D−グルコースのいずれかを補足した200μLの培地Aを含有するマイクロタイタープレートに形質転換体を滅菌したつまようじで移した。30℃で48時間インキュベーション後、マイクロタイタープレートウェルの中身を0.45ミクロンナイロンフィルターを通して濾過し、HPLCでクロマトグラフィーにより分離した。これらの試験の結果を表1に示す。
AA200:
pKP1、pKP2、pKP4のいずれかに相当するコスミドクレブシエラ・ニューモニエDNAまたはSupercosベクターのみでエシェリキア・コリ株AA200を形質転換し、それぞれ、AA200−pKP1、AA200−pKP2、AA200−pKP4及びAA200−scと命名した。株AA200はトリオースリン酸イソメラーゼを欠損している(tpi -)。
各コスミド形質転換体の20個の単一コロニー及び5個の空のベクター形質転換体を単離し、そしてエシェリキア・コリ株ECL707に対して記述したようにグリセロールを1,3−プロパンジオールに転化するそれらの能力に関して試験した。これらの試験の結果を表2に示す。
実施例2
DAR1、GPP2、dhaB及びdhaTを用いた組み換えエシェリキア・コリによる1,3−プロパンジオールへのD−グルコースの転化
エシェリキア・コリの形質転換における使用のための汎用発現プラスミドの構築
発現ベクターpTacIQ
エシェリキア・コリ発現ベクター、pTacIQはpBR322(Sutcliffe等、Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.43、77(1979))のEcoRI中に挿入されたlacIq遺伝子(Farabaugh、Nature 274、5673(1978))及びtacプロモーター(Amann等、Gene 25、167(1983))を含有する。マルチプルクローニング部位及びターミネーター配列(配列番号20)がEcoRIからSphIまでのpBR322配列に置き換わる。
グリセロールデヒドラターゼ遺伝子(dhaB1、2、3)のサブクローニング
プライマー(配列番号21及び22)を用いてPCRによりpHK28−26からdhaB3遺伝子のオープンリーディングフレーム(5’末端にEcoRI部位そして3’末端にXbaI部位を含む)を増幅した。生成物をpLitmus29(New England Biolab,Inc.、Beverly、MA)中にサブクローン化してdhaB3を含有するプラスミドpDHAB3を作製した。
pHK28−26からのdhaBオペロンの4個の遺伝子の全コーディング領域を含有する領域を制限酵素KpnI及びEcoRIを用いてpBluescriptII KS+(Stratagene、La Jolla、CA)中にクローン化してプラスミドpM7を作製した。
dhaB(1、2、3、4)を含有するプラスミドpM7をApaI及びXbaIで消化する(dhaB3の一部及びdhaBXの全部を欠失する)ことによりdhaBX遺伝子を除いた。得られた5.9kbのフラグメントを精製し、プラスミドpDHAB3からの325bp ApaI−XbaIフラグメントと連結して(dhaB3遺伝子を元に戻す)dhaB(1、2、3)を含有するpM11を作製した。
プライマー(配列番号23及び配列番号24)を用いてPCRによりpHK28−26からdhaB1遺伝子のオープンリーディングフレーム(5’末端にHindIII部位及び共通RBSリボソーム結合部位そして3’末端にXbaI部位を含む)を増幅した。生成物をpLitmus29(New England Biolab,Inc.)中にサブクローン化してdhaB1を含有するプラスミドpDT1を作製した。
dhaB1遺伝子の一部、dhaB2遺伝子及びdhaB3遺伝子を含有するM11からのNotI−XbaIフラグメントをpDT1中に挿入してdhaB発現プラスミド、pDT2を作製した。pDT2からのdhaB(1、2、3)遺伝子を含有するHindIII−XbaIフラグメントをpTacIQ中に挿入してpDT3を作製した。
1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子(dhaT)のサブクローニング
完全な1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(dhaT)遺伝子を含有する、pHK28−26のKpnI−SacIフラグメントをpBluescriptII KS+中にサブクローン化してプラスミドpAH1を作製した。合成プライマー(配列番号25と配列番号26)を用いて鋳型DNAとしてpAH1からPCRによりdhaT遺伝子(5’末端にXbaI部位そして3’末端にBamHI部位を含む)を増幅した。生成物をpCR−Script(Stratagene)中にSrfI部位でサブクローン化してdhaTを含有するプラスミドpAH4及びpAH5を作製した。プラスミドpAH4はpCR−Script中のlacプロモーターからの発現のために正しい向きにdhaT遺伝子を含有し、そしてpAH5は反対向きにdhaT遺伝子を含有する。dhaT遺伝子を含有するpAH4からのXbaI−BamHIフラグメントをpTacIQ中に挿入してプラスミドpAH8を作製した。RBS及びdhaT遺伝子を含有するpAH8からのHindIII−BamHIフラグメントをpBluescriptII KS+中に挿入してpAH11を作製した。RBS、dhaT遺伝子及びターミネーターを含有するpAH8からのHindIII−SalIフラグメントをpBluescriptII KS+中に挿入してpAH12を作製した。
dhaB(1、2、3)及びdhaTの発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のdhaB(1、2、3)及びdhaTサブクローンからdhaB(1、2、3)及びdhaTの発現カセットを組み立てた。RBS、dhaT遺伝子及びターミネーターを含有するpAH8からのSpeI−KpnIフラグメントをpDT3のXbaI−KpnI部位中に挿入してpAH23を作製した。pAH23のdhaB3とdhaT遺伝子の間のSmaI−EcoRIフラグメントを除いてpAH26を作製した。pDT2からのEcoRI部位を含有するSpeI−NotIフラグメントを用いてpAH26のSpeI−NotIフラグメントを置き換えてpAH27を作製した。
dhaT及びdhaB(1、2、3)の発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて先に記述した個々のdhaB(1、2、3)及びdhaTサブクローンからdhaT及びdhaB(1、2、3)の発現カセットを組み立てた。pDT3からのdhaB(1、2、3)遺伝子を含有するSpeI−SacIフラグメントをpAH11中にSpeI−SacI部位で挿入してpAH24を作製した。
エシェリキア・コリにおける増加したグリセロール生産のためのグリセロール3−ホスファターゼのクローニング及び発現
サッカロミセス・セレビシエ染色体Vラムダクローン6592(ジーンバンク、受託番号U18813x11)をATCCから購入した。合成プライマー(配列番号27と配列番号28)を用いて標的DNAとしてそのラムダクローンからPCRクローニングによりグリセロール3−リン酸ホスファターゼ(GPP2)遺伝子(5’末端にBamHI−RBS−XbaI部位そして3’末端にSmaI部位を含む)をクローン化した。生成物をpCR−Script(Stratagene)中にSrfI部位でサブクローン化してGPP2を含有するプラスミドpAH15を作製した。プラスミドpAH15はpCR−Script SK+中のlacプロモーターからの発現のために不活性の向きにGPP2遺伝子を含有する。GPP2遺伝子を含有するpAH15からのBamHI−SmaIフラグメントをpBluescriptII SK+中に挿入してプラスミドpAH19を作製した。pAH19はlacプロモーターからの発現のために正しい向きにGPP2遺伝子を含有する。GPP2遺伝子を含有するpAH19からのXbaI−PstIフラグメントをpPHOX2中に挿入してプラスミドpAH21を作製した。
dhaT、dhaB(1、2、3)及びGPP2遺伝子の発現のためのプラスミド
制限酵素SalI−XbaIで消化したpAH5中にSalI−EcoRI−XbaIリンカー(配列番号29及び30)を挿入してpDT16を作製した。そのリンカーはXbaI部位を消失させる。次に、pDT16からの1kb SalI−MluIフラグメントをpAH24中に挿入し、存在するSalI−MluIフラグメントを置き換えてpDT18を作製した。
pDT18からのdhaT及びdhaB(1、2、3)の発現カセットを含有する4.1kb EcoRI−XbaIフラグメント及びpAH21からのGPP2遺伝子を含有する1.0kb XbaI−SalIフラグメントを制限酵素EcoRI及びSalIで消化したベクターpMMB66EH
中に挿入してpDT20を作製した。
エシェリキア・コリにおけるDAR1の過剰発現のためのプラスミド
合成プライマー(配列番号46と配列番号47)を用いてサッカロミセス・セレビシエゲノムDNAからPCRクローニングによりDAR1を単離した。成功したPCRクローニングはDAR1の5’末端にNcoI部位を配置し、その場合、NcoI内のATGはDAR1の開始メチオニンである。DAR1の3’末端では翻訳ターミネーターの後にBamHI部位が導入される。PCRフラグメントをNcoI+BamHIで消化し、発現プラスミドpTrc99A(Pharmacia、Piscataway、New Jersey)内の同じ部位中にクローン化してpDAR1Aを得た。
より優れたリボソーム結合部位をDAR1の5’末端に作製するために、合成プライマー(配列番号48と配列番号49)をアニーリングすることにより得られるSpeI−RBS−NcoIリンカーをpDAR1AのNcoI部位中に挿入してpAH40を作製した。プラスミドpAH40はTrc99A(Pharmacia)のtrcプロモーターからの発現のために正しい向きに新しいRBS及びDAR1遺伝子を含有する。pDAR1AからのNcoI−BamHIフラグメント及び合成プライマー(配列番号31と配列番号32)をアニーリングすることにより得られる2組目のSpeI−RBS−NcoIリンカーをpBluescript II−SK+(Stratagene)のSpeI−BamHI部位中に挿入してpAH41を作製した。構築物pAH41はアンピシリン耐性遺伝子を含有する。pDAR1AからのNcoI−BamHIフラグメント及び合成プライマー(配列番号31と配列番号32)をアニーリングすることにより得られる2組目のSpeI−RBS−NcoIリンカーをpBC−SK+(Stratagene)のSpeI−BamHI部位中に挿入してpAH42を作製した。構築物pAH42はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
DAR1及びGPP2の発現カセットの構築
標準的な分子生物学方法を用いて上記の個々のDAR1及びGPP2サブクローンからDAR1及びGPP2の発現カセットを組み立てた。RBS及びGPP2遺伝子を含有するpAH19からのBamHI−PstIフラグメントをpAH40中に挿入してpAH43を作製した。RBS及びGPP2遺伝子を含有するpAH19からのBamHI−PstIフラグメントをpAH41中に挿入してpAH44を作製した。RBS及びGPP2遺伝子を含有するpAH19からの同じBamHI−PstIフラグメントをpAH42中にも挿入してpAH45を作製した。
エシェリキア・コリ株の構築
エシェリキア・コリW1485は野生型K−12株(ATCC 12435)である。この株をプラスミドpDT20及びpAH42で形質転換し、50μg/mLのカルベニシリン及び10μg/mLのクロラムフェニコールを補足したLA(ルリア寒天、Difco)で選択した。
グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産
1リットル当たり22.5gのグルコース、6.85gのK2HPO4、6.3gの(NH4)2SO4、0.5gのNaHCO3、2.5gのNaCl、8gの酵母エキス、8gのトリプトン、2.5mgのビタミンB12、2.5mLの修正バルチ(Balch’s)微量元素溶液、50mgのカルベニシリン及び10mgのクロラムフェニコールを含有し、最終pH6.8(HCl)、次に濾過滅菌した50mLの培地にエシェリキア・コリW1485/pDT20/pAH42をプレートから移す。修正バルチ微量元素溶液の組成をMethods for General and Molecular Bacteriology(P.Gerhardt等、編集、p158、American Society for Microbiology、Washington,DC(1994))中に見いだすことができる。37℃、300rpmで6時間インキュベートした後、0.5gのグルコース及びIPTG(最終濃度=0.2mM)を添加し、振盪を100rpmに下げた。サンプルをGC/MSにより分析した。24時間後に、W1485/pDT20/pAH42は1.1g/Lのグリセロール及び195mg/mLの1,3−プロパンジオールを生産した。
実施例3
サッカロミセス・セリビシエにおけるdhaB及びdhaTのクローニング及び発現
複製するエピソーム成分として存在することができる発現プラスミドを4個のdha遺伝子の各々に対して構築した。全ての発現プラスミドには酵母ADH1プロモーターが存在し、1つまたはそれより多い制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するDNAのフラグメントで酵母ADH1転写ターミネーターから隔てられている。また、各発現プラスミドはアンピシリンを含有する培地でのエシェリキア・コリにおける選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、エシェリキア・コリにおけるプラスミドの維持のための複製起点及びサッカロミセス・セリビシエにおける維持のための2ミクロン複製起点も含有する。酵母に対して用い、発現プラスミド上に存在する選択栄養マーカーは以下のもの:イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼをコードするHIS3遺伝子、オロチジン5’−リン酸脱炭酸酵素をコードするURA3遺伝子、N−(5’−ホスホリボシル)−アントラニル酸イソメラーゼをコードするTRP1遺伝子及びβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするLEU2のいずれかであった。
5’末端にEcoRI部位を含むプライマー(dhaT、dhaB3、dhaB2及びdhaB1に対してそれぞれ配列番号38と配列番号39、配列番号40と配列番号41、配列番号42と配列番号43及び配列番号44と配列番号45)を用いてPCRによりpHK28−26(配列番号19)からdhaT、dhaB3、dhaB2及びdhaB1のオープンリーディングフレームを増幅した(10mM Tris pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.0001%ゼラチン、200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP、1μMの各プライマー、1−10ngの標的DNA、25ユニット/mL AmplitaqTM(商標)DNAポリメラーゼ(Perkin−Elmer Cetus、Norwalk、CT))。PCRパラメーターは94℃で1分、55℃で1分、72℃で1分、35サイクルであった。生成物をpHIL−D4(Phillips Petroleum、Bartlesville、OK)のEcoRI部位中にサブクローン化してdhaT、dhaB3、dhaB2及びdhaB1をそれぞれ含有するプラスミドpMP13、pMP14、pMP20及びpMP15を作製した。
dhaB1発現プラスミドpMCK10の構築
7.8kbの複製プラスミドpGADGH(Clontech、Palo Alto、CA)をHindIIIで消化し、脱リン酸化し、そしてpMP15からのdhaB1 HindIIIフラグメントに連結した。得られたプラスミド(pMCK10)はADH1プロモーターからの転写のために正しい向きのdhaB1を有し、そしてLEU2マーカーを含んだ。
dhaB2発現プラスミドpMCK17の構築
プラスミドpGADGH(Clontech、Palo Alto、CA)をHindIIIで消化し、HindIII−XmnI及びEcoRI−XmnIアダプター(New England Biolabs、Beverly、MA)とのライゲーションにより一本鎖末端をEcoRI末端に転化した。プラスミドpUC4K(Pharmacia Biotech、Uppsala)からのEcoRIフラグメント上のカナマイシン耐性遺伝子に連結し、エシェリキア・コリ株DH5α中に形質転換し、そして25μg/mLのカナマイシンを含有するLBプレートで選択することにより正しいEcoRI末端を有するプラスミドの選択を実施した。得られたプラスミド(pGAD/KAN2)をSnaBI及びEcoRIで消化し、ADH1プロモーターを含む1.8kbのフラグメントを単離した。プラスミドpGBT9(Clontech、Palo Alto、CA)をSnaBI及びEcoRIで消化し、1.5kbのADH1/GAL4フラグメントをSnaBI及びEcoRIでの消化によりpGAD/KAN2から単離した1.8kbのADH1プロモーターフラグメントで置き換えた。得られたベクター(pMCK11)はADH1プロモーター及びターミネーター並びにTRP1マーカーを有する酵母における複製プラスミドである。プラスミドpMCK11をEcoRIで消化し、脱リン酸化し、そしてpMP20からのdhaB2 EcoRIフラグメントに連結した。得られたプラスミド(pMCK17)はADH1プロモーターからの転写のために正しい向きのdhaB2を有し、そしてTRP1マーカーを含んだ。
dhaB3発現プラスミドpMCK30の構築
プラスミドpGBT9(Clontech)をNaeI及びPvuIIで消化し、1kbのTRP1遺伝子をこのベクターから除いた。TRP1遺伝子をプラスミドpRS406(Stratagene)からの1.7kb AatII/NaeIフラグメントとして与えられるURA3遺伝子で置き換えて中間ベクターpMCK32を得た。pMCK32上に存在する欠失したADH1プロモーターを1.5kb SnaBI/EcoRIフラグメントで取り除き、プラスミドpGAD/KAN2からの1.8kb SnaBI/EcoRIフラグメント上の全長のADH1プロモーターで置き換えてベクターpMCK26を得た。pMCK26上の唯一のEcoRI部位を用いてプラスミドpMP14からのdhaB3を含むEcoRIフラグメントを挿入してpMCK30を得た。pMCK30複製発現プラスミドはADH1プロモーターからの発現のための向きのdhaB3を有し、そしてURA3マーカーを含んだ。
dhaT発現プラスミドpMCK35の構築
プラスミドpGBT9(Clontech)をNaeI及びPvuIIで消化し、1kbのTRP1遺伝子をこのベクターから除いた。TRP1遺伝子をプラスミドpRS403(Stratagene)からのXmnI/NaeIフラグメントとして与えられるHIS3遺伝子で置き換えて中間ベクターpMCK33を得た。pMCK33上に存在する欠失したADH1プロモーターを1.5kb SnaBI/EcoRIフラグメントで取り除き、プラスミドpGAD/KAN2からの1.8kb SnaBI/EcoRIフラグメント上の全長のADH1プロモーターで置き換えてベクターpMCK31を得た。pMCK31上の唯一のEcoRI部位を用いてプラスミドpMP13からのdhaTを含むEcoRIフラグメントを挿入してpMCK35を得た。pMCK35複製発現プラスミドはADH1プロモーターからの発現のための向きのdhaTを有し、そしてHIS3マーカーを含んだ。
dha発現プラスミドでのサッカロミセス・セレビシエの形質転換
Stratagene(La Jolla、CA)から購入したサッカロミセス・セレビシエ株YPH500(ura3−52 lys2−801 ade2−101 trp1−△63 his3−△200 leu2−△1)(Sikorski R.S.及びHieter P.、Genetics 122、19−27、(1989))をFrozen−EZ酵母形質転換キット(カタログ番号T2001)(Zymo Research、Orange、CA)を用いて1−2μgのプラスミドDNAで形質転換した。1つまたはそれより多い以下のもの:アデニン硫酸(20mg/L)、ウラシル(20mg/L)、L−トリプトファン(20mg/L)、L−ヒスチジン(20mg/L)、L−ロイシン(30mg/L)、L−リシン(30mg/L)を添加して補足最小培地(SMM−0.67%のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基(base)、2%グルコース)でコロニーを29℃で3−4日間増殖させた。コロニーを選択プレート上に延ばし、液体培地に接種するために用いた。
dha遺伝子に関するサッカロミセス・セレビシエ形質転換体のスクリーニング
URA+、HIS+、TRP+、LEU+形質転換体からの染色体DNAを各遺伝子に特異的なプライマー(配列番号38−45)を用いてPCRにより分析した。4個全てのオープンリーディングフレームの存在が確かめられた。
形質転換されたサッカロミセス・セレビシエにおけるdhaB及びdhaT活性の発現
インビトロ酵素アッセイを用いて活性のあるグリセロールデヒドラターゼ(dhaB)及び1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)の存在を示した。さらに、ウェスタンブロット分析により4個全てのオープンリーディングフレームからのタンパク質発現が確かめられた。
プラスミドpMCK10、pMCK17、pMCK30及びpMCK35の群で形質転換された株YPH500を0.67%のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、2%グルコース、20mg/Lアデニン硫酸及び30mg/L L−リシンを含有する補足最小培地で増殖させた。細胞をホモジナイズし、抽出物をdhaB活性に関してアッセイした。グリセロールデヒドラターゼには0.12ユニット/mgタンパク質、そして1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼには0.024ユニット/mgタンパク質の比活性が得られた。
実施例4
組み換えサッカロミセス・セレビシエを用いたD−グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産
プラスミドpMCK10、pMCK17、pMCK30及びpMCK35の群を保有するサッカロミセス・セレビシエYPH500を最初に20g/Lのグルコース、6.7g/Lのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、40mg/Lのアデニン硫酸及び60mg/LのL−リシンHClを含有する1.0Lの最小培地中でBiostatBファーメンター(B Braun Biotech,Inc.)で増殖させた。増殖の期間中に、さらなる当量の酵母窒素塩基、アデニン及びリシンを添加した。10%のリン酸及び2MのNaOHの添加でpH5.5、30℃、及び振盪制御により40%の溶存酸素圧力にファーメンターを制御した。38時間後に、細胞(OD600=5.8AU)を遠心分離により集め、基本培地(6.7g/Lのアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20mg/Lアデニン硫酸、30mg/L L−リシンHCl及び50mMリン酸カリウムバッファー、pH7.0)に再懸濁した。
0.5%のグルコース、5μg/mLの補酵素B12及び0、10、20または40mMのクロロキンを補足した4mLの全容量の基本培地中に細胞(OD600=20AU)を含有する反応混合物を10mLのクリンプ密封血清ボトル中に光及び酸素の非存在下で(窒素分散)調製し、振盪しながら30℃でインキュベートした。30時間後にアリコートを取り出し、HPLCにより分析した。結果を表3に示す。
実施例5
D−グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産のための、dhaB及びdhaTがゲノム中に組込まれているサッカロミセス・セレビシエ二重形質転換体の使用
実施例5はグルコースからの1,3−プロパンジオールの製造のためのdhaB1、dhaB2、dhaB3及びdhaTでのサッカロミセス・セレビシエの形質転換及び酵母ゲノム中へのそれらの遺伝子の安定な組込みをphropheticallyに示す。
発現カセットの構築
4個の発現カセット(dhaB1、dhaB2、dhaB3及びdhaT)を酵母のサッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの遺伝子のグルコース誘導性で高レベルの構成的発現のために構築する。これらのカセットは(i)サッカロミセス・セレビシエ株S288Cからのホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター;(ii)遺伝子dhaB1、dhaB2、dhaB3またはdhaTのいずれか;及び(iii)サッカロミセス・セレビシエ株S288CからのPGKターミネーターからなる。重複伸長によるPCRに基づく遺伝子スプライシングの技術(Horton等、BioTechniques、8:528−535、(1990))を用いてDNA配列を再結合し、各遺伝子の最適発現のために継目なく連結されたこれらのカセットを作製する。酵母発現プラスミドにおいて複数のカセットクローニングができる制限部位を有する適当なベクター(pLITMUS39)中にこれらのカセットを別個にクローン化する。
酵母組込みベクターの構築
酵母ゲノム中への発現カセットの組込みをもたらすために用いるベクターを構築する。これらのベクターは以下の成分:(i)発現カセットをサブクローン化するポリクローニング領域;(ii)安定な酵母形質転換体を選択するために用いる独特なマーカー;(iii)酵母を形質転換する前のエシェリキア・コリにおける遺伝子操作を可能にする複製起点及び選択マーカーを含有する。一つの組込みベクターはURA3栄養要求性マーカーを含有し(YIp352b)、もう一つの組込みベクターはLYS2栄養要求性マーカーを含有する(pKP7)。
酵母発現プラスミドの構築
dhaB1及びdhaB2の発現カセットをYIp352bのポリクローニング領域中にサブクローン化し(発現プラスミド#1)、そしてdhaB3及びdhaTの発現カセットをpKP7のポリクローニング領域中にサブクローン化する(発現プラスミド#2)。
発現プラスミドでの酵母の形質転換
Frozen−EZ酵母形質転換キット(Zymo Research、Orange、CA)を用いてサッカロミセス・セレビシエ(ura3、lys2)を発現プラスミド#1で形質転換し、そしてウラシルを欠いたプレートで形質転換体を選択する。dhaB1及びdhaB2の発現カセットの組込みを染色体DNAのPCR分析により確かめる。選択した形質転換体をFrozen−EZ酵母形質転換キットを用いて発現プラスミド#2で再形質転換し、そしてリシンを欠いたプレートで二重形質転換体を選択する。dhaB3及びdhaTの発現カセットの組込みを染色体DNAのPCR分析により確かめる。二重形質転換体中の4個全ての発現カセット(dhaB1、dhaB2、dhaB3、dhaT)の存在を染色体DNAのPCR分析により確かめる。
二重に形質転換された酵母からのタンパク質の生産
二重に形質転換された酵母からのdhaB1、dhaB2、dhaB3及びdhaTによりコードされるタンパク質の生産をウェスタンブロット分析により確かめる。
二重に形質転換された酵母からの酵素活性
二重に形質転換された酵母からの活性グリセロールデヒドラターゼ及び活性1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを上の一般法で記述したような酵素アッセイにより確かめる。
二重に形質転換された酵母からの1,3−プロパンジオールの生産
二重に形質転換された酵母におけるグルコースからの1,3−プロパンジオールの生産を本質的に実施例4に記述したように示す。
実施例6
DAR1/GPP2またはdhaT/dhaB1−3を含有するプラスミドの構築及びクレブシエラ種への形質転換
クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955)、クレブシエラ・ニューモニエ(ECL2106)及びクレブシエラ・オキシトカ(K.Oxytoca)(ATCC 8724)は生来アンピシリン(150μg/mLまで)及びカナマイシン(50μg/mLまで)に耐性であるが、テトラサイクリン(10μg/mL)及びクロラムフェニコール(25μg/mL)に感受性である。その結果、これら後者2つの抗生物質に対する耐性をコードする複製プラスミドはこれらのクレブシエラ株のクローニングベクターとして潜在的に有用である。中等度コピー数のプラスミドpBR322(New England Biolabs、Beverly、MA)のエレクトロポレーションにより、野生型のクレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955)、グルコースにより活性化されるクレブシエラ・ニューモニエ(ECL2106)及びクレブシエラ・オキシトカ(ATCC 8724)をうまくテトラサイクリン耐性に形質転換した。以下の方法によりこれを成し遂げた。10mLの一晩培養物を1LのLB(1%(w/v)バクト−トリプトン(Bacto−tryptone)(Difco、Detroit、MI)、0.5%(w/v)バクト−酵母エキス(Difco)及び0.5%(w/v)NaCl(Sigma、St.Louis、MO))中に接種し、培養物を0.5−0.7のOD600まで37℃でインキュベートした。細胞を氷上で冷やし、4000 x gで15分間の遠心分離により集め、そして1Lのよく冷えた滅菌した10%グリセロール中に再懸濁した。細胞を遠心分離により繰り返し集め、段階的に500mL、20mL、そして最後に2mLのよく冷えた滅菌した10%グリセロール中に再懸濁した。エレクトロポレーションのために、冷やした0.2cmキュベット中で40μLの細胞を1−2μLのDNAと混合し、BioRad Gene Pulser(BioRad、Richmond、CA)を用いて200Ω、2.5kVで4−5ミリ秒間パルスを与えた。1μLのSOC培地(2%(w/v)バクト−トリプトン(Difco)、0.5%(w/v)バクト−酵母エキス(Difco)、10μM NaCl、10μM MgCl2、10μM MgSO4、2.5μM KCl及び20μMグルコース)を細胞に添加し、懸濁液を17 x 100mmの滅菌したポリプロピレンチューブに移した後、培養物を37℃、225rpmで1時間インキュベートした。アリコートを示したような選択培地上で培養した。別個のテトラサイクリン耐性形質転換体からのプラスミドDNAの分析からpBR322の典型的な制限エンドヌクレアーゼ消化パターンが示され、ベクターがテトラサイクリン(10μg/mL)を含有するLB中37℃で一晩培養後に安定に維持されたことを示す。従って、クレブシエラ・ニューモニエ及びクレブシエラ・オキシトカ中にDAR1/GPP2及びdhaT/dhaB1−3発現カセットを導入するためにこのベクター並びにアンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールに対する耐性をコードするpBR329(ATCC 37264)のような誘導体を用いることができる。
DAR1及びGPP2遺伝子をそれらの既知のDNA配列に基づいて、サッカロミセス・セレビシエゲノムからPCRでの増幅により得ることができる。次に、グルコースを含有する培地中でそれらの遺伝子の発現を導くために用いることができる1つまたはそれより多いプロモーターの制御下でそれらをクレブシエラ・ニューモニエまたはクレブシエラ・オキシトカ中に形質転換する。便宜上、プラスミドpAH44のPvuII制限エンドヌクレアーゼでの消化により得られる2.4kb DNAフラグメント上にそれらの遺伝子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシェリキア・コリlacプロモーターの制御下で発現カセット中に配置されている。このDNAフラグメントをPvuIIで消化したpBR329に連結し、そのクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入不活化を生じた。連結されたDNAを用いてエシェリキア・コリDH5α(Gibco、Gaithersberg、MD)を形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン(10μg/mL)に対するそれらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール(25μg/mL)に対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール感受性の形質転換体からのプラスミドDNAの分析により、Plac−dar1−gpp2発現カセットがpBR329のPvuII部位にいずれかの向きでサブクローン化された予想されるプラスミドの存在が確かめられた。pJSP1A(時計回りの向き)及びpJSP1B(反時計回りの向き)と命名したこれらのプラスミドを記述したようにクレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955)、クレブシエラ・ニューモニエ(ECL2106)及びクレブシエラ・オキシトカ(ATCC 8724)中にエレクトロポレーションにより別個に形質転換した。形質転換体をテトラサイクリン(10μg/mL)に対するそれらの耐性により選択し、そしてクロラムフェニコール(25μg/mL)に対するそれらの感受性に関してスクリーニングした。別個の形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析から、予想される消化パターンのみが示され、それらが抗生物質選択で37℃で安定に維持されることが確かめられた。増殖培地へのIPTG(0.2−2.0mM)の添加によりDAR1及びGPP2遺伝子の発現を高めることができる。
クレブシエラ・ニューモニエのdhaB(1−3及)びdhaTの4個の遺伝子をそれらの既知のDNA配列に基づいてクレブシエラ・ニューモニエゲノムからPCRでの増幅により得ることができる。次に、これらの遺伝子をグルコースを含有する培地中でそれらの発現を導くために用いることができる1つまたはそれより多いプロモーターの制御下でクレブシエラ・ニューモニエ中に形質転換する。便宜上、プラスミドpAH24のKpnI/SacI制限エンドヌクレアーゼでの消化により得られる約4.0kb DNAフラグメント上にそれらの遺伝子を得、それによりそれらの遺伝子はすでにエシェリキア・コリlacプロモーターの制御下で発現カセット中に配置されている。このDNAフラグメントを同様に消化したpBC−KS+(Stratagene、La Jolla、CA)に連結し、そしてエシェリキア・コリDH5αを形質転換するために用いた。形質転換体をクロラムフェニコール(25μg/mL)に対するそれらの耐性により選択し、そしてX−galを含有するLB寒天上で白色コロニー表現型に関してスクリーニングした。白色コロニー表現型を示すクロラムフェニコール耐性形質転換体からのプラスミドDNAの制限分析により、dhaT−dhaB(1−3)遺伝子がエシェリキア・コリlacプロモーターの制御下にサブクローン化されたpJSP2と命名された予想されるプラスミドの存在が確かめられた。
3Gへのグルコースの転化を高めるために、このプラスミドをすでにPlac−dar1−gpp2発現カセットを含有するクレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955)(pJSP1A)、クレブシエラ・ニューモニエ(ECL2106)(pJSP1A)及びクレブシエラ・オキシトカ(ATCC 8724)(pJSP1A)中にエレクトロポレーションにより別個に形質転換した。共形質転換体(cotrans formant)をテトラサイクリン(10μg/mL)及びクロラムフェニコール(25μg/mL)の両方に対するそれらの耐性により選択した。別個の共形質転換体から単離されたプラスミドの制限分析から、pJSP1A及びpJSP2の両方に対して予想される消化パターンが示された。培地へのIPTG(0.2−2.0mM)の添加によりDAR1、GPP2、dhaB(1−3)及びdhaT遺伝子の発現を高めることができる。
実施例7
クレブシエラ・ニューモニエによるグルコースからの1,3−プロパンジオールの生産
両方ともpJSP1Aで形質転換されたクレブシエラ・ニューモニエ株ECL 2106及び2106−47、並びにpJSP1AとpJSP2で形質転換されたATCC 25955をグルコースからの1,3−プロパンジオールの生産のために様々な条件下(表4参照)で5LのApplikonファーメンター中で増殖させた。株2106−47はBauer等、Appl.Environ.Microbiol.56、1296(1990)中に記述されたようにフルオロ酢酸/乳酸選択プレートから得られたECL2106のフルオロ酢酸耐性の誘導体である。各場合で、用いた培地は50−100mMのリン酸カリウムバッファー、pH7.5、40mM(NH4)2SO4、0.1%(w/v)酵母エキス、10μM CoCl2、6.5μM CuCl2、100μM FeCl3、18μM FeSO4、5μM H3BO3、50μM MnCl2、0.1μM Na2MnO4、25μM ZnCl2、0.82mM MgSO4、0.9mM CaCl2及び10−20g/Lグルコースを含有した。さらにグルコースを供給し、残存グルコースを過剰に維持した。温度を37℃に制御し、そしてpHを5N KOHまたはNaOHで7,5に制御した。適切な抗生物質をプラスミドの維持のために含み;IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を同様に示した濃度で添加した。嫌気発酵には、0.1vvmの窒素を反応器中に分散させ;dO整定値が5%である場合は1vvmの空気を反応器中に分散させ、そして培地にビタミンB12を補足した。最終濃度及び全体収率(g/g)を表4に示す。
実施例8
dar1、gpp2、dhaB及びdhaTを含有する組み換えクレブシエラ・ニューモニエによる1,3−プロパンジオールへの炭素基質の転化
A.各種クレブシエラ・ニューモニエ組み換え株による1,3−プロパンジオールへのD−フルクトースの転化
クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955 pJSP1A)、クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)、クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 2106 pJSP1A)及びクレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 2106 pJSP1A/pJSP2)の単一コロニーを寒天プレートから移し、別個の培養管中で適切な抗生物質剤を含有するルリア−ベルタニ(LB)培地中で一晩継代培養した。1リットル当たり:10gのフルクトース;1gの酵母エキス;50mmoleのリン酸カリウム、pH7.5;40mmole(NH4)2SO4;0.09mmoleの塩化カルシウム;2.38mg CoCl2・6H2O;0.88mg CuCl2・2H2O;27mg FeCl3・6H2O;5mg FeSO4・7H2O;0.31mg H3BO3;10mg MnCl2・4H2O;0.023mg Na2MnO4・2H2O;3.4mg ZnCl2;0.2g MgSO4・7H2Oを含有するLLMM/Fとして明示される45mLの滅菌濾過した最小培地を含む50mLのフラスコ(?)。単一のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には10μg/mLのテトラサイクリン;二重のプラスミド組み換え体のいずれかを用いる反応には10μg/mLのテトラサイクリン及び25μg/mLのクロラムフェニコールを培地に添加した。2mLの継代培養物を接種する前に培地に窒素を完全に分散させた。いくつかのフラスコには0.5mMの最終濃度でIPTGを添加した。フラスコに蓋をし、次に、New Brunswickシリーズ25インキュベーター/振盪機中で37℃、100rpmでインキュベートした。少なくとも24時間かまたは大部分の炭素基質が生成物に転化されるまで反応を実施した。サンプルをHPLCにより分析した。表5に各種クレブシエラ組み換え体によりフルクトースから生産された1,3−プロパンジオールの収率を記述する。
B.クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)による各種炭素基質の1,3−プロパンジオールへの転化:
クレブシエラ・ニューモニエ(ATCC 25955 pJSP1A/pJSP2)の冷凍したストック培養物のアリコート(0.1mL)を250mLバッフル付きフラスコ中の50mLの種培地に移した。種培地は1リットル当たり;0.1モル NaK/PO4バッファー、pH7.0;3g(NH4)2SO4;5gグルコース、0.15g MgSO4・7H2O、10mL 100X微量元素溶液、25mgクロラムフェニコール、10mgテトラサイクリン及び1gの酵母エキスを含んだ。100X微量元素は1リットル当たり:10gクエン酸、1.5gCaCl2・2H2O、2.8g FeSO4・7H2O、0.39g ZnSO4・7H2O、0.38g CuSO4・5H2O、0.2g CoCl2・6H2O及び0.3g MnCl2・4H2Oを含んだ。得られた溶液をKOHまたはH2SO4のいずれかでpH7.0に滴定した。グルコース、微量元素、抗生物質及び酵母エキスを別個に滅菌した。種接種材料を35℃及び250rpmで一晩増殖させた。
反応設計は半好気的であった。系はアルミホイル片で部分的に開いたままの125mLの密封フラスコ中の130mLの反応培地からなった。反応培地は1リットル当たり:3g(NH4)2SO4;20g炭素基質;0.15モル NaK/PO4バッファー、pH7.5;1g酵母エキス;0.15g MgSO4・7H2O;0.5mmole IPTG;10mL 100X微量元素溶液;25mgクロラムフェニコール;及び10mgテトラサイクリンを含んだ。得られた溶液をKOHまたはH2SO4でpH7.5に滴定した。炭素源は:D−グルコース(Glc);D−フルクトース(Frc);D−ラクトース(Lac);D−ショ糖(Suc);D−マルトース(Mal);及びD−マンニトール(Man)であった。混合を高めるために数個のガラスビーズを培地中に含んだ。細胞懸濁液の吸光度がλ600nmで測定した場合に0.1AUで始まるように種接種材料を添加することにより反応を開始した。フラスコを35℃:250rpmでインキュベートした。24時間後にHPLCにより3G生成を測定した。表6に各種炭素基質から生産された1,3−プロパンジオールの収率を記述する。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)受信人:E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
(B)通り:1007 マーケット通り(MARKET STREET)
(C)市:ウィルミントン(WILMINGTON)
(D)州:デラウェア(DELAWARE)
(E)国:米国(U.S.A.)
(F)郵便番号:19898
(G)電話:302−892−8112
(H)テレファックス:302−773−0164
(I)テレックス:6717325
(A)受信人:GENENCOR INTERNATIONAL,INC.
(B)通り:4 ケンブリッジプレイス(CAMBRIDGE PLACE)
1870 サウスウィントン通り(SOUTHWINTON ROAD)
(C)市:ロチェスター(ROCHESTER)
(D)州:ニューヨーク(NEW YORK)
(E)国:米国(U.S.A.)
(F)郵便番号:14618
(ii)発明の名称:1,3−プロパンジオールの組み換え製造方法
(iii)配列の数:49
(iv)コンピューター可読形態:
(A)媒質型:3.50 インチ ディスケット
(B)コンピューター:IBM PC互換性
(C)オペレーティングシステム:ウィンドウズ95用マイクロソフト ワード
(D)ソフトウェア:マイクロソフトワード バージョン7.0A
(v)現在の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vi)先行する出願データ:
(A)出願番号:60/030,601
(B)出願日:1996年11月13日
(vii)弁護士/代理人の情報:
(A)氏名:FLOYD、LINDA AXAMETHY
(B)登録番号:33,692
(C)参照/整理番号:CR−9982
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1668
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB1
(xi)配列:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:585
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB2
(xi)配列:
(2)配列番号3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:426
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB3
(xi)配列:
(2)配列番号4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1164
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:DHAT
(xi)配列:
(2)配列番号5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1380
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GPD1
(xi)配列:
(2)配列番号6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:2946
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GPD2
(xi)配列:
(2)配列番号7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:3178
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GUT2
(xi)配列:
(2)配列番号8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:816
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GPP1
(xi)配列:
(2)配列番号9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:753
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GPP2
(xi)配列:
(2)配列番号10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:2520
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:GUT1
(xi)配列:
(2)配列番号11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:391
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GPD1
(xi)配列:
(2)配列番号12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:384
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GPD2
(xi)配列:
(2)配列番号13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:614
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GUT2
(xi)配列:
(2)配列番号14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:339
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GPSA
(xi)配列:
(2)配列番号15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:501
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GLPD
(xi)配列:
(2)配列番号16の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:542
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GLPABC
(xi)配列:
(2)配列番号17の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:250
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GPP2
(xi)配列:
(2)配列番号18の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:709
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GUT1
(xi)配列:
(2)配列番号19の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:12145
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(A)生物名:PHK28−26
(xi)配列:
(2)配列番号20の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:94
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号21の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:37
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号22の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:27
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号23の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:33
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号24の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:26
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号25の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:42
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号26の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:36
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号27の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:51
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号28の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:36
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号29の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号30の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号31の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号32の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号33の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:271
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:GPP1
(xi)配列:
(2)配列番号34の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:555
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB1
(xi)配列:
(2)配列番号35の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:194
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB2
(xi)配列:
(2)配列番号36の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:140
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:DHAB3
(xi)配列:
(2)配列番号37の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:387
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:不明
(D)トポロジー:不明
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名:DHAT
(xi)配列:
(2)配列番号38の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:27
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号39の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:28
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号40の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:28
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号41の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:27
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号42の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:30
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号43の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:25
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号44の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:30
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号45の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:29
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号46の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:34
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号47の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:39
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号48の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
(2)配列番号49の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:
Claims (11)
- (i)(a)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号11−16からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子;
(b)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号17および33からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子:
(c)グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号34−36からなる群より選ばれるアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子;
(d)1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、前記タンパク質が配列番号37のアミノ酸配列または前記配列中でアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる前記遺伝子、
の少なくとも1つを含んでなる各カセットの1以上で適当な宿主微生物を形質転換する工程であって、ただし、遺伝子(a)〜(d)の全てが宿主微生物に導入される、工程、
(ii)形質転換された宿主微生物を単糖、オリゴ糖、多糖または1炭素基質よりなる群から選択された少なくとも1つの炭素源の存在下で適当な条件下で培養し、それにより1,3−プロパンジオールを生成する工程、及び
(iii)1,3−プロパンジオールを回収する工程、
を含んでなる組み換え微生物からの1,3−プロパンジオールの生産方法。 - 適当な宿主微生物がバクテリア、酵母及び糸状菌よりなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 適当な宿主微生物がシトロバクター(Citrobacter)、エンテロバクター(Enterobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Klebsiella)、エロバクター(Aerobacter)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ザイゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ピチア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)及びシュードモナス(Pseudomonas)よりなる属の群から選択される請求項2記載の方法。
- 適当な宿主微生物がエシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ種(Klebsiella sp.)及びサッカロミセス種(Saccharomyces sp.)よりなる群から選択される請求項3記載の方法。
- 形質転換された宿主微生物が遺伝子GPD1及びGPD2を含んでなる形質転換カセットで形質転換されたクレブシエラ種(Klebsiella sp.)であって、前記遺伝子がそれぞれ配列番号11および配列番号12に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 炭素源がグルコースである請求項1記載の方法。
- グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号11、配列番号12及び配列番号13に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列が前記グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項1記載の方法。
- グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号33及び配列番号17に示されるアミノ酸配列に対応する遺伝子よりなる群から選択され、それらのアミノ酸配列が前記グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項1記載の方法。
- デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がdhaB1、dhaB2及びdhaB3を含んでなり、それらの遺伝子がそれぞれ配列番号34、配列番号35及び配列番号36に示されるアミノ酸配列に対応し、それらのアミノ酸配列が前記活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項1記載の方法。
- 1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配列番号37に示されるアミノ酸配列に対応し、そのアミノ酸配列が前記1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質の機能を変えないアミノ酸置換、欠失または付加を包含する請求項1記載の方法。
- (1)配列番号11に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子;
(2)配列番号17に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロール−3−ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子;
(3)配列番号34に示されるアミノ酸配列に対応するグリセロールデヒドラターゼ酵素のα−サブユニットをコードする遺伝子;
を含んでなる遺伝子の群、
を含んでなる形質転換された宿主細胞。
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