DE102010029973A1 - Mikrobiologische Herstellung von C4-Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp, aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle, mehr C4-Körper und/oder mehr über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer solchen gentechnisch veränderten Zelle und ein Verfahren zur Herstellung von C4-Körpern und/oder von über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen mit Hilfe dieser Zellen. Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung der Zellen zur Herstellung von C4-Körpern und/oder von über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen aus Saccharose und Kohlendioxid.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle mehr C4-Körper und/oder über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer solchen gentechnisch veränderten Zelle und ein Verfahren zur Herstellung von C4-Körpern und/oder von über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen mit Hilfe dieser Zellen. Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung der Zellen zur Herstellung von C4-Körpern Körpern und/oder von über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen aus Saccharose und Kohlendioxid.
  • C4-Körper, wie etwa Succinat, Malat, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Guten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2-, und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure werden heutzutage im Wesentlichen aus petrochemischen Rohstoffen hergestellt und sind als Ausgangsstoffe für Produkte der Futterindustrie, Agrarwirtschaft und der Pharmazeutischen Industrie von Bedeutung. Zusätzlich werden diese C4-Körper auch als Rohstoff der Chemieindustrie für Massenprodukte, wie zum Beispiel Polymere und Lösungsmittel, oder Spezialchemikalien eingesetzt. Aufgrund der absehbaren Verknappung petrochemischer Rohstoffe und zunehmender Nachfrage nach Produkten, die auf nachwachsenden Rohstoffen basieren, ist es wünschenswert, Alternativen zu den existierenden petrochemischen Verfahren zur Herstellung von C4-Körpern bereitzustellen, die auf nachwachsenden Rohstoffen basieren.
  • Die zurzeit verfolgten Ansätze basieren mehrheitlich auf Mikroorganismen, die in fermentativen Prozessen C4-Körper herstellen. Dabei wird insbesondere Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet. Die notwendige Glucose wird aus Stärke gewonnen, welche z. B. aus Mais, Kartoffeln, Weizen oder anderen Getreidearten hergestellt wird. Nachteilig an diesen Ansätzen ist, dass Glucose vergleichsweise teuer ist und die entsprechende Herstellung und Verwendung von Glucose mit der Verwendung oder Verarbeitung der Ausgangsstoffe zu Nahrungsmitteln konkurriert.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
  • Insbesondere liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde Glucose als Rohstoff durch eine günstigere und in ausreichenden Mengen verfügbare Alternative zu ersetzen.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass Saccharose als Rohstoff für die Herstellung von C4-Körpern verwendet wird. Weltweit betrachtet wird Saccharose zum größten Teil aus Zuckerrohr (ca. ¾ der Jahresproduktion) und zum geringeren Teil aus Zuckerrüben (ca. ¼ der Jahresproduktion) gewonnen. Durch die hohe Saccharose Produktion aus Zuckerrohr in Südamerika und Asien und einer geringeren Konkurrenz zur Nahrungsmittelindustrie, ist Saccharose in großen Mengen und günstiger als Glucose erhältlich.
  • Eine weitere Verbesserung der bestehenden Prozesse liegt darin, dass erfindungsgemäß zusätzlich zu Saccharose Kohlendioxid (CO2) als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Kohlendioxid fällt beispielsweise als Abfallprodukt einer Reihe chemischer Prozesse an und ist daher vergleichsweise günstig erhältlich. Zusätzlich kann durch die Verwertung von Kohlendioxid die Belastung der Atmosphäre mit Treibhausgasen reduziert werden. Im Stand der Technik sind bisher keine Technologien für die Herstellung von C4-Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid verfügbar, die mit den bestehenden petrochemischen Prozessen konkurrieren könnten. Wildtyporganismen, wie etwa Basfia succiniciproducens, Anaerobiospirillum succiniciproducens oder Actinobacillus succinogenes, die Saccharose zu C4-Körpern umsetzen können, sind für die biotechnologische Herstellung nicht geeignet, da die Ausbeuten gering sind und diese Organismen komplexe Nährmedien benötigen, die durch die damit verbundenen Kosten und den Aufwand den Prozess unwirtschaftlich werden lassen.
  • Erfindungsgemäß wird dieser Nachteil dadurch überwunden, dass rekombinante Zellen bereitgestellt werden, die unter entsprechenden Kulturbedingungen, ausgehend von Saccharose und CO2 als Kohlenstoffquellen, große Mengen an C4-Körpern herstellen können.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise herausgefunden, dass die Ausbeute an C4-Körpern durch gentechnische Manipulation geeigneter Zellen, insbesondere eine Verstärkung von Carboxylierungs-Reaktionen, die Kohlendioxid fixieren und zur Bildung von C4-Körpern führen, eine Unterdrückung von Stoffwechselwegen, die den Kohlenstofffluss von Saccharose hin zu Gärungsprodukten verursachen, welche nicht C4-Körper sind, und die Steigerung der Saccharose-Aufnahme und des Saccharose-Metabolismus stark erhöht werden kann. Dieser Ansatz erlaubt es i) Organismen, die üblicherweise nicht in der Lage sind Saccharose zu metabolisieren, die aber im Hinblick auf die erforderlichen Kulturbedingungen günstig sind und ii) Organismen, die auch natürlicherweise in der Lage sind Saccharose zu metabolisieren, aber nur geringe Effizienz im Sinne von Raum-Zeit- und/oder Kohlenstoffausbeute in Bezug auf die Synthese von C4-Körpers besitzen, als effiziente Ganzzellkatalysatoren zur Herstellung von C4-Körpern einzusetzen.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher eine rekombinante Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr C4-Körper und/oder über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen zu bilden vermag.
  • Der Begriff „C4-Körper”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Verbindung, die vier Kohlenstoffatome enthält, und umfasst entsprechende Carbonsäuren, Aldehyde, Alkohole, Zucker, Alkane, Alkene, Amine sowie deren Derivate. Beispielhafte C4-Körper im Sinne der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Succinat, Malst, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Ruten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der C4-Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malst und Oxalacetat und/oder aus durch enzymatische Synthese aus diesen C4-Körpern hergestellte Folgeverbindungen, wie zum Beispiel Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2-, und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin sowie über Malst, Oxalacetat und Folgeverbindungen auf chemischem Wege hergestellten Verbindungen. Wie hierin verwendet umfassen die Bezeichnungen von Carbonsäuren, sowohl die Basenform als auch die Säureform sowie Mischungen dieser Formen. Das bedeutet, dass Begriffe wie Succinat, Malst, Oxalacetat, Fumarat, Aspartat, Butyrat, 2-, 3- oder 4-Hydroxybuttersäure und 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure jeweils auch Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Oxalessigsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Buttersäure, 2-, 3- oder 4-Hydroxybutyrat und 2- oder 3-Hydroxyisobutyrat umfassen.
  • Der Ausdruck „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr C4-Körper zu bilden vermag” umfasst auch den theoretischen Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine C4-Körper, bzw. nicht den gewünschten C4-Körper zu bilden vermag, bzw. diese Verbindung(en) nicht in nachweisbarer Menge erzeugen kann und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Verbindungen gebildet werden. Ferner ist durch diesen Ausdruck erfasst, dass die entsprechende Zelle in einem festgelegten Zeitraum, beispielsweise innerhalb von 2, 4, 8, 12, 24 oder 48 Stunden, mindestens die 2-, 5-, 10-, 100- oder 1000-fache Menge an C4-Körpern bzw. einem oder mehreren gewünschten C4-Körpern bildet wie der Wildtyp.
  • Mit „Wildtyp” einer Zelle wird hierin eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp” fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
  • Die erfindungsgemäßen Zellen können Prokaryoten oder Eukaryoten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), andere tierische Zellen (z. B. Insektenzellen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen bevorzugt und Bakterien und Hefen besonders bevorzugt sind.
  • Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter
    http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria_catalogue.php
    aufgeführt sind. Erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter
    http://www.dsmz.de/microorganisms/yeast_catalogue.php
    aufgeführt sind. Erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter
    http://www.dsmz.de/microorganisms/fungus_catalogue.php
    aufgeführt sind.
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Basfia, Wollinella, Fibrobacter, Ruminococcus, Mannheimia, Lactobacillus, Lactococcus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium Cupriavidus sowie carboxydotrophe Mikroorganismen, wobei Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Hansenula polymorpha, Ralstonia eutropha, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Pichia pastoris, Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium carboxidivorans, Clostridium scatalogenes, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis und Pseudomonas putida besonders bevorzugt sind.
  • Die Begriffe „Kohlendioxid” und „CO2”, wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich sowohl auf das Gas CO2, die in wässriger Lösung mit gelöstem Kohlendioxid im Gleichgewicht stehende Kohlensäure (H2CO3) als auch die beiden Deprotonierungsprodukte der Kohlensäure, Hydrogencarbonat (HCO3 –) und Carbonat (CO3 2–) sowie deren Salze.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die C4-Körper aus der Gruppe, die aus: Succinat, Malst, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1-Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3-Hydroxyisobuttersäure besteht, ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform werden die C4-Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malst, Oxalacetat und aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen. Die durch enzymatische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.
  • In einer Ausführungsform sind die C4-Körper C4-Carbonsäuren, vorzugsweise C4-Dicarbonsäuren, noch bevorzugter Succinat. In einer weiteren Ausführungsform sind die C4-Körper Hydroxycarbonsäuren, noch bevorzugter 2-, 3- und/oder 4-Hydroxybuttersäure sowie 2- und/oder 3-Hydroxyisobuttersäure. In einer anderen Ausführungsform sind die C4-Körper vorzugsweise Malst und/oder Oxalacetat.
  • In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der rekombinanten Zelle um eine mikrobielle Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis oder Pseudomonas putida Zelle.
  • Die erfindungsgemäße rekombinante Zelle kann beispielsweise derart gentechnisch verändert sein, dass sie, im Vergleich zu ihrem Wildtyp, mehr Saccharose aufnehmen kann. Eine andere Möglichkeit, die alternativ oder auch zusätzlich Anwendung finden kann, ist eine gentechnische Veränderung der Zelle, die es der rekombinanten Zelle ermöglicht, im Vergleich zu ihrem Wildtyp, mehr Kohlendioxid zu fixieren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Steigerung der Saccharoseaufnahme dadurch erreicht, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, welches den Transport von Saccharose in die Zelle katalysiert.
  • Der Ausdruck „mindestens eines”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Mengen von ≥ 1, d. h. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30 oder mehr, insbesondere 1, 2, 3, 4 oder 5.
  • In einer Ausführungsform umfasst die rekombinante Zelle der Erfindung ein Enzym E1, das den Transport von Saccharose in die Zelle und die Umsetzung zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert.
  • Unter dem Begriff „Enzym” oder „Ex”, wie hierin verwendet, wobei x eine ganze Zahl bedeutet, wird ein Protein oder Proteinkomplex verstanden, das/der eine oder mehrere biochemische Reaktionen katalysiert und/oder das/der zum Transport von bestimmten Verbindungen, beispielsweise durch eine Membran, dient.
  • Die Begriffe „gesteigerte Aktivität eines Enzyms” oder „verminderte Aktivität eines Enzyms”, wie hierin verwendet, beziehen sich vorzugsweise auf eine gesteigerte/verminderte intrazelluläre oder membranständige Aktivität.
  • Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung oder Verminderung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung/Verminderung der Aktivität des Enzyms E1 als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht oder vermindert werden kann.
  • Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, Repression eliminiert, Inhibition verhindert oder ein Gen oder Allel einschleust oder der Art manipuliert, dass es für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert. Diese Maßnahmen werden gegebenenfalls kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
  • Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
  • Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswert-Software im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al. (Electophoresis, 22: 1712–23 (2001)), Lohaus et al. (Biospektrum 5 32–39 (1998)), Lottspeich (Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999)) und Wilson et al. (Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001)) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert Feedback-inhibierbar sind, wenn eine gesteigerte Enzymaktivität gewünscht ist.
  • Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte ”Enhancer” zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in EP-A-0 472 869 , in US 4,601,893 , bei Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
  • Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Casali, N. and Preston, A. (eds) (2003) E. coli Plasmid Vectors. Humana Press. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549–554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 107: 69–74 (1991)) oder pHS2-I (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 ( US 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66: 119–124 (1990)) oder pAG1 ( US 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden. Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli), nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84 (1994)), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEM1 (Schrumpfet al., Journal of Bacteriology 173: 4510–4516)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337–342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343–347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over”-Ereignisses enthalt der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
  • Mit den oben genannten Methoden lässt sich analog eine Verringerung der enzymatischen Aktivität erzielen. Dies gliedert sich ebenfalls in zwei Strategien, die Reduktion der Expression und/oder die Inhibierung der Enzymaktivität. Zur Reduktion der Expression kann beispielsweise das korrespondierende Gen ganz oder teilweise deletiert werden. Zudem kann die Transkription, beispielsweise durch die Manipulation der Promotorregion oder Verstärkung der Repression (genetisch oder chemisch) bzw. die Herabsetzung der mRNA-Halbwertszeit, inhibiert oder reduziert werden. Ebenfalls kann auf RNA-Ebene die Translation gestört oder reduziert werden. Dem Fachmann sind dazu zahlreiche Techniken bekannt, zum Beispiel die RNAi-Technologie oder die Modifikation der DNA-Sequenz dahingehend, dass es zur Ausbildung von Sekundärstrukturen auf mRNA-Ebene kommt, die die Translation inhibieren oder reduzieren. Die Enzymaktivität kann beispielsweise durch Zugabe von Inhibitoren, durch Einfügen von gerichteten oder ungerichteten Mutationen reduziert werden.
  • Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex” ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms Ex zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex” aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression” oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression” auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms Ex induziert wird.
  • Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms Ex” wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, genetische Deletion des Gens, durch Zugabe von kompetitiven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, weiter oben beschriebene bzw. dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression und/oder Funktion eines bestimmten Enzyms erfolgen.
  • Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens 10mal, darüber hinaus bevorzugt mindestens 100mal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens 1.000mal und am meisten bevorzugt mindestens 10.000 mal mehr C4-Körper bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (C4-Körper) im Nährmedium bestimmt wird.
  • Das Enzym E1 kann beispielsweise ein Phosphoenolpyruvat(PEP)-abhängiges Phosphotransferase-System (PTS) Enzym II (Saccharose-spezifisch) (EC 2.7.1.69; TCDB Klassifikation 4.A.1.2.1, 4.A.1.2.9 oder 4.A.1.2.-) sein.
  • Das Enzym E1 kann beispielsweise durch das scrA Gen kodiert werden. Die kodierende Nukleotidsequenz und die dazugehörige Proteinsequenz können beispielsweise der „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes” (KEGG-Datenbank), den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD; USA), der Proteindatenbank UniProt (Kooperation des European Bioinformatics Institute (EBI), des Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) und des Protein Information Resource (PIR)) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E1 um das aus E. coli stammende scrA Gen (SEQ ID NO: 41) und das daraus resultierende Protein. Darüber hinaus wird das Enzym E1 vorzugsweise von Genen kodiert, die aus der Gruppe derer ausgewählt werden, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren, zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80%, besonders bevorzugt zu mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt zu mindestens 99%, insbesondere zu 100% zu SEQ ID NO: 58 identisch ist.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E1 von Genen kodiert, die aus der Gruppe derer ausgewählt werden, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „PTS-II-BC-sucr” (TIGR01996 oder PssmID 131051) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt (englisch „domain hit”) wird.
  • Zusätzlich zu dem Enzym E1, das den Transport von Saccharose in die Zelle und die Umsetzung zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert, kann die rekombinante Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E2, E3 und E4 oder einer Kombination dieser Enzyme aufweisen. Dabei kann E2 ein Enzym sein, das die Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose katalysiert, E3 kann ein Enzym sein, das die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert, und E4 kann ein Kanal sein, der diffusions-abhängigen Saccharose-Transport in die Zelle erlaubt.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung daher rekombinante Zellen, die im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E2, E3 und E4 aufweisen. In einer Ausführungsform ist im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität des Enzyms E1 und mindestens eines der Enzyme E2, E3 und E4 gesteigert. In einer anderen Ausführungsform ist im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität der Enzyme i) E1, E2 und E3, ii) E2, E3 und E4, iii) E2 und E3, iv) E3 und E4, v) E2 und E4, oder vi) E1, E3 und E4 erhöht. In einer weiteren Ausführungsform weist die erfindungsgemäße rekombinante Zelle eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Aktivität der Enzyme E1, E2, E3 und E4 auf.
  • In weiteren Ausführungsformen kann es sich bei dem Enzym E2 um eine Saccharose-6-Phosphat-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26), bei dem Enzym E3 um eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) und/oder bei dem Enzym E4 um ein Saccharose Porin (TCDB Klassifikation 1.B.3.1.2) handeln.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird E2 von dem scrB (E. coli scrB: SEQ ID NO: 42), bfrA, sacA, sacB, cscA, fruA oder susH Gen (Streptococcus pneumoniae susH: SEQ ID NO: 52) kodiert, E3 wird von dem mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (E. coli scrK: SEQ ID NO: 43) oder cscK Gen (E. coli cscK: SEQ ID NO: 46) kodiert und E4 wird von dem scrY Gen (E. coli scrY: SEQ ID NO: 44) kodiert.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierenden Proteinsequenzen sowie weitere Gene für die Enzyme E2 bis E4 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E2, E3 und/oder E4 um aus E. coli stammende Gene bzw. die dadurch kodierten Proteine.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E2 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 59 aufweisen.
  • In verschiedenen Ausführungsformen wird das Enzym E2 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „scrB_fam” (TIGR01322 oder PssmID 162301) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E3 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 60 oder SEQ ID NO: 63 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E3 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „bac_FRK” (cd01167) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E4 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 61 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E4 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „Maltoporin-like” (cd01346 oder PssmID 30073) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, zeichnet sich die rekombinante Zelle dadurch aus, dass die im Vergleich zum Wildtyp gesteigerte Saccharoseaufnahme durch die erhöhte Aktivität eines Kanals E5 bewirkt wird, der Saccharose in die Zelle symportiert. Die vorliegende Erfindung erfasst ebenfalls Ausführungsformen, in denen dieser gesteigerte Saccharose-Symport mit den zuvor erwähnten erhöhten Aktivitäten der Enzyme E1, E2, E3 und/oder E4 kombiniert ist.
  • Der Kanal E5 kann beispielsweise eine Saccharose-Permease sein. In einer Ausführungsform wird E5 durch das cscB Gen (beispielsweise E. coli cscB: SEQ ID NO: 45) kodiert.
  • In weiteren Ausführungsformen kann die rekombinante Zelle zusätzlich zu E5 eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme aufweisen: E6, das die Umsetzung von Saccharose zu -D-Glucose und -D-Fruktose katalysiert; und E3, das die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert. In einer Ausführungsform ist die Aktivität beider Enzyme erhöht.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung, ist das Enzym E5 eine Saccharose-Permease (TCDB Klassifikation 2.A.1.5.3), das Enzym E3 eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) und das Enzym E6 eine -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26).
  • In diesem Zusammenhang kann das Enzym E5 durch cscB (beispielsweise E. coli cscB: SEQ ID NO: 45), lamB oder scrY (beispielsweise E. coli scrY: SEQ ID NO: 44), E3 durch mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (beispielsweise E. coli scrK: SEQ ID NO: 43) oder cscK (beispielsweise E. coli cscK: SEQ ID NO: 46) und/oder E6 durch cscA (beispielsweise E. coli cscA: SEQ ID NO: 47), susH (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susH: SEQ ID NO: 52), scrB (beispielsweise E. coli scrB: SEQ ID NO: 42), rafD, sacA, fruA oder bfrA kodiert werden. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E3, E5 und E6 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E3, E5 und/oder E6 um aus E. coli stammende Gene und die dadurch kodierten Proteine.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E5 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 62 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E5 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „LacY_symp” (PFAM domain 01306 oder PssmID 110319) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E6 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 64 oder SEQ ID NO: 51 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E6 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „SacC” (COG1621 oder PssmID 31808) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die gesteigerte Saccharoseaufnahme der erfindungsgemäßen rekombinanten Zelle dadurch bewirkt, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mindestens eine gesteigerte Aktivität eines Enzymkomplexes aufweist, der Saccharose in die Zelle transportiert.
  • Dieser Saccharose transportierende Enzymkomplex kann sich beispielsweise aus den Enzymen E7, E8 und E9 zusammensetzen, und umfasst zum Beispiel einen Saccharose-spezifischen ABC-Transporter (TCDB Klassifikation 3.A.1.1.-).
  • In diesem Zusammenhang kann das Enzym E7 durch ein susT1 Gen (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susT1: SEQ ID NO: 48), E8 durch ein susT2 Gen (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susT2: SEQ ID NO: 49) und/oder E9 durch ein susX Gen (beispielsweise Streptococcus pneumoniae susX: SEQ ID NO: 50) kodiert werden.
  • Ferner kann die Zelle mit gesteigerter Saccharose-Transporter-Aktivität eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E10, E2, E3 oder E6 oder einer beliebige Kombination dieser Enzyme aufweisen. Dabei katalysiert das Enzym E10 die Umsetzung von Saccharose zu Saccharose-6-Phosphat, das Enzym E2 die Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose, das Enzym E3 die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat und das Enzym E6 die Umsetzung von Saccharose zu -D-Glucose und -D-Fruktose.
  • In einer Ausführungsform weist die rekombinante Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der Enzyme E10, E2, E3 und E6 auf.
  • Enzym E10 kann eine Saccharose-Kinase, Enzym E2 eine Saccharose-6-Phosphat-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26), Enzym E3 eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) und/oder Enzym E6 eine -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26) sein.
  • In diesem Zusammenhang kann das Enzym E10 durch ein Saccharose-Kinase Gen, E2 durch ein scrB (beispielsweise E. coli scrB: SEQ ID NO: 42), bfrA, sacA, sacB, cscA (beispielsweise E. coli cscA: SEQ ID NO: 47), fruA oder susH Gen und/oder E3 durch ein mac, yajF, mtlZ, rbsK, glcK, pfkB, frcK, frk, sacK, ydhR, kdgK, suk, ydjE, gmuE, ydjE, scrK (beispielsweise E. coli scrK: SEQ ID NO: 43) oder cscK (beispielsweise E. coli cscK: SEQ ID NO: 46) Gen kodiert werden.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierenden Proteinsequenzen sowie weitere alternative Gene für die Enzyme E2, E3, E7, E8, E9 und E10 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden. In einem besonderen Fall handelt es sich bei E2, E3, und/oder E10 um aus E. coli und bei E7, E8 und/oder E9 um aus Streptococcus pneumoniae stammende Gene und die dadurch kodierten Proteine.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E7 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 65 aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Enzym E7 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, ib deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „LplB” (COG4209 oder PssmID 33938) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E8 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 66 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E9 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 67 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E9 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „UgpB” (COG1653 oder PssmID 31839) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können zwei oder drei der erwähnten Möglichkeiten der Manipulation des Saccharose-Aufnahmewegs miteinander kombiniert werden, so dass die rekombinante Zelle sich durch die gesteigerte Aktivität von zwei oder drei Saccharose-Aufnahmewegen von ihrem Wildtyp unterscheidet. Dies kann jeweils ein, mehrere oder sämtliche Enzyme aus den geschilderten Varianten betreffen. In bestimmten Ausführungsformen ist daher in einer rekombinanten Zelle gemäß der Erfindung die Aktivität der folgenden Enzyme gegenüber dem Wildtyp gesteigert:
    E1–E9;
    E1–E10;
    E1, E2, E3, E4, E5, E6;
    E1, E2, E3, E5, E6;
    E1, E2, E3, E7, E8, E9;
    E4, E5, E6, E7, E8, E9;
    E1, E2, E3, E7, E8, E9; E10;
    E3, E4, E6, E7, E8, E9; oder
    E3, E6, E7, E8, E9.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Aktivität von mindestens einem, vorzugsweise mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Enzymen ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme E1–E10 gesteigert.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante Zelle gentechnisch derart verändert, dass sie im Vergleich zu Ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, das die Fixierung von CO2 an einen C3-Körper katalysiert. Diese gesteigerte Kohlendioxid-Fixierung kann alternativ oder zusätzlich zu einer Steigerung des Saccharose-Transports in die Zelle vorliegen. Die Steigerung des Saccharosetransports kann mittels der oben dargelegten Techniken erfolgen.
  • Das mindestens eine Enzym, das die Fixierung von CO2 an einen C3-Körper katalysiert, kann in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus folgenden Enzymen besteht:
    E12, das die Umsetzung von Pyruvat, ATP und CO2 zu Oxalacetat, ADP und Phosphat katalysiert;
    E13, das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, H2O und CO2 zu Oxalacetat und Phosphat katalysiert;
    E14, das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, ADP/GDP/Pi und CO2 zu Oxalacetat und ATP/GTP/PPi katalysiert;
    E15, E16, E17 und E18, die die Umsetzung von Pyruvat NAD(P)H+ und CO2 zu Malat und NAD(P)+ katalysieren.
  • Ebenfalls erfasst durch die vorliegende Erfindung sind beliebige Kombinationen erhöhter Aktivitäten der Enzyme E12–E18 sowie die gesteigerte Aktivität aller Enzyme E12–E18.
  • In einer Ausführungsform ist
    E12 eine Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1.1);
    E13 eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Phosphat:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1.1.31);
    E14 eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (ATP/GTP/PPi:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1.1.32, EC 4.1.1.38 oder EC 4.1.1.49);
    E15 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.38);
    E16 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.39);
    E17 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NADP+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.40); und/oder
    E18 eine D-Malatdehydrogenase ((R)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.83).
  • Das Enzym E12 kann vorzugsweise aus durch ein Gen kodiert werden, das aus der Gruppe umfassend cgl516, aarI62Cp pyrI, pca, cglO689, pc, pcx, pyc-1, pyc-2, accC-2, pycA, pycA2, pyc, pycB, pycB1, pycB2, accC, accA, oadA, pyr, acc und accC1 ausgewählt wird, wobei das pyc-Gen (beispielsweise E. coli pyc: SEQ ID NO: 5) besonders bevorzugt ist.
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Pyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 6,455,284 , US 6,171,833 , US 6,884,606 , US 6,403,351 , US 6,852,516 und US 6,861,246 beschrieben. Eine in diesem Zusammenhang besonders bevorzugte Pyruvat-Carboxylase pyc ist diejenige Mutante, die in „A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generste a new L-lysine-producing mutant.", Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217–223 (2002) beschrieben ist. Bei dieser Mutante wurde die Aminosäure Prolin an Position 458 durch Serin ersetzt. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der Möglichkeiten zur Herstellung von Pyruvat-Carboxylase-Mutanten wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung. In bevorzugter Weise stammt pyc aus Corynebacterium glutamicum.
  • Das Enzym E13 kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ppc, capP, pepC und clpA, wobei das ppc-Gen bevorzugt ist. In einer Ausführungsform stammt ppc aus E. coil (SEQ ID NO: 1).
  • Das Enzym E14 kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend pck, pckG, pckA, pck1, pck2 und pck, wobei das pckA-Gen besonders bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt pckA aus E. coli (SEQ ID NO: 2).
  • Erfindungsgemäß bevorzugte Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 4,757,009 , US 4,980,285 , US 5,573,945 , US 6,872,553 und US 6,599,732 beschrieben. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften im Hinblick auf Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
  • Die Malatdehydrogenasen E15, E16 und E17 können vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend me, me1, me2, me3, mae, mae1, mae2, sfcA, sfcA1, maeA, maeB, maeB1, maeB2, tme, ygkJ, ywkA, ygkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7gll.23, malSI, malS2, dme, maeB1, maeB2, mdh, mdh1, mdh2, dme1 cgi 0120, dme1 cgi 0120, dme1-cg5889, fl9kl6.27, f6f22.7, t22p22.60, fl8al7.1, mod1, tme, mao, cgl3007, malS und malE, wobei für E15 maeA (beispielsweise E. coli maeA: SEQ ID NO: 3), für E16 mme1 (beispielsweise Chlamydomonas reinhardti mme1: SEQ ID NO: 55) sowie dme und für E17 maeB (beispielsweise E. coli maeB: SEQ ID NO: 4) besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen maeA und maeB aus E. coli.
  • Die Malatdehydrogenase E18 kann vorzugsweise durch ein Gen kodiert werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend yeaU, ycsA, ttuC, ttuC1, ttuC2, ttuC3, tdh, leuB, leuB1 und dmlA wobei yeaU und dmlA besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt dmlA aus E. coil (SEQ ID NO: 57).
  • In einer Ausführungsform wird:
    E12 durch ein pyc Gen;
    E13 durch ein ppc Gen;
    E14 durch ein pckA Gen;
    E15 durch ein maeA Gen;
    E16 durch ein mme1 Gen;
    E17 durch ein maeB Gen; und/oder
    E18 durch ein dmlA Gen kodiert.
  • Die vorgenannten Enzyme können einzeln, alle oder in beliebiger Kombination in ihrer Aktivität gesteigert sein. Insbesondere können mindestens eines, mindestens 2, 3, 4, 5, 6, oder 7 Enzyme der Gruppe E12–E18 in ihrer Aktivität gesteigert sein.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E12–E18 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E12 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 68 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E12 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „DRE_TIM_PC_TC_5S” (cd07937) oder der konservierten Domäne „pyruvate carboxylase” (PRK12999) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E13 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 69 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E13 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, inderen Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „Phosphoenolpyruvate carboxylase” (PssmID 166715 oder COG3252 oder c14574 oder PRK00009) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E14 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 70 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E14 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „PEPCK_ATP” (cd00484) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E15 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 71 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E15 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „NAD(P) binding domain of malic enzyme (ME), subgroup 1” (cd05312) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E16 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 56 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E16 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „malate dehydrogenase” (PRK13529) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E17 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 54 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E17 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „NAD(P) binding domain of malic enzyme (ME), subgroup 2” (cd05311) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E18 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 300 Aminosäuren eine Sequenzidentität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 99%, insbesondere von 100% zu SEQ ID NO: 53 aufweisen.
  • In einer Ausführungsform wird das Enzym E18 von Genen kodiert, die ausgewählt werden aus der Gruppe derer, die Genprodukte kodieren, in deren Aminosäuresequenz bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST die Präsenz der konservierten Domäne „Iso_dh Super-family” (c00445 oder PssmID 174206) mit einem E-Wert (englisch „e-value”) kleiner 1 × 10–5 festgestellt wird (englisch „domain hit”).
  • Des Weiteren kann, in einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen, die rekombinante Zelle zusätzlich derart gentechnisch verändert sein, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp einen verminderten Kohlenstofffluss von Saccharose hin zu Gärungsprodukten, die keine C4-Körper sind, aufweist.
  • Diese Ausführungsform umfasst erfindungsgemäße rekombinante Zellen, die zusätzlich gegenüber ihrem Wildtyp dadurch gekennzeichnet sind, dass sie aus Saccharose weniger C1-, C2-, und/oder C3-Nebenprodukte erzeugen.
  • Die dazu erforderliche gentechnische Veränderung kann durch eine Manipulation der rekombinanten Zelle geschehen, wodurch der Metabolismus, der die Gärungsprodukte erzeugt, reduziert oder unterbrochen wird.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivität von mindestens einem der folgenden Enzyme im Vergleich zum Wildtyp verringert:
    E19, E20, E21 und E22, die Komponenten eines glukosespezifischen Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesystems darstellen und als solche den Import von Glukose und in Summe die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat und Glukose zu Pyruvat und Glukose-6-Phosphat katalysieren;
    E23 und E24, die die Umsetzung von Pyruvat und CoA zu Formiat und Acetyl-CoA katalysieren;
    E25, das die Umsetzung von Pyruvat, H2O und Ferricytochrom b1 zu Acetat, CO2 und Ferrocytochrom b1 katalysiert;
    E26, das die Umsetzung von S-Methylmalonyl-CoA zu Propanoyl-CoA und CO2 katalysiert;
    E27 und E28, die die Umsetzung von Acetyl-Phosphat und ADP/Pi zu Acetat und ATP/PPi katalysieren;
    E29, das die Umsetzung von Acetyl-CoA und Pi (Orthophosphat) zu Acetyl-Phosphat und CoA katalysiert;
    E30, das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu D-Lactat und NAD+ katalysiert;
    E31, das die Umsetzung von Acetyl-CoA zu Acetaldehyd katalysiert;
    E32, das die Umsetzung von Acetaldehyd zu Ethanol katalysiert;
    E33, das die Umsetzung von Glyceronphosphat zu Methylglyoxal und Orthophosphat katalysiert;
    E34, E35 und E36, die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert;
    E37, das die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert;
    E38, E39 und E40, die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert;
    E41, das die Umsetzung von Propionyl-CoA, H2O und Oxalacetat zu 2-Methylcitrat und CoA katalysiert;
    E42, das die Umsetzung von 2-Methylcitrat zu 2-Methyl-cis-Aconitat oder 2-Methyl-trans-Aconitat und H2O katalysiert;
    E43, das die Umsetzung von 2-Methyl-trans-Aconitat zu 2-Methyl-cis-Aconitat katalysiert;
    E44, das die Umsetzung von 2-Methyl-cis-Aconitat zu Succinat und Pyruvat katalysiert;
    E45, das die Umsetzung von Propionyl-Phosphat und ADP zu Propionat und ATP katalysiert;
    E46, welches die Umsetzung von Propionyl-CoA und Pi zu Propionyl-Phosphat und CoA katalysiert;
    E47, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Acetaldehyd und CO2 katalysiert;
    E48, welches die Umsetzung von Pyruvat und CoA 2 oxidierten Ferredoxinen zu Acetyl-CoA, CO2, und 2 reduzierten Ferredoxinen und 2H+ katalysiert;
    E49, welches die Umsetzung von D-Xylulose-5-Phosphat und Phosphat zu Acetylphosphat und D-Glyceraldehyd-3-Phosphate und H2O katalysiert;
    E50, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-CoA und Pyruvat zu Propionyl-CoA und Oxalacetat katalysiert;
    E51, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA katalysiert;
    E52, welches die Umsetzung von 2 Pyruvat zu 2-Acetolactat und CO2 katalysiert;
    E53, welches die Umsetzung von 2-Acetolactat zu Acetoin und CO2 katalysiert;
    E54, welches die Umsetzung von Acetoin und NAD(P)H+ zu Butan-2,3-diol und NAD(P)+ katalysiert;
    E55, welches die Umsetzung 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA katalysiert;
    E56, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NAD(P)H+ zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD(P)+ katalysiert;
    E57, welches die Umsetzung von Crotonyl-CoA und H2O zu 3-Hydroxybutyryl-CoA katalysiert;
    E58, welches die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H+ zu Butanol und NAD(P)+ katalysiert;
    E59, welches die Umsetzung von Butyryl-CoA und NAD(P)H+ zu Buryraldehyd und NAD(P)+ katalysiert;
    E60, welches die Umsetzung von Acetoacetat und H+ zu Aceton und CO2 katalysiert;
    E61, welches die Umsetzung von Aceton und NAD(P)H+ zu Propanol und NAD(P)+ katalysiert;
    E62, welches die Umsetzung von Acyl-CoA und Carbonsäure zu Acylat und Carbonsäure-CoA katalysiert und
    E63, das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu L-Lactat und NAD+ katalysiert.
  • In bestimmten Ausführungsformen können auch mehrere, d. h. mindestens 2, oder alle der vorgenannten Enzyme in ihrer Aktivität verringert sein.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist/sind:
    E19 und E20 ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym II (EC 2.7.1.69);
    E21 ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym I (EC 2.7.3.9);
    E22 eine Phosphohistidin-Protein (HPr)-Hexose-Phosphotransferase-Komponenente des PEP-abhängigen Phosphotransferase-Systems;
    E23 und E24 eine Formiat-C-Acetyltransferase (EC 2.3.1.54);
    E25 eine Pyruvat:Ferricytochrom b1-Oxidoreduktase (EC 1.2.2.2);
    E26 eine Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.41);
    E27 eine ATP/PPi:Acetat-Phosphotransferase (EC 2.7.2.1 oder EC 2.7.2.1);
    E28 eine Propionat-/Acetat-Kinase (EC 2.7.2.15);
    E29 eine Acetyl-CoA:Phosphat-Acetyltransferase (EC 2.3.1.8);
    E30 eine D-Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.28);
    E31 eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (CoA-acetylierend) (EC 1.2.1.10);
    E32 eine NAD-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1);
    E33 eine Glyceronphosphat-Phospholyase (EC 4.2.3.3);
    E34, E35, E36, E37, E38, E39 und E40 Formatdehydrogenasen (EC 1.2.1.2);
    E41 eine 2-Methylcitrat Synthase (EC 2.3.3.5);
    E42 eine 2-Methylcitrat Dehydratase (EC 4.2.1.79 oder EC 4.2.1.117);
    E43 eine 2-Methylaconitat Isomerase;
    E44 eine Methylisocitrat Lyase (EC 4.1.3.30);
    E45 eine Propionatkinase (EC 2.7.2.15);
    E46 eine Phosphat-Propionyltransferase (EC 2.3.1.8);
    E47 eine Pyruvatdecarboxylase (EC 4.1.1.1);
    E48 eine Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase (EC 1.2.7.1);
    E49 eine Phosphoketolase (EC 4.1.2.9);
    E50 eine Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase (EC 2.1.3.1);
    E51 eine Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2);
    E52 eine Acetolactat-Synthase (EC 2.2.1.6);
    E53 eine Acetolactat-Decarboxylase (EC 4.1.1.5);
    E54 eine Butandiol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.4 oder EC 1.1.1.76);
    E55 eine Thiolase (EC 2.3.1.9);
    E56 eine 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.36 oder EC 1.1.1.211);
    E57 eine Crotonase (EC 4.2.1.17);
    E58 eine Butanol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2);
    E59 eine Butyraldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 oder EC 1.2.1.5);
    E60 eine Acetoacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.4);
    E61 eine Propanol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2);
    E62 eine Acyl-CoA:CoA-Transferase (EC 2.8.3.-); und/oder
    E63 eine L-Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27).
  • Die erfindungsgemäßen Zellen weisen in einer Ausführungsform eine im Vergleich zum Wildtyp verringerte Aktivität von mindestens einem, vorzugsweise mindestens 2, noch bevorzugter mindestens 3, am bevorzugtesten mindestens 5 der genannten Enzyme auf.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Aktivität von mindestens einem der Enzyme E19–E22 reduziert. Eine solche Verringerung der Enzymaktivität kann vorteilhaft sein, da damit der energieaufwendige Import und die Aktivierung von Glukose unterbunden werden, wodurch der Zelle mehr Energie für den Import und die Aktivierung von Saccharose und für die Fixierung von Kohlendioxid zur Verfügung steht.
  • Das Enzym E26 wird vorzugsweise von einem Gen kodiert, das ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ygfG, mmdA, oadB, oadB2, oadB3, SC1C2.16, SC1G7.10, pccBI, mmdB, mmdC und ppcB, wobei das ygfG-Gen besonders bevorzugt ist. In einer Ausführungsform stammt ygfG aus E. coli.
  • Gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung weist die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität von mindestens einem Enzym E19–E45 auf, wobei:
    E19 durch ein ptsG Gen kodiert wird;
    E20 durch ein ptsI Gen kodiert wird;
    E21 durch ein ptsH Gen kodiert wird;
    E22 durch ein crr Gen kodiert wird;
    E23 durch ein tdcE Gen kodiert wird;
    E24 durch ein pflA oder pflB Gen kodiert wird;
    E25 durch ein poxB Gen kodiert wird;
    E26 durch ein ygfG Gen kodiert wird;
    E27 durch ein ackA Gen kodiert wird;
    E28 durch ein ackA oder tdcD Gen kodiert wird;
    E29 durch ein pta Gen kodiert wird;
    E30 durch ein ldhA Gen kodiert wird;
    E31 durch ein adhE Gen kodiert wird;
    E32 durch ein adhE Gen kodiert wird;
    E33 durch ein mgsA Gen kodiert wird;
    E34 durch ein fdnG Gen kodiert wird;
    E35 durch ein fdnH Gen kodiert wird;
    E36 durch ein fdnI Gen kodiert wird;
    E37 durch ein fdhF Gen kodiert wird;
    E38 durch ein fdoG Gen kodiert wird;
    E39 durch ein fdoH Gen kodiert wird;
    E40 durch ein fdoI Gen kodiert wird;
    E41 durch ein prpC Gen kodiert wird;
    E42 durch ein prpD oder acnD Gen kodiert wird;
    E43 durch ein prpF Gen kodiert wird;
    E44 durch ein prpB Gen kodiert wird;
    E45 durch ein tdcD Gen kodiert wird
    E46 durch ein pta Gen kodiert wird;
    E47 durch ein pdc Gen kodiert wird;
    E48 durch ein porA, porB, porC oder porD Gen kodiert wird;
    E49 durch ein xpk1 oder xpk2 Gen kodiert wird
    E50 durch ein Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase Gen kodiert wird;
    E51 durch ein sbm oder ein mcmA und ein mcmB Gen kodiert wird;
    E52 durch ein alsS, ilvB, ilvM, ilvN, ilvG, ilvI oder ilvH Gen kodiert wird;
    E53 durch ein alsD Gen kodiert wird;
    E54 durch ein butBGen kodiert wird;
    E55 durch ein thl, thlA, thlB oder phaA Gen kodiert wird;
    E56 durch ein phaB Gen kodiert wird;
    E57 durch ein crt Gen kodiert wird;
    E58 durch ein adhE Gen kodiert wird;
    E59 durch ein adhE, bdhA oder bdhB Gen kodiert wird;
    E60 durch ein adc Gen kodiert wird;
    E61 durch ein adh Gen kodiert wird;
    E62 durch ein ctfA und ein ctfB oder ein atoA und ein atoD Gen kodiert wird und/oder
    E63 durch ein ldhL Gen kodiert wird.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene, deren korrespondierende Proteinsequenz sowie weiterer Gene für die Enzyme E19–E63 können unter anderem auch der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung, weist die rekombinante Zelle, die ausgehend von Saccharose und CO2 als Kohlenstoffquellen mehr C4-Körper als der Wildtyp herstellen kann, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität von mindestens einem, mindestens zwei, mindestens 3, oder mindestens 4 der Enzyme E19, E26, E27, E29, E30, E31, E32 und E46 auf. In einer solchen Ausführungsform sind die Enzyme E19, E26, E27, E29/E46, E30 und E31/E32 ldhA, adhE, ack, pta, ygfG und ptsG. Die erfindungsgemäße Zelle kann auch eine verringerte Aktivität aller 8 Enzyme E19, E26, E27, E29, E30, E31, E32 und E46 bzw. aller 6 Enzyme, die durch die Gene ldhA, adhE, ack, pta, ygfG und ptsG kodiert werden, aufweisen.
  • In weiteren Ausführungsformen weist die rekombinante Zelle, die aus Saccharose und CO2 als Kohlenstoffquellen mehr C4-Körper als der Wildtyp herstellen kann, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität von mindestens einem der Enzyme E1–E18 und, optional, eine verringerte Aktivität von mindestens einem der Enzyme E19–E63 auf.
  • Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Zellen, in denen im Vergleich zum Wildtyp die Aktivität:
    • (i) der Enzyme E1 bis E4 und E12 gesteigert und der Enzyme E19, E26, E27, E29 bis E32 und E46 verringert ist;
    • (ii) der Enzyme E3, E5, E6 und E12 gesteigert und der Enzyme E19, E26, E27, E29 bis E32 und E45 verringert ist; oder
    • (iii) der Enzyme E2, E3, E7, E8, E9, E10 und E12 gesteigert und der Enzyme E19, E26, E27, E29 bis E32 und E46 verringert ist.
  • In solchen Ausführungsformen können die Enzyme E1 bis E10 und E12 bis E18 durch die Gene scrA, scrB, scrK, scrY, cscB, cscA, cscK, susT1, susT2, susX bzw. pyc, ppc, pckA, maeA, mme1, maeB und dmlA und die Enzyme E19, E20, E21, E22, E23, E24, E25, E27, E28, E29, E30, E31, E32, E33, E45, E46, E47, E48, E49, E50, E55, E56, E57, E58, E59, E60, E61 und E63 ptsG, ptsI, ptsH, crr, tdcE, pflA, pflB, poxB, ack, pta, tdcD, ldhA, adhE, mgsA, ygfG, pdc, porA, porB, porC, porD, xpk1, xpk2, thl, thlA, thlB, phaA, phaB, crt, bdhA, bdhB, adc, adh und ldhL kodiert werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle gemäß der Erfindung.
  • In einem solchen Verfahren kann die Erhöhung der Aktivität von mindestens einem der vorstehend beschriebenen Enzyme E1–E18 und, optional, die Verringerung der Aktivität von mindestens einem der vorstehend beschriebenen Enzyme E19–E63, durch eines der eingangs beschriebenen Verfahren erfolgen. Bevorzugte Kombinationen von Enzymen mit gesteigerter bzw. verringerter Aktivität sind die oben erwähnten Kombinationen.
  • In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines C4-Körpers und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung, wobei das Verfahren die Inkubation einer Zelle gemäß der Erfindung mit einem Nährmedium, das Saccharose enthält, unter Bedingungen, die die Herstellung mindestens eines C4-Körpers und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung aus Saccharose und CO2 erlauben, umfasst.
  • In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens enthält das Medium Kohlendioxid.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des mindestens einen C4-Körpers und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung kann zusätzlich auch das Isolieren des mindestens einen C4-Körpers und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung aus dem Nährmedium einschließen.
  • Schließlich richtet sich die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen zur Herstellung von mindestens einem C4-Körper und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen.
  • In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Verwendung werden die C4-Körper aus folgender Gruppe ausgewählt: Succinat, Malst, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Guten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1-Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3-Hydroxyisobuttersäure.
  • In einer Ausführungsform werden die C4-Körper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Malst, Oxalacetat und die über diese C4-Körper hergestellten Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen. Die durch enzymatische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Succinat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.
  • Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von C4-Körpern, beispielsweise C4-Carbonsäuren wie Succinat, mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und kultiviert werden. Ebenfalls praktikabel ist ein semikontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung der bekannten Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) zu finden. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen des jeweiligen Wirtszellstammes genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
  • In den verwendeten Nährmedien dienen insbesondere Saccharose und/oder Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen.
  • Als Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.
  • Das Kulturmedium kann weiterhin Metallsalze enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind.
  • Schließlich können dem Medium noch weitere Stoffe, wie z. B. Aminosäuren und/oder Vitamine zugesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
  • Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden.
  • Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
  • Die Aufreinigung des/der C4-Körper(s) oder Folgeprodukten aus der Nährlösung erfolgt vorzugsweise kontinuierlich, wobei es in diesem Zusammenhang weiterhin bevorzugt ist, auch die Herstellung des C4-Körpers durch Fermentation kontinuierlich durchzuführen, so dass der gesamte Prozess von der Herstellung des C4-Körpers bis zur dessen Aufreinigung aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zur kontinuierlichen Aufreinigung des C4-Körpers aus der Fermentationsbrühe wird diese kontinuierlich über eine Vorrichtung zur Abtrennung der bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen, vorzugsweise über einen Filter mit einer Ausschlussgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt, in dem eine Fest/Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
  • Das hinsichtlich seines C4-Körper-Anteils angereicherte Fermentationserzeugnis wird nach der Abtrennung der Mikroorganismen einer vorzugsweise mehrstufigen Trennanlage zugeführt. In dieser Trennanlage sind mehrere hintereinander geschaltete Trennstufen vorgesehen, aus denen jeweils Rückführleitungen ausmünden, die zum Fermentationstank zurückgeführt sind. Weiterhin führen aus den jeweiligen Trennstufen Ableitungen heraus. Die einzelnen Trennstufen können nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten. In der Regel handelt es sich um Membran-Trenneinrichtungen in den einzelnen Trennstufen. Die Auswahl der einzelnen Trennstufen ergibt sich aus Art und Umfang der Gärungsnebenprodukte und Substratreste.
  • Neben der Abtrennung des C4-Körpers mittels Elektrodialyse, Umkehrosmose, Ultrafiltration oder Nanofiltration, in deren Verlauf als Endprodukt eine wässrige C4-Körper-Lösung erhalten wird, kann der C4-Körper auch durch Extraktionsverfahren aus der von Mikroorganismen befreiten Fermentationslösung abgetrennt werden, wobei in diesem Fall letztendlich der reine C4-Körper erhalten werden kann. Zur Abtrennung einer C4-Carbonsäure durch Extraktion können der Fermentationslösung beispielsweise Ammoniumverbindungen oder Amine zugesetzt werden, um ein Ammoniumsalz der C4-Carbonsäure zu bilden. Dieses Ammoniumsalz kann dann aus der Fermentationslösung abgetrennt werden, in dem ein organisches Extraktionsmittel zugesetzt und die so erhaltene Mischung anschließend erhitzt wird, wodurch das Ammoniumsalz sich in der organischen Phase anreichert. Aus dieser Phase kann die C4-Carbonsäure dann unter Erhalt der reinen C4-Carbonsäure beispielsweise durch weitere Extraktionsschritte isoliert werden. Genauere Einzelheiten bezüglich dieses Trennverfahrens sind der WO-A-02/090312 zu entnehmen, deren Offenbarungsgehalt hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung bildet.
  • Je nach Art und Weise der Abtrennung des C4-Körpers aus der Fermentationslösung wird entweder eine wässrige C4-Körper-Lösung, beinhaltend 2 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 7,5 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 25 Gew.-% an C4-Körper, oder aber reiner C4-Körper erhalten.
  • Des Weiteren können die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte C4-Carbonsäuren vor, während oder nach der Aufreinigung noch neutralisiert werden, wobei hierzu Basen wie etwa Kalziumhydroxid oder Natriumhydroxid eingesetzt werden können.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen und den Beispielen enthalten. Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, wobei die Erfindung nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von E. coli-Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum
  • Zur Herstellung von E. coli-Expressionsvektoren für die Gene ppc (SEQ ID NO: 1), pck (SEQ ID NO: 2), maeA (SEQ ID NO: 3) und maeB (SEQ ID NO: 4) aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum (SEQ ID NO: 5) werden diese Gene aus chromosomaler DNA von E. coli MG1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 per PCR amplifiziert und gleichzeitig über die verwendeten Oligonukleotide eine Schnittstelle stromaufwärts der jeweiligen Ribosomenbindungstelle und eine Schnittstelle stromabwärts des Stopcodons eingeführt. Die Präparation der chromosomalen DNA von E. coli MG1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 erfolgt mittels DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Bei der Amplifikation der Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum mit chromosomaler DNA von E. coli MG1655 bzw. C. glutamicum ATCC 13032 als Matrize kommen folgende Oligonukleotide zum Einsatz:
    E. coil ppc:
    ppc-fw: 5'-ATA GAG CTC AGG GCT ATC AAA CGA TAA GAT GGG GTG-3' (SEQ ID NO: 6)
    5'-ATA CCT GCA GGT TAG CCG GTA TTA CGC ATA CCT GCC G-3'
    ppc-rv:
    (SEQ ID NO: 7)
    E. coli pck:
    pck-fw: 5'-ATA GGA TCC TTA CTA TTC AGG CAA TAC ATA TTG GCT AAG GA-3' (SEQ ID NO: 8)
    pck-rv: 5'-ATA CCT GCA GGT CAT TAC AGT TTC GGA CCA GCC GCT AC-3' (SEQ ID NO: 9)
    E. coli maeA:
    maeA-fw: 5'-ATA GAG CTC GTG GAT ATT CAA AAA AGA GTG AGT GAC ATG GAA C-3' (SEQ ID NO: 10)
    maeA-rv: 5'-ATA CCT GCA GGT TAG ATG GAG GTA CGG CGG TAG TCG-3' (SEQ ID NO: 11)
    E. coli maeB:
    maeB-fw: 5'-ATA GAG CTC TAC GTG AAA GGA ACA ACC AAA TGG ATG ACC-3' (SEQ ID NO: 12)
    maeB-rv: 5'-ATA CCT GCA GGT TAC AGC GGT TGG GTT TGC GCT TC-3' (SEQ ID NO: 13)
    C. glutamicum pyc:
    pyc-fw: 5'-ATA GAG CTC TGA AAG GAA TAA TTA CTC TAG TGT CGA CTC-3' (SEQ ID NO: 14)
    pyc-rv: 5'-ATA CCT GCA GGG GTT TAG GAA ACG ACG ACG ATC AAG-3' (SEQ ID NO: 15)
  • Folgende Parameter werden für die PCR eingesetzt: 1 ×: initiale Denaturierung, 98°C, 0:30 min; 30 ×: Denaturierung, 98°C, 0:10 min, Annealing, 60°C, 0:30 min; Elongation, 72°C, 3 min; 1 ×: terminale Elongation, 72°C, 10 min. Für die Amplifikation wird der PhusionTM High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 10 μl der PCR-Reaktionen werden anschließend auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarosegel-Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgt in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
  • In allen Fällen können PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese beträgt für ppc 2710 bp, für pck 1686 bp, für maeA 1745 bp, für maeB 3220 bp und für pyc 3466 bp. Die PCR-Produkte werden mit SacI und SbfI (ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. BamHI und SbfI (pck) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers der Restriktiosendonukleasen (New England Biolabs; Bad Schwalbach) verdaut und in den mit SacI und SbfI (ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. BamHI und SbfI (pck) geschnittenen Vektor pEC-XC99E (SEQ ID NO: 16) ligiert. pEC-XC99E ist ein E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektor, der in beiden Organismen Chloramphenicol-Resistenz vermittelt sowie einen ColE1-Replikationsursprung (hohe Kopiezahl: > 500 Kopien pro E. coli-Zelle) und einen synthetischen trc-Promotor ohne Ribosomenbindungstelle trägt. Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5-Zellen (Gibco-BRL, Karlsruhe) erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
  • Die korrekte Insertion der ppc-, pck-, maeA-, maeB- bzw. pyc-Fragmente wird durch eine Restriktion mit SacI und SbfI (ppc, maeA, maeB und pyc) bzw. BamHI und SbfI (pck) überprüft. Die Authentizität der inserierten Fragmente wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die fertiggestellten E. coli-Expressionsvektoren werden als pEC-XC99E-ppc (SEQ ID NO: 17), pEC-XC99E-pck (SEQ ID NO: 18), pEC-XC99E-maeA (SEQ ID NO: 19), pEC-XC99E-maeB (SEQ ID NO: 20) und pEC-XC99E-pyc (SEQ ID NO: 21) bezeichnet.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von E. coli-Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli sowie scrK-scrYAB aus pUR400
  • Zur Herstellung von E. coli-Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli DSM 1116 (SEQ ID NO: 22) sowie scrK-scrYAB aus pUR400 (SEQ ID NO: 23) werden diese aus chromosomaler DNA von E. coli DSM 1116 bzw. Gesamt-DNA von E. coli-K12 (pUR400) per PCR amplifiziert und gleichzeitig über die verwendeten Oligonukleotide je eine Restriktionsschnittstelle am 5'- bzw. 3'-Ende eingeführt. Die Präparation der chromosomalen DNA aus E. coli DSM 1116 bzw. Gesamt-DNA aus E. coli-K12 (pUR400) erfolgt mittels DNeasy Blond & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers Bei der Amplifikation der Loci cscA-cscKB aus chromosomaler DNA von E. coli DSM 1116 bzw. von scrK-scrYAB aus Gesamt-DNA von E. coli-K12 (pUR400) als Matrize kommen folgende Oligonukleotide zum Einsatz:
    E. coli cscA-cscKB:
    csc-fw: 5'-ATA CAT ATG TTA TTA ACC CAG TAG CCA GAG TGC TCC AT GT-3' (SEQ ID NO: 24)
    csc-rv: 5'-ATA CTC GAG CTA CTA TAT TGC TGA AGG TAC AGG CGT TTC C-3' (SEQ ID NO: 25)
    E. coli scrK-scrYAB:
    scr-fw: 5'-ATA CCA TGG TCC GCC AGT TCA TCC GGG AAC GG-3' (SEQ ID NO: 26)
    scr-rv: 5'-ATA GCG GCC GCT TAT TCT ACC ATG CAA GTT CGC AGC-3' (SEQ ID NO: 27)
  • Folgende Parameter werden für die PCR eingesetzt: 1 ×: initiale Denaturierung, 98°C, 0:30 min; 30 ×: Denaturierung, 98°C, 0:10 min, Annealing, 60°C, 0:30 min; Elongation, 72°C, 5 min; 1 ×: terminale Elongation, 72°C, 10 min. Für die Amplifikation wird der PhusionTM High-Fidelity Master Mix von New England Biolabs (Frankfurt) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Jeweils 10 μl der PCR-Reaktionen werden anschließend auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgtrennt. Die Durchführung der PCR, der Agarosegel-Elektrophorese, Ethidiumbromidfärbung der DNA und Bestimmung der PCR-Fragmentgrößen erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
  • In beiden Fällen können PCR-Fragmente der erwarteten Größe amplifiziert werden. Diese beträgt für cscA-cscKB 3907 bp und für scrK-scrYAB 5800 bp. Die PCR-Produkte werden mit NcoI- und NotI (scrK-scrYAB) bzw. NdeI und XhoI (cscA-cscKB) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers der Restriktiosendonukleasen (New England Biolabs; Bad Schwalbach) verdaut und in den NcoI- und NotI (scrK-scrYAB) bzw. NdeI und XhoI (cscA-cscKB) geschnittenen Vektor pCOLADuet-1 (SEQ ID NO: 28; Merck Biosciences; Nottigham, UK) ligiert. pCOLADuet-1 ist ein E. coli-Vektor mit niedriger Kopiezahl (20–40 Kopien pro Zelle), der Kanamycin-Resistenz vermittelt sowie einen ColA-Replikationsursprung trägt. Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5-Zellen (Gibco-BRL, Karlsruhe) erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
  • Die korrekte Insertion der cscA-cscKB- und scrK-scrYAB-Fragmente wird durch eine Restriktion mit NcoI- und NotI (scrK-scrYAB) bzw. NdeI und XhoI (cscA-cscKB) überprüft. Die Authentizität der inserierten Fragmente wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die fertiggestellten E. coli-Expressionsvektoren werden als pCOLA-csc (SEQ ID NO: 29) bzw. pCOLA-scr (SEQ ID NO: 30) bezeichnet.
  • Beispiel 3
  • Chromatographische Quantifizierung von Edukten und Produkten
  • Die chromatographische Quantifizierung von Saccharose erfolgt auf folgende Art und Weise: Die Quantifizierung von Saccharose wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie durchgeführt. Für die Trennung von Zuckern wird eine Anionenaustauscher-Säule mit Aminophase, 5 μm Partikelgröße und den Maßen 250 × 4,6 mm (Waters Spherisorb NH2; Waters, Eschborn) verwendet. Die mobile Phase besteht aus einem Gemisch aus Acetonitril (56% v/v), Aceton (26% v/v) und Wasser (16% v/v). Die Proben werden sterilfiltriert und unverdünnt vermessen. Das Injektionsvolumen beträgt 10 μL, der Durchfluss der mobilen Phase 2 mL/min und die Säulentemperatur 30°C. Saccharose wird mittels Brechungsindex-Detektor (Agilent 1200 Series RID; Agilent Technologies, Böblingen) quantifiziert. Die Referenzsubstanz (Sigma-Aldrich, Steinheim) wird in Wasser gelöst Vermessen. Dabei liegt bis zu einer Konzentration von 100 g/L eine lineare Abhängigkeit zwischen der Peakfläche und der Substanzkonzentration vor. Die Bestimmungsgrenze liegt für Saccharose bei 1 g/L.
  • Die chromatographische Quantifizierung von Succinat, Acetat, Lactat, Formiat und Ethanol erfolgte auf folgende Art und Weise: Die Trennung der organischen Säuren und Ethanol wird mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie durchgeführt. Dabei findet die Ionenausschluss-Säule Aminex® HPX 87H mit den Maßen 300 mm × 7,8 mm (Bio Rad Laboratories, München) als stationäre Phase Verwendung. Als mobile Phase wird 10 mM Schwefelsäure eingesetzt. Die Säulentemperatur beträgt 40°C, der Durchfluss 0,6 ml/min. Die Probe wird mit 0,5 M Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4 bis 5 angesäuert und mit einem Volumen von 20 μL in die Säule injiziert. Die Detektion erfolgt mittels Diodenarraydetektor (Agilent 1200 Series DAD, Agilent Technologies, Böblingen) bei einer Wellenlänge von 190 bis 400 nm sowie Brechungsindex-Detektor (Agilent 1200 Series RID, Agilent Technologies, Böblingen). Die Referenzsubstanzen werden in Konzentrationen von 0,1 g/L bis 20 g/L in Wasser gelöst vermessen. Die Bestimmungsgrenzen liegen für Lactat, Acetat, Succinat und Formiat bei 0,8 g/L, Ethanol kann bis zu einer Konzentration von 1 g/L bestimmt werden. Im Bereich von 0,8 g/L bis 20 g/L liegt eine lineare Abhängigkeit der Peakflächen von der Substanzkonzentration vor.
  • Beispiel 4
  • Produktion von Succinat durch E. coli-Stämme mit Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli sowie scrK-scrYAB aus pUR400
  • Zur Erzeugung von E. coli-Stämmen mit Expressionsvektoren für die Gene ppc, pck, maeA und maeB aus E. coli sowie pyc aus C. glutamicum in Kombination mit Expressionsvektoren für die Loci cscA-cscKB aus E. coli sowie scrK-scrYAB aus pUR400 werden kompetente Zellen von E. coli MG1655 hergestellt. Dazu wird der Stamm in Luria-Bertani Bouillon nach Miller (Merck, Darmstadt) als 10 mL-Vorkultur angezogen. Eine 100 mL LB-Bouillon wird mit 2 mL der Vorkultur inokuliert und bei 37°C und 200 U/min im Inkubationsschüttler bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 kultiviert. Die elektrokompetenten Zellen werden durch Waschen mit einer sterilen 10% (w/v) Glycerinlösung wie folgt hergestellt: Die 100 mL Kultur wird durch 10 minütige Zentrifugation bei 4°C und 5500 × g geerntet und durch Resuspendieren in 10% Glycerinlösung gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugations- und Waschschritt werden die pellettierten E.coli MG1655 Zellen in 0,5 mL 10% Glycerinlösung aufgenommen und in Aliquots von 50 μL bei –80°C bis zur Elektroporation gelagert.
  • Diese werden dann sequentiell oder in Kombination mit den Plasmiden pEC-XC99E, pEC-XC99E-ppc, pEC-XC99E-pck, pEC-XC99E-maeA, pEC-XC99E-maeB, pEC-XC99E-pyc, pCOLADuet-1, pCOLA-csc und pCOLA-scr transformiert und auf LB-Platten mit Chloramphenicol (50 μg/ml) und/oder Kanamycin (50 μg/ml) ausplattiert. Transformanten werden durch Plasmidpräparation und analytische Restriktionsanalyse bezüglich Präsenz der authentischen Plasmide überprüft.
  • So wurden folgende E. coli-Stämme erzeugt:
    • • E. coli MG1655 (pCOLADuet-1, pEC-XC99E)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-ppc)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-pck)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-maeA)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-maeB)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-csc, pEC-XC99E-pyc)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-ppc)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-pck)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-maeA)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-maeB)
    • • E. coli MG1655 (pCOLA-scr, pEC-XC99E-pyc)
  • Diese Stämme werden im Anschluss verwendet, um ihre Fähigkeit zur Produktion von Succinat unter anaeroben Bedingungen zu analysieren. Dabei wird wie folgt vorgegangen:
    Die Stämme werden einem mehrstufigen Kultivierungsprozess unterzogen. Die Vorkultur zur Produktion von Biomasse wird aerob durchgeführt in einem modifizierten M9-Medium, das zusätzlich Hefeextrakt als Komplexbestandteil enthält. Das Medium, bestehend aus 38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Merck, Darmstadt), 22 mM Kaliumdihydrogenphosphat (Merck, Darmstadt), 8,6 mM Natriumchlorid (Merck, Darmstadt), 18,7 mM Ammoniumchlorid (Merck, Darmstadt), 1% (w/v) Hefeextrakt (Merck, Darmstadt), 2% (w/v) Saccharose (Sigma-Aldrich, Steinheim), 0,1 mM Calciumchlorid-Dihydrat (Sigma-Aldrich, Steinheim), 1 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat (Merck, Darmstadt), 200 mM MOPS (3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure, Sigma-Aldrich, Steinheim) und 1% (v/v) MEM Vitaminlösung (Sigma-Aldrich, Steinheim), wird mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und zu 10 mL mit Chloramphenicol (50 μg/mL) und/oder Kanamycin (50 μg/mL) in einen 100 mL Erlenmeyerkolben mit Schikane vorgelegt und mit einer Einzelkolonie des zu untersuchenden Stammes inokuliert. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C und 250 U/min in einem Inkubationsschüttler. Nach einer Kultivierungsdauer von 8 Stunden werden 200 mL modifiziertes M9-Medium mit 0,2 mg/L Biotin und 0,5 mM IPTG in einem 1000 mL-Erlenmeyerkolben mit Schikane mit der Vorkultur inokultiert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 0,2 erreicht wird. Nach einer Kultivierungsdauer von mindestens 12 Stunden bei 37°C und 250 U/min wird die Kulturbrühe durch 10 minütige Zentrifugation bei 3300 g und 4°C geerntet. Die sedimentierten Bakterienzellen werden mit steriler 0,9% Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend in Medium für die anaerobe Kultivierung aufgenommen. Die anaerobe Hauptkultur erfolgt in modifiziertem M9 Medium ohne Komplexbestandteile (38 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat, 22 mM Kaliumdihydrogen-phosphat, 8,6 mM Natriumchlorid, 18,7 mM Ammoniumchlorid, 2% (w/v) Saccharose, 0,1 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 1 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 200 mM MOPS, 1% (v/v) MEM Vitaminlösung, 0,1% (w/v) Natriumhydrogencarbonat, pH 7,0 mit Natriumhydroxid) unter Zusatz von 0,2 mg/L Biotin, 50 g/L Magnesiumcarbonat und 0,5 mM IPTG, sowie 1 mg/L Resazurin als Sauerstoffindikator. 50 mL Medium werden in 100 ml Laborglasflaschen (Schott, Mainz) vorgelegt und mit der Zellsuspension inokuliert, so dass eine optische Dichte (600 nm) von 20 erreicht wird. Die Flaschen werden mit einer Verschlusskappe mit Stopfen gasdicht verschlossen, die Kultivierung erfolgt bei 37°C und 250 U/min im Inkubationsschüttler für eine Dauer von 24 Stunden. Die Anaerobiose stellt sich innerhalb der ersten Stunde der Kultivierung ein und wird anhand der Entfärbung des Resazurin festgestellt. Während der Kultivierung werden Proben von 1 mL steril mit einer Kanüle durch den Stopfen entnommen, die nach Sterilfiltration mittels in Beispiel 3 beschriebener chromatografischer Methoden hinsichtlich ihres Saccharosegehaltes und des Gehaltes organischer Säuren analysiert werden.
  • Beispiel 5
  • Produktion von Succinat durch E. coli-Stämme mit Deletionen in den Genen ack-pta, adhE, ldhA und ygfG, in welchen das Gen ptsG durch den scrK-scrYAB-Locus aus dem Plasmid pUR400 ersetzt wurde und welcher das Gen pyc, kodierend für eine Pyruvatcarboxylase aus Corynebacterium glutamicum, überexprimiert.
  • Zunächst wurde ein E. coli-Stamm mit Deletionen in den Genen ack-pta (SEQ ID NO: 31), adhE (SEQ ID NO: 32), ldhA (SEQ ID NO: 33) und ygfG (SEQ ID NO: 34) und einem Austausch des ptsG-Gens (SEQ ID NO: 35) durch den scrK-scrYAB-Locus konstruiert. Es wurde der E. coli-Stamm MG1655 ack-pta adhE ldhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB mittels Methoden generiert, die dem Fachmann bekannt sind (z. B. siehe Datsenko KA, Wanner BL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. 97(12): 6640–5.). Die DNA-Sequenz der einzelnen Loci nach Deletion bzw. Insertion ist in SEQ ID NO: 36 (ack-pta), SEQ ID NO: 37 (adhE), SEQ ID NO: 38 (ldhA), SEQ ID NO: 39 (ygfG) und SEQ ID NO: 40 (ptsG::scrK-scrYAB) wiedergegeben.
  • E. coli MG1655 ack-pta adhE IdhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB wurde im Anschluss analog zu Beispiel 4 mit den Plasmiden pEC-XC99E und pEC-XC99E-pyc transformiert.
  • Die E. coli-Stämme MG1655 ack-pta adhE ldhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB (pEC-XC99E) und ack-pta adhE ldhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB (pEC-XC99E-pyc) wurden daraufhin analog zu Beispiel 4 kultiviert und die Konzentration von Saccharose, Succinat und Nebenprodukten analog zu Beispiel 3 quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 und 2 dargestellt. Tab. 1. Produktion von Succinat mit E. coli MG1655 ack-pta adhE ldhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB (pEC-XC99E). Angegeben sind die Konzentration von Succinat und Nebenprodukten sowie die Produktausbeute (YP/S) und die durchschnittliche Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) in den ersten 24 Stunden. Ethanol, Lactat, Pyruvat und Formiat konnten nicht nachgewiesen werden.
    t [h] cSaccharose [g/l] cSuccinat [g/l] cAcetat [g/l] YP/S [g/g] RZA [g·l–1·h–1]
    0 20 0 0 0 0
    24 9 3,8 1,2 0,19 0,16
    Tab. 2. Produktion von Succinat mit E. coli MG1655 ack-pta adhE ldhA ygfG ptsG::scrK-scrYAB (pEC-XC99E-pyc). Angegeben sind die Konzentration von Succinat und den Nebenprodukten Acetat, Ethanol, Lactat und Formiat sowie die Produktausbeute (YP/S) und die durchschnittliche Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) in den ersten 24 Stunden. Ethanol, Lactat, Pyruvat und Formiat konnten nicht nachgewiesen werden.
    t [h] cSaccharose [g/l] cSuccinat [g/l] cAcetat [g/l] YP/S [g/g] RZA [g·l–1·h–1]
    0 20 0 0 0 0
    24 0 15 1,1 0,75 0,6
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  • Die Erfindung wird hierin durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben, ist aber nicht auf diese beschränkt. Insbesondere ist für den Fachmann ohne Weiteres ersichtlich, dass verschiedene Änderungen an der beschriebenen Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung, wie er durch die angefügten Patentansprüche bestimmt wird, abzuweichen. Der Umfang der Erfindung wird somit durch die Patentansprüche bestimmt und es ist beabsichtigt, dass die Erfindung alle Modifikationen und Änderungen, die in den Deutungs- und Äquivalenzbereich der Ansprüche fallen, umfasst.
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  • Zitierte Patentliteratur
    • DE 10031999 A [0030]
    • EP 0472869 A [0032]
    • US 4601893 [0032]
    • WO 96/15246 A [0032]
    • JP 10-229891 A [0032]
    • US 4489160 [0033]
    • US 5158891 [0033]
    • US 6455284 [0081]
    • US 6171833 [0081]
    • US 6884606 [0081]
    • US 6403351 [0081]
    • US 6852516 [0081]
    • US 6861246 [0081]
    • US 4757009 [0084]
    • US 4980285 [0084]
    • US 5573945 [0084]
    • US 6872553 [0084]
    • US 6599732 [0084]
    • GB 1009370 A [0127]
    • WO 02/090312 A [0137]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria_catalogue.php [0015]
    • http://www.dsmz.de/microorganisms/yeast_catalogue.php [0015]
    • http://www.dsmz.de/microorganisms/fungus_catalogue.php [0015]
    • Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)) [0031]
    • Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 [0031]
    • Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39 [0031]
    • Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647 [0031]
    • Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155 [0031]
    • Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 [0031]
    • Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627 [0031]
    • Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284 [0031]
    • Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823 [0031]
    • Hermann et al. (Electophoresis, 22: 1712–23 (2001)) [0031]
    • Lohaus et al. (Biospektrum 5 32–39 (1998)) [0031]
    • Lottspeich (Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999)) [0031]
    • Wilson et al. (Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001)) [0031]
    • Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)) [0032]
    • Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)) [0032]
    • suchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)) [0032]
    • Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)) [0032]
    • Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) [0032]
    • Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) [0032]
    • LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)) [0032]
    • Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)) [0032]
    • Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) [0032]
    • Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford [0033]
    • Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham [0033]
    • Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7 [0033]
    • Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [0033]
    • Casali, N. and Preston, A. (eds) (2003) E. coli Plasmid Vectors. Humana Press [0033]
    • Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549–554 (1989) [0033]
    • Eikmanns et al., Gene 107: 69–74 (1991) [0033]
    • Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991) [0033]
    • Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66: 119–124 (1990) [0033]
    • Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126–132 (1994)) [0033]
    • Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983) [0033]
    • Schäfer et al., Gene 145: 69–73 (1994) [0033]
    • Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84 (1994) [0033]
    • Schrumpfet al., Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) [0033]
    • Spratt et al., Gene 41: 337–342 (1986) [0033]
    • Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) [0033]
    • Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988) [0033]
    • Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) [0033]
    • Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343–347 (1994) [0033]
    • A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generste a new L-lysine-producing mutant.”, Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217–223 (2002) [0081]
    • Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) [0127]
    • Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) [0127]
    • ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) [0127]
    • Datsenko KA, Wanner BL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. 97(12): 6640–5. [0155]

Claims (51)

  1. Rekombinante Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie aus Saccharose und Kohlendioxid als Kohlenstoffquellen im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr C4-Körper und/oder mehr über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen zu bilden vermag.
  2. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 1, wobei die C4-Körper ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Succinat, Malst, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1-Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3-Hydroxyisobuttersäure.
  3. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei die C4-Körper ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Malst, Oxalacetat und die über diese C4-Körper hergestellte Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen.
  4. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 3, wobei die durch enzymatische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.
  5. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei der Zelle um eine mikrobielle Zelle handelt.
  6. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der mikrobiellen Zelle um eine Escherichia coli, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Saccharomyces cerevisiae, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis oder Pseudomonas putida Zelle handelt.
  7. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Saccharose aufnehmen kann.
  8. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Kohlendioxid fixieren kann.
  9. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zelle eine im Vergleich zu Ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, das den Transport von Saccharose in die Zelle katalysiert.
  10. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 9, wobei das mindestens eine Enzym ein Enzym E1 umfasst, das den Transport von Saccharose in die Zelle und die Umsetzung zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert.
  11. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 10, wobei das Enzym E1 ein Phosphoenolpyruvat(PEP)-abhängiges Phosphotransferase-System (PTS) Enzym II (Saccharose-spezifisch) (EC 2.7.1.69; TCDB Klassifikation 4.A.1.2.1, 4.A.1.2.9 oder 4.A.1.2.-) ist.
  12. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Enzym E1 von Genen kodiert wird, die aus der Gruppe derer ausgewählt werden, die Genprodukte kodieren, deren Aminosäuresequenz über einen Bereich von mindestens 100 Aminosäuren, zu mindestens 60% zu SEQ ID NO: 58 identisch ist.
  13. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E2, das die Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose katalysiert; und/oder mindestens eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert; und/oder mindestens eines Kanals E4, der diffusions-abhängigen Saccharose-Transport in die Zelle erlaubt, aufweist.
  14. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 13, wobei das Enzym E2 eine Saccharose-6-Phosphat-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26) ist; und/oder das Enzym E3 eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) ist; und/oder das Enzym E4 ein Saccharose Porin (TCDB Klassifikation 1.B.3.1.2) ist.
  15. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 14, wobei E2 durch ein scrB oder susH Gen kodiert wird; und/oder E3 durch ein scrK oder cscK Gen kodiert wird; und/oder E4 durch ein scrY Gen kodiert wird.
  16. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 9, wobei das mindestens eine Enzym einen Kanal E5 umfasst, der Saccharose in die Zelle symportiert.
  17. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 16, wobei der Kanal E5 eine Saccharose-Permease (TCDB Klassifikation 2.A.1.5.3) ist.
  18. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 17, wobei der Kanal E5 durch ein cscB Gen kodiert wird.
  19. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E6, das die Umsetzung von Saccharose zu -D-Glucose und -D-Fruktose katalysiert; und/oder mindestens eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert, aufweist.
  20. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 19, wobei das Enzym E3 eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) ist; und/oder das Enzym E6 eine -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26) ist.
  21. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 20, wobei E3 durch ein scrK oder cscK Gen kodiert wird; und/oder E6 durch ein cscA Gen kodiert wird.
  22. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 9, wobei das mindestens eine Enzym einen Enzymkomplex aus E7, E8 und E9 umfasst, der Saccharose in die Zelle transportiert.
  23. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 22, wobei der Enzymkomplex aus E7, E8 und E9 ein Saccharose-spezifischer ABC-Transporter (TCDB Klassifikation 3.A.1.1.-) ist.
  24. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 22 oder 23, wobei E7 durch ein susT1 Gen; und/oder E8 durch ein susT2 Gen; und/oder E9 durch ein susX Gen kodiert wird.
  25. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms E10, das die Umsetzung von Saccharose zu Saccharose-6-Phosphat katalysiert; und/oder mindestens eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Saccharose-6-Phosphat zu -D-Glukose-6-Phosphat und -D-Fruktose katalysiert; und/oder mindestens eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von -D-Fruktose zu -D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert; aufweist.
  26. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 25 wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität der Enzyme E10, E2, E3 und E6 aufweist.
  27. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 26, wobei das Enzym E10 eine Saccharose-Kinase ist; und/oder das Enzym E2 eine Saccharose-6-Phosphat-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26) ist; das Enzym E3 eine Fruktokinase (EC 2.7.1.4) ist und/oder das Enzym E6 -D-Fruktofuranosid-Fruktohydrolase (EC 3.2.1.26) ist.
  28. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 26 oder 27, wobei E10 durch ein Saccharose-Kinase Gen; und/oder E2 durch ein scrB oder susH Gen; E3 durch ein scrK oder cscK Gen und/oder E6 durch ein cscA Gen kodiert wird
  29. Die rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Zelle eine im Vergleich zu Ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzyms aufweist, das die Fixierung von CO2 an einen C3-Körper katalysiert.
  30. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 29, wobei das mindestens eine Enzym, das die Fixierung von CO2 an einen C3-Körper katalysiert, aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus folgenden Enzymen besteht: E12, das die Umsetzung von Pyruvat, ATP und CO2 zu Oxalacetat, ADP und Phosphat katalysiert; E13, das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, H2O und CO2 zu Oxalacetat und Phosphat katalysiert; E14, das die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat, ADP/GDP/Pi und CO2 zu Oxalacetat und ATP/GTP/PPi katalysiert; E15, E16, E17 und E18, die die Umsetzung von Pyruvat NAD(P)H+ und CO2 zu Malst und NAD(P)+ katalysieren.
  31. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 30, wobei: E12 eine Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1.1) ist; E13 eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Phosphat:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1.1.31) ist; E14 eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (ATP/GTP/PPi:Oxalacetat-Carboxylase) (EC 4.1.1.32, EC 4.1.1.38 oder EC 4.1.1.49) ist; E15 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.38) ist; E16 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.39) ist; E17 eine Malatdehydrogenase ((S)-Malat:NADP+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.40) ist; und/oder E18 eine D-Malatdehydrogenase ((R)-Malat:NAD+ Oxidoreduktase) (EC 1.1.1.83) ist.
  32. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 31, wobei: E12 durch ein pyc Gen; E13 durch ein ppc Gen; E14 durch ein pckA Gen; E15 durch ein maeA Gen; E16 durch ein mme1 Gen; E17 durch ein maeB Gen; und/oder E18 durch ein dmlA Gen kodiert wird.
  33. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Zelle ferner eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität eines Enzym E12, das die Umsetzung von Pyruvat, ATP und CO2 zu Oxalacetat, ADP und Phosphat katalysiert, aufweist.
  34. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 33, wobei E12 durch ein pyc Gen kodiert wird.
  35. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die Zelle einen im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderten Kohlenstofffluss von Saccharose hin zu Gärungsprodukten, die keine C4-Körper sind, aufweist.
  36. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 35, wobei in der Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp aus Saccharose weniger C1-, C2- und/oder C3-Nebenprodukte erzeugt werden.
  37. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 35 oder 36, wobei der Metabolismus, der Gärungsprodukte erzeugt, reduziert oder unterbrochen ist.
  38. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität von mindestens einem Enzym aufweist, das aus der Gruppe, die aus den folgenden Enzymen besteht, ausgewählt wird: E 19, E20, E21 und E22, die Komponenten eines glukosespezifischen Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesystems darstellen und als solche den Import von Glukose und in Summe die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat und Glukose zu Pyruvat und Glukose-6-Phosphat katalysieren; E23 und E24, die die Umsetzung von Pyruvat und CoA zu Formiat und Acetyl-CoA katalysieren; E25, das die Umsetzung von Pyruvat, H2O und Ferricytochrom b1 zu Acetat, CO2 und Ferrocytochrom b1 katalysiert; E26, das die Umsetzung von S-Methylmalonyl-CoA zu Propanoyl-CoA und CO2 katalysiert; E27 und E28, die die Umsetzung von Acetyl-Phosphat und ADP/Pi zu Acetat und ATP/PPi katalysieren; E29, das die Umsetzung von Acetyl-CoA und Pi (Orthophosphat) zu Acetyl-Phosphat und CoA katalysiert; E30, das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu D-Lactat und NAD+ katalysiert; E31, das die Umsetzung von Acetyl-CoA zu Acetaldehyd katalysiert; E32, das die Umsetzung von Acetaldehyd zu Ethanol katalysiert; E33, das die Umsetzung von Glyceronphosphat zu Methylglyoxal und Orthophosphat katalysiert; E34, E35 und E36, die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert; E37, das die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert; E38, E39 und E40, die einen Komplex bilden, der die Umsetzung von Formiat zu CO2 katalysiert; E41, das die Umsetzung von Propionyl-CoA, H2O und Oxalacetat zu 2-Methylcitrat und CoA katalysiert; E42, das die Umsetzung von 2-Methylcitrat zu 2-Methyl-cis-Aconitat oder 2-Methyl-trans-Aconitat und H2O katalysiert; E43, das die Umsetzung von 2-Methyl-trans-Aconitat zu 2-Methyl-cis-Aconitat katalysiert; E44, das die Umsetzung von 2-Methyl-cis-Aconitat zu Succinat und Pyruvat katalysiert; E45, das die Umsetzung von Propionyl-Phosphat und ADP zu Propionat und ATP katalysiert; E46, welches die Umsetzung von Propionyl-CoA und Pi zu Propionyl-Phosphat und CoA katalysiert; E47, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Acetaldehyd und CO2 katalysiert; E48, welches die Umsetzung von Pyruvat und CoA 2 oxidierten Ferredoxinen zu Acetyl-CoA, CO2, und 2 reduzierten Ferredoxinen und 2H+ katalysiert; E49, welches die Umsetzung von D-Xylulose-5-Phosphat und Phosphat zu Acetylphosphat und D-Glyceraldehyd-3-Phosphate und H2O katalysiert; E50, welches die Umsetzung von (S)-methylmalonyl-CoA und Pyruvat zu Propionyl-CoA und Oxalacetat katalysiert; E51, welches die Umsetzung von (S)-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA katalysiert; E52, welches die Umsetzung von 2 Pyruvat zu 2-Acetolactat und CO2 katalysiert; E53, welches die Umsetzung von 2-Acetolactat zu Acetoin und CO2 katalysiert; E54, welches die Umsetzung von Acetoin und NAD(P)H+ zu Butan-2,3-diol und NAD(P)+ katalysiert; E55, welches die Umsetzung 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA katalysiert; E56, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NAD(P)H+ zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD(P)+ katalysiert; E57, welches die Umsetzung von Crotonyl-CoA und H2O zu 3-Hydroxybutyryl-CoA katalysiert; E58, welches die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H+ zu Butanol und NAD(P)+ katalysiert; E59, welches die Umsetzung von Butyryl-CoA und NAD(P)H+ zu Buryraldehyd und NAD(P)+ katalysiert; E60, welches die Umsetzung von Acetoacetat und H+ zu Aceton und CO2 katalysiert; E61, welches die Umsetzung von Aceton und NAD(P)H+ zu Propanol und NAD(P)+ katalysiert; E62, welches die Umsetzung von Acyl-CoA und Carbonsäure zu Acylat und Carbonsäure-CoA katalysiert; und E63, das die Umsetzung von Pyruvat und NADH zu L-Lactat und NAD+ katalysiert.
  39. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 38, wobei: E19 und E20 ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym II (EC 2.7.1.69); E21 ein PEP-abhängiges Phosphotransferase-System Enzym I (EC 2.7.3.9); E22 eine Phosphohistidin-Protein(HPr)-Hexose-Phosphotransferase-Komponenente des PEP-abhängigen Phosphotransferase-Systems; E23 und E24 eine Formiat-C-Acetyltransferase (EC 2.3.1.54); E25 eine Pyruvat:Ferricytochrom b1-Oxidoreduktase (EC 1.2.2.2); E26 eine Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.41); E27 eine ATP/PPi:Acetat-Phosphotransferase (EC 2.7.2.1 oder EC 2.7.2.1); E28 eine Propionat-/Acetat-Kinase (EC 2.7.2.15); E29 eine Acetyl-CoA:Phosphat-Acetyltransferase (EC 2.3.1.8); E30 eine D-Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.28); E31 eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (CoA-acetylierend) (EC 1.2.1.10); E32 eine NAD-abhängige Alkohol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1); E33 eine Glyceronphosphat-Phospholyase (EC 4.2.3.3); E34, E35, E36, E37, E38, E39 und E40 Formatdehydrogenasen (EC 1.2.1.2); E41 eine 2-Methylcitrat Synthase (EC 2.3.3.5); E42 eine 2-Methylcitrat Dehydratase (EC 4.2.1.79 oder EC 4.2.1.117); E43 eine 2-Methylaconitat Isomerase; E44 eine Methylisocitrat Lyase (EC 4.1.3.30); E45 eine Propionatkinase (EC 2.7.2.15); E46 eine Phosphat-Propionyltransferase (EC 2.3.1.8); E47 eine Pyruvatdecarboxylase (EC 4.1.1.1); E48 eine Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase (EC 1.2.7.1); E49 eine Phosphoketolase (EC 4.1.2.9); E50 eine Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase (EC 2.1.3.1); E51 eine Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2); E52 eine Acetolactat-Synthase (EC 2.2.1.6); E53 eine Acetolactat-Decarboxylase (EC 4.1.1.5); E54 eine Butandiol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.4 oder EC 1.1.1.76); E55 eine Thiolase (EC 2.3.1.9); E56 eine 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.36 oder EC 1.1.1.211); E57 eine Crotonase (EC 4.2.1.17); E58 eine Butanol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2); E59 eine Butyraldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 oder EC 1.2.1.5) E60 eine Acetoacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.4); E61 eine Propanol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.1 oder EC 1.1.1.2); E62 eine Acyl-CoA:CoA-Transferase (EC 2.8.3.-); und/oder E63 eine L-Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27) ist.
  40. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 40, wobei: E19 durch ein ptsG Gen kodiert wird; E20 durch ein ptsI Gen kodiert wird; E21 durch ein ptsH Gen kodiert wird; E22 durch ein crr Gen kodiert wird; E23 durch ein tdcE Gen kodiert wird; E24 durch ein pflA oder pflB Gen kodiert wird; E25 durch ein poxB Gen kodiert wird; E26 durch ein ygfG Gen kodiert wird; E27 durch ein ackA Gen kodiert wird; E28 durch ein ackA oder tdcD Gen kodiert wird; E29 durch ein pta Gen kodiert wird; E30 durch ein ldhA Gen kodiert wird; E31 durch ein adhE Gen kodiert wird; E32 durch ein adhE Gen kodiert wird; E33 durch ein mgsA Gen kodiert wird; E34 durch ein fdnG Gen kodiert wird; E35 durch ein fdnH Gen kodiert wird; E36 durch ein fdnI Gen kodiert wird; E37 durch ein fdhF Gen kodiert wird; E38 durch ein fdoG Gen kodiert wird; E39 durch ein fdoH Gen kodiert wird; E40 durch ein fdoI Gen kodiert wird; E41 durch ein prpC Gen kodiert wird; E42 durch ein prpD oder acnD Gen kodiert wird; E43 durch ein prpF Gen kodiert wird; E44 durch ein prpB Gen kodiert wird; E45 durch ein tdcD Gen kodiert wird E46 durch ein pta Gen kodiert wird; E47 durch ein pdc Gen kodiert wird; E48 durch ein porA, porB, porC oder porD Gen kodiert wird; E49 durch ein xpk1 oder xpk2 Gen kodiert wird E50 durch ein Methylmalonyl-CoA-Carboxytransferase Gen kodiert wird; E51 durch ein sbm oder ein mcmA und ein mcmB Gen kodiert wird; E52 durch ein alsS, ilvB, ilvM, ilvN, ilvG, ilvI oder ilvH Gen kodiert wird; E53 durch ein alsD Gen kodiert wird; E54 durch ein butB Gen kodiert wird; E55 durch ein thl, thlA, thlB oder phaA Gen kodiert wird; E56 durch ein phaB Gen kodiert wird; E57 durch ein crt Gen kodiert wird; E58 durch ein adhE Gen kodiert wird; E59 durch ein adhE, bdhA oder bdhB Gen kodiert wird; E60 durch ein adc Gen kodiert wird; E61 durch ein adh Gen kodiert wird; E62 durch ein ctfA und ein ctfB oder ein atoA und ein atoD Gen kodiert wird; und/oder E63 durch ein ldhL Gen kodiert wird.
  41. Die rekombinante Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15 oder 33 oder 34, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität mindestens eines der Enzyme E19, E20, E21, E22, E23, E24, E25, E26, E27, E28, E29, E30, E31, E32, E33, E45, E46, E47, E48, E49, E50, E55, E56, E57, E58, E59, E60, E61 und E63 aufweist.
  42. Die rekombinante Zelle nach Anspruch 42, wobei die Enzyme E19, E20, E21, E22, E23, E24, E25, E27, E28, E29, E30, E31, E32, E33, E45, E46, E47, E48, E49, E50, E55, E56, E57, E58, E59, E60, E61 und E63 ptsG, ptsI, ptsH, crr, tdcE, pflA, pflB, poxB, ack, pta, tdcD, ldhA, adhE, mgsA, ygfG, pdc, porA, porB, porC, porD, xpk1, xpk2, thl, thlA, thlB, phaA, phaB, crt, bdhA, bdhB, adc, adh und ldhL sind.
  43. Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 42, umfassend die Erhöhung im Vergleich zum Wildtyp der Aktivität mindestens eines der in den Ansprüchen 9 bis 34 genannten Enzyme in der Zelle.
  44. Das Verfahren nach Anspruch 43, ferner umfassend die Verminderung der Aktivität im Vergleich zum Wildtyp mindestens eines der in den Ansprüchen 33 bis 40 genannten Enzyme in der Zelle.
  45. Verfahren zur Herstellung mindestens eines C4-Körpers und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellte Folgeverbindung, wobei das Verfahren die Inkubation einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 42 mit einem Nährmedium, das Saccharose enthält, unter Bedingungen, die die Herstellung mindestens eines C4-Körpers aus Saccharose und CO2 erlauben, umfasst.
  46. Das Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Medium ferner Kohlendioxid enthält.
  47. Das Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, ferner umfassend Isolieren des mindestens einen C4-Körpers und/oder der mindestens einen über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung aus dem Nährmedium.
  48. Das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei der mindestens eine C4-Körper ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Succinat, Malst, Fumarat, Oxalacetat, Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Pyrrolidon, Acetoin, 4,4-Bionell, Hydroxysuccinat, Epoxy-γ-Butyrolacton, Butensäure, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, Buten, n-Buten, cis-2-Buten, trans-2-Buten, Isobuten, Butadien, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 3-Hydroxybutyrolacton, 4-Hydroxybutyrolacton, 1-Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol, Isobutanol, 2-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und 3-Hydroxyisobuttersäure.
  49. Das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei die C4-Körper ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Malst, Oxalacetat und die über diese C4-Körper hergestellten Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus durch enzymatische oder chemische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellte Folgeverbindungen.
  50. Das Verfahren nach Anspruch 49, wobei die durch enzymatische Synthese über Malst oder Oxalacetat hergestellten Folgeverbindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Aspartat, Asparagin, Threonin, Tetrahydrofuran, Butyrat, Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 3- und 4-Hydroxybutyrolacton, 1-, 2- und tert-Butanol, Isobutanol, 2-, 3- und 4-Hydroxybuttersäure, 2- und 3-Hydroxyisobuttersäure, Methionin und Lysin.
  51. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 42 zur mikrobiologischen Herstellung von mindestens einem C4-Körper und/oder mindestens einer über diesen C4-Körper hergestellten Folgeverbindung aus Saccharose und Kohlendioxid.
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DE102010029973A Withdrawn DE102010029973A1 (de) 2010-06-11 2010-06-11 Mikrobiologische Herstellung von C4-Körpern aus Saccharose und Kohlendioxid

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DE (1) DE102010029973A1 (de)
WO (1) WO2011154503A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103147A (zh) * 2012-07-18 2013-05-15 大连理工大学 一株同时具有反硝化和铁还原功能的善变副球菌菌株、培养方法及其应用
DE102012101153A1 (de) * 2012-02-14 2013-08-14 Thyssenkrupp Uhde Gmbh Verfahren zur biotechnologischen herstellung von organischen säuren durch mindestens einen hefestamm
US20140154765A1 (en) * 2011-11-09 2014-06-05 Amyris, Inc. Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011100608A1 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Metabolix, Inc. Process for producing a monomer component from a genetically modified polyhydroxyalkanoate biomass
US8871488B2 (en) 2010-06-18 2014-10-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cells comprising phosphoketolases
DE102012201360A1 (de) 2012-01-31 2013-08-01 Evonik Industries Ag Zellen und Verfahren zur Herstellung von Rhamnolipiden
EP2631298A1 (de) 2012-02-22 2013-08-28 Evonik Industries AG Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Butanol und Buttersäure
US8686114B2 (en) * 2012-03-05 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Variant sucrose transporter polypeptides
WO2013142033A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 Metabolix, Inc. Genetically engineered microorganisms for the production of poly-4-hydroxybutyrate
EP2647696A1 (de) 2012-04-02 2013-10-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur aeroben Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung
US9850192B2 (en) 2012-06-08 2017-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Renewable acrylic acid production and products made therefrom
CN102876760B (zh) * 2012-10-22 2014-07-30 南京工业大学 枯草芽孢菌在高产腺苷且联产乙偶姻中的应用
EP2746400A1 (de) 2012-12-21 2014-06-25 Evonik Industries AG Herstellung von Aminen und Diaminen aus einer Carbonsäure oder Dicarbonsäure oder eines Monoesters davon
FR3002774A1 (fr) * 2013-03-04 2014-09-05 Agronomique Inst Nat Rech Levures mutantes ayant une production accrue de lipides et d'acide citrique
WO2015158716A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-22 Novamont S.P.A. Process for the production of 1,4-butanediol
EP2949214A1 (de) 2014-05-26 2015-12-02 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von Rhamnolipiden
WO2018091525A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danmarks Tekniske Universitet Bacterial cells with improved tolerance to diacids
ES2870324T3 (es) * 2017-05-19 2021-10-26 Basf Se Procedimiento de producción de un compuesto orgánico
CN111139193B (zh) * 2019-12-05 2022-04-22 天津科技大学 一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用

Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1009370A (en) 1962-12-18 1965-11-10 Ajinomoto I I A process for the production of 1-glutamic acid by fermentation
US4489160A (en) 1981-08-26 1984-12-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Plasmid pCG2
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
US4757009A (en) 1983-08-29 1988-07-12 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing amino acids using said bacteria
US4980285A (en) 1984-10-04 1990-12-25 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
EP0472869A2 (de) 1990-08-30 1992-03-04 Degussa Ag Neue Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete Plasmidvektoren
US5158891A (en) 1984-08-21 1992-10-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom
WO1996015246A1 (de) 1994-11-11 1996-05-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Die genexpression in coryneformen bakterien regulierende dna
US5573945A (en) 1994-01-10 1996-11-12 Ajinomoto Co., Inc. Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
US6455284B1 (en) 1998-04-13 2002-09-24 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered E. coli for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
WO2002090312A1 (en) 2001-05-07 2002-11-14 Cargill, Incorporated Process for preparing carboxylic acids and derivatives thereof
US6599732B1 (en) 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
US6852516B2 (en) 1999-01-13 2005-02-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamic acid by fermentation
US6861246B2 (en) 1999-07-07 2005-03-01 Degussa Ag L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
US6872553B2 (en) 1999-10-20 2005-03-29 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the pck gene

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8426173B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 1-butanol
EP2227541B1 (de) * 2007-12-18 2013-06-19 Korea Advanced Institute of Science and Technology Rekombinanter mikroorganismus mit fähigkeit zur verwendung von saccharose als kohlenstoffquelle

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1009370A (en) 1962-12-18 1965-11-10 Ajinomoto I I A process for the production of 1-glutamic acid by fermentation
US4489160A (en) 1981-08-26 1984-12-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Plasmid pCG2
US4757009A (en) 1983-08-29 1988-07-12 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing amino acids using said bacteria
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
US5158891A (en) 1984-08-21 1992-10-27 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom
US4980285A (en) 1984-10-04 1990-12-25 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
EP0472869A2 (de) 1990-08-30 1992-03-04 Degussa Ag Neue Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete Plasmidvektoren
US5573945A (en) 1994-01-10 1996-11-12 Ajinomoto Co., Inc. Mutant and method for producing L-glutamic acid by fermentation
WO1996015246A1 (de) 1994-11-11 1996-05-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Die genexpression in coryneformen bakterien regulierende dna
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
US6455284B1 (en) 1998-04-13 2002-09-24 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered E. coli for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
US6403351B1 (en) 1998-12-23 2002-06-11 Archer Daniels Midland Company Pyruvate carboxylase polypeptide from Corynebacterium glutamicum
US6884606B2 (en) 1998-12-23 2005-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum
US6852516B2 (en) 1999-01-13 2005-02-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamic acid by fermentation
US6599732B1 (en) 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
US6861246B2 (en) 1999-07-07 2005-03-01 Degussa Ag L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of lysine
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
US6872553B2 (en) 1999-10-20 2005-03-29 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the pck gene
WO2002090312A1 (en) 2001-05-07 2002-11-14 Cargill, Incorporated Process for preparing carboxylic acids and derivatives thereof

Non-Patent Citations (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981)
A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generste a new L-lysine-producing mutant.", Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217-223 (2002)
Casali, N. and Preston, A. (eds) (2003) E. coli Plasmid Vectors. Humana Press
Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
Datsenko KA, Wanner BL. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. 97(12): 6640-5.
Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627
Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)
Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))
Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)
Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823
Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford
Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))
Hermann et al. (Electophoresis, 22: 1712-23 (2001))
Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001))
http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria_catalogue.php
http://www.dsmz.de/microorganisms/fungus_catalogue.php
http://www.dsmz.de/microorganisms/yeast_catalogue.php
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))
LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))
Lohaus et al. (Biospektrum 5 32-39 (1998))
Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39
Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647
Lottspeich (Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999))
Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))
Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)
Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284
Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))
Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994))
Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham
Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989
Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989
Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)
Schäfer et al., Gene 145: 69-73 (1994)
Schrumpfet al., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)
Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))
Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66: 119-124 (1990)
Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)
Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)
Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)
Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)
Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)
suchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))
Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)
Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988)
Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155
Wilson et al. (Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001))

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140154765A1 (en) * 2011-11-09 2014-06-05 Amyris, Inc. Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids
US8859261B2 (en) * 2011-11-09 2014-10-14 Amyris, Inc. Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids
DE102012101153A1 (de) * 2012-02-14 2013-08-14 Thyssenkrupp Uhde Gmbh Verfahren zur biotechnologischen herstellung von organischen säuren durch mindestens einen hefestamm
CN103103147A (zh) * 2012-07-18 2013-05-15 大连理工大学 一株同时具有反硝化和铁还原功能的善变副球菌菌株、培养方法及其应用
CN103103147B (zh) * 2012-07-18 2014-11-12 大连理工大学 一株同时具有反硝化和铁还原功能的善变副球菌菌株、培养方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011154503A1 (de) 2011-12-15

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